CN109843307A - 治疗的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开教导了包括改善气道炎症、气道重塑和气道高反应性的症状的用于治疗气道疾病的方法。所述方法包括将抗纤维化药剂与羊膜上皮细胞或它们的功能等同物或外泌体一起给药。
Description
本申请与标题为“治疗的方法”的于2016年8月4日提交的澳大利亚临时专利申请No.2016903060相关并且要求其优先权，其全部内容以它们的整体通过参考引入本文。
技术领域
本公开教导包括改善气道炎症、气道重塑和气道高反应性的症状的用于治疗气道疾病的方法。
背景技术
发明人在本说明书中引用的出版物的著录细节在说明书的末尾按字母顺序收集。
在本说明书中对任何在先出版物(或源自其中的信息)、或者对任何已知的事项的引用不是并且不应该被认为是认可或承认或任何形式的暗示在先出版物(或源自其中的信息)或已知的事项形成本说明书致力于涉及的领域中的公知常识的一部分。
共同由术语“气道疾病”涵盖的包括支气管狭窄和支气管痉挛的肺病、肺综合征和呼吸道炎性病症对于患病的受试者导致显著的发病率并且潜在地危及生命。具有重要意义的一种特定的病状为哮喘。哮喘为涉及气道的阻塞和支气管痉挛的过敏性气道疾病(AAD)(Levey等人(2006)Prim.Care Respir.J.15:20-34)。哮喘在发达国家中的患病率在近几十年来急剧上升(Myers和Tomasio(2011)Respir.Care 56:1389-1407)，并且预测其会在全世界影响3亿人(Stanojevic等人(2012)BMC Public Health 12:204)。每年全世界每250例死亡中就有1例是由哮喘导致的，哮喘还导致1500万伤残调整生命年(disability-adjustedlife year，DALY)的损失并且每年在欧洲使医疗保健系统花费超过200亿美元(Braman(2006)Chest 130:4S-12S)。
皮质类固醇和β2-肾上腺素受体激动剂是用于哮喘的最广泛使用的治疗(Marceau等人(2006)J.Allergy Clin.Immunol.118:574-581)。这些疗法可以分别通过直接靶向气道炎症(AI)或AHR来抑制气道高反应性(AHR；气道对支气管收缩剂的收缩反应[Holgate(2008)Clin.Exp.Allergy 38:872-897])。然而，它们是受限的，这是因为它们不靶向于与哮喘相关的气道重塑(AWR)。气道重塑涉及在肺和气道内的结构变化，包括但不限于有助于与可以独立地导致气道高反应性的哮喘相关的气道的不可逆阻塞的纤维化的发展(Royce和Tang(2009)Curr.Mol.Pharmacol 2:169-181)。
干细胞具有引人注目的修复性(Ge等人(2013)J.Cell.Biochem.114:1595-1605)，经由旁分泌信号传导起作用(Baraniak和McDevitt(2010)Regen.Med.5:121-143)以及增加调节性T细胞(Treg)活性(Weiss(2014)Stem Cells 32:16-25)。考虑将干细胞用于气道重塑的治疗。干细胞在过敏性气道疾病的急性动物模型中取得了一些成功，主要经由免疫调节减少炎症和相关的纤维化(Royce等人(2014)Pharm.therap.141:250-260；Sun等人(2012)Stem Cells 30:2692-2699；Moodley等人(2010)Am.J.Rspir.Crit.Cre Med.182:643-651)。然而，干细胞的使用由于它们的增殖、分化和修复能力的降低而导致在慢性过敏性气道疾病模型中的前景较差(Dolgachev等人(2009)Am J.Path.174:390-400)。这潜在地归因于损害干细胞存活、向靶受损组织的迁移、增殖和与驻留组织细胞的整合的在慢性AAD中的广泛纤维化的存在(Knight和Rossi(2010)Expert Rev.Respir.Med.4:747-758)。
Serelaxin(RLX)为称为人基因-2(H2)松弛素(松弛素-2)的人松弛素激素的主要储存和循环形式的基于药物的形式。除了具有通过其同源G蛋白偶联受体，松弛素家族肽受体-1(RXFP1)，介导的快速发生的抗纤维化作用(Royce等人(2014)同上)以外，目前正在临床上评估serelaxin在患有急性心力衰竭的患者中的血管舒张益处(Teerlink等人(2013)Lancet 281:29-39)，并且serelaxin在小鼠中也是有生物活性的(Samuel等人(2007)Cell.Mol.Life Sci.64:1539-1557)。单独的serelaxin在肺损伤的各种模型中显示治疗效果(Unemori等人(1996)J.Clin.Invest.98:2739-2745；Kenyon等人(2003)Toxicol.Appl.Pharmacol.186:90-100；Tozzi等人(2005)Pulm.Pharm.Therap.18:346-353；Huang等人(2011)Am.J.Path.179:2751-2765)。在慢性AAD的环境中，显示使用Serelaxin的全身(Royce等人(2009)Endocrinology150:2692-2699)和鼻内(Royce等人(2014)Clin.Exp.Allergy 44:1399-1408)治疗减少过多的胶原沉积和气道上皮增厚以及预防AHR的发展。
发现将serelaxin与源自人骨髓的间质干细胞(MSC)联用改善这些细胞的活力和增殖能力，并且更有效地预防阻塞性肾病诱导的肾纤维化(Huuskes等人(2015)FASEBJ.29:540-553)。然而，对于其它病状、在其它干细胞类型的情况下，是否存在协同作用是未知的。
人羊膜上皮干细胞(AEC)具有数种潜在有用的性质。它们是非免疫原性的(Akle等人(1981)Lancet 2:1003-1005)并且可以经由非侵入性过程从成熟胎盘的羊膜囊容易地且符合伦理地收集(Miki等人(2005)Stem Cells 23:1549-1559)。AEC可以在博来霉素诱导的间质性肺损伤的慢性小鼠模型中减少炎症和纤维化二者(Moodley等人(2010)同上)，这与当单独地用于慢性疾病环境时仅显示有限的治疗功效的MSC不同(Huuskes等人(2015)同上)。
需要开发更有效的用于气道疾病的疗法。
发明内容
本发明部分地基于在对肺组织有活性的抗纤维化药剂与羊膜上皮干细胞(AEC)或羊膜外泌体之间存在的令人惊讶的协同作用的确定。抗纤维化药剂的实例为松弛素、或者其重组体、或功能性衍生物或变体形式。本说明书因此教导了在受试者中治疗气道疾病的治疗方案。方案包括抗纤维化药剂与AEC或羊膜外泌体的同时地或以任一种顺序依次地共同给药。在实施方案中，虽然可以是同种异体的或者在某些情况下是异种的，但是AEC对于接受治疗的受试者是自体的，并且外泌体可以是自体的、同种异体的或异种的。受试者通常为需要治疗的人类受试者。然而，存在兽医的应用如在例如赛马等竞技动物(racinganimal)中治疗运动诱导的肺出血。可以通过任何方便的途径，例如通过鼻内和呼吸道内途径，还可以通过静脉内等途径给药。
就人类受试者而言，气道疾病包括急性和慢性过敏性气道疾病和反应性气道疾病以及哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征的特定的病状。这不是气道疾病的穷举的列表，并且所有具有气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性的组分的疾病状况以及依赖于或与其相关的病状均涵盖在本发明中。进一步设计本治疗方案从而治疗这些病状特别是气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性的症状。本文中提出AEC或羊膜外泌体与例如松弛素等抗纤维化药剂的联用在预防或降低发展成纤维化的肺组织的风险方面是有用的。术语“气道疾病”适用于肺和呼吸道的急性或慢性的过敏性和非过敏性炎性病状。因此，例如肺病、反应性气道疾病、肺综合征、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、包括支气管狭窄和支气管痉挛的呼吸道炎性病症等疾病均涵盖在术语“气道疾病”中。
AEC或外泌体可以与抗纤维化药剂分开给药，或者可以将二者一起共同配制，或者AEC或外泌体可以携带例如在AEC中表达的重组形式或导入至外泌体中的形式等抗纤维化药剂的形式。方便地，如上所述，抗纤维化药剂为松弛素，例如人松弛素-2、或其重组形式如serelaxin(在本文中也称为RLX)、或重组松弛素的衍生物。松弛素对于接受治疗的受试者和/或对于AEC或外泌体可以是自体的、同种异体的或异种的。
松弛素的衍生物包括单B链功能性衍生物。后者的实例为如由Hossain等人(2016)Chem.Sci.7:3805-3819记载的H2-(B7-33)。松弛素的衍生物还包括其A链和B链二者的功能性截短的类似物。截短的松弛素类似物的实例为如由Hossain等人(2011)J.Biol.Chem.286:37555-37565记载的H2-(A4-24)(B7-24)。本文中还考虑了松弛素的其它衍生物，包括A链和/或B链的N-和C-末端截短物以及C-末端酰胺化的同系物、游离酸形式和焦谷氨酸类似物。
关于松弛素组分的主题方案可以可选地或者另外采用松弛素受体活化剂或激动剂。受体为RXFP1并且AEC表达RXFP1受体。受体的活化剂或激动剂包括抗RXFP1抗体、药效团或者小分子化学或蛋白质性激动剂(proteinaceous agonist)、和例如雌二醇等基于雌激素的化合物。
如本实施例中所教导的，发现AEC或羊膜外泌体与松弛素的联用比间质干细胞(MSC)与松弛素的联用更有效。AEC或外泌体和松弛素使上皮厚度正常化并且在小鼠模型中部分地逆转纤维化以及改善气道高反应性。本文中提出，例如松弛素等抗纤维化药剂提供其中可以采用基于AEC或基于羊膜的疗法的改善的环境，提高表达松弛素-2受体、RXFP1或包含RXFP1的羊膜外泌体的AEC的治疗和再生能力。进一步提出AEC的治疗益处适用于羊膜外泌体。在这一点上，可以将羊膜外泌体从羊水或胎盘组织中分离或者可以从包括永生化AEC系的AEC系中分离。这包括生物反应器的使用，从而从AEC系产生羊膜外泌体，随后将所述羊膜外泌体分离并且用于本治疗方案。
本文中还提供药剂盒，如以隔室形式包括第一隔室和第二隔室的盒，所述第一隔室包含在药学上可接受的介质中能够重构的形式的AEC或羊膜外泌体；所述第二隔室包含用于肺组织的抗纤维化药剂；其中将AEC或外泌体在使用之前在药学上可接受的介质中重构，其中将AEC和抗纤维化药剂同时地或以任一种顺序依次地给予受试者，其中受试者患有气道疾病。
本文中实现的是包含AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂以及药物载体、赋形剂和/或稀释剂的制剂。抗纤维化药剂包括松弛素。可以将松弛素与AEC或外泌体共同配制，或者松弛素可以包含在AEC或外泌体内或者在AEC或外泌体内产生。
本文中进一步考虑的是AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂组合用于制造在受试者中治疗气道疾病的药物的用途。在实施方案中，提供AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂联合用于在受试者中治疗气道疾病。
在实施方案中，抗纤维化药剂为例如如下的松弛素的形式：分离的天然存在的松弛素；重组松弛素，如serelaxin或例如H2-(B7-33)等衍生的单链松弛素[Hossain等人(2016)同上]、或例如H2-(A4-24)(B7-24)等截短的A链和B链松弛素[Hossain等人(2011)同上]。在实施方案中，松弛素受体可选地或者除了松弛素以外还由RXFP1活化剂或激动剂活化。松弛素对于接受治疗的受试者、进行安全性试验以避免排斥的受试者可以是自体的、同种异体的或异种的。
本文中使用的缩写在表1中定义。
表1
缩写
附图说明
一些图包含颜色标识或实体。彩色照片经请求可从专利权人或者从适当的专利局处获得。如果从专利局获得，则会收取费用。
图1a至c为RXFP1在AEC上的表达的照片表示。将AEC和人肾成纤维细胞(RF；阳性对照)通过免疫荧光对RXFP1染色并且将核用DAPI进行复染。AEC和hRF二者均对RXFP1具有强的细胞质染色。其中一抗由同型对照代替的阴性对照细胞中不存在染色。
图2a至e为RLX、MSC、AEC和联合治疗对AI、上皮厚度和上皮下胶原的影响的图像和图示。A)显示支气管壁内炎性细胞浸润的程度的来自所研究的各组的Masson氏三色染色的肺切片的代表性图像。比例尺＝100μm。还示出了来自5个气道/小鼠的支气管周围炎症评分(其中将切片基于炎性细胞聚集体的数量和分布在0(无可见的炎症)至4(严重的炎症)的等级上评分)的中位数+四分位数范围(B；n＝6/组)；每mL BAL液的嗜酸性细胞计数的平均值+SEM(C；n＝6组)；相对于BM长度的上皮厚度(μm2)的平均值+SEM(D；n＝6组)；和相对于BM长度的上皮下胶原厚度(μm)的平均值+SEM(E；n＝6/组)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA组；相对于OVA+RLX组；+P<0.05，++P<0.01，相对于OVA+MSC组；§P<0.05，相对于OVA+AEC组。OVA，卵白蛋白。
图3a和b为RLX、MSC、AEC和联合治疗对上皮损害的效果的图像和图示。A)显示上皮损害的程度的来自所研究的各组的胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)染色的肺切片的代表性图像。比例尺＝100μm。还示出了来自5个气道/小鼠的上皮内的TSLP阳性的细胞(由箭头指示)的数量/100μm BM长度的平均值+SEM(B；n＝6/组)。**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水组；#P<0.05，##P<0.01，相对于OVA组；+P<0.05，相对于OVA+MSC组。
