TW201837051A - 包含藥物動力學增強劑之經修飾之鬆弛素(relaxin)多肽及其用途 - Google Patents

包含藥物動力學增強劑之經修飾之鬆弛素(relaxin)多肽及其用途 Download PDF

Info

Publication number
TW201837051A
TW201837051A TW107104489A TW107104489A TW201837051A TW 201837051 A TW201837051 A TW 201837051A TW 107104489 A TW107104489 A TW 107104489A TW 107104489 A TW107104489 A TW 107104489A TW 201837051 A TW201837051 A TW 201837051A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
relaxin
polypeptide
glu
modified relaxin
Prior art date
Application number
TW107104489A
Other languages
English (en)
Inventor
吉尼 Ｍ 杜包基
奧法爾 Ｓ 格木森
曉軍 韓
Ｒ 麥克 勞倫斯
達沙 力珀薩
寇特 Ｓ 麥森
克勞迪歐 瑪沛里
保羅 Ｅ 莫林
麥可 C 麥爾斯
Original Assignee
美商必治妥美雅史谷比公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商必治妥美雅史谷比公司 filed Critical 美商必治妥美雅史谷比公司
Publication of TW201837051A publication Critical patent/TW201837051A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/64—Relaxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2221—Relaxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

本發明大體上係關於經修飾之鬆弛素多肽，諸如經修飾之人類鬆弛素2多肽，其等包含連接至藥物動力學增強劑之非天然編碼之胺基酸，及係關於此等多肽之治療用途，諸如用於治療心血管病症(諸如心臟衰竭)及/或涉及纖維化之病症。

Description

包含藥物動力學增強劑之經修飾之鬆弛素(RELAXIN)多肽及其用途
本發明大體上係關於經修飾之鬆弛素多肽，諸如經修飾之人類鬆弛素2多肽，其等包含藥物動力學增強劑，及本發明係關於此等多肽之治療用途，諸如用於治療心血管病症(諸如心臟衰竭)及/或涉及纖維化之病症。在例示性實施例中，該藥物動力學增強劑係連接至非天然編碼之胺基酸，其可經核糖體併入該鬆弛素多肽內。
心臟衰竭(HF)代表當今醫療體系之巨大負擔且估計美國盛行率為580萬及全球超過2300萬人(Roger等人，2012. Circulation, 125(1): e2-e220)。HF之症狀係不足之心輸出量之結果且可取決於該疾病之晚期階段而不斷衰弱。HF之主要症狀及體征包括：1)由於左心室之無效向前流動及肺毛細血管床中增加之壓力而引起之肺水腫所導致之呼吸困難(難以呼吸)；2)當右心室無法適應全身靜脈回流時發生下肢水腫；及3)由於心臟衰竭無法維持足夠之心輸出量以滿足身體之代謝需求而引起之疲勞(Kemp及Conte, 2012. Cardiovascular Pathology, 21:365-371)。 許多參與性疾病、風險因素及病理變化可最終導致心臟衰竭(Jessup及Brozena, 2003. N Engl J Med, 348(20): 2007-2018)。認為涉及HF之病理生理學之傷害事件涵蓋非常急性(諸如心肌梗塞)至更慢性損害(諸如終生高血壓)。死亡率仍很高及患有HF之人中~50%在診斷之5年內死亡(Roger等人，2012. Circulation, 125(1): e2-e220；Roger等人，2004. Jama, 292(3): 344-50)。心臟衰竭明確顯示顯著未滿足之醫療需求。 人類鬆弛素2激素(亦稱為H2鬆弛素)係由53個胺基酸組成之6-kDa肽，其已知負責在分娩前重建生殖道，因此促進生產過程。儘管主要為懷孕之激素，但亦已於未懷孕之女性及男性中偵測到鬆弛素。人類鬆弛素係胰島素肽家族之成員，其包括胰島素、許多胰島素樣肽(INSL3-6)及胰島素樣生長因子(IGFI及IGFII) (Van Der Westhuizen等人，2007. Curr Drug Targets, 8(1): 91-104)。此等異二聚體肽皆結構相關及各包含由兩個二硫鍵連接之兩個肽鏈(A及B)，且該A鏈含有單一分子內二硫鍵。鬆弛素2 (H2)之受體(稱為鬆弛素家族肽受體1 (RXFP1))在小鼠與具有85%胺基酸一致性之人類之間係保守的，且基本上普遍表現於人類及其他物種中(Halls等人，2007. Br J Pharmacol, 150(6): 677-91)。 在人類妊娠期間，為滿足由胎兒對其施加之營養需求，女性身體經受全身血管阻力(SVR)顯著降低~30%及伴隨心輸出量增加~50% (Jeyabalan, 2010: Renal and Electrolyte Disorders. Lippincott Williams及Wilkins. 462-518；Clapp及Capeless, 1997. Am J Cardiol, 80(11): 1469-73)。額外之血管適應包括整體動脈順應性增加~30%，此對維持有效之心室-動脈耦合而言係重要的，及腎血流量(RBF)及腎小球濾過率(GFR)兩者皆增加~50%，此對代謝廢物消除而言係重要的(Jeyabalan, 2010: Renal and Electrolyte Disorders. Lippincott Williams及Wilkins. 462-518；Poppas等人，1997. Circulation, 95(10):第2407至15頁)。嚙齒動物中之臨床前研究及在各種病患設定中進行之臨床研究兩者均提供證據表明鬆弛素係至少一定程度上涉及介導此等適應性生理學變化(Conrad, 2011. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 301(2), R267-275；Teichman等人，2009. Heart Fail Rev, 14(4), 321-329.)。此等適應性反應中之許多可能對HF病患有益，因為過度纖維化、較差之動脈順應性及較差之腎功能皆為心臟衰竭病患常見之特徵(Mohammed等人，2015. Circulation, 131(6), 550-559)、(Wohlfahrt等人，2015. Eur J Heart Fail, 17(1), 27-34；Dammon等人，2011. Prog Cardiovasc Dis, 54(2), 144-153)。據估計，患有HF之病患中30%患有中度至重度腎損傷(Triposkiadis及Skoularigis, 2012. Curr Heart Fail Rep, (4):354-62)，諸如藉由改善血管流動及電解質處理兩者之鬆弛素可對HF病患尤其有益。 鬆弛素肽具有短藥物動力學半衰期：Serelaxin (一種已經研發用於治療HF之重組人類鬆弛素肽)具有5至15分鐘之短第一階段藥物動力學半衰期，且需要48小時連續靜脈內輸注用於治療效用(REASANZ (REASANZ (serelaxin) Briefing Document Prepared by Novartis for FDA Cardiovascular and Renal Drugs Advisory Committee Meeting. February 26, 2014)。就諸如心臟衰竭之慢性疾病而言，具有經改善之藥物動力學曲線之鬆弛素分子為除連續靜脈內輸注外之藥物投與之替代途徑提供機會，其可能更適合作為用於患有慢性疾病之病患之藥劑。
本文提供包含非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽，其中(a)該鬆弛素多肽包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於選自由以下組成之群之位置處經非天然編碼之胺基酸取代：A鏈殘基1、A鏈殘基2、A鏈殘基5、A鏈殘基13、A鏈殘基18、B鏈殘基5、B鏈殘基7及B鏈殘基25，且在該鬆弛素A鏈及/或該鬆弛素B鏈中視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入及/或刪除；(b)該非天然編碼之胺基酸具有結構：， 其中R基係除以下中發現之側鏈外之任何取代基：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸；及(c)該非天然編碼之胺基酸係連接至藥物動力學增強劑，該藥物動力學增強劑包含在2與30種胺基酸之間的肽組分及半衰期延長部分。 本文亦提供包含具有以下結構之AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH之經修飾之鬆弛素多肽：(式III)， 其中該AQ1-鬆弛素包含與SEQ ID NO: 35具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素A鏈多肽及與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素B鏈多肽，其中式III中繪示之經修飾之對乙醯基苯丙胺酸係位於該鬆弛素A鏈多肽之N端。 本文亦提供包含具有本文描述之式III結構之AQ1-鬆弛素-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH之經修飾之鬆弛素多肽，其中AQ1-鬆弛素包含SEQ ID NO: 35之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其中式III中繪示之該經修飾之對乙醯基苯丙胺酸係位於該鬆弛素A鏈多肽之N端。 本文亦提供包含圖8中顯示之結構之經修飾之鬆弛素多肽。 本文亦提供包含圖9中顯示之結構之經修飾之鬆弛素多肽。 在另一態樣中，本文提供包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 在另一態樣中，本文提供包含有效量之用於治療與鬆弛素相關聯之失調症之如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 在另一態樣中，本文提供治療與鬆弛素相關聯之疾病之方法，其包括投與有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本文提供治療心血管疾病之方法，其包括向有此需要之病患投與有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本文提供治療或緩解心臟衰竭之症狀之方法，其包括向有此需要之病患投與有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本文提供治療與纖維化相關聯之疾病之方法，其包括向有此需要之病患投與治療有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本文提供治療或預防腎衰竭之方法，其包括向有此需要之病患投與治療有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本文提供改善、穩定或恢復有此需要之病患之腎功能之方法，其包括向該病患投與治療有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本文提供製造如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之方法，其包括：(a)提供包含該鬆弛素A鏈及該鬆弛素B鏈之多肽，其中該多肽包含該非天然編碼之胺基酸；及(b)使該非天然編碼之胺基酸連接至該藥物動力學增強劑。
相關申請案揭示 本申請案主張2017年2月8日申請之美國臨時申請案第62/456,161號之權利，該案係以全文引用之方式併入本文中。 定義 如本文及隨附申請專利範圍中使用，除非內文另有明確指示，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物。因此，例如，「鬆弛素」、「鬆弛素多肽」或「經修飾之鬆弛素多肽」之提及係指一或多種此等蛋白質之提及且包括一般技術者已知的其等效物等等。 除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常瞭解之含義相同之含義。 術語「藥物動力學延長劑」、「藥物動力學增強劑」、「PK延長劑」及「PK增強劑」可交換使用且各係指視需要經由非天然編碼之胺基酸共價連接(「結合」或「稠合」)至本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之醫藥上可接受之部分、域或分子，其相較於比較物(諸如經修飾之鬆弛素多肽或野生型鬆弛素多肽之未經結合之形式)預防、延遲或減輕經修飾之鬆弛素多肽之活體內蛋白降解或其他活性遞減之化學修飾、增加半衰期(血清半衰期及/或治療半衰期)及/或改善或改變其他藥物動力學或生物物理性質，包括(但不限於)增加吸收速率、減小毒性、改善溶解度、減少聚集、增加經修飾之鬆弛素多肽之生物活性及/或目標選擇性及/或減小經修飾之鬆弛素多肽之免疫原性。本文描述之PK增強劑可包含包括一或多種胺基酸之肽組分及半衰期延長部分。 術語「半衰期延長部分」係指視需要經由非天然編碼之胺基酸直接或經由連接子(例如，肽組分或PEG)共價連接(「結合」或「稠合」)至本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之醫藥上可接受之部分、域或分子(例如作為PK延長劑之組分)，其相較於比較物(諸如經修飾之鬆弛素多肽或野生型鬆弛素多肽之未經結合之形式)增加半衰期(血清半衰期及/或治療半衰期)及/或改善或改變其他藥物動力學或生物物理性質，包括(但不限於)增加吸收速率、減小毒性、改善溶解度、減少聚集、增加經修飾之鬆弛素多肽之生物活性及/或目標選擇性、增加經修飾之鬆弛素多肽之可製造性及/或減小經修飾之鬆弛素多肽之免疫原性。術語半衰期延長部分包括(但不限於)非蛋白質半衰期延長部分，諸如脂肪酸或其衍生物、水溶性聚合物諸如聚乙二醇(PEG)或離散PEG、羥乙基澱粉(HES)、脂質、分支鏈或無分支鏈醯基、分支鏈或無分支鏈C8-C30醯基、分支鏈或無分支鏈烷基及分支鏈或無分支鏈C8-C30烷基；及蛋白質半衰期延長部分，諸如血清白蛋白、轉鐵蛋白、黏附素(adnectin)(例如，白蛋白結合或藥物動力學延長(PKE)黏附素)、Fc域及非結構化多肽，諸如XTEN及PAS多肽(例如，由胺基酸Pro、Ala及/或Ser組成之構象紊亂之多肽序列)及前述任何一者之片段。術語「連接子」或「間隔子」可係將半衰期延長部分連接至經修飾之鬆弛素多肽之任何組分。例示性連接子包括(但不限於)小有機化合物、各種長度之水溶性聚合物，諸如聚(乙二醇)或葡聚糖及(例如)多達50、40、30、25、20、15、10或多達6個胺基酸長度之肽或多肽。 術語「肽組分」係指PK延長劑之組分且包含多達50個胺基酸長度之肽。例示性肽組分包括(但不限於)多達40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸長度之肽。此肽組分可將半衰期延長部分共價連接至本文描述之經修飾之鬆弛素多肽。在一些實施例中，該肽組分可包含2至50個胺基酸。在一些實施例中，該肽組分可包含2至30個胺基酸。在一些實施例中，該肽組分可包含3至20個胺基酸。在一些實施例中，該肽組分可包含5至10個胺基酸。 術語「穩定性」或「熱穩定性」係指當加熱時多肽抵抗展開之能力。一般而言，分子之熱穩定性越高，則使多肽變得展開所需之溫度越大。測定多肽之熱穩定性之例示性方法係示差掃描量熱法(DSC)及熱掃描螢光方法。熱穩定性可關於比較化合物測定，例如，以識別具有經增加之熱穩定性之多肽。 術語「聚集」係指多肽與其他分子(諸如相同多肽之其他分子)形成非共價連接之複合物藉此形成高分子量複合物之趨勢。量測聚集物之形成之例示性方法包括分析型粒徑排阻層析術。聚集之相對量可相對於比較化合物測定，例如，以識別具有減少之聚集之多肽。 術語「脫醯胺」係指多肽內之胺基酸殘基自發經歷脫醯胺反應，藉此改變胺基酸之化學結構，且潛在影響該多肽之功能之趨勢。量測脫醯胺之例示性方法包括成像毛細血管等電聚焦(icIEF)。脫醯胺之相對量可相對於比較化合物測定，例如，以識別具有減少之脫醯胺之多肽。 術語「活體內蛋白水解」係指多肽在引入生命系統中時(例如，當注射至有機體內時)裂解，此可源自於該有機體中出現之蛋白酶。蛋白水解可潛在影響多肽之生物活性或半衰期。例如，野生型鬆弛素可經歷裂解，導致經縮短之無活性多肽。量測鬆弛素之活體內蛋白水解之例示性方法係基於Meso Scale Discovery (MSD)之電化學發光免疫吸附分析(ECLIA)。活體內蛋白水解之相對量可相對於比較化合物測定，例如，以識別具有減少之活體內蛋白水解之多肽。 術語「溶解度」係指一種物質可溶解於另一種物質中之量，例如，可溶解於水溶液中之未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽之量。量測未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽之溶解度之例示性方法係塞流溶解度測試。相對溶解度可相對於比較化合物測定，例如，以識別具有增加之溶解度之多肽。 術語「生物活性(biological activity)」或「生物活性(bioactivity)」係指分子影響與有機體有關之生物系統、途徑、分子或相互作用之任何物理或生物化學性質之能力，該有機體包括(但不限於)病毒、細菌、噬菌體、轉位子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物及人類。例如，在未經修飾或經修飾之鬆弛素之內文中，生物活性包括由鬆弛素執行之功能中之任何一者。例如，「生物活性」經修飾之鬆弛素多肽可顯示野生型鬆弛素之生物活性中之一或更多者，其包括但不限於：包括人類及非人類RXFP1異種同源物之鬆弛素2受體RXFP1之活化、包括人類及非人類異種同源物之另一鬆弛素受體(諸如RXFP2)之活化、活體外或活體內抗纖維化活性、無論在人類、非人類動物及/或模型系統中治療心臟衰竭或纖維化疾病之效用及如本文揭示之其他生物活性，例如，增加全身血管阻力(SVR)、增加心輸出量、增加整體動脈順應性、增加腎血流量(RBF)及/或腎小球濾過率(GFR)。判定分子是否具有野生型鬆弛素(諸如SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5之野生型鬆弛素多肽)之至少一種生物活性之例示性方法可包括活體外活性分析或受體結合分析，例如，細胞內cAMP聚集分析。生物活性之相對程度可相對於比較化合物測定，例如，以識別具有生物活性或針對預期治療用途具有足夠高生物活性之多肽，例如，在活體外或活體內活性分析中，具有比比較物之EC50高小於5倍、10倍、小於20倍、小於50倍或小於100倍之EC50。 本文描述之比較化合物可係缺乏修飾(諸如本文描述之修飾)之另一序列。例如，該比較化合物可係相同之經修飾之鬆弛素多肽序列而未鍵聯至PK延長劑。例示性比較化合物包括(但不限於) SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5之野生型鬆弛素多肽、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6之經修飾之鬆弛素多肽、SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 6之經修飾之鬆弛素多肽、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 6之經修飾之鬆弛素多肽或另一比較化合物。在一些實施例中，該比較化合物可含有至少一種非天然編碼之胺基酸，其可連接至本文描述之連接子、聚合物、生物活性分子、肽、多肽或半衰期延長部分(例如，PEG或脂肪酸)。在一些實施例中，比較化合物可含有至少一種非天然編碼之胺基酸，其可或可不連接至本文描述之連接子、聚合物、生物活性分子、肽、多肽或半衰期延長部分。在一些實施例中，比較化合物可含有額外之胺基酸取代、刪除及/或插入。在一些實施例中，該比較可用多肽之醯化或非醯化形式進行；在先前實例中，該比較可用包含或不包含非天然編碼之胺基酸之多肽進行。 術語「對應」係指藉由與參考序列進行比較識別之多肽或多核苷酸序列內之位置(「位置對應」或「對應之位置」)或區域(「區域對應」或「對應之區域」)。該參考序列可係野生型或未經修飾之序列，諸如SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5之野生型鬆弛素多肽。對應之位置或區域可由該序列與參考序列之比對識別。例如，「對應於鬆弛素A鏈中之胺基酸1之位置」係指當序列與SEQ ID NO: 4比對時，該序列中與如SEQ ID NO: 4中之胺基酸1處在相同比對列中之位置。在該比對中，該胺基酸或核苷酸可匹配或不匹配參考序列之對應位置中之胺基酸或核苷酸。 用以識別對應位置或對應區域之比對可使用習知比對演算法獲得，諸如Blast (Altschul等人，J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10)、Smith-Waterman (Smith及Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1):195-7)或Needleman-Wunsch (Needleman及Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53)。可使用Needleman-Wunsch演算法以獲得最高評分之全域比對(即，比對含有兩個序列中之每個殘基，然而比對可以空位開始及/或結束)。無論是使用Blast、Smith-Waterman還是Needleman-Wunsch，最高評分比對可使用「預設」參數識別，諸如使用BLOSUM62評分矩陣、空位開放罰分11及空位延伸罰分1及(當使用Blast來成對比對時)字長為3。 術語「與纖維化相關聯之疾病」包括其中已可見纖維化發生或其中已知或認為纖維化與疾病病因、進展或症狀相關聯或有助於疾病病因、進展或症狀或其中已知或認為纖維化隨疾病進展發生之疾病、失調症及病症。該纖維化可影響器官或組織，諸如胰臟、肺、心臟、腎、肝、眼、神經系統、骨髓、淋巴結、內膜心肌或腹膜後腔。與纖維化相關聯之例示性疾病包括(但不限於)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化、前期肝硬化(pre-cirrhosis)、肝硬化、瀰漫性實質性肺疾病、囊性纖維化、肺或肺部纖維化、進行性大量纖維化、特發性肺纖維化、注射纖維化、腎或腎臟纖維化、慢性腎疾病、糖尿病腎疾病、局灶節段性腎小球硬化、膜性腎病、IgA腎病、骨髓纖維化、心臟衰竭、代謝性心臟衰竭、心臟纖維化、白內障纖維化、白內障、眼瘢痕、胰臟纖維化、皮膚纖維化、腸纖維化、腸狹窄、內膜心肌纖維化、心房纖維化、縱膈纖維化、克隆氏症(Crohn’s disease)、腹膜後腔纖維化、瘢痕、腎源性系統性纖維化、硬皮症、系統性硬化症、關節纖維化、佩羅尼症候群(Peyronie’s syndrome)、杜普伊特倫攣縮(Dupuytren’s contracture)、糖尿病神經病、黏連性關節囊炎、酒精性肝疾病、肝脂肪變性、病毒性肝炎、膽道疾病、原發性血色病、藥物相關性肝硬化、隱源性肝硬化、威爾森氏症(Wilson’s disease)、α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、間質性肺疾病(ILD)、人類纖維化肺疾病、黃斑變性、視網膜病變、玻璃體視網膜病變、心肌纖維化、格雷夫眼病(Grave’s ophthalmopathy)、藥物誘導之麥角化、心血管疾病、動脈粥樣硬化/再狹窄、增生性瘢痕、原發性或特發性骨髓纖維化及炎症性腸病(包括(但不限於)膠原性結腸炎)。在一些實施例中，與纖維化相關聯之疾病可包括肝纖維化、腎或腎臟纖維化、肺或肺部纖維化及心臟或心肌纖維化。在一些實施例中，與纖維化相關聯之疾病可係肝纖維化。在一些實施例中，與纖維化相關聯之疾病可係NASH。 術語「大體上經純化」係指未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽可大體上或基本上不含通常伴隨或與如其天然存在之環境中發現之蛋白質相互作用之組分，即，天然細胞或在重組產生之未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽之情況下之宿主細胞。可大體上不含細胞材料之未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽包括具有小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%或小於約l% (以乾重或濕重計)之污染蛋白質之蛋白質製劑。因此，如藉由本發明之方法產生之「大體上經純化」之未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽可具有如藉由適當之方法(諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC及毛細管電泳)測定之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%之純度水平，具體言之，至少約75%、80%、85%之純度水平，且更具體言之，至少約90%之純度水平、至少約95%之純度水平、至少約99%之純度水平或更大。 「重組宿主細胞」或「宿主細胞」係指包括外源性多核苷酸之細胞，與用於插入之方法，例如，直接攝取、轉導、f配對或此項技術中已知用於產生重組宿主細胞之其他方法無關。該外源性多核苷酸可作為非完整載體(例如，質體)保持，或或者，可整合於宿主基因體內。 如本文使用，術語「真核生物」係指屬於系統發生域真核生物之有機體，諸如動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、爬蟲動物、鳥等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限於)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。 如本文使用，術語「非真核生物」係指非真核有機體或原核生物有機體。例如，非真核有機體可屬於真細菌(包括(但不限於)大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、螢光假假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)系統發生域或古細菌(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜鹽桿菌(諸如嗜鹽古生菌(Haloferax volcanii)及嗜鹽桿菌物種NRC-1、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、超高溫古生菌強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)、超嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細菌(Aeuropyrum pernix)等)系統發生域。 如本文使用，術語「培養基」包括可支援或含有任何宿主細胞(包括細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核生物宿主細胞、大腸桿菌或假單胞菌宿主細胞及細胞內含物)之任何培養基、溶液、固體、半固體或剛性載體。因此，該術語可包含其中該宿主細胞已生長之培養基，例如，其中已分泌未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽之培養基，包括在增殖步驟之前或之後之培養基。該術語亦可包含含有宿主細胞裂解物之緩衝劑或試劑，諸如在其中未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽係經細胞內產生且該等宿主細胞係經裂解或分裂以釋放該未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽之情況下。 除非內文另有指示，否則如本文使用之術語「鬆弛素」係指人類鬆弛素，具體言之人類鬆弛素2 (亦稱為H2鬆弛素或RLN2)，其等胺基酸序列及空間結構已為人熟知。人類鬆弛素包含由二硫鍵交聯之二十四個胺基酸A鏈及二十九個胺基酸B鏈(參見圖5)。經適當交聯之野生型鬆弛素含有三個二硫鍵：一個在A鏈之位置11與B鏈之位置11之間，第二個在A鏈位之置24與B鏈之位置23之間及第三個在A鏈之位置10與15之間。 如本文使用，「經修飾之鬆弛素多肽」或「經修飾之鬆弛素」可交換使用且應包括彼等不同於野生型鬆弛素(例如，SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5之野生型人類鬆弛素)且通常具有鬆弛素2及其鬆弛素類似物、鬆弛素同型物、鬆弛素模擬物、多型態(例如，天然存在之鬆弛素序列變體)、鬆弛素片段、雜合鬆弛素蛋白、融合蛋白、寡聚物及多聚物、同源物、醣化模式變體、變體、剪接變體及突變蛋白之至少一種生物活性之多肽及蛋白質。術語「經修飾之鬆弛素多肽」及「經修飾之鬆弛素」包含包括一或多種胺基酸取代、添加或刪除之鬆弛素多肽。 天然生成之鬆弛素之各種胺基酸位置中之取代可併入經修飾之鬆弛素多肽內。取代包括(但不限於)彼等調節溶解性或穩定性、增加促效劑活性、增加活體內或活體外半衰期、增加蛋白酶抗性、減小免疫原性或毒性、促進純化或可製造性等者且為術語「經修飾之鬆弛素多肽」或「經修飾之鬆弛素」所包含。在一些實施例中，本文描述之該(等)非天然編碼之胺基酸取代可與經修飾之鬆弛素多肽內之其他添加、取代或刪除組合以相對於另一鬆弛素多肽(例如，SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5之野生型鬆弛素多肽或另一鬆弛素多肽，諸如無該添加、取代或刪除之相同鬆弛素多肽，或另一未經修飾或經修飾之鬆弛素未經修飾或經修飾之多肽)影響經修飾之鬆弛素多肽之生物特性。在一些實施例中，該等其他添加、取代或刪除可增加經修飾之鬆弛素多肽之穩定性(包括(但不限於)對蛋白降解之抗性)或增加經修飾之鬆弛素多肽對其受體之親和力。在一些情況下，該等其他添加、取代或刪除可增加經修飾之鬆弛素多肽之醫藥穩定性。在一些實施例中，該等其他添加、取代或刪除可增加經修飾之鬆弛素多肽之溶解度(包括(但不限於)當表現於大腸桿菌或其他宿主細胞時)，增加經修飾之鬆弛素多肽之可製造性或減少經修飾之鬆弛素多肽之聚集。在一些實施例中，該等添加、取代或刪除可增加表現於大腸桿菌或其他重組宿主細胞中後之多肽溶解度。在一些實施例中，除用於併入導致於大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表現後增加多肽之溶解度之非天然胺基酸之另一位點外，可選擇用於經天然編碼或非天然胺基酸取代之位點。 在一些實施例中，該等經修飾之鬆弛素多肽進一步包含調節經修飾之鬆弛素多肽之生物活性之額外插入、取代或刪除。例如，該等添加、取代或刪除可調節經修飾之鬆弛素之一或多種性質或活性。例如，該等添加、取代或刪除可調節對鬆弛素多肽受體、結合蛋白或相關配體之親和力；在結合至鬆弛素受體後調節信號轉導；調節活體內或循環半衰期；調節治療半衰期；調節多肽之穩定性；調節藉由蛋白酶進行之裂解；調節劑量；調節釋放或生物有效性；促進純化；減少脫醯胺；減少聚集；改善儲藏壽命或活體外半衰期；或改善或改變特定投與途徑。同樣地，經修飾之鬆弛素多肽可包含蛋白酶裂解序列、反應基團、抗體結合域(包括(但不限於) FLAG或聚組胺酸(poly-His))或其他基於親和力之序列(包括(但不限於) FLAG、聚組胺酸、GST等)或改善多肽之偵測(包括(但不限於) GFP)、純化或其他特性之連接分子(包括(但不限於)生物素)。 術語「經修飾之鬆弛素多肽」亦包括天然生成之鬆弛素之生物活性片段、生物活性變體及立體異構體及天然生成之鬆弛素及其多肽融合物之促效劑、模擬物及拮抗劑變體。在胺基端、羧基端或兩端包含額外胺基酸之融合物係為術語「經修飾之鬆弛素多肽」所包含。例示性融合物包括(但不限於)例如其中甲硫胺酸係連接至源自於鬆弛素之缺乏前導肽或信號肽或其部分之成熟形式之重組表現之鬆弛素A鏈及/或B鏈之N端(例如，甲硫胺酸係連接至源自於(例如)在大腸桿菌中之重組表現之鬆弛素A鏈及/或B鏈之N端)之甲硫胺醯基鬆弛素；出於純化目的之融合物(包括(但不限於)聚組胺酸或親和力抗原決定基)；具有血清白蛋白結合肽(諸如PKE黏附素(adnectin))之融合物及具有血清蛋白(諸如血清白蛋白)之融合物；及包含鬆弛素及一或多種其他分子(「融合搭配物」)(包括(但不限於)血清白蛋白、Fc域、免疫球蛋白恆定區、非結構化多肽及黏附素及其片段)之融合蛋白。任何此等片段可藉由標準生物化學方法或藉由表現編碼該片段之多核苷酸製備自蛋白質。 除其中另有指示外，一般而言，如本文使用之術語「鬆弛素多肽」及「鬆弛素」包含未經修飾(即，野生型)鬆弛素及經修飾之鬆弛素多肽兩者。 術語「經修飾之鬆弛素多肽」包括結合至聚合物(諸如PEG或PK延長劑)且可視需要包含半胱胺酸、離胺酸或其他殘基之一或多種衍生之多肽。在一些實施例中，該經修飾之鬆弛素多肽可包含連接子、聚合物或PK延長劑，其中與連接子、聚合物或PK延長劑所結合之胺基酸可係根據本發明之非天然胺基酸或天然編碼之胺基酸(例如，離胺酸或半胱胺酸)，利用此項技術中已知的技術，諸如偶合至離胺酸或半胱胺酸。 術語「經修飾之鬆弛素多肽」亦包括鬆弛素多肽中經由天然編碼之胺基酸(例如，半胱胺酸或離胺酸)結合或連接至本文描述之PK延長劑之鬆弛素多肽。在一些實施例中，該天然編碼之胺基酸可係鬆弛素多肽中之取代或插入。 術語「經修飾之鬆弛素多肽」亦包括醣化經修飾之鬆弛素，諸如(但不限於)於任何胺基酸位置處醣化之多肽、多肽之N連接或O連接之醣化形式。另外，亦包括剪接變體。 除非本文另有規定，否則在本文描述之未經修飾或經修飾之鬆弛素中對胺基酸位置之所有參考係基於SEQ ID NO: 4之A鏈或SEQ ID NO: 5之B鏈中之對應位置。熟習此項技術者將知曉對應於SEQ ID NO: 4或5或另一鬆弛素序列中之位置之胺基酸位置可易於在任何其他鬆弛素分子諸如鬆弛素融合物、變體、片段等中加以識別。例如，序列比對程式(諸如BLAST)可用以比對及識別蛋白質中與SEQ ID NO: 4或5或其他鬆弛素序列中之位置對應之特定位置。參考SEQ ID NO: 4或5或其他鬆弛素序列對本文描述之胺基酸所作之取代、刪除或添加旨在亦欲係指本文描述或此項技術中已知且由本發明明確包含之鬆弛素融合物、變體、片段等之對應位置中之取代、刪除或添加。 術語「經修飾之鬆弛素多肽」亦包含經由融合搭配物(諸如Fc域)形成或連接(包括(但不限於)彼等經由非天然編碼之胺基酸側鏈直接連接至相同或不同之非天然編碼之胺基酸側鏈、連接至天然編碼之胺基酸側鏈或經由連接子間接連接者)之同源二聚體、異源二聚體、同源多聚體及異源多聚體。例示性連接子包括(但不限於)小有機化合物、各種長度之水溶性聚合物，諸如聚(乙二醇)或葡聚糖或肽或多肽，例如，多達50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或多達1個胺基酸長度。 如本文使用之術語「經修飾」係指對給定多肽所作之任何變化，諸如對多肽之長度、多肽之胺基酸序列、化學結構、共轉譯修飾或轉譯後修飾所作之變化。術語「轉譯後經修飾」係指在天然或非天然胺基酸已併入多肽鏈內後，在此胺基酸上發生之任何修飾。該術語包含(僅以實例說明之)共轉譯活體內修飾、共轉譯活體外修飾(諸如在無細胞之轉譯系統中)、轉譯後活體內修飾及轉譯後活體外修飾。 「非天然編碼之胺基酸」係指非20種常見胺基酸或吡咯離胺酸或硒半胱胺酸中之任何一者之胺基酸。可與術語「非天然編碼之胺基酸」同義使用之其他術語係「非天然胺基酸(non-natural amino acid)」、「非天然胺基酸(unnatural amino acid)」、「非天然生成之胺基酸」及其各種連字符或非連字符連接之形式。術語「非天然編碼之胺基酸」亦包括(但不限於)藉由天然編碼之胺基酸(包括(但不限於) 20種常見胺基酸或吡咯離胺酸及硒半胱胺酸)之修飾(例如，轉譯後修飾)發生但非其等本身天然由轉譯複合併入生長之多肽鏈內出現之胺基酸。此等非天然編碼之胺基酸之實例包括(但不限於)N-乙醯葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯葡糖胺基-L-蘇胺酸及O-磷酸酪胺酸。 在經修飾之鬆弛素多肽之內文中，如本文使用之術語「對乙醯基苯丙胺酸」及「對乙醯基-L-苯丙胺酸」 (包括縮寫pAcF及pAF)亦包含化學反應之產物，其中對位位置中之乙醯基不存在且在其位置處存在對另一分子之鍵聯。因此，例如，在包含對乙醯基苯丙胺酸(諸如對乙醯基-L-苯丙胺酸)之經修飾之鬆弛素多肽中，該對乙醯基苯丙胺酸可於對位位置處包含肟、三唑、醯胺或其他鍵聯，例如，具有源自於對乙醯基-L-苯丙胺酸之羰基與胺氧基之反應之肟鍵聯，且在對位位置處缺乏羰基碳。此對乙醯基苯丙胺酸亦可被稱為「經修飾之對乙醯基苯丙胺酸」，例如，「經修飾之對乙醯基-L-苯丙胺酸」。 例示性非天然編碼之胺基酸係對乙醯基苯丙胺酸(pACF)。其可使用在Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746中先前描述之程序合成，該案係以全文引用之方式併入本文中。 「胺基端修飾基團」係指可結合至多肽之胺基端之任何分子。同樣地，「羧基端修飾基團」係指可結合至多肽之羧基端之任何分子。端修飾基團包括(但不限於)各種水溶性聚合物、甲硫胺酸、肽或蛋白質(諸如血清白蛋白)、Fc域、免疫球蛋白恆定區、非結構化多肽、黏附素或其片段、脂肪酸或其衍生物或增加多肽之血清(活體內)半衰期之其他部分。 術語「官能基」、「活性部分」、「活化基團」、「離去基團」、「反應性位點」、「化學反應性基團」及「化學反應性部分」係用於此項技術中且在本文中係指分子之不同可定義部分或單元。該等術語在化學領域中有些同義且在本文中用以指示進行一些功能或活性且與其他分子反應之分子之部分。 本文使用之術語「鍵聯」係指通常由於化學反應所形成且通常為共價鍵聯之基團或鍵。水解穩定之鍵聯意謂該等鍵聯在水中係大體上穩定的且在有用之pH值下不與水反應，包括(但不限於)在生理條件下穩定延長之時間週期，可能甚至無限期地。水解不穩定或可降解鍵聯意謂在水或水溶液(包括，例如血液)中可降解之鍵聯。酶不穩定或可降解鍵聯意謂該鍵聯可由一或多種酶降解。如此項技術中已知，PEG、脂肪酸及其他聚合物可在聚合物主鏈中或在介於聚合物分子之聚合物主鏈與末端官能基中之一或多者之間之連接子基團中包括可降解鍵聯。例如，可藉由羧酸或經活化之羧酸與生物活性藥劑上之醇基之反應所形成之酯鍵聯通常在生理條件下水解以釋放藥劑。其他可水解降解鍵聯包括(但不限於)碳酸酯鍵聯；可源自於胺與醛之反應之亞胺鍵聯；可藉由使醇與磷酸基團反應形成之磷酸酯鍵聯；可係醯肼與醛之反應產物之腙鍵聯；可係醛與醇之反應產物之縮醛鍵聯；可係甲酸及醇之反應產物之原酸酯鍵聯；可由胺基(包括(但不限於)在聚合物之末端處)及肽之羧基形成之肽鍵聯；可係羰基官能基及含有羥基胺或半卡肼之試劑之反應產物之肟或半卡腙鍵聯；及可由亞磷醯胺基團(包括(但不限於)在聚合物之末端處)及寡核苷酸之5'羥基形成之寡核苷酸鍵聯。 在取代基係由其等習知化學式(自左至右書寫)規定之情況下，其等同樣包含源自於自右至左書寫結構之化學相同取代基，例如，結構CH2O相當於結構-OCH2。本文呈現之組合物可包括其中一或多個原子經具有與自然中發現之原子質量或質量數不同之原子質量或質量數之原子置換之同位素標記化合物。本文呈現之組合物可包括異構體，包括(但不限於)非對映異構體、對映異構體及其混合物，例如，L-胺基酸及/或D-胺基酸(諸如對乙醯基-D-苯丙胺酸及/或對乙醯基-L-苯丙胺酸)。 術語「取代基」包括(但不限於)「非干擾性取代基」。「非干擾性取代基」係彼等產生穩定化合物之基團。合適之非干擾性取代基或基團包括(但不限於)鹵基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12環烷基、C3-C12環烯基、苯基、經取代之苯基、甲苯基、二甲苯基、聯苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亞磺醯基、C1-C10烷基磺醯基、--(CH2)m --O--(C1-C10烷基)(其中m係自1至8)、芳基、經取代之芳基、經取代之烷氧基、氟烷基、雜環形基團、經取代之雜環形基團、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、=S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)—CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m係自1至8)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2、其鹽及類似物。如本文使用之各R係H、烷基或經取代之烷基、芳基或經取代之芳基、芳烷基或烷芳基。 術語「鹵素」包括氟、氯、碘及溴。 除非另有規定，否則術語「烷基」(本身或作為另一取代基之部分)意指具有指定數量之碳原子(即，C1-C10意指一至十個碳)之直鏈或分支鏈或環形烴基或其組合，其可完全飽和、單-或多不飽和且可包括二價或多價基團。飽和烴基之實例包括(但不限於)諸如以下之基團：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、異丁基、第二丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基及類似物之同系物及異構體。不飽和烷基係具有一或多個雙鍵或三鍵者。不飽和烷基之實例包括(但不限於)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-及3-丙炔基、3-丁炔基及高碳數同系物或異構體。除非另有說明，否則術語「烷基」亦意欲包括彼等下文更詳細定義之烷基之衍生物，諸如「雜烷基」。受限於烴基之烷基被稱為「同烷基」。 術語「伸烷基」(本身或作為另一取代基之部分)意指衍生自烷烴之二價基團，如例示，但不限於，結構-CH2CH2-及-CH2CH2CH2CH2-，且進一步包括彼等下文描述為「伸雜烷基」之基團。一般而言，烷基(或伸烷基)將具有自1至24個碳原子，及彼等具有10或更少個碳原子之基團係本文描述之方法及組合物之特定實施例。「低碳數烷基」或「低碳數伸烷基」係通常具有八或更少個碳原子之較短鏈烷基或伸烷基。 術語「烷氧基」、「烷基胺基」及「烷基硫基」 (或硫烷氧基)係以其等習知意義使用，且係指彼等分別經由氧原子、胺基或硫原子連接至分子之剩餘部分之烷基。 除非另有規定，否則術語「雜烷基」(本身或與另一術語組合)意指穩定之直鏈或分支鏈或環烴基或其組合，其由規定數量之碳原子及至少一個選自由O、N、Si及S組成之群之雜原子組成且其中該氮原子及硫原子可視需要經氧化及該氮雜原子可視需要經季銨化。雜原子O、N及S及Si可放置於雜烷基之任何內部位置處或放置於其中烷基連接至分子之剩餘部分之位置處。實例包括(但不限於)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、及-CH=CH-N(CH3)-CH3。多達兩個雜原子可係連續的，諸如，例如，-CH2-NH-OCH3及-CH2-O-Si(CH3)3。同樣地，術語「伸雜烷基」(本身或作為另一取代基之部分)意指衍生自雜烷基之二價基團，如例示，但不限於，-CH2-CH2-S-CH2 CH2-及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。就伸雜烷基而言，相同或不同之雜原子亦可佔據鏈末端(包括(但不限於)伸烷基氧基、伸烷基二氧基、伸烷基胺基、伸烷基二胺基、胺氧基伸烷基及類似物)之一端或兩端。更進一步，就伸烷基及伸雜烷基連接基而言，連接基之定向不受其中書寫該連接基之式之方向暗示。例如，該式-C(O)2R'表示-C(O)2R'及-R'C(O)2兩者。 除非另有規定，否則術語「環烷基」及「雜環烷基」(本身或與其他術語組合)分別表示「烷基」及「雜烷基」之環模式。因此，環烷基或雜環烷基包括飽和、部分不飽和及完全不飽和環鍵聯。另外，就雜環烷基而言，雜原子可佔據其中雜環連接至分子之剩餘部分之位置。環烷基之實例包括(但不限於)環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基及類似物。雜環烷基之實例包括(但不限於) 1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基及類似物。另外，該術語包含雙環及三環形環結構。同樣地，術語「伸雜環烷基」(本身或作為另一取代基之部分)意指衍生自雜環烷基之二價基團，及術語「伸環烷基」(本身或作為另一取代基之部分)意指衍生自環烷基之二價基團。 除非另有規定，否則術語「芳基」意指可係單環或稠合在一起或共價連接之多環(包括(但不限於)自1至3個環)之多不飽和、芳族、烴取代基。術語「雜芳基」係指含有一至四個選自N、O及S之雜原子之芳基(或環)，其中該等氮及硫原子係視需要經氧化，且該(等)氮原子係視需要經季銨化。雜芳基可通過雜原子連接至分子之剩餘部分。芳基及雜芳基之非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基及6-喹啉基。用於上文指示之芳基及雜芳基環系統中之各者之取代基係選自下文描述之可接受之取代基之群。 為簡潔起見，術語「芳基」當與其他術語(包括(但不限於)芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)組合使用時包括如上文定義之芳基及雜芳基環兩者。因此，術語「芳烷基」意欲包括彼等其中芳基連接至烷基之基團(包括(但不限於)苄基、苯乙基、吡啶基甲基及類似物)，包括彼等其中碳原子(包括(但不限於)亞甲基)已經(例如)氧原子置換之烷基(包括(但不限於)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基及類似物)。 上文術語中之各者(包括(但不限於) 「烷基」、「雜烷基」、「芳基」及「雜芳基」)意欲包括經指示之基團之經取代及未經取代之形式兩者。下文提供用於基團之各類型之例示性取代基。 用於烷基及雜烷基(包括彼等通常被稱為伸烷基、烯基、伸雜烷基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基及雜環烯基之基團)之取代基可係選自但不限於以下之各種基團中之一或多者：-OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R”’、OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、NR’ C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)=NR””、NR C(NR’R”)=NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、NRSO2R’、-CN及-NO2，其數量在零至(2m’+1)之範圍內，其中m’係此基團中之碳原子之總數量。R’、R”、R”’及R””各獨立地係指氫、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之芳基(包括(但不限於)經1至3個鹵素取代之芳基)、經取代或未經取代之烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳烷基。當本發明之化合物包括多於一個R基時，例如，當存在此等基團中之多於一個時，該等R基中之各者係獨立地作為各R’、R”、R’”及R””選擇。當R’及R”連接至相同氮原子時，其等可與該氮原子組合以形成5-、6-或7員環。例如，-NR’R’’意欲包括(但不限於)1-吡咯啶基及4-嗎啉基。自取代基之上文討論，熟習此項技術者將知曉術語「烷基」意欲包括包括結合至除氫基團外之基團之碳原子之基團，諸如鹵烷基(包括(但不限於) -CF3及-CH2CF3)及醯基(包括(但不限於) -C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3及類似物)。 類似於針對烷基描述之取代基，用於芳基及雜芳基之取代基可變化且係選自(但不限於)：鹵素、OR’、=O、=NR’、=N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R”’、OC(O)R’、-C(O)R’、CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、NR’ C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、NR-C(NR’R”R’”)=NR””、NR C(NR’R”)=NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、NRSO2R’、-CN及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基及氟(C1-C4)烷基，其數量在零至芳環系統上之開放化合價之總數量之範圍內；且其中R’、R”、R”’及R””係獨立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基及雜芳基。當本發明之化合物包括多於一個R基時，例如，當存在此等基團中之多於一個時，該等R基中之各者係獨立地作為各R’、R”、R’”及R””選擇。 術語「脂肪酸」係指具有6至20種碳原子之飽和或不飽和醯基鏈或其衍生物。在一些實施例中，該脂肪酸可連接至本文描述之PK增強劑之肽組分且終止於羧酸或甲基。在一些實施例中，連接至PK增強劑之肽組分之脂肪酸可終止於羧酸。在一些實施例中，該脂肪酸可通過醯胺鍵連接至肽組分。在一些實施例中，該脂肪酸可具有10至18個碳原子。在一些實施例中，該脂肪酸可具有12至17個碳原子。在一些實施例中，該脂肪酸可具有14、15或16個碳原子。在一些實施例中，該脂肪酸可具有15個碳原子。 如本文使用，術語「水溶性聚合物」係指可溶於水性溶劑中之任何聚合物。水溶性聚合物連接至經修飾之鬆弛素多肽可導致變化，其等包括(但不限於)經增強或經調節之血清(活體內)半衰期或相對於未經修飾之形式經增強或經調節之治療半衰期、經減小或經調節之免疫原性或毒性、經調節之物理相關特性(諸如經減少之聚集及多聚體形成、經改變之受體結合、對一或多個結合搭配物之經改變之結合及經改變之受體二聚化或多聚化)。該水溶性聚合物可具有或不具有其自身生物活性，且可用作用於將經修飾之鬆弛素連接至其他物質(包括(但不限於)一或多種未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽或一或多種生物活性分子)之連接子。合適之聚合物包括(但不限於)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、單C1-C10烷氧基或其芳氧基衍生物(描述於美國專利案第5,252,714號中，該案以全文引用之方式併入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、離散PEG、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚胺基酸、二乙烯基醚馬來酸酐、N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯醯胺、聚葡萄糖、聚葡萄糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、寡醣、聚醣、纖維素及纖維素衍生物(包括(但不限於)甲基纖維素及羧基甲基纖維素)、澱粉及澱粉衍生物、兩種或多種胺基酸之多肽、聚烷二醇及其衍生物、聚烷二醇及其衍生物之共聚物、聚乙烯基乙醚及α-β-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺及類似物或其混合物。此等水溶性聚合物之實例包括(但不限於)聚乙二醇及血清白蛋白。 如本文使用，術語「聚烷二醇」 (PEG)或「聚(烯二醇)」係指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。術語「聚烷二醇」包含直鏈及分支鏈聚合物兩者及在0.1 kDa與100 kDa之間之平均分子量。其他例示性實施例係列舉(例如)於商業供應商目錄中，諸如Shearwater公司之目錄「Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications」 (2001)。 