TW202409078A

TW202409078A - 穩定之包含抗gremlin1抗體的藥物製劑

Info

Publication number: TW202409078A
Application number: TW112125006A
Authority: TW
Inventors: 凡張; 蒙盼; 雪明錢; 孫迪; 李紅俊; 郭歡歡
Original assignee: 中國大陸商蘇州創勝醫藥集團有限公司
Priority date: 2022-07-18
Filing date: 2023-07-05
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本申請案揭示了一種藥物製劑，其包含抗GREM1抗體、緩衝液、穩定劑、界面活性劑以及視情況選用之抗氧化劑。上述藥物製劑能夠在長期儲存、高溫下(例如，40℃)、室溫下、振盪及/或多次凍融後仍然保持抗GREM1抗體的穩定性。本申請案亦揭示了上述藥物製劑在預防及/或治療GREM1相關疾病，尤其癌症(例如，GREM1相關之癌症)，以及製備上述藥物製劑的方法。

Description

穩定之包含抗GREMLIN1抗體的藥物製劑

本申請案涉及藥物製劑，尤其涉及穩定之包含抗gremlin1 (GREM1)抗體的藥物製劑。本申請案亦涉及上述藥物製劑的製備方法及其用途。

Gremlin1 (GREM1)為具有富含半胱胺酸的區域及半胱胺酸結的高度保守的分泌性蛋白質( Wordinger等人, 《實驗眼科研究( Exp Eye Res.)》 2008 年 8 月 ; 87(2): 78-79.)。其為神經母細胞瘤家族中差異篩選選擇的基因異常(differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma；DAN)的成員，其充當骨形態生成蛋白(bone morphogenetic protein；BMP)的拮抗劑( Wordinger等人 ,《實驗眼科研究》 2008 年 8 月 ; 87(2): 78-79.)。GREM1可與BMP-2、BMP-4或BMP-7物理結合以形成異二聚體且防止BMP配位體與其對應BMP受體相互作用，且接著相繼地抑制BMP信號傳導路徑的活化。

GREM1與腎臟、肺、肝臟及視網膜的纖維化病灶以及若干腫瘤類型，包括胰臟癌、結腸癌、肺癌、神經膠質瘤、胃癌及前列腺癌密切相關( Sneddon等人 ,《美國國立科學院院刊( PNAS)》 2006 年 10 月 ; 103(40): 14842-14847)。舉例而言，異常GREM1上調賦予幹細胞生態棲位(stem cell niche)外部的結腸細胞具有致腫瘤性。亦發現腫瘤幹細胞高度表現且分泌GREM1以維持其在神經膠質瘤中的幹細胞性( Yan, K.等人 ,《基因發展( Genes Dev)》 28, 1085-1100 (2014))。因此，GREM1已在治療GREM1相關疾病中用作治療目標，例如，使用抗GREM1抗體。

由於抗體分子具有複雜的蛋白質多級結構，且易於物理上黏結在一起，從而可能導致不期望的免疫反應，或者可能在施用期間堵塞注射器或泵而對患者不安全，因此，抗體的液體製劑長期以來面臨的問題之一是凝聚所導致的穩定性問題。

因此，需要具有穩定性及質量一致性的抗GREM1抗體的藥物製劑。

本申請案提供了在長期儲存、高溫下(例如，40℃)、室溫下、振盪及/或多次凍融後仍然保持均一及穩定之包含抗GREM1抗體的穩定之藥物製劑。

在一方面，本申請案提供了一種藥物製劑，其包含抗GREM1抗體及緩衝液，且pH值為4.5-6.5。

在一方面，本申請案提供了一種藥物製劑，其包含抗GREM1抗體及緩衝液，其中，上述緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，且pH值為5.5-6.5。在一些實施方案，上述緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為5至50 mM，或10至30 mM。

在一些實施方案，上述藥物製劑亦包含穩定劑。

在一些實施方案，上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為0.5-20% (w/v)，或0.5至10 % (w/v)。

在一些實施方案，上述穩定劑選自：蔗糖、海藻糖、山梨醇、NaCl及鹽酸精胺酸。

在一些實施方案，上述穩定劑是蔗糖，且上述蔗糖在上述藥物製劑中之濃度為1-10% (w/v)。在另一些實施方案，上述穩定劑是鹽酸精胺酸，且上述鹽酸精胺酸在上述藥物製劑中之濃度為1-5% (w/v)。在另一些實施方案，上述穩定劑是海藻糖，且上述海藻糖在上述藥物製劑中之濃度為5-10% (w/v)。在另一些實施方案，上述穩定劑是山梨醇，且上述山梨醇在上述藥物製劑中之濃度為2-8% (w/v)。在另一些實施方案，上述穩定劑是NaCl，且上述NaCl在上述藥物製劑中之濃度為0.5-1.5% (w/v)。

在一些實施方案，上述藥物製劑亦包含界面活性劑。

在一些實施方案，上述界面活性劑在上述藥物製劑中之濃度為0.005% (w/v)至0.4% (w/v)，或0.01% (w/v)至0.2% (w/v)。

在一些實施方案，上述界面活性劑選自：聚山梨酯80及聚山梨酯20。

在一些實施方案，上述界面活性劑是聚山梨酯80，且上述聚山梨酯80及/或聚山梨酯20在上述藥物製劑中之濃度為0.025% (w/v) - 0.1% (w/v)。

在一些實施方案，上述藥物製劑亦包含抗氧化劑。

在一些實施方案，上述抗氧化劑在上述藥物製劑中之濃度為0.01-0.2% (w/v)，或0.02-0.06% (w/v)。

在一些實施方案，其中上述抗氧化劑選自：甲硫胺酸、半胱胺酸、麩胱甘肽、硫代硫酸鈉及抗壞血酸。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體在上述藥物製劑中之濃度為1至200 mg/ml。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體在上述藥物製劑中之濃度為20至40 mg/ml。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 1所示的重鏈CDR1 (HCDR1)、依SEQ ID NO: 2所示的HCDR2及依SEQ ID NO: 3所示的HCDR3，及/或依SEQ ID NO: 4所示的輕鏈CDR1 (LCDR1)、依SEQ ID NO: 5所示的LCDR2及依SEQ ID NO: 6所示的LCDR3。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 7所示的重鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3，及/或依SEQ ID NO: 8所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3。

在一些實施方案，上述抗GREM1抗體包含依 QX ₁QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGX ₂TFT (SEQ ID NO: 24)所示的重鏈構架區1 (HFR1)、依 WMX ₃QAPGQGLX ₄WMG (SEQ ID NO: 25)所示的HFR2、依 RFX ₅FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 26)所示的HFR3及依 WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO: 17)所示的HFR4，及/或依 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC(SEQ ID NO: 27)所示的輕鏈構架區1 (LFR1)、依 WLQQRPGQSPRRLIX ₆ (SEQ ID NO: 32)所示的LFR2、依 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO: 29)所示的LFR3及依 FGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 30)所示的LFR4，其中，X ₁是V或I；X ₂是Y或S；X ₃是R或K；X ₄是E或T；X ₅是V或A；X ₆是Y或S。

在一些實施方案，上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 14、18或21所示的重鏈構架區1 (HFR1)、依SEQ ID NO: 15、19或22所示的HFR2、依SEQ ID NO: 16、20或23所示的HFR3及依SEQ ID NO: 17所示的HFR4，及/或依SEQ ID NO: 27所示的輕鏈構架區1 (LFR1)、依SEQ ID NO: 28或31所示的LFR2、依SEQ ID NO: 29所示的LFR3及依SEQ ID NO: 30所示的LFR4。

在一些實施方案，上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 7、11或12所示的重鏈可變區的FR1、FR2、FR3及FR4，及/或依SEQ ID NO: 8或13所示的輕鏈可變區的FR1、FR2、FR3及FR4。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 7、11或12所示的重鏈可變區，及/或依SEQ ID NO: 8或13所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案，上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 33所示的重鏈恆定區，及/或依SEQ ID NO: 34所示的輕鏈恆定區。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 9所示的重鏈，及/或依SEQ ID NO: 10所示的輕鏈。

在一些實施方案，上述藥物製劑包含抗GREM1‎抗體、緩衝液、穩定劑及界面活性劑，其中上述緩衝液為組胺酸緩衝液，上述穩定劑為鹽酸精胺酸或蔗糖，上述界面活性劑為聚山梨酯80或聚山梨酯20，且pH值為約4.5-6.5。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體在上述藥物製劑中之濃度為20至40 mg/ml，上述組胺酸緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為10至30 mM，上述鹽酸精胺酸或蔗糖在上述藥物製劑中之濃度為1至10% (w/v)，及/或上述聚山梨酯80或聚山梨酯20在上述藥物製劑中之濃度為0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)。

在一些實施方案，上述抗GREM1‎抗體在上述藥物製劑中之濃度為約33 mg/ml，上述組胺酸緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為約20 mM，上述穩定劑為蔗糖，其在上述藥物製劑中之濃度為約8至9% (w/v)，上述界面活性劑為聚山梨酯80，其在上述藥物製劑中之濃度為約0.05% (w/v)，pH值為約5.5至6.5。

在一些實施方案，上述藥物製劑亦包含抗氧化劑，上述抗氧化劑為甲硫胺酸，上述甲硫胺酸在上述藥物製劑中之濃度為約0.04% (w/v)。

在一些實施方案，上述抗GREM1抗體在上述藥物製劑中之濃度為約33 mg/ml，上述組胺酸緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為約20 mM，上述穩定劑為蔗糖，且其在上述藥物製劑中之濃度為約8.2% (w/v)，上述界面活性劑為聚山梨酯80，且其在上述藥物製劑中之濃度為約0.05% (w/v)，上述甲硫胺酸在上述藥物製劑中之濃度為約0.04% (w/v)，pH值為約6.0。

在另一方面，本申請案提供依本文所述的藥物製劑在製備預防及/或治療GREM1‎相關疾病的藥物中的用途。

在一些實施方案，上述GREM1‎相關疾病選自由以下組成的組：癌症、纖維化疾病、血管生成、青光眼或視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)，或上述GREM1相關疾病與GREM1之含量增加相關，其選自由以下組成之群：硬皮病、特發性肺纖維化、糖尿病性腎病變、IgAN、狼瘡腎炎、奧爾波特症候群、神經膠質瘤、頭頸癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、乳癌及結腸直腸癌。

在一些實施方案，上述藥物亦包含第二治療劑，上述第二治療劑選自化療藥物(如順鉑)、放療、免疫治療藥物(如免疫檢查點調節劑，如PD-1/PD-L1軸抑制劑、TGF-β抑制劑)、抗血管生成藥物(如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的拮抗劑)、靶向治療藥物、細胞治療藥物、基因治療藥物、激素治療藥物、細胞介素等。

本申請案之依下描述僅旨在說明本申請案之各個實施方案。所描述之具體實施例不應被理解為是對本申請案之範圍的限制。在不偏離本申請案之精神及實質的情況下，熟悉此項技術者可進行各種等同替代、改變或變化，且應瞭解本文亦包括此等等同實施方案。本文引用的所有文獻，包括出版物、專利及專利申請案等以全文引用方式併入本文。在本發明中提及的方法包括兩個或更多個限定步驟的情況時，所定義之步驟可以任何順序或同時進行(除非上下文排除該可能性)，且該方法可包括一或多個其他步驟，上述步驟可在任何定義的步驟之前，在兩個定義的步驟之間或在所有定義的步驟之後執行(除非上下文排除了該可能性)。

本文中對「約」(某一數值或某一數值範圍)的提及包括針對該數值或該數值範圍本身的實施例，例如，「約X」包括「X」。一般而言，術語「約」係指某一變數的數值以及在變數的實驗誤差範圍內(例如，平均值的95%置信區間內)的所有數值或變數的10%以內的所有數值，以較大者為準。例如，「約X」包括「110% × X」、「109% × X」、「108% × X」、「107% × X」、「106% × X」、「105% × X」、「104% × X」、「103% × X」、「102% × X」、「101% × X」、「99% × X」、「98% × X」、「97% × X」、「96% × X」、「95% × X」、「94% × X」、「93% × X」、「92% × X」、「91% × X」或「90% × X」。

術語「至少」以及後跟的數字在本文中用於表示一個以該數字為開始的範圍的開端(其可為具有上限或沒有上限的範圍，此取決於所定義之變數)。例如，「至少1」表示1或者大於1。術語「至多」以及後跟的數字在本文中用於表示一個以該數字為結尾的範圍的結束(其可為以1或0作為下限的範圍，或沒有下限的範圍，此取決於所定義之變數)。例如，「至多4」表示4或者小於4，「至多40%」表示40%或者小於40%。在本發明中，當將範圍設為「(第一個數字)至(第二個數字)」或「(第一個數字)至(第二個數字)」時，此意味著上述範圍下限是第一個數字，其上限是第二個數字。例如，5至50 mg/mL係指下限為5 mg/mL，上限為50 mg/mL的範圍。術語「小於」或「大於」某一數值在本文中包括該數值。

