BR112020009096A2 - método para reduzir o tempo de reconstituição de formulações proteicas secas por aspersão - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao uso de uma combinação de açúcar e um ou mais aminoácidos para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão.

Description

“MÉTODO PARA REDUZIR O TEMPO DE RECONSTITUIÇÃO DE FORMULAÇÕES PROTEICAS SECAS POR ASPERSÃO” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de formulações farmacêuticas secas por aspersão e seus processos de fabricação. Mais especificamente, refere-se a métodos, usos e processos para reduzir o tempo de reconstituição de formulações proteicas secas por aspersão para usos farmacêuticos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Injeções líquidas de anticorpos monoclonais, tais como injeções intravenosas, intramusculares ou subcutâneas, são ainda a via de administração mais preferencial que possibilita produzir concentração sistêmica alta de anticorpos monoclonais para usos terapêuticos (Wan et al. Technologies 9 (2), e141 a e146. (2012); Roberts, C. J., Current Opinion in Biotechnology 30, 211 a 217 (2014); Moroz, E. et al. Advanced Drug Delivery Reviews 101, 108 a 121 (2016)). As injeções subcutâneas são a via preferencial das opções mencionadas anteriormente visto que permite ao paciente a autoadministração, limitando potencialmente o impacto sobre a vida diária do paciente e o custo geral de tratamento. Entretanto, o volume que pode ser administrado por via subcutânea na ausência de dispositivos especializados e métodos enzimáticos, como sistemas de infusão subcutânea facilitados por hialuronidase, é muito limitado, cerca de 1,5 a 2 ml, tornando necessário administrar formulações de anticorpo monoclonal altamente concentradas (Wasserman, R. L, et al. Journal of Alleray and Clinical Immunology 130 (4), 951 a 957 (2012)). Consequentemente, as altas concentrações de anticorpos monoclonais nessas formulações aumentarão as chances de autointerações proteicas com um risco associado de agregação irreversível, o que leva a uma diminuição em eficácia de produto e um risco aumentado de respostas imunogênicas (Roberts, C. J., Current Opinion in Biotechnology 30, 211 a 217 (2014); Barnett et al. Biophysical Chemistry 207, 21 a 29 (2015); Mahler et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 98(9), 2.909 a

2.934 (2009)).

[0003] As formulações de anticorpos monoclonais para injeções subcutâneas são frequentemente secas quando sua forma líquida está insuficiente estável, visto que a remoção de água reduz drasticamente a mobilidade conformacional da proteína e limita o transporte de reagentes de molécula pequena, reduzindo subsequentemente a taxa de autointeração de proteína e os mecanismos de degradação, melhorando, assim, a estabilidade da formulação (armazenamento) (Cicerone, M. T., et al. Soft Matter 8, 2.983 a 2.991 (2012)). Mecanismos e modelos diferentes para estabilização de proteína em estado líquido, durante a secagem, e em estado sólido têm sido propostos ao longo dos anos.

[0004] A secagem de formulações proteicas é frequentemente realizada por liofilização, visto que não há risco de expor as proteínas a altas temperaturas. Entretanto, uma grande desvantagem da liofilização é a quantidade de tensão gerada durante as fases tanto de congelamento quanto de secagem, resultando potencialmente em uma perda parcial ou completa de atividade.

[0005] A secagem por aspersão de formulações proteicas, entretanto, representa um processo rápido, em uma etapa, personalizável que produz pós que têm a morfologia, densidade e fluxo de pó desejados. Embora a secagem por aspersão use temperaturas relativamente altas, a exposição ao calor da proteína é mínima como resultado de o calor ser extraído da gotícula durante a evaporação de solvente e a curta duração do processo de secagem por aspersão. Para reduzir o impacto de fatores de tensão, como tensão de cisalhamento, exposição a interfaces de ar/líquido ou tensão de calor aumentada mediante perda de invólucro de hidratação e, ainda, aumentar, ainda, a estabilidade em estado sólido, excipientes adequados são adicionados.

[0006] As formulações secas por aspersão, entretanto, e similarmente a outras formulações proteicas na forma de pó, precisam ser reconstituídas, usualmente em água, logo antes da administração. Embora a reconstituição de uma formulação seca por aspersão possa facilmente ser atingida, o tempo que ocorre para que isso seja concluído pode variar amplamente dependendo dos excipientes adicionados à formulação proteica antes da secagem por aspersão.

[0007] Pesquisa considerável tem sido devotada a determinar a influência desses excipientes sobre a estabilidade da proteína, e a maior parte focou em liofilização ou secagem por aspersão para inalação, em vez de pós para injeção subcutânea. Além disso, pouco é conhecido sobre excipientes adequados que podem afetar o tempo de reconstituição para formulações proteicas secas por aspersão.

[0008] Portanto, permanece uma necessidade na técnica de fornecer formulações proteicas adicionalmente melhoradas para injeções subcutâneas que, uma vez secas por aspersão, se reconstituem dentro de um tempo aceitável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção soluciona a necessidade identificada acima fornecendo métodos, processos e usos para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão através da combinação de um açúcar e um ou mais aminoácidos.

[0010] As seguintes modalidades específicas são descritas conforme numeradas doravante:

[0011] Modalidade 1: Um método para reduzir o tempo de construção de uma formulação proteica seca por aspersão, em que o método compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de um açúcar e um ou mais aminoácidos, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 mM a 200 mM.

[0012] Modalidade 2: O método, de acordo com a Modalidade 1, em que a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

[0013] Modalidade 3: O método, de acordo com a Modalidade 1 ou a Modalidade 2, em que o açúcar é sacarose, trealose ou uma mistura dos mesmos.

[0014] Modalidade 4: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o aminoácido é glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L- treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos.

[0015] Modalidade 5: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o açúcar é sacarose ou trealose e o aminoácido é cloridrato de L-

arginina, cloridrato de L-histidina, cloridrato de L-lisina ou misturas dos mesmos.

[0016] Modalidade 6: O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o método compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende, ainda, um tensoativo.

[0017] Modalidade 7: O método, de acordo com a Modalidade 6, em que o tensoativo é um polissorbato, de preferência, polissorbato 20.

[0018] Modalidade 8: Um processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão que compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, um açúcar e um ou mais aminoácidos; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0019] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de um açúcar e um ou mais aminoácidos, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 mM a 200 mM.

[0020] Modalidade 9: O processo, de acordo com a Modalidade 8, em que a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

[0021] Modalidade 10: O processo, de acordo com as Modalidades 8 ou 9, em que O açúcar é sacarose, trealose ou uma mistura dos mesmos.

[0022] Modalidade 11: O processo, de acordo com qualquer das Modalidades 8 a 10, em que o aminoácido é glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos.

[0023] Modalidade 12: O processo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 8 a 11, em que o açúcar é sacarose ou trealose e o aminoácido é cloridrato de L- arginina, cloridrato de L-histidina, cloridrato de L-lisina ou misturas dos mesmos.

[0024] Modalidade 13: O processo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 8 a 12, em que o método compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende, ainda, um tensoativo.

[0025] Modalidade 14: O processo, de acordo com a Modalidade 13, em que o tensoativo é um polissorbato, de preferência, polissorbato 20.

[0026] Modalidade 15: Uma formulação proteica obtida através do processo, de acordo com qualquer uma das Modalidades 8 a 14.

[0027] Modalidade 16: A formulação proteica, de acordo com a Modalidade 15, para uso em terapia e diagnóstico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] Figura 1. Tempo de reconstituição para formulações contendo um açúcar e combinações de aminoácidos. O efeito de combinação de aminoácidos foi comparado a 2,5% de sacarose sozinha.

[0029] Figura 2. Plotagem de estimativas de parâmetro expandida de formulações secas por aspersão de DoE. O modelo foi calculado com o uso dos valores medidos (n=3) para amostras armazenadas a 5 ºC. As barras abertas identificam parâmetros não significativos, enquanto os parâmetros que são estatisticamente significativos no nível 0,05 são identificados por barras sombreadas. As barras de erro representam o erro padrão estimado para cada um dos parâmetros estimados. Estimativa de interceptação = 18,69 + 0,45 (SE) minutos.

[0030] Figura 3. Tempo de reconstituição de formulações secas por aspersão que compreendem mAb1. Comparação de tempo de reconstituição para formulações que compreendem aminoácidos selecionados e sacarose e um tensoativo (barras pretas) versus um tensoativo sozinho (barras brancas).

[0031] Figura 4. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1. Sacarose sozinha versus sacarose e aminoácido único ou combinação de aminoácidos. Sem tensoativo presente.

[0032] Figura 5. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1. Sacarose e tensoativo apenas versus sacarose, tensoativo e aminoácido único ou combinação de aminoácidos.

[0033] Figura 6. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1. Trealose sozinha versus sacarose e aminoácido único ou combinação de aminoácidos. Sem tensoativo presente.

[0034] Figura 7. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1. Trealose e tensoativo apenas versus sacarose, tensoativo e aminoácido único ou combinação de aminoácidos.

