KR20090102838A - 페나진 및 퀴녹살린 치환된 아미노산 및 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비천연 아미노산 및 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 이러한 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 제조 방법을 개시한다. 또한, 추가로 번역후 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 이러한 변형을 수행하는 방법, 이러한 폴리펩티드의 정제 방법을 개시한다.

Description

페나진 및 퀴녹살린 치환된 아미노산 및 폴리펩티드{PHENAZINE AND QUINOXALINE SUBSTITUTED AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES}

-관련 출원-

본 출원은 2006년 12월 28일 출원된 미국 가출원 제 60/882,500호를 우선권으로 주장한다.

-기술 분야-

본 발명은 비천연 아미노산, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 이러한 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 제조 방법, 및 진단, 환경, 산업 및 치료 용도로서 이러한 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

비-유전적으로 코딩된 아미노산(즉, "비천연 아미노산")을 단백질 내로 도입하는 능력은 천연-발생 작용기에 대해 가치있는 대체물을 제공할 수 있는 화학적 작용기, 예컨대, 라이신의 엡실론 -NH₂, 시스테인의 설프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노 기 등의 도입을 가능하게 한다. 일정 화학적 작용기는 유전적으로 코딩되는 20종의 공통 아미노산에서 발견되는 작용기에 대해 불활성인 것으로 알려져 있지만 비천연 아미노산 상에 도입될 수 있는 작용기와 분명하고 효율적으로 반응하여 안정한 결합을 형성한다.

단백질에서 발견되지 않고, 20종의 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 작용기들 모두에 대해 화학적으로 불활성이며 안정한 공요 연결을 형성하도록 일정한 작용기를 포함하는 시약과 효율적이고 선택적으로 반응시키기 위해 사용할 수 있는 화학 작용기를 선택적으로 도입시키는 방법이 이제는 이용가능하다.

-발명의 요약-

본 발명에서는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 전략을 기술한다. 일 측면은 비천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 전략이다. 일 구체예에서, 이러한 방법, 조성물, 기법 및 전략은 화학 유도체화법을 포함하고, 다른 구체예에서는 생물학적 유도체화법을 포함하며, 다른 구체예에서는 물리적 유도체화법을 포함하고, 다른 구체예에서는 이러한 유도체화법의 조합을 포함한다. 추가 구체예에서, 이러한 유도체화는 위치 선택적(regioselective)이다. 추가 구체예에서, 이러한 유도체화는 위치 특이적(resiospecific)이다. 추가 구체예에서, 이러한 유도체화는 상온에서 빠르게 이루어진다. 다른 구체예에서, 이러한 유도체화는 수용액 중에서 일어난다. 추가 구체예에서, 이러한 유도체화는 pH 약 3∼8, pH 약 4∼약 10, pH 약 4∼8, 및 pH 약 4.5∼약 7.5, pH 약 4∼약 7, pH 약 3∼약 4, pH 약 7∼약 8, pH 약 4∼약 6, pH 약 4, 및 pH 약 6을 포함하는 pH 약 2∼약 10에서 일어난다. 추가 구체예에서, 촉진제의 추가시에, 이러한 유도체화는 비천연 아미노산 함유 시약 및 유도체화 시약 둘 모두에서 화학양론적이거나, 화학양론에 근접하거나 또는 화학양론과 유사하다. 추가 구체예에서는 촉진제의 추가시에, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 목적하는 기를 화학양론적으로, 화학양론에 근접하여 또는 화학양론에 유사하게 도입시킬 수 있는 전략, 반응 혼합물, 합성 조건을 제공한다.

일 측면은 퀴녹살린 또는 페나진 결합을 기초로 하는 펩티드 및 단백질의 화학 유도체화를 위한 비천연 아미노산이다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 그들의 측쇄 상에서 작용기화되어 유도체화 분자와의 반응으로 퀴녹살린 또는 페나진 연결이 생성한다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산은 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 측쇄를 갖는 아미노산에서 선택된다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 보호되거나 마스크된 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 측쇄를 갖는 아미노산에서 선택된다. 추가로 1,2-디카르보닐 측쇄에 대한 동등물, 또는 보호되거나 마스크된 1,2-디카르보닐 측쇄에 대한 동등물을 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 구조는 천연 아미노산을 닮았지만 상기 언급한 작용기 중 하나를 함유한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 페닐알라닌 또는 티로신(방향족 아미노산)을 닮았으며, 한편으로는 개별 구체예에서, 비천연 아미노산은 알라닌 및 루신(소수성 아미노산)을 닮았다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 천연 아미노산과는 구별되는 특성을 갖는다. 일 구체예에서, 이러한 구별되는 특성은 측쇄의 화학 반응성이다. 추가 구체예에서, 상기 구별되는 화학 반응성은 비천연 아미노산이 폴리펩티드 단위로 존재하면서 반응을 수행할 수 있게 하지만 동일 폴리펩티드 내 천연 발생 아미노산 단위의 측쇄는 상기 언급한 반응을 겪지않는다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 발생 아미노산에 대해 오르쏘고날(orthogonal)인 화학적 특성을 갖는다. 본 단락에서 언급한 임의 구체예에서, 비천연 아미노산은 개별 분자로서 존재하고, 양 측면 상에서 하나 이상의 아미노산(임의 길이의 폴리펩티드 포함)이 부착된다.

다른 측면은 비천연 아미노산 폴리펩티드로서, 하나 이상의 비천연 아미노산이 임의 길이이 폴리펩티드에 도입되고 경우에 따라 추가로 천연 발생 또는 비천연 아미노산이 도입된다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 생체내 단백질 번역 동안 부위 특이적으로 도입된다. 추가 구체예는 유도체화 분자와 반응하여 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하는 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 측쇄; 보호되거나 마스크된 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 측쇄; 1,2-디카르보닐 측쇄의 동등물 및 1,2-디카르보닐 측쇄의 보호되거나 마크스된 동등물을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 일 구체예에서는 페닐 알라닌 또는 티로신(방향족 아미노산)을 닮거나, 또는 개별 구체예에서는 알라닌 및 루신(소수성 아미노산)을 닮은, 구조적으로는 천연 아미노산을 닮았지만 상기 언급한 작용기 중 하나를 함유하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 천연 아미노산과는 구별되는 특성을 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 구별되는 특성은 측쇄의 화학 반응성이다. 추가 구체예에서, 이러한 구별되는 화학 반응성은, 폴리펩티드의 단위로 존재하면서 비천연 아미노산의 측쇄가 반응을 수행하도록 하는데 동일한 폴리펩티드 내 천연 발생 아미노산 단위의 측쇄는 상기 언급한 반응을 수행하지 않는다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 천연 발생 아미노산의 측쇄에 대해 오르쏘고날인 화학성을 갖는다.

다른 측면은 퀴녹살린 또는 페나진을 기초로 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하기 위해 분자를 유도체화하는 것이다. 일 구체예는 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성하기 위해 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하기 위해 사용되는 1,2-디카르보닐 치환된 분자이다. 다른 구체예는 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성하기 위해 1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하기 위해 사용된 1,2-아릴디아민 치환된 분자이다. 추가 구체예에서, 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 기초로 하는 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하기 위한 1,2-디카르보닐 및 1,2-아릴디아민 치환된 분자는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임; 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀 및 이의 임의 조합에서 선택된 기를 포함한다. 추가 또는 다른 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환딘 분자는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 비천연 아미노산이 선택적으로 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 분자와 반응할 수 있게 하는 천연 발생 아미놋나의 화학성에 오르쏘고날인 화학성을 갖는다.

상기 구체예와 관련된 추가 측면은 비천연 아미노산 폴리펩티드와 유도체화 분자를 반응시켜 생성된 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 일 구체예는 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성하기 위해 1,2-디카르보닐 치환된 분자로 유도체화시킨 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 다른 구체예는 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성시키기 위해 1,2-아릴디아민 치환된 분자로 유도체화시킨 1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가 구체예에서, 퀴녹살린 또는 페나진 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀 및 이의 임의 조합에서 선택된 기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 퀴녹살린 또는 페나진 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기를 포함한다. 추가 구체예는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.

또 다른 측면은 퀴녹살린 또는 페나진 연결의 형성을 기초로 하는 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생성을 위한 단작용성, 이작용성 및 다작용성 링커이다. 일 구체예는 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성하여 다른 분자에 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 연결시키기 위해 사용되는 분자 링커(이작용성 및 다작용성)이다. 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 구체예에서, 분자 링커는 이의 말단 한쪽에 1,2-디카르보닐 기를 함유한다. 1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 구체예에서, 분자 링커는 이의 말단 한쪽에 1,2-아릴디아민 기를 함유한다. 추가 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 링커 분자는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 추가 구체예에서, 어구 "다른 분자"는 예를 들어, 단백질, 다른 중합체 및 소형 분자를 포함한다. 추가 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 분자 링커는 모든 말단에 동일하거나 동등한 기를 포함하여서 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 반응시, 얻어지는 생성물은 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드의 동종다량체이다. 추가 구체예에서, 동종다량체는 동종이량체이다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산의 측쇄는 비천연 아미노산이 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 링커 분자와 선택적으로 반응할 수 있게 하는 천연 발생 아미노산의 화학성에 대해 오르쏘고날인 화학성을 갖는다. 이 단락에서 기술한 구체예와 관련된 추가 측면은 비천연 아미노산 폴리펩티드와 링커 분자의 반응으로 생성된 연결된 "변형 또는 비변형된" 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가 구체예는 이미 연결된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.

다른 측면은 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 통해 화학 유도체화시키려는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에 도입시키기 위한 비천연 아미노산의 화학 합성 방법이다. 추가 구체예는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 측쇄, 보호 또는 마스크된 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 측쇄, 1,2-디카르보닐 측쇄에 대한 동등물, 또는 1,2-디카르보닐 측쇄에 대한 보호되거나 마스크된 동등물을 갖는 아미노산에서 선택된 비천연 아미노산의 화학 합성 방법이다.

다른 측면은 각각 1,2-아릴디아민 또는 1,2-디카르보닐 치환된 폴리펩티드 또는 단백질의 유도체화를 위한 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 분자를 화학 합성하는 방법이고, 양 경우에서, 페나진 또는 퀴녹살린 연결이 형성된다. 일 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 분자는 경우에 따라 펩티드, 다른 중합체(비분지형 및 분지형) 및 소형 분자를 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 단백질의 생체 내 번역 동안 부위 특이적으로 도입된다. 추가 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 분자는 부위 특이적 방식으로 퀴녹살린 또는 페나진 유도체화된 폴리펩티드를 통해 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산의 부위-특이적 유도체화를 가능하게 한다. 특정 구체예에서, 1,2-디카르보닐 치환된 분자는 부위-특이적 방식으로 퀴녹살린 또는 페나진 유도체화된 폴리펩티드를 통해 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산의 부위-특이적 유도체화를 가능하게 하거나, 또는 1,2-아릴디아민 치환된 분자는 부위-특이적 방식으로 퀴녹살린 또는 페나진 유도체화된 폴리펩티드를 통해 1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산의 부위-특이적 유도체화를 가능하게 한다. 추가 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 분자의 제조 방법은 광범위한 부위 특이적 유도체화된 폴리펩티드에 대한 접근성을 제공한다. 다른 추가 구체예는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 작용기화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 합성하는 방법이다.

다른 측면은 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질의 제조 방법이다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질은 생합성적으로 생산된다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질은 화학적으로 생산된다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질은 생합성 및 화학 방법의 조합을 이용하여 생산된다. 다른 추가 구체예는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질의 제조 방법이다. 다른 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 단백질의 생체 내 번역 동안 부위-특이적으로 도입된다. 다른 추가 구체예에서, 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 비천연 아미노산은 단백질의 생체 내 번역 동안 부위-특이적으로 도입된다.

일 측면은 퀴녹살린 또는 페나진계 생성물을 생성하도록 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 반응물의 반응을 통해 단백질을 유도체화하는 방법이다. 이 측면에는 퀴녹살린 또는 페나진 유도체화된 단백질 부가물을 생성하기 위해 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 반응물의 반응을 기초로 하는 단백질의 유도체화 방법이 포함된다. 다른 추가 구체예는 1,2-아릴디아민 작용기화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 이용하여 1,2-디카르보닐 함유 단백질을 유도체화시키는 방법이다. 다른 추가 구체예는 1,2-디카르보닐 작용기화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 이용하여 1,2-아릴디아민 함유 단백질을 유도체화시키는 방법이다. 또 다른 구체예에서, 1,2-디카르보닐 및 1,2-아릴디아민 치환된 분자는 경우에 따라 단백질, 다른 중합체 및 소형 분자를 포함한다.

다른 측면은 각각 1,2-아릴디아민 또는 1,2-디카르보닐 함유 이작용성 링커를 이용하는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 화학적으로 유도체화하는 방법이다. 일 구체예는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 치환된 링커를 각각 1,2-아릴디아민 또는 1,2-디카르보닐 치환된 단백질에 부착시켜서 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 생성시키는 방법이다. 다른 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 이작용성 링커를 이용하여, 3차원 구조를 정밀하게 제어하고/하거나 부위-특이적으로 유도체화된다. 일 구체예에서, 이러한 방법은 분자 링커(이에 제한되는 것은 아니며 단작용성 링커, 이작용성 링커 및 다작용성 링커를 포함)를 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 부착시키는데 사용하며, 여기서 링커 말단의 하나 이상은 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성하도록, 각각 1,2-아릴디아민 또는 1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결된 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 기를 함유한다(분명하게, 두 조합은 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성시키기 위해 사용된다). 다른 추가 구체예에서, 이들 링커는 예를 들어, 단백질, 다른 중합체(분지형 및 비분지형) 및 소형 분자를 포함하는 다른 분자에 1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 연결시키기 위해 사용된다.

일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 결합된다. 일 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 일 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콘 분자는 이작용성 중합체이다. 일 구체예에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드와 동일하고, 다른 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드이다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 2 이상의 아미노산을 포함한다.

일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체에 대한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 친화력을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 수용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 숙주 세포에서 생산되는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 치환, 부가 또는 결실없는 아미노산 폴리펩티드에 대하여 프로테아제 내성, 혈청 반감기, 면역원성 및/또는 발현성을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역 작용제이다. 일 구체예에서, 작용제, 부분 작용제, 길항제, 부분 길항제 또는 역 작용제는 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함한다. 일 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 일 구체예에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 상응하는 수용체의 이량체화를 방해한다. 일 구체예에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 결합 파트너, 리간드 또는 수용체에 대한 폴리펩티드의 결합을 조절한다. 일 구체예에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 조절한다.

일 구체예에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 고유 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5염기 코돈 및 4염기 코돈으로 이루어진 군에서 선택된다.

또한 본 발명에서는 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조 방법을 기술한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 비천연 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 도입된 비천연 아미노산은, 20개의 통상의 아미노산 중 임의 아미노산에 대해 비반응성인 수용성 중합체에 대해 반응성이다. 일 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 상기 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니며 약 100 Da∼100,000 Da 이상을 포함하는 광범위한 범위이다. 상기 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니며, 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da. 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 약 1,000 Da, 약 900 Da, 약 800 Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 500 Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약 200 Da 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니며, 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,OOO Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da 및 약 1,000 Da을 포함하여, 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.

본 발명에서는 또한 본 발명에서 기술한 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체 및 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이고, 여기서 하나 이상의 아미노산은 비천연 아미노산으로 치환된다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 일 구체예에서, 수용성 중합체는 사카라이드 부분을 통해 폴리펩티드에 연결된다. 본 발명은 또한, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 프로드러그를 기술한다. 또한, 본 발명은 이러한 프로드러그 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사산물을 기술한다. 일 구체예에서, 대사산물은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성에 상보적이거나 상승적인 바람직한 활성을 갖는다. 또한, 본 발명은 이러한 대사산물을 필요로 하는 환자를 포함하여, 유기체에게 바람직한 대사산물을 제공하기 위한 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용도를 기술한다.

본 발명은 또한 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 기술한다. 일 구체예에서, 상기 세포는 폴리펩티드에 비천연 아미노산을 치환하기 위하여 오르쏘고날 RNA 합성효소(synthetase) 및/또는 오르쏘고날 tRNA를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 세포는 세포 배양물 중에 존재하거나, 아니면 다른 구체예에서, 세포는 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 포함하는 다세포 유기체의 일부이다. 세포 구체예 중 임의 구체예에서, 추가 구체예는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함한다. 다른 구체예는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하여 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생산하기 위해 본 발명에 기술한 비천연 아미노산을 활용하는 유기체이다. 다른 구체예는 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 유기체이다. 이러한 유기체는 양서류, 파충류, 조류 및 포유류를 포함하여, 단세포 및 다세포 유기체를 포함한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 시험관 내에서 생산된다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포 용해물에서 생산된다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 리보솜 번역으로 생산된다.

본 발명은 또한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 기술한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 폴리펩티드, 오르쏘고날 RNA 합성효소 및/또는 오르쏘고날 tRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산의 라이브러리 또는 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 본 발명에서 기술한 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리 또는 이의 조합 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 하나 이상의 비천연 아미노산, 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및/또는 하나 이상의 변형 비천연 아미노산을 함유하는 어레이를 기술한다. 본 발명은 또한 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 어레이를 기술한다. 일 구체예에서, 본 발명에서 기술하는 어레이는 유기체에서 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생산을 스크리닝하기 위해 사용한다(폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 검출하거나 또는 폴리펩티드의 번역을 검출하여).

본 발명은 또한 바람직한 활성에 대해 본 발명에서 기술한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법, 또는 본 발명에서 기술한 라이브러리를 스크리닝하기 위해 본 발명에서 기술한 어레이를 사용하는 방법, 또는 바람직한 활성에 대해 화합물 및/또는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 다른 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 기술한다. 또한, 본 발명은 치료 제제 자체뿐만 아니라, 신규한 치료 제제를 개발하고 발견하기 위해 라이브러리 스크리닝으로부터의 이러한 활성 데이타의 용도를 기술한다.

본 발명은 또한, 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형광 검출하기 위한 방법을 기술한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 페나진 및/또는 퀴녹살린 부분을 포함하는 아미노산 측쇄를 이용하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 페나진 및/또는 퀴녹살린 부분은 비천연 아미노산의 번역 후 변형을 통해 형성된다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산은 디카르보닐, 아릴디아민 또는 히드록실아민 측쇄를 갖는다. 추가 구체예에서, 페나진 및/또는 퀴녹살린 부분은 생체 내에서 형성되고, 다른 구체예에서, 페나진 및/또는 퀴녹살린 부분은 시험관 내에서 형성된다.

본 발명은 또한, 폴리펩티드의 치료적 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 기술한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 천연 발생 폴리펩티드 중 임의의 하나 이상의 아미노산을 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환시키는 단계 및/또는 상기 폴리펩티드를 수용성 중합체에 커플링시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 사용하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 기술한다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 커플링된다.

추가 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산, 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산, 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 및 페나진 함유 비천연 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 다른 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하기 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII의 아미노산에서 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화합물 1-12의 아미노산에서 선택된 하나 이상의 천연 아미노산을 포함한다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 최종 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 생체이용성이 증가된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 최종 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 안정성 프로파일이 증가된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 최종 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 수용해성이 증가된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 최종 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 치료적 반감기가 증가된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 최종 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 혈청 반감기가 증가된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 최종 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 순환 시간이 연장된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 얻어진 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 생물학적 활성이 조절된다.

추가의 또는 다른 구체예는 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고 상기 얻어진 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 면역원성이 조절된다.

본 발명에서 기술한 방법 및 조성물은 본 발명에서 기술한 특정 방법론, 프로토콜, 세포주 및 시약에 한정되지 않고 다양할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어는 특정 구체예를 기술하고자 하는 목적으로만 사용되며, 본 발명에서 기술한 방법 및 조성물의 범주를 제한하려는 의도가 아니고, 첨부된 청구항에 의해서만 제한된다.

본 발명 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형은 달리 언급하지 않으면 복수형을 포함하는 것이다.

달리 정의하지 않으면, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미이다. 본 발명에서 기술한 임의 방법, 장치 및 물질 또는 그 동등물을 여기서 기술하는 본 발명의 실시 또는 테스트에서 사용할 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질을 기술한다.

본 발명에서 기술한 공개물은 본 출원의 출원일 전에 개시된 것만을 제공한다. 본 발명에 기술한 발명자는 이전 발명에 의하여 또는 다른 어떠한 이유로 이러한 공개물을 앞선다는 것을 용인하려는 것이 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "친화성 표지"는 또 다른 분자에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합하여, 상기 또 다른 분자를 변형시키거나, 파괴하거나, 상기 또 다른 분자와 함께 화합물을 형성하는 표지를 말한다. 예를 들어, 친화성 표지는 효소 및 이의 기질, 또는 항체 및 이의 항원을 포함한다.

용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 이들의 통상적인 의미로 사용되고, 각각 산소 원자, 아미노 기, 황 원자를 통해 분자에 연결된 알킬 기를 말한다.

그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 경우에 따라 완전 포화, 단-포화 또는 다-포화되는 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합물을 의미하며, 표시된 수의 탄소 원자를 가진 (즉, C₁-C₁₀은 1 내지 10개의 탄소를 의미함) 2가 또는 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 상동체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 불포화 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가진 알킬 기이다. 불포화 알킬 기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐, 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 상동체 및 이성질체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 하기에 보다 상세히 정의된 알킬의 유도체들 예컨대, "헤테로알킬", "할로알킬" 및 "동종알킬"을 포함한다.

그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "알킬렌"은, (-CH₂-)_m으로 예시된 바와 같은 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 이때 n은 1 내지 약 24일 수 있다. 예를 들면, 이러한 기로는 10개 이하의 탄소 원자를 가진 기 예컨대, 식 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 가진 보다 짧은 쇄의 알킬 또는 알킬렌 기이다. 용어 "알킬렌"은, 달리 명시하지 않은 한, "헤테로 알킬렌"으로서 본 발명에서 기재한 기들도 포함한다.

용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비천연 발생 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 공통된 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 피로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기를 가진 화합물, 예를 들면 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 경우에 따라 변형 R 기 (예를 들면, 노르류신) 또는 경우에 따라 변형 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 유사체의 비제한적 예로는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄이 있다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상적으로 공지된 3-문자 또는 1-문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 통상적으로 허용되는 1-문자 코드로 지칭될 수 있다.

"아미노 말단 변형 기"는 말단 아민 기에 부착될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 예를 들면, 이러한 말단 아민 기는 경우에 따라 중합체성 분자의 말단에 존재할 수 있고, 이때 이러한 중합체성 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리사카라이드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 말단 변형 기로는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질이 포함된다. 예를 들면, 말단 변형 기로는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민이 포함된다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는, 중합체성 분자의 치료적 특징을 개질시키는 데 사용될 수 있다.

"항체 단편"은 전장 형태 이외의 항체의 임의의 형태를 의미한다. 본 명세서에서 항체 단편은 전장 항체 내에 존재하는 보다 작은 성분인 항체 및 개조된 항체를 포함한다. 항체 단편으로는 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')₂, 단쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변성 영역, 골격 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄 및 가변 영역, 및 대안적 스캐폴드 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다(Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). 또 다른 작용성 하위구조(substructure)는 펩티드 링커로 공유결합되어 있는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄로 이루어진 가변 영역으로 구성된 단쇄 Fv(scFv)이다(S-z Hu et al, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061). 이들 작은(Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드 내의 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하며, 보다 큰 항원-특이적 분자에 대한 편리한 구축 블록을 제공할 수 있다. 달리 구체적으로 명시하지 않은 한, 용어 "항체" 또는 "항체들"을 사용하는 문장 및 청구범위는 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "방향족" 또는 "아릴"은 접합된 pi 전자 시스템을 가진 하나 이상의 고리를 가진 폐쇄된 고리 구조를 지칭하며, 카르보시클릭 아릴 및 헤테로시클릭 아릴(또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기 둘다를 포함한다. 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 기는 5 내지 20개의 고리 원자를 함유할 수 있다. 상기 용어는 1환 고리가 공유결합된 또는 융합된 고리인 다환(즉, 인접하는 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다. 방향족 기는 비치환되거나 치환될 수 있다. "방향족" 또는 "아릴" 기의 비제한적 예로는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 안트라세닐 및 펜안트라세닐이 있다. 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환기들은 하기 허용가능한 치환기들로 구성된 군으로부터 선택된다.

간략하게, 다른 용어들(아릴옥시, 아릴티옥시, 아르알킬을 포함하나 이들로 한정되지 않는)과 함께 사용될 때 용어 "방향족" 또는 "아릴"은 상기 정의한 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘다를 포함한다. 따라서, 용어 "아르알킬" 또는 "알크아릴"은 탄소 원자(메틸렌 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)가 헤테로원자 예를 들어, 산소 원자로 치환된 알킬 기를 포함하는 알킬 기에 아릴 기가 부착된 라디칼(벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 의미한다. 이러한 아릴 기의 예로는 펜옥시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "아릴렌"은 2가 아릴 라디칼을 의미한다. "아릴렌"의 비제한적인 예는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 및 티오페닐렌을 포함한다. 아릴렌 기에 대한 치환기는 본 발명에서 허용되는 치환기의 군에서 선택된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "하나 이상의 아미노산"은 단일 아미노산, 다수의 아미노산, 올리고펩티드, 아미노산 이량체, 아미노산 삼량체, 아미노산 사량체, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 아미노산의 임의의 다른 연결쇄를 의미한다.

용어 "하나 이상의 당 기"는 단일 당 기, 다수의 당 기, 올리고사카라이드, 사카라이드 이량체, 사카라이드 삼량체, 사카라이드 사량체, 폴리사카라이드 또는 당 기의 다른 임의의 연결쇄를 의미한다.

용어 "하나 이상의 뉴클레오티드"는 단일 뉴클레오티드, 다수의 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 이량체, 뉴클레오티드 삼량체, 뉴클레오티드 사량체, 폴리뉴클레오티드, 핵산, RNA, DNA 또는 뉴클레오티드의 임의의 다른 연결쇄를 의미한다.

"이작용성 링커"로도 지칭되는 "이작용성 중합체"는 다른 부분과 특이적으로 반응하여 공유결합 또는 비-공유결합을 형성할 수 있는 2개의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이러한 부분으로는 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이러한 천연 또는 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드 상의 측쇄가 있을 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 이작용성 링커는 제1 펩티드 상의 기와 반응하는 작용성 기, 및 제2 펩티드 상의 기와 반응하는 또 다른 작용성 기를 가짐으로써, 제1 펩티드, 이작용성 링커 및 제2 펩티드를 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 다양한 화합물을 펩티드에 부착시키기 위한 많은 방법 및 링커 분자가 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명에 참고로 도입되는 유럽 특허출원 제188,256호; 미국특허 제4,671,958호; 미국특허 제4,659,839호; 미국특허 제4,414,148호; 미국특허 제4,699,784호; 미국특허 제4,680,338호; 및 미국특허 제4,569,789호를 참조한다. "다작용성 링커"로도 지칭되는 "다작용성 중합체"는 다른 부분과 특이적으로 반응할 수 있는 2개 이상의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이러한 부분으로는 공유결합 또는 비-공유결합을 형성하는, 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이러한 천연 또는 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드 상의 측 기(아미노산 측 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)가 있을 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 경우에 따라 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있고, 경우에 따라 화합물에 연결된 하나 이상의 분자와 그가 결합하는 분자 또는 상기 화합물 사이에 특정한 소정의 공간 또는 입체구조를 제공하도록 선택될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생체이용성"은 물질 또는 그의 활성 부분이 약학적 제형으로부터 전달되고 작용 부위 또는 일반 순환에서 이용가능하게 될 수 있는 속도 및 정도를 지칭한다. 생체이용성의 증가는 물질 또는 그의 활성 부분이 약학적 제형으로부터 전달되고 작용 부위 또는 일반 순환에서 이용가능하게 될 수 있는 속도 및 정도가 증가됨을 의미한다. 예를 들어, 생체이용성 증가는 다른 물질 또는 활성 부분과 비교시에 혈액에서 물질 또는 이의 활성 부분의 농도 증가로서 나타낸다. 생체이용성 증가를 평가하는 방법의 비제한적인 예는 실시예 22-26에 기술하였다. 이 방법은 경우에 따라서 임의 폴리펩티드의 생체이용성을 평가하는데 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존(transposon), 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이들로 한정되지 않는 유기체에 관한 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물에서 질환을 진단하거나, 치유하거나, 완화하거나, 치료하거나, 예방하기 위한, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 복지를 증가시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예에는 펩티드, 단백질, 효소, 소형 분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성핵종(radionuclide), 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포솜, 마이크로입자 및 미셀이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류에는 약물, 프로드러그, 방사성핵종, 조영제(imaging agent), 중합체, 항생제, 진균제, 항바이러스제, 소염제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물로부터 유래된 독소 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

"생물학적 활성 조절"은 폴리펩티드의 반응성을 증가 또는 감소시키거나, 폴리펩티드의 선택성을 변경시키거나, 폴리펩티드의 물질 선택성을 증강 또는 감소시키는 것을 의미한다. 변형된 생물학적 활성에 대한 분석은 경우에 따라서, 천연 폴리펩티드에 대하여 비천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 비교하여 수행한다.

본 명세서에 사용된 용어 "생물질"은 생물반응기 및/또는 재조합 방법 및 기법으로부터 수득된 물질을 포함하나 이로 한정되지 않는 생물학적 유래의 물질을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "생물리적 프로브"는 분자에서의 구조적 변화를 검출하거나 모니터링할 수 있는 프로브를 지칭한다. 이러한 분자로는 단백질이 있으나, 이로 한정되지 않고, "생물리적 프로브"는 경우에 따라 단백질과 다른 거대분자의 상호작용을 검출하거나 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 생물리적 프로브의 예로는 스핀-표지, 형광단 및 광활성화성 기가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 "생합성적"은 하나 이상의 하기 화합물; 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보솜의 이용을 포함하는, 번역계(세포 또는 비세포)를 활용하는 임의 방법을 의미한다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 섹션 "비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생성"에서 기술한 방법 및 기술을 이용하여 비천연 아미노산 폴리펩티드에 "생합성적"으로 도입시킨다.

본 명세서에서 사용되는, "비오틴 모사체"로도 지칭되는 용어 "비오틴 유사체"는 아비딘 및/또는 스트렙타비딘에 대한 높은 친화성을 가지면서 결합하는, 비오틴 이외의 임의의 분자이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "카르보닐"은 이에 제한되는 것은 아니며, 하나 이상의 케톤기, 및/또는 하나 이상의 알데히드 기, 및/또는 하나 이상의 에스테르 기, 및/또는 하나 이상의 카르복실산기를 함유하는 군을 포함하여, -C(O)-, S(O)-, -S(O)₂- 및 -C(S)-로 이루어진 군에서 선택된 부분을 함유하는 기를 의미한다. 이러한 카르보닐 기는 케톤, 알데히드, 카르복실산, 에스테르 및 티오에스테르를 포함한다. 또한, 이러한 기는 경우에 따라 선형, 분지형 또는 환형 분자의 일부이다.

