CN101146546A

CN101146546A - 肌肉再生

Info

Publication number: CN101146546A
Application number: CNA2006800092346A
Authority: CN
Inventors: 拉维·坎巴德; 姆里杜拉·沙玛; 亚历克斯·亨内布里; 莫妮卡·森纳塞勒诺德莫拉
Original assignee: Ovita Ltd
Current assignee: Ovita Ltd
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2006-02-07
Publication date: 2008-03-19
Also published as: EP1855710A1; EP1855709A4; EP1855709A1; US20090136481A1; US20080187543A1; CA2597146A1; JP2008530004A; WO2006083183A1; CA2597152A1; AU2006211813A1; WO2006083182A1; NZ538097A; WO2006083183A9; AU2006211812A1; CN101146547A; JP2008530003A; WO2006083182A9; EP1855710A4

Abstract

本发明涉及通过利用一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂抑制肌肉生长抑制素活性而来治疗人或动物患者的肌肉减少症的方法。

Description

肌肉再生

发明领域

本发明涉及通过活化卫星细胞来诱导肌肉再生的方法，其尤其用于但不局限于治疗肌肉减少症(sarcopenia)。

背景技术

肌肉组织再生所涉及的常规机制最初包括卫星细胞的募集。肌肉卫星细胞(satellite cell)是独特的成肌先祖谱系，其位于成熟肌纤维(myofiber)的基膜和肌纤维膜之间(Bischoff，1994；Grounds和Yablonka-Reuveni，1993)。在再生周期中，卫星细胞被活化并从肌纤维迁移至再生位点，从而产生成肌细胞(myoblast)。大多数增殖的成肌细胞分化成肌管。肌管成熟并掺入肌纤维。剩下的成肌细胞返回肌纤维以更新卫星细胞群，因而能继续进行再生周期(图1-示意图)。

近来的研究也证明了巨噬细胞在骨骼肌再生的早期事件中的作用(Merly等，1999)。移植模型显示，刺激巨噬细胞浸润会造成卫星细胞较早活化，这证明了巨噬细胞的确在肌肉再生中起着直接作用(Lescaudron等，1997；Lescaudron等，1993)。

肌肉再生周期在个体整个生命周期中持续发生，以替换磨损的或损坏的肌肉组织。可是，当肌体衰老时，肌肉再生周期变得较不有效了。肌肉减少症(sarcopenia)，其造成了肌肉质量和性能降低，其与正常衰老相关。当骨骼肌仍旧能对本身进行再生时，似乎在衰老的肌肉中的环境较不能支持肌肉卫星细胞活化、增殖和分化，这造成了肌肉组织的净损耗(Greenlund和Nair，2003)。

在骨骼肌肉再生中指导巨噬细胞、卫星细胞和成肌细胞迁移的化学信号的性质并未完全被理解清楚。

一些生长因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和机械生长因子(Mechano Growth Factor)(MGF)，显示能通过调节卫星细胞活化来正向影响肌肉再生(Floss等，1997；Miller等，2000，Goldspink和Harridge，2004)。可是目前，没有生长因子用于临床应用，而且肌肉减少症的治疗限于体育运动、或补充生长激素(Greenlund和Nair，2003)。这些疗法仅达到有限的成功率。

因此有需求要通过卫星细胞活化、增殖和分化来提供在肌肉减少症中用于肌肉再生的有效临床治疗。

本发明的目的是以某些方式满足该需求和/或至少提供有用的选择。

发明简述

令人惊讶地，生长因子——肌肉生长抑制素(myostatin)，TGF-β家族的生长因子成员，首次显示出涉及肌肉减少症的病因。抑制肌肉生长抑制素活性被发现能在肌肉减少症的动物模型中显著增进卫星细胞的活化。

因此，本发明提供了治疗肌肉减少症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。本发明可用于治疗人和非人患者的肌肉减少症、以及与肌肉减少症相关的疾病，其特征在于肌肉萎缩和卫星细胞活化能力的降低。

肌肉生长抑制素拮抗剂可选自任意一种或多种已知的肌肉生长抑制素抑制剂。例如，US6096506和US6468535披露了抗肌肉生长抑制素抗体。US6369201和WO01/05820教导了肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体和肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性。肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂在WO02/085306中有公开，其包括截短的II型激活蛋白(Activin)受体、肌肉生长抑制素前域、和卵泡抑素。其他衍生自肌肉生长抑制素肽的肌肉生长抑制素抑制剂也是已知的，包括：例如，从过量表达肌肉生长抑制素的细胞释放入培养物中的肌肉生长抑制素抑制剂(WO00/43781)；显性阴性的肌肉生长抑制素(WO01/53350)，其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替换为酪氨酸)和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。US2004/0181033也教导了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑制素。

一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂优选包含一种或多种选自由肌肉生长抑制素肽和Piedmontese等位基因组成的组的显性阴性产物，所述肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335、350位上或氨基酸第335、350位之间被C-末端截短了。

一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括肌肉生长抑制素剪接变体，所述剪接变体包含SEQ ID NO：8-14之任一项的多肽、或其功能片段或变体、或与其具有95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括与肌肉生长抑制素途径有关的调节剂，所述调节剂包含多肽SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括反义多核苷酸、干扰RNA分子(例如RNAi或siRNA)、或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过抑制肌肉生长抑制素的基因表达来抑制肌肉生长抑制素活性。

当一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂包括抗体时，则抗体可以是源自哺乳动物或非哺乳动物的抗体，例如源自鲨鱼的IgNAR抗体，或者抗体可以是人源化抗体、或包含源自抗体的功能片段。

本发明还提供一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂在制备用于治疗有需要的患者的肌肉减少症的药物中的用途。

一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂可以选自以上公开的肌肉生长抑制素拮抗剂组。

药物可配制成用于局部或全身施用，例如，药物可配制成直接注射入肌肉，或可配制成口服施用，用于全身递送至肌肉。

本发明进一步提供了组合物，其包含一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂和药学上可接受的载体，用于治疗有需要的患者的肌肉减少症。

本发明进一步提供了一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂，其用于治疗有需要的患者的肌肉减少症。

现在，本发明将参考所附的附图图片来更详细地描述，其中：

附图简述

图1显示了卫星细胞在肌肉再生中作用的示意性模型；

图2A显示了通过肌肉生长抑制素来抑制卫星细胞活化；

图2B显示了当从培养基中去除肌肉生长抑制素(拯救)时，肌肉生长抑制素对卫星细胞的活化抑制是可逆的；

图2C显示了肌肉生长抑制素对卫星细胞迁移的影响；

图2D显示了带有BrdU阳性核的典型肌纤维(i)和带有DAPI染色核的相同肌纤维(ii)的显微照片；

图3A显示了在分离自1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的胫骨前肌的纤维上，每100个肌核(myonuclei)中的卫星细胞百分比。通过对CD34免疫染色来显现卫星细胞，并通过DAPI复染显现总核。纤维分离自每组的3只动物，每组有超过1,000个核被计数(P<0.001)；

图3B显示了在分离自1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的胫骨前肌的纤维上，每100个肌核中活化的卫星细胞百分比。通过体外BrdU结合呈现活化的卫星细胞，并通过DAPI复染来呈现总核。纤维分离自每组的3只动物，每组有超过1,000个核被计数(P<0.05)；

图3C显示了流式细胞术确定的BrdU阳性细胞的百分比。卫星细胞在体内用BrdU标记并利用Percoll梯度离心分离自1个月和6个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的后肢肌肉。每个样品组最少分析10,000个细胞一式三份(P<0.001)。空心柱代表1个月大的小鼠，实心柱代表6个月大的小鼠。各种小写字母显示了数据间显著的差异；

图4显示了分离的纤维上的PCNA阳性核的数量。分离的纤维与5μg或10μg350一起温育并用PCNA抗体免疫染色以确定每100个肌核中活化的卫星细胞数。数据表示为平均值±s.e.m(^**＝P<0.001)；

图5A显示了苏木精和曙红染色的野生型和肌肉生长抑制素缺失的小鼠的对照肌肉切片；

图5B显示了虎蛇毒素注射后一天(D1)的低倍视野观察结果；

图5C显示了与(B)相同的切片的较高倍视野观察结果，染色显示了肌纤维嗜曙红的(e)细胞质以及细小的细胞内空泡化(v)，细胞内空间增加和显著的肌纤维断裂(箭头)；

图5D显示了第2天(D2)的肌肉切片，其在肌肉生长抑制素缺失的小鼠的肌肉中核数目增加(箭头)。箭头朝向标明了沿着坏死的肌纤维边缘的肌核；

图5E显示了第3天(D3)的肌肉切片，其在野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉中都有浸润的单核细胞，但在肌肉生长抑制素缺失的切片中数目更高。刻度条等于10μm；

图5F显示了第5天的切片(D5)，其在虎蛇毒素处理的肌肉生长抑制素缺失的肌肉切片中核数目增加；

图6A显示了在野生型(肌肉生长抑制素^+/+)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉生长抑制素^-/-)的再生肌肉中的MyoD阳性成肌前体细胞百分比；

图6B显示了在野生型(肌肉生长抑制素^+/+)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉生长抑制素^-/-)的再生肌肉中的Mac-1阳性细胞百分比；

图6C显示了虎蛇毒素注射后最多28天时，MyoD和肌细胞生成素基因在对照未受损的肌肉(C)和再生野生型(wt)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉生长抑制素缺失)的肌肉中的表达图谱。GAPDH用作为对照来显示所用的RNA等量；

图7显示了虎蛇毒素注射后2、3、7和10天，在用盐水处理和用肌肉生长抑制素抑制剂350处理的小鼠中，在再生的肌肉中的Mac1阳性细胞平均数；

图8显示了在虎蛇毒素注射后第14(D14)、21(D21)和28(D28)天，在得自肌肉生长抑制素敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的组织切片上的免疫荧光。野生型组织显示出较强的着色密度，即比敲除组织有更高的波形蛋白阳性细胞浓度；

图9显示了肌肉生长抑制素对巨噬细胞迁移的化学抑制效应以及利用肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)而得到的恢复；

图10A显示了肌肉生长抑制素对绵羊初级成纤维细胞(primaryfibroblast)的化学吸引效应；

图10B显示了肌肉生长抑制素对绵羊初级成肌细胞(primarymyoblast)的化学抑制效应以及利用肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)而得到的恢复；