依本文中所使用，術語「基準抗體」係指任何現有抗GREM1抗體(如6245P)，其係根據WO2014159010中所揭示之H4H6245P的序列產生，上述專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

抗體依本文所用，術語「抗體」包括與特異性抗原結合的任何免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、二價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。完整的抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈。每條重鏈由重鏈可變區(V _H)及重鏈第一、第二及第三恆定區(C _H1，C _H2，C _H3)組成，而每條輕鏈由輕鏈可變區(V _L)及輕鏈恆定區(C _L)組成。重鏈及輕鏈的V _H及V _L區中亦各有三個互補決定區(CDR)，三個CDR由被稱為構架區(FR)的連續部分間隔開，構架區比CDR更加高度保守且形成一個支架支撐超變環。一條重鏈及一條輕鏈的6個CDR共同構成抗體的抗原結合部位，決定抗體的特異性。本文所述的抗體亦包括完整的抗體的具有抗原結合功能的片段或衍生物，上述片段或衍生物與完整的抗體具有相同的抗原結合特異性，但是上述片段或衍生物與其特異性抗原結合的親和力可與完整的抗體相同或不同。

在一些實施方案中，本文所述的抗體包括抗原結合片段。抗原結合片段指保留與抗原特異性結合的能力的一或多種抗體片段。抗原結合片段之實例包括但不限於(i) Fab片段，其係指由V _L、V _H、C _L及C _H1域組成的單價片段；(ii) Fab'片段，其係指包含一部分鉸鏈區的Fab片段；(iii) F(ab') ₂片段，其係指包含由鉸鏈區的二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iv)由V _H及C _H1域組成的Fd片段；(v)由抗體單臂之V _L及V _H域組成的Fv片段，(vi) dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989)；PCT公開WO 90/05144)，其包含單個可變域；(vii)分離的CDR；(viii)單鏈Fv片段，其係指V _L及V _H域直接相連或經由一個肽鏈連接而形成的單價片段(Huston JS 等，Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988))。

在一些實施方案中，本文所述的抗體包括嵌合的抗體，其部分重鏈及/或輕鏈與由特定種類中衍生獲得的或屬於特定抗體類或亞類的抗體對應序列是相同或同源，而剩餘的鏈與由另一種類中衍生獲得的或屬於另一抗體類或亞類的抗體以及此抗體的片段的對應序列是相同或同源的，只要它們表現出所需的功能活性。

在一些實施方案中，本文所述的抗體包括人源化的抗體。非人體來源(如鼠源型)抗體的人源化形式是包含最少的由非人源型免疫球蛋白中獲得的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab') ₂或抗體的其他與抗原結合的序列)。在一些實例中，人源化抗體可為CDR嫁接的抗體，其中將人源型CDR的胺基酸序列引入非人源型V _H及V _L的胺基酸序列以替換相應的非人源型CDR的胺基酸序列。在另一些實例中，人源化抗體的大部分胺基酸序列可來自於人源型免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的CDR的胺基酸殘基被具有所需特異性、親合性及能力的非人源型(例如小鼠、大鼠、兔)抗體的CDR的胺基酸殘基替代。通常，人源化抗體基本上均包含至少一個，一般包括兩個可變域，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人源型免疫球蛋白的序列，且所有或基本上所有的構架(FR)區是人源型免疫球蛋白的序列。在一些實例中，人源型免疫球蛋白的可變區的構架區殘基被相應的非人源型殘基取代。此外，人源化抗體可包括在原始抗體及引入的CDR或構架區序列中均不存在的殘基。

本文所述的抗GREM1‎抗體係指能夠特異性結合gremlin1 (GREM1‎)蛋白的抗體，例如人源化14E3 (hzd 14E3)，例如Hu14E3_HaLa、Hu14E3_HaLb、Hu14E3_HbLa、Hu14E3_HbLb、Hu14E3_HcLa及Hu14E3_HcLb。

本文所述的「Hu14E3_HaLa」指人源化14E3，其包含具有依SEQ ID NO: 7所示的胺基酸的重鏈可變區及具有依SEQ ID NO: 8所示的胺基酸的輕鏈可變區。在一些實施方案中，本文所述的「Hu14E3_HaLa」亦包含具有依SEQ ID NO: 33所示的胺基酸的重鏈恆定區及具有依SEQ ID NO: 34所示的胺基酸的輕鏈恆定區。在一些實施方案中，本文所述的「Hu14E3_HaLa」包含具有依SEQ ID NO: 9所示的胺基酸的重鏈及具有依SEQ ID NO: 10所示的胺基酸的輕鏈。

本文所述的「Hu14E3_HaLb」指人源化14E3，其包含具有依SEQ ID NO: 7所示的胺基酸的重鏈可變區及具有依SEQ ID NO: 13所示的胺基酸的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所述的「Hu14E3_HaLb」亦包含具有依SEQ ID NO: 33所示的胺基酸的重鏈恆定區及具有依SEQ ID NO: 34所示的胺基酸的輕鏈恆定區。

本文所述的「Hu14E3_HbLa」指人源化14E3，其包含具有依SEQ ID NO: 11所示的胺基酸的重鏈可變區及具有依SEQ ID NO: 8所示的胺基酸的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所述的「Hu14E3_HbLa」亦包含具有依SEQ ID NO: 33所示的胺基酸的重鏈恆定區及具有依SEQ ID NO: 34所示的胺基酸的輕鏈恆定區。

本文所述的「Hu14E3_HbLb」指人源化14E3，其包含具有依SEQ ID NO: 11所示的胺基酸的重鏈可變區及具有依SEQ ID NO: 13所示的胺基酸的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所述的「Hu14E3_HbLb」亦包含具有依SEQ ID NO: 33所示的胺基酸的重鏈恆定區及具有依SEQ ID NO: 34所示的胺基酸的輕鏈恆定區。

本文所述的「Hu14E3_HcLa」指人源化14E3，其包含具有依SEQ ID NO: 12所示的胺基酸的重鏈可變區及具有依SEQ ID NO: 8所示的胺基酸的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所述的「Hu14E3_HcLa」亦包含具有依SEQ ID NO: 33所示的胺基酸的重鏈恆定區及具有依SEQ ID NO: 34所示的胺基酸的輕鏈恆定區。

本文所述的「Hu14E3_HcLb」指人源化14E3，其包含具有依SEQ ID NO: 12所示的胺基酸的重鏈可變區及具有依SEQ ID NO: 13所示的胺基酸的輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所述的「Hu14E3_HcLb」亦包含具有依SEQ ID NO: 33所示的胺基酸的重鏈恆定區及具有依SEQ ID NO: 34所示的胺基酸的輕鏈恆定區。

術語「gremlin1」或「GREM1」係指gremlin的變異體1，且涵蓋不同物種中，例如人類、小鼠、猴等中的gremlin1。GREM1為進化上保守的且人類gremlin1基因( hGREM1)已定位至染色體15q13-q15 (Topol L Z等人, (1997) 《分子細胞生物學( Mol. Cell Biol.)》, 17: 4801-4810；Topol L Z等人, 《細胞發生學細胞遺傳學( Cytogenet Cell Genet.)》, 89: 79-84)。hGREM1之胺基酸序列可經由基因庫資料庫以寄存編號NP-037504或Uniprot資料庫經由寄存編號O60565訪問。術語「人類gremlin1」及術語「hGREM1」在本發明中可互換使用。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括重鏈可變區V _H，上述重鏈可變區V _H具有依SEQ ID NO: 1所示的CDR1、依SEQ ID NO: 2所示的CDR2，及/或依SEQ ID NO: 3所示的CDR3。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括輕鏈可變區V _L，上述輕鏈可變區V _L具有依SEQ ID NO: 4所示的CDR1、依SEQ ID NO: 5所示的CDR2，及/或依SEQ ID NO: 6所示的CDR3。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括重鏈可變區V _H及輕鏈可變區V _L，上述重鏈可變區V _H包含具有依SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列的CDR1、具有依SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列的CDR2，及/或具有依SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列的CDR3，上述輕鏈可變區V _L包含具有依SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列的CDR1、具有依SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列的CDR2，及/或具有依SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列的CDR3。在一些實施方案中，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 1所示的重鏈CDR1 (HCDR1)、依SEQ ID NO: 2所示的HCDR2及依SEQ ID NO: 3所示的HCDR3，以及依SEQ ID NO: 4所示的輕鏈CDR1 (LCDR1)、依SEQ ID NO: 5所示的LCDR2及依SEQ ID NO: 6所示的LCDR3。在一些實施方案中，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 7所示的重鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3，以及依SEQ ID NO: 8所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1抗體包含依 QX ₁QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGX ₂TFT (SEQ ID NO: 24)所示的重鏈構架區1 (HFR1)、依 WMX ₃QAPGQGLX ₄WMG (SEQ ID NO: 25)所示的HFR2、依 RFX ₅FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 26)所示的HFR3及依 WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO: 17)所示的HFR4，以及依 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC(SEQ ID NO: 27)所示的輕鏈構架區1 (LFR1)、依 WLQQRPGQSPRRLIX ₆ (SEQ ID NO: 32)所示的LFR2、依 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO: 29)所示的LFR3及依 FGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 30)所示的LFR4，其中，X ₁是V或I；X ₂是Y或S；X ₃是R或K；X ₄是E或T；X ₅是V或A；X ₆是Y或S。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 14、18或21所示的重鏈構架區1 (HFR1)、依SEQ ID NO: 15、19或22所示的HFR2、依SEQ ID NO: 16、20或23所示的HFR3及依SEQ ID NO: 17所示的HFR4，以及依SEQ ID NO: 27所示的輕鏈構架區1 (LFR1)、依SEQ ID NO: 28或31所示的LFR2、依SEQ ID NO: 29所示的LFR3及依SEQ ID NO: 30所示的LFR4。在一些實施方案中，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 7、11或12所示的重鏈可變區的FR1、FR2及FR3，以及依SEQ ID NO: 8或13所示的輕鏈可變區的FR1、FR2及FR3。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括具有依SEQ ID NO: 7、11或12所示的胺基酸序列的重鏈可變區V _H。在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括具有依SEQ ID NO: 8或13所示的胺基酸序列的輕鏈可變區V _L。在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括具有依SEQ ID NO: 7、11或12所示的胺基酸序列的重鏈可變區V _H及具有依SEQ ID NO: 8或13所示的胺基酸序列的輕鏈可變區V _L。在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 7、11或12所示的重鏈可變區及依SEQ ID NO: 8或13所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體進一步包括免疫球蛋白恆定區。在一些實施例中，免疫球蛋白恆定區包括重鏈及/或輕鏈恆定區。上述重鏈恆定區包括C _H1、C _H1-C _H2或C _H1-C _H3區，上述輕鏈恆定區包括C _L區。在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 33所示的重鏈恆定區及依SEQ ID NO: 34所示的輕鏈恆定區。

在一些實施方案中，本文所述的抗GREM1‎抗體包括具有依SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列的重鏈及具有依SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，上述抗GREM1‎抗體包含依SEQ ID NO: 9所示的重鏈及依SEQ ID NO: 10所示的輕鏈。

下表A中列出了在一些實施方案中的例示性胺基酸序列：表A 例示性胺基酸序列

SEQ ID NO.	胺基酸序列	名稱
1	TYGMA	14E3-HCDR1
2	WINTLSGEPTYADDFKG	14E3-HCDR2
3	EPMDY	14E3-HCDR3
4	KSSQSLLDSDGKTYLS	14E3-LCDR1
5	LVSKLDS	14E3-LCDR2
6	WQGAHFPLT	14E3-LCDR3
7	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS	Hu14E3-Ha VH
11	QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS	Hu14E3-Hb VH
12	QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGSTFTTYGMAWMKQAPGQGLTWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSS	Hu14E3-Hc VH
8	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIK	Hu14E3-La VL
13	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIK	Hu14E3-Lb VL
9	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMAWMRQAPGQGLEWMGWINTLSGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREPMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	Hu14E3-Ha HC
10	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLSWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGAHFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	Hu14E3-La LC
33	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	人IgG1重鏈恆定區
34	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	人κ輕鏈恆定區