如本文使用，術語「經調節之血清半衰期」或「經調節之活體內半衰期」及類似術語係指經修飾之鬆弛素之循環半衰期相對於比較物(諸如其未經修飾之形式或野生型鬆弛素)之正或負變化。血清半衰期可藉由在投與經修飾之鬆弛素後之各種時間點下採取血樣及測定該分子在各樣本中之濃度進行量測。血清濃度與時間之相關性容許血清半衰期之計算。經增加之血清(活體內)半衰期最佳可係至少約兩倍，但較小之增加可係有用的，例如其中該較小之增加使得滿意之給藥方案變為可能或避免毒性效應。在一些實施例中，該增加可係至少約三倍、至少約五倍、至少約十倍、至少約二十倍或至少約五十倍。 如本文使用之術語「經調節之治療半衰期」意指相對於比較物(諸如其未經修飾之形式或野生型鬆弛素)治療有效量之本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之血清或活體內半衰期中之正或負變化。治療半衰期係藉由在投與後之各種時間點下量測分子之藥物動力學及/或藥效學性質進行量測。經增加之治療半衰期最佳使得特別有利之給藥方案、特別有利之總劑量變為可能或避免非所需之效應。在一些實施例中，經增加之治療半衰期來自於經增加之效力、經修飾之分子對其目標之經增加或經減少之結合、由酶(諸如蛋白酶)引起之分子之經增加或經減少之分解或未經修飾之分子之另一參數或作用機制之增加或減少或經受體介導之分子之清除之增加或減少。在一些實施例中，治療半衰期之增加可係至少約兩倍、至少約三倍、至少約五倍、至少約十倍、至少約二十倍或至少約五十倍。 術語「經分離」當應用至核酸或蛋白質時指示該核酸或蛋白質不含在自然狀態下與其相關聯之細胞組分中之至少一些，或該核酸或蛋白質已濃縮至大於其活體內或活體外產生之濃度之程度。其可處於均質狀態。經分離之物質可處於乾燥或半乾燥狀態，或於溶液(包括但不限於水溶液)中。其可係包含額外之醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑之醫藥組合物之組分。純度及均質性係通常使用分析化學技術(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析術)進行測定。作為製劑中存在之主要物質之蛋白質係經大體上純化。特定言之，經分離之基因係分離自開放閱讀框，其等位於基因之側面且編碼除受關注之基因外之蛋白質。術語「經純化」指示核酸或蛋白質在電泳凝膠中引起大體上一條帶。特定言之，可意指該核酸或蛋白質係至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99%或更純。 術語「核酸」係指脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其以單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語包含含有天然核苷酸之已知類似物之核酸，其等具有與參考核酸類似之結合性質且係以與天然存在之核苷酸類似之方式代謝。除非另有明確限制，否則該術語亦係指包括PNA (肽核酸)之寡核苷酸類似物、用於反義技術中之DNA之類似物(硫代磷酸酯、磷醯胺酸酯及類似物)。除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含包括其經保守修飾之變體(包括(但不限於)簡併密碼子取代)及互補序列及明確指示之序列。 本文中可交換使用之術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係指胺基酸殘基之聚合物。即，針對多肽之描述亦同樣適用於肽之描述及蛋白質之描述且反之亦然。該術語適用於天然存在之胺基酸聚合物及其中一或多個胺基酸殘基係非天然編碼之胺基酸之胺基酸聚合物。如本文使用，該術語包含任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白質，其中該等胺基酸殘基係由共價肽鍵連接。 「經保守修飾之變體」係指含有保守取代之胺基酸序列。例示性經保守修飾之變體包括對核酸、肽、多肽或蛋白序列所作之取代、刪除或插入，其改變、添加或刪除多肽序列或經編碼之多肽序列中之單一胺基酸或較小比例之胺基酸，例如，多肽序列或經編碼之多肽序列中多達1、2、3、4或5個胺基酸或多達0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%或3.5%之胺基酸，其視需要可係或可包括以化學上類似之胺基酸取代胺基酸。提供功能類似之胺基酸之保守取代表已為一般技術者已知。此等經保守修飾之變體係除本文揭示之經修飾之鬆弛素多肽之多態性變體、種間同源物及對偶基因外且不排除本文揭示之經修飾之鬆弛素多肽之多態性變體、種間同源物及對偶基因。 提供功能類似之胺基酸之保守取代表已為一般技術者已知。下列八組各含有彼此互為保守取代之胺基酸： 1) 丙胺酸(A或Ala)、甘胺酸(G或Gly)； 2) 天冬胺酸(D或Asp)、麩胺酸(E或Glu)； 3) 天冬醯胺酸(N或Asn)、麩醯胺酸(Q或Gln)； 4) 精胺酸(R或Arg)、離胺酸(K或Lys)、組胺酸(H或His)； 5) 異白胺酸(I或Ile)、白胺酸(L或Leu)、甲硫胺酸(M或Met)、纈胺酸(V或Val)； 6) 苯丙胺酸(F或Phe)、酪胺酸(Y或Tyr)、色胺酸(W或Trp)； 7) 絲胺酸(S或Ser)、蘇胺酸(T或Thr)；及 8) 半胱胺酸(C或Cys)、甲硫胺酸(M或Met) (參見，例如，Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.；第2版(December 1993)。 術語「相同」或百分率「一致性」在兩個或多個核酸或多肽序列之內文中係指相同的兩個或多個序列或子序列。若序列當針對最大對應性在比較視窗上進行比較及比對時，或使用下列序列比較演算法(或一般技術者可獲得之其他演算法)中之任何一者或藉由手動比對及目視檢查量測指定區域時具有相同胺基酸殘基或核苷酸之百分率(即，在規定區域上約60%一致性、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%一致性)，則該等序列係「大體上相同的」。該一致性可存在於至少約20個胺基酸或核苷酸長度之區域或比較視窗上，或存在於至少約25個胺基酸或核苷酸長度之區域上，或在未規定的情況下，跨多核苷酸或多肽之整個序列。如本文使用之「比較視窗」包括對連續位置之任何區段之參考，例如，至少或約10、15、20、25或30個胺基酸，其中在兩個序列經最佳化比對後，序列可與具有相同數量之連續位置之參考序列進行比較。可適用於測定百分率序列一致性及序列相似性之演算法之實例係BLAST及BLAST 2.0演算法，其等係分別描述於Altschul等人，(1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及Altschul等人，(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中及Smith-Waterman (Smith及Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1):195-7)或Needleman-Wunsch (Needleman及Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53)演算法，其等可用預設參數運行，例如，如描述於彼等個別公開案中。 如本文使用之術語「個體」係指作為治療、觀察或實驗之對象之動物，在一些實施例中，哺乳動物，且在其他實施例中人類。動物可係伴侶動物(例如，狗、貓及類似物)、農場動物(例如，牛、綿羊、豬、馬及類似物)或實驗室動物(例如，大鼠、小鼠、幾內亞豬及類似物)。 如本文使用之術語「有效量」係指所投與之化合物(例如，本文描述之經修飾之鬆弛素多肽)之量，該量可預防、治癒、減輕、緩解、延遲發病、降低嚴重性或在一定程度上減少治療中之疾病、病症或失調症之症狀中之一或多者。含有本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物可投與用於預防、增強及/或治療性治療。 術語「增強」意謂在效用或持續時間上增加或延長所需效應。因此，就增強治療劑之效應而言，術語「增強」係指增加或延長(在效用或持續時間上)其他治療劑對系統之效應之能力。 在預防應用中，含有經修飾之鬆弛素多肽之組合物係向易於或否則處於患特定疾病、失調症或病症之風險下之病患投與。此量被定義為「預防有效量」。 在治療應用中，包含經修飾之非天然胺基酸多肽之組合物係向已患有疾病、病症或失調症之病患以足夠治癒或至少部分阻止或緩解該疾病、失調症或病症之症狀之量投與。此量被定義為「治療有效量」且可取決於該疾病、失調症或病症之嚴重性及病程、先前治療、該病患之健康狀況及對藥物之反應及治療醫師之判斷。熟習此項技術者由例行試驗(例如，劑量遞增臨床試驗)確定此等治療有效量被認為較佳。 術語「治療」係用以係指預防性及/或治療性治療。 如本文關於蛋白質重折疊使用之「還原劑」係定義為將巰基維持於還原態且減少分子內或分子間二硫鍵之任何化合物或材料。合適之還原劑包括(但不限於)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰乙醇、半胱胺酸、半胱胺(2-胺基乙硫醇)及還原型麩胱甘肽。對一般技術者而言顯而易見，各種還原劑適用於本發明之方法及組合物中。 如本文關於蛋白質重折疊使用之「氧化劑」係定義為可自正經氧化之化合物移除電子之任何化合物或材料。合適之氧化劑包括(但不限於)氧化型麩胱甘肽、胱胺酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚糖醇及氧。對一般技術者而言顯而易見，各種氧化劑適用於本發明之方法中。 如本文使用之「變性藥劑」或「變性劑」定義為將引起蛋白質之可逆展開之任何化合物或材料。變性藥劑或變性劑之強度將藉由特定變性藥劑或變性劑之性質及濃度兩者測定。合適之變性藥劑或變性劑可係離液劑、洗滌劑、有機溶劑、水混溶性溶劑、磷脂或兩種或多種此等藥劑之組合。合適之離液劑包括(但不限於)尿素、胍及硫氰酸鈉。有用之洗滌劑可包括(但不限於)強洗滌劑(諸如十二烷基硫酸鈉)或聚氧乙烯醚(例如，吐溫或Triton洗滌劑)、十二烷基肌胺酸鈉(Sarkosyl)、溫和非離子型洗滌劑(例如，毛地黃皂苷)、溫和陽離子型洗滌劑(諸如N-›2,3-(二油醯基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基銨)、溫和離子型洗滌劑(例如，膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)或兩性離子洗滌劑包括(但不限於)磺基甜菜鹼(兩性洗滌劑)、3-(3-氯醯胺基丙基)二甲基銨基-1-丙烷硫酸鹽(CHAPS)及3-(3-氯醯胺基丙基)二甲基銨基-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPSO)。有機、水混溶性溶劑(諸如乙腈、低碳數鏈烷醇(尤其C2至C4鏈烷醇，諸如乙醇或異丙醇)或低碳數鏈烷二醇(尤其C2至C4鏈烷二醇，諸如乙二醇))可用作變性劑。用於本發明中之磷脂可係天然存在之磷脂，諸如磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸及磷脂醯肌醇或合成磷脂衍生物或變體，諸如二己醯基磷脂醯膽鹼或二庚醯基磷脂醯膽鹼。 如本文使用之「重折疊」描述將含有二硫鍵之多肽相對於二硫鍵自不恰當折疊或展開狀態轉化至天然或適當折疊之構形之任何過程、反應或方法。 如本文使用，「共折疊」係明確指採用至少兩條彼此相互作用之多肽且導致展開或不恰當折疊之多肽轉化為天然、適當折疊之多肽之重折疊過程、反應或方法。 術語「受保護」係指防止化學反應性官能基在某些反應條件下之反應之「保護基」或部分之存在。該保護基將取決於保護中之化學反應性基團之類型而變化。例如，若化學反應性基團係胺或醯肼，則保護基可選自由以下組成之群：第三丁氧基羰基(t-Boc)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)。若化學反應性基團係硫醇基，則保護基可係鄰吡啶基二硫化物。若化學反應性基團係羧酸(諸如丁酸或丙酸或羥基)，則保護基可係苄基或烷基(諸如甲基、乙基或第三丁基)。此項技術中已知的其他保護基亦可用於本文描述之方法及組合物中或與本文描述之方法及組合物一起使用，包括光不穩定基團(諸如Nvoc及MeNvoc)。此項技術中已知的其他保護基亦可用於本文描述之方法及組合物中或與本文描述之方法及組合物一起使用。 僅以實例說明之，阻斷/保護基可選自：其他保護基係描述於Greene及Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons, New York, NY, 1999中，該案以全文引用之方式併入本文中。 術語「心血管系統之失調症」或「心血管失調症」包括(例如)下列失調症：高血壓(高血液壓力)、外周及心臟血管失調症、冠心病、穩定及不穩定之心絞痛、心臟病發作、心肌功能不全、異常心臟節律(或心律不整)、持續性缺血性功能障礙(「冬眠心肌」)、暫時性缺血後功能障礙(「心肌頓抑」)、心臟衰竭、外周血流紊亂、急性冠脈症候群、心臟衰竭、心臟肌肉疾病(心肌症)、心肌梗塞及血管疾病(血管疾病)。 術語「心臟衰竭」包括心臟衰竭之急性及慢性臨床表現兩者及疾病之更具體或相關類型，諸如晚期心臟衰竭、急性後心臟衰竭、心腎症候群、伴有腎功能損傷之心臟衰竭、慢性心臟衰竭、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、代償性心臟衰竭、失代償性心臟衰竭、右心臟衰竭、左心臟衰竭、整體衰竭(global failure)、缺血性心肌症、擴張型心肌症、與先天性心臟缺陷相關聯之心臟衰竭、心臟瓣膜缺陷、與心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、二尖瓣狹窄、二尖瓣關閉不全、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣關閉不全、三尖瓣狹窄、三尖瓣關閉不全、肺動脈瓣狹窄、肺動脈瓣關閉不全、與組合心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、心肌發炎(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病心臟衰竭、酒精性心肌症、與心臟儲存失調症相關聯之心臟衰竭、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、惡化之心臟衰竭之急性期、伴有保留射血分數之心臟衰竭(HFpEF)、伴有經減小之射血分數之心臟衰竭(HFrEF)、伴有經減小之射血分數之慢性心臟衰竭(HFrEF)、伴有保留射血分數之慢性心臟衰竭(HFpEF)、後心肌重塑、心絞痛、高血壓、肺性高血壓及肺動脈高血壓。 術語「纖維化失調症」包含以纖維化為特徵之疾病及失調症，其中包括下列疾病及失調症：肝或肝臟纖維化、肝之肝硬化、NASH、肺纖維化或肺纖維化、心肌纖維化、內膜心肌纖維化、腎病、腎小球腎炎、間質性腎纖維化、由糖尿病引起之纖維化損傷、骨髓纖維化及類似纖維化失調症、硬皮症、侷限性硬皮病、瘢痕、肥厚性瘢痕形成(亦在手術程序後形成)、痣、糖尿病性視網膜病、增生性玻璃體視網膜病及結締組織之失調症(例如，結節病)。 術語「與鬆弛素相關聯之失調症」及「與鬆弛素相關聯之疾病」包含可加以預防、治療、緩解或藉由調節體內鬆弛素水平(諸如增加血清鬆弛素蛋白質水平)而另外影響之疾病及失調症。與鬆弛素相關聯之失調症包括(但不限於)本文描述之心血管系統之失調症及纖維化失調症。 包含本文呈現之非天然編碼之胺基酸之多肽可包括一或多個原子經具有與自然中發現之原子質量或質量數不同之原子質量或質量數之原子置換之同位素標記化合物。可併入本發明化合物內之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、氟及氯之同位素，諸如分別2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文描述之某些同位素標記化合物(例如彼等其中併入諸如3H及14C之放射性同位素之化合物)可用於藥物及/或受質組織分佈分析。此外，使用同位素(諸如氘，即，2H)之取代可提供由更大之代謝穩定性引起之某些治療優勢，例如，經增加之活體內半衰期或經減少之劑量需求。 I. 綜述 連接至PK增強劑之經修飾之鬆弛素分子係提供於本發明中。例示性實施例經證實相較於其他經修飾或野生型鬆弛素多肽顯示至少一種選自以下之有利性質：經增加之活體內半衰期、經減少之腎液泡形成、經增加之腎血流量、較高之可溶性、經減少之聚集、較低之黏性、經增加之可製造性。 在一項態樣中，本發明提供包含非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽，其中： (a)該經修飾之鬆弛素多肽包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於選自由以下組成之群之位置處經非天然編碼之胺基酸取代：A鏈殘基1、A鏈殘基2、A鏈殘基5、A鏈殘基13、A鏈殘基18、B鏈殘基5、B鏈殘基7及B鏈殘基25，且在該鬆弛素A鏈及/或該鬆弛素B鏈中視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入及/或刪除； (b)該非天然編碼之胺基酸具有結構：， 其中R基係除以下中發現之側鏈外之任何取代基：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸； (c)該非天然編碼之胺基酸係連接至藥物動力學增強劑，該藥物動力學增強劑包含在2與30個胺基酸之間的肽組分及半衰期延長部分。 在一些實施例中，該鬆弛素A鏈多肽可包含於殘基1處經該非天然編碼之胺基酸取代且視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入及/或刪除之SEQ ID NO: 4。該鬆弛素A鏈多肽可包含於殘基1處經該非天然編碼之胺基酸取代且視需要具有一個額外之胺基酸取代、插入或刪除之SEQ ID NO: 4。該鬆弛素B鏈多肽可包含視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入或刪除之SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。該鬆弛素B鏈多肽可包含視需要具有一個額外之胺基酸取代、插入或刪除之SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。該鬆弛素A鏈多肽可包含於殘基1處經該非天然編碼之胺基酸取代之SEQ ID NO: 4且該鬆弛素B鏈多肽可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。 在一些實施例中，該至少一種非天然編碼之胺基酸可包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、半卡肼基、疊氮基或炔基。該非天然編碼之胺基酸可包含苯丙胺酸衍生物。該非天然編碼之胺基酸可選自對位取代、鄰位取代或間位取代之苯丙胺酸。該非天然編碼之胺基酸可選自對位取代、鄰位取代或間位取代之苯丙胺酸，其包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、半卡肼基、疊氮基或炔基。該非天然編碼之胺基酸可包含對乙醯基-L-苯丙胺酸。該非天然編碼之胺基酸可連接至該藥物動力學增強劑。例如，該非天然編碼之胺基酸可通過肟鍵聯或三唑鍵聯(例如，肟鍵聯)連接至該藥物動力學增強劑。 在一些實施例中，該鬆弛素A鏈多肽可包含SEQ ID NO: 35，及該鬆弛素B鏈多肽可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6，且其中該鬆弛素A鏈或B鏈視需要可具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入或刪除。該經修飾之鬆弛素多肽可包含與SEQ ID NO: 35具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素A鏈多肽及與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素B鏈多肽。該鬆弛素A鏈多肽可與SEQ ID NO: 35具有至少95%胺基酸序列一致性。該鬆弛素B鏈多肽可與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%胺基酸序列一致性。該鬆弛素A鏈多肽可包含SEQ ID NO: 35及該鬆弛素B鏈多肽可包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，該鬆弛素A鏈多肽可包含SEQ ID NO: 35及該鬆弛素B鏈多肽可包含SEQ ID NO: 6。 在一些實施例中，該肽組分可包含1至25個胺基酸，例如，2至20個胺基酸、3至10個胺基酸或4至8個胺基酸。該肽組分可包含Glu、Gluγ 、GGGGS‑Gluγ (SEQ ID NO: 139)、DRDDRD (SEQ ID NO: 102)、KKKKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ (SEQ ID NO: 104)、GGGEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 105)、EEEGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 106)、KKKGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 107)、GETGSSGEGT-Gluγ (SEQ ID NO: 108)、GGGKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 109)、GSHHHHHGS-Gluγ (SEQ ID NO: 110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar-Sar-Gluγ (SEQ ID NO: 111)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ (SEQ ID NO: 112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ (SEQ ID NO: 113)、KKKSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 118)、KKSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 114)、KKSGGSGG-Glua (SEQ ID NO: 115)、KKSAGSAG-Gluγ (SEQ ID NO: 116)、KSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 117)、KKSGGSGGEE-Gluγ (SEQ ID NO: 119)、dKdKdKdKdKdK-Gluγ (SEQ ID NO: 120)、EESGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 121)、GSGSGSGS-Gluγ (SEQ ID NO: 123)、EEEGGG-dGluγ (SEQ ID NO: 128)、EGGGGSK-Gluγ (SEQ ID NO: 130)、EEEEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 131)、EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 133)、EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG (SEQ ID NO: 135)、EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 136)、KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Gluγ (SEQ ID NO: 137)、EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA-Gluγ (SEQ ID NO: 138)、KK-Gluγ (SEQ ID NO: 140)、Gluγ 、KGPKGP-Gluγ (SEQ ID NO: 146)、SGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 147)、KGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 148)、KGGGSE-Gluγ (SEQ ID NO: 149)、GSPGSP-Gluγ (SEQ ID NO: 150)、GGGGP-Gluγ (SEQ ID NO: 151)、EGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 152)、EGGGP-Gluγ (SEQ ID NO: 153)、KGPGSE-Gluγ (SEQ ID NO: 154)、精胺-Gluγ 或KKGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 156)。 該肽組分可包含GGGGS‑Gluγ (SEQ ID NO: 139)、DRDDRD (SEQ ID NO: 102)、KKKKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ (SEQ ID NO: 104)、GGGEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 105)、EEEGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 106)、KKKGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 107)、GGGKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 109)、GSHHHHHGS-Gluγ (SEQ ID NO: 110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ (SEQ ID NO: 112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ (SEQ ID NO: 113)或KSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 117)。 該肽組分可包含Gluγ 。例如，該肽組分可包含GGGGS‑Gluγ (SEQ ID NO: 139)。 在例示性實施例中，該經修飾之鬆弛素多肽可包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於A鏈殘基1處經非天然編碼之胺基酸取代，其中該非天然編碼之胺基酸係連接至該藥物動力學增強劑且該藥物動力學增強劑包含肽組分GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)。在一些實施例中，該肽組分可(例如)經由肟鍵聯共價連接至該非天然編碼之胺基酸。 在例示性實施例中，該半衰期延長部分可包含脂肪酸或其衍生物，其中該脂肪酸或其衍生物可共價連接至肽組分。該半衰期延長部分可包含飽和脂肪酸或其衍生物。該半衰期延長部分可包含以羧酸終止之脂肪酸。該半衰期延長部分可包含式I脂肪酸：-Cn-COOH (式I)，其中n可在10與18之間，諸如在12與17之間或13、14、15或16。在一些實施例中，式I之-Cn-可包含第一羰基碳及-(CH2 )n-1 -。例如，-C13-可係-(C=O)-(CH2 )12 -；-C14-可係-(C=O)-(CH2 )13 -；-C15-可係-(C=O)-(CH2 )14 -。在一些實施例中，該脂肪酸之第一羰基碳可視需要經由醯胺鍵結合至(γ) Glu殘基。在一些實施例中，該脂肪酸之第一羰基碳可經由醯胺鍵結合至γ Glu殘基。 在其他實施例中，該半衰期延長部分可包含-C14-COOH。 在其他實施例中，該藥物動力學增強劑可包含以下結構：(式II) 其中式II之胺氧基係(例如)經由肟鍵聯連接至該經修飾之鬆弛素多肽中之非天然胺基酸。 在其他實施例中，該半衰期延長部分可通過醯胺鍵結合至該肽組分。 在其他實施例中，該鬆弛素多肽可包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於A鏈殘基1處經非天然編碼之胺基酸取代；其中該非天然編碼之胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸；其中該非天然編碼之胺基酸係連接至該藥物動力學增強劑，該藥物動力學增強劑包含包括GGGGS‑Gluγ (SEQ ID NO: 139)之肽組分；及包含-C14-COOH之半衰期延長部分，諸如-(C=O)-(CH2 )13 -COOH。 在另一實施例中，本發明提供包含以下結構之經修飾之鬆弛素多肽：(式III)， 其中該AQ1-鬆弛素包含與SEQ ID NO: 35具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素A鏈多肽及與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素B鏈多肽，其中式III中繪示之對乙醯基-L-苯丙胺酸係位於該鬆弛素A鏈多肽之N端。該鬆弛素A鏈多肽可與SEQ ID NO: 35具有至少95%胺基酸序列一致性。該鬆弛素B鏈多肽可與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%胺基酸序列一致性。該AQ1-鬆弛素可包含SEQ ID NO: 35之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽。 在另一實施例中，本發明提供包含鬆弛素結合物「AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139) -C14-COOH」之經修飾之鬆弛素多肽，其包含SEQ ID NO: 35之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其中位於該鬆弛素A鏈多肽之N端之對乙醯基-L-苯丙胺酸可連接至PK增強劑GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH，如式III中繪示：(式III)。 在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素多肽包含圖8中顯示之結構。 在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素多肽包含圖9中顯示之結構。 在例示性實施例中，該經修飾之鬆弛素多肽可係生物活性的。該經修飾之鬆弛素多肽針對一或多種與鬆弛素相關聯之疾病或病症之治療可係治療有效的。如相較於比較化合物(諸如AQ1-20 kDa PEG (AQ1鬆弛素以20 kDa之平均MW結合至PEG))，該經修飾之鬆弛素多肽可顯示經減少之腎液泡形成。如相較於比較化合物(諸如AQ1-20 kDa PEG)，該經修飾之鬆弛素多肽可顯示無腎功能損傷或經減小之腎功能損傷。該腎功能可藉由測定經評估之腎小球濾過率、肌酸清除率、胰島素腎小球濾過率或同位素腎小球濾過率中之一或多者進行量測。 在例示性實施例中，該經修飾之鬆弛素多肽在投與後不顯示經減少之腎血流量及/或可增加腎血流量。腎血流量可藉由測定對胺基馬尿酸鹽清除率進行量測。 如相較於比較化合物(諸如野生型鬆弛素)，該經修飾之鬆弛素多肽可顯示經增加之活體內半衰期，例如，增加至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍。 在另一態樣中，本發明提供包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供包含有效量之如本文描述之用於治療或預防與鬆弛素相關聯之失調症之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 在另一態樣中，本發明提供治療或預防與鬆弛素相關聯之疾病之方法，其包括向有此需要之病患投與有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本發明提供治療或預防心血管疾病之方法，其包括向有此需要之病患投與有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。該心血管疾病可選自冠狀動脈疾病、心臟病發作、心律不整、心臟衰竭、心肌症及血管疾病。 在另一態樣中，本發明提供治療、預防或緩解心臟衰竭之症狀之方法，其包括向有此需要之病患投與有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。該心臟衰竭可選自晚期心臟衰竭、心腎症候群、伴有腎功能損傷之心臟衰竭、慢性心臟衰竭、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、急性心臟衰竭、急性後心臟衰竭、代償性心臟衰竭、失代償性心臟衰竭、右心臟衰竭、左心臟衰竭、整體心臟衰竭、缺血性心肌症、擴張型心肌症、與先天性心臟缺陷相關聯之心臟衰竭、與心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、與組合心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、糖尿病心臟衰竭、酒精性心肌症、與心臟儲存失調症相關聯之心臟衰竭、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、後心肌重塑、伴有保留射血分數之心臟衰竭(HFpEF)、伴有經減小之射血分數之心臟衰竭(HFrEF)、心絞痛、高血壓、肺性高血壓及肺動脈高血壓。 在一些實施例中，該心臟衰竭可選自慢性心臟衰竭、急性心臟衰竭、急性後心臟衰竭、伴有經減小之射血分數之慢性心臟衰竭(HFrEF)、伴有保留射血分數之慢性心臟衰竭(HFpEF)、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、後心肌重塑、心絞痛、高血壓、肺性高血壓及肺動脈高血壓。 在一些實施例中，該心臟衰竭可選自急性後心臟衰竭、晚期心臟衰竭、心腎症候群及伴有腎功能損傷之心臟衰竭。 該等治療方法可進一步包含組合(同時或依序)投與該經修飾之鬆弛素多肽與至少一種選自以下之額外治療劑：ACE抑制劑、β-阻斷劑、利尿劑、鹽皮質素受體拮抗劑、蘭尼鹼受體調節劑、SERCA2a活化劑、腎素抑制劑、鈣通道阻斷劑、腺苷A1受體促效劑、局部腺苷A1受體、多巴胺β-羥化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、針對選擇之細胞傳訊通道具有偏好促效作用之血管緊張素II受體拮抗劑、血管緊張素II受體拮抗劑及腦啡肽酶抑制劑之組合、腦啡肽酶抑制劑、可溶性鳥苷酸環化酶活化劑、肌凝蛋白ATPase活化劑、rho激酶1抑制劑、rho激酶2抑制劑、愛帕琳肽受體促效劑、硝醯基供體化合物、鈣依賴性激酶II抑制劑、抗纖維化劑、半乳糖凝集素-3抑制劑、升壓素受體拮抗劑、FPR2受體調節劑、利尿鈉肽受體促效劑、瞬時受體電位類香草素4離子通道阻斷劑、抗心律不整劑、If 「超極化啟動電流」通道阻斷劑、硝酸鹽、洋地黃化合物、強心劑及β-受體促效劑、細胞膜再封閉劑(例如，帕洛沙姆188)、抗高血脂劑、血漿HDL-提高劑、抗高膽固醇血症劑、膽固醇生物合成抑制劑(諸如HMG CoA還原酶抑制劑)、LXR促效劑、FXR促效劑、普羅布考(probucol)、雷洛昔芬(raloxifene)、菸鹼酸、菸鹼醯胺、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、陰離子交換樹脂、季胺、銷膽胺、考來替泊(colestipol)、低密度脂蛋白受體誘導劑、氯貝丁酯(clofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、苯紮貝特(bezafibrate)、環丙貝特(ciprofibrate)、吉非貝齊(gemfibrizol)、維他命B6、維他命B12、抗氧化維他命、抗糖尿病藥劑、血小板聚集抑制劑、纖維蛋白原受體拮抗劑、阿司匹林及纖維酸衍生劑、PCSK9抑制劑、阿司匹林及P2Y12抑制劑(諸如氯吡格雷(Clopidogrel))。 在另一態樣中，本發明提供治療、預防或緩解與纖維化相關聯之疾病之症狀之方法，其包括向有此需要之病患投與治療有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。與纖維化相關聯之該疾病可包含心臟、肺、腎、骨髓或肝之纖維化、皮膚纖維化或纖維化眼失調症。與纖維化相關聯之該疾病可選自肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、前期肝硬化、瀰漫性實質性肺疾病、囊性纖維化、肺纖維化、進行性大量纖維化、特發性肺纖維化、注射纖維化、腎纖維化、慢性腎疾病、糖尿病腎疾病、局灶節段性腎小球硬化、膜性腎病、IgA腎病、骨髓纖維化、心臟衰竭、代謝性心臟衰竭、心肌纖維化、白內障纖維化、白內障、眼瘢痕、胰臟纖維化、皮膚纖維化、腸纖維化、腸狹窄、內膜心肌纖維化、心房纖維化、縱膈纖維化、克隆氏症(Crohn’s disease)、腹膜後腔纖維化、瘢痕、腎源性系統性纖維化、硬皮症、系統性硬化症、關節纖維化、佩羅尼症候群(Peyronie’s syndrome)、杜普伊特倫攣縮(Dupuytren’s contracture)、糖尿病神經病、黏連性關節囊炎、酒精性肝疾病、肝脂肪變性、病毒性肝炎、膽道疾病、原發性血色病、藥物相關性肝硬化、隱源性肝硬化、威爾森氏症(Wilson’s disease)、α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、間質性肺疾病(ILD)、人類纖維化肺疾病、黃斑變性、視網膜病變、玻璃體視網膜病變、心肌纖維化、格雷夫眼病(Grave’s ophthalmopathy)、藥物誘導之麥角化、心血管疾病、動脈粥樣硬化/再狹窄、增生性瘢痕、原發性或特發性骨髓纖維化、炎症性腸病及膠原性結腸炎。 該治療與纖維化相關聯之疾病之方法可進一步包含該病患組合(同時或依序)投與該經修飾之鬆弛素多肽與至少一種抗纖維化劑。該抗纖維化劑可選自尼達尼布(nintedanib)、吡非尼酮(Pirfenidone)、LPA1拮抗劑、LPA1受體拮抗劑、GLP1類似物、川隆單抗(tralokinumab) (IL-13, AstraZeneca)、維莫德吉(vismodegib) (刺蝟拮抗劑，Roche)、PRM-151 (穿透素-2，TGF β-1, Promedior)、SAR-156597 (雙特異性Mab IL-4&IL-13, Sanofi)、辛圖珠單抗(simtuzumab) ((抗離胺醯氧化酶樣2 (抗LOXL2)抗體，Gilead)、CKD-942、PTL-202 (PDE inh./pentoxifylline/NAC oral control. release, Pacific Ther.)、奧米帕昔布(omipalisib) (口服PI3K/mTOR抑制劑，GSK)、IW-001 (口服溶膠牛V型膠原模式，ImmuneWorks)、STX-100 (整合素α V/β-6螞蟻，Stromedix /Biogen)、干擾素γ-1b (Actimmune)(IFN γ)、PC-SOD (midismase；吸入，LTT Bio-Pharma /CKD Pharm)、來瑞珠單抗(抗IL-13 SC人類化mAb, Roche)、AQX-1125 (SHIP1活化劑，Aquinox)、CC-539 (JNK抑制劑，Celgene)、FG-3019 (FibroGen)、SAR-100842 (Sanofi)及奧貝膽酸(obeticholic acid )(OCA或INT-747，Intercept)。 在另一態樣中，本發明提供治療或預防腎衰竭之方法，其包括有此需要之病患投與治療有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本發明提供改善、穩定或恢復有此需要之病患之腎功能之方法，其包括向該病患投與治療有效量之經修飾之鬆弛素多肽或包含如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。 在另一態樣中，本發明提供製造如本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之方法，其包括：(a)提供包含鬆弛素A鏈及鬆弛素B鏈之多肽，其中該多肽包含非天然編碼之胺基酸；及(b)將該非天然編碼之胺基酸連接至該藥物動力學增強劑。該非天然編碼之胺基酸可藉由肟鍵聯連接至該藥物動力學增強劑，肟鍵聯例如將該非天然編碼之胺基酸連接至該藥物動力學增強劑之肽組分。該肟鍵聯可藉由羰基及胺氧基之反應形成。該羰基可係該非天然編碼之胺基酸之取代基，及該胺氧基可係該藥物動力學增強劑之構成。該胺氧基可係該非天然編碼之胺基酸之取代基，及該羰基可係該藥物動力學增強劑之構成，例如，該藥物動力學增強劑之肽組分之構成。該非天然編碼之胺基酸可經核糖體併入該多肽內。 II.一般重組核酸及用於與本文揭示之經修飾之鬆弛素多肽一起使用之方法 在本發明之實施例中，編碼受關注之經修飾之鬆弛素多肽之核酸可使用重組方法分離、選殖及通常改變。此等實施例可用於(包括(但不限於))蛋白質表現或衍生自經修飾之鬆弛素多肽之變體、衍生物或其他序列之產生期間。在一些實施例中，編碼本文揭示之經修飾之鬆弛素多肽之序列係可操作地連接至異源性啟動子。在一些實施例中，於編碼經修飾之鬆弛素多肽之多核苷酸序列中之DNA密碼子用法可使用此項技術中熟知的技術進行最佳化以供大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如，CHO)表現。 編碼鬆弛素A鏈(SEQ ID NO: 10)、鬆弛素B鏈(SEQ ID NO: 11)、鬆弛素A及B鏈(SEQ ID NO: 12)及前導序列(SEQ ID NO: 13-14)之例示性多核苷酸係提供於本文中。 編碼本文描述之經修飾之鬆弛素多肽之核苷酸序列可基於親代多肽之胺基酸序列合成，包括(但不限於)具有SEQ ID NO: 4、5、6、35、36或37中顯示之胺基酸序列及然後改變該核苷酸序列以便於實現相關胺基酸殘基之引入(即，併入或取代)或移除(即，刪除或取代)。該核苷酸序列可根據習知方法藉由定點誘變加以合宜地修飾。或者，該核苷酸序列可藉由化學合成製備，包括(但不限於)藉由使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸係基於所需多肽之胺基酸序列進行設計，且較佳地選擇彼等在其中待產生重組多肽之宿主細胞中有利之密碼子。 另外，編碼非天然編碼之胺基酸之選擇密碼子(selector codon)可併入多核苷酸序列內，如本文中進一步描述。 本發明亦係關於用於經由正交tRNA/RS對活體內併入非天然胺基酸之真核宿主細胞、非真核宿主細胞及有機體。宿主細胞係用本文之多核苷酸或包括本文之多核苷酸之構築體基因改造，包括(但不限於)轉化、轉導或轉染)，包括本文之多核苷酸之構築體包括(但不限於)本文之載體，其可係(例如)選殖載體或表現載體。例如，用於正交tRNA、正交tRNA合成酶及待衍生之蛋白質之編碼區域係可操作地連接至在所需宿主細胞中發揮作用之基因表現控制元件。該載體可(例如)呈質體、黏質體、噬菌體、細菌、病毒、裸多核苷酸或經結合之多核苷酸之形式。該等載體可藉由標準方法引入細胞及/或微有機體內。 III. 選擇密碼子 本發明之選擇密碼子擴展蛋白質生物合成機器之基因密碼子框架。例如，選擇密碼子包括(但不限於)獨一無二之三鹼基密碼子、無義密碼子，諸如終止密碼子，包括(但不限於)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA)、非天然密碼子、四個或多個鹼基密碼子、稀有密碼子或類似物。一般技術者當可輕易地瞭解，存在大量可引入所需基因或多核苷酸內之選擇密碼子，包括(但不限於)在編碼經修飾之鬆弛素多肽之至少一部分之單一多核苷酸中一或多個、兩個或多個、三個或多個、4、5、6、7、8、9、10或多個。 在一項實施例中，該等方法涉及使用用於活體內併入一或多種非天然(即，經非天然編碼)胺基酸之終止密碼子之選擇密碼子。例如，產生識別終止密碼子(包括(但不限於))UAG及經具有所需非天然胺基酸之O-RS胺醯化之O-tRNA。此O-tRNA無法由天然存在之宿主之胺基醯基-tRNA合成酶識別。習知定點誘變可用以在受關注之多肽中於受關注之位點處引入終止密碼子，包括(但不限於) TAG。參見，例如，Sayers, J.R.等人，(1988),Nucleic Acids Res , 16:791-802。當O-RS、O-tRNA及編碼受關注之多肽之核酸在活體內組合時，併入非天然胺基酸以回應於UAG密碼子以在規定位置處產生含有非天然胺基酸之多肽。 活體內併入非天然胺基酸可在不對真核宿主細胞造成顯著干擾之情況下完成。例如，因為UAG密碼子之抑制效用取決於O-tRNA，包括(但不限於)琥珀抑制基因tRNA與真核釋放因子(包括(但不限於) eRF) (其結合至終止密碼子及開始自核糖體釋放生長肽)之間的競爭，所以抑制效用可藉由(包括(但不限於))增加O-tRNA及/或抑制基因tRNA之表現水平進行調節。 非天然胺基酸亦可用稀有密碼子編碼。例如，當活體外蛋白質合成反應中之精胺酸濃度減小時，該稀有精胺酸密碼子AGG已經證實有效藉由經丙胺酸醯化之合成tRNA插入Ala。參見，例如，Ma等人，Biochemistry , 32:7939 (1993)。在此情況下，該合成tRNA與在大腸桿菌中作為次要物質存在之天然存在之tRNAArg競爭。 選擇密碼子亦包含經擴展之密碼子，包括(但不限於)四個或多個鹼基密碼子，諸如四、五、六或多個鹼基密碼子。四個鹼基密碼子之實例包括(但不限於)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU及類似物。五個鹼基密碼子之實例包括(但不限於)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC及類似物。 在一項實施例中，基於稀有密碼子或無義密碼子之經擴展之密碼子可用於本發明中，其等可減少在其他非所需位點處之錯義通讀及移碼抑制。 就給定之系統而言，選擇密碼子亦可包括天然三個鹼基密碼子中之一者，其中內源性系統不使用(或很少使用)天然鹼基密碼子。例如，此包括缺乏識別天然三個鹼基密碼子之tRNA之系統，及/或其中該三個鹼基密碼子係稀有密碼子之系統。 針對受關注之蛋白質或多肽(諸如經修飾之鬆弛素多肽)編碼之基因可使用一般技術者已知及本文描述之方法誘變，以包括(例如)用於併入非天然胺基酸之一或多個選擇密碼子。例如，用於受關注之蛋白質之核酸係經誘變以包括一或多個選擇密碼子，提供用於併入一或多個非天然胺基酸。本發明包括任何此變體，包括(但不限於)突變體，任何蛋白質之形式，例如，包括至少一個非天然胺基酸。 編碼受關注之蛋白質(諸如經修飾之鬆弛素多肽)之核酸分子可易於經突變以在多肽之任何所需位置引入半胱胺酸。半胱胺酸係廣泛用以在受關注之蛋白質上引入反應性分子、水溶性聚合物、蛋白質或各種其他分子。 IV. 非天然編碼之胺基酸 各種非天然編碼之胺基酸係適用於本發明中。可將任何數量之非天然編碼之胺基酸引入經修飾之鬆弛素多肽內。一般而言，經引入之非天然編碼之胺基酸對20種常見之經基因編碼之胺基酸(即，丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸)係大體上化學惰性的。在一些實施例中，該等非天然編碼之胺基酸包括可與20種常見胺基酸中未發現之官能基(包括(但不限於)疊氮基、酮、醛及胺氧基)有效及選擇性反應以形成穩定結合物之側鏈官能基。例如，包括含有疊氮基官能基之非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽可與聚合物或PK延長劑或或者含有炔烴部分之第二多肽反應以形成穩定結合物，疊氮化物及炔烴官能基之選擇性反應導致形成胡伊斯根(Huisgen)[3+2]環加成產物。α-胺基酸之一般結構係如下闡述(式IV)：非天然編碼之胺基酸係通常具有上文列舉之式之任何結構，其中R基係除二十種天然胺基酸中使用之任何一者外之任何取代基，且可適用於本發明之經修飾之鬆弛素多肽中。因為本發明之非天然編碼之胺基酸通常僅在側鏈之結構上不同於天然胺基酸，所以非天然編碼之胺基酸與其他胺基酸(包括(但不限於)天然或非天然編碼)以與其中其等在天然存在之多肽中形成之方式相同之方式形成醯胺鍵。然而，該等非天然編碼之胺基酸具有將其等與天然胺基酸進行區分之側鏈基團。例如，R視需要包含烷基-、芳基-、醯基-、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醇基、硒基-、磺醯基-、硼酸根、硼酸酯基、磷酸基、膦醯基、膦、雜環、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥基胺、胺基或類似物或其任何組合。 適用於本發明中及適用於與PK延長劑及聚合物反應之例示性非天然編碼之胺基酸包括(但不限於)彼等具有羰基、胺氧基、肼、醯肼、半卡肼、疊氮化物及炔烴反應性基團者。在一些實施例中，非天然編碼之胺基酸包含醣部分。此等胺基酸之實例包括N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-半乳糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-蘇胺酸、N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-天冬醯胺酸及O-甘露糖胺基-L-絲胺酸。 本文提供之許多非天然編碼之胺基酸可購買獲得，例如，購買自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)、Novabiochem (EMD Biosciences之部門，Darmstadt, Germany)或Peptech (Burlington, MA, USA)。彼等無法購買獲得者係如本文提供或使用一般技術者已知的標準方法視需要合成。就有機合成技術而言，參見，例如，Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)；Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)；及Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (第三版，A及B部分，1990, Plenum Press, New York)。亦參見美國專利案第7,045,337及7,083,970號，其等係以全文引用之方式併入本文中。除含有新穎側鏈之非天然胺基酸外，可適用於本發明中之非天然胺基酸亦視需要包含經修飾之主鏈結構，包括(但不限於)如由式V及VI之結構闡述： 其中Z通常包含OH、NH2 、SH、NH-R¢或S-R¢；可相同或不同之X及Y通常包含S或O，及視需要相同或不同之R及R'係通常選自與上文針對具有式I之非天然胺基酸描述之R基之成分之相同列表及氫。例如，本發明之非天然胺基酸在如由式V及VI闡述之胺基或羧基中視需要包含取代。此類非天然胺基酸包括(但不限於) a-羥基酸、a-硫代酸、a-胺基硫羧酸，包括(但不限於)具有對應於常見二十種天然胺基酸之側鏈或非天然側鏈。另外，於a-碳處之取代視需要包括(但不限於) L、D或經a-a-雙取代之胺基酸，諸如D-麩胺酸、D-丙胺酸、D-甲基-O-酪胺酸、胺基丁酸及類似物。其他結構替代物包括環形胺基酸，諸如脯胺酸類似物及3、4、6、7、8及9員環脯胺酸類似物、b及g胺基酸，諸如經取代之b-丙胺酸及g-胺基丁酸。 許多非天然胺基酸係基於天然胺基酸(諸如酪胺酸、麩醯胺酸、苯丙胺酸及類似物)且適用於本發明中。酪胺酸類似物包括(但不限於)對位取代之酪胺酸、鄰位取代之酪胺酸及間位取代之酪胺酸，其中該經取代之酪胺酸包含(包括(但不限於))酮基(包括(但不限於)乙醯基)、苯甲醯基、胺基、肼、羥基胺、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、C6 -C20 直鏈或分支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-甲基、聚醚基團、硝基、炔基或類似物。另外，亦設想經多取代之芳環。可適用於本發明中之麩醯胺酸類似物包括(但不限於) a-羥基衍生物、經g取代之衍生物、環形衍生物及經醯胺取代之麩醯胺酸衍生物。