CN107773755B - 抗表皮生长因子受体单克隆抗体的注射液制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及单克隆抗体的注射液制剂,具体涉及抗表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)单克隆抗体的注射液制剂。本发明还涉及所述注射液制剂用于制备预防和/或治疗与EGFR活性失调或紊乱相关的疾病(例如肿瘤和/或肿瘤转移、与血管生成有关的疾病、非特异性炎症)的药物的用途。本发明的抗EGFR单克隆抗体注射液制剂在振摇、25℃及40℃高温加速实验、2～8℃长期贮存稳定性等实验中均呈现出良好的稳定性，具有很好的应用前景。

Description

抗表皮生长因子受体单克隆抗体的注射液制剂

技术领域

本发明属于药物制剂领域,涉及单克隆抗体的注射液制剂，具体涉及抗表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)单克隆抗体的注射液制剂。本发明还涉及所述注射液制剂用于制备预防和/或治疗肿瘤和/或肿瘤转移的药物的用途。

背景技术

生物技术领域的发展使得在过去二十多年间可以通过重组DNA技术制备用于药学应用的一系列蛋白质。蛋白质药物如单克隆抗体可以用于如肿瘤治疗，例如用于特异性免疫治疗或肿瘤接种。治疗性蛋白质比常规有机和无机活性成分在结构上更大且更复杂，它们具有复杂的三维结构和许多官能团，而三维结构和官能团会影响蛋白质的生物学活性或者引起其它不希望的效应。在制备、保存和运输过程中，蛋白质药物暴露于许多外界因素中，这些外界因素可能会减弱蛋白质活性成分的稳定性，因此有必要采取一些措施来提高蛋白质的稳定性，例如通过添加某些药学上可接受的辅料。

现有文献中公开了治疗性蛋白质的许多制剂。但是，对于各种蛋白质活性成分的药物制剂的组合物的要求是完全不同的。并且，由于不同蛋白质的特定理化性质和降解反应，将已确定的蛋白质配方应用于新的蛋白质活性成分是不可能的。因此，这些新的活性成分的适当药物制剂对本领域技术人员来说仍然是一个严峻的挑战。

本发明的抗表皮生长因子受体单克隆抗体是重组人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体。在一个具体实施方案中，所述抗体对应于专利申请公开CN103772504A的公开的抗体BA03，其序列信息及制备方法参见该公开的实施例1-3。该抗体是在鼠源抗体C225(爱必妥，Erbitux或Cetuximab，ImClone(现在Eli Lilly)公司)的基础上，利用去免疫原性的抗体人源化技术，改变抗体的CDR区和/或框架区而获得的。与已有的抗表皮生长因子受体单克隆抗体相比，本发明的抗体具有更低的免疫原性和更高的生物学活性，例如更高的亲和性、ADCC活性和抗肿瘤活性等，因此具有良好的应用前景。

临床上，爱必妥制剂为无菌、澄明、无色液体，pH 7.0至7.4，含2mg/mL爱必妥抗体、8.48mg/mL氯化钠、1.88mg/mL磷酸氢二钠七水、0.41mg/mL磷酸二氢钠一水合物和注射用水，使用100mg/50mL和200mg/100mL两种制剂规格。爱必妥采用静脉内输注给药，初始给药按400mg/平方米、静脉滴注120分钟(最大输注速率10mg/min)，随后每周剂量按250mg/平方米、60分钟输注(最大输注速率10mg/min)，直至疾病进展或不能接受的毒性。爱必妥制剂由于体积较大(50mL和100mL两种制剂规格)，加之需要始终在2-8℃储藏、运输，直接导致包材、运输、储藏等成本的升高。尽管抗体BA03是在爱必妥抗体基础上经人源化改造而来，但抗体分子序列、生物学活性均有显著差异，加上爱必妥制剂的不足之处，亟待开发适合抗体BA03的药物制剂。

目前对抗体BA03的药物制剂特别是注射液制剂的研究，尚没有报道。

发明内容

本发明的发明人经过反复摸索和大量实验，制备得到了抗EGFR单克隆抗体的注射液制剂，其在振摇、25℃及40℃高温加速实验、2～8℃长期贮存等多项指标检测中均呈现出良好的稳定性，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及抗表皮生长因子受体单克隆抗体的注射液制剂，其含有pH调节剂，所述pH调节剂选自组氨酸及其盐、柠檬酸及其盐、或者磷酸及其盐，所述注射液制剂的pH值为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.0。

在本发明的一个具体实施方案中，所述pH调节剂为组氨酸及其盐，例如组氨酸和组氨酸盐酸盐。

在本发明的一个具体实施方案中，所述pH调节剂为柠檬酸及其盐，例如柠檬酸和柠檬酸钠。

在本发明的一个具体实施方案中，所述pH调节剂为磷酸及其盐，例如磷酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。

在本发明的一个具体实施方案中，所述注射液制剂的pH值为5.5。

在本发明的一个具体实施方案中，所述注射液制剂的pH值为6.0。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的pH调节剂的含量为约15～25mM，例如为18～22mM，例如为20mM。