图4a和b为RLX、MSC、AEC和联合治疗对杯状细胞化生的影响的图像和图示。A)显示存在于气道上皮内的杯状细胞(由箭头指示)的数量的来自各治疗组的阿辛蓝过碘酸希夫(Alcian blue periodic acid Schiff)染色的肺切片的代表性图像。比例尺＝100μm。还示出了来自5个气道/小鼠的杯状细胞计数(表示为杯状细胞的数量/100μm BM长度)的平均值+SEM(B；n＝6/组)。**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水组；#P<0.05，相对于OVA组；相对于OVA+RLX组；+P<0.05，相对于OVA+MSC组；§P<0.05，相对于OVA+AEC组；相对于OVA+MSC+RLX组。
图5为RLX、MSC、AEC和联合治疗对总肺胶原浓度的影响的图示。各小鼠的总肺胶原含量经由羟脯氨酸分析来计算然后除以所分析的相应肺切片的干重从而得到％胶原浓度。示出了来自所研究的每个组(n＝6/组)的肺胶原浓度的平均值+SEM％。***P<0.001，相对于生理盐水组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA组；++P<0.01，相对于OVA+MSC组。
图6a至d为RLX、MSC、AEC和联合治疗对气道上皮TGF-β1表达和上皮下成肌纤维细胞积聚的影响的图像和图示。显示气道上皮内的上皮TGF-β1表达和分布(A)和上皮下成肌纤维细胞积聚(C)的水平的来自各治疗组的免疫组织化学染色的肺切片的代表性图像。比例尺＝100μm(A，C)。还示出了来自5个气道/小鼠的上皮TGF-β1染色(相对于生理盐水对照组中的上皮TGF-β1染色；其表示为1)的平均值+SEM(B；n＝5-6/组)；和每100μm BM长度的上皮下成肌纤维细胞数量的平均值+SEM(D；n＝5-6/组)。*p<0.05，**p<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA组；相对于OVA+RLX组；+P<0.05，++P<0.01，相对于OVA+MSC组。
图7为RLX、MSC、AEC和联合治疗对AHR的影响的图示。通过测量响应于由雾化递送的增加剂量的支气管收缩剂乙酰甲胆碱的气道阻力(经由侵入性体积描记法(invasiveplethysmography))来评估AHR。响应表示为从基线响应至生理盐水的阻力变化。示出了来自所研究的各组(n＝6/组)的响应于各剂量的乙酰甲胆碱而测得的气道阻力的平均值±SEM。**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水组；#P<0.01，###P<0.001，相对于单独的OVA组；相对于OVA+RLX组；+++P<0.001，相对于OVA+MSC组；§§P<0.01，§§§P<0.001，相对于OVA+AEC组。用于图线的图例如下：
OVA，OVA+MSC，OVA+AEC，OVA+RLX，OVA+AEC+RLX，OVA+MSCs+RLX，生理盐水。
图8为示出来自5个气道/小鼠的支气管周围炎症评分(其中将切片基于炎性细胞聚集体的数量和分布在0(无可见的炎症)至4(严重的炎症)的等级上评分)的平均值±S.E.M的图示；来自n＝6-8只动物/组。**P<0.01,***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自AEC的外泌体(EXO)处理组；+p<0.05，相对于OVA/NA+hAEC+RLX处理组；§§P<0.01，§§§P<0.001，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图9为示出来自5个气道/小鼠的杯状细胞计数(表示为每100mm基底膜(BM)长度的杯状细胞的数量)的平均值±S.E.M的图示；n＝6-8只动物/组。**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；相对于OVA/NA+25μg源自hAEC的EXO处理组；+p<0.05，相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的EXO+RLX处理组；+p<0.05，相对于OVA/NA+hAEC+RLX处理组；§§P<0.01，§§§P<0.001，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图10为示出来自5个气道/小鼠的TSLP染色的细胞计数(每100μm基底膜(BM)长度)的平均值±S.E.M的图示；n＝8只动物/组。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；§§§P<0.001，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图11为示出来自5个气道/小鼠的(A)上皮厚度(μm2；相对于基底膜(BM)长度)和(B)上皮下ECM厚度(μm；相对于BM长度—纤维化的量度)的平均值±S.E.M的图示；n＝8只动物/组。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；相对于OVA/NA+25μg源自hAEC的EXO处理组；§P<0.05，§§§P<0.001，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图12为示出总肺胶原浓度(％肺胶原含量/组织干重—纤维化的量度)的平均值±S.E.M的图示；来自n＝7-8只动物/组。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；相对于OVA/NA+25μg源自hAEC的EXO处理组；§P<0.05，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图13为示出来自5个气道/小鼠的TGF-β1染色(表示为每个所分析的区域的％染色)的平均值±S.E.M的图示；n＝7-8只动物/组。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；+p<0.05，相对于OVA/NA+25μg源自hAEC的EXO处理组；§§§P<0.001，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图14为示出来自5个气道/小鼠的上皮下区域(每100μm基底膜(BM)长度)中的α-平滑肌肌动蛋白染色的成肌纤维细胞的数量的平均值±S.E.M的图示；n＝5-8只动物/组。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；+p<0.05，++p<0.01，相对于OVA/NA+25μg源自hAEC的EXO处理组；§§P<0.01，§§§P<0.001，相对于OVA/NA+RLX处理组。
图15为示出所评价的各种组对气道高反应性(AHR)的影响的图示。响应于增加剂量的雾化的乙酰甲胆碱(支气管收缩剂)，经由侵入性体积描记法来评估气道阻力(反映AHR的变化)。结果表示为从基线的阻力变化。示出了对所测试的各剂量的乙酰甲胆碱的气道阻力的平均值±S.E.M.(n＝5只动物/组)。包括hAEC+重组人松弛素(RLX)或单独的RLX的影响用于比较。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于OVA/NA处理的慢性过敏性气道疾病(AAD)组；相对于OVA/NA+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；+p<0.05，++p<0.01，相对于OVA/NA+25μg源自hAEC的EXO处理组；§P<0.05，§§P<0.01，相对于OVA/NA+RLX处理组。
OVA/NA(5)，OVA/NA+5μg EXO(5)，OVA/NA+25μg EXO(5)；
OVA/NA+RLX(5)，OVA/NA+hAEC+RLX(5)，OVA/NA+5μgEXO+RLX(5)，OVA/NA+25μg EXO+RLX(5)，生理盐水/CO(5)
图16为示出来自n＝7只动物/组的来自5个视野/小鼠的每个视野的间质性纤维化的平均值±S.E.M％的图示。***P<0.001，相对于生理盐水(SAL)处理的未损伤对照组；###P<0.001，相对于博来霉素(BLM)处理的肺纤维化组。
图17为示出来自5个气道/小鼠的上皮下ECM厚度(μm；相对于BM长度)的平均值±S.E.M的图示；n＝7只动物/组。*p<0.05，***P<0.001，相对于生理盐水(SAL)处理的未损伤对照组；##P<0.01，###P<0.001，相对于博来霉素(BLM)处理的肺纤维化组；相对于BLM+5μg源自hAEC的外泌体(EXO)处理组；+p<0.05，相对于BLM+25μg源自hAEC的EXO处理组； 相对于BLM+吡非尼酮处理组。
图18为来自5个气道/小鼠的支气管周围炎症评分(其中将切片基于炎性细胞聚集体的数量和分布在0(无可见的炎症)至4(严重的炎症)的等级上评分)的平均值±S.E.M％的图示；来自n＝6-8只动物/组。*p<0.05，***P<0.001，相对于生理盐水(SAL)处理的未损伤对照组；##p<0.01，###P<0.001，相对于博来霉素(BLM)处理的肺纤维化组；+p<0.05，++p<0.01，相对于BLM+hAEC+RLX处理组。
具体实施方式
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”或者例如“包含(comprises)”或“包括(comprising)”等变体将理解为暗示包括所规定的要素、整数或方法步骤或者要素、整数或方法步骤的组，但是不排除任何其它要素、整数或方法步骤或者要素、整数或方法步骤的组。
如在本说明书中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数方面。因此，例如，提及“细胞(a cell)”包括单个的细胞以及两个以上的细胞；提及“气道疾病”包括提及气道疾病的一种或多种具体疾病形式以及气道疾病的一种或多种症状；提及“本公开”包括由本公开教导的单个或多个方面；等。本文中教导和实现的方面由术语“发明”涵盖。所有这样的方面均在本发明的范围内实现。本文中考虑的任何变体和衍生物由本发明的“形式”涵盖。
在提供一系列的数值的情况下，应当理解的是，除非上下文另有明确说明，在范围的上限和下限与所述范围内的任何其它规定的值或中间值之间的各中间值直到下限的单位的十分之一涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地包括在也涵盖在本发明内的较小的范围内，受限于所述范围中的任意具体排除的界限。在所述范围包括界限中的一者或二者的情况下，排除那些所包括的界限中的任一者或二者的范围也涵盖在本发明中。涉及两种以上的药剂(例如细胞、外泌体或治疗剂实体)的术语“给药”意指同时地或以任一种顺序依次地给予药剂。术语“同时地”包括但是不限于当一种药剂(例如细胞或外泌体)包含另一种例如治疗剂实体等药剂时。
通常，将在本领域技术范围内的细胞培养、干细胞生物学和重组DNA技术的常规方法用于开发本发明。这样的技术在文献中有全面的解释，参见，例如Maniatis,Fritsch&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Sambrook、Russell和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2001)；Harlow、Lane和Harlow，Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I,Cold SpringHarbor Laboratory(1998)；以及Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory(1988)。
主要参考气道疾病(AD)和改善纤维化随后发展为肺的损伤或疾病的可能性的疗法来描述本发明。本发明旨在涵盖抗纤维化药剂与AEC或羊膜外泌体组合使用从而治疗气道疾病。
用于实施例的各种术语的缩写在表1和具体实施方式中定义。在具体实施方式中使用完整的术语或缩写。
术语“气道疾病”意指由气道炎症(AI)、气道重塑(AR)和/或气道高反应性(AHR)的症状导致或由于所述症状而加重或者具有所述症状的急性或慢性呼吸性肺部病症。术语“气道疾病”及其缩写“AD”涵盖肺病、反应性气道疾病、肺综合征、以及包括支气管狭窄和支气管痉挛病状的呼吸道炎性病症。这些在本质上或原因上可以为过敏性或非过敏性的。气道疾病的实例为过敏性气道疾病(AAD)或反应性气道疾病(RAD)。气道疾病包括哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征(RADS)。这不是旨在由术语“气道疾病”涵盖的病状的穷举的列表。本发明扩展至具有气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种组分的呼吸道和肺部病状。在实施方案中，气道疾病为可以是或可以不是基于过敏的炎性气道疾病。如上所述，气道疾病可以为急性或慢性的。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指在受试者中的任何治疗性干预，其包括：(i)预防，就使临床症状不发展而言；(ii)抑制，就阻止临床症状的发展而言；和/或(iii)缓解，就引起临床症状的消退而言。在实施方案中，目的在于改善例如气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性等气道疾病的病状或症状。最终，目的在于预防、降低肺或呼吸道组织的纤维化的风险、或者减轻肺或呼吸道组织的纤维化的发展。呼吸道包括气道。