[0035] Figura 8. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende um anticorpo Fab”-PEG. O efeito sobre o tempo de reconstituição de uma formulação de anticorpo Fab'-PEG com sacarose sozinha versus sacarose em combinação com concentração crescente de glicina.

[0036] Figura 9. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende um anticorpo Fab'-PEG,. O efeito sobre o tempo de reconstituição de uma formulação de anticorpo Fab'-PEG com vários aminoácidos a 1% em combinação com 2,5% de sacarose.

[0037] Figura 10. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1, um dissacarídeo e Arginina. A) Efeito de trealose qualquer que seja a concentração de Arginina. B) Efeito de arginina qualquer que seja a concentração de trealose. C) Efeito da quantidade cumulativa de arginina e trealose.

[0038] Figura 11. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1, um dissacarídeo e Glicina. A) Efeito de trealose qualquer que seja a concentração de Glicina. B) Efeito de Glicina qualquer que seja a concentração de trealose. C) Efeito da quantidade cumulativa de Glicina e trealose.

[0039] Figura 12. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1, um dissacarídeo e Lisina. A) Efeito de trealose qualquer que seja a concentração de Lisina. B) Efeito de Lisina qualquer que seja a concentração de trealose. C) Efeito da quantidade cumulativa de Lisina e trealose.

[0040] Figura 13. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb1, um dissacarídeo e Prolina. A) Efeito de trealose qualquer que seja a concentração de Prolina. B) Efeito de Prolina qualquer que seja a concentração de trealose. C) Efeito da quantidade cumulativa de Prolina trealose.

[0041] Figura 14. Tempos de reconstituição de formulação seca por aspersão que compreende mAb?2. O efeito sobre o tempo de reconstituição de formulações de mAb2 com vários aminoácidos a 100 mM em combinação com 2,5% de trealose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0042] O método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende secagem por aspersão de uma formulação proteica na presença de um açúcar e um ou mais aminoácidos.

[0043] Foi relatado que dissacarídeos e aminoácidos, tal como L-arginina, estabilizam a proteína durante a liofiização e em estado sólido (Ohtake et al. Advanced Drug Delivery Reviews 63 (13), 1.053 a 1.073 (2011); Kamerzell et al. Advanced Drug Delivery Reviews 63 (13), 1.118 a 1.159 (2011) e Balcão and Vila, Advanced Drug Delivery Reviews 93, 25 a 41 (2015)). Entretanto, não houve investigações sobre excipientes e métodos que podem reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão que compreende uma proteína conforme descrito no presente documento.

[0044] A presente invenção, portanto, também fornece o uso de uma combinação de um ou mais aminoácidos e um açúcar, tal como um dissacarídeo, de preferência, sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, para reduzir o tempo de reconstituição e uma formulação proteica seca por aspersão.

[0045] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão que compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, um açúcar e um ou mais aminoácidos; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0046] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de um açúcar e um ou mais aminoácidos.

[0047] O termo “na presença de”, conforme usado no presente documento, significa que o açúcar e o um ou mais aminoácidos são parte da formulação proteica antes de secar por aspersão essa formulação e implica nenhuma limitação sobre como e quando foram adicionados ou a ordem de adição, contanto que a formulação proteica antes da secagem por aspersão contenha os mesmos.

[0048] Os tempos de reconstituição aceitáveis são considerados como estando dentro de 30 minutos, de preferência, dentro de 25 minutos ou, mais preferencialmente, dentro de 20 minutos ou antes. O termo “tempo de reconstituição”, conforme usado no presente documento, significa o tempo necessário para reconstituir uma formulação proteica seca por aspersão em um volume desejado de solvente (por exemplo, água). Dentro da presente revelação, ao considerar se certos excipientes são inesperadamente superiores a outros, os tempos de reconstituição para formulações proteicas identicamente secas por aspersão, para os diferentes excipientes a serem investigados, são comparados. Excipientes inesperadamente superiores reduzem o tempo de reconstituição dentro desses limites de pelo menos cerca de 10% ou mais.

[0049] De preferência, a proteína na formulação proteica de acordo com o método, uso e processo da presente invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação a anticorpo do mesmo.

[0050] O termo "anticorpo" ou "anticorpos", conforme usado no presente documento, refere-se a anticorpos monocilonais ou policlonais e não é limitado a anticorpos recombinantes que são gerados por tecnologias recombinantes, conforme conhecido na técnica.

[0051] De preferência, o anticorpo compreendido na formulação proteica de acordo com os métodos, usos e processos da presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0052] "Anticorpo" ou "anticorpos" incluem anticorpos de quaisquer espécies, em particular, de espécies de mamífero, que têm duas cadeias pesadas essencialmente completas e duas leves essencialmente completas, anticorpos humanos de qualquer isotipo, incluindo IgA1, IgA>2, IgD, IgG1, IgG2a, IGG26, I9G3, IgGa IgE e IgM e variantes modificadas dos mesmos, anticorpos primatas não humanos, por exemplo, de chimpanzé, babuíno, macaco reso ou cinomolgo, anticorpos de roedor, por exemplo, de camundongo, rato ou coelho; anticorpos de cabra ou cavalo, e derivados dos mesmos, ou de espécies de pássaros, tais como anticorpos de galinha, ou de espécies de peixes, tais como anticorpos de tubarão.

O termo "anticorpo" ou "anticorpos" também se refere a anticorpos "quiméricos" em que uma primeira porção de pelo menos uma sequência de anticorpo de cadeia pesada e/ou leve é de uma primeira espécie e uma segunda porção da sequência de anticorpo de cadeia pesada e/ou leve é de uma segunda espécie.

Os anticorpos quiméricos de interesse no presente documento incluem anticorpos “primatizados" que compreendem sequências de ligação a antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Old World Monkey, tal como macaco babuíno, reso ou cinomolgo) e sequências de região constante humanas.

Anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência derivada de anticorpos não humanos.

Para a maior parte, anticorpos humanizados são anticorpos humanos (anticorpo de receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável ou região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, coelho, galinha ou primata não humano tendo a especificidade, a afinidade e a atividade desejadas.

Na maior parte dos casos, os resíduos do anticorpo humano (receptor) fora da CDR; isto é, na região de framework (FR), são adicionalmente substituídos por resíduos não humanos correspondentes.

Ademais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador.

Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.

A humanização reduz a imunogenicidade de anticorpos não humanos em seres humanos, facilitando, assim, a aplicação de anticorpos ao tratamento de doenças humanas.

Os anticorpos humanizados e diversas tecnologias diferentes para gerar os mesmos são bem conhecidos na técnica. O termo "anticorpo" ou "anticorpos" também se refere a anticorpos humanos, que podem ser gerados como uma alternativa à humanização. Por exemplo, é também possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que têm capacidade, sob imunização, para produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de anticorpos murinos endógenos. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene de região de junção (JH) de cadeia pesada de anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinativa resulta em inibição completa de produção endógena de anticorpo. À transferência do arranjo de genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos com especificidade contra um antígeno particular mediante imunização do animal transgênico que porta os genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana com o dito antígeno. As tecnologias para produzir tais animais transgênicos e as tecnologias para isolar e produzir anticorpos humanos a partir de tais animais transgênicos são conhecidas na técnica. Alternativamente, no animal transgênico; por exemplo, camundongo, apenas os genes de imunoglobulina que codificam as regiões variáveis do anticorpo de camundongo são substituídos por sequências de genes de imunoglobulina variáveis humanas correspondentes. Os genes de imunoglobulina de linhagem germinativa de camundongo que codificam as regiões constantes de anticorpo permaneces inalterados. Dessa forma, as funções efetoras de anticorpo no sistema imunológico do camundongo transgênico e, consequentemente, o desenvolvimento de célula B são essencialmente inalteradas, o que pode levar a uma resposta de anticorpo melhorada mediante desafio antigênico in vivo. Uma vez que os genes que codificam um anticorpo particular de interesse tenham sido isolados de tais animais transgênicos, os genes que codificam as regiões constantes podem ser substituídos por genes de região constante humanos a fim de obter um anticorpo completamente humano. O termo “anticorpo” ou “anticorpos”, conforme usado no presente documento, também se refere a um anticorpo aglicosilado.

[0053] O termo "fragmento do mesmo" ou variações agramaticais do mesmo,

conforme usado no presente documento, refere-se a um fragmento de anticorpo. Um fragmento de um anticorpo compreende pelo menos um domínio de imunoglobulina de cadeia pesada e leve conforme conhecido na técnica e se liga a um ou mais antígenos. Os exemplos de fragmento de anticorpos de acordo com a invenção incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv e scFv; assim como diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos de domínio (dAbs), tais como sdAbs, VHH ou anticorpos camelídeos (por exemplo, de camelos ou lhamas, tais como Nanobodies'Y) e fragmentos VNAR, anticorpos de cadeia única, anticorpos biespeciíficos, triespecíficos, tetraespecíficos ou multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo ou anticorpos, incluindo, porém sem limitação, construtos Fab-Fv ou Fab- Fv-Fv. Os fragmentos de anticorpo, conforme definido acima, são conhecidos na técnica.

