CN103649116A - 释放松弛素的融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供松弛素融合蛋白，其中接头连接松弛素的羧基端与蛋白质半衰期延长部分，并且所述接头包含蛋白酶切割位点。因此，本发明提供具有延长的半衰期的松弛素融合多肽，由此融合蛋白自身作为释放有生物活性的松弛素的贮藏所。此外，本发明提供编码上述融合多肽的核酸序列、包含该核酸序列的载体、表达松弛素融合多肽的细胞、此类融合多肽的药物组合物和医学用途。

Description

释放松弛素的融合蛋白及其用途
本发明提供松弛素融合蛋白，其中松弛素的羧基端与蛋白质半衰期延长部分由接头连接，并且所述接头包含蛋白酶切割位点。因此，本发明提供具有延长的半衰期的松弛素融合多肽，由此融合蛋白自身充当释放有生物活性的松弛素的贮藏所。此外，本发明提供编码上述融合多肽的核酸序列、包含该核酸序列的载体、表达松弛素融合多肽的细胞、此类融合多肽的药物组合物和医学用途。
发明背景
作为胰岛素超家族的成员的松弛素2 (H2松弛素，RLN2)为在遗传水平上展示从N末端至C末端排列的典型的B-C-A链激素原结构的2-链肽。该超家族的其他成员在人中由7个基因编码，为松弛素基因RLN1、RLN3以及胰岛素样肽基因INSL3、INSL4、INSL5和INSL6。该家族成员之间的总体序列同源性低；尽管如此，但系统发育分析显示这些基因是从RLN3祖先基因进化而来(Hsu, S. Y. (2003)；Wilkinson, T. N.等人，(2005))。成熟蛋白具有大约6000 Da的分子量，并且是由激素原转化酶1 (PC1)和2 (PC2)催化的激素原的酶促切割的产物(Hudson P.等人，(1983))。所获的A-链和B-链通过两个分子间半胱氨酸桥连接；所述A链显示额外的分子内二硫键。
松弛素通过多个途径引发对多种细胞类型的多效性作用。它通过结合称为LGR7 (富含亮氨酸的G蛋白偶联受体7)也命名为RXFP1 (松弛素家族肽1受体)的I类(视紫红质样) G蛋白偶联受体而赋予其活性，并且对LRG8/RXFP2 (松弛素家族肽2受体)具有明显更低的亲和力(Kong RC等人，(2010))。在松弛素分子内，B链中的氨基酸基序(Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)(Schwabe和Büllesbach (2007), Büllesbach和Schwabe (2000))在所有的松弛素肽中均是保守的，并且对于这些肽与相应的受体的相互作用是关键的。松弛素与LGR7/RXFP1的结合导致腺苷酸环化酶的活化以及第二信使分子cAMP的增加。经该机制，松弛素2例如介导大鼠心脏中的心房利钠肽的释放(Toth, M.等人，(1996))。还已经显示松弛素2对大鼠心房肌细胞的正性肌力作用(Piedras-Renteria, E. S.等人，(1997))。由松弛素/LGR7复合物活化的其他信号转导分子为磷酸肌醇-3激酶、酪氨酸激酶和磷酸二酯酶(Bartsch, O.等人，(2001)，Bartsch, O.等人，(2004))。由该系统活化的其他信号转导途径包括导致大鼠和豚鼠心脏中环GMP水平增加的一氧化氮(NO)途径(Bani-Sacchi, T. 等人，(1995))。
松弛素作为多效激素(Dschietzig T.等人，(2006))对器官诸如肺、肾、脑和心脏具有生物活性。松弛素的强力的抗纤维化和血管舒张活性是在多种动物疾病模型以及在临床研究中用该肽获得的积极作用的最显著的原因(McGuane J.T. 等人，(2005))。在病理条件下RLN2在心血管系统中具有多种有益作用。它维持组织内稳态并且在多种病理生理学过程中保护受损的心肌。它展示出显著的血管舒张作用，例如影响啮齿动物冠状动脉中(Nistri, S. 等人，(2003))和其他器官的血管床中的流量和血管舒张。在自发性高血压大鼠中，RLN2降低血压，其为由增加的NO产生介导的作用。
已经在不同的动物模型诸如豚鼠、大鼠和猪中评价了松弛素2的心脏保护活性(Perna A.M.等人，(2005), Bani, D. 等人，(1998))。RLN2改善心肌损伤、炎性细胞浸润和随后的纤维化，由此减轻严重的心室功能障碍(Zhang J. 等人，(2005))。
松弛素2显示出强烈的抗纤维化活性。在受损组织中，成纤维细胞活化和增殖导致增加的胶原产生和间质纤维化。心脏中的纤维化通过生物力学过载而增加，并且影响心室功能障碍、重构和心律失常发生。在动物模型中，松弛素2的持续输注抑制或者甚至逆转了由心肌病、高血压、异丙肾上腺素引起的心脏毒性、糖尿病性心肌病和心肌梗塞而导致的心功能障碍。纤维发生的抑制或已发生的纤维化的逆转可以降低心室僵硬并且改善舒张功能。值得注意的是，尽管松弛素2降低了异常的胶原积累，但它不影响健康组织中的基础胶原含量，突显了它对于治疗用途的安全性。
已经在多个临床研究中检验了松弛素2作为多效血管舒张剂用于治疗患有急性心力衰竭的患者，并取得了非常有希望的结果。在这些研究中，松弛素2与有利缓解的呼吸困难及其他临床结果相关(Teerlink J.R.等人，(2009), Metra M.等人，(2010))。
由于松弛素有限的体内半衰期，因此需要每14-21天重复患者的治疗，由此化合物施用需要以连续输注进行至少48小时。
此外，松弛素2还可以用于治疗疾病诸如胰腺炎，炎症相关疾病如类风湿性关节炎，和癌症(Cosen-Binker L.I.等人，(2006)；Santora K.等人，(2007))或硬皮病，肺、肾和肝纤维化(Bennett RG. (2009))。松弛素2降低了人MDA-MB-231乳腺癌细胞的异种移植肿瘤生长(Radestock Y, Hoang-Vu C, Hombach-Klonisch S. (2008))。
通过化学方法合成松弛素2是困难的。由于B链的低溶解度以及需要在A链和B链之间费力、特异性地引入半胱氨酸桥，因此通过这些方法获得的活性肽的产量是非常低的(Barlos K.K. 等人，(2010))。或者，可以进行松弛素2的重组表达。为了允许在翻译后修饰过程中有效切割前肽原以及分泌成熟且有生物活性的肽，通常用编码激素原转化酶1和/或2的表达构建体共转染表达宿主细胞(Park J.I. 等人，(2008))。然而，前肽原在异种细胞中的内切蛋白酶解加工效率常常显著地限制了生物活性分子的产生(Shaw J.A. 等人，(2002))。
重要的是，在人中静脉施用的松弛素2的半衰期少于10分钟(Dschietzig T. 等人，(2009))。结果是，在临床试验中，松弛素2不得不连续施用超过48小时。因此，松弛素的生物学半衰期的改善或更长时间起效的松弛素融合多肽会是大有裨益的。
可以通过化学修饰诸如目标多肽的聚乙二醇化或羟乙基淀粉化(HESylation)，引入额外的、非天然的N-糖基化位点，或者通过遗传上将该多肽分别与其他分子诸如抗体的免疫球蛋白Fc片段、运铁蛋白、白蛋白、体内结合介导更长的半衰期的其他分子的结合模块、或其他蛋白融合，来进行改善生物学半衰期。然而，IgG的Fc结构域与松弛素2的C末端的融合产生就松弛素活性而论失活的分子。令人惊奇的是，发现当切除Fc结构域时，恢复了松弛素活性。这意味着尽管融合蛋白失活，松弛素正确折叠，但活性被Fc结构域所阻碍，或者在释放Fc结构域后，松弛素恢复了正确折叠。用于抗补体前体药物的Fc融合多肽公开于J Biol Chem.2003 Sep 19;278(38):36068-76。因此，本发明提供松弛素融合多肽，其中松弛素与蛋白质半衰期延长部分诸如IgG的Fc结构域融合，其中所述松弛素经含有内切蛋白酶切割位点的接头多肽与蛋白质半衰期延长部分连接，产生相比于松弛素具有改善的半衰期的多肽，从中经内切蛋白酶的作用释放有活性的松弛素。
发明概述
本发明涉及半衰期延长的松弛素融合多肽作为前体药物，用于释放有活性的松弛素。
本发明的一个实施方案是包含松弛素、含有内切蛋白酶切割位点的接头肽以及蛋白质半衰期延长部分的融合多肽，其中所述接头肽连接松弛素与半衰期延长部分。
在一个实施方案中，上述松弛素为松弛素2或松弛素3。优选的是人松弛素，诸如人松弛素2或人松弛素3。
在一个实施方案中，上述蛋白质半衰期延长部分为多肽，诸如IgG的Fc结构域、血清白蛋白、运铁蛋白、或血清白蛋白结合蛋白或肽。优选的是人或人源化的蛋白质半衰期延长部分诸如人IgG的Fc结构域或人血清白蛋白。
在优选的实施方案中，上述接头包含内切蛋白酶/内切肽酶的切割位点，其中所述内切蛋白酶/内切肽酶是胞外内切蛋白酶/内切肽酶。在进一步优选的实施方案中，上述接头包含内切蛋白酶/内切肽酶的切割位点，其中所述内切蛋白酶/内切肽酶是人内切蛋白酶/内切肽酶。在进一步优选的实施方案中，切割位点是在血液中有活性的内切蛋白酶/内切肽酶(诸如凝血因子Xa)的切割位点。此外，优选具有指向血管内腔的活性部位的膜结合的或膜延伸的内切蛋白酶/内切肽酶(诸如MMP12)的切割位点。在另一个优选的实施方案中，切割位点是其活性在松弛素功能所需的部位上强化或是特异性的内切蛋白酶/内切肽酶的切割位点，例如，内切蛋白酶/内切肽酶在松弛素所需的部位诸如具体器官或组织处特异性表达和/或活化。在另一个优选的实施方案中，切割位点是在生理过程中特定时间点上(例如疾病发生的特定时间点上)表达和/或活化的内切蛋白酶/内切肽酶的切割位点。
在另一方面，本发明提供编码上述融合多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可以进一步包含允许分泌该融合多肽的信号肽的编码序列。包含此类融合多肽的多核苷酸的载体也包括在本发明之内。合适的载体例如是表达载体。本发明进一步的实施方案是包含编码上述融合多肽的多核苷酸、载体、或表达载体的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞或酵母或昆虫细胞，优选哺乳动物细胞。原核细胞可以例如是大肠杆菌(E. coli)细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供包含上述融合多肽的药物组合物。可以配制组合物用于静脉内、腹膜内、局部、吸入性或皮下施用。
本发明的另一个实施方案提供了作为药物的药物组合物或融合多肽。进一步的实施方案是药物组合物或融合多肽在治疗心血管疾病、胰腺炎、炎症、癌症、硬皮病，肺、肾和肝纤维化中的用途。
附图简述
图1：松弛素融合多肽的结构及它随后在血流中通过内切肽酶/内切蛋白酶切割包含蛋白酶切割位点(Protease Cleavage Site，PCS)的接头而活化的图示。A链、B链和C链代表各个松弛素链。具有PCS的接头是包含PCS的接头，并且黑线表示松弛素中的分子间和分子内二硫键。Fc结构域是IgG分子的Fc结构域。
图2：使用CHO-CRE-LGR7细胞系测定松弛素Fc融合构建体的活性。作为对照，使用人松弛素2 (hRelaxin 2；R&D Systems，目录号6586-RN-025)。数据表示为相对光单位，代表松弛素变体和人松弛素2诱导的萤光素酶表达的活性。符号表示平均值，误差棒代表平均数标准误差(S.E.M.)。
图3 a-d：使用CHO-CRE-LGR7细胞系测定松弛素-融合构建体1-4的活性。作为对照，使用人松弛素2 (R&D Systems，目录号6586-RN-025)。数据表示为相对光单位，代表松弛素变体和人松弛素2诱导的萤光素酶表达的活性。符号表示平均值，误差棒代表平均数标准误差。
发明详述
定义：
术语“氨基酸残基”旨在说明包含于由以下组成的组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
术语“松弛素的活性”或“松弛素活性”由松弛素或其变体通过与其受体结合而活化刺激性G蛋白Gs并由此随后产生第二信使环AMP和/或刺激PI3-激酶的能力来定义。松弛素或其变体结合LGR7导致刺激性G蛋白Gs的胞内活化，导致随后产生第二信使环AMP (cAMP)。然而，cAMP产生是时间依赖的二相应答。在起始的短的Gs-腺苷酸环化酶介导的cAMP应答后，受体信号转换为抑制性G蛋白活化并由此转换为PI3-激酶介导的应答。(Halls M.L., Bathgate R.A., Summers, R.J.(2005))。
术语“半衰期延长部分”指直接或经接头与松弛素融合多肽共价连接的(“缀合的”)药学上可接受的部分、结构域或“赋形剂(vehicle)”。半衰期延长部分积极影响药代动力学或药效动力学行为的机制包括但不限于(i)预防或减轻松弛素融合多肽的体内蛋白酶降解或其他降低活性的化学修饰，(ii)通过降低肾过滤、减少受体介导的清除或增加生物利用率来改善半衰期或其他药代动力学特性，(iii)降低毒性，(iv)改善溶解度，(v)增加松弛素融合多肽的生物活性和/或目标选择性。此外，相比于松弛素融合多肽的未缀合形式，半衰期延长部分可以在增加松弛素融合多肽的可制造性和/或降低其免疫原性方面具有积极作用。术语“半衰期延长部分”包括非蛋白质的半衰期延长部分诸如PEG或HES，以及蛋白质的半衰期延长部分诸如血清白蛋白、运铁蛋白或Fc结构域。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用并且包括经肽键连接的两个或多个氨基酸的分子链。所述术语不指链的具体长度。所述术语包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，蛋白片段、类似物、突变的或变体蛋白、融合蛋白等包括于多肽、肽或蛋白的定义中。所述术语还包括如可以使用已知的蛋白质工程技术合成或重组表达的，包含一个或多个氨基酸类似物或非标准或非天然氨基酸的分子。此外，本发明的融合蛋白可以如本文所述通过众所周知的有机化学技术进行衍生化。
术语“功能变体”指在其化学结构上不同于野生型多肽并且至少保持某些它的天然生物活性的变体多肽。在本发明的松弛素2变体的情况下，功能变体是显示至少某些它的天然活性的变体，诸如松弛素受体LGR7的活化。松弛素受体LGR7的活化可以通过实验方法中公开的方法来测定。