可適用於本發明中之實例苯丙胺酸類似物包括(但不限於)對位取代之苯丙胺酸、鄰位取代之苯丙胺酸及間位取代之苯丙胺酸，其中該取代基包含(包括(但不限於))羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、疊氮基、碘基、溴基、酮基(包括(但不限於)乙醯基)、苯甲醯基、炔基或類似物。可適用於本發明中之非天然胺基酸之特定實例包括(但不限於)對乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcb-絲胺酸、L-多巴、經氟化之苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷酸絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對碘基苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸及對炔丙氧基苯丙胺酸及類似物。 在一項實施例中，本文提供包含非天然胺基酸(諸如對乙醯基-L-苯丙胺酸)之經修飾之鬆弛素多肽之組合物。本文亦提供包含對乙醯基-L-苯丙胺酸及(包括(但不限於))蛋白質及/或細胞之各種組合物。在一項態樣中，包括對乙醯基-L-苯丙胺酸非天然胺基酸之組合物進一步包括正交tRNA。該非天然胺基酸可結合(包括(但不限於)共價)至正交tRNA，包括(但不限於)通過胺基-醯基鍵共價結合至正交tRNA，共價結合至正交tRNA之末端核糖之3'OH或2'OH等。 本文描述之經修飾之鬆弛素多肽可包含標題為「Relaxin polypeptides comprising non-naturally encoded amino acids」之美國專利案第8,735,539號中描述之非天然編碼之胺基酸，該案以全文引用之方式併入本文中。 V. 非天然胺基酸之結構及合成 在一些實施例中，本發明提供由肟鍵或鍵聯連接至PK延長劑(例如，包含脂肪酸)之經修飾之鬆弛素多肽。許多類型之非天然編碼之胺基酸係適用於肟鍵之形成。此等包括(但不限於)含有羰基、二羰基、羰基樣、經掩蔽之羰基、受保護之羰基或羥基胺基之非天然編碼之胺基酸。此等胺基酸、其等結構及合成係描述於美國專利案第8,012,931號及第8,735,539號中，其等係以全文引用之方式併入本文中。 非天然編碼之胺基酸(包括含有羥基胺之胺基酸)之例示性結構及合成方法已為此項技術已知，例如，如揭示於美國專利案第7,332,571號、美國專利公開案第2006/0194256、2006/0217532及2006/0217289號及WO 2006/069246中，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。 非天然編碼之胺基酸之化學合成 適用於本發明中之許多非天然胺基酸可購買獲得，例如，可購買自Sigma (USA)或Aldrich (Milwaukee, WI, USA)。彼等無法購買獲得者係如本文提供或如各種公開案中提供或使用一般技術者已知的標準方法視需要合成。 A. 羰基反應性基團 具有羰基反應性基團之胺基酸容許各種反應經由尤其親核加成或醛醇縮合反應以連接分子(包括(但不限於) PEG或其他水溶性分子，諸如肽組分)。 對乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸及間乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸之合成係描述於Zhang, Z.等人，Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)中，其係以全文引用之方式併入本文中。其他含有羰基之胺基酸可由一般技術者類似製造。 在一些實施例中，包含非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽可經化學修飾以產生反應性羰基官能基。例如，適用於結合反應之醛官能基可產生自具有相鄰胺基及羥基之官能基。 在本發明中，攜載相鄰羥基及胺基之非天然編碼之胺基酸可作為「經掩蔽」之醛官能基併入多肽內。例如，5-羥基離胺酸攜載與ε胺相鄰之羥基。用於產生醛之反應條件通常涉及在溫和條件下添加莫耳過量之偏過碘酸鈉以避免在多肽內之其他位點處氧化。氧化反應之pH係通常約7.0。典型之反應涉及將約1.5莫耳過量之偏過碘酸鈉添加至多肽之緩衝溶液，接著在黑暗中培養約10分鐘。參見，例如，美國專利案第6,423,685號，其係以全文引用之方式併入本文中。 羰基官能基在溫和條件下於水溶液中可與含有肼、醯肼、羥基胺或半卡肼之試劑選擇性反應以分別形成在生理條件下穩定之對應之腙、肟或半卡腙鍵聯。參見，例如，Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)；Shao, J. and Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)。此外，羰基獨一無二之反應性容許在其他胺基酸側鏈之存在下選擇性修飾。參見，例如，Cornish, V. W.等人，J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996)；Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992)；Mahal, L. K.等人，Science 276:1125-1128 (1997)。 B. 肼、醯肼或半卡肼反應性基團 含有親核基團(諸如肼、醯肼或半卡肼)之非天然編碼之胺基酸容許與各種親電基團反應以形成結合物。 含有醯肼、肼及半卡肼之胺基酸係獲得自商業來源。例如，L-麩胺酸-g-醯肼係獲得自Sigma Chemical (St. Louis, MO)。無法購買獲得之其他胺基酸可由一般技術者製備。參見，例如，美國專利案第6,281,211號，其係以全文引用之方式併入本文中。 含有攜載醯肼、肼或半卡肼官能基之非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽可與含有醛或具有類似化學反應性之其他官能基之各種分子有效且選擇性反應。參見，例如，Shao, J.及Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)。醯肼、肼及半卡肼官能基之獨一無二之反應性使得其等相較於20種常見胺基酸上存在之親核基團(包括(但不限於)絲胺酸或蘇胺酸之羥基或離胺酸及N端之胺基)對醛、酮及其他親電基團明顯更具反應性。 C. 含有胺氧基之胺基酸 含有胺氧基(亦稱為羥基胺)之非天然編碼之胺基酸容許與各種親電基團反應以形成結合物(包括(但不限於)具有PEG或肽組分)。與肼、醯肼及半卡肼類似，胺氧基之經增強親核性容許其與含有醛或具有類似化學反應性之其他官能基之各種分子有效及選擇性反應。參見，例如，Shao, J.及Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)；H. Hang及C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001)。而與肼基反應之結果係對應之腙，然而，肟通常源自於胺氧基與含有羰基之基團(諸如酮)之反應。 含有胺氧基之胺基酸可製備自容易獲得之胺基酸前驅物(高絲胺酸、絲胺酸及蘇胺酸)。參見，例如，M. Carrasco及R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003)。某些含有胺氧基之胺基酸(諸如L-2-胺基-4-(胺氧基)丁酸))已經自天然來源分離(Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)。其他含有胺氧基之胺基酸可由一般技術者製備。 D. 疊氮化物及炔烴反應性基團 疊氮化物及炔烴官能基之獨一無二之反應性使得其等適用於多肽及其他生物分子之選擇性修飾。有機疊氮化物(特定言之，脂族疊氮化物)及炔烴通常對一般反應性化學條件穩定。特定言之，疊氮化物及炔烴官能基兩者對天然生成之多肽中發現之20種常見胺基酸之側鏈(即，R基)惰性。然而，當緊密靠近時，顯示疊氮化物及炔基之「彈簧加載」性質且其等經由胡伊斯根[3+2]環加成反應選擇性且有效地反應以產生對應之三唑。參見，例如，Chin J.等人，Science 301:964-7 (2003)；Wang, Q.等人，J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003)；Chin, J. W.等人，J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)。 因為胡伊斯根環加成反應涉及選擇性環加成反應(參見，例如，Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(Trost, B. M.編，1991)，第1069至1109頁；胡伊斯根，R. in 1,3-DIPOLAR環加成 CHEMISTRY, (Padwa, A.編，1984)，第1至176頁)而非親核取代，因此攜載含有疊氮化物及炔烴之側鏈之非天然編碼之胺基酸之併入容許所得多肽在非天然編碼之胺基酸之位置處經選擇性修飾。涉及含有疊氮化物或炔烴之經修飾之鬆弛素多肽之環加成反應可在室溫下在水性條件下藉由在催化量的用於將Cu(II)當場還原為Cu(I)之還原劑之存在下添加Cu(II) (包括(但不限於)呈催化量CuSO4 之形式)進行。參見，例如，Wang, Q.等人，J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003)；Tornoe, C. W.等人，J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002)；Rostovtsev等人，Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002)。例示性還原劑包括(包括(但不限於))抗壞血酸鹽、金屬銅、奎寧、氫醌、維他命K、麩胱甘肽、半胱胺酸、Fe2+ 、Co2+ 及施加之電勢。 在其中需要疊氮化物與炔烴間之胡伊斯根[3+2]環加成反應的一些情況下，經修飾之鬆弛素多肽可包含包括炔烴部分之非天然編碼之胺基酸及欲連接至該胺基酸之PK增強劑可包含疊氮化物部分。或者，逆反應(即，疊氮化物位於胺基酸上及炔烴部分存在於水溶性聚合物上)亦可進行。 疊氮化物官能基亦可與含有芳基酯之水溶性聚合物選擇性反應且用芳基膦部分適當地官能化以產生醯胺鍵聯。芳基膦基團當場減少疊氮化物且所得之胺然後與最近之酯鍵聯有效反應以產生對應之醯胺。參見，例如，E. Saxon及C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000)。含有疊氮化物之胺基酸可係烷基疊氮化物(包括(但不限於) 2-胺基-6-疊氮基-1-己酸)或芳基疊氮化物(對疊氮基苯丙胺酸)。 疊氮化物官能基亦可與含有硫酯之水溶性聚合物選擇性反應且用芳基膦部分適當地官能化以產生醯胺鍵聯。芳基膦基團當場減少疊氮化物且所得之胺然後與硫酯鍵聯有效反應以產生對應之醯胺。 含有炔烴之胺基酸可購買獲得。或者，含有炔烴之胺基酸可根據標準方法製備。例如，對炔丙氧基苯丙胺酸可例如如Deiters, A.等人，J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003)中描述合成及4-炔基-L-苯丙胺酸可如Kayser, B.等人，Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997)中描述合成。其他含有炔烴之胺基酸可由一般技術者製備。 含有疊氮化物之胺基酸係購買自商業來源。就彼等無法購買獲得之含有疊氮化物之胺基酸而言，疊氮基可使用一般技術者已知的標準方法相對容易地製備，包括(但不限於)經由置換合適之離去基團(包括(但不限於)鹵化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根)或經由打開經適當保護之內酯。參見，例如，March之Advanced Organic Chemistry (第三版，1985, Wiley及Sons, New York)。 可通過[3+2]環加成添加至本發明之蛋白質之分子幾乎包括具有疊氮化物或炔基衍生物之任何分子。分子包括(但不限於)染料、螢光團、交聯劑、醣衍生物、聚合物(包括(但不限於)包含聚乙二醇之聚合物)、光交聯劑、細胞毒性化合物、親核標記、生物素之衍生物、樹脂、珠、肽、第二蛋白質或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限於) DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物及類似物。此等分子可添加至分別具有炔基(包括(但不限於)對炔丙氧基苯丙胺酸)或疊氮基(包括(但不限於)對疊氮基苯丙胺酸)之非天然胺基酸。 E. 胺基硫醇反應性基團 經β取代之胺基硫醇官能基之獨一無二之反應性使得其等適用於多肽及經由噻唑啶之形成含有醛基之其他生物分子之選擇性修飾。參見，例如，J. Shao及J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899。在一些實施例中，經β取代之胺基硫醇胺基酸可併入經修飾之鬆弛素多肽內及然後與包含醛官能基之PK增強劑反應。在一些實施例中，PK增強劑、藥物結合物或其他有效負載可經由噻唑啶之形成偶合至包含經β取代之胺基硫醇胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽。 F. 額外之反應性基團 可併入本發明之經修飾之鬆弛素多肽內之額外之反應性基團及非天然編碼之胺基酸係描述於下列專利申請案中，其等係以全文引用之方式併入本文中：美國專利公開案第2006/0194256號、美國專利公開案第2006/0217532號、美國專利公開案第2006/0217289號及國際專利申請公開案第WO/2007/070659號。 VI. 包含非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽之活體內產生 本發明之經修飾之鬆弛素多肽可使用經修飾之tRNA及tRNA合成酶以添加或取代在天然生成之系統中未經編碼之胺基酸而活體內產生。此等方法係描述於美國專利案第8,735,539號中，該案以全文引用之方式併入本文中。用於使用在天然生成之系統中未經編碼之胺基酸產生tRNA及tRNA合成酶之方法係描述於(例如)美國專利案第7,045,337及7,083,970號中，其等係以全文引用之方式併入本文中。此等方法涉及產生獨立於對轉譯系統內源性合成酶及tRNA發揮作用之轉譯機制(且因此有時被稱為「正交」)。一般而言，該轉譯系統包含正交tRNA (O-tRNA)及正交胺醯基tRNA合成酶(O-RS)。一般而言，該O-RS優先胺醯化該轉譯系統中具有至少一種非天然生成之胺基酸之O-tRNA且該O-tRNA識別至少一種無法由該系統中之其他tRNA識別之選擇密碼子。該轉譯系統因此將非天然編碼之胺基酸併入該系統中產生之蛋白質內，以回應於經編碼之選擇密碼子，藉此將胺基酸「取代」為經編碼之多肽中之位置。 O-tRNA/胺基醯基-tRNA合成酶之使用涉及編碼非天然編碼之胺基酸之特定密碼子之選擇。儘管可使用任何密碼子，但一般而言希望選擇在其中表現O-tRNA/胺基醯基-tRNA合成酶之細胞中很少或從不使用之密碼子。例如，例示性密碼子包括無義密碼子，諸如很少或從不使用之終止密碼子(琥珀、赭石及蛋白石)、四個或多個鹼基密碼子及其他天然之三個鹼基密碼子。 特定選擇密碼子可使用此項技術中已知的誘變方法引入經修飾之鬆弛素多核苷酸編碼序列中之適當位置內，該等誘變方法包括(但不限於)位點特異性誘變、盒式誘變、限制性選擇誘變等。 VII. 於非真核生物及真核生物中之表現 表現系統、培養及分離 未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽可表現於任何數量之合適之表現系統中，該等表現系統包括(例如)酵母、昆蟲細胞(例如，經桿狀病毒感染之昆蟲細胞)、哺乳動物細胞及細菌。下文提供例示性表現系統之描述。 酵母：如本文使用，術語「酵母」包括可表現編碼經修飾之鬆弛素多肽之基因之各種酵母中之任何一者，包括(但不限於)巴斯德畢赤酵母(P. pastoris )、季氏畢赤酵母(P. guillerimondii )、釀酒酵母(S. cerevisiae )、卡爾斯伯酵母(S. carlsbergensis )、醣化酵母(S. diastaticus )、道格拉氏酵母(S. douglasii )、克魯弗酵母(S. kluyveri )、諾地酵母(S. norbensis )、卵形酵母(S. oviformis )、乳酸克魯維酵母(K. lactis )、脆壁克魯維酵母(K. fragilis )、白色念球菌(C. albicans )、麥芽糖假絲酵母(C. maltosa )及多形漢遜酵母(H. polymorpha )。本文中以引用之方式併入之WO 2005/091944描述鬆弛素於酵母中之表現。 大腸桿菌、假單胞菌屬及其他原核生物： 術語「細菌宿主」或「細菌宿主細胞」係指可用作或已用作重組載體或其他轉移DNA之受體之細菌。該術語包括已經轉染之原始細菌宿主細胞之後代。應瞭解由於意外或故意之突變，單一親代細胞之後代可能在形態或基因體或總DNA補體上與原始親代未必完全相同。待由相關性質(諸如編碼未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽之核苷酸序列之存在)表徵與親代足夠類似之親代細胞之後代包括於由此定義預期之後代中。 在選擇用於表現之細菌宿主時，合適之宿主可包括彼等顯示具有(尤其)良好之包涵體形成能力、低蛋白水解活性及整體穩健性者。工業/醫藥發酵通常使用衍生自K菌株(例如，W3110)或衍生自B菌株(例如，BL21)之細菌。合適之大腸桿菌宿主之其他實例包括(但不限於)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本發明之方法之另一實施例中，該大腸桿菌宿主係蛋白酶減菌株，包括(但不限於) OMP-及LON-。該宿主細胞菌株可係假單胞菌之物種，包括(但不限於)螢光假假單胞菌、綠膿桿菌及惡臭假單胞菌。螢光假假單胞菌生物變種1 (命名為MB101)已知適用於重組產生且可用於治療性蛋白質產生過程。 倘若重組宿主細胞菌株已建立(即，表現構築體已引入宿主細胞內及具有適當之表現構築體之宿主細胞係經分離)，則在適用於產生經修飾之鬆弛素多肽之條件下培養該重組宿主細胞菌株。 重組宿主細胞可以分批或連續形式培養，及細胞收穫(在其中經修飾之鬆弛素多肽細胞內聚集之情況下)或培養物上清液之收穫以分批或連續形式。 細菌宿主細胞中產生之經修飾之鬆弛素多肽可難溶或不溶(以包涵體之形式)。在本發明之一項實施例中，胺基酸取代可在出於增加重組產生之蛋白質之溶解度之目的而經選擇之經修飾之鬆弛素多肽中易於作出。經修飾之鬆弛素多肽可用(例如)尿素或胍鹽酸鹽溶解。 在可溶性經修飾之鬆弛素蛋白之情況下，該鬆弛素可分泌至周質空間或培養基內。例如，經修飾之鬆弛素係藉由使用編碼包括八種不同前導序列(包括彼等SEQ ID NO: 39至44中列舉者)之構築體之質體，且將此等轉形至W3110-B2細胞中來分泌至W3110-B2細胞之周質空間內，然後該等細胞係在37℃下生長直至OD達成約0.8，此時表現係用0.01%阿拉伯糖誘發。五小時後，周質釋放樣本可製備自培養物。另外，可溶性經修飾之鬆弛素可存在於宿主細胞之細胞質中。在進行純化步驟前需濃縮可溶性經修飾之鬆弛素。 當經修飾之鬆弛素多肽作為融合蛋白產生時，融合序列可經移除。融合序列之移除可藉由酶或化學裂解完成。融合序列之酶移除可使用一般技術者已知的方法完成。用於移除融合序列之酶之選擇可藉由融合之一致性確定，且反應條件可藉由如一般技術者將知曉之酶之選擇進行規定。化學裂解可使用一般技術者已知的試劑完成，包括(但不限於)溴化氰、TEV蛋白酶及其他試劑。經裂解之經修飾之鬆弛素多肽可由一般技術者已知的方法純化自經裂解之融合序列。 一般而言，偶爾需要變性及減少經表現之多肽及然後使多肽重折疊為較佳構形。例如，胍、尿素、DTT、DTE及/或伴侶蛋白可添加至受關注之轉譯產物。該等蛋白質可於含有包括(但不限於)氧化型麩胱甘肽及L-精胺酸之氧化還原緩衝劑中重折疊。重折疊試劑可流動或以其他方式移動以接觸一或多種多肽或其他表現產物或反之亦然。 在經修飾之鬆弛素多肽之原核產生之情況下，因此產生之經修飾之鬆弛素多肽可錯誤折疊且因此缺乏生物活性或具有經減小之生物活性。蛋白質之生物活性可由「重折疊」修復。一般而言，錯誤折疊之未經修飾或經修飾之鬆弛素多肽係由增溶(其中該經修飾之鬆弛素多肽係亦不溶的)、使用(例如)一或多種離液劑(例如，尿素及/或胍)及可減少二硫鍵之還原劑(例如，二硫蘇糖醇、DTT或2-巰乙醇、2-ME)展開及減少多肽鍵而進行重折疊。在中等濃度之離液劑下，然後添加氧化劑(例如，氧、胱胺酸或胱胺)，其容許重新形成二硫鍵。經修飾之鬆弛素多肽可使用此項技術中已知的標準方法重折疊，該等方法諸如彼等描述於美國專利案第4,511,502、4,511,503及4,512,922號中者，其等係以全文引用之方式併入本文中。經修飾之鬆弛素多肽亦可與其他蛋白質共折疊以形成異源二聚體或異源多聚體。 重折疊後，經修飾之鬆弛素可進一步經純化。經修飾之鬆弛素之純化可使用一般技術者已知的各種技術完成，該等技術包括疏水性相互作用層析術、粒徑排阻層析術、離子交換層析術、反相高效液相層析術、親和層析術及類似技術或其任何組合。額外之純化亦可包括經純化之蛋白質之乾燥或沈澱之步驟。 純化後，經修飾之鬆弛素可交換至不同緩衝劑內及/或由此項技術中已知的各種方法中之任何一者濃縮，該等方法包括(但不限於)滲濾及透析。作為單一經純化之蛋白質提供之經修飾之鬆弛素可經歷聚集及沈澱。 經純化之經修飾之鬆弛素可係至少90%純(如由反相高效液相層析術、RP-HPLC或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳、SDS-PAGE量測)或至少95%純或至少98%純或至少99%或更純。與經修飾之鬆弛素之純度之精確數值無關，該經修飾之鬆弛素係足夠純以用作醫藥產物或用於進一步處理，諸如與PK增強劑結合。 某些經修飾之鬆弛素分子在缺乏其他活性成分或蛋白質(除賦形劑、載劑及穩定劑、血清白蛋白及類似物外)之情況下可用作治療劑，或其等可與另一蛋白質或聚合物複合。 在本發明之一些實施例中，在各純化步驟後之經修飾之鬆弛素之產率可係用於各純化步驟之初始材料中之未經修飾或經修飾之鬆弛素之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%或至少約99.99%。 VIII. 於替代系統中之表現 本發明之經修飾之鬆弛素多肽可使用無細胞(例如，活體外)轉譯系統表現。轉譯系統可係細胞或無細胞的，且可係原核或真核的。細胞轉譯系統包括(但不限於)全細胞製劑，諸如經透化之細胞或細胞培養物，其中所需核酸序列可轉錄為mRNA且該mRNA經轉譯。無細胞轉譯系統可購買獲得且許多不同類型及系統係為人熟知的。無細胞系統之實例包括(但不限於)原核裂解物，諸如大腸桿菌裂解物，及真核裂解物，諸如小麥胚芽提取物、昆蟲細胞裂解物、兔網織紅細胞裂解物、兔卵母細胞裂解物及人類細胞裂解物。膜提取物(諸如含有微粒體膜之犬胰臟提取物)亦可購買獲得，其等適用於轉譯分泌蛋白。 IX. 含有經修飾之鬆弛素多肽之融合蛋白 本發明亦提供包含經修飾之鬆弛素多肽序列及融合搭配物之經修飾之鬆弛素多肽或其片段。該融合搭配物可賦予功能性質，包括(但不限於)半衰期延長、促進蛋白質純化及/或製造、經增強之生物物理性質，諸如增加溶解性或穩定性及經減小之免疫原性或毒性或任何其他目的。例如，該融合蛋白可顯示經延長之活體內半衰期，藉此在治療方案中促進較不頻繁之給藥(諸如每週兩次、每週一次或每隔一週一次給藥等)。例示性融合蛋白包含融合至融合搭配物(諸如白蛋白(例如，人類血清白蛋白)、PK延長(PKE)黏附素、XTEN、Fc域、免疫球蛋白恆定區或前述任何一者之片段或前述任何一者之組合)之經修飾之鬆弛素。融合蛋白可藉由表現編碼經修飾之鬆弛素多肽序列及在相同閱讀框中之融合搭配物序列(視需要由編碼連接肽之序列分離)之核酸而產生。該融合蛋白可以任何順序包含經修飾之鬆弛素多肽及融合搭配物，例如，連接至經修飾之鬆弛素多肽序列之N端及/或C端之一或多個融合配體或連接至N端及C端兩者之一或多個融合搭配物。 X. 經修飾及未經修飾之鬆弛素多肽之醣化 本發明包括包含一或多個攜載醣殘基之非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽。該等醣殘基可係天然(包括(但不限於) N-乙醯葡萄糖胺)或非天然(包括(但不限於) 3-氟半乳糖)。該等醣可由N或O連接之醣苷鍵(包括(但不限於) N-乙醯基半乳糖-L-絲胺酸)或非天然鍵聯(包括(但不限於)肟或對應之C或S連接之醣苷)連接至非天然編碼之胺基酸。 醣(包括(但不限於)醣基)部分可活體內或活體外添加至經修飾之鬆弛素多肽。在本發明之一些實施例中，包含含有羰基之非天然編碼之胺基酸之經修飾之鬆弛素多肽可經用胺氧基衍生之醣修飾以產生經由肟鍵聯連接之對應之醣化多肽。一經連接至非天然編碼之胺基酸，該醣可藉由用醣基轉移酶及其他酶處理以產生結合至經修飾之鬆弛素多肽之寡醣而加以進一步精製。參見，例如， H. Liu等人，J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)。 XI. 投與及醫藥組合物 本文亦提供包含治療有效量之本文描述之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之組合物。此載劑或賦形劑包括(但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、蔗糖、組胺酸、水、甘油、PS80 (聚山梨醇酯80)、乙醇及/或其組合。該調配物係經製得以適合投與模式。 例如，本文描述之經修飾之鬆弛素多肽可以在約0.1與100 mg/kg受體病患體重之間的濃度向病患投與。在一實施例中，本文描述之經修飾之鬆弛素多肽可以約0.5至5 mg/kg受體病患體重之濃度向病患投與。在另一實施例中，本文描述之經修飾之鬆弛素多肽可以以下頻率向受體病患投與：介於每天一次與每兩週、三週或四週一次之間，諸如約每週一次、每週兩次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次。在另一實施例中，本文描述之經修飾之鬆弛素多肽可每週一次向病患投與。 應瞭解向給定病患投與之經修飾之鬆弛素多肽之濃度可大於或小於上文列舉之例示性投與濃度。 基於本發明提供之資訊，熟習此項技術者將能夠通過例行試驗確定有效劑量及投與頻率，例如，由本文之揭示內容及Goodman等人，(2006)中之教義進行指導。Goodman及Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill；或Howland等人，(2006)。Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams及Wilkins。 經修飾之鬆弛素之平均數量可變化及特定言之應基於合格醫師之建議及處方。經修飾之鬆弛素之精確量係優先問題，其受諸如治療中之病症之精確類型、治療中之病患之病症及組合物中之其他成分之因素影響。本發明亦提供治療有效量之另一活性劑之投與。待給定之量可由一般技術者容易地確定。 「醫藥組合物」係指適用於向哺乳動物投與之化學或生物組合物。此等組合物可經特定調配用於經由許多途徑中之一或多者投與，包括(但不限於)經頰、表皮、硬膜外、吸入、動脈內、心臟內、腦室內、皮內、肌內、鼻內、眼內、腹膜內、脊髓內、鞘內、靜脈內、經口、非經腸、經由灌腸劑或栓劑直腸給藥、皮下、真皮、舌下、透皮及透黏膜。另外，投與可藉助於注射、粉末、液體、凝膠、滴劑或其他投與方式發生。 如本文使用之「醫藥上可接受之載劑」或「賦形劑」包括生理上可相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑。在一項實施例中，該載劑適用於非經腸投與。在另一實施例中，該載劑適用於皮下投與。或者，該載劑可適用於靜脈內、腹膜內、肌內或舌下投與。醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。 在一些實施例中，醫藥組合物可以凍乾形式存在。該組合物可調配成溶液、微乳液、脂質體或適用於高藥物濃度之其他有序結構。該載劑可係溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)及其合適之混合物。在一些實施例中，該醫藥組合物包含穩定劑。適當之流動性可(例如)在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用表面活性劑維持。 在一些實施例中，醫藥組合物在該組合物中包含等滲劑，例如，糖(諸如蔗糖)、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。藉由包括諸如單硬脂酸鹽及明膠之藥劑可延長可注射組合物之吸收。此外，該多肽可調配成定時釋放調配物，例如，調配成包括緩釋聚合物之組合物。該等活性化合物可用可保護化合物以避免快速釋放之載劑進行製備，諸如控釋調配物，其包括移植物及微囊化遞送系統。可使用生物可降解、生物可相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。 本發明之經修飾之鬆弛素多肽及組合物可由適用於蛋白質或肽之任何習知途徑投與，包括(但不限於)非經腸，例如，注射，包括(但不限於)皮下或靜脈內注射或注射或輸注之任何其他形式。多肽組合物可由許多途徑投與，包括(但不限於)經口、靜脈內、腹膜內、肌內、透皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。包含經修飾之鬆弛素之組合物亦可經由脂質體投與。經修飾之鬆弛素多肽可單獨使用或與其他合適之組分(諸如醫藥載劑)組合使用。該經修飾之鬆弛素多肽可與如本文描述之其他藥劑組合使用。 適用於非經腸投與，諸如，例如，藉由關節內(在關節中)、靜脈內、肌內、皮內、腹膜內及皮下途徑之調配物包括水性及非水性、等滲無菌注射溶液，其等可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調配物與預期受體之血液等滲之溶質，及水性及非水性無菌懸浮液，其等可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。經修飾之鬆弛素之調配物可放置於單劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿及小瓶)中。 在本發明之內文中，取決於應用，向病患投與之劑量足以在該病患中經時具有有利之治療反應或其他適當之活性。該劑量係由調配物之效用及採用之經修飾之鬆弛素多肽之活性、穩定性或血清半衰期及病患之病症及待治療之病患之體重或表面積確定。 例如，向70公斤病患投與之劑量通常在相當於目前使用之治療性蛋白質之劑量之範圍內，針對相關組合物之經改變之活性或血清半衰期進行調整。 就投與而言，本發明之調配物係以由相關調配物之LD-50或ED-50及/或經修飾之鬆弛素多肽在各種濃度下可見之任何副作用所確定之比率投與，包括(但不限於)適用於病患之質量及整體健康。投與可經由單次給藥或分次給藥完成。 本發明之經修飾之鬆弛素多肽可向哺乳動物個體直接投與。本發明之經修飾之鬆弛素多肽可與醫藥上可接受之載劑一起製備成以單位劑量可注射形式(包括(但不限於)溶液、懸浮液或乳液)之混合物。本發明之經修飾之鬆弛素多肽亦可藉由連續輸注(使用包括(但不限於)微型泵，諸如滲透泵)、單一推注或緩釋藥性持久之調配物投與。 適用於投與之調配物包括水溶液及非水溶液、等滲無菌溶液，其等可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調配物等滲之溶質及可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑之水性及非水性無菌懸浮液。溶液及懸浮液可製備自先前描述類型之無菌粉末、顆粒及錠劑。 醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組胺酸、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鈉及其他有機酸之緩衝劑；包括(但不限於)抗壞血酸之抗氧化劑；包括(但不限於)彼等小於約10個殘基之低分子量多肽；蛋白質，包括(但不限於)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，包括(但不限於)聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，包括(但不限於)甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸、組胺酸或組胺酸衍生物、甲硫胺酸、麩胺酸鹽或離胺酸；單醣、雙醣及其他醣類，包括(但不限於)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包括(但不限於) EDTA及依地酸二鈉；二價金屬離子，包括(但不限於)鋅、鈷或銅；糖醇，包括(但不限於)甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，包括(但不限於)鈉及氯化鈉；及/或非離子表面活性劑，包括(但不限於)Tween™ (包括(但不限於) Tween 80 (聚山梨醇酯80或PS80)及Tween 20 (聚山梨醇酯20)；Pluronics™及其他普朗尼克酸，包括(但不限於)及其他普朗尼克酸，包括(但不限於)普朗尼克酸F68 (帕洛沙姆188)或PEG。合適之表面活性劑包括(例如，但不限於)基於聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)-聚(環氧乙烷)之聚醚，即，(PEO-PPO-PEO)或聚(環氧丙烷)-聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)，即，(PPO-PEO-PPO)或其組合。PEO-PPO-PEO及PPO-PEO-PPO係於商品名稱PluronicsTM 、R-PluronicsTM 、TetronicsTM 及R-TetronicsTM (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)下市售且進一步描述於美國專利案第4,820,352號中，該案以全文引用之方式併入本文中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可係合適之表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑之組合可用以穩定經修飾之鬆弛素抵抗一或多種應力，該等應力包括(但不限於)來自於攪拌之應力。上文之一些可被稱為「增積劑」。一些亦可被稱為「張力調節劑」。抗菌防腐劑亦可用於產品穩定性及抗菌效用；合適之防腐劑包括(但不限於)苄醇、苯紮氯銨、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯/對羥基苯甲酸丙酯、甲酚及苯酚或其組合。在一些實施例中，該醫藥組合物可包含含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組胺酸、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鈉及/或其他有機酸之緩衝劑；醣類(例如，單醣、雙醣及其他醣類)，諸如海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；及表面活性劑，諸如Tween™ 80 (聚山梨醇酯80或PS80)或Tween 20 (聚山梨醇酯20)。在一些實施例中，該醫藥組合物可包含含有組胺酸之緩衝劑，醣類，諸如蔗糖；及表面活性劑，諸如PS80。 本發明之經修飾之鬆弛素多肽(包括彼等連接至PK增強劑者)亦可藉由或作為緩釋系統之部分投與。緩釋組合物包括(包括(但不限於))以成型製品之形式之半滲透性聚合物基材，包括(但不限於)薄膜或微膠囊。緩釋基材包括來自生物相容性材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、乙烯乙酸乙烯酯(或聚-D-(-)-3-羥基丁酸、聚交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸之聚合物)、聚丙交酯共乙交酯(乳酸及乙醇酸之共聚物)聚酐類，L-麩胺酸及γ-乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、聚(原)酯、多肽、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸、多核苷酸)、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯啶酮及聚矽氧。緩釋組合物亦包括經脂質體包埋之化合物。 向病患投與之劑量在本發明之內文中應足以在個體中隨時間引起有利之反應。通常，每劑量非經腸(例如，靜脈內或皮下)投與之本發明之經修飾之鬆弛素多肽之總醫藥上有效量可在以下之範圍內：約0.01 μg/kg至約500 mg/kg、約0.01 μg/kg至約100 mg/kg、約0.05 mg/kg至約50 mg/kg、約100 μg/kg至約40 mg/kg、約0.2 mg/kg至約20 mg/kg或約0.5 mg/kg至約10 mg/kg或係約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約12 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約30 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg或約100 mg/kg之病患體重，然而此受制於治療自由裁量權。在一些實施例中，每劑量非經腸(例如，靜脈內或皮下)投與之本發明之經修飾之鬆弛素多肽可在以下之範圍內：約0.2 mg/kg至約5 mg/kg、0.5 mg/kg至約3 mg/kg或1 mg/kg至約3 mg/kg或係約0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg或80 mg/kg。在一些實施例中，每劑量非經腸(例如，靜脈內或皮下)投與之本發明之經修飾之鬆弛素多肽可係約1 mg/kg。在一些實施例中，每劑量非經腸(例如，靜脈內或皮下)投與之本發明之經修飾之鬆弛素多肽可係在以下之範圍內之固定劑量：自約0.1 mg至約10,000 mg、自約1 mg至約5,000 mg、自約10 mg至約2,500 mg、自約100 mg至約1,000 mg、自約200 mg至約800 mg、自約400 mg至約600 mg、自約1 mg至約10 mg、自約10 mg至約50 mg、自約50 mg至約100 mg、自約100 mg至約300 mg、自約300 mg至約500 mg、自約500 mg至約700 mg、自約700 mg至約900 mg、自約900 mg至約1,200 mg、自約1,000 mg至約2,000 mg、自約2,000 mg至約3,000 mg、自約3,000 mg至約4,000 mg、自約4,000 mg至約5,000 mg、自約5,000 mg至約6,000 mg、自約6,000 mg至約7,000 mg、自約7,000 mg至約8,000 mg、自約8,000 mg至約9,000 mg或自約9,000 mg至約10,000 mg。 XII. 經修飾之鬆弛素多肽之治療用途 本發明提供經修飾之鬆弛素多肽在治療包括心血管疾病或纖維化疾病之疾病(諸如心臟衰竭、胰臟炎、炎症、癌症、硬皮症、肺纖維化、腎纖維化、肝臟纖維化或心肌纖維化)中之用途。 該心血管疾病可包括(但不限於)冠狀動脈疾病、心臟病發作、心律不整或異常心臟節律、心臟衰竭、心臟瓣膜疾病、先天性心臟疾病、心肌症(心臟肌肉疾病)、心包疾病、主動脈疾病、馬凡症候群或血管疾病(血管疾病)。 在一些實施例中，該心臟衰竭可包含以下中之一或多者：晚期心臟衰竭、心腎症候群、伴有腎功能損傷之心臟衰竭、慢性心臟衰竭、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、急性心臟衰竭、急性後心臟衰竭(諸如後急性失代償性心臟衰竭)、代償性心臟衰竭、失代償性心臟衰竭、右心臟衰竭、左心臟衰竭、整體心臟衰竭、缺血性心肌症、擴張型心肌症、與先天性心臟缺陷相關聯之心臟衰竭、與心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、二尖瓣狹窄、二尖瓣關閉不全、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣關閉不全、三尖瓣狹窄、三尖瓣關閉不全、肺動脈瓣狹窄、肺動脈瓣關閉不全、心絞痛、高血壓、肺性高血壓或肺動脈高血壓、與組合心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、心肌發炎(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病心臟衰竭、酒精性心肌症、與心臟儲存失調症相關聯之心臟衰竭、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、舒張功能障礙、後心肌重塑、伴有保留射血分數之慢性心臟衰竭(HFpEF)或伴有經減小之射血分數之慢性心臟衰竭(HFrEF)。 在一些實施例中，該心臟衰竭係選自慢性心臟衰竭、急性心臟衰竭、急性後心臟衰竭、伴有經減小之射血分數之慢性心臟衰竭(HFrEF)、伴有保留射血分數之慢性心臟衰竭(HFpEF)、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、後心肌重塑、心絞痛、高血壓、肺性高血壓及肺動脈高血壓。在一些實施例中，該心臟衰竭係選自急性後心臟衰竭、晚期心臟衰竭、心腎症候群及伴有腎功能損傷之心臟衰竭。 纖維化係在器官或組織中形成過量纖維結締組織。纖維組織之過量沈積係與可導致器官或組織功能受損之病理狀態相關聯。受影響之器官可包括肺(肺或肺部纖維化)、肝(肝或肝臟纖維化)、腎(腎或腎臟纖維化)及心臟(心肌纖維化)。纖維化亦可影響其他組織及器官，其等包括關節、皮膚、腸、骨髓及其他。例示性纖維化病症或疾病包括(但不限於)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其影響肝；糖尿病腎疾病及糖尿病腎病，其等影響腎；及代謝性心臟衰竭，其影響心臟。例如，NASH係由消耗很少或不消耗酒精之人之肝之脂肪、炎症及損傷表徵且可導致肝硬化。NASH趨於在通常有高血脂水平及糖尿病或糖尿病前期之超重或肥胖之中年人中經診斷。 經修飾之鬆弛素多肽用於潛在治療用途之生物活性可使用標準或已知的活體外或活體內分析進行測定。鬆弛素多肽可針對生物活性由此項技術中已知的合適之方法進行分析。此等分析包括(但不限於)受體結合分析。 關於諸如心臟衰竭及纖維化疾病之疾病，經修飾之鬆弛素之活性可使用一或多種活體內分析進行測定。該等分析通常涉及在該疾病之動物模型中投與鬆弛素及判定對疾病進展、嚴重性或有效治療之其他標記之影響。此等分析可用以在模型分析中確定有效劑量及治療方案，及基於其等預測用於臨床用途之給藥方案，例如，用於人類病患。可利用之例示性HF分析包括：1)小鼠左前降支(LAD)冠狀動脈結紮模型，其模擬患有心肌梗塞且進展為HF之病患之心臟變化(Samuel等人，Lab. Investigation 91:675-690, 2011)；2)有限之AngII-輸注模型，其中利用最小濃度AngII以誘發心肌纖維化(Xu等人，J. Cardiovasc. Pharmacol. 51:62-70, 2008)；3) Dahl鹽敏感性大鼠模型，其係由高血壓、腎損傷及血容量超負荷表徵(Sakata等人，Circulation 109:2143-2149, 2004)；4)心臟及腎纖維化之老年自發性高血壓大鼠(SHR)模型，其先前用以證實WT-RLX效用(Lekgabe等人，Hypertension 46:412-418, 2005)；及5)壓力超負荷之大鼠胸主動脈縮窄模型(Kuster等人，Circulation 111:420-427, 2005)。除此等模型外，經修飾之鬆弛素之活性亦可在狗模型中測定，諸如在正常及快速起搏誘發之HF狗中。另外，可進行此等分析以確定經修飾之鬆弛素當不僅於預防模式中給藥，亦於治療模式中給藥時是否有效。此外，經修飾之鬆弛素可在包括腎(Yoshida等人，Nephrol. Dialysis Transplant 27: 2190-2197, 2012)、肺(Huang等人，Am. J. Pathol. 179:2751-2765, 2011)及肝纖維化(Williams等人，Gut 49:577-583, 2001)之纖維化模型中進行測試。例如，經修飾之鬆弛素之效用可與野生型鬆弛素(例如，野生型人類鬆弛素)之效用進行比較。 本發明之鬆弛素、鬆弛素多肽及/或鬆弛素類似物之投與量可變化且特定言之應基於合格醫師之推薦及處方。本發明之鬆弛素、鬆弛素多肽及/或鬆弛素類似物之精確量係優選問題，其受以下因素影響：治療中之病症之精確類型及/或嚴重性、治療中之病患之病症及組合物中之其他成分。本發明可進一步包含投與治療有效量之另一活性劑。待給藥之量可由一般技術者基於使用鬆弛素、可獲得之鬆弛素治療及/或其他鬆弛素類似物之治療容易地確定。 本發明之化合物可用於減小受梗塞影響之心肌之面積及用於預防繼發性梗塞。本發明進一步提供本發明之化合物用於預防及/或治療血栓栓塞性失調症、缺血後再灌注損傷、微血管及大血管病變(血管炎)、動脈及靜脈血栓形成、水腫、局部缺血(諸如心肌梗塞、中風及短暫性腦缺血發作)；用於與冠狀動脈旁路手術(冠狀動脈旁路移植，CABG)、原發性經皮腔內冠狀動脈成形術(PTCA)、血栓溶解後之PTCA、救援PTCA、心臟移植及開心手術有關之心臟保護；及用於與移植、旁路手術、導管檢查及其他外科手術程序有關之器官保護之用途。本發明進一步提供本發明之化合物用於預防及/或治療呼吸失調症，諸如，例如，慢性阻塞性肺病(慢性支氣管炎，COPD)、氣喘、肺氣腫、支氣管擴張、囊性纖維化(膠稠性黏液病)及肺性高血壓，特定言之肺動脈高血壓之用途。 本發明之例示性實施例提供本發明之經修飾之鬆弛素作為藥劑用於預防及/或治療腎疾病之用途，該等腎疾病包括(但不限於)急性與慢性腎疾病及急性與慢性腎功能不全，及急性與慢性腎衰竭，其包括需透析及無需透析之腎衰竭之急性與慢性階段，及潛在或相關之腎疾病，諸如腎灌注不足、由透析誘發之低血壓、腎小球病、腎小球及腎小管蛋白尿、腎水腫、血尿、原發性、繼發性及急性與慢性腎小球腎炎、膜性及膜增生性腎小球腎炎、奧爾波特氏症候群、腎小球硬化、間質性管狀疾病、腎病性疾病(諸如原發性及先天性腎疾病、腎炎症)、免疫性腎臟疾病(諸如腎移植排斥、免疫複合物誘發之腎臟疾病及中毒誘發之腎病性疾病、糖尿病性及非糖尿病性腎臟疾病、腎盂腎炎、囊性腎、腎硬化、高血壓性腎硬化、腎病症候群)，其等特徵性及診斷上與以下相關聯：肌酐清除率及/或水分排洩之異常減少、異常增加之尿素、氮、鉀及/或肌酸酐之血液濃度、腎酶(諸如麩胺醯合成酶)之活性之改變、尿滲透壓及尿量、經增加之微量白蛋白尿、巨白蛋白尿、腎小球及小動脈病變、腎小管擴張、高磷酸鹽血症及/或透析之需求。 另外，本發明之經修飾之鬆弛素可用作藥劑以用於預防及/或治療以下：腎癌(在不完全切除腎後)、過度使用利尿劑後脫水、隨惡性高血壓增加之不受控制之血壓、尿路梗阻及感染、澱粉樣變性及與腎小球損傷相關聯之全身性疾病(諸如紅斑狼瘡)及風濕性免疫全身性疾病及腎動脈狹窄、腎動脈血栓形成、腎靜脈血栓形成、止痛劑誘發之腎病及腎小管性酸中毒。 另外，本發明提供本發明之經修飾之鬆弛素作為藥劑用於預防及/或治療造影劑誘發及藥物誘發之急性與慢性間質性腎疾病、代謝症候群及血脂異常之用途。 另外，本發明提供本發明之經修飾之鬆弛素作為藥劑用於預防、緩解及/或治療與急性及/或慢性腎疾病相關聯之後效或症狀諸如肺水腫、心臟衰竭、尿毒癥、貧血、電解質紊亂(例如，高鉀血症、低鈉血症)及骨代謝及碳水化合物代謝之用途。 另外，本發明提供本發明之經修飾之鬆弛素作為藥劑用於改善、穩定或恢復有此需要之病患(例如，患有如上文描述之腎疾病之病患)之腎功能之用途。 其他例示性實施例提供經修飾之鬆弛素用於治療及/或預防肺疾病，尤其哮喘病、肺動脈高血壓(PAH)及肺性高血壓(PH)之其他形式，其等包括左心臟疾病、HIV、鐮狀細胞貧血、血栓栓塞(CTEPH)、結節病、COPD或與肺纖維化相關聯之肺性高血壓、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、肺纖維化、肺氣腫(例如，由香煙煙霧誘發之肺氣腫)及囊性纖維化(CF)之用途。 其他例示性實施例提供經修飾之鬆弛素用於治療及/或預防纖維化失調症，其等包括內部器官(諸如，例如，肺、心臟、腎、骨髓及特定言之肝)之纖維化失調症及亦皮膚纖維化及纖維化眼失調症之用途。 此外，本發明提供經修飾之鬆弛素用於製備用以治療及/或預防失調症(特定言之，上文提及之失調症)之藥劑之用途。 此外，本發明提供用於使用有效量之至少一種本發明之經修飾之鬆弛素治療及/或預防失調症，特定言之上文提及之失調症之方法。 此外，本發明提供用於用以治療及/或預防冠心病、急性冠脈症候群、心臟衰竭(例如，急性心臟衰竭、慢性心臟衰竭或晚期心臟衰竭)及心肌梗塞之方法中之經修飾之鬆弛素。 適用於本發明之方法及組合物中之醫藥組合物包括其中含有有效量之活性成分以達成預期目的(例如，治療心臟衰竭)之組合物。鑒於本發明，有效劑量之確定係完全在熟習此項技術者之能力範圍內。 就任何化合物而言，治療有效劑量可最初於活體外分析中，例如，RXFP1受體活化，活體外於經分離灌注之大鼠心臟中或於動物模型(通常小鼠、大鼠、兔、狗或豬)中進行評估。該動物模型亦用以達成所需之濃度範圍及投與途徑。此資訊可然後用以在人類中確定有用之劑量及投與途徑。 治療有效劑量係指改善症狀或病症之經修飾之鬆弛素之量。此等化合物之治療效用及毒性可藉由標準藥物程序活體外或實驗動物測定，例如，ED50 (在50%之群體中治療有效之劑量)及LD50 (致死50%之群體之劑量)。治療效應與毒性效應之間的劑量比率係治療指數且其可表示為比率ED50/LD50。例示性醫藥組合物顯示大治療指數。獲得自活體外分析及動物研究之資料係用以製定用於人類用途之劑量範圍。此等化合物之劑量位於(例如)包括ED50之循環濃度之範圍內及毒性較小或無毒性。該劑量取決於採用之劑量形式、病患之敏感性及投與途徑而在此範圍內變化。 正常劑量量取決於投與途徑可自0.1至100,000毫克總劑量變化。如對特定劑量及遞送方法之指導係提供於參考文獻中。參見美國專利案第4,657,760、5,206,344或5,225,212號。 XIII. 組合 本發明之經修飾之鬆弛素可單獨投與或與其他活性化合物組合投與。在本內文中，術語組合包含同時或依序投與之任何方式，無論該經修飾之鬆弛素及其他藥劑是否包含於相同組合物中或分別投與，該投與可通過相同或不同之投與模式。本發明提供用於治療及/或預防上文提及之失調症之包含至少一種經修飾之鬆弛素及一或多種其他活性成分於醫藥組合物中之藥劑，於該醫藥組合物中，其係與賦形劑或醫藥上可接受之載劑混合。 適用於組合之活性成分可包括(以實例說明之)：調節脂質代謝之活性成分、抗糖尿劑、抗高血壓劑、灌注增強及/或抗血栓劑、抗氧化劑、趨化介素受體拮抗劑、p38-激酶抑制劑、NPY促效劑、食慾激素促效劑、食慾抑制劑、PAF-AH抑制劑、消炎劑(COX抑制劑、LTB4 -受體拮抗劑)、止痛劑(例如，阿司匹林)、P2Y12抑制劑(諸如氯吡格雷(Clopidogrel))、PCSK9抑制劑(諸如依伏庫單抗(evolocumab) (REPATHA))或阿利庫單抗(alirocumab) (PRALUENT)、抗抑鬱劑及其他精神藥物。 本發明進一步提供至少一種經修飾之鬆弛素及至少一種改變脂質代謝之活性成分、抗糖尿劑、降血壓之活性成分及/或具有抗血栓形成作用之藥劑之組合。 經修飾之鬆弛素可與以下組合：一或多種調節脂質代謝之活性成分，例如，HMG-CoA還原酶抑制劑、HMG-CoA還原酶表現之抑制劑、角鯊烯合成抑制劑、ACAT抑制劑、LDL受體誘導物、膽固醇吸收抑制劑、聚合膽汁酸吸附劑、膽汁酸再吸收抑制劑、MTP抑制劑、脂酶抑制劑、LpL活化劑、貝特類藥物、菸鹼酸、菸鹼酸受體促效劑、CETP抑制劑、PPAR-a、PPAR-γ及/或PPAR-δ促效劑、RXR調節物、FXR調節物、LXR調節物、甲狀腺激素及/或甲狀腺模擬物、ATP檸檬酸鹽裂解酶抑制劑、Lp(a)拮抗劑、大麻素受體1拮抗劑、瘦素受體促效劑、鈴蟾肽受體促效劑、PCSK9抑制劑、組織胺受體促效劑及抗氧化劑/自由基清除劑。 在一些實施例中，經修飾之鬆弛素係與來自他汀類藥物之類別之HMG-CoA還原酶抑制劑(例如，洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)或匹伐他汀(pitavastatin))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與角鯊烯合成抑制劑(例如，BMS-188494或TAK-475)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與ACAT抑制劑(例如，阿伐麥布(avasimibe)、甲亞油醯胺(melinamide)、帕替麥布(pactimibe)、依魯麥布(eflucimibe)或SMP-797)組合投與。