[0054] Se for desejado, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode ser conjugado a uma ou mais moléculas efetoras. Será percebido que a molécula efetora pode compreender uma única molécula efetora ou duas ou mais tais moléculas assim ligadas para formar uma porção química única que pode estar ligada aos anticorpos da presente invenção. Quando for desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, o mesmo pode ser preparado por procedimentos de DNA recombinantes ou químicos padrão em que o fragmento de anticorpo está ligado diretamente ou através de um agente de acoplamento à molécula efetora. As técnicas para conjugar tais moléculas efetoras a anticorpos são bem conhecidas na arte (consultar Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2º edição, Robinson et al., eds., 1987, páginas 623 a 653; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119 a 158 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67 a 123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos nos documentos nº* WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO 03/031581. Alternativamente, quando a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo, a ligação pode ser atingida com o uso de procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, conforme descrito nos documentos nº* WO 86/01533 e EP0392745.

[0055] O termo molécula efetora, conforme usado no presente documento, inclui, por exemplo, agentes antineoplásticos, fármacos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, agentes de ligação a antígeno, polímeros sintéticos (incluindo PEG) ou de ocorrência natural, ácidos nucleicos e fragmentos dos mesmos, por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórter, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia por RMN ou ESR.

[0056] A molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou aumentar a entrega de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imunológico. Os exemplos de molécula efetoras adequadas para esse tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação a albumina ou compostos de ligação a albumina, tais como aquelas descritas no documento nº WO05/117984.

[0057] Quando a molécula efetora é um polímero, a mesma pode, em geral, ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homopolissacarídeo ou heteropolissacarídeo.

[0058] Os substituintes opcionais específicos, que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima, incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[0059] Os exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etilenoglicol), poli(propilenoglicol), poli(vinilálcool) ou derivados dos mesmos de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos, especialmente poli(etilenoglico!), tal como metoxipoli(etilenoglico!), ou derivados dos mesmos opcionalmente substituídos.

[0060] Os polímeros de ocorrência natural específicos incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados dos mesmos.

[0061] Em uma modalidade, o polímero é albumina ou um fragmento do mesmo, tal como albumina sérica humana ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade,

o polímero é uma molécula de PEG.

[0062] O tamanho do polímero natural ou sintético pode ser variado conforme desejado, mas estará, de modo geral, em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50.000 Da, por exemplo, de 5.000 a 40.000 Da, tal como de 20.000 a 40.000 Da. O tamanho de polímero pode, em particular, ser selecionado com base no uso destinado do produto, por exemplo, capacidade de localizar certos tecidos, tais como tumores, ou estender meia-vida em circulação (para análise, consultar Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531 a 545). Assim, por exemplo, quando o produto é destinado a deixar a circulação e penetrar o tecido, por exemplo, para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo, com um peso molecular de cerca de 5.000 Da. Para aplicações em que o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais alto, por exemplo, que tem um peso molecular na faixa de 20.000 Da a 40.000 Da.

[0063] Os polímeros adequados incluem um polímeros de polialquileno, tal como um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou um derivado do mesmo e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15.000 Da a cerca de 40.000 Da.

[0064] Em um exemplo, os anticorpos para uso no presente invenção estão ligados a porções químicas poli(etilenoglicol) (PEG). Em um exemplo particular, o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem estar ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido ou grupo funcional aminoácido terminal disponível localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer grupo livre amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser geneticamente modificados no fragmento com o uso de métodos de DNA recombinante (consultar, por exemplo, os documentos nº* US 5.219.996; US 5.667.425; WOS98/25971, WO2008/038024). Em um exemplo, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade C-terminal de sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora.

Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode estar ligada. Múltiplos sítios podem ser usados para ligar duas ou mais moléculas de PEG.

[0065] Adequadamente, as moléculas de PEG estão ligadas covalentemente através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode estar ligada covalentemente ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será, de modo geral, uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono. Quando um grupo tiol é usado como o ponto de ligação, moléculas efetoras adequadamente ativadas, por exemplo, derivados seletivos de tiol, tais como maleimidas, e derivados de cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados por polímero, conforme descrito acima.

[0066] O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reativo tiol, tal como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, junto à Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EUA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis com o uso de procedimentos químicos convencionais. As moléculas de PEG particulares incluem 20K metoxi-PEG-amina (obtenível junto à Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M-PEG-SPA (obtenível junto à Nektar, anteriormente Shearnwvater).

[0067] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento Fab modificado, fragmento Fab' ou diFab que é PEGuilado, isto é, tem PEG (poli(etileno glicol)) covalentemente ligado ao mesmo, por exemplo, de acordo com o método revelado nos documentos nºº EP 0948544 ou EP1090037 [consultar também "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and

Biological Applications", 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531 a 545]. Em um exemplo, PEG é ligado a uma cisteína na região de dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG tem um grupo maleimida ligado covalentemente a um grupo tiol único em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode estar ligado covalentemente ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode estar ligado um polímero de metoxipoli(etileno glicol) que tem um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab pode ser, portanto, aproximadamente 40.000 Da.

[0068] As moléculas de PEG particulares incluem lisina modificada com 2-[3-(N- maleimido)propionamido]Jetil amida de N,N'-bis(metoxipoli(etileno glicol) MW 20.000), também conhecida como PEG2MAL40K (obtenível junto à Nektar, anteriormente Shearnwater).

[0069] As fontes alternativas de ligantes PEG incluem NOF que fornecem GL2- 400MA3 (em que m na estrutura abaixo é 5) e GL2-400MA (em que mé 2) e né aproximadamente 450: H,CO-(CH,CH,O), Atas H o On N (CH) x

YO o mézou5

H,CO-(CH,CH,O), neoenenao H o A (CH), O o / o mis2or5

[0070] Ou seja, cada PEG tem cerca de 20.000 Da.

[0071] Assim, em uma modalidade, o PEG é 2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-f[3- (6-maleimido-1-ox0-hexil)amino]propiloxi) hexano (o PEG ramificado em 2 braços, - CH2) 3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40.000 conhecido como SUNBRIGHT GL2-400MA3.

[0072] Outras molécula efetoras de PEG alternativas do seguinte tipo: CH,O-(CH,CH,O)N

N CH,O-(CH,CH,O)N / o

[0073] estão disponíveis junto à Dr Reddy, NOF eJenkem.

[0074] Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo da invenção que é peguilado (por exemplo, com um PEG descrito no presente documento), ligado através de um resíduo de aminoácido cisteína em ou cerca do aminoácido 226 na cadeia, por exemplo, aminoácido 226 da cadeia pesada (por numeração sequencial).

[0075] Em uma modalidade, a presente revelação fornece uma molécula de Fab'PEG que compreende um ou mais polímeros PEG, por exemplo, 1 ou 2 polímeros, tal como um polímero ou polímeros de 40 kDa. As moléculas de Fab'-PEG, de acordo com a presente revelação, podem ser particularmente vantajosas pelo fato de que têm uma meia-vida independente do fragmento Fc. Em um exemplo, a presente invenção fornece um método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão, em que o método compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de um açúcar e um ou mais aminoácidos, em que a proteína é um fragmento Fab' conjugado a um polímero, tal como PEG. Em outra modalidade da presente invenção, é fornecido um processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão que compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, um açúcar e um ou mais aminoácidos; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0076] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de um açúcar e um ou mais aminoácidos e em que a proteína é um fragmento Fab' conjugado a um polímero, tal como PEG, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 MM a 200 mM.

[0077] O anticorpo ou fragmento do mesmo compreendido na formulação proteica de acordo com os métodos, usos e processos da presente invenção é, de preferência, um anticorpo monoclonal humano ou humanizado, de preferência, um anticorpo monoclonal de comprimento completo humanizado.

[0078] As moléculas de anticorpo podem ser tipicamente produzidas cultivando- se uma célula hospedeira que contém um vetor que codifica a sequência de anticorpo sob condições adequadas para levar à expressão de proteína a partir de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção e isolando-se a molécula de anticorpo.

