CN115515558A - 弹性蛋白产生促进剂以及皮肤化妆品 - Google Patents
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Abstract
提供一种新型弹性蛋白产生促进剂。弹性蛋白产生促进剂含有作为有效成分的唾液酸酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种弹性蛋白产生促进剂，尤其涉及一种能够增加随着年龄增长而减少的真皮弹性蛋白的弹性蛋白产生促进剂。
背景技术
皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。其中，在位于表皮下侧的真皮中分布有赋予皮肤强度的胶原纤维和支持该胶原纤维的弹性蛋白。弹性蛋白是具有弹性和伸缩性的弹性纤维，具有给皮肤带来弹性和张力的作用。然而，已知弹性蛋白的存在量随着年龄增长而减少，这成为皮肤皱纹和松弛的原因之一。
因此，为了防止皮肤的皱纹和松弛，提出了各种弹性蛋白产生促进剂。例如，在专利文献1中，记载了以作为属于脂质运载蛋白家族的蛋白质的脂质运载蛋白2或其分解物作为有效成分的弹性蛋白产生促进剂，在专利文献2中，记载了以特定的二肽或三肽为有效成分的弹性蛋白产生促进剂。
另一方面，唾液酸酶是使唾液酸从糖链脱离的水解酶。唾液酸主要修饰糖链的末端，涉及生理功能、疾病、病毒感染等广泛的生命现象。因此，已知唾液酸酶具有控制细胞分化/繁殖、凋亡等细胞功能的作用。因此，本发明人为了加深关于在生物体内担负重要作用的唾液酸酶的了解，开发了能够在组织上高灵敏度地可视化唾液酸酶的酶活性的荧光成像探针(非专利文献1)。
本发明人正在使用上述的荧光成像探针推进对唾液酸酶的新的生理学作用的阐明。作为一例，在专利文献3中，新发现在胰岛中检测到唾液酸酶活性，并且报告了具有唾液酸酶抑制活性的化合物具有血糖值上升抑制效果以及胰岛素分泌量增加作用。
唾液酸酶大致分为动物(哺乳类)唾液酸酶、病毒唾液酸酶以及细菌唾液酸酶三大类。其中，作为动物唾液酸酶的一种的唾液酸酶NEU1与弹性蛋白结合蛋白(EBP)以及组织蛋白酶A形成分子复合体，参与弹性蛋白纤维集合即涉及弹性纤维的形成(非专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2015-000860号公报
专利文献2：特开2014-141450号公报
专利文献3：特开2017-222641号公报
非专利文献
非专利文献1：Minami A.et al.,PLOS ONE,Volume 9,Issue 1,e81941,2014年
非专利文献2：Hinek A.et al.,J.Biol.Chem.,Vol.281,No.6,pp.3698-3710,2006年
发明内容
发明所要解决的课题
然而，迄今为止，还没有使用非专利文献1中所报道的荧光成像探针可视化皮肤组织中的唾液酸酶活性的分布的报道。另外，也没有对随着年龄增长的真皮的弹性蛋白的存在量降低的现象和唾液酸酶的关联性进行研究的报告。
而且，在抗老化意识提高的同时仍然期待开发和提供具有弹性蛋白产生促进效果的新的材料，但迄今为止还没有为了在皮肤组织中促进弹性蛋白产生使用唾液酸酶的相关研究，并且其有效性完全不明。
因此，本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于，提供一种新型弹性蛋白产生促进剂。
另外，本发明的另一目的在于，提供一种能够改善或预防随着年龄增长的真皮弹性蛋白的减少的弹性蛋白产生促进剂。
课题解决手段
本发明人在使用非专利文献1中记载的荧光成像探针来阐明在痴呆症中唾液酸酶的参与的过程中，偶然发现皮肤组织的唾液酸酶活性随着老化而显著降低。基于这一发现，完成了本发明。
为了解决上述问题，本发明的弹性蛋白产生促进剂含有作为有效成分的唾液酸酶。通过向靶组织施用唾液酸酶，可以促进弹性蛋白的产生，增加靶组织中的弹性蛋白量。
另外，在本发明的弹性蛋白产生促进剂中，上述的唾液酸酶优选是唾液酸酶NEU2。由此，选择作为弹性蛋白产生促进剂适合的唾液酸酶的种类。
另外，在本发明的弹性蛋白产生促进剂中，上述的唾液酸酶优选是细菌唾液酸酶。由此，选择作为弹性蛋白产生促进剂适合的唾液酸酶的种类。另外，由于细菌唾液酸酶的唾液酸酶活性高，稳定性也优异，因此也容易处理。