"카르복시 말단 변형 기"는 말단 카르복시 기에 부착될 수 있는 임의의 분자를 말한다. 예를 들면, 이러한 말단 카르복시 기는 경우에 따라 중합체성 분자의 말단에 존재할 수 있고, 이때 이러한 중합체성 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 폴리사카라이드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 말단 변형 기로는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질이 있다. 예를 들면, 말단 변형 기로는 폴리에틸렌 글리콜 또는 혈청 알부민이 있다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는, 중합체성 분자의 치료적 특징을 개질시키는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "화학적 불활성 기"로도 지칭되는 용어 "화학적 절단성 기"는 산, 염기, 산화제, 환원제, 화학적 개시제 또는 라디칼 개시제에의 노출 시 깨지거나 절단되는 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "화학발광 기"는 열을 가하지 않은 상태에서 화학적 반응의 결과로서 광을 방출 기를 지칭한다. 예를 들면, 루미놀(5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온)은 염기 및 금속 촉매의 존재 하에 과산화수소(H₂O₂)와 같은 산화물과 반응하여 여기된 상태의 생성물(3-아미노프탈레이트, 3-APA)을 생성한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발색단"은 가시광선 파장, UV 파장 또는 IR 파장의 광을 흡수하는 분자를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "보조인자"는 큰 분자의 작용에 필수적인 원자 또는 분자를 지칭한다. 보조인자로는 무기 이온, 보조효소(coenzyme), 또는 효소의 활성에 필요한 몇몇 다른 인자들이 있나 이들로 한정되지 않는다. 예로는 헤모글로빈 중의 헴(heme), 클로로필 중의 마그네슘 및 단백질에 대한 금속 이온이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "코폴딩(cofolding)"은 서로 상호작용하는 2개 이상의 분자를 사용하며 언폴딩된(unfolded) 또는 부적절하게 폴딩된(folded) 분자를 적절하게 폴딩된 분자로 변환시키는 리폴딩(refolding) 과정, 반응 또는 방법을 지칭한다. 예를 들면, "코폴딩"은 서로 상호작용하며 언폴딩된 (또는 부적절하게 폴딩된) 폴리펩티드를 적절하게 폴딩된 천연 폴리펩티드로 변환시키는 2개 이상의 폴리펩티드를 사용한다. 이러한 폴리펩티드는 경우에 따라 천연 아미노산 및/또는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "비교 창"은 두 서열을 최적 배열한 후 인접하는 위치의 동일수의 기준 서열과 서열을 비교하기 위해 사용되는 인접 위치 중 어느 하나의 분절을 의미한다. 이러한 인접 위치는 약 50 내지 약 200 연속 단위, 및 약 100 내지 약 150 연속 단위를 포함하는, 약 20 내지 약 600개의 연속 단위로 이루어진 군을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 이러한 서열은 이에 제한되는 것은 아니며 천연 및 비천연 아미노산을 포함하는 연속 단위를 갖는, 폴리펩티드 및 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 예를 들어, 이러한 서열은 상응하는 연속 단위인 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 비교를 위한 서열의 배열 방법은 이에 제한되는 것은 아니며 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c]의 국소(local) 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85; 2444]의 유사성 스크리닝 방법, 이들 알고리즘([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 실행, 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, % 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘은 각각 문헌[Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402] 및 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어길이(wordlength; W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 3 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 전형적으로, BLAST 알고리즘은 턴 오프된(turned off) "낮은 복잡도(low complexity)" 필터를 사용하여 수행한다.

또한, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다(예를 들면, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 기준은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치(match)가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대해 시험 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

"보존적 변형 변이체"는 천연 및 비천연 아미노산, 천연 및 비천연 핵산 서열 및 이들의 조합물에 적용된다. 특정한 핵산 서열에 대해, "보존적 변형 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 천연 및 비천연 아미노산 서열을 코딩하는 천연 및 비천연 핵산을 지칭하거나, 천연 및 비천연 핵산이 천연 및 비천연 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 한 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 전술한 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적 변형 변이의 한 종류인 "침묵 변이(silent variation)"이다. 따라서, 본 명세서에서 천연 및 비천연 폴리펩티드를 코딩하는 모든 천연 및 비천연 핵산 서열은 천연 및 비천연 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 천연 및 비천연 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 경우에 따라 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 천연 및 비천연 폴리펩티드를 코딩하는 천연 및 비천연 핵산의 각각의 침묵 변이는 기재된 각각의 서열에 내포되어 있다.

아미노산 서열의 경우, 단일 천연 및 비천연 아미노산 또는 코딩된 서열 내의 적은 비율의 천연 및 비천연 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가는 아미노산의 결실, 아미노산의 부가 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로의 천연 및 비천연 아미노산의 치환이 발생된 경우, "보존적 변형 변이체"이다. 과학 문헌에서 입수가능한 보존 치환표는 기능적으로 유사한 천연 아미노산을 제공한다. 이러한 보존적 변형 변이체는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자 이외의 것이나, 이들을 배제하지 않는다. 하기 8개의 군 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라진(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M).

(예를 들면, 문헌 [Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)

그 자체로서 또는 다른 용어와 함께 사용되는 용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은, 달리 명시되지 않은 한, "알킬" 및 "헤테로알킬" 각각의 환형 버젼을 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화 및 불포화 고리 결합을 포함한다. 추가로, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 예를 들어, 헤테로시클이 분자의 나머지 부분에 부착된 위치를 차지하게 된다. 시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 상기 용어는 2환 및 3환 고리 구조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다환 구조를 포함한다. 유사하게, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 그 자체로서 또는 또 다른 치환기의 일부로서 용어 "시클로알킬렌"은 시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "시클로덱스트린"은 고리 형성에 있어서 6개 내지 8개 이상의 글루코즈 분자로 구성된 환형 탄수화물을 지칭한다. 고리의 외부 부분은 수용성 기를 함유하고, 고리의 중심에는 소형 분자를 수용할 수 있는, 비교적 비극성을 나타내는 캐비티(cavity)가 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성"은 세포에게 유해한 화합물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 "변성화제(denaturing agent)" 또는 "변성제(denaturant)"는 중합체의 가역적 언폴딩을 야기할 임의의 화합물 또는 물질로서 정의된다. 예를 들어, "변성화제" 또는 "변성제"는 단백질의 가역적 언폴딩을 초래할 수 있다. 변성화제 또는 변성제의 강도는 구체적인 변성화제 또는 변성제의 성질 및 농도 둘다에 의해 결정될 것이다. 예컨대, 변성화제 또는 변성제는 카오트로프(chaotrope), 세제, 유기 용매, 수 혼화성 용매, 인지질, 또는 이들의 조합물일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 카오트로프의 비제한적 예로는 우레아, 구아니딘 및 나트륨 티오시아네이트가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 세제의 비제한적 예로는 나트륨 도데실 설페이트, 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대, 트윈 또는 트리톤 세제), 사르코실(Sarkosyl)과 같은 강한 세제, 약한 비-이온성 세제(예컨대, 디지토닌), 약한 양이온성 세제 예컨대, N->2,3-(디올레이옥시(Dioleyoxy))-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 약한 이온성 세제(예컨대, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트), 또는 설포베테인(쯔비터전트), 3-(3-클로르아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트(CHAPS) 및 3-(3-클로로아미도프로필)디메틸암모니오-2-히드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 쯔비터이온성 세제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 변성제로서 사용될 수 있는 유기 수 혼화성 용매의 비제한적 예로는 아세토니트릴, 저급 알칸올(특히, C₂-C₄ 알칸올 예컨대, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히, C₂-C₄ 알칸디올 예컨대, 에틸렌-글리콜)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 인지질의 비제한적 예로는 천연 발생 인지질 예컨대, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체 예컨대, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "검출가능 표지"는 형광, 화학발광, 전자-스핀 공명, 자외선/가시광선 흡수 분광법, 질량 분광측정법, 핵 자기 공명, 자기 공명 및 전기화학적 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 분석 기법을 이용하여 관찰할 수 있는 표지를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "디카르보닐"은 1,2-디카르보닐 기, 1,3-디카르보닐 기 및 1,4-디카르보닐 기; 및 하나 이상의 케톤 기, 및/또는 하나 이상의 카르복시 기, 및/또는 하나 이상의 에스테르 기, 및/또는 하나 이상의 카르복실산 기, 및/또는 하나 이상의 티오에스테르 기를 함유하는 기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 -C(O)-, -S(O)-, -S(O)₂- 및 -C(S)-로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 부분을 함유하는 기를 지칭한다. 이러한 디카르보닐 기로는 디케톤, 케토알데히드, 케토산, 케토에스테르 및 케토티오에스테르가 있다. 또한, 이러한 기는 직쇄, 분지형 또는 환형 분자의 일부일 수 있다. 디카르보닐 기의 2부분은 동일하거나 상이하고, 경우에 따라 예를 들어, 에스테르, 케톤, 알데히드, 티오에스테르 또는 아미드를 생성하는 치환기를 2부분 양쪽에 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "1,2-디카르보닐 동등물" 또는 "1,2-디카르보닐에 대한 동등물"은 1,2-치환 패턴으로 위치한 2 이상의 부분을 함유하는 기를 의미하는 것으로서, 여기서 상기 부분 중 하나 또는 둘 모두는 카르보닐 기 이외의 기로 치환되지만, 여전히 1,2-아릴디아민과 반응하여 퀴녹살린 또는 페나진 기를 형성한다. 1,2-디카르보닐 동등물의 비제한적 예는 1,1-디브로모-2-옥소 기이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약물"은 질환 또는 증상의 예방, 진단, 경감, 치료 또는 치유에 사용되는 임의의 물질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "염료"는 발색단을 함유하는 가용성 착색 물질을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 치료할 질환 또는 증상의 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 경감시키는, 투여될 물질 또는 화합물의 충분한 양을 지칭한다. 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 경감 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 예를 들면, 투여될 물질 또는 화합물로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 경우에 따라 예방, 증강 및/또는 치료 처치를 위해 투여될 수 있다. 임의의 개개의 경우에서 적절한 "유효량"은 투여량 상승 연구와 같은 기법을 이용하여 결정할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "전자 밀집 기"는 전자 빔을 조사한 경우 전자를 산란시키는 기를 지칭한다. 이러한 기로는 암모늄 몰리브데이트, 비스무쓰 서브니트레이트 캐드뮴 요오다이드, 99% 카르보히드라지드, 염화철(II) 헥사히드레이트, 헥사메틸렌 테트라민, 98.5% 인듐 트리클로라이드 무수물, 란타늄 니트레이트, 납 아세테이트 트리히드레이트, 납 시트레이트 트리히드레이트, 납 니트레이트, 과요오드산, 포스포몰리브드산, 포스포텅스트산, 칼륨 페리시아니드, 칼륨 페로시아니드, 루테늄 레드, 실버 니트레이트, 실버 프로테이네이트(Ag 분석: 8.0-8.5%) "강한", 실버 테트라페닐포핀(S-TPPS), 나트륨 클로로아우레이트, 나트륨 텅스테이트, 탈륨 니트레이트, 티오세미카르바지드(TSC), 우라닐 아세테이트, 우라닐 니트레이트 및 바나딜 설페이트가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "에너지 전달제"는 또 다른 분자에 에너지를 줄 수 있거나 또 다른 분자로부터 에너지를 받을 수 있는 분자를 지칭한다. 예를 들면, 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 형광 공여 분자의 여기 상태 에너지가 여기되지 않은 수용 분자에 비방사적으로 전달되고, 이 수용 분자가 더 긴 파장에서 공여된 에너지를 형광적으로 방사하는 쌍극자-쌍극자 커플링 과정이다.

용어 "증강시키다" 또는 "증강"은 원하는 효과의 효능 또는 지속 기간을 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제의 효과를 증강시키는 것은 질환, 질병 또는 병태의 치료 과정 동안 치료제의 효과를 효능 또는 지속 기간 면에서 증가시키거나 연장시키는 능력을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "증강-유효량"은 질환, 질병 또는 병태의 치료에 있어서 치료제의 효과를 증강시키는 데 적합한 양을 지칭한다. 환자에게 사용되는 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 질환, 질병 또는 병태의 심각도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 달려 있을 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "진핵생물"은 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 섬모충, 식물(외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충 및 원생생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 계통발생적 도메인 진핵생물류(Eucarya)에 속하는 유기체를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "지방산"은 약 C₆ 또는 더 긴 탄화수소 측쇄를 가진 카르복실산을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형광단"은 여기 시 광자를 방사함으로써 형광을 나타내는 분자를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈 기", "반응성 부분", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"은 화학 반응이 일어나는 분자의 부분 또는 단위체를 지칭한다. 상기 용어들은 화학 분야에서 어느 정도 동의어이고 몇몇 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자와 반응하는 분자의 일부를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

용어 "할로겐"은 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "할로아실"은 -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 할로겐 부분을 함유하는 아실 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "할로알킬"은 -CF₃ 및 -CH₂CF₃ 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 할로겐 부분을 함유하는 알킬 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로알킬"은 O, N, Si 및 S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자 및 알킬 기로 구성된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합물을 지칭하며, 이때 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 경우에 따라 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 경우에 따라 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 존재할 수 있거나, 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 존재할 수 있다. 예로는 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃, 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃과 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속적으로 존재할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로알킬렌"은 -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-에 의해 예시된 바와 같은 (그러나, 이들로 한정되지 않음) 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자가 경우에 따라 쇄의 말단 중 하나 또는 쇄의 말단 양쪽에 존재할 수도 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않음). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합 기의 경우, 결합 기의 배향은 결합 기의 화학식이 기재된 방향에 의해 전혀 암시되지 않는다. 예를 들면, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'- 및 -R'C(O)₂- 둘다를 표시한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 아릴 기를 지칭하며, 이때 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화되어 있고, 상기 질소 원자(들)은 경우에 따라 4급화될 수 있다. 헤테로아릴 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 헤테로아릴 기는 경우에 따라 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 헤테로아릴 기의 비제한적 예로는 페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "호모알킬"은 탄화수소 기인 알킬 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "동일한"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열(subsequence)을 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은, 비교 알고리즘을 사용하여 측정할 때 또는 수동 정렬 및 육안 조사로 측정할 때, 비교 창, 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응에 대해 비교하고 정렬한 경우 일정 %의 동일한 서열 단위체를 가진 2개 이상의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 2개 이상의 서열은 서열 단위체가 특정한 영역에 걸쳐 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일"할 수 있다. 이러한 %는 2개 이상의 서열의 "% 동일성"을 기술하기 위한 것이다. 서열의 동일성은 약 75 내지 100개 이상의 서열 단위체 길이를 가진 영역, 약 50개 서열 단위체 길이를 가진 영역, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 또한, 이 정의는 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 예를 들면, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 동일할 때 동일한 반면, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 특정한 영역에 걸쳐 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일"하다. 동일성은 약 75 내지 100개 이상의 아미노산 길이를 가진 영역, 약 50개 아미노산 길이를 가진 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리펩티드 서열의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 또한, 예를 들면, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 동일할 때 동일한 반면, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 특정한 영역에 걸쳐 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일"하다. 동일성은 약 75 내지 100개 이상의 핵산 길이를 가진 영역, 약 50개 핵산 길이를 가진 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.

서열 비교 시, 전형적으로 한 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이 기준 서열과 시험 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 시험 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 하위서열 배위가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트(Default) 프로그램 매개변수를 사용하거나, 대체가능한 매개변수를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수를 기초로 기준 서열에 대한 시험 서열의 % 서열 동일성을 계산한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "면역원성"은 치료 약물의 투여에 대한 항체 반응을 의미한다. 치료적 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성은 생물학적 유체 중 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 검출을 위한 정량 및 정성 분석을 이용하여 얻는다. 이러한 분석은 방사성면역분석(RIA), 효소-연결된 면역흡착제 분석(ELISA), 발광 면역분석(LIA) 및 형광 면역분석(FIA)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료적 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성 분석은 치료적 천연 아미노산 폴리펩티드의 투여시 항체 반응과 치료적 비천연 아미노산 폴리펩티드의 투여시 항체 반응을 비교하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인터컬레이팅 기"로도 지칭되는 용어 "인터컬레이팅제"는 한 분자의 분자내 공간 또는 분자들 사이의 분자간 공간 내로 삽입될 수 있는 화학적 기를 지칭한다. 예를 들면, 인터컬레이팅제 또는 인터컬레이팅 기는 DNA 이중 나선의 적층 염기 내로 삽입되는 분자일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "단리된"은 원하는 성분을 원하지 않는 성분들로부터 분리하고 제거하는 것을 지칭한다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 수용액을 포함하나 이로 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 단리된 성분은 균질한 상태일 수 있거나, 단리된 성분은 추가의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 일부일 수 있다. 순도 및 균질성은 분석 화학 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 원하는 성분이 단리되고 제제 중에 존재하는 우세한 종인 경우, 상기 성분은 본 명세서에서 실질적으로 정제되었다고 기술된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "정제된"은 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인 원하는 성분을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 핵산 또는 단백질은 이러한 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합되어 있는 세포 성분들 중 적어도 일부를 실질적으로 갖지 않거나, 핵산 또는 단백질이 그의 생체 내 또는 시험관 내 제조의 농축물보다 더 높은 수준으로 농축된 경우 "단리된"다. 예를 들면, 유전자는 상기 유전자를 플랭킹하며 원하는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리되어 있을 때 단리되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "표지"는 화합물 내로 도입되고 용이하게 검출됨으로써 그의 물리적 분포가 검출될 수 있고/있거나 모니터링될 수 있는 물질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "연결(linkage)"은 링커의 작용기와 또 다른 분자 사이의 화학 반응으로부터 형성된 결합 또는 화학적 부분을 지칭한다. 이러한 결합으로는 공유결합 및 비-공유결합이 있을 수 있으나 이들로 한정되지 않는 반면, 이러한 화학적 부분은 에스테르, 카르보네이트, 이민 포스페이트 에스테르, 히드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩티드 연결 및 올리고뉴클레오티드 연결이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 가수분해적으로 안정한 연결은 연결이 물 중에서 실질적으로 안정하고 연장된 기간 동안, 아마도 심지어 무한한 기간 동안 생리학적 조건을 포함하나 이로 한정되지 않는 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는다. 가수분해적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결은 연결이 물 중에서 또는 예를 들면, 혈액을 포함하는 수용액 중에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결은 연결이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 내에서 분해가능한 연결을 포함할 수 있거나, 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기 내에서 불안정한 연결을 포함할 수 있다. 이러한 분해가능한 연결로는 생물학적 활성제 상의 알콜과 PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산의 반응에 의해 형성된 에스테르 연결이 있으나 이로 한정되지 않는데, 이때 이러한 에스테르 기는 생리학적 조건 하에서 일반적으로 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 불안정한 연결로는 카보네이트 연결; 아민과 알데히드의 반응으로부터 생성된 이민 연결; 알콜과 포스페이트 기를 반응시켜 형성한 포스페이트 에스테르 연결; 히드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 연결; 알데히드와 알콜의 반응 생성물인 아세탈 연결; 포르메이트와 알콜의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결; PEG와 같은 중합체의 말단에 존재하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는 아민 기 및 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 연결; 및 중합체의 말단에 존재하는 것을 포함하나 이로 한정되지 않는 포스포르아미다이트 기 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 연결이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "배지"는 세포, 및/또는 이러한 세포에 의해 발현되고/되거나 분비된 생성물을 성장시키고 회수하는 데 사용되는 임의의 배양 배지를 지칭한다. 이러한 "배지"는 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 이.콜라이 또는 슈도모나스 숙주 세포를 포함하는 임의의 숙주 세포 및 세포 내용물을 지지할 수 있거나 함유할 수 있는 용액, 고체, 반-고체 또는 강성 지지체를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "배지"는 숙주 세포가 성장되어 있는 배지 예를 들어, 증식 단계 전 또는 후의 배지를 비롯한, 폴리펩티드가 분비되어 있는 배지를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 "배지"는 예를 들어, 세포 내에서 폴리펩티드가 생성되고 숙주 세포가 용해되거나 파괴되어 상기 폴리펩티드를 방출하는 경우 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충제 또는 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "대사산물"은 화합물, 예를 들어 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사되는 경우 형성된 화합물, 예를 들어 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체를 지칭한다. 용어 "약학적 활성 대사산물" 또는 "활성 대사산물"은 화합물, 예를 들어 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사되는 경우 형성된 화합물, 예를 들어 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성 유도체를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "대사된"은 특정 물질이 유기체에 의해 변화되는 총체적인 과정을 지칭한다. 이러한 과정으로는 가수분해 반응 및 효소에 의해 촉진되는 반응이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 대사에 대한 추가 정보는 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 입수할 수 있다. 예를 들면, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사산물은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 숙주에게 투여하고 숙주로부터 얻은 조직 샘플을 분석함으로써 확인할 수 있거나, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 시험관 내에서 간 세포와 함께 항온처리하고 생성된 화합물들을 분석함으로써 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "금속 킬레이터"는 금속 이온과의 금속 착물을 형성하는 분자를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 분자는 중심 금속 이온과 2개 이상의 배위 결합을 형성할 수 있고 고리 구조를 형성할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "금속-함유 부분"은 금속 이온, 원자 또는 입자를 함유하는 기를 지칭한다. 이러한 부분로는 시스플라틴, 킬레이팅된 금속 이온(예컨대, 니켈, 철 및 백금), 및 금속 나노입자(예컨대, 니켈, 철 및 백금)가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "중원자 도입 부분"은 통상적으로 탄소보다 더 무거운 원자의 이온을 도입하는 기를 지칭한다. 이러한 이온 또는 원자로는 규소, 텅스턴, 금, 납 및 우라늄이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "변형"은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드에게 가해진 변화의 존재를 지칭한다. 이러한 변화 또는 변형은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성 후 변형, 또는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 후 변형에 의해 얻어질 수 있다. "변형 또는 비변형"의 형태로 사용되는 용어는 논의되는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 경우에 따라 변형되는 것, 즉 논의되는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 경우에 따라 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "조절된 혈청 반감기"는 비변형 형태와 비교할 때 변형 생물학적 활성 분자의 순환 반감기에서의 양(positive)의 또는 음(negative)의 변화를 지칭한다. 예를 들면, 변형 생물학적 활성 분자로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 혈청 반감기는 생물학적 활성 분자 또는 변형 생물학적 활성 분자의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하여 각 샘플 중의 해당 분자의 농도를 결정함으로써 측정한다. 혈청 농도와 시간의 상관관계는 혈청 반감기의 계산을 가능하게 한다. 예를 들면, 조절된 혈청 반감기는 개선된 투여 섭생법을 가능하게 할 수 있거나 독성 효과를 피하게 할 수 있는, 혈청 반감기에서의 증가일 수 있다. 혈청에서의 이러한 증가는 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상일 수 있다. 이 방법은 경우에 따라 임의 폴리펩티드의 혈청 반감기를 평가하는데 사용한다.

본 명세서에 사용된 용어 "조절된 치료 반감기"는 비변형 형태와 비교할 때 치료 유효량의 변형 생물학적 활성 분자의 반감기에서의 양의 또는 음의 변화를 의미한다. 예를 들면, 변형 생물학적 활성 분자로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 치료 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 및/또는 약력학적 성질 및/또는 치료 효과를 측정함으로써 측정한다. 증가된 치료 반감기는 유리한 특정 투여 섭생법 또는 유리한 특정 총 투여량을 허용할 수 있게 하거나, 원치않는 효과를 피할 수 있게 한다. 예를 들면, 증가된 치료 반감기는 증가된 효능, 변형 분자와 그의 표적의 증가된 또는 감소된 결합, 비변형 분자의 또 다른 매개변수 또는 작용 기작의 증가 또는 감소, 예를 들어, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 증가된 또는 감소된 분해로부터 비롯될 수 있다. 이 방법은 경우에 임의 폴리펩티드의 치료적 반감기를 평가하는데 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "나노입자"는 입자 크기가 약 500 nm 내지 약 1 nm인 입자를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "화학양론에 근접하는"은 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰 비가 비천연 아미노산 폴리펩티드의 방향족 아민 측쇄 상의 수소의 수에 비해 약 0.75 내지 약 1.5인 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비-진핵생물"은 비-진핵 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비-진핵생물 유기체는 진정세균(Eubacteria)[에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 써머스 써모필러스(thermus thermophilus), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 포함하나 이로 한정되지 않음] 계통발생적 도메인, 또는 고세균(Archaea)[메타노코커스 잔나스키(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 아키오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 애우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 또는 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들면 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC -1을 포함하나 이로 한정되지 않음] 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.

"비천연 아미노산"은 20종의 공통된 아미노산 중 하나, 피로라이신(pyrrolysine) 또는 셀레노시스테인(selenocysteine)이 아닌 아미노산을 말한다. 다른 동의어는 "비천연적으로 코딩된 아미노산", "비천연 아미노산", "비천연 발생 아미노산" 및 하이픈으로 연결된 이들의 다양한 버젼 및 하이픈으로 연결되지 않은 이들의 다양한 버젼이다. 용어 "비천연 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 공통된 아미노산 또는 피로라이신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)의 변형에 의해 천연적으로 발생되지만 그 자체가 번역 복합체(translation complex)에 의해 성장 폴리펩티드 쇄 내로 도입되지 않는 아미노산을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 천연적으로 코딩되지 않는 천연-발생 아미노산의 예로는 N-아세틸글루코즈아미닐-L-세린, N-아세틸글루코즈아미닐-L-쓰레오닌 및 O-포스포티로신이 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 용어 "비천연 아미노산"에는 천연적으로 발생되지 않고 합성에 의해 수득될 수 있거나 비천연 아미노산의 변형에 의해 수득될 수 있는 아미노산이 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 핵산 및 핵산 중합체로는 (i) 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체; (ii) 안티센스 기법에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)인 PNA(펩티도핵산)를 포함하는(이에 제한되지 않음) 올리고뉴클레오티드 유사체; (iii) 그의 보존적 변형 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 상보적 서열, 및 명시적으로 표시된 서열이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선별된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); and Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)] 참조).

본 명세서에서 사용된 용어 "산화제"는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 예를 들면, 산화제로는 산화된 글루타치온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오쓰레이톨, 산화된 에리쓰레이톨 및 산소가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 이에 제한되는 것은 아니며, 화합물의 생물학적 활성이나 특성을 폐기시키지 않고 비교적 비독성인 염, 담체 또는 희석제(이에 제한되지 않음) 등을 포함하는 물질을 의미하는데, 이 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나 또는 이를 함유하는 조성물의 임의 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "광친화성 표지"는 광에의 노출 시 표지가 친화성을 갖는 분자와 결합을 형성하는 기를 가진 표지를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 결합은 공유결합 또는 비-공유결합일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "광케이징 부분"은 일정한 파장에서의 조광 시 다른 이온 또는 분자와 공유결합하거나 비-공유결합하는 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "광절단성 기"는 광에의 노출 시 절단되는 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "광가교제"는 광에의 노출 시 반응성을 나타내어 2개 이상의 단량체성 또는 중합체성 분자와 공유결합 또는 비-공유결합을 형성하는 2개 이상의 작용기를 포함하는 화합물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "광이성질화 부분"은 광 조사 시에 한 이성질체 형태로부터 또 다른 이성질체 형태로 변화하는 기를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 또는 분지형 중합체성 폴리에테르 폴리올을 지칭한다. 이러한 폴리알킬렌 글리콜로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이들의 유도체가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 다른 예시적 구체예는 예를 들어, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카달로그("Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001))와 같은 시판 공급자의 카달로그에 기재되어 있다. 예를 들어, 이러한 중합체 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 예를 들어, 이러한 중합체 폴리에테르 폴리올의 평균 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상이나, 이들로 한정되지 않는다. 상기 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 3,000 Da이다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 0 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 일부 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일부 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "중합체"는 반복된 하위단위체(subunit)로 구성된 분자를 지칭한다. 이러한 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리사카라이드, 또는 폴리알킬렌 글리콜이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들로 구성된 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 대한 설명은 펩티드의 설명에 동일하게 적용되고, 펩티드에 대한 설명은 폴리펩티드에 동일하게 적용된다. 상기 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 또한, 이러한 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하며, 이때 아미노산 잔기들은 공유 펩티드 연결에 의해 연결되어 있다.

용어 "번역 후 변형"은 천연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩티드 쇄에 번역에 의해 도입된 후 일어나는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이러한 변형으로는 생체내에서 번역과 동시에 일어나는 변형, 시험관내에서 번역과 동시에 일어나는 변형(예컨대, 세포-무함유 번역 시스템 내에서의 변형), 생체내에서의 번역 후 변형 및 시험관내에서의 번역 후 변형이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로드러그" 또는 "약학적으로 허용되는 프로드러그"는 생체내 또는 시험관내에서 모 약물로 전환되는 물질을 의미하며, 이러한 제제는 약물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기시키지 않고, 비교적 비독성으로서, 즉 이러한 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기시키지 않거나 또는 이를 함유하는 조성물의 임의 성분과 해로운 방식을 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여된다. 프로드러그는 일반적으로 개체에게 투여 및 이후 흡수된 후, 일부 과정, 예컨대 대사 경로에 의한 전환 등을 통해 활성, 또는 보다 활성인 종으로 전환되는 약물 전구체이다. 일부 프로드러그는 활성을 약하게 하고/하거나 가용성 또는 다른 특성을 약물에 부여하는 프로드러그 상에 존재하는 화학기를 갖는다. 화학기가 프로드러그로부터 절단 및/또는 변형되면 활성 약물이 생성된다. 프로드러그는 효소 또는 비효소 반응을 통해 신체 내에서 활성 약물로 전환된다. 프로드러그는 예를 들어, 양호한 가용성, 증강된 전달 특성, 예컨대 특정 세포, 조직, 장기 또는 리간드에 대한 특이적 표적화, 및 약물의 개선된 치료적 가치 등의 개선된 물리화학적 특성을 제공한다. 이러한 프로드러그의 이점으로는 (i) 모 약물에 비해 투여가 용이하다는 점; (ii) 모 약물은 경구 투여될 수 없는 반면 프로드러그는 경구 투여될 수 있다는 점; 및 (iii) 프로드러그가 모 약물에 비해 약학 조성물에서 개선된 가용성을 가질 수 있다는 점이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 프로드러그는 활성 약물의 약리학적 불활성 또는 감소된-활성의 유도체를 포함한다. 프로드러그는 예를 들어 약물의 성질 예컨대, 물리화학적 성질, 생체약학적 성질 또는 약동학적 성질의 개질을 통해 원하는 작용 부위에 도달하는 약물 또는 생물학적 활성 분자의 양을 조절하기 위해 디자인될 수 있다. 프로드러그의 비제한적인 예로는 세포막을 가로지르는 절달을 촉진시키기 위해 에스테르("프로드러그")로서 투여되는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 있는데, 여기서 수용해성이 이동성에 해롭지만 수용성이 이로운 세포 내에서는, 활성 부분인 카르복실산으로 대사적으로 가수분해되는 것이다. 프로드러그는 또한 부위 특이적 조직으로 약물 전달을 증강시키기 위한 변형제로서 사용하기 위한 가역적 약물 유도체로 디자인된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방적 유효량"은 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물이 환자에게 예방 목적으로 투여된 경우 치료할 질환, 병태 또는 질병의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시킬 상기 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 예방을 위한 사용에 있어서, 이러한 양은 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 예를 들어, 이러한 예방적 유효량은 이에 제한되지 않지만 투여량 증가 임상 시험을 포함하는 방법을 통해 결정할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호될 화학적 반응성 기의 종류에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, (i) 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; (ii) 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있고; (iii) 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들면 부탄산 또는 프로피온산, 또는 히드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면 메틸, 에틸, 또는 tert-부틸일 수 있다.

예를 들어, 차단기/보호기는 하기 기들로부터 선택될 수 있다:

추가로, 보호기는 광불안정성(photolabile) 기 예컨대 Nvoc 및 MeNvoc 및 예컨대 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재된 다른 보호 기를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "방사성 부분"은 핵이 핵 방사선, 예컨대, 알파, 베타 또는 감마 입자를 자발적으로 방출하는 기를 지칭하는데, 이때 알파 입자는 헬륨 핵이고, 베타 입자는 전자이고, 감마 입자는 고 에너지 광자이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "반응성 화합물"은 적절한 조건 하에 또 다른 원자, 분자 또는 화합물에 대해 반응성을 나타내는 화합물을 지칭한다.