当指本发明的多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括至少保持相应的野生型松弛素多肽的某些受体活化特性的任何多肽。本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，并且还包括由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在或是非天然存在的。非天然发生的变体可以使用本领域中已知的诱变技术产生。变体多肽可以包含保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。变体多肽在本文还可以称为“多肽类似物”。如本文所用，多肽的“衍生物”指具有一个或多个由官能团反应而化学衍生的残基的目标多肽。同样作为“衍生物”包括在内的是包含一个或多个二十个标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，脯氨酸可以由4-羟基脯氨酸取代；赖氨酸可以由5-羟基赖氨酸取代；组氨酸可以由3-甲基组氨酸取代；丝氨酸可以由高丝氨酸取代；以及赖氨酸可以由鸟氨酸取代。
术语“融合蛋白”或“融合多肽”表示蛋白包括来源于超过一个亲代蛋白或多肽的多肽组分和/或融合蛋白包括来源于一个或多个亲代蛋白或多肽的不以它们的野生型定位排列的蛋白结构域。通常，融合蛋白从融合基因表达，其中将编码来自于一种蛋白的多肽序列的核苷酸序列在框内添加到编码来自不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列上，且任选地通过接头或延伸段(stretcher)与其分隔开。随后可以通过重组宿主细胞将融合基因表达为单一蛋白。
术语“核苷酸序列”或“多核苷酸”旨在表示两个或多个核苷酸分子的连续的一段序列。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成的来源、或其任何组合的核苷酸序列。
术语“EC 50 ”(半最大有效浓度)指在具体实验条件下诱导基线和最大值之间的一半的应答的治疗化合物的有效浓度。
与给定物质结合使用的术语“免疫原性”旨在表示物质诱导免疫系统的应答的能力。免疫应答可以是细胞或抗体介导的应答(对于免疫原性的进一步定义参见，例如Roitt: Essential Immunology (第8版，Black-well))。通常，对涉及引发免疫应答(诸如T细胞增殖)的过程的诱导降低将指示降低的免疫原性。可以通过使用本领域中已知的任何合适的方法例如体内或体外测定降低的免疫原性。
术语“聚合酶链反应”或“PCR”通常指用于体外扩增期望的核苷酸序列的方法，如描述于，例如美国专利号US 4,683,195和US 4,683,195中。通常，PCR方法涉及使用能够优先与模板核酸杂交的寡核苷酸引物的引物延伸合成的重复循环。
术语“载体”指这样的质粒或其他核苷酸序列，其能够在宿主细胞内复制或者整合入宿主细胞基因组中，并由此用于与相容的宿主细胞(载体-宿主系统)一起行使不同功能：以利于核苷酸序列的克隆即产生可用量的该序列，以指导由该序列编码的基因产物的表达和将核苷酸序列整合入宿主细胞的基因组中。取决于它将行使的功能，载体将包含不同的元件。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可以互换使用，并且所有这样的术语均应被理解为包括从细胞的生长或培养中得到的后代。
术语“功能的体内半衰期”以它的普通含义使用，即，多肽的50％的生物活性仍存在于身体/目标器官中的时间，或多肽活性为初始值的50％的时间。
作为测定功能的体内半衰期的备选方案，可以测定“血清半衰期”，即，不考虑多肽是否保留它的生物功能，在被清除之前，50％的多肽在血浆或血流中循环的时间。血清半衰期的测定通常比测定功能的体内半衰期更容易，并且血清半衰期的大小通常是功能的体内半衰期的大小的良好指示。对血清半衰期的可选术语包括“血浆半衰期”、“循环的半衰期”、“血清清除率”、“血浆清除率”、“终末半衰期”和“消除半衰期”。通过网状内皮系统(RES)、肾、脾或肝的一种或多种的作用，通过组织因子、SEC受体或其他受体介导的消除，或通过特异性或非特异性蛋白水解来清除多肽。通常，清除依赖于蛋白的大小(相对于肾小球过滤的截止值)、电荷、连接的碳水化合物链以及细胞受体的存在。通常将保持的功能性确定为受体结合或受体活化。功能的体内半衰期和血清半衰期可以通过本领域中已知的任何合适的方法测定，并且可以例如通常涉及以下步骤：向哺乳动物合适地施用合适剂量的目的蛋白或多肽；以有规律的间隔从所述哺乳动物收集血液样品或其他样品；测定所述血液样品中目的蛋白或多肽的水平或浓度；和从由此获得的数据(图)中计算相比于适当的参考时间点(例如i.v.应用后不久的起始浓度)，直至目的蛋白或多肽的水平或浓度已经降低50％的时间。例如，参考标准手册，诸如Kenneth, A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists和Peters等人：Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)。还可以参考"Pharmacokinetics", M Gibaldi和D Perron，由Marcel Dekker出版，第2版修订版，(1982)。
“糖基化”是一种化学修饰，其中将糖部分加到多肽的特异性位点处。多肽的糖基化通常为N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列Asn-X-Ser和Asn-X-Thr (“N-X-S/T”)，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列(或基序)的任一种在多肽中的存在产生潜在的N-连接的糖基化位点。O-连接的指碳水化合物部分与丝氨酸和苏氨酸的羟基氧的连接。
“分离的”多肽或融合多肽是已经鉴定并从表达它的细胞的组分中和/或它分泌至其中的培养基中分离出的多肽。细胞的污染组分是会干扰融合多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素或其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，将融合多肽纯化(1)至大于95重量％的融合多肽，如例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱学或通过SDS-毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII、GX 90或Biorad Bioanalyzer设备上)测定，并且在进一步优选的实施方案中，大于99重量％，(2)至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至在还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染通过SDS-PAGE的同质性。然而，通常，分离的融合多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
概述
本申请提供了具有延长的半衰期的松弛素融合蛋白。本申请描述了具有显著延长的生物学半衰期和显著降低的生物活性的改善的松弛素融合蛋白。由于这一事实，即松弛素通过一段编码蛋白酶的切割位点的氨基酸与半衰期延长部分连接，所述蛋白酶在体内有活性并且从松弛素融合蛋白上释放有功能的松弛素，因此，该松弛素融合蛋白具有药理学贮藏所作用。
本发明的一个实施方案是包含松弛素-PCS-HEM的融合蛋白，其中松弛素为包含加工后的A链和B链或其功能变体的松弛素异质二聚体，PCS为包含蛋白酶切割位点(PCS)的接头多肽，并且HEM为蛋白质半衰期延长部分(HEM)。
本发明进一步的实施方案是包含松弛素原-PCS-HEM的融合多肽，其中松弛素原为仍包含C链或其功能变体的未加工的原形式(proform)的松弛素，PCS为包含蛋白酶切割位点(PCS)的接头多肽，并且HEM为蛋白质半衰期延长部分(HEM)。
本发明的另一个实施方案是包含HEM-PCS-松弛素的融合蛋白，其中松弛素为包含加工后的A链和B链或其功能变体的松弛素异质二聚体，PCS为包含蛋白酶切割位点(PCS)的接头多肽，并且HEM为蛋白质半衰期延长部分(HEM)。
本发明进一步的实施方案是包含HEM-PCS-松弛素原的融合蛋白，其中松弛素原为仍包含C链或其功能变体的未加工的原形式的松弛素，PCS为包含蛋白酶切割位点(PCS)的接头多肽，并且HEM为蛋白质半衰期延长部分(HEM)。
将松弛素原理解为没有被激素原转化酶加工的松弛素的原形式，并且包含以其天然定位存在的松弛素B链、松弛素C链和松弛素A链。
松弛素-PCS-HEM和松弛素原-PCS-HEM是优选的实施方案。
松弛素结构域：
在进一步的实施方案中，松弛素包含松弛素2 A链多肽或其功能变体。在进一步的实施方案中，松弛素包含松弛素2 B链多肽或其功能变体。
在进一步的实施方案中，松弛素包含弛素2 A链多肽或其功能变体和松弛素2 B链多肽或其功能变体。
在优选的实施方案中，松弛素A链多肽包含人最小松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 7)或其功能变体，或者包含人松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 6)或其功能变体。在优选的实施方案中，松弛素B链多肽包含人松弛素2 B链多肽(SEQ ID NO: 8)或其功能变体。
在更优选的实施方案中，松弛素A链包含人最小松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 7)或其功能变体，或者包含人松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 6)或其功能变体，并且松弛素B链多肽包含人松弛素2 B链多肽(SEQ ID NO: 8)或其功能变体。
在进一步的实施方案中，松弛素包含松弛素3 A链多肽或其功能变体和/或松弛素3 B链多肽或其功能变体。
在进一步的实施方案中，松弛素A链多肽包含人松弛素3 A链多肽(SEQ ID NO: 9)、人最小松弛素3 A链多肽(SEQ ID NO: 12)，或其功能变体。在进一步的实施方案中，松弛素B链多肽包含人松弛素3 B链多肽(SEQ ID NO: 11)或其功能变体。在优选的实施方案中，松弛素包含人松弛素3 A链多肽(SEQ ID NO: 10)或其功能变体，并且包含人松弛素3 B链多肽(SEQ ID NO: 11)或其功能变体。
在优选的实施方案中，相比于野生型松弛素A链和B链，松弛素A链或B链的功能变体分别具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、插入和/或缺失。进一步优选的是上述松弛素2 B变体，其进一步包含保守基序Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X，其中X代表能够形成螺旋结构的氨基酸。
松弛素A链和B链变体是本领域中已知的。松弛素的深入表征的结合位点几何形状(geometry)为技术人员提供了设计松弛素A链和B链变体的指导，例如见Büllesbach和Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10; 275(45):35276-80对于松弛素B链的变异的指导以及Hossain等人，J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25):17287-97对于松弛素A链和“最小”松弛素A链的变异的指导。例如，对于保守的松弛素2 B基序(Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)，由于三个确定的氨基酸在松弛素B链的表面形成受体接触区，因此X代表能够形成螺旋结构实例的氨基酸，以在保守基序中选择合适的氨基酸X (Büllesbach和Schwabe，(2000))。
在甚至更优选的实施方案中，松弛素A链多肽为人松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 6)或其功能变体，并且松弛素B链多肽为人松弛素2 B链多肽(SEQ ID NO: 8)或其功能变体。在甚至更优选的实施方案中，人松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 6)的功能变体为相比于SEQ ID NO: 16具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失和/或插入的功能变体。进一步优选的是人松弛素2 B链多肽(SEQ ID NO: 8)的功能变体，其中相比于SEQ ID NO: 8，该功能变体具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失和/或插入。甚至进一步优选的是上述人松弛素2 B变体，其进一步包含保守基序Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X。
在甚至更优选的实施方案中，松弛素A链多肽是人松弛素2 A链多肽(SEQ ID NO: 6)或其相比于SEQ ID NO: 6具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸交换(amino acid exchange)的功能变体，并且松弛素B链多肽是人松弛素2 B链多肽(SEQ ID NO: 8)或其相比于SEQ ID NO: 18具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸交换并且包含保守的基序Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X的功能变体。