另外，在本发明的弹性蛋白产生促进剂中，上述的细菌唾液酸酶优选是节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)来源的唾液酸酶。由此，选择唾液酸酶活性高、安全性/稳定性也优异的更合适的唾液酸酶的种类。
另外，在本发明的弹性蛋白产生促进剂中，上述的唾液酸酶优选是构成真皮的纤维性组织的真皮弹性蛋白。由此，选择作为促进弹性蛋白的产生的对象适合的唾液酸酶的种类。
另外，本发明的弹性蛋白产生促进剂优选用于防止或改善皮肤的老化。存在于真皮中的弹性蛋白随着年龄增长其存在量减少从而产生皮肤的皱纹和松弛，通过施用唾液酸酶，促进弹性蛋白的产生，增加弹性蛋白量。因此，能够维持或恢复皮肤的张力和弹性，防止或改善皮肤的老化。
另外，本发明的皮肤化妆品中含有上述的弹性蛋白产生促进剂。由此，可以得到具有提高皮肤的张力和弹性的作用的皮肤化妆品。
发明效果
根据本发明，可以提供具有以下优异效果的弹性蛋白产生促进剂以及皮肤化妆品：
(1)可以提高弹性蛋白的产生，增加靶组织中的弹性蛋白量。
(2)可以提高真皮弹性蛋白的存在量，提高皮肤的张力和弹性。
(3)可以防止/改善由于老化导致的真皮弹性蛋白的减少。
附图说明
图1是示出实施例1中的大鼠皮肤组织切片的唾液酸酶活性的荧光成像图像以及该切片的H&E染色图像。
图2是示出实施例2中的大鼠的周龄与大鼠皮肤组织中的唾液酸酶活性的关系的图表。图表中的***表示：相对于E19，P＜0.001，
表示：相对于12周，P＜0.001。
图3是示出实施例3中的相对于大鼠的皮下脂肪组织(脂肪)的真皮和肌肉组织(真皮+肌肉)的动物唾液酸酶的各同工酶的表达比率的图表。图3(a)表示唾液酸酶Neu1的表达水平，图3(b)表示唾液酸酶Neu2的表达水平，图3(c)表示唾液酸酶Neu3的表达水平，图3(d)表示唾液酸酶Neu4的表达水平。图表中的*表示：P＜0.05，***表示：P＜0.001。
图4是示出实施例4中的通过对大鼠皮肤涂布唾液酸酶NEU2的弹性蛋白产生促进效果的图表。图表中的**表示：相对于CAGE，P＜0.01，***表示：相对于CAGE，P＜0.001。
图5是表示实施例4中的通过对大鼠皮肤涂布唾液酸酶NEU2的弹性蛋白基因的mRNA表达水平的图表。
图6是示出实施例5中的通过对大鼠皮肤涂布细菌唾液酸酶的唾液酸酶活性的变化的图表(图6(b))、弹性蛋白产生促进效果的图表(图6(c))。另外，图6(a)是示出将细菌唾液酸酶分别与PBS或作为离子液体的胆碱和香叶酸(CAGE)混合时的唾液酸酶活性的图表。图表中的*表示：相对于CAGE，P＜0.05，**表示：相对于CAGE，P＜0.01。
图7是示出实施例5中的各试验组的皮肤切片的唾液酸酶活性的分布的荧光成像图像。
图8是示出实施例5中的各试验组的真皮组织切片的弹性蛋白的分布的免疫染色图像。
图9是示出实施例5中的各试验组的真皮组织切片的弹性蛋白的分布的自发荧光弹性蛋白图像。比例尺表示50μm。
图10是示出实施例6中的通过对老化促进模型小鼠的皮肤上涂布唾液酸酶的弹性蛋白产生促进效果的图表。图10(a)示出作为老化促进模型小鼠使用SAMP1的试验组的数据，图10(b)示出作为老化促进模型小鼠使用SAMP8的试验组的数据。图表中的
表示：P＜0.001。
图11是示出实施例7中的唾液酸酶NEU1以及唾液酸酶NEU2的酶活性和耐久性的图表。
图12是示出实施例7中的唾液酸酶NEU1的经时稳定性的图表。
具体实施方式
本发明中的唾液酸酶(有时也称为神经氨酸酶)是从使唾液酸脱离糖链的水解酶，唾液酸酶活性是指能够使唾液酸脱离糖链的活性。对唾液酸酶活性没有特别限制，可以使用例如4MU-Neu5Ac或本发明人开发的BTP-Neu5Ac来检测。
作为本发明中使用的唾液酸酶，只要是具有弹性蛋白产生促进作用的唾液酸酶就没有特别限制，但从弹性蛋白产生促进效果优异的观点出发，优选使用动物(哺乳类)唾液酸酶或细菌唾液酸酶。其中，动物唾液酸酶有四种同工酶NEU1、NEU2、NEU3以及NEU4，可以仅使用一种同工酶，也可以将多种组合使用。另外，在本发明中，特别优选使用这次阐明的在真皮中高表达(参照后述的实施例)的唾液酸酶NEU2。唾液酸酶NEU2是由380个残基氨基酸编码的蛋白质，分子量约42kDa，最适pH接近中性。另外，由于唾液酸酶NEU2的耐久性优异，并且稳定地保持酶活性，因此容易处理。另外，动物唾液酸酶可以仅使用一种，也可以将多种组合使用。