"숙주 세포"로도 지칭되는 용어 "재조합 숙주 세포"는 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭하며, 이때 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 삽입시키는 데 사용되는 방법으로는 직접 섭취(uptake), 형질도입, orf-교배(mating), 또는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위해 사용되는 다른 방법이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 플라스미드를 포함하나 이로 한정되지 않는 비-삽입(nonintegrated) 벡터일 수 있거나, 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "리독스-활성제"는 또 다른 분자를 산화시키거나 환원시키는 분자를 지칭하고, 이로써 리독스 활성제는 환원되거나 산화된다. 리독스 활성제의 예로는 페로센, 퀴논, Ru^{2 +/3+} 착물, Co^{2 +/3+} 착물 및 Os^{2 +/3+} 착물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "환원제"는 환원될 화합물에 전자를 부가할 수 있는 화합물 또는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 환원제로는 디티오쓰레이톨(DTT), 2-머캡토에탄올, 디티오에리쓰리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타치온이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 환원제는 예를 들면, 환원된 상태에서 설프히드릴 기를 유지하고 분자내 또는 분자간 이황화 결합을 환원시키는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리폴딩"은 부적절하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 천연 또는 적절하게 폴딩된 구조로 변환되는 임의의 과정, 반응 또는 방법을 지칭한다. 예를 들면, 리폴딩은 이황화 결합 함유 폴리펩티드를 이황화 결합에 대하여 부적절하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 천연 또는 적절하게 폴딩된 구조로 변환시킨다. 이러한 이황화 결합 함유 폴리펩티드는 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수지"는 고분자량의 불용성 중합체 비드를 지칭한다. 예를 들면, 이러한 비드는 고체 상 펩티드 합성을 위한 지지체로서 사용될 수 있거나, 정제 전 분자의 부착을 위한 부분로서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "사카라이드"는 당, 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 포함하나 이들로 한정되지 않는 일련의 탄수화물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "안전성" 또는 "안전성 프로파일"은 약물이 투여된 회수와 관련하여 약물 투여와 연관된 부작용을 의미한다. 예를 들어, 다수회 투여되고 부작용이 온화한 정도로만 일어나거나 또는 일어나지 않는 약물은 안전성 프로파일이 우수하다고 한다. 이 방법은 예를 들어, 임의 폴리펩티드의 안전성 프로파일을 평가하기 위해 사용된다.

본 명세서에서 사용된 어구 "에 선택적으로 혼성화한다" 또는 "특이적으로 혼성화한다"는 서열이 전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이들로 한정되지 않는 복합 혼합물 중에 존재하는 경우 분자가 엄격한 혼성화 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에 결합하거나, 특정 뉴클레오티드 서열과 함께 이중가닥을 형성하거나 또는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "스핀 표지"는 전자 스핀 공명 분광법에 의해 검출될 수 있고 또 다른 분자에 부착될 수 있는 페어링되지 않은 전자 스핀(즉, 안정한 상자성 기)을 나타내는 원자 또는 일군의 원자를 함유하는 분자를 지칭한다. 이러한 스핀-표지 분자로는 니트릴 라디칼 및 니트록사이드가 있으나, 이들로 한정되지 않고, 단일 스핀-표지 또는 이중 스핀-표지를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "화학양론적인"은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 방향족 아민 측쇄 상의 수소의 수에 대한 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰 비가 약 0.9 내지 약 1.1인 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "화학양론과 유사"는 반응 조건 또는 첨가제의 존재 하에서의 변화에 따라 화학양론적이거나 거의-화학양론적인 상태가 되는 화학 반응을 지칭한다. 반응 조건에서의 이러한 변화로는 온도의 증가 또는 pH의 변화가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 상기 첨가제로는 촉진제가 있으나, 이로 한정되지 않는다.

어구 "엄격한 혼성화 조건"은 낮은 이온 강도 및 고온 조건 하에서의 DNA, RNA, PNA 또는 다른 핵산 모사체 또는 이들의 조합물의 서열의 혼성화를 지칭한다. 예를 들면, 엄격한 조건 하에서 프로브는 핵산의 복합 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이들로 한정되지 않음) 중의 그의 표적 하위서열에 혼성화하지만, 상기 복합 혼합물 중의 다른 서열에는 혼성화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 수 있다. 예를 들면, 서열이 길수록 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 엄격한 조건은 (i) 지정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 융점(T_m)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮고; (ii) 염 농도가 약 pH 7.0 내지 약 8.3에서 약 0.01 내지 약 1.0 M이고, 짧은 프로브(10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 경우 온도가 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브(50개보다 많은 뉴클레오티드를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 경우 온도가 약 60℃ 이상이며; (iii) 포름아미드를 포함하나 이로 한정되지 않는 탈안정화제의 첨가; 및 (iv) 50% 포름아미드, 5 X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리, 또는 5 X SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리, 및 약 5분 내지 약 120분 동안 65℃에서 0.2 X SSC 및 0.1% SDS를 사용한 세척을 포함한다. 예를 들면, 선택적 또는 특이적 혼성화의의 검출은 배경(background) 신호의 2배 이상인 양(positive)의 신호를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌[Tijssen, Techzques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "피험체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. 예를 들면, 피험체는 인간을 포함하나 이로 한정되지 않는 포유동물일 수 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 정제된"은 정제하기 전에 원하는 성분을 정상적으로 동반하거나 원하는 성분과 상호작용하는 다른 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 갖지 않는 원하는 성분을 지칭한다. 예를 들면, 원하는 성분은 원하는 성분 제제가 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 성분들을 함유하는 경우 "실질적으로 정제된 것"일 수 있다. 따라서, "실질적으로 정제된" 목적 성분의 순도는 약 70% 이상, 약 75% 이상, 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상일 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 천연 세포로부터 정제될 수 있거나, 재조합적으로 제조된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 경우 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드 제제는 상기 제제가 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 오염 물질을 함유하는 경우 "실질적으로 정제된 것"일 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되는 경우, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포의 건조 중량의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되는 경우, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포의 건조 중량의 약 5 g/ℓ, 약 4 g/ℓ, 약 3 g/ℓ, 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ, 약 750 mg/ℓ, 약 500 mg/ℓ, 약 250 mg/ℓ, 약 100 mg/ℓ, 약 50 mg/ℓ, 약 10 mg/ℓ 또는 약 1 mg/ℓ 미만으로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, "실질적으로 정제된" 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 SDS-PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 적절한 방법에 의한 측정 시 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 이보다 높을 수 있다.

"비-간섭 치환기"로도 지칭되는 용어 "치환기"는 경우에 따라 분자 상의 또 다른 기를 치환시키는 데 사용될 수 있는 기를 지칭한다. 이러한 기로는 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₅-C₁₂ 아르알킬, C₃-C₁₂ 시클로알킬, C₄-C₁₂ 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₅-C₁₂ 알콕시아릴, C₅-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, -(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀ 알킬)(이때, m은 1 내지 8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 복소환 라디칼, 치환된 헤테로시클릭 라디칼, 니트로알킬, -NO₂, -CN, -NRC(O)-(C₁-C₁₀ 알킬), -C(O)-(C₁-C₁₀ 알킬), C₂-C₁₀ 알킬 티오알킬, -C(O)O-(C₁-C₁₀ 알킬), -OH, -SO₂, =S, -COOH, -NR₂, 카르보닐, -C(O)-(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, -C(O)-CF₃, -C(O)NR₂, -(C₁-C₁₀ 아릴)-S-(C₆-C₁₀ 아릴), -C(O)-(C₆-C₁₀ 아릴), -(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀ 알킬)(이때, m은 각각 1 내지 8임), -C(O)NR₂, -C(S)NR₂, -SO₂NR₂, -NRC(O)NR₂, -NRC(S)NR₂, 이들의 염 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이 목록에서 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환 알킬, 아릴 또는 치환 아릴, 또는 알크아릴이다. 치환기가 좌측부터 우측으로 기재되는 그들의 보편적인 화학식에 의해 특정되는 경우, 이들은 우측부터 좌측으로 기재함으로써 비롯되는 화학적으로 동일한 치환기도 포함하는데, 예를 들면, -CH₂O-는 -OCH₂-와 동등하다.

예를 들어, 알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기로는 -OR, =0, =NR, =N-0R, -NR₂, -SR, -할로겐, -SiR₃, -OC(O)R, -C(O)R, -CO₂R, -CONR₂, -0C(0)NR₂, -NRC(0)R, -NR-C(0)NR₂, -NRC(O)₂R, -NR-C(NR₂)=NR, -NR-C(NR₂)=NR, -S(O)R, -S(O)₂R, -S(O)₂NR₂, -NRSO₂R, -CN 및 -NO₂가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이 목록에서 각각의 R 기로는 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴(1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 티오알콕시 기, 또는 아르알킬 기가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 2개의 R 기가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 경우에 따라 질소 원자와 조합되어 5-원, 6-원 또는 7-원의 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR₂는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.

예를 들어, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기로는 0 내지 방향족 고리계 상의 개방 원자가의 총수 범위 내의 수의 -OR, -O, =NR, =N-0R, -NR₂, -SR, -할로겐, -SiR₃, -OC(O)R, -C(O)R, -CO₂R, -CONR₂, -OC(O)NR₂, -NRC(O)R, -NR-C(0)NR₂, -NRC(O)₂R, -NR-C(NR₂)=NR, -S(O)R, -S(O)₂R, -S(O)₂NR₂, -NRSO₂R, -CN, -NO₂, -R, -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 플루오로(C₁-C₄)알킬이 있으나 이들로 한정되지 않으며; 이 목록에서 각각의 R 기로는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물이 질환, 증상 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 투여된 경우 치료할 질환, 증상 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키거나 경감시키기에 충분한 상기 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 조성물의 효과는 질환, 장애 또는 증상의 심도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 조건에 달려 있다. 예를 들어, 치료 유효량은 투여량 증가 임상 시험을 포함하나 이로 한정되지 않는 방법에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "티오알콕시"는 산소 원자를 통해 분자에 연결된 황을 함유하는 알킬 기를 지칭한다.

용어 "융점" 또는 T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 (지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 평형 상태에서 표적 서열에 혼성화하는 온도이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "독성 부분"은 유해할 수 있거나 사망을 초래할 수 있는 화합물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 증상의 증상을 완화시키거나, 감소시키거나 개선시키는 것, 추가 증상을 예방하는 것, 증상의 대사적 기초 원인을 개선시키거나 예방하는 것, 질환 또는 증상을 억제하는 것, 예를 들어, 질환 또는 증상의 발달을 정지시키는 것, 질환 또는 증상을 경감시키는 것, 질환 또는 증상의 퇴행을 일으키는 것, 질환 또는 증상에 의해 야기되는 증상을 경감시키는 것, 및 질환 또는 증상의 증상을 정지시키는 것을 포함한다. 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 용해될 수 있는 임의의 중합체를 지칭한다. 이러한 수용성 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체(덱스트란 설페이트를 포함함), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체(메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 혈청 알부민, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜과 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 이들의 혼합물이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체와 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 폴리펩티드의 커플링은 증가된 수용성, 증가 또는 조절된 혈청 반감기, 비변형 형태에 비해 증가 또는 조절된 치료 반감기, 증가된 생체이용성, 조절된 생물학적 활성, 연장된 순환 시간, 조절된 면역원성, 응집 및 다량체 형성을 포함하나 이들로 한정되지 않는 조절된 물리적 결합 특성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너와의 변경된 결합, 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 또한, 이러한 수용성 중합체는 경우에 따라 그 자신의 생물학적 활성을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다.

달리 명시하지 않은 한, 당업계의 기술 내에 있는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학법, 생화학법, 재조합 DNA 기법 및 약학적 기법 등이 사용된다.

본 명세서에서 제시된 화합물(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물을 제조하기 위한 시약을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)은 하나 이상의 원자가 천연 상태에서 통상적으로 발견되는 원자량 또는 질량수와 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 치환된다는 점을 제외하고 본 명세서에 제공된 다양한 화학식 및 구조식에서 표시된 화합물들과 동일한 동위원소-표지 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물 내로 도입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷0, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소를 포함한다. 본 명세서에 기재된 몇몇 동위원소-표지 화합물, 예컨대, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 도입된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에서 유용할 수 있다. 또한, 중수소, 즉 ²H와 같은 동위원소를 사용한 치환은 보다 큰 대사적 안정성 예를 들면, 증가된 생체 내 반감기 또는 감소된 투여량 요구로부터 비롯된 치료적 이점을 제공할 수 있다.

본 발명 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물의 제조를 위한 시약을 포함하나, 이들로 한정되지 않음)는 비대칭 탄소 원자를 가지므로 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 혼합물은 이에 제한되지 않지만, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화 등을 포함하는 방법을 이용하여, 그들의 물리적 화학적 차이점에 기초하여 그들의 개별 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 거울상이성질체는 적절한 광학적 활성 화합물(예를 들면, 알콜)을 사용한 반응으로 거울상이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 전환시키고, 부분입체이성질체를 분리하고, 개개의 부분입체이성질체를 상응하는 순수한 거울상이성질체로 전환(예를 들어, 가수분해)시킴으로써 분리할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 이들의 혼합물을 포함하는 이러한 모든 이성질체는 본 명세서에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다.

추가 또는 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 화합물(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)은 프로드러그의 형태로 사용된다. 추가 또는 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 화합물(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)은 이를 필요로 하는 유기체에 투여시 대사되어 대사산물을 생성하고, 이 대사산물은 원하는 치료 효과를 비롯한 원하는 효과를 얻는 데 사용된다. 추가 또는 또 다른 구체예에서, 비천연 아미노산 및 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사산물이 제공된다.

본 명세서에 기재된 방법 및 제형은 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 N-산화물, 결정 형태(다형체로도 공지되어 있음) 또는 약학적으로 허용되는 염의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 호변이성질체로서 존재할 수 있다. 모든 호변이성질체가 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 범위 내에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 물, 에탄올 등과 같은 약학적으로 허용되는 용매와의 용매화 형태뿐만 아니라 비-용매화 형태로 존재할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화 형태도 본 명세서에 개시된 것으로 간주된다.

일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 여러 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 이러한 모든 호변이성질체 형태는 본 명세서에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다. 또한, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 화합물들(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 모든 에놀-케토 형태도 본 명세서에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다.

일 구체예에 있어서, 본 명세서에 기재된 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 산성이고, 약학적으로 허용되는 양이온과의 염을 형성한다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 염기성이므로, 따라서 약학적으로 허용되는 음이온과의 염을 형성한다. 이-염(di-salt)을 비롯한 모든 이러한 염들이 본 명세서에 기재된 조성물의 범위 내에 있고, 이들은 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 염은 수성, 비-수성 또는 부분 수성 매질 중에서 산성 물질과 염기성 물질을 접촉시킴으로써 제조할 수 있다. 염은 다음의 기법; 여과, 비-용매를 사용한 침전 후 여과, 용매의 증발, 또는 수용액의 경우 동결건조 중 하나 이상의 기법을 이용하여 회수한다.

본 발명에서 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염은 경우에 따라 모 비천연 아미노산 폴리펩티드에 존재하는 산성 양자가, 금속 이온, 예를 들어 모 비천연 아미노산 폴리펩티드알칼리 금속 이온, 알칼리토 이온 또는 암모늄 이온으로 치환되거나, 또는 유기 염기와 배위결합을 이루는 경우에 형성된다. 또한, 개시한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 염 형태는 경우에 따라 출발 물질 또는 중간체의 염을 이용하여 제조된다. 본 발명에서 개시한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기산과 본 발명에 개시한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 염기 형태를 반응시켜 약학적으로 허용되는 산 부가염(약학적으로 허용되는 염 유형임)으로서 제조된다. 다르게, 본 발명에 개시한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기 염기와 본 발명에 개시한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유리산 형태를 반응시켜 약학적으로 허용되는 염기 부가염(약학적으로 허용되는 염의 유형임)으로서 제조된다.

약학적으로 허용되는 염 유형은 예를 들어, (1) 염산, 수소화브롬산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산을 사용하여 형성되거나, 아세트산, 프로피온산, 헥사노산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-히드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-메틸비시클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-히드록시-2-엔-1-카르복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등을 사용하여 형성된, 산 부가 염; (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양자가 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리토 이온 또는 알루미늄 이온으로 치환시 형성된 염; 또는 유기 염기와의 배위체를 포함한다. 허용되는 유기 염기로는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등이 있다. 허용가능한 무기 염기로는 수산화알루미늄, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등을 포함한다.

비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염의 상응하는 반대이온을 경우에 따라 이에 제한되는 것은 아니지만, 이온 교환 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 유도 커플링 플라즈마, 원자 흡착 분광계, 질량 분광계 또는 이의 임의 조합을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 분석 및 확인한다. 또한, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염의 치료 활성은 실시예 22-26에 기술한 방법 및 기법을 이용해 테스트한다.

염으로 언급할 것은 용매 부가형태 또는 이의 결정형, 구체적으로 용매화물 또는 다형체를 포함한다. 용매화물은 화학양론적 또는 비화학양론적인 양의 용매를 함유하고, 종종 약학적으로 허용되는 용매 예컨대 물, 에탄올 등과의 결정화 과정 동안 형성된다. 수화물은 용매가 물인 경우에 형성되거나, 알콜화물은 용매가 알콜일 때 형성된다. 다형체는 화합물의 동일한 원소 조성물의 상이한 결정 팩킹 배열을 포함한다. 다형체는 보통 상이한 X선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 용융점, 밀도, 경도, 결정형, 확학 및 전자 특성, 안정성 및 가용성을 갖는다. 다양한 인자들 예컨대 재결정화 용매, 결정화 속도 및 보관 온도가 단일 결정형이 우세하도록 할 것으로 예상된다.

비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염의 다형체 및/또는 용매화물의 스크리닝 및 특징 규명은 이에 제한되는 것은 아니고, 열 분석, X선 회절법, 분광법, 증기 흡착법 및 현미경을 포함하는 다양한 기법을 이용해 수행된다. 열분석 방법은 이에 제한되는 것은 아니고, 다형체 전이를 포함하는 열 화학 분해 또는 열 물리 과정을 사용하고, 이러한 방법은 다형체간 관계도를 분석하거나, 중량 손실을 확인하거나, 유리 전이 온도를 찾거나 또는 부형제 상용성 실험을 위해 사용된다. 이러한 방법은 이에 제한되는 것은 아니고, 시차 주사 열량계(DSC), 조절된 시차 주사 열량계(MDCS), 열중량 분석법(TGA) 및 열중량 및 적외선 분석법(TG/IR)을 포함한다. X선 회절 방법은 이에 제한되는 것은 아니고 단일 결정 및 분말 회절계 및 싱크로트론 소스를 포함한다. 사용되는 다양한 분광법은 이에 제한되는 것은 아니고 라만, FTIR, UVIS 및 NMR(액상 및 고상)을 포함한다. 다양한 현미경 방법은 이에 제한되는 것은 아니고 편광 현미경, 에너지 분산 X선 분석(EDX)를 이용한 주사 전자 현미경(SEM), EDX(가스 또는 수증기 분위기하)를 이용한 환경 주사 전자 현미경, IR 현미경 및 라만 현미경을 포함한다.

본 발명의 방법, 조성물, 장치 및 장비의 원리를 활용하는, 예시적인 구체예를 설명하는 하기 상세한 설명을 통해 발명의 방법 및 조성물의 특징 및 장점을 보다 잘 이해할 수 있을 것이며, 첨부된 도면은 다음과 같다.

도 1은 본 발명에서 기술한 방법, 조성물, 전략 및 기술의 일 측면들의 관련성에 대한 비제한적인 계략 대표도이다.

도 2는 본 발명에서 기술한 퀴녹살린 및 페나진 유도체를 제조하기 위해 사용한 합성 방법론에 대한 예시적인 비제한적 일례를 나타낸 도면이다. 생체적합성 조건하에서 1,2-아릴디아민 및 1,2-디카르보닐 화합물로부터 퀴녹살린 및 페나진을 형성하는 것에 대해 예시한 도면이다.

도 3은 본 발명에서 기술한 퀴녹살린 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, 2-옥소-2-페닐아세트알데히드와 ο-페닐디아민(oPDA)의 반응으로부터 2-페닐퀴녹살린의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면다.

도 4는 본 발명에서 기술한 퀴녹살린 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로, ο-페닐디아민(oPDA)와 펜탄-2,3-디온의 반응으로부터 2-에틸-3-메틸퀴녹살린의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 5는 본 발명에서 기술한 퀴녹살린 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 1-페닐 프로판-2,3-디온의 반응으로부터 2-메틸-3-페닐퀴녹살린의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명에서 기술한 퀴녹살린 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 벤질의 반응으로부터 2,3-디페닐퀴녹살린의 형성, 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 7은 본 발명에서 기술한 퀴녹살린 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 1,2-디(피리딘-2-일)에탄-1,2-디온의 반응으로부터 2,3-디(피리딘-2-일)퀴녹살린의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 8은 본 발명에서 기술한 페나진 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 나프탈렌-1,2-디온의 반응으로부터 벤조[a]페나진의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 9는 본 발명에서 기술한 페나진 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 5-설포닐-나프탈렌-1,2-디온의 반응으로부터 4-설포닐벤조[a]페나진의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 10은 본 발명에서 기술한 페나진 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 1,10-페난트롤린-5,6-디온의 반응으로부터 강력한 형광성 디피리도[3,2-a:2',3'-c]페나진의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 11은 본 발명에서 기술한 페나진 유도체의 형성에 대한 예시적인 비제한적 예로서, ο-페닐디아민(oPDA)과 페난트롤린-9,10-디온의 반응으로부터 강력한 형광성 디벤조[a,c]페나진의 형성 및 상기 반응의 고성능 액체 크로마토그래피 추적 결과를 나타낸 도면이다.

도 12는 본 발명에서 기술한 1,2-디카르보닐, 및 1,2-아릴디아민 기를 함유하는 비천연 아미노산의 예시적인 비제한적 예를 나타낸 도면이다. 경우에 따라, 이러한 비천연 아미노산은 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입시키거나 사용할 수 있다. 이러한 아미노산은 경우에 따라 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 임의의 비천연 아미노산 폴리펩티드에 도입된다.

도 13은 Z 및 W 기를 함유하는 출발 물질로부터 유도체화 제제 [Z- L]_n-L¹-W-R 및 [Z-L]_n-L¹-W'-R을 제조하는 예시적인 비제한적 예를 나타낸 도면이다. 이러한 제제는 경우에 따라 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 14는 PEG 시약의 합성에 대한 예시적이고 비제한적인 대표도를 나타낸 도면이다. 이러한 PEG 시약은 경우에 따라 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다. 임의 폴리알킬렌 글리콜은 경우에 따라 이러한 합성 방법에서 사용되며 m-PEG-30k를 예시 목적으로 도시하였다.

도 15는 Z 및 W 기를 함유하는 출발 물질로부터 유도체화 제제 [Z- L]_n-L¹-W-R 및 [Z-L]_n-L¹-W'-R을 제조하는 예시적인 비제한적 예를 나타낸 도면이다. 이러한 제제는 경우에 따라 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 16은 변형된 퀴녹살린 및 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위해 디케톤 함유 시약을 이용하여 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 디아민 함유 우로텐신(UT-II)을 유도체화하는 것을 도시하였지만, XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 임의의 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이러한 반응에 사용하게 된다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 17은 변형된 퀴녹살린 및 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위해 디아민 함유 시약을 이용하여 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 비보호된 펩티드를 유도체화하는 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 디카르보닐 함유 XT-8을 유도체화하는 것을 도시하였지만, 우로텐신(UT-II), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 임의의 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이러한 반응에 사용하게 된다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 18은 변형된 퀴녹살린 및 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위하여 각각 디아민 및 디카르보닐 시약을 사용하는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 및 디아민 함유 아미노산 단백질 또는 폴리펩티드의 번역 후 변형에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 모양의 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 19A는 신규한 화학 작용기를 도입시키기 위한 디아민 및 디카르보닐 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드 또는 단백질의 변형에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 모양의 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 19B는 PEG 유도체와 작용기 함유 폴리펩티드 또는 단백질의 반응에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 모양의 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 20은 신규한 화학 작용기를 도입하기 위한 디아민 및 디카르보닐 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드 또는 단백질의 변형 및 PEG 유도체와 예시한 작용기의 반응에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 모양의 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 21은 부위-특이적으로 페나진 형성된 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 타원형은 인간 성장 호르몬(hGH)을 나타내고 타원형에 아세토페논 부착은 hGH의 아미노산 35에 변형을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 22는 퀴녹살린 및 페나진 부분을 형성하기 위한 단백질 표지화에 대한 순차적인 접합을 보여주는 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 타원형 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 23은 페나진 부분의 형성을 통해서 PEG 유도체와 비천연 아미노산을 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 연결시키기 위해 이작용성 작용기를 사용하는 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 형태 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 24는 양 말단에 아릴 디아민을 함유하는 이작용성 링커 기의 합성에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다.

도 25는 동종이량체를 형성하기 위해 2개의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함께 연결하기 위한 이작용성 링커의 합성에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 형태 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 26은 퀴녹살린 및 페나진 변형된 폴리펩티드를 형성하기 위한 분지형 PEG 함유 시약과 디카르보닐 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드간의 반응에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 형태 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 27은 퀴녹살린 변형된 폴리머의 이성질체를 형성하기 위한 분지형 PEG 함유 시약과 디아민 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드간의 반응에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 형태 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 28은 페나진 변형된 폴리펩티드를 형성하기 위한 분지형 PEG 함유 시약과 치환된 디아민 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드 간의 반응에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 형태 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

도 29A-D는 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용되는 링커의 합성에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다.

도 30은 아릴 디아민 및 디카르보닐 기를 함유하는 PEG 유도체의 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다.

도 31은 PEG 함유 시약 및 비천연 아미노산 함유 화합물의 2단계 및 1단계 접합에 대한 예시적이고 비제한적인 예를 나타낸 도면이다. 회색 형태 부분은 우로텐신(UT-II), XT-8, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라서 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하기 위한 방법, 조성물, 기술 및 전략 중 어느 것에 도입되거나 사용된다.

I. 서론

최근, 단백질 과학에서 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 수많은 한계를 극복한 완전하게 새로운 기술이 보고되었다. 구체적으로, 생체 내에서 단백질에 비천연 아미노산을 도입할 수 있는 원핵생물 에스케리치아 콜라이(이.콜라이)(Escherichia coli)(E.coli)(예를 들어, 문헌 [L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500] 참조) 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비지아(에스. 세레비지아)(Sacchromyces cerevisiae)(S. cerevisiae))(예를 들어, 문헌 [J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)] 참조)의 단백질 생합성 기구(machinery)에 신규 성분들을 첨가하였다. 광친화성 표지 및 광이성질화 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화 아미노산을 포함하여, 신규한 화학, 물리 또는 생물학적 특성을 갖는 다수의 새로운 아미노산을 이러한 방법을 이용하여 앰버 코돈, TAG에 반응하여 이.콜라이 및 효모에서 단백질에 효율적이고 높은 충실도로 도입되었다. 예를 들어, 문헌 [J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027(전체로 참조하여 포함시킴); J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137(전체로 참조하여 포함시킴); J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99(17): 11020-11024(전체로 참조하여 포함시킴); 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1: 1-11(전체로 참조하여 포함시킴)]을 참조한다. 이 연구들은, 단백질에서 발견되지 않으며 유전적으로 코딩된 20종의 공통된 아미노산에서 발견된 모든 작용기에 대해 화학적 불활성을 나타내고, 경우에 따라 효율적이고 선택적으로 반응하여 안정한 공유결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 화학적 작용기를 선택적이고 일상적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.

II. 개요

도 1은 본 발명에서 기술하는 조성물, 방법 및 기법의 개요를 나타내는 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 1,2-디카르보닐, 1,2-아릴디아민, 퀴녹살린 또는 페나진 기를 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생성 및 사용하기 위한 도구(방법, 조성물, 기법)이다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라서, 이에 제한되는 것은 아니며, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제(이 경우, 생물학적 활성 제제는 치료 활성을 갖는 제제이고 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형 비천연 아미노산은 부착된 치료 제제를 갖는 공동 치료 제제로서 또는 유기체 내 목적 부위에 치료제를 전달하기 위한 수단으로서 기능함); 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀, 및 이의 임의 조합에서 선택된 기를 포함하는 추가의 작용성을 함유한다. 주목할 것은 다양한 상기 언급한 작용성이 한 작용성의 구성원들을 다른 작용성의 구성원으로 분류할 수 있는 것을 암시하려는 의미가 아니다. 또한, 특정 상황에 따라 중복될 수 있다. 예를 들어, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 유도체와 범주가 중복될 수 있지만, 이러한 중복이 완전한 것은 아니므로 두 작용성을 상기에 언급하였다.

도 1에 도시한 바와 같이, 일 측면은 본 발명에서 기술한 방법, 조성물 및 기법을 사용하여 변형시킨 폴리펩티드를 선별 및 디자인하기 위한 방법이다. 신규 폴리펩티드는 경우에 따라, 예를 들어 고수율 스크리닝법(이 경우 다수의 폴리펩티드를 디자인, 합성, 특징규명 및/또는 테스트함)의 일부로서, 또는 연구자의 목적을 기초로 새롭게 디자인된다. 다르게, 신규 폴리펩티드는 경우에 따라 공지이거나 또는 부분 특징규명된 폴리펩티드의 구조를 기초로 디자인된다. 예를 들어, 성장 호르몬 유전자 수퍼패밀리(하기 참조)는 과학 집단의 광범위한 연구 주제였으며, 일 구체예에서, 신규 폴리펩티드는 이 유전자 수퍼패밀리의 구성원 또는 구성원들의 구조를 바탕으로 디자인한다. 치환 및/또는 변형을 위해 어떠한 아미노산(들)을 선택하는가에 대한 원리를 개별적으로 본 발명에서 기술한다. 어떠한 변형을 가하는지에 대한 선택도 본 발명에 기술하며, 실험자 또는 최종 사용자의 요구에 부합하여 사용된다. 이러한 요구에는 이에 제한되는 것은 아니고, 폴리펩티드의 치료 효능 조작, 폴리펩티드의 안전성 프로파일 개선, 폴리펩티드의 약동력학, 약리학 및/또는 약력학의 조정, 예컨대 수용성, 생체이용성 증가, 혈청 반감기 증가, 치료 반감기 증가, 면역원성 조정, 생물학적 활성 조정 또는 순환 시간 연장을 포함한다. 또한, 이러한 변형은 단지 예로서, 폴리펩티드에 추가 작용성 제공, 태크, 표지 또는 검출가능 신호의 폴리펩티드내 도입, 폴리펩티드의 단리 특성 용이화 및 상기 언급한 변형의 조합을 포함한다.

본 발명에서는 또한 1,2-디카르보닐, 1,2-아릴디아민, 퀴녹살린 또는 페나진 기를 함유하도록 변형되었거나 또는 경우에 따라 변형시키는 비천연 아미노산을 기술한다. 이 측면에는 이러한 비천연 아미노산의 제조, 정제, 특징규명 및 사용 방법이 포함된다. 또한 도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11에 기술한 바와 같은 퀴녹살린 및 페나진 유도체의 합성 방법, 및 이러한 유도체를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 도입하는 방법을 포함한다. 본 발명에서 기술하는 다른 측면은 하나 이상의 이러한 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 도입하기 위한 방법, 전략 및 기술을 포함한다. 또한, 이 측면은 하나 이상의 이러한 비천연 아미노산을 함유하는 이러한 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하는 방법을 포함한다. 이 측면은 또한 적어도 부분적으로, 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드(DNA 및 RNA 포함)를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하는 방법 및 이의 조성물을 포함한다. 이 측면은 또한 적어도 부분적으로 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 이러한 올리고뉴클레오티드를 발현하는 세포의 조성물 및 이의 제조, 정제, 특징규명 및 사용 방법을 포함한다.

따라서, 1,2-디카르보닐, 1,2-아릴디아민, 퀴녹살린 또는 페나진 기를 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고 본 발명에서 기술한다. 일 구체예에서, 1,2-디카르보닐, 1,2-아릴디아민, 퀴녹살린 또는 페나진 기를 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 일부 위치에 하나 이상의 번역후 변형을 포함한다. 일 구체예에서, 번역 동시 또는 번역후 변형은 세포 기전(예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토실화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질 연결 변형 등)을 통해 일어나며, 많은 경우에서, 예컨대 세포 기전 기반 번역 동시 또는 번역후 변형은 폴리펩티드 상의 천연 발생 아미노산 부분에서 일어나지만, 일 구체예에서, 세포 기전 기반 번역 동시 또는 번역 후 변형은 폴리펩티드 상의 비천연 아미노산 부분(들) 상에서 일어난다.