在本发明的一个实施方案中，所述注射液制剂还含有蛋白类药物保护剂，优选地，所述蛋白类药物保护剂选自蔗糖、海藻糖和甘氨酸，进一步优选地，所述蔗糖和海藻糖的含量各自独立地为约0.5～7.0质量体积％，例如为1.0～5.0质量体积％，所述甘氨酸的含量为约1.5～2.5质量体积％，例如为2.0质量体积％。在本发明的上下文中，“质量体积％”(也称为“质量体积比”或“质量体积比浓度”)表示注射液制剂中的溶质(单位：“g”)与注射液制剂体积(单位：“mL”)之比，例如，蔗糖的含量为“0.5质量体积％”表示每100mL注射液制剂中含有蔗糖0.5g。

在本发明的一个具体实施方案中，所述蛋白类药物保护剂为蔗糖；在本发明的一个具体实施方案中，其浓度为1.0～5.0质量体积％。

在本发明的一个具体实施方案中，所述蛋白类药物保护剂为海藻糖，其浓度为5.0质量体积％。

在本发明的一个实施方案中，所述注射液制剂还含有增溶剂，优选地，所述增溶剂为吐温80(PS80)，进一步优选地，所述吐温80的含量为约0.01～0.07质量体积％，例如为0.02～0.05质量体积％。

在本发明的一个实施方案中，所述注射液制剂还含有等渗调节剂，优选地，所述等渗调节剂选自氯化钠和葡萄糖。

在本发明的一个实施方案中，所述等渗调节剂为氯化钠。

在本发明的一个实施方案中，所述氯化钠的含量为约0.2～1.0质量体积％，例如为0.3～0.87质量体积％，例如为0.3～0.8质量体积％。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的抗表皮生长因子受体单克隆抗体的含量为约5～20mg/mL，例如为8～15mg/mL，例如为10～12mg/mL。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的抗表皮生长因子受体单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的抗表皮生长因子受体单克隆抗体的重链恒定区为IgG1型，轻链恒定区为κ型。

在本发明的一个实施方案中，所述注射液制剂含有10mg/mL的抗表皮生长因子受体单克隆抗体，总浓度为20mM、pH6.0的柠檬酸和柠檬酸钠，5质量体积％的海藻糖，0.05质量体积％的吐温80和0.3质量体积％的NaCl。

在本发明的一个实施方案中，所述注射液制剂还含有其它药学上可接受的辅料，特别是注射液制剂可接受的辅料，例如抗氧化剂、防腐剂、助溶剂、吸附剂和络合剂等。

本发明第二方面涉及本发明第一方面任一项的注射液制剂用于制备预防和/或治疗与EGFR活性失调或紊乱相关的疾病(例如肿瘤和/或肿瘤转移、与血管生成有关的疾病、非特异性炎症)的药物的用途。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的肿瘤包括但不限于脑肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤(例如膀胱癌)、淋巴系统肿瘤(例如急性白血病、慢性白血病)、胃癌、喉癌、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、食管癌、甲状腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的非特异性炎症包括但不限于牛皮癣、类风湿性关节炎、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生、免疫疾病(如自身免疫性疾病和免疫缺陷性疾病)等。

发明的有益效果

本发明提供了一种优异的抗EGFR单克隆抗体注射液制剂。本发明的抗EGFR单克隆抗体注射液制剂具有良好的溶解性和稳定性，适于储藏和运输，显著降低了包材、运输和储藏等的成本，同时保持了抗体的生物学活性。特别地，本发明的抗EGFR单克隆抗体注射液制剂在振摇、25℃及40℃高温加速实验、2～8℃长期贮存稳定性等实验中均呈现出良好的稳定性，具有很好的应用前景。

附图说明

图1抗体BA03缓冲液筛选研究纯度线性图

A:40℃时各缓冲液之间SEC-纯度比较变化趋势图；

B:40℃时不同缓冲液SEC-纯度随时间变化的线性图；

C:40℃时各缓冲液之间CEX-纯度比较变化趋势图；

D:40℃时不同缓冲液CEX-纯度随时间变化的线性图。

图2振摇实验(25℃，100rpm)纯度线性图，A:SEC-振摇实验，不同处方SEC主峰纯度趋势图；B:CEX-振摇实验，不同处方CEX主峰纯度趋势图。

图3低温实验(2～8℃)纯度线性图，A:SEC-2～8℃考察条件下不同处方纯度线性趋势图；B:CEX-2～8℃考察条件下不同处方纯度线性趋势图。

图4 25℃室温加速试验纯度趋势图

A:25℃时各处方之间SEC纯度变化趋势图；

B:25℃时不同处方SEC-纯度随时间变化的线性图；

C:25℃时各处方之间CEX纯度变化趋势图；

D:25℃时不同处方CEX-纯度随时间变化的线性图。

图5抗体BA03处方开发40℃实验数据分析图

A:SEC-40℃各处方间主峰含量变化趋势图；

B:SEC-40℃各处方主峰含量随时间变化的线性图；

C:CEX-40℃各处方间主峰含量变化趋势图；

D:Binding_elisa-40℃各处方间结合活性变化趋势图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1抗体的制备