另外，细菌唾液酸酶与动物唾液酸酶相比，具有唾液酸酶活性/酶稳定性高、还可以在大肠杆菌中大量表达等容易处理的优点。作为细菌唾液酸酶，作为一例，可以举出来源于节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)、双歧杆菌属细菌(Bifidobacterium sp.)、链球菌属细菌(Streptococcus sp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)或产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等的唾液酸酶。从弹性蛋白产生促进效果以及安全性等的观点出发，特别优选使用来自节杆菌属细菌的产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的唾液酸酶(市售品：nacalai tesque株式会社，型号24229)以及来自双歧杆菌属细菌的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的唾液酸酶等。另外，作为可使用的病毒唾液酸酶，还可以举出甲型流感病毒的神经氨酸酶(NA)、乙型流感病毒的神经氨酸酶(NA)、噬菌体等。另外，唾液酸酶可以仅使用一种，也可以将多种组合使用。
本发明中的唾液酸酶可以根据常规方法使用编码唾液酸酶的基因通过利用基因重组的蛋白表达获得。具体地，通过将编码唾液酸酶的DNA片段作为插入物插入至适当的表达载体的启动子的下游，得到重组载体。启动子是在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可以根据宿主的类型适当选择。通过将该重组载体导入至合适的宿主细胞，可以获得生产具有唾液酸酶活性的蛋白质的转化体。培养转化的宿主细胞并诱导重组蛋白的表达时，在培养细胞或培养物中生产蛋白。生产的蛋白质可以通过预定的方法回收。另外，除了通过上述的利用基因重组的蛋白表达以外，还可以通过从含有唾液酸酶的细胞或组织中提取以及纯化来得到唾液酸酶。
本发明的弹性蛋白产生促进剂含有作为有效成分的上述的唾液酸酶，具有增加含有弹性蛋白的组织中的弹性蛋白量的作用。作为含有弹性蛋白的组织，可以举出皮肤的真皮、血管壁、韧带以及肺组织等，在本发明中，特别是具有增加包含在皮肤的真皮中并构成纤维性组织的真皮弹性蛋白的作用。存在于真皮中的弹性蛋白随着年龄增长其存在量减少从而产生皮肤的皱纹和松弛，但通过施用上述的唾液酸酶，即使在弹性蛋白量减少的真皮中也促进弹性蛋白的产生，增加真皮内的弹性蛋白量。因此，通过本发明的弹性蛋白产生促进剂能够维持或恢复皮肤的张力和弹性，能够防止或改善皮肤的老化。
本发明的弹性蛋白产生促进剂的施用量根据作为目标的改善或预防效果、年龄、施用方法等而变化，因此不能一概而论地规定，通常一天的施用量是，作为有效成分的唾液酸酶，优选0.0001U至10U左右，更优选0.001U至1U左右，特别优选0.005U至0.5U左右。更详细地说明，作为经皮施用量，作为一例，每1cm2的涂布面积，作为有效成分的唾液酸酶，优选0.00005U至5U左右，更优选0.0005U至0.5U左右，特别优选0.0025U至0.25U左右。
在经皮施用本发明的弹性蛋白产生促进剂时，需要使作为有效成分的唾液酸酶渗透到皮肤组织的内部。因此，在施用本发明的弹性蛋白产生促进剂时，优选使用具有经皮药物递送作用的物质。作为具有经皮药物递送作用的物质，只要不妨碍本发明的作用效果即可，可以使用已知的TDDS(Transdermal Drug Delivery System)。更具体地，优选使用在常温/常压下呈液体的有机盐，即所谓的“离子液体”用于经皮药物递送。作为离子液体，优选使用胆碱作为阳离子，例如可以举出胆碱和香叶酸、胆碱和油酸、或胆碱和丙二酸等，其中，可以特别优选使用以下化学式1所示的胆碱和香叶酸(CAGE)。
[化学式1]
具有如上所述的经皮药物递送作用的物质可以与作为有效成分的唾液酸酶一起作为混合成分包含在弹性蛋白产生促进剂中。由此，得到一种剂型的弹性蛋白促进剂。
另外，具有如上所述的经皮药物递送作用的物质可以与作为有效成分的唾液酸酶分开施用。在这种情况下，在皮肤上涂布含有作为有效成分的唾液酸酶的弹性蛋白产生促进剂之后，再将CAGE等具有经皮药物递送作用的物质涂布在已涂布唾液酸酶的上面。在后述的实施例4中，显示出这样的2次涂布施用也是有效的。
另外，在上述的TDDS(Transdermal Drug Delivery System)中，不仅可以进行通过化学物质的药物递送，还可以进行通过微针、无针注射器(needless-injector)、离子导入(iontophoresis)、超声波导入(sonophoresis)、电穿孔等物理性经皮药物递送。