本领域技术人员知晓如何获得功能变体。松弛素A链的功能变体的实例公开于Hossain等人，J Biol Chem.2008 Jun 20; 283(25):17287-97或美国专利公开号US2011/0130332中，并且松弛素B链的功能变体的实例公开于Schwabe和Büllesbach (2007) Adv Exp Med Biol.612:14-25及Büllesbach和Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10;275(45):35276-80)中。
PCS接头：
为了从融合蛋白释放松弛素，所用的接头序列PCS包含蛋白酶/肽酶的切割序列。蛋白酶/肽酶是其催化功能为水解(分解)蛋白的肽键的一组酶。它们还被称为蛋白水解酶或蛋白酶(proteinases)。蛋白酶(Proteases)在它们水解肽键的能力上有所不同，即蛋白酶可以对作为识别和切割位点的特定肽序列具有偏好。蛋白酶细分为六组，然而丝氨酸蛋白酶(诸如凝血因子IIa、VIIa和Xa)以及金属蛋白酶(诸如基质金属蛋白酶2和9)代表最大的家族。
将蛋白酶底物的切割位点位置命名为P1-P1'，表示将在切割位点的N末端位点上的氨基酸定义为P1并且将在C末端位点上的氨基酸定义为P1'。将切割的肽键的N末端方向上的氨基酸编号为P2、P3和P4。在切割位点的羧基侧，编号类似增加(P1'、P2'、P3'等) (Schlechter和Berger (1967和1968))。
在本发明的上下文中，蛋白酶/肽酶是内切蛋白酶/内切肽酶。内切肽酶或内切蛋白酶是破坏非末端氨基酸(即在蛋白内)的肽键的蛋白水解肽酶。与之相反的是外切肽酶，其水解N末端或C末端的肽键，并因此释放多肽的N末端或C末端的氨基酸。为此原因，切割PCS接头的内切肽酶可以以受控的方式从前体药物融合蛋白中释放松弛素。
在优选的实施方案中，PCS为内切蛋白酶的PCS。在优选的实施方案中，PCS为胞外的内切蛋白酶的PCS。在进一步优选的实施方案中，上述内切蛋白酶在血液中或者在体内需要松弛素作用的部位中是有活性的。甚至更优选的是血液中天然存在的内切蛋白酶诸如凝血因子Xa或松弛素可治疗的疾病的患病组织中天然存在的内切蛋白酶诸如MMP金属蛋白酶。还优选的是这样的内切蛋白酶，其为膜结合的或跨膜的，但它们的催化结构域及因此它们的催化活性在血管腔中(因此在人血液中)，或者暴露于组织中的胞间隙，诸如MMP12。甚至进一步优选的是在人血液中和/或松弛素可治疗的疾病的患病组织中是有活性的上述的内切蛋白酶。松弛素可治疗的疾病是例如纤维化疾病。因此，纤维化疾病的患病组织是例如肺、心脏、肝或肾组织。进一步的松弛素可治疗的疾病列于下文中。最优选的是为人来源的或人源化的上述的内切蛋白酶。
本领域技术人员知晓根据EC命名法，内切蛋白酶属于EC 3.4.21 - EC 3.4.24的EC组(由国际生物化学和分子生物学协会的命名委员会确定)。有用的内切蛋白酶是例如胰蛋白酶、凝血酶、Xa因子、VIIa因子、MMP2、MMP12或肾素。
还考虑可以施用切割PCS的外源内切蛋白酶，导致松弛素从前体药物的释放。在优选的实施方案中，该内源蛋白酶通过与该蛋白酶连接的靶向部分而靶向松弛素活性的期望位点(例如，松弛素可治疗的疾病的患病组织)。
关于上述内切蛋白酶表达的知识是现有技术。在本发明的某些方面，不仅优选将具有更长半衰期的松弛素作为前体药物，还优选在身体的特定器官或部分中将松弛素从前体药物释放。因此，可以利用本领域中关于内切蛋白酶在何处表达的信息，以配合松弛素从前体药物中释放的位点。
为了使松弛素从前体药物中的全身释放，可选择存在于血液中的内切蛋白酶。这样的蛋白酶例如是凝血因子Xa。
由于从它的前体药物中释放的松弛素具有短的半衰期，因此修整在特定器官、组织或区室，尤其是患病器官、组织或区室中的松弛素释放进一步改善了它的药物益处，这是由于松弛素在疾病部位处释放。
例如，松弛素对心肌细胞具有直接的抗肥大作用以及对心脏成纤维细胞的抗纤维化活性(Moore XL.等人，(2007)；Wang P. 等人，(2009))。因此，优选主要在心组织中表达的蛋白酶，诸如MMP2 (Overall CM. (2004))或糜蛋白酶(Matsumoto C. 等人，(2009))。受纤维化疾病影响的其他的主要器官是肾(Klein J. 等人，(2011))和肺(Coward WR等人，(2010))。在这些器官中，松弛素的施用展示出强烈的抗纤维化活性(Bennett RG (2009))。因此，作为接头的蛋白酶切割位点优选来自于主要表达于肾和/或肺中的蛋白酶，诸如肺中的MMP12 (Garbacki N. 等人，(2009))或肾中的肾素(Castrop H. 等人，(2010))。
内切蛋白酶的蛋白酶切割位点是本领域中已知的。在表1中给出了一些实例。
Figure 150448DEST_PATH_IMAGE001
本领域中熟知蛋白酶切割位点的变异可以导致底物的不同周转。此类变异包括识别序列内一个或多个氨基酸的保守性或非保守性交换，并且可以影响底物周转的kcat和/或Km。因此，改变松弛素融合蛋白中的PCS提供了进一步修整松弛素的释放动力学的基础。
由于内切蛋白酶的优选切割位点是已知的，因此选择PCS/内切蛋白酶组合，从而使内切蛋白酶特异性切割PCS，但不切割松弛素或半衰期延长部分。此外，本领域中有提供用于测定内切蛋白酶是否还水解松弛素或半衰期延长部分的肽键的方法。
优选的PCS是凝血因子Xa的切割位点，进一步优选的是具有序列IleGluGlyArgMetAsp的PCS。
在进一步的实施方案中，上述融合多肽/蛋白的PCS接头多肽可以进一步在N末端和/或C末端具有延伸多肽。延伸单元可以使内切蛋白酶更好地接近PCS，因此使松弛素从融合蛋白中更好的释放。测定对于给定底物的蛋白酶活性的方法是本领域中已知的。
这样的延伸段是本领域中已知的，并且长度为1-约100个氨基酸，长度为1-约50个氨基酸，长度为1-约25个氨基酸，长度为1-约15个氨基酸，长度为1-约10个氨基酸，或者，长度为1-约5个氨基酸。
延伸序列的氨基酸组成是可变的，尽管优选显示低免疫原性潜力的延伸段。在本发明的实施方案中，延伸多肽可以由任何氨基酸组成。
在更优选的实施方案中，延伸多肽包含Gly和Ser残基。在进一步优选的实施方案中，延伸肽是富含甘氨酸的接头，诸如，如美国专利号7,271,149中公开的包含序列[GGGGS]n的肽，n为1-20之间的整数，优选1-10之间，更优选1-5之间，并且甚至更优选1-3之间。在其他的实施方案中，使用富含丝氨酸的延伸多肽，如美国专利号5,525,491中所述。进一步优选的实施方案是包含Gly和Ser残基并且具有至少3：1的Gly与Ser的比例的延伸多肽。
当将延伸单元引入PCS和松弛素之间时，在由各自的内切蛋白酶分别切割后，分别除了PCS的P或P'氨基酸之外，该延伸单元将保留在松弛素上。因此，使用不减少松弛素活性的延伸单元。在优选的实施方案中，将延伸单元插入PCS和半衰期延长部分之间。
在进一步的实施方案中，上述融合多肽释放有活性的松弛素。在进一步优选的实施方案中，松弛素活性为松弛素受体LGR7的活化。用于测定松弛素活性的方法是本领域中已知的或者提供于本文中。在甚至进一步优选的实施方案中，松弛素受体LGR7的活化通过本文实验方法中公开的方法来测定。在甚至进一步优选的实施方案中，测定松弛素受体LGR7的活化为测定EC50值。在甚至更优选的实施方案中，与诱导半最大活性的对应野生型松弛素有效浓度相比，上述松弛素活性低105倍、104倍、103倍、100倍、75倍、50倍、25倍或10倍。例如，对于基于人松弛素2的融合多肽的对应野生型松弛素为人松弛素2蛋白。
经蛋白质半衰期延长部分的半衰期延长：
为了改善本发明的融合多肽的半衰期，考虑具有蛋白质半衰期延长部分的融合体，诸如免疫球蛋白的免疫球蛋白Fc结构域、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、血清白蛋白、或其变体或体内结合其他介导更长的半衰期的分子的结合分子，例如血清白蛋白结合蛋白。
“免疫球蛋白”是包含通过二硫键结合在一起的多肽链的分子，通常具有两条轻链和两条重链。在每条链中，一个结构域(可变域Fv)具有依赖于分子的抗体特异性的可变的氨基酸序列。其他的结构域(恒定域C)具有为同一类分子所共有的相当恒定的序列。
如本文所用，免疫球蛋白的“Fc”部分具有在免疫学领域中通常赋予该术语的含义。具体而言，该术语指通过从抗体去除两个抗原结合区(Fab片段)所获的抗体片段。去除Fab片段的一种方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，Fc部分由两条重链的恒定区的大致相同大小的片段形成，其通过非共价相互作用并且任选二硫键连接。Fc部分可以包括铰链区并且经CH2和CH3结构域向抗体的C末端延伸。人和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可以见于Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K.,编辑, W.H.Freeman and Co., 1992。
存在五种类型具有不同效应物和药代动力学特性的人免疫球蛋白Fc区：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。IgG是血清中丰度最高的免疫球蛋白。IgG还具有任何免疫球蛋白在血清中最长的半衰期(23天)。与其他免疫球蛋白不同，在结合Fc受体后的胞吞作用后，IgG有效地再循环。存在四种IgG亚类G1、G2、G3和G4，其每一种具有不同作用或功能。这些效应物功能通常经过与Fc受体(FcγR)相互作用或通过结合C1q并固定补体介导。结合FcγR能够导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，而结合补体因子能够导致补体介导的细胞裂解。在设计异源Fc融合蛋白过程中(其中只是利用Fc部分延长半衰期的能力)，重要的是将任何效应物功能最小化。所有IgG亚类均能够结合Fc受体(CD16、CD32、CD64)，并且G1和G3比G2和G4更有效。IgG的Fc受体结合区由位于铰链区和CH2结构域的羧基端区二者中的残基形成。
根据期望的体内作用，本发明的异源融合蛋白可以包含任何上述的同种型或者可以包含其中补体和/或Fc受体结合功能已经改变的突变的Fc区。因此，本发明的异源融合蛋白可以包含免疫球蛋白的整个Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分的片段或其类似物。
优选用于本发明的异源融合蛋白的Fc区来源于IgG1或IgG2 Fc区。
通常，用于本发明的异源融合蛋白的Fc区可以来源于任何物种，包括但不限于人、大鼠、小鼠和猪。优选地，用于本发明的Fc区来源于人或大鼠。然而，最优选的是人Fc区及其片段和变体，以降低融合蛋白在人中为免疫原性的风险。“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，相比于天然序列Fc区或相比于亲本多肽的Fc区，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲代多肽的Fc区中从约一个至约十个氨基酸取代，并且优选从约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区具有至少约80％序列同一性，并且最优选与其具有至少约90％序列同一性，更优选与其具有至少约95％序列同一性。
上述的松弛素化合物可以与白蛋白或其类似物、片段或衍生物直接融合或经肽延伸段融合。通常，构成本发明的融合蛋白的部分的白蛋白可以来源于克隆自任何物种的白蛋白。然而，优选人白蛋白及其片段和类似物，以降低融合蛋白在人中为免疫原性的风险。人血清白蛋白(HSA)由585个氨基酸的单一非糖基化的多肽链组成，具有66,500的分子式分子量(formula molecular weight)。HSA的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)已经描述于例如Meloun等人(1975)；Behrens等人(1975)；Lawn等人(1981)和Minghetti等人(1986)中。已经描述了白蛋白的多种多态变体以及类似物和片段(见Weitkamp等人(1973))。例如，在EP0322094和EP0399666中公开了人血清白蛋白的多种片段。理解本发明的异源融合蛋白包括含有任何白蛋白(包括片段、类似物和衍生物)的松弛素化合物，其中此类融合蛋白是有生物活性的，并且比单独的对应野生型松弛素具有更长的血浆半衰期。因此，融合蛋白的白蛋白部分不用必须具有与天然人白蛋白相同的血浆半衰期。片段、类似物和衍生物是已知的或者能够产生以具有更长的半衰期或者具有对于天然人白蛋白和目标松弛素化合物的半衰期而言居中的半衰期。该技术是本领域中熟知的，例如见WO 93/15199、WO 93/15200、WO 01/77137和EP0413622。
在本发明的一个实施方案中，蛋白质半衰期延长部分具有低免疫原性，是人或人源化的。在优选的实施方案中，蛋白质半衰期延长部分是人，诸如人运铁蛋白(SEQ ID NO: 2)、人血清白蛋白(SEQ ID NO: 3)或人IgG1 Fc (SEQ ID NO: 4)。
此外，还可以使用改善生物学半衰期的其他蛋白、蛋白结构域或肽作为融合配偶体。
经与人血清白蛋白融合的半衰期延长例如公开于WO93/15199中。白蛋白结合作为用于改善蛋白的药代动力学的通常策略例如描述于Dennis等人，The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No 38, Issue of September 20，第35035-35043页中。经与人血清白蛋白结合蛋白融合的半衰期延长例如公开于US20100104588中。经与人血清白蛋白或IgG-Fc结合蛋白融合的半衰期延长例如公开于WO01/45746中。经与人血清白蛋白结合肽融合的半衰期延长的进一步的实例公开于WO2010/054699中。