术语“治疗有效量”意指足以提供包括改善气道疾病状况的症状的治疗的剂量。这将根据要治疗的受试者、疾病和/或疾病的症状、递送的方法、和期望的临床结果而变化。一个主要的结果为炎症减少的气道重塑的减少和降低的纤维化的发生率或风险或者纤维化的影响的减轻。在实施方案中，松弛素的有效量为1μg～10,000μg/kg/受试者/剂量。这包括每天、每2-3天、每周或每月。在1μg与10,000μg之间(包括1μg和10,000μg)的任何量均由本发明涵盖。
本发明以用于气道疾病及其各种临床表现和症状的治疗的治疗方案的开发为基础，所述临床表现和症状包括但不限于炎症、支气管狭窄和/或支气管痉挛，并且最终纤维化、气道重塑和气道高反应性。治疗方案包括对需要治疗性干预的受试者给予：
(A)(i)AEC；或
(ii)羊膜外泌体；和
(B)抗纤维化药剂。
可以同时地或以任一种顺序依次地给药。这包括当抗纤维化药剂包含在AEC或外泌体内或者在AEC或外泌体内产生时。
在实施方案中，抗纤维化药剂为松弛素或者其重组体或功能性衍生物形式。在Samuel等人(2017)British Journal of Pharmacology 174:962-976中总结了松弛素的抗纤维化作用。AEC或外泌体与抗纤维化药剂可以以任一种顺序提供，或者同时或在数秒内、数分钟内或数小时内共同给药，或者一起共同配制(例如包含在AEC或外泌体内或者在AEC或外泌体内产生的松弛素)。在Sterzenbach等人(2017)Molecular Therapy 25(6):1269-1278、Ha等人(2016)Acta PharmaceuticaSinicaB 6(4):287-296、以及WO 2014/168548和其中的参考文献中提供了用于在外泌体中产生或包含例如蛋白质等生物制品的一般方法。
术语“松弛素”意指人松弛素，包括完整的全长松弛素或者保留生物活性的松弛素分子的一部分[如美国专利No.5,023,321中所记载；在实施方案中，重组人松弛素(H2)]和其它具有类松弛素活性的活性剂如松弛素样因子(如美国专利No.5,911,997在SEQ IDNOS:3和4处以及第5栏第27行～第6栏第4行中所记载)，松弛素、保留生物活性类似物的部分和保留生物活性的部分(如美国专利No.5,811,395在SEQ ID NOS:1和2处以及第3栏第16-40行中所记载)，和从受体竞争性地置换结合的松弛素的药剂，包括Agoulnik等人(2017)British Journal of Pharmacology 174:977-989中记载的那些。松弛素可以通过例如美国专利No.4,835,251和美国专利Nos 5,464,756中记载的本领域技术人员已知的任意方法来制得。术语“松弛素-2”意指H2松弛素。松弛素的衍生物形式由Hossain等人(2011)同上和Hossain等人(2016)同上描述。
本文中进一步考虑的是RXFP1(形式上为LGR7)活化剂的用途。如本文中所使用的术语“RXFP1”和“LGR7”是指作为由松弛素H2(也称为松弛素-2)活化的G蛋白偶联受体的相同的实体，如Ivell(2002)Science 295:637-638中所记载。因此，本文中教导包括对需要治疗性干预的受试者同时地或以任一种顺序依次地给药的治疗方案：
(A)(i)AEC；或
(ii)羊膜外泌体；和
(B)抗纤维化药剂和/或抗纤维化药剂经由其作用于细胞的受体的活化剂或激动剂。
在实施方案中，抗纤维化药剂为松弛素或者其重组体或衍生物形式，并且活化剂或激动剂作用于RXFP1。
如本文中所使用的术语“RXFP1活化剂”包括任意如下分子，所述分子具有以与松弛素相同的方式活化RXFP1的能力，即，如本文中的方法所述的在与AEC或羊膜外泌体一起给药时提供与松弛素类似的抗纤维化响应的活化。RXFP1活化剂包括但是不限于小分子、肽模拟物、药效团、或活化的抗RXFP1抗体、以及例如雌二醇等基于雌激素的化合物。
与AEC或其外泌体组合使用的药物包括“药效团”。本发明的药效团通过与松弛素要结合的RXFP1的表位的相互作用来模拟松弛素活性。因此，本发明的药效团具有基本上如由松弛素:RXFP1复合物定义的形状(即几何规定)和电化学特性。术语药效团涵盖肽、肽类似物和小的化学分子。松弛素的其它衍生物包括松弛素类似物和松弛素模拟物(例如参见WO 96/40185；WO 96/40186；Patil等人(2017)British Journal of Pharmacology 174(10):950-961)。
在不旨在将本发明限于任何理论或作用模式的情况下，本发明部分基于松弛素通过其G蛋白偶联受体(RXFP1)[记载于Hsu等人(2002)Science 295:671-674中]提高AEC或羊膜外泌体的修复效果的发现。这提高了整体抗纤维化效果并且促进由气道疾病导致的肺和呼吸组织中的再生反应。
因此，在实施方案中，本文中教导通过如下给药来治疗包括气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性的临床表现的气道疾病的治疗方案：
(A)(i)AEC群体；或
(ii)羊膜外泌体；和
(B)松弛素或者其重组形式或其功能性衍生物，任选与RXFP1活化剂或激动剂一起。
在实施方案中，气道疾病为过敏性气道疾病或反应性气道疾病。在实施方案中，气道疾病为哮喘、过敏性鼻炎、COPD、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染、反应性气道功能障碍综合征、或其症状。在实施方案中，治疗是为了预防或降低包括呼吸道组织的肺组织的纤维化发展的风险或者减轻其影响。
因此，本文中实现的是用于在受试者中治疗气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮干细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中进一步教导在受试者中用于治疗过敏性气道疾病或反应性气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮干细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中还进一步教导用于在受试者中治疗选自包括哮喘、过敏性鼻炎、COPD、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征或由所述疾病组成的列表的气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中又进一步教导用于在受试者中治疗哮喘的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮干细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中实现的又一方面是用于在受试者中预防包括呼吸组织的肺组织的纤维化的发展或减轻其影响的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。提及“减轻(mitigating)”或“减轻(mitigation)”包括症状的逆转和改善。在实施方案中，本文中教导用于在受试者中逆转或改善包括呼吸组织的肺组织的纤维化的发展的症状和影响的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
在实施方案中，抗纤维化药剂为可以减少包括呼吸道组织的肺组织的纤维化的药剂。实例为松弛素(特别是松弛素-2或H2松弛素)、其重组形式(例如serelaxin)或者例如单B链衍生物等松弛素的功能性衍生物或变体。后者的实例为H2-(B7-33)[Hossain等人(2016)同上]。其它衍生物包括例如H2-(A4-24)(B7-24)等截短的A链和B链形式。又一些其它衍生物包括B链N-末端截短物、B链C-末端截短物、B链N-和C-末端截短物、C-末端酰胺化的同系物、游离酸类似物和焦谷氨酸类似物。在Hossain等人(2011)同上和Hossain等人(2016)同上中记载了这些衍生物。另一些其它衍生物包括例如WO 96/40185和WO 96/40186中记载的类似物和变体。也可以将松弛素或其各种形式与RXFP1活化剂或激动剂一起给药。虽然松弛素对于接受治疗的受试者通常是自体的或同种异体的，但是在适当的安全性试验的情况下，可以使用异种的松弛素，即来自一个物种的松弛素用于另一物种。这也适用于AEC或外泌体与松弛素之间的关系。
本文中实现的是用于在受试者中治疗气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与松弛素、其重组形式、或其功能性衍生物一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中进一步教导用于在受试者中治疗过敏性气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与松弛素、其重组形式、或其功能性衍生物一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中还进一步教导用于在受试者中治疗选自包括哮喘、过敏性鼻炎、COPD、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征或由所述疾病组成的列表的气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与松弛素、其重组形式、或其功能性衍生物一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中又进一步教导用于在受试者中治疗哮喘的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与松弛素、其重组形式、或其功能性衍生物一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
本文中实现的又一方面是用于在受试者中预防包括呼吸组织的肺的纤维化的发展或减轻其影响的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与松弛素、其重组形式、或其功能性衍生物一起给予受试者，治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。这方面包括肺纤维化如特发性肺纤维化。
如上所述，气道疾病哮喘、过敏性鼻炎、COPD、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征的列表不旨在穷举。仍然如上所述，也可以将松弛素或其各种形式与RXFP1活化剂或激动剂一起使用。治疗有效量的药学活性的松弛素的给药使得AEC和羊膜外泌体的修复性提高，其使得响应于气道疾病和因而引起的肺损害的重塑减少。
在实施方案中，提供用于促进或增强肺组织愈合以及纤维化的预防或减少的方法。将有效量的例如松弛素等药学活性的抗纤维化药剂与AEC或外泌体一起给予有需要的受试者，当与适当的对照相比时，在受试者中促进肺组织愈合至少约10％～100％，例如，当与适当的对照相比时，肺中的纤维组织的量降低至少约10％～100％。表达“约10％～100％”意指10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100。松弛素与AEC或羊膜外泌体组合以促进肺组织愈合的疗效可以使用本领域已知的任意方法来确定，所述方法包括肺组织病理学、包括呼吸的效力(efficacy of breathing)的各种其它测定、以及生物化学标志物。
本发明的方法适合于治疗如下受试者个体：已经被诊断患有可以导致进行性肺纤维化的疾病的受试者个体、疑似患有与进行性肺纤维化相关的疾病的受试者个体、已知易感和被认为很可能发展成与进行性肺纤维化相关的疾病的受试者个体、或者被认为很可能发展成与进行性肺纤维化相关的先前治疗的疾病的复发的受试者个体。此外，尽管人类受试者为主题治疗方案的主要受益者，但是方案适用于可能患有运动诱导的肺出血的例如马、犬和骆驼等竞技动物。可以采用自体的、同种异体的或异种的AEC、外泌体或松弛素进行适当的安全性试验从而使排斥最小化。在实施方案中，使用AEC外泌体和松弛素的自体的或同种异体的形式。
现有的证据显示纤维化与各种各样的气道疾病中的肺病进程相关，所述气道疾病包括哮喘、过敏性鼻炎、COPD、包括特发性肺纤维化和其它间质性肺病的肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征。主题治疗方案采用抗纤维化药剂如松弛素或者其重组体或功能性衍生物形式，从而提高AEC或羊膜外泌体的修复性。因此，在抗纤维化药剂与AEC或外泌体之间存在协同作用。协同作用扩展至RXFP1活化剂或激动剂的另外的或可选的用途。这样的药剂包括抗RXFP1抗体、药效团、小的化学分子和例如雌二醇等基于雌激素的化合物。
与适当的对照相比，气道疾病的治疗可以通过测量指示疾病的进程的一种或多种诊断参数来确定。对于与动物模型的比较，“适当的对照”为未用松弛素或其它抗纤维化药剂与AEC或羊膜外泌体治疗的动物、或者用没有这些组分中的一种或另一种或者没有任一组分的药物制剂治疗的动物。在人类受试者的情况下，“适当的对照”可以为治疗前的个体，或者可以为用安慰剂治疗的人类(例如，年龄匹配的或类似的对照)。
要通过本发明的方法治疗的气道疾病可能是由于与肺成纤维细胞增殖或者通过肺成纤维细胞对细胞外基质蛋白合成的活化相关的各种各样的疾病所导致的。在本发明中可以有效地治疗这些疾病。这样的疾病包括哮喘、过敏性鼻炎、COPD、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征。
可以将抗纤维化药剂和AEC或羊膜外泌体分开地、同时地或依次地保持和给药，或者在给药之前共同配制。可选地，AEC或外泌体可以包含抗纤维化药剂的形式。例如，可以将AEC遗传工程改造从而产生重组松弛素或其衍生物形式。可以将外泌体操控为包封松弛素、其重组形式、或松弛素的衍生物。
本发明的制剂为包含治疗有效量的药学活性的松弛素或其它抗纤维化药剂与AEC或羊膜外泌体以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂的药物制剂。抗纤维化药剂和AEC或外泌体可以在相同的制剂中共同给药或者在分开的制剂中同时地或依次地给药，或者可以将AEC遗传工程改造从而表达例如松弛素等抗纤维化药剂。此外，可以将外泌体操控为包含抗纤维化药剂。如本文中所述，抗纤维化药剂的实例为松弛素。为简洁起见，对于以下描述，除非另有说明，术语“松弛素”包括其重组形式或功能性衍生物。