图11显示了第28天的(D28)野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉切片的苏木精和曙红染色(H&E)以及Van Geisen(iii)染色的的低倍(i)和高倍(ii)显微照片。在野生型肌肉切片(ii)中见到了厚的结缔组织(箭头)；在野生型肌肉切片(iii)中见到了胶原(箭头)，刻度条等于10μm；在(iv)中显示了再生24天后野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉的扫描电子显微图；刻度条等于120μm；

图12显示了从虎蛇毒素注射中恢复的小鼠中肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)对肌肉重量的影响；

图13A-D显示了虎蛇毒素注射后第7天(A-用盐水处理；B-用肌肉生长抑制素拮抗剂350处理)和第10天(C-用盐水处理；D-用肌肉生长抑制素拮抗剂350处理)，得自再生肌肉的苏木精和曙红染色的肌肉切片。星号显示了坏死区域；

图14显示了图13肌肉切片的未再生的口和再生的

面积的百分比；

图15显示了虎蛇毒素注射后第10和28天，在用盐水处理和用肌肉生长抑制素抑制剂350处理的小鼠中，再生肌肉中的胶原形成的百分比；

图16显示了虎蛇毒素注射后第28天在用盐水处理和用肌肉生长抑制素抑制剂350处理的小鼠中，再生的肌纤维平均纤维面积；

图17显示了施用虎蛇毒素后第1、3、7、10和28天，在用盐水和350处理的胫骨前肌中，基因Pax7(A)和MyoD(B)蛋白质水平(通过蛋白质印迹法检测)；和

图18显示了受损后第2和4天再生肌肉中的炎性应答增加，以及(在第21天)再生肌肉中肌肉质量增加。

定义

在整个说明书和权利要求书中使用的“肌肉减少症"指由于年老而造成的肌肉质量和性能的降低、以及与肌肉减少症相关的病况，其特征在于肌肉萎缩和卫星细胞活化能力的降低。

在整个说明书和权利要求书中使用的“肥大”指细胞大小的任何增加。

在整个说明书和权利要求书中使用的“增生”指细胞数量的任何增加。

在整个说明书和权利要求书中使用的“肌肉萎缩”指由于缺少使用而造成的肌肉组织的任何损耗(wasting)或丧失。

在整个说明书和权利要求书中使用的“抑制剂”或“拮抗剂”指任何化合物，其用于全部或部分降低蛋白质活性。它包括能结合并直接抑制蛋白质活性的化合物，或可用于减少蛋白质的产生或增加其产量，由此影响存在的蛋白质的量并由此降低其活性。

在整个说明书和权利要求书中使用的“基因表达”指转录起始、将DNA片段转录成mRNA、并将mRNA翻译成多肽。

在整个说明书和权利要求书中使用的“包含”指‘至少部分由……组成’，也就是指当解释包括该术语的独立权利要求时，每个权利要求中从该术语开始的特征都需要出现，但其他特征也可以出现。

发明详述

本发明首次显示了，肌肉生长抑制素参与肌肉减少症的病因。尤其，肌肉生长抑制素显示出是卫星细胞活化、增殖、和分化、以及因此在肌肉减少症和与肌肉减少症相关的疾病中肌肉再生的反向调节剂，所述肌肉减少症和与肌肉减少症相关的疾病的特征在于骨骼肌萎缩和卫星细胞活化能力降低。

肌肉生长抑制素是已知参与调节肌肉生长的生长因子。尤其，肌肉生长抑制素是TGF-β家族的生长因子成员并是肌形成有效的负调节剂(McPherron等，1997)。

肌肉生长抑制素敲除的小鼠极大地增加了它们整个身体中的肌肉质量。肌肉生长抑制素缺失的小鼠也比正常小鼠体重增加大约30％，并由于肌纤维增生和肥大而显示出个体肌肉重量增加2-3倍。肌肉生长抑制素中的天然突变被鉴定出是造成“肌肉倍增”表型的原因，“肌肉倍增”表型例如BelgianBlue和Piedmontese牛品种(McPherron等1997b，Kambadur等.1997，Grobet等1997)。

近来研究暗示，肌肉生长抑制素通过调节肌形成的增殖和分化步骤而是细胞周期进程和功能的有效调节剂(Langley等，2002；Thomas等，2000)。几个研究证明了肌肉生长抑制素不仅在胚胎肌形成期间起作用，而且在出生后的肌肉生长中也起作用。Wehling等(Wehling等，2000)和Carlson等(Carlson等，1999)的研究表明，由于小鼠后肢吊起而造成的与萎缩相关的肌肉丧失与M plantaris中肌肉生长抑制素水平的增加有关。肌肉生长抑制素水平增加也与HIV患者中所见的严重肌肉损耗有关(Gonzalez-Cadavid等，1998)。对于在肌肉不被使用期间观察到的肌肉生长抑制素水平升高的一个解释是，肌肉生长抑制素可用作卫星细胞活化的抑制剂。这当然为近来的研究所支持，该研究显示了缺少肌肉生长抑制素会造成活化的卫星细胞在体内增加堆积并增强卫星细胞的自我更新(McCroskery等，2003)。

至今已经暗示了肌肉生长抑制素的许多潜在应用，包括开发肌肉生长抑制素抑制剂以帮助调节动物的整个体重，或用于治疗与一般肌肉损耗相关的病况。可是，当前没有临床或兽医应用的肌肉生长抑制素抑制剂。另外，肌肉生长抑制素以前并没有与衰老中见到的肌肉质量和功能的天然下降(肌肉减少症)有过关联。

因此，本发明涉及治疗肌肉减少症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。患者优选是人患者，但本发明的方法也可用于治疗非人动物的肌肉减少症。

肌肉生长抑制素拮抗剂可选自一种或多种分子，其能全部或部分抑制肌肉生长抑制素活性。

尤其，肌肉生长抑制素拮抗剂可选自任意一种或多种已知的肌肉生长抑制素抑制剂。例如，US6096506和US6468535披露了抗肌肉生长抑制素抗体。US6369201和WO01/05820教导了肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体和肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性。肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂在WO02/085306中有公开，其包括截短的II型激活蛋白受体、肌肉生长抑制素前域、和卵泡抑素。其他衍生自肌肉生长抑制素肽的肌肉生长抑制素抑制剂也是已知的，包括：例如，从过量表达肌肉生长抑制素的细胞释放入培养物中的肌肉生长抑制素抑制剂(WO00/43781)；显性阴性的肌肉生长抑制素(WO01/53350)，其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替换为酪氨酸)和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。US2004/0181033也教导了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且所述小肽能结合并抑制肌肉生长抑制素。

优选肌肉生长抑制素拮抗剂是显性阴性的肽。这些肽衍生自亲本蛋白质，其发挥抑制亲本蛋白质的生物活性的作用。如上所述，肌肉生长抑制素的显性阴性(dominant negative)的肽是已知的，包括成熟的肌肉生长抑制素肽(其在氨基酸第335、350位上或氨基酸第335、350位之间C-末端截短了)和Piedmontese等位基因(其中第3位上的半胱氨酸替换成酪氨酸)。

最初产生的肌肉生长抑制素是375个氨基酸的前体分子，其N-末端上具有分泌信号序列，切掉它后产生无活性的原(pro-)形式。通过弗林蛋白内切蛋白酶在Arg266裂解，释放出N-末端的前域(或与潜伏期相关的肽(LAP)结构域)和成熟的肌肉生长抑制素结构域，由此活化了肌肉生长抑制素。可是，裂解后，前域仍旧能与成熟的结构域结合成无活性的复合物(Lee等2001)。所以，前域、或其片段也可在本发明中用作肌肉生长抑制素拮抗剂来治疗肌肉减少症。

肌肉生长抑制素的剪接变体已经被鉴定出来了，其也可用作肌肉生长抑制素拮抗剂(PCT/NZ2005/000250)。肌肉生长抑制素剪接变体(MSV)由额外的剪接事件产生，该事件去除了第三个外显子的大部分。产生的MSV多肽，在绵羊(oMSV；SEQ ID No：8)和牛MSV(bMSV；SEQ ID No：11)中与天然的肌肉生长抑制素前肽共有最开始的257个氨基酸，但具有独特的64个氨基酸C-末端(绵羊oMSV65，SEQ ID No：9和牛bMSV65，SEQID No：12)。mRNA有195个核苷酸的差别，可是，MSV第257位上的缬氨酸残基与常规的肌肉生长抑制素序列的相同。Belgian Blue牛的MSV(bMSVbb；SEQ ID No：7)编码短了7个氨基酸的314个氨基酸长的蛋白质(SEQ ID No：14)，但是余下的蛋白质序列在两个检测的品种中显示出具有完全的同源性。在bMSVbb中，独特的65个氨基酸的C-末端肽(SEQ ID No：12)是保守的。

也已经发现了对于包括了弗林蛋白内肽酶在内的前肽转变酶(PC1-7)来说，(KERK)裂解位点存在于第271至274位上。在第274位上裂解释放出有47个氨基酸的C-末端成熟的MSV片段(绵羊oMSV47，SEQ ID No：10和牛bMSV47，SEQ ID No：13)。

65个氨基酸的MSV片段(SEQ ID NO：12)显示出在体外可用作为肌肉生长抑制素拮抗剂(PCT/NZ2005/000250)，而且预计在体内，MSV将可用于调节肌肉生长抑制素活性。所以，本文公开的MSV多肽可用于抑制肌肉生长抑制素，由此根据本发明而治疗肌肉减少症。

另一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素基因表达的调节剂。通过导入干扰转录和/或翻译的多核苷酸，可改变肌肉生长抑制素基因表达。例如，可导入反义多核苷酸，其包括：反义表达载体、反义寡脱氧核糖核酸、反义硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸、反义寡核糖核苷酸、反义硫代磷酸酯寡核苷酸、或任何现有已知的其他形式，其包括应用化学修饰以增强反义多核苷酸的功效。通过现有已知方法可产生肌肉生长抑制素的反义分子，如通过(Rayburn等2005)所述的以及肌肉生长抑制素基因序列(McPherron等1997)的知识来进行。

