MX2014015878A - Conjugados de anticuerpo fármaco anti-cd70. - Google Patents

Conjugados de anticuerpo fármaco anti-cd70.

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Abstract

Esta invención se refiere a anticuerpos anti-CD70 y a conjugados para fármacos de anticuerpos que comprenden al menos un aminoácido codificado de manera no natural. Se describen en la presente anticuerpos aCD70 con uno o más aminoácidos codificados de manera no natural y además se describen conjugados para fármacos de anticuerpos en donde los anticuerpos aCD7O de la invención se conjugan a una o más toxinas. Además se describen métodos para utilizar tales conjugados para fármacos de anticuerpos de aminoácidos no naturales, incluyendo usos terapéuticos, de diagnóstico, y otros de biotecnología.

Description

CONJUGADOS DE ANTICUERPO FÁRMACO ANTI-CD70 Campo de la Invención Esta invención se refiere a anticuerpos anti-CD70 y a conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden al menos un aminoácido no naturalmente codificado. Se describen en la presente anticuerpos OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y además se describen conjugados de anticuerpo-fármaco en donde los anticuerpos aCD70 de la invención se conjugan a una o más toxinas. Se describen además métodos para utilizar tales conjugados de anticuerpo de aminoácido no natural-fármaco, incluyendo los usos terapéuticos, diagnósticos y otros bioteenológicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El CD70 es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) de moléculas enlazadas a la membrana celular y secretadas que se expresan mediante una variedad de tipos celulares normales y malignos. La secuencia primaria de aminoácidos (AA) de CD70 predice una proteína transmembrana tipo II con su terminal carboxilo expuesta al exterior de las células y su terminal amino encontrada en el lado citosólico de la membrana de plasma (Bowman et al., 1994, J Immunol 152: 1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73: 447-56). El CD70 humano se compone de un dominio citoplásmico de 20 AA, un dominio transmembrana de 18 AA y un dominio extracitoplásmico de 155 AA con dos sitios potenciales de glicosilación enlazados a N (Bowman et al., supra; Goodwin et al., supra). La inmunoprecipitación específica de células que expresan CD70 etiquetadas por radio-isótopo mediante anticuerpos anti-CD70 produce polipéptidos de 29 y 50 kDa (Goodwin et al., supra; Hintzen et al., 1994, J Immunol 152: 1762-73). En base a su homología con TNF-alfa y TNF-beta, especialmente en las cadenas estructurales C, D, H e I, se predice una estructura trimérica para CD70 (Petsch et al., 1995, Mol Immunol 32: 761-72).
Estudios inmunohistológicos originales revelaron que el CD70 se expresa en células B de centro germinal y células T raras en amígdalas, piel e intestino (Hintzen et al., 1994, Int Immunol 6: 477-80). Subsecuentemente, se reportó que el CD70 se expresa en la superficie celular de linfocitos T y B recientemente activados por antígeno, y su expresión declina después del retiro de la estimulación antigénica (Lens et al., 1996, Eur J Immunol 26: 2964-71; Lens et al., 1997, Immunology 90: 38-45). Dentro del sistema linfoide, las células citotóxicas naturales (Orengo et al., 1997, Clin Exp Immunol 107: 608-13) y las células dendríticas periféricas maduras de ratón (Akiba et al., 2000, J Exp Med 191: 375-80) también expresan CD70. En linajes no linfoides, se ha detectado el CD70 en células epiteliales de médula tímica (Hintzen et al., 1994, supra, Hishima et al., 2000, Am J Surg Pathol 24: 742-46).
Además de su expresión en células normales, se ha reportado la expresión de CD70 en diferentes tipos de cánceres incluyendo linfomas, carcinomas y tumores de origen neural. En células B malignas, se ha reportado que el 71% de los linfomas de célula B grande difusa, el 33% de los linfomas de centro folicular, el 25% de los linfomas de manto y el 50% de B-CLL expresan CD70 (Lens et al., 1999, Br J Haematol 106: 491-503). El CD70 se expresa frecuentemente junto con otros marcadores de activación linfoide en las células malignas de Hodgkin y Reed-Sternberg de la enfermedad de Hodgkin (Gruss y Kadin, 1996, Bailieres Clin Haematol 9: 417-46). Un reporte demuestra la expresión del CD70 en 88% (7 de 8 casos) de carcinomas tímicos y en 20% (1 de 5 casos) de timomas atípicos (Hishima et al., 2000, supra). El segundo tipo de carcinoma en el cual se ha detectado el CD70 es el carcinoma nasofaríngeo. Un estudio reporta la presencia del CD70 en 80% (16 de 20 casos) de biopsias de tumor congeladas instantáneamente obtenidas de carcinomas nasofaríngeos no diferenciados (Agathanggelou et al., 1995, Am J Path 147: 1152-60). El CD70 se ha detectado también en células de tumor cerebral, especialmente en líneas celulares de glioma, en gliomas humanos sólidos y en meningiomas (Held-Feindt y Mentlein, 2002, Int J Cáncer 98: 352-56; Wischlusen et al., 2002, Can Res 62:2592-99).
Se ha propuesto que la transformación de virus incluyendo el virus Epstein-Barr (EBV) y el virus humano de leucemia T (HTLV-1) pueden inducir CD70 en células tales como las células epiteliales que normalmente no expresan CD70 (Agathanggelou et al., supra; Stein et al., 1989, Oxford University Press, p.446). En consecuencia, la expresión de CD70 en células B malignas puede ser un reflejo de la transformación oncogénica (Lens et al., 1999, supra). También, debido a que la expresión de CD70 se induce en células B después del encuentro con el antígeno (Maurer et al., 1990, Eur J Immunol 20: 2679-84; Lens et al., 1996, supra), la expresión estable del CD70 puede reflejar una estimulación antigénica prolongada. Se ha postulado que esto se presenta en linfomas foliculares no de Hodgkin en base a la hipermutación somática en curso (Bahler et al., 1992, Proc Nati Acad Sci USA 89: 6770-74; Bahler et al., 1992, Cáncer Res 52 supl.5547S-51S).
El receptor para CD70 es CD27, una proteína transmembrana tipo I glicosilada de aproximadamente 55 kDa (Goodwin et al., 1993, Cell 73: 447-56; Hintzen et al., 1994, supra). El CD70 se refiere algunas veces como CD27L. El CD27, que existe como un homodímero en la superficie celular (Gravestein et al., 1993, Eur J Immunol 23: 943-50), es un miembro de la superfamilia del receptor TNF como se define por las repeticiones ricas en cisteína de aproximadamente 40 aminoácidos en el dominio extracelular (Smith et al., 1990, Science 248: 1019-23; Lockslcy et al., 2001, Cell 104: 487-501). El CD27 se expresa típicamente por timocitos, células citotóxicas naturales, T y B (Hintzen et al., 1994, Immunol Today 15: 307-11; Lens et al., 1998, Semin Immunol 10: 491-99). En células T en reposo, el CD70 se expresa constitutivamente, aunque la activación antigénica sobre regula adicionalmente la expresión de CD27 (de Jong et al., 1991, J Immunol 146: 2488-94; Hintzen et al., 1993, J Immunol 151: 2426-35). Además, la activación de las células T a través de su complejo de receptor de antígeno de célula T solo o en combinación con la molécula accesoria CD28 libera CD27 soluble proveniente de células T activadas (Hintzen et al., 1991, J Immunol 147: 29-35). Las células B no tratadas no expresan CD27, pero su expresión se induce y, en contraste con el CD70, se sostiene después de la activación antigénica de las células B (Jacquot S et al., 1997 J Immunol 159: 2652-57; Kobata T et al., 1995, Proc Nati Acad Sci USA 92: 11249-53).
En marcado contraste con la expresión restringida de CD27 y CD70 en células de linaje B normales, tanto el CD27 como el CD70 se co-expresan frecuentemente en muchos linfomas no de Hodgkin de célula B y leucemias. Esto puede conducir potencialmente a interacciones funcionales de CD27-CD70 en estas células en forma de un bucle autócrino, dando como resultado la señalización del CD27 y la proliferación inducida por CD70, proporcionando así una ventaja de crecimiento a las células malignas (Lens et al., 1999, supra).
Los datos disponibles soportan un modelo en el cual la ligación del CD27 en linfocitos activados mediante CD70 suministra señales a las células que expresan CD27, incluyendo señales co-estimuladoras en células T, B y citotóxicas. (Ver e.g., Goodwin et al., supra; Hintzen et al., 1995, J Immunol 154:2612-23; Oshina et al., 1998, Int Immunol 10:517-26; Smith et al., supra; Van Lier et al., 1987, J Immunol 139:1589-96; Gravestein et al., 1995, Int Immunol 7:551-7; Tesselaar et al., 1997, J Immunol 159:4959-65; Jacquot et al., supra; Agematsu et al., 1998, Blood 91:173-80; Kobata et al., supra; Agematsu et al., 1997, Eur J Immunol 27:2073-79; Sugita et al., 1992, J Immunol 149:1199-1203; Orengo et al., 1997, Clin Exp Immunol 107:608-13). Se ha demostrado que los anticuerpos contra CD70 tanto murino como humano inhiben tales actividades, presuntamente bloqueando la interacción de CD70/CD27 (Hintzen et al., 1994, supra; Hintzen et al., 1995, supra; Oshima et al., supra).
Se encuentra disponible una información limitada acerca de la modulación de las funciones celulares a través de la señalización de CD70 a la interacción de CD70/CD27. i.e., 'señalización inversa'. Algunos anticuerpos CD70 tienen la capacidad de aumentar la proliferación de la célula T cuando se presentan a células T que expresan CD70, ya sea reticuladas con un anticuerpo secundario o inmovilizadas sobre placas de cultivo de tejido (Bowman et al., 1994, J Immunol 152: 1756-61; Brugnoni, 1997, Immunol Lett 55: 99-104). Tal 'señalización inversa' también se ha descrito en un subconjunto de células B de leucemia linfocítica crónica (B-CLL) y el CD70 puede funcionar como un receptor para transducir señales para facilitar la proliferación de células B-CLL purificadas estimuladas por PMA (Lens et al., 1999, supra). Estas observaciones sugieren situaciones en las cuales la implicación de CD27 y CD70 puede dar como resultado el suministro de señales agonísticas a las células que expresan tanto CD27 como CD70.
El papel de la co-estimulación de CD70/CD27 en enfermedades autoinmunes mediadas por células se ha investigado en un modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (Nakajima et al., 2000, J Neuroimmunol 109: 188-96). La administración in vivo de un mAb de CD70 anti-ratón particular (clon FR-70) suprimió marcadamente el inicio de EAE inhibiendo la producción de TNF-alfa inducido por antígeno sin afectar la preparación de la célula T, la producción de Ig o el balance células THI/TH2· Sin embargo, tal tratamiento tuvo poca eficacia en la enfermedad establecida. Se ha reportado que la expresión de CD70 en células T aumentó por medio del TNF-alfa y el IL-12 y se sub reguló por medio de IL4 (Lens et al., 1998, supra). Por tanto, las interacciones de célula T a célula T mediadas por CD70/CD27 pueden jugar un papel en el aumento de las respuestas inmunes mediadas por THi más que de las respuestas mediadas por TH2· Soportando esta hipótesis, el mAb CD70 anti-ratón FR-70 también es efectivo para inhibir la artritis inducida por colágeno mediada por THi (Nakajima et al., 2000, supra). En contraste, el mismo mAb CD70 anti-ratón no mostró ninguna eficacia en la modulación del lupus en ratones F1 NZB/NZW ni en infección mayor de leishmania experimental en ratones BALB/c susceptibles, de los cuales ambos son predominantemente respuestas autoinmunes mediadas por TH2 (Nakajima et al., 1997, J Immunol 158, 1466-72; Akiba et al., 2000, J Exp Med 191:375-380).
Aun no se ha investigado el papel de CD70 en enfermedad aguda de injerto contra huésped (aGVHD), otra respuesta inmune mediada por THi. La GVHD es una consecuencia mayor y frecuentemente letal de la terapia de trasplante alogénico de médula ósea (BMT) que se presenta cuando se encuentran presentes diferencias de histocompatibilidad del antígeno entre el donante de médula ósea y el receptor del trasplante (den Haan et al., 1995, Science 268: 1476). La GVHD se ocasiona por células T maduras presentes en la médula trasplantada, así como en otras poblaciones celulares menores (Giralt y Champlin, 1994, Blood (Sangre) 84: 3603). Es de notar que el CD70 se ha detectado in vivo en células CD4+ en condiciones caracterizadas por la reacción alogénica, y en casos de prendimiento de células T maternas en pacientes con severa deficiencia inmune combinada (Brugnoni et al., Immunol Lett 55: 99-104). La profilaxis de GVHD se logra por medio de agentes inmunosupresores de célula pan-T tales como ciclosporina, corticoesteroides o metotrexato. Además de la falta de especificidad, estos agentes también se asocian con efectos secundarios adversos significativos. Para limitar estos efectos indeseables y la interrupción de las funciones normales de las células T, son muy necesarias otras intervenciones terapéuticas en base a la dirección selectiva de las células T que participan directamente en el alo-reconocimiento y el rechazo al trasplante.
El CD70 es un objetivo potencialmente útil para la inmunoterapia dirigida al anticuerpo. Como se indicó anteriormente, el CD70 tiene un patrón de expresión restringido en células normales: la expresión de CD70 se restringe mayormente a células T y B activadas recientemente con antígeno bajo condiciones fisiológicas, y su expresión se sub-regula cuando cesa la estimulación antigénica. Se considera que el papel clave del CD70 es facilitar la diferenciación celular en plasma y contribuir a la generación y el mantenimiento de la memoria de la célula T a largo plazo. Además, la evidencia proveniente de modelos animales sugiere que la interacción no regulada de CD70/CD27 puede contribuir a trastornos inmunológicos y, en humanos, los datos experimentales también apuntaron a una regulación anormal potencial de la trayectoria de CD70/CD27 en trastornos inmunes mediados por THi tales como, e.g., artritis reumatoide, psoriasis, y esclerosis múltiple. Es de particular interés que el CD70 se expresa en una variedad de células transformadas incluyendo células B de linfoma, células Hodgkin y Reed-Sternberg, células malignas de origen neural y una cantidad de carcinomas.
Varios grupos han demostrado el efecto inhibitorio del mAb anti-CD70 tanto en modelos in vitro de activación de linfocitos como en modelos animales de respuestas mediadas por THi. El foco se ha colocado en el uso de anticuerpos para bloquear la trayectoria de co-estimulación de CD70/CD27 para lograr la eficacia terapéutica. Sin embargo, una desventaja principal de tal procedimiento es el gran número de receptores de señalización, e.g., la trayectoria co estimuladora de CD28/CD80/CD86, conocidos por participar en enfermedades inmunológicas. Consecuentemente, el bloqueo de una trayectoria de señalización específica puede tener solamente un mínimo impacto en el desarrollo de la enfermedad. Esto se soporta por las observaciones de que el mAb anti-CD70 puede inhibir solo parcialmente la activación de la célula T inducida por células estimuladoras alogénicas (Hintzen et al., 1995, supra) y que un mAb anti-CD70 no mostró eficacia terapéutica en EAE una vez establecida la enfermedad (Nakajima et al., 2000, supra).
Por tanto, existe la necesidad en la téenica de desarrollar un procedimiento para agotar o inhibir el crecimiento de células que expresan CD70 implicadas en cánceres y/o enfermedades inmunológicas por medios diferentes a o además de, el bloqueo de la interacción de CD70/CD27. Debido a que el CD70 se expresa en la superficie de células dendríticas que presentan el antígeno maduro, células T activadas y células B activadas, los agentes que pueden dirigir e inhibir o agotar células CD70+ pueden probar ser efectivos en el retiro de células que presentan el antígeno, que presentan auto-antígenos y que transgreden las células T o B auto-reactivas activadas, así como las células de tumor que expresan CD70.
Los procedimientos que se han utilizado para incrementar la eficacia terapéutica de anticuerpos son radio-etiquetado en combinación con quimioterapia; sin embargo, estos procedimientos incluyen la asociación con efectos secundarios no deseados. Por ejemplo, la terapia de isótopo se asocia con la mielosupresión (Witzig, 2001, Cáncer Chemother Pharmacol 48 (Supl.1): S91-5), y la combinación de la terapia con anticuerpos y quimioterapéuticos se asocia con la inmunosupresión. Además, es difícil producir sustancias isotópicamente etiquetadas, y los pacientes experimentan frecuentemente recaídas después del tratamiento inicial con sustancias isotópicamente etiquetadas.
Por consiguiente, existe la necesidad de ADCs anti-CD70 construidos de tal manera que tengan la capacidad de ejercer un efecto citotóxico, citostático o inmunosupresor clínicamente útil en células que expresan CD70, particularmente sin ejercer efectos indeseables en las células que no expresan CD-70. Tales compuestos serían agentes terapéuticos útiles contra cánceres que expresan CD70 o trastornos inmunes mediados por células que expresan CD70. Más recientemente, se han identificado MAbs tales como 2H5. Por tanto se necesitan conjugados de anticuerpo anti-CD70-fármaco que puedan utilizarse para visualización, diagnóstico y/o usos terapéuticos. La presente invención proporciona tales conjugados de anticuerpo-fármaco para su uso en inmunología y oncología.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente anticuerpos anti-CD70 enlazados a residuos tóxicos a través de uno o más aminoácidos no naturales con uno o más enlazadores y métodos para producir tales aminoácidos y polipéptidos no naturales.
Algunas modalidades de la presente invención proporcionan un anticuerpo anti-CD70 que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD70 comprende un aminoácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD70 comprende dos aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD70 comprende dos o más aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades anticuerpo anti-CD70 comprende 3, 4, 5 o 6 o más aminoácidos no naturalmente codificados, o más modificaciones post-traduccionales. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD70 comprende la secuencia de cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades de la presente invención, el anticuerpo anti-CD70 comprende la SEQ ID NO: 1 y 2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD70 se encuentra enlazado a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD70 se encuentra enlazado a un enlazador, polímero, o molécula biológicamente activa a través de un aminoácido no naturalmente codificado en el anticuerpo anti-CD70.
Algunas modalidades de la presente invención describen un residuo tóxico, o una sal del mismo, que comprende la Fórmula (I): en donde: Z tiene la estructura de COR8, alquilo Ci-C6, o tiazol; Rs es OH o -NH-(alquileno-O)n-NH2; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; Y se selecciona del grupo que consiste de una hidroxilamina, metilo, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, azida, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino, y eno-diona; L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(0)-, -(alquileno-0)n- (CH2)n'-NHC(O)-(CH2)n"-C(Me)2-S-S-(CH2)n- NHC(O)-(alquileno- 0)n ---alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno- C(0)-W-, - (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; W tiene la estructura de: U tiene la estructura de : encuentra ausente, Y es metilo, R5 es COR8, y R8 es -NH-(alquileno-O)n-NH2; y cada n, h' , n'', n''' y n'''' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno.
En algunas modalidades, R5 es tiazol. En otras modalidades, R6 es H. En ciertas modalidades, Ar es fenilo. En modalidades agregadas o adicionales, R7 es metilo. En algunas modalidades, n es un entero de 0 a 20, de Oa lOo de 0 a 5.
En algunas modalidades , se describe un compuesto que comprende la Fórmula ( II) : En ciertas modalidades, L es - (alquileno-O)n-alquileno-. En modalidades específicas, cada alquileno es -CH2CH2-, n es igual a 3, y R7 es metilo. En otras modalidades, L es -alquileno-. En modalidades específicas, cada alquileno es -CH2CH2- y R7 es metilo o hidrógeno. En ciertas modalidades, L es -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-. En ciertas modalidades específicas, cada alquileno es -CH2CH2-, n es igual a 4, y R7 es metilo. En modalidades adicionales o alternativas, L es -(alquileno-O)n-(CH2)n -NHC(O)-(CH2)n---C(Me)2-S-S-(CH2)n----NHC(0)-(alquileno-O)n----alquileno-. En modalidades específicas, cada alquileno es -CH2CH2-, n es igual a 1, n' es igual a 2, n'' es igual a l, n es igual a 2, n'''' es igual a 4, y R7 es metilo.
En algunas modalidades, Y es azida. En otras modalidades, Y es ciclooctina. En modalidades específicas, la ciclooctina tiene la estructura de: cada R19 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-C6, éster, éter, tioéter, aminoalquilo, halógeno, alquil éster, aril éster, amida, aril amida, alquil haluro, alquil amina, ácido alquil sulfónico, alquil nitro, tioéster, sulfonil éster, halosulfonilo, nitrilo, alquil nitrilo, y nitro; y q es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.
Algunas modalidades de la presente invención describen un compuesto, o sal del mismo, que comprende la Fórmula (III) , (IV) , (V) o (VI) : .
Re — — en donde : Z tiene la estructura de: R5 es H, COR8, alquilo Ci-C6, o tiazol; Rg es OH; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; Y, y V se seleccionan cada uno del grupo que consiste de una hidroxilamina, metilo, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, azida, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino, y eno-diona; Llf L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste de un enlace, -alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, -alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J- (alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n-alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: I cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno.
En ciertas modalidades, se describe un compuesto que comprende la Fórmula (VII): I I — — En ciertas modalidades , L es - (alquileno-O)n-alquileno-J-, L2 es -alquileno'-J'-(alquileno-O)n--alquileno-, L3 es -J''-(alquileno-O)n.-alquileno-, alquileno es -CH2CH2-, alquileno' es - - n' y n'' son 3, J tiene la estructura de tienen la estructura de AtAoA H , y R7 es metilo. En otras modalidades, Li es -J- (alquileno-O)n-alquileno-, L2 es -(alquileno-0)n--alquileno-J'-alquileno'-, L3 es -(alquileno-O)n---alquileno-J''-, alquileno es -CH2CH2-, alquileno' es -(CH2)4-, n'' son 4, y J, J' y J'' tienen la estructura En algunas modalidades, Y es azida. En otras modalidades, Y es ciclooctina. En modalidades específicas, la ciclooctina tiene la estructura de: cada RI9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo Ci~C6, alcoxi Ci-C6, áster, éter, tioéter, aminoalquilo, halógeno, alquil áster, aril áster, amida, aril amida, alquil haluro, alquil amina, ácido alquil sulfónico, alquil nitro, tioéster, sulfonil áster. halosulfonilo, nitrilo, alquil nitrilo, y nitro; y q es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.
Ciertas modalidades de la presente invención describen un compuesto que comprende la Fórmula (VIII) o (IX): en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, CON (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido,- R3 y R4 son cada uno independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; Z tiene la estructura de: R5 es H, CO2H alquilo C -C6, o tiazol ; R6 es OH o H ; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Cx-C6 o hidrógeno; L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(0) -(alquileno-O)n (CH2)n'-NHC(0)-(CH2)n-.-C(Me)2-S-S-(CH2)n- NHC(O)-(alquileno- O)n" "-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno C(0)-W-, - (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(0)-, y (alquileno-0)n-alquileno-U-alquileno-; W tiene la estructura de: U tiene la estructura de: cada n, h', n'', n''' y n'''' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno; o un metabolito activo, o un profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas modalidades, Ri es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es anti-CD70. En otras modalidades, R2 es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo anti-CD70. En ciertas modalidades específicas, el anticuerpo es CD70-2H5- HA119-NCA1.
Algunas modalidades de la presente invención describen un compuesto, o sal del mismo, que comprende la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII): II . en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')- CS (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, (R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, S(0)kN (R')- N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N (R')-, N(R')S(0)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N- -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R3 y R4 son cada uno independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; Z tiene la estructura de: R5 es H, CO2H, alquilo C -C6 , o tiazol ; R6 es OH o H ; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; L1 L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste de un enlace, -alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J- (alquileno-O)n- alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n. alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W--alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-N e)n-alquileno-W-, J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMe-alquileno' NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno.
En algunas modalidades, ¾ es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades específicas, el anticuerpo es herceptin. En otras modalidades, R2 es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo es aCD70. En algunas modalidades, el anticuerpo se deriva de cualquier anticuerpo 0íCD70 conocido. En ciertas modalidades específicas, el anti cuerpo es ARX-OÍCD70.
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un método para derivatizar un análogo de dolastatina que comprende la Fórmula (I), (III), (IV), (V), o (VI), comprendiendo el método poner en contacto el análogo de dolastatina con un reactivo de la Fórmula (XXXVII), en donde la Fórmula (I), (III), (IV), (V), o (VI) corresponde a: — I — en donde : Z tiene la estructura de: R5 es H, CORg , alquilo Ci-C6, o tiazol ; R8 es OH o -NH- (alquileno-O) n-NH2 ; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo O -Ob o hidrógeno ; Y es NH2-O- O metilo; L, Li, L2, L3/ y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un enlace, alquileno-, -alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, (alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH2)n'-NHC(O)- (CH2)n— C(Me)2-S-S—(CH2)n' "-NHC(O)-(alquileno-O)n-----alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(O)-W-, (alquileno-O)-alquileno-J-, -alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno', -J- (alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J- (alquileno-O)n'-alquileno-J'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J- (alquileno-NMe)-alquileno-W-, y J- (alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: : cada J y J' tienen independientemente la estructura de: o L se encuentra ausente, Y es metilo, R5 es COR8, y R8 es -NH-(alquileno-O)n-NH2; y cada n, h', n'', n''' y n'''' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno; en donde la Fórmula (XXXVII) corresponde a: (XXXVII) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(O)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, S(O)kN(R')~, N(R')C(O)N (R')-, (R')C(S)N (R')-, N (R')S(0)k (R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; K es R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, resina, al menos un aminoácido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, resina, al menos un aminoácido o polinucleótido; y R3 y R4 son cada uno independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo.
En algunas modalidades, el análogo de dolastatina derivatizado comprende al menos un aminoácido que contiene oxima que tiene la estructura de la Fórmula (VIII), (IX), (X), (XI), (XII), O (XIII): -A 0 RR^ \ HN Ri M Me >.A Me R7 O A Me OMe O Me Me MeO ^NH ,*-1 ? O \ Me Me n - eVT/XMMbe r-^ z (X) R†N B ^'AA O R7 O ^ Me OMeO / \ Jf R U Me Me MeO ^ NJH R 4 3 R3 T RR22 ° Z En modalidades específicas, El análogo de dolastatina se pone en contacto con el reactivo de la Fórmula (XXXVII) en solución acuosa bajo condiciones ligeramente acídicas.
Ciertas modalidades de la presente invención describen un compuesto que comprende la Fórmula (XXV) , (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), O (XXX): , - R7 Q, , Me OMe O OMe O Me Me Ar R6 en donde : Z tiene la estructura de: R5 es H, CO2H, alquilo C -C6, o tiazol R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; Ri es H, un grupo de protección amino, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección áster, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R4 es H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; L, Li, L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un enlace, alquileno-, -alquileno-C (0) -, -alquileno-J-, - (alquileno-O) n-alquileno-, - (alquileno-O) n-alquileno-C (O) - , - (alquileno-O) n- J-, - (alquileno-O) n-J-alquileno- , - (alquileno-O) n- (C¾) h - NHC (O) - (CH2) n' --C (Me) 2-S-S- (C¾) n- - ,-NHC (0) - (alquileno-O) n -alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(0)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, -alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno', -J- (alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J- (alquileno-O)n--alquileno-J'-, -W-, -alquileno- -, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J- (alquileno-NMe)n~ alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(0)-, (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileño'-NMe-alquileño''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: U tiene la estructura de: cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno; y cada Ri6 se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alquilo, NO2, CN, y alquilo sustituido.
En algunas modalidades, Ri es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades específicas, el anticuerpo es aCD70. En otras modalidades, R2 es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidad ;s específicas, el anticuerpo es OÍCD70.
Algunas modalidades de la presente invención describen un compuesto que comprende la Fórmula (XXXI), (XXXII) , (XXXIII) , (XXXIV) , (XXXV) , o (XXXVI) : i ~ _ - . en donde : Z tiene la estructura de: R5 es H, CO2H, alquilo C -C6, o tiazol; R6 es OH H; Ar es fenilo o piridina; Ri es H, un grupo de protección amino, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección áster, resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R4 es H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido; R7 es alquilo 0i-0e o hidrógeno; L, Li, L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un enlace, alquileno-, -alquileno-C(0)-, -alquileno-J-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n- J-, - (alquileno-O)-J-alquileno-, - (alquileno-O)n-(CH2)n'~ NHC(O)-(CH2)n-.-C(Me)2-S-S-(C¾)n- NHC(O)-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(0)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, -alquileno'-J-(alquileno-O)n_ alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno', -J- (alquileno-O)-alquileno-, -(alquileno-0)n-alquileno-J- (alquileno-O)n--alquileno-J'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)-alquileno-W-, -J- (alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-Me-alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; cada J y J' tienen independientemente la estructura de : cada n y n son independientemente enteros mayores iguales a uno; D tiene la estructura de: · cada R17 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", (alquileno o alquileno sustituido)-S-S-(arilo o arilo sustituido), C(O)R", C(O)2R", o C(0)N(R")2 en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, o aralquilo sustituido; cada Zi es un enlace , CR17R17 , O , S , NR' , CR17RI7 -CR17R17 , CR17R17— 0 , O-CR17R17 , CR17R17— S , S-CR17R17 , CR17R17-NR' , o NR' -CR17R17 ; cada R' es H, alquilo, o alquilo sustituido; cada Z2 se selecciona del grupo que consiste de un enlace, C(0)~, -C(S)-, alquileno C1-C3 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C3 opcionalmente sustituido, y heteroalquilo opcionalmente sustituido; cada Z3 se selecciona independientemente del grupo que consiste de un enlace, alquileno Ci-C4 opcionalmente sus ituido, alquenileno C!-C4 opcionalmente sustituido. heteroalquilo opcionalmente sustituido, -O-, -s-, C ( O ) C (S) y -N (R' ) - ; cada T3 es un enlace, C(R'')(R''), 0, o S; con la salvedad de que cuando T3 es O o S, R'' no puede ser halógeno; cada R'' es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; m y p son 0, 1, 2, o 3, siempre que al menos uno de m o p no sea 0; — en donde (a) indica el enlace al grupo B y (b) indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo heterociclo,- - (b) T c-c-l h, ¾ a, en donde (a) indica el enlace al grupo B y (b) indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo heterociclo; M4 es en donde (a) indica el enlace al grupo B y (b) indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo heterociclo; cada RI9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo Ci-C6, alcoxi Cx-Cg, éster, éter, tioéter, aminoalquilo, halógeno, alquil éster, aril éster, amida, aril amida, alquil haluro, alquil amina, ácido alquil sulfónico, alquil nitro, tioéster, sulfonil éster, halosulfonilo, nitrilo, alquil nitrilo, y nitro; q es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11; y cada Ri6 se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alquilo, NO2, CN, y alquilo sustituido.
En algunas modalidades, Ri es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades específicas, el anticuerpo es OÍCD70. En otras modalidades, R2 es un polipéptido. En modalidades específicas, el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades específicas, el anticuerpo es aCD70.
En algunas modalidades, se describe un compuesto que comprende la Fórmula (XXXI-A): En ciertas modalidades, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los compuestos descritos y un vehículo, excipiente o aglutinante farmacéuticamente aceptable.
En modalidades adicionales o alternativas se encuentran métodos para detectar la presencia de un polipéptido en un paciente, comprendiendo el método administrar un polipéptido que comprende al menos un aminoácido no natural que contiene heterociclo y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene heterociclo resultante modula la inmunogenicidad del polipéptido en relación al polipéptido de aminoácido homólogo de origen natural.
Debe entenderse que los métodos y composiciones descritos en la presente no se limitan a la metodología, protocolos, líneas celulares, construcciones y reactivos particulares descritos en la presente y como tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el propósito de describir solamente las modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de los métodos y composiciones descritos en la presente, que solamente se limitarán por las reivindicaciones anex s.
Como se utilizan en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tiene el mismo significado comúnmente entendido por el de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenecen las invenciones descritas en la presente. Aunque cualquier método, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en la presente puede utilizarse para llevar a la práctica o para probar las invenciones descritas en la presente, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos.
Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad con el propósito de describir y detallar, por ejemplo, las construcciones y metodologías descritas en las publicaciones, que pueden utilizarse en conexión con las invenciones descritas en la presente. Las publicaciones detalladas en la presente se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe interpretarse como una admisión de que los inventores descritos en la presente no están autorizados para ante fechar tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón.
Los términos "enlace a base de aldol" o "enlace a base de aldol mezclado" se refieren a la condensación catalizada por ácido o base de un compuesto carbonilo con el enolato/enol de otro compuesto carbonilo, que puede o no ser el mismo, para generar un compuesto b-hidroxi carbonilo - un aldol.
El término "etiqueta de afinidad" como se utiliza en la presente, se refiere a una etiqueta que se enlaza de manera reversible o irreversible a otra molécula, ya sea para modificarla, destruirla o para formar un compuesto con la misma. A modo de ejemplo, las etiquetas de afinidad incluyen enzimas y sus sustratos, o anticuerpos y sus antígenos.
Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se utilizan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo enlazados a moléculas a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otra molécula significa, a menos que se defina de otra manera, un radical de hidrocarburo de cadena recta o ramificada, o cíclico, o una combinación de los mismos, que puede estar totalmente saturado, mono o poli-insaturado y puede incluir radicales di- y multivalentes que tienen el número de átomos de carbono designado (i.e., Ci-Cio significa de uno a diez carbonos). Ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y lo similar. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más enlaces dobles o enlaces triples. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1 y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros más altos. El término "alquilo", a menos que se anote de otra manera, también pretende incluir los derivados de alquilo definidos en más detalle en la presente, tales como "heteroalquilo", "haloalquilo" y "homoalquilo".
El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otra molécula significa un radical bivalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, mediante (-CH2-)n en donde n puede ser de 1 a aproximadamente 24. Solamente a modo de ejemplo, tales grupos incluyen, pero no se limitan a, grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono tales como las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2-. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que tiene generalmente ocho o menos átomos de carbono. El término "alquileno", a menos que se defina de otra manera, también pretende incluir los grupos descritos en la presente como "heteroalquileno".
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y no naturales, así como a análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos naturalmente codificados son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina) y pirolisina y selenocisteína. Análogos de aminoácido se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, solamente a modo de ejemplo. un a-carbono que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (a modo de ejemplo, norleucina) o pueden tener estructuras de péptido modificadas mientras retienen aún la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Ejemplos no limitantes de análogos de aminoácido incluyen homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina.
En la presente pueden referirse los aminoácidos ya sea por sus nombre, sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, Adicionalmente, los nucleótidos pueden referirse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Un "grupo de modificación de terminal amino" se refiere a cualquier molécula que pueda unirse a un grupo amina terminal. A modo de ejemplo, tales grupos amina terminal pueden encontrarse al final de las moléculas poliméricas, en donde tales moléculas poliméricas incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos. Los grupos de modificación de terminal incluyen pero no se limitan a, varios polímeros, péptidos o proteínas solubles en agua. Solamente a modo de ejemplo, los grupos de modificación de terminal incluyen polietilenglicol o albúmina de suero. Los grupos de modificación de terminal pueden utilizarse para modificar las características terapéuticas de la molécula polimérica, incluyendo pero sin limitarse a el incremento de la vida media en suero de los péptidos.
Por "anticuerpo" en la presente se entiende una proteína que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por todos o parte de los genes del anticuerpo. Los genes de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, épsilon, y mu, así como los genes de miríada de región variable de inmunoglobulina. Anticuerpo en la presente pretende incluir anticuerpos de longitud total y fragmentos de anticuerpo, e incluye anticuerpos que existen naturalmente en cualquier organismo o fabricados (e.g., son variantes).
El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, anticuerpos monoclonales o policlonales. El término "anticuerpo" también abarca anticuerpos multiespecífíeos tales como los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos humanos se producen comúnmente de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas comprendiendo cada una regiones variables y regiones constantes. La región variable de cadena ligera comprende 3 CDRs, identificadas en la presente como CDRL1, CDRL2 y CDRL3 flanqueadas por regiones de estructura. La región variable de cadena pesada comprende j3 CDRs, identificadas en la presente como CDRH1, CDRH2, y CDRH3, flanqueadas por regiones de estructura.
Los anticuerpos anti-CD70 conocidos en la téenica son adecuados para uso con esta invención. Ejemplos no limitantes de los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y y 1F4 y las secuencias de aminoácidos se proporcionan en la Solicitud de Patente de E.U. publicada 20100150950, incorporada en la presente mediante la referencia. Las secuencias de aminoácidos VH de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y y 1F4 se muestran en las SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 4, 5, 73, y 6 respectivamente. Las secuencias de aminoácido VL de 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y y 1F4 se muestran en las SEQ ID Nos. 7, 8, 9, 10, 11, 11 y 12, respectivamente de la Solicitud de Patente de E.U. publicada 201001500950 (teniendo la 69A7 y la 69A7Y la secuencia de aminoácidos VL de la SEQ ID NO: 11). Cualquier secuencia de cadena pesada conocida puede combinarse con secuencias de cadena ligera y, en algunas modalidades de la presente invención, existe un aminoácido no naturalmente codificado en la región constante de los anticuerpos. En algunas modalidades de la presente invención existen dos o más aminoácidos no naturalmente codificados en la región constante de los anticuerpos. Por consiguiente, en un aspecto, esta descripción proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de enlace al antlgeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.1, 2, 3, 4, 5, 6, y 73; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID Nos.: 7, 8, 9, 10, 11, y 12; y (c) un aminoácido no naturalmente codificado; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a CD70.
Los anticuerpos anti-CD70 (aCD70) conocidos en la téenica son adecuados para su uso en la presente invención. Por ejemplo, las secuencias para el anticuerpo 2H5 se proporcionan en la Patente de E.U. No. 8,124,738 y se incorpora en la presente mediante la referencia.
El término "fragmento de enlace al antígeno" como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de enlazarse a un antígeno. Se ha demostrado que la función de enlace al antígeno del anticuerpo puede llevarse a cabo por medio de fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "fragmento de enlace al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente bisulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y VH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento cLAb (Ward et al., (1989) Nature 341-544-546), que consiste de un dominio VH; (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR), e.g., VH CDR3 que comprende o no una secuencia adicional (enlazador, región(es) de estructura, etc.) y (v) una combinación de dos a seis CDRs aisladas que comprenden o no una secuencia adicional (enlazador, región(es) de estructura, etc.). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican para genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, por medio de un enlazador sintético que les permite producirse como una cadena de polipéptido única en la cual las regiones VL y VH forman pares para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); ver, e.g., Bird et al., (1988) Science 242:423-426; y Huston et al., (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también pretenden estar abarcados dentr5o del término "fragmento de enlace al antígeno" de un anticuerpo. Además, los fragmentos de enlace al antígeno incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace que comprenden (i) un polipéptido de dominio de enlace (tal como una región variable de cadena pesada, una región variable de cadena ligera, o una región variable de cadena pesada fusionada a una región variable de cadena ligera a traves de un péptido enlazador) que se fusiona a un polipéptido de región de articulación de inmunoglobulina; (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región de articulación; y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región constante CH2. La región de articulación puede modificarse remplazando uno o más residuos de cisteína con residuos de serina a fin de evitar la dimerización. Tales proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace se describen además en la US 2003/0118592 y la US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando téenicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica y los fragmentos se analizan por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Un sitio de enlace al antígeno típico se comprende de las regiones variables formadas por la formación de pares de una inmunoglobulina de cadena ligera y una inmunoglobulina de cadena pesada. La estructura de las regiones variables de anticuerpo es muy consistente y exhibe estructuras muy similares. Estas regiones variables se comprenden típicamente de regiones de estructura (FR) relativamente homologas ínter-espaciadas con tres regiones hipervariables denominadas Regiones Determinantes de Comple entariedad (CDRs). La actividad de enlace total del fragmento de enlace al antígeno se dicta frecuentemente por medio de la secuencia de las CDRs. Las FRs frecuentemente juegan un papel en el posicionamiento y la alineación apropiados en tres dimensiones de las CDRs para un óptimo enlace al antígeno.
De hecho, debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que muestran las propiedades de los anticuerpos específicos de origen natural construyendo vectores de expresión que incluyen las secuencias CDR provenientes del anticuerpo específico de origen natural injertado sobre secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, e.g., Riechmann L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones P. et al., 1996, Nature 321:522-525; y Queen C. et al., 1989, Proc Nati Acad Sci USA 86:10029-10033). Tales secuencias de estructura pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias del gen de anticuerpo de línea terminal. Estas secuencias de línea germinal diferirán de las secuencias del gen de anticuerpo maduro debido a que no incluirán genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante V (D)J uniendo durante la maduración de la célula B. Las secuencias del gen de línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo del repertorio secundario de alta afinidad que contiene mutaciones a través de todo el gen variable pero típicamente agrupadas en las CDRs. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción de terminal amino de la región de estructura 1 y en la porción de terminal carboxi de la región de estructura 4. Además muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de enlace del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular a fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de enlace similares a las del anticuerpo original. La secuencia parcial de cadena pesada y ligera que expande las regiones CDR es típicamente suficiente para este propósito. La secuencia parcial se utiliza para determinar cuál variable de línea germinal y segmentos del gen de unión contribuyeron a los genes variables de anticuerpo recombinados. La secuencia de línea germinal se utiliza entonces para llenar las porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias guía de cadena pesada y ligera se dividen durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para agregar las secuencias faltantes, pueden combinarse secuencias de ADNc clonadas con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación PCR. Alternativamente, la región variable completa puede sintetizarse para crear un clon de la región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas tales como la eliminación o la inclusión de sitios de restricción particulares o la optimización de codones particulares.
Por supuesto, la totalidad o porciones de la región de estructura del anticuerpo descrito en la presente pueden utilizarse en conjunción con las CDRs a fin de optimizar la afinidad, la especificidad o cualquier otra propiedad deseada del anticuerpo. Por "anticuerpo" se entiende en la presente una proteína que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por todos o parte de los genes del anticuerpo. Los genes de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, épsilon, y mu, así como a los genes miríada de la región variable de inmunoglobulina. Anticuerpo en la presente pretende incluir los anticuerpos de longitud total y fragmentos de anticuerpo, e incluyen anticuerpos que existen naturalmente en cualquier organismo o fabricados (e.g., son variantes).