因此，本文中实现的是包含AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的制剂。在实施方案中，本文中实现的是包含AEC或羊膜外泌体与松弛素以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的制剂。在实施方案中，本文中教导包含羊膜外泌体与例如松弛素等抗纤维化药剂以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的制剂。在实施方案中，如本文中在前定义的，制剂在本发明的方法中用于治疗气道疾病。
松弛素，作为抗纤维化蛋白质性分子的实例，可以作为多肽来给药，或者可以在AEC中从包含编码松弛素的序列的多核苷酸表达。适用于本发明的方法的松弛素可以从天然来源分离，可以化学合成或酶促合成，或者使用本领域已知的标准重组技术来产生。在包括例如美国专利Nos.4,835,251；5,326,694；5,320,953；5,464,756；和5,759,807的各种公布文本中可找到制备重组松弛素的方法的实例。
适合于使用的松弛素包括但是不限于人松弛素、重组人松弛素、例如猪松弛素等源自非人类哺乳动物的松弛素、和本领域已知的松弛素的任何各种各样的变体。松弛素、药学活性的松弛素变体和包含松弛素的药物制剂是本领域公知的。参见，例如美国专利Nos.5,451,572；5,811,395；5,945,402；6,780,836；6,723,702；5,166,191；和5,759,807。通常，重组人松弛素(serelaxin)在氨基酸序列方面与包括24个氨基酸的A链和29个氨基酸的B链的人H2基因的天然存在的产物相同。松弛素的有效量包括1～10,000μg/kg/受试者。这包括1μg/kg/受试者～1,000μg/kg/受试者。这包括10μg/kg/受试者～800μg/kg/受试者或者在任意这些范围之间的量。剂量可以为每天、每周或每月。
编码松弛素的核苷酸序列是本领域已知的并且可以用于AEC(例如GenBankAccession Nos.AF135824；AF076971；NM.sub.--006911；和NM.sub.—005059)。可以将本发明的松弛素多核苷酸和多肽通过基因递送载体导入至AEC中。基因递送载体可以为病毒来源或非病毒来源的(通常参见，Jolly(1994)Cancer Gene Therapy 1:51-64；Kimura(1994)Human Gene Therapy 5:845-852；Connelly(1995)Human Gene Therapy 1:185-193；和Kaplitt(1994)Nature Genetics 6:148-153)。可以将用于包括本发明的多核苷酸的编码序列的构建体的递送的基因治疗载体局部或全身给药。这些构建体可以利用病毒载体方法或非病毒载体方法。这样的编码序列的表达可以使用内源性哺乳动物启动子或异源性启动子来诱导。编码序列的表达可以为组成型的(constitutive)或调控型的(regulated)。
本发明可以采用构建为在AEC中携带或表达所选择的感兴趣的核酸分子的重组逆转录病毒。可以采用的逆转录病毒载体包括EP 415 731；WO 90/07936；WO 94/03622；WO93/25698；WO 93/25234；美国专利No.5,219,740；WO 93/11230；WO 93/10218；Vile和Hart(1993)Cancer Res.53:3860-3864；Vile和Hart(1993)Cancer Res.53:962-967；Ram等人(1993)Cancer Res.53:83-88；Takamiya等人(1992)J.Neurosci.Res.33:493-503；Baba等人(1993)J.Neurosurg.79:729-735；美国专利No.4,777,127；和EP 345,242中记载的那些。
基因递送载体还可以采用例如腺相关病毒(AAV)载体等细小病毒。代表性实例包括由Srivastava在WO 93/09239中；Samulski等人(1989)J.Vir.63:3822-3828；Mendelson等人(1988)Virol.166:154-165；和Flotte等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10613-10617公开的AAV载体。
还感兴趣的是腺病毒载体，例如由Berkner(1988)Biotechniques 6:616-627；Rosenfeld等人(1991)Science 252:431-434；WO 93/19191；Kolls等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219；Kass-Eisler等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11498-11502；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655记载的那些。
可以采用其它基因递送载体和方法，包括与单独的灭活的腺病毒连接或未连接的聚阳离子浓缩DNA，例如Curiel(1992)Hum.Gene Ther.3:147-154；配体连接的DNA，例如参见Wu(1989)J.Biol.Chem.264:16985-16987；真核细胞递送载体细胞；光聚合水凝胶材料的沉积；手持式基因转移粒子枪(hand-held gene transfer particle gun)，如美国专利No.5,149,655中所记载；如美国专利No.5,206,152中和WO 92/11033中记载的电离辐射；核电荷中和或与细胞膜的融合。另外的方法记载于Philip(1994)Mol.Cell Biol.14:2411-2418和Woffendin(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:1581-1585中。
适合于使用的其它非病毒递送包括机械递送系统如Woffendin等人(1994)同上中记载的方法。这种方法可以用于将松弛素蛋白导入至外泌体。此外，可以将编码序列和其表达的产物通过光聚合水凝胶材料的沉积来递送。可以用于编码序列向AEC的递送的用于基因递送的其它常规方法包括，例如，手持式基因转移粒子枪的使用，如美国专利No.5,149,655中所记载；用于将转移的基因活化的电离辐射的使用，如美国专利No.5,206,152和PCTNo.WO 92/11033中所记载。
还可以在外泌体或AEC内引入松弛素。参见，例如，WO2014/168548。
包含AEC或羊膜外泌体的药物组合物与抗纤维化药剂(例如松弛素[或者包含抗纤维化药剂的AEC或外泌体])一起或分开给药可以通过本领域技术人员已知的任何方便的手段来进行。给药的途径包括但不限于经呼吸道(respiratorally)、鼻内、气管内、经鼻咽、静脉内、腹膜内、胸腔内、皮下、皮内、肌内、眼内、鞘内、经直肠、和通过缓慢或持续释放的植入物。
适合于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液。
以分散液形式的无菌可注射溶液通常通过将各种灭菌的活性成分引入至包含羊膜外泌体的无菌溶媒中来制备。
对于肠胃外给药，可以将活性组分与药物载体配制并且作为混悬剂给药。适当的载体的说明性实例为水、生理盐水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇、或者动物来源、植物来源或合成来源的油。载体还可以包含其它成分，例如，防腐剂和缓冲剂等。当将活性组分鞘内给药时，也可以在脑脊液中配制它们。
本发明的活性组分还可以以可以在一段时间在内部递送外泌体的持续递送或持续释放机制来给药。例如，能够持续递送羊膜外泌体的可生物降解的微球或胶囊或者其它可生物降解的聚合物构型可以包括在本发明的制剂中(例如Putney和Burke(1998)NatBiotech 16:153-157)。
在制备本发明的药物组合物时，可以使用各种各样的制剂技术并且对其进行操控从而改变生物分布。用于改变生物分布的许多方法对于本领域普通技术人员是已知的。这样的方法的实例包括保护包含例如蛋白质、脂质(例如，脂质体)、碳水化合物、或合成聚合物等物质的囊泡中的外泌体。对于药物代谢动力学的一般讨论，参见，例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 21st ed.(2006)。
通常，松弛素的剂量，与AEC或外泌体同时地或依次地，可以为每天或每周约0.1～500μg/kg体重。这样的量包括每天或每周或者如由医师确定的这样的其它间隔为0.1、0.5、1、6、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μg/kg。在实施方案中，期望获得等于或超过约1.0ng/ml、约0.5ng/ml～约50ng/ml、约1ng/ml～约20ng/ml的松弛素的血清浓度。对于对70kg的人的给药，剂量可以在每天约2μg～约2mg、每天约10μg～500μg、或每天约50μg～约100μg的范围内。当然，给予的松弛素的量将取决于受试者和痛苦的严重性、给药的方式和时间表、另外递送的AEC或外泌体的数量、和处方医师的判断。
RXFP1与松弛素形成具有特定的分子相互作用的复合物，并且适配该几何和化学描述的药效团可以用于本方法从而在RXFP1-松弛素界面处将RXFP1活化。在本发明的目前描述的方法中，可以使用这些活化剂代替松弛素或者除了松弛素以外还可以使用这些活化剂。鉴定本发明的药效团要求模拟包含RXFP1上的松弛素结合位点的残基的正像(positiveimage)的小分子和肽等的鉴定。成功的化合物结合至RXFP1、活化并且由此产生与在松弛素给药时看到的那些类似的效果。
作为RXFP1活化药效团的候选分子可以涵盖许多化学类别，包括但不限于肽和小分子。候选药效团可以包含与蛋白质的结构相互作用所需的官能团，特别是氢键，并且通常包括至少胺、羰基、羟基或羧基，通常至少两个官能性化学基团。候选药效团经常包含用以上官能团中的一种或多种取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或多芳香族结构。还在包括但不限于多核苷酸、肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合的生物分子之中发现候选抑制剂药效团。
候选RXFP1活化药效团可以从包括合成的或天然化合物的文库的广泛的各种来源获得。例如，许多手段可用于广泛的各种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，包括随机化的寡核苷酸和寡肽的表达。可选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库是可获得的或者容易产生的。此外，天然的或合成产生的文库和化合物通过常规的化学的、物理的和生物化学的手段来容易地修饰，并且可以用于产生组合文库。可以将已知的药理学相关的构架(scaffold)进行例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等定向的或随机的化学修饰从而产生结构类似物。
参与松弛素-RXFP1复合物形成的蛋白质的结构方面的鉴定可以定义在设计调节复合物中分子和/或蛋白质:蛋白质相互作用的药效团的试验中要使用的三级结构。具体地，具有特定的三级结构的化合物(小分子、肽等)的数据集可以使用例如药物化学、组合化学和分子建模等本领域已知的技术来鉴定，从而确定很可能结合至参与RXFP1与松弛素的结合的蛋白质的原子或原子团的分子。任选地，还可以考虑例如疏水性和亲水性、和官能性残基在结构基序(structural motif)中的布置等因素。
在本发明的试验的实施方案中，所述试验涉及：(1)将文库中的化合物与关于空间定向的结合位点匹配；(2)使用计算机生成的分子显示软件目视筛选候选化合物；和(3)在存在和不存在松弛素的情况下针对RXFP1实验性地筛选实际的化合物从而确定通过LGR7提高信号传导活性的化合物。
一旦鉴定了靶蛋白的官能性残基，分子的该部分可以用作用于与例如，如Available Chemicals Database(ACD，Molecular Design Labs，1997)等数据库中的已知的分子的比较的模板，或者其可以用于从头设计分子。在一个实例中，所鉴定的分子的初始组可以包含数万或数十万以上的不同的非肽有机化合物。不同的或补充的组可以包含可以在化学反应中或者经由细菌或噬菌体合成产生的数百万的不同的肽。大的肽文库和制备其的方法在通过参考引入本文的于1993年11月30日发布的美国专利No.5,266,684和于1995年5月30日发布的美国专利No.5,420,246中公开。非肽有机分子的文库在PCT公开WO96/40202中公开。
分子的初始文库经由计算机生成的建模(modeling)来筛选，例如将化合物的计算机模型与在RXFP1上的松弛素配体结合位点的计算机模型匹配从而找出模拟松弛素表位的空间取向和基本结构的分子。相对于初始组，该筛选应当大幅度地减少候选分子的数量。
然后使用产生分子的可视图像的适当的计算机程序将所筛选的组目视地进行进一步的筛选。然后实际测试所得候选分子的提高松弛素-RXFP1复合物形成和使得RXFP1活化的能力。
本文中进一步教导以隔室形式包括第一隔室和第二隔室的药剂盒，所述第一隔室包含可以在药学上可接受的介质中重构的形式的AEC或羊膜外泌体，所述第二隔室包含用于肺组织的抗纤维化药剂；其中将AEC或外泌体在使用之前在药学上可接受的介质中重构，其中将AEC和抗纤维化药剂同时地或以任一种顺序依次地给予受试者，其中受试者患有气道疾病。