다른 구체예에서, 번역후 변형은 세포 기전을 활용하지 않지만, 대신 작용성은 본 발명에서 기술한 화학 방법, 또는 특정 반응성 기에 적합한 다른 방법을 활용하여 제2 반응성 기를 포함하는 분자(표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀 및 이의 임의 조합에서 선택된 기 포함)를 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산(이에 제한되지는 않지만 케톤, 알데히드, 아세탈, 헤미아세탈, 옥심 또는 히드록실아민 작용기를 포함)에 부착시켜 제공한다. 일 구체예에서, 번역 동시 또는 번역 후 변형은 진핵생물 세포 또는 비진핵생물 세포 내에서 생체 내에서 제조된다. 일 구체예에서, 번역후 변형은 세포 기전을 활용하지 않고 시험관 내에서 제조된다. 이 측면은 또한 하나 이상의 이러한 번역 동시 또는 번역후 변형된 비천연 아미노산을 함유하는 이러한 폴리펩티드의 제조, 정제, 특징규명 및 사용 방법을 포함한다.

본 발명에서 기술한 방법, 조성물, 전략 및 기법의 범주내에는 또한 폴리펩티드의 일부인 비천연 아미노산(1,2-디카르보닐 또는 1,2-아릴디아민 기, 또는 이의 마스크 또는 보호된 형태 또는 동등물 함유)과 반응할 수 있어서 임의의 상기 언급한 번역후 변형을 생성시킬 수 있는 시약을 포함한다. 대체로, 얻어진 번역후 변형 비천연 아미노산은 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 함유하고, 얻어진 퀴녹살린 또는 페나진 함유 비천연 아미노산에 대해 경우에 따라 후속 변형 반응을 수행한다. 이 측면은 또한 임의의 이러한 비천연 아미노산(들)을 번역후 변형시킬 수 있는 시약의 제조, 정제, 특징규명 및 사용 방법을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 하나의 숙주 세포에서 생체 내에서 일어난 하나 이상의 번역 동시 또는 번역후 변형을 포함하는데, 여기서 번역후 변형은 다른 숙주 세포 유형에서는 정상적으로 일어나는 것이 아니다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 진핵생물 세포의 생체 내에서 일어나는 하나 이상의 번역 동시 또는 번역후 변형을 포함하는데, 여기서 번역 동시 또는 번역후 변형은 비진핵생물 세포에서는 정상적으로 일어나는 것이 아니다. 이러한 번역 동시 또는 번역후 변형의 예는 이에 제한되는 것은 아니고, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토실화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질 연결 변형 등을 포함한다. 일 구체예에서, 번역 동시 또는 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 연결에 의해 아스파라긴에 올리고사카라이드(이에 제한되는 것은 아니고, 여기서 올리고사카라이드는 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등)를 부착시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 번역 동시 또는 번역후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 연결을 통해서 세린 또는 트레오닌에 올리고사카라이드(이에 제한되는 것은 아니고, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등 포함)을 부착시키는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국지화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다. 이 측면은 또한 하나 이상의 번역 동시 또는 번역후 변형을 함유하는 이러한 폴리펩티드의 제조, 정제, 특징규명 및 사용 방법을 포함한다. 다른 구체예에서, 글리코실화 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비글리코실화 형태로 생성된다. 이러한 글리코실화 비천연 아미노산의 비글리코실화 형태는 경우에 따라 단리되거나 또는 실질적으로 정제 또는 미정제된 글리코실화 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 올리고사카라이드기의 화학적 또는 효소적 제거; 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 글리코실화하지 않는 숙주(예컨대 숙주는 원핵생물 또는 이러한 폴리펩티드를 글리코실화하지 않도록 조작 또는 돌연변이화시킨 진핵생물 포함함)에서 비천연 아미노산의 생성, 정상적으로 폴리펩티드를 글리코실화하는 진핵생물에 의해 비천연 아미노산 폴리펩티드가 생성되는 세포 배양 배지에 글리코실화 억제제를 첨가, 또는 이러한 임의 방법의 조합을 포함하는 방법으로 제조한다. 또한 본 발명에서는 정상적으로 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 비글리코실화 형태를 포함한다(정상적으로 글리코실화된 폴리펩티드는 천연 발생 폴리펩티드가 글리코실화되는 조건하에서 생성시 글리코실화되는 폴리펩티드를 의미함). 물론, 이러한 정상적으로 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 임의의 본 발명에서 기술한 폴리펩티드)의 비글리코실화 형태는 미정제 형태, 실질적으로 정제 형태 또는 단리 형태이다.

일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서 번역후 변형은 화학양론적이거나, 화학양론과 유사하거나 또는 화학양론에 근접하다.

비천연 아미노산 함유 폴리펩티드는 다른 구체예에서, 1,2-디카르보닐, 1,2-아릴디아민, 퀴녹살린 또는 페나진, 또는 이의 보호된 형태 또는 동등물을 함유하는 비천연 아미노산을 1 이상, 약 2 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 5 이상, 약 6 이상, 약 7 이상, 약 8 이상, 약 9 이상 또는 약 10 이상 또는 그 이상 함유한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이하며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11 , 12, 13. 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재한다. 일 구체예에서, 단백질의 천연 발생 형에 존재하는 특정 아미노산 중 1 이상이지만 전부보다는 적은 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된다.

본 발명에서 제공하는 방법 및 조성물은 1,2-디카르보닐 기, 1,2-아릴디아민 기 또는 이의 보호되거나 마스크된 형태 또는 동등물, 또는 퀴녹살린 또는 페나진 기를 함유하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드로 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입은 이에 제한되는 것은 아니며, 하나 이상의 비천연 아미노산과 특이적 화학 반응하지만, 통상 발생하는 20 아미노산과는 반응하지 않는 접합 화법의 적용을 가능하게 한다. 도입되면, 비천연 발생 아미노산 측쇄는 경우에 따라 본 발명에서 기술한 화학 방법 또는 천연 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적절한 화학 방법을 통해 변형시킨다.

본 발명에서 기술한 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 이에 제한되는 것은 아니며, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀, 및 이의 임의 조합을 포함하는 다른 물질과, 광범위한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질의 접합체를 제공한다.

일 구체예에서, 화학식 I-XI 및 XXXI11-XXXVII의 화합물 및 화합물 1-6을 포함하여, 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 링커 및 시약은 온화한 산성 조건(이에 제한되는 것은 아니고, 약 pH 3 내지 약 pH 8, 약 pH 4 내지 약 pH 10, 약 pH 4 내지 약 pH 8, 및 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 4 내지 약 pH 7, 약 pH 3 내지 약 pH 4, 약 pH 7 내지 약 pH 8; 약 pH 4 내지 약 pH 6, 약 pH 4; 및 약 pH 6을 포함하는, 약 pH 2 내지 약 pH 10 포함) 하 수용액에서 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 온화한 산성 조건 하에서 약 1개월 이상 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 온화한 산성 조건 하에서 약 2주 이상 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 온화한 산성 조건 하에서 약 5일 이상 안정하다.

본 발명에서 개시한 조성물, 방법, 기법 및 전략의 다른 측면은 임의의 상기 언급한 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드를 실험 또는 사용하기 위한 방법이다. 이 측면에는 예를 들어, "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드로부터 혜택을 얻게되는 치료, 진단, 분석기반, 산업, 미용, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 소비자-제품 및/또는 군대 용도 등이 포함된다.

III. 폴리펩티드 중 비천연 아미노산의 위치

본 발명에서 기술한 방법 및 조성물은 폴리펩티드로 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입을 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산은 일 구체예에서, 폴리펩티드의 활성을 파괴하지 않는 하나 이상의 특정 위치에 도입된다. 이는 경우에 다라 이에 제한되는 것은 아니며, 소수성 아미노산의 비천연 또는 천연 소수성 아미노산으로 치환, 벌키 아미노산을 비천연 또는 천연 벌키 아미노산으로 치환, 친수성 아미노산을 비천연 또는 천연 소수성 아미노산으로 치환 및/또는 활성에 필요하지 않은 위치에 비천연 아미노산 삽입을 포함하는 "보존적" 치환을 통해 수행한다.

다양한 생화학 및 구조적 접근을 사용하여 폴리펩티드 내 비천연 아미노산으로의 치환에 적합한 부위를 선택한다. 폴리펩티드쇄의 임의 위치는 비천연 아미노산을 도입시키기 위한 선택에 적절하고, 선택은 경우에 따라 합리적인 디자인을 기초로하거나 또는 임의의 또는 어떠한 특별한 목적을 위한 것이 아닌 무작위 선택에 의한다. 바람직한 부위의 선택은 경우에 따라 이에 제한되는 것은 아니며 작동제, 초작동제, 부분 작동제, 역작동제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 결합 파트너에 대한 결합 조절제, 결합 파트너 활성 조절제, 결합 파트너 구조 조절제, 이량체 또는 다량체 형성, 천연 분자와 비교한 활성 또는 특성 무변화 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 특성 예컨대 가용성, 응집성 또는 안정성 등의 조작을 포함하여, 임의의 바람직한 특성 또는 활성을 갖는 비천연 아미노산 폴리펩티드(경우에 따라 추가 변형되거나 비변형된 상태로 남음)를 생성하는 것을 기초로 한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 필요한 폴리펩티드의 위치는 이에 제한되는 것은 아니고 점돌연변이화 분석, 알라닌 주사 또는 상동성 주사 방법을 포함하는 방법을 이용하여 확인한다. 이에 제한되는 것은 아니고, 알라닌 또는 상동성 주사 돌연변이화법을 포함하는 방법에 의해 생물학적 활성에 핵심적인 것으로 확인된 것들 이외의 잔기가 폴리펩티드에 대해 추구하는 바람직한 활성에 따라서 비천연 아미노산으로의 치환을 위해 양호한 후보이다. 다르게, 생물학적 활성에 핵심적인 것으로 확인된 부위는 또한 폴리펩티드에 대해 추구하는 바람직한 활성에 따라서 비천연 아미노산으로의 치환을 위해 양호한 후보이다. 또 다르게는 단순하게 비천연 아미노산으로 폴리펩티드의 각 위치에 연속 치환을 하고 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 임의 폴리펩티드에 비천연 아미노산으로의 치환을 위한 위치를 선택하는 임의 수단, 기법 또는 방법이 본 발명에서 기술한 방법, 기법 및 조성물에 사용하기 적합하다.

결실을 함유하는 폴리펩티드의 천연 발생적 돌연변이체의 구조 및 활성을 또한 비천연 아미노산 치환에 견딜 수 있는 단백질의 영역을 정하기 위해 시험한다. 비천연 아미노산으로의 치환에 견디지 못하는 잔기를 제거하면, 각각의 남아있는 위치에서의 제안된 치환들의 영향을 이에 제한되는 것은 아니며, 관련 폴리펩티드, 및 임의 연관 리간드 또는 결합 단백질의 3차원 구조를 포함하는 방법을 사용하여 조사한다. 많은 폴리펩티드의 X선 결정학적 및 NMR 구조는 단백질 및 핵산의 거대 분자의 3차원 구조 데이타를 포함하는 중심 데이타베이스인 단백질 데이타 은행(PDB, www.rcsb.org)에서 입수가능하고, 비천연 아미노산으로 경우에 따라 치환된(바람직하다면) 아미노산 위치를 확인하는데 사용한다. 또한, 3차원 구조 데이타를 이용불가능한 경우에는, 경우에 따라 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 조사하는 모델을 이용한다. 따라서, 비천연 아미노산으로의 치환을 위해 이용가능한 아미노산 위치의 확인은 용이하게 수행할 수 있다.

비천연 아미노산의 도입을 위한 예시적인 부위는 이에 제한되는 것은 아니며, 가능한 수용체 결합 영역, 또는 결합 단백질 또는 리간드에 결합하기 위한 영역에서 배제된 부위, 완전하게 또는 부분적으로 용매 노출된 부위, 근처 잔기와 최소한 또는 전혀 수소 결합 상호작용을 하지 않는 부위, 인접 반응성 잔기에 최소 노출된 부위, 및/또는 연관 수용체, 리간드 또는 결합 단백질과 특정 폴리펩티드의 3차원 결정 구조에 의해 예측된 고도로 탄력적인 영역에 존재하는 부위 등을 포함한다.

광범위한 비천연 아미노산이 경우에 따라 폴리펩티드의 주어진 위치로 치환되거나 또는 도입된다. 예를 들어, 특정 비천연 아미노산은 이의 관련 리간드, 수용체 및/또는 결합 단백질과 폴리펩티드의 3차원 결정 구조의 조사, 보존적 치환에 대한 선호를 기초로 도입을 위해 선택된다.

일 구체예에서, 본 발명에서 기술하는 방법은 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 도입시키는 단계로서, 여기서 비천연 아미노산은 제1 반응성 기를 포함하는 것인 단계; 및 상기 폴리펩티드를 제2 반응성 기를 포함하는 분자(이에 제한되는 것은 아니며, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부위; 방사성 부위; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부위; 화학 방사선 여기가능 부위; 리간드; 광이성질화 부위; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부위; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부위; 동위원소 표지된 부위; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀, 및 이의 임의 조합을 포함)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 제1 반응성기는 1,2-디카르보닐 부분이고 제2 반응성 기는 1,2-아릴디아민 부분이고, 이를 통해 퀴녹살린 연결이 형성된다. 일 구체예에서, 제1 반응성 기는 1,2-디카르보닐 부분이고 제2 반응성기는 1,2-아릴디아민 부분이며, 이를 통해 페나진 연결이 형성된다. 일 구체예에서, 제1 반응성기는 1,2-아릴디아민 부분이고 제2 반응성기는 1,2-디카르보닐 부분이고, 이를 통해 퀴녹살린 연결이 형성된다. 일 구체예에서, 제1 반응성기는 1,2-아릴디아민 부분이고 제2 반응성기는 1,2-디카르보닐 부분이며, 이를 통해 페나진 연결이 형성된다.

일부 경우에서, 비천연 아미노산 치환(들) 또는 도입9들)은 경우에 따라 다른 화학적, 물리적, 약리학적 및/또는 생물학적 특성에 영향을 주기 위해 폴리펩티드 내에 다른 부가, 치환 또는 결실을 조합시킨다. 일부 경우에서, 다른 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 안정성(이에 제한되는 것은 아니고, 단백질가수분해에 대한 내성 포함) 증가시키거나 또는 적절한 수용체, 리간드 및/또는 결합 단백질에 대한 폴리펩티드의 친화성을 증가시킨다. 일부 경우에서, 다른 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 가용성(이에 제한되는 것은 아니고, 이.콜라이 또는 다른 숙주 세포 내에서 발현시를 포함)을 증가시킨다. 일 구체예에서, 부위는 이.콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현 후 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 목적을 위해 비천연 아미노산을 도입시키기 위한 다른 부위 이외에도 천연적으로 코딩된 또는 비천연 아미노산으로의 치환을 위해 선택한다. 일 구체예에서, 폴리펩티드는 관련된 리간드, 결합 단백질 및/또는 수용체에 대한 친화성을 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절(이에 제한되는 것은 아니고, 증가 또는 감소 포함)하거나, 수용체 이량체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체이용성을 조절하거나, 정제를 촉진하거나, 또는 특정 투여 경로를 개선 또는 변경시키는 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 화학 또는 효소 절단 서열, 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인(이에 제한되는 것은 아니고, FLAG 또는 폴리-His 포함) 또는 다른 친화성 기반 서열(이에 제한되는 것은 아니고, FLAG, 폴리-His, GST 등) 또는 검출(이에 제한되는 것은 아니고, GFP), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 프로드러그 방출 또는 활성화, 크기 감소 또는 폴리펩티드의 다른 특성을 개선시키는 연결 분자(이에 제한되는 것은 아니고 비오틴 포함)를 포함한다.

IV. 예로서의 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리

본 발명에서 기술한 방법, 조성물, 전략 및 기법은 특정 유형, 부류 또는 패밀리의 폴리펩티드 또는 단백질에 제한되는 것이 아니다. 또한, 실제로 임의 폴리펩티드를 경우에 따라 본 발명에서 기술한 하나 이상의 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산을 포함하도록 디자인 또는 변형시킨다. 예를 들어, 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4. MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학주성 단백질-1, 단핵구 화학주성 단백질-2, 단핵구 화학주성 단백질-3, 단핵구 염증성 단백질-1 알파, 단핵구 염증성 단백질-i 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅(exfoliating) 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그(hedgehog) 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린(neurturin), 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자(oncogene) 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀(pleiotropin), 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신(relaxin), 레닌(renin), SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타낼 수 있다.

따라서, 성장 호르몬(GH) 수퍼유전자 패밀리의 하기 설명은 설명 및 예시를 위한 목적으로 제공된 것이지 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 또한, 본 발명에서 GH 폴리펩티드에 대한 언급은 GH 수퍼유전자 패밀리의 임의의 구성원의 예로서 포괄적인 용어를 사용하기 위한 것이다. 따라서, GH 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에 기재된 변형 및 화학적 기법은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것들을 비롯한 GH 수퍼유전자 패밀리의 임의의 구성원에 동일하게 적용될 수 있다.

하기 단백질들은 성장 호르몬(GH) 수퍼유전자 패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 단백질들을 포함한다(문헌[Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1991); Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)] 참조): 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리쓰로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀-1(CT-1)("GH 수퍼유전자 패밀리"). 향후, 유전자 클로닝 및 시퀀싱을 통해 이 유전자 패밀리의 추가 구성원이 확인될 것으로 기대된다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 동일성을 갖는다는 사실에도 불구하고 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유되는 구조적 특징은 상기 유전자 패밀리의 신규 구성원이 용이하게 확인될 수 있게 하고, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에 유사하게 적용된다.

G-CSF(문헌[Zink et al., FEBS Lett. 314: 435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33: 8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167 (1993)] 참조), GM-CSF(문헌[Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al., J. Mol. Biol. 224: 1075-1085 (1992)] 참조), IL-2(문헌[Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); McKay, D. B. Science 257: 412(1992)] 참조), IL-4(문헌[Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035(1991); Powers et al., Science 256: 1673-1677 (1992)] 참조), 및 IL-5(문헌[Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)] 참조)를 비롯한 다수의 사이토카인의 구조가 X선 회절 및 NMR 연구에 의해 결정되었으며, 상당한 1차 서열 상동성이 결여되어 있음에도 불구하고 GH 구조에서의 현저한 보존성을 보인다. IFN은 모델링 및 다른 연구를 기초로 하여 이 패밀리의 구성원인 것으로 간주되고 있다(문헌[Lee et al., J. Growth hormone Cytokine Res. 15: 341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17: 62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4: 1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. 274: 661 (1997)] 참조). 알파, 베타, 오메가, 타우, 엡실론 및 감마 인터페론과 같은 IFN뿐만 아니라 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 트롬보포이에틴(TPO), 온코스타틴 M, 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)를 포함하는 상당수의 추가 사이토카인 및 성장 인자들이 이 패밀리에 속한다(문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and IhIe (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS] 검토). 현재 상기 사이토카인 및 성장 인자들 모두가 하나의 큰 유전자 패밀리를 구성하는 것으로 간주된다.

이 패밀리의 구성원은 유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 것 외에도, 세포 표면 수용체를 반드시 올리고머화시켜 세포 내 신호 전달 경로를 활성화시키는 성질을 공유한다. GH 및 EPO를 포함하나 이들로 한정되지 않는 일부 GH 패밀리 구성원은 단일 유형의 수용체에 결합하여 상기 수용체가 동종이량체를 형성한다. IL-2, IL-4 및 IL-6을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 패밀리 구성원은 하나 이상의 유형의 수용체에 결합하여 상기 수용체가 이종이량체 또는 보다 높은 차수의 응집물을 형성하게 한다(문헌[Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)] 참조). 돌연변이유발 연구는 GH와 마찬가지로 다른 사이토카인 및 성장 인자들도 다수의 수용체 결합 부위, 전형적으로 2개의 수용체 결합 부위를 함유하고, 그들의 동족(cognate) 수용체에 순차적으로 결합한다는 것을 밝혀냈다(문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476] 참조). GH와 마찬가지로, 이러한 다른 패밀리 구성원에 대한 1차 수용체 결합 부위는 주로 4개의 알파 나선 및 A-B 루프에서 발생한다. 수용체 결합에 참여하는 나선 다발 내의 특정 아미노산은 상기 패밀리 구성원간에 서로 상이하다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원과 상호작용하는 세포 표면 수용체의 대부분은 구조적으로 관련되어 있고, 제2의 큰 다중-유전자 패밀리를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제6,608,183호를 참조할 수 있으며, 이를 GH 수퍼유전자 패밀리의 설명을 위해 참조하여 포함시킨다.

GH 수퍼유전자 패밀리의 다양한 구성원의 돌연변이 연구로부터 얻은 일반적인 결론은, 일반적으로 알파 나선을 연결시키는 루프는 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 점이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 전부는 아니더라도 대부분의 패밀리 구성원에서 수용체 결합에 대해 필수적이지 않은 것으로 보인다. 이러한 이유로, B-C 루프는 경우에 따라 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원에서 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, A-B 루프, C-D 루프(및 GH 수퍼패밀리의 인터페론/IL-10 유사 구성원의 D-E 루프)도 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, 나선 A에 근접해 있으며, 최종 나선에 멀리 떨어져 있는 아미노산도 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있고, 또한 비천연 아미노산을 도입하기 위한 부위일 수 있다. 일부 구체예에서, 비천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 이상의 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 루프 구조 내의 임의의 위치에서 치환된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 이상의 아미노산 내에서 치환된다.

EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IFN, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12, p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론을 포함하나 이들로 한정되지 않는 GH 패밀리의 특정 구성원은 N-연결 및/또는 O-연결 당을 함유한다. 단백질 내의 글리코실화 부위는 거의 루프 영역에서만 발생하고 알파 나선 다발에서는 발생하지 않는다. 일반적으로, 루프 영역은 수용체 결합에 관여하지 않고, 당 기의 공유결합에 대한 부위이기 때문에, 이들은 비천연 아미노산 치환을 단백질 내로 도입하기에 유용한 부위일 수 있다. 단백질에서 N-연결 글리코실화 부위 및 O-연결 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산은 표면에 노출되기 때문에 비천연 아미노산 치환을 위한 선택적인 부위일 수 있다. 따라서, 천연 단백질은 이들 부위에서 단백질에 부착되는 벌키한 당 기를 허용할 수 있고, 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위로부터 떨어져 위치하는 경향이 있을 수 있다.

앞으로 추가 GH 수퍼유전자 패밀리의 추가 구성원이 발견될 가능성이 크다. 예를 들어, 예측되는 단백질 서열의 컴퓨터-보조 2차 및 3차 구조 분석 및 특정 표적에 결합하는 분자를 확인하도록 디자인된 선별 기법에 의해 GH 수퍼유전자 패밀리의 신규 구성원을 동정할 수 있다. 대체적으로, GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 비-나선 아미노산(루프 영역)에 의해 연결된 4개의 또는 5개의 양친매성 나선을 갖는다. 단백질은 그들의 N-말단에서 소수성 신호 서열을 함유하여 세포로부터의 분비가 촉진될 수 있다. 또한, 이러한 추후 발견될 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원도 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 포함된다.

V. 비천연 아미노산

본 발명에서 기술하는 방법 및 조성물에서 사용되는 비천연 아미노산은 다음의 4가지 특성 중 1 이상을 갖는다: (1) 비천연 아미노산의 측쇄 상의 하나 이상의 작용기는 20종의 공통된 유전적으로 코딩된 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)의 화학적 반응성에 대해 오르쏘고날하거나 또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 존재하는 천연 발생 아미노산의 화학적 반응성에 오르쏘고날인 하나 이상의 특성 및/또는 활성 및/또는 반응성을 갖는다; (2) 도입된 비천연 아미노산이 20종의 공통된 유전적으로 코딩된 아미노산에 대한 실질적인 화학적 불활성을 나타낸다; (3 비천연 아미노산은 천연 발생 아미노산에 적합한 안정성 또는 전형적인 생리적 조건 하에서, 폴리펩티드에 안정적으로 도입되며, 이러한 안정한 도입은 경우에 따라 생체내 시스템을 통해 일어날 수 있다; 및 (4) 비천연 아미노산은 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 특성을 파괴하지 않는 조건(물론, 이러한 생물학적 특성의 파괴가 변형/변환을 목적으로 하지 않는 경우)하에서 시약과 반응시켜 퀴녹살린 또는 페나진 기로 변환되는 작용성 기를 포함하거나, 여기서 상기 변환은 경우에 따라 약 pH 3 내지 약 pH 8; 약 pH 4 내지 약 pH 10; 약 pH 4 내지 약 pH 8, 및 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 4 내지 약 pH 7, 약 pH 3 내지 약 pH 4, 약 pH 7 내지 약 pH 8, 약 pH 4 내지 약 pH 6, 약 pH 4 및 약 pH 6을 포함하는, 약 pH 2 내지 약 pH 10의 수성 조건 하에서 일어난다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 비천연 아미노산에 대한 이들 4종의 성질을 만족시키는 아미노산의 예시적 비제한적 예는 도 12에 도시하였다. 임의의 수의 비천연 아미노산을 경우에 따라 폴리펩티드 내로 도입시킬 수 있다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 보호되거나 마스크된 퀴녹살린 또는 페나진, 또는 마스크된 기의 탈마스크화 또는 보호기의 탈보호 이후에 퀴녹살린 또는 페나진 기로 변환되는 보호되거나 마스크된 기를 포함한다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산은 보호기의 탈보호화 또는 마스크된 기의 탈마스크화 이후에 1,2-디카르보닐 기로 변환되어서 1,2-아릴디아민과 반응하여 퀴녹살린 또는 페나진 기를 형성하게되는 보호되거나 마스크된 1,2-디카르보닐 기를 포함한다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산은 보호기의 탈보호화 또는 마스크된 기의 탈마스크화 이후에 1,2-아릴디아민 기로 변환되어서 1,2-디카르보닐과 반응하여 퀴녹살린 또는 페나진 기를 형성할 수 있는 보호되거나 마스크된 1,2-아릴디아민 기를 포함한다.

본 발명에 기재된 방법 및 조성물에서 경우에 따라 사용하는 비천연 아미노산은 이에 제한되는 것은 아니며, 광활성가교제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사능 아미노산, 신규 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이징 및/또는 광이성질화 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들면 당 치환된 세린, 다른 탄수화물에 의해 변형된 아미노산, 케토-함유 아미노산, 알데히드-함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학절단성 및/또는 광절단성 아미노산, 약 5개 이상 또는 약 10개 이상의 탄소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 장쇄 탄화수소 또는 폴리에테르를 포함하나 이들로 한정되지 않는 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄를 갖는 아미노산, 탄소-연결 당 함유 아미노산, 리독스-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산이 있으나 이들로 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, 비천연 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린이 있다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는 아미노산과 사카라이드 사이의 천연 발생 N-연결 또는 0-연결이 이에 제한되는 것은 아니며, 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하는 천연 상태에서 통상적으로 발견되지 않는 공유결합에 의해 교체되어 있는 예시적 아미노산들을 포함한다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는 천연 발생 단백질에서는 통상적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예를 들면 2-데옥시-글루코즈, 2-데옥시갈락토즈 등이 있다.

이러한 폴리펩티드에 비천연 아미노산의 도입을 통해 폴리펩티드에 도입되는 화학 부분은 다양한 폴리펩티드의 조작 및 이점을 제공하다. 예를 들어, 1,2-디카르보닐 및 1,2-아릴디아민 작용기의 고유 반응성은 생체 내 및 시험관 내 둘 모두에서 단백질의 선택적인 변형을 가능하게 한다. 일 구체예에서, 예를 들어 중원자 비천연 아미노산은 X선 구조 데이터를 위상화하는 데 유용할 수 있다. 비천연 아미노산을 이용한 중원자의 부위 특이적 도입은 중원자에 대한 위치를 선별하는데 있어서 선택성 및 탄력성을 제공한다. 광반응성 비천연 아미노산(이에 제한되는 것은 아니며 벤조페논 및 아릴아지드(이에 제한되는 것은 아니고 페닐아지드 측쇄 포함)를 포함)은 예를 들어, 폴리펩티드의 효과적인 생체 내 및 시험관내 광가교를 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예는 이에 제한되는 것은 아니고, p-아지드-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함한다. 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 경우에 따라 광반응성 기 제공 일시 제어(temporal control)의 여기를 통해 마음대로 가교시키게 된다. 비제한적인 예에서, 비천연 아미노산의 메틸기는 이에 제한되는 것은 아니며 핵자기 공명 및 진동 분광법의 이용을 포함하여, 국지 구조 및 역학의 프로브로서, 이에 제한되는 것은 아니며 메틸기를 갖는 것을 포함하여, 동위원소 표지된 것으로 치환시킨다.

A. 1,2-디카르보닐, 보호된 1,2-디카르보닐, 마스크된 1,2-디카르보닐 및 1,2-디카르보닐 유사기

1,2-디카르보닐 작용기를 갖는 아미노산을 1,2-아릴디아민과 반응시켜 퀴녹살린 또는 페나진을 형성시키며, 이들은 경우에 따라 다른 분자에 더욱 연결된다. 1,2-디카르보닐 작용기를 함유하는 비천연 아미노산은 다양한 1,2-아릴디아민기와 반응하여, 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 통해 접합체(이에 제한되는 것은 아니며, PEG 또는 다른 수용성 중합체 사용 포함)를 형성하는 것이 가능하다. 1,2-디카르보닐 작용기는 1,2-디카르보닐 유사기(구조적으로 1,2-디카르보닐 기와 유사하고 1,2-디카르보닐 기와 유사한 방식으로 1,2-아릴디아민과 반응하게 됨), 마스크된 1,2-디카르보닐 기(경우에 따라 1,2-디카르보닐 기로 용이하게 전환됨), 또는 보호된 1,2-디카르보닐 기(탈보호화시에 1,2-디카르보닐 기와 유사한 반응성을 가짐)를 포함한다.

이러한 아미노산의 하기 화학식 I의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")(CO)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

J는 이고, 여기서 X는 CH₂, NR", O 또는 S이고, n은 0, 1, 2 또는 3이고, R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬; 시클로알킬이고,

R₁은 H, 아미노산 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 함께 선택된 R³ 및 R⁴ 또는 함께 선택된 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나, 또는

-A-B-J-R 기는 함께 1,2-디카르보닐 기, 보호된 1,2-디카르보닐 기 또는 마스크된 1,2-디카르보닐 기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기는 함께 1,2-디카르보닐 기, 보호된 1,2-디카르보닐 기 또는 마스크된 1,2-디카르보닐 기를 포함하는 단환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.

J는 경우에 따라 임의 위치에서 B 및 R에 부착된다는 것을 주목한다. 비제한적인 예로서, J가 시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온 유도체인 경우, B 및 J는 경우에 따라 하기에 나타낸 바와 같이 고리 주변 3,4-, 3,5-, 3,6-, 또는 4,5-위치에 위치한다:

일 구체예에서, 고리는 경우에 따라 치환될 수 있음을 주목한다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태이거나 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

일 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 온화한 산성 조건 하에서 1 개월 이상 동안 수용액 중에서 안정하다. 일 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 온화한 산성 조건 하에서 2주 이상 동안 안정하다. 일 구체예에서, 화학식 I의 화합물은 온화한 산성 조건 하에서 5일 이상 동안 안정하다. 일 구체예에서, 상기 산성 조건은 pH 약 3 내지 약 8, pH 약 4 내지 약 10, pH 약 4 내지 약 8 및 pH 약 4.5 내지 약 7.5, pH 약 4 내지 약 7, pH 약 3 내지 약 4, pH 약 7 내지 약 8, pH 약 4 내지 약 6, pH 약 4 및 pH 약 6을 포함하는, pH 약 2 내지 약 10이다.