Por "fragmento de anticuerpo" se entiende cualquier forma de un anticuerpo diferente a la forma de longitud total. Los fragmentos de anticuerpo en la presente incluyen anticuerpos que son los componentes más pequeños que existen dentro de anticuerpos de longitud total y anticuerpos que se han fabricado. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fe, Fab, y (Fab')2, Fv monocatenario (scFv), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de CDRs, regiones variables, regiones de estructura, regiones constantes, cadenas pesadas, cadenas ligeras y regiones variables y moléculas no anticuerpo de andamiaje alternativas, anticuerpos biespecífíeos, y lo similar (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng.2:339-76; Hudson 1998 Curr. Opin. Biotechnol.9:395-402). Otra sub estructura funcional es un Fv monocatenario (scFv) comprendido de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina covalentemente conectadas por un enlazador de péptido (S-z Hu et al., 1996, Cáncer Research, 56:3055-3061). Estas pequeñas proteínas (Mr 25,000) generalmente retienen especificidad y afinidad para el antígeno en un polipéptido único y pueden proporcionar un bloque de construcción conveniente para moléculas específicas al antígeno más grandes. A menos que se anote específicamente de otra manera, las declaraciones y reivindicaciones que utilizan el término "anticuerpo" o "anticuerpos" incluyen específicamente "fragmento de anticuerpo" y "fragmentos de anticuerpo".
Por "conjugado de anticuerpo-fármaco" o "ADC", como se utiliza en la presente, se entiende una molécula de anticuerpo, o un fragmento de la misma, covalentemente enlazada a una o más moléculas biológicamente activas. La molécula biológicamente activa puede conjugarse al anticuerpo a través de un enlazador, un polímero u otro enlace covalente.
El término "aromático" o "arilo", como se utiliza en la presente, se refiere a una estructura de anillo cerrado que tiene al menos un anillo que tiene un sistema pi electrón conjugado e incluye grupos tanto arilo carbocíclico como arilo heterocíclico (o "heteroarilo" o "heteroaromáticos"). El grupo aromático carbocíclico o heterocíclico puede contener de 5 a 20 átomos de anillo. El término incluye anillos monocíclicos covalentemente enlazados o grupos policíclicos de anillo fusionado (i.e., anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono). Un grupo aromático puede ser no sustituido o sustituido. Ejemplos no limitantes de grupos "aromáticos" o "arilo" incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, antracenilo, y fenantracenilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo anotados anteriormente se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos en la presente.
Por brevedad, el término "aromático" o "arilo" cuando se utiliza en combinación con otros términos (incluyendo, pero sin limitarse a, ariloxi, ariltioxi, aralquilo) incluye anillos tanto arilo como heteroarilo como se definió anteriormente. Por tanto, el término "aralquilo" o "alcarilo" pretende incluir aquellos radicales en los cuales un grupo arilo se une a un grupo alquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y lo similar) incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (incluyendo pero sin limitarse a, un grupo metileno) se ha remplazado por un heteroátomo, solamente a modo de ejemplo, por un átomo de oxígeno. Ejemplos de tales grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo, y lo similar.
El término "arileno", como se utiliza en la presente, se refiere a un radical de arilo bivalente. Ejemplos no limitantes de "arileno" incluyen fenileno, piridinileno, pirimidinileno, y tiofenileno. Los sustituyentes para los grupos arileno se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables descritos en la presente.
Un "polímero bifuncional", también referido como un "enlazador bifuncional", se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales con la capacidad de reaccionar específicamente con otros residuos para formar enlaces covalentes o no covalentes. Tales residuos pueden incluir, pero no se limitan a, los grupos secundarios en aminoácidos o péptidos naturales o no naturales que contienen tales aminoácidos naturales o no naturales. Los otros residuos que pueden enlazarse al enlazador bifuncional o polímero bifuncional pueden ser residuos iguales o diferentes. Solamente a modo de ejemplo, un enlazador bifuncional puede tener un grupo funcional reactivo con un grupo en un primer péptido, y otro grupo funcional que es reactivo con un grupo en un segundo péptido, mediante lo cual forma un conjugado que incluye el primer péptido, el enlazador bifuncional y el segundo péptido. Se conocen muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para la unión de diversos compuestos a péptidos. Ver, e.g., la Solicitud de Patente Europea No. 188,256; las Patentes de E.U. Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784, 4,680,338 y 4,569,789 que se incorporan mediante la referencia en la presente en su totalidad. Un "polímero multi-funcional" también referido como un "enlazador multi-funcional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales con la capacidad de reaccionar con otros residuos. Tales residuos pueden incluir, pero no se limitan a, los grupos secundarios en aminoácidos o péptidos naturales o no naturales que contienen tales aminoácidos naturales o no naturales (incluyendo, pero sin limitarse a, los grupos secundarios de aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un polímero bifuncional o un polímero multi-funcional pueden ser de cualquier longitud o peso molecular deseados y pueden seleccionarse para proporcionar una separación o conformación particular deseada entre una o más de las moléculas enlazadas a un compuesto y las moléculas o el compuesto a los cuales se enlaza.
El término "biodisponibilidad" como se utiliza en la presente, se refiere a la tasa y la extensión a la cual se suministra una sustancia o su residuo activo a partir de una forma de dosis farmacéutica y se vuelve disponible en el sitio de acción o en la circulación general. Los incrementos en la biodisponibilidad se refieren a incrementar la tasa y la extensión de la sustancia o de su residuo activo a las cuales se suministran a partir de una forma de dosis farmacéutica y se vuelven disponibles en el sitio de acción o en la circulación general. A modo de ejemplo, el incremento en la biodisponibilidad puede indicarse como un incremento en la concentración de la sustancia o de su residuo activo en la sangre en comparación con otras sustancias o residuos activos. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar los incrementos en la biodisponibilidad se proporciona en los ejemplos 21 a 25. Este método puede utilizarse para evaluar la biodisponibilidad de cualquier polipéptido.
El término "molécula biológicamente activa", "residuo biológicamente activo" o "agente biológicamente activo" como se utiliza en la presente significa cualquier sustancia que puede afectar cualquier propiedad física o bioquímica de un sistema, trayectoria, molécula o interacción biológica relacionada con un organismo incluyendo, pero sin limitarse a, virus, bacterias, bacteriófagos, transposones. priones, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se utiliza en la presente, las moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia destinada al diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad en humanos u otros animales, o de otra manera para mejorar el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de molécula pequeña, fármacos duros, fármacos suaves, profármacos, carbohidratos, átomos o moléculas inorgánicos, tintes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxinas, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Las clases de agentes biológicamente activos adecuados para uso con los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, fármacos, profármacos, radionúclidos, agentes de visualización, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-tumor, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroideos, toxinas microbianamente derivadas y lo similar.
Por "actividad biológica moduladora" se entiende el incremento o la disminución de la reactividad de un polipéptido, la alteración de la selectividad del polipéptido, el mejoramiento o la disminución de la selectividad de sustrato del polipéptido. El análisis de la actividad biológica modificada puede llevarse a cabo comparando la actividad biológica del polipéptido no natural con la del polipéptido natural.
El término "biomaterial" como se utiliza en la presente, se refiere a un material biológicamente derivado, incluyendo, pero sin limitarse a, el material obtenido de biorreactores y/o de métodos y téenicas recombinantes.
El término "sonda biofísica" como se utiliza en la presente, se refiere a sondas que pueden detectar o monitorear los cambios estructurales en las moléculas. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, y la "sonda biofísica" puede utilizarse para detectar o monitorear la interacción de las proteínas con otras macromoléculas. Ejemplos de sondas biofísicas incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de giro, un fluoróforo, y grupos foto-activables.
El término "bio-sintéticamente" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier método que utiliza un sistema de traducción (celular o no celular), incluyendo el uso de al menos uno de los siguientes componentes: un polinucleótido, un codón, un ARNt, y un ribosoma. A modo de ejemplo, los aminoácidos no naturales pueden estar "bio-sintéticamente incorporados" en polipéptidos de aminoácido no natural utilizando los métodos y técnicas descritos en la presente, "Generación in vivo de polipéptidos que comprenden aminoácidos no naturales" y en el ejemplo 20 no limitante. Adicionalmente, los métodos para la selección de aminoácidos no naturales útiles que pueden "incorporarse bio-sintéticamente" en polipéptidos de aminoácido no natural, se describen en el ejemplo 20 no limitante.
El término "análogo de biotina" o también referido como "mimético de biotina" como se utiliza en la presente, es cualquier molécula diferente a biotina, que se enlaza con alta afinidad a avidina y/o estreptavidina.
El término "carbonilo" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que contiene un residuo seleccionado del grupo que consiste de -C(O)-, -S(O)-, S(0)2- y -C(S)-, incluyendo, pero sin limitarse a, los grupos que contienen al menos un grupo cetona y/o al menos un grupo aldehido y/o al menos un grupo éster y/o al menos un grupo de ácido carboxílico y/o al menos un grupo tioéster. Tales grupos carbonilo incluyen cetonas, aldehidos, ácidos carboxilicos, ásteres y tioésteres. Adicionalmente, tales grupos pueden ser parte de moléculas lineales, ramificadas o cíclicas.
El término "grupo de modificación de terminal carboxi" se refiere a cualquier molécula que pueda unirse a un grupo carboxi terminal. A modo de ejemplo, tales grupos de terminal carboxi pueden estar al final de las moléculas poliméricas, en donde tales moléculas poliméricas incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos. Los grupos de modificación de terminal incluyen pero no se limitan a, varios polímeros, péptidos o proteínas solubles en agua. Solamente a modo de ejemplo, los grupos de modificación de terminal incluyen polietilenglicol o albúmina de suero. Los grupos de modificación de terminal pueden utilizarse para modificar las características terapéuticas de la molécula polimérica incluyendo, pero sin limitarse a, incrementar la vida media en suero de los péptidos.
El término "grupo químicamente divisible" también referido como "químicamente lábil", como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que se rompe o se divide a su exposición al ácido, base, agentes oxidantes, agentes de reducción, iniciadores químicos o iniciadores de radical.
El término "grupo quimioluminiscente" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que emite luz como resultado de una reacción química sin la adición de calor. Solamente a modo de ejemplo, el luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazinadiona) reacciona con oxidantes como peróxido de hidrógeno (H2O2) en presencia de una base y un catalizador de metal para producir un producto en estado excitado (3-aminoftalato, 3-APA).
El término "cromóforo", como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula que absorbe la luz de longitudes de onda visibles, longitudes de onda UV o longitudes de onda IR.
El término "cofactor" como se utiliza en la presente, se refiere a un átomo o molécula esencial para la acción de una molécula grande. Los cofactores incluyen, pero no se limitan a, iones inorgánicos, coenzimas, proteínas, o algún otro factor necesario para la actividad de las enzimas. Los ejemplos incluyen, heme en hemoglobina, magnesio en clorofila, y iones de metal para proteínas.
"Co-plegado" como se utiliza en la presente, se refiere a procesos, reacciones o métodos de replegado que emplean al menos dos moléculas que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de moléculas no plegadas o inapropiadamente plegadas en moléculas apropiadamente plegadas. Solamente a modo de ejemplo, el "co-plegado" emplea al menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y da como resultado la transformación de polipéptidos no plegados o inapropiadamente plegados en polipéptidos nativos, apropiadamente plegados. Tales polipéptidos pueden contener aminoácidos naturales y/o al menos un aminoácido no natural.
Una "ventana de comparación" como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas utilizadas para comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear las dos secuencias de manera óptima. Tales posiciones contiguas incluyen, pero no se limitan a, un grupo que consiste de aproximadamente 20 a aproximadamente 600 unidades secuenciales, incluyendo de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 unidades secuenciales y de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 unidades secuenciales. Solamente a modo de ejemplo, tales secuencias incluyen polipéptidos y polipéptidos que contienen aminoácidos no naturales, incluyendo las unidades secuenciales, pero sin limitarse a, aminoácidos naturales y no naturales. Adicionalmente, solo a modo de ejemplo, tales secuencias incluyen polinucleótidos siendo los nucleótidos las unidades secuenciales correspondientes. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son muy conocidos en la téenica. La alineación óptima de secuencias para comparación puede conducirse incluyendo pero sin limitarse a mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison WI) o mediante alineación manual e inspección visual (ver, e.g., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular) (suplemento 1995)).
Solamente a modo de ejemplo, un algoritmo que puede utilizarse para determinar la identidad porcentual de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1997) Nuc. Acids Res.25:3389-3402, y en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para llevar a cabo análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como fallas una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como fallas una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y las alineaciones de matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915) (B) de 50, una expectativa (E) de 19, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas. El algoritmo BLAST se lleva a cabo típicamente con el filtro de "baja complejidad" apagado.
El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, e.g., Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787). Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría la oportunidad de una igualdad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, o menor que aproximadamente 0.01, o menor que aproximadamente 0.001.
El término "variantes conservadoramente modificadas" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos naturales y no naturales como de ácidos nucleicos naturales y no naturales, y combinaciones de los mismos. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, "variantes conservadoramente modificadas" se refiere a aquellos ácidos nucleicos naturales y no naturales que codifican para secuencias de aminoácidos naturales y no naturales idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico natural y no natural no codifica para una secuencia de aminoácidos naturales y no naturales para secuencias esencialmente idénticas. A modo de ejemplo, debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican para cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos para el aminoácido alanina. Por tanto, en cualquier posición en donde una alanina se especifica por medio de un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones del ácido nucleico son "variaciones silentes", que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Por tanto a modo de ejemplo cada secuencia de ácido nucleico natural o no natural en la presente que codifica para un polipéptido natural o no natural describe también cada variación silente posible del ácido nucleico natural o no natural. El de experiencia ordinaria en la téenica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico natural o no natural (excepto AUG, que es comúnmente el único codón para metionina, y TGG que es comúnmente el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido nucleico natural o no natural que codifica para un polipéptido natural y no natural se encuentra implícita en cada secuencia descrita.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína que altera, agrega o suprime un aminoácido natural o no natural único o un pequeño porcentaje de aminoácidos naturales y no naturales en la secuencia codificada es una "variante conservadoramente modificada" en donde la alteración da como resultado la supresión de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido natural y no natural con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos naturales funcionalmente similares son muy conocidas en la téenica. Tales variantes conservadoramente modificadas son en adición a y no para excluir las variantes polimórficas, homólogos ínter-especie, y alelos de los métodos y composiciones descritos en la presente.
Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos para los otros. 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), etionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, e.g., Creighton, Proteins Structures and Molecular Properties (Proteínas: estructuras y propiedades moleculares) (W.H. Free an & Co; 2a edición, diciembre 1993).
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se defina de otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Por tanto, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluye enlaces de anillo saturados, parcialmente insaturados y totalmente insaturados. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroáto o puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se encuentra unido al resto de la molécula. El heteroátomo puede incluir, pero no se limita a, oxígeno, nitrógeno o azufre. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y lo similar. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo y lo similar. Adicionalmente, el término abarca estructuras multi-cíclicas, incluyendo pero sin limitarse a, estructuras de anillo bicíclico y tricíclico. De manera similar, el término "heterocicloalquileno" por sí mismo o como parte de otra molécula significa un radical bivalente derivado de heterocicloalquilo, y el término "cicloalquileno" por sí mismo o como parte de otra molécula significa un radical bivalente derivado de cicloalquilo.
El término "ciclodextrina", como se utiliza en la presente, se refiere a carbohidratos cíclicos que consisten de al menos seis a ocho residuos de glucosa en una formación de anillo. La parte externa del anillo contiene grupos solubles en agua; en el centro del anillo se encuentra una cavidad relativamente no polar con la capacidad de alojar pequeñas moléculas.
El término "citotóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que daña las células.
"Agente desnaturalizador" o "desnaturalizante" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier compuesto o material que ocasionará un desplegado reversible de un polímero. Solamente a modo de ejemplo, el "agente desnaturalizador" o "desnaturalizante" puede ocasionar el desplegado reversible de una proteína. La resistencia de un agente desnaturalizador o desnaturalizante se determinará tanto por las propiedades como por la concentración del agente desnaturalizador o desnaturalizante particular. A modo de ejemplo, los agentes desnaturalizadores o desnaturalizantes incluyen, pero no se limitan a, caótropos, detergentes, solventes orgánicos mezclables en agua, fosfolípidos, o una combinación de los mismos. Ejemplos no limitantes de caótropos incluyen, pero no se limitan a, urea, guanidina y tiocianato de sodio. Ejemplos no limitantes de detergentes pueden incluir, pero no se limitan a, detergentes fuertes tales como dodecil sulfato de sodio, o éteres de polioxietileno (e.g., detergentes Tween o Tritón), Sarkosyl, detergentes suaves no tóxicos (e.g., digitonin), detergentes suaves catiónicos tales como N-2,3-(dioleioxi)-propil-N,N,N-trimetilamonio, detergentes iónicos suaves (e.g., colato de sodio o deoxicolato de sodio) o detergentes zwitteriónicos incluyendo, pero sin limitarse a, sulfobetaínas (Zwittergent), sulfato de 3-(3-clolamidopropil)dimetilamonio-1-propano (CHAPS) y sulfonato de 3- (3-clolamidopropil)dimetilamonio-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO). Ejemplos no limitantes de solventes orgánicos mezclables en agua incluyen, pero no se limitan a, acetonitrilo, alcanoles inferiores (especialmente alcanoles C2-C4 tales como etanol o isopropanol) o alcandioles inferiores (alcandioles C2-C4 tales como etilenglicol) que pueden utilizarse como desnaturalizantes. Ejemplos no limitantes de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos de origen natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, y fosfatidilinositol o derivados o variantes sintéticas de fosfolípido tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina.
El término "funcionalidad deseada" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier grupo seleccionado de una etiqueta; un tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un foto-reticulador; un compuesto citotóxico; un fármaco; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de foto-afinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína, o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido de antisentido; un sacárido; un dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de giro; un fluoróforo; un residuo que contiene metal; un residuo radiactivo; un grupo funcional nuevo; un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas, un residuo foto-encasillado; un residuo excitable por radiación actínica; un ligando; un residuo fotoisomerizable; biotina; un análogo de biotina; un residuo que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente divisible; un grupo foto-divisible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado a carbono; un agente activo de reducción-oxidación; un amino tioácido; un residuo tóxico; un residuo isotópicamente etiquetado; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso en electrones; un grupo magnético; un grupo de intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo (en cuyo caso, el agente biológicamente activo puede incluir un agente con actividad terapéutica y el polipéptido de aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado puede servir ya sea como un agente co-terapéutico con el agente terapéutico anexo o como un medio para suministrar el agente terapéutico al sitio deseado dentro de un organismo); una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un ácido ribonucleico inhibitorio; un radionucleótido; un agente de captura de neutrón; un derivado de biotina; punto(s) cuantum; un nano transmisor; un radio transmisor; una abzima; un activador complejo activado; un virus; un adyuvante; un aglicano, un alergano, una angiostatina, un antihormonal, un antioxidante, un aptámero, un ARN guía, una saponina, un vector de lanzadera, una macromolécula, un mimótopo, un receptor, una micela inversa, y cualquier combinación de los mismos.
El término "diamina" como se utiliza en la presente, se refiere a grupos/moléculas que comprenden al menos dos grupos amina funcionales incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo hidracina, un grupo amidina, un grupo imina, un grupo 1,1-diamina, un grupo 1,2-diamina, un grupo 1,3-diamina y un grupo 1,4-diaina. Adicionalmente, tales grupos pueden ser parte de moléculas lineales, ramificadas o cíclicas.
El término "etiqueta detectable" como se utiliza en la presente, se refiere a una etiqueta que puede ser observable utilizando téenicas analíticas que incluyen, pero no se limitan a, fluorescencia, quimioluminiscencia, resonancia de giro de electrón, espectroscopia ultravioleta/de absorbencia visible, espectroscopia de masa, espectrometría de masa, resonancia magnética nuclear, resonancia magnética, y métodos electroquímicos.
El término "dicarbonilo" como se utiliza en la presente se refiere a un grupo que contiene al menos dos residuos seleccionados del grupo que consiste de -C(O)-, S(O)-, -S(O)2- y -C(S)-, incluyendo, pero sin limitarse a, grupos 1,2-dicarbonilo, grupos 1,3-dicarbonilo, y grupos 1,4-dicarbonilo, y grupos que contienen al menos un grupo cetona, y/o al menos un grupo aldehido, y/o al menos un grupo éster, y/o al menos un grupo de ácido carboxílico, y/o al menos un grupo tioéster. Tales grupos dicarbonilo incluyen dicetonas, cetoaldehídos, cetoácidos, cetoésteres y cetotioésteres. Adicionalmente, tales grupos pueden ser parte de moléculas lineales, ramificadas o cíclicas. Los dos residuos en el grupo dicarbonilo pueden ser iguales o diferentes y pueden incluir sustituyentes que producirían, solamente a modo de ejemplo, un éster, una cetona, un aldehido, un tioéster, o una amida, en cualquiera de los dos residuos.
El término "fármaco" como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sustancia utilizada en la prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o cura de una enfermedad o condición.
El término "tinte" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia colorante soluble que contiene un cromóforo.
El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad suficiente de un agente o un compuesto que se administra que aliviará en alguna medida uno o más de los síntomas de la enfermedad o condición que se trata. El resultado puede ser la reducción o el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. A modo de ejemplo, un agente o compuesto que se administra incluye, pero no se limita a, un polipéptido de aminoácido natural, un polipéptido de aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural modificado, o un polipéptido no aminoácido modificado. Las composiciones que contienen tales polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido natural modificado, o polipéptidos de aminoácido no natural modificado pueden administrarse para tratamientos profilácticos, mejoradores y/o terapéuticos. Una cantidad "efectiva" apropiada en un caso individual puede determinarse utilizando téenicas tales como un estudio de escalación de dosis.
El término "grupo denso en electrones" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que difunde los electrones cuando se irradia con un haz de electrón. Tales grupos incluyen, pero no se limitan a, molibdato de amonio, yoduro de cadmio de subnitrato de bismuto, 99%, carbohidrazida, hexahidrato de cloruro férrico, tetramina de hexametileno, 98.5%, tricloruro de indio anhidro, nitrato de lantano, trihidrato de acetato de plomo, trihidrato de citrato de plomo, nitrato de plomo, ácido periódico, ácido fosfomolíbdico, ácido fosfotúngstico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de plata, proteinato de plata (análisis Ag: 8.0 a 8.5%) "fuerte", tetrafenilporfina de plata (S-TPPS), cloroaurato de sodio, tungstato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbazida (TSC), acetato de uranilo, nitrato de uranilo, y sulfato de vanadilo.
El término "agente de transferencia de energía" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula que puede ya sea donar o aceptar energía proveniente de otra molécula. Solamente a modo de ejemplo, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es un proceso de acoplamiento bipolar-bipolar mediante el cual la energía en estado excitado de una molécula donante de fluorescencia no se transfiere de manera radiada a una molécula receptora no excitada que después emite de manera fluorescentes la energía donada a una longitud de onda más larga.
Los términos "mejorar" o "que mejora" significan que incrementa o prolonga ya sea en potencia o duración el efecto deseado. A modo de ejemplo, "mejorar" el efecto de agentes terapéuticos se refiere a la capacidad para incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración el efecto de agentes terapéuticos durante el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición. Una "cantidad mejoradora efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de un agente terapéutico en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición. Cuando se utilizan en un paciente, las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y el curso de la enfermedad, trastorno o condición, de la terapia previa, del estado de salud del paciente y la respuesta a los fármacos y del juicio del médico que lo trata.
Como se utiliza en la presente, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya, incluyendo, pero sin limitarse a, animales (incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos, insectos, rreeppttiilleess,, aavveess,, eettcc..)),, ciliados, plantas (incluyendo pero sin limitarse a monocotiledóneas, dicotiledóneas, y algas), hongos, levaduras, flagelados, microsporidias y protists.
El término "ácido graso" como se utiliza en la presente, se refiere a ácidos carboxílíeos con una cadena lateral de hidrocarburo de aproximadamente C6 o más larga.
El término "fluoróforo" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula que a su excitación emite fotones y por tanto es fluorescente.
Los términos "grupo funcional", "residuo activo", "grupo de activación", "grupo de partida", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "residuo químicamente reactivo", como se utilizan en la presente, se refieren a porciones o unidades de una molécula en las cuales se presentan las reacciones químicas. Los términos son de algún modo sinónimos en las téenicas químicas y se utilizan en la presente para indicar las porciones de las moléculas que llevan a cabo alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas.
El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y bromo.
El término "haloacilo" como se utiliza en la presente, se refiere a grupos acilo que contienen residuos de halógeno incluyendo, pero sin limitarse a, -C(O)CH3-, C(O)CF3-, -C(O)CH2OCH3 y lo similar.
El término "haloalquilo", como se utiliza en la presente, se refiere a grupos alquilo que contienen residuos de halógeno incluyendo, pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3 y lo similar.
El término "heteroalquilo" como se utiliza en la presente, se refiere a radicales de hidrocarburo de cadena recta o ramificada, o cíclicos, o combinaciones de los mismos, que consisten de un grupo alquilo y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de 0, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente. El(los) heteroátomo(s) 0, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se une al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3 -CH2-CH2,-S(0)-CH3, -CH2- CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -SÍ(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, y - CH=CH-N(CH3)-CH3. Adicionalmente, hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como, a modo de ejemplo, -C¾-NH-OCH3 y -CH2-O-S1(CH3)3.
Los términos "enlace a base de heterocíclico" o "enlace de heterociclo" se refieren a un residuo formado a partir de la reacción de un grupo dicarbonilo con un grupo diamina. El producto de reacción resultante es un heterociclo que incluye un grupo heteroarilo o un grupo heterocicloalquilo. El grupo heterociclo resultante sirve como un enlace químico entre un aminoácido no natural o un polipeptido de aminoácido no natural y otro grupo funcional. En una modalidad, el enlace heterociclo incluye un enlace heterociclo que contiene nitrógeno, incluyendo solamente a modo de ejemplo, un enlace pirazol, un enlace pirrol, un enlace indol, un enlace benzodiazepina y un enlace pirazolona.
De manera similar, el término "heteroalquileno" se refiere a un radical bivalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero sin limitarse por, -CH2-CH2-S-CH2 CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos pueden ocupar también cualquiera o ambas de las terminales de cadena (incluyendo pero son limitarse a, alquilenoxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno, y lo similar). Aun adicionalmente, para grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no se implica ninguna orientación del grupo de enlace por la dirección en la cual se escribe la fórmula del grupo de enlace. A modo de ejemplo, la fórmula -C(O)2R'- representa tanto -C(O)2R'- como -R'C(0)2-.
El término "heteroarilo" o "heteroaromático" como se utiliza en la presente, se refiere a grupos arilo que contienen al menos un heteroátomo seleccionado de N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente, y el(los) átomo(s) de nitrógeno puede(n) cuaternizarse opcionalmente. Los grupos heteroarilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Un grupo heteroarilo puede estar unido al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo.
El término "homoalquilo", como se utiliza en la presente se refiere a grupos alquilo que son grupos hidrocarburo.
El término "idéntico" como se utiliza en la presente, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Adicionalmente, el término "sustancialmente idéntico", como se utiliza en la presente, se refiere a dos o más secuencias que tienen un porcentaje de unidades secuenciales que son iguales cuando se comparan y se alinean por máxima correspondencia sobre una ventana de comparación o una región designada medida utilizando algoritmos de comparación o mediante alineación manual e inspección visual. Solamente a modo de ejemplo, dos o más secuencias pueden ser "sustancialmente idénticas" si las unidades secuenciales son aproximadamente 60% idénticas, aproximadamente 65% idénticas, aproximadamente 70% idénticas, aproximadamente 75% idénticas, aproximadamente 80% idénticas, aproximadamente 85% idénticas, aproximadamente 90% idénticas o aproximadamente 95% idénticas sobre una región especificada. Tales porcentajes describen la "identidad porcentual" de dos o más secuencias. La identidad de una secuencia puede existir sobre una región que es de al menos aproximadamente 75 a 100 unidades secuenciales en longitud, sobre una región que es de aproximadamente 50 unidades secuenciales en longitud, o, cuando no se especifica, a través de toda la secuencia. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Solamente a modo de ejemplo, dos o más secuencias de polipéptido son idénticas cuando los residuos de aminoácido son iguales, mientras dos o más secuencias de polipéptido son "sustancialmente idénticas" si los residuos de aminoácido son aproximadamente 60% idénticos, aproximadamente 65% idénticos, aproximadamente 70% idénticos, aproximadamente 75% idénticos, aproximadamente 80% idénticos, aproximadamente 85% idénticos. aproximadamente 90% idénticos o aproximadamente 95% idénticos sobre una región especificada. La identidad puede existir sobre una región que es de al menos aproximadamente 75 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, sobre una región que es de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud o, cuando no se especifica, a través de la secuencia completa de una secuencia de polipéptidos. Adicionalmente, solo a modo de ejemplo, dos o más secuencias de polinucleótido son idénticas cuando los residuos de ácido nucleico son iguales, mientras dos o más secuencias de polinucleótido son "sustancialmente idénticas" si los residuos de ácido nucleico son aproximadamente 65% idénticos, aproximadamente 70% idénticos, aproximadamente 75% idénticos, aproximadamente 80% idénticos, aproximadamente 85% idénticos, aproximadamente 90% idénticos o aproximadamente 95% idénticos sobre una región especificada. La identidad puede existir sobre una región que es de al menos aproximadamente 75 a aproximadamente 100 ácidos nucleicos de longitud, sobre una región que es de aproximadamente 50 ácidos nucleicos de longitud o, cuando no se especifica, a través de la secuencia completa de una secuencia de polinucleótidos.
Para la comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, se introducen en una computadora las secuencias de prueba y de referencia, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Pueden utilizarse parámetros de falla del programa, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces las identidades de secuencia porcentuales para las secuencias de prueba relativas a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.
El término "inmunogenicidad" como se utiliza en la presente, se refiere a una respuesta del anticuerpo a la administración de un fármaco terapéutico. La inmunogenicidad hacia polipéptidos de aminoácido no natural terapéuticos puede obtenerse utilizando análisis cuantitativos y cualitativos para la detección de anticuerpos de polipéptidos anti-aminoácido no natural en fluidos biológicos. Tales análisis incluyen, pero no se limitan a, radioinmunoanálisis (RIA), análisis inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA), inmunoanálisis luminiscente (LIA) e inmunoanálisis fluorescente (FIA). El análisis de inmunogenicidad hacia polipéptidos de aminoácido no natural terapéuticos implica comparar la respuesta del anticuerpo a la administración de los polipéptidos de aminoácido no natural terapéuticos con la respuesta del anticuerpo a la administración de polipéptidos de aminoácido natural terapéuticos.
El término "agente de intercalado" también referido como "grupo de intercalado", como se utiliza en la presente, se refiere a un químico que puede insertarse en el espacio intramolecular de una molécula o en el espacio intermolecular entre las moléculas. Solamente a modo de ejemplo un agente o grupo de intercalado puede ser una molécula que se inserta en las bases apiladas de la doble hélice del ADN.
El término "aislado" como se utiliza en la presente, se refiere a la separación y el retiro de un componente de interés de componentes no de interés. Las sustancias aisladas pueden estar ya sea en un estado seco o semiseco, o en solución, incluyendo pero sin limitarse a una solución acuosa. El componente aislado puede estar en un estado homogéneo o el componente aislado puede ser parte de una composición farmacéutica que comprende vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. La pureza y la homogeneidad pueden determinarse utilizando téenicas de química analítica que incluyen, pero no se limitan a, electroforesis de gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto desempeño. Adicionalmente, cuando el componente de interés se aísla y es la especie predominante presente en la preparación, el componente se describe en la presente como sustancialmente purificado. El término "purificado" como se utiliza en la presente, puede referirse a un componente de interés que es al menos 85% puro, al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 99% puro o más puro. Solamente a modo de ejemplo, los ácidos nucleicos o proteínas se "aíslan" cuando tales ácidos nucleicos o proteínas se encuentran libres de al menos algunos de los componentes celulares con los cuales se asocian en su estado natural, o que el ácido nucleico o proteína se ha concentrado a un nivel mayor que la concentración de si producción in vivo o in vitro. También, a modo de ejemplo, un gen se aísla cuando se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen que codifica para una proteína diferente al gen de interés.
El término "etiqueta" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que se incorpora en un compuesto y se detecta fácilmente, mediante lo cual puede detectarse y/o monitorearse su distribución física.
El término "enlace" como se utiliza en la presente se refiere a uniones o residuos químicos provenientes de una reacción química entre el grupo funcional de un enlazador y otra molécula. Tales enlaces pueden incluir, pero no se limitan a, enlaces covalentes y enlaces no covalentes, mientras tales residuos químicos pueden incluir, pero no se limitan a, ésteres, carbonatos, fosfato ésteres de imina, hidrazonas, acétales, ortoésteres, enlaces de péptido y enlaces de oligonucleótido. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con el agua a valores útiles de pH incluyendo, pero sin limitarse a, bajo condiciones fisiológicas durante un prolongado período de tiempo, tal vez incluso indefinidamente. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas incluyendo, por ejemplo, sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significa que el enlace puede degradarse por una o más enzimas. Solamente a modo de ejemplo, el PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la estructura del polímero o en el grupo de enlace entre la estructura de polímero y uno o más de los grupos funcionales de terminal de la molécula de polímero. Tales enlaces degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces áster formados por la reacción de ácidos carboxílicos de PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, en donde tales grupos áster generalmente se hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente biológicamente activo. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen pero no se limitan a enlaces de carbonato, enlaces de imina que resultan de la reacción de una amina y un aldehido, enlaces de fosfato áster formados mediante la reacción de un alcohol con un grupo fosfato, enlaces de hidrazona que son el producto de reacción de una hidracida y un aldehido, enlaces de acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol, enlaces de ortoéster que son el producto de reacción de un formato y un alcohol, enlaces de péptido formados por un grupo amina, incluyendo pero sin limitarse a, en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido, y enlaces de oligonucleótido formados por un grupo fosforamidita incluyendo pero sin limitarse a, en el extremo de un polímero, y un grupo 5'-hidroxilo de un oligonucleótido.
Los términos "medio" o "medios", como se utilizan en la presente, se refieren a cualquier medio de cultivo utilizado para hacer crecer y cosechar células y/o productos expresados y/o secretados por tales células. Tal "medio" o "medios" incluyen, pero no se limitan a, soportes en solución, sólidos, semisólidos o rígidos que pueden soportar o contener cualquier célula huésped incluyendo, a modo de ejemplo, células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insecto, células huésped de plantas, células huésped eucarióticas, células huésped de mamífero, células CHO, células huésped procarióticas, E-coli, células huésped de pseudomonas, y contenidos celulares. Tal "medio" o "medios" incluyen, pero no se limitan a, un medio o medios en los cuales la célula huésped se ha hecho crecer dentro de los cuales se ha secretado un polipéptido, incluyendo el medio ya sea antes o después de una etapa de proliferación. Tal "medio" o "medios" incluyen también pero no se limitan a, amortiguadores o reactivos que contienen lisados de célula huésped, a modo de ejemplo, un polipéptido producido de manera intracelular y las células huésped se lisan o se rompen para liberar el polipéptido.
El término "metabolito", como se utiliza en la presente, se refiere a un derivado de un compuesto, a modo de ejemplo, un polipéptido de aminoácido natural, un polipéptido de aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural modificado, o un polipéptido de aminoácido no natural modificado, que se forma cuando el compuesto, a modo de ejemplo, el polipéptido de aminoácido natural, el polipéptido de aminoácido no natural, el polipéptido de aminoácido natural modificado o el polipéptido de aminoácido no natural modificado, se metaboliza. El término "metabolito farmacéuticamente aceptable" o "metabolito activo" se refiere a un derivado biológicamente activo de un compuesto, a modo de ejemplo, un polipéptido de aminoácido natural, un polipéptido de aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural modificado, o un polipéptido de aminoácido no natural modificado, que se forma cuando el compuesto, a modo de ejemplo, el polipéptido de aminoácido natural, el polipéptido de aminoácido no natural, el polipéptido de aminoácido natural modificado o el polipéptido de aminoácido no natural modificado, se metaboliza.
El término "metabolizado" como se utiliza en la presente, se refiere a la suma de los procesos mediante los cuales una sustancia particular se cambia por medio de un organismo. Tales procesos incluyen, pero no se limitan a, reacciones de hidrólisis y reacciones catalizadas por enzimas. Pueden obtenerse información adicional acerca del metabolismo de The Pharmacological Basis of Therapeutics (Las bases farmacológicas de terapéuticos) 9a edición, McGraw Hill (1996). Solamente a modo de ejemplo, los metabolitos de polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido natural modificado o polipéptidos de aminoácido no natural modificado pueden identificarse ya sea mediante la administración de los polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido natural modificado o polipéptidos de aminoácido no natural modificado a un huésped y el análisis de muestras de tejido provenientes del huésped, o mediante la incubación de los polipéptidos de aminoácido natural, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido natural modificado o polipéptidos de aminoácido no natural modificado con células hepáticas in vitro y el análisis de los compuestos resultantes.
El término "quelador de metal" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula que forma un complejo de metal con iones de metal. A modo de ejemplo, tales moléculas pueden formar dos o más enlaces de coordinación con un ion de metal central y pueden formar estructuras de anillo.
El término "residuo que contiene metal" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que contiene un ion de metal, un átomo o partícula. Tales residuos incluyen, pero no se limitan a cisplatina, iones de metales quelados (tales como níquel, hierro y platino) y nanopartículas de metal (tales como níquel, hierro y platino).
El término "residuo que incorpora un átomo pesado" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que incorpora un ion de un átomo que es comúnmente más pesado que el carbono. Tales iones o átomos incluyen, pero no se limitan a, silicio, tungsteno, oro, plomo y uranio.
El término "modificado" como se utiliza en la presente se refiere a la presencia de un cambio a un aminoácido natural, un aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido e aminoácido no natural. Tales cambios, o modificaciones, pueden obtenerse mediante modificaciones post-síntesis de los aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural, o mediante la modificación co-traduccional o post-traduccional de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural. La forma "modificada o no modificada" significa que el aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido e aminoácido no natural tratado se modifica opcionalmente, es decir, el aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido e aminoácido no natural bajo discusión puede ser modificado o no modificado.
Como se utiliza en la presente, el término "vida media en suero modulada" se refiere a cambios positivos o negativos en la vida media en circulación de una molécula activa biológicamente modificada en relación a su forma no modificada. A modo de ejemplo, las moléculas biológicamente activas modificadas incluyen, pero no se limitan a, aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural. A modo de ejemplo, la vida media en suero se mide tomando muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de la administración de la molécula biológicamente activa o la molécula biológicamente activa modificada y determinando la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración en suero con el tiempo permite calcular la vida media en suero. A modo de ejemplo, la vida media en suero modulada puede incrementarse en la vida media en suero, lo cual puede permitir un régimen de dosis mejorado o evitar efectos tóxicos. Tales incrementos en suero pueden ser de al menos dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos aproximadamente diez veces. Un ejemplo no limitante de un metodo para evaluar los incrementos en la vida media en suero se proporciona en el ejemplo 33. Este método puede utilizarse para evaluar la vida media en suero de cualquier polipéptido.
El término "vida media terapéutica modulada" como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula biológicamente activa modificada en relación a su forma no modificada. A modo de ejemplo, las moléculas biológicamente activas modificadas incluyen, pero no se limitan a, aminoácido natural, aminoácido no natural, polipéptido de aminoácido natural o polipéptido de aminoácido no natural. A modo de ejemplo, la vida media terapéutica se mide midiendo las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en varios puntos de tiempo después de la administración. La vida media terapéutica incrementada puede permitir un régimen de dosis particularmente benéfico, una dosis total particularmente benéfica, o evitar un efecto no deseado. A modo de ejemplo, la vida media terapéutica incrementada puede resultar de una potencia incrementada, un enlace incrementado o disminuido de la molécula modificada a su objetivo, un incremento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada, o un rompimiento incrementado o disminuido de las moléculas por medio de enzimas tales como, solamente a modo de ejemplo, proteasas. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar los incrementos en la vida media terapéutica se proporciona en el ejemplo 33. Este método puede utilizarse para evaluar la vida media terapéutica de cualquier polipéptido.
El término "nanopartícula" como se utiliza en la presente, se refiere a una partícula que tiene un tamaño de partícula entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 1 nm.
El término "casi-estequiométrico" como se utiliza en la presente, se refiere a que la relación de los moles de los compuestos que participan en una reacción química es de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 1.5.
Como se utiliza en la presente, el término "no eucariota) se refiere a organismos no eucarióticos. A modo de ejemplo, un organismo no eucariótico puede pertenecer a las eubacterias (que incluyen pero no se limitan a, Escherichia coli, Thermus Thermophilus, o Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), un dominio filogenético o la Archaea, que incluye, pero no se limita a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix o halobacterias tales como Haloferax volcanii y especies de halobacterias NRC-1, o dominio filogenético.
Un "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden utilizarse como sinónimos con el término "aminoácido no natural" son "aminoácido no naturalmente codificado", "aminoácido no natural", "aminoácido no de origen natural", y varias versiones con guiones o sin guiones de los mismos. El término "aminoácido no natural" incluye, pero no se limita a, aminoácidos que se presentan naturalmente por la modificación de un aminoácido naturalmente codificado (incluyendo, pero sin limitarse a, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero que no se incorporan en sí en una cadena de polipéptido en crecimiento por el complejo de traducción. Ejemplos de aminoácidos de origen natural que no están codificados naturalmente incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, y O-fosfotirosina. Adicionalmente, el término "aminoácido no natural" incluye pero no se limita a, aminoácidos que no se presentan naturalmente y que pueden obtenerse sintéticamente o pueden obtenerse mediante la modificación de aminoácidos no naturales.
El término "ácido nucleico" como se utiliza en la presente, se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, o ribonucleótidos y a sus polímeros ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria. Solamente a modo de ejemplo, tales ácidos nucleicos y polímeros de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, (i) análogos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural; (ii) análogos de oligonucleótido que incluyen, pero no se limitan a, PNA (ácido peptidomimético), análogos de ADN utilizados en teenología de antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y lo similar),- (iii) sus variantes conservadoramente modificadas (incluyendo pero sin limitarse a, sustituciones degeneradas de codón) y secuencias complementarias y secuencias explícitamente indicadas. A modo de ejemplo, las sustituciones degeneradas de codón pueden lograrse generando secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados se sustituye con residuos de base mezclada y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
El término "agente oxidante" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o material con la capacidad de retirar un electrón de un compuesto que se oxida. A modo de ejemplo, los agentes oxidantes incluyen, pero no se limitan a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado y oxígeno. Una amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados para uso en los métodos y composiciones descritos en la presente.
El término "farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente, se refiere a un material incluyendo, pero sin limitarse a, una sal, vehículo o diluyente, que no abroga la actividad biológica o las propiedades del compuesto, y que es relativamente no tóxico, i.e., el material puede administrarse a un individuo sin ocasionar efectos biológicos no deseables ni interactuar de manera nociva con ninguno de los componentes de la composición en la cual se contiene.