在另一實施例中，其他經修飾之鬆弛素係與膽固醇吸收抑制劑(例如，伊澤替米貝(ezetimibe)、替奎安(tiqueside)或帕馬苷(pamaqueside))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與MTP抑制劑(例如，英普他派(implitapide)、BMS-201038、R-103757或JTT-130)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與脂酶抑制劑(例如，奧利司他(orlistat))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與甲狀腺激素及/或甲狀腺模擬物(例如，D-甲狀腺素或3,5,3'-三碘甲腺胺酸(T3))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與菸鹼酸受體之促效劑(例如，菸鹼酸、阿昔莫司(acipimox)、阿昔呋喃(acifran)或酒石酸煙醇(radecol))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與CETP抑制劑(例如，達賽曲匹(dalcetrapib)、BAY 60-5521、安塞曲匹(anacetrapib)或CETP疫苗(CETi-1))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與PPAR-γ促效劑(例如，來自噻唑烷二酮類藥物之類別，例如，吡格列酮(pioglitazone)或羅格列酮(rosiglitazone))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與PPAR-δ促效劑(例如，GW-501516或BAY 68-5042)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與聚合膽汁酸吸附劑(例如，銷膽胺、考來替泊(colestipol)、考來維侖(colesolvam)、考來膠(CholestaGel)或考來替蘭(colestimide))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與膽汁酸再吸收抑制劑(例如，ASBT (= IBAT)抑制劑，諸如，例如，AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與抗氧化劑/自由基清除劑(例如，普羅布考、AGI-1067、BO-653或AEOL-10150)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與大麻素受體1拮抗劑(例如，利莫那班(rimonabant)或SR-147778)組合投與。 經修飾之鬆弛素可與以下組合：一或多種抗糖尿劑，例如，胰島素及胰島素衍生物、磺醯尿素、雙胍、格列奈衍生物、葡萄糖苷酶抑制劑、PPAR-γ促效劑、二肽基-肽酶IV之抑制劑(DPP-IV抑制劑)、氧雜二唑烷酮、噻唑烷二酮類藥物、GLP 1受體促效劑、升糖素拮抗劑、胰島素致敏劑、CCK 1受體促效劑、瘦素受體促效劑、涉及葡萄糖新生及/或肝醣分解之刺激之肝酶之抑制劑、葡萄糖攝取之調節物及亦鉀通道開放劑。 在一些實施例中，經修飾之鬆弛素係與胰島素或胰島素衍生物組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與磺醯尿素(例如，甲苯磺丁脲(tolbutamide)、格列本脲(glibenclamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)或格列齊特(gliclazide))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與雙胍(例如，二甲雙胍)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與格列奈衍生物(例如，瑞格列奈(repaglinide)或那格列奈(nateglinide))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與葡萄糖苷酶抑制劑(例如，米格列醇(miglitol)或阿卡波糖(acarbose))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與DPP-IV抑制劑(例如，西他列汀(sitagliptin)及維達列汀(vildagliptin))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與PPAR-γ促效劑(例如，來自噻唑烷二酮之類別，例如，吡格列酮或羅格列酮)組合投與。 該經修飾之鬆弛素可與一或多種降血壓活性成分組合，例如，鈣拮抗劑、血管緊張素II拮抗劑、ACE抑制劑、腎素抑制劑、β-受體阻斷劑、α-受體阻斷劑、利尿劑、醛固酮拮抗劑、鹽皮質素受體拮抗劑、ECE抑制劑、ACE/NEP抑制劑及血管肽酶抑制劑。 在一些實施例中，經修飾之鬆弛素係與鈣拮抗劑(例如，硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)、維拉帕米(verapamil)或地爾硫卓(diltiazem))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與血管緊張素II拮抗劑(例如，氯沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、坎地沙坦(candesartan)、恩布沙坦(embusartan)、奧美沙坦(olmesartan)或替米沙坦(telmisartan))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與ACE抑制劑(例如，依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、賴諾普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、地拉普利(delapril)、福辛普利(fosinopril)、喹那普利(quinopril)、培哚普利(perindopril)或群多普利(trandopril))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與β-受體阻斷劑(例如，普萘洛爾(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、噻嗎洛爾(timolol)、吲哚洛爾(pindolol)、阿普洛爾(alprenolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴佈洛爾(penbutolol)、布拉洛爾(bupranolol)、美替洛爾(metipranolol)、納多洛爾(nadolol)、甲吲洛爾(mepindolol)、咔唑洛爾(carazalol)、甲磺胺心定(sotalol)、美托洛爾(metoprolol)、倍他洛爾(betaxolol)、塞利洛爾(celiprolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、艾司洛爾(esmolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡維地洛(carvedilol)、阿達洛爾(adaprolol)、蘭地洛爾(landiolol)、奈比洛爾(nebivolol)、依泮洛爾(epanolol)或布新洛爾(bucindolol))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與α-受體阻斷劑(例如，哌唑嗪)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與利尿劑(例如，呋塞米(furosemide)、布美他尼(bumetanide)、托拉塞米(torsemide)、芐氟噻嗪(bendroflumethiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪(polythiazide)、三氯噻嗪(trichloromethiazide)、氯噻酮、吲達帕胺(indapamide)、美托拉宗(metolazone)、喹乙宗(quinethazone)、乙醯唑胺、二氯苯磺胺、醋甲唑胺(methazolamide)、甘油、異山梨醇、甘露醇、阿米洛利(amiloride)或氨苯蝶啶(triamteren))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與醛固酮或鹽皮質素受體拮抗劑(例如，安體舒通(spironolactone)或依普利酮(eplerenone))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與升壓素受體拮抗劑(例如，考尼伐坦(conivaptan)、托伐普坦(tolvaptan)、利伐普坦(lixivaptan)或SR-121463)組合投與。 經修飾之鬆弛素可與下列中之一或多者組合：抗血栓劑，例如，血小板聚集抑制劑或抗凝劑；利尿劑；升壓素受體拮抗劑；有機硝酸鹽及NO供體；具有正性肌力活性之化合物；抑制環鳥苷單磷酸酯(cGMP)及/或環磷酸腺苷(cAMP)之降解之化合物，諸如，例如，磷酸二酯酶(PDE) 1、2、3、4及/或5之抑制劑，特定言之PDE 5抑制劑，諸如西地那非(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)及他達拉非(tadalafil)及亦PDE 3抑制劑，諸如米力農(milrinone)；利尿鈉肽，例如，「心房利尿鈉肽」 (ANP，阿那立肽(anaritide))、「B型利尿鈉肽」或「腦利尿鈉肽」 (BNP，奈西立肽)、「C型利尿鈉肽」 (CNP)及亦尿擴張素；前列腺環素受體(IP受體)之促效劑，例如，伊洛前列素(iloprost)、貝前列素(beraprost)、西卡前列素(cicaprost)；If (有趣通道)通道之抑制劑，例如，伊伐佈雷定(ivabradine)；鈣致敏劑，諸如，以實例說明之，左西孟旦(levosimendan)；鉀補充劑；鳥苷酸環化酶之NO-獨立性但亞鐵血紅素依賴性刺激物，例如，WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301及WO 03/095451中描述之化合物；鳥苷酸環化酶之NO-及亞鐵血紅素獨立性活化劑，例如，WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/19780、WO 02/070462及WO 02/070510中描述之化合物；人類中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)之抑制劑，例如，西維來司他(sivelestat)及DX-890 (Reltran)；抑制信號轉導級聯之化合物，例如，酪胺酸激酶抑制劑，例如，索拉非尼(sorafenib)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)及埃羅替尼(erlotinib)；及/或調節心臟之能量代謝之化合物，例如，乙莫克舍(etomoxir)、二氯乙酸鹽、雷諾嗪(ranolazine)及曲美他嗪(trimetazidine)。 在一些實施例中，經修飾之鬆弛素係與有機硝酸鹽或NO供體(例如，硝普鈉、硝酸甘油、單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯、嗎斯酮胺(molsidomin)或SIN-1)或與吸入性NO組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與正性變力性化合物(例如，強心苷(地高辛)、β-腎上腺素及多巴胺促效劑，諸如異丙腎上腺素、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺或多巴酚丁胺)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與抗交感神經劑(諸如利血平、可樂定或α-甲基多巴)，或與鉀通道促效劑(諸如米諾地爾(minoxidil)、二氮嗪、雙肼屈嗪或肼屈嗪)或與釋放一氧化氮之物質(諸如硝酸甘油或硝普鈉)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與血小板聚集抑制劑(例如，阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定或雙嘧達莫)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與凝血酶抑制劑(例如，希美加群(ximelagatran)、美拉加群(melagatran)、達比加群(dabigatran)、比伐盧定(bivalirudin)或克賽(clexane))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與GPIIb/IIIa拮抗劑(例如，替羅非班(tirofiban)或阿昔單抗(abciximab))組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與因子Xa抑制劑(例如，利伐沙班(rivaroxaban) (BAY 59-7939)、DU-176b、阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、非地沙班(fidexaban)、雷紮沙班(razaxaban)、磺達肝癸鈉(fondaparinux)、依達肝素(idraparinux)、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428)組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物組合投與。在另一實施例中，該經修飾之鬆弛素係與維他命K拮抗劑(諸如，以實例說明之，香豆素(殺鼠靈))組合投與。 此外，本發明提供包含至少一種經修飾之鬆弛素(通常與一或多種惰性非毒性醫藥上合適之助劑一起)之藥劑，及亦其等用於上文提及之目的之用途。視需要，該藥劑可包含該經修飾之鬆弛素及另一活性成分，諸如彼等上文提及者。例如，該藥劑可以有效治療或預防心臟衰竭及/或與纖維化相關聯之疾病之量包含該經修飾之鬆弛素及另一活性成分。 實例 實例1：非天然編碼之胺基酸之經核糖體併入前鬆弛素原內 此實例例示包括非天然編碼之胺基酸之鬆弛素多肽在大腸桿菌中之選殖及表現。 用於選殖鬆弛素之方法係為一般技術者已知。用於鬆弛素之多肽及多核苷酸序列及將鬆弛素選殖至宿主細胞內係詳細描述於美國專利案第4,758,516號；美國專利案第5,166,191號；美國專利案第5,179,195、5,945,402號；及5,759,807號中；該等專利案中之所有係以參考之方式併入本文中。 編碼鬆弛素之cDNA係顯示為SEQ ID NO: 12及成熟多肽胺基酸序列係顯示為SEQ ID NO: 1。例示性鬆弛素序列係提供於表1中。 表1：鬆弛素序列 使用包含正交tRNA (O-tRNA)及正交胺醯基tRNA合成酶(O-RS)之經引入之轉譯系統以表現鬆弛素或含有非天然編碼之胺基酸之鬆弛素類似物。該O-RS優先以非天然編碼之胺基酸胺醯化該O-tRNA。進一步，該轉譯系統將該非天然編碼之胺基酸插入該鬆弛素或鬆弛素類似物內，以回應於經編碼之選擇密碼子。合適之O-RS及O-tRNA序列係描述於標題為「Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof」之WO 2006/068802中(E9；SEQ ID NO: 16)及標題為「Compositions of tRNA and Uses Thereof」之WO 2007/021297中(F13；SEQ ID NO: 17)，其等係以全文引用之方式併入本文中。可利用之例示性序列係闡述於表2中。 表2：表現系統中利用之序列 以含有經修飾之鬆弛素或鬆弛素類似物基因及正交胺醯基tRNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼之胺基酸特異)之質體轉形大腸桿菌容許將非天然編碼之胺基酸位點特異性併入該鬆弛素多肽內，如描述於美國專利案第8,735,539號中，該案係以全文引用之方式併入本文中。 野生型成熟鬆弛素係由PCR使用標準方案擴增自cDNA合成反應及選殖至質體載體諸如pET30 (NcoI-BamHI)內。鬆弛素序列係次選殖至含有受衍生自大腸桿菌脂蛋白啟動子序列之合成啟動子(Miller, J.H., Gene, 1986)之構成控制之來自詹氏甲烷球菌之琥珀抑制子酪胺醯基tRNATyr/CUA (Mj tRNATyr/CUA)及受大腸桿菌GlnRS啟動子之控制之正交酪胺醯基-tRNA-合成酶(MjTyrRS) (例如，E9)之抑制載體內。鬆弛素之表現係在T7啟動子之控制下，該啟動子係由L-阿拉伯糖間接誘發。琥珀突變係使用標準快速變化突變方案引入(Stratagene; La Jolla, California)。構築體係經序列證實。 使用對乙醯基苯丙胺酸(pAcF)抑制 使用含有包含琥珀突變之經修飾之鬆弛素基因(編碼於A鏈殘基1具有pAcF之SEQ ID NO: 38，參見圖4)及如上文描述之正交胺醯基tRNA合成酶/tRNA對之質體以轉形至大腸桿菌菌株W3110B55 [F- IN (rrnD-rrnE) lambdaaraB::g1 tetA fhuA::dhfr proS W375R::cat]中以產生其中T7聚合酶之表現係在阿拉伯糖可誘發之啟動子之控制下之大腸桿菌之菌株。整夜細菌培養物係1:100稀釋於含有2X YT培養基之搖瓶中及在37℃下生長至~0.8之OD600 。蛋白質表現係藉由添加阿拉伯糖(0.2%最終)，及對乙醯基苯丙胺酸(pAcF)至4 mM之最終濃度誘發。培養物係在37℃下培養5小時。細胞係經集結成粒及重懸浮於B-PER裂解緩衝劑(Pierce) 100ul/OD/ml + 10ug/ml DNase中及在37℃下培養30分鐘。細胞材料係藉由離心移除及移除上清液。使該集結粒重懸浮於等量之SDS-PAGE蛋白質加樣緩衝劑中。將所有樣本裝載於具有MES及DTT之4至12% PAGE凝膠上。鬆弛素之表現係藉由SDS-PAGE、西方墨點轉漬分析法或電灑離子化離子阱質譜法及類似法證實。 經修飾之鬆弛素基因序列可包括N端His標誌物，例如，HHHHHHSGG (SEQ ID NO: 55)。經His標誌之突變鬆弛素蛋白可使用一般技術者已知的方法純化。ProBond鎳螯合樹脂(Invitrogen, Carlsbad, CA)可經由由製造商提供之標準經His標誌之蛋白純化程序使用。蛋白質之功能量測可通過此項技術中已知的方法、本申請案及併入之參考文獻中提供之方法進行及或者活細胞上之ELISA可經研發以評估本發明之鬆弛素多肽。 實例2：含有非天然編碼之胺基酸之成熟鬆弛素之產生及純化 前鬆弛素原(於A鏈殘基1處具有pAcF之SEQ ID NO: 38，參見圖4)係由在大腸桿菌細胞中作為包涵體發酵產生。該非天然編碼之胺基酸對乙醯基苯丙胺酸係使用實例1中提供之一般方法經核糖體併入。 使含有表現經修飾之鬆弛素多肽之質體之大腸桿菌細胞生長於含有發酵培養基之發酵槽中。將康黴素添加至該發酵槽以促進質體穩定性。將L-丙胺酸-L-對乙醯基苯丙胺酸鹽酸鹽(L-Ala-pAcF)添加至該發酵槽以使得將對乙醯基苯丙胺酸(pAcF)併入前鬆弛素原胺基酸序列中。最終，添加L-阿拉伯糖以誘發前鬆弛素原表現。該等細胞內產生之前鬆弛素原導致不溶性包涵體(IB)之形成。發酵液係在誘發後持續時間後收穫。發酵滴定量係每升發酵約4.5 g前鬆弛素原。 藉由在高剪切下裂解細胞將包涵體(IB)自完整細胞分離。該等完整IB係藉由離心回收。回收後，將該等IB集結粒重懸浮於水中及再次離心以移除雜質。經清洗之IB係在pH 8.5下溶解於含有5 mM二硫蘇糖醇(DTT)之5 M胍/Tris緩衝劑中。前鬆弛素原之重折疊係藉由將經溶解之IB溶液緩慢稀釋至約4.5倍至含有5 mM DTT及8.5 mM胱胺之冷凍pH 8.5 Tris緩衝劑內達成。將重折疊溶液培養至少12小時，接著繼續進行處理。在培養週期完成後，藉由添加乙酸及鹽酸使pH下降至3.5至4.0，以促進雜質之沈澱。沈澱之材料係藉由離心，接著深度過濾移除。 經深度過濾之重折疊溶液係用pH 4乙酸鹽緩衝劑稀釋約6.5倍以減小製劑之導電性以裝載於Tosoh Bioscience SP550C陽離子交換管柱上。裝載後，清洗SP550C管柱及然後前鬆弛素原係使用10%至90%梯度之含有1 M NaCl之50 mM乙酸鹽pH 5.5緩衝劑溶離。SP550C溶離液係用純化水稀釋直至該前鬆弛素原濃度為1.5 mg/mL。藉由添加2M Tris，pH 8.0，接著在製劑中添加2 mM CaCl2用於酶轉化以將pH調節至8.0。 野生型胰蛋白酶係用琥珀酸酐修飾(即，琥珀醯化)以在胰蛋白酶處理步驟完成時促進自前鬆弛素原/胰蛋白酶反應混合物之移除。將在10 mM HCl、20 mM CaCl2中之經濃縮野生型胰蛋白酶用純化水稀釋至5 mg/mL，然後將1 M pH 7.6硼酸鹽緩衝劑添加至0.2 M之最終濃度。將固體琥珀酸酐添加至經稀釋之pH經調節之胰蛋白酶溶液中，固體琥珀酸酐係以比胰蛋白酶過量100莫耳分三次等莫耳添加(3 x 33.3莫耳過量添加)並在各添加之間混合10分鐘。 將琥珀醯化胰蛋白酶添加至前鬆弛素原溶液，在22℃下培養4小時以確保完全酶移除前鬆弛素原分子之連接肽及前導序列。所得之鬆弛素-R分子於B鏈上含有C端精胺酸。經胰蛋白酶處理之材料係接著通過Sartobind STIC® PA陰離子交換過濾器進行處理，該過濾器結合琥珀醯化胰蛋白酶同時將鬆弛素-R收集在溢流道中。將羧基肽酶-B (CPB)添加至STIC® PA濾液及攪拌培養2小時以確保完全酶移除B鏈C端精胺酸殘基。該CPB反應係藉由使反應混合物之pH下降至2.8至3.2加以中止。 成熟鬆弛素係使用Tosoh Bioscience SP-5PW陽離子交換樹脂純化。將該成熟鬆弛素裝載於管柱上及然後進行三次管柱清洗；1) 50 mM乙酸鹽pH 5.5，2) 50 mM乙酸鹽pH 5.5，0.1 M NaCl及3) 50 mM乙酸鹽pH 4.0。經結合之鬆弛素係在pH 4下使用自0%至100% 2M KCl之線性梯度於20管柱體積上溶離。在進一步處理前，使用1 M HCl將經溶離之鬆弛素溶液之pH調節至3.0。或者，胰蛋白酶係藉由沈澱移除自該反應混合物。在室溫下將該反應混合物之pH增加至8.0歷時1小時後，鬆弛素沈澱。沈澱之鬆弛素係然後藉由離心回收。集結粒係藉由將集結粒重懸浮於pH 8 Tris緩衝劑中，接著離心來清洗3次。在最終清洗後，將該集結粒重溶解於20 mM乙酸中。經純化之鬆弛素不顯示任何胰蛋白酶活性。最終產物係成熟鬆弛素。 基本上，相同合成方法係用以產生RLX-AQ1 (「AQ1」) (圖2)及RLX-BM25/AN1 (「BM25/AN1」) (圖3)，及對前鬆弛素原序列進行適當修飾。 實例3：鬆弛素結合至包含連接至脂肪酸之肽之PK增強劑 經純化之鬆弛素係藉由超濾濃縮至約10 mg/mL。將包含肽及C15脂肪酸之經胺氧基活化之PK增強劑(例如，GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH)以比鬆弛素過量1.5莫耳添加至反應混合物。然後以比鬆弛素過量45莫耳添加醯肼添加劑(即，4胺基-苯甲醯肼)。視需要用1 M HCl調節該溶液以將pH維持在3.5與4.0之間及將溫度控制在30℃下。結合反應使連接至C15脂肪酸之肽連接子(例如，GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH)(如遵循實例4中描述之製程製備)與鬆弛素中之對乙醯基苯丙胺酸殘基之間形成穩定之肟鍵。該反應係於16小時內完成。 用10 mM pH 4.0乙酸鹽緩衝劑將結合反應混合物稀釋至≤ 4 mS/cm，然後裝載於GE Healthcare SP HP陽離子交換管柱上。裝載完成後，該管柱係用20 mM組胺酸pH 6.0清洗以移除雜質。鬆弛素-C15結合物(包含，例如，AQ1-鬆弛素-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH)係然後用50 mM碳酸氫銨，pH 8.5溶離。該成熟鬆弛素之結構係示意性闡述於圖5中及以式III進行闡述：(式III)。 經純化之鬆弛素-C15結合物係經濃縮及然後滲濾至適當之最終調配緩衝劑中。結合物之例示性組合物係8 mg/mL鬆弛素-C15結合物於20 mM組胺酸、0.25 M蔗糖、0.05% (w/v)聚山梨醇酯-80(pH 5.5)中。該組合物係在£ -60ºC下冷凍儲存。 其他鬆弛素-脂肪酸結合物可使用類似方法製備。 實例4：PK增強劑之固相合成 本文揭示之PK增強劑可使用下文例示之程序製備。 本申請案中，尤其包括在下文之說明性方案及實例中所使用之縮寫係為熟習此項技術者已知。使用之該等縮寫中之一些係如下：min為分鐘；h為小時；rt為室溫；sat.為飽和；TFA為三氟乙酸；DMF為N,N-二甲基甲醯胺；DCM為二氯甲烷；Fmoc為9-茀基甲氧基羰基；HATU = 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸鹽；DIEA或DIPEA為二異丙基乙胺；NMP為N-甲基吡咯啶酮；EDC為1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺；DMSO為二甲基亞碸；MeOH為甲醇；EtOAc為乙酸乙酯；Et3 N為三乙胺；MeCN或CAN為乙腈。 分析資料：質譜：「ESI-MS(+)」表示以陽離子模式進行之電灑離子化質譜；「ESI-MS(-)」表示以陰離子模式進行之電灑離子化質譜；「ESI-HRMS(+)」表示以陽離子模式進行之高解析度電灑離子化質譜；「ESI-HRMS(-)」表示以陰離子模式進行之高解析度電灑離子化質譜。經偵測之質量係以「m/z」單位名稱報告。精確質量大於1000之化合物係通常偵測為雙電荷、三電荷離子及/或四電荷離子。CAD：帶電之氣溶膠偵測器。ELSD：蒸氣光散射偵測器。 分析LCMS條件A：管柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1 × 50 mm，1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有0.05% TFA之水；移動相B：95:5乙腈:具有0.05% TFA之水；溫度：50℃；梯度：0至100% B歷時3分鐘，然後1.0分鐘保持於100% B；流量：1 mL/min；偵測：質量。 分析LCMS條件B：管柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1 × 50 mm，1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有10 mM乙酸銨之水；移動相B：95:5乙腈:具有10 mM乙酸銨之水；溫度：50℃；梯度：0至100% B歷時3分鐘，然後1.0分鐘保持於100% B；流量：1.0 mL/min；偵測：質量。 分析UHPLC-CAD條件A：管柱：Waters BEH Phenyl，150 x 2.1 mm，1.7-μm粒子；移動相A：具有0.05% TFA之水，移動相B：具有0.05% TFA之乙腈；溫度：35℃；梯度分佈：10% B至35% B自0分鐘至15分鐘，35% B至95% B自16分鐘至25分鐘，然後1.0分鐘保持於95% B；後運行時間：4分鐘(在初始移動相條件下)；流動速率：0.35 mL/min；注射體積：3 μL之2 mg/mL樣本於DMSO中；偵測：在100 PA範圍及35 psi氣體下之CAD。 分析UHPLC-CAD條件B：管柱：Waters BEH Phenyl，150 x 2.1 mm，1.7-μm粒子；移動相A：具有0.05% TFA之水，移動相B：具有0.05% TFA之乙腈；溫度：35℃；梯度分佈：10% B至95% B自0分鐘至25分鐘，然後1.0分鐘保持於95% B；後運行時間：4分鐘(在初始移動相條件下)；流動速率：0.35 mL/min；注射體積：3 μL之2mg/mL樣本於DMSO中；偵測：在100 PA範圍及34 psi氣體下之CAD。 一般程序： 所有操作係在自動操作下於Prelude肽合成器(Protein Technologies)上進行。除非另有說明，否則所有程序係在配有底部玻璃料之40 mL聚丙烯反應容器中進行。該容器係通過該容器之底部及頂部連接至該Prelude肽合成器。DMF可通過該容器之頂部及底部添加，DMF均勻地上下清洗該容器之側面。試劑僅通過該容器之底部添加及通過該玻璃料接觸樹脂。所有溶液通過該容器之底部移除。「週期性攪動」描述通過底部玻璃料之N2 氣體之短暫脈衝；該脈衝持續約5秒且每30秒發生一次。胺基酸溶液通常在製備後超過兩週無法使用。HATU溶液係於製備之兩週內使用。DMF =二甲基甲醯胺；HATU = 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸鹽；DIPEA =二異丙基乙胺；2-氯三苯甲基氯樹脂= 2-氯三苯基甲基氯樹脂(Chem-Imprex, 100至200目，黃珠，1.1 meg/g)。常用之胺基酸係列於下文中及側鏈保護基指示於括號內。Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(Ot Bu)-OH；Fmoc-Bzt-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(t Bu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(t Bu)-OH；Fmoc-Thr(t Bu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr (t Bu)-OH；Fmoc-Val-OH。下列脂肪酸衍生物係用於最後之偶合步驟，HO2 C(CH2 )n CH3 ，n = 10至18及HO2 C(CH2 )n (CO2 t Bu)，n = 10至18。 一般程序描述以0.4 mmol規模進行之實驗，其中該規模係由結合至樹脂之 (2-(胺氧基)乙基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯之量確定。此規模對應於約364 mg上文描述之樹脂。然而，基於46%之裝載效率之假設使用800 mg樹脂。在裝載反應結束時，由甲醇中止過量之2-氯三苯基甲基氯。所有程序可藉由以規模的倍數調節本文描述之體積自0.400 mmol規模按比例減小。在胺基酸偶合前，所有肽合成序列以下文稱為「連接子裝載程序」及「樹脂膨脹程序」之連接子裝載程序及樹脂膨脹程序開始。然後，胺基酸偶合至一級胺N端使用下文描述之「一級胺偶合程序」。胺基酸偶合至二級胺N端使用下文描述之「二級偶合程序」。自樹脂整體脫保護及裂解使用下文描述之「整體脫保護程序」。最終，含有用於LC-MS純化之粗產物之澄清溶液之製備使用下文描述之「樣本製備程序」。 連接子裝載程序：規模0.4 mmol係用以準備六個反應容器(RV)且在各RV中針對樹脂裝載0.4 mmol (2-(胺氧基)乙基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯。在0℃下將DIEA (2.95 mL, 16.9 mmol)添加至 (2-(胺氧基)乙基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯鹽酸鹽(化合物4，0.803 g, 2.4 mmol)於CH2 Cl2 (72 mL)中之混合物。在該混合物變得均質後，立即將12 mL此澄清溶液添加至含有800 mg 2-氯三苯甲基氯樹脂之30 mL小瓶中。將所有6個小瓶放置於振動器中在750 rpm下振動75分鐘。然後，將0.2 mL MeOH一次性添加至一個小瓶中，在750 rpm下各振動2分鐘。將該等樹脂轉移至40 mL RV，用CH2 Cl2 (8 mL × 3)、DMF (8 mL × 3)、CH2 Cl2 (10 mL × 3)清洗。將此方法(MeOH中止及CH2 Cl2 /DMF/CH2 Cl2 清洗)施用至另外5個小瓶以在六個RV中提供結合樹脂之連接子化合物5。 樹脂膨脹程序：將含有來自先前步驟之樹脂之RV連接至Prelude肽合成器，及如下清洗(膨脹)三次：向RV中添加DMF (10 mL)，之後將該混合物定期攪拌10分鐘，然後通過玻璃料排出溶劑。 一級胺偶合程序： 向含有來自先前步驟之樹脂之RV中添加哌啶:DMF (20:80 v/v, 10.0 mL)。將該混合物定期攪拌5分鐘及然後通過玻璃料排出溶液。向該RV中再次添加哌啶:DMF (20:80 v/v, 10.0 mL)。將該混合物定期攪拌5分鐘及然後通過玻璃料排出溶液。該樹脂係如下經底部清洗一次：通過容器之底部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。該樹脂係如下從頂部連續清洗四次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。向該RV中以該順序添加胺基酸或脂肪酸(0.2 M於DMF中，4.0 mL, 2當量)、HATU (0.2 M於DMF中，4.0 mL, 2當量)及DIPEA (0.8 M於DMF中，2.0 mL, 4當量)。將該混合物定期攪拌15分鐘或30分鐘，然後通過玻璃料排出該反應混合物溶液(15分鐘反應時間係僅用於最初之偶合反應以於Prelude合成器上形成第一醯胺鍵；就所有其他序列而言，施用30分鐘反應時間)。該樹脂係如下連續清洗三次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (8.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。向該RV中添加DMF (3.3 mL)、DIPEA (0.8 M於DMF中，1.5 mL, 3當量)。在將該混合物攪拌30秒後，添加乙酸酐(1.0 M於DMF中，5.0 mL, 12.5當量)。將該混合物定期攪拌10分鐘，然後通過玻璃料排出該溶液。該樹脂係如下從底部清洗一次：通過容器之底部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。該樹脂係如下從頂部連續清洗四次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。所得之樹脂係直接用於下一步驟中。 二級胺偶合程序： 向含有來自先前步驟之樹脂之RV中添加哌啶:DMF (20:80 v/v, 10.0 mL)。將該混合物定期攪拌5分鐘及然後通過玻璃料排出溶液。向該RV中再次添加哌啶:DMF (20:80 v/v, 10.0 mL)。將該混合物定期攪拌5分鐘及然後通過玻璃料排出溶液。該樹脂係如下從底部清洗一次：通過容器之底部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。該樹脂係如下從頂部連續清洗四次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。向該反應容器中以該順序添加胺基酸或脂肪酸(0.2 M於DMF中，4.0 mL, 2當量)、HATU (0.2 M於DMF中，4.0 mL, 2當量)及DIPEA (0.8 M於DMF中，2.0 mL, 4當量)。將該混合物定期攪拌30分鐘，然後通過玻璃料排出該反應溶液。該樹脂係如下從頂部連續清洗三次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (8.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。向該反應容器中以該順序再次添加胺基酸或脂肪酸(0.2 M於DMF中，4.0 mL, 2當量)、HATU (0.2 M於DMF中，4.0 mL, 2當量)及DIPEA (0.8 M於DMF中，2.0 mL, 4當量)。將該混合物定期攪拌30分鐘，然後通過玻璃料排出該反應溶液。該樹脂係如下從頂部連續清洗三次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (8.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。向該RV中添加DMF (3.3 mL)，DIPEA (0.8 M於DMF中，1.5 mL, 3當量)。在將該混合物攪拌30秒後，添加乙酸酐(1.0 M於DMF中，5.0 mL, 12.5當量)。將該混合物定期攪拌10分鐘，然後通過玻璃料排出該溶液。該樹脂係如下從底部清洗一次：通過容器之底部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。該樹脂係如下從頂部連續清洗四次：就各清洗而言，通過容器之頂部添加DMF (10.0 mL)及將所得之混合物定期攪拌2分鐘，然後通過玻璃料排出溶液。所得之樹脂係直接用於下一步驟中。 整體脫保護程序： 在Prelude上之程序完成後，各RV係用CH2 Cl2 (8 mL × 6)清洗，及容許空氣乾燥。當樹脂自由流動後，將其轉移至30 mL小瓶內，且添加8 mL裂解溶液(參見下文)。將該小瓶在振動器中在750 rpm下振動75分鐘後，過濾該反應混合物。將所得之澄清褐色溶液分至四個25 mL試管內，各含有16 mL乙醚，導致白色懸浮液之形成。各經離心後，用乙醚清洗兩次以在各試管中形成白色固體。該裂解溶液(50 mL)係如下製備：向250 ml Erlenmeyer燒瓶中添加500 mg二硫蘇糖醇、46 mL TFA、2.5 mL水及1.0 mL三異丙基矽烷，及攪拌以形成澄清溶液。 樣本製備程序： 向含有獲得自先前步驟之粗產物之各試管中依次添加0.4 mL DMSO及0.4 mL MeOH。攪拌1分鐘後，在許多情況下形成澄清溶液。然而，若固體仍存在於該試管中，則添加更多DMSO (0.2 mL)，且將該混合物攪拌2分鐘。此時，若固體仍存在，則移除該澄清溶液且添加更多DMSO (多達1.0 mL)。所得之澄清溶液係在2.0 mL每注射下經歷製備型LC-MS。 化合物A之合成將DMAP (2.80 g, 23.0 mmol)添加至十五烷二酸(25.0 g, 92.0 mmol)於2-Me-THF (250 mL)中之混合物。在室溫下攪拌10分鐘後，添加第三丁醇(13.2 mL, 138 mmol)並在室溫下繼續攪拌10分鐘。在60℃下將所得懸浮液加熱10分鐘後，其變為澄清無色溶液。歷時2小時在60℃下於經壓力平衡之加料漏斗中將BOC-酸酐(26.0 g, 119 mmol)於THF (100 mL)中之溶液添加至上文反應混合物。在添加即將結束時，該反應混合物變為淺粉紅色澄清溶液。在60℃下繼續攪拌18小時。冷卻至0℃後，歷時5分鐘添加100 mL 1.5 N HCl。然後，將該混合物升溫至室溫並攪拌15分鐘。分離後，有機層係用鹽水(250 mL x 2)清洗，於Na2 SO4 上乾燥，過濾並濃縮。將所得材料懸浮於乙腈(250 mL)中，在室溫下攪拌1小時，且過濾以移除未反應之二酸初始材料。然後，將濾液濃縮至約125 mL。在0℃下將所得懸浮液攪拌2小時，隨著時間推移變得越來越渾濁。所得固體係經過濾，用冷(0℃)乙腈(2 x 15 mL)清洗並乾燥以提供呈灰白色固體之15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸(化合物1, 8.20 g, 25.0 mmol, 27.2%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 , ppm) d 2.35 (t, J = 7.58 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.46 Hz, 2H), 1.68 – 1.54 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.34 – 1.24 (m, 18H)。13 C NMR (125 MHz, CDCl3 , ppm) d 179.91, 173.44, 79.93, 35.64, 34.08, 29.57, 29.48, 29.46, 29.41, 29.39, 29.29, 29.23, 29.09, 29.06, 28.12, 25.12, 24.70。 下列化合物係根據上文程序製備，HO2 C(CH2 )n CO2 t Bu, n = 10 -18。自未反應之二酸HO2 C(CH2 )n CO2 H及過反應之二酯t BuO2 C(CH2 )n CO2 t Bu分離所需產物-單酯HO2 C(CH2 )nCO2 t Bu係藉由利用其等於乙腈中之不同溶解度而在各情況下達成。使用機械攪拌器，在0℃下歷時10分鐘將氫氧化鉀(74.1 g, 1122 mmol)分批添加至N-羥基胺基甲酸第三丁酯(50.0 g, 376 mmol)於無水乙醇(500 mL)中之澄清溶液。在0℃下攪拌10分鐘及然後在室溫下攪拌20分鐘後，將該反應混合物冷卻至0℃，且歷時15分鐘分批添加2-溴乙胺氫溴酸鹽(100 g, 488 mmol)。在0℃下攪拌30分鐘及然後在室溫下攪拌5小時後，過濾所得白色懸浮液且濾餅係用EtOH (40 mL × 2)清洗。將經組合之濾液濃縮至100 mL之體積，用t-BuOMe (500 mL)及H2 O (250 mL)萃取。分離後，水層係用t-BuOMe (200 mL)萃取。經組合之有機層係用鹽水(2 × 200 mL)清洗，於Na2 SO4 上乾燥，在真空下經濃縮及乾燥以提供非常黏稠之液體(20.0 g)。將所得液體溶解於t-BuOMe (300 mL)中。在室溫下將HCl (3 M於環戊基甲基醚中) (40 mL, 120 mmol)滴加至上文澄清溶液。形成白色懸浮液。在室溫下攪拌4小時後，過濾所得白色固體，用t-BuOMe清洗，並在真空下乾燥45分鐘以提供呈白色固體之2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(化合物2, 15.5 g, 72.9 mmol, 19.4%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 , ppm) d 10.21 (br s, 1H), 8.27 (br s, 2.6H), 3.92 (t, J = 5.26 Hz, 2H), 2.98 (t, J = 5.26 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H)。13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6 , ppm) d 157.10, 80.79, 72.00, 37.46, 28.46。將碳酸氫鈉(8.00 g, 95 mmol)添加至2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(化合物2, 13.5 g, 63.5 mmol)、Fmoc-OSu (25.7 g, 76.0 mmol)於THF (450 mL)及水(150 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下攪拌整夜後，在真空下移除所有揮發物組分。在水層已用固體NaCl飽和後，殘餘物係用EtOAc (400 mL, 200 mL)萃取。經組合之有機層係於Na2 SO4 上乾燥，過濾，濃縮。該殘餘物係於矽膠上用EtOAc/己烷溶離來經歷急速層析術。更純之溶離份係經組合，濃縮且殘餘物係使用上文條件再純化。再一次，該等更純之溶離份係經組合及濃縮。殘餘物係使用相同條件純化第三次。純溶離份係經組合，濃縮及在高真空下過濾以提供(化合物3, 19.2 g, 48.2 mmol, 76%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 , ppm) d 7.78 (d, J = 7.32 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 7.32 Hz, 2H), 7.63, (s, 1H), 7.42 (t, J = 7.32 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.232 Hz, 2H), 6.00 (br s, 1H), 4.40 (d, 2H), 4.26 (t, J = 7.10 Hz, 1H), 3.91 (t, J = 4.20 Hz, 2H), 3.49 – 3.46 (m, 2H), 1.52 (s, 9H)。13 C NMR (125 MHz, CDCl3 , ppm) d 157.54, 156.90, 144.06, 141.32, 127.68, 127.08, 125.23, 119.96, 82.11, 75.66, 66.91, 47.30, 39.23, 28.24。在室溫下將HCl (100 mL, 400 mmol, 4 M於二噁烷中)添加至化合物3 (8.6 g, 21.6 mmol)、1,4-二甲氧基苯(7.46 g, 54.0 mmol)於乙醚(100 mL)中之經攪拌之溶液。在室溫下攪拌整夜後，該混合物變為幾乎無法攪拌之稠懸浮液。添加更多醚(400 mL)並在室溫下將所得懸浮液攪拌30分鐘。然後在氮下過濾該懸浮液並用醚(3 × 100 mL)清洗固體以提供呈白色固體之化合物4 (6.36 g, 19.0 mmol, 87%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 , ppm) d 11.10 (br, s, 2.60 H), 7.89 (d, J = 7.58 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 7.34 Hz, 2H), 7.54 (br t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.42 (t, J = 7.32 Hz, 2H), 7.34 (t, J = 7.32 Hz, 2H), 4.31 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 5.38 Hz, 2H), 3.28 (q, J = 5.22 Hz)。13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6 , ppm) d 156.74, 144.32, 141.22, 128.11, 127.57, 125.64, 120.60, 73.50, 66.08, 47.17, 38.91。化合物A 原材料係經由製備型LC/MS使用下列條件純化：管柱： X Bridge CSH C18，19 x 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有0.1%三氟乙酸之水；移動相B：95:5乙腈:具有01.%三氟乙酸之水；梯度：0至34.9% B歷時23分鐘，然後2分鐘保持於100% B；流量：20 mL/min。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。在氮流下將含有所需產物之所得水溶液冷卻至-78℃並凍乾以提供呈白色固體之標題化合物A (88 mg, 25.9%產率，LC-CAD純度98.6%)。 分析條件A：滯留時間= 1.24分鐘；ESI-MS (M+H)+ = 775.30。 分析條件B：滯留時間= 1.05分鐘；ESI-MS (M+H)+ = 775.25。原材料係經由製備型LC/MS使用下列條件純化：管柱： X Bridge C18，19 x 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有0.1%三氟乙酸之水；移動相B：95:5乙腈:具有0.1%三氟乙酸之水；梯度：20至70% B歷時20分鐘，然後5分鐘保持於100% B；流量：20 mL/min。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。在氮流下將含有所需產物之所得水溶液冷卻至-78℃並凍乾以提供呈白色固體之標題化合物(47 mg, 3.4%產率，LC-CAD純度72%)。 分析條件A：滯留時間= 1.14分鐘；ESI-MS (M+3H)+3 = 1166.90, (M+3H)+4 = 875.45。 分析條件B：滯留時間= 0.991分鐘；ESI-MS (M+3H)+3 = 1166.90, (M+3H)+4 = 875.50。 實例5：PK增強劑之溶液相合成 本文揭示之PK增強劑可使用下文例示之程序製備。(2-(((第三丁氧基羰基)胺基)氧基)乙基)胺基甲酸芐酯3。將DBU (26.3 ml, 174 mmol)分批添加至(2-溴乙基)胺基甲酸芐酯(30 g, 116 mmol)及羥基胺基甲酸第三丁酯(24.76 g, 186 mmol)於THF (75ml)中之攪拌混合物。在室溫下將該反應混合物攪拌整夜(觀察到沈澱)。LCMS顯示僅痕量初始材料留下。該反應混合物係經濃縮，用水中止，用乙酸乙酯萃取。該乙酸乙酯相係經組合，用水，鹽水清洗，然後用Na2 SO4 乾燥。濃縮後，獲得45 g粗產物並進行層析術分離(0至20%丙酮於己烷中)。分離後，獲得呈非常黏稠之淡黃色油之(2-(((第三丁氧基羰基)胺基)氧基)乙基)胺基甲酸芐酯(32.9 g, 106 mmol, 91%產率)。1 H NMR (400MHz，氯仿-d) d 7.43 - 7.30 (m, 5H), 5.75 (br. s., 1H), 5.32 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.94 - 3.85 (m, 2H), 3.54 - 3.42 (m, 2H), 1.50 (s, 9H)。 (2-胺基乙氧基)胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽4。將(2-(((第三丁氧基羰基)胺基)氧基)乙基)胺基甲酸芐酯(16.4 g, 52.8 mmol)溶解於MeOH (161 ml)中並添加氯仿(5.33 ml, 66.1 mmol)。該溶液係用氮吹掃，然後小心添加Pd/C (2.81 g, 2.64 mmol)。然後將該溶液冷卻至0℃並緩慢滴加三乙基矽烷(76 ml, 476 mmol)。在添加期間觀察到H2 逸出且其係放熱的。添加後，然後容許將該反應整夜逐漸升溫至室溫。使該反應混合物濾過矽藻土墊並用額外之甲醇清洗，然後在真空下蒸發。然後殘餘物係用己烷濕磨且所得固體係經過濾，用額外之己烷清洗並容許在抽吸下乾燥以產生呈淡粉色固體之2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(10.2 g, 48.0 mmol, 91%產率)。1 H NMR (400MHz，氯仿-d) d 8.78 (br. s., 1H), 8.31 (br. s., 2H), 4.24 ( s., 2H), 3.39 ( s., 2H), 1.48 (s, 9H)。 ((3,6,9-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十二烷-12-基)氧基)胺基甲酸第三丁酯5。將N-甲基嗎啉(5.17 ml, 47.0 mmol)滴加至2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(4 g, 18.81 mmol)、2-(2-(((芐氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)乙酸(5.01 g, 18.81 mmol)及HATU (7.87 g, 20.69 mmol)於無水DMF (75 ml)中之溶液。容許在室溫下將該混合物攪拌整夜。該反應係用乙酸乙酯稀釋並用1 N HCl清洗。經分離之水相係然後用額外部分之乙酸乙酯萃取及經組合之有機物係然後用1 N HCl、鹽水、飽和碳酸氫鈉溶液清洗，接著用額外之鹽水清洗。有機層係然後在真空下經乾燥(Na2 SO4 )並蒸發。粗產物係然後藉由管柱層析術使用乙酸乙酯-己烷作為溶離液純化以產生6.25g (78%)標題化合物。1 H NMR (400 MHz，氯仿-d) δ 7.69 (s, 1H), 7.41 - 7.28 (m, 6H), 7.00 - 6.87 (m, 1H), 5.81 (br s, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.98 (dd, J=16.7, 5.7 Hz, 4H), 3.86 (t, J=4.8 Hz, 2H), 3.55 - 3.46 (m, 2H), 1.46 (s, 9H)。