화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우, 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -0-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R은 C_{1 -6} 알킬 또는 시클로알킬이다. R은 -CH₃, -CH(CH₃)₂ 또는 시클로프로필이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R¹은 H, tert-부틸옥시카르보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA) 또는 벤질옥시카르보닐(Cbz)이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R¹은 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R²는 OH, O-메틸, O-에틸 또는 O-t-부틸이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R²는 수지, 아미노산, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R²는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R²는 리보핵산(RNA)이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R²는 tRNA이다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, tRNA는 특이적으로 셀렉터 코돈을 인식한다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, 실렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 고유 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 이루어진 군에서 선택된다. 화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, R²는 서프레서 tRNA이다.

화학식 I의 화합물의 일 구체예에서, -A-B-는 하기 (i), (ii), (iii) 및 (iv)로 이루어진 군에서 선택된다:

(i) A는 치환된 저급 알킬렌, C₄-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고,

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다;

(ii) A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 치환된 저급 알킬렌, C₄-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다;

(iii) A는 저급 알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다; 및

(iv) A는 페닐렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

또한, 하기 화학식 II의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고,

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태이거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기 화학식 III의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, 각각의 화합물은 경우에 따라 아미노 보호되고 카르복실 보호되거나, 또는 이의 염이다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며,

n은 0 내지 8이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, 이러한 화합물들은 경우에 따라 아미노 보호되고 카르복실 보호되거나, 또는 이의 염이다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

1,2-디카르보닐 작용기화는 수용액 중 온화한 조건 하에서 선택적으로 1,2-아릴디아민 함유 시약과 반응하여 생리적 조건 하에서 안정한 상응하는 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 형성한다. 또한, 디카르보닐기의 고유한 반응성은 다른 아미노산 측쇄 존재하에서 선택적인 변형을 가능하게 한다. 문헌 [Cornish, V W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151(1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G.. Bioconjug. Chem. 3: 138-146(1992); Mahal, I. K. et al., Science 276: 1125-1128(1997)]을 참조한다.

p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746(2003)]에 기술되어 있으며, 본 발명의 합성 방법에 대한 참조문헌으로 포함시킨다. 다른 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 아미노산을 필요하다면 유사하게 제조한다. 또한, 본 발명에 포함되는 비천연 아미노산의 비제한적인 예시적인 합성법은 실시예 1 및 16에 나타내었다.

B. 1,2-아릴디아민, 보호된 1,2-아릴디아민 및 마스크된 1,2-아릴디아민 기

1,2-아릴디아민 기를 함유하는 비천연 아미노산은 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 통해서, 접합체(이에 제한되는 것은 아니며, PEG 또는 다른 수용성 중합체를 갖는 것을 포함)를 형성하도록 다양한 1,2-디카르보닐 또는 1,2-디카르보닐 동등 기와 반응을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에서 기술하는 구체예는, 1,2-아릴디아민 기, 1,2-아릴디아민 유사기(1,2-아릴디아민 기와 구조적으로 유사하고 1,2-아릴디아민 기아 유사한 방식으로 1,2-디카르보닐과 반응하게됨), 마스크된 1,2-아릴디아민 기(경우에 따라 용이하게 1,2-아릴디아민 기로 전환됨), 또는 보호된 1,2-아릴디아민 기(탈보호시 1,2-아릴디아민 기와 유사한 반응성을 가짐)를 포함하는 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이다. 이러한 아미노산은 하기 화학식 V의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고,

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

J는 이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 함께 선택된 R³ 및 R⁴ 또는 함께 선택된 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-A-B-J-R 기는 함께 1,2-아릴디아민 기, 보호된 1,2-아릴디아민 기 또는 마스크된 1,2-아릴디아민 기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기를 형성하거나; 또는

-J-R 기는 함께 1,2-아릴디아민 기, 보호된 1,2-아릴디아민 기 또는 마스크된 1,2-아릴디아민 기를 포함하는 단환 또는 이환 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기를 형성한다.

J는 임의 위치에서 B 및 R에 부착된다는 것을 주목한다. 비제한적인 예로서, J가 1,2-디아미노페닐 유도체인 경우, B 및 J는 하기에 도시한 바와 같이, 고리 주변의 3,4-, 3,5-, 3,6- 또는 4,5-위치에 위치한다:

또한 상기 고리는 경우에 따라 치환될 수 있음을 주목한다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태이거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O), -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, =N-O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

또한, 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고,

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 함께 선택된 R³ 및 R⁴ 또는 함께 선택된 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 화학식 VIII의 구조를 갖는 하기 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(R')-, -S-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O), -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-; -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기의 아미노산을 포함한다:

여기서, 상기 화합물들은 경우에 따라 아미노 보호되고 카르복실 보호되거나, 또는 이의 염이다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 화학식 IX의 구조를 갖는 하기 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(R')-, -S-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O), -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-; -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며,

n은 0 내지 8이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 하기 아미노산을 포함한다:

여기서, 상기 화합물들은 경우에 따라 아미노 보호되고 카르복실 보호되거나, 또는 이의 염이다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

또한, 화학식 X의 구조를 갖는 하기 아미노산을 포함한다:

상기 식에서, R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂-, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 이루어진 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

C. 퀴녹살린 및 페나진 기

퀴녹살린 또는 페나진 기를 함유하는 비천연 아미노산은 1,2-아릴디아민을 함유하는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 함유 시약과 반응시키거나, 또는 1,2-디카르보닐을 함유하는 비천연 아미노산을 1,2-아릴디아민을 함유하는 시약과 반응시켜 생성된다. 상기 시약은 경우에 따라 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀, 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 분자에 추가로 연결된다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 폴리펩티드에 도입되고, 여기서 적절한 시약과 반응시 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 통해 폴리펩티드와 목적 분자 간의 접합체가 형성된다.

이러한 아미노산은 하기 화학식 XI의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고,

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이고, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

J는 이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R³ 및 R⁴ 또는 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, CN, NO₂-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂이고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, L-Y이거나, 또는 R" 기가 하나보다 많이 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬을 형성하며;

하나보다 많은 R₅ 기가 존재하는 경우, 2개의 R₅는 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성하고;

Y는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 약물 전달제, 전자 전달 제제, 호르몬, 스테로이드, 효소, 비타민, 영양분, 식이 보조제, 면역글로불린, 사이토카인, 인터루킨, 인터페론, 뉴클레아제, 인슐린, 종양 억제제, 혈액 단백질, 호르몬 또는 호르몬 유사체, 백신, 항원, 혈액 응고 인자, 성장 인자, 리보자임 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고;

L은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N-, -C(R')₂=N-N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')(여기서, k는 1, 2 또는 3임)로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며; 또는

-A-B-J-R 기는 함께 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기는 함께 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 포함하는 단환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.

일 구체예에서, Y는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 산화물; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당 기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 비오틴; 비오틴 유사체; 검출가능 표지; 및 이의 임의 조합에서 선택된다.

일 측면은 하기 화학식 1-6의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 활성 대사산물, 프로드러그, 용매화물, 다형체, 호변이성질체 또는 겨울상이성질체이다:

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이고, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")(CO)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

X는 -C(R₅)(R₅)-, -NR₅-, -O- 또는 -S-이고;

Y는 -CR₅- 또는 -N-이고;

n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; m은 0,1, 2, 3 또는 4이며; 단, m+n은 1, 2, 3 또는 4이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거, 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")₂ 또는 -L-Z이거나; 또는

함께 선택된 2개의 R₅ 기는 경우에 따라 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴을 형성하고;

각각의 R"은 독립적으로 H, 보호기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬이거나, 또는 하나보다 많은 R" 기가 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 헤테로아릴이며;

Z는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 약물 전달제, 전자 전달 제제, 호르몬, 스테로이드, 효소, 비타민, 영양분, 식이 보조제, 면역글로불린, 사이토카인, 인터루킨, 인터페론, 뉴클레아제, 인슐린, 종양 억제제, 혈액 단백질, 호르몬 또는 호르몬 유사체, 백신, 항원, 혈액 응고 인자, 성장 인자, 리보자임 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고;

L은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 치환된 아르알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)O-, -C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -OC(O)-, -OC(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CS-, -N(R')CS-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, OC(O)N(R')-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')S(O)_k-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -N=C(R')-, -N=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, 또는 -C(R')₂-N(R')-N(R')-이고, 여기서 k는 0, 1 또는 2이고 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며; 또는

-A-B-페나진 또는 퀴녹살린 함유 부분 기는 함께, 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 포함하는, 치환 또는 미치환된 이환 또는 삼환, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하거나; 또는

-B-페나진 또는 퀴녹살린 함유 부분 기는 함께, 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 포함하는, 치환 또는 미치환된 단환 또는 이환, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성한다.

일 구체예에서, Z는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 산화물; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당 기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 비오틴; 비오틴 유사체; 검출가능 표지; 및 이의 임의 조합에서 선택된다.

추가 구체예는 하기 화학식 7-12의 구조를 갖는 화합물이다:

상기 식에서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 k는 1, 2, 또는 3이고 R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

다른 구체예는 하기 화학식 XI-A에 상응하는 화합물이다:

[화학식 XI-A]

다른 구체예는 하기 화학식 XI-B에 상응하는 화합물이다:

[화학식 XI-B]

상기 식에서, 각각의 R₃은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR', -SR'-, -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고; R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴이고; B는 -CH₂-, -N(R')-, -O- 또는 -S-이며; R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.

추가 구체예는 하기 화학식 XI-C에 상응하는 화합물이다:

[화학식 XI-C]

상기 식에서, B는 -O-, -S- 또는 -N(R')-이고, R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

또 다른 구체예는 하기 화학식 XI-D에 상응하는 화합물이다:

[화학식 XI-D]

상기 식에서, R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)N(R')₂, -OR'- 및 -S(O)_kR'으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 k는 1, 2 또는 3이고 R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

다른 구체예는 하기 화학식 XI-E에 상응하는 화합물이다:

[화학식 XI-E]

이러한 아미노산의 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드에 도입되고 경우에 따라 번역후 변형된다.

D. 비천연 아미노산의 세포내 흡수

진핵생물 세포에 의한 비천연 아미노산의 흡수는 이에 제한되는 것은 아니며, 단백질로의 도입을 포함하여, 비천연 아미노산을 디자인하고 선택할 때 통상적으로 고려하는 이슈 중 하나이다. 예를 들어, 높은 전하 밀도의 α-아미노산은 이들 화합물이 세포 투과성이 아닌 것으로 알려져 있다. 천연 아미노산은 단백질 기반 수송 시스템의 수집을 통해 진핵생물 세포로 흡수된다. 세포에 의해서 비천연 아미노산이 흡수되는 경우를 평가하기 위해 급속 스크리닝을 실시하였다(실시예 16은 경우에 따라 비천연 아미노산에 대해 수행된 테스트의 비제한적인 예를 나타낸 것이다. 예를 들어, U.S. 공개 특허 출원 제2004/198637호(발명의 명칭: 단백질 분석)를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시키며, 문헌 [Lin, D.R. & Schuitz. P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785]도 참조한다. 다양한 분석법을 통해 용이하게 흡수를 분석하였지만, 세포 흡수 경로에 따르는 비천연 아미노산을 디자인하기 위한 대안법은 생체 내에서 아미노산을 생성하기 위한 생합성 경로를 제공한다.

대체로, 본 발명에서 기술하는 세포 흡수를 통해 생성된 비천연 아미노산은 이에 제한되는 것은 아니며, 천연 세포내 양을 포함하는, 효율적인 단백질 생합성을 위해서 충분한 농도이지만, 다른 아미노산의 농도에 영향을 주거나 세포 공급원을 소모할 정도는 아닌 농도로 생성된다. 이러한 방식으로 생성된 농도는 대체로 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다.

E. 비천연 아미노산의 생합성

아미노산 및 다른 화합물을 생성하는 많은 생합성 경로들이 세포에 이미 존재한다. 특정 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법은 이에 제한되는 것은 아니고 세포에 존재하는 것을 포함하여 자연계에 존재할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 경우에 따라 신규 효소를 첨가하거나 존재하는 숙주 세포 경로를 변경함으로써 숙주 세포에서 생성된다. 추가의 신규 효소는 천연 발생 효소 또는 인공적으로 진화시킨 효소가 포함된다. 예를 들면, p-아미노페닐알라닌의 생합성(국제특허공보 제WO 2002/085923호(발명의 명칭: "비천연 아미노산의 생체내 도입")의 실시예에서 제공됨)은 다른 유기체로부터의 공지된 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 이 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 진핵생물 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 원하는 화합물을 합성하는 효소적 경로를 제공한다. 경우에 따라 첨가되는 효소 유형의 예는 본 발명에서 제공된다. 추가 효소 서열은 예를 들면, 유전자은행(Genbank)에서 찾을 수 있다. 또한, 인공적으로 진화된 효소는 동일한 방식에 의해 세포 내로 부가시킬 수 있다. 이 방식으로, 세포 기구 및 세포 자원을 개조하여 비천연 아미노산을 생성한다.

신규 효소를 제조하기 위한 다양한 방법들이 생합성 경로에서의 사용 또는 현존하는 경로의 진화를 위해 이용가능하다. 경우에 따라, 예를 들면, 멕시겐, 인코포레이티드(Maxygen, Inc.)(월드 와이드 웹 maxygen.com에서 입수가능)에 의해 개발된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 반복적 재조합을 사용하여 신규 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들면, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4): 389-391; and, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 유사하게, 제넨코르(Genencor)(월드 와이드 웹 genencor.com에서 입수가능함)에 의해 개발된 디자인패쓰(DesignPath)^TM는 이에 제한되는 것은 아니고 경우에 따라 세포 내에서 비천연 아미노산을 생성하는 경로를 조작하는 것을 포함하는 대사 경로 조작에 사용된다. 이 기법은 기능 유전체학 및 분자의 진화 및 디자인을 통해 확인된 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는 신규 유전자의 조합물을 사용하여 숙주 유기체 내에서 기존 경로를 재구성한다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹 상의 diversa.com에서 입수가능)도 비천연 아미노산을 생합성적으로 생성하기 위한 신규 경로를 찾기 위한 목적을 포함하나 이로 한정되지 않는, 유전자 경로 및 유전자의 라이브러리를 신속하게 스크리닝하기 위한 기법을 제공한다.

전형적으로, 본 명세서에 기재된 유전자조작된 생합성 경로를 사용하여 생성된 비천연 아미노산은 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나 세포 자원을 고갈시키는 정도는 아니지만 천연 세포 내에서의 양을 포함하나 이로 한정되지 않는 효율적인 단백질 생합성에 충분한 농도로 생성된다. 이 방식으로 생체내에서 생성되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 세포를 특정 경로에 바람직한 효소를 생성하는 데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시키고, 비천연 아미노산이 생성되면, 경우에 따라, 생체내 선별을 이용하여 리보솜 단백질 합성 및 세포 성장 둘다에 대해 비천연 아미노산의 생성을 더 최적화시킨다.

F. 추가 합성 방법

본 명세서에 기재된 비천연 아미노산은 경우에 따라, 공지된 방법을 이용하거나, 본 명세서에 기재된 기법을 이용하거나, 이들을 조합하여 합성할 수 있다. 보조적으로, 하기 표는 조합시, 목적하는 작용기를 생성하는 다양한 출발 친전자체 및 친핵체를 제공한다. 제공된 정보는 설명을 위한 것이지 본 명세서에 기재된 합성 기법을 한정하고자 하는 것이 아니다. 하기 표 1은 공유 결합 및 이의 전구체의 예를 나타낸 것이다.

공유결합 생성물	친전자체	친핵체
카르복스아미드	활성화 에스테르	아민/아닐린
카르복스아미드	아실 아지드	아민/아닐린
카르복스아미드	아실 할라이드	아민/아닐린
에스테르	아실 할라이드	알콜/페놀
에스테르	아실 니트릴	알콜/페놀
카르복스아미드	아실 니트릴	아민/아닐린
이민	알데히드	아민/아닐린
옥심	알데히드 또는 케톤	히드록실아민
알킬 아민	알킬 할라이드	아민/아닐린
에스테르	알킬 할라이드	카르복실산
티오에테르	알킬 할라이드	티올
에테르	알킬 할라이드	알콜/페놀
티오에테르	알킬 설포네이트	티올
에스테르	알킬 설포네이트	카르복실산
에스테르	알킬 설포네이트	알콜/페놀
에스테르	무수물	알콜/페놀
카르복스아미드	무수물	아민/아닐린
티오페놀	아릴 할라이드	티올
아릴 아민	아릴 할라이드	아민
티오에테르	아진딘	티올
보로네이트 에스테르	보로네이트	글리콜
카르복스아미드	카르복실산	아민/아닐린
에스테르	카르복실산	알콜
N-아실우레아 또는 무수물	카르보디이미드	카르복실산
에스테르	디아조알칸	카르복실산
티오에테르	에폭시드	티올
티오에테르	할로아세트아미드	티올
암모트리아진	할로트리아진	아민/아닐린
트리아지닐 에테르	할로트리아진	알콜/페놀
아미딘	이미도 에스테르	아민/아닐린
우레아	이소시아네이트	아민/아닐린
우레탄	이소시아네이트	알콜/페놀
티오우레아	이소티오시아네이트	아민/아닐린
티오에테르	말레이미드	티올
포스파이트 에스테르	포스포르아미다이트	알콜
실릴 에테르	실릴 할라이드	알콜
알킬 아민	설포네이트 에스테르	아민/아닐린
티오에테르	설포네이트 에스테르	티올
에스테르	설포네이트 에스테르	카르복실산
에테르	설포네이트 에스테르	알콜
설폰아미드	설포닐 할라이드	아민/아닐린
설포네이트 에스테르	설포닐 할라이드	페놀/알콜

일반적으로, 탄소 친전자체는 탄소 친핵체를 비롯한 상보적 친핵체에 의해 공격받기 쉬운데, 이때 공격 친핵체는 친핵체와 탄소 친전자체 사이에 새로운 결합을 형성하도록 탄소 친전자체에 전자 1쌍을 제공한다.

탄소 친핵체의 비제한적인 예는 이에 제한되는 것은 아니며, 알킬, 알케닐, 아릴 및 알키닐 그리냐드, 유기리튬, 유기아연, 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-주석 시약(유기스타난), 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-보란 시약(유기보란 및 유기보로네이트)을 포함하며; 이들 탄소 친핵체들은 물 또는 극성 유기 용매 중에서 동역학적으로 안정하다는 장점을 가진다. 탄소 친핵체의 다른 비제한적인 예는 인 일리드, 에놀 및 에놀레이트 시약을 포함하고; 이들 탄소 친핵체들은 전구체들로부터 비교적 용이하게 생성된다는 장점을 가진다. 탄소 친핵체는 탄소 친전자체와 함께 사용하는 경우 탄소 친핵체와 탄소 친전자체 사이의 새로운 탄소-탄소 결합을 발생시킨다.

탄소 친전자체와 커플링에 적합한 비-탄소 친핵체의 비제한적인 예에는 1차 및 2차 아민, 티올, 티올레이트 및 티오에테르, 알콜, 알콕시드, 아지드, 세미카르바지드 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이들 비-탄소 친핵체들은 탄소 친전자체들과 함께 사용된 경우 전형적으로 헤테로원자 연결(C-X-C)을 발생시키고, 이때 X는 헤테로원자, 예를 들어, 산소 또는 질소이다.

VI. 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드

편의를 위해, 본 섹션에 기술하는 화합물의 형태, 특성 및 다른 특징들은 총칭적으로 및/또는 특정 예를 들어 기술하였다. 하지만, 본 섹션에서 기술하는 형태, 특성 및 다른 특징들은 본 섹션에서 제공하는 일반 설명 또는 특정예에만 한정해서는 안되며, 본 섹션에서 기술한 형태, 특성 및 다른 특징들은 본 명세서, 청구항 및 도면에서 기술하는 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 임의 하부화학식 또는 특정 화합물을 포함하여 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 모든 화합물에 동등하게 적용된다.

본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입시킨다. 비천연 아미노산은 폴리펩티드의 임의의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 비롯한 폴리펩티드 상의 임의의 위치에 존재한다. 바람직하게는, 비천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조의 파괴가 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 목적 중 하나인 경우가 아니라면 상동성 천연-발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는다. 또한, 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입함으로써 경우에 따라, 활성 및/또는 3차 구조를 완전히 파괴하지 않으면서, 활성(예를 들어, 폴리펩티드의 치료 효과의 개질, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 성질의 조절(예컨대, 수용성 및 생체이용성의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에의 추가 작용기의 제공, 태그, 표지 또는 검출가능한 신호의 폴리펩티드 내로의 도입, 폴리펩티드의 단리 성질의 개선, 및 전술한 변형의 임의의 조합) 및/또는 상동성 천연-발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 3차 구조를 어느 정도까지 변형시킬 수 있다. 활성 및/또는 3차 구조의 이러한 변형은 종종 이러한 도입을 수행하는 목적 중 하나이지만, 경우에 따라 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입한 것이 상동성 천연-발생 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조에 거의 영향을 미치지 않을 수도 있다. 따라서, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 제조 방법, 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 정제, 단리 및 특징규명 방법, 및 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물을 사용하는 방법은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 인정된다. 또한, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 또 다른 폴리펩티드(예를 들어, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 천연-발생 아미노산 폴리펩티드를 포함함)에 연결될 수도 있다.

본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 생합성적으로 또는 비-생합성적으로 제조된다. "생합성적으로"라 함은 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보솜 중 하나 이상을 사용하는 임의의 방법을 의미한다. "비-생합성적"이라 함은 번역 시스템을 사용하지 않는 임의의 방법을 의미하고, 이 방법은 고체 상태 펩티드 합성 방법, 고체상 펩티드 합성 방법, 하나 이상의 효소를 사용하는 방법, 및 하나 이상의 효소를 사용하지 않는 방법으로 더 분류될 수 있고; 또한, 이 하위-분류들 중 임의의 분류는 중첩될 수 있고, 많은 방법들이 경우에 따라 이들 하위-분류들을 이용한다.

본 명세서에 기재한 방법, 조성물, 전략 및 기법은 폴리펩티드의 특정 유형, 부류 또는 패밀리에 한정되는 것이 아니다. 또한, 본 명세서에서 기술하는 조성물의 범주는 실제로 임의 폴리펩티드가 본 발명에서 기술한 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하게 한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 이루어진 군에서 선택된 치료 단백질과 상동성을 갖는다. 관련 또는 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 성장 호르몬 수퍼유전자의 임의의 폴리펩티드 구성원과의 상동성을 나타낼 수도 있다.

비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이 추가 변형될 수 있거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 추가 변형 없이 사용될 수 있다. 폴리펩티드 내로의 비천연 아미노산의 도입은 경우에 따라 단백질 구조 및/또는 기능 변화의 조정(tailoring), 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 단백질분해효소 표적 부위의 접근용이성의 변화, 부분에 대한 표적화(단백질 어레이의 경우를 포함하나 이로 한정되지 않음)의 변화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 증강되거나 또는 심지어 완전히 새로운 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 경우에 따라 비천연 아미노산을 단백질 내로 포함시킴으로써 하기 성질들을 변화시킨다: 독성, 생체분포(biodistribution), 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나 이로 한정되지 않음), 공유결합 또는 비-공유결합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체 및 항체 단편을 포함하나 이로 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구 등을 포함하는 연구에 유용하다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다.

또한, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분(들)의 측쇄는 매우 광범위한 폴리펩티드에 추가 작용기를 제공할 수 있는데, 예를 들어, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부위의 측쇄는 경우에 따라 하기 작용기들 중 임의의 작용기를 포함할 수 있다: 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자 도입 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소형 분자; 저해성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획제; 비오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 애브자임; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물.

한 측면에서, 조성물은 이에 제한되는 것은 아니며, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 포함하여, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 동일하거나 상이하다. 또한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 상이하거나 또는 동일한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내에 경우에 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 상이한 부위가 존재한다. 다른 측면에서, 조성물은 폴리펩티드에 존재하는 특정 아미노산의 하나 이상이지만, 전체보다는 적은 수의 아미노산이 비천연 아미노산(들)으로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이하다(예를 들어, 폴리펩티드는 2 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나 또는 2개의 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2 이상의 비천연 아미노산을 갖는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나 또는 하나 이상의 상이한 비천연 아미노산과 동일한 유형의 비천연 아미노산 다수를 조합한다.

본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 구체예가 경우에 따라 고체상(예를 들어, 고체 수지 상에서) 펩티드 합성법, 용액상 펩티드 합성법 및/또는 효소 사용없이 화학적으로 합성할 수 있다 하더라도, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 구체예는 세포막, 세포 추출물 또는 용해물 시스템을 통한 합성 또는 생체내 시스템을 통한 합성, 즉 예를 들어 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포의 세포 기구를 사용한 합성을 가능하게 한다. 또 다른 또는 추가 구체예에서, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 핵심 특징들 중 하나는 이들을 리보솜을 사용하여 합성한다는 것이다. 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산의 또 다른 또는 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 이에 제한되는 것은 아니고 리보솜 및/또는 생체 내 시스템을 통하여, 효소 보조없이, 고체 수지의 조합을 포함하는 방법의 조합을 통해 합성된다.

리보솜 및/또는 생체내 시스템을 통한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성은 고체 수지 상에서 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 효소를 사용하지 않으면서 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드와 상이한 장점 및 특징을 가진다. 이 장점 또는 특징은 상이한 불순물 프로파일을 포함하는데, 즉 리보솜을 사용한 시스템 및/또는 생체내 시스템은 숙주 세포 단백질, 막의 일부 및 지질을 비롯한, 사용된 생물학적 시스템으로부터 유래한 불순물을 가지는 반면, 고체 수지를 사용한 시스템 및/또는 효소를 사용하지 않는 시스템으로부터의 불순물 프로파일은 유기 용매, 보호기, 수지 물질, 커플링제 및 합성 과정에서 사용된 다른 화학물질을 포함할 것이다. 또한, 리보솜의 사용 및/또는 생체내 시스템을 통해 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 방사성 패턴은 세포에서 사용되는 공급원료의 방사성 패턴과 유사한 반면, 고체 수지 상에서 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 방사성 패턴은 합성에 사용된 아미노산의 방사성 패턴과 유사할 것이다. 또한, 리보솜의 사용 및/또는 생체내 시스템을 통해 합성된 비천연 아미노산은 아미노산의 D-이성질체를 실질적으로 갖지 않을 것이고/것이거나, 내부 시스테인 아미노산을 폴리펩티드의 구조 내로 용이하게 도입할 수 있을 것이고/것이거나, 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 거의 제공하지 않을 것이다. 다른 한편으로, 고체 수지 상에서 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 보다 높은 함량의 아미노산의 D-이성질체 및/또는 보다 높은 비율의 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 가질 것이다. 더욱이, 당업자는 리보솜의 사용 및/또는 생체내 시스템의 사용에 의해 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 고체 수지 및/또는 효소의 비-사용을 통해 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 구별할 수 있을 것이다.

VII. 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법

A. 본 발명에서 사용할 일반적인 재조합 핵산 방법

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 많은 구체예에서, 원하는 폴리펩티드(예를 들어, GH 폴리펩티드를 포함함)를 코딩하는 핵산을 단리하고 클로닝하고, 종종 재조합 방법을 이용하여 변경시킨다. 이러한 구체예는 단백질 발현을 위해, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트(cassette), 또는 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열을 생성하는 동안에 이용하는 것을 포함하여 사용되지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성한 후, 관련 아미노산 잔기(들)의 도입(즉, 삽입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)에 영향을 주기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시킴으로써 생성된다. 뉴클레오티드 서열은 경우에 따라서 공지 방법에 따라 부위-지정 돌연변이유발에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성되는 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택하여 디자인한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드는 PCR, 결찰(ligation) 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되어 조립될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193(1991)], 및 미국특허 제6,521,427호를 참조할 수 있다.

본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 재조합 유전학 분야에서의 관용적인 기법을 이용한다. 본 발명에 이용되는 일반적 방법을 개시하는 교재는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.

분자 생물학적 기법을 설명하는 일반 교재는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 포함한다. 이러한 교재들은 비천연 아미노산, 오르쏘고날 tRNA, 오르쏘고날 합성효소 및 그들의 쌍을 포함하는 단백질을 생성하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자의 생성을 포함하나 이로 한정되지 않는 것과 관련된 돌연변이유발, 벡터의 사용, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기술하고 있다.

신규 합성효소 또는 tRNA의 생성, tRNA 분자의 돌연변이유발, 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발, tRNA의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈의 생성, 원하는 단백질 또는 폴리펩티드에서 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈의 삽입을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 다양한 종류의 돌연변이유발기법을 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에서 사용한다. 이들은 부위-지정, 무작위 점 돌연변이유발, 상동 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 반복적(recursive) 돌연변이유발 방법, 키메라 구축, 우라실 함유 주형을 사용한 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발, 갭을 가진(gapped) 이중체 DNA를 사용한 돌연변이유발 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 적절한 방법은 점 미스매치 복구(point mismatch repair), 복구능-결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발, 제한-선택 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이유발, 이중 가닥 절단 복구(double-strand break repair) 등을 포함한다. 키메라 구축물을 사용하는 돌연변이유발기법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이유발기법도 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에 포함된다. 한 구체예에서, 돌연변이유발기법은 서열, 서열 비교, 물성, 결정 구조 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 천연 발생 분자, 또는 변경된 또는 돌연변이된 천연 발생 분자의 공지된 정보에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서의 본문 및 예에는 이러한 절차 및 다른 관련 절차가 개시되어 있다. 하기 문헌 및 그에 인용된 참고문헌에서 추가 정보를 발견할 수 있다: 문헌[Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988); Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38: 879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligotiucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 또한, 많은 상기 방법에 대한 더 상세한 설명은 다양한 돌연변이유발 방법을 이용한 과제 해결에 대한 유용한 조절을 기술하는 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾을 수 있다.

또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 오르쏘고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 진핵생물 숙주 세포, 비-진핵생물 숙주 세포 및 유기체의 사용에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 구축물을 사용하여 유전자조작시킨다(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나 이로 한정되지 않음). 예를 들어, 오르쏘고날 tRNA, 오르쏘고날 tRNA 합성효소 및 유도화될 단백질에 대한 코딩 영역들을 원하는 숙주 세포에서 작용하는 유전자 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결한다. 벡터는 경우에 따라서 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 네이키드(naked) 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(문헌[Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 소형 비드 또는 입자의 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 가진 소립자에 의한 고속 탄두 침투(ballistic penetration)(문헌[Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참조)를 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다.

조작된 숙주 세포는 경우에 따라서 예를 들면, 스크리닝 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체의 선별과 같은 단계에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포들은 경우에 따라 형질전환 유기체 내에서 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예를 들면, 후속 핵산 단리)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참고문헌은 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York] 및 여기서 인용된 참고문헌[Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.

표적 핵산을 세포 내로 도입하는 몇몇 공지된 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 방법이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이들 방법은 수용 세포와, DNA를 함유하는 박테리아 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염(이하에서 추가로 논의됨) 등을 포함한다. 박테리아 세포는 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 DNA 구축물을 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 대수기(log phase)까지 성장하고, 박테리아 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법(예를 들면, 문헌[Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 다수의 키트가 시판되고 있다(예를 들면, Pharmacia Biotech에서 판매하는 EasyPrep^TM 및 FlexiPrep^TM; Stratagene에서 판매하는 StrataClean^TM; 및 Qiagen에서 판매하는 QIAprep^TM). 그 다음, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가로 개조하여, 세포를 형질감염시키는 데 사용되거나 유기체를 감염시키는 다른 관련 벡터 내로 도입되는 다른 플라스미드를 생성한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 터미네이터, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 경우에 따라 하나 이상의 독립된 종결서열, 진핵생물, 원핵생물 또는 이들 둘다(셔틀 벡터를 포함하나 이로 한정되지 않음)에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 및 원핵 및 진핵생물 시스템 둘다에 대한 선별 마커(marker)를 함유하는 일반 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는, 바람직하게는, 이들 둘다에서 복제 및 도입에 적합하다. 문헌[Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1): 10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지(bacteriophage)의 카달로그는 예를 들면, ATCC에 의해 제공되며, 그 예로는 ATCC에 의해 공개된 카달로그[The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds)]가 있다. 또한, 시퀀싱, 클로닝 및 분자 생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 절차 및 기초적인 이론적 고려사항은 문헌[Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾을 수 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산(및, 표준이든 비표준이든 사실상 임의의 모든 표지 핵산)을 다양한 시판 공급원 중 임의의 공급원, 예를 들면, Midland Certified Reagent Company(텍사스 미들랜드 소재, 월드 와이드 웹(World Wide Web) mcrc.com에서 이용가능함), The Great American Gene Company(캘리포니아주 라모마 소재, 월드 와이드 웹 genco.com에서 이용가능함), ExpressGen Inc.(일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹 expressgen.com에서 이용가능함), Operon Technologies Inc.(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 공급원으로부터 특별 주문하거나 일반 주문하여 공급받을 수 있다.