在实施方案中，抗纤维化药剂为松弛素(松弛素-2)、或者其重组形式如serelaxin或功能性衍生物形式(例如，单B链衍生物如H2-(B7-33)，或者例如H2-(A4-24)(B7-24)等A链和B链截短物)。如Hossain等人(2011)同上和Hossain等人(2016)同上中所记载，本文中考虑松弛素的其它衍生物。可选地，AEC或外泌体包含松弛素。
本发明还考虑AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂组合用于制造在受试者中治疗气道疾病的药物的用途。如上所述，如前文所述，抗纤维化药剂的实例为松弛素。
这里还教导AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂用于在受试者中治疗气道疾病。如上，抗纤维化药剂的实例为松弛素或者其重组体或衍生物形式。松弛素或其形式的作用还可以通过如上讨论的RXFP1活化剂或激动剂的使用来增强。
尽管在羊膜外泌体的替代物中提及AEC，但是本发明不排除共同配制或共混的AEC和外泌体以根据主题治疗方案使用。
羊膜外泌体可以方便地从培养AEC的生物反应器获得。可以在不同的妊娠阶段分离AEC，产生具有不同的修复性或光谱(spectra)的羊膜外泌体。AEC或外泌体对于接受治疗的受试者可以是自体的、同种异体的、或者在一些情况下，如果可以使排斥最小化，则可以是异种的。
尽管使用AEC或羊膜外泌体与例如松弛素等抗纤维化药剂来治疗气道疾病的益处，但是本公开扩展至使用MSC与例如松弛素等抗纤维化药剂来治疗这些病状。因此，本公开扩展至在受试者中治疗气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的间质干细胞(MSC)与抗纤维化药剂一起给予受试者，治疗在改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。在实施方案中，抗纤维化药剂为松弛素。
使用MSC治疗的气道疾病如本文中所公开。本文中还教导了当用于治疗气道疾病时包含MSC和例如松弛素等抗纤维化药剂的制剂。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步描述本文中公开的方面。
材料和方法
动物
6～8周龄的雌性Balb/c小鼠从Monash Animal Services(Monash University，Clayton，Victoria，Australia)获得并且在受控的环境下、在12小时光照/12小时黑暗的照明周期、在自由获取水和实验室食物(Barastock Stockfeeds，Pakenham，Victoria，Australia)的情况下饲养。在任何实验之前，为所有小鼠提供4～5天的适应期。
慢性AAD的诱导
为了在慢性AAD中评估MSC、AEC和RLX(serelaxin)的单独效果对联用效果，在小鼠(n＝36)中建立卵白蛋白(OVA)诱导的AAD的慢性模型。在第0天和第14天，将小鼠用10μg的V级鸡蛋OVA(Sigma-Aldrich，MO，USA)和在500μl的0.9％w/v标准生理盐水溶液(BaxterHealth Care，NSW，Australia)中的400μg的硫酸铝钾佐剂(明矾；AJAX Chemicals，NSW，Australia)的两次腹膜内注射来致敏。然后通过使用超声雾化器(Omron NE-U07；Omron，Kyoto，Japan)在第21天与第63天之间一周三次全身吸入暴露(雾化)于气雾化的OVA(在0.9％w/v标准生理盐水中为2.5％w/v)30分钟来激发(challenge)它们。给予对照小鼠(n＝6)500μl 0.9％w/v生理盐水的腹膜内注射并且用0.9％w/v生理盐水代替OVA来雾化。
干细胞和/或RLX的鼻内治疗
在第64天(完成慢性AAD模型的诱导后1天)，将小鼠用异氟烷(Baxter HealthCare，NSW，Australia)轻度麻醉并且在进行适当治疗的鼻内给药的同时保持在半仰卧位。在两周时间内从第64天至第77天对小鼠给予以下治疗：单独的OVA：在两周治疗期内在第64天和第71天使用自动移液管使小鼠(n＝6)接受50μL的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS；用于MSC和AEC的溶媒)(每个鼻孔25μL)；并且用作损伤对照组。
单独的RLX：小鼠(n＝6)在两周治疗期(从第64天至第77天)内经由鼻内递送(Royce等人(2014)同上；Royce等人(2015)Stem Cell Res.15:495-505)每天接受50μL(每个鼻孔25μL)的0.8mg/mL(等同于0.5mg/kg/天)RLX溶液(Corthera Inc，San Carlos，CA，USA；Novartis Pharma AG，Basel，Switzerland的子公司)。
单独的MSC：将MSC(来自Tulane Center for Stem Cell Research andRegenerative Medicine；New Orleans，LA，USA；从n＝3～4个健康供体合并)如前所述进行表征和培养(Wise等人(2014)am.J.Phyisol.Renal Physiol.306:F1222-F1235)；并且使用在第3代与第6代之间的MSC用于所概述的研究。在给药之前，将1×106个MSC在50μL的PBS中重悬并且每周一次鼻内给予小鼠(n＝6)；在两周治疗期的第64天和第71天，每个鼻孔25μL(Royce等人(2015)同上)。
单独的AEC：获得AEC(来自足月胎盘；从2～3个独立的供体合并；并且预先进行表征[Murphy等人(2010)Curr.Prot.Stem Cell Biol.chapter 1,Unit 1E6])并且在用于包含10％v/v FBS的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)/F-12培养基中之前将其过夜重构(一旦从保存在液氮中解冻)。将1×106个AEC重悬在50μL的PBS中，并且如以上对小鼠的MSC治疗的详述，在第64天和第71天给予第四子组的小鼠(n＝6)。
联合治疗：两个另外的子组的小鼠(n＝6/组)在两周治疗期内接受MSC和RLX或者AEC和RLX的鼻内给药(如以上对各治疗的描述)。在各情况下，在MSC或AEC给药之前约15～20分钟给予RLX。
侵入性体积描记法
在第78天(PBS或详述的各种治疗的最后鼻内给药之后24小时)，将小鼠用10mg/kg的氯胺酮和2mg/kg BW的甲苯噻嗪(在0.9％w/v生理盐水中)的腹膜内注射来麻醉。然后进行气管造口术，然后将麻醉的小鼠放置在Buxco Fine Pointe体积描记器(Buxco，ResearchSystems，Wilmington，NC，USA)的腔室中。然后，响应于经气管内递送、5次剂量为3.125～50mg/ml以引起支气管收缩的增加剂量的雾化的乙酰基-β-甲基胆碱氯化物(乙酰甲胆碱；Sigma Aldrich，MO，USA)，测量各小鼠的气道阻力(反映AHR的变化)。将通过将在各剂量后的最大阻力减去基线阻力(仅PBS)来计算的气道阻力的变化对所评价的乙酰甲胆碱的各剂量作图。
支气管肺泡灌洗(BAL)和组织收集
在侵入性体积描记法之后，通过将3×0.5mL灌洗液与冰冷的PBS合并来收集BAL液并且在-80℃下将其保存在300μL的5％v/v FBS中。然后将肺组织分离并且在分成4个分开的叶之前在冷PBS中漂洗。将最大的叶固定在10％v/v中性缓冲甲醛中过夜并且进行处理从而将其切割并包埋在石蜡中。将剩余的三片叶在液氮中速冻用于各种其它试验。
肺组织病理学
一旦将来自各小鼠的最大的叶进行处理和石蜡包埋，将各组织块连续切片(厚度3μm)并且放置在带电的Mikro玻璃载玻片(Grale Scientific，Ringwood，Victoria，Australia)上并且进行各种组织学染色或免疫组织化学。为了评估炎症评分，使来自各小鼠(总计42只)的一片载玻片经历Mayer氏苏木精和曙红(Amber Scientific，Midvale，Western Australia，Australia)(H&E)染色。类似地，为了评估上皮厚度和上皮下胶原沉积，另一组载玻片经历了Masson氏三色染色。为了评估杯状细胞化生，第三组载玻片经历了阿辛蓝过碘酸希夫(Alcian blue periodic acid Schiff，ABPAS)染色。如下详述，将H&E、Masson三色和ABPAS染色的切片在形态测定上进行分析。
免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)
IHC用于检测TGF-β1(使用多克隆抗体；sc-146；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA；1:1000稀释)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA；成肌纤维细胞分化的标志物；使用单克隆抗体；M0851；DAKO抗体，Glostrup，Denmark；1:200稀释)和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP；针对上皮损害的标志物；使用多克隆抗体；ABT330；EMD Millipore Corp’.Temecula，CA，USA；1:1000稀释)。一抗染色使用DAKO EnVision抗兔或抗小鼠试剂盒和3,3’-二氨基联苯胺(DAB)色原来检测，同时还包括在没有任何一抗的情况下暴露于EnVision试剂盒的阴性对照。然后将所有载玻片用苏木精复染。
在腔室载玻片上培养的AEC和人肾成纤维细胞(RF；用作阳性对照；由KollingInstitute of Medical Research，University of Sydney，NSW，Australia提供)上进行IF，从而检测RXFP1(使用对RXFP1的多克隆抗体；HPA027067；Sigma-Aldrich，Castle Hill，NSW，Australia；1:200稀释)。一抗使用山羊抗兔Alexa Fluor(注册商标)555二抗(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)来检测。核用4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)来显像，同时还包括同种型(阴性)对照。
所有IHC染色的载玻片均由Monash Histology Services，Clayton，Victoria，Australia使用用于形态测定分析的ScanScope AT Turbo(Aperio，CA，USA)来扫描；而使用HyD共聚焦显微镜(Leica SP8Confical Invert，Monash Micro Imaging，ClaytonVictoria，Australia)使IF染色的载玻片成像。
形态测定分析
Masson氏三色-、ABPAS-和IHC染色的载玻片如下经历形态测定分析。随机地选择每片载玻片的5个气道(直径为150～300μm)并且使用Aperio ImageScope软件(Aperio，CA，USA)来分析。Masson氏三色染色的载玻片经历了半定量的细支气管周围炎症评分，其中，实验者不知情并且如前所述(Royce等人(2015)同上)从0(气道周围没有可检测到的炎症)至4(广泛且大量的炎性细胞聚集体，合并的尺寸～0.6mm2)对单个的气道评分。Masson氏三色染色的载玻片还经历了通过测量表示为μm2/μm基底膜(BM)长度的上皮和上皮下胶原层(染成蓝色)的厚度对上皮厚度和上皮下胶原的分析。
通过将每100μm BM长度的阳性染色的杯状细胞、α-SMA阳性的细胞和TSLP阳性的细胞的个数计数，分别分析ABPAS-、α-SMA-和TSLP染色的载玻片的杯状细胞化生、成肌纤维细胞数和受损害的上皮细胞。通过运行算法以评估在气道上皮内的强的阳性染色的像素，分析TGF-β1染色的载玻片的TGF-β1蛋白表达。结果表示为每上皮的总面积(mm2)的强阳性像素的数量；然后表示为相对于表示为1的生理盐水处理的对照组的强阳性像素的数量。
羟脯氨酸测定
将来自各小鼠的第二大的肺叶如前所述(Royce等人(2009)同上；Royce等人(2014)同上；Royce等人(2015)同上)进行处理，用于由纯化的反式-4-羟基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich)的标准曲线确定的羟脯氨酸含量的测量。将羟脯氨酸值乘以6.94的因子((基于代表大多数哺乳动物组织中的胶原的氨基酸组成的～14.4％的羟脯氨酸(Gallop和Paz(1975)Physiol.Revs.55:418-487)；为了推断总胶原含量，反过来将其除以各相应的组织的干重从而得到百分胶原浓度。
统计学分析
所有统计学分析均使用GraphPad Prism v6.0(GraphPad Software Inc.，CA，USA)来进行并且表示为平均值±SEM。AHR结果通过双向ANOVA(two-way ANOVA)与Bonferroni事后检定(Bonferroni post-hoc test)来分析。剩余的数据经由单向ANOVA与Neuman-Keuls事后检定来分析以用于组间多重比较。在各情况下，在p值小于0.05的情况下，认为数据是显著的。
合并上皮损害的慢性过敏性气道疾病(AAD)的诱导
以下与实施例9特别相关。在小鼠(n＝56)中建立卵白蛋白(OVA)诱导的合并上皮损害的慢性AAD的模型。在第0天和第14天，将如上所述的小鼠用10μg的V级鸡蛋OVA(Sigma-Aldrich，MO，USA)和400μg的硫酸铝钾佐剂(明矾；AJAX Chemicals，NSW，Australia)的两次腹膜内(IP)注射来致敏。然后通过使用超声雾化器(Omron NE-U07；Omron，Kyoto，Japan)在第21天与第63天之间一周三次全身吸入暴露(雾化)于气雾化的OVA(在0.9％w/v标准生理盐水中为2.5％w/v)30分钟来激发它们。然后，小鼠在第64天(最后一个OVA雾化期后1天；OVA+NA组)接受Clara细胞特异性细胞毒素萘(NA；200mg/kg体重；Sigma-Aldrich，StLouis，MO，USA)的单次IP注射并且再放置3天(从而诱导和加剧气道上皮损害)。然而，对于对照小鼠(n＝8)，代替OVA，给予它们500μL 0.9％w/v生理盐水的IP注射并且用0.9％w/v生理盐水雾化；并且代替NA，对它们注射玉米油(CO；用于NA的溶媒)。