El término "etiqueta de foto-afinidad" como se utiliza en la presente, se refiere a una etiqueta con un grupo que, a su exposición a la luz, forma un enlace con una molécula para la cual la etiqueta tiene afinidad. Solamente a modo de ejemplo, tal enlace puede ser covalente o no covalente.
El término "residuo foto-encasillado" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que, a su iluminación a ciertas longitudes de onda, se enlaza de manera covalente o no covalente a otros iones o moléculas.
El término "grupo foto-divisible" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo que se rompe a su exposición a la luz.
El término "foto-reticulador" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que comprende dos o más grupos funcionales que, a su exposición a la luz, son reactivos y forman un enlace covalente o no covalente con dos o más moléculas monoméricas o poliméricas.
El término "residuo foto-isomerizable" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo en donde a su iluminación con luz cambia de una forma isomérica a otra.
El término "polialquileno glicol" como se utiliza en la presente, se refiere a polioles de poliéter poliméricos ramificados. Tales polialquileno glicoles incluyen, pero no se limitan a, polietileno glicol, polipropileno glicol, polibutileno glicol y sus derivados. Otras modalidades ejemplares se enlistan, por ejemplo, en catálogos comerciales de proveedor, tales como el catálogo de Shearwater Corporation "Poliethylene Glycol and Derivates for Biomedical Applications" (Polietileno glicol y derivados para aplicaciones biomédicas) (2001). Solamente a modo de ejemplo, tales polioles de poliéter poliméricos tienen pesos moleculares promedio entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. A modo de ejemplo, tales polioles de poliéter polimérico incluyen, pero no se limitan a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero sin limitarse a, aproximadamente 100,000 Da, aproximadamente 95.000 Da, aproximadamente 90,000 Da, aproximadamente 85.000 Da, aproximadamente 80,000 Da, aproximadamente 75.000 Da, aproximadamente 70,000 Da, aproximadamente 65.000 Da, aproximadamente 60,000 Da, aproximadamente 55.000 Da, aproximadamente 50,000 Da, aproximadamente 45.000 Da, aproximadamente 40,000 Da, aproximadamente 35.000 Da, aproximadamente 30,000 Da, aproximadamente 25.000 Da, aproximadamente 20,000 Da, aproximadamente 15.000 Da, aproximadamente 10,000 Da, aproximadamente 9.000 Da, aproximadamente 8,000 Da, aproximadamente 7.000 Da, aproximadamente 6,000 Da, aproximadamente 5.000 Da, aproximadamente 4,000 Da, aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 2,000 Da, aproximadamente 1.000 Da, aproximadamente 900 Da, aproximadamente 800 Da, aproximadamente 700 Da, aproximadamente 600 Da, aproximadamente 500 Da, 400 Da, aproximadamente 300 Da, aproximadamente 200 Da, aproximadamente 100 Da y aproximadamente 50 Da. En algunas modalidades el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 50,000 Da. En algunas modalidades el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 1,000 Da. En algunas modalidades el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 500 Da. En algunas modalidades el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 2,000 Da y aproximadamente 50,000. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es de entre aproximadamente 5,000 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero es entre aproximadamente 10,000 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades, la molécula de poli(etileno glicol) es un polímero ramificado. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede estar entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo, pero sin limitarse a, aproximadamente 100,000 Da, aproximadamente 95,000 Da, aproximadamente 90,000 Da, aproximadamente 85,000 Da, aproximadamente 80,000 Da, aproximadamente 75,000 Da, aproximadamente 70,000 Da, aproximadamente 65,000 Da, aproximadamente 60,000 Da, aproximadamente 55,000 Da, aproximadamente 50,000 Da, aproximadamente 45,000 Da, aproximadamente 40,000 Da, aproximadamente 35,000 Da, aproximadamente 30,000 Da, aproximadamente 25,000 Da, aproximadamente 20,000 Da, aproximadamente 15,000 Da, aproximadamente 10,000 Da, aproximadamente 9,000 Da, aproximadamente 8,000 Da, aproximadamente 7.000 Da, aproximadamente 6,000 Da, aproximadamente 5,000 Da, aproximadamente 4,000 Da, aproximadamente 3.000 Da, aproximadamente 2,000 Da, aproximadamente 1,000 Da, aproximadamente 900 Da, aproximadamente 800 Da , aproximadamente 700 Da, aproximadamente 600 Da, aproximadamente 500 Da, aproximadamente 400 Da, aproximadamente 300 Da, aproximadamente 250 Da , aproximadamente 200 Da, aproximadamente 150 Da, aproximadamente 100 Da, aproximadamente 75 Da, y aproximadamente 50 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 5,000 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 5,000 y aproximadamente 20,000 Da. En otras modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 50,000 Da.
El término "polímero" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula compuesta de subunidades repetidas. Tales moléculas incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos, polinucleótidos o polisacáridos o polialquileno glicoles.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Es decir, una descripción dirigida a un polipéptido se aplica igualmente a la descripción de un péptido y a la descripción de una proteína y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido de origen natural así como a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido son un aminoácido no natural. Adicionalmente, tales "polipéptidos", "péptidos" y "proteínas" incluyen cadenas de aminoácido de cualquier longitud incluyendo proteínas de longitud total, en donde los residuos de aminoácido se enlazan mediante enlaces de péptido covalentes.
El término "modificado de manera post-traduccional" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que se presente después de que tal aminoácido se ha incorporado de manera traduccional en una cadena de polipéptido. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificaciones co-traduccionales in vivo, modificaciones co-traduccionales in vitro (tal como en un sistema de traducción libre de células), modificaciones post-traduccionales in vivo y modificaciones post-traduccionales in vitro.
Los términos "profármaco" o "profármaco farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente, se refieren a un agente que se convierte en el fármaco de origen in vivo o in vitro, que no abroga la actividad biológica ni las propiedades del fármaco y es relativamente no tóxico, i.e., el material puede administrarse a un individuo sin ocasionar efectos biológicos indeseables ni interactuar de manera nociva con ninguno de los componentes de la composición en la cual se encuentra contenido. Los profármacos son generalmente precursores de fármaco que, después de su administración a un sujeto y su subsecuente absorción, se convierten en una especie activa o más activa a través de algún proceso, tal como la conversión mediante una trayectoria metabólica. Algunos profármacos tienen un grupo químico presente en el profármaco que lo hace menos activo y/o confiere solubilidad o alguna otra propiedad al fármaco. Una vez que el grupo químico se ha dividido y/o modificado a partir del profármaco se genera el fármaco activo. Los profármacos se convierten en el fármaco activo dentro del cuerpo a través de reacciones enzimáticas o no enzimáticas. Los profármacos pueden proporcionar propiedades fisicoquímicas mejoradas tales como mejor solubilidad, características de suministro mejoradas, tales como la dirección de manera específica de una célula, tejido, órgano o ligando particular, y un valor terapéutico mejorado del fármaco. Los beneficios de tales profármacos incluyen, pero no se limitan a, (i) facilidad de administración en comparación con el fármaco de origen; (ii) el profármaco puede estar biodisponible por administración oral mientras el de origen no; y (iii) el profármaco también puede tener una solubilidad mejorada en composiciones farmacéuticas en comparación con el fármaco de origen. Un profármaco incluye un derivado farmacológicamente inactivo o de actividad reducida de un fármaco activo. Los profármacos pueden diseñarse para modular la cantidad de un fármaco o una molécula biológicamente activa que alcanza un sitio de acción deseado mediante la manipulación de las propiedades del fármaco, tales como las propiedades fisicoquímicas, biofarmacéuticas o farmacocinéticas. Un ejemplo, sin limitación de un profármaco sería un polipéptido de aminoácido no natural que se administra como un éster (el "profármaco") para facilitar la transmisión a través de una membrana celular en donde la solubilidad en agua es nociva para la movilidad pero que después se, hidroliza metabólicamente al ácido carboxílico, la entidad activa, una vez dentro de la célula en donde la solubilidad en agua es benéfica. Los profármacos pueden diseñarse como derivados de fármaco reversibles, para uso como modificadores para mejorar el transporte del fármaco a tejidos específicos del sitio.
El término "cantidad profilácticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a esa cantidad de una composición que contiene al menos un polipéptido de aminoácido no natural o al menos un polipéptido de amino ácido no natural modificado profilácticamente aplicado a un paciente que aliviará en alguna medida uno o más de los síntomas de una enfermedad, condición o trastorno que se trata. En tales aplicaciones profilácticas, tales cantidades pueden depender del estado de salud del paciente, del peso y lo similar. Se considera dentro de la experiencia de la téenica determinar tales cantidades profilácticamente efectiva mediante experimentación de rutina, incluyendo, pero sin limitarse a, una prueba clínica de escalado de dosis.
El término "protegido" como se utiliza en la presente, se refiere a la presencia de un "grupo de protección" o un residuo que evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo de protección variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Solamente a modo de ejemplo, (i) si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidracida, el grupo de protección puede seleccionarse de ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo) (Fmoc); (ii) si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo de protección puede ser ortopiridildisulfuro; y (iii) si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo de protección puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo o ter-butilo.
Solamente a modo de ejemplo, los grupos de bloqueo/protección pueden seleccionarse de: i Fmoc Adicionalmente, los grupos de protección incluyen, pero no se limitan a, incluir grupos foto-lábiles tales como Nvoc y MeNvoc y otros grupos de protección conocidos en la técnica. Otros grupos de protección se describen en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (Grupos de protección en la síntesis orgánica), 3a Ed. John Wilcy & Sons, New York, NY, 1999, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.
El término "residuo radiactivo" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo cuyos núcleos desechan espontáneamente la radiación nuclear, tales como las partículas alfa, beta o gamma; en donde las partículas alfa son núcleos de helio, las partículas beta son electrones y las partículas gamma son fotones de alta energía.
El término "compuesto reactivo" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que bajo las condiciones apropiadas es reactivo hacia otro átomo, molécula o compuesto.
El término "célula huésped recombinante", también referido como "célula huésped" se refiere a cada célula que incluye un polinucleótido exógeno, en donde los métodos utilizados para insertar el polinucleótido exógeno en una célula incluyen, pero no se limitan a, absorción directa, transducción, igualación f, u otros métodos conocidos en la téenica para crear células huésped recombinantes. Solamente a modo de ejemplo, tal polinucleótido exógeno puede ser un vector no integrado, incluyendo pero sin limitarse a, un plásmido o puede integrarse en el genoma huésped.
El término "agente activo de reducción/oxidación" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula que oxida o reduce otra molécula, por lo cual el agente activo de reducción/oxidación se reduce o se oxida. Ejemplos del agente activo de reducción/oxidación incluyen, pero no se limitan a, ferroceno, quinonas, complejos de Ru2+/3+, complejos de Co2+/3+ y complejos de Os2+/3+.
El término "agente de reducción" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o material con la capacidad de agregar un electrón a un compuesto que se reduce. A modo de ejemplo los agentes de reducción incluyen, pero no se limitan a, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanotiol) y glutationa reducida. Tales agentes de reducción pueden utilizarse, solamente a modo de ejemplo, para mantener los grupos sulfhidrilo en el estado reducido y para reducir enlaces bisulfuro intra o inter-moleculares.
"Replegado" como se utiliza en la presente describe cualquier proceso, reacción o método que transforma un estado inapropiadamente plegado o no plegado en una conformación nativa o apropiadamente plegada. Solamente a modo de ejemplo, el replegado transforma los polipéptidos que contienen el enlace bisulfuro de un estado inapropiadamente plegado o no plegado a una conformación nativa o apropiadamente plegada con respecto a los enlaces bisulfuro. Tales polipéptidos que contienen el enlace bisulfuro pueden ser polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural.
El término "resina" como se utiliza en la presente, se refiere a perlas de polímero insolubles de alto peso molecular. Solamente a modo de ejemplo, tales perlas pueden utilizarse como soportes para la síntesis del péptido en fase sólida, o como sitios para la unión de moléculas antes de la purificación.
El término "sacárido" como se utiliza en la presente, se refiere a una serie de carbohidratos que incluyen, pero no se limitan a azúcares, monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
El término "seguridad" o "perfil de seguridad" como se utiliza en la presente, se refiere a los efectos secundarios que pueden relacionarse con la administración de un fármaco en relación al número de veces que se ha administrado el fármaco. A modo de ejemplo, se dice que un fármaco que se ha administrado muchas veces y ha producido solamente efectos secundarios suaves o nulos tiene un excelente perfil de seguridad. Un ejemplo no limitante de un método para evaluar el perfil de seguridad se proporciona en el ejemplo 26. Este método puede utilizarse para evaluar el perfil de seguridad de cualquier polipéptido.
La frase "se híbrida selectivamente a" o "se híbrida específicamente a", como se utiliza en la presente, se refiere al enlace, la duplicación o la hibridación de una molécula a una secuencia de nucleótidos particular bajo rígidas condiciones de hibridación cuando esa secuencia se encuentra presente en una mezcla de compuesto incluyendo, pero sin limitarse a, ADN o ARN total celular o biblioteca.
El término "etiqueta de giro" como se utiliza en la presente, se refiere a moléculas que contienen un átomo o un grupo de átomos que exhiben un giro de electrón no emparejado (i.e., un grupo paramagnético estable) que puede detectarse mediante espectroscopia de resonancia de giro de electrón y puede unirse a otra molécula. Tales moléculas de etiqueta de giro incluyen, pero no se limitan a, radicales de nitrilo y nitróxidos, y pueden ser etiquetas de giro únicas o etiquetas de giro dobles.
El término "estequiométrico" como se utiliza en la presente, se refiere a que la relación de los moles de los compuestos que participan en una reacción química es de aproximadamente 0.9 a aproximadamente 1.1.
El término "tipo estequiométrico" como se utiliza en la presente, se refiere a una reacción química que se convierte en estequiométrica o casi-estequiométrica a los cambios en las condiciones de reacción o en presencia de aditivos. Tales cambios en las condiciones de reacción incluyen, pero no se limitan a, un incremento en la temperatura o un cambio en el pH. Tales aditivos incluyen, pero no se limitan a, aceleradores.
La frase "condiciones rígidas de hibridación" se refiere a la hibridación de secuencias de ADN, ARN, PNA u otros miméticos de ácido nucleico, o combinaciones de los mismos, bajo condiciones de baja resistencia iónica y alta temperatura. A modo de ejemplo, bajo condiciones rígidas una sonda se hibridará a su subsecuencia objetivo en una mezcla compuesta de ácido nucleico (incluyendo pero sin limitarse a, ADN o ARN total celular o de biblioteca) pero no se hibridará a otras secuencias en la mezcla de compuesto. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. A modo de ejemplo, secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Las condiciones rigurosas de hibridación incluyen, pero no se limitan a, (i) aproximadamente de 5 a 10°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una resistencia iónica y a un pH definidos; (ii) la concentración de sal es de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 1.0 M a un pH de aproximadamente 7.0 a un pH de aproximadamente 8.3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (incluyendo pero sin limitarse a, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (incluyendo pero sin limitarse a, de más de 50 nucleótidos); (iii) la adición de agentes desestabilizadores incluyendo, pero sin limitarse a, formamida; (iv) formamida al 50%, 5X SSC y SDS al 1%, incubación a 42°C o 5X SSC, aproximadamente SDS al 1%, incubación a 65°C, con lavado en 0.2X SSC y aproximadamente SDS al 1% a 65°C durante entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 minutos. Solamente a modo de ejemplo, la detección de hibridación selectiva o específica incluye, pero no se limita a, una señal positiva de al menos dos veces de fondo. Una extensa guía acerca de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes (Téenicas de laboratorio en bioquímica y biología molecular - hibridación con sondas nucleicas), "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (Revisión de principios de hibridación y la estrategia de análisis de ácido nucleico) (1993).
El término "sujeto" como se utiliza en la presente, se refiere a un animal que es el sujeto de tratamiento, observación o experimento. Solamente a modo de ejemplo, el sujeto puede ser, pero no se limita a, un mamífero incluyendo, pero sin limitarse a, un humano.
El término "sustancialmente purificado" como se utiliza en la presente, se refiere a un componente de interés que puede estar sustancial o esencialmente libre de otros componentes que acompañan normalmente o interactúan con, el componente de interés antes de la purificación. Solamente a modo de ejemplo, el componente de interés puede estar "sustancialmente purificado" cuando la preparación del componente de interés contiene menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% (por peso en seco) de componentes contaminantes. Por tanto, un componente de interes "sustancialmente purificado" puede tener un nivel de pureza de aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más. Solamente a modo de ejemplo, un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural pueden purificarse a partir de una célula nativa, o una célula huésped en el caso de polipéptidos de aminoácido natural recombinantemente producidos o de polipéptidos de aminoácido no naturales. A modo de ejemplo una preparación de un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural puede estar "sustancialmente purificada" cuando la preparación contiene menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% (por peso en seco) del material contaminante. A modo de ejemplo, cuando un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural se produce recombinantemente por medio de células huésped, el polipéptido de aminoácido natural o el polipéptido de aminoácido no natural puede estar presente a aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2%, o aproximadamente 1% o menos del peso en seco de las células. A modo de ejemplo, cuando un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural se produce recombinantemente por medio de células huésped, el polipéptido de aminoácido natural o el polipéptido de aminoácido no natural puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/1, aproximadamente 4 g/1, aproximadamente 3 g/1, aproximadamente 2 g/1, aproximadamente 1 g/1, aproximadamente 750 mg/1, aproximadamente 500 mg/1, aproximadamente 250 mg/1, aproximadamente 100 mg/1, aproximadamente 50 mg/1, aproximadamente 10 mg/1, o aproximadamente 1 mg/1 o menos del peso en seco de las células. A modo de ejemplo, los polipéptidos de aminoácido natural o los polipéptidos de aminoácido no natural "sustancialmente purificados" pueden tener un nivel de pureza de aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 99% o mayor como se determina por los metodos apropiados incluyendo, pero sin limitarse a, análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar.
El término "sustituyentes" también referidos como "sustituyentes no interferentes" se refiere a grupos que pueden utilizarse para remplazar otro grupo en una molécula. Tales grupos incluyen, pero no se limitan a, halo, alquilo Ci-Cio, alquenilo C2-Ci0, alquinilo C2-Ci0, alcoxi Ci-Ci0, aralquilo C5-Ci2, cicloalquilo C3-Ci2, cicloalquenilo C4-Ci2, fenilo, fenilo sustituido, toluolilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-Ci2, alcoxiarilo C5-Ci2, ariloxialquilo C5-C12, oxiarilo C7-Ci2, alquilsulfinilo Ci-C6, alquilsulfonilo Ci-Ci0, -(CH2)m-O-(alquil Ci-Ci0) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, -NO2, -CN, -NRC(O)-(alquil Oc-Oo), -C(O)-(alquil Ci-Cio), alctioalquilo C2-C10, -C(0)O-(alquil Cx-Cxo), -OH, -S02, =S, -C00H, -NR2, carbonilo, -C(0)-(alquil Ci-Cio)- CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR2, -(arilo Ci-C10)-S-(arilo C6-Ci0), - C(0)-(arilo C6-Ci0), -(CH2)m-0-(CH2)m-0-(alquil Ci-Cio) en donde cada m es de 1 a 8, -C(0)NR2, -C(S)NR2, -S02NR2, -NRC(0)NR2, - NRC(S)NR2, sus sales, y lo similar. Cada grupo R en la lista precedente incluye, pero no se limita a, H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, o alcarilo. Cuando los grupos sustituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente identicos que resultarían de la escritura de la estructura de derecha a izquierda; por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -0CH2-.
Solamente a modo de ejemplo, los sustituyentes para radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo los grupos referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) incluyen, pero no se limitan a: -0R, =0, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -halógeno, -SiR3, -OC(O)R, -C (O)R, -CO2R, -CONR2, -0C(O)NR2, -NRC(O)R, NRC(0)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(0)2R, -S(0)2NR2, -NRS02R, -CN y -NO2. Cada grupo R en la lista precedente incluye, pero no se limita a, hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, pero sin limitarse a, arilo sustituido con 1 a 3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos aralquilo. Cuando dos grupos R están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR2 pretende incluir, pero no se limita a, lpirrolidinilo y 4-morfolinilo.
A modo de ejemplo, los sustituyentes para grupos arilo y heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, -OR, =0, =NR, =N-OR, -NR2 -SR, -halógeno, -SiR3, -0C(O)R, -C(O)R, - C O2R, -C0NR2, -0C(0)NR2, -NRC(0)R, -NRC(0)NR2, -NR(0)2R, -NR- C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN, -NO2, -R, -N3, -CH(Ph) 2, fluoro alcoxi (Ci-C4), y fluoro alquilo (Ci-C4), en un número que varía de cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en donde cada grupo R en la lista precedente incluye, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad de una composición que contiene al menos un polipéptido de aminoácido no natural y/o al menos un polipéptido de aminoácido no natural modificado administrada a un paciente que ya sufre de una enfermedad, condición o trastorno, suficiente para curar o al menos detener parcialmente, o aliviar en alguna medida uno o más de los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición que se trata. La efectividad de tales composiciones depende de condiciones que incluyen, pero no se limitan a, la severidad y el curso de la enfermedad, trastorno o condición, la terapia previa, el estado de salud del paciente y la respuesta a los fármacos y el juicio del médico que lo trata. Solamente a modo de ejemplo, las cantidades terapéuticamente efectivas pueden determinarse por experimentación de rutina incluyendo, pero sin limitarse a, una prueba clínica de escalado de dosis.
El término "tioalcoxi" como se utiliza en la presente, se refiere a grupos alquilo que contienen azufre enlazados a moléculas a través de un átomo de oxígeno.
El término "punto de fusión térmica" o Tm es la temperatura (bajo la resistencia iónica, el pH y la concentración nucleica definida) a la cual el 50% de las sondas complementarias a un objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en equilibrio.
El término "residuo tóxico" o "grupo tóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que puede ocasionar daños, perturbaciones o muerte. Los residuos tóxicos incluyen, pero no se limitan a, NCA1, auristatina, agente de enlace de ranura menor de ADN, agente de alquilación de ranura menor de ADN, enediina, lexitropsina, duocarmicina, taxano, puromicina, dolastatina, maitansinoide, vinca alcaloide, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecan, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretatstatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1, netropsina, podofilotoxina (e.g. etoposida, teniposida, etc.), baccatina y sus derivados, agentes anti-tubulina, criptofisina, combretastatina, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colquicinas, colcimid, estramustin , cemadotina, discodermolida, maitansina, eleuterobina, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, clorozotocina, gas de uracilo, clormetina, ifosfamida, clorambucil, pipobroman, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, busulfan, dacarbazina, y temozolomida, ytarabina, citosina arabinosida, fluorouracilo, floxuridina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurin , pentostatina, 5-fluorouracilo, metotrexato, 10-propargil-5,8-dideazafolato, ácido 5,8-dideazatetrahidrofólico, leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, gemcitabina, Ara-C, paclitaxel, docetaxel, deoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, azatioprina, brequinar, antibióticos (e.g., antraciclina, gentamicina, cefalotina, vancomicina, telavancina, daptomicina, azitromicina, eritromicina, rocitromicina, furazolidona, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, flucloxacilina, meticilina, penicilina, ciprofloxacina, moxifloxacina, ofloxacina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, estreptomicina, rifabutina, etambutol, rifaximina, etc.), fármacos antivirales (e.g., abacavir, aciclovir, ampligen, cidofovir, delavirdina, didanosina, efavirenz, entecavir, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, inosina, lopinavir, metisazona, nexavir, nevirapina. oseltamivir, penciclovir, estavudina, trifluridina, truvada valaciclovir, zanamivir, etc.), hidrocloruro de daunorubicina, daunomicina, rubidomicina, cerubidina, idarubicina, doxorubicina, epirubicina y derivados de morfolino, bisciclopeptidos de fenoxizona (e.g., dactinomicina), glicopéptidos básicos (e.g., bleomicina), glicósidos de antraquinona (e.g., plicamicina, mitramicina), antracenodionas (e.g., mitoxantrona), azirinopirrolo indoledionas (e.g., mitomicina), inmuno-supresores macrocíclicos (e.g., ciclosporina, FK-506, tacrolimus, prograf, rapamicina etc.), navelbeno, CPT-11, anastrazol letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida ifosamida, droloxafina, alocolquicina, Halichondrin B colquicina, derivados de colquicina, maitansina, rizoxina paclitaxel, derivados de paclitaxel, docetaxel, tiocolquicina, tritil cisterina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, cisplatina, carboplatina, hidroxiurea, N-metilhidrazina, epidofilotoxina, procarbazina, mitoxantrona, leucovorina, y tegafur. Los "taxanos" incluyen paclitaxel, así como cualquier derivado activo o profármaco de taxano. Agentes quimioterapéuticos tales como erlotinib (TARCEVA.RTM., Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE.RTM., Millenium Pharm.), fulvestrant (FASLODEX.RTM., AstraZeneca), sutent (SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA.RTM., Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC.RT ., Novartis), PTK787/ZK 222584 ((NNoovvaarrttiiss)),, oxaliplatina (Eloxatin.RTM., Sanofi), 5-FU (5-fluorouracilo), leucovorina, rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNE.RTM., Wyeth), lapatinib (TYKERB.RTM., GSK572016, GlaxoSmithKline), lonafarnib (SCH 66336), sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs.), y gefitinib (IRESSA.RTM., AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes de alquilación tales como tiotepa y CYTOXAN.RTM. ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; antineoplásticos antifolato tales como pemetrexed (ALIMTA.RTM. Eli Lilly), aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metila elaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobin ; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; gases de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, gas de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina, caliqueamicina, caliqueamicin gammall y caliqueamicina omegall; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como un cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos del antibiótico de enediina de cromoproteína relacionados, aclacinomicinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA.RTM. doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenadores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucida; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM. complejo de polisacárido (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 ,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, e.g., paclitaxel (TAXOL.RTM., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE.TM. albúmina libre de Cremophor, formulación de paclitaxel en nanopartículas (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), y TAXOTERE.RTM. doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); cloranbucil; GEMZAR.RTM. gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina vinblastina; platino; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE.RTM. vinorelbina; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" como se utilizan en la presente, incluyen aliviar, abatir o aminorar los síntomas de una enfermedad o condición, prevenir síntomas adicionales, aminorar o prevenir las causas metabólicas subyacentes de los síntomas, inhibir la enfermedad o condición, e.g., detener el desarrollo de la enfermedad o condición, aliviar la enfermedad o condición, ocasionar la regresión de la enfermedad o condición, aliviar la condición ocasionada por la enfermedad o condición, o detener los síntomas de la enfermedad o condición. Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" incluyen, pero no se limitan a, tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.
Como se utiliza en la presente, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero soluble en solventes acuosos. Tales polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietileno glicol, propionaldehído de polietileno glicol, sus derivados de mono alcoxi C1-C10 o ariloxi descritos en la Patente de E.U. No. 5,252,714 que se incorpora en la presente mediante la referencia), monometoxi-polietileno glicol, polivinil pirrolidona, alcohol polivinílico, ácidos de poliamino, anhídrido diviniléter maleico, N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluyendo sulfato de dextrano, polipropileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietoxilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo, pero sin limitarse a, metilcelulosa y carboximetil celulosa, albúmina de suero, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquileno glicol y sus derivados, copolímeros de polialquileno glicoles y sus derivados, polivinil etil éteres y alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, y lo similar, o mezclas de los mismos. Solamente a modo de ejemplo, el acoplamiento de tales polímeros solubles en agua a polipéptidos de aminoácido natural o polipéptidos de aminoácido no natural puede dar como resultado cambios que incluyen, pero no se limitan a, incrementada solubilidad en agua, vida media en suero incrementada o modulada, vida media terapeutica incrementada o modulada en relación a la forma no modificada, incrementada biodisponibilidad, actividad biológica modulada, tiempo de circulación extendido, inmunogenicidad modulada, características de asociación física modulada incluyendo, pero sin limitarse a, agregación y formación de multímero, enlace al receptor alterado, enlace alterado a uno o más socios de enlace, y dimerización o multimerización del receptor alteradas. Adicionalmente, tales polímeros solubles en agua pueden tener o no su propia actividad biológica.
A menos que se indique de otra manera, se emplean métodos convencionales de espectroscopia de masa, NMR, HPLC, química de proteínas, bioquímica, téenicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica.
Los compuestos, (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido no natural modificados, y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) presentados en la presente incluyen compuestos isotópicamente etiquetados, que son idénticos a los citados en las diversas fórmulas y estructuras presentadas en la presente, pero por el hecho de que uno o más átomos se remplazan por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente a la masa atómica o al número de masa comúnmente encontrados en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los compuestos presentes incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 1SN, 180, 170, 35S, 18F, 3SC1, respectivamente. Ciertos compuestos isotópicamente etiquetados descritos en la presente, por ejemplo aquellos en los cuales se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H y 14C, son útiles en análisis de distribución en tejido de fármacos y/o sustratos. Además, la sustitución con isótopos tales como deuterio, i.e., 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, vida media in vivo incrementada o requerimientos de dosis reducida.
Algunos de los compuestos en la presente (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido no natural modificados, y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) tienen átomos de carbono asimétricos y por tanto pueden existir como enantiómeros o diastereómeros. Las mezclas diastereoméricas pueden separarse en sus diastereómeros individuales en base a sus diferencias físico químicas mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccional. Los enantiómeros pueden separarse convirtiendo la mezcla enantiomérica en una mezcla diastereomérica mediante la reacción con un compuesto ópticamente activo apropiado (e.g., alcohol), separando los diastereómeros y convirtiendo (e.g., hidrolizando) los diastereómeros individuales en los enantiómeros puros correspondientes. Todos tales isómeros, incluyendo diastereómeros, enantiómeros y sus mezclas se consideran parte de las composiciones descritas en la presente.
En modalidades agregadas o adicionales, los compuestos descritos en la presente (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido no natural modificados, y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) se utilizan en forma de profármacos. En modalidades agregadas o adicionales, los compuestos descritos en la presente (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural, polipéptidos de aminoácido no natural modificados, y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) se metabolizan a su administración a un organismo que necesita producir un metabolito que se utiliza después para producir un efecto deseado, incluyendo un efecto terapéutico deseado. En modalidades agregadas o adicionales se encuentran los metabolitos activos de aminoácidos no naturales y polipéptidos de aminoácido no natural "modificado o no modificado".
Los métodos y formulaciones descritos en la presente incluyen el uso de N-óxidos, formas cristalinas (también conocidas como polimorfos) o sales farmacéuticamente aceptables de aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado. En ciertas modalidades, los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado pueden existir como tautómeros. Todos los tautómeros se incluyen dentro del alcance de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado presentados en la presente. Adicionalmente, los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado descritos en la presente pueden existir en formas no solvatadas así como solvatadas con solventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y lo similar. Las formas solvatadas de los aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado presentados en la presente también se consideran descritos en la presente.
Algunos de los compuestos en la presente (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) pueden existir en diversas formas tautoméricas. Todas tales formas tautoméricas se consideran parte de las composiciones descritas en la presente. También, por ejemplo, todas las formas enol-ceto de cualquiera de los compuestos (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) se consideran en la presente como parte de las composiciones descritas en la presente.
Algunos de los compuestos en la presente (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) son acídicos y pueden formar una sal con un catión farmacéuticamente aceptable. Algunos de los compuestos en la presente (incluyendo, pero sin limitarse a, aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácido-no natural y polipéptidos de aminoácido no natural modificado y reactivos para producir los compuestos antes mencionados) pueden ser básicos y por consiguiente pueden formar una sal con un anión farmacéuticamente aceptable. Todas tales sales, incluyendo di-sales se encuentran dentro del alcance de las composiciones descritas en la presente y pueden prepararse mediante métodos convencionales. Por ejemplo, las sales pueden prepararse poniendo en contacto las entidades acídicas y básicas, con cualquiera de un medio acuoso, no acuoso o parcialmente acuoso. Las sales se recuperan utilizando al menos una de las téenicas siguientes: filtración, precipitación con un no solvente seguida por filtración, evaporación del solvente o, en el caso de soluciones acuosas, liofilización.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente pueden formarse cuando un protón acídico presente en los polipéptidos de aminoácido no natural de origen ya sea se remplaza por un ion de metal, a modo de ejemplo un ion de metal alcalino, un ion de tierra alcalina, o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica. Adicionalmente, las formas de sal de los polipéptidos de aminoácido no natural descritos pueden prepararse utilizando sales de los materiales de inicio o intermediarios. Los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente pueden prepararse como una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable (que es un tipo de sal farmacéuticamente aceptable) haciendo reaccionar la forma de base libre de los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente con un ácido inorgánico u orgánico f rmacéuticamente aceptable. Alternativamente, los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente pueden prepararse como sales de adición de base farmacéuticamente aceptables (que son un tipo de sal farmacéuticamente aceptable) haciendo reaccionar la forma de ácido libre de los polipéptidos de aminoácido no natural descritos en la presente con una base inorgánica u orgánica farmacéuticamente aceptable.
Los tipos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de adición de ácido, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y lo similar; o formadas con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]oct-2-eno-1-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 4,4'-metilenobis-(3-hidroxi-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido lauril sulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico y lo similar; (2) sales formadas cuando el protón acídico presente en el compuesto de origen ya sea se remplaza por un ion de metal, e.g., un ion de metal alcalino, un ion de tierra alcalina o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica. Las bases orgánicas aceptables incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y lo similar. Las bases inorgánicas aceptables incluyen hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio y lo similar.
Los contraiones correspondientes de las sales farmacéuticamente aceptables del polipéptido de aminoácido no natural pueden analizarse e identificarse utilizando varios métodos que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de ion, electroforesis capilar, plasma inductivamente acoplado, espectroscopia de absorción atómica, espectrometría de masa o cualquier combinación de los mismos. Adicionalmente, la actividad terapéutica de tales sales farmacéuticamente aceptables de polipéptido de aminoácido no natural puede probarse utilizando las téenicas y métodos descritos en los ejemplos 87 a 91.
Debe entenderse que la referencia a una sal incluye las formas de adición de solvente o las formas cristalinas de las mismas, particularmente solvatos o polimorfos. Los solvatos contienen cantidades ya sea estequiométricas o no estequiométricas de un solvente, y frecuentemente se forman durante el proceso de cristalización con solventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y lo similar. Cuando el solvente es agua se forman hidratos o se forman alcoholatos cuando el solvente es alcohol. Los polimorfos incluyen las diferentes disposiciones de empaquetado cristalino de la misma composición elemental del compuesto. Los polimorfos tienen comúnmente patrones de difracción de rayos X, espectros infrarrojos, puntos de fusión, densidad, dureza, configuración cristalina, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidad y solubilidad diferentes. Varios factores tales como el solvente de recristalización, la tasa de cristalización, y la temperatura de almacenamiento pueden ocasionar que domine una sola forma cristalina.
La visualización y caracterización de polimorfos y/o solvatos de sales farmacéuticamente aceptables del polipéptido de aminoácido no natural puede llevarse a cabo utilizando una variedad de téenicas que incluyen, pero no se limitan a, análisis térmico, difracción por rayos X, espectroscopia, absorción de vapor y microscopía. Los métodos de análisis térmico se dirigen a la degradación termo química o a procesos termo físicos que incluyen, pero no se limitan a, transiciones polimórficas, y tales métodos se utilizan para analizar las relaciones entre las formas polimórficas, para determinar la pérdida de peso, para encontrar la temperatura de transición del vidrio o para estudios de compatibilidad de excipientes. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, calorimetría de escaneo diferencial (DSC), calorimetría de escaneo diferencial modulado (MDCS), análisis termo-gravimétrico (TGA) y análisis termo-gravimétrico e infrarrojo (TG/IR). Los métodos de difracción por rayos X incluyen, pero no se limitan a, difractómetros únicos de cristal y polvo y fuentes sincrotrón. Las diversas téenicas espectroscópicas utilizadas incluyen, pero no se limitan a, Raman, FTIR, UVIS y NMR (en estado líquido y sólido). Las diversas técnicas de microscopía incluyen, pero no se limitan a, microscopía de luz polarizada, microscopía de electrón de escaneo (SEM) con análisis de rayos X de dispersión de energía (EDX), microscopía de electrón de escaneo ambiental con EDX (en una atmosfera de gas o vapor de agua), microscopía IR, y microscopía Raman.
INCORPORACIÓN MEDIANTE LA REFERENCIA Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente mediante la referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente incorporada mediante la referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones anexas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención mediante la referencia a la siguiente descripción detallada que expone las modalidades ilustrativas, en las cuales se utilizan los principios de la invención, y los dibujos anexos de los cuales: La Figura 1 presenta una ilustración gráfica de la eficacia anti-tumor del anticuerpo de ARX-aCD70 no conjugado CD70-2H5-HA119 administrado en una dosis única a ratones atímicos hembra 7 días después del implante de un fragmento de tumor 786-0 en una dosis de 3 mg/kg) contra el vehículo de control.
La Figura 2 presenta una ilustración gráfica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba de ratones atímicos hembra tratados con dosis de 1 mg/kg, 3 mg/kg, y 10 mg/kg del conjugado de anticuerpo-fármaco CD70-2H5-HA119-NCA1 en el modelo de xeno-injerto de carcinoma de célula renal, en las mismas condiciones de la Figura 1.
La Figura 3A presenta una ilustración gráfica de los resultados de un análisis de citotoxicidad de tres conjugados de anticuerpo ARX-fármaco: CD70-2H5-NCA1, CD-70-69A7-NCA1 y CD70hIF6-NCA1 en células 786-0.
La Figura 3B presenta una ilustración gráfica de los resultados de un análisis de citotoxicidad de tres conjugados de anticuerpo ARX-fármaco: CD70-2H5-NCA1, CD-70- 69A7-NCA1 y CD70hIF6-NCAl en células Caki-1.
La Figura 4A-4C presenta una ilustración gráfica del volumen del tumor al paso del tiempo después de una inyección única en el día 12 del anticuerpo aCD70 CD70-2H5-HA119 de la Figura 4(A) conjugado a AS269 (también referido como NCA1 dentro de la presente solicitud); del anticuerpo aCD70 CD70-8A1-HA122 de la Figura 4(B) conjugado a AS269; y del anticuerpo aCD70 CD70-7F2-HA119 de la Figura 4(C) conjugado. Los conjugados de anticuerpo-fármaco se proporcionaron en dosis de 0.5 mg/kg; 1 mg/kg; y 3 mg/kg y se compararon con el vehículo.
La Figura 5 presenta un trazo punteado de los volúmenes del tumor de diferentes grupos de prueba medidos en el día 49 después del trasplante del fragmento de tumor 786- 0.
La Figura 6A presenta una ilustración gráfica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba de ratones atímicos hembra tratados con 3 mg/kg de CD70-2H5-AS269; 3 mg/kg de CD70-8A1-AS269; y 3 mg/kg de CD70-7F2AS269; administrados 12 días después del trasplante de un fragmento de tumor 786-0.
La Figura 6B presenta una ilustración gráfica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba de ratones atímicos hembra tratados con 1 mg/kg y 3 mg/kg de CD70-2H5AS269 en comparación con el vehículo; los conjugados de anticuerpo-fármaco se administraron 12 días después del trasplante de un fragmento de tumor 786-0.
La Figura 6C presenta una ilustración gráfica del volumen del tumor en grupos de sujetos de prueba de ratones atímicos hembra tratados con 1 mg/kg y 3 mg/kg de 8Al-pAFl-AS269 en comparación con el vehículo; los conjugados de anticuerpo-fármaco se administraron 12 días después del trasplante de un fragmento de tumor 786-0.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en la presente, será obvio para los expertos en la téenica que tales modalidades se proporcionan solamente a modo de ejemplo. Ahora se presentarán a los expertos en la técnica numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las modalidades de la invención descritas en la presente en la práctica de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos por las mismas.
I. Introducción Recientemente, se ha reportado una teenología completamente nueva en la ciencia de proteínas, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con modificaciones de proteínas de sitio específico. Específicamente, se han agregado nuevos componentes a la maquinaria de la proteína biosintética del procariota Escherichia coli (E. coli) (e.g., L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y del eucariota Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (e.g., J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), lo cual ha permitido la incorporación de aminoácidos no naturales a proteínas in vivo. Se han incorporado eficientemente y con alta fidelidad un número de aminoácidos nuevos con propiedades químicas, físicas o biológicas nuevas, que incluyen etiquetas de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos de ceto, y aminoácidos glicosilados en proteínas de E. coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Ver, e.g., J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society (Diario de la Sociedad Americana de Química) 124:9026-9027 (incorporada mediante la referencia en su totalidad); J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137 (incorporada mediante la referencia en su totalidad); J. W. Chin, et al., (2002), PNAS Estados Unidos de América 99(17):11020-11024 (incorporada mediante la referencia en su totalidad); y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-11 (incorporada mediante la referencia en su totalidad). Estos estudios han demostrado que es posible introducir selectiva y rutinariamente grupos funcionales químicos que no se encuentran en proteínas, que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales que se encuentran en los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes y que pueden utilizarse para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables.
II. Sumario La presente invención proporciona anticuerpos OÍCD70 que tienen un aminoácido no naturalmente codificado que facilita la conjugación del anticuerpo a un fármaco (e.g., un fármaco, toxina, molécula marcador). En una modalidad, el ADC comprende un anticuerpo aCD70 conjugado a un fármaco en donde la conjugación se presenta a través de un aminoácido no naturalmente codificado en el anticuerpo. En una modalidad, el ADC comprende un anticuerpo aCD70 conjugado a un fármaco en donde la conjugación se presenta a través de un aminoácido no naturalmente codificado en la cadena pesada del anticuerpo. En una modalidad, el ADC comprende un anticuerpo OÍCD70 conjugado a un fármaco en donde la conjugación se presenta a través de un aminoácido no naturalmente codificado en la cadena ligera del anticuerpo. En una modalidad, el ADC comprende un anticuerpo de longitud total conjugado a un fármaco en donde la conjugación se presenta a través de un aminoácido no naturalmente codificado en el anticuerpo. En una modalidad, el ADC comprende un anticuerpo de longitud total conjugado a un fármaco en donde la conjugación se presenta a través de un aminoácido no naturalmente codificado en la cadena pesada del anticuerpo. En una modalidad, el ADC comprende un anticuerpo de longitud total conjugado a un fármaco en donde la conjugación se presenta a través de un aminoácido no naturalmente codificado en la cadena ligera del anticuerpo.
