WO2021241428A1 - エラスチン産生促進剤及び皮膚化粧料 - Google Patents

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WO2021241428A1
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elastin
skin
neu2
cage
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彰 南
隆 鈴木
康範 岩尾
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静岡県公立大学法人
日研フード株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to an elastin production promoter, and more particularly to an elastin production promoter capable of increasing dermal elastin that has decreased with aging.
  • the skin is composed of epidermis, dermis and subcutaneous tissue. Of these, collagen fibers that impart strength to the skin and elastin that supports these collagen fibers are distributed in the dermis below the epidermis. Elastin is an elastic fiber having elasticity and elasticity, and has an action of bringing elasticity and firmness to the skin. However, it is known that the abundance of elastin decreases with aging and is one of the causes of wrinkles and sagging of the skin.
  • Patent Document 1 describes an elastin production-promoting agent containing lipocalin 2, a protein belonging to the lipocalin family, or a decomposition product thereof as an active ingredient
  • Patent Document 2 describes elastin containing a specific dipeptide or tripeptide as an active ingredient. Production promoters are described.
  • sialidase is a hydrolase that desorbs sialic acid from sugar chains.
  • Sialic acid mainly modifies the ends of sugar chains and is involved in a wide range of biological phenomena such as physiological functions, diseases, and viral infections. Therefore, it is known that sialidase plays a role in controlling cell functions such as cell differentiation / proliferation and apoptosis. Therefore, in order to deepen the knowledge about sialidase, which plays an important role in the living body, the present inventors have developed a fluorescence imaging probe capable of highly sensitively visualizing the enzymatic activity of sialidase on the tissue (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 3 newly found that sialidase activity is detected in pancreatic islands, and reports that a compound having sialidase inhibitory activity has an effect of suppressing an increase in blood glucose level and an effect of increasing insulin secretion. ing.
  • Cialidases are roughly classified into three categories: animal (mammalian) sialidases, viral sialidases, and bacterial sialidases. Among them, it has been reported that sialidase NEU1, which is a kind of animal sialidase, forms a molecular complex with elastin-binding protein (EBP) and cathepsin A, and is involved in the formation of elastin fiber assembly, that is, elastic fibers (they are involved in the formation of elastin fiber assembly, that is, elastic fibers).
  • EBP elastin-binding protein
  • Non-patent document 2 Non-patent document 2
  • Non-Patent Document 1 there has been no report of visualizing the distribution of sialidase activity in skin tissue using a fluorescence imaging probe as reported in Non-Patent Document 1. In addition, there is no report on the relationship between the phenomenon that the abundance of elastin in the dermis decreases with aging and sialidase.
  • the present invention has been made in view of the above points, and an object thereof is to provide a novel elastin production promoter.
  • Another object of the present invention is to provide an elastin production promoter capable of improving or preventing a decrease in dermal elastin due to aging.
  • Non-Patent Document 1 In the process of elucidating the involvement of sialidase in dementia using the fluorescent imaging probe described in Non-Patent Document 1, the present inventors happened to significantly reduce the sialidase activity of skin tissue with aging. I found out to do. Based on this finding, the present invention has been completed.
  • the elastin production promoter of the present invention contains sialidase as an active ingredient.
  • sialidase By administering the sialidase to the target tissue, the production of elastin is promoted, and the amount of elastin in the target tissue can be increased.
  • sialidase NEU2 sialidase NEU2. This selects a type of sialidase suitable as an elastin production promoter.
  • the above-mentioned sialidase is a bacterial sialidase.
  • This selects a type of sialidase suitable as an elastin production promoter.
  • bacterial sialidase has high sialidase activity and excellent stability, so that it is easy to handle.
  • the above-mentioned bacterial sialidase is a sialidase derived from Arthrobacter sp.
  • a more suitable type of sialidase having high sialidase activity and excellent safety and stability is selected.
  • the elastin production promoter of the present invention is dermis elastin in which the above-mentioned elastin constitutes the fibrous tissue of the dermis. Thereby, a suitable target for promoting the production of elastin is selected.
  • the elastin production promoter of the present invention is for preventing or improving skin aging.
  • the amount of elastin present in the dermis decreases with age, causing wrinkles and sagging of the skin.
  • administration of sialidase promotes the production of elastin and increases the amount of elastin. Therefore, the firmness and elasticity of the skin can be maintained or restored, and the aging of the skin can be prevented or ameliorated.
  • the skin cosmetic of the present invention contains the above-mentioned elastin production promoter. As a result, a skin cosmetic having an effect of enhancing the firmness and elasticity of the skin can be obtained.
  • an elastin production promoter and a skin cosmetic having the following excellent effects. (1) It is possible to improve the production of elastin and increase the amount of elastin in the target tissue. (2) The abundance of dermal elastin can be increased, and the firmness and elasticity of the skin can be enhanced. (3) It is possible to prevent / improve the decrease of dermal elastin due to aging.
  • FIG. 3 is a fluorescence imaging image showing the sialidase activity of a rat skin tissue section and an H & E stained image of the same section in Example 1. It is a graph which shows the relationship between the age of a rat and the sialidase activity in a rat skin tissue in Example 2.
  • 3 is a graph showing the expression ratio of each isozyme of animal sialidase of dermis and muscle tissue (Dermis + Muscle) to rat subcutaneous adipose tissue (Fat) in Example 3.
  • 3 is a graph showing the mRNA expression level of the elastin gene by application of sialidase NEU2 to rat skin in Example 4.
  • FIG. 6 (c) a graph showing an elastin production promoting effect by applying bacterial sialidase to rat skin in Example 5.
  • FIG. 6 (a) is a graph showing the sialidase activity when bacterial sialidase is mixed with PBS or ionic liquid coringeranoic acid (CAGE), respectively. * In the graph: P ⁇ 0.05 vs. CAGE, **: P ⁇ 0.01 vs. Shows CAGE.
  • 6 is a fluorescence imaging image showing the distribution of sialidase activity in skin sections of each test group in Example 5.
  • 6 is an immunostaining image showing the distribution of elastin in dermis tissue sections of each test group in Example 5.
  • FIG. 6 is an autofluorescent elastin image showing the distribution of elastin in dermis tissue sections of each test group in Example 5.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 10 (a) shows the data of the test group using SAMP1 as the aging-accelerated model mouse
  • FIG. 10 (b) shows the data of the test group using SAMP8 as the aging-accelerated model mouse.
  • ⁇ in the graph: P ⁇ 0.001 is shown.
  • the sialidase (sometimes called neuraminidase) in the present invention is a hydrolase that liberates sialic acid from a sugar chain
  • the sialidase activity refers to an activity that can liberate sialic acid from a sugar chain.
  • the sialidase activity is not particularly limited, but can be detected using, for example, 4MU-Neu5Ac or BTP-Neu5Ac developed by the present inventors.
  • the sialidase used in the present invention is not particularly limited as long as it has an elastin production promoting effect, but an animal (mammalian) sialidase or a bacterial sialidase is preferably used from the viewpoint of excellent elastin production promoting effect.
  • an animal (mammalian) sialidase or a bacterial sialidase is preferably used from the viewpoint of excellent elastin production promoting effect.
  • there are four types of isozymes NEU1, NEU2, NEU3 and NEU4 in animal sialidase and it is possible to use only one type of isozyme or a combination of a plurality of types.
  • sialidase NEU2 which has been clarified to be highly expressed in the dermis (see Examples described later), is particularly preferably used.
  • Cialidase NEU2 is a protein encoded by amino acids of 380 residues, has a molecular weight of about 42 kDa, and has an optimum pH near neutral. In addition, Cialidase NEU2 has excellent durability and stable enzyme activity, so that it is easy to handle. It should be noted that the animal sialidase can be used alone or in combination of a plurality of species.
  • Bacterial sialidase has the advantage of being easier to handle, as it has higher sialidase activity and enzyme stability than animal sialidase, and can be expressed in large quantities in Escherichia coli.
  • Examples of the bacterial sialidase include Arthrobacter sp., Bifidobacterium sp., Streptococcus sp., Vibrio cholerae, Salmonella Typhimurium, and Clostridium perfringens.
  • Cialidase derived from Arthrobacter ureafaciens commercially available: Nakaraitesk Co., Ltd., model number 24229) and Bifidobacterium bacterium from the viewpoint of promoting elastin production and safety.