抗体的序列信息及制备方法可参考中国专利申请公开CN103772504A中公开的抗体BA03。具体如下：

抗体的重链可变区序列为:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYDVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARALDYYDYEFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)

抗体的轻链可变区序列为:

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQNNEWPTSFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：2)

(1)根据抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列,分别设计并合成编码重链和轻链可变区序列的PCR引物寡核苷酸片段，合成时引入需要的酶切位点。PCR引物寡核苷酸片段一般长约54个碱基，相邻寡核苷酸片段约有18个碱基重叠。混合同等量的各个PCR引物片段，进行重叠延伸PCR反应。

PCR反应体系：dNTPs 0.2μM(最终浓度)；每个PCR引物片段1μl；10×buffer 3μl；cloned pfu(Invitrogen)1μl；加水至30μl。

PCR反应条件：94℃3min→(94℃30s→56℃30s→72℃1min)×30→72℃10min

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段，经EcoRI酶切后，将抗体重链可变区序列和轻链可变区序列分别克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)载体中，转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen)后在LB/Kanamycin平板上进行筛选，取10个白色菌斑接种于含有Kanamycin的LB液体培养液中培养，用QIAGEN质粒提取试剂盒(QIAquick PCRpurification kit)提取质粒并进行测序，确定重链和轻链可变区序列。

(2)构建表达载体

从正常人B细胞分离RNA，用RT-PCR方法获得人IgG1重链恒定区IgG1Fc片段和轻链恒定区κ片段，在RT-PCR时引入需要的酶切位点，并将其预先构建到pcDNA3.1(Invitrogen)表达载体中，分别得到pcDNA3.1–Fc和pcDNA3.1-κ表达载体，经DH5细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。

抗体的重链可变区由Eco47III/NheI从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-Fc表达载体中，使重链可变区与恒定区连接。抗体的轻链可变区由AscI/BsiWI从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-κ表达载体中，使轻链可变区与恒定区连接(可参考文献Morrison SL.Cloning,expression,and modification ofantibody V regions.Curr Protoc Immunol.2002May；Chapter 2:Unit 2.12.)。再次经过DH5细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。测序结果与记录的抗体的编码序列一致，即分别得到抗体重链和轻链的表达载体。

(3)转染CHO细胞及特异抗体表达

细胞系及培养条件：CHO-S细胞(购自Invitrogen)培养条件为1×CD-CHO(购自GIBCO)，1×HT(购自GIBCO)，8mM谷氨酰胺(购自GIBCO)，培养于37℃,8％CO₂温箱。将步骤(2)获得的抗体重链表达载体和轻链表达载体共转染CHO-S细胞，采用DMRIE-C转染试剂盒(购自Invitrogen)，按照试剂盒说明书操作。转染后的第三天，细胞培养于上述的培养液并加有500μg/mL G418(购自GIBCO)和12.5μg/mL嘌呤霉素(购自Sigma)进行加压筛选。加压约14天后，挑选出的阳性多克隆培养于六孔板中，并用直接ELISA的方法(包被EGFR-Fc来自表达的293T细胞中)检测特异抗体表达量。挑选出表达率最高的阳性多克隆，大批量培养7天后，离心收集培养上清，采用蛋白A的亲和层析柱(购自GE)纯化后，透析至PBS,并经过0.22um膜过滤后，即得到纯化的抗体BA03，用于以下各实施例。

注射液各处方的配制包括以下方法:

将纯化的抗体BA03加入超滤管中，15℃3500rpm离心30min，浓缩至0.5mL，加入对应缓冲液10mL进行一次换液，15℃3500rpm离心直至超滤管中蛋白体积小于0.5mL。相同操作进行二次换液，最后用移液器吸取超滤管中的蛋白并转移至15mL离心管中。两次换液率约为99.8％。根据超滤换液后蛋白的浓度及体积计算加入辅料和缓冲液的量。按照计算量称量添加相应辅料和缓冲液，涡旋至辅料完全溶解。将加入辅料后的样品转入生物安全柜中，采用0.22μm一次性无菌过滤器过滤样品，并分装至2mL西林瓶中。

实施例2抗体BA03注射液制剂中缓冲液和pH组合的筛选

1)本实施例的目的是筛选适合抗体BA03的pH及缓冲系统。为此，我们设计7个缓冲体系，分别是20mM柠檬酸体系(含有总浓度为20mM的柠檬酸和柠檬酸钠)，pH为6.0；20mM组氨酸体系(含有总浓度为20mM的组氨酸和组氨酸盐酸盐)，pH为5.5，6.0，6.5；以及20mM磷酸体系(含有总浓度为20mM的磷酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)，pH为6.0，6.5，7.0。由于20mMpH6.5的组氨酸体系及20mM pH6.5的磷酸体系在超滤换液过程中出现沉淀，蛋白析出的现象，故加入0.05％PS80及0.87％氯化钠溶液使蛋白复溶。详见表1。在各缓冲体系中，抗体的浓度均为10mg/mL。