关于hAEC、外泌体和/或RLX的鼻内治疗，在第68天(完成慢性OVA/NA诱导的AAD模型的诱导后1天)，将小鼠用异氟烷(Baxter Health Care，NSW，Australia)轻度麻醉并且在进行适当治疗的鼻内给药的同时保持在半仰卧位。从第68天至第74天，每天或每周一次对小鼠给予以下治疗：
单独的OVA/NA(损伤对照组)：从第68天至第74天使用自动移液管使小鼠的子组(n＝8)每天接受50μL的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS；用于AEC和源自AEC的外泌体的溶媒；每个鼻孔25μL)。
RLX：另外的子组的小鼠(n＝8)从第68天至第74天每天接受50μL(每个鼻孔25μL)的0.8mg/mL(等同于0.5mg/kg/天)的RLX溶液(Corthera Inc，San Carlos，CA，USA；Novartis Pharma AG，Basel，Switzerland的子公司)。
AEC+RLX：由于之前已经显示AEC(1×106个/小鼠)+RLX(0.8mg/ml)的鼻内给药减少OVA诱导的气道炎症并且消除OVA诱导的气道纤维化和气道高反应性(Royce等人(2016)Clinical Science 130:3151-65)，因此将联合疗法应用于第三子组的OVA/NA损伤的小鼠并且用作阳性对照组。将冷冻的AEC(来自足月胎盘；从2～3个独立的供体合并)在37℃水浴中解冻，然后在PBS中重悬。将1×106个AEC在50μL的PBS中重悬并且在第68天给予另外的子组的小鼠(n＝8)。如以上详述的，从第68天至第74天每天给予RLX(0.8mg/ml)(50μl/小鼠)。
源自AEC的外泌体：对第四和第五子组的OVA/NA损伤的小鼠(每个子组n＝8)各自给予分别包含5μg或25μg的源自AEC的外泌体的50μL的PBS。仅在第68天鼻内给予外泌体。
源自AEC的外泌体+RLX：仅在第68天对第六和第七子组的OVA/NA损伤的小鼠(每个子组n＝8)各自给予分别包含5μg或25μg的源自AEC的外泌体的50μL的PBS。如以上详述的，这些小鼠从第68天至第74天还接受RLX(0.8mg/ml)的每日鼻内给药。
对75只小鼠进行如上所述的侵入性体积描记。
组织收集、肺组织病理学、免疫组织化学(IHC)、形态测定分析、羟脯氨酸测定和统计学分析如上所述。
博来霉素诱导的肺纤维化的诱导
以下与实施例10相关。在小鼠(n＝49)中建立博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化的模型。在第0天和第7天，对小鼠鼻内(IN)给予在50μl的生理盐水中的20μg的硫酸博来霉素(Hospira，Melbourne，Victoria，Australia)(等同于400μg/ml；每个鼻孔25μl)。然而，对于对照小鼠(n＝7)，代替BLM，在第0天和第7天给予它们0.9％w/v生理盐水的鼻内给药(每只小鼠50μL)。然后接下来的两周，所有小鼠不进行治疗(直至第21天)。
在第22天(完成BLM诱导的肺纤维化模型的诱导后1天)，将小鼠用异氟烷(BaxterHealth Care，NSW，Australia)轻度麻醉并且在进行适当治疗的鼻内给药的同时保持在半仰卧位。从第22天至第28天，每天或每周一次对小鼠给予以下治疗。
单独的BLM(损伤对照组)：从第22天至第28天使用自动移液管使小鼠的子组(n＝7)每天接受50μL的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS；用于吡非尼酮、AEC和源自AEC的外泌体的溶媒；每个鼻孔25μL)。
吡非尼酮：另外的子组的小鼠(n＝7)从第22天至第28天通过每天两次口服灌胃接受1mg的吡非尼酮(Tocris Bioscience，Noble Park，Victoria，Australia)(等同于50mg/kg/天)。
AEC+重组人松弛素(RLX)：按照慢性AAD模型，第三组BLM损伤的小鼠接受AEC(1×106个/小鼠)+RLX(0.8mg/ml)的鼻内给药。将冷冻的AEC(来自足月胎盘；从2～3个独立的供体合并)在37℃水浴中解冻，然后在PBS中重悬。将1×106个AEC在50μL的PBS中重悬并且在第22天给予另外的子组的小鼠(n＝7)。从第22天至第28天每天鼻内给予RLX(0.8mg/ml)(50μl/小鼠)。
源自AEC的外泌体：对第四和第五子组的BLM损伤的小鼠(每个子组n＝7)各自给予分别包含5μg或25μg的源自AEC的外泌体的50μL的PBS。仅在第22天鼻内给予外泌体。
源自AEC的外泌体+RLX：仅在第22天对第六和第七子组的BLM损伤的小鼠(每个子组n＝7)各自给予分别包含5μg或25μg的源自AEC的外泌体的50μL的PBS。如以上详述的，这些小鼠从第22天至第28天还接受RLX(0.8mg/ml)的每日鼻内给药。
侵入性体积描记、组织收集、肺组织病理学、形态测定分析和统计学如上所述。
实施例1
RXFP1在AEC上的表达
通过免疫荧光和用DAPI核复染，对于RXFP1阳性染色的AEC和人肾成纤维细胞(RF；阳性对照)(图1)。AEC和RF二者均对RXFP1具有强的细胞质染色。其中一抗由同型对照代替的阴性对照细胞中不存在染色。
实施例2
RLX、MSC、AEC和联合治疗对气道炎症(AI)的影响
使用来自Masson氏三色染色的图像的支气管周围发炎评分(图2A和图2B)和来自BAL液的嗜酸性细胞浸润(图2C)作为AI的量度。OVA处理的小鼠的支气管周围发炎评分(1.70±0.60)与生理盐水对照(0.15±0.40)相比显著地增加(P<0.001，相对于生理盐水组；图2B)。这证实了已经在OVA处理的小鼠中建立了AAD的慢性模型。动物的RLX治疗没有显著地影响OVA诱导的炎症评分的增加(1.55±0.83；P<0.001，相对于生理盐水组)，而单独的MSC(1.30±0.20；P<0.05，相对于OVA组；P<0.001，相对于生理盐水组)仅适度地但是显著地减少了支气管周围炎症(图2B)。相比之下，单独的AEC(1.05±0.28)、MSC+RLX(1.00±0.40)和AEC+RLX(0.90±0.70)能够有效地降低OVA诱导的炎症评分～40-50％；在AEC+RLX的情况下观察到最大效果(P<0.001，相对于OVA组；P<0.01，相对于OVA+RLX组；P<0.05，相对于OVA+MSC组)。然而，单独的AEC或联合治疗都不能将支气管周围炎症减少至在生理盐水处理的对照中所看到的情况(所有P<0.01，相对于生理盐水组；图2B)。
与来自生理盐水处理的对照的嗜酸性细胞的数量(1.06×105±0.25×105个/mLBAL液)相比，OVA处理的小鼠还具有显著增加的嗜酸性细胞的数量(2.85+0.45/mL BAL液)(P<0.01，相对于生理盐水组；图2C)。RLX(1.60×105±0.47×105个/mL BAL液)和单独的MSC(1.79×105±0.21×105个/mL BAL液)二者部分地但是显著地将嗜酸性细胞浸润降低至类似的程度(二者P<0.05，相对于单独的OVA)，但是达到与在生理盐水处理的对照中测得的水平没有差异的水平(图2C)。相比之下，单独的AEC(7.37×104±1.46×104个/mLBAL液)、以及MSC+RLX的联用效果(8.19×104±3.79×104个/mL BAL液)或AEC+RLX的联用效果(5.92×104±1.05×104个/mL BAL液)完全消除了嗜酸性细胞浸润(所有P<0.01，相对于OVA组；与生理盐水组没有差异)，再次达到不再与在生理盐水处理的对照中测得的水平有差异的水平(图2C)。
实施例3
RLX、MSC、AEC和联合治疗对上皮厚度和上皮损害的影响
OVA处理的小鼠的上皮厚度(21.20±0.60μm2)与生理盐水处理的对照(16.89±0.76μm2)相比显著地增加(P<0.01，相对于生理盐水组；图2D)。虽然该值与从生理盐水处理的对照小鼠测量的值在统计学上没有差异，但是使用单独的MSC(19.23±0.73μm2)的治疗仅诱导减少OVA诱导的上皮厚度的增加的趋势。相比之下，单独的RLX(18.19±0.74μm2；p<0.05，相对于单独的OVA)、单独的AEC(16.90±0.39μm2)、MSC+RLX(17.75±0.87μm2)和AEC+RLX(18.21±2.19μm2)均使OVA诱导的上皮厚度的增加正常化恢复至在生理盐水处理的对照小鼠中看到的情况(所有P<0.05，相对于单独的OVA组；与生理盐水组没有差异；图2D)。
TSLP用作上皮损害的标志物，并且，与小鼠的生理盐水处理的对应部分中的在气道上皮内的TSLP阳性的细胞的数量(1.00±0.30)相比，在气道上皮内的TSLP阳性的细胞的数量在OVA处理的小鼠中显著地更高(4.61±0.53)(P<0.001，相对于生理盐水组)。单独的MSC(4.50±0.42)不能减少OVA诱导的TSLP表达的增加。然而，单独的RLX(3.14±0.34)、单独的AEC(3.50±0.19)以及MSC+RLX的联用效果(3.53±0.28)或AEC+RLX的联用效果(3.30±0.27)与单独的OVA组相比均显著地降低TSLP表达水平(所有P<0.05，相对于单独的OVA组)；但是未达到在生理盐水处理的对照小鼠中测得的水平(所有P<0.01，相对于生理盐水组)[图3]。值得注意的是，与单独的MSC的影响相比，单独的RLX也降低TSLP表达水平(P<0.05，相对于OVA+MSC组；图3)。
实施例4
RLX、MSC、AEC和联合治疗对杯状细胞化生的影响
从ABPAS染色的肺切片分析杯状细胞化生，并且，与从生理盐水处理的对应部分测得的杯状细胞化生(1.62±0.32)相比，杯状细胞化生在OVA处理的小鼠中显著地增加(4.83±0.20)(P<0.001，相对于生理盐水组；图4)。单独的RLX(5.08±0.25)、单独的MSC(5.23±0.47)、单独的AEC(5.00±0.16)或MSC+RLX(5.06±0.41)均不影响OVA诱导的杯状细胞数量的增加(所有P<0.001，相对于生理盐水组)。相比之下，仅AEC+RLX的联用效果(4.39±0.28)显著地降低OVA诱导的杯状细胞数量的增加(P<0.05，相对于单独的OVA组；OVA+RLX组；OVA+MSC组，OVA+AEC组；和OVA+MSC+RLX组；图4)；但是没有完全恢复至从生理盐水处理的对照测得的水平(P<0.01，相对于生理盐水组)。
实施例5
RLX、MSC、AEC和联合治疗对气道纤维化的影响
气道纤维化通过从Masson氏三色染色的肺切片(图2E)分析上皮下胶原沉积和总肺胶原浓度(图5)的羟脯氨酸分析来测量。与从生理盐水处理的对照测得的上皮下胶原(相对于基底膜长度)(8.07±0.58μm)相比，上皮下胶原(相对于基底膜长度)在OVA处理的小鼠中显著地增加(26.26±1.37μm)(P<0.001，相对于生理盐水组；图2E)。单独的RLX(18.27±2.26μm)、单独的MSC(19.67±1.17μm)或单独的AEC(17.87±2.150μm)显著地以类似的程度减少OVA诱导的上皮下胶原沉积的异常增加(减少～35-45％；所有P<0.01，相对于单独的OVA组；图2E)。与在OVA损伤的小鼠中测得的上皮下胶原沉积相比，用AEC+RLX治疗的小鼠具有上皮下胶原沉积的进一步的减少(13.72±1.25μm)(减少～70％；P<0.001，相对于OVA组；P<0.05，相对于生理盐水组)，同时通过MSC+RLX的联用效果使OVA诱导的上皮下胶原沉积的增加正常化(11.12±0.93μm)(P<0.001，相对于OVA组；与生理盐水组没有差异)；并且达到比任一单独的疗法大的程度(P<0.05，相对于单独的RLX或单独的AEC；P<0.01，相对于单独的MSC；图2E)。
在总肺胶原浓度的测量中观察到类似的发现，与从生理盐水处理的对照获得的相应的测量值(2.84±0.11％)相比，所述总肺胶原浓度在OVA处理的小鼠中显著地增加(3.82±0.10％)(P<0.001，相对于生理盐水组)；并且通过单独的RLX(3.08±0.23％；P<0.01，相对于单独的OVA组)或单独的AEC(3.26±0.14％；P<0.05，相对于单独的OVA组)显著地降低，但是不能通过单独的MSC降低(3.52±0.12％)(图5)。引人注目地，MSC+RLX的联用效果(2.75±0.11％；P<0.001，相对于单独的OVA组)或AEC+RLX的联用效果(2.90±0.04％；P<0.01，相对于单独的OVA组)完全逆转了OVA诱导的肺胶原浓度的增加，使其恢复至在生理盐水处理的对照动物中测得的水平(图5)。MSC+RLX或AEC+RLX的联用效果还以比单独的MSC更大程度降低总肺胶原浓度(二者P<0.01，相对于OVA+MSC组；图5)。
实施例6
RLX、MSC、AEC和联合治疗对气道上皮TGF-β1表达的影响
为了阐明RLX与MSC或AEC的联用效果能够使OVA诱导的上皮下肺胶原沉积和总的肺胶原沉积正常化的可能的机制，评估了气道上皮TGF-β1染色的变化(图6A和图6B)。与生理盐水处理的对照中的上皮TGF-β1表达(1.00±0.47)相比，上皮TGF-β1表达在OVA处理的小鼠中显著地增加(10.65±0.81)(P<0.01，相对于生理盐水组；图6B)。如先前在另外的研究(Royce等人(2015)同上)中所显示的，单独的RLX(5.85±1.42)，但不是单独的MSC(8.15±1.78)，能够部分地但是显著地降低OVA诱导的异常上皮TGF-β1表达水平的增加。另一方面，单独的AEC(3.04±0.44)以及MSC+RLX的联用效果(1.47±0.45)或AEC+RLX的联用效果(2.63±0.060)能够明显地降低气道上皮TGF-β1表达，达到不再与在生理盐水处理的对照中测得的水平有差异的水平(所有P<0.001，相对于单独的OVA组；与生理盐水组没有差异)；并且达到比单独的MSC的效果更大的程度(所有P<0.05，相对于OVA+MSC组；图6B)。