将能理解，任何反义多肽不必100％互补于所讨论的多核苷酸，而需要有足够的同一性以使反义多核苷酸结合于基因上，或结合于mRNA上来破坏基因表达，而不实质性地破坏其他基因的表达。也可以理解，互补于包括5’非翻译区域的基因的多核苷酸也可用于破坏肌肉生长抑制素蛋白的翻译。同样，这些互补的多核苷酸不必100％互补，而要能足以结合mRNA并破坏翻译，而不实质性地破坏其他基因的表达。

基因表达的调节也可包括应用干扰RNA分子，其包括RNA干扰(RNAi)或小干扰RNA(siRNA)，这将为技术人员通过学习已知技术所理解(Ren等2006)。

基因表达的调节也可通过使用催化性RNA分子或核酶来实现。现有已知这类核酶可被设计成与特异性靶向的RNA分子配对。核酶结合并裂解靶向的RNA(Nakamura等2005)。

现有已知的任何其他调节基因表达和RNA加工的技术也可用于调节肌肉生长抑制素基因表达。

另一种肌肉生长抑制素拮抗剂是衍生自肌肉生长抑制素受体的肽。该受体衍生的片段通常包括肌肉生长抑制素结合结构域，其随后结合并抑制野生型肌肉生长抑制素。肌肉生长抑制素受体是IIB型激活蛋白，其肽序列在(Lee等2001)中有描述。熟练技术人员无需过多实验就可生产出该受体拮抗剂。

另一种肌肉生长抑制素拮抗剂包括抗肌肉生长抑制素抗体。抗肌肉生长抑制素的抗体是现有已知的，如上所述，产生该抗体的方法也是现有已知的。抗体可以是哺乳动物或非哺乳动物的抗体，例如鲨鱼的IgNAR类抗体；或衍生自能结合肌肉生长抑制素的任何这种蛋白质的片段或衍生物。

将可理解，其他涉及肌肉生长抑制素信号传导途径的分子将适用于本发明，尤其是具有针对肌肉生长抑制素的拮抗活性的分子。一种这类肽被称为“强效(mighty)”，其被公开于PCT/NZ2004/000308中，其用于促进肌肉生长。通过肌肉生长抑制素可抑制“强效”表达，所以它涉及相同的信号传导途径。所以将可理解，不直接抑制肌肉生长抑制素，而使用对抗肌肉生长抑制素信号传导作用的肽(例如“强效”)可用于治疗肌肉减少症。

能理解，编码“强效”基因的多核苷酸(绵羊：SEQ ID No：15和牛：SEQID No：17)可用于在肌肉上进行局部基因治疗，其能永久或瞬时表达“强效”，或可选地可直接使用“强效”蛋白质(绵羊：SEQ ID No.16和牛：SEQ IDNo.18)。将可理解，由于遗传密码的冗余性，可产生与SEQ ID No：15-18中所公开的那些不完全一样、但具有基本相同活性的序列。另外，也可产生在非关键结构域上有改变、但具有基本相同的功能的其它肽。改变可包括插入、缺失、或将一个氨基酸残基变化为另一个。这类变化包含在本发明的范围内。

本发明基于以下发现，即肌肉生长抑制素拮抗剂能治疗肌肉减少症，所以任何已知的或开发中的肌肉生长抑制素拮抗剂都适用于该方法中。这包括了任何能结合肌肉生长抑制素的分子，例如，E.coli的IMM7免疫蛋白质、或现有已知的任何其他种类的结合蛋白质。其他能结合并抑制肌肉生长抑制素的肽是已知的，例如，含氨基酸WMCPP的肽(US2004/0181033)。将能理解，任何能抑制肌肉生长抑制素的化合物将可用于本发明的方法和药物中。

用于本发明方法中的肌肉生长抑制素拮抗剂可在肌肉再生的动物模型或体外模型中测试生物活性，所述肌肉再生包括下面所讨论的肌肉减少症，并适宜地将活性化合物配制成药物组合物。除了本文所述的一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂，本发明的药物组合物可包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其他现有公知的材料。该材料应是无毒的并应当不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的精确性质将取决于药物组合物所需的性质和施用途径，如口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、局部、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用途径。

口服施用的药物组合物可以是片剂、锭剂、胶囊、粉剂、颗粒剂或液体形式。片剂或其它固体口服剂型通常将包括固体载体，如明胶、淀粉、甘露醇、结晶纤维素、或其它药物制备中常用的惰性材料。相似地，液体药物组合物，如糖浆剂或乳剂，一般将包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。

对于静脉内、经皮、皮下、皮内或腹膜内注射，活性成分将是可接受的非肠道水溶液的形式，其不含热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。

对于鼻腔或肺部施用，活性成分将是适于吸入的微小粉末或溶液或悬浮液的形式。可选地，活性成分可以是适于直接应用于鼻粘膜的形式，如膏剂或乳剂、鼻腔喷雾剂、鼻腔滴剂或气雾剂。

一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂治疗肌肉减少症的能力可根据Kirk(2000)方法在老年鼠模型中被验证。

在另一个具体实施方式中，本发明预见到了一种或多种肌肉生长因子的用途，其与本发明的药物组合物联合施用以使治疗方案获得额外的或协同的效果。该生长因子可选自由HGF、FGF、IGF、MGF、生长激素等组成的组。该物质可与本文所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时施用。

施用本发明的药物组合物优选以“预防有效量”或“治疗有效量”来进行，其量足以对个体显示出有益效果。实际施用量、和施用速率和时程将取决于要治疗的肌肉减少症的性质和严重性。开治疗处方，如决定剂量等，在开业医生和其它内科医生的职责范围内，其典型地将考察要治疗的疾病、病患个体状况、递送位点、施用方法和其它医师所知的因素。上述技术和规程的例子可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.(编)，1980中找到。

本发明也涉及一种或多种肌肉生长抑制素抑制剂在制备用于治疗有需要的患者的肌肉减少症的药物中的用途。一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂可选自上述肌肉生长抑制素拮抗剂的组。

药物可配制成用于局部或全身施用的配方，例如，药物可配制成用于直接肌肉注射的配方，或可配制成口服施用的配方，以用于向肌肉全身递送。

药物可进一步包含一种或多种其他肌肉生长促进化合物以为治疗肌肉减少症带来额外或协同效应，所述肌肉生长促进化合物选自由HGF、FGF、IGF、MGF、生长激素等组成的组。药物可配制成一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂和一种或多种肌肉生长促进化合物分开、顺序或同时施用的配方。

不限于理论，可认为通过包括诱导卫星细胞活化、增殖和分化，肌肉生长抑制素拮抗剂有效治疗肌肉减少症。

例如，抑制肌肉生长抑制素活性，已经显示出对肌肉再生有直接效果。尤其，当缺少肌肉生长抑制素(在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中)、或利用肌肉生长抑制素拮抗剂抑制肌肉生长抑制素的时候，卫星细胞和成肌细胞迁移增加了。另外，卫星细胞活化在衰老肌肉中首次显示出显著增加。

另外，抑制肌肉生长抑制素活性首次显示出对巨噬细胞募集有直接效果。尤其，当缺少肌肉生长抑制素(在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中)、或利用肌肉生长抑制素拮抗剂抑制肌肉生长抑制素的时候，巨噬细胞的数量和向再生位点迁移的时间增加了。如上所述，巨噬细胞被认为涉及卫星细胞活化。

因此显示出，抑制肌肉生长抑制素直接用于增加卫星细胞迁移和活化，并通过巨噬细胞募集而间接作用于卫星细胞活化。

肌肉生长抑制素缺失的小鼠中的结果间接显示了抑制肌肉生长抑制素活性会造成卫星细胞活化、增殖和分化的增加。这提示了抑制肌肉生长抑制素可用于在具有正常肌肉生长抑制素水平的动物中增加卫星细胞的活化。可是，由于卫星细胞是胚胎来源的，而且肌肉生长抑制素缺失的小鼠在胚胎阶段具有显著较多的卫星细胞群，因此肌肉生长抑制素缺失的表型将不能在野生型动物动物中被复制。这不仅因为卫星细胞的实际数量不能增加到肌肉生长抑制素缺失的基础水平，而且因为肌肉细胞再生周期本身在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中更有效。另外，由于肌肉生长抑制素在除了肌肉之外的组织中被找到，因此部分敲除肌肉生长抑制素活性可有不利的副作用。因此，通过应用肌肉生长抑制素拮抗剂来抑制肌肉生长抑制素活性，其对出生后的老年的肌肉再生周期的效应难以预测。这为Goldspink和Harridge，2004所支持，其注意到了用于治疗肌肉减少症的建议疗法将不是部分敲除肌肉生长抑制素，这是因为这会造成呼吸和心血管功能的损害。可是令人惊奇地，本发明首次发现，肌肉生长抑制素拮抗剂可用于成功治疗肌肉减少症，而不带来不利的副作用。

本发明也可广义地被认为个别或整体地存在于本申请说明书参考或所示的部分、元素和特征中，以及两个或更多所述部分、元素或特征的任意或全部组合，而且本文提及了特定的完整事物，这些完整事物在本发明相关的现有技术中具有已知的等同物，该已知的等同物被认为纳入本文了，就好像个别描述过一样。

本发明存在于前述内容中，并也关注以下仅给出实例的那些内容。

实施例

实施例1肌肉生长抑制素调节卫星细胞活化

方法

卫星细胞的体内BrdU标记

通过体内5-溴-2’-脱氧-尿嘧啶核苷(BrdU)标记来研究卫星细胞活化。安乐死前2小时，野生型和肌肉生长抑制素-缺失的小鼠用BrdU(Roche)(30mg/kg)一次腹膜内注射。根据经改造的Yablonka-Reuveni和Nameroff(1987)规程来分离卫星细胞。简而言之，用CO₂气体处死1个月和6个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的小鼠(每组n＝10)，然后进行颈错位。切下后肢肌肉，切碎并在含0.2％(w/v)1A型胶原酶(>260 CDU/mg，Sigma)的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中于37℃消化90分钟。捣碎肌肉浆，然后通过70μM过滤膜(BD Biosciences)，之后上样于70％和40％Percoll梯度(Sigma)中，于25℃以2000xg离心20分钟。收集两个梯度溶液之间的界面，细胞重悬于PBS中。为了检测BrdU的掺入，使用原位细胞增殖试剂盒——FLUOS(Roche)。在冰上用70％乙醇固定细胞30分钟，并用2N HCL+0.5％TritonX-100于室温(RT)处理30分钟，然后用0.1M四硼酸二钠缓冲液(pH8.5)中和。在含0.5％Tween-20的PBS中透化细胞，并于37℃与含单克隆抗BrdU-FLUOS抗体(1∶25，Roche)的温育缓冲液(Roche)温育45分钟。用FACScan(Beckton-Dickinson)流式细胞仪分析细胞。