经与Fc结构域融合的半衰期延长例如公开于WO2001/058957中。
生物活性决定了目的蛋白与它的融合配偶体的优选定向。包括融合配偶体的C末端以及N末端定向。此外，为了改善生物学半衰期或其他功能，融合配偶体可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、去糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化或其他来修饰。
蛋白质半衰期延长部分的实例为运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白、免疫球蛋白和免疫球蛋白的Fc结构域。优选的是人蛋白质半衰期延长部分，例如人运铁蛋白、人运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、人血清白蛋白、人免疫球蛋白或人Fc结构域。
在进一步的实施方案中，相比于对应的野生型松弛素而言，包含至少一个半衰期延长部分的上述融合多肽具有延长的半衰期，其中所述半衰期延长为至少5、10、20、50、100或500倍。优选地，确定作为血清半衰期的半衰期，表示例如通过使用市售的定量ELISA测定(例如R&D Systems, Human Relaxin-2 Quantikine ELISA试剂盒，目录号DRL200)检测血清或全血中的融合蛋白。所述半衰期优选为人血半衰期。
克隆、载体系统、表达、宿主和纯化
本发明还提供载体，其包含编码本发明的融合多肽HEM-PCS-松弛素原或松弛素原-PCS-HEM的分离的核酸分子。该载体系统与能够指导它在宿主细胞中的表达的表达序列可操作地连接。
合适的宿主细胞可以选自细菌细胞(诸如大肠杆菌)、酵母细胞(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。动物细胞包括但不限于HEK293细胞、CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞和多种原代哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的衍生物，诸如HEK293T细胞，也是可应用的。
本发明的DNA分子
本发明还涉及编码本发明的融合蛋白HEM-PCS-松弛素原或松弛素原-PCS-HEM的DNA分子。
本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，而是还包括其变体。本发明中的DNA变体可以通过参考它们在杂交中的物理特性来描述。技术人员会认识到由于DNA是双链的，因此可以使用核酸杂交技术用DNA来鉴定它的互补物，并且可以用DNA来鉴定它的等价物或同源物。还会认识到杂交可以以低于100％互补性发生。然而，给予合适的条件选择，可以使用杂交技术基于它们与具体探针的结构相关性来区分DNA序列。关于此类条件的指导，见Sambrook等人，1989，上文和Ausubel等人，1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. 编辑(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons)。
两条多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为两条序列将彼此杂交的条件的“严格性”的函数。如本文所用，术语“严格性”指条件不适于杂交的程度。严格条件非常不适于杂交，并且只有结构上最相关的分子才会在该条件下彼此杂交。相反，非严格条件适合于显示较低程度的结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性直接与两条核酸序列的结构关系相关。以下关系用于关连杂交和相关性(其中Tm为核酸双链体的解链温度)：
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b.  错配碱基对的数目每升高1％，双链体DNA的Tm 降低1℃。
Figure 909643DEST_PATH_IMAGE003
其中μ1和μ2为两种溶液的离子强度。
杂交严格性是许多因素的函数，包括总体DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的试剂的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、更长的探针大小和不存在破坏氢键的试剂。杂交通常在两个阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
首先，在结合阶段中，在适合于杂交的条件下使探针与目标结合。在这一阶段通常通过改变温度来控制严格性。对于高严格性，温度通常在65℃-70℃之间，除了使用短(< 20 nt)寡核苷酸探针之外。代表性的杂交溶液包含6X SSC、0.5% SDS、5X Denhardt溶液和100 μg的非特异性载体DNA。见Ausubel等，2.9部分，附录27 (1994)。当然，许多不同的但作用等效的缓冲液条件是已知的。当相关性程度较低时，可以选择更低的温度。低严格性结合温度在约25℃-40℃之间。中等严格性在至少约40℃-低于约65℃之间。高严格性为至少约65℃。
其次，通过洗涤去除过量探针。在这一阶段通常应用更严格的条件。因此，正是这个“洗涤”阶段对于经杂交确定相关性是最重要的。洗涤溶液通常包含更低的盐浓度。一种示例性中等严格性溶液包含2X SSC和0.1% SDS。高严格性洗涤溶液包含少于约0.2X SSC的等同物(在离子强度上)，并且优选的严格性溶液包含约0.1X SSC。与多种严格性相关的温度与上文对“结合”的讨论是相同的。洗涤溶液也通常在洗涤过程中更换多次。例如，典型的高严格性洗涤条件包含在55℃下洗涤两次，每次30分钟，以及在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
本发明的实施方案为编码本发明的融合多肽的分离的核酸序列。
重组DNA构建体和表达
本发明进一步提供包含一种或多种本发明的核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体与载体结合使用，所述载体诸如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，将编码本发明的融合多肽的DNA分子插入所述载体中。
如本文提供的融合多肽可以通过编码融合多肽的核酸序列在宿主细胞中的重组表达来制备。为了重组表达融合多肽，可以用携带有编码融合多肽的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，从而使融合多肽在宿主细胞中表达。使用标准重组DNA方法学来制备和/或获得编码融合多肽的核酸，将这些核酸并入重组表达载体中并将该载体引入宿主细胞，诸如描述于Sambrook, Fritsch和Maniatis (编辑)，Molecular Cloning; A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)；Ausubel, F. M. 等人，(编辑) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等的美国专利号4,816,397中的那些。
为了表达融合多肽，可以使用标准重组DNA表达方法(参见，例如
Figure 117901DEST_PATH_IMAGE004
Figure 932273DEST_PATH_IMAGE005
Figure 754736DEST_PATH_IMAGE006
。例如，可以将编码期望多肽的DNA插入表达载体中，随后将其转染入合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是原核和真核细胞。原核宿主细胞的实例例如是细菌，真核宿主细胞的实例是酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解表达载体的设计，包括调节序列的选择，受多种因素的影响，诸如宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平和表达是组成型的还是诱导型的。
细菌表达
通过插入编码期望蛋白的结构DNA序列与在可操作的阅读相内的合适的翻译起始和终止信号以及有功能的启动子来构建用于细菌用途的有用的表达载体。载体将包含一种或多种表型可选标记物和复制起点以确保载体的保持，并且如需要，以提供在宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的多个种。
细菌载体可以是例如基于噬菌体的、基于质粒的或基于噬菌粒的。这些载体可以包含来源于通常包含众所周知的克隆载体pBR322 (ATCC 37017)的元件的商业可得质粒的可选的标记物和细菌复制起点。转化合适的宿主菌株并且宿主菌株生长至合适的细胞密度后，通过合适的方法(例如变温或化学诱导)将所选的启动子去阻遏/诱导，并且将细胞培养另外一段时期。通常将细胞通过离心收集，通过物理或化学方法破碎，并将保留所获的粗提物用于进一步纯化。
在细菌系统中，根据待表达蛋白的预期用途，可以有利地选择多种表达载体。例如，当将要产生大量的此类蛋白时，指导高水平的易于纯化的融合多肽产物表达的载体可以是所需要的。本发明的融合多肽包括纯化的产物、化学合成步骤的产物、和通过重组技术从原核宿主产生的产物，所述原核宿主包括例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的多个种，优选来自大肠杆菌细胞。
哺乳动物表达和纯化
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平的蛋白表达的病毒元件，诸如来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(诸如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40 (SV40)(诸如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。对于病毒调节元件的进一步描述以及其序列，参见例如Stinski的U.S. 5,168,062、Bell等的U.S. 4,510,245和Schaffner等的U.S. 4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和可选标记物(参见例如Axel等的U.S. 4,399,216、4,634,665和U.S. 5,179,017)。合适的可选标记物包括赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物(诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性并且neo基因赋予对G418的抗性。
将表达载体转染入宿主细胞中可以使用标准技术诸如电穿孔、磷酸钙沉淀、和DEAE-葡聚糖、脂转染或聚阳离子介导的转染来进行。
用于表达本文提供的融合多肽的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞) (包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中，与DHFR可选标记物使用，例如如描述于R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在某些实施方案中，设计表达载体从而使表达的蛋白分泌至宿主细胞生长的培养基中。抗体的瞬时转染/表达可以例如按照由Durocher等(2002) Nucl.Acids Res. Vol 30 e9的方案实现。抗体稳定的转染/表达例如可以按照UCOE系统(T. Benton等(2002) Cytotechnology 38: 43-46)的方案实现。
融合多肽可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。
本发明的融合多肽可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，所述方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A层析、蛋白G层析、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析(“HPLC”)也可以用于纯化。参见例如Colligan, Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，每一章完整地通过参考并入本文。
本发明的融合多肽包括纯化的或分离的产物、化学合成步骤的产物、和通过重组技术从真核宿主(例如包括酵母(例如毕赤酵母)、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞，优选从哺乳动物细胞)产生的产物。根据在重组生产步骤中所用的宿主，本发明的融合多肽可以是糖基化的或者可以是非糖基化的，并优选糖基化的。这样的方法描述于许多标准实验室手册中，诸如Sambrook，上文，部分17.37-17.42；Ausubel，上文，第10、12、13、16、18和20章。
治疗用途
本发明的一个实施方案是本发明的药物组合物或融合多肽在治疗心血管疾病、肾疾病、胰腺炎、炎症、癌症、硬皮病，肺、肾和肝纤维化中的用途。
心血管疾病
心血管系统的病症或心血管病症在本发明的上下文中表示例如以下病症：高血压(血压高)、外周和心血管病症、冠心病、稳定型和不稳定型心绞痛、心肌机能不全、持续缺血性功能障碍(“冬眠心肌”)、暂时缺血后功能障碍(“顿抑心肌”)、心力衰竭、外周血流紊乱、急性冠脉综合征、心力衰竭和心肌梗塞。