本发明的弹性蛋白产生促进剂可以作为具有抗衰老效果的皮肤化妆品使用。由此，能够维持或恢复皮肤的张力和弹性，防止或改善皮肤的皱纹和松弛。
在不损害本发明的作用效果的范围内，本发明的弹性蛋白产生促进剂或皮肤化妆品可以混合一般外用剂中混合的各种成分。例如，可以举出保湿剂、润肤剂、植物提取物、植物油脂、pH调节剂、表面活性剂、增粘剂、维生素、氨基酸、防腐剂、抗菌剂、香料以及色素等。
另外，本发明的弹性蛋白产生促进剂或皮肤化妆品，作为适用于一般皮肤的剂型，可以通过以往惯用的方法适用于各种外用剂的剂型，例如可以举出化妆水等液剂、乳剂、凝胶剂、干水等粉末剂或乳膏剂等。另外，也可以适用于贴剂、面膜剂、化妆品、清洁剂、肥皂或护发剂或生发剂等。另外，在将作为有效成分的唾液酸酶和具有经皮药物递送作用的物质分别制剂化的情况下，除了可以将分别制剂化的物质在使用时混合后施用之外，还可以将分别制剂化的物质同时或以时间差施用。
下面，通过实施例更详细地说明本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。
实施例
[实施例1]
1.对皮肤组织中的唾液酸酶活性的研究(1)
使用本发明人开发的荧光成像探针(非专利文献1)对大鼠皮肤组织中的唾液酶活性的有无以及分布进行研究。该荧光成像探针是在作为荧光物质的BTP3[(2-苯并噻唑-2-基)-4-溴苯酚]的酚羟基上结合了唾液酸酶识别的唾液酸的分子物种Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸)的BTP3-Neu5Ac。BTP3-Neu5Ac可溶于水，荧光也被关闭控制，但与唾液酸酶反应时会生成不溶于水的荧光物质BTB3并沉积在组织中，被荧光染色。因此，能够对唾液酸酶活性的存在部位进行组织化学荧光成像。
使用冷冻组织切片制作用包埋剂(Tissue-Tek(注册商标)O.C.T.化合物，SAKURA-FINETEK Japan株式会社)包埋Wistar系雄性大鼠(12周龄，日本SLC株式会社)的背部皮肤。冻结组织后，使用冷冻切片机(Leica Microsystems株式会社)制作100μm至300μm厚的冷冻组织切片。将该切片浸入50μL至100μL的含有1mM的BTP3-Neu5Ac的PBS(pH7.3)中，之后用PBS清洗，并通过荧光显微镜进行观察(Ex/Em＝372nm/526nm)。将观察后的切片进行苏木精-伊红染色(H&E染色)并观察。结果示于图1。
如图1所示，在大鼠皮肤组织中的真皮的下层部分检测到了强荧光。因此，表明在皮肤组织的真皮的下层部分具有非常强的唾液酸酶活性。
[实施例2]
2.对皮肤组织中的唾液酸酶活性的研究(2)
对大鼠皮肤组织中的唾液酸酶活性与年龄增长的关系进行了研究。测定妊娠(胎生)第19天(E19)、1周龄、6周龄、12周龄以及超过21月龄的Wistar系雄性大鼠(日本SLC株式会社)的各皮肤中的唾液酸酶活性。在采集到的各大鼠的皮肤中加入2倍量的0.32M蔗糖，在冰冷的同时以200rpm进行匀浆。对于该匀浆，添加含有作为能够荧光检测唾液酸酶活性的底物的40μM的4MU-Neu5Ac(4-甲基伞形酮-N-乙酰神经氨酸)的PBS(pH7.3)，在27℃孵育1小时。在反应停止后，使用酶标仪(Infinite(注册商标)M200，Tekan Japan株式会社)测量通过与唾液酸酶的反应而游离的4MU(4-甲基伞形酮)的荧光强度(Ex/Em＝355nm/460nm)。结果示于图2。
根据图2，发现唾液酸酶活性虽然一直到12周龄都在增加，但对于超过21月龄的大鼠，唾液酸酶活性减少到12周龄的大鼠的约1/3左右。因此，首次发现皮肤组织中的唾液酸酶活性随着年龄增长而显著减少。这些发现表明，随着年龄增长的弹性蛋白的存在量的减少可能与随着年龄增长的唾液酸酶活性的减少有关。因此，认为通过补充因老化而减少的真皮下层的唾液酸酶，有可能抑制真皮中的弹性蛋白的存在量的减少，促进真皮中的弹性蛋白产生。
[实施例3]
3.真皮中存在的唾液酸酶的同工酶的研究
动物唾液酸酶有NEU1、NEU2、NEU3以及NEU4四种同工酶。四种同工酶的定位和底物特异性各不相同，因此，功能和作用也不同。在实施例1中，在大鼠皮肤组织的真皮下层检测到强的唾液酸酶活性，因此对在真皮中高表达的唾液酸酶的同工酶进行了研究。