[0079] A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, em cujo caso apenas uma sequência de codificação de polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para produção de produtos que compreendem cadeias tanto pesadas quanto leves, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, em que o vetor inclui sequências que codifica polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[0080] Um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que pode ser fabricado de acordo com escaladas industriais pode ser produzido cultivando-se células hospedeiras eucarióticas transfectadas com um ou mais vetores de expressão que codificam o fragmento de anticorpo recombinante. As células hospedeiras eucarióticas são, de preferência, células de mamífero, mais preferencialmente, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0081] As células de mamífero podem ser cultivadas em qualquer meio que suportará seu crescimento e expressão da proteína recombinante, de preferência, o meio é um meio quimicamente definido que está isento de produtos derivados de animal, tal como soro animal e peptona. Há meios de cultura celular diferentes disponíveis para a pessoa versada na técnica que compreendem diferentes combinações de vitaminas, aminoácidos, hormônios, fatores de crescimento, íons, tampões, nucleosídeos, glicose ou uma fonte de energia equivalente, presentes em concentrações adequadas para possibilitar o crescimento celular e a produção de proteína. Componentes de meios de cultura celular adicionais podem estar incluídos no meio de cultura celular em concentrações adequadas em diferentes momentos durante um ciclo de cultura celular que poderiam ser conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0082] A cultura de células de mamífero pode ocorrer em qualquer recipiente adequado, tal como um frasco de agitação ou um biorreator, que pode ou não ser operado em um modo de batelada alimentada, dependendo da escala de produção necessária. Esses biorreatores podem ser um tanque agitado ou reatores pneumáticos. Vários biorreatores de grande escala estão disponíveis com uma capacidade de mais de 1.000 | a 50.000 |, de preferência, entre 5.000 | e 20.000 | ou até 10.000 |. Alternativamente, os biorreatores de escala menor, tal como entre 21 e

100 |, podem ser também usados para fabricar um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0083] Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é tipicamente encontrado no sobrenadante de uma cultura de células hospedeiras de mamífero, tipicamente uma cultura de células CHO. Para processos de cultura de CHO, em que a proteína de interesse, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é secretada no sobrenadante, em que o dito sobrenadante é coletado por métodos conhecidos na técnica, tipicamente por centrifugação.

[0084] Alternativamente, as células hospedeiras são células procarióticas, de preferência, bactérias gram-negativas. Mais preferencialmente, as células hospedeiras são células de E. coli. As células hospedeiras procarióticas para expressão de proteína são bem conhecidas na técnica (Terpe, K. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211 a 222 (2006)). As células hospedeiras são células recombinantes que foram geneticamente modificadas para produzir a proteína de interesse, tal como um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo. As células hospedeiras de E. coli recombinantes podem ser derivadas de qualquer cepa de E. coli adequada, incluindo de MC4100, TG1, TG2, DHBA4, DH5a, DH1, BL21, K12, XL1Blue e JM109. Um exemplo é a cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325), uma cepa hospedeira comumente usada para fermentações de proteína recombinante. Os fragmentos de anticorpo podem ser também produzidos cultivando-se cepas de E. coli modificadas, por exemplo, mutantes metabólicos ou cepas de E. coli com deficiência de protease.

[0085] Um fragmento de anticorpo é tipicamente encontrado no periplasma da célula hospedeira de E. coli ou no sobrenadante de cultura de células hospedeiras, dependendo da natureza da proteína, da escala de produção e da cepa de E. coli usada. Os métodos para alvejar proteínas a esses compartimentos são bem conhecidos na técnica (Makrides, S.C.; Microbiol Rev 60, 512 a 538 (1996)). Os exemplos de sequências de sinalização adequadas para direcionar proteínas ao periplasma de E. coli incluem as sequências de sinalização PhoA, OmMpA, OmpT, LamB e OmpF de E. coli. As proteínas podem ter como alvo o sobrenadante baseando-se nas trajetórias secretórias naturais ou pela indução de vazamento limitado da membrana externa para causar secreção de proteína, cujos exemplos são o uso do líder pelB, o líder de proteína A, a coexpressão de proteína de liberação de bacteriocina, a proteína de liberação de bacteriocina induzida por mitomicina juntamente com a adição de glicina ao meio de cultura e a coexpressão do gene Kkil para permeabilizaçção de membrana. Com máxima preferência, a proteína recombinante é expressa no periplasma da E. coli hospedeira.

[0086] A expressão da proteína recombinante nas células hospedeiras de E. coli pode estar também sob o controle de um sistema induzível, de modo que a expressão do anticorpo recombinante em E. coli esteja sob o controle de um promotor induzível. Muitos promotores induzíveis para uso em E. coli são bem conhecidos na técnica e, dependendo do promotor, a expressão da proteína recombinante pode ser induzida variando-se fatores, tal como temperatura ou a concentração de uma substância particular no meio de crescimento. Os exemplos de promotores induzíveis incluem os promotores lac, tac e trc de E.coli que são induzíveis com lactose ou o análogo de lactose não hidrolisável, isopropil-b-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e os promotores phoA, trp e araBAD que são induzidos por fosfato, triptofano e L-arabinose, respectivamente. A expressão pode ser induzida, por exemplo, pela adição de um indutor ou uma alteração em temperatura em que a indução é dependente de temperatura. Quando a indução de expressão de proteína recombinante é atingida pela adição de um indutor à cultura, o indutor pode ser adicionado por qualquer método adequado, dependendo do sistema de fermentação e do indutor, por exemplo, por adições de dose única ou múltipla ou por adição gradual de indutor através de uma alimentação. Será entendido que pode haver um atraso entre a adição do indutor e a indução real de expressão de proteína, por exemplo, quando o indutor é lactose, pode haver um atraso antes de a indução de expressão de proteína ocorrer enquanto qualquer fonte de carbono pré-existente é utilizada antes da lactose.

[0087] Culturas de células hospedeiras de E. coli (fermentações) podem ser cultivadas em qualquer meio que suportará o crescimento de E. coli e a expressão da proteína recombinante. O meio pode ser qualquer meio quimicamente definido, tal como, por exemplo, descrito em Durany O, et al. (2004) (Process Biochem 39, 1.677 a 1.684).

[0088] A cultura das células hospedeiras de E. coli pode ocorrer em qualquer recipiente adequado, tal como um frasco de agitação ou um fermentador, dependendo da escala de produção necessária. Vários fermentadores de grande escala estão disponíveis com uma capacidade de mais de 1.000 litros até cerca de 100.000 litros. De preferência, fermentadores de 1.000 a 50.000 litros são usados, mais preferencialmente, 1.000 a 25.000, 20.000, 15.000, 12.000 ou 10.000 litros. Fermentadores de escala menor podem ser também usados com uma capacidade entre 0,5 e 1.000 litros.

[0089] A fermentação de E. coli pode ser realizada em qualquer sistema adequado, por exemplo, modo contínuo, batelada ou batelada alimentada, dependendo da proteína e dos rendimentos necessários. O modo de batelada pode ser usado com adições em dose de nutrientes ou indutores quando necessário. Alternativamente, uma cultura de batelada alimentada pode ser usada e as culturas crescem em pré-indução em modo de batelada na taxa de crescimento máxima específica que pode ser prolongada com o uso dos nutrientes inicialmente presentes no fermentador e um ou mais regimes de alimentação de nutrientes usados para controlar a taxa de crescimento até a fermentação ser concluída. O modo de batelada alimentada pode também ser usado em pré-indução para controlar o metabolismo das células hospedeiras de E. coli e para permitir que densidades celulares mais altas sejam atingidas.

[0090] Se for desejado, as células hospedeiras podem ser submetidas à coleta do meio de fermentação, por exemplo, células hospedeiras podem ser coletadas da amostra por centrifugação, filtração ou por concentração. Nesse caso, o processo tipicamente compreende uma etapa de centrifugação e recuperação celular antes de extrair a proteína.

[0091] Para processos de fermentação de E. coli em que a proteína de interesse, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, é encontrada no espaço periplásmico da célula hospedeira, é necessário liberar a proteína da célula hospedeira. A liberação pode ser atingida por qualquer método adequado, tal como lise celular, por tratamento mecânico ou por pressão, tratamento de congelamento/descongelamento, choque osmótico, agentes de extração ou tratamento térmico. Tais métodos de extração para liberação de proteína são bem conhecidos na técnica. Portanto, em uma modalidade particular, o processo de produção compreende uma etapa de extração de proteína adicional antes da purificação de proteína.

[0092] Outros métodos para obter fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo humano in vitro são baseados em tecnologias de exibição, tal como tecnologia de exibição de fago ou exibição de ribossomo, em que são usadas bibliotecas de DNA recombinante que são geradas pelo menos em parte artificialmente ou de repertórios de gene de domínio variável de imunoglobulina (V) de doadores. Tecnologias de exibição de fago e ribossomo para gerar anticorpos humanos são bem conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos podem ser também gerados a partir de células B humanas isoladas que são imunizadas ex vivo com um antígeno de interesse e subsequentemente fundidos para gerar hibridomas que podem ser, então, triados para o anticorpo humano ideal.

[0093] O método, uso e processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão.

[0094] O processo de secagem por aspersão envolve a evaporação de umidificação após a atomização de uma alimentação de fluido em gotículas finas, resultando em um pó seco. Consistindo em três etapas básicas, a secagem por aspersão começa com dispersão de alimentação líquida em gás de aspersão (ar comprimido ou N2, 5 a 8 bar) por um bocal de dois fluidos. As gotículas pequenas são aspergidas através do bocal (atomização). As gotículas são, então, suspensas em um meio de secagem, usualmente consistindo em uma corrente de ar concorrente aquecida, permitindo evaporação e transferência do líquido. Na etapa final, os sólidos secos são separados da corrente de ar no ciclone. O pó seco é coletado e o ar é liberado para a atmosfera.

[0095] Os exemplos de secagem por aspersão de uma formulação proteica são descritos nos Exemplos doravante.