表B 例示性hzd 14E3 (hu14E3)的構架區(FR)胺基酸序列

		FR1	FR2	FR3	FR4
hu14E3	Ha	SEQ ID NO: 14Q V QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASG Y TFT	SEQ ID NO: 15WM R QAPGQGL E WMG	SEQ ID NO: 16RF V FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR	SEQ ID NO: 17WGQGTMVTVSS
Hb	SEQ ID NO: 18Q I QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASG Y TFT	SEQ ID NO: 19WM R QAPGQGL E WMG	SEQ ID NO: 20RF A FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR	SEQ ID NO: 17WGQGTMVTVSS
Hc	SEQ ID NO: 21Q I QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASG S TFT	SEQ ID NO: 22WM K QAPGQGL T WMG	SEQ ID NO: 23RF A FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR	SEQ ID NO: 17WGQGTMVTVSS
通式	SEQ ID NO: 24Q X ₁ QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASG X ₂ TFT	SEQ ID NO: 25WM X ₃ QAPGQGL X ₄ WMG	SEQ ID NO: 26RF X ₅ FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR
hu14E3	La	SEQ ID NO: 27DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC	SEQ ID NO: 28WLQQRPGQSPRRLI Y	SEQ ID NO: 29GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC	SEQ ID NO: 30FGQGTKLEIK
Lb	SEQ ID NO: 27DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC	SEQ ID NO: 31WLQQRPGQSPRRLI S	SEQ ID NO: 29GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC	SEQ ID NO: 30FGQGTKLEIK
通式		SEQ ID NO: 32WLQQRPGQSPRRLI X ₆

其中X ₁是V或I；X ₂是Y或S；X ₃是R或K；X ₄是E或T；X ₅是V或A；X ₆是Y或S。

本申請案涉及包含抗GREM1‎抗體(例如本申請案所述的抗GREM1‎抗體)的藥物製劑。在一些實施方案中，抗GREM1‎抗體在本申請案之藥物製劑中之濃度可為1至200 mg/ml、1至190 mg/ml、10至190 mg/ml、20至180 mg/ml、20至170 mg/ml、20至160 mg/ml、20至150 mg/ml、20至140 mg/ml、20至130 mg/ml、20至120 mg/ml、20至110 mg/ml、20至100 mg/ml、20至90 mg/ml、20至80 mg/ml、20至70 mg/ml、20至60 mg/ml、20至50 mg/ml、20至40 mg/ml‎、20至30 mg/ml。在一些實施方案中，抗GREM1‎抗體之濃度是在上述範圍內的任一濃度值。例如，根據需要，抗GREM1‎抗體在藥物製劑中之濃度可為至少5 mg/ml、至少10 mg/ml、至少20 mg/ml、至少30 mg/ml、至少40 mg/ml、至少50 mg/ml、至少60 mg/ml、至少70 mg/ml、至少80 mg/ml、至少90 mg/ml、至少100 mg/ml、至少110 mg/ml、至少120 mg/ml、至少130 mg/ml、至少140 mg/ml、至少150 mg/ml、至少160 mg/ml、至少170 mg/ml、至少180 mg/ml、至少190 mg/ml及/或至多200 mg/ml。在一些實施方案中，抗GREM1‎抗體在本申請案之藥物製劑中之濃度為21 mg/ml。在一些實施方案中，抗GREM1‎抗體在本申請案之藥物製劑中之濃度為33 mg/ml。

緩衝液術語「緩衝液」一般係指經由其酸鹼共軛組分的作用而耐受pH值變化的緩衝溶液。本文所用的「緩衝液」指已知可安全地應用於藥學製劑中、具有維持或控制該製劑之pH值在所需範圍的化合物溶液。能控制pH值在溫和酸性pH值至溫和鹼性pH值範圍(例如，pH 4.5至8.0)的可接受的緩衝液包括但不限於琥珀酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、精胺酸緩衝液、2-胺基-2-羥甲基-1,3-丙二醇(TRIS)緩衝液、組胺酸緩衝液等中的一種或任意幾種的組合。

可使用本領域已知的任何適當的方法製備上述製劑溶媒中的緩衝液。在一些實施方案中，可使用特定的酸性及鹼性離子對來製備本申請案所述的緩衝液。在一個示例中，可準確稱取酸性，鹼性離子對的輔料，加入約為目標緩衝液體積的60%的純水，混合均勻後，測定溶液之pH。若pH值偏離目標值，可使用相應的離子對調節pH。然後將溶液用純水稀釋至目標重量或目標體積。最後測定溶液的電導率，滲透壓及pH以進行驗證。

本申請案之穩定之藥物製劑可包含使得藥物製劑具有4.5至8.0之pH值，例如具有4.5至6.0、4.5至6.5、5.7至6.3、6.0至7.0或7.0至8.0之pH值的緩衝液。在一些實施方案中，合適的緩衝液使得本申請案之藥物製劑具有4.5至6.5之pH值。特別地，本申請案之藥物製劑之pH值可為依上列舉的彼等pH值範圍內的任一pH值，例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。

可將藥物製劑之pH值控制在所需範圍內的緩衝液之實例包括乙酸緩衝液、組胺酸緩衝液、檸檬酸緩衝液及其他有機酸或無機酸緩衝液。此等緩衝液可單獨使用1種，亦可將2種以上混合使用。較佳地，本申請案之藥物製劑包含乙酸緩衝液、組胺酸緩衝液。更佳地，本申請案之藥物製劑包含組胺酸緩衝液。

「乙酸緩衝液」為包含乙酸根離子的緩衝液。乙酸緩衝液可包含乙酸(例如冰乙酸)、乙酸鉀、乙酸鈉(例如三水合乙酸鈉)、等中之一或多者。在一些實施方案中，乙酸緩衝液為乙酸-乙酸鈉緩衝液，具體為冰乙酸-三水合乙酸鈉緩衝液。在一些實施方案中，乙酸緩衝液之pH值可為在4.5至6.5範圍內的任一pH值，例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。

「組胺酸緩衝液」為包含組胺酸根離子的緩衝液。組胺酸緩衝液可包括組胺酸、組胺酸鹽酸鹽(例如一水合組胺酸鹽酸鹽)、組胺酸乙酸鹽、組胺酸磷酸鹽、組胺酸硫酸鹽等中之一或多者。在一些實施方案中，組胺酸緩衝液可為組胺酸-組胺酸鹽酸鹽緩衝液。在一些實施方案中，組胺酸緩衝液之pH值可為在4.5至6.5範圍內的任一pH值，例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。

「檸檬酸緩衝液」為包含檸檬酸根離子的緩衝液。檸檬酸緩衝液可包含檸檬酸、檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸一鉀、檸檬酸二鉀、檸檬酸三鉀、氯化鈉、氯化鉀等中之一或多者。在一些實施方案中，檸檬酸緩衝液為檸檬酸-檸檬酸三鈉緩衝液。在一些實施方案中，檸檬酸緩衝液之pH值可為在4.5至6.5範圍內的任一pH值，例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，且本申請案之藥物製劑之pH值為4.5至6.5。不希望受到理論的束縛，但認為乙酸緩衝液及組胺酸緩衝液更加優於檸檬酸緩衝液。例如，當本申請案之藥物製劑的緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液時，上述藥物製劑中的抗GREM1‎抗體更為穩定(例如，在高溫下更為穩定)，抗體分子之間的作用力為排斥力而非吸引力，且具有更小的分子間聚集的風險。

本文所述的緩衝液之濃度指緩衝液中緩衝離子之濃度。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的合適的緩衝液之濃度可為5至50 mM、10至50 mM、10至40 mM、10至30 mM、10至20 mM。在一些實施方案中，緩衝液之濃度是在上述範圍內的任一濃度值。例如，根據需要，緩衝液之濃度可為5 mM、至少10 mM、至少15 mM、至少20 mM、至少25 mM、至少30 mM、至少35 mM、至少40 mM、至少45 mM及/或至多50 mM，取決於具體的緩衝液及藥物製劑所需的穩定性。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為乙酸緩衝液，例如乙酸-乙酸鈉緩衝液，其濃度可為5至50 mM。在一些實施方案中，上述乙酸緩衝液之濃度可為5至50 mM、5至45 mM、5至40 mM、5至35 mM、5至30 mM、5至25 mM、5至20 mM、5至15 mM、5至10 mM。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為組胺酸緩衝液，例如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液，其濃度可為5至50 mM。在一些實施方案中，組胺酸緩衝液之濃度可為5至50 mM、5至45 mM、5至40 mM、5至35 mM、5至30 mM、5至25 mM、5至20 mM、5至15 mM、5至10 mM。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，且濃度為5至50 mM。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，且濃度為10至30 mM。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，且濃度為約20 mM。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的緩衝液為組胺酸緩衝液，且濃度為約20 mM。

穩定劑依本文所用，術語「穩定劑」指如下一種試劑，當其與感興趣的蛋白質結合時，其能阻止或減少蛋白質的化學及/或物理不穩定性。穩定劑之實例包括糖類、醇類、酸類、鹽類、聚合物等。糖類之實例包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡聚糖等。醇類之實例包括山梨醇等。酸類之實例包括檸檬酸、磷酸、酒石酸、胺基酸、乙二胺四乙酸、鹽酸精胺酸等。鹽類之實例包括硫酸鈉、麩胺酸鈉、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀、乙酸銨等。聚合物之實例包括聚乙二醇、普維酮等。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑選自糖類。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑選自醇類。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑不是甘露醇。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑選自鹽類。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑選自胺基酸類。在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑選自蔗糖、海藻糖、山梨醇、NaCl、鹽酸精胺酸或它們的組合。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑在藥物製劑中之濃度可為0.5至20% (w/v)、0.5至10% (w/v)、0.5至5% (w/v)、0.5至2.5% (w/v)、0.5至1.5% (w/v)、1至15% (w/v)、1至10% (w/v)、1至5% (w/v)、5至10% (w/v)、2至8% (w/v)或2至5% (w/v)，取決於具體的穩定劑及藥物製劑所需的穩定性。在一些實施方案中，穩定劑之濃度是在上述範圍內的任一濃度值。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑為蔗糖，其在藥物製劑中之濃度可為‎0.5至20% (w/v)。在一些實施方案中，蔗糖在藥物製劑中之濃度可為‎0.5至10% (w/v)、1至10% (w/v)、10至20% (w/v)或5至15% (w/v)。在一些實施方案中，蔗糖在藥物製劑中之濃度為1至10% (w/v)。在一些實施方案中，蔗糖在藥物製劑中之濃度為約5% (w/v)。在一些實施方案中，蔗糖在藥物製劑中之濃度為約8.2% (w/v)。在一些實施方案中，蔗糖在藥物製劑中之濃度為約9% (w/v)。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑為鹽酸精胺酸，其在藥物製劑中之濃度可為0.5至20% (w/v)。在一些實施方案中，鹽酸精胺酸在藥物製劑中之濃度可為0.5至10% (w/v)、1至10% (w/v)、10至20% (w/v)或5至15% (w/v)。在一些實施方案中，鹽酸精胺酸在藥物製劑中之濃度為1至5% (w/v)。在一些實施方案中，鹽酸精胺酸在藥物製劑中之濃度為約3% (w/v)。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑為海藻糖，其在藥物製劑中之濃度可為‎0.5至20% (w/v)。在一些實施方案中，海藻糖在藥物製劑中之濃度可為0.5至10% (w/v)、1至10% (w/v)、10至20% (w/v)或5至15% (w/v)。在一些實施方案中，海藻糖在藥物製劑中之濃度為5至10% (w/v)。在一些實施方案中，海藻糖在藥物製劑中之濃度為約9% (w/v)。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑為山梨醇，其在藥物製劑中之濃度可為0.5至20% (w/v)。在一些實施方案中，山梨醇在藥物製劑中之濃度可為0.5至10% (w/v)、1至10% (w/v)、10至20% (w/v)或5至15% (w/v)。在一些實施方案中，山梨醇在藥物製劑中之濃度為2至8% (w/v)。在一些實施方案中，山梨醇在藥物製劑中之濃度為約5% (w/v)。

在一些實施方案中，用於本申請案之藥物製劑的穩定劑為NaCl，其在藥物製劑中之濃度可為‎0.5至20% (w/v)。在一些實施方案中，NaCl在藥物製劑中之濃度可為0.5至10% (w/v)、1至10% (w/v)、10至20% (w/v)或5至15% (w/v)。在一些實施方案中，NaCl在藥物製劑中之濃度為0.5至1.5% (w/v)。在一些實施方案中，NaCl在藥物製劑中之濃度為約0.9% (w/v)。

界面活性劑依本文所用，術語「界面活性劑」指同時具有親水性及疏水性兩性結構的有機物質，即它們包含具有相反溶解度趨勢的基團，例如，油溶性烴鏈及水溶性離子基團。取決於表面活性部分的電荷，界面活性劑可分為陰離子、陽離子及非離子界面活性劑。

界面活性劑之實例包括聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；以及聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇與丙二醇的共聚物(例如普朗尼克(Pluronics)、PF68等)。在一些實施方案中，本發明之藥物製劑的界面活性劑選自聚山梨酯20 (polysorbate 20、PS 20或吐溫20)、聚山梨酯80 (polysorbate 80、PS 80或吐溫80)或它們的組合。