将超滤换液后的7个蛋白缓冲液过滤分装，取样检测，记为T0。40℃恒温保存箱放置2周，50℃放置1周，按表1所示时间点及检测项取样检测。选择较为稳定的蛋白缓冲液体系。

表1抗体BA03制剂缓冲液筛选实验方案

注：X＝外观,浓度,pH,渗透压,SEC-HPLC,CEX-HPLC,SDS-PAGE,DLS；

Y＝Binding_elisa；Z＝不溶性微粒,DSC

2)缓冲液筛选研究结果

在对7个缓冲液考察中，我们对比了各样品在加温(40℃和50℃)条件下，各质量参数在不同时间的变化，检测结果汇总在表2。

从表2可以看出，根据抗体BA03各缓冲液0天(T0)的检测结果，各项检测数据显示7个缓冲液在0天外观良好，为无色澄清液体，无明显可见异物。浓度为9.6～10.2mg/mL，DSC图谱显示双峰，数据显示Tm初始为61.6～64.4℃，其中H55，P60及P70的Tm相对较低，说明热稳定性相对较差(Tm越高，表明热稳定性越好，反之亦然)。DLS粒径为12.50～17.42nm，PdI为0.032～0.213，数据显示除H65粒径较大且不均一外，其余缓冲液均粒径较小，粒度均一，粒度分布图显示单峰，窄而尖，无蛋白降解和聚集。不溶性微粒结果显示10μm和25μm的颗粒较少，符合药典规定。纯度0天SEC主峰为98.9～99.5％，CEX主峰为47.1～48.8％，纯度结果显示各缓冲液在0天并无显著性差异。

缓冲液筛选高温加速实验数据(见表2)显示，样品在40℃放置1周后，外观良好，无色澄清，无明显可见异物。40℃放置2周后，各样品也为无色澄清液体，但是H60和P70出现颗粒悬浮物。50℃放置1周后，除H55外观为无色、微乳光液体外，其余缓冲液均出现沉淀、蛋白变性的现象。浊度比较为H55＜C60＜P60＜P65＝P70＝H60＝H65。高温加速试验中H55及C60浓度与0天相比并无显著性差异，其余缓冲液均有不同程度的浓度波动。DLS数据显示40℃放置两周后，粒径为13.26～23.43nm，PdI为0.058～0.305，除H60及H65粒径较大，粒度分布不均一，出现双峰外，其余缓冲液DLS结果良好。

由于50℃放置1周，除H55外其余均发生变性，对变性样品经过离心处理，导致纯度检测主峰含量偏高，故50℃放置一周的SEC及CEX数据仅供参考。由图1(A)(B)可知，高温加速试验各缓冲液与0天相比SEC纯度降低，40℃放置1周后，SEC主峰为93.7～97.2％，下降幅度为2.2～5.2％。40℃放置2周后，SEC主峰为88.3～95.9％，下降率为3.5～15.0％。高温加速试验各缓冲液SEC纯度排序为H55＝C60＞P65＞P60＞P70＞H60＞H65。

由图1(B)可知，40℃放置1周，各缓冲液CEX纯度为43.3～48.8％，除P70下降了4.1％外，其余缓冲液并无显著性差异。40℃放置2周，CEX纯度为35.2～48.4％，下降幅度为0～11.92％。高温加速实验各缓冲液CEX纯度排序H60＞P65＞C60＞P60＞H55＞P70＞H65。

3)缓冲液筛选研究评分和选择

为了便于比较不同缓冲液/pH体系在各质量参数的表现，我们采用评分制考察各缓冲液之间的稳定性，针对各考察点的检测项结果优劣规定3分为优秀，2.5分为良好，2分为合格，1分为较差，给出相应分数。同时，考虑到检测项的精密和数据的可靠性给出在总体考核中的不同权重。将各考察点的分数乘以检测项权重，再将所有检测项分数相加即得各处方总分。根据总分排名情况评选出最优处方。

表3抗体BA03缓冲液筛选评分表

抗体BA03缓冲液筛选评分情况见表3，缓冲液筛选表得到排名前三位的分别是20mM pH5.5组氨酸体系，20mM pH6.0柠檬酸体系，20mM pH6.0组氨酸体系。

3)缓冲液筛选小结

根据以上实验结果，高温加速实验数据显示H55及C60缓冲液表现出了良好的稳定性，故我们选择20mM pH5.5的组氨酸体系及20mM pH6.0的柠檬酸体系为后续处方筛选的pH和缓冲液体系。

实施例3抗体BA03注射液制剂中其它辅料的筛选

1)辅料筛选方案

根据缓冲体系筛选结果，我们选择了20mM组氨酸缓冲体系(总浓度为20mM的组氨酸和组氨酸盐酸盐，pH5.5)和20mM柠檬酸缓冲体系(总浓度为20mM的柠檬酸和柠檬酸钠，pH6.0)为处方设计的缓冲液体系。另外，在前期缓冲液筛选中没有考察低于pH5.5，在处方筛选中我们增加了pH分别为pH4.5和pH5.0的20mM组氨酸体系(总浓度为20mM的组氨酸和组氨酸盐酸盐)，以确保最后所选择的pH为最佳pH。辅料的选择和辅料添加的量和范围分别为0～5％蔗糖，0～5％海藻糖，0～0.05％的吐温80，0～0.87％氯化钠以及0～2％甘氨酸。辅料和处方筛选方案见表4，总计11个制剂处方。在所有制剂处方中，抗体的浓度均为10mg/mL。