En algunas modalidades, el fármaco del ADC es un fármaco citotóxico. En algunos aspectos de la invención, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que consiste de una auristatina, un agente de enlace de ranura menor de ADN, un agente de alquilación de ranura menor de ADN, una enediina, una lexitropsina, una duocarmicina, un taxano, una puromicina, una dolastatina, un maitansinoide, y un vinca alcaloide. En algunos aspectos de la invención, el fármaco citotóxico es En otras modalidades de la presente invención, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que comprende l En algunas modalidades de la presente invención, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que consiste de En otros aspectos de la presente invención, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que consiste de: En otros aspectos de la presente invención, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que consiste de: En otros aspectos de la presente invención, el fármaco citotóxico se selecciona del grupo que consiste de AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecan, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretatstatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1, o netropsina.
En algunos aspectos de la invención, el fármaco citotóxico es un agente anti-tubulina. En algunas modalidades el agente anti-tubulina es una auristatina, un vinca alcaloide, una podofilotoxina, un taxano, un derivado de bacatina, una criptofisina, un maitansinoide, una combretastatina o una dolastatina. En otros aspectos de la invención, el agente anti-tubulina es AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, paclitaxel, docetaxel, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colquicinas, colcimid, estramustina, cemadotina, discodenolida, maitansina, DM-1, o eleuterobina.
En otros aspectos de la invención, el fármaco citotóxico del ADC es ganciclovir, etanercept, ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetil, metotrexato, cortisol, aldosterona, dexametasona, un inhibidor de ciclooxigenasa, un inhibidor de 5-ipoxigenasa o un antagonista del receptor de leucotrieno.
En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo del ADC comprende un anticuerpo de longitud total que: (a) se enlaza a CD70, y (b) se conjuga a un agente citotóxico o a un agente inmunosupresor, en donde el conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce: (a) un efecto citotóxico o cistostático en una línea celular de cáncer que expresa CD70, o (b) un efecto citotóxico, citostático o inmunosupresor en una célula inmune que expresa CD70, en donde la conjugación se presenta en un aminoácido no naturalmente codificado en el anticuerpo.
En un nivel, se describen en la presente herramientas (métodos, composiciones, téenicas) para crear y utilizar derivados o análogos de un enlazador de dolastatina, que comprenden al menos un carbonilo, dicarbonilo, oxima, hidroxilamina, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino, o eno-diona. En otro nivel, se describen en la presente herramientas (métodos, composiciones, técnicas) para crear y utilizar derivados o análogos del enlazador de dolastatina, que comprenden al menos un aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado con una oxima, amina aromática, heterociclo (e.g., indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.).
Tales derivados del enlazador de dolastatina que comprenden aminoácidos no naturales pueden contener funcionalidad adicional, que incluye pero no se limita a, un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinación de los mismos. Debe notarse que las funcionalidades varias antes mencionadas no pretenden implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan clasificarse como miembros de otra funcionalidad. De hecho, habrá superposición dependiendo de las circunstancias particulares. Solamente a modo de ejemplo, un polímero soluble en agua se superpone en alcance con un derivado de polietilen glicol, sin embargo la superposición no se completa y por tanto ambas funcionalidades se citaron anteriormente.
Se proporciona en la presente en algunas modalidades, un derivado del enlazador del grupo tóxico que comprende un carbonilo, dicarbonilo, oxima, hidroxilamina, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino, o eno-diona. En algunas modalidades, el derivado del grupo tóxico comprende cualquiera de los enlazadores descritos en la presente. En otras modalidades, se describen en la presente herramientas (métodos, composiciones, téenicas) para crear y utilizar derivados o análogos del grupo tóxico que comprenden al menos un aminoácido no natural o un aminoácido no natural modificado con una oxima, amina aromática, heterociclo (e.g., indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.).
En algunas modalidades, tales derivados tóxicos que comprenden aminoácidos no naturales pueden contener una funcionalidad adicional, incluyendo pero sin limitarse a, un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinación de los mismos. En modalidades específicas, el grupo tóxico es un inhibidor de tubulina. En ciertas modalidades específicas, el grupo tóxico es dolastatina o auristatina. En otras modalidades específicas, el grupo tóxico es dolastatina o un derivado de auristatina. Debe notarse que las funcionalidades varias antes mencionadas no pretenden implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan clasificarse como miembros de otra funcionalidad. De hecho, habrá superposición dependiendo de las circunstancias particulares. Solamente a modo de ejemplo, un polímero soluble en agua se superpone en alcance con un derivado de polietilen glicol, sin embargo la superposición no se completa y por tanto ambas funcionalidades se citaron anteriormente.
Ciertas modalidades de la presente invención describen preparaciones de ciertos residuos tóxicos con enlazadores que reducen la toxicidad del residuo in vivo mientras el residuo tóxico retiene la actividad farmacológica. En algunas modalidades, la toxicidad del grupo tóxico enlazado, cuando se administra a un animal o a un humano, se reduce o se elimina en comparación con el grupo tóxico libre o los derivados del grupo tóxico que comprenden enlaces lábiles, mientras retiene la actividad farmacológica. En algunas modalidades, pueden administrarse dosis incrementadas del grupo tóxico enlazado (e.g., derivados del enlazador de dolastatina, derivados de dolastatina enlazados a aminoácido no natural) a animales o humanos con mayor seguridad. En ciertas modalidades, los polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a un residuo tóxico (e.g., derivado de dolastatina) proporcionan estabilidad in vitro e in vivo. En algunas modalidades, los polipéptidos de aminoácido no natural enlazados a un residuo tóxico (e.g., inhibidor de tubulina, derivado de dolastatina-10) son eficaces y menos tóxicos en comparación con el residuo tóxico libre (e.g., inhibidor de tubulina, dolastatina-10).
III. Derivados del Enlazador de Dolastatina En un nivel, se describen en la presente herramientas (métodos, composiciones, téenicas) para crear y utilizar derivados o análogos del enlazador de dolastatina que comprenden al menos un aminoácido no natural o aminoácido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, oxima, o hidroxilamina. Tales derivador del enlazador de dolastatina que comprenden aminoácidos no naturales pueden contener una funcionalidad adicional, que incluye pero no se limita a, un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinación de los mismos. Debe notarse que las varias funcionalidades antes mencionadas no pretenden implicar que los miembros de una funcionalidad no puedan clasificarse como miembros de otra funcionalidad. De hecho, habrá superposición dependiendo de las circunstancias en particular. Solamente a modo de ejemplo, un polímero soluble en agua se superpone en alcance con un derivado de polietilen glicol, sin embargo la superposición no se completa y por tanto ambas funcionalidades se citaron anteriormente.
En un aspecto existen métodos para seleccionar y diseñar un derivado del enlazador de dolastatina que va a modificarse utilizando los métodos, composiciones y téenicas descritas en la presente. El nuevo derivado del enlazador de dolastatina puede diseñarse nuevamente, incluyendo únicamente a modo de ejemplo, como parte de un proceso de exploración de alto rendimiento (en cuyo caso pueden diseñarse, sintetizarse, caracterizarse y/o probarse numerosos polipéptidos) o en base a los intereses del investigador. El nuevo derivado del enlazador de dolastatina también puede diseñarse en base a la estructura de un polipéptido conocido o parcialmente caracterizado. Solamente a modo de ejemplo, la dolastatina ha sido sujeto de intenso estudio por la comunidad científica; puede diseñarse un nuevo compuesto en base a la estructura de dolastatina. Los principios para seleccionar cuál(es) aminoácido(s) sustituir y/o modificar se describen por separado en la presente. La selección de cuál modificación emplear también se describe en la presente y puede utilizarse para cumplir las necesidades del experimentador o el usuario final. Tales necesidades pueden incluir, pero no se limitan a, manipular la efectividad terapéutica del polipéptido, mejorar el perfil de seguridad del polipéptido, ajustar la farmacocinética, farmacología y/o farmacodinamia del polipéptido, tal como, solamente a modo de ejemplo, incrementando la solubilidad en agua, la biodisponibilidad, incrementando la vida media en suero, incrementando la vida media terapéutica, modulando la inmunogenicidad, modulando la actividad biológica, o extendiendo el tiempo de circulación. Adicionalmente, tales modificaciones incluyen, solamente a modo de ejemplo, proporcionar funcionalidad adicional al polipéptido, incorporar un anticuerpo y cualquier combinación de las modificaciones antes mencionadas.
También se describen en la presente derivados del enlazador de dolastatina que se han modificado o pueden modificarse para contener un grupo oxima, carbonilo, dicarbonilo o hidroxilamina. Se incluyen en este aspecto métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar tales derivados del enlazador de dolastatina.
El derivado del enlazador de dolastatina puede contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o diez o más de un grupo carbonilo o dicarbonilo, un grupo oxima, un grupo hidroxilamina o sus formas protegidas. El derivado del enlazador de dolastatina puede ser el mismo o diferente, por ejemplo puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más sitios diferentes en el derivado que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más grupos reactivos diferentes.
A. Estructura y Síntesis de Derivados del Enlazador de Dolastatina: Grupos Electrofílíeos y Nucleofílicos Los derivados de dolastatina con enlazadores que contienen un grupo hidroxilamina (también llamado aminooxi) permiten la reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero sin limitarse a, con PEG u otros polímeros solubles en agua). Como las hidracinas, hidracidas y semicarbacidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi les permite reaccionar eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas que contienen grupos carbonilo o dicarbonilo incluyendo, pero sin limitarse a, cetonas, aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver e.g., Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc.117:3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res.34(9): 727-736 (2001). Mientras el resultado de la reacción con un grupo hidracina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxima resulta generalmente de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo o dicarbonilo tal como, a modo de ejemplo, cetonas, aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. En algunas modalidades, los derivados de dolastatina con enlazadores que comprenden una azida, alquino o cicloalaquino, permiten el enlace de moléculas a través de reacciones de cicloadición (e.g., cicloadiciones 1,3-bipolares, cicloadiciones Huisgen de azida-alquino, etc.). (Descritas en la Patente de E.U. No. 7,807,619 que se incorpora mediante la referencia en la presente en la medida relativa a la reacción).
Por tanto, en ciertas modalidades descritas en la presente se encuentran derivados de dolastatina con enlazadores que comprenden un grupo hidroxilamina, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino e hidroxilamina eno-diona, un grupo tipo hidroxilamina (que tiene una reactividad similar a un grupo hidroxilamina y es estructuralmente similar a un grupo hidroxilamina), un grupo hidroxilamina enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo hidroxilamina) o un grupo hidroxilamina protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo hidroxilamina a su desprotección). En algunas modalidades, los derivados de dolastatina con enlazadores comprenden azidas, alquinos o cicloalquinos. Tales derivados del enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (I), (III), (IV), (V) y (VI): - . — \ — en donde : Z tiene la estructura de: R5 es H, COR8, alquilo C -C6 o tiazol ; Rg es OH o NH (alquileno-O) n-NH2 ; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; Y, y V se seleccionan cada uno del grupo que consiste de una hidroxilamina, metilo, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, alquino, cicloalquino, y eno-diona; Li, L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un enlace, -alquileno-, -alquileno-C(O)-, -alquileno-J-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n- J-, - (alquileno-O)n-J-alquileno-, -(alquileno-O)n-(CH2)n·- NHC(O)-(CH2)n -C(Me)2-S-S-(CH2)n- NHC(O)-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(0)-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, -alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno', -J- (alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J- (alquileno-O)n--alquileno-J'-, -W-, -alquileno- -, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J- (alquileno-NMe)n- alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe alquileno'-NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: : cada J y J' tienen independientemente la estructura de: cada n, h', n'', n''' y n'''' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno; y o L está ausente, Y es metilo, R5 es COR8 y R8 es - NH(alquileno-O)n-NH2.
Tales derivados del enlazador de dolastatina pueden encontrarse en forma de una sal o pueden incorporarse en un polipéptido, polímero, polisacárido o un polinucleótido de aminoácido no natural y opcionalmente modificarse de manera traduceional.
En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III) y (V), R5 es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III) y (V), R5 es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III) y (V), R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III) y (V), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde el alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III) y (V), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En algunas modalidades, Y es azida. En otras modalidades, Y es cicloalquino. En modalidades específicas, la ciclooctina tiene la estructura de: cada Rig se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo Ci-C6/ alcoxi Ci-C6, éster, éter, tioéter, aminoalquilo, halógeno, alquil éster, aril éster, amida, aril amida, alquil haluro, alquil amina, ácido alquil sulfónico, alquil nitro, tioéster, sulfonil éster, halosulfonilo, nitrilo, alquil nitrilo, y nitro; y q es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), (III), y (V), R6 es H. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), (III), y (V), R6 es hidroxi.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), (III), y (V), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), (III), (IV), (V), y (VI), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo, iso-butilo, ter- butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), (III), (IV), (V), y (VI), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), (III), y (V), Y es hidroxilamina, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, áster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, o eno-diona.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (IV) y (VI), V es a hidroxilamina, metilo, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, áster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino, y eno-diona.
En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III), (IV), (V) y (VI), cada L, L1 L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III), (IV), (V) y (VI), cada L, Li, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula (I), (III), (IV), (V) y (VI), cada alquileno, alquileno', alquileno'', y alquileno''' es independientemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- . En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XIV) , (XV) , (XVI) , (XVII) , y (XVIII) , cada n, n' , h' ' , n' ' ' , y n' ' ' ' es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, O 100.
B. Estructura y Síntesis de Derivados del Enlazador de Dolastatina: Grupos Hidroxilamina Por tanto, en ciertas modalidades descritas en la presente se encuentran derivados de dolastatina con enlazadores que comprenden un grupo hidroxilamina, un grupo tipo hidroxilamina (que tiene una reactividad similar a un grupo hidroxilamina y es estructuralmente similar a un grupo hidroxilamina), un grupo hidroxilamina enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo hidroxilamina) o un grupo hidroxilamina protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo hidroxilamina a su desprotección). Tales derivados del enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (I): en donde: Z tiene la estructura de: R5 es H, CORg, alquilo C -C6, o tiazol; R8 es OH o -NH- (alquileno-O) n-NH2 ; R es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo C -C6 o hidrógeno; Y es NH2-O- O metilo; L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de -alquileno-, -alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(0)-, -(alquileno-0)n- ( CH2 ) n— NHC ( O ) - (CH2)n -C( e)2-S-S- (CH2)n - NHC(O) - (alquileno- 0) n- - ---alquileno-, - (alquileno-O) n-alquileno-W- , -alquileno-C (0) -W- , - (alquileno-O) -alquileno-U-alquileno-C (0) - , y (alquileno-O) n-alquileno-U-alquileno- ; W tiene la estructura de: o L está ausente, Y es metilo, R5 es CORg, y R8 es -NH- (alquileno-O)n-N¾ ; y cada n, n' , n'', n'' ' y n'''' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno. Tales derivados del enlazador de dolastatina pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido, polímero, polisacárido, o un polinucleótido de aminoácido no natural y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R5 es tiazol. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), Rs es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), Rs es -NH-(alquileno-O)n-NH2/ en donde el alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, O CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R6 es H. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R6 es hidroxi.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), Y es hidroxilamina, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino o eno-diona. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), V es una hidroxilamina, metilo, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino y eno-diona.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), cada L es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), cada L es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , O CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (I), cada n, h', n'', n''', y n" " es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades, los derivados del enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (II) : En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), L es -(alquileno-O)n-alquileno-. En algunas modalidades, cada alquileno es -CH2CH2-, n es igual a 3, y R7 es metilo. En algunas modalidades, L es -alquileno-. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), cada alquileno es -CH2CH2- y R7 es metilo o hidrógeno. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), L es -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), cada alquileno es -CH2CH2-, n es igual a 4, y R7 es metilo. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), L es -(alquileno-O)n-(CH2)n--NHC(O)-(CH2)n..-C(Me)2-S-S-(C¾)n---- NHC(O)-(alquileno-O)n,. "-alquileno-. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), cada alquileno es -CH2CH2-, n es igual a 1, n' es igual a 2, n'' es igual a 1, n''' es igual a 2, n'''' es igual a 4, y R7 es metilo. Tales derivados del enlazador de dolastatina pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido, polímero, polisacárido, o un polinucleótido de aminoácido no natural y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), cada L es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), cada L es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II), alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- o CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- . En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (II) , cada n, n' , n' ' , n" ', y n" " es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
Tales derivados del enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI): _ \ i , en donde : Z tiene la estructura de: R5 es H, COR8 alquilo C -C6 o tiazol ; R8 es OH; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo C -C6 o hidrógeno; Y es NH2-O- ; V es -0-NH2 LI, L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste de un enlace, -alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J- (alquileno-O)n alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, -W- -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMe-alquileno' NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales una uno.
Tales derivados del enlazador de dolastatina pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido, polímero, polisacárido, o un polinucleótido de aminoácido no natural y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), R5 es tiazol. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), R6 es H. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), Ar es fenilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), R7 es metilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), n y n' son enteros de 0 a 20. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), n y n' son enteros de 0 a 10. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) o (VI), n y n' son enteros de 0 a 5.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III) y (V), R5 es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III) y (V), R5 es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III) y (V), R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III) y (V), R5 es -NH-(alquileno-0)n-NH2, en donde el alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o CHz^ CHzCHsCHzCHsCHaCHzCHaCHsCHzCHs-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III) y (V), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NHz, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), R6 es H. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), R6 es hidroxi.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III) y (V), Y es hidroxilamina, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, áster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino o eno-diona. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (IV) y (VI), V es una hidroxilamina, metilo, aldehido, aldehido protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, áster, dicarbonilo, hidracina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquino y eno-diona.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XIV), (XV), (XVI), (XVII), y (XVIII), cada L, Lx, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XIV), (XV), (XVI), (XVII), y (XVIII), cada L, Li, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), cada alquileno, alquileno', alquileno'', y alquileno''' es independientemente -CH2-, CH2CH2- , -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2-, H2CH2CH2CH2CH2 H2- , CH2CH2CH CH CH CH H , CH2CH CH CH2CH CH2CH CH - , -CH2CH CH CH CH CH2CH CH CH - , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), alquileno es metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (III), (IV), (V) y (VI), cada n y n' es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, O 100 En ciertas modalidades, los derivados del enlazador de dolastatina incluyen compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (VII): _ — En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VII), Li es -(alquileno-O)n-alquileno-J-, L2 es -alquileno'-J'-(alquileno-O)n.-alquileno-, L3 es -J''-(alquileno-O)n"-alquileno-, alquileno es -CH2CH2-, alquileno' es —(CH2)4—, n es 1, n' y n'' son 3, J tiene la estructura de J' y J" tienen la estructura de H y R7 es metilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VII), I^ es -J-(alquileno-O)n-alquileno-, L2 es -(alquileno-O)'-alquileno-J'-alquileno'-, L3 es -(alquileno-0)n---alquileno-J''-, alquileno es -CH2CH2-, alquileno' es -(CH2)4-, n son 4, y J, J' y J'' tienen la estructura Tales derivados del enlazador de dolastatina pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido, polímero, polisacárido, o un polinucleótido de aminoácido no natural y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (I)-(VII) son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (I)-(VII) son estables por al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (I)-(VII) son estables por al menos 5 días bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, tales condiciones acídicas tienen un pH de 2 a 8.
Los métodos y composiciones proporcionados y descritos en la presente incluyen polipéptidos que comprenden un derivado del enlazador de dolastatina que contiene al menos un grupo carbonilo o dicarbonilo, un grupo oxima, un grupo hidroxilamina, o sus formas protegidas o enmascaradas. La introducción de al menos un grupo reactivo en un derivado del enlazador de dolastatina puede permitir la aplicación de químicas de conjugación que implican reacciones químicas específicas, incluyendo, pero sin limitarse a, con uno o más derivados del enlazador de dolastatina mientras no reaccionen con los aminoácidos que se presentan comúnmente. Una vez incorporadas, las cadenas laterales del derivado del enlazador de dolastatina también pueden modificarse utilizando las metodologías químicas descritas en la presente o adecuadas para los grupos o sustituyentes funcionales particulares presentes en el derivado del enlazador de dolastatina.
Los métodos y composiciones del derivado del enlazador de dolastatina descritos en la presente proporcionan conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, sustituyentes o residuos, con otras sustancias que incluyen pero no se limitan a un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinación de los mismos.
En ciertas modalidades, los derivados del enlazador de dolastatina, enlazadores y reactivos descritos en la presente, incluyendo los compuestos de las Fórmulas (I)-(VII) son estables en solución acuosa bajo condiciones ligeramente acídicas (incluyendo pero sin limitarse a un pH de 2 a 8). En otras modalidades, tales compuestos son estables por al menos un mes bajo condiciones ligeramente acídicas. En otras modalidades, tales compuestos son estables por al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acídicas. En otras modalidades, tales compuestos son estables por al menos 5 días bajo condiciones ligeramente acídicas.
En otro aspecto de las composiciones, métodos, téenicas y estrategias descritos en la presente se encuentran métodos para el estudio o la utilización de cualquiera de los derivados del enlazador de dolastatina de aminoácido no natural "modificado o no modificado" antes mencionados. Incluidos dentro de este aspecto, solamente a modo de ejemplo, se encuentran los usos terapéuticos, diagnósticos, en base a análisis, industriales, cosméticos, en biología de plantas, ambientales, de producción de energía, de productos consumibles y/o militares que se beneficiarían del derivado del enlazador de dolastatina que comprende un polipéptido o proteína de aminoácido no natural "modificado o no modificado".
Ejemplos no limitantes de derivados del enlazador de dolastatina incluyen: - - - - - ' ~~ - 261 1 1 1 En otro aspecto de la presente invención, el fármaco conjugado al anticuerpo anti-CD70 es dexametasona. En otro aspecto de la presente invención el fármaco conjugado al anticuerpo anti-CD70 es dasantinib. En otro aspecto de la presente invención, el fármaco conjugado al anticuerpo anti-CD70 es FK506. En otro aspecto de la presente invención el fármaco conjugado al anticuerpo anti-CD70 es un derivado de dexametasona. En otro aspecto de la presente invención, el fármaco conjugado al anticuerpo anti-CD70 es un derivado de dasantinib. En otro aspecto de la presente invención, el fármaco conjugado al anticuerpo anti-CD70 es un derivado de , En otros aspectos de la presente invención, la porción de enlazador-fármaco del conjugado de anticuerpo anti-CD70-fármaco se selecciona de uno de los siguientes ejemplos no limitantes. > En otros aspectos de la presente invención, la porción del fármaco enlazador del conjugado de anticuerpo fármaco anti-CD70 se selecciona de uno de los siguientes ejemplos no limitantes.
- — : Fármaco Enlazador Fármaco IV. Derivados de Aminoácido No Natural Los aminoácidos no naturales utilizados en los métodos y composiciones descritos en la presente tienen al menos una de las siguientes cuatro propiedades: (1) al menos un grupo funcional de la cadena lateral del aminoácido no natural tiene al menos una característica y/o actividad y/o reactividad ortogonal a la reactividad química de los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados (i.e., alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina. lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina), o al menos ortogonal a la reactividad química de los aminoácidos de origen natural presentes en el polipéptido que incluye el aminoácido no natural; (2) los aminoácidos no naturales introducidos sustancialmente son químicamente inertes hacia los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados; (3) el aminoácido no natural puede incorporarse de manera estable en un polipéptido, preferentemente con la estabilidad proporcional con los aminoácidos de origen natural u otras condiciones fisiológicas típicas, y además preferentemente tal incorporación puede presentarse a través de un sistema in vivo; y (4) el aminoácido no natural incluye un grupo funcional oxima o un grupo funcional que puede transformarse en un grupo oxima haciéndolo reaccionar con un reactivo, preferentemente bajo condiciones que no destruyan las propiedades biológicas del polipéptido que incluyen el aminoácido no natural (a menos, por supuesto, que tal destrucción de las propiedades biológicas sea el propósito de la modificación/transformación), o en donde la transformación puede presentarse bajo condiciones acuosas a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8, o en donde el sitio reactivo en el aminoácido no natural es un sitio electrofílico. Cualquier número de aminoácidos no naturales puede introducirse en el polipéptido. Los aminoácidos no naturales también pueden incluir oximas protegidas o enmascaradas o grupos protegidos o enmascarados que pueden transformarse en un grupo oxima después de la desprotección del grupo protegido o de desenmascarar el grupo enmascarado. Los aminoácidos no naturales también pueden incluir grupos carbonilo o dicarbonilo protegidos o enmascarados que pueden transformarse en un grupo carbonilo o dicarbonilo después de la desprotección del grupo protegido o de desenmascarar el grupo enmascarado y por tanto están disponibles para reaccionar con hidroxilaminas u oximas para formar grupos oxima.
Los aminoácidos no naturales que pueden utilizarse en los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos que comprenden aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos que interactúan de manera covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos glicosilados tales como una serina sustituida con azúcar, otros aminoácidos modificados por carbohidratos, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que contienen aldehido, aminoácidos que comprenden polietileno glicol u otros poliéteres, aminoácidos sustituidos por un átomo pesado, aminoácidos químicamente divisibles y/o foto divisibles, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales incluyendo, pero sin limitarse a, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga incluyendo, pero sin limitarse a, mayores que aproximadamente 5 o mayores que aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos enlazados a carbono que contienen azúcar, aminoácidos de reducción/oxidación, aminoácidos que contienen amino tioácido y aminoácidos que comprenden uno o más residuos tóxicos.
En algunas modalidades, los aminoácidos no naturales comprenden un residuo sacárido. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-manosaminil-L-serina. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen también ejemplos del enlace N u 0 de origen natural entre el aminoácido y el sacárido se remplaza por un enlace covalente que no se encuentra comúnmente en la naturaleza incluyendo, pero sin limitarse a, un alqueno, una oxima, un tioéter, una amida y lo similar. Ejemplos de tales aminoácidos incluyen también sacáridos que no se encuentran comúnmente en proteínas de origen natural tales como 2-desoxi-glucosa, 2-desoxigalactosa y lo similar.
Los residuos químicos incorporados en polipéptidos a través de la incorporación de aminoácidos no naturales en tales polipéptidos ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de polipéptidos. Por ejemplo, la reactividad única de un grupo funcional carbonilo o dicarbonilo (incluyendo un grupo funcional ceto o aldehido) permite la modificación selectiva de proteínas con cualquiera de un número de reactivos que contienen hidracina o hidroxilamina in vivo e in vitro. Un aminoácido no natural de átomo pesado, por ejemplo, puede ser útil para ajustar la fase de los datos de estructura de rayos X. La introducción específica del sitio de átomos pesados utilizando aminoácidos no naturales tambien proporciona selectividad y flexibilidad para seleccionar posiciones para átomos pesados. Los aminoácidos no naturales foto-reactivos (incluyendo pero sin limitarse a, cadenas laterales de aminoácidos con benzofenona y arilazidas (incluyendo pero sin limitarse a, fenilazida)), por ejemplo, permiten la eficiente foto-reticulación in vivo e in vitro de los polipéptidos. Ejemplos de aminoácidos foto-reactivos no naturales incluyen, pero no se limitan a, p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. El polipéptido con los aminoácidos no naturales foto-reactivos puede entonces reticularse a voluntad mediante la excitación del control temporal que proporciona el grupo foto-reactivo. En un ejemplo no limitante, el grupo metilo de un aminoácido no natural puede sustituirse con un grupo isotópicamente etiquetado incluyendo, pero sin limitarse a, metilo, como sonda de estructura y dinámica local, incluyendo, pero sin limitarse a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia de vibración.
A. Estructura y Síntesis de Derivados de Aminoácido No Natural: Grupos Carbonilo, tipo Carbonilo, Carbonilo Enmascarados y Carbonilo Protegidos Los aminoácidos con un grupo reactivo electrofílico permiten una variedad de reacciones para enlazar moleculas a través de diversas reacciones químicas incluyendo, pero sin limitarse a, reacciones de adición nucleofílica. Tales grupos reactivos electrofílicos incluyen un grupo carbonilo o dicarbonilo (incluyendo un grupo ceto o aldehido), un grupo tipo carbonilo o tipo dicarbonilo (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo y es estructuralmente similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo), un grupo carbonilo enmascarado o dicarbonilo enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo carbonilo o dicarbonilo) o un grupo carbonilo protegido o dicarbonilo protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo a su desprotección). Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII): (XXXVII) en donde: A es opcional y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)-, -0S(0)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-< NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')- CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, o un grupo de protección, o cuando se encuentra presente más de un grupo R'', dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Rx es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo biciclico o tricíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado; o los grupos -K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, que incluye un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, que incluye un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, que incluye un grupo dicarbonilo enmascarado; con la salvedad de que cuando A es fenileno y cada R3 es H, B se encuentre presente; y que cuando A es -(CH2)4- y cada R3 es H, B no sea -NHC(O)(CH2CH2)-; y que cuando A y B están ausentes y cada R3 es H, R no sea metilo. Tales aminoácidos no naturales pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (XXXVII) son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (XXXVII) son estables por al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (XXXVII) son estables por al menos 5 días bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, tales condiciones acídicas son un pH de 2 a 8.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), B es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(R')=N N(R')-, -N(R')C0-, C(O)-, -C(R')=N-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, CON(R') (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(alquileno o alquileno sustituido)-, S(0)(alquileno o alquileno sustituido)-, o -S(0)2(alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), B es -0(CH2)-, -CH=N-, CH=N NH-, -NHCH2-, -NHCO-, C(O)-, C(0) (CH2)-, CONH (CH2)-, -SCH2-, -S(=0)CH2-, o -S(O)2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R es alquilo C1-6 o cicloalquilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII) R es -CH3, -CH(CH3)2, o ciclopropilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), Rx es H, ter-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA), o benciloxicarbonilo (Cbz). En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), Rx es una resina, un aminoácido, un polipéptido, un anticuerpo, o un polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es OH, O-metilo, 0-etilo, u 0-t-butilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es una resina, un aminoácido, un polipéptido, un anticuerpo, o un polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es un polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es ácido ribonucleico (ARN).
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), se selecciona del grupo que consiste de: (i) A es alquileno inferior sustituido, arileno C4, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador bivalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(0)2-, -OS(0)2-, C(0)-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, C(0)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R') N (R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, -N(R')C(S)-, S(0)N(R'), S(0)2N(R'), N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(0)2N(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-; (ii) A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior sustituido, arileno C4, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es un enlazador bivalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, C(O)-, C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C{0)0-, -N(R')C(S)-, S(0)N(R'), S(0)2N(R'), N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(0)2N(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2N(R') N(R')-; (iii) A es alquileno inferior; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador bivalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -NS(0)2-, -OS(O)2-, c(0)-, C (O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, C(0)N(R')-, -CSN(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)-, S (0)N(R'), S(0)2N(R'), N(R')C(O)N (R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)N(R')-, -N (R')S(0)2N(R')-, N(R')- N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-; y (iv) A es fenileno; B es un enlazador bivalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(0)2-, -0S(0)2-, C(O)-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, -N(R')C(S)~ , S(O)N(R'), S(O)2N(R'), N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(0)2N(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')- , -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2N(R') N(R')-; cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido Ri es opcional, y cuando se encuentra presente, es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando se encuentra presente, es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y cada R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Adicionalmente, los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVIII) están incluidos: en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, - OS(O)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-» NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N (R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')a N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, al menos un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, al menos un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; con la salvedad de que cuando A es fenileno, B se encuentre presente; y que cuando A es -(CH2)4-, B no sea -NHC(O)(CH2CH2)-; y que cuando A y B están ausentes, R no sea metilo. Tales aminoácidos no naturales pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXIX) están incluidos: (XXXIX) en donde : B es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'- (alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R') N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido,- y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' en donde k:es 1, 2, o 3, -C(0)N(R')2, -OR', y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos están incluidos: Tales aminoácidos no naturales pueden ser opcionalmente un grupo amino protegido, carboxilo protegido y/o en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXX) están incluidos: (XXXX) en donde -NS(O)2- -0S(O)2-, son opcionales, y cuando están presentes son un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')- N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N (R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Rx es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2, o 3, -C(0)N(R')2 -0R', y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es de 0 a 8; con la salvedad de que cuando A es -(CH2)4-, B no es -NHC(O)(CH2CH2)-. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos están incluidos: en donde tales compuestos son opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXI) están incluidos: (XXXXI) en donde, A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, - 0S(0)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipeptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXII) están incluidos: (XXXXII) en donde, B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, - OS(O)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' en donde k es 1, 2, o 3, C(0)N(R')2 -0R', y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos están incluidos: en donde tales compuestos son opcionalmente amino protegidos. opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXIV) están incluidos: en donde, B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, - OS(O)2- C (O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')~, CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')- (alquileno o alquileno sustituido}-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, S(O)kN(R')~, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2, o 3, -C(0)N(R')2, -0R', y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es de 0 a 8.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos están incluidos: - y donde tales compuestos son opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente a las estructuras monocarbonilo, los aminoácidos no naturales descritos en la presente pueden incluir grupos tales como grupos dicarbonilo, tipo dicarbonilo, dicarbonilo enmascarados y dicarbonilo protegidos.
Por ejemplo, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXV) están incluidos:' (XXXXV) en donde A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, -OS(O)2- C (O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')- CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R’)C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXVI) están incluidos: en donde B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior. alquileno inferior sustituido alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, 0S(0)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN (R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2, o 3, C(0)N(R')2 -0R', y -S(0)kR'» en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos están incluidos: en donde tales compuestos son opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXVII) están incluidos: (XXXXVII) en donde, B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, -NS(0)2-, - OS(0)2-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-f C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' en donde k es 1, 2, o 3, -C(O)N(R')2, -OR', y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es de 0 a 8.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos están incluidos : en donde tales compuestos son opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXVIII) están incluidos: (XXXXVIII) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; R1 es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; Xi es C, S, o S(O); y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXIX) están incluidos: (XXXXIX) en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido. heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXX) están incluidos: (XXXXX) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXI) están incluidos: (XXXXXI) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; Xi es C, S, o S(0); y n es O, 1, 2, 3, 4, o 5; y cada Rs y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo, o cualquier R8 y R9 pueden formar juntos =0 o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXII) están incluidos: (XXXXXII) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Rx es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipeptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; n es 0, 1, 2, 3, 4, o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo, o cualquiera de R8 y R9 pueden formar juntos =0 o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos Re adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXIII) están incluidos: ¡ (XXXXXIII) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; n es O, 1, 2, 3, 4, o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo, o cualquiera de Rg y R9 pueden formar juntos =0 o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXIV) están incluidos: (XXXXXIV) en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipeptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; Xi es C, S, o S(O); y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXV) están incluidos: (XXXXXV) en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipeptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traducciona1.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXVI) están incluidos 1 (XXXXXVI) en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N (R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXVII) están incluidos: (XXXXXVII) en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; : - en donde (a) indica el enlace al grupo A y (b) indica el enlace a los respectivos grupos carbonilo, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; T3 es un enlace, C(R)(R), O, o S, y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXVIII) están incluidos: - - — — . - en donde (a) indica el enlace al grupo A y (b) indica el enlace a los respectivos grupos carbonilo, R3 y R4 se seleccionan independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; T3 es un enlace, C(R)(R), O, o S, y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipeptido, o un polinucleótido,- y R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' en donde k es 1, 2, o 3, -C(O)N(R')2» -OR', y -S(O)kR' en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXIX) están incluidos: (XXXXXIX) en donde: R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; y T3 es O, o S.
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
Adicionalmente, los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXX) están incluidos: en donde: R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido.
Adicionalmente, los siguientes aminoácidos que tienen estructuras de la Fórmula (XXXXXX) están incluidos: Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduceional.
La funcionalidad carbonilo o dicarbonilo puede hacerse reaccionar selectivamente con un reactivo que contiene hidroxilamina bajo condiciones suaves en solución acuosa para formar el enlace oxima correspondiente que es estable bajo condiciones fisiológicas. Ver e.g., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc.81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc.117(14):3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo o dicarbonilo permite la modificación selectiva en presencia de las otras cadenas laterales de aminoácido. Ver, e.g., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc.118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem.3:138-146 (1992); Mahal, L.
K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
La síntesis de p-acetil-(+/-)-fenilalanina y m-acetil-(+/-)-fenilalanina se describe en Zhang et al., Biochemistry (Bioquímica) 42:6735-6746 (2003), incorporada mediante la referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo pueden prepararse de manera similar.
En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural se modifica químicamente para generar un grupo funcional carbonilo o dicarbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehido útil para reacciones de conjugación puede generarse a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. Cuando la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo, una serina o treonina de terminal N (que puede estar normalmente presente o puede estar expuesta a través de digestión química o enzimática) puede utilizarse para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de división oxidativa suaves utilizando periodato. Ver, e.g., Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem.3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem.269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en la téenica se restringen al aminoácido en la terminal N del péptido o proteína.
Adicionalmente, a modo de ejemplo, un aminoácido no natural portador de grupos hidroxilo y amino adyacentes puede incorporarse en un polipéptido como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina porta un grupo hidroxilo adyacente a la amina épsilon. Las condiciones de reacción para generar el aldehido implican típicamente la adición de un exceso molar de metaperiodato de sodio bajo condiciones suaves para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es típicamente de aproximadamente 7.0. Una reacción típica implica la adición de un exceso molar de aproximadamente 1.5 de metaperiodato de sodio a una solución amortiguada del polipéptido, seguida por incubación durante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Ver, e.g., Patente de E.U. No.6,423,685.
B. Estructura y Síntesis de Aminoácidos No Naturales: Grupos Dicarbonilo, tipo Dicarbonilo, Dicarbonilo Enmascarados, y Dicarbonilo Protegidos Los aminoácidos con un grupo electrofílico reactivo permiten una variedad de reacciones para enlazar moléculas a través de reacciones de adición nucleofílica entre otras. Tales grupos reactivos electrofílicos incluyen un grupo dicarbonilo (incluyendo un grupo dicetona, un grupo cetoaldehído, un grupo cetoácido, un grupo cetoéster, y un grupo cetotioéster), un grupo tipo dicarbonilo (que tiene una reactividad similar a un grupo dicarbonilo y es estructuralmente similar a un grupo dicarbonilo), un grupo dicarbonilo enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo dicarbonilo), o un grupo dicarbonilo protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo dicarbonilo a su desprotección). Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII): en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador enlazado en un extremo a un residuo que contiene diamina, seleccionado el enlazador del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)R"-, S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde k es 1, 2, o 3, C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, NR"- (alquileno o alquileno sustituido)-, CON(R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, CSN (R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, y N (R")C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde cada R" es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; , en donde , Ti es un enlace, alquileno Ci~C4 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C4 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo opcionalmente sustituido; en donde cada sustituyente opcional se selecciona independientemente de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; T2, se selecciona del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, 0-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k~ en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(O)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(O)N (R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(0)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; en donde cada Ci se selecciona independientemente del grupo que consiste de -O-, -S-, -N(H)-, -N(R)-, -N(Ac)-, y -N(OMe)- ; X2 es -0R, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe), o N3, y en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido,- R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; o los grupos -A-B-K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; o los grupos -K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado.
Un ejemplo no limitante de aminoácidos de dicarbonilo que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII) incluye: Los siguientes aminoácidos que tienen las estructuras de la Fórmula (XXXVII) también están incluidos .
Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido o un polinucleótido y opcionalmente modificarse de manera post traduccional.
C. Estructura y Síntesis de Aminoácidos No Naturales: Grupos Cetoalquino, Tipo Cetoalquino, Cetoalquino Enmascarado, Cetoalquino Protegido, grupos Alquino y Cicloalquino Los aminoácidos que contienen grupos reactivos con reactividad tipo dicarbonilo permiten el enlace de moléculas a través de reacciones de adición nucleofílica. Tales grupos reactivos electrofílicos incluyen un grupo cetoalquino, un grupo tipo cetoalquino (que tiene una reactividad similar a un grupo cetoalquino y es estructuralmente similar a un grupo cetoalquino), un grupo cetoalquino enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo cetoalquino), o un grupo cetoalquino protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo cetoalquino a su desprotección). En algunas modalidades, los aminoácidos que contienen grupos reactivos con un alquino terminal, alquino interno o cicloalquino permiten el enlace de moléculas a través de reacciones de cicloadición (e.g., cicloadiciones 1,3-bipolares, cicloadición Huisgen de azida-alquino, etc.). Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXXI-A) o (XXXXXXI-B): -en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador enlazado en un extremo a un residuo que contiene diamina, seleccionado el enlazador del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)R"-, S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde k es 1, 2, o 3, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, NR"- (alquileno o alquileno sustituido)-, CON(R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, y N(R")C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde cada R" es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; G es opcional, y cuando se encuentra presente es, T4 es un grupo de protección carbonilo incluyendo, pero sin limitarse a , en donde cada Cc se selecciona independientemente del grupo que consiste de -O-, -S-, -N(H)-, -N (R)-, -N(Ac)-, y -N(OMe)-; X2 es -0R, -OAc, -SR, -N(R)2, -N(R)(Ac), -N(R)(OMe), o N3, y en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada R19 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-C6, éster, éter, tioéter, aminoalquilo, halógeno, alquilo éster, arilo éster, amida, arilo amida, alquilo haluro, alquilo amina, ácido alquilo sulfónico, alquilo nitro, tioéster, sulfonilo éster, halosulfonilo, nitrilo, alquilo nitrilo, y nitro; y q es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.
D. Estructura y Síntesis de Aminoácidos No Naturales: Grupos Cetoamina, Tipo Cetoamina, Cetoamina Enmascarado, y Cetoamina Protegidos Los aminoácidos que contienen grupos reactivos con reactividad tipo dicarbonilo permiten el enlace de las moleculas a través de reacciones de adición nucleofílica. Tales grupos reactivos incluyen un grupo cetoamina, un grupo tipo cetoamina (que tiene una reactividad similar a un grupo cetoamina y es estructuralmente similar a un grupo cetoamina), un grupo cetoamina enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo cetoamina); o un grupo cetoamina protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo cetoamina a su desprotección). Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXXII): en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador enlazado en un extremo a un residuo que contiene diamina, seleccionado el enlazador del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, 0- (alquileno o alquileno sustituido)-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)R"-, S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde k es 1, 2, o 3, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, NR"- (alquileno o alquileno sustituido)-, CON(R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, CSN (R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, y N (R")C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde cada R" es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Tx es un alquileno opcionalmente sustituido, un alquenileno C3-C4 opcionalmente sustituido, o un heteroalquilo opcionalmente sustituido,- T4 es un grupo de protección carbonilo incluyendo, pero sin limitarse a, °Vtr> o v x-** , en donde cada Xi se selecciona independientemente del grupo que consiste de -O-, -S-, -N(H)-, -N(R')-, -N(Ac)-, y —N(OMe)-; X2 es -OR, -OAc, -SR', -N(R')2, -N(R')(Ac), - N (R')(OMe), o N3, y en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido,- cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo.