在一些實施方案中，界面活性劑在本申請案之藥物製劑中之濃度可為0.005% (w/v) 至0.4% (w/v)、0.01% (w/v) 至0.3% (w/v)、0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)、0.025% (w/v) 至0.1% (w/v) 、0.05% (w/v) 至0.1% (w/v)或0.01% (w/v) 至0.1% (w/v)，取決於具體的界面活性劑及藥物製劑所需的穩定性。在一些實施方案中，界面活性劑之濃度是在上述範圍內的任一濃度值。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑的界面活性劑為聚山梨酯20及/或聚山梨酯80，其在藥物製劑中之濃度可為0.005% (w/v) 至0.4% (w/v)。在一些實施方案中，聚山梨酯20及/或聚山梨酯80在藥物製劑中之濃度可為0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)。在一些實施方案中，聚山梨酯20及/或聚山梨酯80在藥物製劑中之濃度可為0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)。在一些實施方案中，聚山梨酯20及/或聚山梨酯80在藥物製劑中之濃度可為約0.05% (w/v) 。在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑的界面活性劑為聚山梨酯80。在一些實施方案中，上述聚山梨酯80在藥物製劑中之濃度為約0.05% (w/v) 。

抗氧化劑依本文所用，術語「抗氧化劑」指能夠延緩氧對藥物製劑產生氧化作用的物質。自不同角度影響自氧化過程的各階段，起到還原劑、阻滯劑、協同劑及/或螯合劑的作用，而以提供電子或有效氫原子供游離基接受，使自氧化的鏈反應中斷，從而降低蛋白的氧化反應。抗氧化劑之實例包括但不限於甲硫胺酸、半胱胺酸、麩胱甘肽、硫代硫酸鈉、抗壞血酸。在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑的抗氧化劑可為甲硫胺酸。

在一些實施方案中，抗氧化劑在本申請案之藥物製劑中之濃度可為‎0.01 至0.2% (w/v)，0.01 至0.1% (w/v)或0.02 至0.06% (w/v)，取決於具體的抗氧化劑及藥物製劑所需的穩定性。在一些實施方案中，抗氧化劑之濃度是在上述範圍內的任一濃度值。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑的抗氧化劑為甲硫胺酸且其在上述藥物製劑中之濃度為0.01 至0.2% (w/v)。在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑的抗氧化劑為甲硫胺酸且其在上述藥物製劑中之濃度為0.02 至0.06% (w/v)。在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑的抗氧化劑為甲硫胺酸，且其在上述藥物製劑中之濃度為約0.04% (w/v)。

其他材料本申請案之藥物製劑亦可視情況包含其他材料，例如但不限於等滲劑、稀釋劑等。

術語「等滲劑」指可賦予藥物適宜的滲透張力避免水份跨越接觸該藥物的細胞膜淨流動的化合物或組合物。在一些實施方案中，本申請案之製劑具有與人血基本相同的滲透壓。合適的等滲劑包括但不限於：甘油，胺基酸或蛋白質(如甘胺酸或白蛋白)，鹽類(如氯化鈉)以及糖類(如葡萄糖、蔗糖及乳糖)。

術語「稀釋劑」是藥學上可接受的，且可用於稀釋本申請案之藥物製劑的試劑。典型的稀釋劑包括水、生理鹽水、注射用抑菌劑、pH緩衝液、無菌鹽溶液、林格溶液或葡萄糖液。

製劑在一方面，本申請案提供了包含抗GREM1‎抗體(例如本申請案提供的具體的抗GREM1‎抗體)、緩衝液、穩定劑及界面活性劑的穩定之藥物製劑。上述藥物製劑具有pH 4.5至8.0，在一些實施方案中為pH 4.5至6.5，以達到足夠的穩定性。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含： i) 抗GREM1‎抗體(例如本申請案提供的具體的抗GREM1‎抗體)，其濃度為1至200 mg/ml，較佳為20至40 mg/ml，更佳為約21 mg/ml或33 mg/ml；及/或 ii) 緩衝液，其較佳為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，更佳為組胺酸緩衝液，且上述緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為5至100 mmol/L，較佳為5至50 mmol/L或10至30 mmol/L，更佳為約20 mmol/L；及/或 iii) 穩定劑，其較佳為蔗糖、海藻糖、山梨醇、NaCl或鹽酸精胺酸， a) 較佳為蔗糖，且上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為‎0.5至20% (w/v)，較佳為‎1至10% (w/v)，更佳為‎約5% (w/v)，約8.2% (w/v)或約9% (w/v)，或者 b) ‎較佳為鹽酸精胺酸，且上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為‎0.5至20% (w/v)，較佳為‎1至5% (w/v)，更佳為‎約3% (w/v)，或者 c) 較佳為海藻糖，且上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為‎‎0.5至20% (w/v)，較佳為‎5至10% (w/v)，更佳為‎約9% (w/v)，或者 d) ‎較佳為山梨醇，且上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為‎‎0.5至20% (w/v)，較佳為‎2至8% (w/v)，更佳為‎約5% (w/v)，或者 e) ‎較佳為NaCl，且上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為‎‎0.5至20% (w/v)，較佳為‎0.5-1.5% (w/v)，更佳為‎約0.9% (w/v)；及/或 iv) 界面活性劑，其較佳為聚山梨酯80或聚山梨酯20，更佳為聚山梨酯80，且上述界面活性劑在上述藥物製劑中之濃度為0.005% (w/v) 至0.4% (w/v)，較佳為0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)，更佳為0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)，更佳為約0.05% (w/v)，及/或 v) 抗氧化劑，較佳為甲硫胺酸、半胱胺酸、麩胱甘肽、硫代硫酸鈉及抗壞血酸，更佳為甲硫胺酸，且上述抗氧化劑在上述藥物製劑中之濃度為0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)，較佳為0.02% (w/v) 至0.06% (w/v)，更佳為約0.04% (w/v)，及其中上述藥物製劑具有pH值為約4.5至6.5，較佳為約5.5至6.5。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約1至200 mg/ml的抗GREM1‎抗體(例如本申請案提供的具體的抗GREM1‎抗體)，濃度為約5至50 mmol/L的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，其中上述藥物製劑之pH為4.5至6.5。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約10至30 mg/ml的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約1至200 mg/ml的抗GREM1‎抗體(例如本申請案提供的具體的抗GREM1‎抗體)，濃度為約5至50 mmol/L的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，濃度為約‎0.5至20% (w/v)的蔗糖、海藻糖及山梨醇、NaCl或鹽酸精胺酸，其中上述藥物製劑之pH為4.5至6.5。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約10至30 mg/ml的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約1至10% (w/v)的蔗糖。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約1至5% (w/v)的鹽酸精胺酸。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約5至10% (w/v)的海藻糖。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約2至8% (w/v)的山梨醇。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約0.5至1.5% (w/v)的NaCl。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約1至200 mg/ml的抗GREM1‎抗體(例如本申請案提供的具體的抗GREM1‎抗體)，濃度為約5至50 mmol/L的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，濃度為約‎0.5至20% (w/v)的蔗糖、海藻糖、山梨醇、NaCl或鹽酸精胺酸，及濃度為約0.005% (w/v) 至0.4% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20，其中上述藥物製劑之pH為4.5至6.5。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約10至30 mg/ml的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約1至10% (w/v)的蔗糖、濃度為約1至5% (w/v)的鹽酸精胺酸、濃度為約5至10% (w/v)的海藻糖、濃度為約2至8% (w/v)的山梨醇或濃度為約0.5至1.5% (w/v)的NaCl。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約1至200 mg/ml的抗GREM1‎抗體(例如本申請案提供的具體的抗GREM1‎抗體)，濃度為約5至50 mmol/L的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，濃度為約‎0.5至20% (w/v)的蔗糖、海藻糖、山梨醇、NaCl或鹽酸精胺酸，濃度為約0.005% (w/v) 至0.4% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20，及濃度為約0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)的甲硫胺酸，其中上述藥物製劑之pH為4.5至6.5。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約10至30 mg/ml的乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約1至10% (w/v)的蔗糖、濃度為約1至5% (w/v)的鹽酸精胺酸、濃度為約5至10% (w/v)的海藻糖、濃度為約2至8% (w/v)的山梨醇或濃度為約0.5至1.5% (w/v)的NaCl。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20。在一些實施方案中，上述藥物製劑中包含濃度為約0.02% (w/v) 至0.06% (w/v)的甲硫胺酸。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體、濃度為約10至30 mmol/L的組胺酸緩衝液、濃度為約1至10% (w/v)的鹽酸精胺酸及濃度為約0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20，其中上述藥物製劑之pH為約4.5至6.5或約5.5至6.5。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體、濃度為約10至30 mmol/L的組胺酸緩衝液、濃度為約1至10% (w/v)的鹽酸精胺酸、濃度為約0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20及濃度為約0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)的甲硫胺酸，其中上述藥物製劑之pH為約4.5至6.5或約5.5至6.5。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體、濃度為約10至30 mmol/L的組胺酸緩衝液、濃度為約1至10% (w/v)的蔗糖及濃度為約0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20，其中上述藥物製劑之pH為約4.5至6.5或約5.5至6.5。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約20至40 mg/ml的抗GREM1‎抗體、濃度為約10至30 mmol/L的組胺酸緩衝液、濃度為約1至10% (w/v)的蔗糖、濃度為約0.025% (w/v) 至0.1% (w/v)的聚山梨酯80或聚山梨酯20及濃度為約0.01% (w/v) 至0.2% (w/v)的甲硫胺酸，其中上述藥物製劑之pH為約4.5至6.5或約5.5至6.5。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約33 mg/ml的抗GREM1‎抗體、濃度為約20 mmol/L的組胺酸緩衝液、濃度為約8至9% (w/v)的蔗糖及濃度為約0.05%的聚山梨酯80，其中上述藥物製劑之pH為約5.5至6.5。

在一些實施方案中，本申請案之藥物製劑包含濃度為約33 mg/ml的抗GREM1‎抗體、濃度為約20 mmol/L的組胺酸緩衝液、濃度為約8.2% (w/v)的蔗糖、濃度為約0.05% (w/v)的聚山梨酯80及濃度為約0.04% (w/v)的甲硫胺酸，其中上述藥物製劑之pH為約6.0。

抗體分子的化學降解、或凝聚形成聚合物，或者抗體分子的脫糖基、糖基化修飾、氧化或可能導致單體蛋白質至少一種功能活性降低的其他結構性修飾等，均可能引起抗體製劑的不穩定。對於包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑而言，在藥物製劑儲存過程中，抗GREM1‎抗體可能發生化學降解，從而導致抗體之濃度下降；抗GREM1‎抗體亦可能凝聚而形成有時不可溶的以含有多個抗體分子的多聚分子形式存在的聚合物，從而導致含單個抗體分子的單體含量減少。因而，聚合物抗體之含量增加，將導致單體抗體的純度下降。此外，由於不溶性聚合物的形成，藥物製劑的濁度可能增大。

在一些實施方案中，本申請案之包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑可在長期儲存、高溫下、室溫下、振盪及/或多次凍融後仍然保持穩定性，其中抗GREM1‎抗體的物理及/或化學穩定性及/或功能活性等隨時間變化而保持相對恆定。在一些實施方案中，抗體蛋白濃度、蛋白純度、蛋白活性、製劑之pH值、製劑的滲透壓、製劑之外觀、製劑中之不溶性微粒等可作為藥物製劑的穩定性的標誌。本領域中已有多種測定蛋白質穩定性的分析技術，此在 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee編，Marcel Dekker公司，紐約，紐約出版社(1991)及Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90 (1993)中有所綜述。

在一些實施方案中，藥物製劑的穩定性可經由本領域已知的方法在選定之條件及時間內進行量測。示例的方法包括，但不限於，動態光散射(DLS)、分子排阻層析(SEC)、陽離子交換層析(CEX)、非還原性毛細管電泳(NR CE-SDS)、pH值量測、蛋白濃度(Protein Conc)量測、目檢(Visual Inspection)及微流成像(MFI)。

依本申請案實施例所示，本申請案之包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑在目檢中顯示出高穩定性，例如，長期儲存下的高穩定性、高溫下(例如，40℃)或室溫下的高穩定性、振盪後之高穩定性、凍融後之高穩定性。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指藥物製劑在DLS測試中，蛋白粒徑在貯藏過程中沒有明顯變化，KD呈正值，即單抗分子間的作用力為排斥力，單抗分子沒有發生聚集。依本申請案實施例所示，本申請案之包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑在DLS測試中顯示出高穩定性，例如，長期儲存下的高穩定性、高溫下(例如，40℃)或室溫下的高穩定性、振盪後之高穩定性、凍融後之高穩定性。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指藥物製劑在SEC測試中，藥物製劑在貯藏過程中僅有少量的蛋白質降解，且高聚體、低聚體增加速率緩慢。依本申請案實施例所示，本申請案之包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑在SEC測試中顯示出高穩定性，例如，長期儲存下的高穩定性、高溫下(例如，40℃)或室溫下的高穩定性、振盪後之高穩定性、凍融後之高穩定性。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指藥物製劑在CEX測試中，藥物製劑的電荷異質性在貯藏過程中沒有發生明顯變化，酸性峰、鹼性峰的分離程度沒有發生明顯變化。依本申請案實施例所示，本申請案之包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑在CEX測試中顯示出高穩定性，例如，長期儲存下的高穩定性、高溫下(例如，40℃)的高穩定性、凍融後之高穩定性。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指藥物製劑在NR CE-SDS測試中，藥物製劑在貯藏過程中僅有少量的蛋白質降解，且高聚體、低聚體增加速率緩慢。依本申請案實施例所示，本申請案之包含抗GREM1‎抗體的藥物製劑在NR CE-SDS測試中顯示出高穩定性，例如，長期儲存下的高穩定性、高溫下(例如，40℃)或室溫下的高穩定性、振盪後之高穩定性、凍融後之高穩定性。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指當藥物製劑在目檢測試中，藥物製劑之外觀在貯藏過程中沒有觀測到明顯變化，仍呈現無色澄明液體。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指當藥物製劑在MFI測試中，藥物製劑在貯藏過程中不同粒徑區間的亞可見微粒無明顯的增加趨勢。