  • Bifidobacterium bifidum-derived sialidase and the like are particularly preferably used.
  • examples of usable virus sialidase include neuraminidase (NA) of influenza A virus, neuraminidase (NA) of influenza B virus, and bacteriophage. It is possible to use only one type of sialidase or a combination of a plurality of types.
  • the sialidase in the present invention can be obtained by gene expression by gene recombination using a gene encoding sialidase according to a conventional method.
  • a recombinant vector can be obtained by inserting a DNA fragment encoding sialidase as an insert downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • a transformant producing a protein having sialidase activity can be obtained.
  • sialidase can also be obtained by extraction and purification from cells or tissues containing sialidase.
  • the elastin production promoter of the present invention contains the above-mentioned sialidase as an active ingredient, and has an action of increasing the amount of elastin in a tissue containing elastin.
  • tissue containing elastin include the dermis of the skin, the blood vessel wall, the ligaments, and the lung tissue.
  • the dermis elastin contained in the dermis of the skin and constituting the fibrous tissue is increased. Has an effect. The amount of elastin present in the dermis decreases with age, causing wrinkles and sagging of the skin.
  • the elastin production promoter of the present invention can maintain or restore the firmness and elasticity of the skin, and can prevent or improve the aging of the skin.
  • the dose of the elastin production-promoting agent of the present invention cannot be unconditionally specified because it varies depending on the target improvement or preventive effect, age, administration method, etc., but the daily dose is usually used as the active ingredient sialidase. , 0.0001U to 10U, more preferably 0.001U to 1U, and even more preferably 0.005U to 0.5U.
  • the transdermal dose, 2 per coating area 1cm As an example, a sialidase as an active ingredient, it is preferable that about 0.00005U ⁇ 5U, the order of 0.0005 ⁇ 0.5 U It is more preferable, and it is more preferable that it is about 0.0025U to 0.25U.
  • a substance having a transdermal drug delivery action As the substance having a transdermal drug delivery action, a known TDDS (Transdermal Drug Delivery System) can be used as long as it does not interfere with the action and effect of the present invention. More specifically, it is preferable to use a so-called "ionic liquid", which is an organic salt that exhibits a liquid at normal temperature and pressure, for transdermal drug delivery.
  • TDDS Transdermal Drug Delivery System
  • choline geranic acid As the ionic liquid, those using choline as a cation are preferable, and examples thereof include choline geranic acid, choline oleic acid, choline malonic acid, etc. Among them, choline geranic acid (CAGE) represented by the following chemical formula 1 is particularly preferable. Can be used.
  • the substance having the transdermal drug delivery action as described above can be contained in the elastin production promoter as a compounding ingredient together with the active ingredient sialidase. This gives a one-agent type elastin accelerator.
  • the substance having a transdermal drug delivery action as described above can be administered separately from the active ingredient sialidase.
  • a substance having a transdermal drug delivery action such as CAGE is applied after the sialidase is applied.
  • CAGE a substance having a transdermal drug delivery action
  • TDDS Transdermal Drug Delivery System
  • microneedles needleless injectors
  • iontophoresis iontophoresis
  • ultrasonic introduction sonophoresis
  • the elastin production promoter of the present invention can be used as a skin cosmetic having an anti-aging effect. Thereby, the firmness and elasticity of the skin can be maintained or restored, and the wrinkles and sagging of the skin can be prevented or improved.
  • the elastin production promoter or skin cosmetic of the present invention may contain various components usually blended in an external preparation as long as the action and effect of the present invention are not impaired.
  • examples thereof include moisturizers, emollients, plant extracts, vegetable oils and fats, pH regulators, surfactants, thickeners, vitamins, amino acids, preservatives, antibacterial agents, fragrances and pigments.
  • the elastin production promoter or skin cosmetic of the present invention can be applied to various external preparation dosage forms by a conventionally used method as a dosage form usually applied to the skin, for example, lotion.
  • a dosage form usually applied to the skin for example, lotion.
  • Such as liquids, emulsions, gels, powders such as dry water, creams and the like can be mentioned.
  • It can also be applied to patches, facial masks, makeup products, cleansing agents, soaps, hair care agents, hair growth agents and the like.
  • the active ingredient sialidase and the substance having a transdermal drug delivery effect are separately formulated, the separately formulated ones can be mixed and administered at the time of use, or they are separately prepared. It is also possible to administer the isomers at the same time or at different times.
  • Example 1 Examination of sialidase activity in skin tissue (1) The presence or absence and distribution of sialidase activity in rat skin tissue was investigated using the fluorescence imaging probe (Non-Patent Document 1) developed by the present inventors.
  • This fluorescent imaging probe has a phenolic hydroxyl group of BTP3 [(2-benzothiazole-2-yl) -4-bromophenol], which is a fluorescent substance, and Neu5Ac (N-acetylneuramine), which is a molecular species of sialic acid recognized by sialidase. It is BTP3-Neu5Ac to which acid) is bound.
  • BTP3-Neu5Ac is soluble in water and its fluorescence is also controlled off, but when it reacts with sialidase, a water-insoluble fluorescent substance BTB3 is generated, deposited on the tissue, and fluorescently stained. Therefore, the site of sialidase activity can be histochemically fluorescently imaged.
  • the back skin of a Wistar male rat (12 weeks old, Nippon SLC Co., Ltd.) was used as an embedding agent for preparing frozen tissue sections (Tisshoe Tech (registered trademark) OCT Compound, Sakura Finetech Japan Co., Ltd.). ) was embedded.
  • a frozen tissue section having a thickness of 100 to 300 ⁇ m was prepared by cryostat (Leica Microsystems, Inc.).
  • the sections after observation were stained with hematoxylin and eosin (H & E staining) for observation.
  • the results are shown in FIG.
  • Example 2 2. Examination of sialidase activity in skin tissue (2) The relationship between sialidase activity in rat skin tissue and aging was investigated. Cialidase activity in each skin of Wistar male rats (Nippon SLC Co., Ltd.) on the 19th day of pregnancy (embryonic) (E19), 1-week-old, 6-week-old, 12-week-old, and over 21-month-old was measured. Twice the amount of 0.32 M sucrose was added to the skin of each rat collected, and homogenized at 200 rpm while cooling with ice.
  • Example 3 Examination of isozymes of sialidase present in the dermis
  • isozymes of animal sialidases There are four types of isozymes of animal sialidases: NEU1, NEU2, NEU3 and NEU4. The four isozymes differ in their localization and substrate specificity, and therefore their functions and roles are also different. Since strong sialidase activity was detected in the dermis subcutaneous layer of rat skin tissue in Example 1, an isozyme of sialidase highly expressed in the dermis was investigated.
  • TRIzol registered trademark
  • the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 20 minutes to separate the aqueous layer.
  • 250 ⁇ L of 2-propanol was added to 250 ⁇ L of the aqueous layer, and after inversion mixing, the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After standing, it was centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 10 minutes, and after removing the supernatant, 500 ⁇ L of 75% ethanol was added and centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 20 minutes.
  • RNA separated by a spectrophotometer (NanoDrop ND-1000, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was quantified, and the concentration of total RNA was adjusted to 100 ng / ⁇ L with UltraPure DNase / RNase-Free Distilled Water.
  • RNA sample isolated from the excised tissues (A) and (B) were measured by real-time RT-PCR method. Quantified. Specifically, using OneStep TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Takara Bio Inc.), measurements were taken according to the protocol, and the expression levels of each mRNA were compared. Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System Lite (Takara Bio Inc.) was used as the measuring device.
  • FIG. 3 (a) shows the mRNA expression level of sialidase Neu1
  • FIG. 3 (b) shows the mRNA expression level of sialidase Neu2
  • FIG. 3 (c) shows the mRNA expression level of sialidase Neu3
  • FIG. 3 (d) shows the mRNA expression of sialidase Neu4.
  • FIG. 3 shows the level of mRNA expression level in the dermis and the muscle tissue (Dermis + Muscle) immediately below the dermis when the mRNA expression level of the subcutaneous adipose tissue (Fat) is 1. From this result, it was clarified that among the four isozymes, sialidase NEU2 was highly expressed in the dermis.