表4抗体BA03注射液处方实验方案

2)辅料和处方筛选的考察条件和实施方案

将配制好的11个处方过滤分装，取样检测，记为T0。2～8℃，25℃以及40℃稳定性考察箱放置8周，25℃、100rpm振摇2周，按表5所示时间点及检测项取样检测。通过25℃振摇影响因素实验、25℃及40℃高温加速试验和2～8℃长期贮存稳定性筛选出较为稳定的制剂处方。由于样品量较少，F9处方配制过程中有损失，故F9处方只测T0,U-40-2W,U-40-4W及U-05-4W SEC结果。考察条件见表5。

表5抗体BA03注射液处方考察条件

注：X＝外观,浓度,pH,渗透压,SEC-HPLC,CEX-HPLC,SDS-PAGE,DSC(T0)

Y＝Binding_elisa Z＝不溶性微粒,DLS

3)制剂处方筛选结果

(1)25℃振摇实验结果与分析

注射液制剂的储存，运输，和临床使用过程中都会引起震荡，导致蛋白变性失活，考察注射液制剂的重要指标之一是考察其在震荡条件下的稳定性。我们将抗体BA03放在室温(25℃)条件下震荡(100rpm)两周，除观察外观和有无明显的沉淀外，检测其多聚体和碎片含量的变化，电荷分布的变化，可溶性和不溶性颗粒的变化，以及热稳定性的改变，从而评价不同处方在该条件下的表现。考察的方法包括SEC-HPLC，CEX-HPLC，HIAC(不溶性微粒)，DLS，和DSC，考察结果见表6。

根据表6的检测结果，各项检测数据显示11个处方0天(T0)外观良好，为无色澄清液体，无明显可见异物。浓度为9.9～10.8mg/mL，DSC显示双峰，Tm1为50.7～76.3℃，F7和F8处方热稳定性相对较高，渗透压为272～311mOsm/kg。DLS粒径较小，为12.73～16.62nm，除F3，F10及F11显示双峰外，其余处方粒度均一，粒度分布图显示单峰，窄而尖，PdI为0.058～0.194。不溶性微粒结果显示除F3 10μm以上颗粒较多(颗粒数为926粒/mL)外，其余处方10μm和25μm以上的颗粒较少，符合药典规定。纯度结果显示F1～F11 0天SEC主峰为97.6～98.1％，CEX主峰为46.5～47.5％，生物活性为97.1～105.2％。除F3(无吐温)处方在T0时颗粒较多，粒度分布不均一外，其余处方T0时外观色泽、含量、渗透压、不溶性微粒，DLS，纯度及生物活性等方面均无显著性差异。

样品在振摇2周后，F6(无糖类稳定剂)出现乳白色微浊液体外，其余均为无色澄清液体。不溶性微粒结果显示F3在振摇2周后，10μm和25μm以上的颗粒较多，分别为2481粒/mL和726粒/mL。

振摇实验各处方纯度线性趋势与0天相同。SEC-HPLC 11个处方主峰纯度为96.6～97.5％，与T0比较轻微下降，下降幅度0.6～1.3％。CEX-HPLC 11个处方主峰为48.2～49.2％，各个处方间没有差异。由图2(A)和(B)可知，11个处方振摇2周在纯度检测方面无显著性差异。与T0相比无明显聚集或降解。

上述结果说明，处方中无吐温和糖类稳定剂会影响制剂外观，并且振摇使溶液中颗粒数显著增加，不利于制剂在运输过程中的稳定性。

(2)2～8℃低温储存结果与分析

抗体BA03注射液拟定的长期储存温度为2-8℃。我们考察了不同处方在长期储存条件下的稳定性。将不同样品储存了0周(T0)、4周(4W)和8周(8W)后取样，检测其在不同时间点多聚体和碎片含量的变化，电荷分布的变化，可溶性和不溶性颗粒的变化，以及热稳定性等的改变，从而考察不同处方在该条件下的表现。考察的方法包括SEC-HPLC，CEX-HPLC，HIAC(不溶性微粒)，DLS，和DSC，考察结果见表7。

表7抗体BA03处方筛选低温(2～8℃-8W)实验数据

由表7可知，样品在2～8℃放置8W时外观良好，无色澄清，无颗粒。总体来说，11个处方外观色泽、含量等指标在低温条件下稳定性良好。图3显示了不同处方纯度线性趋势图。由图3(A)可见，纯度SEC-HPLC检测，与T0比较，11个处方主峰并无显著性差异。F1～F112～8℃放置8周的主峰含量为97.6～98.1％，下降幅度为0.1～0.5％，符合产品质量控制要求(本产品质量控制要求≥95.0％)。由图3(B)可见，CEX-HPLC检测，2～8℃放置8周后，与T0比较，11个处方主峰并无显著性变化，为47.0～48.1％，各处方之间没有明显差异。活性实验结果显示样品经低温2～8℃放置8周后，结合活性为93.3～110.9％，符合产品质量控制要求(本产品活性质量控制要求70～130％)。生物活性未发生明显改变。