MS m/e 447.0 (M+Na+ )。 (2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)乙氧基)胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽6。將5 (6.25 g, 14.72 mmol)溶解於無水甲醇(58.9 ml)中並添加氯仿(1.782 ml, 22.09 mmol)，接著添加Pd-C (1.567 g, 1.472 mmol)。反應燒瓶係然後用氫(氣球)吹掃並容許攪拌6小時，然後濾過矽藻土並蒸發以產生2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(4.87 g, 14.90 mmol, 101%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 10.00 (br s, 1H), 8.71 (br t, J=5.7 Hz, 1H), 8.18 - 7.99 (m, 4H), 3.77 (d, J=5.7 Hz, 2H), 3.69 (t, J=5.9 Hz, 2H), 3.59 (s, 2H), 3.36 - 3.23 (m, 3H), 1.41 (s, 9H)。(S)-2-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(((S)-3-羥基-1-甲氧基-1-側氧基丙-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯8。將(S)-4-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊酸(7.，購買自ChemImpex) (15 g, 44.5 mmol)及(S)-2-胺基-3-羥基丙酸甲酯鹽酸鹽(6.92 g, 44.5 mmol)溶解於DMF (148 ml)中並將該溶液冷卻至0℃。添加HATU (18.60 g, 48.9 mmol)，接著添加N-甲基嗎啉(12.22 ml, 111 mmol)。容許在0℃下在N2 下將該反應攪拌12小時。該反應混合物係用EtOAc稀釋，用1 N HCl中止，然後用飽和NaHCO3 及鹽水清洗。有機相係於無水Na2 SO4 上乾燥並在真空下濃縮。粗產物係藉由層析術純化(0至40%丙酮/己烷)純化以產生呈灰白色固體之(S)-2-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(((S)-3-羥基-1-甲氧基-1-側氧基丙-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(16.31 g, 36.5 mmol, 82%產率)。1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) d 7.37 (m, 5H), 6.5 (bs, 1H), 5.53 (m, 1H); 5.1(s, 2H), 4.7(m, 1H), 4.28(m, 1H), 4.1(bs, 1H), 3.95(m, 1H), 3.8(s, 3H), 2.4(m, 2H), 2.3(M,1H), 1.7(m, 1H), 1.5(s, 9H); MS m/e 439.2 (M+H+ )。 (S)-2-((S)-4-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-3-羥基丙酸9。將(S)-2-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(((S)-3-羥基-1-甲氧基-1-側氧基丙-2-基)胺基)-5-側氧基戊酸第三丁酯(14 g, 31.9 mmol)溶解於THF (106 ml)及水(53.2 ml)中並冷卻至0℃。攪拌30分鐘後，添加LiOH (0.688 g, 28.7 mmol)。在此溫度下在N2 下攪拌該反應混合物。反應完成後，在0℃下將該反應混合物之pH調整至~4。該反應混合物係用EtOAc (3 x 150 ml)萃取。經組合之有機相係於無水Na2 SO4 上乾燥並在旋轉蒸發下濃縮以產生呈灰白色固體之(S)-2-((S)-4-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-3-羥基丙酸(13.01 g, 30.7 mmol, 96%產率)。MS m/e 425.0 (M+H+ )。 (5S,10S)-5-(第三丁氧基羰基)-10-(羥甲基)-3,8,11,14-四側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,9,12,15-四氮雜十七烷-17-酸甲酯10。將2-(2-胺基乙醯胺基)乙酸甲酯鹽酸鹽(5 g, 27.4 mmol)溶解於DMF (116 ml)中並裝入(S)-2-((S)-4-(((芐氧基)羰基)胺基)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-3-羥基丙酸(11.62 g, 27.4 mmol)。向此反應混合物中添加HATU (11.45 g, 30.1 mmol)及N-甲基嗎啉(7.53 ml, 68.5 mmol)。在室溫下在N2 下將該反應混合物攪拌12小時。LC/MS及HPLC指示該反應之完成。該反應混合物係用EtOAc (150 mL)稀釋並用1 N HCl中止。分離有機層並用鹽水(50 mL)、 NaHCO3 水溶液(50 mL)及最終鹽水(3 x 50 mL)清洗。該有機層係於無水Na2 SO4 上乾燥並在真空下蒸發以產生呈稠油之所需產物，其係用於層析術純化(0至10% MeOH/DCM)以產生呈稠油之所需產物(5S,10S)-5-(第三丁氧基羰基)-10-(羥甲基)-3,8,11,14-四側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,9,12,15-四氮雜十七烷-17-酸甲酯(14 g, 25.3 mmol, 93%產率)。1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) d 7.38 (m, 5H), 5.1 (m, 2H), 4.0 (m, 6H), 3.7(s, 3H), 2.4(m, 2H), 2.2(M,1H), 1.9(m, 1H), 1.45(s, 9H); MS m/e 553.2 (M+H+ )。 (5S,10S)-5-(第三丁氧基羰基)-10-(羥甲基)-3,8,11,14-四側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,9,12,15-四氮雜十七烷-17-酸11。將5-(第三丁氧基羰基)-10-(羥甲基)-3,8,11,14-四側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,9,12,15-四氮雜十七烷-17-酸(5S,10S)-甲酯(20 g, 36.2 mmol)溶解於THF (193 ml)及水(97 ml)中並冷卻至0℃。攪拌30分鐘後，添加LiOH (0.780 g, 32.6 mmol)。在0℃下在N2 下將該反應混合物攪拌5小時。該反應之進展係藉由LC/MS及HPLC監測。反應完成後，該反應係用EtOAC (150 mL)稀釋並由1 N HCl中和。分離有機相，且水相係用EtOAc (3 x 50 mL)萃取，於無水Na2 SO4 上乾燥，在真空下濃縮並在高真空下乾燥12小時以產生呈灰白色固體之所需產物(18 g, 96%產率)。MS m/e 539.1 (M+H+ )。15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸13。在Ar下將十五烷二酸(20.2 g, 70.5 mmol)於乙酸酐(70 ml)中之懸浮液加熱至128℃。在此溫度下將所得溶液攪拌6.0小時且然後冷卻至室溫。該溶液係用甲苯(100 mL)稀釋並蒸發。殘餘物係用甲苯(4 x 80 mL)汽提並在真空下乾燥6.5小時以產生27.53 g灰白色固體。在室溫下及在Ar下，向上文之固體(27.53 g)及第三丁醇(235 ml)之混合物分三批添加4-二甲基胺基吡啶(34.8 g, 282 mmol)，歷時15分鐘之週期。將該混合物加熱至50℃並在此溫度下將所得溶液攪拌34.0小時。冷卻至室溫後，該混合物係用甲苯(50 mL)稀釋並蒸發。殘餘物係用甲苯(2 x 100 mL)汽提及然後置於9/1醚/CH2 Cl2 (600 mL)中。該溶液係用1 M HCl (400 mL)、0.5 M HCl (400 mL)、水(300 mL)及鹽水(300 mL)清洗。有機層係經乾燥(Na2 SO4 )並蒸發。將粗產物置於CH2 Cl2 (50 mL)中並進行聲處理。所得懸浮液係通過中等燒結漏斗過濾且該漏斗中之固體係用兩小部分之CH2 Cl2 沖洗。濾液及沖洗物係經組合並蒸發。濃縮液係經層析(120 g急速管柱筒，CH2 Cl2 至9/1 CH2 Cl2 /i-PrOH)以按溶離順序產生： -十五烷二酸二第三丁酯及15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸之~5/1混合物(7.19 g，無色油)。 -呈白色固體之15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸(4.38 g, 19%產率)：LC/MS [M-H]-1 = 327；1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) d 2.37 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.22 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 1.63 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.28 (m, 18H)。 -15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸及十五烷二酸之~4/1混合物(4.42 g，灰白色固體)。 二及單第三丁基酯之混合物(7.19 g)係藉由層析術(120 g急速管柱筒，CH2 Cl2 至9/1 CH2 Cl2 /i-PrOH)分離以提供額外量呈白色固體之15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸(0.8 g, 4%產率)。 單第三丁基酯及二酸之混合物(4.42 g)係藉由層析術(330 g急速管柱筒，Hex至4/1小時ex /丙酮)分離以提供額外量呈白色固體之15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸(2.92 g, 13%產率)。 15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸之總經分離之量係8.1 g (36%產率)。N2-((芐氧基)羰基)-N5-((S)-1-((2-((2-((2-((2,2-二甲基-4,10-二側氧基-3,6-二氧雜-5,9-二氮雜十一烷-11-基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙-2-基)-L-麩胺酸第三丁酯14。在室溫下在氮氣氛下將2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(3.73 g, 11.41 mmol)及(5S,10S)-5-(第三丁氧基羰基)-10-(羥甲基)-3,8,11,14-四側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,9,12,15-四氮雜十七烷-17-酸(5.85 g, 10.87 mmol)溶解於DMF (36.2 ml)中。將該溶液冷卻至0℃，然後添加HATU (4.55 g, 11.96 mmol)，接著滴加N-甲基嗎啉(2.99 ml, 27.2 mmol)。容許整夜將該反應升溫至室溫。將該反應冷卻至0℃，然後用冰水中止並在冰融化時劇烈攪拌。當所有冰已在燒瓶周圍融化時，已形成沈澱(ppte)，其然後以抽吸(緩慢)過濾整夜。將所得蠟狀固體溶解於甲醇(200 mL)中，然後蒸發。用甲醇(約20 mL)進行處理，接著添加乙醚，然後沈澱產物，藉由抽吸收集以產生28-(((芐氧基)羰基)胺基)-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24-七氮雜二十九烷-29-酸(23S,28S)-第三丁酯6.4 g (73%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 9.96 (br s, 1H), 8.24 - 8.01 (m, 5H), 7.87 (br t, J=5.6 Hz, 1H), 7.62 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 7.40 - 7.30 (m, 5H), 5.10 - 4.96 (m, 3H), 4.30 - 4.24 (m, 1H), 4.10 (q, J=5.3 Hz, 3H), 3.93 - 3.84 (m, 1H), 3.80 - 3.53 (m, 13H), 3.31 - 3.23 (m, 2H), 3.17 (d, J=5.3 Hz, 7H), 2.90 (s, 1H), 2.75 - 2.67 (m, 1H), 2.35 - 2.20 (m, 2H), 1.98 - 1.86 (m, 1H), 1.82 - 1.71 (m, 1H), 1.42 - 1.24 (m, 20H)。MS m/e 811.4 (M+H+ )。 N5-((S)-1-((2-((2-((2-((2,2-二甲基-4,10-二側氧基-3,6-二氧雜-5,9-二氮雜十一烷-11-基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-3-羥基-1-側氧基丙-2-基)-L-麩胺酸第三丁酯15。將甲醇(158 ml)一次性添加至(23S,28S)-28-(((芐氧基)羰基)胺基)-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24-七氮雜二十九烷-29-酸第三丁酯(6.4 g, 7.89 mmol)且容許在氮氣氛下攪拌該固體直至胺溶解(約3 H)。然後添加Pd/C (0.840 g, 0.789 mmol)並然後經由氣球引入氫氣氛。容許在室溫下攪拌該反應，然後通過玻璃濾紙過濾並蒸發濾液以產生呈灰白色脆性固體之(23S,28S)-28-胺基-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24-七氮雜二十九烷-29-酸第三丁酯4.8 g (90%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 9.96 (br s, 1H), 8.29 - 8.19 (m, 1H), 8.17 - 7.96 (m, 3H), 7.87 (br t, J=5.7 Hz, 1H), 5.00 (br s, 1H), 4.28 - 4.08 (m, 1H), 3.78 - 3.56 (m, 10H), 3.30 - 3.14 (m, 3H), 2.90 (s, 1H), 2.75 - 2.67 (m, 1H), 2.34 - 2.06 (m, 3H), 1.87 - 1.74 (m, 1H), 1.68 - 1.50 (m, 1H), 1.41 (d, J=4.3 Hz, 15H), 1.10 (s, 1H)。 (23S,28S)-28-(第三丁氧基羰基)-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25,30-八側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24,29-八氮雜四十四烷-44-酸第三丁酯16。 在0℃下在氮氣氛下將N-甲基嗎啉(1.950 ml, 17.73 mmol)滴加至(23S,28S)-28-胺基-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25-七側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24-七氮雜二十九烷-29-酸第三丁酯(4.8 g, 7.09 mmol)、15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸(2.446 g, 7.45 mmol)及HATU (2.97 g, 7.80 mmol)之部分溶液。添加額外之20 mL DMF以溶解反應混合物，該反應混合物然後容許整夜緩慢升溫至室溫。然後在冰浴中冷卻該反應，接著用冰中止並容許融化同時劇烈攪拌該混合物。然後過濾該固體以產生膠狀固體(6.1g)，將該膠狀固體轉移至SFC以用於純化。SFC純化產生用於下一步驟中之呈白色固體之(23S,28S)-28-(第三丁氧基羰基)-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25,30-八側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24,29-八氮雜四十四烷-44-酸第三丁酯(2.5 g, 2.53 mmol, 35.7%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 9.96 (br s, 1H), 8.23 - 8.02 (m, 1H), 7.97 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 7.84 (t, J=5.8 Hz, 1H), 4.96 (t, J=5.6 Hz, 1H), 4.32 - 4.21 (m, 1H), 4.17 - 4.03 (m, 1H), 3.85 (d, J=6.0 Hz, 1H), 3.76 (br d, J=5.1 Hz, 1H), 3.72 - 3.55 (m, 1H), 3.30 - 3.24 (m, 1H), 2.27 - 2.07 (m, 1H), 2.01 - 1.86 (m, 1H), 1.80 - 1.65 (m, 1H), 1.49 - 1.38 (m, 5H), 1.35 (br s, 1H), 1.29 - 1.16 (m, 4H)。MS m/e 987.7 (M+H+ )。 (17S,22S)-1-(胺氧基)-22-羧基-17-(羥甲基)-4,7,10,13,16,19,24-七側氧基-3,6,9,12,15,18,23-七氮雜三十八烷-38-酸，化合物A。將(23S,28S)-28-(第三丁氧基羰基)-23-(羥甲基)-2,2-二甲基-4,10,13,16,19,22,25,30-八側氧基-3,6-二氧雜-5,9,12,15,18,21,24,29-八氮雜四十四烷-44-酸第三丁酯(2.5 g, 2.53 mmol)溶解於25 mL + 10 mL經冷卻之92:8 TFA:TIPS之清洗混合物中。將該溶液直接添加至白色固體並容許在室溫下攪拌3小時。將該溶液冷卻至0℃並添加320 mL庚烷: 40 mL MTBE，然後轉移至冰箱，歷時整夜。澄清油已經分離且在燒瓶底部可見。移除上清液並添加冷乙醚(1L)。將所得白色固體攪拌2小時，然後快速過濾並在布氏漏斗中乾燥以產生(17S,22S)-1-(胺氧基)-22-羧基-17-(羥甲基)-4,7,10,13,16,19,24-七側氧基-3,6,9,12,15,18,23-七氮雜三十八烷-38-酸2.1 g (95%產率)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 8.42 - 8.34 (m, 1H), 8.20 - 7.95 (m, 3H), 4.81 - 4.74 (m, 1H), 4.61 (dd, J=10.9, 4.6 Hz, 1H), 4.48 (dd, J=10.8, 7.5 Hz, 1H), 4.30 - 4.03 (m, 1H), 3.93 - 3.30 (m, 10H), 2.47 - 2.39 (m, 1H), 2.33 (dt, J=3.7, 1.9 Hz, 1H), 2.27 - 2.08 (m, 3H), 2.05 - 1.91 (m, 1H), 1.82 - 1.69 (m, 1H), 1.52 - 1.43 (m, 2H), 1.24 (s, 9H), 1.21 - 1.00 (m, 1H)。具有CAD偵測之HPLC分析指示81%純度，Agilent 1100 LC/UV/CAD, ACE C18-300 300 x 4.6 mm ID, 5mm, A: 水0.05%TFA;B: ACN 0.05%TFA。 實例6：額外PK增強劑之溶液相合成 分析LCMS條件A：管柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1 × 50 mm，1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有0.05% TFA之水；移動相B：95:5乙腈:具有0.05% TFA之水；溫度：50℃；梯度：0至100% B歷時3分鐘，然後1.0分鐘保持於100% B；流量：1 mL/min；偵測：質量。 分析LCMS條件B：管柱：Waters Acuity UHPLC BEH C18，2.1 × 50 mm，1.7-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有10 mM乙酸銨之水；移動相B：95:5乙腈:具有10 mM乙酸銨之水；溫度：50℃；梯度：0至100% B歷時3分鐘，然後1.0分鐘保持於100% B；流量：1.0 mL/min；偵測：質量。 分析UHPLC-ELSD條件A：HPLC條件：管柱：Waters BEH C18，150 x 2.1 mm，1.7-μm粒子；移動相A：具有0.05% TFA之水，移動相B：具有0.05% TFA之乙腈；溫度：35℃；梯度分佈：10% B至50% B自0分鐘至15分鐘，50% B至60% B自16分鐘至20分鐘，60% B至95% B自21分鐘至26分鐘然後4.0分鐘保持於95% B；後運行時間：4分鐘(在初始移動相條件下)；流動速率：0.35 mL/min；注射體積：5 μL 1 mg/mL樣本於50/50 MeCN/水；MS條件：質量範圍m/z 120至2000。離子化及模式：電灑離子化，陽離子模式。ELSD條件：增益：20。漂移管溫度：60℃。氣體流動速率：40 psi。 分析UHPLC-ELSD條件B：HPLC條件：管柱：Waters BEH CSH C18，150 x 2.1 mm，1.7-μm粒子；移動相A：具有0.05% TFA之水，移動相B：具有0.05% TFA之乙腈；溫度：35℃；梯度分佈：10% B至95% B自0分鐘至24分鐘，然後3.0分鐘保持於95% B；後運行時間：4分鐘(在初始移動相條件下)；流動速率：0.35 mL/min；注射體積：2 μL 1 mg/mL樣本於50/50 MeCN/水中；MS條件：質量範圍m/z 120至2000。離子化及模式：電灑離子化，陽離子模式。ELSD條件：增益：50。漂移管溫度：60℃。氣體流動速率：40 psi。 分析UHPLC-CAD條件C：HPLC條件：管柱：Waters BEH Phenyl，150 x 2.1 mm，1.7-μm粒子；移動相A：具有0.05% TFA之水，移動相B：具有0.05% TFA之乙腈；溫度：35℃；梯度分佈：10% B至95% B自0分鐘至25分鐘，然後2.0分鐘保持於95% B；後運行時間：4分鐘(在初始移動相條件下)；流動速率：0.35 mL/min；注射體積：5 μL 1 mg/mL樣本於MeOH中；MS條件：質量範圍m/z 120至2000。離子化及模式：電灑離子化，陽離子模式。CAD條件：範圍：100 PA。氣體流動速率：35 psi。 分析UHPLC-CAD條件D：HPLC條件：管柱：Waters BEH Phenyl，150 x 2.1 mm，1.7-μm粒子；移動相A：具有0.05% TFA之水，移動相B：具有0.05% TFA之乙腈；溫度：35℃；梯度分佈：10% B至35% B自0分鐘至15分鐘，35% B至95% B自16分鐘至25分鐘，然後2.0分鐘保持於95% B；後運行時間：3分鐘(在初始移動相條件下)；流動速率：0.35 mL/min；注射體積：2 μL 1 mg/mL樣本於50/50 MeOH/水中；MS條件：質量範圍m/z 120至2000。離子化及模式：電灑離子化，陽離子模式。CAD條件：範圍：100 PA。氣體流動速率：35 psi。 PEG36 -Glug -C13 -CH3 (8)之合成。 十四烷酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1)。將於CH2 Cl2 中之DCC (1 M, 99 mL, 99 mmol)添加至十四烷酸(20.55 g, 90 mmol)於DMF (100 mL)中之經攪拌之溶液。在室溫下將該混合物攪拌整夜，過濾，濃縮及在高真空下乾燥。將所得固體懸浮於醚/己烷(1:3, 80 mL)中歷時45分鐘，藉由過濾收集並乾燥以提供呈白色固體之十四烷酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1) (16.96 g, 52.1 mmol, 58%產率)，其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 (S)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基-4-十四醯胺基戊酸(2)。將水(150 ml)添加至(S)-4-胺基-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊酸(10.5 g, 51.7 mmol)、十四烷酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1) (16.81 g, 51.7 mmol)及NaHCO3 (5.21 g, 62.0 mmol)於DME (450 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將所得澄清溶液攪拌4小時。在真空下移除DME，及然後添加HCl水溶液 (1 M, 67.2 ml, 67.2 mmol)以將pH調整至2至3。在0℃下將所得懸浮液攪拌30分鐘，及然後過濾。所得白色固體係用DME (2 x)共沸乾燥，然後在室溫下懸浮於醚/己烷1:3 (160 mL)中歷時1小時。所得白色固體係藉由過濾收集並在高真空下乾燥以提供(S)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基-4-十四醯胺基戊酸(2) (8.5 g, 21 mmol, 40%產率)，其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 (S)-2-十四醯胺基戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (3)。在室溫下將於CH2 Cl2 中之DCC (1 M, 26.6 mL, 26.6 mmol)添加至(S)-5-(第三丁氧基)-5-側氧基-4-十四醯胺基戊酸(2) (10.0 g, 24.2 mmol)及1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(3.06 g, 26.6 mmol)於DMF (30 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該反應混合物攪拌整夜，過濾並濃縮。將殘餘物溶解於CH2 Cl2 中並藉由急速層析術於矽膠上，用EtOAc/己烷(1:2)溶離來純化以提供呈白色固體之(S)- 2-十四醯胺基戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (3) (8.95 g, 17.5 mmol, 73%產率)。1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) d 6.29 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.58 (m, 1H), 2.82 (s, 4H), 2.70 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.29 (m, 1H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.06 (m, 1H), 1.60 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.25 (m, 20H), 0.86 (t, J = 6.3 Hz, 3H)。13 C-NMR (CDCl3 , 100 MHz) δ ppm 173.0, 170.3, 168.7, 167.6, 82.4, 51.2, 36.0, 31.5, 29.29. 29.27, 29.25, 29.11, 28.97, 28.92, 27.6, 27.15, 27.10, 25.21, 25.11, 22.3, 13.7。 化合物5。在室溫下將水(4.5 mL)添加至化合物4 (750 mg, 0.448 mmol)、(S)-2-十四醯胺基戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) 3 (297 mg, 0.582 mmol)及NaHCO3 (75 mg, 0.90 mmol)於DME (13.5 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將所得澄清溶液攪拌整夜後，添加HCl水溶液 (1 M, 0.896 mL, 0.896 mmol)，及在真空下濃縮該混合物。殘餘物係藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.NH4 OAc溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈白色固體之標題化合物5 (610 mg, 66%產率)。(M+2H)2+ 1036, (M+3H)3+ 691。 化合物6。將於CH2 Cl2 中之DCC (1 M, 0.32 mL, 0.32 mmol)添加至化合物5 (550 mg, 0.266 mmol)及1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(36.7 mg, 0.319 mmol)於CH2 Cl2 (12 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜，過濾及在真空下濃縮以提供呈白色固體之化合物6，其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 化合物7。在室溫下將水(2.5 mL)添加至化合物6 (577 mg, 0.266 mmol)、2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯(Miao, Z.；Liu, J.；Norman, T.；Driver, R. WO 2006/069246) (70.3 mg, 0.399 mmol)及NaHCO3 (33.5 mg, 0.40 mmol)於DME (7.5 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜並濃縮。殘餘物係藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.NH4 Cl溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈白色固體之標題化合物7 (360 mg, 61%產率)。(M+2H)2+ 1115, (M+3H)3+ 743。 化合物8。在室溫下將TFA (2 mL)添加至化合物7 (274 mg, 0.123 mmol)、1,4-二甲氧基苯(155 mg, 1.12 mmol)於CH2 Cl2 (2 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌4小時及然後濃縮。殘餘物係藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.NH4 Cl溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈白色固體之標題化合物8 (228 mg, 84%產率)。其UHPLC-ELSD純度係使用分析UHPLC-ELSD條件A測定為93.3%。(M+2H)2+ 1037, (M+3H)3+ 691。 PEG36 -Glug -C13 -CO2 H (16)之合成。 14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四烷酸(9)。在1 L經火焰乾燥之圓底燒瓶中裝入十四烷二酸(21 g, 81 mmol)、DMAP (9.93 g, 81 mmol)及甲苯(300 mL)。在室溫下將該混合物攪拌15分鐘後，添加2-甲基丙-2-醇(11.7 mL, 122 mmol)及二碳酸二第三丁酯(26.6 g, 122 mmol)。在室溫下將所得混合物攪拌30分鐘，及然後在116℃下加熱15小時。混合物係經濃縮，及殘餘物係於矽膠上經歷急速層析術，用含有1% HOAc之EtOAc/己烷(1:2)溶離，以提供14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四烷酸(9) (9.0 g, 29 mmol, 35%產率)。該材料藉由1 H-NMR係約80%純(主要雜質係二第三丁酯)，且其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 十四烷二酸1-第三丁酯14-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (10)。將於CH2 Cl2 中之DCC (1 M, 59.6 mL, 59.6 mmol)添加至14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四烷酸(9) (12.5 g, 39.8 mmol)及1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(6.86 g, 59.6 mmol)於CH2 Cl2 (200 mL)中之經攪拌之溶液。在室溫下將該混合物攪拌整夜，過濾並濃縮。殘餘物係藉由急速層析術於矽膠上，用CH2 Cl2 溶離來純化以提供呈白色固體之十四烷二酸1-第三丁酯14-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (10) (6.2 g, 15 mmol, 38%產率)。1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) d 2.84 (br s, 4H), 2.60 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), 1.26 (m, 14H)。13 C-NMR (CDCl3 , 100 MHz) d 173.4, 169.2, 168.7, 79.9, 35.6, 31.0, 29.54, 29.51, 29.47, 29.34, 29.31, 29.09, 28.8, 28.1, 25.6, 25.1。 (S)-5-(第三丁氧基)-4-(14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四醯胺基)-5-側氧基戊酸(11)。將水(40 ml)添加至(S)-4-胺基-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊酸(1.600 g, 7.87 mmol)、十四烷二酸1-第三丁酯14-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (10) (3.6 g, 7.87 mmol)及NaHCO3 (0.794 g, 9.45 mmol)於DME (120 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將所得澄清溶液攪拌整夜。在真空下移除DME，並添加HCl水溶液 (1 M, 9.45 ml, 9.45 mmol)以將pH調整至2至3。該混合物係用CH2 Cl2 (1 × 250 mL, 2 × 50 mL)萃取，而水層係用固體NaCl飽和。經組合之有機層係於Na2 SO4 上乾燥，過濾，濃縮及在真空下乾燥以提供呈白色固體之(S)-5-(第三丁氧基)-4-(14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四醯胺基)-5-側氧基戊酸(11) (5.14 g, 10.3 mmol)，其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 (S)-2-(14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四醯胺基)戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (12)。將於CH2 Cl2 中之DCC (1 M, 11.8 mL, 11.8 mmol)添加至(S)-5-(第三丁氧基)-4-(14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四醯胺基)-5-側氧基戊酸(11) (3.93 g, 7.87 mmol)及1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(1.359 g, 11.81 mmol)於CH2 Cl2 (100 mL)中之經攪拌之溶液。在室溫下將該混合物攪拌20小時，及然後過濾。在真空下濃縮濾液，及殘餘物藉由急速層析術於矽膠上，用EtOAc/CH2 Cl2 (1:19)溶離來純化以提供 (S)-2-(14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四醯胺基)戊二酸 1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (12) (3.2 g, 68%產率)。1 H-NMR (CDCl3 , 400 MHz) d 6.27 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.59 (m, 1H), 2.84 (s, 4H), 2.71 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.31 (m, 1H), 2.22 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 2.18 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 2.08 (m, 1H), 1.58 (m 4H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.25 (m, 16H)。13 C-NMR (CDCl3 , 100 MHz) d 173.41, 173.37, 170.7, 169.1, 168.0, 82.8, 79.9, 51.6, 36.4, 35.6, 29.58, 29.47, 29.35, 29.30, 29.10, 28.12, 27.99, 27.55, 27.50, 25.59, 25.48, 25.13。 化合物13。將水(4 mL)添加至化合物4 (750 mg, 0.448 mmol) (購買自Quanta BioDesign, Powell, Ohio)、 (S)-2-(14-(第三丁氧基)-14-側氧基十四醯胺基)戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (12) (401 mg, 0.672 mmol)及NaHCO3 (45.1 mg, 0.537 mmol)於DME (12 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜後，添加HCl水溶液 (1 M, 0.537 mL, 0.537 mmol)。在真空下濃縮該混合物，及殘餘物藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.NH4 Cl溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈白色固體之標題化合物13 (870 mg, 90%產率)。(M+2H)2+ 1079, (M+3H)3+ 719。 化合物14。在室溫下將於CH2 Cl2 中之DCC (1 M, 0.605 mL, 0.605 mmol)添加至化合物13 (870 mg, 0.403 mmol)及1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(69.6 mg, 0.605 mmol)於CH2 Cl2 (10 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜，過濾，濃縮及在真空下乾燥以提供呈白色固體之化合物14，其無需進一步純化即可直接用於下一步驟中。 化合物15。在室溫下將水(4 mL)添加至化合物14 (908 mg, 0.403 mmol)及2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯(2) (142 mg, 0.806 mmol)於DME (12 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜，濃縮，及殘餘物藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.NH4 Cl溶離來純化(管柱：Teledyne Isco C18 Redi SepRf高性能金；偵測器：ELSD；速率：60 mL/min；溶劑A：95% H2 O，5% MeCN，10 mM NH4 OAc；溶劑B：5% H2 O，95% MeCN，10 mM NH4 OAc)。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈白色固體之標題化合物15 (730 mg, 78%產率)。(M+2H)2+ 1158, (M+3H)3+ 772。 化合物16。在室溫下將TFA (8 mL, 104 mmol)添加至化合物15 (420 mg, 0.181 mmol)及1,4-二甲氧基苯(201 mg, 1.451 mmol)於CH2 Cl2 (8 mL)中之經攪拌之混合物。在室溫下將該混合物攪拌3小時，濃縮，及殘餘物藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.NH4 Cl溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機物係使用氮流移除。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈白色固體之標題化合物16 (240 mg, 63%產率)。其UHPLC-ELSD純度係使用分析UHPLC-ELSD條件B測定為75.2%。(M+2H)2+ 1052, (M+3H)3+ 701。 精胺-Glug -C14 -CO2 H (27)之合成 (4-((3-胺基丙基)(第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-(((芐氧基)羰基)胺基)丙基)胺基甲酸第三丁酯(18)。將水(100 mL)添加至N-(芐氧基羰氧基)琥珀醯亞胺(16.6 g, 66.4 mmol)、丁烷-1,4-二基雙((3-胺基丙基)胺基甲酸二第三丁酯) (17) (Strømgaard, K；Bjørnsdottir, I；Andersen, K；Brierley, M. J.；Rizoli, S.；Eldursi, N；Mellor, I,. R.；4 Peter N.R. Usherwood, P. N. R.；Hansen, S. H.；Krogsgaard-Larsen, P.；Jaroszewski, J. W. Chirality, 2000, 12, 93) (19.1 g, 47.4 mmol)於THF (300 mL)中之混合物。在室溫下將其攪拌整夜後，在真空下移除所有THF且該混合物係用CH2 Cl2 (350 ml, 100 ml × 2)萃取，而水層係用固體NaCl飽和。經組合之有機層係於Na2 SO4 上乾燥，過濾，及在真空下濃縮，且藉由急速層析術用2 M NH3 -MeOH/CH2 Cl2 (自1:19至1:9)溶離來純化以提供(4-((3-胺基丙基)(第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-(((芐氧基)羰基)胺基)丙基)胺基甲酸第三丁酯(18) (5.19 g, 9.67 mmol, 20.4%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.22 - 7.40 (m, 5 H), 5.01 - 5.12 (m, 2 H), 3.34 - 3.48 (m, 4 H), 3.01 - 3.31 (m, 5 H), 2.65 (br t, J=6.60 Hz, 2 H), 1.86 - 2.19 (m, 4 H), 1.55 - 1.75 (m, 4 H), 1.43 - 1.50 (m, 4 H), 1.43 (s, 9 H), 1.42 (s, 9 H)。13 C-NMR光譜因旋轉異構體之存在而係非常複雜的。 十五烷二酸1-(第三丁酯) 15-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (19)。在室溫下將15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷酸(實例4中之化合物1) (3.28 g, 10.0 mmol)、1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(1.73 g, 15.0 mmol)及EDC (2.88 g, 15.0 mmol)於CH2 Cl2 (100 mL)中之混合物攪拌16小時。然後該混合物係用CH2 Cl2 (200 mL)稀釋，並用鹽水/水(1:1)清洗兩次，於Na2 SO4 上乾燥，過濾，濃縮並在高真空下乾燥以提供十五烷二酸1-第三丁酯15-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (19) (4.26 g, 10.0 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。 (S)-5-(第三丁氧基)-4-(15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷醯胺基)-5-側氧基戊酸(20)。將NaHCO3 (1.01 g, 12.0 mmol)於水(30 mL)中之溶液添加至(S)-4-胺基-5-(第三丁氧基)-5-側氧基戊酸(2.44 g, 12.0 mmol)及十五烷二酸1-第三丁酯15-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (19) (4.26 g, 10.0 mmol)於DME (90 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌16小時後，在真空下移除所有DME，將pH調整至2至3，且該混合物係用CH2 Cl2 (350 mL, 150 mL)萃取。經組合之有機層係於Na2 SO4 上乾燥，過濾，濃縮及在真空下乾燥以提供(S)-5-(第三丁氧基)-4-(15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷醯胺基)-5-側氧基戊酸(20) (5.14 g, 10.0 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。 (15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五醯基)-L-麩胺酸1-(第三丁酯) 5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (21)。在室溫下將(S)-5-(第三丁氧基)-4-(15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷醯胺基)-5-側氧基戊酸(20) (5.14 g, 10.0 mmol)、1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(1.73 g, 15.0 mmol)、EDC (2.88 g, 15.0 mmol)於CH2 Cl2 (100 mL)中之混合物攪拌16小時。然後該混合物係用CH2 Cl2 (200 mL)稀釋，並用鹽水/水(1:1)清洗兩次。有機層係於Na2 SO4 上乾燥，過濾，在真空下濃縮且殘餘物係經歷急速層析術，用EtOAc/CH2 Cl2 溶離以提供呈白色固體之 (S)-2-(15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷醯胺基)戊二酸1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (21) (3.41 g, 5.58 mmol, 55.8%產率) (針對3個步驟，55.8%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 6.20 (br d, J=7.82 Hz, 1 H), 4.62 (td, J=7.95, 4.89 Hz, 1 H), 2.80 - 2.91 (m, 4 H), 2.56 - 2.79 (m, 2 H), 2.29 - 2.42 (m, 1 H), 2.17 - 2.28 (m, 4 H), 2.02 - 2.16 (m, 1 H), 1.54 - 1.69 (m, 4 H), 1.48 - 1.53 (m, 9 H), 1.44 - 1.48 (m, 9 H), 1.21 - 1.39 (m, 18 H)。13 C-NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ ppm 173.35, 173.33, 170.66, 168.95, 168.01, 82.82, 79.85, 51.66, 36.46, 35.66, 29.61, 29.49, 29.35, 29.31, 29.12, 28.15, 28.00, 27.62, 27.54, 25.60, 25.48, 25.15。 (S)-8,13,21-參(第三丁氧基羰基)-3,18,23-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,8,13,17,22-五氮雜三十七烷-37-酸第三丁酯(22)。將水(20 mL)添加至(4-((3-胺基丙基)(第三丁氧基羰基)胺基)丁基)(3-(((芐氧基)羰基)胺基)丙基)胺基甲酸第三丁酯(18) (1.42 g, 2.65 mmol)、(S)-2-(15-(第三丁氧基)-15-側氧基十五烷醯胺基)戊二酸 1-第三丁酯5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (21) (1.62 g, 2.65 mmol)於DME (60 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜後，在高真空下移除所有揮發性組分(包括水)，且殘餘物係用MeOH (2 x)共沸乾燥。