[0096] O anticorpo ou fragmento do mesmo compreendeu na formulação proteica de acordo com a presente invenção como um todo pode estar presente em qualquer concentração, tal como de 1 a 200 mg/ml, de preferência, de 20 a 150 mg/ml, ainda preferencialmente, de 30 a 100 mg/ml, tal como 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 mg/ml. Alternativamente, o um ou mais aminoácidos estão, de preferência, presentes na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma quantidade expressa em termos de peso por 100 ml (% em p/v). Em tal caso, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreendido na formulação proteica de acordo com a presente invenção como um todo pode estar presente em uma quantidade de 0,1 a 20% em p/v, de preferência, de 2,0 a 15% em p/v, ou ainda preferencialmente, de 3,0 a 10% em p/v, tal como 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10% em p/v.

[0097] A redução do tempo de reconstituição de uma formulação proteica que foi seca por aspersão é atingida incorporando-se secagem por aspersão anterior de açúcar e um ou mais aminoácidos.

[0098] No contexto desta invenção como um todo, o açúcar é, de preferência, selecionado dentre um dissacarídeo, mais preferencialmente, sacarose, trealose ou uma mistura dos mesmos. O açúcar está, de preferência, na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma quantidade de 1,0% a 20% em p/v, ou de 1,5% a 15% em p/v ou de 1,5% a 10% em p/v ou 1,5% a 4,5% em pív, tal como 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,5, 4,0, 4,1, 4,2 ou 4,5% em p/v, ou ainda preferencialmente, 2,5% a 4,2% em p/ív, tal como 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1 ou 4,2% em p/v. Alternativamente, o açúcar está, de preferência, presente na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma quantidade expressa em molaridade. Em tal caso, o açúcar está, de preferência, presente na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma quantidade de 30 a 600 mM, ou de 45 a 135 mM, tal como 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120 ou 135 mM ou, ainda preferencialmente, 70 mM a 125 MM, tal como 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 ou 125 mM. Sacarose ou trealose são igualmente açúcares de atuação para atingir o efeito técnico da presente invenção e sua presença individual em relação à mistura é preferencial.

[0099] No contexto desta invenção como um todo, o um ou mais aminoácidos podem estar presentes em sua forma D e/ou L, mas a forma L é típica. O um ou mais aminoácidos é, de preferência, glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L- treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L- arginina ou misturas dos mesmos. Embora não limitante, a inclusão de um aminoácido básico é preferencial, isto é, arginina, lisina e/ou histidina ou misturas dos mesmos. O aminoácido pode estar presente como qualquer sal adequado, por exemplo, um sal de cloridrato, tal como arginina-HCl, lisina-HCI ou histidina-HCl. O um ou mais aminoácidos está, de preferência, presente na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma quantidade de ou acima de 10 mM a 250 mM, de preferência, de ou acima de 50 mM a 200 mM ou de ou acima de 50 mM a 150 mM, tal como 50, 51, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 mM. Alternativamente, o um ou mais aminoácidos estão, de preferência, presentes na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma quantidade expressa em termos de peso por 100 ml (% em p/v). Por exemplo, pelo menos um aminoácido deve ser arginina-HCI (que tem um MW de 210,66 Da), a dita arginina-HCI estará presente em uma quantidade de ou acima de 0,2 a 5,25% em p/v ou de ou acima de 1,06 a 4,2% em pív, de preferência, de ou acima de 1,06 a 3,2% em pív, tal como 1,1, 1,15, 1,2, 1,5, 2,0, 2,2, 2,5, 3,0 ou 3,2% em p/v. Em outro exemplo, o pelo menos um aminoácido deve ser lisina-HCI (que tem um MW de 182,65 Da), a dita lisina-HCI estará presente em uma quantidade de ou acima de 0,1 a 4,5% em p/v ou de ou acima de 0,9 a 3,6% em p/v, de preferência, de ou acima de 0,9 a 2,7% em pív, tal como 0,9, 0,95, 1,0, 1,5, 1,8, 2,0, 2,5 ou 2,7% em p/v. Estará bem dentro das habilidades da pessoa versada converter a molaridade de interesse na % em p/v para qualquer aminoácido.

[0100] No contexto desta invenção como um todo, a molaridade do açúcar e um dentre o um ou mais aminoácidos pode ser acumulada. Em tal caso, o açúcar e o um ou mais aminoácidos estão, de preferência, presentes na formulação proteica a ser seca por aspersão em uma molaridade cumulativa (também alternativamente denominada quantidade cumulativa) de ou acima de 60 mM a 400 mM, de preferência,

de ou acima de 70 mM a 300 mM ou de ou acima de 70 mM a 260 mM, tal como 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou 260 mM.

[0101] Em uma modalidade, o método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O dito anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0102] Em outra modalidade, o processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L- alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L- glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0103] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/vy e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 mM a 200 mM. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O dito anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0104] Em outra modalidade, o processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, de 1% a 20% de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e de ou acima de 50 MM a 250 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L- treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L- histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0105] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O dito anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0106] Em ainda outra modalidade, o método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de 1,5% a 4,5% em p/v ou de 2,5% a 4,2% em p/v de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e de ou acima de 50 MM a 200 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L- alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L- aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O dito anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0107] Em outra modalidade, o processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, de 1,5% a 4,5% em p/v ou de 2,5% a 4,2% em p/v de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e de ou acima de 50 mM a 200 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L- prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0108] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O dito anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG. A presente invenção também fornece um método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão que compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de um açúcar, um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

[0109] Adicionalmente, a presente invenção fornece um processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção que compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, um açúcar, um ou mais aminoácidos e um tensoativo; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0110] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de um açúcar e um ou mais aminoácidos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20 % em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 mM a 200 mM.

[0111] Os tensoativos disponíveis para uso nos métodos de acordo com a invenção incluem, porém sem limitação, tensoativos não iônicos, tensoativos iônicos e tensoativos zwiteriônicos. Os tensoativos típicos para uso com a invenção incluem, porém sem limitação, éster de ácido graxo de sorbitano (por exemplo, monocaprilato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano), trioleato de sorbitano, ésteres de ácido graxo de glicerina (por exemplo, monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina, monoestearato de glicerina), ésteres de ácido graxo de poliglicerina (por exemplo, monoestearato de decaglicerila, diestearato de decaglicerila, monolinoleato de decaglicerila), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano (por exemplo, monolaurato de polioxietileno sorbitano, mono-oleato de polioxietileno sorbitano, monoestearato de polioxietileno sorbitano, monopalmitato de polioxietileno —sorbitano, trioleato de polioxietileno sorbitano, tristearato de polioxietileno), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitol (por exemplo, tetraestearato de polioxietileno sorbitol, tetraoleato de polioxietileno sorbitol), ésteres de ácido graxo de polioxietileno glicerina (por exemplo, monoestearato de polioxietileno glicerila), ésteres de ácido graxo de polietileno glicol (por exemplo, diestearato de polietileno glicol), éteres alquílicos de polioxietileno (por exemplo, éter laurílico de polioxietileno), éteres alquílicos de polioxietileno polioxipropileno (por exemplo, polioxietileno polioxipropileno glicol, éter propílico de polioxietileno polioxipropileno, éter cetílico de polioxietileno polioxipropileno), éteres alquilfenílicos de polioxietileno (por exemplo, éter nonilfenílico de polioxietileno), óleos de rícino hidrogenados de polioxietileno (por exemplo, óleo de rícino de polioxietileno, óleo de rícino de hidrogenado de polioxietileno), derivados de cera de abelha de polioxietileno (por exemplo, cera de abelha de polioxietileno sorbitol), derivados de polioxietileno lanolina (por exemplo, polioxietileno lanolina) e amidas de ácido graxo de polioxietileno (por exemplo, amida de ácido esterárico de polioxietileno); sulfatos de C10-C16 alquila (por exemplo, cetil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, oleil sulfato de sódio), sulfato de éster C10-C18 alquílico de polioxietileno com uma média de 2a 4 moles de unidades de óxido de etileno (por exemplo, lauril sulfato de polioxietileno de sódio) e sais de éster de sulfossuccinato de C1-C138 alquila (por exemplo, éster de lauril sulfossuccinato de sódio); e tensoativos naturais, tal como lecitina, glicerofosfolipídio, esfingofosfolipídios (por exemplo, esfingomielina) e ésteres de sacarose de C12-C1s ácidos graxos. Os tensoativos preferenciais são ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, por exemplo, polissorbato 20, 40, 60 ou 80, mais preferencialmente, polissorbato 20 ou polissorbato 80.

[0112] Os tensoativos estão, de modo geral, presentes em uma quantidade de 0,01% em p/v a 1,0% em pv, de preferência, de 0,02% em p/v a 0,1% em p/v ou, ainda preferencialmente, de 0,02% em p/v a 0,05% em p/v. De preferência, o tensoativo é polissorbato 20 ou polissorbato 80 e está presente em uma quantidade de 0,02% em p/v a 0,05% em p/v, tal como 0,02, 0,03, 0,04 ou 0,05% em p/v.