在本发明的上下文中，术语心力衰竭包括心力衰竭的急性和慢性表现，以及更特异或相关类型的疾病，诸如急性失代偿性心力衰竭、右心力衰竭、左心力衰竭、整体衰竭、缺血性心肌病、扩张型心肌病、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜缺陷、与心脏瓣膜缺陷相关的心力衰竭、二尖瓣狭窄、二尖瓣关闭不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣关闭不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣关闭不全、组合型心脏瓣膜缺损、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心力衰竭、酒精性心肌病、心脏贮积症(cardiac storage disorders)、和舒张性和收缩性心力衰竭和恶化心力衰竭的急性期。
本发明的化合物进一步还适合于减小由梗塞影响的心肌面积，并且适合于预防继发性梗塞。
此外，本发明的化合物适合于预防和/或治疗血栓栓塞性病症、缺血后再灌注损伤、微血管和大血管受损(血管炎)、动脉和静脉血栓形成、水肿、缺血诸如心肌梗塞、中风和短暂性脑缺血发作，适合于与冠状动脉搭桥手术(CABG)、直接经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、血栓溶解后PTCA、复苏PTCA、心脏移植和心内直视手术相关的心保护，并且适合于与移植、搭桥手术、导管检查和其他外科手术操作相关的器官保护。
其他领域的适应证为例如预防和/或治疗呼吸病症，诸如，如慢性阻塞性肺疾病(慢性支气管炎，COPD)、哮喘、肺气肿、支气管扩张、囊性纤维化(粘液粘稠病)和肺动脉高压，特别是肺动脉高血压。
肾疾病
本发明涉及本发明的融合多肽作为预防和/或治疗肾疾病的药物的用途，尤其是急性和慢性肾疾病和急性和慢性肾功能不全，以及急性和慢性肾衰竭，包括需要或不需要透析的肾衰竭的急性和慢性阶段，以及潜在的或相关的肾疾病，诸如肾血流灌注不足、透析引起的低血压、肾小球病、肾小球性和肾小管性蛋白尿、肾水肿、血尿，原发性、续发性、以及急性和慢性肾小球肾炎、膜性和膜性增生性肾小球肾炎、奥尔波特综合征、肾小球硬化症、肾小管间质疾病(interstistial tubular diseases)、肾病疾病，诸如原发性和先天性肾疾病、肾炎症、免疫性肾疾病如肾移植排斥、免疫复合物引起的肾疾病、以及中毒引起的肾病疾病、糖尿病性和非糖尿病性肾疾病、肾盂肾炎、囊性肾、肾硬化、高血压性肾硬化、肾病综合征，其表征为并且在诊断上与以下相关：肌酸酐清除率和/或水排泄的异常降低，尿素、氮、钾和/或肌酸酐的血液浓度的异常增加，肾酶诸如谷氨酰合成酶的活性、尿渗透压和尿量中的改变，增加的微量白蛋白尿、大量白蛋白尿、肾小球和小动脉受损、肾小管扩张、高磷血症和/或需要透析。
此外，本发明的融合多肽可以作为药物用于预防和/或治疗：肾癌、在肾不完全切除后，过度使用利尿剂后脱水、伴有恶性高血压的不受控的血压升高、尿路梗阻和感染、淀粉样变性、以及与肾小球损伤相关的全身性疾病诸如红斑狼疮、和风湿性免疫系统疾病、以及肾动脉狭窄、肾动脉血栓形成、肾静脉血栓形成、止痛药引起的肾病和肾小管性酸中毒。
此外，本发明的融合多肽可以作为药物用于预防和/或治疗造影剂引起的和药物引起的急性和慢性间质性肾疾病、代谢综合征和血脂异常(dyslipemia)。
此外，本发明包括本发明的融合多肽作为药物的用途，其用于预防和/或治疗与急性和/或慢性肾疾病相关的后效副作用，诸如肺水肿、心力衰竭、尿毒症、贫血、电解质紊乱(例如高钾血症、低钠血症)、以及骨代谢和碳水化合物代谢。
肺疾病
此外，本发明的融合蛋白还适合于治疗和/或预防肺疾病，尤其是哮喘病、肺动脉高血压(PAH)和其他形式的肺动脉高压(PH)包括左心疾病、HIV、镰状细胞性贫血、血栓栓塞(CTEPH)、结节病(sarkoidosis)、COPD或肺纤维化相关的肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、肺纤维化、肺气肿(例如由香烟烟雾引起的肺气肿)和囊性纤维化(CF)。
纤维化病症
此外，本发明的融合蛋白适合于治疗和/预防内脏器官诸如，如肺、心脏、肾、骨髓和尤其是肝的纤维化病症、并且还有皮肤纤维化和纤维化眼病症。在本发明的上下文中，术语纤维化病症具体包括以下术语：肝纤维化、肝硬化、肺纤维化、心内膜心肌纤维化、肾病、肾小球性肾炎、间质性肾纤维化、糖尿病导致的纤维化损伤、骨髓纤维化和类似纤维化病症、硬皮病、硬斑病、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕形成(也为手术操作后形成)、痣、糖尿病性视网膜病、增生性玻璃体视网膜病变和结缔组织疾病(例如结节病)。
癌症
癌症是其中一组细胞表现出不受控制的生长的疾病。癌症通常分为癌(carcinomas)，其为来源于上皮细胞的癌症(这一组包括许多最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌)；肉瘤，其来源于结缔组织或间充质细胞；淋巴瘤和白血病，来源于造血细胞；生殖细胞癌，其来源于多能性的；和胚细胞瘤，其为来源于未成熟的“前体”或胚胎组织的癌症。
此外，本发明提供本发明的融合蛋白用于制备用于治疗和/或预防病症具体为上述病症的药物的用途。
此外，本发明提供使用有效量的至少一种本发明的融合蛋白治疗和/或预防病症具体为上述病症的方法。
此外，本发明提供本发明的融合蛋白，其用于治疗和/或预防冠心病、急性冠脉综合征、心力衰竭和心肌梗塞的方法中。
药物组合物和施用
本发明还提供包含在药学上可接受的赋形剂中的松弛素融合蛋白的药物组合物。该松弛素融合蛋白可以全身施用或局部施用。任何本领域中已知的施用方式均可以使用，包括但不限于静脉内、腹膜内、动脉内、鼻内、经吸入、口服、皮下施用、经局部注射或以外科植入的形式。
本发明还涉及药物组合物，其可以包含单独的本发明的融合多肽，或者包含与至少一种其他试剂诸如稳定化合物组合的本发明的融合多肽，其可以在任何无菌、生物相容的药物载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。这些分子中的任何均可以单独向患者施用，或者在药物组合物(其中它与一种或多种赋形剂或药学上可接受的载体混合)中与其他试剂、药物或激素组合施用。在本发明的一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。
本发明还涉及药物组合物的施用。这样的施用口服或肠胃外完成。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、或鼻内施用。除了活性组分之外，这些药物组合物可以包含合适的药学上可接受的载体，其包含有利于将活性化合物加工成能够药学上使用的制剂中的赋形剂和助剂。配制和施用技术的进一步的细节可以见于最新版的
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。
口服施用的药物组合物可以使用本领域中熟知的药学上可接受的载体配制成适合于口服施用的剂型。此类载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、悬浮液等，用于由患者摄入。
用于肠胃外施用的药物制剂包括活性化合物的水溶液。对于注射，本发明的药物组合物可以在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液诸如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，活性化合物的悬浮液可以制备为合适的含油注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或赋形剂包括脂肪油诸如芝麻油、或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高浓度的溶液的试剂。
本发明的融合蛋白可以单独使用，或者如需要，可以与其他活性化合物组合使用。此外，本发明提供具体用于治疗和/或预防上述病症的药物，其包含至少一种本发明的融合多肽和一种或多种进一步的活性组分。
用于组合的合适的活性组分为，作为实例并作为优选：调节脂质代谢的活性组分、抗糖尿病剂、降压剂、灌注增强和/或抗血栓剂、抗氧化剂、趋化因子受体拮抗剂、p38激酶抑制剂、NPY激动剂、食欲肽激动剂、厌食剂、PAF-AH抑制剂、消炎药(COX抑制剂、LTB4-受体拮抗剂)、镇痛药例如阿司匹林、抗抑郁药和其他精神药物。
本发明具体涉及至少一种本发明的融合多肽与至少一种改变脂质代谢的活性组分、抗糖尿病剂、降低血压的活性组分和/或具有抗血栓作用的药剂的组合。
本发明的融合多肽能够优选与一种或多种以下物质组合：
● 调节脂质代谢的活性组分，作为实例并作为优选来自于HMG-CoA还原酶抑制剂、HMG-CoA还原酶表达的抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、ACAT抑制剂、LDL受体诱导剂、胆固醇吸收抑制剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸重吸收抑制剂、MTP抑制剂、脂肪酶抑制剂、LpL激活剂、贝特类(fibrates)、烟酸、CETP抑制剂、PPAR-α、PPAR-γ和/或PPAR-δ激动剂、RXR调节剂、FXR调节剂、LXR调节剂、甲状腺激素和/或甲状腺模拟物、ATP柠檬酸裂解酶抑制剂、Lp(a)拮抗剂、大麻素受体1拮抗剂、瘦蛋白受体激动剂、铃蟾肽受体激动剂、组胺受体激动剂和抗氧化剂/自由基清除剂；
● 在Rote Liste 2004/II，第12章中提及的抗糖尿病药，并且还作为实例并作为优选，来自于磺酰脲类、双胍类、氯茴苯酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂、二肽基-肽酶IV抑制剂(DPP-IV抑制剂)、噁二唑烷二酮类(oxadiazolidinones)、噻唑烷二酮、GLP 1受体激动剂、胰高血糖素拮抗剂、胰岛素致敏剂、CCK 1受体激动剂、瘦蛋白受体激动剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄入的调节剂以及钾通道开放剂的那些，诸如，如公开于WO 97/26265和WO 99/03861中的那些；
● 低血压活性组分，作为实例并作为优选来自于钙拮抗剂、血管紧张素AII拮抗剂、ACE抑制剂、肾素抑制剂、β受体阻断剂、α受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、盐皮质激素受体拮抗剂、ECE抑制剂、ACE/NEP抑制剂和血管肽酶抑制剂；和/或
● 抗血栓药剂，作为实例并作为优选来自于血小板聚集抑制剂或抗凝血剂；
● 利尿剂；
● 血管加压素受体拮抗剂；
● 有机硝酸盐和NO供体；
● 具有正性肌力活性的化合物；
● 抑制环鸟苷酸(cGMP)和/或环腺苷酸(cAMP)的化合物，诸如，如磷酸二酯酶(PDE) 1、2、3、4和/或5的抑制剂，尤其是PDE 5抑制剂，诸如西地那非、伐地那非和他达拉非，并且还有PDE 3抑制剂，诸如米力农；
● 利钠肽，诸如例如，“心房利钠肽”(ANP，阿那立肽)，“B型利钠肽”或“脑利钠肽”(BNP，奈西立肽)，“C型利钠肽”(CNP)并且还有尿扩张素；
● 前列环素受体(IP受体)的激动剂，诸如，作为实例，伊洛前列素、贝前列素、西卡前列素；
● If (funny通道)通道抑制剂，诸如，作为实例，伊伐布雷定；
● 钙致敏剂，诸如，作为实例并作为优选，左西孟旦；
● 钾添加剂；
● 鸟苷酸环化酶的不依赖NO但依赖血红素的刺激剂，诸如，具体为WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301和WO 03/095451中描述的化合物；
● 鸟苷酸环化酶的不依赖NO和血红素的激活剂，诸如，具体为WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/19780、WO 02/070462和WO 02/070510中描述的化合物；
● 人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)抑制剂，诸如例如，西维来司他和DX-890 (Reltran)；
● 抑制信号转导级联的化合物，诸如例如，酪氨酸激酶抑制剂，具体为索拉非尼、伊马替尼、吉非替尼和厄洛替尼；和/或
● 调节心脏能量代谢的化合物，诸如例如，乙莫克舍、二氯乙酸、雷诺嗪和曲美他嗪。