单个肌纤维的分离和培养

根据前述的Rosenblatt等，(1995)来分离单个纤维。简而言之，用CO₂气体对1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素-缺失的小鼠进行安乐死，随后进行颈错位。切下胫骨前肌，并在含0.2％(w/v)1A型胶原酶(>260CDU/mg，Sigma)的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中于37℃消化60分钟。将肌肉转入DMEM+10％马血清(HS)+0.5％鸡胚提取物(CEE)，轻微研磨分离纤维。将分离的纤维转入用10％基质胶(Becton Dickinson)包被的4孔腔载玻片(Becton Dickinson)上，并于37℃用含4％多聚甲醛的PBS固定10分钟或于37℃在5％CO₂中以1∶1000在DMEM+10％HS+0.5％CEE+BrdU(Roche)中培养48小时。

为了确定肌肉生长抑制素拮抗剂(肌肉生长抑制素的显性阴性肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了，下文称其为“350”或“350蛋白”)对卫星细胞活化的效应，6个月大的野生型小鼠胫骨前肌的单个肌纤维在存在5μg/ml或10μ/ml 350的培养基中培养32小时，并用甲醇固定，用PBS洗涤。固定的纤维与含0.35％角叉藻聚糖λ的1∶50稀释度的抗PCNA抗体温育过夜。用山羊抗小鼠-alexa fluor546检测初级抗体。PCNA阳性的活化的卫星细胞在显微镜下计数并表示成总肌核(myonuclei)的百分比。

根据改良的Beauchamp等，(2000)方法，用CD34抗体检测卫星细胞。简而言之，用多聚甲醛固定纤维，用PBS洗涤，在含0.5％TritonX-100的PBS中透化10分钟，并用含10％常规羊血清的PBS在室温封闭30分钟。导入含1∶100的大鼠抗小鼠CD34单克隆抗体(克隆RAM34；PharMingen)并含0.35％角叉藻聚糖λ的(Sigma)的PBS过夜。用含1∶300的生物素化的山羊抗大鼠IgG多克隆抗体(Amersham)并含0.35％角叉藻聚糖λ的(Sigma)的PBS在室温下温育2小时，然后在RT下用含1∶400的抗生物素蛋白链菌素缀合的Alexa fluor488(Molecular Probes)并含0.35％角叉藻聚糖λ(Sigma)的PBS温育1小时，由此检测初级抗体。用含1∶1000的DAPI的PBS复染纤维5分钟，然后用荧光固定培养基(Dako)固定，并用OlympusBX50显微镜和SPOT RT照相机和软件检测。

掺入BrdU的细胞的检测按照5-溴-2’-脱氧-尿嘧啶核苷标记与检测试剂盒(Roche)规程进行。用含1∶1000的DAPI的PBS复染纤维5分钟，然后用荧光固定培养基(Dako)固定并用Olympus BX50显微镜和SPOT RT照相机和软件检测。

通过肌肉生长抑制素抑制卫星细胞活化。

如上所述，从4周大的野生型小鼠(n＝3)中分离出单个肌纤维。让纤维粘附3分钟，然后加入500μl纤维培养基(FM)[DMEM，10％(v/v)马血清(HS)，0.5％(v/v)鸡胚提取物(CEE)，(青霉素/链霉素)]或其中增加了重组肌肉生长抑制素的量的FM(Thomas等，2000)。从E.coli中纯化重组肌肉生长抑制素在别处(Thomas等，2000)有述。在37℃/5％CO₂，让细胞迁移出纤维72小时。用倒置显微镜计数每个孔中的迁移的卫星细胞数量。重复至少30个单个纤维，用于进行统计分析。组间的差异通过正态线性化模型用GenStat6二项式分布来分析。

纤维上活化的卫星细胞中体外BrdU掺入：

通过上述方法，从4周大的野生型小鼠(n＝6)中分离出肌纤维，并使之附着到10％基质胶包被的4孔Lab-Tek^腔载玻片上。向孔中加入包含10μM BrdU的FM培养基，其带有或不带有浓度逐渐提高的肌肉生长抑制素，温育纤维48小时。在拯救实验中，分离的纤维在含1μg/ml肌肉生长抑制素的FM中培养24小时，然后轻轻洗去一半并替换为FM，同时将另一半保留在含重组肌肉生长抑制素的培养基中再培养24小时。在-20℃用Carnoys固定液固定纤维过夜。根据Roche(Roche国际诊断公司)细胞增殖试剂盒1规程进行BrdU掺入和检测。利用DAPI染色来使所有肌核可见化。计数纤维(n＝30)上的BrdU阳性核，并计算每100个DAPI阳性核中BrdU阳性核的数目。组间的差异通过正态线性化模型用GenStat6泊松分布来分析。

结果

肌肉生长抑制素抑制卫星细胞的活化

为了证明肌肉生长抑制素对卫星细胞活化的直接效应，我们在肌肉生长抑制素处理后评估卫星细胞的增殖。对分离自野生型小鼠的各个肌纤维进行培养以使卫星细胞活化，和进行如通过BrdU结合所指示的增殖(Conboy和Rando，2002；Rosenblatt等，1995)。在缺少重组肌肉生长抑制素的情况下，有卫星细胞增殖，导致被计数的核中6％掺入了BrdU。可是，当以增加的浓度向培养基中加入重组肌肉生长抑制素时，较少卫星细胞增殖了。在肌肉生长抑制素浓度为5μg/ml时，少于1％的被计数核掺入BrdU(P<0.001)。为了证明肌肉生长抑制素对卫星细胞的增殖效应是可逆的，去除添加的重组肌肉生长抑制素；去除重组肌肉生长抑制素后，有显著更大量的卫星细胞增殖了(P<0.001，图2A和B)。

这些结果显示，肌肉生长抑制素直接抑制了不活动的卫星细胞进入细胞周期。为了进一步研究肌肉生长抑制素对卫星细胞增殖的效应，使卫星细胞与纤维分离从而迁移并接着增殖。图2C证明了当不向培养基中加入重组肌肉生长抑制素时，平均检测到了30个成肌细胞。可是，随着肌肉生长抑制素浓度增加，迁移的成肌细胞数目减少了。这些结果清楚地证明了，肌肉生长抑制素直接抑制卫星细胞的活化。

肌肉生长抑制素对衰老时的卫星细胞数量和活化的影响。

在卫星细胞中表达肌肉生长抑制素，利用年轻肌肉生长抑制素缺失的小鼠的研究显示，肌肉生长抑制素的缺少导致了每单位纤维长度有较多的卫星细胞数目并导致了它们更倾向于活化(McCroskery等，2003)。为了阐明肌肉生长抑制素和衰老对卫星细胞行为的影响，对1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素缺失的小鼠的卫星细胞总数和它们活化的能力进行定量。

为了分析每单位纤维长度的卫星细胞数，利用细胞表面标记CD34对附着于单个纤维的卫星细胞计数(图3A)，所述单个纤维分离自1个月和24个月大的野生型和肌肉生长抑制素缺失的胫骨前肌。结果显示，每纤维100个肌核的卫星细胞平均数从1个月大的野生型纤维中观察到的5显著增加到了1个月大的肌肉生长抑制素缺失的纤维中的11(图3A)。衰老显示对卫星细胞数几乎没有影响，在1个月和24个月大的野生型或肌肉生长抑制素缺失的纤维之间没有观察到卫星细胞数目的显著改变(图3A)。

由于不但卫星细胞数目而且卫星细胞活性与肌肉再生的能力相关，用体外和体内BrdU标记研究卫星细胞的活化。附着于分离的纤维上的BrdU体外标记的卫星细胞显示，在1个月大的野生型胫骨前肌中每纤维中活化的卫星细胞平均百分比为6.5％，而相应地，在1个月大的肌肉生长抑制素缺失的胫骨前肌中为10％(图3B)。可是，在衰老过程中，在野生型和肌肉生长抑制素缺失的24个月大的小鼠中，卫星细胞活化都降低了(图3B)。值得注意的是，在24个月时，与野生型纤维相比，在肌肉生长抑制素缺失的肌纤维中每纤维有两倍的活化卫星细胞数目。最终，还利用体内BrdU掺入测量卫星细胞活化的倾向性。BrdU标记的卫星细胞的FACS分析显示了体外标记的卫星细胞的相似倾向。来自1个月大的野生型肌肉的活化的卫星细胞百分比为8.5％，而相应地1个月大的肌肉生长抑制素缺失的肌肉中的为14.8％。随着年龄增加，野生型和肌肉生长抑制素缺失的六个月大的肌肉中的活化的卫星细胞百分比分别显著下降了2％和5％(图3C)。值得注意的是，与对照相比，在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中有两倍的可活化的卫星细胞数目。

350能活化卫星细胞

因为缺失的小鼠中卫星细胞生理性质(包括每肌纤维的数量和活化程度)可能是由于胚胎发育期介导的效应造成的，而不是由于出生后缺少与肌肉生长抑制素的接触而造成的，因此我们测试了肌肉生长抑制素拮抗剂对野生型小鼠卫星细胞活化的影响。当包含卫星细胞的野生型小鼠的单肌纤维与增加浓度的350一起温育时，观察到了增加的卫星细胞活化数目。该结果确认了，350是野生型肌肉中卫星细胞的有效活化剂。它也显示了，肌肉生长抑制素缺失的小鼠中观察到增加的卫星细胞活化可能是由于出生后持续不与肌肉生长抑制素接触造成的，而并非来源于胚胎不接触肌肉生长抑制素的效应。350能活化不活动的野生型卫星细胞的发现，结合观察到了肌肉生长抑制素缺失的小鼠在老年时增加了活化的卫星细胞水平，这显示了施用350或其他肌肉生长抑制素拮抗剂预计能防止诸如老年人中肌肉减少症的病况的发生。另外，在活化的卫星细胞比例已经有起色的情况下，预期其能降低病况的严重性(图4)。