[0113] Em uma modalidade, o método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos e um tensoativo selecionado dentre um polissorbato. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo e/ou o polissorbato é polissorbato 20. O anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0114] Em outra modalidade, o processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L- alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L- glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos e um tensoativo de polissorbato; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0115] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 mM a 200 mM. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo e/ou o tensoativo de polissorbato é polissorbato

20. O anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0116] Em outra modalidade, o método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de 1% a 20% em p/v de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, de 50 mM a 250 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos e de 0,01% em p/v a 1,0% em p/v de polissorbato 20. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0117] Em outra modalidade, o processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, de 1% a 20% de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, de 10 mM a 250 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L- glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos e de 0,01% em p/v a 1,0% em p/v de polissorbato 20; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0118] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0119] Em ainda outra modalidade, o método para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de 1,5% a 4,5% em p/v ou de 2,5% a 4,2% em p/v de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, de ou acima de 50 mM a 200 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L- alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L- aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo e de 0,02% em p/v a 0,1% em p/v de polissorbato 20. O anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0120] Em outra modalidade, o processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção compreende as etapas de: a. Preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, de 1,5% a 4,5% em p/v ou de 2,5% a 4,2% em p/v de sacarose ou trealose ou uma mistura dos mesmos, de ou acima de 50 mM a 200 mM de um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L- prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L- asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos e de 0,02% em p/v a 0,1% em p/v de polissorbato 20; b. Secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a); c. Recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. Recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1;

[0121] em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de sacarose ou trealose e um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo de glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L- aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos. De preferência, a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O anticorpo ou um fragmento do mesmo é opcionalmente conjugado a um polímero, tal como PEG.

[0122] A formulação proteica a ser seca por aspersão tem um pH de 4,0 a 7,5, de preferência, de 4,0 a 6,0, mais preferencialmente, de 5,0 a 6,0, tal como 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 ou 6,0. Para manter o pH constante, a formulação proteica a ser seca por aspersão compreende um agente de tamponamento. Há muitos agentes de tamponamento usados no campo farmacêutico de formulações proteicas, tal como, porém sem limitação, citrato, fosfato, lactato, histidina, glutamato, maleato, tartrato ou succinato. Uma espécie de tampão preferencial é tipicamente selecionada dentre aquelas que têm um pKa que é próximo (unidade +/-1 pH) ao pH preferencial para estabilidade de proteína ideal a fim de manter alta capacidade de tamponamento e está associada à estabilidade demonstrada máxima observada para uma proteína particular quando colocada em uma série de espécies de tampão variadas. As faixas de pH adequadas de uma formulação são, de modo geral, escolhidas dentre aquelas associadas à estabilidade demonstrada máxima observada para uma proteína particular quando colocada em uma série de formulações de pH variadas. O agente de tamponamento pode ser também um aminoácido ou uma mistura de aminoácidos, de preferência, a uma concentração de 10 mM a 100 mM, 10 MM a 80 MM, 10 mM a 60 mM, 15 mM a 60 mM, de preferência, 10 mM a 50 mM, tal como as 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 MM. Como um exemplo não limitante, o tampão pode ser um tampão de histidina a uma concentração de 10 mM a 100 mM.

[0123] Excipientes adicionais podem ser usados nos métodos e processos de acordo com a presente invenção. Esses excipientes incluem, porém sem limitação, agentes acentuadores de viscosidade, agentes avolumadores, agentes solubilizantes, tais como monossacarídeos, por exemplo, frutose, maltose, galactose, glicose, D- manose, sorbose e similares; polissacarídeos, por exemplo, rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e similares; os polióis, tal como manitol, xilitol,

maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e similares; polietileno glicóis (por exemplo, PEG100, PEG300, PEG600, PEG1500, PEG2000, PEG3000, PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000 ou PEG20000), polivinilpirrolidona, N-óxido de trimetilamina, trimetilglicina ou combinações dos mesmos.

[0124] Antes de uma composição de formulação proteica seca por aspersão poder ser administrada a um paciente, a mesma precisa ser reconstituída com um solvente. Dentro da presente invenção, o solvente preferencial é um solvente aquoso, mais preferencialmente, o solvente aquoso é água, ainda mais preferencialmente, é água esterilizada.

[0125] Será entendido por um versado na técnica que a reconstituição da formulação proteica seca por aspersão pode ser realizada dias, semanas ou meses após a dita formulação proteica seca por aspersão de acordo com a invenção ter sido recuperada.

[0126] O volume de solvente usado para reconstituição determina a concentração da proteína, tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo, na formulação proteica seca por aspersão reconstituída resultante. A reconstituição com um volume menor de solvente que o volume pré-secagem por aspersão fornece uma formulação que é mais concentrada que antes da secagem por aspersão e vice-versa.

[0127] A razão de reconstituição (volume entre formulação proteica pré-seca por aspersão e solvente usado para reconstituir a formulação proteica seca por aspersão) pode variar de 1:0,1 a 10:1. Em uma modalidade preferencial, uma razão de cerca de 1:0,5 é aplicada de modo que a concentração resultante da proteína na formulação proteica seca por aspersão reconstituída seja duas vezes a concentração da formulação proteica antes da secagem por aspersão.

[0128] A presente invenção também fornece uma formulação proteica seca por aspersão obtida através do processo de acordo com a presente invenção. De preferência, tal formulação proteica seca por aspersão é uma formulação de anticorpo ou um fragmento de uma formulação de anticorpo.

[0129] Tal formulação proteica seca por aspersão pode ser armazenada, até a reconstituição ser necessária, em um recipiente adequado, tal como um frasco, uma ampola, um tubo, uma garrafa ou uma seringa (tal como uma seringa pré-preenchida). O recipiente pode ser parte de um kit de peças que compreende um ou mais recipientes que compreendem a formulação proteica seca por aspersão obtida de acordo com o processo da presente invenção, solventes adequados para reconstituir a formulação proteica seca por aspersão, dispositivos de entrega, tal como uma seringa, seringa pré-preenchida, um autoinjetor, um dispositivo sem agulha, um implante ou um emplastro, ou outros dispositivos para administração parental e instruções de uso.

[0130] A formulação proteica ou a formulação proteica seca por aspersão (alternativamente = denominada formulação proteica reconstituída uma vez reconstituída), obtida através dos processos de acordo com a presente invenção, é para uso em terapia ou diagnóstico.

[0131] As formulações proteicas reconstituídas obtidas através dos processos de acordo com a invenção são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme usado no presente documento, refere-se a uma quantidade de uma proteína (isto é, um anticorpo) necessário para tratar, aliviar ou prevenir uma doença, distúrbio ou afecção alvejada, ou para exibir um efeito terapêutico, farmacológico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura celular ou em modelos de animal, usualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo de animal pode ser também usado para determinar a faixa de concentração e a via de administração adequadas. Tais informações podem, então, ser usadas para determinar doses e vias úteis para administração em seres humanos.

[0132] A quantidade terapeuticamente eficaz exata para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado doentio, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso e gênero do indivíduo, da dieta, do tempo e da frequência de administração, da combinação (ou combinações) de fármacos, das sensibilidades de reação e da tolerância/resposta à terapia. Essa quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro do julgamento do clínico. De modo geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por exemplo, 0,1 mg/kg a 200 mg/kg ou 1 mg/kg a 100 mg/kg.

[0133] A dosagem adequada variará dependendo, por exemplo, do anticorpo particular a ser empregado, do indivíduo tratado, do modo de administração e da natureza e gravidade da afecção que é tratada. Em uma modalidade particular, a formulação proteica seca por aspersão reconstituída obtida através dos processos de acordo com a presente invenção é administrada por via subcutânea ou como uma injeção intramuscular.

[0134] A invenção será agora adicionalmente descrita por meio de exemplos com referências às modalidades ilustradas nos desenhos anexos.

EXEMPLOS Exemplo 1

[0135] Um anticorpo monocional IgG humanizado (mMAb1), que tem um ponto isoelétrico (pl) de cerca de 6,1, foi fornecido em uma solução aquosa a uma concentração de 160 mg/ml em histidina 30 mM, sorbitol 200 mM pH 5,6. Todos os excipientes foram obtidos junto à Sigma-Aldrich (Steinheim'Y, Alemanha).

[0136] Filtros centrífugos Amicon Ultra-15 30K (Millipore!VM) para volumes até 15 ml foram usados para realizar uma troca de tampão. Quatro ciclos de diluição de 2 a 3 vezes foram realizados, incluindo centrifugação repetida por 2 horas a 20 ºC (força centrífuga relativa = 4.000-9). Soluções de estoque foram preparadas em tampão de histidiha 15 mM a pH 5,6. Toda formulação compreendeu 2,5% de sacarose (equivalente a sacarose 73 mM). As concentrações dos aminoácidos usados nesse estudo são mostradas na Tabela 1. Tabela 1

Z (Adicionalmente a tampão e 2,5% de sacarose)

Z (Adicionalmente a tampão e 2,5% de sacarose) 7 75 7

[0137] Após troca de tampão, as formulações foram diluídas com as soluções de estoque correspondentes a uma concentração de mAb1 de 50 mg/ml antes da secagem por aspersão.