B. 셀렉터 코돈

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 포함되는 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격을 확장시킨다. 예를 들면, 셀렉터 코돈은 독특한 3 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예를 들면 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 원하는 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 광범위한 범위 내의 수의 셀렉터 코돈을 원하는 유전자 내로 도입할 수 있다.

일 구체예에서, 본 방법은 비천연 아미노산을 진핵생물 세포의 생체 내로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈의 사용을 포함한다. 예를 들면, UAG를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈을 인식하며 원하는 비천연 아미노산을 가진 O-RS에 의해 아미노아실화된 O-tRNA가 생성된다. 이 O-tRNA는 천연 발생 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식되지 않는다. 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 원하는 폴리펩티드 내의 원하는 부위에, UAG를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonuclease if a phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802]을 참조할 수 있다. O-RS, O-tRNA, 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 반응하여 도입되어 특정 위치에서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.

생체내 비천연 아미노산의 도입은 진핵생물 숙주 세포에 유의한 영향을 주지 않으면서 수행할 수 있다. 예를 들면, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 엠버 서프레서 tRNA를 포함하나 이로 한정되지 않는 O-tRNA와 진핵생물 방출 인자(eRF를 포함하나 이로 한정되지 않음)(이는 정지 코돈에 결합하여, 리보솜으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 달려 있기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 서프레서 tRNA의 발현 수준 증가를 포함하나 이들로 한정되지 않는 방법에 의해 조절될 수 있다.

또한, 셀렉터 코돈은 4개 이상의 염기 코돈, 예를 들면, 4개, 5개 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4개의 염기로 구성된 코돈의 예는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 5개의 염기로 구성된 코돈의 예는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 특징은 프레임쉬프트(frameshift) 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 하나 또는 다수의 비천연 아미노산을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아미노산을 동일한 단백질 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 안티코돈(anticodon) 루프, 예를 들면 8 내지 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 안티코돈 루프를 갖는 특수 프레임쉬프트 서프레서 tRNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이된 O-tRNA의 존재 하에서, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈은 단일 아미노산으로 판독된다. 다른 구체예에서, 안티코돈 루프는 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 5개 이상의 염기로 구성된 코돈, 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 코돈을 해독(decoding)할 수 있다. 256개의 가능한 4 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기로 구성된 코돈의 사용에 의해 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌[Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조할 수 있다.

예를 들면, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 데 사용된다. 예를 들면, 문헌[Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는 시험관내에서 2개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 서프레서 tRNA를 사용하여 2-나프틸알라닌 및 라이신의 NBD 유도체를 동시에 스트렙타비딘(streptavidin) 내로 도입하는 데 사용되었다. 예를 들면, 문헌[Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194-12195]을 참조할 수 있다. 생체내 연구에서, 무어(Moore) 등은 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체의 능력을 조사하였고, 4개의 염기로 구성된 UAGA가 0 또는 -1 프레임(frame)으로 거의 해독되지 않으면서 13 내지 26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 해독될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌[Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195]을 참조할 수 있다. 일 구체예에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 한 연장된 코돈이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있으며, 이는 다른 원치 않는 부위에서의 미스센스 리드쓰루(missense readthrough) 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.

또한, 소정의 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 3개의 천연 염기로 구성된 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 이때 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않음). 예를 들면, 이는 3개의 천연 염기로 구성된 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 경우에 따라 비천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비천연 염기쌍은 현존하는 유전자 알파벳을 더 연장시킨다. 여분의 1개 염기쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 성질은 안정한 선택적 염기 페어링(base paring), 높은 신뢰도에서의 중합효소에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기(nascent) 비천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 연속 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 비천연 염기쌍에 대한 설명은 예를 들면, 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182] 및 문헌 [Wu, Y., et. al. (2002) J.Am.Chem.Soc. 124:14626-14630]을 참조한다. 다른 관련 문헌은 하기에 나열된다.

생체내에서 사용하는 경우, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 갖고, 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정하고 세포 효소에 의해 파괴되지 않는다. 베너(Benner) 및 다른 사람들에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규 와슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였는데, 이중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들면, 문헌[Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322-8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33-37; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 이 염기들은 어는 정도 천연 염기와 미스페어링(mispairing)하고, 효소적으로 복제될 수 없다. 쿨(Kool) 및 그의 동료들은 염기들 사이의 소수성 팩킹(packing) 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 점을 입증하였다. 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602-608; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825-2828]을 참조할 수 있다. 모든 상기 요건을 만족시키는 비천연 염기쌍을 개발하려는 노력으로, 슐츠(Schultz), 로메스버그(Romesberg) 및 그의 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍(self-pair)은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 밝혀졌고, 이.콜라이 DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌[McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11585-11586; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274-3278]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율 및 선별성을 가진 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803-8804]을 참조할 수 있다. 그러나, 양쪽 염기 둘다 추가 복제를 위한 사슬 종결제로 작용한다. 최근, 돌연변이 DNA 중합효소는 PICS 자가 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439-7440]을 참조할 수 있다. 또한, 새로운 메탈로염기쌍인 Dipic:Py도 개발되었으며, 상기 염기쌍은 Cu(II) 결합 시 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714-10715]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르쏘고날하기 때문에, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 방법은 이 성질을 이용하여 이들에 대한 오르쏘고날 tRNA를 생성할 수 있다.

또한, 번역 우회(translational bypassing) 시스템을 경우에 따라 사용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열은 유전자 내로 도입되지만, 단백질로 번역되지 않는다. 이 서열은 리보솜이 서열 상에서 호핑하여(hopping), 삽입 부위의 다운스트림(downstream)의 번역을 재개하는 신호(cue)로서 작용하는 구조를 포함한다.

특정한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및/또는 조성물에서 원하는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 경우에 따라 예를 들어 비천연 아미노산의 도입을 위해 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함시키기 위하여 문헌 [Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques] 하에 본 발명에서 기술된 것들 및 공지 방법을 이용해 돌연변이시킨다. 예를 들어, 원하는 단백질에 대한 핵산은 하나 이상의 비천연 아미노산을 도입시키기 위해 제공되는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 예를 들면, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는, 임의의 단백질의 돌연변이체 형태를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 변이체를 포함한다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 상응하는 핵산, 즉 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하거나 또는 이의 생체 내 도입을 가능하게 하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.

예를 들어, GH 폴리펩티드를 포함하는 원하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 시스테인이 도입되도록 용이하게 돌연변이시킬 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 매우 다양한 다른 분자를 원하는 단백질 내로 도입하는 데 널리 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입하기에 적합한 방법 예컨대, 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제6,608,183호에 기재된 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 표준 돌연변이유발 기법을 포함한다. 이러한 시스테인 도입 및 활용 기법의 사용은 경우에 따라 본 명세서에 기술된 비천연 아미노산 도입 및 활용 기법과 함게 사용된다.

VIII. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 생성

편의를 위해, 이 섹션에서 기술한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생성은 총체적으로 및/또는 특정예를 들어 기술하였다. 하지만, 이 섹션에서 기술한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생성이 이 섹션에서 기술한 특정예나 일반적인 설명에 한정되는 것은 아니며, 이 섹션에 기술한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체 내 생성은 본 명세서, 청구항 및 도면에 기술한 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 임의의 하위화학식 또는 특정 화합물을 포함하여 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 모든 화합물에 동등하게 적용된다.

천연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산을 부가하거나 이것으로 치환시키기 위해 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 생체내에서 생성할 수 있다.

천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법은 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 미국 공개 특허 출원 제2004/0082575호(출원 번호 제10/126,927호) 및 제2003/0108885(출원 번호 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 이들 방법은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA와 독립적으로 작용하는(따라서, 때때로 "오르쏘고날"이라고도 지칭됨) 번역 기구의 생성을 포함한다. 일 구체예에서, 번역 시스템은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드는 상응하는 DNA로부터 전사된 mRNA일 수 있거나, 또는 상기 mRNA는 경우에 따라 RNA 바이러스 벡터로부터 발생되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 비천연 아미노산의 도입을 위한 소정의 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 추가로 포함한다. 번역 시스템은 tRNA를 포함하고 또한 비천연 아미노산을 포함하는 적절한 경우에, 여기서 tRNA는 상기 언급한 셀렉터 코돈에 특이적이고/특이적으로 인식한다. 추가 구체예에서, 상기 비천연 아미노산은 아미노아실화된다. 비천연 아미노산은 본 발명에서 기술한 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6 중 어느 하나의 구조를 갖는 것을 포함한다. 추가 또는 다른 구체예에서, 번역 시스템은 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성효소를 포함하고, 다른 추가의 구체예에서, 번역 시스템은 오르쏘고날 tRNA 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함한다. 추가 구체예에서, 번역 시스템은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 전술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드(예를 들어, DNA의 형태로 존재), 상기 언급한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA(예를 들어, DNA 형태로 존재), 또는 전술한 폴리뉴클레오티드가 통합된 게놈 DNA(추가 구체예에서, 통합은 안정한 통함임). 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 구체예에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 고유 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 이루어진 군에서 선택된다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 구체예에서, tRNA는 서프레서 tRNA이다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 리보솜에 의해 합성된다.

또 다른 또는 추가 구체예에서, 번역 시스템은 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키고, O-tRNA는 이 시스템에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비천연적으로 코딩된 아미노산을 상기 시스템에서 생성된 폴리펩티드 내에 삽입함으로써 코딩된 폴리펩티드 내의 특정 위치에서 비천연 아미노산을 "치환"시킨다.

특정한 합성 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입하기 위한 매우 다양한 오르쏘고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 일반적으로 적합하다. 예를 들면, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 문헌[Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100; 56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적 O-RS 또는 이의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 각각 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0082575호 및 제2003/0108885호에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용되는 상응하는 O-tRNA 분자도 본 발명에 참고로 도입되는 미국 공개 특허 출원 제2003/0082575(출원 제10/126,927호) 및 제2003/0108885(출원 제10/126,931호)에 기재되어 있으며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 또한, 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[Mehl et al. in J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939 and Santoro et al. Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048]에는 스크리닝 방법 및 p-아미노페닐알라닌을 폴리펩티드 내로 도입하기 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 및 tRNA 분자가 논의되어 있다.

본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 예시적인 O-tRNA 서열은 본 발명에 참고로 도입되는 미국 공개 특허 출원 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 개시된 뉴클레오티드 서열 서열번호 1 내지 3을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정한 비천연 아미노산에 특이적인 한 쌍의 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 다른 예는 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 에스. 세레비지아에서 케토-함유 아미노산 및 아지드-함유 아미노산 둘다를 도입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌[Chin, J. W., et al., Science 301: 964-967 (2003)]에 기재되어 있다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비천연 아미노산을 코딩하는 특정한 코돈의 선택을 포함한다. 임의의 코돈을 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 예시적인 코돈은 넌센스 코돈, 예를 들면 정지 코돈(엠버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 및 거의 사용되지 않거나 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3 염기 코돈을 포함한다.

특정한 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이유발 방법(부위 특이적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 이용하여 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입할 수 있다.

비천연 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들면 O-RS, O-tRNA, 및 오르쏘고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌[Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허출원 공개 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르쏘고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법은 본 발명에 참고로 도입되는 미국 공개 특허 출원 제2003/0082575호(출원 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(출원 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 또한, 본 발명에 완전히 참고로 도입되는 PCT 공보 제WO 04/035743호(발명의 명칭: "단백질 내로의 케토 아미노산의 부위 특이적 도입")에는 케토 아미노산의 도입을 위한 오르쏘고날 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다. 본 발명에 완전히 참고로 도입되는 PCT 공보 제WO 04/094593호(발명의 명칭: "진핵생물 유전 코드의 확장")에는 진핵생물 숙주 세포에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 오르쏘고날 RS와 tRNA 쌍이 기재되어 있다.

하나 이상의 재조합 오르쏘고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성하는 방법은 (a) 원핵생물 유기체, 예를 들면, 메타노코커스 잔나스키, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 이.콜라이, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등, 또는 진핵생물 유기체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 제1 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리 중에서 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 구성원을 선별 (및/또는 스크리닝)함으로써, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계, 및/또는 (c) 비천연 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 대한 풀을 (경우에 따라, 음성 선별을 통해) 선별함으로써 비천연 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다. 예를 들면, 비활성 RS는 약 1개 이상, 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 5개 이상, 약 6개 이상 또는 약 10개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산(알라닌을 포함하나 이들로 한정되지 않음)으로 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다.

돌연변이체 RS의 라이브러리는 단백질의 3차원적 RS 구조에 기초한 합리적(rational) 디자인, 또는 무작위적 또는 합리적 디자인 기법을 이용한 RS 뉴클레오티드의 돌연변이유발을 포함하여, 다양한 기법을 이용해 생성시킬 수 있으며, 이러한 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 돌연변이, 다양성(diversity) 발생 재조합 돌연변이, 키메라 구축물, 합리적 디자인, 및 본 명세서에 기재되어 있거나 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.

일 구체예에서, 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 단계를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 활성을 가진 구성원을 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리로부터 선별(및/또는 스크리닝)하는 단계는, 항생제 내성 유전자 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 양성 선별 또는 스크리닝 마커(이때, 양성 선별 및/또는 스크리닝 마커는 엠버, 오커, 및 오팔 코돈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 선별제의 존재 하에 다수의 세포를 성장시키는 단계; 및 양성 선별 또는 스크리닝 마커의 존재 하에 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하여 선별제 및/또는 스크리닝제의 존재 하에 생존하는 (또는 특이적 반응을 나타내는) 세포를 확인함으로써 활성(경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 함유하는 양성적으로 선별된 세포로 구성된 하위세트를 제공하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 선별제 및/또는 스크리닝제 농도는 변할 수 있다.

한 측면에서, 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자이고, 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 경우에 따라, 양성 선별 마커는 β-락타마제 유전자이고, 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 또 다른 측면에서, 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성-기초 스크리닝 마커(세포 표면 마커를 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함한다.

일 구체예에서, 비천연 아미노산의 부재 하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(경우에 따라, 돌연변이체)에 대한 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝하는 과정은, 양성 선별 또는 스크리닝으로부터의 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 사용하여 음성 선별 또는 스크리닝 마커(이때, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함함)를 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연 아미노산 및 스크리닝제 또는 선별제로 보충된 제1 배지에서 생존하거나 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만 비천연 아미노산 및 선별제 또는 스크리닝제로 보충되지 않는 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 또는 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 확인하여 생존하는 세포 또는 스크리닝된 세포에 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들면, CAT 확인 프로토콜은 경우에 따라 적합한 O-RS 재조합체의 결정에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로서 작용한다. 예를 들면, 클론의 풀은 경우에 따라 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖거나 갖지 않는 CAT(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 함유하는 성장 플레이트 상에서 복제된다. 따라서, 비천연 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서만 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 콜로니로 간주된다. 한 측면에서, 선별제(및/또는 스크리닝제)의 농도는 변할 수 있다. 일부 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 경우에 따라 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 이.콜라이, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균(eubacterium), 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 구체예에서, 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성-기초 스크리닝 마커를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대한 풀을 스크리닝하거나 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하는 과정은 양성 선별 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RS의 풀을 단리하는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커(이때, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함함), 및 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서는 생존하거나 특이적 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 확인함으로써 비천연 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 생존하거나 스크리닝된 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 이러한 구체예는 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한 경우(이때, 각각의 유기체는 경우에 따라, 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 이.콜라이, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면은 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 스크리닝 마커가 경우에 따라 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성-기초 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본 명세서의 구체예에서, 스크리닝 및/또는 선별은 경우에 따라 스크리닝 및/또는 선별 엄격도(stringency)의 변경을 포함한다.

일 구체예에서, 하나 이상의 재조합 오르쏘고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 생성하는 방법은 경우에 따라 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(경우에 따라, 돌연변이됨)의 제2 세트를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 단계 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라, 단계 (d) 내지 (f)를 약 2회 이상 반복한다. 한 측면에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이된 O-RS의 제2 세트는 무작위적 돌연변이유발, 부위 특이적 돌연변이유발, 재조합 또는 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.

전술한 방법들에서 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 둘다를 포함하나 이들로 한정되지 않는 선별/스크리닝 단계의 엄격도는 경우에 따라 선별/스크리닝 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 양성 선별/스크리닝 단계 (b), 음성 선별/스크리닝 단계 (c) 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 둘다는 리포터(reporter)의 사용을 포함하며, 이때 리포터는 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 경우에 따라, 리포터는 세포 표면 상, 파지 디스플레이(phage display) 상 등에서 나타나고, 비천연 아미노산 또는 유사체를 수반하는 친화성 또는 촉매 활성에 기초하여 선별된다. 일 구체예에서, 돌연변이된 합성효소는 세포 표면 상, 파지 디스플레이 상 등에서 나타난다.

재조합 오르쏘고날 tRNA(O-tRNA)를 생성하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터 서프레서 tRNA를 포함하나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계, (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하거나 또는 스크리닝하여 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르쏘고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 선별하거나 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA(이때, 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 tRNA는 서프레서 tRNA이고/이거나 천연 및/또는 비천연 염기로 된 독특한 3 염기 코돈을 포함하거나, 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 정지 코돈이다. 일 구체예에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 오르쏘고날성을 갖는다. 일부 구체예에서, 경우에 따라 O-tRNA를 변형시킬 필요 없이 제2 유기체로부터 제1 유기체 내로 도입할 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 구체예에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 또는 상이하고 경우에 따라 원핵생물(메타노코커스 잔나스키, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 이.콜라이, 할로박테리움 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 진핵생물, 포유동물, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 또한, 재조합 tRNA는 경우에 따라 비천연 아미노산에 의해 아미노아실화되며, 이때 비천연 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체내에서 생합성된다. 비천연 아미노산은 경우에 따라 적어도 제1 또는 제2 유기체를 위한 성장 배지에 첨가되고, 여기서 비천연 아미노산은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 도입되도록 적절한 세포 내 농도에 도달할 수 있다.

일 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이로 한정되지 않음)하거나 스크리닝하는 단계(단계 (b))는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 독성 마커 유전자(이때, 독성 마커 유전자, 또는 독성 또는 세포증식 저해 물질을 생성하는 유전자 또는 유기체에 필수적인 유전자) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 라이브러리를 제2 유기체의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 오르쏘고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 함유하는 생존 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 이용함으로써 선별할 수 있다.

또 다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 경우에 따라 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 방법의 또 다른 구체예에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 이때 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 도입된 오르쏘고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별하거나 스크리닝하는 단계는, 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자(이때, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈, 예를 들면 하나 이상의 엠버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마제 유전자를 포함하나 이로 한정되지 않음), 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 물질의 해독화를 이끌어내는 유전자), 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포 내로 도입하는 단계; 및 항생제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 선별제 또는 스크리닝제의 존재 하에 성장하는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 확인함으로써 하나 이상의 재조합 tRNA(이때, 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 반응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물 내에 아미노산을 삽입함)를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 선별제 및/또는 스크리닝제의 농도는 다양하다.

특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재 하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대해 라이브러리를 음성적으로 선별하거나 스크리닝함으로써 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르쏘고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별하거나 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제3 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재 하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 구성원에 대해 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선별하거나 스크리닝하여 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연 아미노산의 부재 하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대해 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝함으로써, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(이때, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연적으로 코딩된 아미노산, 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 이 방법에 의해 생성된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍이 포함된다. 예를 들면, 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예를 들면 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 것들을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제 3 유기체가 동일한 (메타노코커스 잔나스키를 포함하나 이로 한정되지 않음) 경우를 포함한다.

제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 오르쏘고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법도 본 명세서에 기재된 방법에 포함된다. 이 방법은 마커 유전자, tRNA, 및 제1 유기체로부터 단리되거나 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체로부터의 세포로 구성된 제1 세트 내로 도입하는 단계; 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복(duplicate) 세포 세트 내로 도입하는 단계; 및 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하지만 제1 세트에서는 생존하는 세포를 선별하거나 중복 세포 세트에서는 제공하지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 제1 세트 및 중복 세포 세트는 선별제 또는 스크리닝제의 존재 하에 성장하고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르쏘고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 일 구체예에서, 비교 및 선별 또는 스크리닝은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 선별제 또는 스크리닝제의 농도는 경우에 따라 다양하다.

본 명세서에 기재된 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합물을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 유기체는 경우에 따라 메타노코커스 잔나스키, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 이.콜라이, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필루스 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 유기체는 경우에 따라 식물(복합 식물, 예를 들면 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함하나 이로 한정되지 않음), 해조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하나 이로 한정되지 않음), 동물(포유동물, 곤충, 절지 동물 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 진핵생물 유기체 등을 포함한다.

A. 비-진핵생물 세포 및 진핵생물 세포에서의 발현

본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 비-진핵생물 세포 및 진핵생물 세포에서의 발현에 적용될 수 있다.

클로닝된 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시키기 위해, 대체로, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지정하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결서열, 및 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위(단백질을 코딩하는 핵산의 경우)를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝(subcloning)한다. 적합한 박테리아 프로모터는 예를 들면, 문헌[Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다.

폴리펩티드 발현용 박테리아 발현 시스템은 이.콜라이, 바실러스 종(Bacillus sp.), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 균주에서 이용가능하다(문헌[Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983)] 참조). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵생물 발현 시스템도 상업적으로 입수가능하다. 오르쏘고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(본 명세서에 기재됨)를 사용하여 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르쏘고날 성분을 사용할 수 있는 그의 능력을 기초로 선별된다. 예시적인 숙주 세포로는 그람-양성(Gram-positive) 박테리아(비. 브레비스(B. brevis), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 및 그람-음성 박테리아(이.콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애루기노사, 슈도모나스 푸티다) 뿐만 아니라, 효모 및 다른 진핵생물 세포가 있다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 경우에 따라 본 발명에 기재된 바와 같이 사용된다.

본 명세서에 기재된 진핵생물 숙주 세포 또는 비-진핵생물 숙주 세포는 비천연 아미노산을 많은 유용한 양으로 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 경우에 따라 약 10 ㎍ 이상, 약 50 ㎍ 이상, 약 75 ㎍ 이상, 약 100 ㎍ 이상, 약 200 ㎍ 이상, 약 250 ㎍ 이상, 약 500 ㎍ 이상, 약 1 ㎎ 이상, 약 10 ㎎ 이상, 약 100 ㎎ 또는 약 1 그램 이상의 비천연 아미노산-함유 폴리펩티드, 또는 생체내 단백질 생성 방법(재조합 단백질 생성 및 정제에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 제공되어 있음)을 이용하여 얻어질 수 있는 양의 비천연 아미노산-함유 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 경우에 따라 세포 용해물, 완충제, 약학적 완충제 또는 다른 액체 현탁액을 포함하는 조성물(약 1 nl 내지 약 100 ℓ의 부피를 포함하나 이로 한정되지 않는 부피) 중에 1 ℓ 당 약 10 ㎍ 이상, 약 50 ㎍ 이상, 약 75 ㎍ 이상, 약 100 ㎍ 이상, 약 200 ㎍ 이상, 약 250 ㎍ 이상, 약 500 ㎍ 이상, 약 1 ㎎ 이상 또는 약 10 ㎎ 이상의 농도를 포함(이에 한정되지 않음)하는 농도의 폴리펩티드가 존재. 진핵생물 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량 (전형적으로, 시험관내 번역을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 방법을 이용하여 얻을 수 있는 양보다 많은 양을 포함하지만, 이로 한정되지 않음) 제조하는 것은 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물의 한 특징이다.

본 명세서에 기재된 진핵생물 숙주 세포 또는 비-진핵생물 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 유용하게 대량으로 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지 또는 완충제 중에 약 10 ㎍/ℓ 이상, 약 50 ㎍/ℓ 이상, 약 75 ㎍/ℓ 이상, 약 100 ㎍/ℓ 이상, 약 200 ㎍/ℓ 이상, 약 250 ㎍/ℓ 이상, 또는 약 500 ㎍/ℓ 이상, 약 1 mg/ℓ 이상, 약 2 mg/ℓ 이상, 약 3 mg/ℓ 이상, 약 4 mg/ℓ 이상, 약 5 mg/ℓ 이상, 약 6 mg/ℓ 이상, 약 7 mg/ℓ, 약 8 mg/ℓ 이상, 약 9 mg/ℓ 이상, 약 10 mg/ℓ 이상, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900 mg/ℓ, 약 1 g/ℓ, 약 5 g/ℓ, 약 10 g/ℓ 이상의 단백질 농도(이에 한정되지 않음)로 생성될 수 있다.

1. 발현 시스템, 배양 및 단리

본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 발현 시스템, 배양 및 단리에 적용될 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아를 비롯한 임의의 다수의 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 발현 시스템에 대한 설명은 본 명세서에 제공되어 있다.

효모

본 명세서에 사용된 용어 "효모"는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2개의 과(family), 즉 스퍼모프토라세애(Spermophthoraceae)와 사카로마이세타세애(Saccharomycetaceae)로 나뉜다. 사카로마이세타세애는 4개의 하위과(subfamily), 스키조사카로마이코이데애(Schizosaccharomycoideae)(예를 들면, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데애(Nadsonioideae), 리포마이코이데애(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데애(Saccharomycoideae)(예를 들면, 피키아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 과, 스포로볼로마이세타세애(Sporobolomycetaceae)(예를 들면, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세애(Cryptococcaceae)(예를 들면, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.

특정 구체예에서, 피. 파스토리스(P. pastoris), 피. 귈러리몬디이(P. guillerimondii), 에스. 세레비지아(S. cerevisiae), 에스. 칼스버겐시스(S. carlsbergensis), 에스. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), 에스. 더글라시이(S. douglasii), 에스. 클루이베리(S. kluyveri), 에스. 노르벤시스(S. norbensis), 에스. 오비포르미스(S.oviformis), 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis), 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 말토사(C. maltosa) 및 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 피키아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물에서 사용된다.

발현용 효모 숙주의 선택 시, 적합한 숙주는 예를 들면, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성, 우수한 가용성 단백질 생성 및 전체적인 강인성(robustness)을 갖는 것으로 입증된 숙주들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 효모는 캘리포니아 대학(University of California)(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부(Department of Biophysics and Medical Physics) 이스트 제네틱 스톡 센터(Yeast Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; "ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.

용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되는 효모를 포함한다. 이 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 수용한 기원 효모 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 비천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

염색체외 레플리콘(extrachromosomal replicon) 또는 통합 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주 내로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들면, 에스. 세레비지아(문헌[Sikorski et al., GENETICS (1998) 112: 19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1978) 75: 1929] 참조); 씨. 알비칸스(문헌[Kurtz et al., Mol. CELL. BIOL. (1986) 6: 142] 참조); 씨. 말토사(문헌[Kunze et al., J. BASIC MOL. MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); 에이치. 폴리모르파(문헌[Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202: 302] 참조); 케이. 프라길리스(문헌[Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158: 1165] 참조): 케이. 락티스(문헌[De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (1990) 8: 135] 참조); 피. 귈러리몬디이(문헌[Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25: 141] 참조); 피. 파스토리스(미국특허 제5,324,639호, 제4,929,555호 및 제4,837,148호; 문헌[Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5: 3376] 참조); 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)(문헌[Beach and Nurse, NATURE (1981) 300: 706] 참조); 및 와이. 리폴리티카(Y. lipolytica)(Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1986) 10:49); 에이. 니둘란스(A. nidulans)(문헌[Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112: 284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26: 205-221; and Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1984) 81: 1470-74] 참조); 에이. 니게르(A. niger)(문헌[Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479] 참조); 티. 레시아(T. reesia)(유럽 특허 제0 244 234호); 및 섬사상 진균류, 예를 들면 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(국제특허공보 제WO 91/00357호)(상기 각각의 문헌은 본 발명에 참고로 도입됨)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.

효모 벡터에 대한 조절 서열은 알코올 데히드로게나제(ADH)(유럽 특허 제0 284 044호); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프럭토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(유럽 특허 제0 329 203호)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌[Myanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1983) 80: 1] 참조). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제[hitzeman et.al., J.BIOL.CHEM. (1980) 255(4):12073-12080); 및 다른 해당 효소, 예를 들면 피루베이트 데카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 및 포스포글루코즈 이소머라제(문헌[Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17: 4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1968) 7: 149-167] 참조)에 대한 프로모터를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 조절된다는 추가 이점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2; 이소사이토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인; 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제; 질소 대사와 관련된 분해성 효소; 및 말토스 및 갈락토즈 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에서 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제0 073 657호에 추가로 기재되어 있다.

또한, 효모 인핸서를 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 효모 프로모터의 업스트림 활성화 서열(UAS)이 또 다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 연결되어 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 하이브리드 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 연결된 ADH 조절 서열을 포함한다. 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제4,880,734호 및 제4,876,197호를 참조할 수 있다. 하이브리드 프로모터의 다른 예는 원하는 효소 유전자, 예를 들면 GAP 또는 PyK의 전사 활성화 영역과 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자의 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. 유럽 특허 제0 164 556호를 참조할 수 있다. 나아가, 효모 프로모터는 효모 RNA 중합효소에 결합하는 능력 및 전사를 개시하는 능력을 갖는 비-효모로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다.

효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 조절 요소는 예를 들면, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터 유래된 종결서열을 포함한다(문헌[Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256: 1385] 참조). 또한, 2 μ의 플라스미드로부터 유래된 복제기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자이다. 문헌[Tschumper et al., GENE (1980) 10: 157; Kingsman et al., GENE (1979) 7: 141]을 참조할 수 있다. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에게 선별 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

외인성 DNA를 효모 숙주 내로 도입하는 방법은 전형적으로 스페로플라스트(spheroplast)의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모의 형질전환은 문헌[Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. (1979) 76: 3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130: 946]에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, DNA를 세포에 도입하는 다른 방법, 예를 들면, 핵 주입, 전기천공법 또는 원형질체 융합도 일반적으로 문헌[SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 그 다음, 효모 숙주 세포를 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 배양할 수 있다.

효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 미국 공개 특허 출원 제20020055169호, 미국특허 제6,361,969호, 제6,312,923호, 제6,183,985호, 제6,083,723호, 제6,017,731호, 5,674,706호, 제5,629,203호, 제5,602,034호 및 제5,089,398호; 재심사된 미국특허 제RE37,343호 및 제RE35,749호; 국제특허공보 제WO 99/07862호; 제WO 98/37208호; 및 제WO 98/26080호; EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; 제WO 90/10277호; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203호; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556를 참조할 수 있다. 또한, 각각 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2): 79-93; Romanes et al., YEAST (1992) 8 (6): 423-488; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185: 3-7]을 참조할 수 있다.

효모 숙주 균주는 표준 공급 회분식 발효 방법을 이용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장시킬 수 있다. 발효 방법은 경우에 따라 특정한 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 조절 방식에서의 차이를 고려하여 적절하게 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코즈 공급물, 복합 질소 공급원(예를 들면, 카세인 가수분해물) 및 다양한 비타민 보충을 필요로 할 수 있는 반면, 메틸오트로픽(methylotrophic) 효모인 피. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제5,324,639호, 문헌[Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9: 95] 및 문헌[Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29: 1113]을 참조할 수 있다.