在一些實施方案中，穩定之藥物製劑係指當藥物製劑在蛋白濃度測試中，藥物製劑中的蛋白濃度的變化不超過+/-20%、不超過+/-19%、不超過+/-18%、不超過+/-17%、不超過+/-16%、不超過+/-15%、不超過+/-14%、不超過+/-13%、不超過+/-12%、不超過+/-11%、不超過+/-10%、不超過+/-9%、不超過+/-8%、不超過+/-7%、不超過+/-6%、不超過+/-5%、不超過+/-4%、不超過+/-3%、不超過+/-2%、不超過+/-1%、或者不超過+/-0.5%，其中蛋白濃度可根據《中國藥典》2010年版，三部，通則0401，經由紫外-可見光分光光度法測定。

製劑製備本申請案提供的藥物製劑可由以下方法製備，其包括： 1)提供製劑溶媒及抗GREM1‎抗體原液，其中上述製劑溶媒包含緩衝液； 2)使用上述製劑溶媒對上述抗GREM1‎抗體原液進行換液，從而得到依本文所述的藥物製劑。在一些實施方案中，上述換液為緩衝液置換，例如經由透析法進行緩衝液置換。在一些實施方案中，上述換液為過濾換液。在一些實施方案中，上述過濾為無菌過濾，及/或熟悉此項技術者所知曉的其他過濾方法。 3)換液結束後，在上述抗GREM1‎抗體原液中加入所需量的製劑輔料(例如穩定劑、界面活性劑，以及視情況選用之抗氧化劑)，用緩衝液稀釋至目標濃度。

在一些實施例中，上述製劑溶媒中的上述緩衝液為濃度為約20 mM的組胺酸緩衝液。

在一些實施例中，上述穩定劑為濃度為約8.2% (w/v)的蔗糖，上述界面活性劑為濃度為約0.05% (w/v)的聚山梨酯80，上述抗氧化劑為濃度為約0.04% (w/v)的甲硫胺酸。

在一些實施方案中，上述換液為緩衝液置換。在一些實施方案中，使用上述製劑溶媒對上述抗GREM1‎抗體原液進行透析換液。例如，可將一定體積的樣品置於透析袋內(例如Snake Skin®透析袋)，密封後，置於≥100倍體積的目標緩衝液中，持續攪拌以促進置換。透析進行適當的次數(例如3次)，持續適當的時間(例如4h、4h及隔夜)，在適當的攪拌速度下完成(例如300 rpm)。

在一些實施方案中，上述換液為過濾換液。在一些實施方案中，上述過濾為無菌過濾(例如經由0.22微米孔徑的濾膜，將細菌截留在膜上，抗GREM1‎抗體溶液會穿過濾膜，從而除菌)，及/或熟悉此項技術者所知曉的其他過濾方法。

藥物組合在另一方面，本申請案提供一種藥物組合，包含本文所述的藥物製劑及第二治療劑，上述第二治療劑選自化療藥物(如順鉑)、放療、免疫治療藥物(如免疫檢查點調節劑，如PD-1/PD-L1軸抑制劑、tgf -β抑制劑)、抗血管生成藥物(如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的拮抗劑)、靶向治療藥物、細胞治療藥物、基因治療藥物、激素治療藥物、細胞介素等。

應用在另一方面，本申請案亦提供了治療個體之疾病的方法，其包括將治療有效量的本申請案之藥物製劑或藥物組合施用至個體，其中上述個體具有或可能具有需要用針對GREM1‎的抗體進行治療的疾病。

依本文所用，術語「治療」係指減少或改善病症或其一或多種症狀的嚴重性及/或持續時間，抑制或預防病症進展，引起病症消退，抑制或預防與病症相關之一或多種症狀復發、發展、發作或進展。需要治療之個體包括已經患有疾病之個體。

術語「治療有效量」係指實現可量測的改善或預防特定的病症所需的最小濃度。

本申請案之藥物製劑或藥物組合可用於治療GREM1‎相關之疾病，包括慢性及急性疾病。GREM1‎相關之疾病包括癌症等。在一些實施方案中，上述GREM1‎相關之疾病為表現GREM1‎的癌症。表現GREM1‎的癌症之實例包括但不限於，癌症、纖維化疾病、血管生成、青光眼或視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)，或上述GREM1相關疾病或病狀與GREM1之含量增加相關，其選自由以下組成之群：硬皮病、特發性肺纖維化、糖尿病性腎病變、IgAN、狼瘡腎炎、奧爾波特症候群、神經膠質瘤、頭頸癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、乳癌及結腸直腸癌。

本申請案之藥物製劑或藥物組合可經由任何合適的途徑施用於個體。例如，上述藥物製劑可經由靜脈注射施用於個體。

在又一方面，本申請案提供了藥物製劑或藥物組合在製備預防及/或治療GREM1‎相關疾病的藥物中的用途。

在一些實施方案中，上述藥物進一步包括第二治療劑，上述第二治療劑選自化療藥物(如順鉑)、放療、免疫治療藥物(如免疫檢查點調節劑，如PD-1/PD-L1軸抑制劑、TGF-β抑制劑)、抗血管生成藥物(如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的拮抗劑)、靶向治療藥物、細胞治療藥物、基因治療藥物、激素治療藥物、細胞介素等。

實例 實驗方法總述：在以下實例中，將抗GREM1‎抗體進行製劑的配方篩選試驗。以下實例中使用的抗GREM1‎抗體為Hu14E3_HaLa。由於其他人源化抗GREM1抗體(例如，Hu14E3_HaLb、Hu14E3_HbLa、Hu14E3_HbLb、Hu14E3_HcLa及Hu14E3_HcLb)與Hu14E3_HaLa的胺基酸序列基本一致，因此，可預期如下製劑篩選實驗對此等人源化抗GREM1抗體同樣適用。換言之，上述人源化抗GREM1抗體(例如，Hu14E3_HaLa、Hu14E3_HaLb、Hu14E3_HbLa、Hu14E3_HbLb、Hu14E3_HcLa及Hu14E3_HcLb)在本申請案提供的製劑配方中亦能夠達到預期的高穩定性(例如，長期儲存下的高穩定性、高溫下(例如，40℃)或室溫下的高穩定性、振盪後之高穩定性、凍融後之高穩定性)。本申請案所述的抗GREM1‎抗體經由以下方法製備：將在具有10% Pluronic F-68的Freestyle 293表現培養基中培養的呈1×10 ⁶個細胞/毫升的HEK293E細胞用最終濃度為0.5 μg/ml的等量重鏈載體及輕鏈載體DNA及1.0 μg/ml的PEI(聚乙烯亞胺-直鏈，Polyscience)轉染。DNA比PEI比率為1:2。具有最佳MEM的DNA與PEI複合物形成時段在室溫下應為15分鐘。將轉染的細胞培養在處於5% CO ₂、37℃及125 rpm振盪速度下的燒瓶中。在轉染後22至26小時添加1%蛋白腖培養基。在第6天收集經調節培養基且將上清液在3,000 rpm下離心30分鐘。接著將澄清的經調節培養基裝載至nProteinA管柱(GE醫療集團(G.E.Healthcare))上，用PBS加0.1% triton-X100洗滌，且最後用pH 3.5的含有0.1M甘胺酸的溶液溶離結合的IgG。將溶離的抗體蛋白質透析至PBS中且儲存在-80℃下。為去除內毒素，使純化蛋白質經由Hitrap DEAE Sepharose F.F.管柱來進一步加工且使用尺寸排阻層析法(Superdex 200 5/150 GL，GE醫療集團)分析所得抗體以確定純度水平。具體描述請參見PCT/CN2022/072297，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

本申請案以下實例中測試的抗GREM1‎抗體配方按如下方法製備： 1. 製備目標製劑溶液： a) 用透析法將含有抗GREM1‎抗體(即原液，在以下實例中亦簡寫為DS)的緩衝液置換至目標製劑緩衝液中。具體地，將一定體積的DS樣品置於Snake Skin ^®透析袋內，密封後，置於≥100倍體積的目標緩衝液中，持續攪拌以促進置換。透析進行3次，持續時間分別為4h、4h及隔夜，攪拌速度為300 rpm。 b) 透析結束後，DS中加入所需量的穩定劑、界面活性劑母液，然後用目標緩衝體系將DS稀釋至目標濃度，得到目標製劑溶液。本申請案之以下實例對測試的抗GREM1‎抗體配方用以下分析方法進行分析： 2. 動態光散(DLS)：蛋白粒徑及分佈經由動態光散射儀(DLS)進行測定，方法參數如下：採集時間5s，每次量測採集20次，量測溫度25℃。 3. 分子排阻層析(SEC)：蛋白聚集情況使用Waters的超高效液相層析系統(UPLC)，層析管柱為Tosoh的TSKgelG3000SWXL SEC管柱(7.8 × 300 mm，5 μm)，經由SEC方法測定。移動相為50 mM磷酸鈉緩衝液，300 mM NaCl，pH 6.8±0.1。流速為1.0 mL/min。將樣品稀釋至10 mg/mL，偵測體積10 μL，偵測波長為280 nm。 4. 陽離子交換層析(CEX)：蛋白之電荷異質性經由CEX使用Agilent 1260 Infinity系統中的A Thermo Propac Elite WCX-10 4mm×150 mm 5um管柱測定。用移動相A及B之混合溶液將樣品稀釋至2.00 mg / mL。 5. 非還原性毛細管電泳(NR CE-SDS)：蛋白碎片情況經由CE-SDS(NR)方法進行測定。將標準品或供試樣品用磷酸-檸檬酸緩衝液稀釋至4 mg/mL，然後取25 μL與75 μL SDS樣品緩衝液及5 μL NEM(100 mM N-乙基馬來醯亞胺)渦旋混合進行變性處理。變性的樣品經離心後，在70±2℃下培育10±2 min，在室溫下冷卻，然後再次離心。使用SDS分離凝膠套組及未塗層的熔融石英毛細管在PA800 plus上進行分離。 6. 目檢(Visual Inspection)：經由YB-2澄明度偵測儀檢查黑色背景下樣品的外觀。報告透明度，顏色。 7. 微流成像(MFI)：經由微流動成像5200測定指定尺寸(2-10μm，10-25μm及＞25μm)的亞可見顆粒的數量。簡言之，根據儀器手冊將500μL每種樣品注射至MFI儀器中。報告每毫升平均顆粒數。 8. 活性偵測：經由ELISA結合方法偵測抗GREM1抗體與Gremlin抗原決定基的結合活性。採用Human Gremlin/GREM1 Protein(Acro)為包被抗原，偵測抗體為Goat anti-Human IgG-Fc HRP conjugated(Bethyl laboratories), 酶反應之受質為TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)。將抗原包被吸附在ELISA固相載體吸附盤上，洗滌封閉後加入供試品與之結合，培育後洗滌，加入偵測抗體，培育洗滌除去未結合的偵測抗體，再加入受質顯色，最後加入反應終止液，於酶標儀上讀取吸光值，其偵測波長為450 nm/650 nm。

實例 1 ： pH 篩選實驗將抗GREM1‎抗體蛋白進行製劑之pH篩選試驗。在pH 4.5至pH 6.5的範圍內，考察抗GREM1‎抗體在乙酸、組胺酸及檸檬酸緩衝體系中的穩定性，具體處方設計見表1。所有處方均考察初始時刻T0、40℃下保存3天、5天、7天(40℃ (3D、5D、7D))及凍融3個循環、5個循環(FT(3C、5C))後之穩定性(經由SEC、NR CE-SDS、CEX及/或MFI偵測)。表 1. pH 篩選實驗設計