实施例7
RLX、MSC、AEC和联合治疗对上皮下成肌纤维细胞积聚的影响
与从它们的生理盐水处理的对应部分测得的每100μm BM长度的α-SMA染色的成肌纤维细胞的数量(0.44±0.13)相比，对小鼠的OVA处理还在气道的上皮下层导致每100μmBM长度的α-SMA染色的成肌纤维细胞的数量显著增加(1.72±0.07)(p<0.001，相对于生理盐水组；图6C和图6D)。包括单独的RLX(1.08±0.10)、单独的MSC(1.06±0.10)或单独的AEC(1.13±0.19)的所有单独治疗显著地以类似的程度减少OVA诱导的上皮下成肌纤维细胞数的增加(减少～45-50％；所有P<0.01，相对于单独的OVA组；所有P<0.05，相对于生理盐水组)；而MSC+RLX(0.88±0.12)的联用效果或AEC+RLX(0.63±0.12)的联用效果使上皮下成肌纤维细胞的数量进一步减少至不再与在生理盐水处理的对照动物中测得的数量有差异的数量(二者P<0.001，相对于单独的OVA组；与生理盐水组没有差异；图6D)。
实施例8
RLX、MSC、AEC和联合治疗对AHR的影响
经由侵入性体积描记法来评估AHR，并且，与在生理盐水对照中测得的AHR相比，AHR在OVA处理的小鼠中显著地增加(图7)。AHR部分地但是显著地通过单独的RLX降低(降低～50％；P<0.001，相对于OVA组；P<0.01，相对于生理盐水组)，或通过单独的AEC降低(降低～35-40％；P<0.05，相对于OVA组；P<0.001，相对于生理盐水组)，但是不能通过单独的MSC降低(P<0.001，相对于生理盐水组)；这与这些治疗在逆转气道/肺纤维化方面的有效程度相关。相比之下，MSC+RLX或AEC+RLX的联用效果使AHR进一步降低至不再与从生理盐水处理的对照小鼠测得的水平显著不同的水平(二者P<0.001，相对于单独的OVA组；与生理盐水组没有差异；图7)。MSC+RLX或AEC+RLX的联用效果还以比单独的MSC显著更大的程度降低AHR(二者P<0.01，相对于OVA+MSC组；图7)。
实施例9
合并上皮损害的慢性过敏性气道疾病/哮喘模型
在图8～15中呈现的数据清楚地显示松弛素的存在在合并上皮损害的慢性过敏性气道疾病/哮喘模型的动物模型中增大了外泌体的治疗潜力。该动物模型记载于就在实施例1之前的部分中。结果显示，外泌体/松弛素联用显著地降低炎症评分、杯状细胞化生、上皮损害、上皮厚度和上皮下ECM厚度、胶原浓度、上皮TGF-β1表达水平、上皮下成肌纤维细胞密度，并且改善气道高反应性。总之，这些结果与显示松弛素增大AEC和外泌体的治疗潜力的那些(实施例2～8)一致。
来自各组研究的苏木精和曙红染色的肺切片显示支气管壁内炎性细胞浸润的程度。来自5个气道/小鼠的支气管周围炎症评分(其中将切片基于炎性细胞聚集体的数量和分布在0(无可见的炎症)至4(严重的炎症)的等级上评分)的平均值±S.E.M在图8中示出。
来自各组研究的阿辛蓝过碘酸希夫染色的肺切片显示杯状细胞化生的程度。来自5个气道/小鼠的杯状细胞计数(表示为每100mm基底膜(BM)长度的杯状细胞的数量)的平均值±S.E.M在图9中示出。
免疫组织化学染色的肺切片示出来自所研究的各组的胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP；上皮损害的标志物)。来自5个气道/小鼠的TSLP染色的细胞计数(每100μm基底膜(BM)长度)的平均值±S.E.M在图10中示出。
Masson氏三色染色的肺切片显示来自所研究的各组的上皮厚度和上皮下细胞外基质(ECM/蓝色染色)厚度的程度。来自5个气道/小鼠的(A)上皮厚度(μm2；相对于基底膜(BM)长度)和(B)上皮下ECM厚度(μm；相对于BM长度—纤维化的量度)的平均值±S.E.M在图11中示出。
来自n＝7-8只动物/组的总肺胶原浓度(％肺胶原含量/组织干重—纤维化的量度)的平均值±S.E.M在图12中示出。
免疫组织化学染色的肺切片示出来自所研究的各组的上皮TGF-β1表达水平。来自5个气道/小鼠、n＝7-8只动物/组的TGF-β1染色(表示为每个所分析的区域的％染色)的平均值±S.E.M在图13中示出；*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，相对于生理盐水/玉米油处理的未损伤对照组。
免疫组织化学染色的肺切片示出上皮下成肌纤维细胞密度。来自5个气道/小鼠的上皮下区域(每100μm基底膜(BM)长度)中的α-平滑肌肌动蛋白染色的成肌纤维细胞的数量的平均值±S.E.M在图14中示出。
针对气道高反应性(AHR)进行评价的各种组的影响在图15中示出。响应于增加剂量的雾化的乙酰甲胆碱(支气管收缩剂)，经由侵入性体积描记法来评估气道阻力(反映AHR的变化)。图15中的结果表示为从基线的阻力变化。示出了对各剂量的乙酰甲胆碱试验(n＝5只动物/组)的气道阻力的平均值±S.E.M.。包括hAEC+重组人松弛素(RLX)或单独的RLX的影响用于比较。
实施例10
博来霉素间质性纤维化模型
来自所研究的各组的Masson氏三色染色的肺切片的代表性图像显示间质性肺细胞外基质/胶原沉积(纤维化)的程度。来自n＝7只动物/组的来自5个视野/小鼠的每个视野的间质性纤维化的平均值±S.E.M％在图16中示出。
来自所研究的各组的Masson氏三色染色的肺切片的代表性图像显示上皮下细胞外基质(ECM)沉积(作为纤维化的另一量度)的程度。来自5个气道/小鼠、n＝7只动物/组的上皮下ECM厚度(μm；相对于BM长度)的平均值±S.E.M在图17中示出。
来自博来霉素模型的纤维化数据表明，虽然所有治疗(包括吡非尼酮)均使博来霉素诱导的间质性纤维化的增加正常化(图16)，但是仅RLX+外泌体(EXO)或RLX+hAEC还能够使博来霉素诱导的上皮下ECM/胶原沉积的增加也正常化(图17)。相比之下，单独的5μg外泌体在逆转上皮下胶原沉积方面仅具有部分效果而吡非尼酮不具有效果。在显示25μg EXO+RLX提供最佳的保护并且逆转间质和上皮下胶原沉积二者恢复至在生理盐水处理的对照小鼠中测得的间质和上皮下胶原沉积方面，趋势是类似的。数据支持例如特发性肺纤维化等肺纤维化的治疗。
实施例11
博来霉素诱导的肺部炎症的逆转
来自博来霉素模型的炎症评分(图18)示出，单独的外泌体或单独的吡非尼酮仅部分地减少博来霉素诱导的肺部炎症，而外泌体+松弛素的联用效果能够完全逆转博来霉素诱导的肺部炎症。苏木精和曙红染色的肺切片显示支气管壁内炎性细胞浸润的程度。
博来霉素模型(BLM模型)表现为间质性和较低程度的支气管周围炎症而AAD模型主要表现为支气管周围炎症。数据支持AEC+松弛素不能限制BLM诱导的肺部炎症的结论；这可以由AEC在从体内清除之前具有有限的时间来产生外泌体和引起效果的事实来解释。数据还示出，外泌体可以在外泌体生物发生(exosome biogenesis)发生之前通过绕过细胞引发步骤(cellpriming step)和随后的滞后而对靶细胞直接发挥它们的作用。通过外泌体+松弛素的联用效果将BLM诱导的肺部炎症最佳地减少至与在生理盐水处理的未损伤对照组中测得的水平没有显著差异的水平。
实施例12
治疗方案的开发
在前的实施例比较了在慢性OVA诱导的AAD的环境中、在不存在和存在抗纤维化药剂(RLX)的情况下AEC与MSC的治疗效果。结果表明：1)与单独的MSC的效果相比，单独的AEC显示针对如下的更强的保护：慢性AAD诱导的AI的增加(如通过支气管周围炎症评分和嗜酸性细胞计数的变化来评估的)、AWR(如由上皮损害/厚度、总肺胶原浓度和上皮TGF-β1表达的变化来评估的)和AHR。然而，单独的AEC治疗不能完全逆转与模型相关的结构和功能变化。2)RLX的存在能够增强由MSC或AEC提供的保护，以使嗜酸性细胞计数、上皮厚度、胶原沉积、上皮TGF-β1表达水平、上皮下成肌纤维细胞积聚和AHR在两种联合治疗组中均正常化，恢复至在生理盐水处理的对照小鼠中测得的水平。与单独治疗的效果相比，联合治疗的优良的抗纤维化效果看起来是由它们更强的逆转异常TGF-β1表达和成肌纤维细胞分化的能力来解释。因此，根据本发明，将RLX与AEC联用有效地逆转AWR(包括气道/肺纤维化)的数个方面、和慢性AAD的环境中的AWR诱导的AHR的变化。
虽然所评价的所有治疗能够明显地降低嗜酸性细胞浸润或使其正常化，但是单独的RLX和MSC通常在逆转支气管周围炎症方面不太有效。相比之下，单独的AEC显示最有效的抗炎作用并且还明显地使嗜酸性细胞计数降低至不再与在生理盐水处理的对照中测得的水平不同的水平。有趣的是，AEC和RLX的联用效果以比单独的RLX或MSC更大的程度使支气管周围炎症评分进一步降低。在慢性AAD模型中，显示MSC的气管内移植减少在BAL液中的嗜酸性细胞、中性粒细胞和单核细胞的浸润(Ge等人(2013)同上)。之前尚未在慢性AAD的环境中研究AEC的效果。单独的RLX在减少AAD的慢性小鼠模型中的单核细胞(Royce等人92009)同上；Royce等人(2014)同上)和淋巴细胞(Royce等人(2009)同上；Royce等人(2014)同上)以及其它模型中的巨噬细胞(Samuel等人(2011)Lab.Invest.91:675-690)的浸润方面尚不是有效的。与其它治疗相比，RLX与AEC的联用效果具有更广泛的抗炎效果。
这些各种炎性细胞以及Th2CD4+细胞的浸润也与涵盖AWR的各种结构变化相关。在哮喘期间，损伤和修复的重复循环导致在气道中的异常结构变化，这导致肺功能的不可逆的丧失(Hirota和Martin(2013)Chest 144:1026-1032)。在目前的实施例中，经由上皮增厚、杯状细胞化生、气道胶原沉积(纤维化)以及上皮TGF-β1表达和上皮下成肌纤维细胞积聚来评估AWR。
上皮增厚导致气道变窄并且因此导致增加的气道阻力，导致哮喘诱导的呼吸困难的增加(Hogg(1997)APMIS 105:745-745)。上皮增厚在OVA处理的小鼠中加剧并且单独的MSC治疗不显著地影响上皮增厚。这与先前的结果一致，所述结果显示鼻内(Royce等人(2015)同上)或静脉内(i.v.)[Firinci等人(2011)Int.Immunopharmacol.11:1120-1126]递送的MSC不能在慢性AAD模型中抑制上皮增厚。相反，单独的RLX能够降低上皮厚度，这与使用用RLX全身(Royce等人(2009)同上)或鼻内(Royce等人(2014)同上)治疗的慢性AAD损伤的小鼠的先前的发现一致。同样地，发现单独的AEC和与RLX联用使OVA诱导的上皮厚度的增加正常化。这些发现可以表明，可以使异常的上皮增厚和由对气道/肺的上皮损害引起的相关的纤维化正常化的治疗更可能保护其免受AAD诱导的AWR和AWR对AHR的影响。事实上，另一项最近的研究显示，单独的RLX或者与上皮修复因子(三叶因子-2；TFF2)或与TFF2和皮质类固醇地塞米松联用的能力能够完全逆转OVA诱导的动态肺顺应性的丧失，这是由于这些治疗的显著地降低上皮厚度和肺胶原浓度二者(纤维化的基础)的能力[Patel等人(2016)Br.J.Pharmacol.doi:10.1111/bph.13494]。
与上皮增厚相关，本发明评价了肺损害的标志物(TSLP)，其响应于哮喘样症状的各种刺激而由气道上皮细胞(连同IL-25和IL-33)明显地产生和分泌(Bartemes和Kita(2012)Clin.Immunol.143:222-235)。有趣的是，发现可以显著地逆转上皮增厚的所有治疗也部分地减少OVA诱导的气道上皮TSLP表达的增加。这些发现意味着所评价的单独的RLX或AEC的给药和联合治疗能够部分地诱导上皮组织修复。与本研究的发现一致，还发现单独的RLX和与MSC联用在肾脏疾病/纤维化的输尿管阻塞诱导的模型中显著地抑制上皮肾损伤分子(KIM-1)表达(Huuskes等人(2015)同上)。这可能是由于这些疗法的抗凋亡和/或血管生成效果所导致的(Samuel等人(2011)同上；Linthout等人(2011)Curr.Pharmaceut.Des.17:3341-3347)。
过多的ECM组分特别是胶原的沉积在哮喘个体中在气道的上皮下和外膜内发生并且导致纤维化的发展(Gillis和Lutchen(1999)J.Appl.Physiol.86:2011-2012)。在目前的实施例中，通过检查上皮下胶原含量和总胶原含量以及胶原转换(collagen turnover)的两种标志物，即TGF-β1和α-SMA(成肌纤维细胞分化的标志物)来评价纤维化。单独的MSC能够部分地降低上皮下胶原水平但是仅显示使总肺胶原浓度水平降低的趋势，这与先前的研究(Royce等人(2014)同上；Royce等人(2014)同上)有些不一致并且表明这些细胞的效果可能是患者依赖性的和/或批次间依赖性的。相比之下，单独的RLX或AEC能够显著地但不完全逆转OVA诱导的上皮下胶原和总肺胶原二者的增加。这与已经显示单独的RLX可以减少与慢性AAD相关的气道/肺纤维化(Royce等人(2009)同上；Royce等人(2014)同上；Royce等人(2015)同上)的先前的研究、和显示单独的AEC(Moodley等人(2010)同上；Murphy等人(2011)同上)可以减少博来霉素诱导的损伤之后的间质性肺纤维化的那些一致。更令人印象深刻地，两种联合治疗均能够进一步减少OVA诱导的气道/肺纤维化的增加并且实际上使其正常化。这也与使用MSC与RLX的组合从而减少由单侧输尿管阻塞诱导的肾纤维化的先前的发现(Huuskes等人(2015)同上)一致。
在目前的实施例中，发现在慢性AAD的环境中由MSC显示的有限的抗纤维化效力与它们在适度地减少上皮下成肌纤维细胞积聚的同时缺乏影响气道上皮TGF-β1表达水平的能力相关。由单独的RLX或AEC显示的抗纤维化效力与它们显著地降低气道上皮TGF-β1表达水平和上皮下成肌纤维细胞积聚二者的能力一致；并且与RLX(Unemori等人(1996)同上；Tozzi等人(2005)同上；Patel等人(2016)同上)和AEC(Moodley等人(2010)同上；Moodley等人(2013)PLoS ONE8；e69299)二者在气道/肺中的通常的TGF-β1抑制效果一致。更重要的是，两种联合疗法的增强的抗纤维化效力导致它们在明显地使上皮下成肌纤维细胞分化降低的同时使慢性AAD诱导的上皮TGF-β1表达水平的异常增加正常化的能力；如果测得的慢性AAD诱导的异常的上皮下肺胶原沉积和总的肺胶原沉积的增加没有正常化，则很可能导致明显的逆转。这些发现表明，RLX可以与表达RXFP1的多种干细胞类型联用，通过创造其中这些移植的细胞可以存活并且执行它们的治疗/修复效果的更有利的环境和/或通过直接促进它们的活力、增殖和迁移，来治疗与哮喘相关联的AWR和相关的AHR。