將殘餘物溶解於MeOH/CH2 Cl2 (1:9, ＜10 mL)中並經歷急速層析術，用MeOH/CH2 Cl2 溶離以提供呈黏性液體之(S)-8,13,21-參(第三丁氧基羰基)-3,18,23-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,8,13,17,22-五氮雜三十七烷-37-酸第三丁酯(22) (2.74 g, 2.65 mmol, 100%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.29 - 7.39 (m, 5 H), 7.12 - 7.25 (m, 1 H), 6.69 - 6.89 (m, 1 H), 5.67 - 5.95 (m, 1 H), 5.03 - 5.15 (m, 2 H), 4.30 - 4.47 (m, 1 H), 3.38 - 3.54 (m, 8 H), 3.05 - 3.32 (m, 8 H), 2.12 - 2.35 (m, 6 H), 1.86 - 2.05 (m, 1 H), 1.51 - 1.76 (m, 7 H), 1.45 (s, 9 H), 1.44 (s, 27 H), 1.17 - 1.33 (m, 20 H)。13 C-NMR光譜因旋轉異構體之存在而係非常複雜的。 (S)-5-(3-胺基丙基)-10,18-雙(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,15,20-三側氧基-3-氧雜-5,10,14,19-四氮雜三十四烷-34-酸第三丁酯(23)。在室溫下使(S)-8,13,21-參(第三丁氧基羰基)-3,18,23-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,8,13,17,22-五氮雜三十七烷-37-酸第三丁酯(22) (1.36 g, 1.32 mmol)及Pd-C (0.140 g, 10重量%)於乙醇(100 mL)中之混合物在帕爾(Parr)振動器(H2 , 30 psi)中氫化18小時。該混合物係經過濾，用EtOH清洗，在真空下經濃縮及乾燥以提供(S)-5-(3-胺基丙基)-10,18-雙(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,15,20-三側氧基-3-氧雜-5,10,14,19-四氮雜三十四烷-34-酸第三丁酯(23) (1.19 g, 1.32 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 6.91 - 7.09 (m, 1 H), 6.46 - 6.73 (m, 1 H), 4.34 - 4.54 (m, 1 H), 3.66 - 3.81 (m, 1 H), 3.10 - 3.36 (m, 10 H), 2.82 - 2.93 (m, 2 H), 2.58 - 2.67 (m, 3 H), 2.13 - 2.36 (m, 6 H), 1.55 - 1.72 (m, 6 H), 1.49 - 1.53 (m, 4 H), 1.48 (s, 9 H), 1.47 (d, J=3.18 Hz, 27 H), 1.22 - 1.37 (m, 20 H)。13 C-NMR光譜因旋轉異構體之存在而係非常複雜的。 (S)-20,28,33-參(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,18,23,38-四側氧基-3-氧雜-19,24,28,33,37-五氮雜四十一烷-41-酸(24)。將吡啶(13 mL)添加至(S)-5-(3-胺基丙基)-10,18-雙(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,15,20-三側氧基-3-氧雜-5,10,14,19-四氮雜三十四烷-34-酸第三丁酯(23) (1.19 g, 1.32 mmol)及二氫呋喃-2,5-二酮(0.66 g, 6.6 mmol)之混合物。在室溫下將該混合物攪拌16小時後，在真空下移除所有揮發性組分，且殘餘物係經歷急速層析術，用含有0.5% AcOH之MeOH/CH2 Cl2 溶離以提供呈黏性液體之(S)-20,28,33-參(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,18,23,38-四側氧基-3-氧雜-19,24,28,33,37-五氮雜四十一烷-41-酸(24) (1.32 g, 1.32 mmol, 100%產率)。1 H-NMR (400 MHz，氯仿-d) δ ppm 4.38 - 4.50 (m, 1 H), 3.47 - 3.58 (m, 1 H), 3.09 - 3.32 (m, 9 H), 2.75 (s, 4 H), 2.64 - 2.73 (m, 2 H), 2.46 - 2.59 (m, 2 H), 2.27 - 2.35 (m, 2 H), 2.17 - 2.27 (m, 4 H), 2.07 - 2.14 (m, 4 H), 1.83 - 2.04 (m, 1 H), 1.67 - 1.80 (m, 3 H), 1.55 - 1.66 (m, 4 H), 1.41 - 1.54 (m, 38 H), 1.19 - 1.37 (m, 20 H)。 (S)-8,13-雙(第三丁氧基羰基)-3,18,23-三側氧基-4,8,13,17,22-五氮雜三十六烷-1,21,36-三羧酸21,36-二第三丁酯1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (25)。將於CH2 Cl2 中之DCC (1.0 M, 2.0 mL, 2.0 mmol)添加至(S)-20,28,33-參(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,18,23,38-四側氧基-3-氧雜-19,24,28,33,37-五氮雜四十一烷-41-酸(24) (1.32 g, 1.32 mmol)、1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(0.23 g, 2.0 mmol)於CH2 Cl2 (20 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌16小時後，將其過濾，濃縮並在高真空下乾燥以提供 (S)-8,13-雙(第三丁氧基羰基)-3,18,23-三側氧基-4,8,13,17,22-五氮雜三十六烷-1,21,36-三羧酸21,36-二第三丁酯1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (25) (1.45 g, 1.32 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。 (S)-18,23,31-參(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,28,33-五側氧基-3,6-二氧雜-5,9,14,18,23,27,32-七氮雜四十七烷-47-酸第三丁酯(26)。在室溫下將NaHCO3 (0.233 g, 2.77 mmol)於水(4 mL)中之溶液添加至(S)-8,13-雙(第三丁氧基羰基)-3,18,23-三側氧基-4,8,13,17,22-五氮雜三十六烷-1,21,36-三羧酸21,36-二第三丁酯1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (25) (1.45 g, 1.32 mmol)及2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(0.561 g, 2.64 mmol)於DME (12 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌6小時後，在真空下移除所有揮發性組分(包括水)，且殘餘物係用THF共沸乾燥。該殘餘物係經歷急速層析術用MeOH/CH2 Cl2 溶離以提供呈黏性液體之(S)-18,23,31-參(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,28,33-五側氧基-3,6-二氧雜-5,9,14,18,23,27,32-七氮雜四十七烷-47-酸第三丁酯(26) (0.87 g, 0.75 mmol, 57%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 4.33 - 4.48 (m, 1 H), 3.80 - 3.94 (m, 4 H), 3.42 - 3.55 (m, 14 H), 3.08 - 3.32 (m, 7 H), 2.68 - 2.77 (m, 4 H), 2.50 - 2.63 (m, 4 H), 2.13 - 2.34 (m, 4 H), 1.54 - 1.74 (m, 6 H), 1.43 - 1.53 (m, 45 H), 1.22 - 1.35 (m, 20 H)。13 C-NMR光譜因旋轉異構體之存在而係非常複雜的。 (S)-1-(胺氧基)-25-羧基-4,7,22,27-四側氧基-3,8,12,17,21,26-六氮雜四十一烷-41-酸(27)。向(S)-18,23,31-參(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,28,33-五側氧基-3,6-二氧雜-5,9,14,18,23,27,32-七氮雜四十七烷-47-酸第三丁酯(26) (0.50 g, 0.43 mmol)及DTT (0.067 g, 0.43 mmol)於TFA (1.5 ml)中之混合物添加三乙基矽烷(0.10 ml, 0.63 mmol)及水(0.10 mL, 5.6 mmol)。在室溫下將所得混合物攪拌2小時，且然後使用N2 流整夜移除所有揮發性組分。殘餘物係藉由製備型LC/MS使用下列條件而經歷純化：管柱：Waters CSH C18，19 x 200 mm, 5-μm粒子；移動相A：5:95乙腈:具有0.1%三氟乙酸之水；移動相B：95:5乙腈:具有0.1%三氟乙酸之水；梯度：0至35% B歷時25分鐘，然後5分鐘保持於100% B；流量：20 mL/min。含有所需產物之溶離份係經組合及揮發性有機組分係使用氮流移除。在氮流下將含有所需產物之所得水溶液冷卻至-78℃並凍乾以提供呈白色固體之標題化合物(27) (72 mg, 21%產率)。其LC-CAD純度係使用分析UHPLC-CAD條件C測定為94.9%。[MH]+ 745.09。 分析條件A：滯留時間= 1.27分鐘；ESI-MS (MH)+ = 744.55。 分析條件B：滯留時間= 1.20分鐘；ESI-MS (MH)+ = 744.40。 化合物39之合成： 十八烷酸1-(第三丁酯) 18-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (29)。將EDC (1.406 g, 7.33 mmol)添加至18-(第三丁氧基)-18-側氧基十八烷酸(28) (藉由類似於用以製備實例4中之化合物1之方法製備) (2.09 g, 5.64 mmol)及1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(0.844 g, 7.33 mmol)於CH2 Cl2 (40 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜，用CH2 Cl2 (100 mL)稀釋及用NaHCO3 清洗。分離後，水層係用CH2 Cl2 (80 mL × 2)萃取。經組合之有機層係用鹽水清洗，於Na2 SO4 上乾燥，過濾，及在真空下乾燥。殘餘物係經歷急速層析術用CH2 Cl2 溶離以提供呈白色固體之十八烷酸1-第三丁酯18-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (29) (2.13 g, 4.55 mmol, 81%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 2.85 (br s, 4H), 2.62 (t, J=7.5 Hz, 2H), 2.22 (t, J=7.6 Hz, 2H), 1.77 (quin, J=7.5 Hz, 2H), 1.67 - 1.54 (m, 3H), 1.50 - 1.37 (m, 10H), 1.37 - 1.21 (m, 22H)。13 C-NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ ppm 173.33, 169.12,168.67, 79.85, 35.67, 30.98, 29.65 (br s), 29.62 (br s), 25.61, 29.55, 29.50, 29.36, 29.31, 29.12, 29.09, 28.81, 28.15, 25.15, 24.60。 (S)-18-((6-(((芐氧基)羰基)胺基)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-18-側氧基十八烷酸第三丁酯(30)。將NaHCO3 (0.41 g, 4.83 mmol)添加至18-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)十八烷酸1-第三丁酯(29) (1.13 g, 2.416 mmol)及Lys(Nɛ -CBZ)-Ot Bu鹽酸鹽(1.17 g, 3.14 mmol)於DME (60 mL)及水(20 mL)中之混合物。在室溫下將所得之淺色懸浮液攪拌整夜。在真空下移除DME，及然後添加HCl水溶液 (1 M, 4.83 mL, 4.83 mmol)以將pH調整至2至3。該混合物係用EtOAc (200 mL, 100 mL × 2)萃取。經組合之有機層係用鹽水清洗，於Na2 SO4 上乾燥，過濾，在真空下濃縮並經歷急速層析術用EtOAc/CH2 Cl2 溶離以提供呈無色黏稠液體之(S)-18-((6-(((芐氧基)羰基)胺基)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-18-側氧基十八烷酸第三丁酯(30) (1.66 g, 2.42 mmol, 100%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.29 - 7.38 (m, 5 H), 6.08 (br d, J=7.34 Hz, 1 H), 5.06 - 5.19 (m, 2 H), 4.84 - 5.02 (m, 1 H), 4.48 (td, J=7.70, 5.14 Hz, 1 H), 3.07 - 3.27 (m, 2 H), 2.15 - 2.24 (m, 4 H), 1.75 – 1.88 (m, 1H), 1.49 - 1.70 (m, 7 H), 1.46 (s, 9 H), 1.44 (s, 9 H), 1.20 - 1.34 (m, 26 H)。13 C-NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ ppm 173.30, 172.87, 171.81, 171.05, 156.49, 136.67, 128.47, 128.03, 82.03, 79.82, 66.55, 60.35, 52.24, 40.66, 36.65, 35.64, 32.35, 29.67, 29.64, 29.61, 29.50, 29.48, 29.44, 29.33, 29.29, 29.10, 28.13, 28.00, 25.63, 25.13, 22.25, 21.00, 14.19. [MH]+ 689.62。 (S)-18-((6-胺基-1-(第三丁氧基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-18-側氧基十八烷酸第三丁酯(31)。在室溫下將(S)-18-((6-(((芐氧基)羰基)胺基)-1-(第三丁氧基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-18-側氧基十八烷酸第三丁酯(30) (1.060 g, 1.2 mmol)及Pd-C (0.128 g, 1.200 mmol)於EtOH (50 mL)中之混合物氫化(氣球)整夜。在用氮真空吹掃幾個週期後，小心過濾該反應混合物，並用EtOH清洗。濾液係在真空下經濃縮及乾燥以提供呈無色液體之(31) (S)-18-((6-胺基-1-(第三丁氧基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-18-側氧基十八烷酸第三丁酯(0.67 g, 1.2 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 6.40 - 6.59 (m, 1 H), 4.30 - 4.50 (m, 1 H), 3.16 - 3.37 (m, 2 H), 2.65 - 2.81 (m, 2 H), 2.10 - 2.25 (m, 4 H), 1.72 - 1.84 (m, 1 H), 1.47 - 1.67 (m, 7 H), 1.43 (s, 9 H), 1.41 (s, 9 H), 1.22 - 1.36 (m, 26 H)。13 C-NMR (CDCl3 ) δ ppm 173.53, 173.48, 171.90, 82.10, 79.95, 52.47, 50.19, 40.80, 36.50, 35.62, 32.11, 30.66, 29.63, 29.60, 29.56, 29.48, 29.44, 29.33, 29.25, 29.05, 28.07, 27.94, 25.66, 25.09, 22.41。[MH]+ 555.63。 (S)-19-(第三丁氧基羰基)-1-(9H-茀-9-基)-3,13,21-三側氧基-2,7,10-三氧雜-4,14,20-三氮雜三十八烷-38-酸第三丁酯(32)。將NaHCO3 (0.202 g, 2.40 mmol)添加至1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十三烷-13-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(0.715 g, 1.44 mmol)、(S)-18-((6-胺基-1-(第三丁氧基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-18-側氧基十八烷酸第三丁酯(31) (0.67 g, 1.2 mmol)於DME (15 mL)及水(5)中之混合物。在室溫下攪拌整夜後，在真空下移除所有揮發性組分，且殘餘物係經歷急速層析術，用EtOAc/CH2 Cl2 溶離以提供呈無色黏稠液體之(S)-19-(第三丁氧基羰基)-1-(9H-茀-9-基)-3,13,21-三側氧基-2,7,10-三氧雜-4,14,20-三氮雜三十八烷-38-酸第三丁酯(32) (1.12 g, 1.20 mmol, 100%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.78 (d, J=7.58 Hz, 2 H), 7.63 (d, J=7.34 Hz, 2 H), 7.37 - 7.47 (m, 2 H), 7.30 - 7.36 (m, 2 H), 6.21 - 6.37 (m, 1 H), 6.00 - 6.17 (m, 1 H), 5.43 - 5.63 (m, 1 H), 4.40 - 4.54 (m, 3 H), 4.19 - 4.33 (m, 1 H), 3.75 (t, J=5.87 Hz, 2 H), 3.53 - 3.68 (m, 6 H), 3.42 (br d, J=4.89 Hz, 2 H), 3.22 (q, J=6.28 Hz, 2 H), 2.44 (br t, J=5.38 Hz, 2 H), 2.22 (t, J=7.58 Hz, 4 H), 1.75 - 1.89 (m, 1 H), 1.55 - 1.69 (m, 7 H), 1.47 (s, 9 H), 1.46 (s, 9 H), 1.20 - 1.35 (m, 26 H)。13 C-NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ ppm 173.34, 173.01, 171.82, 171.38, 156.56, 143.99, 141.34, 127.70, 127.05, 125.06, 119.98, 82.07, 79.87, 70.25, 70.12, 70.05, 67.29, 66.63, 52.27, 47.33, 40.86, 38.99, 37.03, 36.67, 35.67, 32.45, 29.70, 29.67, 29.64, 29.63, 29.53, 29.51, 29.38, 29.33, 29.13, 29.03, 28.15, 28.04, 25.68, 25.16, 22.47. [MH]+ 936.80。 (S)-1-胺基-15-(第三丁氧基羰基)-9,17-二側氧基-3,6-二氧雜-10,16-二氮雜三十四烷-34-酸第三丁酯(33)。將Et3 N (2.5 mL, 18 mmol)添加至(S)-19-(第三丁氧基羰基)-1-(9H-茀-9-基)-3,13,21-三側氧基-2,7,10-三氧雜-4,14,20-三氮雜三十八烷-38-酸第三丁酯(32) (1.12 g, 1.20 mmol)於DMF (10 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜後，添加更多之Et3 N (1.0 mL, 7.2 mmol)。在室溫下將該混合物再攪拌7小時。在真空下移除所有揮發性組分，且在高真空下乾燥殘餘物以提供呈無色液體之(S)-1-胺基-15-(第三丁氧基羰基)-9,17-二側氧基-3,6-二氧雜-10,16-二氮雜三十四烷-34-酸第三丁酯(33) (0.857 g, 1.20 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。[MH]+ 714.70。 (S)-39-(第三丁氧基羰基)-1-(9H-茀-9-基)-3,13,23,33,41-五側氧基-2,7,10,17,20,27,30-七氧雜-4,14,24,34,40-五氮雜五十八烷-58-酸第三丁酯(34)。將NaHCO3 (0.20 g, 2.4 mmol)添加至1-(9H-茀-9-基)-3-側氧基-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十三烷-13-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(0.715 g, 1.44 mmol)、(S)-1-胺基-15-(第三丁氧基羰基)-9,17-二側氧基-3,6-二氧雜-10,16-二氮雜三十四烷-34-酸第三丁酯(33) (0.857 g, 1.20 mmol)於DME (15 mL)及水(5 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜後，在真空下移除所有揮發性組分，並添加HCl水溶液 (1 M, 2.4 mL, 2.4 mmol)以將pH調整至2至3。所得混合物係用EtOAc (200 mL, 100 mL × 2)萃取。經組合之有機層係用鹽水清洗，於Na2 SO4 上乾燥，過濾及在真空下濃縮。殘餘物係經歷急速層析術(矽膠)，用MeOH/CH2 Cl2 溶離以提供呈無色黏稠液體之(S)-29-(第三丁氧基羰基)-1-(9H-茀-9-基)-3,13,23,31-四側氧基-2,7,10,17,20-五氧雜-4,14,24,30-四氮雜四十八烷-48-酸第三丁酯(34) (1.03 g, 0.940 mmol, 78%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.78 (d, J=7.58 Hz, 2 H), 7.63 (br d, J=7.34 Hz, 2 H), 7.39 - 7.46 (m, 2 H), 7.30 - 7.36 (m, 2 H), 6.74 (br s, 1 H), 6.27 - 6.39 (m, 1 H), 6.05 - 6.24 (m, 1 H), 5.60 - 5.78 (m, 1 H), 5.19 - 5.40 (m, 3 H), 4.38 - 4.55 (m, 3 H), 4.17 - 4.32 (m, 1 H), 3.74 - 3.79 (m, 2 H), 3.72 (t, J=5.99 Hz, 2 H), 3.61 - 3.67 (m, 4 H), 3.54 - 3.61 (m, 8 H), 3.48 - 3.54 (m, 6 H), 3.37 - 3.47 (m, 4 H), 3.17 - 3.29 (m, 2 H), 2.49 (br t, J=5.87 Hz, 2 H), 2.43 (t, J=5.87 Hz, 2 H), 2.18 - 2.26 (m, 4 H), 1.76 - 1.90 (m, 1 H), 1.51 - 1.73 (m, 7 H), 1.48 (s, 9 H), 1.46 (s, 9 H), 1.18 - 1.37 (m, 26 H)。13 C-NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ ppm 173.34, 173.04, 171.80, 171.43, 171.34, 156.62, 144.00, 141.35, 127.69, 127.05, 125.04, 119.97, 82.05, 79.87, 77.55, 70.22, 70.18, 70.16, 70.07, 69.92, 67.23, 66.51, 53.40, 52.29, 50.86, 47.34, 40.99, 39.18, 39.04, 37.04, 36.95, 36.67, 35.67, 32.42, 29.70 (br s), 29.68 (br s), 29.65 (br s), 29.63 (br s), 29.54, 29.51, 29.38, 29.34, 29.32, 29.12, 29.01, 28.15, 28.0, 25.68, 25.16, 22.51. [MH]+ 1254.90。 (S)-1-胺基-25-(第三丁氧基羰基)-9,19,27-三側氧基-3,6,13,16-四氧雜-10,20,26-三氮雜四十四烷-44-酸第三丁酯(35)。將Et3 N (1.2 mL, 8.61 mmol)添加至(S)-29-(第三丁氧基羰基)-1-(9H-茀-9-基)-3,13,23,31-四側氧基-2,7,10,17,20-五氧雜-4,14,24,30-四氮雜四十八烷-48-酸第三丁酯(34) (330 mg, 0.301 mmol)於DMF (3 mL)中之混合物。在室溫下將該混合物攪拌20小時後，在高真空下移除所有揮發性組分。殘餘物係經歷急速層析術，用2 M NH3 -MeOH/CH2 Cl2 (1:9)溶離，以提供呈無色液體之(S)-1-胺基-25-(第三丁氧基羰基)-9,19,27-三側氧基-3,6,13,16-四氧雜-10,20,26-三氮雜四十四烷-44-酸第三丁酯(35) (164 mg, 0.188 mmol, 62.3%產率)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 6.78 - 6.92 (m, 1 H), 6.48 - 6.62 (m, 1 H), 6.15 - 6.35 (m, 1 H), 4.35 - 4.53 (m, 1 H), 3.75 (q, J=6.11 Hz, 4 H), 3.59 - 3.68 (m, 8 H), 3.54 - 3.59 (m, 2 H), 3.49 - 3.54 (m, 2 H), 3.40 - 3.48 (m, 3 H), 3.16 - 3.29 (m, 2 H), 2.80 - 2.92 (m, 2 H), 2.38 - 2.57 (m, 4 H), 2.12 - 2.32 (m, 4 H), 1.75 - 1.87 (m, 1 H), 1.49 - 1.75 (m, 8 H), 1.47 (s, 9 H), 1.45 (s, 9 H), 1.20 - 1.38 (m, 26 H)。13 C-NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ ppm 173.32, 173.04, 171.80, 171.47, 171.37, 81.99, 79.85, 74.86, 73.34, 70.30, 70.23, 70.12, 70.08, 69.88, 67.30, 52.31, 50.60, 41.74, 39.18, 39.00, 37.05, 37.00, 36.64, 35.65, 32.35, 29.67, 29.66, 29.61, 29.52, 29.48, 29.33, 29.31, 29.31, 29.11, 29.04, 28.13, 28.03, 25.68, 25.13, 22.51。[MH]+ 873.75。 (S)-23-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,21,29,39,49-五側氧基-3,32,35,42,45-五氧雜-22,28,38,48-四氮雜五十二烷-52-酸(36)。在室溫下將吡啶(5.0 mL)添加至(S)-1-胺基-25-(第三丁氧基羰基)-9,19,27-三側氧基-3,6,13,16-四氧雜-10,20,26-三氮雜四十四烷-44-酸第三丁酯(35) (164 mg, 0.188 mmol)及二氫呋喃-2,5-二酮(94 mg, 0.939 mmol)之混合物。在室溫下將該混合物攪拌整夜後，在高真空下移除所有揮發性組分。殘餘物係藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq. TFA溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。組合含有所需產物之溶離份並使用氮流移除揮發性有機組分。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供呈無色液體之標題化合物(S)-23-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,21,29,39,49-五側氧基-3,32,35,42,45-五氧雜-22,28,38,48-四氮雜五十二烷-52-酸(36) (123 mg, 0.126 mmol, 67.3%產率)。[MH]+ 973.81。 (S)-3,13,23,31-四側氧基-7,10,17,20-四氧雜-4,14,24,30-四氮雜四十七烷-1,29,47-三羧酸29,47-二第三丁酯1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (37)。向(S)-23-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,21,29,39,49-五側氧基-3,32,35,42,45-五氧雜-22,28,38,48-四氮雜五十二烷-52-酸(36) (123 mg, 0.126 mmol)、1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(21.8 mg, 0.190 mmol)及EDC (31.5 mg, 0.164 mmol)之混合物添加CH2 Cl2 (5 mL)。在室溫下將所得澄清溶液攪拌整夜後，LC/ELSD-MS顯示約70%轉化。添加更多之1-羥基吡咯啶-2,5-二酮(21.8 mg, 0.190 mmol)及EDC (31.5 mg, 0.164 mmol)，且在室溫下將該混合物攪拌3.5小時。LC/ELSD-MS顯示完全轉化。該混合物係用CH2 Cl2 (150 mL)稀釋及用水/鹽水(2:1)清洗，於Na2 SO4 上乾燥，過濾，在高真空下濃縮以提供呈無色液體之(S)-3,13,23,31-四側氧基-7,10,17,20-四氧雜-4,14,24,30-四氮雜四十七烷-1,29,47-三羧酸29,47-二第三丁酯1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (37) (135 mg, 0.126 mmol, 100%產率)，其係直接用於下一步驟中。[MH]+ 1070.93。 (S)-39-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,23,33,41-六側氧基-3,6,17,20,27,30-六氧雜-5,9,14,24,34,40-六氮雜五十八烷-58-酸第三丁酯(38)。將NaHCO3 (21.2 mg, 0.252 mmol)添加至(S)-3,13,23,31-四側氧基-7,10,17,20-四氧雜-4,14,24,30-四氮雜四十七烷-1,29,47-三羧酸29,47-二第三丁酯1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯) (37) (135 mg, 0.126 mmol)及2-胺基乙氧基胺基甲酸第三丁酯鹽酸鹽(53.6 mg, 0.252 mmol)於DME (4.5 mL)及水(1.5 mL)中之混合物。在室溫下將所得澄清溶液攪拌整夜。在真空下移除所有揮發性組分，且殘餘物係藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq.TFA溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。組合含有所需產物之溶離份並使用氮流移除揮發性有機組分。含有所需產物之所得水溶液係經凍乾以提供標題化合物(S)-39-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,23,33,41-六側氧基-3,6,17,20,27,30-六氧雜-5,9,14,24,34,40-六氮雜五十八烷-58-酸第三丁酯(38) (118 mg, 0.104 mmol, 83.0%產率)。[MH]+ 1131.99。 (S)-1-(胺氧基)-33-羧基-4,7,17,27,35-五側氧基-11,14,21,24-四氧雜-3,8,18,28,34-五氮雜五十二烷-52-酸(39)。在0℃下將TFA (2 mL)添加至(S)-39-(第三丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10,13,23,33,41-六側氧基-3,6,17,20,27,30-六氧雜-5,9,14,24,34,40-六氮雜五十八烷-58-酸第三丁酯(38) (118 mg, 0.104 mmol)及1,4-二甲氧基苯(144 mg, 1.043 mmol)於CH2 Cl2 (2 mL)中之混合物。在0℃下將該混合物攪拌5分鐘，及然後在室溫下攪拌2小時。該混合物係經濃縮，並在高真空下乾燥30分鐘。殘餘物係藉由中壓反相層析術於C-18管柱上，用MeCN/aq. TFA溶離來純化(藉由ELSD-MS監測)。組合含有所需產物之溶離份並使用氮流移除揮發性有機組分。在氮流下將含有所需產物之所得水溶液冷卻至-78℃並凍乾以提供呈白色固體之(S)-1-(胺氧基)-33-羧基-4,7,17,27,35-五側氧基-11,14,21,24-四氧雜-3,8,18,28,34-五氮雜五十二烷-52-酸(39) (60.0 mg, 0.064 mmol, 61.3%產率)。其LC-CAD純度係使用分析UHPLC-CAD條件D測定為98.0%。[MH]+ 919.88, [M+2H]+ /2 460.69。 實例7：細胞內cAMP聚集分析 H2鬆弛素之效應係經由其同源G蛋白偶合受體(鬆弛素家族肽受體(RXFP1))介導，導致細胞傳訊路徑之組合之刺激，該等細胞傳訊路徑係細胞類型依賴性且可包括腺苷酸環化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂醯肌醇3-激酶及細胞外傳訊調節激酶(Erk1/2)。Bathgate等人，2006. Pharmacol. Rev. 58, 7-31。本文描述之細胞內cAMP聚集分析係用以評估鬆弛素生物活性及效力。測試化合物係基於WT-RLX(圖1)、AQ1 (圖2)及BM25/AN1 (圖3)。如顯示之PK延長劑係經由如實例3中描述之肟鍵聯結合至AQ1及BM25/AN1中含有之對乙醯基苯丙胺酸。 將穩定表現人類RXFP1受體(基因座編號LOC59350)之CHO-K1細胞(ATCC；Cat. # CRL-9618) (10,000/孔)接種至96孔盤內及在37℃及5% CO2 下培養整夜。第二天，自該等孔移除培養基及以添加於50 μL緩衝劑(1 X HBSS, 5 mM HEPES (7.2), 0.5 mM IBMX, 0.1% BSA)中之配體(鬆弛素多肽)刺激該等細胞；在37℃下培養10分鐘。未經刺激之細胞係用作參考對照。終止反應及使用均相時間分辨螢光(HTRF)動態2 cAMP套組(CisBio, #62AM4PEC)根據製造商之方案量測細胞cAMP濃度。盤係使用EnVision 2104多標記讀數器(PerkinElmer)進行分析。信號係以在665 nm下之螢光強度/在620nm下之螢光強度之比率 x 10,000表示。樣本中cAMP濃度係藉由與自已知濃度之cAMP產生之標準曲線比較進行測定。各鬆弛素之效力係使用一式兩份進行之十點濃度反應曲線測定。資料係使用Microsoft Excel, Version 2013 Xlfit軟體進行分析。有效濃度50 (EC50)值(其中反應為最大一半之點)係使用容許可變斜率之四參數邏輯方程計算(表3)。 表3：細胞內cAMP聚集分析結果。此表中使用之縮寫：dK：D-離胺酸；Sar：肌胺酸(N-甲基甘胺酸)；dGlu：D-麩胺酸；20kDa PEG：聚(乙二醇)，20 kDa分子量；PEGn (例如，n係2、12、24或36)：-(O-CH2 -CH2 )n -O-；-C13-：-(C=O)-(CH2 )12 -；-C14-：-(C=O)-(CH2 )13 -；-C15-：-(C=O)-(CH2 )14 - (此等縮寫係說明但不限於式I之-Cn-或此等術語在此表外之使用)。在表3之Glug -C13-、Glug -C14-、Glug -C15-及Glug -C17-中，脂肪酸之第一羰基碳係經由醯胺鍵結合至(γ) Glu殘基。 a 鬆弛素結合物AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH包含SEQ ID NO: 35之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其中位於該鬆弛素A鏈多肽之N端之經修飾之對乙醯基-L-苯丙胺酸係連接至包含GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH之PK增強劑，如式III中繪示(式III)。 實例8：活體內藥物動力學(PK)研究 雄性Sprague-Dawley大鼠(n=3)接受調配於合適之緩衝劑(例如，20 mM組胺酸，750 mM NaCl，pH 6.0)中之單一靜脈內(IV)或皮下(SC)劑量(1 mg/kg)之鬆弛素構築體(如上文實例7中描述)。在不同時間點經由頸靜脈採集血液樣本，長達72小時。使血液樣本在室溫下凝結(30至60分鐘)及然後在4℃下離心(1500至2000)以獲得血清。離心後，將血清樣本轉移至96孔盤及儲存在-80℃下，直至生物分析。鬆弛素濃度係藉由ELISA自血清量測。 使用來自個別動物之鬆弛素濃度-時間曲線進行分析。藥物動力學參數係藉由非隔室方法使用Phoenix WinNonlin (第6.4版)或Kinetica (第5版)進行計算。報告平均藥物動力學參數Cmax 、AUCinf 、C24 及半衰期(表4)。 表4：活體內PK資料(如表3中之縮寫)。 a 調節自0.2 mpkb 調節自0.3 mpkc 調節自0.5 mpk 實例9：大鼠腎血流量研究 將雄性Sprague Dawley大鼠(~250至300 g)用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，用PE-205管插入氣管以保持氣道通暢，及用經加熱之手術盤將溫度維持在37℃下。將1.4F壓力導管(Millar Inc., Houston, TX)推進右頸動脈內以量測主動脈血壓。用PE-50管插入右頸靜脈以投與測試物品。藉由腹膜後腔切口曝露左腎，且將多普勒流量探針(型號0.5 VB，Transonic System Inc., Ithaca, NY)連接至左腎動脈以監測血流。在此等外科手術程序完成後，補充戊巴比妥鈉(15 mg/kg，腹膜內)。在10至15分鐘平衡後，該鬆弛素係以1 mg/kg以0.15至1.82 mL/kg之給藥體積歷時30秒經由輸注泵(Harvard Apparatus, Holliston, MA)靜脈內投與。血壓、心率及腎血流量係在鬆弛素投與後使用連接至運行LabChart 7-Pro資料獲取軟體(ADInstruments, Dunedin, New Zealand)之桌上型電腦之Millar MPVS超信號調節單元連續記錄45分鐘(表5)。 表5：大鼠腎血流量變化(如表3中之縮寫)。 a 動物在化合物投與後不久死亡。屍檢顯示腎呈蒼白色，其指示血流之完全損失。b 可見該化合物難溶。 上文列表之結果闡明結合物結構與位置及所得之腎血流量之間的複雜關係。WT-RLX單獨引起腎血流量超過基線約25%增加，其係在給定之鬆弛素之已知血管活性下預期。預期作為鬆弛素促效劑之各種測試化合物(參見實例7)應同樣引起腎血流量之增加。出人意料地，然而，可見該等化合物中之一些引起腎血流量之減少。腎血流量之此損害可係臨床上顯著的禁忌症，尤其在其中通常可見腎損傷之心臟衰竭中。該等化合物BM25/AN1、BM25/AN1-C13-CH3、BM25/AN1-PEG36-C13-CH3、BM25/AN1-PEG36-Glu-C13-CH3、AQ1及AQ1-Glu-C13-CH3全部導致受損腎血流量(上表5)。 此等結果係出人意料且不可預測的。結構相關化合物顯示對腎血流量之不同效應。LEVEMIR® (一種經FDA批准之用於治療糖尿病之胰島素之市售長效形式)係已證實安全性之胰島素-C13-CH3結合物(Novo Nordisk A/S之NDA 21-878，第1頁)。相反，投與結構類似於LEVEMIR® 之BM25/AN1-C13-CH3在大鼠中係致命的，且屍檢顯示蒼白之腎，其指示腎血流量係經阻斷。另外，於A鏈之位置1處含有對乙醯基苯丙胺酸之單一胺基酸取代之AQ1鬆弛素減少腎血流量，而含有相同非天然胺基酸取代但結合至20kDa PEG之AQ1-20kDa PEG化合物增加腎血流量。此外，BM25/AN1-PEG36-Glu-C13-CH3減少腎血流量，但AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3增加腎血流量。引起經減少之腎血流量之上文提及之化合物中之數種含有以甲基結尾之PK增強劑，例如，BM25/AN1-C13-CH3、BM25/AN1-PEG36-C13-CH3及AQ1-Glu-C13-CH3。然而，經AQ1-EEEGGG-Glug -C15-CH3及AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3治療之動物顯示良好之腎血流量，其指示該甲基並非始終引起較差之腎血流量。相反，AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH及結合至包含肽組分及-C13-COOH、-C14-COOH或-C15-COOH脂肪酸之PK增強劑之其他經測試AQ1鬆弛素分子通常顯示經改善之腎血流量(上表5)。 實例10：大鼠毒性研究 AQ1-20kDa-PEG係藉由皮下投與以1、5及15 mg/kg/天之劑量向大鼠給藥10天。在最終劑量後，將動物安樂死，解剖及進行腎組織病理學。在所有劑量下，於腎小管上皮細胞中觀測到液泡(圖7C)。相反，在經皮下給藥媒劑(150 mM Arg於10 mM檸檬酸鹽緩衝液中，pH 5.5) 10天之大鼠之腎小管上皮細胞中未觀測到液泡(圖7A)。 AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH係藉由皮下投與以10及40 mg/kg/天之劑量向大鼠給藥7天。在最終劑量後，將動物安樂死，解剖，及進行腎組織病理學。在所有劑量下，於腎小管上皮細胞中觀測到液泡(圖7B)。 AQ1-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH係藉由皮下投與以5、20及40 mg/kg/天之劑量向大鼠給藥7天。在最終劑量後，將動物安樂死，解剖，及進行腎組織病理學。在所有劑量下，腎小管上皮細胞顯示正常且無與測試物品相關之液泡之證據(圖7D)。 化合物AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH亦顯示良好之腎血流量結果(實例9)、有利之溶解度曲線(資料未顯示)及顯著低於AQ1-20kDa PEG之黏度。 實例11：鬆弛素對人類原發性心臟成纖維細胞之影響 原發性人類心臟成纖維細胞(NHCF-V)係購買自Lonza, Fairlawn, NJ (Cat.#: CC-2904)。NHCF-V細胞係分離自正常成人心臟組織之心室。細胞對平滑肌α-肌動蛋白染色呈陽性及表現≥90%膠原I及≤ 10%馮維勒布蘭德因子(Von Willibrand factor)VIII。第3至第6代細胞係用於即時定量逆轉綠-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)研究。細胞係培養於含有10% FBS完全培養基之FGM™-3 BulletKit™ (Cat. #: CC-4526, Lonza)中。在匯合時，細胞係經分裂及以150,000/孔之密度於6孔盤中在完全培養基中培養24小時。接著歷時24小時將細胞換為無血清培養基(Cat. #: CC-3131, Fibroblast Basal Medium, Lonza)，然後用人類H2鬆弛素(Cat. #: 3596-RN, R&D Systems)或AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH在0.5 ng/mL之TGF-β (Cat. #: 240-B, R&D Systems)之存在下再處理24小時。針用於圖譜分析之TGF-b濃度之選擇及持續時間係基於先前報導。收穫6孔盤中之細胞用於總RNA提取及qRT-PCR分析。 總RNA係使用Rneasy迷你套組(Cat. #: 74106, Qiagen)根據製造商之方案(包括基因體cDNA之柱上移除)提取。即時qRT-PCR係以兩步驟方法進行；cDNA合成及即時偵測係分別於PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research)及ABI Prism 7700序列偵測系統(Applied Biosystems)中進行。TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)係根據製造商之方案用於後續PCR反應中。所有qRT-PCR反應係一式兩份進行。用於平滑肌α-肌動蛋白之序列特異性引物(正義：5’-AAATACTCTGTCTGGATCGGTGGCTCC-3’ (SEQ ID NO: 51)；反義：5’-CACATAGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGCTA-3’ (SEQ ID NO: 52))及管家基因L30 (正義：5’-GCTGGAGTCGATCAACTCTAGG-3' (SEQ ID NO: 53)；反義：5’-CCAATTTCGCTTTGCCTTGTC-3’ (SEQ ID NO: 54))係使用引物表現第2版軟體(Applied Biosystems)基於已公開之序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)進行設計。平滑肌α肌動蛋白之表現程度係標準化至管家基因L30之表現程度。經AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH處理之人類心臟成纖維細胞係使用學生T檢驗(Microsoft Excel，2013版)分析與經媒劑處理之細胞之顯著性差異，且≤ 0.05之P值視為顯著。 AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH經證實減少促纖維化基因、平滑肌α-肌動蛋白於經TGF-β處理(0.5 ng/mL；24小時)之原發性人類心臟成纖維細胞中之表現。如圖6A至6B中顯示，基因表現之減少係濃度依賴性的且對人類H2鬆弛素及AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH兩者同樣穩健。AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH可用作抗纖維化劑以治療纖維化疾病(例如，心肌纖維化)。 實例12：PK增強劑之額外實例 如下表6中顯示之PK增強劑係通常根據上文實例4、5及6中描述之方法產生。此等PK增強劑係使用實例3中描述之方法結合至包含非天然編碼之胺基酸(例如，於A鏈位置1處，諸如RLX-AQ1)之經修飾之鬆弛素多肽且加以表徵，包括如實例7至11中描述測試生物活性、藥物動力學性質、對腎血流量之影響、液泡形成及對心臟成纖維細胞之影響。 表6：例示性PK增強劑(如表3中之縮寫，且如下文指示)。 X = Gluγ 、(D)-Gluγ 、Aspα 、Aspβ 、(D)-Aspα 或(D)-Aspβ Z = (D)-Gluγ 、Aspα 、Aspβ 、(D)-Aspα 或(D)-Aspβ FA =脂肪酸=例如，C13-COOH、C14-COOH或C15-COOH；除非本文另有指示。 如下表7中顯示之PK增強劑係通常根據本文之實例3至5中描述之方法合成。此等PK增強劑係使用實例3中描述之方法結合至包含非天然編碼之胺基酸(例如，於A鏈位置1處，諸如在RLX-AQ1中)之經修飾之鬆弛素多肽且加以表徵，包括如實例7至11中描述測試生物活性、藥物動力學性質、對腎血流量之影響、液泡形成及對心臟成纖維細胞之影響。 表7：例示性PK增強劑(縮寫：N-MeK：6-N-甲基離胺酸；Dap：2,3-二胺基丙酸；其他如表3中)。 應瞭解本文描述之實例及實施例係僅用於說明目的且一般技術者可依此進行各種修飾或變化且該等修飾或變化應包括於本申請案之精神及範圍及隨附申請專利範圍之範圍內。亦應瞭解本文使用之術語係僅出於描述例示性實施例之目的，且無意限制本發明之範圍，本發明之範圍僅受限於隨附申請專利範圍。所有公開案、專利案、專利申請案及/或本申請案中引用之其他文獻係出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同已個別地指示各個公開案、專利案、專利申請案及/或其他文獻出於所有目的以引用之方式併入一般。