实施例2：肌肉生长抑制素拮抗剂增加炎性应答和卫星细胞的趋化性

肌肉减少症是与老龄相关的肌肉损耗形式。随着变老，伴随肌纤维萎缩而来的是肌肉质量减少了。这些事件不仅影响肌纤维而且影响卫星细胞，造成肌肉再生能力的下降。这主要归因于卫星细胞丧失对损伤响应的活化的倾向，和对常规补充肌纤维的需求。另外，再生的另一主要步骤，对肌肉损伤的炎性反应，也在老年时降低了并造成了肌肉减少症部分症状。肌肉生长抑制素——肌形成过程有效的负调节剂，在衰老时会显示出在循环中增加了。我们在本文中提供了数据，确认了增加的肌肉生长抑制素水平抑制卫星细胞的活化和炎性细胞的趋化性。我们也提供了证据，即强肌肉生长抑制素拮抗剂能逆转并拯救肌肉生长抑制素介导的对卫星细胞活化和炎性细胞趋化性的抑制。这些令人惊讶的发现显示了肌肉生长抑制素抑制剂可用于对肌肉减少症的治疗。

材料和方法

350的表达和纯化

对应于牛肌肉生长抑制素267-350位氨基酸的cDNA(下文中被称为350或350蛋白)被PCR扩增出并克隆进pET16-B载体中。350蛋白的表达和纯化按照制造商(Qiagen)的规程在天然条件下进行。

虎蛇毒素模型

用25％芬太尼(Hypnorm)(柠檬酸芬太尼0.315mg/ml和氟茴哌丁酮10mg/ml)和10％速眠安(Hypnovel)(咪唑安定5mg/ml)的混合物以0.1ml/10g体重的量来麻醉6至8周大的雄性C57BL/10和肌肉生长抑制素^-/-小鼠(每组n＝27)。右腿的胫骨肌前肌用100μl注射器(SGE，澳大利亚)肌肉注射10μl 10μg/ml的虎蛇毒素。在第0天(对照)和第1、2、3、5、7、10、14或28天(每天n＝3)，从安乐死的小鼠中切下胫骨前肌。胫骨前肌在组织Tec液中固定，并在用液氮冷冻的异戊烷中冷冻。对于350在年老的肌肉上进行的试验，如上所述，用虎蛇毒素注射1岁大的野生型小鼠的左胫骨前(TA)肌肉。在第1、3、5、和7天，用肌肉生长抑制素拮抗剂(350)以6μg每克体重皮下注射注射过虎蛇毒素的小鼠，或注射等量盐水(对照小鼠)。为了评估350对肌肉康复的效应，在注射虎蛇毒素后第1、3、7、10和28天使小鼠安乐死，切下胫骨前肌，进行蛋白质分离或组织切片。冷冻的肌肉样品储存于-80℃。7μm的横向切片(n＝3)在3个水平进行切割，相隔100μm。然后用苏木精和曙红或Van Geisen对切片染色。然后用装有DAGE-MTIDC-330彩色照相机(DAGE-MTI Inc.)的Olympus BX50显微镜(OlympusOptical Co.，德国)检测切片并拍照。

免疫组织化学

用2％多聚甲醛后固定(post fix)冷冻的肌肉切片(7μm厚)，然后用含0.3％(v/v)Triton X-100的PBS透化，然后用10％(v/v)正常羊血清-Tris缓冲盐水(NGS-TBS)于室温封闭1小时。切片与用5％NGS-TBS稀释的抗体一起于4℃温育过夜。所用的抗体是：小鼠抗MyoD，1∶25稀释度(554130；PharMingen)，它是活化的成肌细胞的特异性标记物(Cooper等，1999；Koishi等，1995)；山羊抗Mac-1，1∶400稀释度(整联蛋白M-19；Santa Cruz)，它是特异于浸润的外周巨噬细胞的抗体(Springer等，1979)；1∶300稀释度的小鼠抗波形蛋白抗体，它是成纤维细胞的标记物。用PBS洗切片3次，然后与1∶400稀释度的驴抗小鼠Cy3缀合物(715-165-150；JacksonImmunoResearch，West Grove，PA，美国)或1∶400稀释度的生物素化的驴抗绵羊/山羊IgG抗体(RPN1025；Amersham)一起温育。二级抗体温育后，与荧光素缀合的抗生物素蛋白链菌素(S-869；Molecular Probes)一起于室温温育30分钟，所述抗生物素蛋白链菌素稀释度为1∶400，其用5％NGS-TBS稀释。用PBS漂洗切片3次，用DAPI复染并用Dako^荧光固定介质固定。用落射荧光显微镜检测胫骨前肌切片。用装有DAGE-MTI DC-330彩色照相机(DAGE-MTI Inc.，IN，美国)的Olympus BX50显微镜(OlympusOptical Co.，德国)拍下典型的显微照片。用Scion成像程序(NIH)对5个随机挑选的肌肉切片测量出平均肌肉面积，所述肌肉切片是前面来自于对肌肉生长抑制素^-/-和野生型小鼠进行免疫组织化学而用的切片。

趋化性试验

根据公开的规程(Allen等，1997；Partridge，1997)，培养来自于4至6周大的小鼠的后肢肌肉的初级成肌细胞。简而言之，切碎肌肉并在0.2％1A型胶原酶中消化90分钟。通过预先在未包被的平板上铺板3小时来富集培养物中的成肌细胞。成肌细胞培养物在10％基质胶包被的平板上于37℃/5％CO₂培养于补加20％胎牛血清(FCS)、10％HS和1％CEE的生长培养基(GM)中。48小时后，通过流式细胞术分析培养物中MyoD的表达来评估培养物纯度程度。用胰蛋白酶收集细胞，以10⁶个细胞/200μl的浓度重悬并用5ml70％乙醇于-20℃固定过夜。用1∶200的兔多克隆抗MyoD(Santa Cruz)于室温进行染色30分钟，然后用1∶500的Alexa fluor488抗兔缀合物染色(Molecular Probes)。分析一式两份进行，每个试验中收集10⁴个细胞事件。通过对前向和侧向散射图谱进行射门来排除碎片。通过FACscan(Becton Dickinson)来分析细胞。通过腹膜灌洗技术来分离巨噬细胞。根据公开的规程(Colditz和Movat，1984)制备酵母聚糖活化的小鼠血清(ZAMS)。在带有7mm直径的孔的Boyden型单盲孔腔室(Neuro Probe，MD美国)中进行趋化性实验。彻底洗涤带有8μm洞的聚碳酸酯过滤膜(Neuro probe；洞＝6％的表面积)，而对于成肌细胞试验，用含1％基质胶的DMEM处理过滤膜30分钟。然后干燥过滤膜并置于顶层和底层腔室之间。

对于成肌细胞的趋化性试验，含5％鸡胚提取物(CEE)和透析缓冲液的DMEM用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(2.5和5μg/ml肌肉生长抑制素)和350蛋白质(5倍肌肉生长抑制素浓度，即，12.5μg/ml和25μg/ml)加入阳性对照培养基中。纯DMEM用作阴性对照。在24孔板上，用测试或对照培养基注满底层孔。将七万五千个细胞加入到顶层孔中。于37℃、5％CO₂温育平板7小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。

对于巨噬细胞的趋化性试验，含33％酵母聚糖活化的小鼠血清(ZAMS))的DMEM和透析缓冲液用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(5μg/ml肌肉生长抑制素)和350蛋白质(2和5倍肌肉生长抑制素浓度，即，10μg/ml和25μg/ml)加入阳性对照培养基或纯DMEM中。在24孔板上，用测试或对照培养基注满底层孔。将七万五千个细胞加入到带有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)0.8μm膜的顶层孔中。于37℃、5％CO₂温育平板4小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。

从羊羔皮肤外植体上获取初级成纤维细胞。含10pg/ml重组TGF-β的DMEM用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(5μg/ml肌肉生长抑制素)加入到阳性对照培养基中。在24孔板上，用测试或对照培养基注满底层孔。将八万八千个细胞加入到带有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)0.8μm膜的顶层孔中。于37℃、5％CO₂温育平板4小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。

针对基因表达的RTPCR

根据厂商规程用Trizol(Invitrogen)分离总RNA。用Superscript预扩增试剂盒(Invitrogen)进行反逆转录反应。用1μl反转录反应液进行PCR，即94℃30秒，55℃30秒，和72℃30秒。对于每个基因，利用不同的循环来确定指数扩增所需的循环数。在琼脂糖凝胶上分离扩增子并转移至尼龙膜上。通过DNA印迹杂交来检测PCR产物。用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA的丰度来校正每个数据点。

结果

肌肉生长抑制素影响成肌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的趋化性。

再生周期中还涉及炎性应答，例如对破坏的或破损的肌肉细胞的应答。免疫应答的特征在于存在嗜曙红细胞，而在野生型和肌肉生长抑制素^-/-肌肉中，在虎蛇毒素注射后24小时内都见得到成肌细胞迁移(图5C)。到第2天，野生型和肌肉生长抑制素^-/-应答在炎性应答和卫星细胞迁移上的差异明显，其中肌肉生长抑制素^-/-肌肉切片中再生位点上的核增长显著提高(图5D，箭头)。观察到的核数目的增加是由于巨噬细胞和成肌细胞数目增加而造成的。沿着坏死的肌纤维边缘可见到最高密度的核(图5D，箭头)，尤其在肌肉生长抑制素^-/-切片中。到第3天，再生的野生型肌肉切片也显示出核数目增加了，然而仍旧远小于从肌肉生长抑制素^-/-小鼠中收集的对应组织(图5E)。在野生型和肌肉生长抑制素^-/-肌肉切片中，虎蛇毒素注射后单核细胞增加的顶点都出现在第5天(图5F)。所示的主要效应是巨噬细胞和成肌细胞加速迁移到肌肉生长抑制素^-/-肌肉切片中的再生位点上。