  • Example 4 Elastin production promoting effect by sialidase NEU2
  • sialidase NEU2 is present in a large amount in the dermis. Therefore, the elastin production promoting effect by sialidase NEU2 was investigated. Specifically, sialidase NEU2 was prepared by expressing recombinant protein in cultured cells, applied to rat skin for a predetermined period of time, and then the amount of elastin contained in rat skin tissue was measured.
  • a DNA fragment of a gene (2531bp) encoding rat sialidase NEU2 was prepared by the cloning method.
  • the DNA fragment of the prepared rat Neu2 gene was cloned into a vector as an insert to obtain a recombinant vector containing the Neu2 gene.
  • the constructed NEU2 expression vector was introduced into C6 glioma cells and transfected to obtain NEU2-producing cells.
  • the obtained NEU2-producing cells were cultured in MEM medium to express proteins.
  • the expressed NEU2 protein was recovered from the medium and concentrated by ultrafiltration. PBS (pH 7.3) containing 4MU-Neu5Ac was added to this concentrate, and the mixture was incubated at 27 ° C. for 1 hour.
  • the enzymatic activity of sialidase NEU2 obtained by expression of the recombinant protein was 21.3.4MU nmol / min / mL.
  • the stratum corneum which is the outermost cell of the skin, has the function of a physical barrier that prevents the invasion of foreign substances. Therefore, even if a protein such as sialidase NEU2 is applied to the skin surface, it is difficult to allow the stratum corneum to permeate and act inside the skin tissue. Therefore, in this example, cholinergic acid (CAGE), which is an ionic liquid, was used for transdermal administration of the sialidase NEU2 obtained as described above.
  • CAGE cholinergic acid
  • the structural formula of CAGE is shown in Chemical Formula 2 below. CAGE is known to have excellent drug solubility and a transdermal drug delivery action (see Special Table 2016-535781).
  • a sample solution (CAGE + Neu2) in which CAGE and Cialidase NEU2 were mixed was prepared, and a coating test was conducted.
  • a double application test (Neu2, CAGE) in which a certain amount of Cialidase NEU2 was applied and then CAGE was applied.
  • a test was also conducted in which only PBS (phosphate buffer) and CAGE were applied as sample solutions.
  • the skin tissue of the part where the sample solution was applied was collected. After homogenizing the collected skin tissue, the amount of elastin contained in the homogenate of the skin tissue was measured using an elastin colorimetric determination kit (Fastin Elastin Assay Kit, manufactured by Biocolor). The results are shown in the graph of FIG. According to this result, the amount of elastin in the skin tissue was applied both when Cialidase NEU2 and CAGE were applied as a mixed solution (CAGE + Neu2) and when Cialidase NEU2 was applied and then CAGE was applied (Neu2, CAGE). Was found to increase. From this, it was clarified that the transdermal administration of Cialidase NEU2 promotes the production of elastin in the skin tissue.
  • Cialidase NEU2 since the increase in the amount of elastin is large when Cialidase NEU2 is applied and then CAGE is applied (Neu2, CAGE), CAGE applies the previously applied Cialidase NEU2 to the skin. It was found that it can be quickly taken up above and delivered inside the skin.
  • RNA expression of the elastin gene was investigated. Specifically, one day after the last application of each sample solution shown in Table 1, tissues such as skin and subcutaneous fat on the flank of the rat were collected, and TRIzol (registered trademark) Reagent (Invitrogen Co., Ltd.) was used. Total RNA was separated from rat skin by the same method as in Example 3. Using the isolated RNA sample, the mRNA expression level of the elastin gene in rats was measured by the real-time RT-PCR method. Real-time RT-PCR was performed according to the protocol using the One-Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR kit (Takara Bio Inc.) and primers.
  • Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System Lite (Takara Bio Inc.) was used as the measuring device.
  • the expression level of elastin mRNA was determined as a relative amount of elastin mRNA to the internal standard GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). The results are shown in the graph of FIG.
  • Example 5 Elastin production promoting effect by bacterial sialidase
  • sialidase There are multiple types of sialidase, such as animal sialidase present in mammals, viral sialize present in viruses, and bacterial sialidase present in bacteria. Of these, the elastin production-promoting effect of bacterial sialidase, which has higher sialidase activity than animal sialidase, was investigated.
  • a sample solution (CAGE + AUSA) was prepared by mixing a certain amount of cholinergic acid (CAGE) and Cialidase (AUSA) derived from Arthrobacter ureafaciens in the same manner as in Example 4, and a coating test was conducted.
  • a test was also conducted in which only PBS (phosphate buffer) and CAGE were applied as sample solutions.
  • each sample solution was applied to the area of a circle having a diameter of 15 mm from which the hair was removed from the rat.
  • the application was performed twice a day for 5 days (10 times in total).
  • elastin in the skin tissue subjected to the application test was confirmed by immunohistochemical staining (Fig. 8) and autofluorescence of elastin (Fig. 9). Specifically, an extended section was prepared from the dermis of the collected skin tissue and fixed with 4% paraformaldehyde in PBS. 100 ⁇ L of normal goat serum (Goat Serum 2%) was added as a blocking agent for immunohistochemical staining, and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. Subsequently, 100 ⁇ L of the primary antibody (Elastin Polyclonal antibody) was added, and the mixture was incubated overnight at 4 ° C.
  • the primary antibody Elastin Polyclonal antibody
  • elastin is an autofluorescent substance that emits autofluorescence
  • the autofluorescence of elastin was observed using a fluorescence microscope for dermis sections fixed with 4% paraformaldehyde in PBS. The results are shown in FIG.
  • a large amount of elastin autofluorescence was observed, and an increase in the amount of elastin was observed.
  • Example 6 Elastin production promoting effect on aging-promoting model mice
  • sialidase is transdermally administered to individuals in a state where the elastin amount is reduced due to the decrease in elastin activity due to aging using the aging-promoting model mice. It was investigated whether this could promote the production of elastin.
  • SAMP1 and SAMP8 which are SAMPs (Senescence-Accelerated Mouse Prone) showing accelerated aging and short life span, were selected (24 weeks old, male, Nippon SLC Co., Ltd.).
  • the hair on the left and right backs of the Society for Senescence Acceleration Model Mouse was removed, and a site to which the sample solution was applied was provided.
  • Table 3 With the contents shown in Table 3 below, each sample solution was applied to the area of a circle having a diameter of 10 mm from which the hair of the mouse was removed. The application was performed twice a day for 5 days (10 times in total).
  • the skin tissue of the part to which the sample solution was applied was collected, and a part of the collected skin tissue was homogenized.
  • the amount of elastin contained in the homogenate of the collected skin tissue was measured using an elastin colorimetric kit (Fastin Elastin Assay Kit, a product of Biocolor). The results are shown in the graph of FIG.
  • Example 7 Examination of Stability of Enzyme Activity of Siaridase NEU1-producing cells producing rat-derived sialidase NEU1 were obtained by the same method as in Example 4 and using C6 glioma cells.
  • the NEU1-producing cells were cultured in MEM medium to express sialidase NEU1.
  • the cells were collected and subjected to cytolysis treatment to obtain a solubilized solution containing the expressed sialidase NEU1.
  • PBS (pH 4.6) containing 4MU-Neu5Ac was added to this solubilized solution, and the mixture was reacted at 27 ° C. for a predetermined time.
  • sialidase NEU2 can be suitably used as an elastin production promoter as compared with sialidase NEU1 when applied to the skin.
  • the present invention provides an elastin production-promoting agent and a skin cosmetic that have an excellent elastin production-promoting effect and can prevent or improve the decrease of dermal elastin due to aging. It is widely useful in the industry of.