[0138] A secagem por aspersão foi realizada com um secador Búchi Mini Spray B-290, com ar de saída passando através de um desumificador (Buúchi Labortechnik, Flawil, Suíça). A temperatura de entrada foi definida em 120 ºC e a temperatura de saída estava entre 55 e 60 ºC. O aspirador foi ajustado em 100%, que corresponde a uma taxa de fluxo de ar de 35 m?/h. O ajuste de taxa para o fluxo de alimentação líquida foi 3 ml/min, de acordo com 10% de taxa de bomba, e 600 |/h para o fluxo de N2 de atomização. As formulações (9 a 15 ml) foram atomizadas com um bocal de dois fluidos (0,7 mm de diâmetro interno de orifício de líquido). Após a secagem por aspersão, os pós foram coletados através de um ciclone em um recipiente de vidro, transferidos em um frasco de plástico e armazenados no congelador a 2 a 8 ºC. Para cada formulação, quatro frascos foram preenchidos com pó seco por aspersão, contendo aproximadamente 100 mg de mAb1. Três frascos foram usados para avaliação de tempo de reconstituição.

[0139] As formulações secas por aspersão foram reconstituídas com 0,9 ml de água MÍilliQ a uma concentração de aproximadamente 100 mg/ml. O tempo para o pó se dissolver completamente foi visualmente observado e registrado. Uma tréplica de amostras foi reconstituída para investigar a variação em tempo de reconstituição para uma dada formulação. Mediante reconstituição, a concentração de mAb1 foi determinada não diluída por absorbância de UV a 280 nm com um SoloVPE (CE Technologies) conectada a um espectrofotômetro UV-visível Cary50Bio (Varian), com coeficiente de extinção e=1,33 ml.mg-1.cm-1.

[0140] As formulações secas por aspersão foram reconstituídas em triplicata, os desvios médio e padrão foram calculados para as diferentes formulações de mAb1 secas por aspersão. Todas as formulações mostraram tempo de reconstituição mais rápido em comparação com 2,5% de sacarose, exceto pelas formulações com leucina e fenilalanina (Figura 1). A formulação que compreende leucina mostrou uma aparência muito leitosa e a presença de uma alta quantidade de agregados (dados não mostrados) que afetaram o tempo de reconstituição. A formulação que compreende fenilalanina foi, em vez disso, transparente e mostrou pouca formação de partículas (sub)visíveis (dados não mostrados), mas ainda resultou em um tempo de reconstituição mais alto do que sacarose sozinha. Esses experimentos mostram que a combinação de um açúcar, tal como sacarose, em combinação com um aminoácido, tal como glicina, serina, cisteína, isoleucina, glutamina, alanina, arginina, prolina, lisina e triptofano, reduz o tempo de reconstituição de uma formulação de anticorpo seca por aspersão em combinação com sacarose sozinha. Exemplo 2

[0141] O efeito de um tensoativo sobre a redução de tempo de reconstituição foi analisada. Diafiltração de fluxo tangencial foi usada para trocar o tampão de armazenamento de mAb1 com uma solução de estoque aquosa (pH 5,0) contendo um açúcar (0,1 M) e lactato (0,05 M) ou L-arginina HCI (0,24 M), trealose (0,1 M)eL- histidina (0,05 M). Após a etapa de diafiltração, as soluções foram, ainda, concentradas e filtradas (Polietersulfona, 0,22 um, Merck Millipore, Bedford Massachusetts, EUA). A concentração das formulações de mAb1 foi medida com o uso de absorbância de UV a 280 nm com coeficiente de extinção 1,33 (mg/ml) cm? e ajustada a 100 mg/ml. As soluções de alimentação usada durante a triagem de formulação foram preparadas adicionando-se soluções filtradas (0,22 um) dos excipientes remanescentes. As soluções usadas durante os experimentos de triagem de parâmetros de processo SD (Tabela 2) foram adicionadas com polissorbato 20 e diluídas com água ultra-pura (Tipo 1 (o = 18,2 MOcm a 25 ºC) e filtradas (0,22 um)) até suas concentrações finais. A solução de estoque de hidróxido de sódio, monocloridrato de L-histidina mono-hidratado e polissorbato 20 foram obtidos junto à Merck (Darmstadt, Alemanha). Monocloridrato de L-arginina, monocloridrato de L- lisina e di-hidrato de D(+)-trealose foram obtidos junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA). D(+)-sacarose foi adquirida junto à Applichem (Darmstadt, Alemanha). L-histidina foi adquirida junto à Merck and Sigma-Aldrich para a formulação e formulações de triagem de parâmetros de processo de secagem por aspersão (SD), respectivamente. Soluções de estoque de ácido láctico e ácido clorídrico foram fornecidas pela Fisher scientific (Pittsburgh, Pensilvânia, EUA).

[0142] As soluções de alimentação para os experimentos de triagem de formulação foram secos por aspersão a uma concentração de mAb1 de 50 mg/ml e um volume de alimentação total de 15 ml, com o uso de um secador por aspersão Búchi B-290 Mini, equipado com um bocal de dois fluidos de 0,7 mm, ciclone de alto desempenho, vaso de coleta pequena e o desumidificador B-296 (Búchi Labortechnik AG, Flawil, Suíça). Os ajustes foram baseados em procedimento doméstico e mantidos constantes para todos os experimentos de triagem de formulação. A temperatura de ar de entrada foi ajustada em 120 ºC (a temperatura de saída foi monitorada e variou entre 55 a 60ºC), a taxa de fluxo de ar de entrada a 580 I/min, taxa de fluxo de Nº? de bocal a 10 I/min e a taxa de alimentação de solução foi ajustada em 3 ml/min.

[0143] O pó do vaso de coleta (coletor) foi, então, agrupado com o pó recuperado do ciclone e dispensado em frascos de injeção de vidro , tubulares, transparentes, Tipo 2 de 2 ml (Schott AG, Mainz, Alemanha) fechados com tamponadores de injeção de borracha FluroTec (West pharmaceutical services, West Whiteland Township, Pensilvania, EUA) e vedações de crimpagem de alumínio (Adelphi healthcare packaging, West Sussex, RU). Finalmente, as amostras foram armazenadas a 5 ºC ou a 40 ºC durante 4 semanas, seguido por armazenamento a 5 ºC antes da reconstituição, Tabela 2

; A Açúcar (50 |Tensoativo (2 mm Sais de Aminoácido mM MM; =1,7%) |mM) Sem sal de aminoácido e Sacarose Sem ; tensoativo HisHCI 120 mM Sacarose Sem tensoativo ArgHCI 120 mM Sacarose Sem ; tensoativo LysHCI 120 mM Sacarose Sem ; tensoativo HisHCI e ArgHiC!I 60 mM cada —|Sacarose Sem ; tensoativo e HisHCI e LysHCI 60 mM cada |Sacarose Sem ; tensoativo Sem 7 ArgHCIl e LysHCI 60 mM cada —|Sacarose t ; ensoativo HisHCl e ArgHCl e 40 mM cada |Sacarose Sem ; LysHCI tensoativo e Sem sal de aminoácido e Trealose Sem ; tensoativo — |HisHC 120 mM Trealose Sem tensoativo ArgHCI 120 mM Trealose Sem ; tensoativo 12 LysHCI 120 mM Trealose sem tensoativo HisHCI e ArgHiC!l 60 mM cada |Trealose Sem ; tensoativo 14 HisHCI e LysHCI 6OmMcada |Trealose Sem tensoativo Sem ArgHCl! e LysHCI 60 mM cada |Trealose t ; ensoativo HiIsHCI e ArgHCl e Sem LysHC! 40mMcada |Trealose tensoativo Sem sal de aminoácido po Sacarose Colissorbato

[0144] Os dados obtidos para os diferentes níveis de fator para o projeto de triagem de formulação foram usados para modelo de regressão de ajuste, contendo fatores nominais, para cada uma das respostas.

Como o software JMP representa variáveis nominais por termos cujas estimativas de parâmetro em zero cruzam todos os níveis, fatores nominais de nível n serão representados por n-1 variáveis indicadoras para processamento. Portanto, apenas estimativas de parâmetro n-1 poderiam ser obtidas diretamente para a triagem de formulação visto que as estimativas de parâmetro foram calculadas tomando-se a diferença entre a resposta média correspondente a um certo nível e a resposta média através de todos os níveis. As estimativas de parâmetro para o nível de fator final foram calculadas separadamente com base no conhecimento de que estimativas de parâmetro através de todos os níveis de uma variável nominal são restritas à soma em zero, isto é, o termo final foi calculado como a negativa da soma das estimativas através de outros níveis n-1. Isso implica uma dependência entre as estimativas de parâmetro expandidas (manual da JMP Genomics 8).

[0145] As formulações secas por aspersão foram reconstituídas em triplicata a 100 mg/ml, duas vezes a concentração pré-secagem por aspersão de mAb1 nas soluções de alimentação e as estimativas de parâmetro expandidas para o modelo resultante são mostradas na Figura 2. As estimativas de parâmetro foram significativas no nível 0,05 para o fator de tensoativo e os níveis de sal de aminoácido único de L-arginina HCI e L-histidina HCI.