在肌肉再生期间，炎性细胞和卫星细胞迁移到再生位点上(Watt等，1994)。为了确定缺少肌肉生长抑制素是否能增强活化的卫星细胞或炎性细胞的迁移，定量再生位点上的炎性细胞和成肌细胞的比例。用免疫组织化学来检测MyoD(成肌细胞的特异性标记物)(Beauchamp等，2000)和Mac-1(用于浸润的外周巨噬细胞)(Kawakami等，1995)。发现未处理的对照肌肉切片对MyoD免疫染色阴性。用DAPI染色肌肉切片从而计数出核的总数。定量结果证明了与野生型切片相比，在肌肉生长抑制素^-/-再生的肌肉中在第二天，再生位点上出现了两倍数量的成肌细胞(MyoD阳性)(图6A)和巨噬细胞(Mac-1阳性)(图6B)。从注射后第2天到第5天，肌肉生长抑制素^-/-肌肉切片上有多于野生型肌肉的成肌细胞(图6A)。像MyoD阳性细胞一样，在肌肉生长抑制素^-/-肌肉应答虎蛇毒素损伤中的更早期(第2天)，可见到巨噬细胞向再生位点增加浸润(图6B)。另外，肌肉生长抑制素^-/-肌肉中更迅速减少的炎性细胞数表明，肌肉生长抑制素^-/-小鼠中整个炎性细胞应答过程都加速了(图6B)。

Grounds等(Grounds等，1992)证明了MyoD和肌细胞生成素的基因表达可用作在肌肉再生期间非常早期检测迁移的成肌细胞的标记物。因此在再生的组织中确定MyoD和肌细胞生成素的表达。定量RT-PCR结果确证了肌肉调节因子myoD和肌细胞生成素的表达，与野生型肌肉相比，在肌肉生长抑制素^-/-肌肉中是在较早时表达的。在肌肉生长抑制素^-/-肌肉中，在虎蛇毒素注射后12小时内检测到了高水平的MyoD mRNA。可是在野生型肌肉中，直到虎蛇毒素注射后第1天才检测到MyoD表达(图6C)。相似地，在再生的肌肉生长抑制素^-/-肌肉中，在虎蛇毒素注射后12小时内的非常早期阶段也检测到更高水平的肌细胞生成素mRNA。可是，在野生型再生的肌肉中，直到由虎蛇毒素注射造成的肌肉损伤后1天才检测到肌细胞生成素mRNA(图6C)。因此，免疫组织化学和基因表达分析的结果同时表明，肌肉生长抑制素^-/-肌肉中成肌细胞向再生位点的迁移增加并加速了。

年老时，在骨骼肌肉中可见到卫星细胞活化和炎性应答的减少。基于本文提供的数据，我们认为年老肌肉中所见到的增加水平的肌肉生长抑制素在应答损伤并在必要时防止肌肉堆积时，造成了倾向于丧失要活化的卫星细胞。为了逆转这些肌肉减少症中所见的情况，我们用肌肉生长抑制素拮抗剂治疗小鼠。

为了证明350抑制肌肉生长抑制素活性而带来增强炎性应答的有益效果，虎蛇毒素注射后进行肌肉再生的小鼠用350蛋白处理，并确定炎性应答。第2天在用350处理过了的受损的肌肉中发现更高百分比的Mac1阳性巨噬细胞(图7)。到第3天，350处理的肌肉中的百分比掉落到盐水处理的第3天的肌肉之下，并在第7和10天的肌肉中持续更低。该结果显示到第2天在350处理的肌肉中有早期或更深层次的巨噬细胞募集，然后到第7和10天募集降低了。这些结果显示350处理加速肌肉炎性过程。诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂通过抑制肌肉生长抑制素效应而增强巨噬细胞应答的能力显示出，施用肌肉生长抑制素抑制剂或拮抗剂对患有肌肉减少症的人会带来有益效果，其通过在衰老期间恢复维持肌肉完整性所需的炎性应答来实现。

除了成肌细胞，成纤维细胞也会迁移至再生位点并在其上扩增。研究肌肉再生时肌肉生长抑制素对成纤维细胞迁移动力学的影响。如用波形蛋白抗体(成纤维细胞的特异性标记)染色的图8所示，与野生型肌肉相比，在肌肉生长抑制素^-/-小鼠胫骨前肌中的再生位点上成纤维细胞的增加实质上较小。该结果以及以下成纤维细胞迁移试验的数据，清楚证明了肌肉生长抑制素是用作为成纤维细胞的化学引诱物的。

肌肉生长抑制素对成肌细胞和巨噬细胞趋化性的抑制并通过350对其拯救

已经证明了24小时后，由虎蛇毒素损伤的肌肉组织中的肌肉生长抑制素出现了显著倍数的增加(Kirk等2000)。

以上提供的结果显示，肌肉生长抑制素^-/-肌肉中巨噬细胞浸润增加并加速，和成肌细胞向再生区域迁移增加并加速。由于这两种细胞类型已知都受趋化性因子影响而指导它们的运动(Bischoff，1997；Jones，2000)，研究肌肉生长抑制素对卫星细胞衍生的成肌细胞和巨噬细胞的迁移能力的影响。为了测试肌肉生长抑制素是否干扰趋化性信号，使用盲孔(blind-well)趋化性腔室。通过过滤膜来评估分离的成肌细胞或巨噬细胞针对化学引诱物(针对成肌细胞是CEE，而针对巨噬细胞是ZAMS活化的血清)的迁移能力。如流式细胞术所测得的，发现分离的成肌细胞90％是成肌性(MyoD阳性)的。如图9所示，将5μg/ml肌肉生长抑制素加入到ZAMS培养基中能完全消除巨噬细胞迁移。当向含5μg/ml肌肉生长抑制素的培养基中加入350蛋白时，观察到了肌肉生长抑制素对巨噬细胞的化学抑制效应的显著拯救(增加了20倍)。该结果确认了施用诸如350的肌肉生长抑制素抑制剂能通过降低肌肉生长抑制素对巨噬细胞迁移的抑制而加速肌肉再生进程。

除了对巨噬细胞迁移的影响，我们在本文中还证明了诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂也能降低肌肉生长抑制素对成肌细胞趋化性移动的负效应。向阳性对照培养基中加入2.5和5μg/ml重组肌肉生长抑制素会分别造成成肌细胞迁移被抑制了66和82％。当向含重组肌肉生长抑制素的培养基中加入350蛋白质时，肌肉生长抑制素对成肌细胞的化学抑制效应被拯救至近似于阳性对照中所观察到的水平，因此证明了诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂能通过增强成肌细胞迁移而有效地加速肌肉再生(图10B)。诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂通过降低肌肉生长抑制素抑制效应而增强成肌细胞迁移的能力显示了施用肌肉生长抑制素抑制剂对患有肌肉减少症的人会带来有益效果，其通过在衰老期间恢复维持肌肉完整性所需的炎性应答来实现。

肌肉生长抑制素用作针对成纤维细胞的化学引诱物

与巨噬细胞和成肌细胞相反，肌肉生长抑制素可用作成纤维细胞迁移的化学引诱剂。在肌肉生长抑制素缺失的肌肉中观察到成纤维细胞向再生位点迁移的减少支持了这个结果(图10A)。为了直接证明肌肉生长抑制素对成纤维细胞的趋化性效应，利用重组肌肉生长抑制素在体外进行迁移试验。如图10A所示，与缓冲液对照相比，肌肉生长抑制素的加入增加了成纤维细胞的趋化性移动。

实施例3：对肌肉生长抑制素进行拮抗使得纤维变性减少并增强肌肉再生。

方法

切割创伤模型

在每只小鼠(野生型和肌肉生长抑制素缺失)的左胫骨前肌(TA)切开3mm的横向切口。在损伤后第0、3、5、和7天，野生型胫骨前肌在损伤位点上以2μg/g体重注射350蛋白(总量为85μg/小鼠)或盐水(注射入胫骨前肌肉)。未受损的右胫骨前肌用作为对照。在切割后第2、4、7、10和21天收集受损的和对照肌肉，并确定它们的重量。还通过Van Geisen染色来测定胶原沉积在再生位置和再生的肌肉组织上的程度。

扫描电子显微术

剔除肌肉样品的脂肪和肌腱，并用含2.5％(v/v)戊二醛的10ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)固定48小时，期间轻轻摇动。用PBS洗去戊二醛，洗1小时，然后转移到50ml2M NaOH中，并于25℃恒温温育5天。然后用PBS洗样品并移入50ml无菌蒸馏水中。再于25℃恒温保存肌肉4天。在前36小时，每隔12小时换水，然后每隔24小时换。然后将肌肉转移入1％丹宁酸，放置2小时，然后用PBS洗3次。用1％OsO4处理肌肉2小时，然后用递增梯度的乙醇(50％-100％)用浸入法脱水3次，每次15分钟。用二氧化碳干燥肌肉样品并用金包被。检测标本并用带有10kV加速电压的扫描电子显微镜(HITACHI 4100，日本)拍照。

如实施例2所述用Van Geisen在第21天评估野生型相对于缺失型的割伤胫骨前肌中的胶原积聚。

结果

缺少肌肉生长抑制素能增强肌肉再生并减少纤维变性

肌肉减少症的一个重要指标是由于纤维变性增加而造成的肌肉力量的丧失。骨骼肌肉在出生后衰老过程中重复退化和再生周期，这造成纤维变性组织的积聚。为了评估肌肉生长抑制素在纤维变性中的作用，虎蛇毒素注射之后比较这两种肌肉基因型的组织学(参见实施例2中的方法一节)。在第28天，在苏木精和曙红染色的来自于受损的野生型肌肉的切片中观察到疤痕组织，而在肌肉生长抑制素^-/-肌肉切片中只观察到非常少的疤痕组织(图11A)。Van Geisen氏染色进一步确认了结缔组织的存在(图11A)。在第28天，野生型肌肉切片上有较大的胶原面积，所以与肌肉生长抑制素^-/-肌肉相比，切割过的野生型组织中可见到更多疤痕组织。为了进一步确认该结果，用扫描电子显微镜分析再生的肌肉。第0天(对照)和第24天再生的肌肉的扫描电子显微照片，显示了结缔组织框架包围原来由肌纤维占据的空间(图11A)。在对照(未受损)的样品中，野生型和肌肉生长抑制素^-/-肌肉在纤维腔周围都没有变厚的结缔组织。可是，到了肌肉再生的第24天，在野生型肌肉中观察到了密集的结缔组织束(图11A)，但在肌肉生长抑制素^-/-肌肉中没有观察到。相似地，在割伤肌肉模型中比较肌肉生长抑制素缺失的与野生型小鼠，在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中，第28天再生肌肉位点上胶原积累的程度显著减少(数据未提供)。这些结果确认了缺少肌肉生长抑制素会导致肌肉再生后减少疤痕组织。预期这能帮助在衰老的肌肉中减少疤痕组织，因而减少肌肉减轻症的症状。