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Abstract

新規なエラスチン産生促進剤を提供する。　エラスチン産生促進剤は、シアリダーゼを有効成分として含有している。

Description

エラスチン産生促進剤及び皮膚化粧料
　本発明は、エラスチン産生促進剤に関するものであり、特に加齢により減少した真皮エラスチンを増加させることができるエラスチン産生促進剤に関する。
　皮膚は表皮、真皮及び皮下組織から構成されている。このうち、表皮の下側にある真皮には、皮膚に強度を付与するコラーゲン線維と、このコラーゲン線維を支持するエラスチンが分布している。エラスチンは弾力性及び伸縮性を有する弾性線維であり、皮膚に弾力性とハリをもたらす作用を有している。しかしながら、エラスチンはその存在量が加齢と共に減少し、皮膚の皺やたるみの原因の一つとなることが知られている。
　そこで、皮膚の皺やたるみを防止するため、種々のエラスチン産生促進剤が提案されている。たとえば、特許文献１では、リポカリンファミリーに属するタンパク質であるリポカリン２又はその分解物を有効成分とするエラスチン産生促進剤が記載され、特許文献２では、特定のジペプチド又はトリペプチドを有効成分とするエラスチン産生促進剤が記載されている。
　他方、シアリダーゼとは、糖鎖からシアル酸を脱離する加水分解酵素である。シアル酸は主に糖鎖の末端を修飾しており、生理機能や疾患、ウイルス感染など幅広い生命現象に関与している。それゆえ、シアリダーゼは細胞分化・増殖、アポトーシス等の細胞機能を制御する役割を果たすことが知られている。そこで、本件発明者らは、生体内で重要な役割を担うシアリダーゼに関する知見を深めるため、シアリダーゼの酵素活性を組織上で高感度に可視化できる蛍光イメージングプローブを開発した（非特許文献１）。
　本発明者らは、上述した蛍光イメージングプローブを用いて、シアリダーゼの新たな生理学的役割の解明を進めている。一例として、特許文献３では、膵島においてシアリダーゼ活性が検出されることを新規に見出したこと、並びに、シアリダーゼ阻害活性を有する化合物が血糖値上昇抑制効果及びインスリン分泌量増加作用を有することを報告している。
　シアリダーゼは、大きく分けて、動物（哺乳類）シアリダーゼ、ウイルスシアリダーゼ及び細菌シアリダーゼの３つの分類がある。このうち、動物シアリダーゼの一種であるシアリダーゼＮＥＵ１は、エラスチン結合タンパク質（ＥＢＰ）及びカテプシンＡと分子複合体を形成し、エラスチン線維集合、すなわち、弾性線維の形成に関与することが報告されている（非特許文献２）。
特開２０１５－０００８６０号公報 特開２０１４－１４１４５０号公報 特開２０１７－２２２６４１号公報
Minami A. et al., PLOS ONE, Volume 9, Issue 1, e81941, 2014年 Hinek A. et al., J. Biol. Chem., Vol.281, No.6, pp.3698-3710, 2006年
　しかしながら、これまで、非特許文献１で報告されたような蛍光イメージングプローブを用いて、皮膚組織におけるシアリダーゼ活性の分布を可視化した報告はなされていない。また、加齢と共に真皮のエラスチンの存在量が低下するという現象と、シアリダーゼの関連性について検討された報告もなされていない。
　そして、エラスチンの産生促進効果を有する新たな材料を開発し、提供することはアンチエイジング意識の高まりと共に依然として期待されているところ、皮膚組織におけるエラスチンの産生促進のためにシアリダーゼを用いることに関する検討はこれまでなされておらず、その有効性はまったく不明であった。
　したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、新規なエラスチン産生促進剤を提供することにある。
　また、本発明の他の目的としては、加齢による真皮エラスチンの減少を改善又は予防することができる、エラスチン産生促進剤を提供することにある。
　本発明者らは、非特許文献１に記載された蛍光イメージングプローブを用いて、認知症におけるシアリダーゼの関与を解明する過程の中で、偶然にも皮膚組織のシアリダーゼ活性が老化に伴って著しく低下することを見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
　上記課題を解決するため、本発明のエラスチン産生促進剤は、シアリダーゼを有効成分として含有する。シアリダーゼを対象組織に投与することにより、エラスチンの産生が促進され、対象組織でのエラスチン量を増加させることができる。
　また、本発明のエラスチン産生促進剤は、上述したシアリダーゼがシアリダーゼＮＥＵ２であることも好ましい。これにより、エラスチン産生促進剤として好適なシアリダーゼの種類が選択される。
　また、本発明のエラスチン産生促進剤は、上述したシアリダーゼが細菌シアリダーゼであることも好ましい。これにより、エラスチン産生促進剤として好適なシアリダーゼの種類が選択される。また、細菌シアリダーゼはシアリダーゼ活性が高く、安定性にも優れるため、取り扱いも容易である。
　また、本発明のエラスチン産生促進剤は、上述した細菌シアリダーゼが、アルスロバクター属細菌（Arthrobacter sp.）由来のシアリダーゼであることも好ましい。これにより、シアリダーゼ活性が高く、安全性・安定性にも優れた、より好適なシアリダーゼの種類が選択される。
　また、本発明のエラスチン産生促進剤は、上述したエラスチンが真皮の線維性組織を構成する真皮エラスチンであることも好ましい。これにより、エラスチンが産生促進される対象として、好適なものが選択される。
　また、本発明のエラスチン産生促進剤は、皮膚の老化の防止用又は改善用であることも好ましい。真皮に存在するエラスチンは、加齢によりその存在量が減少して皮膚の皺やたるみを生じさせるところ、シアリダーゼを投与することにより、エラスチンの産生が促進され、エラスチン量が増加する。それゆえ、皮膚のハリや弾力性を維持又は回復させることができ、皮膚の老化を防止又は改善することができる。
　また、本発明の皮膚化粧料には、上述したエラスチン産生促進剤が含まれる。これにより、皮膚のハリや弾力性を高める作用を有する皮膚化粧料が得られる。
　本発明によれば、以下のような優れた効果を有するエラスチン産生促進剤及び皮膚化粧料を提供することができる。
（１）エラスチンの産生を向上させ、対象組織でのエラスチン量を増加させることができる。
（２）真皮エラスチンの存在量を高め、皮膚のハリや弾力性を高めることができる。
（３）老化による真皮エラスチンの減少を予防・改善することができる。
実施例１における、ラット皮膚組織切片のシアリダーゼ活性を示す蛍光イメージング画像及び同切片のＨ＆Ｅ染色画像である。 実施例２における、ラットの週齢とラット皮膚組織におけるシアリダーゼ活性との関係を示すグラフである。グラフ中の＊＊＊：Ｐ＜０．００１　ｖｓ．Ｅ１９、†††：Ｐ＜０．００１　ｖｓ．１２ｗｅｅｋｓを示す。 実施例３における、ラットの皮下脂肪組織（Ｆａｔ）に対する真皮及び筋肉組織（Ｄｅｒｍｉｓ＋Ｍｕｓｃｌｅ）の動物シアリダーゼの各アイソザイムの発現比率を示すグラフである。図３（ａ）：シアリダーゼＮｅｕ１、図３（ｂ）：シアリダーゼＮｅｕ２、図３（ｃ）：シアリダーゼＮｅｕ３、図３（ｄ）：シアリダーゼＮｅｕ４の発現レベルを示している。グラフ中の＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１を示す。 実施例４における、ラット皮膚に対するシアリダーゼＮＥＵ２塗布によるエラスチン産生促進効果を示すグラフである。グラフ中の＊＊：Ｐ＜０．０１　ｖｓ．ＣＡＧＥ、＊＊＊：Ｐ＜０．００１　ｖｓ．ＣＡＧＥを示す。 実施例４における、ラット皮膚へのシアリダーゼＮＥＵ２塗布によるエラスチン遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 実施例５における、ラット皮膚に対する細菌シアリダーゼ塗布による、図６（ｂ）：シアリダーゼ活性の変化を示すグラフ、図６（ｃ）：エラスチン産生促進効果を示すグラフである。また、図６（ａ）は細菌シアリダーゼをＰＢＳ又はイオン液体であるコリンゲラン酸（ＣＡＧＥ）とそれぞれ混合した際のシアリダーゼ活性を示すグラフである。グラフ中の＊：Ｐ＜０．０５　ｖｓ．ＣＡＧＥ、＊＊：Ｐ＜０．０１　ｖｓ．ＣＡＧＥを示す。 実施例５における、各試験群の皮膚切片のシアリダーゼ活性の分布を示す蛍光イメージング画像である。 実施例５における、各試験群の真皮組織切片のエラスチンの分布を示す免疫染色画像である。 実施例５における、各試験群の真皮組織切片のエラスチンの分布を示す自家蛍光エラスチン画像である。スケールバーは５０μｍを示す。 実施例６における、老化促進モデルマウスの皮膚に対するシアリダーゼ塗布によるエラスチン産生促進効果を示すグラフである。図１０（ａ）は老化促進モデルマウスとしてＳＡＭＰ１を用いた試験群のデータ、図１０（ｂ）は老化促進モデルマウスとしてＳＡＭＰ８を用いた試験群のデータを示す。グラフ中の†††：Ｐ＜０．００１を示す。 実施例７におけるシアリダーゼＮＥＵ１及びシアリダーゼＮＥＵ２の酵素活性と耐久性を示すグラフである。 実施例７におけるシアリダーゼＮＥＵ１の経時安定性を示すグラフである。
　本発明におけるシアリダーゼ（ノイラミニダーゼと呼ばれることもある）とは、糖鎖からシアル酸を遊離する加水分解酵素であり、シアリダーゼ活性とは糖鎖からシアル酸を遊離させることができる活性のことをいう。シアリダーゼ活性は、特に限定されないが、例えば、４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃや本発明者らが開発したＢＴＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを用いて検出され得る。