上述结果说明，11种处方制品在低温条件下具有较为良好的稳定性。

(3)加速稳定性试验

在考察长期储存条件的稳定性同时，我们也考察了抗体BA03的加速稳定性，即在温度高于储存条件下的稳定性，考察的温度有25℃和40℃。加速稳定性有助于区分不同处方制剂，也可以用来预估产品在长期储存条件下的稳定性。另外，一定时间的室温稳定性(2周到1个月以上，25℃)有助于将来临床条件下的应用，减少对冷链的要求等。将放置在不同温度的样品储存了0周(T0)、4周(4W)和8周(8W)后取样，检测其在不同时间点多聚体和碎片含量的变化，电荷分布的变化，可溶性和不溶性颗粒的变化，以及热稳定性等的改变，从而考察不同处方在该条件下的表现。考察的方法包括SEC-HPLC，CEX-HPLC，HIAC(不溶性微粒)，DLS和DSC，考察结果见表8和9。

25℃室温加速试验结果与分析

25℃室温加速试验结果汇总于表8。结果显示，25℃放置8周后，11个处方浓度为10.4～11.2mg/mL，SEC主峰含量为95.9～97.1％，下降幅度为1.2～2.2％。由图4(A)(B)可知，25℃各处方间下降趋势与T0相同，F3纯度最高，F10纯度较低，其余处方无显著性差异。CEX主峰含量为47.1～48.1％，各处方间无明显区别。

上述结果说明，25℃放置8周，11个处方纯度均较高，其中F3纯度最高，F10纯度较低，其余处方无显著性差异。

表8抗体BA03处方筛选室温(25℃-8W)实验数据

高温40℃检测结果与分析

高温40℃检测结果见表9所列。由表9可知，样品在40℃放置2周时，除F6有细小颗粒外，其余处方外观良好，无色澄清，无颗粒。放置4周后，F2，F3，F7，F8，F10，F11外观无变化，F1外观由澄明转为微乳光，F4，F5，F6出现乳浊，其中F5乳浊程度较轻。放置8周后，只有F3及F8外观为无色澄清，无颗粒液体，F10为乳光液体，F7和F11微乳浊液体，其余处方均乳浊变性。将样品离心后取上清液浓度为5.7～10.5mg/mL，只有F3，F8及F7浓度无明显改变，故40℃8周样品只测定F3，F7及F8处方的SEC，CEX及生物活性。

由图5(A)(B)可见，纯度SEC-HPLC检测，与T0比较，11种制剂处方样品40℃高温放置两周后均呈下降趋势。40℃放置4周后F1～F11主峰为59.9～94.5％，下降幅度为3.6～38.1％。F3，F8及F11纯度较高。40℃放置8周后，F3、F7及F8主峰含量分别为91.9％，67.7％及85.5％，下降幅度为6.2％，30.4％及12.2％。

图5(C)可见纯度CEX-HPLC检测，40％放置4W与T0比较，主峰纯度降低，但各处方间无显著性差异，主峰含量为41.1～44.4％，下降幅度为2.53～7.16％。40％放置8W，F3，F7及F8主峰含量显著下降，分别为34.9％，32.5％及31.2％低于产品质量控制要求(本产品质量控制要求≥45％)

活性实验结果显示样品经40℃高温放置4周后，生物活性为47.3～101.8％，各处方的活性趋势与SEC趋势线相符，F3，F7及F8放置8周后活性为89.7％，55.2％及91.7％，F3及F8符合产品质量控制要求(本产品活性质量控制要求70～130％)。

上述结果说明本产品对40℃高温敏感很可能是由药品蛋白本身性质决定的。建议本产品低温贮存，在运输等过程中也应当避免置于大于40℃的高温。其中F3及F8 40℃放置8周稳定性相对较高。

表9抗体BA03处方筛选高温(40℃-8W)实验数据

(4)制剂处方筛选综合评估

在T0点时浓度为9.9～10.8mg/mL；DSC检测图谱显示双峰，Tm1为50.7～76.3℃，其中F7和F8处方热稳定性相对较高；各处方渗透压为272～311mOsm/kg；DLS粒径较小，为12.73～16.62nm，除F3，F10及F11显示双峰外，其余处方粒度均一，粒度分布图显示单峰，窄而尖，PdI为0.058～0.194；不溶性微粒结果显示除F3 10μm以上颗粒较多，颗粒数为926粒/mL外，其余处方10μm和25μm以上的颗粒较少，符合药典规定；纯度考察方面，SEC-HPLC纯度为97.6～98.1％，CEX-HPLC纯度为46.5～47.5％；生物活性为97.1～105.2％；除F3(无吐温)处方在T0时颗粒较多，粒度分布不均以外，其余处方T0时外观色泽、含量、渗透压、不溶性微粒，DLS，纯度及生物活性等方面均无显著性差异。