[0146] A adição de polissorbato 20 em vez de um açúcar não resultou em uma redução do tempo de reconstituição. A Figura 3 mostra uma comparação dos tempos de reconstituição obtidos para formulações secas por aspersão de mAb1 que compreendem sacarose e glicina, sacarose e alanina, sacarose e arginina e sacarose e prolina do Exemplo 1 versus formulações secas por aspersão que compreendem polissorbato 20 em vez de sacarose. Conforme mostrado na Figura 3, os tempos de reconstituição foram, em cada caso, piores para os aminoácidos em combinação com o tensoativo na ausência de sacarose.

[0147] Similarmente, conforme mostrado nas Figuras 4, 5, 6 e 7, o tempo de reconstituição não foi reduzido para uma formulação seca por aspersão na presença de um tensoativo (polissorbato 20) e um açúcar (sacarose, conforme mostrado nas Figuras 4 e 5, ou trealose, conforme mostrado nas Figuras 6 e 7) na ausência de um ou mais aminoácidos, tal como L-arginina HCI, L-lisina HCl, L-histidina HCL ou combinações dos mesmos. Exemplo 3

[0148] Uma formulação que compreende 200 mg/ml de um anticorpo Fab'-PEG, que tem um pl de cerca de 7,0, teve o tampão trocado com o uso de filtro centrífugo Amicon Ulta-15-30K (Millipore), com várias formulações de aminoácidos (glicina, alanina, prolina, lisina, serina, glutamina e arginina) e sacarose em tampão de histidina MM pH 5,5.

[0149] A formulação preparada foi conforme mostrado na Tabela 3. Tabela 3 Aminoácido (adicionalmente a 2,5% de sacarose = 73 (%) mM mM) Glicina 0,25a2,5 34 a 333 “ "

F .

[0150] A secagem por aspersão das formulações foi realizada com um secador por aspersão Búchi B290 mini, acoplado a um desumidificador B-296 usado para pré- desumidificar o ar de secagem antes da secagem por aspersão (sem ajustes necessários). Uma formulação que compreende 50 mg/ml de um anticorpo Fab'-PEG foi seco por aspersão com o uso dos parâmetros de processo mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

Parâmetro Valor mê/h (ajuste: 100%) ar Tentrada de Ar 120 ºC 600 I/h de N2 (ajuste: máximo) Taxa de bomba —145 ml/h (ajuste 10%)

[0151] Os produtos secos por aspersão foram reconstituídos com 900 ul de água MIIliQ para obter uma concentração de 100 mg/ml. O tempo para o pó dissolver completamente em uma solução transparente foi medido. Em tO, uma tréplica de amostras foi reconstituída para avaliar a variação em tempo de reconstituição para uma dada formulação. A concentração de Fab'-PEG foi determinada por absorção de UV a 280 nm não diluído com SoloVPE (CE Technologies) conectado a um espectrofotômetro — UV-visível! Cary50Bio (Varian) ou após a diluição a aproximadamente 1 mg/ml com um leitor de placa Spectramax M5 (Molecular Devices), com e=0,86 ml.mg-1.cm-1.

[0152] Conforme mostrado na Figura 8, o tempo de reconstituição de uma formulação seca por aspersão de um anticorpo Fab'-PEG a 100 mg/ml na presença de 2,5% de sacarose e concentração crescente de glicina é reduzido em comparação com a mesma formulação sem glicina (cerca de 25 minutos).

[0153] Os outros aminoácidos testados também mostraram efeito superior em relação ao tempo de reconstituição de uma formulação que compreende um anticorpo Fab'-PEG em 2,5% de sacarose apenas. Conforme mostrado na Figura 9, a inclusão dos aminoácidos selecionados levou a uma redução em tempos de reconstituição em relação a uma sacarose sozinha (Glnh > Ala > Ser > Gly > Lys > Arg > Pro). Exemplo 4

[0154] O efeito de adição de aminoácidos e/ou açúcar sobre o tempo de reconstituição foi, ainda, analisado. mAb1 foi fornecido em uma solução aquosa a uma concentração de 50 mg/ml em histidina 15 mM, pH 5,6. Diferentes aminoácidos (Arg-

HCI; GIy-HCI, Lys-HCI e Pro-HCI) e um açúcar (trealose) foram, cada um, testados em diferentes molaridades (0, 50, 100 e 150 mM para os aminoácidos e 30, 75, 120 mM para o açúcar).

[0155] A formulação preparada foi conforme mostrado na Tabela 5. Tabela 5 Aminoácido |ffeca (Arg; Gly, Lys ou Pro; em mM) (Treaalose; mM) a

FE o 120 50 30 7 50 120 100 30 7 so 7

[0156] A secagem por aspersão das formulações, reconstituição e avaliação de tempo de reconstituição foram realizadas de acordo com o exemplo 3.

[0157] Conforme mostrado na Figura 10B, o tempo de reconstituição de uma formulação seca por aspersão de mAb1 a 50 mg/ml (100 mg/ml mediante reconstituição) na presença de um açúcar (no presente documento o dissacarídeo trealose, qualquer que seja sua molaridade) e a concentração crescente de arginina é reduzida em comparação com a mesma formulação sem arginina (cerca de 22 minutos). A Figura 10C destaca que esse efeito é adicionalmente aumentado quando tanto a molaridade de açúcar quanto de aminoácido é combinada (molaridade cumulativa), até atingir um platô (no presente documento, cerca de 200 mM de molaridade cumulativa).

[0158] Em comparação, a presença de glicihna não melhora o tempo de reconstituição para mAb1, seja qual for sua molaridade ou aquela do açúcar.

[0159] Os outros aminoácidos testados (prolina e lisina) também mostraram uma tendência a tempo de reconstituição reduzido quando é considerada a molaridade cumulativa (consultar as Figuras 12C e 13C), embora menos pronunciada do que com arginina. Exemplo 5

[0160] O efeito de adição de aminoácidos e açúcar sobre o tempo de reconstituição foi, ainda, analisado com mAb2 (um anticorpo monoclonal IgG humanizado, que tem um pl de cerca de 7,6), a 50 mg/ml (100 mg/ml mediante reconstituição). Diferentes aminoácidos (Arg-HCI; GIy-HCI, Lys-HCI e Pro-HCI) e um açúcar (trealose) foram testados em apenas uma molaridade (100 mM para os aminoácidos e 75 mM para o açúcar), em um tampão de histidina 15 mM, pH 5,6, na presença de 0,01% em p/v de PS20 (0,02% em p/v mediante reconstituição). À formulação de controle não continha nenhum aminoácido.

[0161] A secagem por aspersão das formulações, reconstituição e avaliação de tempo de reconstituição foram realizadas de acordo com o exemplo 3.

[0162] A Figura 14 enfatiza que, embora todos os aminoácidos testados possam reduzir o tempo de reconstituição em comparação com uma formulação que compreende apenas açúcar 75 mM, os melhores resultados são obtidos com arginina, seguida por prolina e lisina.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para reduzir o tempo de construção de uma formulação proteica seca por aspersão, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende uma proteína na presença de um açúcar e um ou mais aminoácidos, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 MM a 200 mM.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo,

3. Método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o açúcar é sacarose, trealose ou uma mistura dos mesmos.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o açúcar é sacarose ou trealose e o aminoácido é cloridrato de L-arginina, cloridrato de L-histidina, cloridrato de L-lisina ou misturas dos mesmos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende, ainda, um tensoativo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é um polissorbato, de preferência, polissorbato 20.

8. Processo para reduzir o tempo de reconstituição de uma formulação proteica seca por aspersão caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. preparar uma formulação proteica que compreende uma proteína, um açúcar e um ou mais aminoácidos; b. secar por aspersão a formulação proteica preparada na etapa a);

Cc. recuperar a formulação proteica seca por aspersão da etapa b); d. recuperar, de preferência com água, a formulação proteica seca por aspersão recuperada dentro de um tempo de reconstituição RT1; em que o tempo de reconstituição RT1 é menor que o tempo de reconstituição da mesma formulação proteica preparada na ausência de um açúcar e um ou mais aminoácidos, em que o açúcar é um dissacarídeo e está presente em uma quantidade de 1,0 a 20% em p/v e em que o um ou mais aminoácidos estão presentes em uma quantidade de ou acima de 50 mM a 200 mM.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

10. Processo, de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o açúcar é sacarose, trealose ou uma mistura dos mesmos.

11. Processo, de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é glicina, L-prolina, L-alanina, L-valina, L-serina, L-treonina, L-glutamina, L-asparagina, L-glutamato, L-aspartato, L-histidina, L-lisina, L-arginina ou misturas dos mesmos.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o açúcar é sacarose ou trealose e o aminoácido é cloridrato de L-arginina, cloridrato de L-histidina, cloridrato de L-lisina ou misturas dos mesmos.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende secar por aspersão uma formulação proteica que compreende, ainda, um tensoativo.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é um polissorbato, de preferência, polissorbato 20.

15. Formulação proteica caracterizada pelo fato de que é obtida através do processo, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 14.

16. Formulação proteica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia e diagnóstico.