處方	pH	蛋白濃度(mg/ml)	緩衝液	穩定性條件及偵測項目
F1	4.5	21	20 mM乙酸-乙酸鈉	T0：SEC、NR CE-SDS、CEX 40℃ (3D、5D、7D)：SEC、NR CE-SDS、CEX FT (3 C、5 C)：SEC、NR CE-SDS、CEX、MFI
F2	5.0	20 mM乙酸-乙酸鈉
F3	5.5	20 mM乙酸-乙酸鈉
F4	5.5	21	20 mM組胺酸-鹽酸組胺酸
F5	6.0	20 mM組胺酸-鹽酸組胺酸
F6	5.5	20 mM檸檬酸-檸檬酸鈉
F7	6.0	20 mM檸檬酸-檸檬酸鈉
F8	6.5	20 mM檸檬酸-檸檬酸鈉

實驗結果如下：凍融(5C)：在5個循環(5C)的凍融條件下，蛋白外觀、濃度、SEC、DLS以及NR CE-SDS結果中各處方均無明顯變化，在MFI實驗中，在凍融應力5個循環後，製劑F6，F7及F8在不同粒徑區間的亞可見微粒有明顯的增加趨勢，且明顯差於其他製劑。整體上來看，製劑F1至F5無明顯的區別(資料見下表)。故說明檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系不利於蛋白的低溫儲存。

處方	T0	凍融_3循環 FT_3x (FT 3C)	凍融_5循環 FT_5x (FT 5C)
≥2μm, ＜10μm	≥10μm, ＜25μm	≥25μm, ＜100μm	≥2μm, ＜10μm	≥10μm, ＜25μm	≥25μm, ＜100μm	≥2μm, ＜10μm	≥10μm, ＜25μm	≥25μm, ＜100μm
F1	634	73	15	447	11	0	409	19	4
F2	1273	34	0	829	8	0	4479	65	62
F3	768	8	0	795	69	8	1043	19	4
F4	233	19	0	264	11	0	386	8	0
F5	225	0	0	203	4	0	1983	19	0
F6	524	42	0	2920	375	8	65298	2794	46
F7	432	15	0	2610	191	0	63491	1907	8
F8	1330	4	0	424	15	0	60927	1494	8

40℃(3D、5D、7D)：在40℃條件下，蛋白外觀、濃度、DLS結果中各處方均無明顯變化。依圖1所示，SEC資料顯示，製劑F6、F7、F8的高聚體含量及增加速率略快於其他製劑。依圖2所示，製劑F1及F2的CEX主峰降解最快。其他製劑的主峰純度及高聚體含量基本上無變化且製劑間基本無區別。

綜上，經由凍融及40℃穩定性考察，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系不利於蛋白的低溫儲存。在40℃條件下，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系的處方F8的高分子聚合物HMW及小分子碎片LMW增加速率略快於其他處方，乙酸-乙酸鈉緩衝體系的處方中F1及F2的CEX主峰降解最快。因此，較佳的緩衝體系是組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液。

實例 2 ：輔料篩選將抗GREM1‎抗體蛋白進行製劑的輔料篩選試驗。研究了無機鹽(氯化鈉)，胺基酸(精胺酸鹽酸鹽)，醇(山梨醇及甘露醇)及糖類(蔗糖及海藻糖)對蛋白的保護作用。具體的處方設計見表2中。在培育後偵測樣品，所有處方均考察初始時刻T0、40℃下保存3天、7天、14天(40℃ (3D、7D、14D))及凍融1個循環、3個循環、5個循環(FT(1C、3C、5C))後之穩定性(經由SEC、NR CE-SDS、CEX及/或MFI偵測)。表 2

處方	蛋白濃度(mg/mL)	緩衝體系	PS80 濃度(w/v, %)	輔料	穩定性條件及偵測項目
F9	33.0	20 mM組胺酸-鹽酸組胺酸, pH 5.7	0.05	150 mM (即約0.88% (w/v)) NaCl	T0：SEC、NR CE-SDS、CEX 40℃ (3D, 7D, 14D)：SEC、NR CE-SDS、CEX; FT (1C, 3C,5C)：SEC、NR CE-SDS、CEX、MFI
F10	150 mM (即約3.16% (w/v))鹽酸精胺酸
F11	5%(w/v)蔗糖
F12	5%(w/v)山梨醇
F13	9%(w/v)蔗糖
F14	9%(w/v)海藻糖
F15	5%(w/v)甘露醇

實驗結果如下：一、凍融5個循環：各處方濃度、CEX及NR CE-SDS結果沒有明顯變化，DLS結果顯示(表3)製劑F15 (甘露糖)在T0及凍融應力下蛋白呈現多分散體系(PDI%＞25%)，表明蛋白在該處方中有聚集的風險。在SEC上凍融應力下5個循環期間，製劑F15呈現明顯的高聚體增加(圖3)，其餘製劑均沒有觀測到明顯的差異且主峰無變化。表 3

處方	T0	凍融_1 循環FT_1x	凍融_3 循環FT_3x	凍融_5 循環FT_5x
半徑(nm )	PDI%	半徑 (nm)	PDI%	半徑 (nm)	PDI%	半徑 (nm)	PDI%
F9	6.3	14.5	6.3	15.6	6.2	15.4	6.2	14.4
F10	6.2	13.9	6.3	16.6	6.2	15.6	6.2	15.6
F11	5.3	10.1	5.3	11.9	5.4	11.1	5.3	11.7
F12	4.9	6.8	4.9	8.0	4.9	6.9	4.9	8.8
F13	5.5	15.9	5.4	17.2	5.6	17.0	5.5	16.7
F14	5.0	13.9	4.9	13.5	5.0	12.7	5.0	12.7
F15	5.2	27.3	5.4	27.0	5.5	27.0	5.6	25.3

二、40℃下實驗結果：在40℃應力14天期間，自實驗結果可知，在40℃條件下培育14天，各處方的高分子量聚合物HWM沒有明顯變化，小分子碎片LMW略有增加，CEX主峰明顯下降，處方間沒有明顯區別(圖14)。在40℃培育4週期間，選擇製劑F10及F13用於考察氧化趨勢。LC-MS結果表明，該等2種製劑在位點HC_M101，HC_M109，HC_M249，HC_M425有明顯的氧化趨勢(表4)。表 4：輔料篩選研究氧化結果_40℃

氧化	處方	T0 (%)	40℃_14天 40℃_2W(%)	40℃_4週 40℃_4W (%)
HC_M101	F10	0.8	NT	6.9
F13	2.7	7.2
HC_M109	F10	2.8	NT	20.2
F13	9.3	23.6
HC_M249	F10	4.0	NT	25.7
F13	9.8	26.0
HC_M425	F10	2.0	NT	12.7
F13	4.8	11.5

注：NT表示未偵測

綜上，經由凍融及40℃穩定性考察，甘露醇不利於蛋白的穩定，其餘各種穩定劑沒有明顯區別。考慮到蔗糖廣泛用於生物製劑，而鹽酸精胺酸可經由氫鍵結合而保護蛋白，因此較佳蔗糖及鹽酸精胺酸進行後續實驗。此外，LC-MS結果顯示，蛋白在一些位點有明顯的氧化的趨勢，添加抗氧化劑甲硫胺酸用於後續的製劑處方篩選。

實例 3. 界面活性劑篩選將抗GREM1‎抗體蛋白進行界面活性劑篩選試驗。研究了0.025%至0.1% (w/v)的聚山梨酯80及聚山梨酯20的保護作用。處方設計詳見表5。所有處方均考察初始時刻T0、40℃下保存3天、7天、14天(40℃ (3D、7D、14D))及在25℃下以200 rpm的速度振搖1天、3天、5天(振搖(200 rpm，25℃：1D、3D、5D))後之穩定性(經由SEC、NR CE-SDS、CEX偵測)。表 5

處方	蛋白濃度(mg/mL)	緩衝體系	輔料(w/v, %)	界面活性劑種類及濃度(w/v, %)	穩定性條件及偵測項目
F16	33.0	20 mM組胺酸-鹽酸組胺酸，pH 5.7	9%蔗糖	‎0.025% PS80‎	T0：SEC、NR CE-SDS、CEX 40℃ (3D、7D、14D)：SEC、NR CE-SDS、CEX 振搖(200 rpm，25℃：1D、3D、5D) ：SEC、NR CE-SDS、CEX
F17	‎0.05% PS80‎
F18	‎0.10% PS80‎
F19	‎0.025% PS20‎
F20	‎0.05% PS20‎
F21	‎0.10% PS20‎

一、振搖樣品之結果分析自實驗結果可知，在振搖5天後，各處方的高分子量聚合物HWM、小分子碎片LMW及電荷異構體均沒有明顯變化，處方間沒有明顯區別。

二、40℃樣品之結果分析自實驗結果可知，在40℃條件下培育14天，各處方的高分子量聚合物HWM沒有明顯變化，小分子碎片LMW略有增加，CEX主峰明顯下降，處方間沒有明顯區別。

綜上，經由振搖及40℃穩定性考察，聚山梨酯80及聚山梨酯20在0.025% (w/v)至0.1% (w/v)濃度範圍對蛋白的保護作用良好且無明顯區別，均滿足實驗要求，選擇0.05% (w/v)聚山梨酯80用於後續研究。

實例 4. pH 篩選，穩定劑、抗氧化劑實驗本實驗進一步考察了不同pH條件下的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系及鹽酸精胺酸、蔗糖兩種穩定劑，且考察了甲硫胺酸的抗氧化作用。處方設計詳見表6。所有處方均考察初始時刻T0、40℃下保存2週、4週(40℃ (2W、4W))、25℃下保存2週、4週、6週(25℃ (2W、4W、6W))、5℃下保存2週、4週、6週、3個月(5℃ (2W、4W、6W、3M))、凍融1個循環、3個循環、5個循環(FT (1C、3C、5C))、及在25℃下以1000 rpm的速度振搖8小時(振搖(1000 rpm，25℃：8h))、在25℃下以400 rpm的速度攪拌1小時(攪拌(400 rpm，25℃: 1h)後)的穩定性(經由SEC、NR CE-SDS、CEX、目檢(可見異物)及/或MFI偵測、活性偵測)。表 6

處方	蛋白濃度(mg/mL)	緩衝體系	界面活性劑濃度(w/v, %)	輔料	穩定性條件及偵測項目
F22	33.0	20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，pH 5.7	0.05% 聚山梨酯80	150 mM (即約3.16% (w/v))鹽酸精胺酸	T0：SEC、NR CE-SDS、CEX 40℃ (2W、4W)：SEC、NR CE-SDS、CEX、活性 25℃ (2W、4W、6W) ：SEC、NR CE-SDS、CEX 5℃ (2W、4W、6W、3M) ：SEC、NR CE-SDS、CEX、目檢(可見異物) FT(1C、3C、5C)：SEC、NR CE-SDS、CEX、MFI 振搖(1000 rpm，25℃: 8h) ：SEC、NR CE-SDS、CEX 攪拌(400 rpm，25℃: 1h) ：SEC、NR CE-SDS、CEX
F23	9%蔗糖
F24	20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，pH 6.0	150 mM (即約3.16% (w/v) 鹽酸精胺酸
F25	9%蔗糖
F26	150 mM (即約3.16% (w/v) 鹽酸精胺酸+0.04%甲硫胺酸
F27	20 mM 組胺酸-鹽酸組胺酸，pH 6.5	150 mM (即約3.16% (w/v)鹽酸精胺酸

一、凍融、振搖及攪拌結果自實驗結果可知，在凍融、振搖及攪拌條件下，各處方的高分子量聚合物HWM、小分子碎片LMW及電荷異構體均沒有明顯變化，處方間沒有明顯區別。

二、光照結果自實驗結果可知，各處方的高分子量聚合物HMW及小分子碎片LMW沒有明顯變化，CEX主峰略有下降，處方間沒有明顯區別。‎

三、40℃結果自實驗結果可知，在40℃條件下，各處方的高分子量聚合物HMW略有增加，小分子碎片LMW明顯增加，CEX主峰下降(圖4)，各處方間沒有明顯差異。此外活性結果各處方間沒有明顯差異(活性偵測以T0樣品為參考品。依表7所示，在40℃高溫下培育4週後，所有製劑結合活性結果在接受標準範圍內(相對於參考品的50%-150%之間)。依表8所示，比較處方F24及F26的液質聯用LC-MS資料，可發現甲硫胺酸有明顯的抗氧化作用。‎ 表 7

處方	40 ℃_4 週_ (%)
F22	73%
F23	75%
F24	72%
F25	81%
F26	84%
F27	79%

表 8

氧化	處方	T0 (%)	40 ℃_2 週(%)	40 ℃_4 週(%)
HC_M101	F24	NT	6.0	5.7
F26	1.5	2.7	3.0
HC_M109	F24	NT	15.6	17.1
F26	3.4	6.3	7.6
HC_M249	F24	NT	22.1	17.8
F26	3.7	7.9	7.7
HC_M425	F24	NT	9.8	8.3
F26	2.4	4.0	4.2