350处理能增强肌肉再生并降低纤维变性

为了研究诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂在增强肌肉再生中的功效，用虎蛇毒素使1岁大的野生型小鼠(C57Black)受损伤并注射350(参见实施例2中的方法)。典型地，在虎蛇毒素损伤后，肌肉重量起初由于产生的水肿而增加，然后由于受损的肌纤维坏死而降低，所述受损肌纤维从受损位点处被清除。这以后，肌肉重量由于新纤维的生长而开始增加。试验结果显示在第7和10天，350处理的肌肉的重量丧失不如注射对照盐水的肌肉的多(图12)。这可能是由于较快修复受损的肌肉而造成的。提供的分子数据(图7)确实支持以下假说：即在350治疗的小鼠中，受损的肌肉较快地再生是由于巨噬细胞迁移的加速和增强以及较早讨论的其它加速肌肉再生的过程的组合而造成的，所述其它加速肌肉再生的过程与肌肉生长抑制素拮抗剂用于治疗肌肉减少症的用途有关。

组织学分析证实了盐水和350处理的肌肉之间的差异。苏木精和曙红染色显示了与盐水处理的肌肉相比，在用350处理的肌肉中初生肌纤维较早的形成了，而且相关地坏死区域较早的减少了(图13)。该结果证实了在350处理的小鼠中肌肉再生加速并增强了。分析图9所示的组织学数据以定量整个肌肉横切面视野区域上的再生的和未再生的面积。肌肉切片始终取自每片肌肉中间饱满部分。图14中所示的分析显示，与350治疗的小鼠相比，在第7天在盐水治疗的对照小鼠中未再生的面积增加了。结果，与350处理的小鼠相比，在第7天在对照中有相对较少的再生的肌肉。在第10天也见到了相同的效果。这些结果确认了，与盐水处理的对照相比，在350处理的肌肉中未再生面积减少了，而再生面积增加了。

另外，检测胶原的Van Geisen染色显示在施用虎蛇毒素后第10和28天，与盐水处理的肌肉相比，胶原沉积的水平在350处理的肌肉中下降了，这显示在肌肉再生过程中，350处理能减少纤维变性(图15)。该结果证明了，诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂在肌肉再生期间减少了疤痕组织(纤维变性)的形成。这显示了，预计施用诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂能帮助在衰老肌肉中减少疤痕组织，由此减轻肌肉减少症的症状。

利用Van Geisen染色成像，施用虎蛇毒素后第28天测量随机挑选的再生的纤维区域以评估纤维大小(图16)。得自该分析的结果显示，来自350处理的肌肉的再生纤维显著大于盐水处理的肌肉。经修复的肌纤维大小增加确认了由于通过350抑制肌肉生长抑制素功能而诱导出肌肉细胞的肥大。

为了进一步确认350处理的小鼠中肌肉再生增加部分是由于卫星细胞活化增加而造成的，我们对Pax7和MyoD蛋白的表达进行了分子分析。Pax7蛋白是卫星细胞的标记物，而MyoD的表达表示卫星细胞的活化。蛋白质分析确认卫星细胞活化和水平增加(图17)。用350治疗的Pax7水平(图17A)在第3、7、10、和28天较高，这显示与盐水处理的肌肉相比，卫星细胞活化增加了。另外，在350处理的肌肉中，Pax7水平在第7和10天之间增加了，而相反，在盐水处理的肌肉中观察到了下降。这显示了，在350处理的肌肉中，在第10天左右卫星细胞活化增加了。用350治疗的MyoD水平(图17B)在第3、7、和10天也较高，这显示与盐水处理的肌肉相比，增加了肌形成。综合考虑，在350处理的组织中较高的Pax7和MyoD水平支持了卫星细胞活化的观察结果，因此继而肌形成增加了。该结果确认了用350处理能加速并增强肌肉再生，而且会减轻肌肉减少症的症状。

局部应用350诱导肌肉再生增强

为了评估在肌肉再生位点直接应用350对增强肌肉再生的有效性，将350蛋白质应用到通过上述切割而造成损伤后再生的胫骨前肌上。未受损的右胫骨前肌用作为对照。在受损后第2、4、7、10和21天收集受损的和对照肌肉并确定它们的重量。在切割后第2和4天，在注射350和注射盐水的胫骨前肌中都观察到了由于炎性浸润造成的最初的肌肉重量增加(图18)。在损伤肌肉后第7至10天，注射350和注射盐水的胫骨前肌都恢复到它们的正常重量。可是，在损伤后第21天，与盐水处理的肌肉相比，注射350的胫骨前肌显示出通过肌肉重量反映出的肌肉大小显著增加。

讨论

肌肉减少症是与年龄相关的肌肉质量和力量的丧失。减少的肌肉质量的部分原因是在衰老时的卫星细胞活化以及之后肌肉受损后再生和随时间维持正常肌肉补充过程的能力下降而造成的。炎性应答的速度较慢和成肌细胞数量下降是在老年时对降低肌肉再生起主要作用的因素。近来，在老年男人和女人中显示有效的肌肉生长负调节剂(肌肉生长抑制素)的水平较高。本文记录的数据清楚证明了，肌肉生长抑制素抑制卫星细胞活化和炎性应答。因此我们提出肌肉生长抑制素涉及肌肉减少症的进程。本文提供的数据也证明了缺少肌肉生长抑制素或通过350抑制肌肉生长抑制素活性在肌肉损耗期间能使卫星细胞活化和炎性应答增加。因为350能深层次活化卫星细胞，所以在衰老时施用350可通过卫星细胞活化驱动的过程使炎性应答活化并使肌肉组织再生和补充。这将进一步导致巨噬细胞和成肌细胞对再生区域的趋化性增加。由于缺少肌肉生长抑制素也会使成肌细胞的增殖增加，所以这进一步导致在衰老时期肌形成增加、肌肉损伤被成功修复以及肌肉补充增加。本文提供的体内试验数据的确清楚证明了，施用350能增强肌肉再生，由此确认了350和其它肌肉生长抑制素拮抗剂将是有价值的治疗肌肉减少症的治疗选择。

由于肌肉受损和再生的重复周期，出现的肌肉纤维变性的增加导致了肌肉强度的减少。在肌肉再生期间，浸润的成纤维细胞造成了纤维变性。我们在本文中清楚地显示了，肌肉生长抑制素作用为成纤维细胞迁移的化学引诱剂。相反，缺少肌肉生长抑制素造成了成纤维细胞的减少。在肌肉再生期间施用350时，我们观察到了纤维变性的下降。因此，可认为在肌肉减少症期间施用350也会帮助减轻肌肉中在衰老时发生的纤维变性并将增加老年肌肉的肌肉强度。

结论

在老年肌肉中，肌肉生长抑制素拮抗剂能成功地通过增加肌肉再生和减少纤维变性而增进肌肉质量。所以，肌肉生长抑制素拮抗剂将提供用于治疗和/或预防肌肉减少症的有价值的治疗选择。

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引用的专利

US6096506，US6369201，US6468535，US2004/0181033，US2002/0181033，WO02/085306，WO01/53350，WO01/05820，WO00/43781，PCT/NZ2005/000250，PCT/NZ2004/000308

本文中引用的所有文献都纳入本说明书参考。

工业实用性

本发明提供治疗肌肉减少症的方法，其通过向有需要的患者施用一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂来进行。该方法提供用于在年老肌肉中增进肌肉质量、以及在再生肌肉组织中减少胶原形成的方法，由此增进再生肌肉组织的全面功能。

序列表

<11O>奥里科有限公司(Orico Limited)

<120>肌肉再生

<130>538813

<160>18

<170>PatentIn Vetsion 3.1

<21O>1

<211>966

<212>DNA

<213>绵羊

<400>1

atgcaaaaac tgcaaatctt tgtttatatt tacctattta tgctgcttgt tgctggccca 60

gtggatctga atgagaacag cgagcagaag gaaaatgtgg aaaaaaaggg gctgtgtaat 120

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ctcagtaagc ttcgcctgga aacagctcct aacatcagca aagatgctat aagacaactt 240

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<21O>2

<211>195

<212>DNA

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<210>3

<211>141

<212>DNA

<213>绵羊

<400>3

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<210>4

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<212>DNA

<213>牛

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<210>6

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<400>6

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aggcagtcaa aaagtattca ttttggtcaa aatttcaaaa ttatagcctg cctttgcaat 120

actgcagctt ttaggatgaa a 141

<210>7

<211>945

<212>DNA

<213>Belgian Blue

<400>7

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gtggatctga atgagaacag cgagcagaag gaaaatgtgg aaaaagaggg gctgtgtaat 120

gcatgtttgt ggagggaaaa cactacatcc tcaagactag aagccataaa aatccaaatc 180

ctcagtaaac ttcgcctgga aacagctcct aacatcagca aagatgctat cagacaactt 240

ttgcccaagg ctcctccact cctggaactg attgatcagt tcgatgtcca gagagatgcc 300

agcagtgacg gctccttgga agacgatgac taccacgcca ggacggaaac ggtcattacc 360

atgcccacgg agtctgatct tctaacgcaa gtggaaggaa aacccaaatg ttgtttcttt 420

aaatttagct ctaagataca atacaataaa ctagtaaagg cccaactgtg gatatatctg 480

aggcctgtca agactcctgc gacagtgttt gtgcaaatcc tgagactcat caaacccatg 540

aaagacggta caaggtatac tggaatccga tctctgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600

ggtatttggc agagcattga tgtgaagaca gtgttgcaga actggctcaa acaacctgaa 660

tccaacttag gcattgaaat caaagcttta gatgagaatg gccatgatct tgctgtaacc 720

ttcccagaac caggagaaga tggactggtg cattttcaca ctcctcccta tgggcaatgg 780

atgttctata gagaaagaaa actcattttc ctagaggtct acattcaatt ctgtagcata 840

cttggagaag ctgcattgaa aaggcagtca aaaagtattc attttggtca aaatttcaaa 900

attatagcct gcctttgcaa tactgcagct tttaggatga aataa 945

<210>8

<211>321

<212>PRT

<213>绵羊

<400>8

Met Gln Lys Leu Gln Ile Phe Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Leu