Los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXXII) incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXXIII) y la Fórmula (XXXXXXIV): ' (XXXXXXIII) (XXXXXXIV) en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' en donde k es 1, 2, o 3, C(O)N(R'>2 -OR', y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido.
E. Estructura y Síntesis de Aminoácidos no naturales: Diamina, tipo Diamina, Diamina Enmascarada, Aminas Protegidas y Azidas Los aminoácidos con un grupo reactivo nucleofílico permiten una variedad de reacciones para enlazar moleculas a través de reacciones de adición electrofílica entre otras. Tales grupos reactivos nucleofílicos incluyen un grupo diamina (incluyendo un grupo hidracina, un grupo amidina, un grupo imina, un grupo 1,1-diamina, un grupo 1,2-diamina, un grupo 1,3-diamina y un grupo 1,4-diamina), un grupo tipo diamina (que tiene una reactividad similar a un grupo diamina y es estructuralmente similar a un grupo diamina), un grupo diamina enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo diamina), o un grupo diamina protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo diamina a su desprotección). En algunas modalidades, los aminoácidos que contienen grupos reactivos con azidas permiten el enlace de las moléculas a través de reacciones de cicloadición (e.g., cicloadiciones 1,3-bipolares, cicloadición Huisgen de azida-alquino, etc.).
En otro aspecto se encuentran métodos para la síntesis química de moléculas sustituidas por hidracina para la derivatización de derivados de dolastatina sustituidos por carbonilo. En una modalidad, la molécula sustituida por hidracina puede enlazar derivados de dolastatina. En una modalidad se encuentran métodos para la preparación de moléculas sustituidas por hidracina adecuadas para la derivatización de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo, incluyendo, solamente a modo de ejemplo, polipéptidos de aminoácido no natural que contiene cetona o aldehido. En una modalidad agregada o adicional, los aminoácidos no naturales se incorporan específicamente en el sitio durante la traducción in vivo de proteínas. En una modalidad agregada o adicional, los derivados de dolastatina sustituidos por hidracina permiten la derivatización específica del sitio de aminoácidos no naturales que contienen carbonilo a través del ataque nucleofílico de cada grupo carbonilo para formar un polipéptido derivatizado por heterociclo, incluyendo un polipéptido derivatizado por heterociclo que contiene nitrógeno de manera específica del sitio. En una modalidad agregada o adicional, el método para la preparación de derivados de dolastatina sustituidos por hidracina proporciona acceso a una amplia variedad de polipéptidos derivatizados específicamente en el sitio. En una modalidad agregada o adicional se encuentran métodos para sintetizar derivados de dolastatina enlazados a polietileno glicol (PEG) funcionalizados por hidracina.
Tales aminoácidos incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII-A) o (XXXVII-B): -en donde : A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador enlazado en un extremo a un residuo que contiene diamina, seleccionado el enlazador del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, O- (alquileno o alquileno sustituido)-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)R"-, -C(O)R"-, S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde k es 1, 2, o 3, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, NR"- (alquileno o alquileno sustituido)-, CON(R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, CSN (R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, y N(R")C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde cada R" es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; - en donde : R8 y Rg se seleccionan independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, o un grupo de protección amina; Ti es un enlace, alquileno Ci-C4 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C4 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo opcionalmente sustituido; T2 es alquileno Ci-C4 opcionalmente sustituido, alquenileno Ci-C4 opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, o heteroarilo opcionalmente sustituido; en donde cada sustituyente opcional se selecciona independientemente de alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, cicloalquilo inferior, cicloalquilo inferior sustituido, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido, alquinilo, heteroalquilo inferior, heteroalquilo sustituido, heterocicloalquilo inferior, heterocicloalquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, o aralquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; R. es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende al menos un grupo diamina, un grupo diamina protegido o un grupo diamina enmascarado; o los grupos -B-K-R forman juntos un cicloalquilo o cicloarilo o heterocicloalquilo bicíclicos o tricíclicos que comprenden al menos un grupo diamina, un grupo diamina protegido o un grupo diamina enmascarado; o los grupos -K-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende al menos un grupo diamina, un grupo diamina protegido o un grupo diamina enmascarado; en donde al menos un grupo amino en -A-B-K-R es opcionalmente una amina protegida.
En un aspecto se encuentran compuestos que comprenden las estructuras 1 o 2: en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador enlazado en un extremo a un residuo que contiene diamina, seleccionado el enlazador del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, O- (alquileno o alquileno sustituido)-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)R"-,-S(0)k(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde k es 1, 2, o 3, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, NR"- (alquileno o alquileno sustituido)-, CON(R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, CSN (R")-(alquileno o alquileno sustituido)-, y N (R")C0-(alquileno o alquileno sustituido)-, en donde cada R" es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Ti es un enlace o CH2; y T es CH; en donde cada sustituyente opcional se selecciona independientemente de alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, cicloalquilo inferior, cicloalquilo inferior sustituido, alquenilo inferior, alquenilo inferior sustituido, alquinilo, heteroalquilo inferior, heteroalquilo sustituido, heterocicloalquilo inferior, heterocicloalquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, o aralquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido, o un polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los residuos que contienen -A-B-diamina forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico que comprende al menos un grupo diamina, un grupo diamina protegido o un grupo diamina enmascarado; o los grupos de residuos que contienen -B-diamina forman juntos un cicloalquilo o cicloarilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende al menos un grupo diamina, un grupo diamina protegido o un grupo diamina enmascarado; en donde al menos un grupo amino en un residuo que contiene -A-B-diamina es opcionalmente una amina protegida; o un metabolito activo, sal, o un profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los siguientes ejemplos no limitantes de aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII) están incluidos: .
Tales aminoácidos no naturales también pueden estar en la forma de una sal o pueden incorporarse en un aminoácido no natural, un polipéptido, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y/o modificarse opcionalmente de manera post traduccional.
En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (XXXVII) son estables en solución acuosa por al menos 1 mes bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (XXXVII) son estables por al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (XXXVII) son estables por al menos 5 días bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, tales condiciones acídicas son un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 8.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), B es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, O- (alquileno o alquileno sustituido)-, C(R')=NN(R')-, -N(R')C0-, C(O)-, -C(R')=N-, C(0)-(alquileno o alquileno sustituido)-, CON (R')(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(alquileno o alquileno sustituido)-, S(0)(alquileno o alquileno sustituido)-, o -S(0)2(alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), B es -0(CH2)-, -CH=N-, CH=NNH-, -NHCH2-, -NHCO-, C(O)-, C(0)(CH2)-, C0NH(CH2)-, - SCH2-, -S(=0)CH2-, o -S(O)2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R es alquilo o cicloalquilo Ci-6. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII) R es -CH3, -CH(CH3)2, o ciclopropilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), Ri es H, ter-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) N acetilo tetrafluoroacetilo (TFA), o benciloxicarbonilo (Cbz). En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), Ri es una resina, aminoácido, polipéptido, o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), Ri es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o anticuerpo monoclonal. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es OH, O-metilo, 0-etilo, u 0-t-butilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es una resina, al menos un aminoácido, polipéptido, o polinucleótido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXVII), R2 es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o anticuerpo monoclonal.
Los siguientes ejemplos no limitantes de aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII) también están incluidos: Ejemplos no limitantes de aminoácidos protegidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXVII) incluyen: .
[ F . Estructura y Síntesis de Aminoácidos no Naturales: Aminas Aromáticas Los aminoácidos no naturales con grupos reactivos nucleofílicos, tales como, solamente a modo de ejemplo, un aromático (incluyendo grupos amina secundaria y un grupo amina aromático enmascarado (que puede fácilmente en un grupo amina aromático) o un grupo amina aromática protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo amina aromática a su desprotección) permiten una variedad de reacciones para enlazar moléculas a través de diversas reacciones incluyendo, pero sin limitarse a, reacciones de alquilación reductiva con derivados del enlazador de dolastatina que contienen aldehido. Tales aminoácidos no naturales que contienen amina aromática incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXXV): I en donde: se selecciona del grupo que consiste de un anillo de arilo monocíclico, un anillo de arilo bicíclico, un anillo de arilo multicíclico, un anillo de heteroarilo monocíclico, un anillo de heteroarilo bicíclico, y un anillo de heteroarilo multicíclico; A es independientemente CRa, o N; B es independientemente CRa, N, O, o S; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, -N02, -CN, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR', y -S(O)kR', en donde k es 1, 2, o 3; y n es O, 1, 2, 3, 4, 5, o 6; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; M es H o -CH2R5; O el residuo M-N-C(R5) puede formar una estructura de anillo de 4 a 7 miembros; R5 es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, C(O)R", C(0)0R", C(0)N(R")2, C(0)NHCH(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-N(R")2, -(alquenileno o alquenileno sustituido)- N(R")2, (alquileno o alquileno sustituido) (arilo o arilo sustituido), (alquenileno o alquenileno sustituido) (arilo o arilo sustituido), -(alquileno o alquileno sustituido)- ON(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", (alquileno o alquileno sustituido)-S-S-(arilo o arilo sustituido), en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, o -C(O)0R'; o dos grupos R5 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o R5 y cualquier Ra forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; y cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido.
Tales aminoácidos no naturales también pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente alquilarse reductiamente .
La estructura (como se presenta en todos los ejemplos en la presente) no presenta las orientaciones relativas de "A," "B," "NH-M" y "Ra"; más bien estas cuatro características de esta estructura pueden orientarse de cualquier manera químicamente adecuada (junto con otras características de esta estructura), como se ilustra por ejemplo en la presente.
Los aminoácidos no naturales que contienen un residuo de amina aromático que tiene la estructura de la Fórmula (A) incluyen aminoácidos no naturales que tienen las estructuras: ' A' donde, cada A' se selecciona independientemente M M I I c—NH c— NH de CRa, N, o , y hasta dos A' pueden ser seleccionado el A' restante de CRa/ o N.
Tales aminoácidos no naturales también pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente alquilarse reduct ivamente .
Ejemplos no limitantes de aminoácidos no naturales que contienen un residuo de amina aromático que tiene la estructura de la Fórmula (XXXXXXV) incluyen aminoácidos no naturales que tienen la estructura de la Fórmula (XXXXXXVI), y la Fórmula (XXXXXXVII), 0 (XXXXXXVI) O (XXXXXXVII) en donde; G es un grupo de protección amina, que incluye, pero no se limita a, Tales aminoácidos no naturales pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente alquilarse reductivamente.
Los aminoácidos no naturales que contienen un residuo de amina aromático tienen las siguientes estructuras: y en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, -N02, -CN, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2, -OR', y -S(O)kR', en donde k es 1, 2, o 3; M es H o -CH2R5; o el residuo M-N-C(R5) puede formar una estructura de anillo de 4 a 7 miembros; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, un aminoácido, un polipéptido o un polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, un aminoácido, un polipéptido o un polinucleótido; R5 es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, C(0)R", C(0)0R", C (0)N(")2, C (O)NHCH(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-N(R")2, -(alquenileno o alquenileno sustituido)- N (R")2, (alquileno o alquileno sustituido) (arilo o sustituido arilo), (alquenileno o alquenileno sustituido) (arilo o sustituido arilo), -(alquileno o alquileno sustituido)-0N(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", -(alquileno o alquileno sustituido)-S-S-(arilo o sustituido arilo), en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, o -C(O)0R'; o R5 y cualquier Ra forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; y cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Tales aminoácidos no naturales también pueden estar en la forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido, o un polinucleótido.
Tales aminoácidos no naturales de la Fórmula (XXXXXXV) pueden formarse mediante la reducción de residuos amina protegidos o enmascarados en el residuo aromático de un aminoácido no natural. Tales residuos amina protegidos o enmascarados incluyen pero no se limitan a, iminas, hidracinas, nitro, o sustituyentes azida. Los agentes de reducción utilizados para reducir tales residuos de amina protegidos o enmascarados incluyen, pero no se limitan a.
TCEP , Na2S, Na2S204 , LiA1H4 , NaBH4 o NaBCNH3 .
V. Derivados de Dolastatina Enlazados a Aminoácido no Natural En otro aspecto se describen en la presente metodos, estrategias y téenicas para incorporar al menos uno de tales derivados del enlazador de dolastatina en un aminoácido no natural. También se incluyen en este aspecto métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar tales derivados del enlazador de dolastatina que contienen al menos uno de tales aminoácidos no naturales. También se incluyen en este aspecto composiciones y métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar oligonucleótidos (incluyendo ADN y ARN) que pueden utilizarse para producir, al menos en parte, un derivado del enlazador de dolastatina que contiene al menos un aminoácido no natural. También se incluyen en este aspecto composiciones y métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar células que pueden expresar tales oligonucleótidos que pueden utilizarse para producir, al menos en parte, un derivado del enlazador de dolastatina que contiene al menos un aminoácido no natural.
Por tanto, los derivados del enlazador de dolastatina que comprenden al menos un aminoácido no natural o un aminoácido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, alquino, cicloalquino, azida, oxima o hidroxilamina se proporcionan y se describen en la presente. En ciertas modalidades, los derivados del enlazador de dolastatina con al menos un aminoácido no natural o un aminoácido no natural modificado con un grupo carbonilo, dicarbonilo, alquino, cicloalquino, azida, oxima o hidroxilamina incluyen al menos una modificación post-traduccional en alguna posición en el polipéptido. En algunas modalidades la modificación co-traduccional o post-traduccional se presenta a través de la maquinaria celular (e.g., glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación del enlace de glicolípidos, y lo similar), en muchos casos, de tal manera que se presentan tales modificaciones co-traduccionales o post-traduccionales en base a la maquinaria celular en los sitios de aminoácido de origen natural sobre el polipéptido, sin embargo, en ciertas modalidades, las modificaciones co-traduccionales o post-traduccionales en base a la maquinaria celular se presentan sobre el(los) sitio(s) de aminoácido no natural en el polipéptido.
En otras modalidades, la modificación post-traduccional no utiliza la maquinaria celular, pero la funcionalidad se proporciona en su lugar por la unión de una molécula (un polímero, un polímero soluble en agua; un derivado de polietileno glicol: una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido: un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinación de los mismos) que comprende un segundo grupo reactivo para el al menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo (incluyendo, pero sin limitarse a, un aminoácido no natural que contiene un grupo funcional cetona, aldehido, acetal, hemiacetal, alquino, cicloalquino, azida, oxima, o hidroxilamina) utilizando la metodología química descrita en la presente, u otras adecuadas para los grupos reactivos particulares. En ciertas modalidades, la modificación co-traduccional o post-traduceional se realiza in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica. En ciertas modalidades, la modificación post-traduccional se realiza in vitro sin utilizar la maquinaria celular. También se incluyen en este aspecto métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar tales derivados del enlazador de dolastatina que contienen al menos uno de tales aminoácidos no naturales modificados de manera co-traduccional o post-traduccional.
También se incluyen dentro del alcance de los métodos, composiciones, estrategias y téenicas descritos en la presente, reactivos con la capacidad de reaccionar con un derivado del enlazador de dolastatina (que contiene un grupo carbonilo o dicarbonilo, un grupo oxima, alquino, cicloalquino, azida, un grupo hidroxilamina, o sus formas enmascaradas o protegidas) que es parte de un polipéptido a fin de producir cualquiera de las modificaciones post-traduccionales antes mencionadas. En ciertas modalidades, el derivado del enlazador de dolastatina modificado de manera post-traduccional resultante contendrá al menos un grupo oxima; el derivado del enlazador de dolastatina que contiene oxima modificado resultante puede experimentar subsecuentes reacciones de modificación. También se incluyen en este aspecto métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar tales reactivos con la capacidad de cualquiera de tales modificaciones post-traduccionales de tal(es) derivado(s) del enlazador de dolastatina.
En ciertas modalidades, el polipéptido o derivado de dolastatina enlazado a un aminoácido no natural incluye al menos una modificación co-traduccional o post-traduccional que se realiza in vivo por una célula huésped, en donde la modificación post-traduccional no se realiza normalmente por otro tipo de célula huésped. En ciertas modalidades, el polipéptido incluye al menos una modificación co-traduccional o post-traduccional que se realiza in vivo por medio de una célula eucariótica, en donde la modificación co-traduccional o post-traduccional no se realiza normalmente por una célula no eucariótica. Ejemplos de tales modificaciones co-traduccionales o post-traduccionales incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación del enlace de glicolípidos y lo similar. En una modalidad, la modificación co-traduccional o post-traduccional comprende la unión de un oligosacárido a una asparagina por medio de un enlace GlcNAc-asparagina (incluyendo pero sin limitarse a, cuando el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc, y lo similar). En otra modalidad, la modificación co-traduccional o post-traduccional comprende la unión de un oligosacárido (incluyendo pero sin limitarse a Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina por medio de un enlace GalNAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina o GlcNAc-treonina. En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido puede comprender una secuencia de secreción o localización, una etiqueta de epítopo, una etiqueta FLAG, una etiqueta de polihistidina, una fusión GST y/o lo similar. También se incluyen en este aspecto métodos para producir, purificar, caracterizar y utilizar tales polipéptidos que contienen al menos una de tales modificaciones co-traduccionales o post-traduccionales. En otras modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural glicosilado se produce en una forma no glicosilada. Tal forma no glicosilada de un aminoácido no natural glicosilado puede producirse mediante métodos que incluyen el retiro químico o enzimático de los grupos de oligosacárido de un polipéptido de aminoácido no natural glicosilado aislado o sustancialmente purificado o no purificado; la producción del aminoácido no natural en un huésped que no glicosila tal polipéptido de aminoácido no natural (incluyendo tal huésped procariotas o eucariotas fabricadas o mutadas para no glicosilar tal polipéptido), la introducción de un inhibidor de glicosilación en el medio de cultivo celular en el cual se produce tal polipéptido de aminoácido no natural por medio de una eucariota que normalmente glicosilaría tal polipéptido, o una combinación de cualquiera de tales métodos. También se describen en la presente tales formas no glicosiladas de polipéptidos de aminoácido no natural normalmente glicosilados (por normalmente glicosilados se entiende un polipéptido que se glicosilaría cuando se produce bajo condiciones en las cuales se glicosilan los polipéptidos de origen natural). Por supuesto, tales formas no glicosiladas de polipéptidos de aminoácido no natural normalmente glicosilados (o de hecho cualquier polipéptido descrito en la presente) pueden estar en una forma no purificada, una forma sustancialmente purificada o en una forma aislada.
En ciertas modalidades, el polipéptido de aminoácido no natural incluye al menos una modificación post-traduccional que se realiza en presencia de un acelerador, en donde la modificación post-traduccional es estequiométrica, tipo estequiométrica o casi-estequiométrica. En otras modalidades el polipéptido se pone en contacto con un reactivo de la Fórmula (XIX) en presencia de un acelerador. En otras modalidades el acelerador se selecciona del grupo que consiste de: A. Síntesis Química de Derivados de Dolastatina Enlazados a Aminoácido no Natural: Derivados de Dolastatina Enlazados que Contienen Oxima Los derivados del enlazador de dolastatina de aminoácido no natural que contienen un grupo oxima permiten la reacción con una variedad de reactivos que contienen ciertos grupos carbonilo o dicarbonilo reactivos (incluyendo pero sin limitarse a, cetonas, aldehidos u otros grupos con reactividad similar) para formar nuevos aminoácidos no naturales que comprenden un nuevo grupo oxima. Tal reacción de intercambio de oxima permite la funcionalización adicional de derivados del enlazador de dolastatina. Además, el derivado del enlazador de dolastatina original que contiene un grupo oxima puede ser útil por sí mismo siempre que el enlace oxima sea estable bajo las condiciones necesarias para incorporar el aminoácido en el polipéptido (e.g., los métodos sintéticos in vivo, in vitro y químicos descritos en la presente) Por tanto, en ciertas modalidades descritas en la presente se encuentran derivados del enlazador de dolastatina de aminoácidos no naturales con cadenas laterales que comprenden un grupo oxima, un grupo tipo oxima (que tiene una reactividad similar a un grupo oxima y es estructuralmente similar a un grupo oxima), un grupo oxima enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo oxima) o un grupo oxima protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo oxima a su desprotección).
Tales derivados del enlazador de dolastatina de aminoácido no natural incluyen derivados del enlazador de dolastatina que tienen la estructura de la Fórmula (VIII) o | en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)N(R')-, CON (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N (R' ) C (0) 0- , S(0)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R3 y R4 son cada uno independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; Z tiene la estructura de: R5 es H, COR8, alquilo Ci-C6, o tiazol; R8 es OH R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de -alquileno-, -alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n (CH2)n'-NHC(O)-(CH2)n''-C(Me)2-S-S-(CH2)n'''-NHC(O)-(alquileno-O)n''''-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno- C( O)-W-, - (alquileno-O)-alquileno-U-alquileno-C(O)-, y (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; tiene la estructura de: : I cada n, n' , n' n' n' son independientemente enteros mayores que o igual a uno; o un metabolito activo, o un profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R5 es tiazol. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R6 es H. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), Ar es fenilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R7 es metilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), n es un entero de 0 a 20. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), n es un entero de 0 a 10. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), n es un entero de 0 a 5.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R5 es tiazol. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R5 es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde el alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de la Fórmula (VIII) y (IX), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno, o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, O 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R6 es H.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo, iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), cada L es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), cada L es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), cada alquileno, alquileno', alquileno'', y alquileno''' es independientemente -CH2 CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2- CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno, o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) y (IX), cada n, n', h'', n''', y n'''' es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 0100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) 0 (IX), Ri es un polipéptido. En ciertas modalideides de los compuestos de la Fórmula (VIII) 0 (IX), R2 es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) o (IX), el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (VIII) o (IX), el anticuerpo es herceptin.
Tales derivados de enlazador de dolastatina de aminoácido no natural incluyen derivados de enlazador de dolastatina que tienen la estructura de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII): — en donde: A es opcional, y cuando se encuentra presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno, o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, C(O)-, C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, C(0)N(R')-, CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, CSN (R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, N(R')C(0)0-, S(0)kN(R')-, N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N (R')-, N(R')S(O)kN(R') N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- (R')-, C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, y C(R')2 N(R') N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R3 y R4 son cada uno independientemente H, halógeno, alquilo inferior, o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; Z tiene la estructura de: R5 es H, COR8/ alquilo Cy-C , o tiazol; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; Li, L2, L3 y L4 son cada uno enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste de un enlace, -alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-, alquileno'-J-(alquileno-O)n-alquileno-, -J-(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-(alquileno-O)n--alquileno-J'-, -(alquileno-O)n-alquileno-J-alquileno'-, - -, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, J- (alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J-alquileno-NMe-alquileno'- NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: cada J y J' tienen independientemente la estructura de : , cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales una uno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R5 es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R6 es H. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), Ar es fenilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R7 es metilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), n y n' son enteros de 0 a 20. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), n y n' son enteros de 0 a 10. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), n y n' son enteros de 0 a 5.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R5 es tiazol. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R5 es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde el alquileno es -CH2-, - CH2CH2-, -CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno, o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R6 es H. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R6 es hidroxi.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada ¾, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada Llf L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada alquileno, alquileno', alquileno'', y alquileno''' es independientemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno, o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), cada n y n' es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), Ri es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), R2 es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII), el anticuerpo es herceptin. [00352] En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII) son estables en solución acuosa durante al menos 1 mes bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII) son estables durante al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, los compuestos de la Fórmula (X), (XI), (XII) o (XIII) son estables durante al menos 5 días bajo condiciones ligeramente acídicas. En ciertas modalidades, tales condiciones acídicas son un pH de 2 a 8. Tales aminoácidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, un polímero, un polisacárido o un polinucleótido modificado de manera post traduccional.
Los aminoácidos no naturales a base de oxima pueden sintetizarse mediante métodos ya descritos en la téenica o mediante métodos descritos en la presente incluyendo: (a) reacción de un aminoácido no natural que contiene hidroxilamina con un reactivo que contiene carbonilo o dicarbonilo; (b) reacción de un aminoácido no natural que contiene carbonilo o dicarbonilo con un reactivo que contiene hidroxilamina; o (c) reacción de un aminoácido no natural que contiene oxima con ciertos reactivos que contienen carbonilo o dicarbonilo.
B. Estructura y Síntesis Química de Derivados de Dolastatina Enlazados a Aminoácido no Natural: Derivados de Dolastatina Enlazados de Amina Aromática Alquilada En un aspecto se encuentran derivados del enlazador de dolastatina para la derivatización química de aminoácidos no naturales en base a la reactividad de un grupo amina aromática. En modalidades agregadas o adicionales, al menos uno de los aminoácidos no naturales antes mencionados se incorpora en un derivado del enlazador de dolastatina, es decir, tales modalidades son derivados de dolastatina enlazados a aminoácido no natural. En modalidades agregadas o adicionales, los derivados del enlazador de dolastatina se funcionalizan en sus cadenas laterales de manera que su reacción con un aminoácido no natural de derivatización genera un enlace amina. En modalidades agregadas o adicionales, los derivados del enlazador de dolastatina se seleccionan de derivados del enlazador de dolastatina que tienen cadenas laterales de amina aromática. En modalidades agregadas o adicionales, los derivados del enlazador de dolastatina comprenden una cadena lateral enmascarada, incluyendo un grupo de amina aromática enmascarada. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales se seleccionan de aminoácidos que tienen cadenas laterales de amina aromática. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden una cadena lateral enmascarada, que incluye un grupo de amina aromática enmascarada.
En otro aspecto se encuentran derivados del enlazador de dolastatina sustituidos por carbonilo tales como, a modo de ejemplo, aldehidos, y cetonas para la producción de polipéptidos de aminoácido no natural derivatizados en base a un enlace amina. En una modalidad adicional se encuentran derivados del enlazador de dolastatina sustituidos por aldehido utilizados para derivatizar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen amina aromática a través de la formación de un enlace amina entre el enlazador de dolastatina de derivatización y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene amina aromática.
En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden cadenas laterales de amina aromática en donde la amina aromática se selecciona de una aril amina o una heteroaril amina. En una modalidad agregada o adicional, los aminoácidos no naturales se asemejan a un aminoácido natural en estructura pero contienen grupos de amina aromática. En una modalidad diferente o adicional los aminoácidos no naturales se asemejan a fenilalanina o tirosina (aminoácidos aromáticos). En una modalidad, los aminoácidos no naturales tienen propiedades distintas a las de los aminoácidos naturales. En una modalidad, tales propiedades distintas son la reactividad química de la cadena lateral; en una modalidad adicional esta reactividad química distinta permite que la cadena lateral del aminoácido no natural experimente una reacción mientras es una unidad de un polipéptido aunque las cadenas laterales de las unidades de aminoácido de origen natural en el mismo polipéptido no experimentan la reacción antes mencionada. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a la de los aminoácidos de origen natural. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende un residuo que contiene nucleófilo; en una modalidad adicional, el residuo que contiene nucleófilo en la cadena lateral del aminoácido no natural puede experimentar una reacción para generar una dolastatina derivatizada enlazada a amina. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende un residuo que contiene electrófilo; en una modalidad adicional, el residuo que contiene electrófilo en la cadena lateral del aminoácido no natural puede experimentar un ataque nucleofílico para generar una dolastatina derivatizada enlazada a amina. En cualquiera de las modalidades antes mencionadas en este párrafo, el aminoácido no natural puede existir como una molécula separada o puede incorporarse en un polipéptido de cualquier longitud; si es esto último, entonces el polipéptido puede incorporar además aminoácidos de origen natural o no naturales.
La modificación de los aminoácidos no naturales descritos en la presente utilizando reacciones de alquilación reductiva o de aminación reductiva tiene cualquiera o todas las siguientes ventajas. Primero, las aminas aromáticas pueden alquilarse reductivamente con compuestos que contienen carbonilo, incluyendo aldehidos, y cetonas, en un rango de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 (y en ciertas modalidades en un rango de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 7) para generar enlaces de amina sustituida, incluyendo amina secundaria y terciaria. Segundo, bajo estas condiciones de reacción la química es selectiva para los aminoácidos no naturales debido a que las cadenas laterales de los aminoácidos de origen natural son no reactivas. Esto permite la derivatización específica en el sitio de polipéptidos que tienen incorporados aminoácidos no naturales que contienen residuos de amina aromática o residuos de aldehido protegido, incluyendo, a modo de ejemplo, proteínas recombinantes. Tales polipéptidos y proteínas derivatizados pueden prepararse por tanto como productos homogéneos definidos. Tercero, las condiciones suaves necesarias para efectuar la reacción de un residuo de amina aromática en un aminoácido, que se ha incorporado en un polipéptido, con un reactivo que contiene aldehido generalmente no destruyen irreversiblemente la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, cuando el propósito de la reacción es destruir tal estructura terciaria). De manera similar, las condiciones suaves necesarias para efectuar la reacción de un residuo de aldehido en un aminoácido que se ha incorporado en un polipéptido y se ha desprotegido, con un reactivo que contiene amina aromática generalmente no destruyen irreversiblemente la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, cuando el propósito de la reacción es destruir tal estructura terciaria). Cuarto, la reacción se presenta rápidamente a temperatura ambiente, lo cual permite el uso de muchos tipos de polipéptidos o reactivos que de otra manera serían inestables a temperaturas más altas. Quinto, la reacción se presenta rápidamente en condiciones acuosas, de nuevo permitiendo el uso de polipéptidos y reactivos incompatibles (en cualquier medida) con soluciones no acuosas. Sexto, la reacción se presenta rápidamente incluso cuando la proporción de polipéptido o aminoácido a reactivo es estequiométrica, tipo estequiométrica o casi estequiométrica; de manera que es innecesario agregar un exceso del reactivo o el polipéptido para obtener una cantidad útil del producto de reacción. Séptimo, la amina resultante puede producirse de manera regio-selectiva y/o regio-específica, dependiendo del diseño de la amina y de las porciones amina y carbonilo de los reactivos. Finalmente, la alquilación reductiva de las aminas aromáticas con reactivos que contienen aldehido y la aminación reductiva de aldehidos con reactivos que contienen amina aromática, generan enlaces de amina incluyendo de amina secundaria y terciaria que son estables bajo condiciones biológicas.
Los aminoácidos no naturales con grupos reactivos nucleofilicos, tales como, solamente a modo de ejemplo, un grupo de amina aromática (incluyendo grupos de amina secundaria y terciaria), un grupo de amina aromática enmascarada (que puede convertirse fácilmente en un grupo de amina aromática) o un grupo de amina aromática protegida (que tiene una reactividad similar a un grupo de amina aromática a su desprotección) permiten una variedad de reacciones para enlazar moléculas a través de varias reacciones, incluyendo pero sin limitarse a, reacciones de alquilación reductiva con derivados del enlace de dolastatina enlazados que contienen aldehido. Tales derivados de dolastatina enlazados a un aminoácido no natural alquilado incluyen los aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX) o (XXX): - .
I I - — en donde : Z tiene la estructura de Rs es H, CO2H, alquilo Ci-C6, o tiazol; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección áster, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido,- R4 es H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; L, Li, L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un enlace, alquileno-, -alquileno-C(0)-, -(alquileno-O)n-alquileno-, (alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n-(CH2)n--NHC(O)- (CH2)n"~C(Me)2—S—S—(CH2)n-·--NHC(O)-(alquileno-O)n- alquileno- , - (alquileno-O) -alquileno-W- , -alquileno-C (0) -W- , (alquileno-O) n-alquileno-J- , -alquileno' -J- (alquileno-O) n-alquileno-, - (alquileno-O) n-alquileno- J-alquileno' , -J- (alquileno-O) n-alquileno- , - (alquileno-O) n-alquileno-J- (alquileno-O) n,-alquileno-J' - , -W- , -alquileno- - , alquileno' - J- (alquileno-NMe)n-alquileno-W-, y J- (alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(0)-, (alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe-alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de: cada J y J' tienen independientemente la estructura cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno; y cada Ris se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alquilo, N02, CN, y alquilo sustituido.
Tales derivados de dolastatina enlazados a aminoácido no natural alquilado tambien pueden encontrarse en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipéptido de aminoácido no natural, polímero, polisacárido, o un polinucleótido y opcionalmente _alquilarse de manera reductiva.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), Rs es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R.6 es H. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), Ar es fenilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R7 es metilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (xxvi), (xxvil), (xxvm ), (XXIX), o (XXX), n es un entero de 0 a 20. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), n es un entero de 0 a 10. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX) o (XXIV), n es un entero de 0 a 5.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R5 es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R5 es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula ((XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R5 es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde el alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno, o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), Rs es -NH-(alquileno-O)n-NH2, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R6 es H. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R6 es hidroxi.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), cada L, Li, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), cada L, Li, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), cada alquileno, alquileno' , alquileno' ' , y alquileno' ' ' es independientemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH; -CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XIX) , (XX) , (XXI) , (XXII) , (XXIII) o (XXIV) , alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno, o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV) , (XXVI) , (XXVII) , (XXVIII) , (XXIX) , o (XXX) , cada n, h', n' ' , n' ' ' , y n' ' ' ' es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV) , (XXVI) , (XXVII) , (XXVIII) , (XXIX) , o (XXX) , ¾ es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), R2 es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX), el anticuerpo es herceptin.
Los compuestos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX) pueden formarse por medio de la alquilación reductiva de compuestos de amina aromática con reactivos que contienen carbonilo tales como, a modo de ejemplo, cetonas, ásteres, tioésteres y aldehidos.
En algunas modalidades, los residuos de amina enmascarada de los aminoácidos no naturales contenidos en los polipéptidos se reducen inicialmente para proporcionar aminoácidos no naturales que contienen residuos de amina aromática incorporados en los polipéptidos de aminoácido no natural. Tales residuos de amina aromática se alquilan después de manera reductiva con los reactivos que contienen carbonilo descritos anteriormente para proporcionar polipéptidos que contienen los aminoácidos no naturales de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX). Tales reacciones también pueden aplicarse a aminoácidos no naturales incorporados en polímeros sintéticos, polisacáridos o polinucleótidos. Adicionalmente, tales reacciones pueden aplicarse a aminoácidos no naturales no incorporados. A modo de ejemplo, el agente de reducción utilizado para reducir residuos de amina enmascarada incluye, pero no se limita a, TCEP, Na2S, Na2S204, LiA1H4, B2H6, y NaBH4. Solamente a modo de ejemplo, la alquilación reductiva puede presentarse en amortiguadores acuosos con un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 y utilizando un agente suave de reducción, tal como, solamente a modo de ejemplo, cianoborohidruro de sodio (NaBCNH3). Adicionalmente, pueden utilizarse otros agentes de reducción para la alquilación reductiva incluyendo, pero sin limitarse a, TCEP, Na2S, Na2S204, LiAlH4, B2H6, y NaBH4.
Se describió anteriormente una síntesis ejemplar no limitante de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen los aminoácidos de la Fórmula (XXV), (XXVI), (XXVII), (XXVIII), (XXIX), o (XXX) mediante alquilación reductiva de residuos de amina aromática secundaria contenidos en aminoácidos no naturales con reactivos que contienen carbonilo. Tal alquilación reductiva proporciona polipéptidos que contienen aminoácidos no naturales con residuos de amina aromática terciaria. Tales reacciones también pueden aplicarse a aminoácidos no naturales incorporados en polímeros sintéticos, polisacáridos o polinucleótidos. Adicionalmente tales reacciones pueden aplicarse a aminoácidos no naturales no incorporados. Solamente a modo de ejemplo, la alquilación reductiva puede presentarse en amortiguadores acuosos con un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 y utilizando un agente suave de reducción, tal como, solamente a modo de ejemplo, cianoborohidruro de sodio (NaBCNH3). Adicionalmente, pueden utilizarse otros agentes de reducción para la alquilación reductiva incluyendo, pero sin limitarse a, TCEP, Na2S, Na2S204, LÍA1H4, B2Hg, y NaBH4.
C. Síntesis Química de Derivados de Dolastatina Enlazados a Aminoácido no Natural: Derivados de Dolastatina Enlazados que Contienen Heteroarilo En un aspecto se encuentran aminoácidos no naturales para la derivatización química de derivados del enlazador de dolastatina en base a la reactividad de un grupo dicarbonilo, incluyendo un grupo que contiene al menos un grupo cetona, y/o al menos un grupo aldehido y/o al menos un grupo éster y/o al menos un ácido carboxílico y/o al menos un grupo tioéster y en donde el grupo dicarbonilo puede ser un grupo 1,2-dicarbonilo, un grupo 1,3-dicarbonilo o un grupo 1,4-dicarbonilo. En aspectos agregados o adicionales se encuentran aminoácidos no naturales para la derivatización química de derivados del enlazador de dolastatina en base a la reactividad de un grupo diamina incluyendo un grupo hidracina, un grupo amidina, un grupo imina, un grupo 1,1-diamina, un grupo 1,2-diamina, un grupo 1,3-diamina y un grupo 1,4-diamina. En modalidades agregadas o adicionales, al menos uno de los aminoácidos no naturales antes mencionados se incorpora en un derivado del enlazador de dolastatina, es decir, tales modalidades son derivados de dolastatina enlazados a aminoácido no natural. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales se funcionalizan en sus cadenas laterales de manera que su reacción con una molécula de derivatización genera un enlace, incluyendo un enlace a base de heterocíclico, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno y/o un enlace a base de aldol. En modalidades agregadas o adicionales se encuentran polipéptidos de aminoácido no natural que pueden reaccionar con un enlazador de dolastatina de derivatización para generar derivados de dolastatina enlazados a aminoácido no natural que contienen un enlace, incluyendo un enlace a base de heterocíclico, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno, y/o un enlace a base de aldol. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales se seleccionan de aminoácidos que tienen cadenas laterales de dicarbonilo y/o diamina. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden una cadena lateral enmascarada, incluyendo un grupo diamina enmascarado y/o un grupo dicarbonilo enmascarado. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden un grupo seleccionado de: ceto-amina (i.e., un grupo que contiene tanto una cetona como una amina); ceto-alquino (i.e., un grupo que contiene tanto una cetona como un alquino); y uno eno-diona (i.e., un grupo que contiene un grupo dicarbonilo y un alqueno).
En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales comprenden cadenas laterales de dicarbonilo en donde el carbonilo se selecciona de una cetona, un aldehido, un ácido carboxílico o un éster incluyendo un tioéster. En otra modalidad se encuentran aminoácidos no naturales que contienen un grupo funcional que tiene la capacidad de formar un heterociclo, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno, al tratamiento con un agente apropiadamente funcionalizado. En una modalidad agregada o adicional, los aminoácidos no naturales se asemejan a un aminoácido natural en estructura pero contienen uno de los grupos funcionales antes mencionados. En una modalidad diferente o adicional los aminoácidos no naturales se asemejan a fenilalanina o tirosina (aminoácidos aromáticos) mientras en una modalidad separada los aminoácidos no naturales se asemejan a alanina y leucina (aminoácidos hidrófobos). En una modalidad, los aminoácidos no naturales tienen propiedades distintas a las de los aminoácidos naturales. En una modalidad, tales propiedades distintas son la reactividad química de la cadena lateral; en una modalidad adicional esta reactividad química distinta permite que la cadena lateral del aminoácido no natural experimente una reacción mientras es una unidad de un polipéptido aunque las cadenas laterales de las unidades de aminoácido de origen natural en el mismo polipéptido no experimentan la reacción antes mencionada. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a la de los aminoácidos de origen natural. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende un residuo que contiene electrófilo; en una modalidad adicional, el residuo que contiene electrófilo en la cadena lateral del aminoácido no natural puede experimentar un ataque nucleofílico para generar una proteína derivatizada de heterociclo, incluyendo una proteína derivatizada de heterociclo que contiene nitrógeno. En cualquiera de las modalidades antes mencionadas en este párrafo, el aminoácido no natural puede existir como una molécula separada o puede incorporarse en un polipéptido de cualquier longitud; si es esto último, entonces el polipéptido puede incorporar además aminoácidos de origen natural o no naturales.
En otro aspecto se encuentran moléculas sustituidas por diamina, en donde el grupo diamina se selecciona de un grupo hidracina, uno amidina, uno imina, uno 1,1-diamina, uno 1,2-diamina, uno 1,3-diamina y uno 1,4-diamina, para la producción de derivados de dolastatina enlazados a aminoácido no natural derivatizados en base a un enlace heterociclo. incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno. En una modalidad adicional se encuentran derivados de dolastatina sustituidos por diamina utilizados para derivatizar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen dicarbonilo a través de la formación de un enlace heterociclo, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno, entre la molécula de derivatización y el polipéptido de aminoácido no natural que contiene dicarbonilo. En modalidades adicionales los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen dicarbonilo antes mencionados son polipéptidos de aminoácido no natural que contienen dicetona. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo comprenden cadenas laterales en donde el carbonilo se selecciona de una cetona, un aldehido, un ácido carboxílico o un éster, incluyendo un tioéster. En modalidades agregadas o adicionales, las moléculas sustituidas por diamina comprenden un grupo seleccionado de una funcionalidad deseada. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a la de los aminoácidos de origen natural que permite al aminoácido no natural reaccionar selectivamente con las moléculas sustituidas por diamina. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende un residuo que contiene electrófilo que reacciona selectivamente con la molécula que contiene diamina; en una modalidad adicional, el residuo que contiene electrófilo en la cadena lateral del aminoácido no natural puede experimentar un ataque nucleofílico para generar una proteína derivatizada de heterociclo, incluyendo una proteína derivatizada de heterociclo que contiene nitrógeno. En un aspecto adicional relacionado con las modalidades descritas en este párrafo se encuentran polipéptidos de aminoácido no natural modificado que resultan de la reacción de la molécula de derivatización con los polipéptidos de aminoácido no natural. Modalidades adicionales incluyen cualquier modificación adicional de los polipéptidos de aminoácido no natural ya modificados.