将理解脂质代谢修饰活性组分为表示优选来自于以下的化合物：HMG-CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、ACAT抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、MTP抑制剂、脂肪酶抑制剂、甲状腺激素和/或甲状腺模拟物、烟酸受体激动剂、CETP抑制剂、PPAR-α激动剂、PPAR-γ激动剂、PPAR-δ激动剂、聚合胆汁酸吸附剂、胆汁酸重吸收抑制剂、抗氧化剂/自由基清除剂并且还有大麻素受体1拮抗剂。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合多肽与来自于他汀类药物类的HMG-CoA还原酶抑制剂组合施用，所述HMG-CoA还原酶抑制剂诸如，作为实例并作为优选，洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀或匹伐他汀。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合多肽与角鲨烯合成抑制剂组合施用，所述角鲨烯合成抑制剂诸如，作为实例并作为优选，BMS-188494或TAK-475。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合多肽与ACAT抑制剂组合施用，所述ACAT抑制剂诸如，作为实例并作为优选，阿伐麦布、甲亚油酰胺、帕替麦布、依鲁麦布或SMP-797。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与胆固醇吸收抑制剂组合施用，所述胆固醇吸收抑制剂诸如，作为实例并作为优选，依泽替米贝、替奎安或帕马苷(pamaqueside)。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与MTP抑制剂组合施用，所述MTP抑制剂诸如，作为实例并作为优选，英普他派(mplitapide)、BMS-201038、R-103757或JTT-130。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与脂肪酶抑制剂组合施用，所述脂肪酶抑制剂诸如，作为实例并作为优选，奥利司他。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与甲状腺激素和/或甲状腺模拟物组合施用，所述甲状腺激素和/或甲状腺模拟物诸如，作为实例并作为优选，D-甲状腺素或3,5,3'-三碘甲腺原氨酸(T3)。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与烟酸受体激动剂组合施用，所述烟酸受体激动剂诸如，作为实例并作为优选，烟酸、阿昔莫司、阿昔呋喃(acifran)或酒石酸烟醇(radecol)。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与CETP抑制剂组合施用，所述CETP抑制剂诸如，作为实例并作为优选，达塞曲匹、BAY 60-5521、安塞曲匹(anacetrapib)或CETP疫苗(CETi-1)。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与PPAR-γ激动剂组合施用，例如来自于噻唑烷二酮类的PPAR-γ激动剂，诸如，作为实例并作为优选，吡格列酮或罗格列酮。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与PPAR-δ激动剂组合施用，所述PPAR-δ激动剂诸如，作为实例并作为优选，GW-501516或BAY 68-5042。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与聚合胆汁酸吸附剂组合施用，所述聚合胆汁酸吸附剂诸如，作为实例并作为优选，消胆胺、考来替泊、考来维仑(colesolvam)、考来胶或考来替兰(colestimide)。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与胆汁酸重吸收抑制剂组合施用，所述胆汁酸重吸收抑制剂诸如，作为实例并作为优选，ASBT (= IBAT)抑制剂，诸如例如， AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与抗氧化剂/自由基清除剂组合施用，所述抗氧化剂/自由基清除剂诸如，作为实例并作为优选，普罗布考、AGI-1067、BO-653或AEOL-10150。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与大麻素受体1拮抗剂组合施用，所述大麻素受体1拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，利莫那班或SR-147778。
将理解抗糖尿病药为表示优选胰岛素和胰岛素衍生物，并且还有口服有效的降血糖的活性组分。本文中，胰岛素和胰岛素衍生物包括动物、人或生物技术来源的胰岛素以及还有其混合物。口服有效的降血糖的活性组分优选包括磺酰脲类、双胍类、氯茴苯酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和PPAR-γ激动剂。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与胰岛素组合施用。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与磺酰脲类组合施用，所述磺酰脲类诸如，作为实例并作为优选，甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪和格列齐特。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与双胍类组合施用，所述双胍类诸如，作为实例并作为优选，二甲双胍。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与氯茴苯酸衍生物组合施用，所述氯茴苯酸衍生物诸如，作为实例并作为优选，瑞格列奈或那格列奈。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与葡糖苷酶抑制剂组合施用，所述葡糖苷酶抑制剂诸如，作为实例并作为优选，米格列醇或阿卡波糖。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与DPP-IV抑制剂组合施用，所述DPP-IV抑制剂诸如，作为实例并作为优选，西他列汀或维格列汀。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与PPAR-γ激动剂组合施用，例如来自于噻唑烷二酮类的PPAR-γ激动剂，诸如，作为实例并作为优选，吡格列酮或罗格列酮。
优选将降压剂理解为表示来自钙拮抗剂、血管紧张素AII拮抗剂、ACE抑制剂、β受体阻断剂、α受体阻断剂和利尿剂的化合物。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与钙拮抗剂组合施用，所述钙拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，硝苯地平、氨氯地平、维拉帕米和地尔硫卓。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与血管紧张素AII拮抗剂组合施用，所述血管紧张素AII拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、恩布沙坦、奥美沙坦或替米沙坦。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与ACE抑制剂组合施用，所述ACE抑制剂诸如，作为实例并作为优选，依那普利、卡托普利、赖诺普利、雷米普利、地拉普利、福辛普利、奎诺普利(quinopril)、培哚普利或川多普利(trandopril)。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与β受体阻断剂组合施用，所述β受体阻断剂诸如，作为实例并作为优选，普萘洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿普洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、布拉洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、甲吲洛尔、卡拉洛尔(carazalol)、索他洛尔、美托洛尔、倍他洛尔、塞利洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、艾司洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛、阿达洛尔、兰地洛尔、奈必洛尔、依泮洛尔或布新洛尔。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与α受体阻断剂组合施用，所述α受体阻断剂诸如，作为实例并作为优选，哌唑嗪。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与利尿剂组合施用，所述利尿剂诸如，作为实例并作为优选，呋塞米、布美他尼、托拉塞米、苄氟噻嗪、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、泊利噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮(chlorothalidone)、吲达帕胺、美托拉宗、喹乙宗、乙酰唑胺、双氯非那胺(dichlorophenamide)、醋甲唑胺、甘油、异山梨醇、甘露醇、阿米洛利或氨苯蝶啶。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与醛固酮或盐皮质激素受体拮抗剂组合施用，所述醛固酮或盐皮质激素受体拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，螺内酯或依普利酮。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与血管加压素受体拮抗剂组合施用，所述血管加压素受体拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，考尼伐坦、托伐普坦、利希普坦或SR-121463。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与有机硝酸盐或NO供体组合施用或者与吸入性NO组合施用，所述有机硝酸盐或NO供体诸如，作为实例并作为优选，硝普钠、硝酸甘油、单硝酸异山梨醇酯、二硝酸异山梨醇酯、吗多明(molsidomin)或SIN-1。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与正性肌力化合物组合施用，所述正性肌力化合物诸如，作为实例并作为优选，强心苷(地高辛)、β-肾上腺素能和多巴胺能激动剂，诸如异丙肾上腺素、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺或多巴酚丁胺。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与抗交感神经张力药(antisympathotonics)组合施用，所述抗交感神经张力药诸如利血平、可乐定或α-甲基多巴，或者与钾通道激动剂组合施用，所述钾通道激动剂诸如米诺地尔、二氮嗪、双肼屈嗪或肼屈嗪，或者与释放一氧化氮的物质组合施用，所述释放一氧化氮的物质诸如硝酸甘油或硝普钠。
将抗血栓药理解为表示，优选地，来自于血小板聚集抑制剂或抗凝血剂的化合物。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与血小板聚集抑制剂组合施用，所述血小板聚集抑制剂诸如，作为实例并作为优选，阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定或双嘧达莫。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与凝血酶抑制剂组合施用，所述凝血酶抑制剂诸如，作为实例并作为优选，希美加群、美拉加群、达比加群、比伐卢定或克赛。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与GPIIb/IIIa拮抗剂组合施用，所述GPIIb/IIIa拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，替罗非班或阿昔单抗。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与Xa因子抑制剂组合施用，所述Xa因子抑制剂诸如，作为实例并作为优选，利伐沙班(rivaroxaban)(BAY59-7939)、DU-176b、阿哌沙班、奥米沙班、非地沙班(fidexaban)、雷扎沙班、磺达肝癸钠、艾卓肝素、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428，条件是PCS不是Xa因子切割位点。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物组合施用。
在本发明优选的实施方案中，本发明的融合蛋白与维生素K拮抗剂组合施用，所述维生素K拮抗剂诸如，作为实例并作为优选，香豆素。
在本发明的上下文中，尤其优选这样的组合，其包含至少一种本发明的融合蛋白以及还有一种或多种选自以下的进一步活性组分：HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)、利尿剂、β受体阻断剂、有机硝酸盐和NO供体、ACE抑制剂、血管紧张素AII拮抗剂、醛固酮和盐皮质激素受体拮抗剂、血管加压素受体拮抗剂、血小板聚集抑制剂和抗凝血剂，以及还有它们用于治疗和/或预防上述病症的用途。
此外，本发明提供包含至少一种本发明的融合蛋白的药物，其通常与一种或多种惰性无毒的药学上合适的助剂在一起，以及还有它们用于上述目的的用途。
治疗有效剂量
适合用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中以有效量包含活性组分以实现预期目的，例如心力衰竭。有效剂量的测定完全属于本领域技术人员的能力范围内。
对于任何化合物，治疗有效剂量可以首先在体外测定(例如LGR7受体活化)中评价，在分离的灌注大鼠心脏中离体(ex vivo)评价，或者在动物模型通常为小鼠、兔、犬或猪中评价。还使用动物模型获得施用的期望浓度范围和途径。随后可以将这样的信息用于确定在人中施用的有用剂量和途径。