注：NT表示未偵測

四、25℃結果自實驗結果可知，在25℃條件下，各處方的高分子量聚合物HMW及小分子碎片LMW沒有明顯變化，CEX主峰有一定下降，處方間無明顯差異(圖5至圖7)。

五、5℃結果自實驗結果可知，在5℃條件下，各處方的高分子量聚合物HMW、小分子碎片LMW及電荷異構體均沒有明顯變化，處方間無明顯差異。但在3個月(3M)時，處方F22，F24，F26及F27，即所有含鹽酸精胺酸的處方，均觀測到可見異物(表9)，含蔗糖的處方F23及F25，均未發現可見異物。表 9

處方	外觀
3M
F22	UPS
F23	NVP
F24	UPS
F25	NVP
F26	UPS
F27	UPS

備註：UPS---不可計數微粒群；NVP---無可見異物

綜合考慮各條件之結果，在5℃條件下置放3個月後，所有含鹽酸精胺酸的處方，均觀測到可見異物，因此較佳的穩定劑為蔗糖。為使製劑之滲透壓儘可能接近人體之血漿滲透壓，將蔗糖之濃度由9% (w/v)調整為8.2% (w/v)。不同pH (pH5.7、pH6.0及pH6.5)的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系(處方22、24及27)沒有明顯差異，因此，選擇中間之pH，即pH6.0，作為較佳之pH。甲硫胺酸有明顯的抗氧化作用。因此，較佳的處方為，20 mM組胺酸/鹽酸組胺酸，8.2% (w/v)蔗糖，0.04% (w/v)甲硫胺酸，0.05% (w/v)聚山梨酯80，pH6.0用於處方確認研究。

實例 5 ：處方確認實驗本實驗進一步考察了實例4中較佳的處方，即20 mM組胺酸/鹽酸組胺酸，8.2% (w/v)蔗糖，0.04% (w/v)甲硫胺酸，0.05% (w/v)聚山梨酯80，pH6.0，在各條件下的穩定性。處方設計詳見表10。所有處方均考察初始時刻T0、40℃下保存2週、4週(40℃ (2W、4W))、25℃下保存2週、4週、6週(25℃ (2W、4W、6W))、5℃下保存2週、4週、6週、3個月、6個月(5℃ (2W、4W、6W、3M、6M))、凍融1個循環、3個循環、5個循環(FT(1C、3C、5C))、及在25℃下以200 rpm的速度振搖3天、7天(振搖(200 rpm，25℃：3D、7D))、在25℃下以400 rpm的速度攪拌2小時、4小時(400 rpm，25℃: 2H、4H)後、光照5天、10天後之穩定性(經由SEC、NR CE-SDS、CEX、目檢(可見異物)及/或MFI偵測)。表 10

處方	描述	應力條件及偵測項目
F28	33.0 mg/mL DS、20 mM組胺酸、8.2%(w/v)蔗糖、0.04%(w/v)甲硫胺酸、0.05%(w/v)聚山梨酯80、pH6.0	1. 在初始時刻進行備註欄X及Y項偵測(T0 ^XY)； 2. 凍融1個循環、3個循環、5個循環後進行備註欄X及Y項偵測(FT(1C、3C、5C) ^XY)； 3. 以200 rpm的速度振搖3天、7天後進行備註欄X項偵測(振搖,200 rpm，25℃ (3D、7D) ^X)； 4. 光照：5天後進行備註欄X項偵測、10天後進行備註欄X及Z項偵測(光照，5D、10D ^Z) ^X)； 5. 光照對照：5天、10天後進行備註欄X項偵測(避光，5D、10D) ^X)； 6. 以400 rpm的速度攪拌2小時、4小時後進行備註欄X項偵測(攪拌, 400 rpm，25℃ (2H, 4H) ^X); 7. 在25℃下保存2週、4週、6週後進行備註欄X項偵測(25℃，2W、4W、6W) ^X)； 8. 在5℃下保存2週、4週、6週、3個月、6個月後進行備註欄X項偵測(5℃，2W、4W、6W 、3M、6M) ^X)。 9. 在40℃下保存2週、4週後進行備註欄X項偵測，4週樣品亦進行備註欄Z項偵測(40℃ (2W、4W ^Z)) ^X；
X=濃度、外觀、NR CE-SDS、SEC、CEX；Y=MFI；Z=效能(Potency)。

實驗結果發現，最終製劑在長期5℃(圖8至圖10)及加速25℃(圖11至圖13)、凍融、振搖及攪拌實驗條件下穩定性良好，各偵測指標均沒有發生明顯變化(表11至表14)。在光照條件下，雖然CEX主峰明顯下降，但製劑的結合活性結果在接受標準範圍內(相對於參考品的50%-150%之間)，故活性無明顯變化，滿足穩定性要求。在40℃條件下(表15)，雖然LMW明顯增加，CEX主峰明顯下降，但製劑的4週結合活性結果在接受標準範圍內(相對於參考品的50%-150%之間)，故活性無明顯變化。因此，所選擇的緩衝體系及處方組分可為GREM1蛋白提供良好的穩定性。表 11 ：凍融結果

偵測項目	T0	1x	3x	5x
SEC	HMW%	0.2	0.2	0.2	0.2
MP%	98.7	98.8	98.7	98.8
LMW%	1.2	1.0	1.0	1.0
NR CE-SDS	LMW%	2.5	2.5	2.5	2.5
MP%	97.2	97.3	97.3	97.3
HMW%	0.3	0.2	0.2	0.2
CEX	MP%	67.6	67.7	67.7	67.7
酸峰%	16.8	16.8	16.7	16.7
鹼性峰%	15.6	15.6	15.6	15.6
MFI	≥2μm, ＜10μm	1429	528	1028	830
≥10μm, ＜25μm	109	0	35	4
≥25μm,＜100μm	16	0	4	0

表 12 ：攪拌結果

偵測項目	T0	400 rpm, 2H	400 rpm, 4H
SEC	HMW%	0.2	0.2	0.2
MP%	98.7	98.8	98.9
LMW%	1.2	1.1	0.9
NR CE-SDS	LMW%	2.5	2.5	2.6
MP%	97.2	97.3	97.1
HMW%	0.3	0.1	0.2
CEX	MP%	67.6	67.5	67.6
酸峰%	16.8	16.8	16.8
鹼性峰%	15.6	15.6	15.6

表 13 ：振搖結果

偵測項目	T0	3D	7D
SEC	HMW%	0.2	0.2	0.2
MP%	98.7	98.8	98.7
LMW%	1.2	1.0	1.1
NR CE-SDS	LMW%	2.5	2.6	2.7
MP%	97.2	97.2	97.2
HMW%	0.3	0.2	0.1
CEX	MP%	67.6	67.1	66.7
酸峰%	16.8	16.9	17.0
鹼性峰%	15.6	16.0	16.3

表 14 ：光照及光照對照

偵測項目	光照(25℃光照)	光照對照(25℃避光)
T0	5D	10D	T0	5D	10D
SEC	HMW%	0.2	0.3	0.4	0.2	0.2	0.2
MP%	98.7	98.5	98.3	98.7	98.8	98.7
LMW%	1.2	1.2	1.3	1.2	1.0	1.0
NR CE-SDS	LMW%	2.5	2.7	3.0	2.5	2.6	2.7
MP%	97.2	97.1	96.7	97.2	97.2	96.9
HMW%	0.3	0.2	0.3	0.3	0.2	0.4
CEX	MP%	67.6	60.2	53.5	67.6	66.8	66.3
酸峰%	16.8	20.8	25.8	16.8	16.9	17.2
鹼性峰%	15.6	19.0	20.7	15.6	16.3	16.5
效能	100%	NT	86%	NT	NT	NT

注：NT表示未偵測表 15 ： 40 ℃

偵測項目	T0	2W	4W
SEC	HMW%	0.2	0.5	0.6
MP%	98.7	97.0	96.1
LMW%	1.2	2.5	3.3
NR CE-SDS	LMW%	2.5	4.6	5.9
MP%	97.2	94.9	94
HMW%	0.3	0.5	0.1
CEX	MP%	67.6	49.4	39.9
酸峰%	16.8	28.8	37.6
鹼性峰%	15.6	21.8	22.5
效能	100%	NT	84%

注：NT表示未偵測

實例 6 ：本申請案所用之抗 GREM1 ‎ 抗體的活性表徵 經由 ELISA 偵測抗 GREM1 抗體與人類 GREM1 的結合親和力分析在4℃下用100微升/孔的含0.5 μg/ml hGREM1 (ACRO)及小鼠gremlin(R&D)的高pH塗佈緩衝液塗佈透明聚苯乙烯培養盤(BEAVER)整夜。接著在自動培養盤洗滌器上使用PBS + 0.1% Tween 20 (西格瑪)洗滌培養盤一次。將100 μl的由PBS +1% BSA +1%標準山羊血清+ 0.5% Tween 20 (西格瑪)組成的阻斷溶液添加至每個孔中且在室溫下培育2小時。接著將100 μl於含有PBS + 1% BSA +1%標準山羊血清+0.01% Tween 20的抗體稀釋緩衝液中的抗體(以2 μg/ml開始且連續稀釋)添加至培養盤的每個孔中且在室溫下培育1小時。然後，用200 μl的PBS+0.1% Tween20洗滌培養盤三次，接著添加100微升/孔的1:10000山羊抗小鼠IgG-HRP (艾博抗)，且在室溫下培育1小時。接著用PBS+0.1% Tween20將其洗滌3次。最後，將100微升/孔的TMB(皮爾斯)添加至每個孔中，且在若干分鐘之後，向每個孔中添加50 μl的停止溶液。在Multiscan FC微盤讀數儀(賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific))上在450 nM下讀取培養盤。依表16及表17所示，相比於基準抗體6245P，本申請案所用的抗GREM1抗體及其他人源化抗GREM1抗體(例如，Hu14E3_HaLb、Hu14E3_HbLa、Hu14E3_HbLb、Hu14E3_HcLa及Hu14E3_HcLb)具有與人類GREM1更好的結合親和力。

經由 Fortebio 量測人源化抗體的親和力人類GREM1蛋白質用動力學緩衝液稀釋以得到2μg/ml之濃度。0 nM用作參考對照。待測試的抗體用ForteBio動力學緩衝液(PBS pH 7.4，0.1% BSA + 0.002% Tween-20)稀釋至100 nM、50 nM及25 nM之濃度。將人類GREM1-his固定於NTA生物感測器上。偵測基線60秒，且接著偵測抗GREM1抗體締合120秒以得到K _on因子資料。接著在動力學緩衝液中解離90秒以得到K _off因子資料。依表16中所示，本申請案使用的抗GREM1抗體具有小於1 nM的KD值，遠低於基準抗體的KD值，即相比於基準抗體6245P，本申請案所用的抗GREM1抗體具有與人類GREM1更好的結合親和力。

經由 ELISA 偵測抗 GREM1 抗體阻斷 GREM1 結合於人類 BMP2/4/7 的能力用重組人類BMP2/4 (0.5 μg/ml)塗佈培養盤整夜且接著在室溫下將抗體的連續稀釋液與1 μg/ml的修飾的人類GREM1-his一起培育1h，之後將此複合物添加至塗佈培養盤中且將其在室溫下再培育一小時。接著洗滌培養盤且添加抗his HRP(金斯瑞(GenScript))。接著用TMB溶液開發培養盤且經由添加停止溶液使其停止。在盤讀數儀上在450 nm下讀取培養盤。結果在表16中示出，指示本文中提供的抗GREM1抗體相比基準抗體6245P可更好地抑制GREM1與BMP2或BMP4的結合，即相比於基準抗體6245P，本申請案所用的抗GREM1抗體具有更好的對人類GREM1與BMP2或BMP4的結合的阻斷活性。表 16

活性參數	本申請案所用的抗 GREM1 抗體	基準抗體 6245P
EC50 (ng/ml)	人類GREM1	6.90	57.5
KD (M)	人類GREM1	＜1.0E-12	2.58E-09
IC50 (μg/ml)	BMP2	0.4232	0.7971
BMP4	0.5551	0.6377

表 17 ：結合 hGremlin-his 之 EC50

抗體	EC50 (ng/ml)
14E3 (hIgG1)	Hu14E3_HaLa	6.9
Hu14E3_HaLb	5.6
Hu14E3_HbLa	6.0
Hu14E3_HbLb	6.2
Hu14E3_HcLa	6.6
Hu14E3_HcLb	6.1
嵌合14E3	6.8
6245P (hIgG4)		57.5

本申請案之抗 GREM1 抗體與順鉑的組合在食道癌 PDX 模型中的功效人類gremlin IHC，具體而言，陽性食道腫瘤組織(E7)係獲自北京腫瘤醫院(Beijing Cancer Hospital)繼代的NOD/SCID小鼠及確立的PDX庫。經測試，發現E7食道PDX模型在GREM1表現中為陽性但不具有PD-L1表現。