그러나, 이러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 관계없는 일부 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 성장 제한 영양분, 전형적으로 탄소를 증식기 동안 발효기에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 발효 방법은 적합한 양의 탄소, 질소, 기저 염, 인, 및 다른 소수의 영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피키아에서 사용하기에 적합한 발효 배지의 예는 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제5,324,639호 및 제5,231,178호에 기재되어 있다.

배큘로바이러스 ( Baculovirus )-감염 곤충 세포

용어 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체(recipient)로서 사용될 수 있거나 사용되는 곤충을 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원 곤충 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질, 예를 들면 비천연 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

애데스 애깁티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리초플루시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯하여, 폴리펩티드의 발현을 위해 적절한 곤충 세포로서 몇몇 시판되는 곤충 종을 선택한다. 발현을 위해 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 특히, 우수한 분비 용량, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 입증된 숙주들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 곤충은 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Insect Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다.

일반적으로, 배큘로바이러스-감염 곤충 발현 시스템의 구성성분들은 전달 벡터, 통상 배큘로바이러스 게놈의 단편 및 발현될 이종 유전자 삽입에 편리한 제한 부위 둘다를 함유하는 박테리아 플라스미드; 전달 벡터 내의 배큘로바이러스-특이적 단편과 서열 상동성을 나타내는 야생형 배큘로바이러스(이는 배큘로바이러스 게놈 내에서의 이종 유전자의 상동 재조합을 가능하게 함); 및 적합한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터의 구축, 세포의 형질감염, 플라크(plaque)의 픽킹(picking), 배양물 중에서의 세포의 성장 등에 사용되는 물질, 방법 및 기법은 당업계에 공지되어 있고, 이러한 기법들이 기재된 메뉴얼도 이용가능하다.

이종성 유전자를 전달 벡터에 삽입시킨 후, 벡터 및 야생형 바이러스 게놈을 곤충 숙주 세포 내로 형질감염시키는데, 이때 벡터와 바이러스 게놈은 재조합된다. 팩키징된 재조합 바이러스를 발현시키고, 재조합 플라크를 확인하고 정제한다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템용 물질 및 방법은 예를 들면, 인비트로겐 코퍼레이션(Invitrogen Corp.)(캘리포니아주 칼스버드 소재)으로부터 키트 형태로 상업적으로 입수가능하다. 이러한 기법들은 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 충분히 기재되어 있다. 또한, 문헌[RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16. 9-16. 11 (1994); KING AND POSSEE, BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); and O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 이용한 다양한 이종 단백질의 제조는 하기 참고문헌들에 기재되어 있고, 이러한 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하는 데 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제6,368,825호, 제6,342,216호, 제6,338,846호, 제6,261,805호, 제6,245,528호, 제6,225,060호, 제6,183,987호, 제6,168,932호, 제6,126,944호, 제6,096,304호, 제6,013,433호, 제5,965,393호, 제5,939,285호, 제5,891,676호, 제5,871,986호, 제5,861,279호, 제5,858,368호, 제5,843,733호, 제5,762,939호, 제5,753,220호, 제5,605,827호, 제5,583,023호, 제5,571,709호, 제5,516,657호, 제5,290,686호; 국제특허공보 제WO 02/06305호, 제WO 01/90390호, 제WO 01/27301호, 제WO 01/05956호, 제WO 00/55345호, 제WO 00/20032 제WO 99/51721호, 제WO 99/45130호, 제WO 99/31257호, 제WO 99/10515호, 제WO 99/09193호, 제WO 97/26332호, 제WO 96/29400호, 제WO 96/25496호, 제WO 96/06161호, 제WO 95/20672호, 제WO 93/03173호, 제WO 92/16619호, 제WO 92/03628호, 제WO 92/01801호, 제WO 90/14428호, 제WO 90/10078호, 제WO 90/02566호, 제WO 90/02186호, 제WO 90/01556호, 제WO 89/01038호, 제WO 89/01037호 및 제WO 88/07082호를 참조할 수 있다.

배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 헬퍼(helper)-독립적 바이러스 발현 벡터인 배큘로바이러스 오토그라파칼리포르니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스(nuclear polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)로부터 유도된 곤충 발현 및 전달 벡터를 포함한다. 통상, 이 시스템으로부터 유도된 바이러스 발현 벡터는 강한 바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌[O' Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]을 참조할 수 있다.

외래 유전자를 배큘로바이러스 게놈 내에 삽입시키기 전에, 프로모터, 리더(필요에 따라), 원하는 코딩 서열 및 전사 종결서열을 포함하는 전술한 성분들을 전형적으로 중간체 전위 구축물(intermediate transplacement construct)(전달 벡터)로 조립한다. 종종, 중간체 전위 구축물은 숙주, 예를 들면 박테리아에서 안정하게 유지될 수 있는 레플리콘, 예를 들면 염색체 외부 요소(예를 들면, 플라스미드)에서 유지된다. 레플리콘은 복제 시스템을 갖기 때문에, 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주에서 유지될 수 있다. 더욱 구체적으로, 플라스미드는 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호(문헌[Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177] 참조), 및 이.콜라이 중에서의 선별 및 증식을 위한 원핵 앰피실린-내성(amp) 유전자 및 복제기점을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 AcNPV 내로 도입하는 데 통상 사용되는 전달 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들면, 폴리헤드린 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT로부터 32개 염기쌍만큼 떨어진 다운스트림 위치 내로 BamHI 클로닝 부위를 도입하는 pVL985를 비롯한 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들이 디자인되었다. 문헌[Luckow and Summers, 17 VIROLOGY 31 (1989)]을 참조할 수 있다. 다른 시판되는 벡터는 예를 들면, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; 및 pBlueBac4.5(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)를 포함한다.

이종성 유전자의 삽입 후, 전달 벡터 및 야생형 배큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주 내로 동시에 형질감염된다. 이종 DNA를 배큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위로 도입하는 예시적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌[SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 17: 31]을 참조할 수 있다. 예를 들면, 상동 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들면 폴리헤드린 유전자 내에 삽입될 수 있고, 원하는 배큘로바이러스 유전자 내로 도입된 제한 효소 부위 내에 삽입될 수 있다. 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91]을 참조할 수 있다.

형질감염은 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]에 기재된 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터 및 배큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키기 위해 리포솜을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26 (1): 36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37: 6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12: 323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18: 45; TILICNS et al., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10: 263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17: 491; Kost et al., GENE (1997) 190: 139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271: 22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37): 22376; Reversey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (39): 23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270: 4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68 (2): 766; and Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2); 274]을 참조할 수 있다. 시판되는 리포솜은 예를 들면, 셀펙틴(Cellfectin)^® 및 리포펙틴(Lipofectin)^®(인비트로겐 코퍼레이션, 캘리포니아주 칼스버드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 이용할 수 있다. 문헌[TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18 (19): 5667; and Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70: 3501]을 참조할 수 있다.

통상, 배큘로바이러스 발현 벡터는 배큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 배큘로바이러스 프로모터는, 배큘로바이러스 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열(예를 들면, 구조 유전자)의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 배큘로바이러스 프로모터는, 존재하는 경우 통상 구조 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인핸서로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 더욱이, 발현은 조절가능한 발현 또는 기본구성적 발현일 수 있다.

감염 주기의 후기에서 풍부하게 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로는 바이러스 폴리헤드린 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; 유럽 특허 제0 127 839호 및 제0 155 476호 참조) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌[Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69: 765] 참조)로부터 유도된 서열이 있다.

새로이 형성된 배큘로바이러스 발현 벡터를 감염성 재조합 배큘로바이러스로 팩키징한 후, 성장한 플라크를 예컨대, 문헌[Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]에 기재된 기법으로 정제할 수 있다.

몇몇 곤충 세포의 감염을 위한 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터가 개발되었다. 예를 들면, 특히, 애데스 애깁티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노가스터(ATCC 번호 1963), 스포돕테라 프루기페르다 및 트리초플루시아 니에 대한 재조합 배큘로바이러스가 개발되었다. 문헌[Wright, NATURE (1986) 321: 718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56: 153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3: 2156]을 참조할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25: 225]을 참조할 수 있다. 보다 구체적으로, 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 사용되는 세포주는 통상적으로 Sf9(스포돕테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포돕테라 프루기페르다)(인비트로겐 코퍼레이션, 카달로그 번호 11497-013(캘리포니아주 칼스버드 소재)), Tri-368(트리초풀시아 니(Trichopulsia ni)) 및 하이-파이브(High-Five)^TM BTI-TN-5B1-4(트리초풀시아 니)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

배큘로바이러스/발현에서의 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현 둘다를 위한 세포 및 배양 배지는 상업적으로 입수가능하다.

박테리아

다양한 벡터를 박테리아 숙주에서 사용하기 위해 이용가능하다. 벡터는 경우에 따라 단일 카피이거나, 저 또는 고 멀티카피 벡터이다 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 제공된다. 벡터는 보통, 선별을 가능하게 하는 마커를 포함하는데, 이러한 마커는 경우에 따라 세포독성 제제 내성, 자가영양성 또는 면역성을 제공한다. 때때로, 상이한 특성을 제공하는 다수의 마커가 존재한다.

박테리아 프로모터는, 박테리아 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 코딩 서열(예를 들면, 구조 유전자)의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 가질 것이다. 전형적으로, 이 전사 개시 영역은 RNA 중합효소 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 박테리아 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 인접 RNA 중합효소 결합 부위와 중첩될 수 있는 오퍼레이터로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특정 유전자의 전사를 억제할 수 있기 때문에 오퍼레이터는 음성 조절(유도성) 전사를 허용한다. 기본구성적 발현은 음성 조절 요소, 예를 들면 오퍼레이터의 부재 하에 일어날 수 있다. 또한, 양성 조절은 통상 RNA 중합효소 결합 서열에 근접한 (5') 유전자 활성화제 단백질 결합 서열(존재하는 경우)에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성화제 단백질의 일례는 에스케리치아 콜라이(이.콜라이)에서 lac 오페론의 초기 전사를 돕는 이화생성물 활성화제 단백질(CAP)이다(문헌[Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173] 참조). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성 조절이므로 전사를 증가시키거나 감소시킨다.

대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예로는 당 대사 효소, 예를 들면 갈락토즈, 락토스(lac)(문헌[Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열이 있다. 추가 예로는 생합성 효소, 예를 들면 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열이 있다(문헌[Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731]; 미국특허 제4,738,921호; 유럽 특허 제036 776호 및 제121 775호 참조). 또한, β-갈락토시다아제(bla) 프로모터 시스템(문헌[Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser)] 참조), 박테리오파지 람다 PL(문헌[Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] 참조) 및 T5(미국특허 제4,689,406호 참조) 프로모터 시스템도 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명에 포함되는 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예를 들면 T7 프로모터를 사용하여 높은 수준으로 폴리펩티드 생성을 유도한다. 이러한 벡터의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 노바겐(Novagen)으로부터 시판되는 pET29 계열, 및 본 발명에 참고로 도입되는 국제특허공보 제WO 99/05297호에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포의 생존 능력 또는 성장 매개변수에 악영향을 주지 않으면서 숙주에서 폴리펩티드를 높은 수준으로 생성한다.

또한, 자연계에서 발견되지 않는 합성 프로모터도 박테리아 프로모터로서 기능한다. 예를 들면, 한 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 박테리아 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합하여 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다(본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제4,551,433호 참조). 예를 들면, tac 프로모터는 trp 프로모터, 및 lac 리프레서에 의해 조절되는 lac 오페론 서열 둘다를 포함하는 하이브리드 trp-lac 프로모터이다(문헌[Amaml et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80; 21] 참조). 나아가, 박테리아 프로모터는, 박테리아 RNA 중합효소에 결합할 수 있으며 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는, 비-박테리아로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비-박테리아로부터 유래된 천연 발생 프로모터를 상용가능한 RNA 중합효소와 커플링하여 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 중합효소/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌[Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074] 참조). 또한, 하이브리드 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 이.콜라이 오퍼레이터 영역을 포함할 수 있다(유럽 특허 제267 851호 참조).

기능성 프로모터 서열 외에도, 효율적인 리보솜 결합 부위도 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. 이.콜라이에서, 리보솜 결합 부위는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열로 불리고, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈으로부터 3 내지 11개 뉴클레오티드만큼 업스트림 부위에 위치한 3 내지 9개의 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함한다(문헌[Shine et al., NATURE (1975) 254: 34] 참조). 상기 SD 서열은 이.콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이의 염기 페어링에 의해 mRNA와 리보솜의 결합을 촉진시키는 것으로 생각된다(문헌[Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)] 참조). 약한 리보솜 결합 부위를 사용하여 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 발현시키는 것은 문헌[Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]을 참조할 수 있다.

용어 "박테리아 숙주" 또는 "박테리아 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되는 박테리아를 지칭한다. 이 용어는 형질감염된 원 박테리아 숙주 세포의 자손을 포함한다. 단일 모세포의 자손이 우연한 돌연변이 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 성질 예를 들면, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

발현을 위한 박테리아 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주는 특히, 우수한 인클루젼 바디(inclusion body) 형성능, 낮은 단백질분해 활성 및 전체적인 강인성을 갖는 것으로 입증된 것들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 박테리아 숙주는 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 박테리얼 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션("ATCC")(버지니아주 마나사스 소재)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 일반적으로, 산업적/약학적 발효는 K 균주(예를 들면, W3110)로부터 유도된 박테리아 또는 B 균주(예를 들면, BL21)로부터 유도된 박테리아를 사용한다. 이러한 균주들은 이들의 성장 매개변수가 널리 공지되어 있고 강인하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 병원성을 나타내지 않으며, 안전성 및 환경상의 이유로 상업적으로 중요하다. 본 명세서에 기재되어 있으며 본 발명에 포함되는 방법의 일 구체예에서, 이.콜라이 숙주는 BL21, DH10B 또는 이들의 유도체 균주이다. 본 발명에 기재되어 있으며 본 발명에 포함되는 방법의 또 다른 구체예에서, 이.콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-을 포함하나 이들로 한정되지 않는 단백질분해효소 결핍 균주이다. 또 다른 구체예에서, 박테리아 숙주는 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 애루기노사, 및 슈도모나스 푸티다와 같은 슈도모나스 종일 수 있다. 슈도모나스 균주의 일례는 피. 를루오레센스 비오바르 1, 균주 MB101((Dow Chemical)이다.

일단 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구축물이 숙주 세포 내로 도입되었고, 적합한 발현 구축물을 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 폴리펩티드의 제조에 적합한 조건 하에 배양한다. 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구축물의 성질 및 숙주 세포의 종류에 달려 있다. 재조합 숙주 균주는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 통상적으로 배양한다. 전형적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한(assimilatable) 공급원, 및 경우에 따라, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다. 경우에 따라, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제, 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 위한 항생제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.

재조합 숙주 세포는 회분식 또는 연속식으로 세포를 수거하거나(폴리펩티드가 세포내에 축적되는 경우) 또는 배양 상등액을 수거하면서 회분식 또는 연속식으로 배양할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 제조하는 경우, 회분식 배양 및 세포 수거가 바람직하다.

일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 재조합 시스템에서 발현시킨 후 정제한다. 상기 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 통상적으로, 박테리아 숙주 세포에서 생성된 많은 폴리펩티드가 낮은 가용성 또는 불용성(인클루젼 바디의 형태의 경우)을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 재조합적으로 제조된 단백질의 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 선별된 아미노산 치환을 폴리펩티드 내로 용이하게 도입할 수 있다. 불용성 폴리펩티드의 경우, 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과 후 세포의 균질화에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수거될 수 있다. 가용성이 낮은 폴리펩티드의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 용해가능한 폴리펩티드의 침전을 유도할 수 있다. 그 다음, 침전된 단백질을 원심분리 또는 여과에 의해 편리하게 수거할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 파괴하거나 균질화하여, 당업자에게 잘 공지되어 있는 다양한 방법을 이용하여 세포내로부터 인클루젼 바디를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 파괴 또는 균질화는 효소적 세포 파괴, 초음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 파괴를 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 본 명세서에 기재되고 본 발명에 포함되는 방법의 일 구체예에서, 고압 방출 기술을 이용하여 이.콜라이 숙주 세포를 파괴하여 폴리펩티드의 인클루젼 바디를 방출시킬 수 있다. 폴리펩티드의 인클루젼 바디를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질분해와 같은 요인으로 인한 손실 없이 인클루젼 바디의 수율을 최대화시키기 위해 반복 수행 시 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리하다.

그 다음, 당업계에 공지된 임의의 다수의 적절한 가용화제를 사용하여 불용성 또는 침전된 폴리펩티드를 가용화할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드로 가용화할 수 있다. 편리하게 취급할 수 있는 회분 크기를 이용하여 큰 회분을 생산할 수 있기 위해, 가용화된 폴리펩티드의 부피를 최소화해야 한다. 이 요인은 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 회분에서 성장할 수 있는 대규모 상업적 셋팅에서 중요할 수 있다. 또한, 특히 인간의 약학적 용도를 위해 대규모 상업적 셋팅에서 폴리펩티드를 제조하는 경우, 기구 및 용기, 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 독한 화학물질은 가능하면 피해야 한다. 보다 독한 변성화제인 구아니딘 히드로클로라이드 대신에 더욱 순한 변성화제인 우레아를 사용하여 폴리펩티드 인클루젼 바디를 가용화할 수 있다는 점이 본 명세서에 기재되고 본 발명에 포함되는 방법에서 밝혀졌다. 우레아의 사용은 폴리펩티드 인클루젼 바디를 효율적으로 가용화하면서 폴리펩티드의 제조 및 정제 공정에서 사용되는 스테인레스 강철 장치에 대한 손상 위험을 유의하게 감소시킨다.

가용성 폴리펩티드의 경우, 펩티드는 세포주위질 공간 또는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 펩티드는 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 전에 가용성 펩티드를 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 명세서에 기재된 기법을 포함하나 이로 한정되지 않는 표준 기법을 이용하여 예를 들어, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 펩티드를 농축시킬 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 기법을 포함하나 이로 한정되지 않는 표준 기법을 이용하여 숙주 세포를 파괴하고 숙주 세포의 세포질 또는 세포질주위 공간으로부터 가용성 펩티드를 방출시킬 수 있다.

폴리펩티드가 융합 단백질로서 생성되는 경우, 융합 서열을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 융합 서열의 제거는 효소적 또는 화학적 절단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 조건 하에 달성될 수 있다. 융합 서열의 효소적 제거는 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 종류에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정될 것이다. 화학적 절단은 시아노겐 브로마이드, TEV 단백질분해효소 및 다른 시약을 포함하나 이들로 한정되지 않는 시약을 사용하여 달성할 수 있다. 절단된 폴리펩티드는 경우에 따라 잘 공지되어 있는 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제된다. 이러한 방법은 융합 서열 및 폴리펩티드의 본질(identity) 및 성질에 의해 결정될 것이다. 정제 방법은 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

또한, 폴리펩티드는 경우에 따라 DNA를 제거하기 위해 단백질 용액으로부터 정제된다. DNA는 예를 들면 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제거될 수 있다. 일 구체예에서, DNA 예를 들면, 프로타민 설페이트와 같은 핵산 침전제를 사용한 침전에 의해 제거된다. 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과를 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 폴리펩티드가 인간을 치료하는 데 사용되는 셋팅에서 중요한 인자이며, 본 명세서에 기재된 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용되는 수준으로 감소시킨다.

또한, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기(bioreactor), 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들 각각은 회분식, 공급-회분식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.

본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 인간 형태는 일반적으로 당업계의 표준 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 여과하여 세포 찌꺼기들을 제거할 수 있다. 상등액을 원하는 부피로 눙축시키거나 희석시키거나, 추가 정제를 위해 제제를 컨디셔닝하는 데 적합한 완충제로 투석여과할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 추가 정제는 상응하는 온전한 형태로부터 폴리펩티드 변이체인 탈아미드화 형태 및 절단된 형태를 분리하는 단계를 포함한다.

하기 예시적인 절차 중 임의의 절차를 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정제에 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75의 사용을 포함하나 이로 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피; 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환 크로마토그래피(displacement chromatography); 전기영동 절차(분취형 등전위 포커싱(isoelectric focusing)을 포함하나 이로 한정되지 않음); 상이한 가용성(differential solubility) 이용법(황산암모늄 침전을 포함하나 이로 한정되지 않음); SDS-PAGE 또는 추출.

비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 파트너 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물 내에 포함되는 폴리펩티드는, 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질한 정도까지 정제될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 렉틴(lectin) 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 다수의 방법에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 정확하게 폴딩된 성숙 단백질을 제조하고자 하는 경우 단백질 리폴딩 단계를 이용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 고순도가 바람직한 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산(또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드)에 대해 생성된 항체는 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드의 친화성-기초 정제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 정제를 위한 정제 시약으로서 사용된다. 일단 폴리펩티드가 부분적으로 또는 균질한 정도로 정제되면, 필요한 경우, 경우에 따라 분석 성분, 치료제, 예방, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 제조용 면역원을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 용도로 사용된다.

본 명세서에 언급된 다른 참고문헌 외에도, 문헌[R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications. Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에서 인용된 참고문헌에 기재된 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다.

진핵생물 숙주 세포 또는 비-진핵생물 숙주 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 제조의 장점은 전형적으로 폴리펩티드가 그의 천연 구조로 폴딩된다는 점이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 특정 구체예에서, 합성, 발현 및/또는 정제 후, 폴리펩티드는 관련 폴리펩티드의 원하는 입체구조와는 상이한 입체구조를 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 한 측면에서, 발현된 단백질을 경우에 따라 변성된 후 복원된다. 이는 샤페로닌(chaperonin)을 원하는 폴리펩티드에 첨가하는 방법, 단백질을 무질서 유발제(chaotropic agent), 예를 들면 구아니딘 HCl 중에서 가용화하는 방법, 단백질 디설피드 이소머라제를 사용하는 방법 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성한다.

또한, 발현된 폴리펩티드를 변성시키고 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 입체구조로 리폴딩시키는 것이 종종 바람직하다. 예를 들면, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 원하는 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(상기 참고문헌들 및 문헌[Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270] 참조). 예를 들면, 데빈스키(Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서의 인클루젼 바디 단백질의 변성 및 환원을 개시한다. 단백질은 산화된 글루타치온 및 L-아르기닌을 포함하나 이들로 한정되지 않는 물질을 함유하는 산화환원 완충제 중에서 리폴딩될 수 있다. 일 구체예에서, 리폴딩 시약은 유동하거나 이동하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉할 수 있으며, 아니면 다른 구체예에서는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물이 유동하거나 또는 이동하여 리폴딩 시약과 접촉할 수 있다.

비천연 아미노산 폴리펩티드를 원핵생물에서 제조하는 경우, 제조된 폴리펩티드는 미스폴딩되어 생물학적 활성을 갖지 않거나 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 단백질의 생체활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일 구체예에서, 미스폴딩된 폴리펩티드는 예를 들면, 하나 이상의 무질서 유발제(예를 들면, 우레아 및/또는 구아니딘), 및 디설피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들면, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 쇄를 가용화하고(이때, 폴리펩티드도 불용성을 가짐), 언폴딩하고, 환원시킴으로써 리폴딩한다. 그 다음, 중간 정도의 무질서 상태에서, 디설피드 결합을 재형성시키는 산화제(예를 들면, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가한다. 언폴딩된 또는 미스폴딩된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들면 본 발명에 참고로 도입되는 미국특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법을 이용하여 리폴딩할 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 다른 단백질과 코폴딩하여 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 리폴딩 또는 코폴딩 후, 폴리펩티드는 더 정제될 수 있다.

비천연 아미노산 폴리펩티드의 정제는 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않은 다양한 기법을 이용하여 달성할 수 있다. 추가 정제는 정제된 단백질의 건조 또는 침전 단계를 포함할 수도 있다.

정제 후, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상이한 완충제 내로 교환될 수 있고/있거나, 정용여과 및 투석을 포함하나 이들로 한정되지 않은 당업자에게 공지된 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 농축될 수 있다. 단일 정제 단백질로서 제공되는 hGH는 응집시키고 침전시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 정제된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 (역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC 또는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-PAGE에 의한 측정 시) 90% 이상일 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 정제된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도의 정확한 수치적 값과 관계없이, 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 약학 제품으로서 사용하기거나 PEG와 같은 수용성 중합체와의 접합을 포함하나 이로 한정되지 않은 추가 공정에 사용하기에 충분하다.

특정 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드 분자는 (부형제, 담체 및 안정화제, 혈청 알부민 등 외에) 다른 활성 성분 또는 단백질의 부재 하에서 치료제로서 사용될 수 있고, 특정 구체예에서 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드 또는 중합체와 착물을 형성할 수 있다.

2. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정제

일반적 정제 방법

본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 일반적 정제에 적용될 수 있다.

다양한 단리 단계들 중 어느 하나를 세포 용해물 추출물, 배양 배지, 인클루젼 바디, 숙주 세포의 세포질주위 공간, 숙주 세포의 세포질, 또는 원하는 폴리펩티드를 포함하는 다른 물질에 대해 수행할 수 있거나, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 확장층(expanded bed) 흡착, 또는 이들의 임의의 조합 및/또는 임의의 적합한 순서로의 이들 방법의 반복을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 발생된 임의의 폴리펩티드 혼합물에 대해 수행할 수 있다.

본 명세서에 기재된 기법을 수행하는 데 사용되는 장치 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 입수가능하다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록기 및 전체 시스템은 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 라보라토리즈, 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(캘피로니아주 허큘레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 이러한 회사들로부터 입수가능하다.

본 명세서에 기재된 컬럼 크로마토그래피 방법에서의 평형화 및 다른 단계, 예를 들어, 세척 및 용출은 특수 장치, 예를 들면 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행할 수 있다. 시판되는 펌프는 하이로드(HILOAD)^® 펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

분획 수집기의 예는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기인 FRAC-100 분획 수집기, FRAC-200 분획 수집기 및 슈퍼프랙(SUPERFRAC)^® 분획 수집기(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 혼합기도 입수가능하다. 시판되는 혼합기는 그라디안트 믹서(Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 혼합기(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.

임의의 시판되는 모니터를 사용하여 크로마토그래피 방법을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는 데 사용될 수 있다. 검출기의 예는 모니터 UV-1, 유니코드(UVICORD)^® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터(Conductivity Monitor)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터의 다양한 AKTA^® 시스템을 비롯한 전체 시스템이 상업적으로 입수가능하다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 일 구체예에서, 예를 들면, 폴리펩티드는 먼저 생성된 정제된 폴리펩티드를 우레아 중에서 변성시킨 후, 적합한 pH에서 환원제(예를 들면, DTT)를 함유하는 TRIS 완충제로 희석시킴에 의해 환원되고 변성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드를 약 2 M 내지 약 9 M의 농도의 우레아 중에서 변성시킨 후, pH가 약 5.0 내지 약 8.0인 TRIS 완충제 중에서 희석시킨다. 그 다음, 이 구체예의 리폴딩 혼합물을 항온처리할 수 있다. 일 구체예에서, 리폴딩 혼합물을 실온에서 4 내지 24시간 동안 항온처리한다. 그 다음, 환원되고 변성된 폴리펩티드 혼합물을 추가로 단리할 수 있거나 정제할 수 있다.

본 명세서에 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 폴리펩티드 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 이들의 임의의 후속 혼합물을 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 농축시킬 수 있다. 나아가, 당업자에게 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 이의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용출 완충제를 다음 단리 단계에 적합한 완충제로 교환할 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피

본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 이온 교환 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

일 구체예에서, 선택적 추가 단계로서 이온 교환 크로마토그래피를 제1 폴리펩티드 혼합물에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌[ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](카달로그 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))을 참조할 수 있다. 시판되는 이온 교환 컬럼은 하이트랩(HITRAP)^®, 하이프랩(HIPREP)^® 및 하이로드^® 컬럼(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 이러한 컬럼은 강한 음이온 교환기, 예를 들면 Q 세파로스^® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스^® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스^® XL; 강한 양이온 교환기, 예를 들면 SP 세파로스^® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스^® 패스트 플로우 및 SP 세파로스^® XL; 약한 음이온 교환기, 예를 들면 DEAE 세파로스^® 패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들면 CM 세파로스^® 패스트 플로우(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 과정 중 임의의 단계에서 폴리펩티드에 대해 음이온 또는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적합한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행할 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스는 섬유질, 다공성, 비-다공성, 미세구형(microgranular), 비드형 또는 가교-결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질로는 셀룰로오스, 아가로오스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 이들의 임의의 복합체가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 폴리펩티드를 양이온 교환 매트릭스에 흡착시킨 후, 폴리펩티드를 매트릭스로부터 탈착시키기에 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 가진 완충제와 상기 매트릭스를 접촉시킴으로써 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 용출할 수 있다. 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 높은 pH 용출에서 사용하기에 적합한 완충제로는 농도가 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이하인 시트레이트, 포스페이트, 포르메이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

역상 크로마토그래피

본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 역상 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

적합한 프로토콜에 따라 RP-HPLC를 수행하여 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124: 217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359: 391-402]을 참조할 수 있다. RP-HPLC를 폴리펩티드에 대해 수행하여 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 단리할 수 있다. 이와 관련하여, 약 C₃ 이상 내지 약 C₃₀ 이상, 약 C₃ 이상 내지 약 C₂₀ 이상, 또는 약 C₃ 이상 내지 약 C₁₈ 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 길이를 갖는 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도화 수지를 사용할 수 있다. 별법으로, 중합체 수지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 나아가, RP-HPLC 컬럼을 용매, 예를 들면 에탄올로 세척할 수 있다. 이온 페어링 시약(ion pairing agent) 및 유기 개질제, 예를 들면, 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적합한 용출 완충제를 사용하여 RP-HPLC 컬럼으로부터 폴리펩티드를 용출할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온 페어링 시약은 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 하나 이상의 구배 또는 등용매 조건을 이용하여 용출을 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간 및 피크 폭을 감소시키기에 바람직한 구배 조건이다. 또 다른 방법은 상이한 용매 농도 범위를 갖는 2종의 구배를 이용하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 용출 완충제의 예는 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법

본 단락에 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 폴리펩티드에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS(분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))]을 참조할 수 있다. 적합한 HIC 매트릭스는 아가로오스, 가교-결합된 아가로오스, 세파로스, 셀룰로오스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 비롯한 알킬-치환 매트릭스 또는 아릴-치환 매트릭스, 예를 들면 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스; 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸-치환 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하나 이들로 한정되지 않는 혼합된 형태의 수지를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 대한 시판되는 공급원은 하이트랩^®, 하이프랩^® 및 하이로드^® 컬럼(뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 요약하면, 로딩(loading) 전, HIC 컬럼을 당업자에게 공지된 표준 완충제, 예를 들면 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 헤페스를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 그 다음, 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 컬럼을 표준 완충제를 사용하여 세척하고, 폴리펩티드를 HIC 컬럼 상에서 보유하면서 원치 않는 물질을 제거하도록 컨디셔닝할 수 있다. 약 3 내지 약 10 컬럼 부피의 표준 완충제, 예를 들면 EDTA, 및 평형 완충제보다 낮은 농도의 황산암모늄을 함유하는 헤페스 완충제, 또는 아세트산/염화나트륨 완충제 등을 사용하여 폴리펩티드를 용출할 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산칼륨의 구배를 이용하는, 감소하는 선형 염 구배를 이용하여 폴리펩티드 분자를 용출할 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 여과, 예를 들면 투석여과 또는 한외여과에 의해 용출물을 농축할 수 있다. 투석여과를 이용하여 폴리펩티드를 용출하는 데 사용되는 염을 제거할 수 있다.

다른 정제 기법

이 섹션에서 개시된 기법은 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 정제 기법에 경우에 따라 적용될 수 있다.