　本発明において用いられるシアリダーゼとしては、エラスチン産生促進作用を有するものであれば特に限定されないが、エラスチン産生促進効果に優れる観点から、動物（哺乳類）シアリダーゼ又は細菌シアリダーゼが好適に用いられる。このうち、動物シアリダーゼには４種のアイソザイムＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３及びＮＥＵ４があり、アイソザイムの１種のみを使用することも、複数種を組合せて使用することも可能である。さらに、本発明においては、真皮において高く発現することが今回解明された（後述する実施例参照）シアリダーゼＮＥＵ２が特に好適に用いられる。シアリダーゼＮＥＵ２は、３８０残基のアミノ酸からコードされるタンパク質であり、分子量は約４２ｋＤａ、至適ｐＨは中性付近である。また、シアリダーゼＮＥＵ２は耐久性に優れ、酵素活性も安定的に保持されるため、取り扱いし易い。なお、動物シアリダーゼは１種のみを使用することも、複数種を組合せて使用することも可能である。
　また、細菌シアリダーゼは、動物シアリダーゼと比較して、シアリダーゼ活性・酵素安定性が高く、大腸菌での大量発現も可能である等、取り扱いが容易という利点がある。細菌シアリダーゼとしては、一例として、アルスロバクター属細菌（Arthrobacter sp.）、ビフィドバクテリウム属細菌（Bifidobacterium sp.）、ストレプトコッカス属細菌（Streptococcus sp.）、Vibrio cholerae、Salmonella Typhimurium又はClostridium perfringens等を由来とするシアリダーゼが挙げられ、エラスチン産生促進効果及び安全性等の観点から、アルスロバクター属細菌のArthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ（市販品：ナカライテスク株式会社、型番２４２２９）及びビフィドバクテリウム属細菌のBifidobacterium bifidum由来のシアリダーゼ等が特に好適に用いられる。また、使用可能なウイルスシアリダーゼとして、Ａ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｂ型インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）、バクテリオファージ等も挙げられる。なお、シアリダーゼは１種のみを使用することも、複数種を組合せて使用することも可能である。
　本発明におけるシアリダーゼは、常法に従い、シアリダーゼをコードする遺伝子を用いて、遺伝子組み換えによるタンパク質発現により得ることができる。具体的には、シアリダーゼをコードするＤＮＡ断片をインサートとして、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターが得られる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。この組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、シアリダーゼ活性を有するタンパク質を生産する形質転換体が得られる。形質転換された宿主細胞を培養し、組換えタンパク質の発現を誘導させると、培養細胞又は培養物中にタンパク質が生産される。生産されたタンパク質は、所定の方法にて回収することが可能である。なお、上述した遺伝子組み換えによるタンパク質発現のほか、シアリダーゼを含有する細胞又は組織から抽出及び精製することによってシアリダーゼを得ることも可能である。
　本発明のエラスチン産生促進剤は、前述したシアリダーゼを有効成分として含むものであって、エラスチンが含まれる組織におけるエラスチン量を増加させる作用を有する。エラスチンが含まれる組織としては、皮膚の真皮、血管壁、靭帯及び肺組織等が挙げられるが、本発明においては、特に、皮膚の真皮に含まれ、線維性組織を構成する真皮エラスチンを増加させる作用を有する。真皮に存在するエラスチンは、加齢によりその存在量が減少して皮膚の皺やたるみを生じさせるが、上述したシアリダーゼを投与することにより、いったんエラスチン量が減少した真皮においても、エラスチンの産生が促進され、真皮内のエラスチン量が増加する。それゆえ、本発明のエラスチン産生促進剤により、皮膚のハリや弾力性を維持又は回復させることができ、皮膚の老化を防止又は改善することができる。
　本発明のエラスチン産生促進剤の投与量は、目標とする改善又は予防効果、年齢、投与方法等によって変化するので一概には規定できないが、通常一日の投与量は、有効成分であるシアリダーゼとして、０．０００１Ｕ～１０Ｕ程度とすることが好ましく、０．００１Ｕ～１Ｕ程度とすることがより好ましく、０．００５Ｕ～０．５Ｕ程度とすることがより好ましい。さらに詳細に説明すると、経皮投与量としては、一例として塗布面積１ｃｍ２あたり、有効成分であるシアリダーゼとして、０．００００５Ｕ～５Ｕ程度とすることが好ましく、０．０００５Ｕ～０．５Ｕ程度とすることがより好ましく、０．００２５Ｕ～０．２５Ｕ程度とすることがより好ましい。
　本発明のエラスチン産生促進剤を経皮投与するにあたっては、有効成分であるシアリダーゼを皮膚組織の内部に浸透させる必要がある。そのため、本発明のエラスチン産生促進剤を投与するにあたり、経皮薬物送達作用を有する物質を用いることが好ましい。経皮薬物送達作用を有する物質としては、本発明の作用効果を妨げないものであればよく、既知のＴＤＤＳ（Transdermal Drug Delivery System）を用いることができる。より詳細には、常温・常圧で液体を呈する有機塩である、いわゆる“イオン液体”を経皮薬物送達のために用いることが好ましい。イオン液体としては、カチオンとしてコリンを用いるものが好ましく、例えば、コリンゲラン酸、コリンオレイン酸又はコリンマロン酸等が挙げられ、このうち、以下化学式１に示すコリンゲラン酸（ＣＡＧＥ）が特に好適に用いられ得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上述したような経皮薬物送達作用を有する物質は、有効成分であるシアリダーゼと共に配合成分としてエラスチン産生促進剤に含有させることができる。これにより、１剤タイプのエラスチン促進剤が得られる。
　また、上述したような経皮薬物送達作用を有する物質は、有効成分であるシアリダーゼとは別に投与することも可能である。この場合には、有効成分であるシアリダーゼを含むエラスチン産生促進剤を皮膚に塗布した後、ＣＡＧＥのような経皮薬物送達作用を有する物質を、シアリダーゼを塗布した上から塗布する。後述する実施例４では、このような２回塗布投与も有効であることが示されている。
　また、上述したＴＤＤＳ（Transdermal Drug Delivery System）にあたっては、化学物質による薬物送達だけでなく、マイクロニードル、無針注射器（ニードルレスインジェクター）、イオン導入（イオントフォレシス）、超音波導入（ソノフォレシス）、エレクトロポレーション等による物理的な経皮薬物送達を行うことも可能である。
　本発明のエラスチン産生促進剤は、アンチエイジング効果を有する皮膚化粧料として用いることができる。これにより、皮膚のハリや弾力性を維持又は回復させ、皮膚の皺やたるみを予防又は改善させることができる。
　本発明のエラスチン産生促進剤又は皮膚化粧料には、本発明の作用効果を損なわない範囲で、通常外用剤に配合される種々の成分を配合することができる。例えば、保湿剤、エモリエント剤、植物エキス、植物油脂、ｐＨ調整剤、界面活性剤、増粘剤、ビタミン類、アミノ酸類、防腐剤、抗菌剤、香料及び色素などが挙げられる。
　さらに、本発明のエラスチン産生促進剤又は皮膚化粧料は、通常皮膚に適用される剤形として、従来慣用されている方法により種々の外用剤の剤型に適用されることができ、例えば、ローション等の液剤、乳液剤、ゲル剤、ドライウォーター等の粉末剤又はクリーム剤等が挙げられる。また、貼付剤、パック剤、メイクアップ製品、クレンジング剤、石鹸又はヘアケア剤や育毛剤等に適用することも可能である。なお、有効成分であるシアリダーゼと、経皮薬物送達作用を有する物質とを別々に製剤化した場合には、別々に製剤化したものを使用時に混合して投与することができるほか、別々に製剤化したものを、同時にまたは時間差をおいて投与することも可能である。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
　［実施例１］
　１．皮膚組織におけるシアリダーゼ活性の検討（１）
　ラット皮膚組織におけるシアリダーゼ活性の有無及び分布について、本発明者らが開発した蛍光イメージングプローブ（非特許文献１）を用いて検討を行った。この蛍光イメージングプローブは、蛍光物質であるＢＴＰ３［（２－ベンゾチアゾール－２－イル）－４－ブロモフェノール］のフェノール性水酸基に、シアリダーゼが認識するシアル酸の分子種Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）を結合させたＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃである。ＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃは水に可溶であり、蛍光もオフ制御されているが、シアリダーゼと反応すると水に不溶の蛍光物質ＢＴＢ３が生成して組織に沈着し、蛍光染色される。それゆえ、シアリダーゼ活性の存在部位を組織化学的に蛍光イメージングすることができる。
　Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１２週齢、日本エスエルシー株式会社）の背部皮膚を、凍結組織切片作製用包埋剤（ティシュー・テック（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて包埋した。組織を凍結した後、クリオスタット（ライカマイクロシステムズ株式会社）で１００～３００μｍ厚の凍結組織切片を作製した。この切片を１ｍＭのＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃを含むＰＢＳ（ｐＨ７．３）５０～１００μＬに浸した後、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した（Ｅｘ／Ｅｍ＝３７２ｎｍ／５２６ｎｍ）。観察後の切片をヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）して観察を行った。結果を図１に示す。
　図１に示すように、ラット皮膚組織のうち、真皮の下層部分に強い蛍光が検出された。よって、皮膚組織の真皮の下層部分に、極めて強いシアリダーゼ活性を有することが明らかとなった。
　［実施例２］
　２．皮膚組織におけるシアリダーゼ活性の検討（２）
　ラット皮膚組織におけるシアリダーゼ活性と、加齢との関係について検討を行った。妊娠（胎生）１９日目（Ｅ１９）、１週齢、６週齢、１２週齢及び２１月齢超のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本エスエルシー株式会社）の各皮膚におけるシアリダーゼ活性を測定した。採取した各ラットの皮膚に２倍量の０．３２Ｍスクロースを加え、氷冷しながら２００ｒｐｍでホモジナイズした。このホモジネートに対し、シアリダーゼ活性を蛍光検出できる基質である４０μＭの４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃ（４－メチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチルノイラミン酸）を含んだＰＢＳ（ｐＨ７．３）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。反応停止後に、プレートリーダー（Infinite（登録商標）Ｍ２００、テカンジャパン株式会社）を用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵ（４－メチルウンベリフェロン）の蛍光強度を測定した（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５ｎｍ／４６０ｎｍ）。結果を図２に示す。
　図２によれば、シアリダーゼ活性は１２週齢までは増加するものの、２１月齢超のラットについては、１２週齢のラットの約１／３程度まで減少することがわかった。このように、皮膚組織におけるシアリダーゼ活性は、加齢と共に著しく減少することが今回初めて見出された。これらの知見から、加齢によるエラスチンの存在量の減少は、加齢と共にシアリダーゼ活性が減少することが関与している可能性がある。そこで、老化によって減少した真皮下層のシアリダーゼを補うことにより、真皮におけるエラスチンの存在量の減少の抑制や、真皮におけるエラスチン産生を促進できる可能性があると考えられた。
　［実施例３］
　３．真皮に存在するシアリダーゼのアイソザイムの検討
　動物シアリダーゼにはＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３及びＮＥＵ４の４種類のアイソザイムがある。４種のアイソザイムは、その局在や基質特異性がそれぞれ異なっており、それゆえ、機能や役割も異なっている。実施例１において、ラット皮膚組織の真皮下層に強いシアリダーゼ活性が検出されたことから、真皮において高く発現しているシアリダーゼのアイソザイムについて検討を行った。
　Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１２週齢、日本エスエルシー株式会社）から、（Ａ）真皮及び真皮に隣接する筋肉組織（Ｄｅｒｍｉｓ＋Ｍｕｓｃｌｅ）と、（Ｂ）皮下脂肪組織（Ｆａｔ）をそれぞれ摘出した。摘出組織（Ａ）、（Ｂ）それぞれについて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの分離を行った。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの分離は、具体的には次のようにして行った。摘出組織それぞれに対し、TRIzol（登録商標）Reagent（インビトロジェン株式会社）１ｍＬを加えてホモジナイズし、室温で５分間静置した。引き続き、クロロホルム１００μＬを加えて転倒混和後、室温で３分間静置した。静置後、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、水層を分取した。水層２５０μＬに２－プロパノール２５０μＬを加え、転倒混和後、室温で１０分間静置した。静置後、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清除去後、７５％エタノール５００μＬを加え、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清除去後、３分間風乾し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water（インビトロジェン株式会社）を３０μＬ加えた。分光光度計（NanoDrop ND-1000、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）で分離されたｔｏｔａｌ　ＲＮＡを定量し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterでｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度を１００ｎｇ／μＬに調整した。
　摘出組織（Ａ）、（Ｂ）から分離された各ＲＮＡサンプルを用いて、４種のシアリダーゼのアイソザイム、すなわち、ラットのシアリダーゼＮｅｕ１、Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ３及びＮｅｕ４のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で定量した。具体的には、One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit（タカラバイオ株式会社）を用い、プロトコールに従って測定し、各ｍＲＮＡの発現量を比較した。測定機器にはThermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System Lite（タカラバイオ株式会社）を用いた。
　結果を図３に示す。図３（ａ）はシアリダーゼＮｅｕ１のｍＲＮＡ発現量、図３（ｂ）はシアリダーゼＮｅｕ２のｍＲＮＡ発現量、図３（ｃ）はシアリダーゼＮｅｕ３のｍＲＮＡ発現量及び図３（ｄ）はシアリダーゼＮｅｕ４のｍＲＮＡ発現量を示す。なお、図３では、皮下脂肪組織（Ｆａｔ）のｍＲＮＡ発現量を１としたときの、真皮及び真皮のすぐ下側に隣接する筋肉組織（Ｄｅｒｍｉｓ＋Ｍｕｓｃｌｅ）におけるｍＲＮＡ発現量のレベルを示している。この結果によれば、４種のアイソザイムのうち、シアリダーゼＮＥＵ２が真皮において高く発現していることが明らかとなった。
　［実施例４］
　４．シアリダーゼＮＥＵ２によるエラスチン産生促進効果
　本実施例では、真皮に多量に存在するシアリダーゼがシアリダーゼＮＥＵ２であることが見出されたことから、シアリダーゼＮＥＵ２によるエラスチン産生促進効果を検討した。具体的には、培養細胞での組換えタンパク質発現によりシアリダーゼＮＥＵ２を作製し、ラットの皮膚に所定期間塗布した後、ラットの皮膚組織内に含まれるエラスチン量を測定した。
　まず、ラットのシアリダーゼＮＥＵ２をコードする遺伝子（２５３１ｂｐ）のＤＮＡ断片をクローニング法により作成した。作成したラットのＮｅｕ２遺伝子のＤＮＡ断片をインサートとしてベクターにクローニングし、Ｎｅｕ２遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したＮＥＵ２発現ベクターをＣ６グリオーマ細胞に導入してトランスフェクションを行い、ＮＥＵ２産生細胞を得た。得られたＮＥＵ２産生細胞をＭＥＭ培地にて細胞培養し、タンパク質発現を行った。発現したＮＥＵ２タンパク質を培地から回収し、限外濾過によって濃縮した。この濃縮液に対し、４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを含んだＰＢＳ（ｐＨ７．３）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。反応停止後に、プレートリーダーを用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵの蛍光強度を測定し、シアリダーゼ活性を得た（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５ｎｍ／４６０ｎｍ）。組換えタンパク質発現により得られたシアリダーゼＮＥＵ２の酵素活性は、２１．３　４ＭＵ　ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬであった。