11个处方考察样品在25℃100rpm振摇2周后，F6(无糖类稳定剂)出现乳白色微浊液体外，其余均为无色澄清液体。不溶性微粒结果显示F3在振摇2周后，10μm和25μm以上的颗粒较多，分别为2481粒/mL和726粒/mL。11个处方外观色泽、含量、纯度方面均无显著性差异。SEC-HPLC主峰纯度为96.6～97.5％，下降幅度0.6～1.3％。CEX-HPLC主峰纯度为48.2～49.2％。25℃放置8周，11个处方外观色泽、含量无显著性差异。除F10外，SEC-HPLC纯度与T0相比无明显下降，主峰为95.9～97.1％，下降幅度约为1.0～2.2％。CEX主峰为47.1～48.1％，无明显改变。

样品在40℃放置2周时，除F6有细小颗粒外，其余处方外观良好，无色澄清，无颗粒。放置4周后，F2，F3，F7，F8，F10，F11外观无变化，F1外观由澄明转为微乳光，F4，F5，F6出现乳浊，其中F5乳浊程度较轻。放置8周后，只有F3及F8外观为无色澄清，无颗粒，F10为乳光液体，F7及F11微乳浊，其余处方均乳浊变性。将样品离心后取上清液测定浓度为5.7～10.5mg/mL，SEC及CEX纯度也明显下降，建议本产品低温贮存，在运输等过程中也应当避免置于大于40℃的高温。其中F3及F8℃放置8周稳定性相对较高。

11种处方制品在低温条件下具有较为良好的稳定性。2～8℃放置8周的主峰含量为97.6～98.1％，下降率为0.1～0.5％，2～8℃放置8周后，与T0比较，11个处方主峰并无显著性变化，为47.0～48.1％，各处方之间没有明显差异。生物活性为93.3～110.9％，各项指标均符合产品质量控制要求。

总体来说，11个处方Tm值、外观色泽、含量、渗透压、pH值、纯度、生物活性等检测项在低温、室温、振摇等考察条件下均较为稳定。高温40℃储存时原研处方F3及F8表现出相对较好的稳定性，其中F3SEC纯度最高，但是F3(无吐温)处方T0及25℃，100rpm振摇2周后，不溶性微粒颗粒数急剧升高。且DLS粒度分布检测呈现双峰，粒度分布不均一。

为了便于比较不同制剂处方在不同条件下各质量参数的表现，我们采用评分制考察各处方之间的稳定性，针对各考察点的检测项结果优劣规定3分为优秀，2.5分为良好，2分为合格，1分为较差，给出相应分数。同时，考虑到检测项的精密和数据的可靠性给出在总体考核中的不同权重。将各考察点的分数乘以检测项权重，再将所有检测项分数相加即得各处方总分。根据总分排名情况评选出最优处方。抗体BA03处方筛选评分情况见表10。

(5)小结

综合考虑各检测项，根据处方筛选评分规则，根据评分表得到抗体BA03注射液最优处方为F8：20mM柠檬酸体系(总浓度为20mM的柠檬酸和柠檬酸钠)，pH6.0，5％海藻糖，0.05％PS80，0.3％NaCl。

附：分析方法：

1)外观

将样品瓶擦拭干净，在暗室中置于澄明度检测仪下，调节光照度为1500LX，置样品于遮光板边缘处(25cm)手持供试品西林瓶颈部，分别在黑色和白色背景下用目检视颜色、澄明度、可见异物等。

2)浓度

待样品混合均匀后用移液枪吸取少量样品采用Nano Drop2000测样品在280nm波长的吸光度并计算浓度。消光系数为1.50。重复测定两次取其均值为最终结果。

3)pH

将pH计用3种标准液(pH分别为4.01,6.86,9.18)校准，要求校准斜率在95.0％～105.0％之间，校准零点漂移值在-60.0mv—+60.0mv之间。如校准数值不在以上范围内需重新校准。无菌分装100μl样品测定pH值。

4)渗透压

移液器吸取20μl样品及2份290mOsm参比液到样品管内，Advanced 2020Multi-Sample渗透压仪测定样品及参比液的渗透压值

5)SDS-PAGE

按照考马斯亮蓝染色法的标准操作规程分析蛋白纯度及相对分子量，样品测试前用超纯水或缓冲液稀释至2mg/mL。利用电泳仪(Invitrogen/Power Ease500 1314288-111)进行蛋白样品纯度的分离检测，对聚丙烯酰胺凝胶进行上样、电泳、清洗、染色、脱色、干胶等操作。用GS-800扫描仪对胶进行扫描分析。

6)DSC

通过差示热量扫描方法测试供试品Tm、Tm1及Tm2值。样品扫描前需用空白制剂稀释至1mg/mL。

7)动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)

分布系数(particle dispersion index,PDI)。样品无需稀释或过滤。生物安全柜中用移液器吸取40μl样品加入样品池中。启动Nano ZS粒度仪，用Zetasizer Nano软件分析处理数据。