治疗有效剂量指改善症状或状况的融合蛋白的量。此类化合物的治疗效力和毒性，例如ED50 (在50％的种群中治疗有效的剂量)和LD50 (对50%的种群致死的剂量)，可以通过标准药学程序在体外或实验动物中测定。治疗作用和毒性作用之间的剂量比例为治疗指数，并且它可以表示为ED50/LD50的比例。优选显示大治疗指数的药物组合物。将从体外测定和动物研究中获得的数据用于制定用于人使用的剂量的范围。此类化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，所述循环浓度包括基本不具有毒性或无毒性的ED50。根据使用的剂型、患者敏感性和施用途径，剂量在这一范围内变化。
根据施用途径，正常剂量的量可以在0.1-100,000毫克总剂量中变化。对递送的具体剂量和方法的指导提供于文献中。参见美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212。相比对于蛋白或它们的抑制剂，本领域技术人员对多核苷酸将使用不同制剂。类似地，多核苷酸或多肽的递送将对于具体细胞、状况(conditions)、定位等是特异性的。
本发明通过以下实施例进一步描述。提供实施例仅仅用于通过参考具体实施方案来说明本发明。这些实例尽管说明了本发明的某些具体方面，但并不描述为限制或限定本发明的范围。
除了另有详述之处以外，所有实施例均使用标准技术进行，其对于本领域技术人员是熟知的且常规的。以下实施例的常规分子生物学技术可以如标准实验室手册中所述进行，诸如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989。
进一步优选的实施方案是：
1. 一种融合蛋白，其包含松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素，其中
松弛素包含松弛素A链多肽或其功能变体和松弛素B链多肽或其功能变体，
PCS包含内切蛋白酶切割位点，并且
HEM为蛋白质半衰期延长部分。
2. 一种融合多肽，其包含松弛素原-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素原，其中
松弛素原包含松弛素A链多肽或其功能变体、松弛素C链多肽和松弛素B链多肽或其功能变体，
PCS包含内切蛋白酶切割位点，并且
HEM为蛋白质半衰期延长部分。
3. 根据第1或2项的融合蛋白或多肽，其中所述PCS是胞外内切蛋白酶的切割位点。
4. 根据第3项的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶是内源内切蛋白酶。
5. 根据第3或4项的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶是心脏、肝、肾或肺表达的内切蛋白酶。
6. 根据第3项的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶是膜结合的或跨膜的蛋白酶，其催化活性在膜的胞外侧。
7. 根据第1-6项中任一项的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶选自表1所述的内切蛋白酶。
8. 根据第1-6项中任一项的融合蛋白或多肽，其中所述PCS选自表1所述的PCS。
9. 根据第3-8项中任一项的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶选自Xa因子、胰蛋白酶、MMP2、MMP9、MMP12、肾素、弹性蛋白酶和糜蛋白酶。
10. 根据第3-9项中任一项的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶是人的。
11. 根据第1-10项中任一项的融合蛋白或多肽，其中所述PCS具有这样的序列，其包含在由以下组成的序列的组中：IleGluGlyArgMetAsp (FXa切割位点)、RAKRFASL (MMP9切割位点)、INARVSTI (胰蛋白酶切割位点)、RVGFYESD (糜蛋白酶切割位点)和GLRVGFYE (弹性蛋白酶切割位点)。
12. 根据第1-11项中任一项的融合蛋白或多肽，其中所述PCS在N末端和/或在C末端具有延伸多肽。
13. 根据前述项中任一项的融合多肽，其中所述蛋白质半衰期延长部分包含在由以下组成的蛋白质半衰期延长部分的组中：免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、运铁蛋白和血清白蛋白结合蛋白。
14. 根据前述项中任一项的融合多肽，其中所述蛋白质半衰期延长部分是IgG1 Fc结构域。
15. 根据前述项中任一项的融合多肽，其中所述蛋白质半衰期延长部分是人的。
16. 根据前述项中任一项的融合多肽，其中所述松弛素A链为人松弛素2 A链，并且松弛素B链为人松弛素2 B链。
17. 根据前述项中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽为松弛素原-PCS-HEM。
18. 根据前述项中任一项的融合多肽，其中所述融合多肽为松弛素-PCS-HEM。
19. 一种多核苷酸，其编码根据第2-18项中任一项的松弛素原-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素原融合多肽。
20. 一种载体，其包含根据第19项的多核苷酸。
21. 一种宿主细胞，其包含根据第20项的载体或根据第17项的多核苷酸。
22. 根据第1-18项中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白的生产方法，包括培养进一步包含激素原转化酶活性的第21项的宿主细胞和分离所述蛋白的步骤。
23. 一种药物组合物，其包含根据第1-18项中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白。
24. 根据第23项的药物组合物或根据第1-18项中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白，其作为药物。
25. 根据第23或24项的药物组合物或根据第1-18项中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白，其作为药物用于治疗心血管疾病、肺疾病、纤维化病症或肾疾病。
26. 治疗心血管疾病、肺疾病、纤维化病症或肾疾病的方法，其包括施用治疗有效剂量的根据第23或24项的药物组合物或根据第1-18项中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白。
27. 根据第25或26项的治疗，其中所述心血管疾病包含于由冠心病、急性冠脉综合征、心力衰竭或心肌梗塞组成的心血管疾病的组中。
实施例
实验方案
构建松弛素-Fc融合蛋白：
通过化学基因合成产生松弛素变体的cDNA序列。将该合成的基因亚克隆入哺乳动物表达载体pCEP4 (Invitrogen，目录号V044-50)中。使用LDL受体相关蛋白(LRP，氨基酸组成MLTPPLLLLLPLLSALVAA)或CD33 (氨基酸组成MPLLLLLPLLWAGALA)的前导序列作为用于所获蛋白正确分泌的信号前导序列。对于合成的构建体的亚克隆，按照生产商说明书使用限制酶HindIII和BamH1。
为了改善血浆半衰期，通过基于化学的基因合成将人IgG1的Fc部分与人松弛素2组合。将人松弛素2 (按照其基因组组成排列如下：B链-C链-A链)的羧基末端部分与人IgG1 Fc部分的N末端融合，由此将融合蛋白的这两部分通过6个氨基酸长的接头序列连接，所述接头序列由具有编码凝血因子Xa切割位点的序列IleGluGlyArgMetAsp的多肽组成。
松弛素原-Fc融合体具有以下序列(蛋白：SEQ ID NO: 1；核苷酸序列：SEQ ID NO: 17)：
Figure 951865DEST_PATH_IMAGE009
  。
将由激素原转化酶切除的C链序列用小写字母表示。将FXa切割位点用粗体、下划线字母标记。
改善多肽的生物学半衰期的另一个选择是与多肽如运铁蛋白(检索号P02787)或白蛋白(检索号P02768)融合(SR Schmid (2009))。
另一个选择是使用其他蛋白酶切割位点而非FXa的切割位点，例如表1中列出的切割位点。
显示MMP9切割位点的构建体松弛素-融合体1具有SEQ ID NO: 13 (多肽)和核苷酸序列SEQ ID NO. 29。
显示糜蛋白酶切割位点的构建体松弛素-融合体2具有SEQ ID NO: 14 (多肽)和核苷酸序列SEQ ID NO. 30。
显示胰蛋白酶切割位点的构建体松弛素-融合体3具有SEQ ID NO: 15 (多肽)和核苷酸序列SEQ ID NO. 31。
显示弹性蛋白酶切割位点的构建体松弛素-融合体4具有SEQ ID NO: 16 (多肽)和核苷酸序列SEQ ID NO. 32。
松弛素Fc融合蛋白的表达：
对于小规模表达(最多2毫升培养体积)，使用Lipofectamine2000转染试剂 (Invitrogen，目录号11668-019)按照生产商说明书用编码松弛素-Fc融合构建体的表达质粒瞬时转染HEK293 (ATCC，目录号CRL-1573)细胞。对于松弛素的正确加工，用编码人激素原转化酶1 (检索号NP_000430.3)的表达载体共转染细胞。在加湿培养箱中在5%二氧化碳和37℃下，在D-Mem F12 (Gibco， #31330)、1% 青霉素-链霉素(Gibco，#15140)和10%胎牛血清(FCS，Gibco，#11058)中培养细胞。
转染后三至五天，使用稳定转染的CHO-CRE-GR7细胞系检测转染后的细胞的条件培养基的活性。
对于大规模表达(10毫升培养体积或更多)，如Tom等人，2007中所述，在哺乳动物细胞中瞬时表达该构建体。简而言之，将表达质粒转染入HEK293-6E细胞并在Fernbach-Flasks或Wave-Bags中孵育。在37℃，在F17培养基(Invitrogen)中表达5-6天。转染后添加入5 g/l胰蛋白胨TN1 (Organotechnie)、1% Ultra-Low IgG FCS (Invitrogen)和0.5 mM丙戊酸(Sigma)。
松弛素Fc融合蛋白的纯化：
从哺乳动物细胞培养上清液中纯化松弛素Fc-融合构建体。首先，通过离心使上清液从细胞碎片中澄清出来。通过蛋白A (MabSelect Sure，GE Healthcare)亲和层析随后通过体积排阻层析(SEC)纯化蛋白。因此，将上清液加入预先在PBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich)中平衡的蛋白A柱中，用10个柱体积的PBS pH 7.4 + 500 mM NaCl去除污染物。将松弛素Fc融合构建体用50 mM 醋酸钠 pH 3.5 + 500 mM NaCl洗脱，并在Superdex 200柱上用PBS pH 7.4通过SEC进一步纯化。
表达的松弛素-Fc融合蛋白的定量：
对于分泌且纯化的重组松弛素变体的定量，按照生产商说明书使用商业可得的定量ELISA (R&D Systems，人松弛素-2 Quantikine ELISA试剂盒，目录号DRL200)。
此外，对于某些构建体，通过使用FC-ELISA定量蛋白。对于Fc ELISA，在4℃下用抗Fc抗体(SigmaAldrich，目录号A2136)以5 μg/毫升的浓度包被96孔微量滴定板(Nunc, Maxi Sorp black，目录号460918)过夜。通过使用50微升/孔的由PBS和0.05% Tween 20 (SigmaAldrich，目录号63158)缓冲液组成的缓冲液洗涤板一次。加入30微升封闭缓冲液(Candor Bioscience，目录号113500)并且将所述板在37℃下孵育1小时。使用50微升/孔的PBS/0.05% Tween 20缓冲液将板洗涤3次。加入样品并将板在37℃下孵育1小时。如果有必要，则必须通过使用上述封闭缓冲液稀释样品。孵育后，使用50微升/孔的PBS/0.05% Tween 20缓冲液将板洗涤3次。
对于检测，加入30微升的以1:10000稀释在10％封闭缓冲液中的抗h-Fc-POD (SigmaAldrich，目录号A0170)，并在37℃下孵育1小时。孵育后，使用50微升/孔的PBS/0.05% Tween 20缓冲液将板洗涤3次。加入30微升BM Blue Substrate POD (Roche Diagnostics，目录号11484281001)并在孵育五分钟后，通过加入1摩尔硫酸(acid sulfur)溶液终止反应。使用Tecan Infinite 500读数器(吸光度模式，消光450nm，发射690nm)测定吸收。
活性检测：
用环AMP应答元件(CRE)萤光素酶报道基因构建体(Biomyx Technology, pHTS-CRE, 目录号P2100)稳定转染CHO K1细胞(ATCC，目录号CCL-61)，产生CHO-CRE-萤光素酶细胞系。
随后用人LGR7/RXFP1受体(检索号NM_021634.2)(其作为2271个碱基对长的DNA片段被克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(-) (Invitrogen，目录号V79520)中)稳定转染该细胞系，产生CHO-CRE-LGR7细胞系。将该细胞系在D-Mem F12 (Gibco，#31330) 2 mM Glutamax (Gibco，#35050)、100 nM丙酮酸(Gibco，# 11360-070)、20 mM Hepes (Gibco，# 15630)、1% 青霉素-链霉素(Gibco，#15140)和10%胎牛血清(FCS, Gibco, #11058)中培养。