　皮膚の最外層の細胞である角質層は、異物の侵入を防ぐ物理的バリアーの機能を有している。それゆえ、シアリダーゼＮＥＵ２のようなタンパク質を皮膚表面に塗布しても、角質層を透過させ、皮膚組織の内部で作用させることは困難である。そこで、本実施例では、上述のようにして得たシアリダーゼＮＥＵ２を経皮投与するにあたり、イオン液体であるコリンゲラン酸（ＣＡＧＥ）を用いた。ＣＡＧＥの構造式を以下化学式２に示す。ＣＡＧＥは、薬物溶解性に優れ、経皮薬物送達作用を有することが知られている（特表２０１６－５３５７８１参照）。本実施例では、ＣＡＧＥとシアリダーゼＮＥＵ２とを混合したサンプル液（ＣＡＧＥ＋Ｎｅｕ２）を調製し、塗布試験を行った。また、シアリダーゼＮＥＵ２を一定量塗布した後に、ＣＡＧＥを塗布するという２回塗布試験（Ｎｅｕ２，ＣＡＧＥ）も試みた。なお、比較対照として、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）及びＣＡＧＥのみをサンプル液として塗布する試験も行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１２週齢、日本エスエルシー株式会社）の左右背部の毛を直径１５ｍｍの円の大きさに除毛し、サンプル液を塗布する部位を設けた。以下表１に示す内容で、各サンプル液をラットの除毛した直径１５ｍｍの円の範囲に塗布した。塗布は１日２回、５日間に亘って行った（計１０回塗布）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　最後の塗布から１日後、サンプル液の塗布を行った部分の皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をホモジナイズした後、エラスチンの比色定量キット（Fastin Elastin Assay Kit、Biocolor社製品）を用い、皮膚組織のホモジネートに含まれるエラスチン量を測定した。結果を図４のグラフに示す。この結果によれば、シアリダーゼＮＥＵ２とＣＡＧＥとを混合液として塗布した場合（ＣＡＧＥ＋Ｎｅｕ２）と、シアリダーゼＮＥＵ２を塗布してからＣＡＧＥを塗布した場合（Ｎｅｕ２，ＣＡＧＥ）のいずれにおいても、皮膚組織におけるエラスチン量が増加することがわかった。これにより、シアリダーゼＮＥＵ２を経皮投与することにより、皮膚組織におけるエラスチンの産生が促進されることが明らかとなった。
　また、図４のグラフで示されるように、シアリダーゼＮＥＵ２を塗布してからＣＡＧＥを塗布した場合（Ｎｅｕ２，ＣＡＧＥ）のエラスチン量の増加が大きいことから、ＣＡＧＥは先に塗布されたシアリダーゼＮＥＵ２を皮膚上で素早く取り込み、皮膚内部に送達することができることがわかった。
　また、シアリダーゼＮＥＵ２の投与がエラスチン遺伝子のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を調べた。具体的には、表１に示す各サンプル液の最後の塗布から１日後、ラットの側腹部の皮膚及び皮下脂肪等の組織を採取し、TRIzol（登録商標）Reagent（インビトロジェン株式会社）を用い、実施例３と同様の方法にて、ラットの皮膚からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを分離した。分離したＲＮＡサンプルを用いて、ラットのエラスチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で測定した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにあたっては、One-Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCRキット（タカラバイオ株式会社）及びプライマーを用いてプロトコールに従って行った。測定機器にはThermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System Lite（タカラバイオ株式会社）を用いた。エラスチンｍＲＮＡの発現レベルは、内部標準であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）に対するエラスチンｍＲＮＡの相対量として求めた。結果を図５のグラフに示す。
　図５のグラフに示されるように、エラスチン遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルについては、シアリダーゼＮＥＵ２の投与を行わなかった対照区（ＰＢＳ、ＣＡＧＥ）と、シアリダーゼＮＥＵ２の投与を行った試験区（ＣＡＧＥ＋Ｎｅｕ２、Ｎｅｕ２，ＣＡＧＥ）との間で、シアリダーゼＮＥＵ２の投与による統計学的に有意な影響は認められなかった。このことから、シアリダーゼＮＥＵ２の投与はエラスチン遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルには影響しないことが示された。なお、図４に示すように、シアリダーゼＮＥＵ２の投与により皮膚組織におけるエラスチン量は著しく増加しており、エラスチン産生が促進されていることから、シアリダーゼＮＥＵ２は、エラスチン遺伝子の発現亢進以外のメカニズムにより、エラスチン産生を促進することが推測された。
　［実施例５］
　５．細菌シアリダーゼによるエラスチン産生促進効果
　シアリダーゼには、哺乳類に存在する動物シアリダーゼ、ウイルスに存在するウイルスシアリーゼ及び細菌に存在する細菌シアリダーゼ等の複数の種類がある。このうち、動物シアリダーゼと比較して高いシアリダーゼ活性を有する細菌シアリダーゼについて、エラスチン産生促進効果を検討した。
　具体的には、アルスロバクター属細菌のArthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼをラットの皮膚に所定期間塗布した後、ラットの皮膚組織内に含まれるエラスチン量及びシアリダーゼ活性を測定した。本実施例では、実施例４同様にコリンゲラン酸（ＣＡＧＥ）とArthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ（ＡＵＳＡ）とを一定量混合したサンプル液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）を調製し、塗布試験を行った。また、比較対照として、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）及びＣＡＧＥのみをサンプル液として塗布する試験も行った。
　事前に、シアリダーゼ（ＡＵＳＡ）とＣＡＧＥとを混合した際に、シアリダーゼ活性が維持されるかどうかについて確認を行った。Arthrobacter ureafaciens由来のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ：Neuraminidase from Arthrobacter ureafaciens, highly purified、型番：２４２２９－７４、ナカライテスク株式会社）をＰＢＳ又はＣＡＧＥにそれぞれ添加し、１２５ｎｇ／ｍＬ濃度の溶液を調製した。ＡＵＳＡとＰＢＳの混合液（１２５ｎｇ／ｍＬ：ＡＵＳＡ　ｉｎ　ＰＢＳ）とＡＵＳＡとＣＡＧＥの混合液（１２５ｎｇ／ｍＬ：ＡＵＳＡ　ｉｎ　ＣＡＧＥ）に対し、４０μＭの４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを含んだＰＢＳ（ｐＨ７．３）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。反応停止後に、プレートリーダーを用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵの蛍光強度を測定し、シアリダーゼ活性を得た（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５ｎｍ／４６０ｎｍ）。結果を図６（ａ）に示す。この結果によれば、シアリダーゼをＣＡＧＥと混合しても（ＡＵＳＡ　ｉｎ　ＣＡＧＥ）、シアリダーゼ活性が失われることはなく、活性が維持されることが分かった。
　次に、Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１２週齢、日本エスエルシー株式会社）の左右背部の毛を除毛し、サンプル液を塗布する部位を設けた。以下表２に示す内容で、各サンプル液をラットの除毛した直径１５ｍｍの円の範囲に塗布した。塗布は１日２回、５日間に亘って行った（計１０回塗布）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　最後の塗布から１日後、サンプル液の塗布を行った部分の皮膚組織を採取し、採取した皮膚組織の一部をホモジナイズした。このホモジネートに対し、４０μＭの４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを含んだＰＢＳ（ｐＨ７．３）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。反応停止後に、プレートリーダーを用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵの蛍光強度を測定し、シアリダーゼ活性を得た（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５ｎｍ／４６０ｎｍ）。結果を図６（ｂ）に示す。また、エラスチンの比色定量キット（Fastin Elastin Assay Kit、Biocolor社製品）を用い、採取した皮膚組織のホモジネートに含まれるエラスチン量を測定した。結果を図６（ｃ）のグラフに示す。
　図６（ｂ）及び図６（ｃ）に示すように、ＣＡＧＥと細菌シアリダーゼを混合したサンプル液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）を皮膚に塗布することにより、皮膚組織におけるシアリダーゼ活性が上昇し、皮膚組織におけるエラスチン量が増加することがわかった。これにより、細菌シアリダーゼを経皮投与することにより、皮膚組織におけるエラスチンの産生が促進されることが明らかとなった。