8)不溶性微粒

不溶性微粒采用颗粒计数仪(HIAC,9703+)检测。在生物安全柜内将样品稀释10倍，静置脱气30min。启动HIAC,9703+颗粒计数仪，用PharmSpec软件分析处理数据。

9)SEC-HPLC

SEC-HPLC检测采用Agilent 1260高效液相色谱，TSK G3000SWXL凝胶柱(5um,7.8mm×300mm)。流动相组成为50mM PB+300mM NaCl，pH7.00±0.2，流速为1mL/min。检测波长为214nm，样品浓度稀释至1mg/mL，进样量10μl。

10)CEX-HPLC

CEX-HPLC检测采用Agilent 1260高效液相色谱，Dionex BioLC ProPac WCX-10色谱柱(10μm,4×250mm)。流动相组成为：A：20mM MES,pH 6.0±0.1；B：20mM MES,500mMNaCl,pH 6.0±0.1，流速为1mL/min。检测波长为280nm，样品浓度稀释至1mg/mL，进样量100ul。

11)结合活性

将抗体BA03-A用包被缓冲液稀释至4μg/mL,50μL/孔，2～8℃包被至高吸附的96孔板中，用300μL/孔，1％BSA对96孔板进行封闭，25℃孵育2±1h，反应结束后PBST洗板6次。后用1％BSA稀释参考品及供试品至1μg/mL，并以之为起始浓度进行2.4倍比稀释，共11个点及1个NSB(无样品对照)，稀释好的样品以100μL/孔加入封闭好的96孔板中，25℃孵育1.5±0.25h，反应结束后PBST洗板6次。将HRP标记羊抗人IgG Fab多抗用1％BSA稀释至1±0.1μg/mL，100μL/孔25℃孵育60±10min，反应结束后PBST洗板6次。将底物TMB、底物缓冲液及3％双氧水以50:950:1的比例进行混匀，100μL/孔25℃孵育30±5min，之后用1M H2SO4 100μL/孔终止反应，在酶标仪SpectraMax M2或相当的仪器上以450nm(参比波长650nm)读取并记录吸光值。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (13)

1.抗表皮生长因子受体单克隆抗体的注射液制剂，其含有：

(1)抗表皮生长因子受体单克隆抗体和pH调节剂，所述pH调节剂为柠檬酸及其盐，所述pH调节剂的含量为15～25mM，所述注射液制剂的pH值为5.5～6.0，其中所述抗表皮生长因子受体单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的序列如SEQ IDNO：2所示，并且所述抗表皮生长因子受体单克隆抗体的含量为5～20mg/mL；

(2)蛋白类药物保护剂，所述蛋白类药物保护剂为海藻糖，所述海藻糖的含量为0.5～7.0质量体积％；

(3)增溶剂，所述增溶剂为吐温80，并且所述吐温80的含量为0.01～0.07质量体积％；和

(4)等渗调节剂，所述等渗调节剂为氯化钠，所述氯化钠的含量为0.2～1.0质量体积％。

2.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中所述pH调节剂的含量为18～22mM。

3.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中所述pH调节剂的含量为20mM。

4.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中所述海藻糖的含量为1.0～5.0质量体积％。

5.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中吐温80的含量为0.02～0.05质量体积％。

6.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中所述氯化钠的含量为0.3～0.87质量体积％。

7.根据权利要求6所述的注射液制剂，其中所述氯化钠的含量为0.3～0.8质量体积％。

8.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中所述抗表皮生长因子受体单克隆抗体的含量为8～15mg/mL。

9.根据权利要求8所述的注射液制剂，其中所述抗表皮生长因子受体单克隆抗体的含量为10～12mg/mL。

10.根据权利要求1所述的注射液制剂，其中所述抗表皮生长因子受体单克隆抗体的重链恒定区为IgG1型，轻链恒定区为κ型。

11.根据权利要求1所述的注射液制剂，其含有10mg/mL的抗表皮生长因子受体单克隆抗体，pH6.0、总浓度为20mM的柠檬酸和柠檬酸钠，5质量体积％的海藻糖，0.05质量体积％的吐温80和0.3质量体积％的氯化钠。

12.根据权利要求1-11任一项所述的注射液制剂用于制备治疗与EGFR活性失调或紊乱相关的疾病的药物的用途，其中所述与EGFR活性失调或紊乱相关的疾病选自肿瘤和/或肿瘤转移、与血管生成有关的疾病或非特异性炎症，其中所述肿瘤选自脑肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、淋巴系统肿瘤、胃癌、喉癌、单核细胞白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、肝癌、肾癌、结肠直肠癌、食管癌、甲状腺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，所述非特异性炎症选自牛皮癣、类风湿性关节炎、接触性皮炎、迟发型过敏反应、子宫内膜异位、瘢痕形成、良性前列腺增生或免疫疾病。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述泌尿生殖系统肿瘤为膀胱癌，所述淋巴系统肿瘤选自急性白血病或慢性白血病，所述免疫疾病选自自身免疫性疾病或免疫缺陷性疾病。

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