En otro aspecto se encuentran moléculas sustituidas por dicarbonilo para la producción de polipéptidos de aminoácido no natural derivatizados en base a un enlace heterociclo, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno. En una modalidad adicional se encuentran moléculas sustituidas por dicarbonilo utilizadas para derivatizar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen diamina a través de la formación de un heterociclo incluyendo un grupo heterociclo que contiene nitrógeno. En una modalidad adicional se encuentran moléculas sustituidas por dicarbonilo que pueden formar tal heterociclo, incluyendo grupos heterociclo que contienen nitrógeno con un polipéptido de aminoácido no natural que contiene diamina en un rango de pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8. En una modalidad adicional se encuentran moléculas sustituidas por dicarbonilo utilizadas para derivatizar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen diamina a través de la formación de un enlace heterociclo, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno, entre la molécula de derivatización y los polipéptidos de aminoácido no natural que contienen diamina. En una modalidad adicional las moléculas sustituidas por dicarbonilo son moléculas sustituidas por dicetona, en otros aspectos moléculas sustituidas por ceto-aldehído, en otros aspectos moléculas sustituidas por ceto-ácido, en otros aspectos moléculas sustituidas por cetoéster, incluyendo moléculas sustituidas por cetotioéster. En modalidades adicionales, las moléculas sustituidas por dicarbonilo comprenden un grupo seleccionado de una funcionalidad deseada. En modalidades agregadas o adicionales, las moléculas sustituidas por aldehido son moléculas de polietileno glicol (PEG) sustituidas por aldehido. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural tiene una química ortogonal a la de los aminoácidos de origen natural que permite que el aminoácido no natural reaccione selectivamente con las moléculas sustituidas por carbonilo. En una modalidad adicional, la cadena lateral del aminoácido no natural comprende un residuo (e.g., un grupo diamina) que reacciona selectivamente con la molécula que contiene dicarbonilo; en una modalidad adicional, el residuo nucleofílico en la cadena lateral del aminoácido no natural puede experimentar un ataque electrofílico para generar una proteína derivatizada por heterocíclico, incluyendo una proteína derivatizada por heterociclo que contiene nitrógeno. En un aspecto adicional relacionado con las modalidades descritas en este párrafo se encuentran los polipéptidos de aminoácido no natural modificados que resultan de la reacción de la molécula de derivatización con los polipéptidos de aminoácido no natural. Las modalidades adicionales incluyen cualquiera de las modificaciones de los polipéptidos de aminoácido no natural ya modificados.
En un aspecto se encuentran métodos para derivatizar proteínas a través de la reacción de reactivos de carbonilo e hidracina para generar una proteína derivatizada por heterociclo, incluyendo una dolastatina derivatizada por heterociclo que contiene nitrógeno. Incluidos dentro de este aspecto se encuentran métodos para la derivatización de derivados del enlazador de dolastatina en base a la condensación de reactivos que contienen carbonilo e hidracina para generar una dolastatina derivatizada por heterociclo, incluyendo una dolastatina derivatizada por heterociclo que contiene nitrógeno. En modalidades adicionales o agregadas se encuentran métodos para derivatizar derivados de dolastatina que contienen cetona o derivados de dolastatina que contienen aldehido con aminoácidos no naturales funcionalizados con hidracina. Aún en aspectos adicionales o agregados, la molécula sustituida por hidracina puede incluir proteínas, otros polímeros o moléculas pequeñas.
En otro aspecto se encuentran métodos para la síntesis química de moléculas sustituidas por hidracina para la derivatización de derivados de dolastatina sustituidos por carbonilo. En una modalidad, la molécula sustituida por hidracina es un derivado del enlazador de dolastatina adecuado para la derivatización de polipéptidos de aminoácido no natural que contienen carbonilo, incluyendo solamente a modo de ejemplo, polipéptidos de aminoácido no natural que contienen cetona o aldehido.
En un aspecto se encuentran aminoácidos no naturales para la derivatización química de análogos de dolastatina en base a un enlace de quinoxalina o fenacina. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales se funcionalizan en sus cadenas laterales de tal manera que su reacción con un enlazador de dolastatina de derivatización genera un enlace de quinoxalina o fenacina. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales se seleccionan de aminoácidos que tienen cadenas laterales de 1,2-dicarbonilo o 1,2-arildiamina. En modalidades agregadas o adicionales, los aminoácidos no naturales se seleccionan de aminoácidos que tienen cadenas laterales de 1,2-dicarbonilo o 1,2-arildiamina protegidas o enmascaradas. Además se incluyen equivalentes para las cadenas laterales de 1,2-dicarbonilo o equivalentes protegidos o enmascarados para cadenas laterales de 1,2-dicarbonilo.
En otro aspecto se encuentran moléculas de derivatización para la producción de polipéptidos de aminoácido no natural derivatizado en base a enlaces de quinoxalina o fenacina. En una modalidad se encuentran derivados de enlazador de dolastatina sustituidos por 1,2-dicarbonilo utilizados para derivatizar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen 1,2-arildiamina para formar enlaces de quinoxalina o fenacina. En otra modalidad se encuentran derivados de enlazador de dolastatina sustituidos por 1,2-arildiamina utilizados para derivatizar polipéptidos de aminoácido no natural que contienen 1,2-dicarbonilo para formar enlaces de quinoxalina o fenacina. En un aspecto adicional relacionado con las modalidades anteriores se encuentran polipéptidos de aminoácido no natural modificados que resultan de la reacción del enlazador de dolastatina de derivatización con los polipéptidos de aminoácido no natural. En una modalidad se encuentran polipéptidos de aminoácido no natural que contienen 1,2-arildiamina derivatizados con un derivado de enlazador de dolastatina sustituido por 1,2-dicarbonilo para formar enlaces de quinoxalina o fenacina. En otra modalidad se encuentran polipéptidos de aminoácido no natural que contienen 1,2-dicarbonilo derivatizados con derivados de enlazador de dolastatina sustituidos por 1,2-arildiamina para formar enlaces de quinoxalina o fenacina.
Se proporcionan en la presente en ciertas modalidades moléculas de derivatización para la producción de compuestos tóxicos que comprenden polipéptidos de aminoácido no natural en base a enlaces de triazol. En algunas modalidades, la reacción entre el primero y segundo grupos reactivos puede proceder a través de una reacción bipolarófila. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo puede ser una azida y el segundo grupo reactivo puede ser un alquino. En modalidades adicionales o alternativas, el primer grupo reactivo puede ser un alquino y el segundo grupo reactivo puede ser una azida. En algunas modalidades, la reacción de cicloadición Huisgen (ver, e.g., Huisgen, en 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY (Química de cicloadición 1,3-bipolar), (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176) proporciona que la incorporación de aminoácidos no naturalmente codificados portadores de cadenas laterales que contienen azida y alquino permita modificar los polipéptidos resultantes con selectividad extremadamente alta. En ciertas modalidades, los grupos funcionales tanto de azida como de alquino son inertes hacia los veinte aminoácidos comunes encontrados en polipéptidos de origen natural. Cuando se ponen en cercana proximidad, sin embargo, la naturaleza de "carga de resorte" de los grupos azida y alquino se revela y éstos reaccionan selectiva y eficientemente a través de la reacción de cicloadición Huisgen [3 2] para generar el triazol correspondiente. Ver, e.g., Chin et al., Science 301:964-7 (2003); Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 125, 3192-3193 (2003); Chin et al., J. Am. Chem. Soc., 124:9026-9027 (2002). La reacción de cicloadición que implica polipéptidos que contienen azida o alquino puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones acuosas por medio de la adición de Cu(II) (e.g., en forma de una cantidad catalítica de CuSO4) en presencia de un agente de reducción para reducir Cu(II) a Cu(I) in situ, en una cantidad catalítica. Ver, e.g., Wang et al., J. Am. Chem. Soc.125, 3192-3193 (2003); Tornoe et al., J. Org. Chem.67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, Angew. Chem. Int. Ed.41:2596-2599 (2002). Los agentes de reducción preferidos incluyen ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2, Co2 y un potencial eléctrico aplicado.
Tales derivados de dolastatina enlazados a heteroarilo de aminoácido no natural incluyen aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV) O (XXXVI): . en donde : Z tiene la estructura de R5 es H , CO2H, alquilo C -C3, o tiazol ; R6 es OH o H; Ar es fenilo o piridina; Ri es H, un grupo de protección amino, una resina, al menos un aminoácido, polipeptido o polinucleótido; R2 es OH, un grupo de protección éster, una resina, al menos un aminoácido, polipéptido o polinucleótido; R4 es H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; R7 es alquilo Ci-C6 o hidrógeno; L, Li, L2, L3, y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un enlace, alquileno-, -alquileno-C(0)-, -alquileno-J-, -(alquileno-O)n-alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-C(O)-, -(alquileno-O)n- J-, - (alquileno-O)n-J-alquileno-, -(alquileno-O)n-(CH2)n.- NHC(O)-(CH2)n.--C(Me)2-S-S-(CH2)n- NHC(O)-(alquileno-O)n.--alquileno-, -(alquileno-O)n-alquileno-W-, -alquileno-C(0)-W-, -(alquileno-0)-alquileno-J-, -alquileno'-J-(alquileno-O)n~ alquileno-, -(alquileno-0)n-alquileno-J-alquileno', -J- (alquileno-0)n-alquileno-, -(alquileno-0)n-alquileno-J- (alquileno-O)'-alquileno-J'-, -W-, -alquileno-W-, alquileno'-J-(alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -J- (alquileno-NMe)n-alquileno-W-, -(alquileno-O)n-alquileno-U-alquileno-C(O)-, (alquileno-0)n-alquileno-U-alquileno-; -J-alquileno-NMe-alquileno'-NMe-alquileno''-W-, y -alquileno-J-alquileno'-NMe- alquileno''-NMe-alquileno'''-W-; W tiene la estructura de cada J y J' tiene independientemente la estructura cada n y n' son independientemente enteros mayores que o iguales a uno; D tiene la estructura de: , ._ - cada RI7 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", (alquileno o alquileno sustituido)-S-S-(arilo o arilo sustituido), C(O)R", C(O)2R", O C(0)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, o aralquilo sustituido; cada Zi es un enlace, CRI7RI7, O, S, NR', CRI7RI7- CRI7RI7, CRI7RI7-0, 0-CRI7RI7, CRI7RI7-S, S-CRI7RI7, CRI7RI7-NR', o NR' - CR17RI7 ; cada R' es H, alquilo o alquilo sustituido; cada Z2 se selecciona del grupo que consiste de un enlace, C(O)-, -C(S)-, alquileno Ci-C3 opcionalmente sustituido, alquenileno C!-C3 opcionalmente sustituido, y heteroalquilo opcionalmente sustituido; cada Z3 se selecciona independientemente del grupo que consiste de un enlace, alquileno C1-C4 opcionalmente sustituido, alquenileno C1-C4 opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido, -O-, -S-, C(O)-, C(S)-, y -N(R')-; cada T3 es un enlace, C(R'')(R'') O, o S; con la salvedad de que cuando T3 es 0, o S, R'' no puede ser halógeno; cada R'' es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; m y p son 0, 1, 2, o 3, siempre que al menos uno de m o p no sea 0; — en donde (a) indica el enlace al grupo B y (b) indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo heterociclo; - :— : en donde (a) indica el enlace al grupo B y (b) indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo heterociclo; M4 es donde (a) indica el enlace al grupo B y (b) indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo heterociclo; cada R19 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo CI-CÉ, alcoxi Ci-C6, éster, éter, tioéter, aminoalquilo, halógeno, alquil éster, aril éster, amida, aril amida, alquil haluro, alquil amina, ácido alquil sulfónico, alquil nitro, tioéster, sulfonil éster, halosulfonilo, nitrilo, alquil nitrilo, y nitro; q es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11; y cada RI6 se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alquilo, NO2, CN, y alquilo sustituido.
En algunas modalidades, el compuesto de la Fórmula (XXXI) incluye los compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (XXI-A): En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R5 es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), Re es H. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), Ar es fenilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R7 es metilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), n es un entero de 0 a 20. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), n es un entero de 0 a 10. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII) , (XXXIV) , (XXXV) , o (XXXVI) , h es un entero de 0 a 5.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV) , (XXXV), o (XXXVI) , R5 es tiazol o ácido carboxílico. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI) , (XXXII) , (XXXIII) , (XXXIV) , (XXXV), o (XXXVI) , R5 es hidrógeno. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI) , (XXXII) , (XXXIII) , (XXXIV) , (XXXV) , o (XXXVI) , R5 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, ter-butilo, pentilo o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI) , (XXXII) , (XXXIII) , (XXXIV) , (XXXV) , o (XXXVI), R5 es -NH- (alquileno-O) P-NH2 , en donde el alquileno es -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2- , - CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- , o -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- . En ciertas modalidades de la Fórmula (XXXI) , (XXXII), (XXXIII), (XXXIV) , (XXXV) , o (XXXVI) , alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (xxxi), (xxxn) , (xxxm) , (xxxiv) , (xxxv) , o (XXXVI) , R5 es -NH- (alquileno-O) n-NH2, en donde n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, O 10 En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R6 es H. En algunas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R6 es hidroxi.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), Ar es fenilo.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R7 es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, butilo, sec-butilo, iso-butilo, ter-butilo, pentilo, o hexilo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R7 es hidrógeno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), cada L, Li, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador divisible o un enlazador no divisible. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), cada L, Li, L2, L3, y L4 es independientemente un enlazador de oligo(etilen glicol) derivatizado.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), cada alquileno, alquileno', alquileno'', y alquileno''' es independientemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, o CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), alquileno es metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexileno o heptileno.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), cada n, n', n'', n''', y n'''' es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100.
En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R1 es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), R2 es un polipéptido. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI), el polipéptido es un anticuerpo. En ciertas modalidades de los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), O (XXXVI), el anticuerpo es o¡CD70.
Los compuestos de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV), o (XXXVI) pueden formarse mediante la alquilación reductiva de compuestos de amina aromática con reactivos que contienen carbonilo tales como, a modo de ejemplo, cetonas, ásteres, tioésteres y aldehidos.
La formación de tales derivados de dolastatina enlazados a heterociclo de aminoácido no natural que tienen la estructura de la Fórmula (XXXI), (XXXII), (XXXIII), (XXXIV), (XXXV) o (XXXVI) incluye, pero no se limita a, (i) reacciones de aminoácidos no naturales que contienen diamina con derivados de enlace de dolastatina que contienen dicarbonilo o reacciones de aminoácidos no naturales que contienen diamina con derivados de enlace de dolastatina que contienen cetoalquino, (ii) reacciones de aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo ya sea con derivados de enlazador de dolastatina que contienen diamina o reacciones de aminoácidos no naturales que contienen dicarbonilo con derivados de enlazador de dolastatina que contienen cetoamina, (iii) reacciones de aminoácidos no naturales que contienen cetoalquino con derivados de enlazador de dolastatina que contienen diamina, o (iv) reacciones de aminoácidos no naturales que contienen cetoamina con derivados del enlazador de dolastatina que contienen dicarbonilo.
La modificación de los derivados de enlazador de dolastatina descritos en la presente con tales reacciones tiene cualquiera o todas las siguientes ventajas. Primero, las diaminas experimentan condensación con compuestos que contienen dicarbonilo en un rango de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, (y en modalidades adicionales en un rango de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10, en otras modalidades en un rango de pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, en otras modalidades en un rango de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 y en modalidades adicionales en un rango de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en otras modalidades un pH de aproximadamente 4 y aún en otra modalidad un pH de aproximadamente 8) para generar enlaces de heterociclo incluyendo enlaces de heterociclo que contiene nitrógeno.
Bajo estas condiciones las cadenas laterales de los aminoácidos de origen natural son no reactivos. Segundo, tal química selectiva hace posible la derivatización específica en el sitio de proteínas recombinantes: las proteínas derivatizadas pueden prepararse ahora como productos homogéneos definidos. Tercero, las condiciones suaves necesarias para efectuar la reacción de las diaminas descritas en la presente con los polipéptidos que contienen dicarbonilo descritos en la presente generalmente no destruyen irreversiblemente la estructura terciaria del polipéptido (exceptuando, por supuesto, cuando el propósito de la reacción es destruir tal estructura terciaria). Cuarto, la reacción se presenta rápidamente a temperatura ambiente, lo cual permite el uso de muchos tipos de polipéptidos o reactivos que serían inestables a temperaturas más altas. Quinto, la reacción se presenta rápidamente en condiciones acuosas, de nuevo permitiendo el uso de polipéptidos y reactivos incompatibles (en cualquier medida) con soluciones no acuosas. Sexto, la reacción se presenta rápidamente incluso cuando la proporción de polipéptido o aminoácido a reactivo es estequiométrica, tipo estequiométrica o casi estequiométrica; de manera que es innecesario agregar un exceso del reactivo o el polipéptido para obtener una cantidad útil del producto de reacción. Séptimo, el heterociclo resultante puede producirse de manera regio-selectiva y/o regio-específica, dependiendo del diseño de la diamina y de las porciones diamina y dicarbonilo de los reactivos. Finalmente, la condensación de las diaminas con moléculas que contienen dicarbonilo genera enlaces heterociclo, incluyendo un heterociclo que contiene nitrógeno, que son estables bajo condiciones biológicas.
VI. Ubicación de aminoácidos no naturales en derivados de enlazador de dolastatina Los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales en un derivado de enlazador de dolastatina. Uno o más aminoácidos no naturales pueden incorporarse en una o más posiciones particulares que no interrumpen la actividad del derivado de enlazador de dolastatina. Esto puede lograrse realizando sustituciones "conservadoras" incluyendo, pero sin limitarse a, la sustitución de aminoácidos hidrófobos con aminoácidos hidrófobos no naturales o naturales, aminoácidos en volumen con aminoácidos en volumen no naturales o naturales, aminoácidos hidrófilos con aminoácidos hidrófilos no naturales o naturales) y/o la inserción del aminoácido no natural en una ubicación que no se requiere para su actividad.
Puede emplearse una variedad de procedimientos bioquímicos y estructurales para seleccionar los sitios para sustitución deseados con un aminoácido no natural dentro del derivado de enlazador de dolastatina. En algunas modalidades, el aminoácido no natural se enlaza en la terminal C del derivado de dolastatina. En otras modalidades, el aminoácido no natural se enlaza en la terminal N del derivado de dolastatina. Cualquier posición del derivado de enlazador de dolastatina es adecuada para la selección para incorporar un aminoácido no natural, y la selección puede basarse en un diseño racional o por selección aleatoria para cualquiera o ningún propósito particular deseado. La selección de los sitios deseados puede basarse en la producción de un polipéptido de aminoácido no natural (que puede modificarse adicionalmente o permanecer sin modificación) que tiene cualquier propiedad o actividad deseada incluyendo, pero sin limitarse a, moduladores de enlace al receptor, moduladores de actividad del receptor, moduladores de enlace a los socios de enlace, moduladores de la actividad del socio de enlace, moduladores de conformación del socio de enlace, formación de dímero o multímero, ningún cambio en la actividad o propiedad en comparación con la molécula nativa o manipulación de cualquier propiedad física o química del polipéptido tal como la solubilidad, la agregación o la estabilidad. Alternativamente, los sitios identificados como críticos para la actividad biológica pueden ser también buenos candidatos para la sustitución con un aminoácido no natural, de nuevo dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Otra alternativa sería realizar simplemente sustituciones seriales en cada posición en la cadena de polipéptido con un aminoácido no natural y observar el efecto en las actividades del polipéptido. Cualquier medio, téenica o método para seleccionar una posición para la sustitución con un aminoácido no natural en cualquier polipéptido es adecuado para uso en los métodos, técnicas y composiciones descritos en la presente.
La estructura y la actividad de mutantes de origen natural de un polipéptido que contienen supresiones pueden también examinarse para determinar las regiones de la proteína con probabilidad de ser tolerantes de sustitución con un aminoácido no natural. Una vez eliminados los residuos con probabilidad de ser intolerantes a la sustitución con aminoácidos no naturales, el impacto de las sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes puede examinarse utilizando métodos que incluyen, pero no se limitan a, la estructura tridimensional del polipéptido relevante, y cualquier ligando o proteína de enlace asociada. Las estructuras cristalográficas de rayos X y NMR de muchos polipéptidos se encuentran disponibles en el banco de datos de proteínas (PBD, www.rcsb.org), una base de datos centralizada que contiene datos estructurales tridimensionales de grandes moléculas de proteínas y ácidos nucleicos, y pueden utilizarse para identificar posiciones de aminoácidos que pueden sustituirse con aminoácidos no naturales. Adicionalmente, pueden producirse modelos que investigan la estructura secundaria y terciaria de polipéptidos, si no se encuentran disponibles los datos estructurales tridimensionales. Por tanto, la identidad de las posiciones de aminoácido que pueden sustituirse con aminoácidos no naturales puede obtenerse fácilmente.
Los sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido no natural incluyen, pero no se limitan a, aquellos excluidos de las regiones potenciales de enlace al receptor, o las regiones para enlace a proteínas o ligandos de enlace pueden exponerse total o parcialmente al solvente, tienen mínima o ninguna interacción de enlace al hidrógeno con residuos cercanos, pueden exponerse mínimamente a residuos reactivos cercanos y/o pueden estar en regiones altamente flexibles como se predice por la estructura cristalina tridimensional de un polipéptido particular con su receptor, ligando o proteína de enlace asociada.
Una amplia variedad de aminoácidos no naturales pueden sustituirse por, o incorporarse en, una posición dada en un polipéptido. A modo de ejemplo, un aminoácido no natural particular puede seleccionarse para su incorporación en base al examen de la estructura cristalina tridimensional de un polipéptido con su ligando, receptor y/o proteína de enlace asociada, una preferencia para sustituciones conservadoras.
En una modalidad, los métodos descritos en la presente incluyen incorporar en el derivado de enlazador de dolastatina, cuando el derivado de enlazador de dolastatina comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto el derivado de enlazador de dolastatina con una molécula (incluyendo pero sin limitarse a una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y cualquier combinación de los mismos) que comprende un segundo grupo reactivo. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es un residuo hidroxilamina y el segundo grupo reactivo es un residuo carbonilo o dicarbonilo, por lo cual se forma un enlace oxima. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es un residuo carbonilo o dicarbonilo y el segundo grupo reactivo es un residuo hidroxilamina, por lo cual se forma un enlace oxima. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es un residuo carbonilo o dicarbonilo y el segundo grupo reactivo es un residuo oxima, por lo cual se presenta una reacción de intercambio de oxima. En ciertas modalidades, el primer grupo reactivo es un residuo oxima y el segundo grupo reactivo es un residuo carbonilo o dicarbonilo, por lo cual se presenta una reacción de intercambio de oxima.
En algunos casos, la(s) incorporación(es) del derivado de enlazador de dolastatina se combinará(n) con otras adiciones, sustituciones o supresiones dentro del polipéptido para afectar otros atributos químicos, físicos, farmacológicos y/o biológicos. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la estabilidad (incluyendo pero sin limitarse a resistencia a la degradación proteolítica) del polipéptido o incrementar la afinidad del polipéptido para su receptor, ligando y/o proteína de enlace apropiados. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o supresiones pueden incrementar la solubilidad (incluyendo pero sin limitarse a, cuando se expresan en E- coli u otras células huésped) del polipéptido. En algunas modalidades, se seleccionan sitios para sustitución con aminoácidos naturalmente codificados o no naturales además de otro sitio para la incorporación de un aminoácido no natural con el propósito de incrementar la solubilidad del polipéptido después de la expresión en E. coli u otras células huésped recombinantes. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden otra adición, sustitución, o supresión que modula la afinidad para el ligando, proteína de enlace y/o receptor asociado, modula (incluyendo pero sin limitarse a, incrementa o disminuye) la dimerización del receptor, estabiliza los dímeros del receptor, modula la vida media en circulación, modula la liberación o la bio-disponibilidad, facilita la purificación o mejora o altera la vía de administración particular. De manera similar, el polipéptido de aminoácido no natural puede comprender secuencias de división química o enzimática, secuencias de división de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace al anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en la afinidad (incluyendo pero sin limitarse a FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero sin limitarse a biotina) que mejoran la detección (incluyendo pero sin limitarse a GFP), la purificación, el transporte a través de tejidos o membranas celulares, la liberación o activación de profármacos, la reducción del tamaño, u otros atributos del polipéptido.
VII. Expresión de Anti-CD70 e Interacciones de Ligando como Ejemplos Los métodos, composiciones, estrategias y téenicas descritos en la presente no se limitan al tipo, clase o familia de polipéptidos o proteínas particular. De hecho, virtualmente cualquier polipéptido puede diseñarse o modificarse para incluir al menos un derivado del enlazador de dolastatina que contiene aminoácidos no naturales "modificado o no modificado" descrito en la presente. Solamente a modo de ejemplo, el polipéptido puede ser homólogo a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa-1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticuerpo monoclonal (e.g., bevacizumab, cetuximab, panitumumab, infliximab, adalimumab, basiliximab, daclizumab, omalizumab, ustekinumab, etanercept, gemtuzumab, alemtuzumab, rituximab, trastuzumab, nimotuzumab, palivizumab, y abciximab), apolipoproteína, apoproteína, factor atrial natriurético, polipéptido atrial natriurético, péptido atrial, quimiocina C-X-C, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligando c-kit, citosina, quimiocina CC, proteína 1 quimio-atrayente de monocito, proteína 2 quimio-atrayente de monocito, proteína 3 quimio-atrayente de monocito, proteína 1 inflamatoria de monocito, proteína i beta inflamatoria de monocito, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando c-kit, colágeno, factor estimulador de colonia (CSF), factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor de complemento 1, citosina, péptido 78 activador de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, factor de crecimiento epidérmico (EGF), péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO), toxina exfoliante, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), fibrinógeno, fibronectina, proteína de bulto de cuatro hélices, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, grf, proteína hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocitos (hGF), hirudina, hormona humana de crecimiento (hGH), albúmina de suero humano, ICAM-1, receptor ICAM-1, LFA-1, receptor LFA-1, insulina, factor de crecimiento tipo insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferón (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), lactoferrina, factor inhibitorio de leucemia, luciferasa, neurturina, factor inhibitorio de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratioroidea, PD-ECSF, PDGF, hormona de péptido, plcyotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina pirogénica A, exotoxina pirogénica B, exotoxina pirogénica C, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor I de complemento soluble, I-CAM 1 soluble, receptor de interleucina soluble, receptor de TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina de estafilococo, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, receptor de hormona esteroidea, superóxido dismutasa, toxina del síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador del plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF), factor de necrosis tumoral, factor alfa de necrosis tumoral, factor beta de necrosis tumoral, receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor LDL, y corticosterona.
Por tanto se proporciona la siguiente descripción de un ARX-anti-CD70 ADC, anti-CD70-2H5-HA119-NCA, y CD70-2H5-HA119-NCA1 para propósitos ilustrativos y a modo de ejemplo no limitante del alcance de los métodos, composiciones, estrategias y téenicas descritos en la presente.
El CD70-2H5-HA119-NCA1 es un conjugado de anticuerpo monoclonal humanizado-fármaco que interactúa con el ligando CD27 que funciona, como ejemplo no limitante, promoviendo la supervivencia y la expansión celular de células CD8 T tratadas con antígeno, la formación de células T de memoria y la proliferación de células B. Los receptores CD70 se han encontrado en altas densidades en tejido canceroso por ejemplo de 34000 a 189000 copias por célula (Caki-1, 786-0, L-428, UMRC3, LP-1, DBTRG-05 MG) (Engineered anti-CD70 antibody-drug conjúgate with increased therapeutic índex (Conjugado fabricado de anticuerpo anti-CD70-fármaco con índice terapéutico incrementado), Molecular Cáncer Therapeutics, 2008) y en tejido no canceroso y/o en tejido normal los receptores se encuentran en el 5% al 15% de las células T activadas y en el 10% al 25% de las células B activadas. La expresión de CD70 se ha encontrado en -40% de múltiples aislados de mieloma (Preclinical Characterization of SGN-70, a Humanized Antibody Directed against CD70 (Caracterización preclínica de SGN-70, un anticuerpo humanizado dirigido contra CD70), Cáncer Therapy: Preclinical, 2008) y se confirmó la expresión de CD70 en un alto porcentaje de, por ejemplo, células Reed-Sternberg de linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin y tumores de carcinoma de célula renal. El CD70 es una proteína de membrana integral tipo II de la familia TNF. Para los propósitos de esta invención, es posible que el anticuerpo a sea cualquier anticuerpo CD70 conocido con un aminoácido no naturalmente codificado. Para propósitos de ilustración, los anticuerpos CD70-2H5-HA119-NCA1 se describen en la Tabla 1.
En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una región constante de anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 3 con un aminoácido no naturalmente codificado. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una región constante de anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 4. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una región constante de anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 3 en donde un aminoácido es un aminoácido no naturalmente codificado. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una región constante de anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 3 en donde el primer aminoácido es un aminoácido no naturalmente codificado. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una región constante de anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 4 en donde un aminoácido es un aminoácido no naturalmente codificado. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una región constante de anti-CD70 que comprende la SEQ ID NO: 4 en donde el primer aminoácido es un aminoácido no naturalmente codificado. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 10. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo o¡CD70 con una cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 con una cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO. 1 y una cadena ligera de la SEQ ID NO.2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO. 10 y una cadena ligera de la SEQ ID NO.11. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO.1 y una cadena ligera de la SEQ ID NO.2 y una región constate. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO.10 y una cadena ligera de la SEQ ID NO.11 y una región constate. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO.10 y una cadena ligera de la SEQ ID NO. 11 y una región constate que comprende la SEQ ID NO.3. En otra modalidad de la presente invención, existe un aminoácido no naturalmente codificado en la secuencia de anticuerpos de anti-CD70. En otra modalidad de la presente invención, existe más de un aminoácido no naturalmente codificado en la secuencia de anticuerpos de anti-CD70. En otra modalidad de la presente invención, el aminoácido 119 de la SEQ ID NO. 1 se sustituye con un aminoácido no naturalmente codificado. En otra modalidad de la presente invención, el aminoácido 122 de la SEQ ID NO.10 se sustituye con un aminoácido no naturalmente codificado. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO.1 y una cadena ligera de la SEQ ID NO.2 y una región constate que comprende la SEQ ID NO. 3. En otras modalidades de la presente invención, más de un aminoácido no naturalmente codificado se sustituye en el anticuerpo anti-CD70. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo aCD70 comprende una cadena pesada con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos no naturalmente codificados. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo aCD70 comprende la SEQ ID NO. 4 y las regiones variables anti-CD70 proporcionadas en la Solicitud de Patente de E.U. publicada 20100150950.
En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo OÍCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 90% de homología para la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 90% de homología para la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 90% de homología para la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 95% de homología para la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo OÍCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 95% de homología para la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 95% de homología para la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 96% de homología para la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 96% de homología para la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 96% de homología para la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 97% de homología para la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo <xCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 97% de homología para la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 97% de homología para la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo OÍCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 98% de homología para la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo OÍCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 98% de homología para la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo OÍCD70 que comprende una secuencia de aminoácido con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y 98% de homología para la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido un aminoácido no naturalmente codificados y 99% de homología para la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70 que comprende una secuencia de aminoácido un aminoácido no naturalmente codificados y 99% de homología para la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo aCD70antibody que comprende una secuencia de aminoácido un aminoácido no naturalmente codificados y 99% de homología para la SEQ ID NO: 3. La selección del sitio del aminoácido no naturalmente codificado se describe en esta especificación y debido a que pertenece específicamente a anticuerpos o¡-CD70, los sitios se seleccionaron en base a la exposición de superficie/accesibilidad del sitio dentro del anticuerpo y los sitios de aminoácido hidrófobo/neutro se seleccionaron para mantener la carga en el anticuerpo.
Tabla 1: SECUENCIAS DE ANTICUERPO AMINOÁCIDO Y NUCLEÓTIDO En una modalidad, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo aCD70-fármaco (ADC o un OÍCD70-ADC) en donde el anticuerpo es un OÍCD70 que comprende una cadena ligera y pesada. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un OÍCD70-ADC que comprende una cadena pesada (SEQ. ID. NO.: 1). En otra modalidad de la presente invención se proporciona un OÍCD70-ADC que comprende una cadena ligera (SEQ. ID. NO.: 2). En otra modalidad de la presente invención se proporciona un OÍCD70-ADC que comprende una cadena pesada (SEQ. ID. NO.: 10). En otra modalidad de la presente invención se proporciona un OÍCD70-ADC que comprende una cadena ligera (SEQ. ID. NO.: 11). En otra modalidad de la presente invención se proporciona un OÍCD70-ADC que comprende una cadena ligera (SEQ. ID. NO.: 2) y una pesada (SEQ. ID. NO.: 1). En otra modalidad de la presente invención se proporciona un aCD70-ADC que comprende una cadena ligera (SEQ. ID. NO.: 11) y una pesada (SEQ. ID. NO.: 10). En algunas modalidades de la presente invención la región constante, SEQ ID NO.3 o 4, ha mutado cualquiera de las posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo 115, 116, 117. En algunas modalidades de la presente invención, se realizan mutaciones al anticuerpo para inhibir la función ADCC. En algunas modalidades de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo o¡CD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición en la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo o¡CD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición en la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 2.
En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad de la presente invención. el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición en la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 3.
En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 10. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 10. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición en la SEQ ID NO: 10. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 10.
En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo o¡CD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 11. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 11. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición en la SEQ ID NO: 11. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 11.
En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 4. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 4. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición en la SEQ ID NO: 4. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 4.
En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, 3, 4, o 5 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, o 3 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1 o 2 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con dos aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 2 posiciones de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo o¡CD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición de la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 4. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 5. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo OÍCD70 de la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 7. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 8. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo aCD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo cxCD70 de la SEQ ID NO. 2 en donde la cadena pesada comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo OÍCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO.2 en donde la cadena pesada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos no naturalmente codificados. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO.2 en donde la cadena pesada comprende 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos no naturalmente codificados. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo OÍCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo OÍCD70 de la SEQ ID NO.2 en donde la cadena pesada comprende 1, 2, o 3 aminoácidos no naturalmente codificados. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo o¡CD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo OÍCD70 de la SEQ ID NO.2 en donde la cadena pesada comprende dos aminoácidos no naturalmente codificados. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena pesada del anticuerpo cxCD70 de la SEQ ID NO. 2 en donde la cadena pesada comprende un aminoácido no naturalmente codificado. En otra modalidad, la presente invención proporciona un OÍCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 9. En otra modalidad, la presente invención proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 10. En otra modalidad, la presente invención proporciona un o¡CD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 11. En otra modalidad, la presente invención proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 12. En otra modalidad, la presente invención proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 13. En otra modalidad, la presente invención proporciona un aCD70-ADC que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 14.
En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo o¡CD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, 3, 4, o 5 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1, 2, o 3 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo OÍCD70 con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 1 o 2 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con dos aminoácidos no naturalmente codificados sustituidos en 2 posiciones de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende un anticuerpo aCD70 con un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una posición de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 9. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 10. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 11. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo o¡CD70 de la SEQ ID NO: 12. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 13. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 14. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 2 y una cadena ligera del anticuerpo OÍCD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera del anticuerpo aCD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera del anticuerpo c¿CD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera del anticuerpo aCD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera del anticuerpo OÍCD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo OÍCD70 de la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera del anticuerpo OÍCD70. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comprende el anticuerpo aCD70 de la SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera del anticuerpo aCD70.
Como un ejemplo adicional no limitante, se proporciona la siguiente descripción del anticuerpo HER2 trastuzumab para propósitos ilustrativos y solamente a modo de ejemplo, y no como limitación al alcance de los métodos, composiciones, estrategias y téenicas descritas en la presente. Además, la referencia a trastuzumab en esta solicitud pretende utilizar el término genérico como un ejemplo de cualquier anticuerpo. Por tanto, se entiende que las modificaciones y químicas descritos en la presente con referencia a trastuzumab pueden aplicarse igualmente a cualquier anticuerpo o anticuerpo monoclonal, incluyendo los listados específicamente en la presente.
Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se enlaza al dominio IV del segmento extracelular del receptor HER2/neu. El gen HER2 (también conocido como HER2/neu y gen ErbB2) se amplifica en 20 a 30% de los cánceres de mama en etapa temprana, lo cual lo hace sobre-expresado. También, en el cáncer, el HER2 puede enviar señales sin mitógenos que lleguen y se enlacen a cualquier receptor, haciéndolo sobre-reactivo.
HER2 se extiende a través de la membrana celular y transporta señales desde el exterior de la célula al interior. En personas sanas, los compuestos de señalización llamados mitógenos llegan a la membrana celular y se enlazan a la parte exterior de otros miembros de la familia HER de receptores. Esos receptores enlazados se enlazan (se dimerizan) entonces con HER2, activándolo. Después HER2 envía una señal al interior de la célula. La señal pasa a través de diferentes trayectorias bioquímicas. Esto incluye la trayectoria PI3K/Akt y la trayectoria MAPK. Estas señales promueven la invasión, la supervivencia y el crecimiento de vasos sanguíneos (angiogénesis) de las células.
Las células tratadas con trastuzumab experimentan detención durante la fase G1 del ciclo celular de manera que existe una proliferación reducida. Se ha sugerido que trastuzumab induce parte de su efecto mediante la sub regulación de HER2/neu conduciendo a la interrupción de la dimerización y la señalización del receptor a través de la cascada PI3K aguas abajo. Por tanto P27Kipl se fosforila y tiene la capacidad de entrar al núcleo e inhibir la actividad de cdk2, ocasionando la detención del ciclo celular. También, trastuzumab suprime la angiogénesis tanto por la inducción de los factores anti-angiogénicos como por la represión de los factores pro-angiogénicos. Se considera que una contribución al crecimiento no regulado observado en el cáncer puede deberse a la división proteolítica de HER2/neu que da como resultado la liberación del dominio extracelular. Trastuzumab ha demostrado inhibir la división del ectodominio HER2/neu en células de cáncer de mama.
VIII. Absorción celular de aminoácidos no naturales La absorción del aminoácido no natural por una célula eucariótica es un problema considerado típicamente cuando se diseñan y se seleccionan aminoácidos no naturales, incluyendo pero sin limitarse a, para su incorporación en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de OÍ aminoácidos sugiere que es improbable que estos compuestos sean permeables a la célula. Los aminoácidos naturales se absorben en la célula eucariótica a través de una recolección de sistemas de transporte a base de proteínas. Puede realizarse una rápida exploración que evalúa cuáles aminoácidos no naturales, si existen, se absorben por las células (los ejemplos 15 y 16 en la presente ilustran ejemplos no limitantes de pruebas que pueden efectuarse en aminoácidos no naturales). Ver, e.g., los análisis de toxicidad e.g., en la Publicación de Patente de E.U. No. 2004/198637 titulada "Protein Arrays" (Disposiciones de proteínas) que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad y Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code (Progreso hacia la evolución de un organismo con un código genético expandido) PNAS Estados Unidos 96:4780-4785. Aunque la absorción se analiza fácilmente con diversos análisis, una alternativa para diseñar aminoácidos no naturales dóciles a las trayectorias de absorción celular es proporcionar trayectorias biosintéticas para crear aminoácidos in vivo.
Típicamente, el aminoácido no natural producido a través de absorción celular como se describe en la presente, se produce en una concentración suficiente para la biosíntesis de la proteína, incluyendo pero sin limitarse a, una cantidad celular natural, pero no a un grado tal que afecte la concentración de los otros aminoácidos o que agote los recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM.
IX. Biosíntesis de Aminoácidos no Naturales Existen muchas trayectorias biosintéticas en las células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. Aunque puede no existir en la naturaleza un método biosintético para un aminoácido no natural particular, incluyendo pero sin limitarse a, en una célula, los métodos y composiciones descritos en la presente proporcionan tales métodos. Por ejemplo, las trayectorias biosintéticas para aminoácidos no naturales pueden generarse en una célula huésped agregando nuevas enzimas o modificando las trayectorias de la célula huésped existentes. Las nuevas enzimas adicionales incluyen enzimas de origen natural o enzimas desarrolladas artificialmente. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo en la WO 2002/'085923 titulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids" (Incorporación in vivo de aminoácidos no naturales) se basa en la adición de una combinación de enzimas conocidas provenientes de otros organismos. Los genes de estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariótica transformando la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una trayectoria enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Se proporcionan en la presente ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente. Las secuencias de enzimas adicionales se encuentran, por ejemplo, en el GenBank. Pueden agregarse en una célula enzimas artificialmente desarrolladas de la misma manera. De esta manera, se manipula la maquinaria celular y los recursos de la célula para producir aminoácidos no naturales.
Se encuentra disponible una variedad de métodos para producir nuevas enzimas para uso en trayectorias biosintéticas o para el desarrollo de trayectorias existentes. Por ejemplo, la combinación recursiva, incluyendo pero sin limitarse a, la desarrollada por Maxygen Inc., (disponible en la red mundial en wviw.maxigen.com), puede utilizarse para desarrollar nuevas enzimas y trayectorias. Ver, e.g., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling (Rápida evolución de una proteína in vitro mediante reestructuración de ADN), Nature (Naturaleza) 370(4):389-391; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution (Reestructuración de ADN mediante fragmentación aleatoria y re-ensamblado: Recombinación in vitro para la evolución molecular), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 91:10747-10751. Similarly DesignPath™, desarrollado por Genencor (disponible en la red mundial en genencor-com) se utiliza opcionalmente para la fabricación de la trayectoria metabólica, incluyendo pero sin limitarse a, para fabricar una trayectoria para crear un aminoácido no natural en una celula. Esta teenología reconstruye las trayectorias existentes en organismos huésped utilizando una combinación de nuevos genes, incluyendo pero sin limitarse a aquellos identificados a través de genómica funcional, evolución molecular y diseño. Diversa Corporation (disponible en la red mundial en diversa.com) también proporciona tecnología para explorar rápidamente bibliotecas de genes y trayectorias de genes incluyendo, pero sin limitarse a, para crear nuevas trayectorias para producir de manera biosintética aminoácidos no naturales.
Típicamente, el aminoácido no natural producido con una trayectoria biosintética fabricada como se describe en la presente se produce en una concentración suficiente para la eficiente biosíntesis de proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, una cantidad celular natural, pero no a tal grado que afecte la concentración de los otros aminoácidos o que agote los recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM. Una vez que se transforma una célula con un plásmido que comprende los genes utilizados para producir las enzimas deseadas para una trayectoria específica y que se genera un aminoácido no natural, se utilizan las selecciones in vivo para optimizar adicionalmente la producción del aminoácido no natural tanto para la síntesis de proteína ribosomal como para el crecimiento celular.
X. Metodología Sintética adicional Los aminoácidos no naturales descritos en la presente pueden sintetizarse utilizando las metodologías descritas en la téenica o utilizando las técnicas descritas en la presente o mediante una combinación de los mismos. Como una ayuda, la siguiente tabla proporciona varios electrófilos y neutrófilos de inicio que pueden combinarse para crear un grupo funcional deseado. La información proporcionada pretende ser ilustrativa y no limitante a las técnicas sintéticas descritas en la presente.
Tabla 2: Ejemplos de Enlaces Covalentes y sus Precursores En general los electrófilos de carbono son susceptibles al ataque por nucleófilos complementarios, incluyendo nucleófilos de carbono, en donde un nucleófilo de ataque lleva un par de electrón al electrófilo de carbono a fin de formar un nuevo enlace entre el nucleófilo y el electrófilo de carbono.