从Wistar系雄性大鼠(12周龄，日本SLC株式会社)中分别取出(A)真皮和与真皮相邻的肌肉组织(真皮+肌肉)、以及(B)皮下脂肪组织(脂肪)。分别对取出的组织(A)、(B)进行总RNA的分离。总RNA的分离具体如下进行。向各取出的组织加入1mL的TRIzol(注册商标)Reagent(Invitrogen株式会社)进行匀浆，在室温中静置5分钟。接着，加入100μL氯仿并颠倒混合，之后室温静置3分钟。静置后，在4℃以15000rpm离心20分钟，分取水层。在水层250μL中加入2-丙醇250μL，颠倒混合后，室温静置10分钟。静置后，在4℃以15000rpm离心10分钟，去除上清液后，加入75％乙醇500μL，在4℃以15000rpm离心20分钟。去除上清液之后，风干3分钟，加入UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water(Invitrogen株式会社)30μL。用分光光度计(NanoDrop ND-1000，Thermo Fisher Scientific株式会社)定量分离的总RNA，用UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water将总RNA的浓度调整至100ng/μL。
使用从取出的组织(A)、(B)分离的各RNA样品，通过实时RT-PCR方法定量四种唾液酸酶的同工酶，即，大鼠唾液酸酶Neu1、Neu2、Neu3以及Neu4的mRNA表达量。具体地，使用OneStep TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit(TAKARA BIO株式会社)，按照实验步骤进行测定，并比较各mRNA的表达量。对于测量仪器，使用Thermal Cycler Dice(注册商标)Real Time System Lite(TAKARA BIO株式会社)。
结果示于图3。图3(a)示出唾液酸酶Neu1的mRNA表达量，图3(b)示出唾液酸酶Neu2的mRNA表达量，图3(c)示出唾液酸酶Neu3的mRNA表达量，图3(d)示出唾液酸酶Neu4的mRNA表达量。另外，图3示出当以皮下脂肪组织(脂肪)的mRNA表达量为1时真皮和紧邻真皮正下方的肌肉组织(真皮+肌肉)中的mRNA表达量的水平。根据该结果，表明在四种同工酶中，唾液酸酶NEU2在真皮中高表达。
[实施例4]
4.通过唾液酸酶NEU2的弹性蛋白产生促进效果
由于发现真皮中大量存在的唾液酸酶为唾液酸酶NEU2，因此在本实施例中研究了通过唾液酸酶NEU2的弹性蛋白产生促进效果。具体地，通过培养细胞中的重组蛋白表达制备唾液酸酶NEU2，并在大鼠的皮肤上涂布预定时间后，测定大鼠的皮肤组织内含有的弹性蛋白量。
首先，通过克隆法制备了编码大鼠的唾液酸酶NEU2的基因(2531bp)的DNA片段。将制备的大鼠的Neu2基因的DNA片段作为插入物克隆到载体中，得到含有Neu2基因的重组载体。将构建的NEU2表达载体导入C6胶质瘤细胞进行转染，得到NEU2产生细胞。将得到的NEU2产生细胞在MEM培养基中进行细胞培养，进行蛋白表达。将表达的NEU2蛋白从培养基中回收并通过超滤浓缩。向该浓缩液添加含有4MU-Neu5Ac的PBS(pH7.3)，在27℃孵育1小时。反应停止后，使用酶标仪测定通过与唾液酸酶的反应而游离的4MU的荧光强度，得到唾液酸酶活性(Ex/Em＝355nm/460nm)。通过重组蛋白表达获得的唾液酸酶NEU2的酶活性为21.3 4MUnmol/min/mL。
作为皮肤最外层细胞的角质层具有防止异物侵入的物理屏障的功能。因此，即使将诸如唾液酸酶NEU2之类的蛋白质涂布在皮肤表面，也难以透过角质层在皮肤组织内部起作用。因此，在本实施例中，将如上所述得到的唾液酸酶NEU2经皮施用时，使用作为离子液体的胆碱和香叶酸(CAGE)。CAGE的结构式示于以下化学式2。已知CAGE的药物溶解性优异，具有经皮药物递送作用(参见特表2016-535781)。在本实施例中，制备混合CAGE和唾液酸酶NEU2的样品液(CAGE+Neu2)，并进行了涂布试验。另外，还尝试了在涂布一定量的唾液酸酶NEU2之后进行所谓的涂布CAGE的2次涂布试验(Neu2，CAGE)。另外，作为比较对照，还进行了仅将PBS(磷酸缓冲液)和CAGE作为样品液涂布的试验。
[化学式2]