圖1：無非天然編碼之胺基酸之人類鬆弛素2多肽之序列。A鏈(SEQ ID NO: 4)及B鏈(SEQ ID NO: 6)多肽係由如圖5中繪示之二硫鍵連接。該B鏈中之位置1相對於人類鬆弛素2多肽B鏈(SEQ ID NO: 5)係經修飾(下劃線位置，天冬胺酸如圖所示經丙胺酸取代)，此已可見改善製造而無顯著不利影響效力。在本文之工作實例中，此多肽被稱為「野生型」或WT-RLX。 圖2：RLX-AQ1 (「AQ1」)(具有非天然編碼之胺基酸(對乙醯基苯丙胺酸(pAcF，下劃線)取代A鏈位置1)之人類鬆弛素2多肽)序列。A鏈(SEQ ID NO: 35)及B鏈(SEQ ID NO: 6)係由二硫鍵於圖5中繪示之位置處連接。 圖3：RLX-BM25/AN1 (「BM25/AN1」)(具有非天然編碼之胺基酸(對乙醯基苯丙胺酸(pAcF，下劃線)取代B鏈位置25)且另一A鏈位置1含有天冬醯胺酸取代麩醯胺酸(下劃線)之人類鬆弛素2多肽)之序列。A鏈(SEQ ID NO: 36)及B鏈(SEQ ID NO: 37)係由二硫鍵於圖5中繪示之位置處連接。 圖4：用於表現RLX-AQ1之前鬆弛素原多肽之示意圖。前鬆弛素原多肽(SEQ ID NO: 38)係表現於大腸桿菌或另一表現系統中。非天然編碼之胺基酸(諸如pAcF)可經核糖體併入前鬆弛素原多肽序列內，促進後續連接至藥物動力學增強劑(「PK延長劑」)。對大腸桿菌表現特異之前導序列係由灰色圓圈指示。衍生自具有經添加之肽裂解位點及Lys至Gly取代之前胰島素之C-肽(連接肽)係由黑色圓圈指示。前導序列及C-肽係由酶裂解移除(裂解位點由未經標記之箭頭指示)。於B鏈殘基1 (「B1」)處之丙胺酸取代(存在於SEQ ID NO: 6中)有助於移除前導序列。用於位點特異性PK增強劑連接之pAcF殘基係經指示。A及B鏈與名為RLN2之HUGO對齊且係衍生自鬆弛素2轉錄變體1 cDNA (參考序列NM_134441)。 圖5：包含A鏈(SEQ ID NO: 36)及B鏈(SEQ ID NO: 6)之成熟RLX-AQ1之結構繪示，該成熟RLX-AQ1係通過於A鏈位置1處之非天然編碼之胺基酸連接至藥物動力學增強劑(「PK延長劑」)。 圖6A至6B：WT-RLX(圖6A)及AQ1-GGGGS-Glug (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH (圖6B)對經TGF-β治療之人類心臟成纖維細胞之平滑肌α-肌動蛋白基因表現之變化之影響，使用qRT-PCR以量測mRNA濃度。條形圖上之數字指示僅將媒劑設定為基線時相對於TGF-β之百分比減少。平均值± SEM；*P ＜ 0.05。Veh =媒劑。nM =奈莫耳。 圖7A至7D：雌性Sprague Dawley大鼠中之PEG相關腎皮質小管上皮細胞液泡形成。腎來自用媒劑或鬆弛素類似物每日一次皮下(SQ)治療之大鼠。含有PEG之鬆弛素類似物(圖7B及7C)顯示以大聚結液泡之存在為特徵之顯著皮質管狀液泡形成。在經媒劑(圖7A)或非聚乙二醇化鬆弛素(圖7D)治療之動物中觀測不到液泡。圖7A：媒劑(150 mM Arg於10 mM檸檬酸鹽緩衝液pH 5.5中) SQ，10天。圖7B：AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH (1.5 kD PEG) SQ，40 mg/kg/天，7天。圖7C：AQ1-20-kDa-PEG (20 kD PEG) SQ，15 mg/kg/天，10天。圖7D：AQ1-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH SQ，40 mg/kg，7天。放大40×, H&E。 圖8：式III中繪示之AQ1-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH之結構。 圖9：式III中繪示之AQ1-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH之結構。

Claims (75)

  1. 一種經修飾之鬆弛素多肽，其包含非天然編碼之胺基酸，其中： (a)該經修飾之鬆弛素多肽包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於選自由以下組成之群之位置處經非天然編碼之胺基酸取代：A鏈殘基1、A鏈殘基2、A鏈殘基5、A鏈殘基13、A鏈殘基18、B鏈殘基5、B鏈殘基7及B鏈殘基25，且在該鬆弛素A鏈及/或該鬆弛素B鏈中視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入及/或刪除； (b)該非天然編碼之胺基酸具有以下之結構：， 其中R基係除以下中發現之側鏈外之任何取代基：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸；及 (c)該非天然編碼之胺基酸係連接至藥物動力學增強劑，該藥物動力學增強劑包含在2與30個胺基酸之間的肽組分及半衰期延長部分。
  2. 如請求項1之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽包含於殘基1處經該非天然編碼之胺基酸取代且視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入及/或刪除之SEQ ID NO: 4。
  3. 如請求項1之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽包含於殘基1處經該非天然編碼之胺基酸取代且視需要具有一個額外之胺基酸取代、插入或刪除之SEQ ID NO: 4。
  4. 如請求項3之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素B鏈多肽包含視需要具有一個額外之胺基酸取代、插入或刪除之SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。
  5. 如請求項1之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽包含於殘基1處經該非天然編碼之胺基酸取代之SEQ ID NO: 4及該鬆弛素B鏈多肽包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。
  6. 如請求項1至5中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、半卡肼基、疊氮基或炔基。
  7. 如請求項1至5中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸包含苯丙胺酸衍生物。
  8. 如請求項1至5中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸係選自對位取代、鄰位取代或間位取代之苯丙胺酸。
  9. 如請求項1至5中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸係選自對位取代、鄰位取代或間位取代之苯丙胺酸，其包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、半卡肼基、疊氮基或炔基。
  10. 如請求項1至5中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸包含對乙醯基-L-苯丙胺酸。
  11. 如請求項1至10中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸係連接至該肽組分。
  12. 如請求項1至11中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸係通過肟鍵聯或三唑鍵聯連接至該藥物動力學增強劑。
  13. 如請求項1至11中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該非天然編碼之胺基酸係通過肟鍵聯連接至該藥物動力學增強劑。
  14. 如請求項1之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽包含SEQ ID NO: 35，及該鬆弛素B鏈多肽包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6，且其中該鬆弛素A鏈或B鏈視需要具有多達兩個額外之胺基酸取代、插入或刪除。
  15. 如請求項13之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽包含與SEQ ID NO: 35具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素A鏈多肽及與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素B鏈多肽。
  16. 如請求項15之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽與SEQ ID NO: 35具有至少95%胺基酸序列一致性。
  17. 如請求項15之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素B鏈多肽與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%胺基酸序列一致性。
  18. 如請求項15之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽包含SEQ ID NO: 35及該鬆弛素B鏈多肽包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。
  19. 如請求項1至18中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含2至25個胺基酸。
  20. 如請求項19之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含2至20個胺基酸。
  21. 如請求項19之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含3至10個胺基酸。
  22. 如請求項19之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含4至8個胺基酸。
  23. 如請求項1至18中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含Glu、Gluγ 、GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)、DRDDRD (SEQ ID NO: 102)、KKKKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ (SEQ ID NO: 104)、GGGEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 105)、EEEGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 106)、KKKGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 107)、GETGSSGEGT-Gluγ (SEQ ID NO: 108)、GGGKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 109)、GSHHHHHGS-Gluγ (SEQ ID NO: 110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar-Sar-Gluγ (SEQ ID NO: 111)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ (SEQ ID NO: 112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ (SEQ ID NO: 113)、KKKSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 118)、KKSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 114)、KKSGGSGG-Glua (SEQ ID NO: 115)、KKSAGSAG-Gluγ (SEQ ID NO: 116)、KSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 117)、KKSGGSGGEE-Gluγ (SEQ ID NO: 119)、dKdKdKdKdKdK-Gluγ (SEQ ID NO: 120)、EESGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 121)、GSGSGSGS-Gluγ (SEQ ID NO: 123)、EEEGGG-dGluγ (SEQ ID NO: 128)、EGGGGSK-Gluγ (SEQ ID NO: 130)、EEEEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 131)、EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 133)、EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG (SEQ ID NO: 135)、EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 136)、KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Gluγ (SEQ ID NO: 137)、EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA-Gluγ (SEQ ID NO: 138)、KK-Gluγ (SEQ ID NO: 140)、Gluγ 、KGPKGP-Gluγ (SEQ ID NO: 146)、SGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 147)、KGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 148)、KGGGSE-Gluγ (SEQ ID NO: 149)、GSPGSP-Gluγ (SEQ ID NO: 150)、GGGGP-Gluγ (SEQ ID NO: 151)、EGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 152)、EGGGP-Gluγ (SEQ ID NO: 153)、KGPGSE-Gluγ (SEQ ID NO: 154)、精胺-Gluγ 或KKGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 156)。
  24. 如請求項1至18中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)、DRDDRD (SEQ ID NO: 102)、KKKKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 103)、RGGEEKKKEKEK-Gluγ (SEQ ID NO: 104)、GGGEEE-Gluγ (SEQ ID NO: 105)、EEEGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 106)、KKKGGG-Gluγ (SEQ ID NO: 107)、GGGKKK-Gluγ (SEQ ID NO: 109)、GSHHHHHGS-Gluγ (SEQ ID NO: 110)、Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Gluγ (SEQ ID NO: 112)、Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Gluγ (SEQ ID NO: 113)或KSGGSGG-Gluγ (SEQ ID NO: 117)。
  25. 如請求項1至18中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含Gluγ 。
  26. 如請求項1至18中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該肽組分包含GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)。
  27. 如請求項1至18中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素多肽包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於A鏈殘基1處經非天然編碼之胺基酸取代，其中該非天然編碼之胺基酸係連接至該藥物動力學增強劑且該藥物動力學增強劑包含肽組分GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)。
  28. 如請求項1至27中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該半衰期延長部分包含脂肪酸或其衍生物，其中該脂肪酸或其衍生物係共價連接至該肽組分。
  29. 如請求項1至27中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該半衰期延長部分包含飽和脂肪酸或其衍生物。
  30. 如請求項1至29中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該半衰期延長部分包含以羧酸終止之脂肪酸。
  31. 如請求項1至30中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該半衰期延長部分包含式I脂肪酸： -Cn-COOH (式I) 其中n係在10與18之間。
  32. 如請求項31之經修飾之鬆弛素多肽，其中n係在12與17之間。
  33. 如請求項31之經修飾之鬆弛素多肽，其中n係13、14或15。
  34. 如請求項1至33中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該半衰期延長部分包含-C14-COOH。
  35. 如請求項1至34中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該藥物動力學增強劑包含：(式II) 其中該胺氧基係連接至該經修飾之鬆弛素多肽中之該非天然胺基酸。
  36. 如請求項1至35中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該半衰期延長部分係通過醯胺鍵結合至該肽組分。
  37. 如請求項1之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素多肽包含SEQ ID NO: 4之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其於A鏈殘基1處經非天然編碼之胺基酸取代； 其中該非天然編碼之胺基酸包含連接至該藥物動力學增強劑之對乙醯基-L-苯丙胺酸，該藥物動力學增強劑包含： 包含GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)之肽組分；及 包含-C14-COOH之半衰期延長部分。
  38. 一種經修飾之鬆弛素多肽，其包含：(式III)， 其中該AQ1-鬆弛素包含與SEQ ID NO: 35具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素A鏈多肽及與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%胺基酸序列一致性之鬆弛素B鏈多肽，其中式III中繪示之該經修飾之對乙醯基苯丙胺酸係位於該鬆弛素A鏈多肽之N端。
  39. 如請求項38之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素A鏈多肽與SEQ ID NO: 35具有至少95%胺基酸序列一致性。
  40. 如請求項38之經修飾之鬆弛素多肽，其中該鬆弛素B鏈多肽與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%胺基酸序列一致性。
  41. 如請求項38之經修飾之鬆弛素多肽，其中AQ1-鬆弛素包含SEQ ID NO: 35之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽。
  42. 一種經修飾之鬆弛素多肽，其包含AQ1-GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH，其包含圖8中顯示之結構，其包含圖9中顯示之結構，或其包含SEQ ID NO: 35之鬆弛素A鏈多肽及SEQ ID NO: 6之鬆弛素B鏈多肽，其中位於該鬆弛素A鏈多肽之N端之該經修飾之對乙醯基苯丙胺酸係連接至PK增強劑GGGGS-Gluγ (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH，如式III中繪示：(式III)。
  43. 如請求項1至42中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽係生物活性的。
  44. 如請求項1至43中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽針對一或多種與鬆弛素相關聯之疾病或病症之治療係治療有效的。
  45. 如請求項1至44中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽導致相較於AQ1-20kDa PEG更少之腎液泡形成。
  46. 如請求項1至45中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽導致相較於AQ1-20kDa PEG無腎功能損傷或經減小之腎功能損傷。
  47. 如請求項46之經修飾之鬆弛素多肽，其中該腎功能係藉由測定經評估之腎小球濾過率、肌酸清除率、胰島素腎小球濾過率或同位素腎小球濾過率中之一或多者進行量測。
  48. 如請求項1至47中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽在投與後不減小腎血流量。
  49. 如請求項1至48中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽可在投與後增加腎血流量。
  50. 如請求項48或49之方法，其中該腎血流量係藉由測定對胺基馬尿酸鹽清除率進行量測。
  51. 如請求項1至50中任一項之經修飾之鬆弛素多肽，其中該經修飾之鬆弛素多肽顯示經增加之活體內半衰期。
  52. 如請求項51之經修飾之鬆弛素多肽，其中該活體內半衰期係增加至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍或至少50倍。
  53. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑。
  54. 一種醫藥組合物，其包含用於治療與鬆弛素相關聯之失調症之有效量之如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽及醫藥上可接受之載劑。
  55. 一種如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽或如請求項53至54中任一項之組合物在製造用於治療有此需要之病患之與鬆弛素相關聯之疾病之藥劑中之用途。
  56. 一種如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽或如請求項53至54中任一項之組合物在製造用於治療有此需要之病患之心血管疾病之藥劑中之用途。
  57. 如請求項56之用途，其中該心血管疾病係選自冠狀動脈疾病、心臟病發作、心律不整、心臟衰竭、心肌症及血管疾病。
  58. 一種如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽或如請求項53至54中任一項之組合物在製造用於治療或緩解有此需要之病患之心臟衰竭之症狀之藥劑中之用途。
  59. 如請求項58之用途，其中該心臟衰竭係選自晚期心臟衰竭、心腎症候群、伴有腎功能損傷之心臟衰竭、慢性心臟衰竭、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、急性心臟衰竭、急性後心臟衰竭、代償性心臟衰竭、失代償性心臟衰竭、右心臟衰竭、左心臟衰竭、整體心臟衰竭、缺血性心肌症、擴張型心肌症、與先天性心臟缺陷相關聯之心臟衰竭、與心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、與組合心臟瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、糖尿病心臟衰竭、酒精性心肌症、與心臟儲存失調症相關聯之心臟衰竭、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、後心肌重塑、伴有保留射血分數之心臟衰竭(HFpEF)、伴有經減小之射血分數之心臟衰竭(HFrEF)、心絞痛、高血壓、肺性高血壓及肺動脈高血壓。
  60. 如請求項58之用途，其中該心臟衰竭係選自慢性心臟衰竭、急性心臟衰竭、急性後心臟衰竭、伴有經減小之射血分數之慢性心臟衰竭(HFrEF)、伴有保留射血分數之慢性心臟衰竭(HFpEF)、伴有中程射血分數之慢性心臟衰竭(HFmEF)、舒張性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、後心肌重塑、心絞痛、高血壓、肺性高血壓及肺動脈高血壓。
  61. 如請求項58之用途，其中該心臟衰竭係選自急性後心臟衰竭、晚期心臟衰竭、心腎症候群及伴有腎功能損傷之心臟衰竭。
  62. 如請求項55至61中任一項之用途，其中該藥劑係用於與至少一種選自以下之額外治療劑組合(同時或依序)投與：ACE抑制劑、β-阻斷劑、利尿劑、鹽皮質素受體拮抗劑、蘭尼鹼受體調節劑、SERCA2a活化劑、腎素抑制劑、鈣通道阻斷劑、腺苷A1受體促效劑、局部腺苷A1受體、多巴胺β-羥化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、針對選擇之細胞傳訊通道具有偏好促效作用之血管緊張素II受體拮抗劑、血管緊張素II受體拮抗劑及腦啡肽酶抑制劑之組合、腦啡肽酶抑制劑、可溶性鳥苷酸環化酶活化劑、肌凝蛋白ATPase活化劑、rho激酶1抑制劑、rho激酶2抑制劑、愛帕琳肽受體促效劑、硝醯基供體化合物、鈣依賴性激酶II抑制劑、抗纖維化劑、半乳糖凝集素-3抑制劑、升壓素受體拮抗劑、FPR2受體調節劑、利尿鈉肽受體促效劑、瞬時受體電位類香草素4離子通道阻斷劑、抗心律不整劑、If 「超極化啟動電流(funny current)」通道阻斷劑、硝酸鹽、洋地黃化合物、強心劑、β-受體促效劑、細胞膜再封閉劑(例如帕洛沙姆188)、抗高血脂劑、血漿HDL-提高劑、抗高膽固醇血症劑、膽固醇生物合成抑制劑(諸如HMG CoA還原酶抑制劑)、LXR促效劑、FXR促效劑、普羅布考(probucol)、雷洛昔芬(raloxifene)、菸鹼酸、菸鹼醯胺、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、陰離子交換樹脂、季胺、銷膽胺、考來替泊(colestipol)、低密度脂蛋白受體誘導劑、氯貝丁酯(clofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、苯紮貝特(bezafibrate)、環丙貝特(ciprofibrate)、吉非貝齊(gemfibrizol)、維他命B6、維他命B12、抗氧化維他命、抗糖尿病藥劑、血小板聚集抑制劑、纖維蛋白原受體拮抗劑、阿司匹林及纖維酸衍生劑、PCSK9抑制劑、阿司匹林及P2Y12抑制劑(諸如氯吡格雷(Clopidogrel))。
  63. 一種如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽或如請求項53至54中任一項之組合物在製造用於治療有此需要之病患之與纖維化相關聯之疾病之藥劑中之用途。
  64. 如請求項62之用途，其中與纖維化相關聯之該疾病包含心臟、肺、腎、骨髓或肝之纖維化、皮膚纖維化或纖維化眼失調症。
  65. 如請求項63之用途，其中與纖維化相關聯之該疾病係選自肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、前期肝硬化、瀰漫性實質性肺疾病、囊性纖維化、肺纖維化、進行性大量纖維化、特發性肺纖維化、注射纖維化、腎纖維化、慢性腎疾病、糖尿病腎疾病、局灶節段性腎小球硬化、膜性腎病、IgA腎病、骨髓纖維化、心臟衰竭、代謝性心臟衰竭、心臟纖維化、白內障纖維化、白內障、眼瘢痕、胰臟纖維化、皮膚纖維化、腸纖維化、腸狹窄、內膜心肌纖維化、心房纖維化、縱膈纖維化、克隆氏症(Crohn’s disease)、腹膜後腔纖維化、瘢痕、腎源性系統性纖維化、硬皮症、系統性硬化症、關節纖維化、佩羅尼症候群(Peyronie’s syndrome)、杜普伊特倫攣縮(Dupuytren’s contracture)、糖尿病神經病、黏連性關節囊炎、酒精性肝疾病、肝脂肪變性、病毒性肝炎、膽道疾病、原發性血色病、藥物相關性肝硬化、隱源性肝硬化、威爾森氏症(Wilson’s disease)、α 1-抗胰蛋白酶缺乏症、間質性肺疾病(ILD)、人類纖維化肺疾病、黃斑變性、視網膜病變、玻璃體視網膜病變、心肌纖維化、格雷夫眼病(Grave’s ophthalmopathy)、藥物誘導之麥角化、心血管疾病、動脈粥樣硬化/再狹窄、增生性瘢痕、原發性或特發性骨髓纖維化、炎症性腸病及膠原性結腸炎。
  66. 如請求項63至65中任一項之用途，其中該藥劑係用於與至少一種抗纖維化劑組合(同時或依序)向該病患投與。
  67. 如請求項66之用途，其中該至少一種抗纖維化劑係選自尼達尼布(nintedanib)、吡非尼酮(Pirfenidone)、LPA1拮抗劑、LPA1受體拮抗劑、GLP1類似物、川隆單抗(tralokinumab) (IL-13, AstraZeneca)、維莫德吉(vismodegib) (刺蝟拮抗劑，Roche)、PRM-151 (穿透素-2，TGF β-1，Promedior)、SAR-156597 (雙特異性Mab IL-4&IL-13，Sanofi)、辛圖珠單抗(simtuzumab) ((抗離胺醯氧化酶樣2 (抗LOXL2)抗體，Gilead)、CKD-942、PTL-202 (PDE inh./pentoxifylline/NAC oral control. release, Pacific Ther.)、奧米帕昔布 (口服PI3K/mTOR抑制劑，GSK)、IW-001 (口服溶膠牛V型膠原模式，ImmuneWorks)、STX-100 (整合素α V/β-6螞蟻，Stromedix /Biogen)、干擾素γ-1b (Actimmune) (IFN γ)、PC-SOD (midismase；吸入，LTT Bio-Pharma /CKD Pharm)、來瑞珠單抗(抗IL-13 SC人類化mAb，Roche)、AQX-1125 (SHIP1活化劑，Aquinox)、CC-539 (JNK抑制劑，Celgene)、FG-3019 (FibroGen)、SAR-100842 (Sanofi)及奧貝膽酸(obeticholic acid) (OCA或INT-747，Intercept)。
  68. 一種如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽或如請求項53至54中任一項之組合物在製造用於治療或預防有此需要之病患之腎衰竭之藥劑中之用途。
  69. 一種如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽或如請求項53至54中任一項之組合物在製造用於改善、穩定或恢復有此需要之病患之腎功能之藥劑中之用途。
  70. 一種製造如請求項1至52中任一項之經修飾之鬆弛素多肽方法，其包括： (a) 提供包含該鬆弛素A鏈及該鬆弛素B鏈之多肽，其中該多肽包含該非天然編碼之胺基酸；及 (b) 將該非天然編碼之胺基酸連接至該藥物動力學增強劑。
  71. 如請求項70之方法，其中該非天然編碼之胺基酸經藉由肟鍵聯連接至該藥物動力學增強劑。
  72. 如請求項71之方法，其中該肟鍵聯係藉由羰基與胺氧基之反應形成。
  73. 如請求項72之方法，其中該羰基係該非天然編碼之胺基酸之取代基，及該胺氧基係該藥物動力學增強劑之構成。
  74. 如請求項72之方法，其中該胺氧基係該非天然編碼之胺基酸之取代基，及該羰基係該藥物動力學增強劑之構成。
  75. 如請求項70至74中任一項之方法，其中該非天然編碼之胺基酸係經核糖體併入該多肽內。
TW107104489A 2017-02-08 2018-02-08 包含藥物動力學增強劑之經修飾之鬆弛素(relaxin)多肽及其用途 TW201837051A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762456161P 2017-02-08 2017-02-08
US62/456,161 2017-02-08
US201862627411P 2018-02-07 2018-02-07
US62/627,411 2018-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201837051A true TW201837051A (zh) 2018-10-16

Family

ID=61521817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107104489A TW201837051A (zh) 2017-02-08 2018-02-08 包含藥物動力學增強劑之經修飾之鬆弛素(relaxin)多肽及其用途

Country Status (18)

Country Link
US (5) US10266578B2 (zh)
EP (1) EP3580232B1 (zh)
JP (1) JP7372837B2 (zh)
KR (1) KR102670432B1 (zh)
CN (1) CN110637027A (zh)
AU (2) AU2018219283B2 (zh)
BR (1) BR112019016139A2 (zh)
CA (1) CA3052639A1 (zh)
CL (1) CL2019002132A1 (zh)
CO (1) CO2019009587A2 (zh)
ES (1) ES2963839T3 (zh)
IL (1) IL268421A (zh)
MX (1) MX2019008449A (zh)
MY (1) MY193457A (zh)
PE (1) PE20191716A1 (zh)
SG (2) SG11201907209QA (zh)
TW (1) TW201837051A (zh)
WO (1) WO2018148419A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2972902T3 (es) * 2010-08-17 2024-06-17 Ambrx Inc Polipéptidos de relaxina modificados y sus usos
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
AU2018219283B2 (en) 2017-02-08 2022-05-19 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
KR20200116085A (ko) * 2018-01-31 2020-10-08 사노피 변형된 지질화된 릴랙신 b 사슬 펩타이드 및 이들의 치료적 용도
JP2021534153A (ja) * 2018-08-15 2021-12-09 アイビバ バイオファーマ インコーポレイテッド Ｖｅｇｆおよびｔｇｆベータのマルチキナーゼ阻害剤およびその使用
AU2020321977C1 (en) 2019-07-31 2024-04-18 Eli Lilly And Company Relaxin analogs and methods of using the same
JP2023524981A (ja) * 2020-05-08 2023-06-14 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 操作されたリラキシンおよびその使用の方法
US11439685B2 (en) 2020-05-22 2022-09-13 Trustees Of Boston University Formulations for treating a fibrotic disease
US20210380655A1 (en) * 2020-06-02 2021-12-09 Trustees Of Boston University Production of soluble relaxin and relaxin analogs
CN114075276A (zh) * 2020-08-17 2022-02-22 成都奥达生物科技有限公司 一种长效松弛素2类似物
KR20230001168A (ko) * 2021-06-28 2023-01-04 (주) 넥셀 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 약학 조성물
EP4392440A2 (en) * 2021-08-23 2024-07-03 River 2 Renal Corp. Combination of relaxin and vasopressin analogues for treatment of renal disorders or conditions
CN113699124B (zh) * 2021-09-08 2022-04-12 北京大学 一种含非天然氨基酸蛋白的制备方法
CN115717130A (zh) * 2022-09-02 2023-02-28 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 氨酰-tRNA合酶突变体及烯基酪氨酰-tRNA的制备方法

Family Cites Families (346)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
DE3169595D1 (en) 1980-11-10 1985-05-02 Gersonde Klaus Method of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatment, the use of this method and apparatus for its application
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US5145962A (en) 1982-08-12 1992-09-08 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human pro relaxin polypeptides
IL70414A (en) 1982-12-13 1991-06-10 Florey Howard Inst Polypeptide having human h2-relaxin activity,double-stranded dna fragments coding therefor,vectors containing the dna fragments and methods for preparing the polypeptide,dna fragments and vectors
US5179195A (en) 1982-12-13 1993-01-12 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human relaxin polypeptides
US4511502A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4820352A (en) 1983-01-10 1989-04-11 Bausch & Lomb Incorporated Cleaning and conditioning solutions for contact lenses and methods of use
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US5089398A (en) 1983-02-22 1992-02-18 Chiron Corporation Enhanced yeast transcription employing hybrid GAPDH promoter region constructs
CA1341116C (en) 1983-02-22 2000-10-17 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein
JPS59166086A (ja) 1983-03-09 1984-09-19 Teruhiko Beppu 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法
US4755465A (en) 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4859600A (en) 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
ATE78293T1 (de) 1983-05-27 1992-08-15 Texas A & M Univ Sys Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
JPS607934A (ja) 1983-06-29 1985-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd リポソ−ムの製造方法
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4689406A (en) 1983-08-10 1987-08-25 Amgen Enhancement of microbial expression of polypeptides
ATE159858T1 (de) 1983-09-26 1997-11-15 Ehrenfeld Udo Mittel und erzeugnis für die diagnose und therapie von tumoren sowie zur behandlung von schwächen der zelligen und humoralen immunabwehr
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
DK518384A (da) 1984-01-31 1985-07-01 Idaho Res Found Vektor til fremstilling af et gen-produkt i insektceller, fremgangsmaade til dens fremstilling samt dens anvendelse
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
EP0480480A3 (en) 1984-05-11 1992-06-10 Chiron Corporation Enhanced yeast transcription employing hybrid promoter region constructs
US4880734A (en) 1984-05-11 1989-11-14 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4738921A (en) 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
US4837148A (en) 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
DE3680924D1 (de) 1985-01-14 1991-09-26 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
EP0229108B1 (en) 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
JPS63123383A (ja) 1986-11-11 1988-05-27 Mitsubishi Kasei Corp ハイブリツドプロモ−タ−、発現調節ｄｎａ配列および発現ベクタ−
US5186933A (en) 1986-12-30 1993-02-16 Baylor College Of Medicine Synthesis and immunogenicity of rotavirus genes using a baculovirus expression system
JPH02502876A (ja) 1987-03-16 1990-09-13 アメリカン　バイオジェネティック　サイエンシズ　インク ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体
EP0284044B1 (en) 1987-03-23 1994-03-23 Zymogenetics, Inc. High level expression in yeast
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
WO1989001038A1 (en) 1987-07-24 1989-02-09 Cetus Corporation PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE FORMS OF CSF USING A BACULOVIRUS (AcNPV)-INSECT CELL EXPRESSION SYSTEM
AU2136788A (en) 1987-07-24 1989-03-01 Cetus Corporation Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
WO1989007945A1 (en) 1988-02-26 1989-09-08 Genentech, Inc. Human relaxin formulation
CA1324969C (en) 1988-05-06 1993-12-07 Jeffrey R. Shuster High level expression of proteins in yeast
US5674706A (en) 1988-05-06 1997-10-07 Chiron Corporation High level expression of proteins in yeast
FR2631974B1 (fr) 1988-05-31 1992-12-11 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede de preparation et son application en tant que vecteur d'expression de genes
AU4197389A (en) 1988-08-05 1990-03-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The In vivo infection of live insects with a recombinant baculovirus
GB8819453D0 (en) 1988-08-16 1988-09-21 Roy P Production of bluetongue virus non-structural proteins using baculovirus expression vector
NZ230425A (en) 1988-09-02 1992-07-28 Molecular Eng Ass Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
CA2345497A1 (en) 1988-10-28 1990-04-28 Genentech, Inc. Growth hormone variants and method for forming growth hormone variants
AU649217B2 (en) 1988-11-18 1994-05-19 Regents Of The University Of California, The Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
WO1990010078A1 (en) 1989-02-23 1990-09-07 University Of Ottawa Improved baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
WO1990010277A1 (en) 1989-02-24 1990-09-07 Cell Analysis Systems, Inc. Method and apparatus for determining a proliferation index of a cell sample
DE69033192T3 (de) 1989-04-19 2004-05-19 Enzon, Inc. Aktive karbonate von polyalkylenoxyden zur modifizierung von polypeptiden
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
JPH04501065A (ja) 1989-05-17 1992-02-27 ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション インコーポレイテッド 改良されたバキュロウイルス発現ベクター
DE69026306T2 (de) 1989-05-27 1996-10-17 Seikagaku Kogyo Co Ltd Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine.
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5162601A (en) 1989-11-22 1992-11-10 The Upjohn Company Plant potyvirus expression vector with a gene for protease
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
FR2664905B1 (fr) 1990-07-18 1994-08-12 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
WO1992001800A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
EP0541721A4 (en) 1990-08-02 1993-12-29 Chiron Corporation Expression of human cmv glycoprotein-h using the baculovirus-insect cell expression system
WO1992004363A1 (en) 1990-09-04 1992-03-19 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5231178A (en) 1991-01-16 1993-07-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1
WO1992016555A1 (en) 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
WO1992016619A1 (en) 1991-03-19 1992-10-01 Us Army Expression of influenza nucleoprotein antigens in baculovirus
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6126944A (en) 1991-04-26 2000-10-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Baculovirus expression vectors and recombinant antigens for detecting type-specific antibodies to herpes simplex virus
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5290686A (en) 1991-07-31 1994-03-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of influenza a M2 protein in baculovirus