1 5 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Val Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gln Asn Asn

35 40 45

Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu

65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

85 90 95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

100 105 110

Val Thr Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

115 120 125

Ala Glu Val Gln Glu Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

130 135 140

Lys Ile Gln Hi s Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

165 170 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

195 200 205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

245 250 255

Val His Phe Tyr Thr Pro Pro Tyr Gly Gln Trp Ile Phe His Lys Glu

260 265 270

Arg Lys Ile Ile Phe Leu Glu Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu

275 280 285

Gly Glu Ala Val Phe Lys Arg Gln Ser Ly s Ser Ile His Phe Cys Gln

290 295 300

Asn Phe Lys Ile Ile Ala Cys Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met

305 310 315 320

Lys

<210>9

<211>65

<212>PRT

<213>绵羊

<400>9

Val His Phe Tyr Thr Pro Pro Tyr Gly Gln Trp Ile Phe His Lys Glu

1 5 10 15

Arg Lys Ile Ile Phe Leu Glu Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu

20 25 30

Gly Glu Ala Val Phe Lys Arg Gln Ser Lys Ser Ile His Phe Cys Gln

35 40 45

Asn Phe Lys Ile Ile Ala Cys Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met

50 55 60

Lys

65

<210>10

<211>47

<212>PRT

<213>绵羊

<400>10

Ile Ile Phe Leu Glu Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu Gly Glu

1 5 10 15

Ala Val Phe Lys Arg Gln Ser Lys Ser Ile His Phe Cys Gln Asn Phe

20 25 30

Lys Ile Ile Ala Cys Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met Lys

35 40 45

<210>11

<211>321

<212>PRT

<213>牛

<400>11

Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1 5 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr

35 40 45

Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu

65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val

85 90 95

Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

100 105 110

Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

115 120 125

Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

130 135 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Arg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

165 170 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

195 200 205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys

245 250 255

Val His Phe His Thr Pro Pro Tyr Gly Gln Trp Met Phe Tyr Arg Glu

260 265 270

Arg Lys Leu Ile Leu Leu Glu Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu

275 280 285

Gly Glu Ala Ala Leu Lys Arg Gln Ser Lys Ser Ile His Phe Gly Gln

290 295 300

Asn Phe Lys Ile Ile Ala Cys Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met

305 310 315 320

Lys

<210>12

<211>65

<212>PRT

<213>牛

<400>12

Val His Phe His Thr Pro Pro Tyr Gly Gln Trp Met Phe Tyr Arg Glu

1 5 10 15

Arg Lys Leu Ile Leu Leu Glu Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu

20 25 30

Gly Glu Ala Ala Leu Lys Arg Gln Ser Lys Ser Ile His Phe Gly Gln

35 40 45

Asn Phe Lys Ile Ile Ala Cys Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met

50 55 60

Lys

65

<210>13

<211>47

<212>PRT

<213>牛

<400>13

Leu Ile Leu Leu Glu Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu Gly Glu

1 5 10 15

Ala Ala Leu Lys Arg Gln Ser Lys Ser Ile His Phe Gly Gln Asn Phe

20 25 30

Lys Ile Ile Ala Cys Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met Lys

35 40 45

<210>14

<211>314

<212>PRT

<213>Belgian Blue

<400>14

Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1 5 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr

35 40 45

Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu

65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Lcu Lcu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val

85 90 95

Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

100 105 110

Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

115 120 125

Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

130 135 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Arg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

165 170 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

195 200 205

Lys Thr yal Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Val His Phe His Thr Pro Pro

245 250 255

Tyr Gly Gln Trp Met Phe Tyr Arg Glu Arg Lys Leu Ile Leu Leu Glu

260 265 270

Val Tyr Ile Gln Phe Cys Ser Ile Leu Gly Glu Ala Ala Leu Lys Arg

275 280 285

Gln Ser Lys Ser Ile His Phe Gly Gln Asn Phe Lys Ile Ile Ala Cys

290 295 300

Leu Cys Asn Thr Ala Ala Phe Arg Met Lys

305 310

<210>15

<211>576

<212>DNA

<213>绵羊

<400>1

atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct 60

ggctctccga agcggcggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc 120

ccggacgccg aaccgccgcc gctgcttcag acgcagaccc caccgccgac tctgcagcag 180

cccgccccgc ccggcagcga gcggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata 240

aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt 300

gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcagcac tcacagcacc tagttctcca 360

ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttaccc tccgacaagt tggaataata 420

tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc 480

aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg 540

cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 576

<210>16

<211>192

<212>PRT

<213>绵羊

<400>2

Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser

20 25 30

Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu

35 40 45

Leu Gln Thr Gln Thr Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Gly Ser Glu Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile

65 70 75 80

Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val

85 90 95

Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser

100 105 110

Ala Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp

115 120 125

Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Gln Val Gly Ile Ile Cys Glu Arg Leu

130 135 140

Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu Gln Ile Leu

145 150 155 160

Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys Phe Thr His

165 170 175

Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Thr Arg Pro Thr Ser Tyr Val Ser

180 185 190

<210>17

<211>576

<212>DNA

<213>牛

<400>3

atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct 60

ggctctccga agcgacggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc 120

ccggacgccg aaccgccacc gctgcttcag acgcagatcc caccgccgac tctgcagcag 180

cccgccccgc ccggcagcga ccggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata 240

aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt 300

gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcaacac tcacagcacc tagttctcca 360

ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttacgc tccgacaagt tggaataata 420

tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc 480

aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg 540

cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 576

<210>18

<211>192

<212>PRT

<213>牛

<400>4

Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser

20 25 30

Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu

35 40 45

Leu Gln Thr Gln Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro

50 55 60

Gly Ser Asp Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile

65 70 75 80

Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val

85 90 95

Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser

100 105 110

Thr Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp

115 120 125

Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Gln Val Gly Ile Ile Cys Glu Arg Leu

130 135 140

Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu Gln Ile Leu

145 150 155 160

Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys Phe Thr His

165 170 175

Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Thr Arg Pro Thr Ser Tyr Val Ser

180 185 190

Claims

1.治疗肌肉减少症的方法，其包括向有需要的人或非人患者施用有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选自由下列所组成的组：

-抗肌肉生长抑制素抗体；

-能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性的肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制素免疫缀合物；

-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的II型激活蛋白受体、肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；

-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑制素抑制剂；

-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；

-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且所述小肽能结合并抑制肌肉生长抑制素；

-肌肉生长抑制素的剪接变体；

-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和

-反义多核苷酸、RNAi、siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过抑制肌肉生长抑制素的基因表达来抑制肌肉生长抑制素活性。

3.如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。

4.如权利要求3所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或350位上具有C-末端截短。

5.如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQ ID NO：8-14、或其功能片段或变体、或与其具有95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

6.如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含“强效”肽SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

7.如权利要求1-6之任一项所述的方法，其用于在再生的肌肉中增加卫星细胞的活性、和成肌细胞和巨噬细胞的迁移。

8.如权利要求1-7之任一项所述的方法，其中选自由HGF、FGF、IGF、MGF和生长激素组成的组的一种或多种其他的生长促进化合物与至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时联合施用以进一步增进肌肉再生。

9.如权利要求1-7之任一项所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配制成用于局部或全身施用。

10.如权利要求9所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配制成用于口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。

11.至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂在制备用于治疗有需要的人或非人患者的肌肉减少症的药物中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选自由下列所组成的组：

-抗肌肉生长抑制素抗体；

-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；

-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑制素；

-肌肉生长抑制素的剪接变体；

-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和

13.如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。

14.如权利要求13所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或350位上具有C-末端截短。

15.如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQ ID NO：8-14、或其功能片段或变体、或与其具有95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

16.如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含“强效”肽SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

17.如权利要求11-17之任一项所述的用途，其中药物进一步包含选自由HGF、FGF、IGF、MGF和生长激素组成的组的一种或多种其他的肌肉生长促进化合物，并且其中该药物配制成用于分开、顺序或同时施用至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂和其他化合物。

18.如权利要求11-16之任一项所述的用途，其中将该药物配制成用于局部或全身施用。

19.如权利要求18所述的用途，其中该药物配制成用于口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。

20.药物化合物，其包含至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂和药学上可接受的载体，所述药物化合物用于治疗有需要的人或非人患者的肌肉减少症的方法中。

21.如权利要求20所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选自由下列所组成的组：

-抗肌肉生长抑制素抗体；

-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养基中的肌肉生长抑制素抑制剂；

-肌肉生长抑制素的剪接变体；

-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和

22.如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。

23.如权利要求22所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或350位上具有C-末端截短。

24.如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQ ID NO：8-14、或其功能片段或变体、或与其具有95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

25.如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含“强效”肽SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

26.如权利要求20-25之任一项所述的药物化合物，其进一步包含选自由HGF、FGF、IGF、MGF和生长激素组成的组的一种或多种其他的肌肉生长促进化合物，其中组合物配制成与至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时施用。

27.如权利要求20-25之任一项所述的药物化合物，其配制成用于局部或全身施用。

28.如权利要求27所述的药物化合物，其配制成用于口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。

29.至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其用于治疗有需要的人或非人患者的肌肉减少症的方法中。

30.如权利要求29所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其选自由下列所组成的组：

-抗肌肉生长抑制素抗体；

-肌肉生长抑制素的剪接变体；

-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和

31.如权利要求30所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。

32.如权利要求31所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或350位上具有C-末端截短。

33.如权利要求30所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQ ID NO：8-14、或其功能片段或变体、或与其具有95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

34.如权利要求30所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含“巨大的”肽SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95％、90％、85％、80％、75％或70％序列同一性的序列。

35.如权利要求29-34之任一项所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其与选自由HGF、FGF、IGF、MGF和生长激素组成的组的一种或多种其他的肌肉生长促进化合物组合在一起，用于与至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时施用以进一步增进肌肉再生。

36.如权利要求29-34之任一项所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其配制成用于局部或全身施用。

37.如权利要求32所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配制成用于口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用。