向每隻小鼠皮下接種直徑大致為3 mm的小腫瘤組織塊，自攜帶腫瘤小鼠的整體腫瘤剝離物中剪切上述小腫瘤組織塊。接種之後18天，選擇腫瘤大小為約70 mm ³的動物且將其隨機分為4個組，每個組由8隻小鼠組成。接著，用同型對照+PBS、20 mg/kg劑量的本申請案之抗GREM1抗體、3 mg/kg劑量的順鉑以及本申請案之抗GREM1抗體與順鉑的組合處理小鼠。經由腹膜內注射及PBS施用同型對照及本申請案之抗GREM1抗體，一週兩次且持續4週，而經由靜脈內注射施用順鉑，一週一次且持續4週。在結束研究時利用CO ₂吸入殺死動物。使用測徑規(INSIZE)在兩個維度量測腫瘤大小，一週兩次或三次，且使用下式以mm ³表示體積：V = 0.5 a×b ²，其中a及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑。使用Prism GraphPad分析結果且表示為均值±S.E.M。經由T-測試進行兩個組之間的比較，且若p為*＜0.05及**＜0.01，則將差異視為顯著的。

表18顯示與同型對照相比，當此實驗中使用單獨的本申請案之抗GREM1抗體時顯著增強腫瘤生長抑制。與單獨的本申請案之抗GREM1抗體相比(63.97% TGI對比42.92% TGI)或與單獨的順鉑相比(63.97% TGI對比59.79% TGI)時，本申請案之抗GREM1抗體與順鉑的組合進一步抑制腫瘤生長，從而表明本申請案之抗GREM1抗體與順鉑的組合治療對食道癌的協同效應。

到目前為止，用於食道癌之一線療法一般包括食管切除術、化學療法、靶向療法、免疫療法(例如，靶向PD-1或PD-L1)，及/或其組合。用於食道癌的二線療法及後續療法可涉及靶向療法，如靶向血管內皮生長因子(VEGF)受體的雷莫蘆單抗或用於轉移性腺癌的過度表現HER2的曲妥珠單抗(NCCN腫瘤學臨床實踐指南(NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology)、食道及食管胃連接部癌症(Esophageal and Esophagogastric Junction Cancers)、美國國立綜合癌症網路(National Comprehensive Cancer Network). V1. 2020)。上文所描述之資料顯示本文所提供的抗GREM1抗體可有效地治療並不表現PD-L1的腫瘤，例如並不過度表現PD-L1的食道癌，且在於化學療法(例如順鉑)組合時可進一步達成協同效應。此表明本文所提供的抗GREM1抗體可充當用於食道癌的一線療法或二線療法的新選擇。表 18 ：第 26 天本申請案使用的抗 GREM1 抗體與順鉑的組合在食管癌 PDX 模型中的腫瘤生長抑制

處理(n=8)	腫瘤大小(mm ³, 均值±S.E.M)	TGI(%)	相比於同型對照的p 值
同型對照20 mg/kg+PBS	1192.40±203.22	/	/
本申請案使用的抗GREM1抗體20 mg/kg	680.59±163.73	42.92	0.0701
順鉑3mg/kg	479.41±104.05	59.79	0.0075
本申請案使用的抗GREM1抗體20 mg/kg+順鉑3mg/kg	429.65±86.99	63.97	0.0039

圖1示出了在分別選用乙酸、組胺酸及檸檬酸三種不同緩衝體系中之pH篩選實驗中，根據SEC所測得的蛋白的穩定性資料。圖2示出了在分別選用乙酸、組胺酸及檸檬酸三種不同緩衝體系中之pH篩選實驗中，根據CEX所測得的蛋白的穩定性資料。圖3示出了在分別選用NaCl、鹽酸精胺酸、蔗糖、山梨醇、海藻糖及甘露醇作為穩定劑的輔料篩選實驗中，根據SEC所測得的蛋白穩定性資料。圖4示出了在不同pH條件下的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系中，分別選用鹽酸精胺酸及蔗糖作為穩定劑，甲硫胺酸作為抗氧化劑的輔料篩選實驗中，根據CEX所測得的蛋白穩定性資料。圖5示出了在不同pH條件下的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系中，分別選用鹽酸精胺酸及蔗糖作為穩定劑，甲硫胺酸作為抗氧化劑的輔料篩選實驗中，根據CEX所測得的蛋白穩定性資料。圖6示出了在不同pH條件下的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系中，分別選用鹽酸精胺酸及蔗糖作為穩定劑，甲硫胺酸作為抗氧化劑的輔料篩選實驗中，根據SEC測得的蛋白穩定性資料。圖7示出了在不同pH條件下的組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系中，分別選用鹽酸精胺酸及蔗糖作為穩定劑，甲硫胺酸作為抗氧化劑的輔料篩選實驗中，根據NR CE-SDS所測得的蛋白穩定性資料。圖8示出了目標製劑在長期5℃實驗條件下，根據SEC所測得的蛋白穩定性資料。圖9示出了目標製劑在長期5℃實驗條件下，根據NR CE-SDS所測得的蛋白穩定性資料。圖10示出了目標製劑在長期5℃實驗條件下，根據CEX所測得的蛋白穩定性資料。圖11示出了目標製劑在加速25℃實驗條件下，根據SEC所測得的蛋白穩定性資料。圖12示出了目標製劑在加速25℃實驗條件下，根據NR CE-SDS所測得的蛋白穩定性資料。圖13示出了目標製劑在加速25℃實驗條件下，根據CEX所測得的蛋白穩定性資料。圖14示出了目標製劑在40℃實驗條件下，根據CEX所測得的蛋白穩定性資料。

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Claims

一種藥物製劑，上述藥物製劑包含抗GREM1抗體及緩衝液，上述緩衝液為乙酸緩衝液或組胺酸緩衝液，且pH值為4.5至6.5。
如請求項1之藥物製劑，其中上述緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為5至50 mM，或10至30 mM。
如請求項1或2之藥物製劑，亦包含穩定劑。
如請求項3之藥物製劑，其中上述穩定劑在上述藥物製劑中之濃度為0.5-20% (w/v)，或0.5-10 % (w/v)。
如請求項3或4之藥物製劑，其中上述穩定劑選自：蔗糖、海藻糖、山梨醇、NaCl及鹽酸精胺酸。
如請求項5之藥物製劑，其中： a) 上述穩定劑為蔗糖，且上述蔗糖在上述藥物製劑中之濃度為1-10% (w/v)；及/或 b) 上述穩定劑為鹽酸精胺酸，且上述鹽酸精胺酸在上述藥物製劑中之濃度為1-5% (w/v)；及/或 c) 上述穩定劑為海藻糖，且上述海藻糖在上述藥物製劑中之濃度為5-10% (w/v)；及/或 d) 上述穩定劑為山梨醇，且上述山梨醇在上述藥物製劑中之濃度為2-8% (w/v)；及/或 e) 上述穩定劑為NaCl，且上述NaCl在上述藥物製劑中之濃度為0.5-1.5% (w/v)。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中亦包含界面活性劑。
如請求項7之藥物製劑，其中上述界面活性劑在上述藥物製劑中之濃度為0.005% (w/v) -0.4% (w/v)，或0.01% (w/v) - 0.2% (w/v)。
如請求項7或8之藥物製劑，其中上述界面活性劑選自：聚山梨酯80及聚山梨酯20。
如請求項9之藥物製劑，其中： a) 上述界面活性劑為聚山梨酯80，且上述聚山梨酯80及/或聚山梨酯20在上述藥物製劑中之濃度為0.025% (w/v) - 0.1% (w/v)。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，亦包含抗氧化劑。
如請求項11之藥物製劑，其中上述抗氧化劑在上述藥物製劑中之濃度為0.01-0.2% (w/v)，或0.02-0.06% (w/v)。
如請求項11或12之藥物製劑，其中上述抗氧化劑選自：甲硫胺酸、半胱胺酸、麩胱甘肽、硫代硫酸鈉及抗壞血酸。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體在上述藥物製劑中之濃度為1至200 mg/ml。
如請求項14之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體在上述藥物製劑中之濃度為20至40 mg/ml。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 1所示的重鏈CDR1 (HCDR1)、依SEQ ID NO: 2所示的HCDR2及依SEQ ID NO: 3所示的HCDR3，及/或依SEQ ID NO: 4所示的輕鏈CDR1 (LCDR1)、依SEQ ID NO: 5所示的LCDR2及依SEQ ID NO: 6所示的LCDR3。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 7所示的重鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3，及/或依SEQ ID NO: 8所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含如 QX ₁QLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGX ₂TFT (SEQ ID NO: 24)所示的重鏈構架區1 (HFR1)、如 WMX ₃QAPGQGLX ₄WMG (SEQ ID NO: 25)所示的HFR2、如 RFX ₅FSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 26)所示的HFR3及如 WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO: 17)所示的HFR4，及/或如 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC(SEQ ID NO: 27)所示的輕鏈構架區1 (LFR1)、如 WLQQRPGQSPRRLIX ₆ (SEQ ID NO: 32)所示的LFR2、如 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO: 29)所示的LFR3及如 FGQGTKLEIK(SEQ ID NO: 30)所示的LFR4，其中，X ₁是V或I；X ₂是Y或S；X ₃是R或K；X ₄是E或T；X ₅是V或A；X ₆是Y或S。
如請求項18之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 14、18或21所示的重鏈構架區1 (HFR1)、依SEQ ID NO: 15、19或22所示的HFR2、依SEQ ID NO: 16、20或23所示的HFR3及依SEQ ID NO: 17所示的HFR4，及/或依SEQ ID NO: 27所示的輕鏈構架區1 (LFR1)、依SEQ ID NO: 28或31所示的LFR2、依SEQ ID NO: 29所示的LFR3及依SEQ ID NO: 30所示的LFR4。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 7、11或12所示的重鏈可變區的FR1、FR2、FR3及FR4，及/或依SEQ ID NO: 8或13所示的輕鏈可變區的FR1、FR2、FR3及FR4。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 7、11或12所示的重鏈可變區，及/或依SEQ ID NO: 8或13所示的輕鏈可變區。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 33所示的重鏈恆定區及/或依SEQ ID NO: 34所示的輕鏈恆定區。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體包含依SEQ ID NO: 9所示的重鏈及/或依SEQ ID NO: 10所示的輕鏈。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其包含抗GREM1抗體、緩衝液、穩定劑及界面活性劑，其中上述緩衝液為組胺酸緩衝液，上述穩定劑為鹽酸精胺酸或蔗糖，上述界面活性劑為聚山梨酯80或聚山梨酯20，且pH值為約4.5-6.5。
如請求項24之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體在上述藥物製劑中之濃度為20-40 mg/ml，上述組胺酸緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為10-30 mM，上述鹽酸精胺酸或蔗糖在上述藥物製劑中之濃度為1-10% (w/v)，及/或上述聚山梨酯80或聚山梨酯20在上述藥物製劑中之濃度為0.025% (w/v) - 0.1% (w/v)。
如請求項25之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體在上述藥物製劑中之濃度為約33 mg/ml，上述組胺酸緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為約20 mM，上述穩定劑為蔗糖，其在上述藥物製劑中之濃度為約8-9% (w/v)，上述界面活性劑為聚山梨酯80，其在上述藥物製劑中之濃度為約0.05% (w/v)，pH值為約5.5-6.5。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，亦包含抗氧化劑，上述抗氧化劑為甲硫胺酸。
如前述請求項中任一項之藥物製劑，其中甲硫胺酸在上述藥物製劑中之濃度為約0.04% (w/v)。
如請求項27之藥物製劑，其中上述抗GREM1抗體在上述藥物製劑中之濃度為約33 mg/ml，上述組胺酸緩衝液在上述藥物製劑中之濃度為約20 mM，上述穩定劑為蔗糖，且其在上述藥物製劑中之濃度為約8.2% (w/v)，上述界面活性劑為聚山梨酯80，且其在上述藥物製劑中之濃度為約0.05% (w/v)，上述甲硫胺酸在上述藥物製劑中之濃度為約0.04% (w/v)，pH值為約6.0。
如請求項1至29中任一項之藥物製劑在製備預防及/或治療GREM1相關疾病的藥物中的用途。
如請求項30之用途，其中上述GREM1相關疾病選自由以下組成的組：癌症、纖維化疾病、血管生成、青光眼或視網膜疾病、腎病、肺動脈高血壓或骨關節炎(OA)，或上述GREM1相關疾病與GREM1之含量增加相關，其選自由以下組成之群：硬皮病、特發性肺纖維化、糖尿病性腎病變、IgAN、狼瘡腎炎、奧爾波特症候群、神經膠質瘤、頭頸癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、乳癌及結腸直腸癌。
如請求項30或31之用途，其中上述藥物進一步包括第二治療劑，上述第二治療劑選自化療藥物(如順鉑)、放療、免疫治療藥物(如免疫檢查點調節劑，如PD-1/PD-L1軸抑制劑、TGF-β抑制劑)、抗血管生成藥物(如VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3的拮抗劑)、靶向治療藥物、細胞治療藥物、基因治療藥物、激素治療藥物、細胞介素等。