Ejemplos no limitantes de nucleófilos de carbono incluyen, pero no se limitan a alquilo, alquenilo, arilo y alquinilo Grignard, organolitio, organozinc, reactivos de alquilo, alquenilo, arilo, y alquinilo-estaño (organoestananos), reactivos de alquilo, alquenilo, arilo y alquinilo-borano (organoboranos y organoboronatos); estos nucleófilos de carbono tienen la ventaja de ser cinéticamente estables en agua o en solventes orgánicos polares. Otros ejemplos no limitantes de nucleófilos de carbono incluyen ílidos de fósforo, enol y reactivos de enolato; estos nucleófilos de carbono tienen la ventaja de ser relativamente fáciles de generar a partir de precursores muy conocidos por los expertos en la téenica de la química orgánica sintética. Los nucleófilos de carbono, cuando se utilizan en conjunción con electrófilos de carbono, engendran nuevos enlaces de carbono-carbono entre el nucleófilo de carbono y el electrófilo de carbono.
Ejemplos no limitantes de nucleófilos no carbono adecuados para el acoplamiento a los electrófilos de carbono incluyen, pero no se limitan a aminas primarias y secundarias, tioles, tiolatos y tioéteres, alcoholes, alcóxidos, azidas, semicarbazidas, y lo similar. Estos nucleófilos no carbono, cuando se utilizan en conjunción con electrófilos de carbono, generan típicamente enlaces heteroátomo (C-X-C), en donde X es un heteroátomo, incluyendo, pero sin limitarse a, oxígeno, azufre o nitrógeno.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Síntesis del Compuesto 1 Esquema 1 - Compuesto 1-3: se disolvieron tetra (etilen glicol) 1-1 (10 g, 51.5 mmol), N-hidroxiftalimida 1-2 (8.4 g, 51.15 mmol) y trifenilfosfina (17.6 g, 67 mmol) en 300 mi de tetrahidrofurano seguido de la adición de DIAD (12.8 mi, 61.78 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. EL residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 5.47 g (31%) del compuesto 1-3.
Compuesto 1-4: Se agregó periodinano Dess-Martin (300 mg, 0.71 mmol) a una solución del compuesto 1-3 (200 mg, 0.59 mmol) en 15 mi de diclorometano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se templó con la solución de bisulfito de sodio en 15 mi de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla se separó. La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio saturado, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 150 mg (75%) del compuesto 1-4.
Compuesto 1-6: Se agregó el compuesto 1-4 (63 mg, 0.186 mmol) y 70 ml de ácido acético a una solución de sal de hidrocloruro de monometildolastatina 1-5 (50 mg, 0.062 mmol) en 1 mi de DMF, seguido por la adición de 8 mg de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se purificó mediante HPLC para proporcionar 60 mg (80%) del compuesto 1-6. S (ESI) m/z 547 [M+2H] , 1092 [M+H] .
Id .
Compuesto 1: El compuesto 1-6 (60 mg, 0.05 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 32 ul de hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 33 mg (55%) del compuesto 1. MS (ESI) m/z 482 [M+2H], 962 [M+H].
Ejemplo 2: Síntesis del Compuesto 2 Esquema 2 - - _ El compuesto 2 se sintetizó mediante una ruta sintética similar a la descrita en el Ejemplo 1. MS (ESI) m/z 460 [M+2H], 918 [M+H].
Ejemplo 3: Síntesis del Compuesto 3 Esquema 3 - i - i i .. i El compuesto 3 se sintetizó mediante una ruta sintética similar al Ejemplo 1. MS (ESI) m/z 438 [M+2H], 974 [M+H].
Ejemplo 4: Síntesis del Compuesto 4 Compuesto 4-2: Se agregaron 1.68 mi de DIEA a una solución de Val (OtBu)-OH.HCl 4-1 (1 g, 4.77 mmol) y bromoetanol (304.7 ml, 4.3 mmol) en 10 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Se agregaron 4.8 mmol de Boc20 a la mezcla de reacción, seguido por 0.84 mi de DIEA. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción se concentró in vacuo y se extrajo con etil acetato, y se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 0.66 g del compuesto 4-1.
Esquema 4 .
I Compuesto 4-3: Se agregó DIAD (394 ml, 1.9 mmol) a una solución del compuesto 4-2 (500 mg, 1.58 mmol), N-hidroxiftalimida (261 mg, 1.6 mmol) y trifenilfosfina (538 mg, 2.05 mmol) en 15 mi de THF a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 0.68 g del compuesto 4-3.
Compuesto 4-4: El compuesto 4-3 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en DMF y se trató con Boc20 (230 ul, 1 mmol) y DIEA (352 ml, 2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 100 mg del compuesto 4-4.
Compuesto 4-5: Se agregó phe(OtBu)-OH.HCl, HATU y N-metilmorfolina a una solución del compuesto Boc-Val-Dil-metilDap-OH en DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea. El compuesto resultante se trató con HCl/EtOAC para proporcionar el compuesto 4-5.
Compuesto 4-6: se agregó el compuesto 4-4, HATU y DIEA a una solución del compuesto 4-5 en DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea para proporcionar el compuesto 4-6.
Compuesto 4-7: El compuesto 4-6 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar al compuesto 4-7.
Compuesto 4-8: Se agregó formilaldehído y ácido acetico a una solución del compuesto 4-7 en 1 mi de DMF, seguido por la adición de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 4-8.
Compuesto 4: El compuesto 4-8 se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregó hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 4.
Ejemplo 5: Síntesis del Compuesto 5 El compuesto 4-7 se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregó hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar el Compuesto 5.
Ejemplo 6: Síntesis de Compuesto 6 Esquema 6 * , Compuesto 6-2: Se agregaron 283 mg de hidrocloruro de fenilalanina, 433 mg de HATU y 581 ml de N-metilmorfolina a una solución del compuesto 6-1 (500 mg, 0.875 mmol) en 3 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea para proporcionar 560 mg (76%) del compuesto 6-2.
Compuesto 6-3: El compuesto 6-2 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar 511 mg del compuesto 6-3.
Compuesto 6-4: Se agregaron 255 mg de Boc-N-metil valina, 314 mg de HATU y 303 ml de N-metilmorfolina a una solución del compuesto 6-3 (368 mg, 0.55 mmol) en 3 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea para proporcionar 370 mg (79%) del compuesto 6-4.
Compuesto 6-5: Se agregaron 5 equivalentes de 1N de LiOH a una solución del compuesto 6-4 (170 mg) en 10 mi de MeOH. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se acidificó mediante 1N de HCl y se extrajo con etil acetato, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir 150 mg (90%) del compuesto 6-5.
Compuesto 6-6: El compuesto 6-5 se disolvió en 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío y se purificó mediante HPLC para proporcionar 150 mg del compuesto 6-6.
Compuesto 6-7: Se agregó el compuesto 1-4 (63 mg, 0186 mmol) y 70 ml de ácido acetico a una solución del compuesto 6-6 (50 mg, 0.062 mmol) en 1 mi de DMF, seguido por la adición de 8 mg de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se purificó mediante HPLC para proporcionar 60 mg (80%) del compuesto 6-7.
Compuesto 6: El compuesto 6-7 (60 mg, 0.05 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 32 ml de hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1 N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 33 mg (55%) del compuesto 6.
Ejemplo 7: Síntesis del Compuesto 7 Esquema 7 .
El compuesto 7 se sintetizó mediante una ruta sintética similar a la del compuesto 1. MS (ESI) m/z 440 [M+2H], 879 [M+H].
Ejemplo 8: Síntesis del Compuesto 8 Esquema 8 - El compuesto 8 se sintetizó mediante una ruta sintética similar a la del compuesto 1. MS (ESI) m/z 418 [M+2H], 835 [M+H].
Ejemplo 9: Síntesis del Compuesto 9.
Esquema 9 - Compuesto 9-1: Se agregó 4-(2-aminoetil) piridina, HATU y N-metilmorfolina a una solución del compuesto Boc-Val-Dil-metilDap-OH en DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea. El compuesto resultante se trató con HCl/EtOAC para proporcionar el compuesto 9-1.
Compuesto 9-2: Se agregó el compuesto 4-4, HATU y DIEA a una solución del compuesto 9-1 en DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea para proporcionar el compuesto 9-2.
Compuesto 9-3: El compuesto 9-2 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto 9-3.
Compuesto 9-4: Se agregó formilaldehído y ácido acético a una solución del compuesto 9-3 en 1 mi de DMF, seguido por la adición de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 9-4.
Compuesto 9: El compuesto 9-4 se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregó hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 9.
Ejemplo 10: Síntesis de Compuesto 10 Esquema 10 Compuesto 10: El compuesto 9-3 se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregó hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar el Ejemplo 10.
Ejemplo 11: Síntesis de Compuesto 11 Esquema 11 , - - Compuesto 11-3: Se agregaron 47 mg de sodio a una solución de tetra (etilen glicol) 11-1 (40.6 mi, 235 mmol) en 100 mi de tetrahidrofurano. Se agregaron 12 mi de ter-butilacrilato después de que se disolvió el sodio. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se templó con 2 mi de 1N de HCl. El residuo se suspendió en salmuera y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para proporcionar 6.4 g (23%) del compuesto 11-3.
Compuesto 11-5: Se disolvieron el compuesto 11-3 (1.0 g, 3.12 mmol), N-hidroxiftalimida 11-4 (611 mg, 3.744 mmol) y trifenilfosfina (1.23 g, 4.68 mmol) en 20 mi de tetrahidrofurano seguido por la adición de DIAD (0.84 mi, 4.06 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (80 g), se eluyó con 0-100% de etil acetato/hexanos, para proporcionar 1.0 g (100%) del compuesto 11-5.
Compuesto 11-6: El compuesto 11-5 se disolvió en 15 mi 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar 1.0 g del compuesto 11-6.
Compuesto 11-8: Se agregaron 33 ml (0.186 mmol) de diisopropiletilamina a una solución de 30 mg (0.0372 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, 31 g (0.0744 mmol) del compuesto 11-6 y 38.2 mg (0.082 mmol) de PyBroP en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 28 mg (65%) del compuesto 11-8. MS (ESI) m/z 785 [M+2H], 1164[M+H].
Compuesto 11: El compuesto 11-8 (28 mg, 0.024 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 23 ml (0.72 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 20 mg (66%) del compuesto 11. MS (ESI) m/z 518 [M+2H], 1034[M+H].
Ejemplo 12: Síntesis del Compuesto 12 Esquema 12 Compuesto 12-2: Se agregaron 283 mg de hidrocloruro de fenilalanina, 433 mg de HATU y 581 ml de N-metilmorfolina a una solución del compuesto 12-1 (500 mg, 0.875 mmol) en 3 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea para proporcionar 560 mg (76%) del compuesto 12-2.
Compuesto 12-3: El compuesto 12-2 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar 511 mg del compuesto 12-3.
Compuesto 12-4: Se agregaron 255 mg de Boc-N-metil valina, 314 mg de HATU y 303 ml de N-metilmorfolina a una solución del compuesto 12-3 (368 mg, 0.55 mmol) en 3 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea para proporcionar 370 mg (79%) del compuesto 12-4.
Compuesto 12-5: Se agregaron 5 equivalentes de 1N de LiOH a una solución del compuesto 12-4 (170 mg) en 10 mi de MeOH. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se acidificó mediante 1N de HCl y se extrajo con etil acetato se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para proporcionar 150 mg (90%) del compuesto 12-5.
Compuesto 12-6: El compuesto 12-5 se disolvió en 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío y se purificó mediante HPLC para proporcionar 150 mg del compuesto 12-6.
Compuesto 12-7: Se agregó formilaldehído (3 equivalentes) y 20 equivalentes de ácido acético a una solución del compuesto 12-6 en DMF, seguido por la adición de 2 equivalentes de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 12-7.
Compuesto 12-10: Se disolvieron ter-butil 2-(hidroxietoxi)etilcarbamato (2.05 g, 10 mmol), N-hidroxiftalimida (1.8 g, 11 mmol) y trifenilfosfina (3.67 g, 14 mmol) en 100 mi de tetrahidrofurano seguido por la adición de DIAD (2.48 mi, 12 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. El residuo se trató con 50 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retiró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío para obtener 2.6 g (91%) del compuesto 12-10. MS (ESI) m/z 251 [M+H].
Compuesto 12-11: se agregaron 11.2 mg del compuesto 12-10, 15 mg de HATU y 23 ml de DIEA a una solución del compuesto 12-10 (20 mg, 0.026 mmol) en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 20 mg (70%) del compuesto 12-4. MS (ESI) m/z 490 [M+2H], 978[M+H].
Compuesto 12: El compuesto 12-11 (20 mg, 0.0183 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 18 ml (0.56 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 14 mg (72%) del compuesto 12. MS (ESI) m/z 425 [M+2H], 848[M+H].
Ejemplo 13: Síntesis del Compuesto 13 Esquema 13 , .
‘ Compuesto 13-2: Se disolvieron en 50 mi de tetrahidrofurano seguido por la adición de DIAD (2 mi, 9.564 mmol) ter-butil 6-hidroxihexanoato 13-1 (1.5 g, 1.97 mmol), N-hidroxiftalimida (1.42 g, 8.76 mmol) y trifenilfosfina (2.82 g, 10.76 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 2.5 g, (95%) del compuesto 13-2.
Compuesto 13-3: El compuesto 13-2 se trató con 15 mi de 4N de HCl en dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas y se concentró hasta secarse al vacío para proporcionar 900 mg (100%) del compuesto 13-3.
Compuesto 13-4: Se agregaron 397 mg de N-hidroxisuccinimida a una solución del compuesto 13.3 (900 mg, 3.0 mmol) en 10 mi de THF, seguido por la adición de 669 mg de DCC. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se filtró. La filtración se concentró y se trató con 10 mi de DCM. La solución de DCM se estabilizó a temperatura ambiente durante 1 hora y se filtró. La filtración se concentró y se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 800 mg (71%) del compuesto 13-4.
Compuesto 13-6: La mezcla del compuesto 13-4 (435 mg, 1.16 mmol) y Val-Cit-PABOH 13-51 (400 mg, 1.054 mmol) en 12 mi de DMF se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El solvente se retiró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró y se lavó con éter. El sólido se secó al vacío para proporcionar 660 mg (98%) del compuesto 13-6.
Compuesto 13-7: Se agregó bis(p-nitrofenil carbonato (286 mg, 0.94 mmol) a una solución del compuesto 13-6 (200 mg, 0.313 mmol) en 6 mi de DMF, seguido por la adición de 110.2 ml de DIEA. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas y se concentró. El residuo se trató con éter y se filtró. El sólido recolectado se lavó con éter, ácido cítrico al 5%, agua, éter y se secó al vacío para proporcionar 210 mg (83%) del compuesto 13-7.
Compuesto 13-9: Se agregó el compuesto 13-7 (159 mg, 0.2 mmol) y 10 mg de HOBt a una solución de sal de hidrocloruro de monometilauristatina 13-8 (100 mg, 0.1325 mmol) en 2 mi de DMF, seguido por la adición de 35.2 ml de DIEA. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se purificó mediante HPLC para proporcionar 93 mg (51%) del compuesto 13-9. MS (ESI) m/z 692 [M+2H], 1382 [M+H].
Compuesto 13: El compuesto 13-9 (50 mg, 0.036 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 23 m? de hidracina. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 32 mg (65%) del compuesto 13. MS (ESI) m/z 638.5 [M+Na+2H], 1253.3 [M+H], 1275.8 [M+Na].
Ejemplo 14: Síntesis del Compuesto 14 Esquema 14 - _ Compuesto 14-3: Se agregaron 47 mg de sodio a una solución de tetra (etilen glicol) 14-1 (40.6 mi, 235 mol) en 100 mi de tetrahidrofurano. Se agregaron 12 mi de ter-butilacrilato después de que se disolvió el sodio. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se templó con 2 mi de 1N de HCl. El residuo se suspendió en salmuera y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para proporcionar 6.4 g (23%) del compuesto 14-3.
Compuesto 14-5: Se disolvieron el compuesto 14-3 (1.0 g, 3.12 mmol), N-hidroxiftalimida 14-4 (611 mg, 3.744 mmol) y trifenilfosfina (1.23 g, 4.68 mmol) en 20 mi de tetrahidrofurano seguido por la adición de DIAD (0.84 mi, 4.06 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (80 g), se eluyó con 0-100% de etil acetato/hexanos, para proporcionar 1.0 g (100%) del compuesto 14-5.
Compuesto 14-6: El compuesto 14-5 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar 1.0 g del compuesto 14-6.
Compuesto 14-7: Se agregaron 1.062 g (5.148 mmol) de DCC a una solución del compuesto 6 (1.93 g, 4.68 mmol) y N-hidroxisuccinimida (646 mg, 5.616 mmol) en 20 mi de tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se filtró. La filtración se concentró y se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (80 g), se eluyó con 0-100% de etil acetato/hexanos para proporcionar 2.37 g (100%) del compuesto 14-7.
Compuesto 14-8: Se produjo el compuesto 14-8 se preparó de acuerdo con la literatura (Bioconjugat Chem.2002, 13 (4), 855-869.) Compuesto 14-9: Se agregaron 295 mg (0.58 ol) del compuesto 14-7 a una solución del compuesto 14-8 (200 mg, 0.527 mmol) en 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se concentró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío para proporcionar 402 mg (98%) del compuesto 14-9.
Compuesto 14-10: Se agregaron 0.186 mi (1.054 mmol) de diisopropiletilamina a una solución del compuesto 14-9 (406 mg, 0.527 mmol) y bis(p-nitrofenol) carbonato (481 mg, 1.58 mmol) en 10 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El solvente se retiró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter, ácido cítrico al 5%, agua, éter y se secó al vacío para proporcionar 350 mg (72%) del compuesto 14-10.
Compuesto 14-11: Se agregaron 22 ml (0.124 mmol) de diisopropiletilamina a una solución de 50 mg (0.062 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, 87.2 mg (0.093 mmol) del compuesto 14-10 y 4.7 mg (0.031 mmol) de HOBt en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 41 mg (42%) del compuesto 14-11. MS (ESI) m/z 785 [M+2H].
Compuesto 14: El compuesto 14-11 (41 mg, 0.026 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 17 ml (0.52 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 22 mg (58%) del compuesto 14. MS (ESI) m/z 720 [M+2H].
Ejemplo 15: Síntesis del Compuesto 15 Esquema 15 - Compuesto 15-2: Se agregaron 22 ml (0.124 mmol) de diisopropiletilamina a una solución de 50 mg (0.062 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatin , 75 mg (0.093 mmol) del compuesto 13-7 y 4.7 mg (0.031 mmol) de HOBt en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 41 mg (42%) del compuesto 15-2. MS (ESI) m/z 718 [M+2H], 1435 [M+H].
Compuesto 15-2: El compuesto 15-2 (41 mg, 0.026 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 17 ml (0.52 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1 N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 22 mg (58%) del ejemplo 15. MS (ESI) m/z 653 [M+2H], 1305 [M+H].
Ejemplo 16: Síntesis del Compuesto 16 Esquema 16 Compuesto 16-3: Se agregaron 47 mg de sod una solución de etilen glicol 16-1 (13.1 mi, 235 mmol) en 100 mi de tetrahidrofurano. Se agregaron 12 mi de ter-butilacrilato después de que se disolvió el sodio. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se templó con 2 mi de 1N de HCl. El residuo se suspendió en salmuera y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 5.2 g (24%) del compuesto 16-3.
Compuesto 16-5: Se disolvieron el compuesto 16-3 (2.0 g, 10.5 mmol), N-hidroxiftalimida (2.05 g, 12.6 mmol) y trifenilfosfina (3.58 g, 13.65 mmol) en 50 mi de tetrahidrofurano seguido por la adición de DIAD (3.26 mi, 15.75 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar el compuesto 16-5.
Compuesto 16-6: El compuesto 16-5 se disolvió en 15 mi 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto 16-6.
Compuesto 16-7: Se agregaron 1.28 g (6.2 mmol) de DCC a una solución del compuesto 16-6 (5.16 mmol) y N- hidroxisuccinimida (722 mg, 6.7 mmol) en 20 ml de tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se filtró. La filtración se concentró y se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 500 mg del compuesto 16-7.
Compuesto 16-8: El compuesto 16-8 se produjo de acuerdo con la literatura (Bioconjugat Chem.2002, 13 (4), 855-869.) Compuesto 16-9: Se agregaron 2.92 ml (16.6 mmol) de diisopropiletilamina a una solución del compuesto 16-8 (5.0 g, 8.3 mmol) y bis(p-nitrofenol) carbonato (7.6 g, 25 mmol) en 100 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El solvente se retiró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter, ácido cítrico al 5%, agua, éter y se secó al vacío para proporcionar 5.0 g (81%) del compuesto 16-9.
Compuesto 16-10: Se agregaron 437 ml (2.48 mmol) de diisopropiletilamina a una solución de 1.0 g (1.24 mmol) de hidrocloruro de monometildolastatina, 1.42 g (1.8575 mmol) del compuesto 16-9 y 95 mg (0.62 mmol) de HOBt en 10 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 1.0 g (58%) del compuesto 16-10. MS (ESI) m/z 700 [M+2H], 1398 [M+H].
Compuesto 16-11: Se agregaron 5 mi (48 mmol) de dietilamina a una solución del compuesto 16-10 (1.0 g, 0.715 mmol) en 15 mi de tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en 20 mi de DCM, se trató con 200 mi de éter y se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío para proporcionar 860 mg del compuesto 16-11. MS (ESI) m/z 589 [M+2H], 1176 [M+H].
Compuesto 16: Se agregaron 32 mg (0.085 mmol) del compuesto 16-7 a una solución de 50 mg (0.0425 mmol) del compuesto 16-11 en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El HPLC y MS mostraron la reacción completada. Se agregaron 27.2 ml (0.85 mmol) de hidracina anhidro a la mezcla de reacción. La reacción se completó en 2 horas. La mezcla de reacción se acidificó con 1N de HCl y se purificó mediante HPLC para proporcionar 40 mg (66%) del compuesto 16. MS (ESI) m/z 654 [M+2H], 1307[M+H].
Ejemplo 17: Síntesis del Compuesto 17 Esquema 17 Compuesto 17-2: Se agregaron 1.12 g (5.424 mmol) de DCC a una solución del compuesto 17-1 (1.0 g, 4.52 mmol) y N-hidroxisuccinimida (572 mg, 4.97 mmol) en 20 mi de tetrahidrofurano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se filtró. La filtración se concentró para proporcionar el compuesto 17-2.
Compuesto 17: Se agregaron 41 mg (0.1275 mmol) del compuesto 17-2 a una solución de 50 mg (0.0425 mmol) del compuesto 16-11 en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El HPLC y MS mostraron la reacción completada. Se agregaron 20 ml (0.625 mmol) de hidracina anhidro a la mezcla de reacción. La reacción se completó en 2 horas. La mezcla de reacción se acidificó con 1N de HCl y se purificó mediante HPLC para proporcionar 35 mg (60%) del compuesto 17. MS (ESI) m/z 625 [M+2H], 1249[M+H].
Ejemplo 18: Síntesis del Compuesto 18 Esquema 18 1 1 Compuesto 18-1: Se agregó diisopropiletilamina a una solución del compuesto 6-6, mg (0.062 mmol) del compuesto 14-10 y HOBt en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar el compuesto 18-1.
Compuesto 18: El compuesto 18-1 se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregó hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar el compuesto 18.
Ejemplo 19: Síntesis del Compuesto 19 Esquema 19 Compuesto 19-2: Se disolvieron ter-butil 2-(2-hidroxietoxi)etilcarbamato 13 (2.05 g, 10 mmol), N-hidroxiftalimida (1.8 g, 11 mmol) y trifenilfosfina (3.67 g, 14 mmol) en 100 mi de tetrahidrofurano seguido por la adición de DIAD (2.84 mi, 12 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y después se concentró hasta secarse. El residuo se trató con 50 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retiró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío para obtener 2.6 g (91%) del compuesto 19-2. MS (ESI) m/z 251 [M+H].
Compuesto 19-3: Se agregaron 1.056 mi (6 mmol) de diisopropiletilamina a la mezcla del compuesto 19-2 (315 mg, 1.1 mmol), Boc-Lys(Boc)-OH (365 mg, 1 mmol), EDC (382 mg, 2 mmol) y HOBt (306 mg, 2 mmol) en 10 mi de DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se extrajo con etil acetato, se lavó con ácido cítrico al 5%, bicarbonato de sodio saturado, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (40 g), se eluyó con 0-100% de etil acetato/hexanos, para proporcionar 405 mg (70%) del compuesto 19-3.
Compuesto 19-4: El compuesto 19-3 se disolvió en 15 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar 315 mg (98%) del compuesto 19-4. MS (ESI) m/z 379 [+H].
Compuesto 19-5: Se agregó periodinano Dess-Martin (636 mg, 1.5 mmol) a una solución del compuesto 14-3 (322 mg, 1 mmol) en 20 mi de diclorometano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se templó con una solución de tiosulfato de sodio (1.4 g, 8.85 mmol) en 15 mi de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla se separó. La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio saturado, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (40 g), se eluyó con 0-100% de etil acetato/hexanos para proporcionar 170 mg (53%) del compuesto 19-5.
Compuesto 19-6: Se agregaron 1.19 g (3.72 mmol) del compuesto 17 a una solución de hidrocloruro de monometildolastatina 1.0 g (1.24 mmol) en 20 mi de DMF seguido por 1.4 mi (24.8 mmol) de ácido acético y 156 mg (2.48 mmol) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retiró al vacío. El residuo se ajustó a pH 8 mediante bicarbonato de sodio y se extrajo con DCM, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (40 g), se eluyó con 0-5% de metanol/DCM para proporcionar 680 mg (51%) del compuesto 19-6. MS (ESI) m/z 538 [M+2H], 1075 [M+H].
Compuesto 19-7: Se agregaron 20 mi de 4N de HCl/dioxano a una solución del compuesto 19-6 (680 mg, 0.632 mmol) en 5 mi de DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío para proporcionar 660 mg (98%) del compuesto 19-7. MS (ESI) m/z 510 [M+2H], 1019 [M+H].
Compuesto 19-8: Se agregaron 98 mg (0.257 mmol) de HATU a una solución del compuesto 19-7 (280 mg, 0.257 mmol), el compuesto 19-4 (38 mg, 0.0857 mmol) y N-metilmorfolina (0.283 mi, 2.57 mmol) en 5 mi de N-metilpirrolidinona. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 160 mg (71%) del compuesto 19-8. MS (ESI) m/z 596 [M+4H], 794[M+3H], 1191 [M+2H].
Compuesto 19: El compuesto 19-8 (160 mg, 0.0613 mmol) se disolvió en 1.5 mi de DMF. Se agregaron 20 ml (0.613 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 120 mg (75%) del compuesto 19. MS (ESI) m/z 451[M+5H], 563[M+4H], 751 [M+3H], 1126 [M+2H].
Ejemplo 20: Síntesis del Compuesto 20 Esquema 20 .
Compuesto 20-2: Se agregaron 1.65 g de hidruro de sodio a una solución de tetra (etilen glicol) 20-1 (8.0 g, 41.2 mmol) en 100 mi de tetrahidrofurano a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregaron 6.21 g de TBS-C1 a esta solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se templó con 2 mi de 1N de HCl. El residuo se suspendió en salmuera y se extrajo con etil acetato (100 mi XI, 50 mi X2). La capa orgánica se combinó y se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 5.7 g del compuesto 20-2.
Compuesto 20-3: Se agregó periodinano Dess-Martin (1.03 g, 2.43 mmol) a una solución del compuesto 20-2 (500 mg, 1.62 mmol) en 30 mi de diclorometano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se templó con una solución de tiosulfato de sodio (1.4 g, 8.85 mmol) en 15 mi de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla se separó. La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio saturado, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 400 mg del compuesto 20-3.
Compuesto 20-4: Se agregaron 245 mg (075 mmol) del compuesto 20-3 a una solución de hidrocloruro de monometildolastatina 213 mg (0.263 mmol) en 4 mi de DMF seguido por 0.303 mi (5 mmol) de ácido acético y 34 mg (0.5 mmol) de cianoborohidruro de sodio. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente se retiró al vacío. Se agregaron 3 mi de acetonitrilo al 60% seguido por 0.2 mi de HF.Piridina a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El solvente orgánico se retiró al vacío. El residuo se ajustó a pH 8 mediante bicarbonato de sodio y se extrajo con DCM, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 160 mg del compuesto 20-4. MS (ESI) m/z 474 [M+2H], 947[M+H].
Compuesto 20-5: Se agregaron 0.3 mi de fosgeno/tolueno a una solución del compuesto 20-4 (50 mg, 0.062 mmol) en 4 mi de DCM a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 3 horas y se concentró al vacío para la siguiente etapa sin purificación.
Compuesto 20-6: Se agregaron 25 ml de diisopropiletilamina a una solución del compuesto 19-4 (7.6 mg, 0.017 mmol) y el compuesto 20-5 (0.062 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC, se eluyó con 20-70% CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 33 mg del compuesto 20-6. MS (ESI) m/z 582[M+4H], 775[M+3H], 1163[M+2H].
Compuesto 20: El compuesto 20-6 (33 mg, 0.014 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 14 ml (0.43 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 10 mg del compuesto 20. MS (ESI) m/z 549[M+4H], 732[M+3H], 1098[M+2H].
Ejemplo 21: Síntesis del Compuesto 21 Esquema 21 - ' Compuesto 21-2: La mezcla de N,N'-dimetileno diamina 21-1 (5 mi, 46.5 mmol) y ter-butil acrilato 13 mi (116 mmol) se calentó a 85°C durante 1 hora Se agregaron otros 13 mi (116 mmol) de ter-butil acrilato La mezcla de reacción se calentó continuamente a 85°C durante 1 hora y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se diluyó con hexanos y se purificó mediante cromatografía de columna instantánea utilizando cartuchos SiliaSep (120 g), se eluyó con 0-5% de metanol/DCM para proporcionar 10.1 g (62%) del compuesto 21-2. MS (ESI) m/z 345 [M+H].
Compuesto 21-3: Se agregaron 40 mi de 4N de HCl/dioxano a una solución del compuesto 21-2 (5.0 g, 14.5 mmol) en 50 mi de DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días y se concentró al vacío. El residuo se trató con éter, se filtró, se lavó con éter y se secó al vacío para proporcionar 4.3 g (97%) del compuesto 21-3.
Compuesto 21-4: Se agregaron 160 mg del compuesto 16-11 a una solución de 166 mg (0.544 mmol) del compuesto 21-3 y 0.15 mi de N-metilmorfolina en 10 mi de N. metilpirrolidinona, seguido por 0.068 mi (0.408 mmol) de DECP. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 35-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 100 mg (50%) del compuesto 21-4. MS (ESI) m/z 464[M+3H], 696 [M+2H], 1391 [M+H].
Compuesto 21-5: Se agregaron 29.3 mg (0.077 mmol) de HATU a una solución del compuesto 19-4 (11 mg, 0.025 mmol), el compuesto 21-4 (115 mg, 0.077 mmol) y N-metilmorfolina (0.028 mi, 0.25 mmol) en 1.5 mi de N-metilpirrolidinona. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC, se eluyó con 20-70% CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 60 mg (67%) del compuesto 21-5. MS (ESI) m/z 625 [M+5H], 781 [M+4H], 1041[M+3H].
Compuesto 21: El compuesto 21-5 (60 mg, 0.014 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 7 ml (0.21 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 29 mg (58%) del compuesto 21. MS (ESI) m/z 599[M+5H], 749[M+4H], 998 [M+3H].
Ejemplo 22: Síntesis del Compuesto 22 Esquema 22 Compuesto 22: Se agregaron 32 mg (0.085 mmol) de HATU a una solución del compuesto 19-4 (7.6 mg, 0.017 mmol), el compuesto 12-7 (40 mg, 0.051 mmol) y DIEA (0.030 mi, 0.17 mmol) en 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 24 mg (68%) del compuesto 22-1. MS (ESI) m/z 612 [M+3H], 917 [M+2H], 1834 [M+H] .
Compuesto 22: El compuesto 22-1 (24 mg, 0.012 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 12 ml (0.36 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 15 mg (58%) del ejemplo 21. MS (ESI) m/z 569[M+3H], 852[M+2H], 1726[M+2H].
Ejemplo 23: Síntesis del Compuesto 23 Esquema 23 Compuesto 23-1: Se agregaron 3.31 g de cloruro de toluenosulfonilo a una solución del compuesto 14-3 (4.0 g, 12.4 mmol) y 6.6 mi (37.2 mmol) de DIEA en 50 mi de DCM a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla de reacción se extrajo con etil acetato. La capa orgánica se combinó y se lavó con ácido cítrico al 5%, agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 3.5 g del compuesto 23-1.
Compuesto 23-2: Se agregó azida de sodio (1.44 g, 22.02 mmol) a una solución del compuesto 23-1 (3.5 g, 7.34 mmol) en 20 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 2 días. La mezcla de reacción se extrajo con etil acetato. La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para proporcionar 2.1 g del compuesto 23-2.
Compuesto 23-3: Se agregaron 400 mg (10%) de Pd-C a una solución del compuesto 23-2 (2.1 g, 6.05 mmol) en 50 mi de MeOH. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente bajo 1 atmosfera de ¾ durante 24 horas. La mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío para proporcionar 2.1 g del compuesto 23-3. MS (ESI) m/z 322[M+H].
Compuesto 23-4: Se agregaron 38 mg de HATU a una solución del compuesto 23-3 (33 mg, 0.102 mmol), el compuesto 12-7 (40 mg, 0.051 mmol) y 54 ml de diisopropiletilamina en 1 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC para proporcionar 52 mg del compuesto 23-4. MS (ESI) m/z 525[M+2H], 1049[M+H].
Compuesto 23-5: El compuesto 23-4 (52 mg, 0.045 mmol) se disolvió en 5 mi de 4N de HCl/dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró al vacío para proporcionar 52 mg (100%) del compuesto 23-5. MS (ESI) m/z 497[M+2H], 993[M+H].
Compuesto 23-6: Se agregaron 32 mg (0.085 mmol) de HATU a una solución del compuesto 19-4 (7.6 mg, 0.017 mmol), el compuesto 23-6 (52 mg, 0.051 mmol) y DIEA (0.030 mi, 0.17 mmol) en 2 mi de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 26 mg (61%) del compuesto 23-6. MS (ESI) m/z 583[M+4H], 777[M+3H], 1165[M+2H].
Compuesto 23: El compuesto 23-6 (26 mg, 0.01 mmol) se disolvió en 1 mi de DMF. Se agregaron 10 ml (0.31 mmol) de hidracina anhidro. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se templó con una solución de 1N de hidrocloruro. La mezcla de reacción se purificó mediante HPLC de preparación, se eluyó con 20-70% de CH3CN/H20 en 20 minutos a 254 nm, para proporcionar 10 mg (40%) del ejemplo 23. MS (ESI) m/z 550 [M+4H], 733[M+3H], 1100[M+2H].
Tabla 3: Estructuras de los Compuestos 1-23 sz oz s - .1 1 - - Ejemplo 24: Transfección Transitoria Se implantó un cultivo de CHO-S a 0.75 x 10A6/ml aproximadamente 16 horas antes de la transfección en el medio FreeStyle Cho. Las células están listas para transfección al siguiente día cuando el conteo de células alcanza 1.4 - 1.6 x 10A6/ml. Cuando las celulas alcanzaron el conteo objetivo, se agregaron 400 mM de pAF de reserva a una concentración de cultivo final de 1.4 mM. El complejo PEI/ADN se preparó como se describe: Se disolvió ADN (1.42 mg/l x 10L6 células) en RPMI (5% (v/v) del volumen total de cultivo), la mezcla de ADN/RPMI se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos, se agregó PEI de reserva (1 mg/ml) a la solución de ADN en una proporción de 3:1 (mi PEl/pg ADN), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. El cultivo se agregó suavemente a la mezcla y se removió. Los matraces se transfieren a una incubadora a 32°C. En el día 6 después de la transfección, se llevó a cabo un inmunoanálisis Western. En el día 7 después de la transfección, se recolectó el sobrenadante.
Ejemplo 25: Estudio de Eficacia In Vivo de CD70-ADC Se probó la eficacia anti tumor del conjugado CD70-2H5-HA119-NCA1 a NCA1 en un modelo de ratón de xenoinjerto de carcinoma de célula renal. Se transfirieron células de carcinoma de célula renal humana 786-0 como fragmento de tumor para 2 pasajes in vivo dentro de ratones atímicos, hembras, de 5 semanas de edad. Los ratones, diez por grupo experimental, se trataron con diferentes dosis de CD70-2H5-HA119-NCA1 en una formulación de 50 mM de histidina, 100 mM de NaCl, 5% de trehalosa, pH 6.0 y se midieron en comparación con el vehículo de prueba de formulación sin ADC mediante inyección intravenosa en la cola en el día uno del estudio. Se pesaron y midieron tridimensionalmente los tumores de los ratones utilizando un calibrador electrónico. El volumen individual del tumor se calculó como la altura x anchura x longitud. Los ratones con tumores vascularizados (determinado por la apariencia de los tumores) de tamaños apropiados se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se dosificaron por peso corporal individual en el Día 33 (tres (3) semanas después de la inyección con células). Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 2.
Tabla 4: Grupos Experimentales para Estudio de Eficacia In Vivo de CD70 Ej emplo 26 : CD70-ADC en Modelo de Linf orna Burkitt Se midió la eficacia anti-tumor del ADC de ARX- OÍCD70 no conjugado y ARX-aCD70 conjugado en el modelo de tumor Daudi (linfoma Burkitt). Se utilizaron ratones hembra atímicos como sujetos experimentales, diez por grupo, y para iniciar, se suministró una única inyección intravenosa en el día 1 a todos los grupos (N = 20). Fueron cinco grupos, 10 de artículo de experimento y 10 de vehículo por grupo, distribuidos aleatoriamente después de una semana.
Se administró una segunda inyección después de 21 días (o cuando lo tumores comenzaron a crecer de nuevo), y los grupos no vehículo se dividieron en grupos iguales de 10 cada uno y se suministró una segunda inyección intravenosa.
Se pesaron y se midieron tridimensionalmente los tumores de los ratones utilizando un calibrador electrónico.
El volumen individual del tumor se calcula como la altura x anchura x longitud. Los ratones con tumores vascularizados (determinado por la apariencia de los tumores) de tamaños apropiados se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se dosificaron por peso corporal individual en el Día 33 (tres (3) semanas después de la inyección con células).
Ejemplo 27: Estudio de Citotoxicidad de 96 horas para CD70-2H5-HA119-NCA1 en 786-0 Se comparó la citotoxicidad de los conjugados de anticuerpo-fármaco ARX-aCD70 con dolastatina en células 786- 0. Se midió la IC50 y los resultados de este experimento se muestran en la Figura 3A.
Ejemplo 28: Estudio de Citotoxicidad de 96 horas de CD70-2H5-HA119-NCA1 en Caki-1 Se comparó la citotoxicidad de los conjugados de anticuerpo-fármaco ARX-aCD70 con dolastatina en células Caki- 1. Se midió la IC50 y los resultados se este experimento se muestran en la Figura 3B.
Ejemplo 29: Actividad Anti-tumor de tres CD70-AS269 en el modelo de xenoinjerto de cáncer de hígado en 786-0.
Se utilizó el modelo de tumor de carcinoma de célula renal 786-0 en ratones hembra atímicos. Se suministraron a diez grupos de diez ratones cada uno fragmentos de tumor 786-0 y después se distribuyeron aleatoriamente después de una semana y media cuando los tumores crecieron entre 100 y 300 mm3. Los grupos, uno para cada nivel de dosis y uno para el vehículo, se trataron de la siguiente forma: - Vehículo, - CD70-2H5-HA119-NCAl-IgGlvl a 0.5, 1 y 3 mg/kg - CD70-7F2-HA119-NCAl-IgGlvl a 0.5, 1 y 3 mg/kg - CD70-8A1-HA122-NCAl-IgGlvl a 0.5, 1 y 3 mg/kg Se suministró de forma intravenosa una inyección de dosis única a los 100 ratones en el día 12 después del trasplante, y los resultados de estos experimentos incluyen los datos proporcionados en las Figuras 4-6C.
Ejemplo 30: Prueba Clínica Humana del CD70-2H5- HA119-NCA1 para oncología.
Prueba Clínica Humana de la Seguridad y/o Eficacia del CD70-2H5-HA119-NCAl para Oncología.
Objetivo: Comparar la seguridad y farmacocinética de la composición administrada que comprende el derivado de dolastatina enlazado a ARX-aCD70.
Diseño del Estudio: Este estudio será un estudio de Fase I, de centro único, de etiqueta abierta, de intensificación aleatorizada de dosis seguido de un estudio de Fase II en pacientes con cáncer renal. Los pacientes no deben haberse expuesto al derivado de dolastatina enlazado a aCD70 antes de entrar en el estudio. Los pacientes no deben haber recibido tratamiento para su cáncer dentro de las 2 semanas previas al comienzo de la prueba. Los tratamientos incluyen el uso de quimioterapia, factores de crecimiento hematopoyéticos, y terapia biológica tal como anticuerpos monoclonales. Los pacientes deben haberse recuperado de toda toxicidad (para calificar 0 o 1) asociada con tratamientos anteriores. Se evalúa a todos los sujetos por seguridad y todas las recolecciones de sangre para el análisis de farmacocinética se recolectan como se programó. Todos los estudios se llevan a cabo con la aprobación del comité institucional de ética y el consentimiento del paciente.
Fase I: Los pacientes reciben i.v. el CD70-2H5-HA119-NCA1 en los días 1, 8, y 15 de cada ciclo de 28 días. Las dosis del CD70-2H5-HA119-NCA1 pueden mantenerse o modificarse por toxicidad en base a las evaluaciones como se subraya más adelante. El tratamiento se repite cada 28 días en ausencia de toxicidad inaceptable. Cohortes de 3 a 6 pacientes reciben dosis escaladas del CD70-2H5-HA119-NCA1 hasta determinar la dosis máxima tolerada (MTD del CD70-2H5-HA119-NCA1. La MTD se define como la dosis que precede a aquella en la que 2 de 3 o 2 de 6 pacientes experimentan toxicidad limitante de dosis. Las toxicidades limitantes de dosis se determinan de acuerdo con las definiciones y estándares establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) Terminología Común para Eventos Adversos (CTCAE) Versión 3.0 (Agosto 9, 2006).