AI和AWR二者均有助于AHR的发展(Ober和Hoffjan(2006)Genes Immun.7:95-100；Kariyawasam等人(2007)Am.J.Respir.Crit.Care Med.175:896-904)。AHR的程度还与哮喘的严重性相关(Bourlet等人(1997)Chest 112:45-52，Holgate等人(2004)Proc.Am.Thorac.Soc.1:93-98)。先前的研究已经显示由于ECM组分的沉积导致的BM厚度的增加(上皮下纤维化)与气道的扩张性的降低相关(Ward等人(2001)Am.J.Respir.Crit.Care Med.164:1718-1721)，同时与AHR的增加相关(Milanese等人(2001)J.Appl.Physiol.91:1035-1040)。在目前的研究中，使用侵入性体积描记法来评价AHR从而确定气道阻力。OVA诱导的AHR的增加与所研究的各治疗逆转气道/肺纤维化的有效程度一致地成比例地减少；基于联合治疗的使气道上皮厚度、上皮TGF-β1表达水平和总肺胶原浓度正常化的能力，联合治疗中的任一种能够完全逆转AHR，使其恢复至从生理盐水处理的对照小鼠测得的水平。这些发现与公开的研究(Patel等人(2016)同上)一致，所述研究也显示可以消除慢性AAD诱导的上皮厚度和/或损害以及胶原浓度的异常增加的其它疗法是使乙酰甲胆碱诱导的AHR正常化的关键。然而，这些治疗减少气道/肺纤维化的程度看起来更多地与它们逆转AHR的有效程度相关。
本发明部分地基于以下发现：将RLX与AEC或外泌体联用能够显著地减少AI并且完全消除与慢性AAD相关的气道上皮增厚、气道上皮TGF-β1表达水平、气道/肺纤维化和AHR。因此，该联合疗法提供治疗气道疾病发病机理的三个主要组分(AI、AWR和AHR)的新的方式，特别是对于对皮质类固醇疗法有抗性的患者。AEC与RLX联用在进一步减少AI和AWR以及改善与哮喘相关的AHR方面是有效的。
因此，治疗方案包括对需要治疗的受试者给予：
(A)(i)AEC；或
(ii)羊膜外泌体；和
(B)抗纤维化药剂如松弛素、重组体或衍生物形式。
在实施方案中，治疗方案包括对需要治疗的受试者给予羊膜外泌体和例如松弛素或重组体或衍生物形式等抗纤维化药剂。
通过任意方便的途径如鼻内、呼吸道、气管内、鼻咽、静脉内、腹膜内、胸腔内、皮下、皮内、肌内、眼内、鞘内或直肠途径给药。抗纤维化药剂经由其起作用的受体(例如松弛素的RXFP1)的活化剂或激动剂的添加也会有帮助。提出该疗法以改善AI、AWR和/或AHR中的任一种或全部并且减少纤维化。AEC或外泌体与抗纤维化药剂可以共同给药或以任一种顺序分开给药或依次给药或者一起配制。
如本实施例中教导的，发现AEC或外泌体与松弛素的联用比间质干细胞(MSC)与松弛素的联用更有效。AEC或外泌体与松弛素使上皮厚度正常化并且在小鼠模型中部分地逆转纤维化以及改善气道高反应性。本文中提出，例如松弛素等抗纤维化药剂提供其中可以采用基于AEC的疗法的改善的环境，提高表达松弛素-2受体RXFP1的AEC的治疗和再生能力。进一步提出AEC的治疗益处适用于羊膜外泌体。在这一点上，可以将羊膜外泌体从羊水或胎盘组织中分离或者可以将其从包括永生化AEC系的AEC系中分离。这包括生物反应器的使用，从而从AEC系产生羊膜外泌体，随后将所述羊膜外泌体分离并且用于本治疗方案。尽管如此，本发明扩展至MSC与例如松弛素等抗纤维化药剂用于治疗气道疾病的用途。
本领域技术人员将理解，除了具体地描述的那些以外，本文中所述的本公开易于作出变化和修改。应当理解的是，本公开考虑了所有这样的变化和修改。本公开还单独地或共同地使本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物、以及任意两种以上的步骤、特征、组合物或化合物的任意和所有组合成为可能。
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Claims (53)
1.一种用于在受试者中治疗气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的羊膜上皮细胞(AEC)或羊膜外泌体与抗纤维化药剂一起给予所述受试者，所述治疗在足以改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗纤维化药剂为松弛素-2、松弛素-2的重组形式、或者松弛素-2的功能性衍生物、变体或模拟物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述松弛素-2的重组形式为serelaxin。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述松弛素-2的衍生物为松弛素-2的单B链衍生物或者A链和B链截短物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述松弛素-2的单B链衍生物为H2-(B7-33)或者所述A链和B链截短物为H2-(A4-24)(B7-24)。
6.根据权利要求2～5任一项所述的方法，其进一步包括RXFP1活化剂或激动剂的给药。
7.根据权利要求2～6任一项所述的方法，其中将所述AEC进行遗传修饰，从而表达松弛素或者其衍生物或变体。
8.根据权利要求2～6任一项所述的方法，其中将所述羊膜外泌体进行修饰，从而包含所述松弛素、或者其重组体、衍生物或变体形式。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人类。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为竞技动物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述竞技动物为马。
12.根据权利要求2～6任一项所述的方法，其中将所述AEC或外泌体与所述松弛素同时地或依次地共同给药，或者所述AEC或外泌体包含所述松弛素。
13.根据权利要求12所述的方法，其中给予所述松弛素，接着是所述AEC或羊膜外泌体。
14.根据权利要求1～13任一项所述的方法，其中松弛素和所述AEC或外泌体中的一种或另一种或两种的给药通过鼻内给药、呼吸道内给药、鼻咽内给药或静脉内给药。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述AEC对于接受治疗的受试者是自体的或同种异体的或异种的。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述外泌体对于接受治疗的受试者是自体的或同种异体的或异种的。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述松弛素对于接受治疗的受试者是自体的或同种异体的或异种的。
18.根据权利要求1～17任一项所述的方法，其中所述气道疾病选自由哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征组成的列表。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肺纤维化为特发性肺纤维化或其它间质性肺病。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述气道疾病为哮喘。
21.根据权利要求1～17任一项所述的方法，其用于肺组织或呼吸组织纤维化的治疗、预防或减少。
22.一种药剂盒，其以隔室形式包括第一隔室和第二隔室，所述第一隔室包含在药学上可接受的介质中能够重构的形式的AEC或羊膜外泌体；第二隔室包含用于肺组织的抗纤维化药剂；其中将所述AEC或外泌体在使用之前在药学上可接受的介质中重构，其中将所述AEC和所述抗纤维化药剂同时地或以任一种顺序依次地给予受试者。
23.一种制剂，其包含AEC或羊膜外泌体和抗纤维化药剂以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
24.根据权利要求22所述的药剂盒或根据权利要求23所述的制剂，其中所述抗纤维化药剂为松弛素-2、松弛素-2的重组形式或松弛素-2的功能性衍生物。
25.根据权利要求24所述的药剂盒或制剂，其中所述松弛素-2的重组形式为serelaxin。
26.根据权利要求24所述的药剂盒或制剂，其中所述松弛素-2的衍生物为松弛素-2的单B链衍生物或者A链和B链截短物。
27.根据权利要求26所述的药剂盒或制剂，其中所述松弛素-2的单B链衍生物为H2-(B7-33)或者所述A链和B链截短物为H2-(A4-24)(B7-24)。
28.根据权利要求22～27任一项所述的药剂盒或制剂，其进一步包括RXFP1活化剂或激动剂。
29.根据权利要求22所述的药剂盒或根据权利要求23所述的制剂，其任选地包括包含所述抗纤维化药剂的AEC或外泌体。
30.根据权利要求29所述的药剂盒或制剂，其中所述抗纤维化药剂为松弛素或者其重组体或功能性衍生物。
31.AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂组合用于制造在受试者中治疗气道疾病的药物的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述抗纤维化药剂为松弛素-2、松弛素-2的重组形式或松弛素-2的功能性衍生物。
33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述气道疾病选自由哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征组成的列表。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述肺纤维化为特发性肺纤维化或其它间质性肺病。
35.根据权利要求33所述的用途，其中所述气道疾病为哮喘。
36.根据权利要求31～35任一项所述的用途，其用于肺组织或呼吸组织纤维化的治疗、预防或减少。
37.AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂，其用于在受试者中治疗气道疾病。
38.根据权利要求37所述的AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂，其中所述抗纤维化药剂为松弛素-2、松弛素-2的重组形式或松弛素-2的功能性衍生物。
39.根据权利要求37或38所述的AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂，其中所述气道疾病选自由哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征组成的列表。
40.根据权利要求39所述的AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂，其中所述肺纤维化为特发性肺纤维化或其它间质性肺病。
41.根据权利要求39所述的AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂，其中所述气道疾病为哮喘。
42.根据权利要求37～39任一项所述的AEC或羊膜外泌体与抗纤维化药剂，其用于肺组织或呼吸组织纤维化的治疗、预防或减少。
43.一种在受试者中治疗气道疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的间质干细胞(MSC)与抗纤维化药剂一起给予受试者，所述治疗在改善气道炎症、气道重塑和/或气道高反应性中的一种或多种的时间和条件下。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗纤维化药剂为松弛素-2、松弛素-2的重组形式、或者松弛素-2的功能性衍生物、变体或模拟物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述松弛素-2的重组形式为serelaxin。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述松弛素-2的衍生物为松弛素-2的单B链衍生物或者A链和B链截短物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述松弛素-2的单B链衍生物为H2-(B7-33)或者所述A链和B链截短物为H2-(A4-24)(B7-24)。
48.根据权利要求43～47任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
49.根据权利要求43～47任一项所述的方法，其中所述受试者为竞技动物。
50.根据权利要求43～49任一项所述的方法，其中所述气道疾病选自由哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、上呼吸道感染和反应性气道功能障碍综合征组成的列表。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肺纤维化为特发性肺纤维化或其它间质性肺病。
52.一种制剂，其包含间质干细胞(MSC)和抗纤维化药剂以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
53.根据权利要求52所述的制剂，其中所述抗纤维化药剂为松弛素。
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