US5166191A (en) 1991-08-19 1992-11-24 Genentech, Inc. Use of relaxin in cardiovascular therapy
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
US6256642B1 (en) 1992-01-29 2001-07-03 Microsoft Corporation Method and system for file system management using a flash-erasable, programmable, read-only memory
WO1993021259A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Cornell Research Foundation Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
US5516657A (en) 1992-05-11 1996-05-14 Cambridge Biotech Corporation Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound proteins
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
EP0707650B1 (en) 1993-06-21 2003-05-21 Genentech, Inc. Process for producing human relaxin
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5491076A (en) 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
US5605792A (en) 1993-11-04 1997-02-25 The Ohio State University Research Foundation Infectious bursal disease virus VP2 fusion protein expressed by baculovirus, use as diagnostic
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
FR2715664B1 (fr) 1994-01-31 1996-04-12 Proteine Performance Sa Baculovirus recombinant et son utilisation pour la production d'anticorps monoclonaux.
US6852507B1 (en) 1994-01-31 2005-02-08 L'institut National De La Recherche Agronomique Recombinant baculovirus and use thereof in the production of monoclonal antibodies
JP3090586B2 (ja) 1994-03-15 2000-09-25 片倉工業株式会社 システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルスおよびその製造法並びにこれを利用する有用タンパク質の製造法
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US6403375B1 (en) 1994-08-24 2002-06-11 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Establishment of Trichoplusia ni cell lines in serum-free medium for recombinant protein and baculovirus production
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6183987B1 (en) 1995-02-17 2001-02-06 Stichting Institut Voor Dierhouderij En Diergezonheld Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulation hormone (rec bFSH) in the baculovirus expression system
FR2732035B1 (fr) 1995-03-23 1997-05-30 Agronomique Inst Nat Rech Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede
NZ308772A (en) 1995-05-17 1999-04-29 Du Pont Recombinant baculovirus insecticides
AU5893696A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5911997A (en) 1995-06-07 1999-06-15 Connetics Corporation Relaxin-like factor and methods and uses thereof
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5861279A (en) 1996-01-17 1999-01-19 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists
AU1690697A (en) 1996-01-17 1997-08-11 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin antagonists
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
JP4410852B2 (ja) 1996-08-02 2010-02-03 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 単一の共有結合ｎ末端水溶性ポリマーを有するポリペプチド
US5980948A (en) 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
JP4341859B2 (ja) 1996-12-13 2009-10-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス， インコーポレーテッド 酵母での異種タンパク質の発現の方法
WO1998032466A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
GB9703406D0 (en) 1997-02-19 1997-04-09 Chiron Spa Expression of heterologous proteins
WO1998049198A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
CN1250566C (zh) 1997-06-06 2006-04-12 协和发酵工业株式会社 化学修饰的多肽
US5965393A (en) 1997-07-01 1999-10-12 National Institute Of Immunology Method for enhancing foreign gene expression in baculovirus expression vector system
CA2296770A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
GB9715660D0 (en) 1997-07-25 1997-10-01 Zeneca Ltd Proteins
WO1999007862A1 (en) 1997-08-05 1999-02-18 Chiron Corporation Novel pichia pastoris gene sequences and methods for their use
DE19735593C2 (de) 1997-08-15 1999-08-26 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie
US6090584A (en) 1997-08-21 2000-07-18 University Technologies International Inc. Baculovirus artificial chromosomes and methods of use
DE69830065T2 (de) 1997-09-16 2006-01-19 Egea Biosciences, LLC, San Diego Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
US6129912A (en) 1997-09-26 2000-10-10 Uab Research Foundation Polyethylene glycol-protein compositions which reduce the antigenic display of red blood cells
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6201072B1 (en) 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
DE19748489A1 (de) 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics Gmbh Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
EP0924298A1 (en) 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
CN1292033A (zh) 1998-03-04 2001-04-18 昂尼克斯药物公司 用于遗传物质高通量表达的杆状病毒表达系统和方法
ATE279430T1 (de) 1998-03-05 2004-10-15 Chiron Corp Verfahren zur verbesserung der serum halbwertszeit von biologisch aktiven molekülen
AU2903899A (en) 1998-03-12 1999-09-27 Shearwater Polymers Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
KR100264953B1 (ko) 1998-04-03 2001-03-02 박현우 재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
US6168932B1 (en) 1998-07-13 2001-01-02 Parker Hughes Institute Recombinant DTctGMCSF fusion toxin in a baculovirus expression vector system
US6245528B1 (en) 1998-07-28 2001-06-12 Academia Sinica Latent baculovirus expression system
DE19834044A1 (de) 1998-07-29 2000-02-03 Bayer Ag Neue substituierte Pyrazolderivate
DE19834047A1 (de) 1998-07-29 2000-02-03 Bayer Ag Substituierte Pyrazolderivate
US6368825B1 (en) 1998-08-10 2002-04-09 Academia Sinica Baculovirus containing minimal CMV promoter
WO2000012587A2 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Gryphon Sciences Polyamide chains of precise length, methods to manufacture them and their conjugates
WO2000020032A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Trustees Of Dartmouth College RECOMBINANT CAT ALLERGEN, Fel dI, EXPRESSED IN BACULOVIRUS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CAT ALLERGY
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
WO2000026354A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 Novozymes A/S Glycosylated proteins having reduced allergenicity
US6451346B1 (en) 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
US6281211B1 (en) 1999-02-04 2001-08-28 Euro-Celtique S.A. Substituted semicarbazides and the use thereof
US6994986B2 (en) 1999-03-17 2006-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford University In vitro synthesis of polypeptides by optimizing amino acid metabolism
AU4325900A (en) 1999-03-17 2000-10-04 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system
US6342216B1 (en) 1999-03-17 2002-01-29 The Board Of Regents, The University Of Texas System Therapy of cancer by insect cells containing recombinant baculovirus encoding genes
US6337191B1 (en) 1999-03-22 2002-01-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Vitro protein synthesis using glycolytic intermediates as an energy source
KR100619611B1 (ko) 1999-04-16 2006-09-01 더블유엠. 마쉬 라이스 유니버시티 작용화 폴리(프로필렌 푸마레이트) 및 폴리(프로필렌푸마레이트-코-에틸렌 글리콜
US6261805B1 (en) 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
DE19943639A1 (de) 1999-09-13 2001-03-15 Bayer Ag Dicarbonsäurederivate mit neuartigen pharmazeutischen Eigenschaften
DE19943635A1 (de) 1999-09-13 2001-03-15 Bayer Ag Neuartige Aminodicarbonsäurederivate mit pharmazeutischen Eigenschaften
DE19943634A1 (de) 1999-09-13 2001-04-12 Bayer Ag Neuartige Dicarbonsäurederivate mit pharmazeutischen Eigenschaften
DE19943636A1 (de) 1999-09-13 2001-03-15 Bayer Ag Neuartige Dicarbonsäurederivate mit pharmazeutischen Eigenschaften
AU2039501A (en) 1999-10-15 2001-04-23 Rockefeller University, The System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
ATE317868T1 (de) 1999-12-22 2006-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
WO2001045796A2 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol)
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
AU2001257577A1 (en) 2000-02-28 2001-09-03 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
GB0012997D0 (en) 2000-05-26 2000-07-19 Eurogene Limited Gene delivery
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
JP2002030098A (ja) 2000-07-17 2002-01-29 Institute Of Immunology Co Ltd バキュロウィルスの発芽ウイルスからウイルスエンベロープを回収する方法
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
AR031176A1 (es) 2000-11-22 2003-09-10 Bayer Ag Nuevos derivados de pirazolpiridina sustituidos con piridina
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
DE10110750A1 (de) 2001-03-07 2002-09-12 Bayer Ag Neuartige Aminodicarbonsäurederivate mit pharmazeutischen Eigenschaften
DE10110749A1 (de) 2001-03-07 2002-09-12 Bayer Ag Substituierte Aminodicarbonsäurederivate
DK1456360T3 (en) 2001-04-19 2015-08-31 Scripps Research Inst Methods and Composition for Preparation of Orthogonal TRNA-Aminoacyl-TRNA Synthetase Pairs
AUPR814401A0 (en) 2001-10-08 2001-11-01 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human 3 relaxin
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
WO2003040211A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
DE10220570A1 (de) 2002-05-08 2003-11-20 Bayer Ag Carbamat-substituierte Pyrazolopyridine
DE60332725D1 (de) 2002-05-30 2010-07-08 Scripps Research Inst Kupferkatalysierte ligierung von aziden und acetylenen
WO2004035605A2 (en) 2002-10-16 2004-04-29 The Scripps Research Institute Glycoprotein synthesis
CA2502029C (en) 2002-10-16 2014-06-10 The Scripps Research Institute Site specific incorporation of keto amino acids into proteins
AU2003300389B2 (en) 2002-12-22 2009-10-08 The Scripps Research Institute Protein arrays
AU2004233083B2 (en) 2003-04-17 2010-09-16 The Scripps Research Institute Expanding the eukaryotic genetic code
AU2003903124A0 (en) 2003-06-20 2003-07-10 Mark Del Borgo Analogues of heteromeric proteins
EP1704242A4 (en) 2003-07-07 2008-06-18 Scripps Research Inst COMPOSITIONS WITH PAIRS OF ORTHOGONAL LEUCYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASE AND USES THEREOF
WO2005007624A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal glutamyl-trna and aminoacyl trna synthetase pairs and uses thereof
PT1914314E (pt) 2003-07-07 2010-09-08 Scripps Research Inst Composições de pares ortogonais de lisil-arnt e aminoacil-arnt-sintetase e suas utilizações
WO2005014024A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2005035727A2 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Ambrx, Inc. Polymer derivatives
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
EP1765149B1 (en) 2004-03-19 2016-09-28 University Of Pittsburgh Use of relaxin to increase arterial compliance
KR20070034512A (ko) 2004-06-18 2007-03-28 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
MX2007000728A (es) 2004-07-21 2007-03-15 Ambrx Inc Polipeptidos biosinteticos que utilizan amino acidos no naturalmente codificados.
EP2399893B1 (en) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
CA2594557C (en) 2004-12-22 2016-04-26 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
CA2594561C (en) 2004-12-22 2014-12-23 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
WO2006068802A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
AU2005323106B2 (en) 2004-12-22 2010-07-29 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
US7883858B2 (en) 2005-01-27 2011-02-08 Institute For Systems Biology Methods for identifying and monitoring drug side effects
US20060264367A1 (en) 2005-05-21 2006-11-23 Howard Florey Institute Prevention of fibrosis following cardiac injury
WO2006133089A2 (en) 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
WO2006132969A2 (en) 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Incorporation of non-naturally encoded amino acids into proteins
CN102703446B (zh) 2005-08-18 2014-05-28 Ambrx公司 tRNA组合物和其用途
CN101489571B (zh) 2005-11-02 2014-06-18 Ambrx公司 生物合成多肽融合抑制剂
DK1954710T3 (da) 2005-11-08 2011-06-27 Ambrx Inc Acceleratorer til modifikation af unaturlige aminosyrer og unaturlige aminosyrepolypeptider
CN101454461A (zh) 2005-11-16 2009-06-10 Ambrx公司 包括非天然氨基酸的方法和组合物
KR101423898B1 (ko) 2005-12-14 2014-07-28 암브룩스, 인코포레이티드 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도
CN105085313A (zh) 2005-12-30 2015-11-25 Ambrx公司 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
KR20080108416A (ko) 2006-01-19 2008-12-15 암브룩스, 인코포레이티드 조절된 면역원성을 갖는 비천연 아미노산 폴리펩티드
EP1999259B1 (en) 2006-03-03 2014-06-25 California Institute of Technology Site-specific incorporation of amino acids into molecules
WO2007103490A2 (en) 2006-03-09 2007-09-13 The Scripps Research Institute System for the expression of orthogonal translation components in eubacterial host cells
CN106008699A (zh) 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
CA2662752C (en) 2006-09-08 2016-04-12 Ambrx, Inc. Site specific incorporation of non-natural amino acids by vertebrate cells
KR20090051227A (ko) 2006-09-08 2009-05-21 암브룩스, 인코포레이티드 척추동물 세포를 위한 하이브리드 서프레서 ｔＲＮＡ
JP5451390B2 (ja) 2006-09-08 2014-03-26 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞内におけるサプレッサーｔｒｎａの転写
JP4897050B2 (ja) 2006-11-10 2012-03-14 コヴェックス・テクノロジーズ・アイルランド・リミテッド 抗血管形成化合物
WO2011028195A2 (en) 2006-12-18 2011-03-10 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
KR20090102838A (ko) 2006-12-28 2009-09-30 암브룩스, 인코포레이티드 페나진 및 퀴녹살린 치환된 아미노산 및 폴리펩티드
KR101476472B1 (ko) 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
MX2009011870A (es) 2007-05-02 2009-11-12 Ambrx Inc Polipeptidos de interferon beta modificados y usos de los mismos.
US9353170B2 (en) 2007-06-08 2016-05-31 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Long-acting transient polymer conjugates of exendin
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2009036460A2 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Ambrx, Inc. Modified human apolipoprotein a-i polypeptides and their uses
CN104004088B (zh) * 2007-09-26 2017-11-07 Ucb医药有限公司 双特异性抗体融合物
WO2009052435A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Ambrx, Inc. Anti-tnfri polypeptides and their uses
EP2215114B1 (en) 2007-10-30 2013-09-04 Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine Chimeric relaxin polypeptides comprising an a and b chain derived from different relaxin family peptides
WO2009061369A2 (en) 2007-11-02 2009-05-14 The Scripps Research Institute Directed evolution using proteins comprising unnatural amino acids
ES2632504T3 (es) 2007-11-20 2017-09-13 Ambrx, Inc. Polipéptidos de insulina modificados y sus usos
NZ602170A (en) 2008-02-08 2014-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
WO2010051056A2 (en) 2008-03-11 2010-05-06 Ambrx, Inc. ANTI-FcεRI POLYPEPTIDES AND THEIR USES
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
WO2009140433A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Corthera, Inc. Method of promoting wound healing
CA2724540C (en) 2008-05-16 2014-07-08 Corthera, Inc. Treating dyspnea associated with acute heart failure with relaxin
WO2009140657A2 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Corthera, Inc. Method of treating chronic heart failure
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
JP5680534B2 (ja) 2008-07-23 2015-03-04 イーライ リリー アンド カンパニー 修飾されているウシｇ−ｃｓｆポリペプチドおよびそれらの使用
US20110171312A1 (en) 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Modified therapeutic peptides, methods of their preparation and use
MX2011003272A (es) 2008-09-26 2011-04-28 Ambrx Inc Polipeptidos de eritropoyetina animal modificados y sus usos.
ES2660000T3 (es) 2008-09-26 2018-03-20 Ambrx, Inc. Vacunas y microorganismos dependientes de la replicación de aminoácidos no naturales
JP5090330B2 (ja) 2008-12-26 2012-12-05 Ｋｄｄｉ株式会社 画像処理装置、画像処理方法およびプログラム
WO2010105081A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 Medtronic, Inc. Method of treating heart failure
US8389475B2 (en) 2009-08-10 2013-03-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Relaxin analogs
GR1007010B (el) 2009-10-08 2010-10-07 Χημικα Και Βιοφαρμακευτικα Εργαστηρια Πατρων Αε (Cbl-Patras), Ινσουλινοειδη πεπτιδια
JP2013515080A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているウシのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
EP2805965A1 (en) 2009-12-21 2014-11-26 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011079293A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Ambrx, Inc Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand polypeptides and their uses
US20110243942A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Athena Discovery, Inc. Relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives
US9567386B2 (en) * 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
ES2972902T3 (es) 2010-08-17 2024-06-17 Ambrx Inc Polipéptidos de relaxina modificados y sus usos
CA2822591C (en) * 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
US20150080559A1 (en) 2011-05-27 2015-03-19 Ambrx, Inc. Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-Natural Amino Acid Linked Dolastatin Derivatives
MX359217B (es) 2011-05-27 2018-09-19 Ambrx Inc Composiciones que contienen, métodos que involucran, y usos de derivados de dolastatina unidos a aminoácidos no naturales.
KR20140054009A (ko) * 2011-07-01 2014-05-08 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 릴랙신 융합 폴리펩타이드 및 그의 용도
CN103649116A (zh) 2011-07-08 2014-03-19 拜耳知识产权有限责任公司 释放松弛素的融合蛋白及其用途
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
WO2013130917A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Ambrx, Inc. Interleukin-3 polypeptide conjugates their uses
EP2820034A4 (en) 2012-02-29 2015-07-15 Ambrx Inc MODIFIED ADIPONECTINPOLYPEPTIDES AND ITS USES
WO2013130913A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates and their uses
US20150018530A1 (en) 2012-02-29 2015-01-15 Ambrx, Inc. Novel Prodrug Containing Molecule Compositions and Their Uses
US10800856B2 (en) 2012-06-07 2020-10-13 Ambrx, Inc. Prostate-specific membrane antigen antibody drug conjugates
KR20150023729A (ko) 2012-06-14 2015-03-05 암브룩스, 인코포레이티드 핵 수용체 리간드 폴리펩티드에 접합된 항-psma 항체
CA2875743A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Sanofi Exendin-4 peptide analogues
KR102332435B1 (ko) 2012-06-19 2021-12-01 암브룩스, 인코포레이티드 항cd70 항체 약물 컨쥬게이트
WO2014059174A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of relaxin to treat atrial fibrillation
AR094147A1 (es) 2012-12-27 2015-07-15 Bayer Pharma Aktiengellschaft Polipeptidos de fusion con actividad de relaxina y sus usos
CA2924109A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents and compositions thereof
ES2845924T3 (es) 2013-10-15 2021-07-28 Scripps Research Inst Interruptores de células T con receptores de antígenos quiméricos peptídicos y usos de los mismos
JP6637415B2 (ja) 2013-10-15 2020-01-29 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート キメラ抗原受容体ｔ細胞スイッチおよびその使用
CA2928754A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. Human relaxin analogue, pharmaceutical composition of same, and pharmaceutical application of same
EP4212180A1 (en) 2013-12-18 2023-07-19 The Scripps Research Institute Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof
US20150297680A1 (en) 2014-04-02 2015-10-22 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for increasing protein half-life
CA2950178A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The California Institute For Biomedical Research Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
WO2015188135A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The California Institute For Biomedical Research Constant region antibody fusion proteins and compositions thereof
JP6803236B2 (ja) 2014-06-10 2020-12-23 アムジェン インコーポレイテッド アペリンポリペプチド
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
MA41794A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 The California Institute For Biomedical Res Agents thérapeutiques modifiés et compositions associées
ES2880682T3 (es) 2015-10-05 2021-11-25 Fredax Ab Anticuerpos anti PSA (5A10) humanizados
BR112018008681A2 (pt) 2015-10-28 2018-10-30 Tufts Medical Center novos polipeptídeos com estabilidade proteolítica melhorada, e métodos para preparar e usar os mesmos
EP3384935A4 (en) 2015-12-02 2019-08-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PROTEIN COMPLEX UTILIZING A FATTY ACID DERIVATIVE, AND PROCESS FOR PREPARING THE SAME
AU2016382394B2 (en) 2015-12-31 2019-07-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting conjugate of triple glucagon/GLP-1/GIP receptor agonist
CN109843307A (zh) 2016-08-04 2019-06-04 哈德逊医学研究所 治疗的方法
DK3522911T3 (da) 2016-10-07 2022-03-07 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Sammensætninger omfattende relaxin og fremgangsmåder til anvendelse deraf
EP3551230A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 CureVac AG Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease
US11684584B2 (en) 2016-12-30 2023-06-27 Genevant Sciences Gmbh Branched peg molecules and related compositions and methods
CA3049262A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Peptide compositions and methods of use thereof for disrupting tead interactions
US11192931B2 (en) 2017-01-25 2021-12-07 Medlmmune, Llc Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
AU2018219283B2 (en) 2017-02-08 2022-05-19 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
CA3072274C (en) 2017-02-08 2024-01-02 Brooke Schumm Intra-operative radiation therapy capsule with cylindrical shell radiation containment shutter system
WO2018156815A1 (en) 2017-02-23 2018-08-30 Aspyrian Therapeutics, Inc. Therapeutic compositions and related methods for photoimmunotherapy
WO2018160876A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 The Regents Of The University Of California In situ lipid synthesis for protein reconstitution
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
US20180371046A1 (en) 2017-05-01 2018-12-27 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Therapy for Lower Urinary Tract Dysfunctions
US11939385B2 (en) 2017-05-16 2024-03-26 ALX Oncology Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
KR20200116085A (ko) 2018-01-31 2020-10-08 사노피 변형된 지질화된 릴랙신 b 사슬 펩타이드 및 이들의 치료적 용도
WO2019149781A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Sanofi Modified lipidated relaxin b chain peptides and their therapeutic use
TW201934572A (zh) 2018-01-31 2019-09-01 法商賽諾菲公司 經修飾之鬆弛素ｂ鏈胜肽及其治療用途

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019016139A2 (pt) 2020-04-07
WO2018148419A1 (en) 2018-08-16
CA3052639A1 (en) 2018-08-16
CL2019002132A1 (es) 2019-11-29
US10266578B2 (en) 2019-04-23
AU2018219283B2 (en) 2022-05-19
KR20190115049A (ko) 2019-10-10
JP2020506242A (ja) 2020-02-27
US20190256570A1 (en) 2019-08-22
US11185570B2 (en) 2021-11-30
MY193457A (en) 2022-10-14
CN110637027A (zh) 2019-12-31
US11364281B2 (en) 2022-06-21
EP3580232B1 (en) 2023-09-20
KR102670432B1 (ko) 2024-05-28
AU2018219283A1 (en) 2019-09-26
SG11201907209QA (en) 2019-09-27
ES2963839T3 (es) 2024-04-02
AU2022218485A1 (en) 2022-11-03
MX2019008449A (es) 2019-09-09
CO2019009587A2 (es) 2019-09-18
PE20191716A1 (es) 2019-12-05
SG10201912034UA (en) 2020-02-27
US20220331402A1 (en) 2022-10-20
JP7372837B2 (ja) 2023-11-01
IL268421A (en) 2019-09-26
EP3580232A1 (en) 2019-12-18
US20180222960A1 (en) 2018-08-09
US20210196791A1 (en) 2021-07-01
US20220211812A1 (en) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220211812A1 (en) Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
AU2020210152B2 (en) Modified fgf-21 polypeptides and uses thereof
TWI792596B (zh) 新穎脂肪酸及其於共軛至生物分子之用途
EA043751B1 (ru) Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие фармакокинетический энхансер, и их применение