　また、蛍光イメージングプローブＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃを用いて、塗布試験を行った皮膚組織におけるシアリダーゼ活性の存在部位を組織化学的な蛍光イメージングにより示した。具体的には、採取した皮膚組織の一部を凍結組織切片作製用包埋剤（ティシュー・テック　Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて包埋し、組織を凍結した後、クリオスタット（ライカマイクロシステムズ株式会社）で１００μｍ厚の凍結組織切片を作製した。ＰＢＳで洗浄した後、３００μＭのＢＴＰ３－Ｎｅｕ５Ａｃを１５０μＬ添加し、室温（２７℃）で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察した（Ｅｘ，Ｅｍ＝３６０／４０，５２５／５０）。結果を図７に示す。
　この結果によれば、ＰＢＳのみ、又はＣＡＧＥのみを経皮投与した皮膚組織と比べて、ＣＡＧＥと細菌シアリダーゼの混合液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）を経皮投与した皮膚組織では、皮膚組織内部において強い蛍光が観察された。これにより、ＣＡＧＥと細菌シアリダーゼの混合液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）を経皮投与することにより、皮膚組織内にシアリダーゼが送達され、シアリダーゼ活性が上昇することが確認された。
　さらに、塗布試験を行った皮膚組織におけるエラスチンの分布について免疫組織染色（図８）及びエラスチンの自家蛍光（図９）により確認した。具体的には、採取した皮膚組織の真皮から伸展切片を作製し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。免疫組織染色のブロッキング剤としてヤギ正常血清（Goat Serum ２％）１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。引き続き、１次抗体（Elastin Polyclonal antibody）を１００μＬ加え、４℃で一晩インキュベートした。そして、２次抗体（Goat Anti-Rabbit IgG）を１００μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした後、顕微鏡（Ｅｘ／Ｅｍ＝４７０ｎｍ／５２５ｎｍ）で観察した。免疫組織染色の結果を図８に示す。
　この結果によれば、ＰＢＳのみ、又はＣＡＧＥのみを経皮投与した皮膚組織と比べて、ＣＡＧＥと細菌シアリダーゼの混合液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）を経皮投与した皮膚組織では、皮膚組織内部においてエラスチンの広い範囲における染色が観察された。これにより、ＣＡＧＥと細菌シアリダーゼの混合液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）を経皮投与することにより、皮膚組織内にシアリダーゼが送達され、皮膚組織におけるエラスチンの産生が促進されることが明らかとなった。
　他方、エラスチンは自家蛍光を発する自家蛍光物質であることから、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した真皮切片について、蛍光顕微鏡を用いてエラスチンの自家蛍光を観察した。結果を図９に示す。細菌シアリダーゼとＣＡＧＥとの混合液（ＣＡＧＥ＋ＡＵＳＡ）の塗布を行った皮膚組織ではエラスチンの自家蛍光が多く観察され、エラスチン量が増加している様子が観察された。
　［実施例６］
　６．老化促進モデルマウスに対するエラスチン産生促進効果
　本実施例では、老化促進モデルマウスを用いて、加齢によりシアリダーゼ活性が低下し、エラスチン量が減少した状態の個体に対しても、シアリダーゼを経皮投与することにより、エラスチンの産生を促すことができるかどうかを調べた。
　老化促進モデルマウスとしては、促進老化・短寿命を示すＳＡＭＰ（Senescence-Accelerated Mouse Prone）であるＳＡＭＰ１とＳＡＭＰ８を選択した（２４週齢、雄、日本エスエルシー株式会社）。老化促進モデルマウスの左右背部の毛を除毛し、サンプル液を塗布する部位を設けた。以下表３に示す内容で、各サンプル液をマウスの除毛した直径１０ｍｍの円の範囲に塗布した。塗布は１日２回、５日間に亘って行った（計１０回塗布）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　最後の塗布から１日後、サンプル液の塗布を行った部分の皮膚組織を採取し、採取した皮膚組織の一部をホモジナイズした。このホモジネートに対し、エラスチンの比色定量キット（Fastin Elastin Assay Kit、Biocolor社製品）を用い、採取した皮膚組織のホモジネートに含まれるエラスチン量を測定した。結果を図１０のグラフに示す。
　この結果によれば、老化促進モデルマウスに対して、シアリダーゼを経皮投与することにより、エラスチン発現量が増加することがわかった。よって、老化によってエラスチン量が減少している状態においても、シアリダーゼを経皮送達させることにより、真皮におけるエラスチン産生を促進して真皮中のエラスチン量を増加させるという、アンチエイジング効果を有することが明らかとなった。
　［実施例７］
　７．シアリダーゼの酵素活性の安定性の検討
　ラット由来のシアリダーゼＮＥＵ１を産生するＮＥＵ１産生細胞を、実施例４と同様の方法及びＣ６グリオーマ細胞を用いて得た。このＮＥＵ１産生細胞をＭＥＭ培地にて細胞培養してシアリダーゼＮＥＵ１を発現させた。細胞を回収し、細胞溶解処理を行って、発現したシアリダーゼＮＥＵ１を含む可溶化液を得た。この可溶化液に対し、４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを含んだＰＢＳ（ｐＨ４．６）を添加し、２７℃で所定の時間反応させた。なお、シアリダーゼＮＥＵ１の至適ｐＨは４．６と酸性領域にあるため、反応液のｐＨを４．６としている。反応停止後に、プレートリーダーを用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵの蛍光強度を測定し、可溶化液中のシアリダーゼＮＥＵ１のシアリダーゼ活性を定量した（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５５ｎｍ／４６０ｎｍ）。また、実施例４で得たラット由来のシアリダーゼＮＥＵ２を産生するＮＥＵ２産生細胞についても同様の試験を行い、可溶化液におけるシアリダーゼＮＥＵ２の所定の反応時間ごとのシアリダーゼ活性を定量した。なお、シアリダーゼＮＥＵ２の至適ｐＨは中性領域であるため、実施例４と同様に反応液のｐＨは７．３としている。結果を図１１に示す。なお、図１１におけるＭｏｃｋは、インサートＤＮＡ断片が組み込まれていない空のベクターを用いた場合のデータを示している。
　また、上述したシアリダーゼＮＥＵ１を含む可溶化液について、可溶化後の経過時間とそのシアリダーゼ活性を定量し、酵素活性の安定性を調べた。可溶化処理から所定時間経過した可溶化液に対し、４ＭＵ－Ｎｅｕ５Ａｃを含んだＰＢＳ（ｐＨ４．６）を添加し、２７℃で１時間反応させた。反応停止後に、プレートリーダーを用いて、シアリダーゼとの反応によって遊離した４ＭＵの蛍光強度を測定し、シアリダーゼ活性を定量した。結果を図１２に示す。
　これらの結果によれば、シアリダーゼＮＥＵ１と比較して、シアリダーゼＮＥＵ２は得られたシアリダーゼ活性が強いことが示された（図１１）。また、シアリダーゼＮＥＵ１の酵素活性は細胞の可溶化後に急速に減弱すること（図１２）が示された。これらの結果から、シアリダーゼＮＥＵ２は皮膚に塗布して用いるにあたり、シアリダーゼＮＥＵ１と比較してエラスチン産生促進剤として好適に使用され得ることがわかった。
　本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
　本発明は、エラスチン産生促進効果に優れ、老化による真皮エラスチンの減少を予防・改善することができるエラスチン産生促進剤及び皮膚化粧料を提供するため、化粧品分野や医薬品、医薬部外品等の分野の産業において幅広く役立つものである。

Claims (7)

  1. 　シアリダーゼを有効成分として含有する、エラスチン産生促進剤。
  2. 　前記シアリダーゼがシアリダーゼＮＥＵ２である、請求項１に記載のエラスチン産生促進剤。
  3. 　前記シアリダーゼが細菌シアリダーゼである、請求項１に記載のエラスチン産生促進剤。
  4. 　前記細菌シアリダーゼが、アルスロバクター属細菌（Arthrobacter sp.）由来のシアリダーゼであることを特徴とする請求項３に記載のエラスチン産生促進剤。
  5. 　前記エラスチンが真皮の線維性組織を構成する真皮エラスチンであることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のエラスチン産生促進剤。
  6. 　皮膚の老化の改善用又は予防用であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載のエラスチン産生促進剤。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のエラスチン産生促進剤を含むことを特徴とする皮膚化粧料。
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