对于刺激，将培养基换为OptiMem (Gibco，#11058) + 含有不同浓度的重组表达的松弛素-Fc融合蛋白(通常以100 nM的浓度起始，随后1：2稀释)的1% FCS。使用商业可得的重组表达的人松弛素2 (R&D Systems，目录号6586-RN-025)作为阳性对照。随后，将细胞在加湿培养箱中在5％二氧化碳和37℃下孵育6小时。6小时后，使用萤光素酶检测系统(Promega，# E1500)并使用Tecan Infinite 500读数器(发光模式，1000毫秒积分时间，测定时间30秒)检测细胞的萤光素酶活性。
通过使用计算机程序Graph Pad Prism Version 5，用相对发光单位来测定不同分子的EC50值。
对于松弛素以及本发明的融合多肽的选择性的活性检测，使用具有LGR7受体的内源表达的细胞系(例如THP1，ATCC目录号TIB-202)或原代细胞(例如Celprogen Inc., 人心肌细胞培养物，目录号36044-15)。按照生产商说明书培养这些细胞。
用于检测松弛素或松弛素-Fc融合蛋白诱导的cAMP产生的检测方法是本领域中已知的。例如，按照生产商说明书，使用cAMP ELISA (例如IBL International GmbH，cAMP ELISA，目录号CM 581001)进行此类测定。
用于检测松弛素或松弛素-Fc融合蛋白诱导的PI3激酶活化的检测方法是本领域中已知的。例如，按照生产商说明书，使用PI3-激酶HTRF测试(例如Millipore，PI3-Kinase HTRF Assay，目录号33-016)进行此类测定。
松弛素-Fc融合蛋白的蛋白酶处理和活性检测
将表达松弛素-融合蛋白的HEK293细胞的上清液与如下说明的相应蛋白酶孵育：
- 将2 ml表达松弛素-Fc的HEK293细胞的上清液与1 μg的因子Xa蛋白酶(New England Biolabs，目录号P8010)在23℃下孵育6小时。
- 将2 ml表达松弛素-融合体2的HEK293细胞的上清液与浓度为0.83 μg/ml的糜蛋白酶(Sigma Aldrich，目录号C8118)在37℃下孵育6小时。
- 将2 ml表达松弛素-融合体3的HEK293细胞的上清液与浓度为10 μg/ml的胰蛋白酶(Sigma Aldrich，目录号T0303)在37℃下孵育6小时。
- 将2 ml表达松弛素-融合体4的HEK293细胞的上清液与浓度为5 μg/ml的弹性蛋白酶(Sigma Aldrich，目录号E7885)在37℃下孵育6小时。
使用前，需要通过将MMP9 (R&D Systems，目录号911-MP)与APMA (对氨基苯汞乙酸盐；Sigma Aldrich，目录号A-9563)孵育来将所述蛋白酶活化。为此，需要在测定缓冲液(50mM Tris，10mM CaCl2，150mM NaCl2，0.05% Brij35，pH 7.5)将MMP9稀释至100 μg/ml的浓度(例如，100 μl终体积中1 μg)。加入APMA至终浓度为1 mM(例如，100 μl的终体积中20 μl的5 mM储备溶液)。将该混合物在37℃下孵育24小时。随后，将活化的MMP9在表达松弛素-融合体1的HEK293细胞的2 ml上清液中稀释至终浓度为0.4 ng/ml。与活化的MMP9在37℃下孵育6小时。
通过使用如上描述的CHO-CRE-LGR7细胞系检测表达松弛素-Fc融合蛋白的HEK293细胞的上清液的活性。使用人松弛素2作为正对照。
对于松弛素-Fc融合蛋白，未检测到活性。相反，在含松弛素-Fc融合蛋白的上清液的FXa孵育后，观察到CHO-CRE-LGR7细胞系的明显活化。尽管该活性低于人松弛素2阳性对照获得的活性，但它显示出使用PCS产生了可释放的活性松弛素分子。
使用未纯化的松弛素-融合蛋白是略微较低的活性的一种可能解释，这是由于样品中可能的杂质导致浓度的错误测定或者会对基于细胞的萤光素酶测定的准确性产生负面影响。
使用由空表达载体转染的HEK293细胞的上清液导致活性检测中以大约3倍降低。另一种解释可以是松弛素-融合蛋白的不完全切割产生了切出且功能上有活性的松弛素及无活性的松弛素-融合蛋白的混合物。
实施例1：松弛素-Fc
为了改善生物学半衰期，通过基于化学的基因合成将人IgG1的Fc部分与人松弛素2组合。将人松弛素2 (按照它的基因组组成排列如下：B链-C链-A链)的羧基末端部分与人IgG1 Fc部分的N末端融合，由此将融合蛋白的这两部分通过6个氨基酸长的接头序列连接，所述接头序列由具有编码凝血因子Xa切割位点的序列IleGluGlyArgMetAsp的多肽组成。如上描述通过将该构建体与蛋白酶FXa孵育后使用CHO-CRE-LGR7细胞系，松弛素仅显示出可检测的活性。
实施例2：松弛素-融合体1
为了改善生物学半衰期，通过基于化学的基因合成将人IgG1的Fc部分与人松弛素2组合。将人松弛素2 (按照它的基因组组成排列如下：B链-C链-A链)的羧基末端部分与人IgG1 Fc部分的N末端融合，由此将融合蛋白的这两部分通过6个氨基酸长的接头序列连接，所述接头序列由具有编码蛋白酶MMP9切割位点的序列ArgAlaLysArgPheAlaSerLeu的多肽组成。如上描述通过将该构建体与蛋白酶MMP9孵育后使用CHO-CRE-LGR7细胞系，松弛素仅显示出可检测的活性。
实施例3：松弛素-融合体2
为了改善生物学半衰期，通过基于化学的基因合成将人IgG1的Fc部分与人松弛素2组合。将人松弛素2 (按照它的基因组组成排列如下：B链-C链-A链)的羧基末端部分与人IgG1 Fc部分的N末端融合，由此将融合蛋白的这两部分通过6个氨基酸长的接头序列连接，所述接头序列由具有编码蛋白酶糜蛋白酶切割位点的序列ArgValGlyPheTyrGluSerAsp的多肽组成。如上描述通过将该构建体与蛋白酶糜蛋白酶孵育后使用CHO-CRE-LGR7细胞系，松弛素仅显示出可检测的活性。在糜蛋白酶实验中获得的低信号值可能是由于加入的糜蛋白酶切割了由筛选细胞系表达的LGR7受体。本领域技术人员知晓如何去除或降低测定系统中的糜蛋白酶活性(例如，使用特异性蛋白酶抑制剂)。尽管如此，这些数据还是证明可以从融合蛋白中释放有功能的松弛素。
实施例4：松弛素-融合体3
为了改善生物学半衰期，通过基于化学的基因合成将人IgG1的Fc部分与人松弛素2组合。将人松弛素2 (按照它的基因组组成排列如下：B链-C链-A链)的羧基末端部分与人IgG1 Fc部分的N末端融合，由此将融合蛋白的这两部分通过6个氨基酸长的接头序列连接，所述接头序列由具有编码蛋白酶胰蛋白酶切割位点的序列IleAsnAlaArgValSerThrIle的多肽组成。如上描述，松弛素仅在将该上清液与胰蛋白酶孵育后显示出显著的活性。未孵育的上清液显示出较低的活性，可能是由于细胞培养上清液中的蛋白酶污染，其识别与胰蛋白酶相比相似切割位点。
实施例5：松弛素-融合体4
为了改善生物学半衰期，通过基于化学的基因合成将人IgG1的Fc部分与人松弛素2组合。将人松弛素2 (按照它的基因组组成排列如下：B链-C链-A链)的羧基末端部分与人IgG1 Fc部分的N末端融合，由此将融合蛋白的这两部分通过6个氨基酸长的接头序列连接，所述接头序列由具有编码蛋白酶弹性蛋白酶切割位点的序列GlyLeuArgValGlyPheTyrGlu的多肽组成。如上描述通过将该构建体与蛋白酶弹性蛋白酶孵育后使用CHO-CRE-LGR7细胞系，松弛素仅显示出可检测的活性。未孵育的上清液显示出较低的活性，可能是由于细胞培养上清液中的蛋白酶污染，其识别与弹性蛋白酶相比相似切割位点。
表2：
构建体和对应SEQ ID NOs的列表。      
名称 描述 SEQ ID NO:
松弛素-Fc 松弛素-Fxa切割位点-人IgG1 Fc SEQ ID NO:1
运铁蛋白 运铁蛋白 SEQ ID NO:2
白蛋白 白蛋白 SEQ ID NO:3
Fc IgG1人 Fc IgG1人 SEQ ID NO:4
人松弛素2 人松弛素2 SEQ ID NO:5
RLN2 A链 RLN2 A链 SEQ ID NO:6
RLN2最小A链 RLN2最小A链 SEQ ID NO:7
RLN2 B链 RLN2 B链 SEQ ID NO:8
人松弛素3 人松弛素3 SEQ ID NO:9
RLN3 A链 RLN3 A链 SEQ ID NO:10
RLN3 B链 RLN3 B链 SEQ ID NO:11
RLN3最小A链 RLN3最小A链 SEQ ID NO:12
松弛素-融合体1 松弛素-MMP9切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:13
松弛素-融合体2 松弛素-糜蛋白酶切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:14
松弛素-融合体3 松弛素-胰蛋白酶切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:15
松弛素-融合体4 松弛素-弹性蛋白酶切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:16
松弛素-Fc 松弛素-Fxa切割位点-人IgG1 Fc SEQ ID NO:17
运铁蛋白 运铁蛋白 SEQ ID NO:18
白蛋白 白蛋白 SEQ ID NO:19
Fc IgG1人 Fc IgG1人 SEQ ID NO:20
人松弛素2 人松弛素2 SEQ ID NO:21
RLN2 A链 RLN2 A链 SEQ ID NO:22
RLN2最小A链 RLN2最小A链 SEQ ID NO:23
RLN2 B链 RLN2 B链 SEQ ID NO:24
人松弛素3 人松弛素3 SEQ ID NO:25
RLN3 A链 RLN3 A链 SEQ ID NO:26
RLN3 B链 RLN3 B链 SEQ ID NO:27
RLN3最小A链 RLN3最小A链 SEQ ID NO:28
松弛素-融合体1 松弛素-MMP9切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:29
松弛素-融合体2 松弛素-糜蛋白酶切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:30
松弛素-融合体3 松弛素-胰蛋白酶切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:31
松弛素-融合体4 松弛素-弹性蛋白酶切割位点-人Fc IgG1 SEQ ID NO:32
参考文献：
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Figure 11143DEST_PATH_IMAGE011
Figure 333857DEST_PATH_IMAGE013
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。
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Claims (15)

1.一种融合蛋白，其包含松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素，其中
松弛素包含松弛素A链多肽或其功能变体，和松弛素B链多肽或其功能变体，
PCS包含内切蛋白酶切割位点，并且
HEM为蛋白质半衰期延长部分。
2.一种融合多肽，其包含松弛素原-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素原，其中
松弛素原包含松弛素A链多肽或其功能变体、松弛素C链多肽和松弛素B链多肽或其功能变体，
PCS包含内切蛋白酶切割位点，并且
HEM为蛋白质半衰期延长部分。
3.权利要求1或2的融合蛋白或多肽，其中所述PCS是胞外内切蛋白酶的切割位点。
4.权利要求3的融合蛋白或多肽，其中所述内切蛋白酶是内源内切蛋白酶。
5.前述权利要求中任一项的融合多肽，其中所述蛋白质半衰期延长部分包含在由以下组成的蛋白质半衰期延长部分的组中：免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、运铁蛋白和血清白蛋白结合蛋白。
6.前述权利要求中任一项的融合多肽，其中所述松弛素A链为人松弛素2 A链，并且所述松弛素B链为人松弛素2 B链。
7.一种多核苷酸，其编码权利要求2-6中任一项的松弛素原-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素原融合多肽。
8.一种载体，其包含权利要求7的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求8的载体或权利要求7的多核苷酸。
10.权利要求1-6中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白的生产方法，其包括培养进一步包含激素原转化酶活性的权利要求9的宿主细胞和分离所述蛋白的步骤。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白。
12.权利要求11的药物组合物或权利要求1-6中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白，其作为药物。
13.权利要求11或12的药物组合物或权利要求1-6中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白，其作为用于治疗心血管疾病、肺疾病、纤维化病症或肾疾病的药物。
14.治疗心血管疾病、肺疾病、纤维化病症或肾疾病的方法，其包括施用治疗有效剂量的权利要求11或12的药物组合物或权利要求1-6中任一项的松弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-松弛素蛋白。
15.权利要求13或14的治疗，其中所述心血管疾病包含在冠心病、急性冠脉综合征、心力衰竭或心肌梗塞的组中。
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