Fase II: Los pacientes reciben el CD70-2H5-HA119-NCA1 como en la fase I en la MTD determinada en la fase I. El tratamiento se repite cada 4 semanas durante 2 a 6 cursos en ausencia de progreso de la enfermedad o toxicidad inaceptable. Después de completar 2 cursos de la terapia de estudio, los pacientes que logran una respuesta completa o parcial pueden recibir 4 cursos adicionales. Los pacientes que mantienen la enfermedad estable durante más de 2 meses después de completar los 6 cursos de la terapia de estudio pueden recibir otros 6 cursos adicionales en el momento del progreso de la enfermedad, siempre que cumplan con el criterio original de elegibilidad.
Muestras de sangre: Se extrae sangre en serie mediante punción directa en vena antes y después de la administración del CD70-2H5-HA119-NCA1. Las muestras de sangre venosa (5 mi) para la determinación de concentraciones en suero se obtienen aproximadamente 10 minutos antes de la dosificación y aproximadamente en los momentos siguientes a la dosis: días 1, 8, y 15. Cada muestra de suero se divide en dos alícuotas. Todas las muestras de suero se almacenan a -20°C. Las muestras de suero se envían sobre hielo seco.
Farmacocinética: Los pacientes experimentan una recolección de muestras de plasma/suero para evaluación farmacocinética antes de comenzar el tratamiento en los días 1, 8, y 15. Los parámetros de farmacocinética se calculan mediante métodos de modelo independiente en un sistema computarizado VAX 8600 de Digital Equipment Corporation utilizando la versión más reciente del software BIOAVL. Se determinan los siguientes parámetros de farmacocinética: máxima concentración en suero (Cmax); tiempo para alcanzar la máxima concentración en suero (tmax); área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC) desde el tiempo cero al tiempo de la última muestra de sangre (AUC0-72) calculada utilizando una regla de línea trapezoidal; y vida media de eliminación terminal (ti/2), computada a partir de la constante de la tasa de eliminación. La constante de la tasa de eliminación se estima mediante la regresión lineal de puntos de datos consecutivos en la región lineal terminal del trazo de concentración-tiempo log-lineal. La desviación promedio estándar (SD), y el coeficiente de variación (CV) de los parámetros de farmacocinética se calculan para cada tratamiento. Se calcula la proporción promedio del parámetro (formulación preservada/formulación no preservada).
Respuesta del Paciente a la terapia de combinación: La respuesta del paciente se evalúa mediante visualización con rayos X, escaneo CT, y MRI, y la visualización se lleva a cabo antes de comenzar el estudio y al final del primer ciclo llevando a cabo una visualización adicional cada cuatro semanas o al final de los ciclos subsecuentes. Las modalidades de visualización se seleccionan en base al tipo de cáncer y a la viabilidad/disponibilidad, y la misma modalidad de visualización se utiliza para tipos de cáncer similares así como a lo largo del curso del estudio de cada paciente. Las tasas de respuesta se determinan utilizando el criterio RECIST. (Therasse et al. J. Nati. Cáncer Inst.2000 febrero 2; 92(3):205-16; http://ctep.cancer.gov/forms/TherasseRECISTJNCI.pdf). Los pacientes experimentan también a biopsia de cáncer/tumor para evaluar los cambios en el fenotipo de la célula de cáncer progenitora y el crecimiento clonogénico mediante citometría de flujo, inmunoanálisis Western, e IHC, y para cambios en la citogenética mediante FISH. Después de terminar el tratamiento de estudio, se realiza un seguimiento periódico de los pacientes durante 4 semanas.
Análisis Adicionales Por Actividades Citotóxicas, Citostáticas e Inmuno-Moduladoras Se conocen métodos para determinar si un anticuerpo media la función de efector contra una célula objetivo. Los ejemplos ilustrativos no limitantes de tales métodos se describen en la presente.
Para determinar si un anticuerpo anti-CD70 o su derivado media la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo contra células inmunes activadas o células cancerosas que expresan CD70, puede utilizarse un análisis que mide la muerte de la célula objetivo en presencia del anticuerpo y células inmunes al efector. Un análisis utilizado para medir este tipo de citotoxicidad puede basarse en la determinación de la liberación de 51Cr de células objetivo metabólicamente etiquetadas después de la incubación en presencia de células efector y anticuerpo específico del objetivo (ver, e.g., Perussia y Loza, 2000, Methods in Molecular Biology (Métodos en biología molecular) 121:179-92; y "51Cr Release Assay of Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) " (Análisis de liberación de 51Cr de citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo) en Current Potocols in Immunology (Protocolos actuales en inmunología), Coligan et al. eds., Wilcyand Sons, 1993). Por ejemplo, las células inmunes activadas (e.g., linfocitos activados) o las células cancerosas que expresan CD70 etiquetadas con Na2 51Cr04 se colocan en placas a una densidad de 5,000 células por pozo de una placa de 96 pozos y pueden tratarse con concentraciones variables de anticuerpo anti-CD70 durante 30 minutos, después se mezclan con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) normales durante 4 horas. El rompimiento de membrana que acompaña la muerte de la célula objetivo libera 51Cr hacia el sobrenadante del cultivo que puede recolectarse y evaluarse por radiactividad como una medición de la actividad citotóxica. Otros análisis para medir la ADCC pueden implicar etiquetas no radiactivas o basarse en la liberación inducida de las enzimas específicas. Por ejemplo, un análisis no radiactivo en base a fluorometría disuelta por tiempo se encuentra comercialmente disponible (Delphia, Perkin Elmer). Este análisis se basa en cargar las células objetivo con acetoximetil áster de fluorescencia aumentando el ligando (BATDA) que penetra la membrana celular y después se hidroliza para formar un ligando hidrófilo impermeable a la membrana (TDA). Cuando se mezcla con anticuerpo específico del objetivo y células efector PBMC, el TDA se libera de las células U sadas y se encuentra disponible para formar un quelado altamente fluorescente cuando se mezcla con europio. La señal, medida con un fluorómetro disuelto por tiempo se correlaciona con la cantidad de lisis celular.
Para determinar si el anticuerpo anti-CD70 o su derivado media la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo contra células inmunes activadas o células cancerosas que expresan CD70, puede utilizarse un análisis que mide la internalización de la célula objetivo mediante células efector inmunes (e.g., macrófagos recién cultivados o una línea celular tipo macrófago establecida) (ver, e.g., Munn y Cheung, 1990, J. Exp. Med. 172:231-37; Keler et al., 2000, J. Immunol.164:5746-52; Akewanlop et al., 2001, Cáncer Res. 61:4061-65). Por ejemplo las células objetivo pueden etiquetarse con un tinte de membrana lipófila tal como PKH67 (Sigma), recubierto con un anticuerpo específico del objetivo, y mezclarse con células efector inmunes durante 4 a 24 horas. Las células efector pueden identificarse entonces mediante contra-manchado con un anticuerpo etiquetado con fluorocromo específico para un marcador de superficie celular fagocítico (e.g., CD14) y las células se analizan por medio de citometría de flujo bicolor o microscopía de fluorescencia. Las células positivas dobles representan las células efector que tienen células objetivo internalizadas. Para estos análisis, las células efector pueden ser monocitos derivados de PBMC que se han diferenciado en macrófagos mediante el cultivo durante 5 a 10 días con M-CSF o GM-CSF (ver, e.g., Munn y Cheung, supra). Las líneas celulares humanas tipo macrófago U937 (Larrick et al., 1980, J. Immunology (Inmunología) 125:6-12) o THP-1 (Tsuchiya et al., 1980, Int. J. Cáncer 26:171-76) que se encuentran disponibles del ATCC pueden utilizarse como una fuente alternativa de células fagocíticas.
También se conocen métodos para determinar si un anticuerpo media la citotoxicidad dependiente del complemento al enlazarse a células objetivo. Los mismos métodos pueden aplicarse para determinar si un agente de enlace a CD70 media la CDC en células inmunes activadas o en células cancerosas que expresan CD70. Ejemplos ilustrativos de tales métodos se describen más adelante, La fuente del complemento activo puede ser suero humano normal o purificado de animales de laboratorio incluyendo conejos. En un análisis estándar, un agente de enlace a CD70 se incuba con células inmunes activadas que expresan CD70 (e.g., linfocitos activados) o células cancerosas que expresan CD70 en presencia del complemento. La capacidad de tal agente de enlace a CD70 para mediar la lisis celular puede determinarse entonces mediante varias lecturas. En un ejemplo, se utiliza un análisis de liberación de 51Cr04 Nasup. En este análisis, las células objetivo se etiquetan con Na51Cr04. El Na51Cr04 no incorporado se retira y las células se colocan en placas a una densidad adecuada, típicamente entre 5,000 y 50,000 células/pozo, en una placa de 96 pozos. La incubación con el agente de enlace a CD70 en presencia de suero normal o complemento purificado tiene una duración típicamente de 2 a 6 horas a 37 grados C en una atmosfera de CO2 al 5%. La radiactividad liberada, que indica la lisis celular, se determina en un alícuota del sobrenadante de cultivo mediante conteo de rayos gamma. La lisis celular máxima se determina liberando el Na51Cr04 incorporado mediante tratamiento detergente (0.5 a 1% de NP-40 o Tritón X-100). La lisis celular de fondo espontánea se determina en pozos en donde solamente se encuentra presente el complemento sin ningún agente de enlace a CD70. El porcentaje de lisis se calcula como una lisis celular máxima (lisis inducida por el agente de enlace a CD70- lisis espontánea). La segunda lectura es una reducción de los tintes metabólicos, e.g., azul alamar, por las células viables. En este análisis, las células objetivo se incuban con el agente de enlace a CD70 con complemento y se incuban como se describió anteriormente. Al final de la incubación, se agrega un volumen de 1/10 de azul alamar (Biosorce International, Camarillo, California). La incubación continúa durante hasta 16 horas a 37 grados C en una atmosfera de CO2 al 5%. La reducción del azul alamar como indicación de las células viables metabólicamente activas se determina mediante análisis fluorométrico con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. La tercera lectura es la permeabilidad de la membrana celular al yoduro de propidio (PI). La formación de poros en la membrana de plasma como resultado de la activación del complemento facilita la entrada del PI en las células en donde se difundirá hacia los núcleos y se enlazará al ADN. Al enlazarse al ADN, se incrementa significativamente la fluorescencia del PI en los 600 nm. El tratamiento de las células objetivo con el agente de enlace a CD70 y el complemento se lleva a cabo como se describió anteriormente. Al final de la incubación, se agrega PI a una concentración final de 5 mu-g/ml. Después se examina la suspensión celular mediante cito etría de flujo utilizando un láser de 488 nm de argón para la excitación. Las células U sadas se detectan mediante emisión de fluorescencia a 600 nm.
Modelos Animales Adicionales de Trastornos Inmunológicos o Cánceres que Expresan CD70 Los agentes de enlace anti-CD70 de la presente invención, e.g., los anticuerpos o derivados con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados y los ADCs de la invención, pueden probarse o validarse en modelos animales de trastornos inmunológicos o cánceres que expresan CD70. El téenico experto conoce una cantidad de modelos animales establecidos de trastornos inmunológicos o cánceres que expresan CD70, de los cuales cualquiera puede utilizarse para analizar la eficacia del anticuerpo anti-CD70 o derivado. Ejemplos no limitantes de tales modelos se describen más adelante.
Ejemplos de modelos animales de enfermedades autoinmunes específicas del órgano que incluyen diabetes, lupus, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, encefalomielitis autoinmune experimental (esclerosis múltiple), tiroiditis, miastenia gravis, artritis, uveítis, y enfermedad inflamatoria intestinal, se han descrito por Bigazzi, "Animal Models of Autoimmunity: Spontaneous and Induced, " (Modelos animales de autoinmunidad: espontánea e inducida) en The Autoimmune Diseases (Las enfermedades autoinmunes) (Rose and Mackay eds., Academic Press, 1998) y en "Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease, " (Modelos animales para enfermedad autoinmune e inflamatoria) en Current Protocols in Immunology (Protocolos actuales en inmunología) (Coligan et al. eds., Wilcy and Sons, 1997).
Las condiciones alérgicas, e.g., asma y dermatitis, también pueden modelarse en roedores. La hipersensibilidad en vías aéreas puede inducirse en ratones mediante ovalbúmina (Tomkinson et al., 2001, J. Immunol. 166:5792-800) o en antígeno de huevo de esquistosoma mansoni (Tesciuba et al., 2001, J. Immunol.167: 1996-2003). La cepa Nc/Nga de ratones muestra un marcado incremento en IgE en suero y espontáneamente desarrolla lesiones tipo dermatitis atópica (Vestergaard et al., 2000, Mol. Med. Today 6:209-10; Watanabe et al., 1997, Int. Immunol.9:461-66; Saskawa et al., 2001, Int. Arch. Allergy Immunol.126:239-47).
La inyección de linfocitos donantes inmuno-competentes en un huésped histo-incompatible letalmente irradiado es un procedimiento clásico para inducir GVHD en ratones. Alternativamente, el modelo murino B6D2F1 de origen proporciona un sistema para inducir GVHD tanto agudo como crónico. En este modelo los ratones B6D2F1 con la progenie F1 de una cruza entre las cepas de origen de ratones C57BL/6 y/DBA/2. La transferencia de células linfoides de DBA/2 en ratones B6D2F1 no irradiados ocasiona GVHD crónico, mientras la transferencia de células linfoides C57BL/6, C57BL/10 o B10.D2 ocasiona GVHD agudo (Slayback et al., 2000, Bone Marrow Transpl.26:931-938; Kataoka et al., 2001, Immunology 103:310-318).
Adicionalmente, tanto las células madre hematopoyéticas humanas como las células linfoides de sangre periférica maduras pueden injertarse en ratones SCID, y estas células linfo-hematopoyéticas humanas permanecen funcionales en los ratones SCID (McCune et al., 1988, Science (Ciencia) 241:1632-1639; Kamel-Reid y Dick, 1988, Science (Ciencia) 242:1706-1709; Mosier et al., 1988, Nature (Naturaleza) 335:256-259). Esto ha proporcionado un pequeño sistema de modelo animal para la prueba directa de agentes terapéuticos potenciales en células linfoide humanas. (Ver, e.g., Tournoy et al., 2001, J. Immunol.166:6982-6991).
Además, pueden crearse pequeños modelos animales para examinar las eficacias in vivo de los anticuerpos anti-CD70 o sus derivados implantando líneas celulares de tumor humanas que expresan CD70 en cepas de roedor inmunodeficíente apropiadas, e.g., ratones atímicos o ratones SCID. Ejemplos de líneas celulares de linfoma humano que expresan CD70 incluyen, por ejemplo, Daudi (Ghetie et al., 1994, Blood (Sangre) 83:1329-36; Ghetie et al., 1990, Int. J. Cáncer 15:481-85; de Mont et al., 2001, Cáncer Res.61:7654-59), HS-Sultan (Cattan y Maung, 1996, Cáncer Chemother. Pharmacol. 38:548-52; Cattan y Douglas, 1994, Leuk. Res. 18:513-22), Raji (Ochakovskaya et al., 2001, Clin. Cáncer Res.7:1505-10; Breisto et al., 1999 , Cáncer Res. 59:2944-49), y CA46 (Kreitman et al., 1999, Int. J. Cáncer 81:148-55). Un ejemplo no limitante de una línea de linfoma de Hodgkin que expresa CD70 es L428 (Drexler, 1993, Leuk. Lymphoma 9:1-25; Dewan et al., 2005, Cáncer Sci. 96:466-473). Ejemplos no limitantes de líneas celulares de carcinoma de célula renal humana que expresa CD70 incluyen 786-0 (Ananth et al., 1999, Cáncer Res. 59:2210-16; Datta et al., 2001, Cáncer Res. 61:1768-75), ACHN (Hara et al., 2001, J. Urol.166:2491-94; Miyake et al., 2002, J. Urol.167:2203-08), Caki-1 (Prewett et al., 1998, Clin. Cáncer Res. 4:2957-66; Shi y Siemann, 2002, Br. J. Cáncer 87:119-26), y Caki-2 (Zellweger et al., 2001, Neoplasia 3:360-67). Ejemplos no limitantes de líneas celulares de carcinoma nasofaríngeo que expresan CD70 incluyen C15 y C17 (Busson et al., 1988, Int. J. Cáncer 42:599-606; Bernheim et al., 1993, C ncer Genet. Cytogenet. 66:11-5). Ejemplos no limitantes de líneas celulares de glioma humano que expresan CD70 incluyen U373 (Palma et al., 2000, Br. J. Cáncer 82:480-7) y U87MG (Johns et al., 2002, Int. J. Cáncer 98:398-408). Ejemplos no limitantes de líneas celulares de mieloma múltiple incluyen MM.1S (Greenstein et al., 2003, Experimental Hematology 31:271-282) y L363 (Diehl et al., 1978, Blut 36:331-338). (Ver también Drexler y Matsuo, 2000, Leukemia Research 24:681-703). Estas líneas de célula de tumor pueden establecerse en huéspedes roedores inmunodefieientes ya sea como un tumor sólido mediante inyecciones subcutáneas o como tumores diseminados mediante inyecciones intravenosas. Una vez establecidos dentro de un huésped, estos modelos de tumor pueden aplicarse para evaluar las eficacias terapéuticas del anticuerpo anti-CD70 o sus derivados como se describe en la presente al modular el crecimiento del tumor in vivo.
Trastornos asociados con CD70 Los anticuerpos anti-CD70 y los ADCs descritos en la presente son útiles para tratar o prevenir un cáncer que expresa CD70 o un trastorno inmunológico caracterizado por la expresión de CD70 mediante la activación inapropiada de células inmunes (i.e., linfocitos o células dendríticas). Tal expresión de CD70 puede deberse, por ejemplo, a los incrementados niveles de proteína CD70 en la superficie de las células y/o a la alterada antigenicidad del CD70 expresado. El tratamiento o la prevención del trastorno inmunológico, de acuerdo con los métodos descritos en la presente, se logra administrando a un sujeto que necesita tal tratamiento o prevención una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD70 o su derivado, mediante lo cual el anticuerpo o derivado (i) se enlaza a las células inmunes activadas que expresan CD70 y que están asociadas con el estado de enfermedad y (ii) ejerce un efecto citotóxico, citostático o inmunomodulador en las células inmunes activadas. En algunas modalidades, el efecto citotóxico, cistostático o inmunomodulador se ejerce sin conjugación a un agente citotóxico, citostático o inmunomodulador. En algunas modalidades, el efecto citotóxico, cistostático o inmunomodulador se ejerce mediante la conjugación a un agente citotóxico, cistostático o inmunomodulador.
Las enfermedades inmunológicas que se caracterizan por la activación inapropiada de las células inmunes y que pueden tratarse o prevenirse mediante los métodos descritos en la presente pueden clasificarse, por ejemplo, por el(los) tipo(s) de reacción(es) de hipersensibilidad que subyacen al trastorno. Estas reacciones se clasifican típicamente en cuatro tipos: reacciones anafilácticas, reacciones citotóxicas (citolíticas), reacciones del complejo inmune, o reacciones de inmunidad mediadas por la célula (CMI) (también referidas como reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (Ver e.g., Fundamental Immunology (Inmunología fundamental) (William E. Paul ed., Raven Press 3a ed.1993).
Ejemplos específicos de tales enfermedades inmunológicas incluyen las siguientes: artritis reumatoide, artritis psoriática, enfermedades desmielinantes autoinmunes (e.g., esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, lupus eritematoso sistémico, miastenia gravis, enfermedad de Grave, glomerulonefritis, trastorno hepatológico autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal (e.g., enfermedad de Crohn), anafilaxis, reacción alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus tipo I, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, polimiositis, dermato iositis, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, uveítis autoinmune, enfermedad de Addison, adrenalitis, tiroiditis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad tiroidea autoinmune, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, ateroesclerosis, lupus eritematoso cutáneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, penfigus vulgaris, penfigus, dermatitis herpetiforme, alopecia arcata, penfigoide, escleroderma, esclerosis sistémica progresiva, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, inmovilidad esofágica, esclerodáctil), y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, espondilitis anquilosante, colitis ulcerativa, enfermedad de tejido conectivo mixto, poliarteritis nodosa, vascultis sistémica necrotizante, dermatitis atópica, rinitis tópica, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Chagas, sarcoidosis, fiebre reumática, asma, aborto recurrente, síndrome anti-fosfolípidos, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome post cardiotomía, síndrome de Cushing, hepatitis activa crónica autoinmune, pulmón de observador de aves, necrolisis tóxica epidérmica, síndrome de Alport, alveolitis, alveolitis alérgica, alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, reacción a transfusión, arteritis de Takayasu, polimialgia reumática, arteritis temporal, esquistosomiasis, arteritis de célula gigante, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, eczema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Behcet, síndrome de Caplan, enfermedad de Kawasaki, dengue, encefalomielitis, endocarditis, fibrosis endomiocardial, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, psoriasis, eritroblastosis fetalis, faciitis eosinófila, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, cielitis, ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, ciclitis de Fuch, nefropatía IgA, púrpura Henoch-Schonlein, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo al trasplante, cardiomiopatía, síndrome Eaton-Lambert, policondritis recurrente, crioglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, síndrome de Evan, y falla gonadal autoinmune.
Por consiguiente, los métodos descritos en la presente abarcan el tratamiento de enfermedades de linfocitos B (e.g., lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide, y diabetes Tipo I), linfocitos Thl (e.g., artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, tuberculosis, o enfermedad de injerto contra huésped), o linfocitos Th2 (e.g., dermatitis atópica, lupus eritematoso sistémico, asma atópica, rino-conjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica, o enfermedad crónica de injerto contra huésped). En general, los trastornos que implican células dendríticas implican trastornos de linfocitos Thi p linfocitos Th2.
En algunas modalidades, el trastorno inmunológico es un trastorno mediado por la célula T, tal como un trastorno de célula T en el cual las células T activadas asociadas con el trastorno expresan CD70. Pueden administrarse agentes de enlace anti-CD70 (e.g., anticuerpo o derivados) para agotar tales células T activadas que expresan CD70. En una modalidad específica, la administración de anticuerpos anti-CD70 o sus derivados puede agotar las células T activadas que expresan CD70, mientras las células T en reposo no se agotan sustancialmente por el anti-CD70 o derivado. En este contexto, "no se agotan sustancialmente" significa que menos de aproximadamente el 60% o menos de aproximadamente el 70% o menos de aproximadamente el 80% de las células T en reposo no se agota.
Los anticuerpos anti-CD70 y los ADCs descritos en la presente también son útiles para tratar o prevenir un cáncer que expresa CD70. El tratamiento o la prevención de un cáncer que expresa CD70, de acuerdo con los metodos descritos en la presente, se logra administrando a un sujeto que necesita tal tratamiento o prevención una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD70 o derivado, mediante lo cual el anticuerpo o derivado (i) se enlaza a células cancerosas que expresan CD70 y (ii) ejerce un efecto citotóxico o citostático para agotar o inhibir la proliferación de las células cancerosas que expresan CD70. En algunas modalidades, el efecto citotóxico, cistostático o inmunomodulador se ejerce sin conjugación a un agente citotóxico, citostático o inmunomodulador. En algunas modalidades, el efecto citotóxico, cistostático o inmunomodulador se ejerce mediante la conjugación a un agente citotóxico, cistostático o inmunomodulador.
Los cánceres que expresan CD70 que pueden tratarse o prevenirse mediante los métodos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, diferentes subtipos de linfoma no de Hodgkin (NHLs indolentes, NHLs foliculares, linfornas linfocíticos pequeños, NHLs linfoplasmacíticos, o NHLs de zona marginal); enfermedad de Hodgkin (e.g., células Reed-Sternberg); cánceres del linaje de la célula B, incluyendo, e.g., linfomas de célula B grande difusa, linfomas foliculares, linfoma de Burkitt, linfomas de célula de manto, leucemias linfocíticas de célula B (e.g., leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica); linfomas de celula B positivas al virus Epstein Barr; carcinomas de célula renal (e.g., célula transparente y papilar); carcinomas nasofaríngeos; carcinomas tímicos; gliomas; glioblastomas; neuroblastomas; astrocitomas; meningiomas; macroglobulinemia Waldenstrom; mielo as múltiples; y carcinomas de colon, estómago y recto. El cáncer puede ser, por ejemplo, recientemente diagnosticado, pre-tratado o refractario o recurrente. En algunas modalidades, el cáncer que expresa CD70 tiene al menos aproximadamente 15,000, al menos aproximadamente 10,000 o al menos aproximadamente 5,000 moléculas/células CD70.
Con respecto a los regímenes terapéuticos para administración en combinación de anticuerpos anti-CD70 conjugados o no conjugados de la presente invención, en una modalidad específica, se administra un agente de enlace anti-CD70 concurrentemente con un agente terapéutico. En otra modalidad específica, el anticuerpo anti-CD70 se conjuga a un agente terapéutico. En algunas modalidades, se monitorea al sujeto después de la administración del agente de enlace anti-CD70 y opcionalmente el agente terapéutico.
El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, cualquier agente que ejerce un efecto terapéutico en células cancerosas o en células inmunes activadas. Típicamente, el agente terapéutico es un agente citotóxico o inmunomodulador.
Tal administración en combinación puede tener un efecto aditivo o sinergico en los parámetros de la enfermedad (e.g., severidad de un síntoma, el número de síntomas o la frecuencia de recurrencia).
Las clases útiles de agentes citotóxicos o inmuno-moduladores incluyen, por ejemplo, agentes anti-túbulina, auristatinas, aglutinantes de ranura menor de ADN, inhibidores de replicación de ADN, agentes de alquilación, (e.g., complejos de platino tales como cis-platina, mono (platino), bis(platino), complejos de platino tri-nucleares y carboplatina), antracielinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicina, etoposidas, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinóles, compuestos de pre formación, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiación, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, vinca alcaloides y lo similar.
Los agentes citotóxicos o inmuno-moduladores individuales incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucil, cisplatina, colquicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinosida, citocalasina B, dacarbacina, dactinomicina (actinomicina), daunorubicina, decarbacina, docetaxel, doxorubicina, un estrógeno, 5-fluordeoxiuridina, 5-fluoroacilo, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbicina, rapamicina (Sirolimus), estreptozotocina, tenoposida, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecan, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.
En algunas modalidades típicas, el agente terapéutico es un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, dolastatinas (e.g., auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), enlazadores de ranura menor de ADN (e.g., enediínas y lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (e.g., paclitaxel, y docetaxel), puromicinas, vinca alcaloides, CC-1065, SN-38, topotecan, morfolino-doxorubicina, rizocina, cianomorfolino-doxorubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, croptofisinas, cemadotin, maintansinoides, discodermolida, eleuterobina y mitoxantrona.
En algunas modalidades, el agente citotóxico es un quimioterapéutico convencional tal como, por ejemplo, doxorubicina, paclitaxel, melfalan, vinca alcaloides, metotrexato, mitomicina C o etoposida. En algunas modalidades, el agente terapéutico puede ser una terapia combinada, tal como CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina. prednisolona y vincristina), CHOP-R (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisolona y rituximab) o ABVD (doxorubicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina). Los agentes tales como los análogos CC-1065, caliqueamicina, maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina y palitoxina pueden enlazarse a los anticuerpos anti-CD70 o sus derivados.
En modalidades específicas, el agente citotóxico o cistostático es auristatina E (tambien conocido en la téenica como dolastatina-10) o su derivado. Típicamente, el derivado de auristatina E es, e.g., un éster formado entre auristatina E y ceto ácido. Por ejemplo, auristatina E puede hacerse reaccionar con ácido paraacetil benzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados típicos de auristatina incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y la estructura de auristatina E y sus derivados se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U. Nos.20030083263 y 20050009751), la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US03/24209, la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US02/13435, y las Patentes de E.U. Nos. 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; y 4,486,414.
En modalidades específicas, el agente citotóxico es un agente de enlace de ranura menor de ADN, (ver e.g.. Patente de E.U. No. 6,130,237). Por ejemplo, en algunas modalidades, el agente de enlace de ranura menor es un compuesto CBI. En otras modalidades, el agente de enlace de ranura menor es una enediína (e.g., caliqueamicina). Ejemplos de agentes anti-tubulina incluyen, pero no se limitan a, taxanos (e.g., Taxol.RTM (paclitaxel), Taxotere.RTM (docetaxel)), T67 (tularik), vinca alcaloides (e.g., vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina), y dolastatinas (e.g., auristatina E, AFP, MMAF, AEB, AEVB). Otros agentes anti-tubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxano (e.g., epotilona A y B), nocodazol, colquicina y colcimida, estramustina, criptroficinas, cemadotin, maitansinoides, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina.
En algunas modalidades, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes anti-tubulina. Por ejemplo, en modalidades específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen Inc.; ver tambien Chari et al., 1992, Cáncer Res. 52:127-131). En algunas modalidades, el agente terapéutico no es un radioisótopo. En algunas modalidades, el agente terapéutico no es ricina ni saporina. En ciertas modalidades, el agente terapéutico es un agente anti-VEGF, tal como AVASTIN (bevacizumab) o NEXAVAR (sorafenib); un bloqueador PDGF tal como SUTENT (sunitinib malato); o un inhibidor de cinasa, tal como NEXAVAR (sorafenib tosilato). En algunas modalidades, el agente citotóxico o inmuno-modulador es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de purina (e.g., azotioprina o mofetil micofenolato), un inhibidor de dihidrofolato reductasa (e.g., metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, citidina arabinosida, amantadina, dideoxiuridina, yododeoxiuridina, poscarnet, o trifluridina.
En otras modalidades, el agente citotóxico o inmuno-modulador es tacrolimus, ciclosporina o rapamicina. En modalidades adicionales, el agente citotóxico es aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoina, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido de arsénico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoyetina alfa, Denileucina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirubicina, Epoyetina alfa, estramustina, exemestano, Filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, goserelina, idarubicina, ifosfamida, imatinib mesilato, interferón alfa-2a, irinotecan, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina o gas de nitrógeno, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsalen, mitomicina C, mitotano, fenpropionato de nandrolona, oprelvecina, oxaliplatina, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pentostatina, pipobroman, plicamicina porfímero sodio, procarbazina, quinacrina, rasburicasa Sargramostim, estreptozocina, tamoxifen, temozolomida teniposida, testolactona, tioguanina, toremifeno Tositumomab, Trastuzumab, tretinoina, gas de uracilo, valrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina o zoledronato.
En modalidades adicionales, el agente terapeutico es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal anti HER2 humanizado, RITUXAN (rituximab; Genentech; un anticuerpo monoclonal anti CD20 quimérico); OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; un anticuerpo IgG2a murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; un anticuerpo anti-EGFR IgG quimérico); Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD; Campath I/H (Leukosite, MA; un anticuerpo IgGl humanizado); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-CD33 IgG humanizado); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; un anticuerpo anti-CD22 IgG humanizado); Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclone, Inc., CA; un anticuerpo anti-HLA-DrlO murino radioetiquetado); Allomune (BioTransplant, CA; un mAb anti-CD2 humanizado); Avastin (Genentech, Inc., CA; un anticuerpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ y Amgen, CA; un anticuerpo anti-CD22); CEAcide (Immunomedics, NJ; un anticuerpo anti-CEA humanizado); o un anticuerpo anti-CD40 (e.g., como se describe en la Patente de E.U. No. 6,838,261).
Otros anticuerpos adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra los siguientes antígenos: CAI25, CAI5-3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis lambda. alfa fetoproteína, CA 242, alcalina fosfatasa de placenta, antígeno de membrana específico de próstata, fosfatasa de ácido prostático, factor de crecimiento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor de anti-transferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gplOO, MARTI, antígeno específico de próstata, receptor IL-2, CD20, CD52, CD30, CD33, CD22, gonadotropina coriónica humana, CD38, CD40, mucina, P21, MPG, y producto oncógeno Neu.
En algunas modalidades, el agente terapéutico es un agente inmuno-modulador. El agente inmuno-modulador puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, REVLIMID (lenalidomida), ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato mofetil o metotrexato. Alternativamente, el agente inmuno-modulador puede ser, por ejemplo, a glucocorticoide (e.g., cortisol o aldosterona) o un análogo de glucocorticoide (e.g., prednisona o dexametasona).
En algunas modalidades típicas, el agente inmuno-modulador es un agente anti-inflamatorio, tal como derivados arilcarboxílíeos, derivados que contienen pirazol, derivados de oxicam y derivados de ácido nicotínico. Las clases de agentes anti-inflamatorios incluyen, por ejemplo, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de 5-lipoxigenasa, y antagonistas del receptor de leucotrieno. En algunas modalidades, el agente inmuno-modulador es una citocina, tal como G-CSF, GM-CSF o IL-2. Los inhibidores de ciclooxigenasa adecuados incluyen ácido meclofenámico, ácido mefenámico, carprofeno, diclofenaco, diflunisal, fenbufen, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetina, y ácido acetilsalicílico.
Los inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores de reducción/oxidación (e.g., derivados de butano, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), masoprocol, fenidona, Ianopaleno, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquilhidroxilamina), e inhibidores no de reducción/oxidación (e.g., hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos y sus derivados, metoxitetrahidropirano, ácidos boswéllicos y derivados acetilados de ácidos boswéllicos, y ácidos quinolinametoxifenilacéticos substituidos con radicales cicloalquilo), y precursores de inhibidores de reducción/oxidación.
Otros inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen antioxidantes (e.g., fenoles, propil galato. flavonoides y/o sustratos de origen natural que contienen flavonoides, derivados hidroxiladosa de las flavonas, flavonol, dihidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de calcona, 4,2',4'-trihidroxicalcona, orto-aminofenoles, N-hidroxiureas, benzofuranoles, ebselen y especies que incrementan la actividad de las selenoenzimas de reducción), agentes quelantes de hierro (e.g., ácidos hidroxámicos y sus derivados, N-hidroxiureas, 2-bencil-1-naftol, catecoles, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfasalazina, zyleuton, ácido 5-hidroxiantranílico y ácidos 4-(omega-arilalquil)fenilalcanoicos), compuestos que contienen imidazol (e.g., cetoconazol e itraconazol), fenotiazinas, y derivados de benzopirano.
Aún otros inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores de eicosanoides (e.g., ácidos octadecatetraenoico, eicosatetraenoico, docosapentaenoico, eicosahexaenoico y docosahexaenoico y sus ásteres, PGE1 (prostaglandina El), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, ácidos 15-monohidroxieicosatetraenoico, 15-monohidroxi-eicosatrienoico y 15-monohidroxieicosapentaenoico, y leucotrienos B5, C5 y D5), compuestos que interfieren con los flujos de calcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamil, fuscosida, curcumina, ácido clorogénico, ácido caféico, ácido 5,8,11,14-eicosatetrayenoico (ETYA), hidroxifenilretinamida, Ionapalen, esculina. dietilcarbamazina, fenantrolina, baicalcina, proxicromil, tioéteres, dialil sulfuro y di-(1-propenil) sulfuro.
Los antagonistas del receptor de leucotrieno incluyen calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products Way 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck and Co. MK-591, Merck and Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKline Beecham SKand F-104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 y Teijin TEI-1338.
La invención como se describe en los ejemplos no pretende limitar el alcance de la invención. Las líneas celulares descritas en los siguientes ejemplos se mantuvieron en cultivo de acuerdo con las condiciones especificadas por la American type Culture Collection (ATCC) o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania (D SZ), o como se conozcan de otra manera. Los reactivos del cultivo celular se obtuvieron de Invitrogen Corp., Carlsbad, California. La presente invención no debe limitarse en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las descritas en la presente se harán aparentes para los expertos en la téenica a partir de la descripción anterior y las figuras anexas. Tales modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un compuesto que comprende la Fórmula o en donde A es y cuando se encuentra presente es alquileno alquileno inferior cicloalquileno cicloalquileno inferior alquenileno alquenileno inferior heteroalquileno heteroalquileno heterocicloalquileno heterocicloalquileno inferior arileno heteroarileno alcarileno o aralquileno B es y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno alquileno inferior alquenileno alquenileno inferior heteroalquileno heteroalquileno inferior o alquileno o alquileno en donde es o o alquileno o alquileno o alquileno o alquileno o alquileno CSN o alquileno o alquileno y en donde cada es independientemente o alquilo R es alquilo o cicloalquilo Ri es un grupo de protección al menos un polipéptido o R2 es un grupo de protección al menos un polipéptido o R3 y R4 son cada uno independientemente alquilo o alquilo inferior o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un Z tiene la estructura R5 es H alquilo C o tiazol R8 es R6 es OH o Ar es fenilo o R7 es alquilo o L es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de y W tiene la estructura U tiene la estructura cada y son independientemente enteros mayores que o iguales a o un metabolito o un profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del El compuesto de la reivindicación en donde Ri es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo comprende uno o más aminoácidos no naturalmente El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo aCD70 comprende al menos uno y no más de diez aminoácidos no naturalmente El compuesto de la reivindicación en donde R2 es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo aCD70 comprende uno o más aminoácidos no naturalmente El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo OÍCD70 comprende al menos uno y no más de diez aminoácidos no naturalmente El o sal del que comprende la Fórmula o Q Me M Mee R7 O Me OMe O Me Me MeO 1 o en donde A es y cuando se encuentra presente es alquileno alquileno inferior cicloalquileno cicloalquileno inferior alquenileno alquenileno inferior heteroalquileno heteroalquileno heterocicloalquileno heterocicloalquileno inferior arileno heteroarileno alcarileno o aralquileno B es y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno alquileno inferior alquenileno alquenileno inferior heteroalquileno heteroalquileno inferior o alquileno o alquileno en donde k es o o alquileno o alquileno o alquileno o alquileno o alquileno CSN o alquileno o alquileno y en donde cada es independientemente o alquilo R es alquilo o cicloalquilo Ri es un grupo de protección al menos un o R2 es un grupo de protección al menos un o y R4 son cada uno independientemente alquilo o alquilo inferior o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un Z tiene la estructura R5 es alquilo o R6 es OH o Ar es fenilo o R7 es alquilo o y son cada uno enlazadores seleccionados independientemente del grupo que consiste de un y W tiene la estructura y cada n y son independientemente enteros mayores que o iguales a El compuesto de la reivindicación en donde Ri es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo El compuesto de la reivindicación en donde R2 es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo Un método para derivatizar un análogo de dolastatina que comprende la Fórmula o comprendiendo el método poner en contacto el análogo de dolastatina con un reactivo de la Fórmula en donde la Fórmula o corresponde en donde Z tiene la estructura de R5 es alquilo o es OH o R6 es OH o Ar es fenilo o R7 es alquilo o Y es o Ll L2 L3 y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un y y W tiene la estructura cada J y tienen independientemente la estructura o L se encuentra Y es R5 es y Rs es y cada y son independientemente enteros mayores que o iguales a en donde la Fórmula corresponde en A es y cuando se encuentra presente es alquileno alquileno inferior alquenileno alquenileno inferior arileno heteroarileno alcarileno o aralquileno B es y cuando se encuentra presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno alquileno inferior alquenileno alquenileno inferior o alquileno o alquileno en donde k es o o alquileno o alquileno o alquileno o alquileno o alquileno CSN o alquileno o alquileno N y en donde cada es independientemente o alquilo cada es independientemente o alquilo R es alquilo o cicloalquilo Ri es un grupo de protección al menos un o R2 es un grupo de protección al menos un o y y R4 son cada uno independientemente alquilo o alquilo inferior o y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un El de la reivindicación en donde el análogo de dolastatina derivatizado comprende al menos una oxima que contiene un aminoácido que tiene la estructura de la Fórmula o I I I i El de la reivindicación en donde el análogo de dolastatina se conecta con el reactivo de la Fórmula en solución acuosa bajo condiciones modaradamente Un compuesto que comprende la Fórmula O i i I en donde Z tiene la estructura de R5 es alquilo o R6 es OH o Ar es fenilo o es un grupo de protección al menos un o R2 es un grupo de protección al menos un o R4 es alquilo o alquilo inferior R7 es alquilo o L3 y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un y W tiene la estructura U tiene la estructura cada n y son independientemente enteros mayores que o iguales a y cada RI6 se selecciona independientemente del grupo que consiste de y alquilo El compuesto de la reivindicación en donde Ri es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo El compuesto de la reivindicación en donde R2 es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo Un compuesto que comprende la Fórmula O en donde Z tiene la estructura R5 es alquilo C tiazol R6 es OH o Ar es fenilo o es un grupo de protección al menos un o R2 es un grupo de protección al menos un o R4 es alquilo o alquilo inferior R7 es alquilo o y L4 son cada uno enlazadores seleccionados del grupo que consiste de un y cada J y tienen independientemente la estructura de cada n y son independientemente enteros mayores que o iguales a D tiene la estructura I cada R17 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo alquenilo alquinilo alcoxi alquilalcoxi óxido de óxido de polialquileno arilo heteroarilo alcarilo aralquilo o alquileno o alquileno o alquileno o arilo O en donde cada es independientemente alquilo alquenilo alcoxi arilo alcarilo o aralquilo cada Z es un enlace CR17R17 O S S o cada es o alquilo cada Z2 se selecciona del grupo que consiste de un alquileno opcionalmente alquenileno opcionalmente y heteroalquilo opcionalmente cada Z3 se selecciona independientemente del grupo que consiste de un alquileno opcionalmente alquenileno opcionalmente heteroalquilo opcionalmente y cada T3 es un o con la salvedad de que cuando T3 es o no puede ser cada es alquilo o cicloalquilo m y p son siempre que al menos uno de m o p no sea 0 en donde indica el enlace al grupo B y indica el enlace a las posiciones respectivas dentro de1 grupo en donde indica el enlace al grupo B y indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo en donde indica el enlace al grupo B y indica el enlace a las posiciones respectivas dentro del grupo cada RÍ9 se selecciona independientemente del grupo que consiste de alquilo alcoxi alquil aril aril alquil alquil ácido alquil alquil sulfonil alquil y q es 10 u y cada RI6 se selecciona independientemente del grupo que consiste de y alquilo El compuesto de la reivindicación en donde es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo El compuesto de la reivindicación en donde R2 es un El compuesto de la reivindicación en donde el polipéptido es un El compuesto de la reivindicación en donde el anticuerpo es un anticuerpo El compuesto de la reivindicación que comprende la Fórmula Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o 22 a 36 y un excipiente o aglutinante farmacéuticamente RESUMEN Esta invención se refiere a anticuerpos y a conjugados de anticuerpo fármaco que comprenden al menos un aminoácido codificado de manera no Se describen en la presente anticuerpos con uno o más aminoácidos codificados de manera no natural y además se describen conjugados de anticuerpo fármaco en donde los anticuerpos de la invención se conjugan a una o más Además se describen métodos para utilizar tales conjugados de anticuerpo fármaco de aminoácidos no incluyendo usos de y otros de insufficientOCRQuality
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