以直径为15mm的圆的大小去除Wistar系雄性大鼠(12周龄，日本SLC株式会社)的左右背部的毛，并设置涂布样品液的部位。按照下表1所示的内容，将各样品液涂布在大鼠的除毛的直径为15mm的圆的范围内。1天涂布2次，历时5天(共涂布10次)。
[表1]
| 试验组 | 涂布内容 |
| PBS | 涂布60μL的PBS |
| CAGE | 涂布60μL的CAGE |
| CAGE+Neu2 | 涂布42μL的CAGE和18μL的Neu2的混合液60μL |
| Neu2，CAGE | 涂布18μL的NEU2之后、涂布42μL的CAGE |
在从最后的涂布开始1天后，采集进行样品液涂布的部分的皮肤组织。将采集的皮肤组织匀浆，之后使用弹性蛋白的比色定量试剂盒(Fastin Elastin Assay Kit，Biocolor公司产品)测定皮肤组织的匀浆中含有的弹性蛋白量。结果示于图4的图表。根据该结果，发现在将唾液酸酶NEU2和CAGE作为混合液涂布的情况下(CAGE+Neu2)和涂布唾液酸酶NEU2之后再涂布CAGE的情况下(Neu2，CAGE)中的任何一种情况下，皮肤组织中的弹性蛋白量均增加。由此，表明通过经皮施用唾液酸酶NEU2，能够促进皮肤组织中的弹性蛋白的产生。
另外，如图4的图表所示，在涂布唾液酸酶NEU2之后再涂布CAGE的情况下(Neu2，CAGE)的弹性蛋白量的增加较大，因此发现CAGE能够在皮肤上迅速地摄取先涂布的唾液酸酶NEU2并将其递送至皮肤内部。
另外，研究了唾液酸酶NEU2的施用对弹性蛋白基因的mRNA表达带来的影响。具体地，在从表1所示的各样品液的最后的涂布开始1天后，采集大鼠的侧腹部的皮肤以及皮下脂肪等组织，使用TRIzol(注册商标)Reagent(Invitrogen株式会社)，以与实施例3同样的方法从大鼠的皮肤中分离总RNA。使用分离的RNA样品，用实时RT-PCR法测定大鼠的弹性蛋白基因的mRNA表达量。在实时RT-PCR时，使用One-Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒(TAKARA BIO株式会社)和引物并按照实验步骤进行。对于测量仪器，使用ThermalCycler Dice(注册商标)Real Time System Lite(TAKARA BIO株式会社)。弹性蛋白mRNA的表达水平作为弹性蛋白mRNA相对于作为内标的GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的相对量来求出。结果示于图5的图表。
如图5的图表所示，关于弹性蛋白基因的mRNA表达水平，在没有进行唾液酸酶NEU2的施用的对照组(PBS、CAGE)与进行了唾液酸酶NEU2的施用的试验组(CAGE+Neu2、Neu2，CAGE)之间，未发现通过唾液酸酶NEU2的施用在统计学上显著的影响。由此，表明唾液酸酶NEU2的施用不影响弹性蛋白基因的mRNA表达水平。另外，如图4所示，通过唾液酸酶NEU2的施用，皮肤组织中的弹性蛋白量显著增加，促进了弹性蛋白的产生，因此推测唾液酸酶NEU2通过弹性蛋白基因的过表达以外的机制促进弹性蛋白的产生。
[实施例5]
5.通过细菌唾液酸酶的弹性蛋白产生促进效果
对于唾液酸酶，有存在于哺乳类中的动物唾液酸酶、存在于病毒中的病毒唾液酸酶以及存在于细菌中的唾液酸酶等多个种类。其中，对于与动物唾液酸酶相比具有高唾液酸酶活性的细菌唾液酸酶，研究了弹性蛋白产生促进效果。
具体地，在大鼠的皮肤上涂布节杆菌属细菌的产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)来源的唾液酸酶预定时间之后，测定大鼠的皮肤组织内所含的弹性蛋白量和唾液酸酶活性。在本实施例中，与实施例4相同地制备混合一定量的胆碱和香叶酸(CAGE)和产脲节杆菌来源的唾液酸酶(AUSA)的样品液(CAGE+AUSA)，并进行涂布试验。另外，作为比较对照，还进行了仅将PBS(磷酸缓冲液)以及CAGE作为样品液涂布的试验。
事先确认了混合唾液酸酶(AUSA)和CAGE时唾液酸酶活性是否得以维持。将产脲节杆菌来源的唾液酸酶(产脲节杆菌来源的神经氨酸酶，高度纯化，型号：24229-74，NACALAITESQUE株式会社)分别添加至PBS或CAGE中，制备125ng/mL浓度的溶液。向AUSA和PBS的混合液(125ng/mL：PBS中的AUSA)和AUSA和CAGE的混合液(125ng/mL：CAGE中的AUSA)添加含有40μM的4MU-Neu5Ac的PBS(pH7.3)，在37℃孵育1小时。反应停止后，使用酶标仪测定通过与唾液酸酶的反应而游离的4MU的荧光强度，得到唾液酸酶活性(Ex/Em＝355nm/460nm)。结果示于图6(a)。根据该结果，发现即使将唾液酸酶与CAGE混合(CAGE中的AUSA)，唾液酸酶活性也不会消失，活性得以维持。
然后，去除Wistar系雄性大鼠(12周龄，日本SLC株式会社)的左右背部的毛，设置涂布样品液的部位。按照下表2所示的内容，将各样品液涂布在大鼠的除毛的直径为15mm的圆的范围内。1天涂布2次，历时5天(共涂布10次)。
[表2]
| 试验组 | 涂布内容 |
| PBS | 涂布60μL的PBS |
| CAGE | 涂布60μL的CAGE |
| CAGE+AUSA | 涂布60μL的AUSA和CAGE的混合液(AUSA：1U/mL) |
从最后的涂布开始1天后，采集进行样品液涂布的部分的皮肤组织，将采集的皮肤组织的一部分匀浆。向该匀浆添加含有40μM的4MU-Neu5Ac的PBS(pH7.3)，在37℃孵育1小时。反应停止后，使用酶标仪测定通过与唾液酸酶的反应而游离的4MU的荧光强度，得到唾液酸酶活性(Ex/Em＝355nm/460nm)。结果示于图6(b)。另外，使用弹性蛋白的比色定量试剂盒(Fastin Elastin Assay Kit，Biocolor公司产品)测定了采集的皮肤组织的匀浆中含有的弹性蛋白量。结果示于图6(c)的图表。
如图6(b)以及6(c)所示，发现通过将CAGE和细菌唾液酸酶混合的样品液(CAGE+AUSA)涂布在皮肤上，皮肤组织中的唾液酸酶活性上升，并且皮肤组织中的弹性蛋白量增加。由此，表明通过经皮施用细菌唾液酸酶，能够促进皮肤组织中的弹性蛋白的产生。
另外，使用荧光成像探针BTP3-Neu5Ac，通过组织化学荧光成像显示进行了涂布试验的皮肤组织中的唾液酸酶活性的存在部位。具体地，将采集的皮肤组织的一部分使用冷冻组织切片制作用包埋剂(Tissue-Tek O.C.T.化合物，SAKURA-FINETEK Japan株式会社)包埋，冻结组织后，使用冷冻切片机(Leica Microsystems株式会社)制作100μm厚的冷冻组织切片。用PBS清洗后，添加150μL的300μM的BTP3-Neu5Ac，并在室温(27℃)孵育30分钟。用PBS洗涤后，用荧光显微镜观察(Ex,Em＝360/40，525/50)。结果示于图7。
根据该结果，与仅经皮施用PBS或CAGE的皮肤组织相比，在经皮施用CAGE和细菌唾液酸酶的混合液(CAGE+AUSA)的皮肤组织中，在皮肤组织内部观察到强荧光。由此，确认了通过经皮施用CAGE和细菌唾液酸酶的混合液(CAGE+AUSA)，唾液酸酶被递送至皮肤组织内，唾液酸酶活性上升。
另外，通过免疫组织染色(图8)以及弹性蛋白的自发荧光(图9)确认了进行了涂布试验的皮肤组织中的弹性蛋白的分布。具体地，从采集的皮肤组织的真皮制备伸展切片，用PBS中的4％多聚甲醛进行固定。加入作为免疫组织染色的封闭剂山羊正常血清(GoatSerum，2％)100μL，室温孵育30分钟。接着，加入1次抗体(Elastin Polyclonal antibody)100μL，4℃孵育过夜。然后，加入2次抗体(Goat Anti-Rabbit IgG)100μL，室温孵育30分钟，之后用显微镜(Ex/Em＝470nm/525nm)观察。免疫组织染色的结果示于图8。
根据该结果，与仅经皮施用PBS或CAGE的皮肤组织相比，在经皮施用CAGE和细菌唾液酸酶的混合液(CAGE+AUSA)的皮肤组织中，在皮肤组织内部观察到弹性蛋白在大范围内的染色。由此，表明通过经皮施用CAGE和细菌唾液酸酶的混合液(CAGE+AUSA)，唾液酸酶被递送至皮肤组织内，促进皮肤组织中的弹性蛋白的产生。
另一方面，由于弹性蛋白是发出自发荧光的自发荧光物质，因此对于用PBS中的4％多聚甲醛固定的真皮切片，使用荧光显微镜观察弹性蛋白的自发荧光。结果示于图9。在涂布细菌唾液酸酶和CAGE的混合液(CAGE+AUSA)的皮肤组织中观察到大量的弹性蛋白的自发荧光，观察到弹性蛋白量增加的情况。
[实施例6]
6.对老化促进模型小鼠的弹性蛋白产生促进效果
在本实施例中，使用老化促进模型小鼠，研究了能否对因年龄增长导致的唾液酸酶活性降低、弹性蛋白量减少状态的个体也能通过经皮施用唾液酸酶来促进弹性蛋白的产生。
作为老化促进模型小鼠，选择作为表示促进老化/短寿命的SAMP(Senescence-Acelerated Mouse Prone)的SAMP1和SAMP8(24周龄，雄性，日本SLC株式会社)。去除老化促进模型小鼠的左右背部的毛，设置涂布样品液的部位。按照下表3所示的内容，将各样品液涂布在小鼠的除毛的直径为10mm的圆的范围内。1天涂布2次，历时5天(共涂布10次)。
[表3]
| 试验组 | 涂布内容 |
| PBS | 涂布40μL的PBS |
| CAGE+AUSA | 涂布40μL的AUSA和CAGE的混合液(AUSA：1U/mL) |
从最后的涂布开始1天后，采集进行样品液涂布的部分的皮肤组织，将采集的皮肤组织的一部分匀浆。对该匀浆使用弹性蛋白的比色定量试剂盒(Fastin Elastin AssayKit，Biocolor公司产品)测定采集的皮肤组织的匀浆中含有的弹性蛋白量。结果示于图10的图表。
根据该结果，发现通过对老化促进模型小鼠经皮施用唾液酸酶，弹性蛋白表达量增加。因此，表明即使在因老化导致的弹性蛋白量减少的状态下，通过经皮递送唾液酸酶，具有促进真皮中的弹性蛋白产生从而使真皮中的弹性蛋白量增加的抗衰老效果。
[实施例7]
7.唾液酸酶的酶活性的稳定性的研究
使用与实施例4相同的方法以及C6胶质瘤细胞获得产生小鼠来源的唾液酸酶NEU1的NEU1产生细胞。将该NEU1产生细胞在MEM培养基中进行细胞培养以表达唾液酸酶NEU1。回收细胞并进行细胞溶解处理，得到含有表达的唾液酸酶NEU1的溶解液。向该溶解液添加含有4MU-Neu5Ac的PBS(pH4.6)，并在27℃使其反应预定时间。另外，由于唾液酸酶NEU1的最适pH为4.6，处于酸性区域，因此将反应液的pH设为4.6。反应停止后，使用酶标仪测定通过与唾液酸酶的反应而游离的4MU的荧光强度，定量溶解液中的唾液酸酶NEU1的唾液酸酶活性(Ex/Em＝355nm/460nm)。另外，对实施例4中得到的产生大鼠来源的唾液酸酶NEU2的NEU2产生细胞也进行了同样的试验，定量溶解液中的唾液酸酶NEU2的每单位预定反应时间的唾液酸酶活性。另外，由于唾液酸酶NEU2的最适pH在中性区域，因此与实施例4同样地将反应液的pH设为7.3。结果示于图11。另外，图11中的Mock表示使用没有嵌入插入DNA片段的空载体时的数据。
另外，对于上述的含有唾液酸酶NEU1的溶解液，定量溶解后的经过时间及其唾液酸酶活性，以研究酶活性的稳定性。向从溶解处理经过预定时间的溶解液添加含有4MU-Neu5Ac的PBS(pH4.6)，使其在27℃反应1小时。反应停止后，使用酶标仪测定通过与唾液酸酶的反应而游离的4MU的荧光强度，定量唾液酸酶活性。结果示于图12。
根据这些结果，表示与唾液酸酶NEU1相比，得到的唾液酸酶NEU2的唾液酸酶活性强(图11)。另外，表示唾液酸酶NEU1的酶活性在细胞溶解后急剧减弱(图12)。这些结果，发现在唾液酸酶NEU2涂布于皮肤使用时，与唾液酸酶NEU1相比适合作为弹性蛋白产生促进剂使用。
本发明不限于上述的实施方式或实施例，在不脱离权利要求书中记载的发明的主旨的范围内的各种设计变更的方式也包含在技术范围内。
工业可用性
本发明提供一种弹性蛋白产生促进剂和皮肤化妆品，由于其具有优异的弹性蛋白产生促进效果，能够预防/改善因老化引起的真皮弹性蛋白的减少，因此在化妆品领域和医药品、准药品等领域的产业中具有广泛的应用。
Claims (7)
1.一种弹性蛋白产生促进剂，所述弹性蛋白产生促进剂含有作为有效成分的唾液酸酶。
2.根据权利要求1所述的弹性蛋白产生促进剂，其中，所述唾液酸酶是唾液酸酶NEU2。
3.根据权利要求1所述的弹性蛋白产生促进剂，其中，所述唾液酸酶是细菌唾液酸酶。
4.根据权利要求3所述的弹性蛋白产生促进剂，其特征在于，所述细菌唾液酸酶是节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)来源的唾液酸酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的弹性蛋白产生促进剂，其特征在于，所述弹性蛋白是构成真皮的纤维性组织的真皮弹性蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的弹性蛋白产生促进剂，其特征在于，所述弹性蛋白产生促进剂用于防止或改善皮肤的老化。
7.一种皮肤化妆品，其特征在于，所述皮肤化妆品包括权利要求1-6中任一项所述的弹性蛋白产生促进剂。
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