경우에 따라 비천연 아미노산 폴리펩티드는 겔 여과법을 이용하여 정제한다. 이러한 기법은 문헌[GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS], 카달로그 번호 18-1022-18, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)에 기술되어 있다. 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(적절한 매트릭스는 HA-Ultrogel, 고해상(칼바이오켐), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트(바이오라드), 바이오-겔 HTP 하이드록시아파타이트(바이오라드)를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)를 이용하여 정제한다. 또한, HPLC, 확장된 층 흡착, 한외여과, 투석여과, 동결건조 등을 경우에 따라 제1 폴리펩티드 혼합물 또는 이의 임의 후속 혼합물 상에서 수행하여 임의의 잉여 염을 제거하고 다음 단리 단계 또는 최종 약물 생성물의 제형을 위해 적절한 완충제로 완충제를 교체한다. 본 명세서에 기재된 각 단계에서 당업자에게 공지되어 있는 기법을 사용하여, 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 비롯한 폴리펩티드의 수율을 모니터링할 수 있다. 또한, 이러한 기법은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 수율을 평가하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 수율은 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 뿐만 아니라 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 임의의 여러 역상 고압 액체 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면 시아노 RP-HPLC, C₁₈RP-HPLC 등을 사용하여 모니터링할 수 있다.

순도는 표준 기법, 예를 들면 SDS-PAGE를 사용하거나 웨스턴 블랏(Western blot) 및 ELISA 분석을 이용하여 폴리펩티드를 측정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 다클론 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다.

특정 구체예에서, 각 정제 단계 후의 폴리펩티드의 수율은 각 정제 단계 후 출발 물질 중의 폴리펩티드의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.9% 이상 또는 약 99.99% 이상일 수 있다.

RP-HPLC 물질 비다크(Vydac) C4(비다크)는 그 표면이 C4-알킬 쇄를 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 폴리펩티드의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출을 수행한다. 스테인레스 강철 컬럼(2.8 내지 3.2 리터의 비다크 C4 실리카 겔로 충전됨)을 사용하여 분취형 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 히드록시아파타이트 울트로겔 용출액을 산성화시키고, 비다크 C4 컬럼에 로딩한다. 세척 및 용출을 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획을 수거하고, 즉시 포스페이트 완충제로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 폴리펩티드 분획을 풀링한다.

DEAE 세파로스(파마시아) 물질은 세파로스 비드의 표면에 공유결합된 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어져 있다. DEAE 기와 폴리펩티드의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 보유되지 않으면서 컬럼을 통과한다. 이들 물질들을 세척한 후, 낮은 pH에서 아세테이트 완충제로 컬럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 그 다음, 컬럼을 중성 포스페이트 완충제로 세척하고, 폴리펩티드를 증가된 이온 강도를 갖는 완충제로 용출한다. 컬럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 팩킹한다. 컬럼 부피는 겔 1 ㎖ 당 3 내지 10 mg의 폴리펩티드 범위 내의 폴리펩티드 로딩이 이루어지도록 조정한다. 컬럼을 물 및 평형화 완충제(인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용출액의 풀링된 분획을 로딩하고, 컬럼을 평형화 완충제로 세척한다. 그 다음, 컬럼을 세척 완충제(아세트산나트륨 완충제)로 세척한 후, 평형화 완충제로 세척한다. 그 후, 용출 완충제(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 폴리펩티드를 컬럼으로부터 용출하고, 마스터 용출 프로파일에 따라 단일 분획으로 수집한다. DEAE 세파로스 컬럼의 용출액은 특정한 전도성을 갖도록 조정한다. 생성된 약물을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70 ℃에서 저장한다.

이에 제한되는 것은 아니며, 브래드포드 분석법, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분광법(MALDI-TOF 포함하나, 이에 제한되는 것은 아님) 및 단백질 특징규명을 위한 다른 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 광범위한 방법 및 과정을 경우에 따라 사용하여 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 수율 및 순도를 분석한다.

추가 방법은 내독소를 제거하는 단계를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 내독소는 그람-음성 숙주 세포 예컨대, 이.콜라이의 외막 상에 위치된 리포폴리-사카라이드(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있고, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 사용한 정제 기법, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이 방법들의 조합 방법 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 원하는 폴리펩티드로부터 오염물질 예컨대, 동시-이동하는 단백질을 제거하기 위한 변형 방법 또는 추가 방법이 필요할 수 있다. 내독소 수준의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있고 리뮬러스 아메보사이트 용해물(LAL) 분석을 포함하나 이로 한정되지 않는다.

추가 방법 및 절차로는 단백질 염색 방법과 커플링된 SDS-PAGE, 면역블롯팅, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화-질량 분광계(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전위 포커싱, 분석 음이온 교환, 크로마토포커싱 및 원평광 이색성 분광 분석(circular dichroism)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 임의의 하위화학식 또는 특정 화합물을 포함하는 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 아미노산을 폴리펩티드에 도입하여서, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조한다. 다른 구체예에서, 이러한 아미노산은 폴리펩티드 내 특정 부위에 도입시킨다. 다른 구체예에서, 이러한 아미노산은 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드에 도입시킨다. 다른 구체예에서, 이러한 번역 시스템은 (i) 상기 아미노산의 도입을 위한 예정된 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함하며 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 상기 아미노산을 포함하며 상기 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 번역 시스템에서 생성된 mRNA이다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 파지를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 내로 안정하게 도입된다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5-염기 코돈 및 4-염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, tRNA는 서프레서 tRNA이다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 상기 아미노산으로 아미노아실화된 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 상기 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 오르쏘고날 tRNA 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 리보솜에 의해 합성되고, 추가 구체예에서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 및 진핵생물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 생체내 번역 시스템이다. 다른 구체예에서, 세포는 이.콜라이 세포, 효모 세포, 슈도모나스 종으로부터의 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다. 이러한 번역 시스템의 다른 구체예에서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 또는 진핵생물 세포로부터의 세포 추출물을 포함하는 시험관내 번역 시스템이다. 다른 구체예에서, 세포 추출물은 이.콜라이 세포, 효모 세포, 슈도모나스 종으로부터의 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포로부터 유래된 것이다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드의 적어도 일부는 고체상 펩티드 합성 또는 용액상 펩티드 합성 또는 이들의 조합 기법에 의해 합성되지만, 다른 구체예는 상기 폴리펩티드를 또 다른 폴리펩티드에 결찰시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 임의 하위화학식 또는 특정 화합물을 포함하여, 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 아미노산을 폴리펩티드에 도입하며, 여기서 이 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료 단백질에 상동성을 갖는 단백질이다.

B. 생체내 번역 후 변형

진핵생물 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 제조함으로써 이러한 폴리펩티드는 진핵생물 세포에서의 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산, 및 진핵생물 세포에 의해 생체내에서 만들어진 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 이때 번역 후 변형은 원핵세포에 의해서는 만들어지지 않는다. 예를 들어, 번역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질-연결 변형, 글리코실화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라진 연결에 의해 올리고사카라이드((GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc를 포함하는 이로 한정되지 않음)를 아스파라진에 부착시킨 단계를 포함한다. 진핵생물 세포 단백질의 N-연결 올리고사카라이드의 일부 예가 나열된 하기 표 1을 참조한다(기재되지 않은 추가 잔기도 존재할 수 있음). 또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 연결, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 연결로 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시킨 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선(preproparathyroid) 호르몬, 전전구인슐린(preproinsulin), 전구인슐린(proinsulin), 전전구-오피오멜라노코르틴(prepro-opiomelanocortin), 전구-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin) 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)의 단백질분해 처리, 다중서브유닛(multisubunit) 단백질 또는 거대분자 조립체(assembly)로의 조립, 세포 내의 또 다른 부위로의 이동(소기관, 예를 들면 소포체, 골기체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로의 이동 또는 분비성 경로를 통한 이동을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다. 특정 구체예에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다.

비천연 아미노산의 한 이점은 추가 분자를 부가시키는 데 사용될 수 있는 추가 화학적 부분을 제공한다는 점이다. 이러한 변형은 진핵생물 세포 또는 비-진핵생물 세포의 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들면, 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선별적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 포함하나 이들로 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유결합 형성을 포함한다. 이러한 경우, 선별성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근용이성에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 제조한 폴리펩티드에서, 시험관내 및 생체내에서의 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 포함하나 이로 한정되지 않는 다른 더 많은 선별적 반응들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7]을 참조할 수 있다. 이는 형광 발색단, 가교연결제, 사카라이드 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약 호스트(host)를 사용하여 사실상 임의의 단백질을 선별적으로 표지할 수 있게 한다. 또한, 본 발명에 참고로 도입되는, 2003년 1월 16일 출원된 미국특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "당단백질 합성")를 참조한다. 또한, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 번역 후 변형은 스타우딩거 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용한 결합을 포함하나 이로 한정되지 않음)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조한다.

IX. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 대체 시스템

비-재조합 숙주 세포, 돌연변이된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 몇몇 방법들이 사용되었다. 본 단락에 개시된 대체 시스템은 비천연 아미노산의 제조에 적용될 수 있다. 예를 들어, 반응성 측쇄, 예를 들면 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도화는 라이신을 N₂-아세틸-라이신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 효소에 의한 펩티드 단편의 연결 및 펩티드 단편의 천연 화학적 연결이 최근에 개발되었기 때문에, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69: 923 (2000)]을 참조할 수 있다. 화학적 펩티드 결찰 및 천연 화학적 결찰은 본 명세서에 완전히 참고로 도입되는 미국특허 제6,184,344호, 미국특허 공보 제2004/0138412호, 미국특허 공보 제2003/0208046호, 및 국제특허공보 제WO 02/098902호 및 제WO 03/042235호에 기재되어 있다. 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 서프레서 tRNA를, 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가하는 일반적인 시험관내 생합성 방법을 이용하여 100개 초과의 비천연 아미노산을 사실상 임의의 크기의 다양한 단백질 내로 부위 특이적으로 도입하였다. 예를 들면, 문헌[V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34; 621 (1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244: 182-188 (1989); and, J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-8014 (1989)]을 참조할 수 있다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기전 및 신호 전달도입의 연구를 위해 매우 다양한 작용기가 단백질 내로 도입되었다.

선별적 압력 도입으로 지칭되는 생체내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 실시하였다. 예를 들면, 문헌[N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13: 41 (1999)]을 참조할 수 있다. 세포에 특정한 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하지만, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정체 성장기의 개시 시점에서, 천연 아미노산은 고갈되고, 비천연 아미노산 유사체로 교체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들면, 이 방법에 의해, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질 내로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더(shoulder)를 나타내며(예를 들면, 문헌[C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284: 29 (2000)] 참조), ¹⁹F NMR을 이용하여 키토올리고사카라이드 리간드와 메티오닌의 상호작용을 연구하기 위해 박테리오파지 T4 리소자임(lysozyme)에서 메티오닌을 트리플루오로메티오닌으로 치환하는 데 사용되었고(예를 들면, 문헌[H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry. 36: 3404 (1997)] 참조), 트리플루오로류신을 류신 대신에 도입하여, 류신-지퍼(zipper) 단백질의 열적 안정성 및 화학적 안정성을 증가시켰다. 예를 들면, 문헌[Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40: 1494 (2001)]을 참조할 수 있다. 나아가, 셀레노메티오닌(selenomethionine) 및 텔루로메티오닌(telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질 내로 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들면, 문헌[W. A. Hendrickson, J.R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9: 1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1: 283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230: 788 (1995); and, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol. 270; 616 (1997)]을 참조할 수 있다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의한 단백질의 추가 변형을 가능하게 하였다. 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[J. C. M. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428: 68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122: 1282 (2000); and, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487 (2000)]; 미국특허 제6,586,207호; 및 미국특허출원 공개 제2002/0042097호를 참조할 수 있다.

이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 달려 있고, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 신뢰도를 보증하기 위해 높은 선별성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우에서 달성되었다. 예를 들면, 이.콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala²⁹⁴의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 일으킨다. 문헌[M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33: 7107 (1994)]을 참조할 수 있다. 이 돌연변이체 PheRS를 보유하는 이.콜라이 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입한다. 예를 들면, 문헌[M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett., 364: 272 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467: 37 (2000)]을 참조할 수 있다. 유사하게, 이.콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phel30Ser는 티로신보다 아자티로신을 더 효율적으로 도입하는 것으로 밝혀졌다. 문헌[F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275: 40324 (2000)]을 참조할 수 있다.

비천연 아미노산을 생체내에서 단백질 내로 도입하는 또 다른 방법은 교정(proofreading) 기전을 갖는 합성효소를 개질시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이 오류는 분리된 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된(mischarged) 아미노산을 탈아실화시켜 단백질 번역의 신뢰도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 작용하지 못하는 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정(editing) 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이 방법은 발릴-tRNA 합성효소(VaIRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌[V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292: 501 (2001)]을 참조할 수 있다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)로 tRNAVal을 잘못 아미노아실화시킬 수 있고, 이러한 비-동족 아미노산들은 추후 교정 도메인에 의해 가수분해된다. 이.콜라이 염색체의 무작위적 돌연변이유발 후, ValRS의 교정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이된 이.콜라이 균주를 선별하였다. 이러한 교정-결핍 ValRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하기 때문에, Cys의 -SH 기는 Abu의 -CH₃로 치환되고 돌연변이체 ValRS도 이 돌연변이체 이.콜라이 균주가 Abu의 존재 하에 성장하는 경우 Abu를 단백질 내로 도입한다. 질량 분광 분석은 천연 단백질 내의 각각의 발린 위치에서 발린의 약 24%가 Abu로 치환된다는 것을 보여준다.

또한, 고체-상 합성 및 반합성 방법도 새로운 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들면, 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조할 수 있다: 문헌[Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of prazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am. Chem., 88 (24): 5914-5919 (1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res, 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256: 221-225 (1992); Chaiken, I. M. Seniisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev. Biochem., 11 (3): 255-301 (1981); Offord, R. E. Protein engineering by chemical means, Protein Eng., 1 (3): 151-157 (1987); and, Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183): 243 (1994)].

화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관내에서 단백질 내로 도입하는 데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌[Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238 (4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev. Biochem., 54: 565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226: 505-511 (1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243 (24): 6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J Am. Chem. Soc., 3153-3154 (1966); and, Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242 (4881): 1038-1040 (1988)]을 참조할 수 있다.

별법으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법을 사용하여 몇몇 생물리적 프로브를 시험관내에서 합성된 단백질 내로 도입하였다. 하기 문헌 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌을 참고할 수 있다: 문헌[Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev. Biochem., 62: 483-514 (1993); and, Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci., 83 (22): 8604- 8608 (1986)].

종래, 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비천연 아미노산을 시험관내에서 부위 특이적으로 도입할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 방법들을 이용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성을 갖는 균주를 사용하여 다수의 20종의 공통된 아미노산을 유사한 구조의 상동체로 치환시킬 수 있고, 예를 들면, 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268: 439-42 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J Am. Chem. Soc., 111: 8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13: 41-51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 435-62 (1995)]을 참조할 수 있다.

예를 들면, 정지 코돈 UAG를 인식하고 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 제조하였다. 보편적인 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 정지 코돈 TAG를 단백질 유전자 내의 원하는 부위에 도입하였다. 예를 들면, 문헌[Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16 (3): 791-802 (1988)]을 참조할 수 있다. 아실화된 서프레서 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특정한 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 반응하여 비천연 아미노산이 도입되었다. [³H]-Phe을 사용한 실험 및 α-히드록시산을 사용한 실험은 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정한 위치에서만 도입되고, 이 아미노산이 단백질 내의 임의의 다른 부위에서는 도입되지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들면, 문헌[Noren, et al, supra: Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6): 425-432; and, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041): 197-200 (1992)]을 참조할 수 있다.

또한, 미세주사(microinjection) 기법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입하였다. 예를 들면, 문헌[M. W. Nowak, P. C. Kearney, J.R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268: 439 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 645 (2000)]을 참조할 수 있다. 시험관내에서 제조된 2개의 RNA 종(원하는 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 엠버 서프레서 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 주사하였다. 그 다음, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에서 비천연 아미노산을 삽입시킨다. 이 방법은 일반적으로 시험관내 발현 시스템에서 생성되지 않는 일체형(integral) 막 단백질의 생체내 구조-기능 연구를 가능하게 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 태치키닌(tachykinin) 뉴로키닌(neurokinin)-2 수용체 내로 도입하여 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것(예를 들면, 문헌[G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271: 19991 (1996)] 참조); 이온 채널에서 표면-노출된 잔기를 확인하기 위해 바이오티닐화 아미노산을 도입하는 것(예를 들면, 문헌[J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4: 739 (1997)] 참조); 실시간으로 이온 채널의 구조적 변화를 모니터링하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용하는 것(예를 들면, 문헌[J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20: 619 (1998)] 참조), 및 관문(gating) 기전을 프로빙(probing)하기 위해 알파 히드록시 아미노산을 사용하여 이온 채널 골격을 변화시키는 것을 포함한다(예를 들면, 문헌[P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96: 89 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4: 239 (2001)] 참조).

생체내에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 직접 도입하는 능력은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포, 또는, 가능한 경우, 살아있는 유기체에서의 돌연변이체 단백질의 연구 가능성, 및 치유적 치료에 있어서의 이러한 돌연변이체 단백질의 사용이라는 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 성질을 갖는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력은 단백질 기능을 프로빙하고 새로운 성질을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생성하기 위해 단백질의 구조를 합리적 및 체계적으로 개조하는 능력을 크게 확장시킬 수 있다.

파라-F-Phe를 부위 특이적으로 도입하려는 한 시도에서, 효모 앰버 서프레서 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 이.콜라이 균주에서 사용하였다. 예를 들면, 문헌[R. Furter, Protein Sci. 7: 419 (1998)]을 참조할 수 있다.

무세포(시험관내) 번역 시스템을 경우에 따라 사용하여 원하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻을 수도 있다. 주형(시험관 내 번역)으로서의 mRNA 또는 주형(시험관 내 전사와 번역이 조합됨)으로서의 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관 내 합성은 리보솜에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 본 발명에 참고로 도입되는 문헌[Kim, D. M. and J.R. Swartz, Biotechraology and Bioengineering, 74: 309-316 (2001); Kim, D. M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D. M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D. M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineerng, 66, 180-188, (1999); and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechnology 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 제6,337,191호; 미국 특허출원 공개 제2002/0081660호; 및 국제특허출원 공개 제WO 00/55353호 및 제WO 90/05785호를 참조할 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 방법은 mRNA-펩티드 융합 기술을 포함한다. 예를 들면, 문헌[R. Roberts and J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94: 12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003)]을 참조할 수 있다. 이 방법에서, 퓨로마이신(puromycin)에 결합된 mRNA 주형은 리보솜 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비천연 아미노산 역시 펩티드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 포획한다. 생성된 mRNA-펩티드 접합체가 시험관 내 분석에서 흥미로운 성질을 갖는 것으로 발견된 경우, 그의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 보다 최근에, 정제된 성분을 사용한 시험관 내 리보솜 번역이 비천연 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 문헌[A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 100: 6353 (2003)]을 참조할 수 있다.

X. 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형

편의를 위해, 본 섹션에 기술한 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은 총체적으로 및/또는 특정예를 들어 기술하였다. 하지만, 본 섹션에서 기술한 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역후 변형이 이 섹션에서 제공한 일반적인 설명이나 특정예에만 제한되는 것은 아니며, 본 섹션에 기술한 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역후 변형은 본 명세서, 청구항 및 도면에 기술한 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII 및 구조 1-6을 갖는 화합물의 범주에 속하는 임의의 하위 화학식 또는 특정 화합물을 포함하여, 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII 및 구조 1-6을 갖는 화합물의 범주에 속하는 모든 화합물에 동등하게 적용된다.

단백질의 생체내 번역 과정 동안에 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 도입하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단이 개발되었다. 이 기술은 천연 발생 아미노산의 측쇄에 대해 오르쏘고날한 측쇄 화학성을 가진 비천연 아미노산을 도입함으로써 재조합 단백질의 부위 특이적 유도화를 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단의 주요 이점은 유도화된 단백질이 소정의 균질한 생성물로서 제조될 수 있다는 점이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 생체내 번역 기법에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드로 한정되지 않고, 예를 들어, 발현된 단백질 결찰, 화학적 합성, 리보자임-기반 기법(예컨대, 본 발명의 "대체 시스템에서의 발현" 단락 참조)을 비롯한 임의의 기법에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다.

비천연 아미노산을 재조합 단백질 내로 도입하는 능력은 번역 후 유도화를 위해 실시될 수 있는 화학적 기법을 넓게 확장시키는데, 이때 이러한 유도화는 생체내 또는 시험관내에서 일어난다.

보다 구체적으로, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분 상에 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 형성하기 위하여 1,2-디카르보닐 및 1,2-아릴디아민의 반응을 활용한 폴리펩티드 유도체화는 몇가지 장점을 제공한다. 우선, 천연 발생 아미노산은 (a) 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 형성하기 위해 1,2-아릴디아민 기와 반응할 수 있는 1,2-디카르보닐 기를 함유하지 않고 (b) 1,2-디카르보닐 기와 반응할 수 있는 1,2-아릴디아민 기는 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 형성하고, 따라서 이러한 연결을 형성하도록 디자인된 시약은 부위 특이적으로 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분(물론 비천연 아미노산 및 상응하는 시약이 이러한 연결을 형성하도록 디자인되었다고 가정함)과 반응하게 되어서, 부위 선택적으로 단백질을 유도체화하는 능력은 공지 방법을 이용하여 생성된 유도체와 단백질의 혼합물과 대조적으로 단일한 동종 생성물을 제공하게 된다. 다음으로, 이러한 페나진 또는 퀴녹살린 연결은 생물학적 조건에서 안정하며, 이러한 페나진 또는 퀴녹살린 연결에 의해 유도체화된 단백질이 치료 용도로 유효한 후보물임을 시시한다. 세번째로, 얻어진 페나진 또는 퀴녹살린 연결의 안정성은 이 페나진 또는 퀴녹살린 연결이 형성된 비천연 아미노산의 본질(identity)(즉, 작용기 및/또는 구조)을 기초로 조작할 수 있다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드에의 페나진 또는 퀴녹살린 연결은 1 시간 미만의 분해 반감기를 가지며, 다른 구체예에서는 1일 미만이고, 다른 구체예에서는 2일 미만이며, 다른 구체예에서는 1주 미만이고 또 다른 구체예에서는 1주 이상이다. 다른 구체예에서, 얻어진 페나진 또는 퀴녹살린 연결은 온화한 산성 조건하에서 2주 이상 안정하고, 다른 구체예에서, 얻어진 페나진 또는 퀴녹살린 연결은 온화한 산성 조건 하에서 5일 이상 안정하다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 약 pH 2 내지 약 pH 8에서 1일 이상 안정하고, 다른 구체예에서는 약 pH 2 내지 약 pH 6에서, 다른 구체예에서는 약 pH 2 내지 약 pH 4에서 1일 이상 안정하다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기술한 전략, 방법, 조성물 및 기법을 이용하여, 비천연 아미노산 폴리펩티드에의 페나진 또는 퀴녹살린 연결은 사용시 상황(예컨대, 지속 방출의 치료 용도 또는 진단 용도 또는 산업적 용도 또는 군용 등)에 분핵 반감기를 조절하여 합성한다.

전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 신규 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체 및 항체 단편을 포함하나 이로 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구 등에 유용하다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4: 645-652]을 참조할 수 있다. 전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 용도에는 분석-기재 용도, 산업 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경 용도, 에너지-생성 용도 및/또는 방위산업 용도가 포함된다. 전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 치료 효과의 개질, 폴리펩티드의 안전성 프로파일의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 성질의 조절(예컨대, 수용성 및 생체이용성의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에의 추가 작용기의 제공, 폴리펩티드 내로의 태그, 표지 또는 검출가능한 신호의 도입, 폴리펩티드의 단리 성질의 개선 및 전술한 변형의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 한정되지 않는 새로운 또는 개선된 기능을 도입하기 위한 추가 변형을 받을 수 있다.

일 구체예는, 페나진 함유 비천연 아미노산, 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산, 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 및 아릴 디아민 함유 비천연 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 동종 생합성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 사용을 포함하는 폴리펩티드의 단리 특성을 용이하게 하는 방법이다. 다른 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산은 본 발명에서 기술한 바와 같이 폴리펩티드에 생합성적으로 도입된다. 다른 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 아미노산에서 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정한 종류, 부류 또는 패밀리로 한정되지 않는다. 실제로, 사실상 임의의 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 이루어진 군에서 선택된 치료 단백질과 상동성을 나타낼 수 있다. 이 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 다라 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리의 임의의 폴리펩티드 구성원과 상동성이다.

이러한 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자 도입 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소형 분자; 저해성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획제; 비오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 애브자임, 활성화된 착물 활성화제, 바이러스, 보조제, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 백터, 거대분자, 미모토프, 수용체, 리버스 미셀 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분 상에 추가 작용기를 도입하는 것을 포함한다.

또한, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 다른 작용기, 예컨대 카르보닐, 디카르보닐, 히드록실아민 또는 아릴디아민으로 전환되는 부분을 함유한다. 도 19는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 아릴 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드로 화학 전환되는 것에 대해 도시하였다. 이렇게 얻어진 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 아릴 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징규명 및 사용하는 방법, 조성물, 기법 및 전략에 사용하거나 이에 도입시킨다. 화학 부분의 다른 작용기, 예컨대 디카르보닐 또는 아릴 디아민으로의 화학 전환하는 것은 예를 들어, 공지된 문헌 예컨대 [in March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5^th Ed., (Wiley 2001); 및 Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., Vols A and B(Plenum 2000, 2001)]에 기술된 방법 들을 이용하여 실시할 수 있다.

또한, 아릴 디아민 함유 시약을 이용하여 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 화학 변형시키는 것은 경우에 따라 적절한 여기 하에 고 형광성 페나진 및 페녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하는데 사용한다. 또한, 디카르보닐 함유 시약과 반응시 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 적절한 여기하에 고형광성 페나진 및 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산을 생성하는데 사용한다.

본 명세서에 기술한 방법 및 조성물의 일 측면은 이에 제한되는 것은 아니고, 번역후 변형된 비천연 아미노산을 예를 들어, 약 2 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 5 이상, 약 6 이상, 약 7 이상, 약 8 이상, 약 9 이상 또는 약 10 이상을 포함하여 약 하나 이상 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물이다. 번역후 변형된 비천연 아미노산은 경우에 따라서, 동일하거나 상이한데, 이에 제한되는 것은 아니고, 상이한 번역후 변형 비천연 아미노산을 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상 포함하는 폴리펩티드에 상이한 부위가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상 존재할 수 있다. 다른 측면에서, 조성물은 폴리펩티드에 존재하는 특정 아미노산이 하나 이상이지만 전부보다는 적은 아미노산이 번역후 변형된 비천연 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 번역후 변형된 비천연 아미노산을 갖는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 번역후 변형된 비천연 아미노산은 경우에 따라 동일하거나 상이하다(이에 제한되는 것은 아니고, 폴리펩티드는 2 이상의 상이한 유형의 번역후 변형된 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 2 이상의 동일한 번역후 변형된 비천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2 이상의 번역후 변형된 비천연 아미노산을 갖는 소정의 폴리펩티드에 있어서, 번역후 변형된 비천연 아미노산은 경우에 따라 동일하거나, 상이하거나 또는 하나 이상의 상이한 번역후 변형된 비천연 아미노산을 갖는 동일 유형의 다수의 번역후 변형된 비천연 아미노산의 조합이다.

A. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역후 변형하는 방법; 페나진 및 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성

퀴녹살린 또는 페나진 기를 함유하는 비천연 아미노산은 1,2-디카르보닐을 함유하는 시약과 1,2-아릴디아민을 함유하는 비천연 아미노산을 반응시키거나, 또는 1,2-아릴디아민을 함유하는 시약과 1,2-디카르보닐을 함유하는 비천연 아미노산을 반응시켜 생성시킨다. 상기 시약은 경우에 따라 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자 도입 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 분자에 더욱 연결된다. 일 구체예에서, 비천연 아미노산은 적절한 시약과 반응시에 폴리펩티드에 도입되는데, 이때 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 통해 목적 분자와 폴리펩티드 사이에 접합이 형성된다.

일 측면은 하기 구조 1-6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법이다:

상기 방법은 폴리펩티드 내에 말단 또는 내부 위치에 상기 구조 1-6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 도입하는 단계를 포함한다.

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이며, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

X는 -C(R₅)(R₅)-, -NR₅-, -O- 또는 -S-이고;

Y는 -CR₅- 또는 -N-이며;

n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;

m은 0, 1, 2, 3 또는 4이며, 단 m+n은 1, 2, 3 또는 4이고;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬이고;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")₂ 또는 -L-Z이고; 또는

함께 선택된 2개의 R₅ 기는 경우에 따라 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴을 형성하고;

각각의 R"은 독립적으로, H, 보호기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬이거나, 또는 하나보다 많은 R" 기가 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하고;

Z는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 약물 전달제, 전자 전달 제제, 호르몬, 스테로이드, 효소, 비타민, 영양분, 식이 보조제, 면역글로불린, 사이토카인, 인터루킨, 인터페론, 뉴클레아제, 인슐린, 종양 억제제, 혈액 단백질, 호르몬 또는 호르몬 유사체, 백신, 항원, 혈액 응고 인자, 성장 인자, 리보자임 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고;

L은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 치환된 아르알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)O-, -C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, OC(O)-, -OC(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CS-, -N(R')CS-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, OC(O)N(R')-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')S(O)_k-, -N(R')C(O)N(R')-, N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -N=C(R')-, -N=N-, -C(R')=N-(R')-, -C(R')₂-N=N-, 또는 -C(R')₂-N(R')-N(R')-이고;

여기서, k는 0, 1 또는 2이고 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이거나; 또는

-A-B-페나진 또는 퀴녹살린 함유 부분은 함께 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 포함하는, 치환되거나 미치환된 이환 또는 삼환, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성하거나; 또는

-B-페나진 또는 퀴녹살린 함유 부분 기는 함께 하나 이상의 퀴녹살린 또는 페나진 기를 포함하는, 치환되거나 미치환된 단환 또는 이환, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴을 형성한다.

일 구체예에서, Z는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 산화물; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당 기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 비오틴; 비오틴 유사체; 검출가능 표지; 및 이의 조합에서 선택된다.

일 구체예는 구조 1-6이 하기 구조 7-12에 상응하는 것인 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법이다:

상기 방법은 폴리펩티드 내에 말단 또는 내부 위치에 구조 1-6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 k는 1, 2 또는 3이고 R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

일 구체예는 구조 7을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 구조 7이 하기 화학식 XI-A 또는 XI-C를 갖는 구조에 상응하는 것인 폴리펩티드 내 말단 또는 내부 위치에 구조 7을 갖는 하나 이상의 아미노산을 도입하는 단계를 포함한다:

[화학식 XI-A]

[화학식 XI-C]

일 구체예는 구조 1을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 구조 1이 하기 화학식 XI-B를 갖는 구조에 상응하는 것인 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 단계를 포함한다:

[화학식 XI-B]

일 구체예는 구조 6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 구조 6이 하기 화학식 XI-D를 갖는 구조에 상응하는 것인 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 단계를 포함한다:

[화학식 XI-D]

상기 식에서, 각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR', -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고, B는 -CH₂-, -N(R')-, -O- 또는 -S-이며, R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.

일 구체예는 화학식 XI-A-D의 구조를 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 하기 화학식 XI-A-D의 구조를 갖는 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 단계를 포함한다:

일 구체예는 구조 1 또는 6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서 아미노산은 (i) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 구조 1-6을 갖는 아미노산의 도입의 사전 지정 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) 아미노산을 포함하는 tRNA로서, 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함하는 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드에 특정 부위에 도입된다.

일 구체예는 구조 1 또는 6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 아미노산을 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서 번역 시스템은 구조 1-6을 갖는 아미노산을 아미노아실화시키는 tRNA를 포함한다.

일 구체예는 구조 1 또는 6을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 아미노산을 도입시키는 단계를 포함하고, 여기서 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 및 진핵생물 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포를 포함하는 생체 내 번역 시스템이다.

일 구체예는 하기 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다:

[화학식 VII]

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이며, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬이고;

각각의 R"은 독립적으로 H, 보호기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬이거나, 또는 하나보다 많은 R" 기가 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하고;

각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR', -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고, R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

일 구체예는 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 비천연 아미노산과 1,2-디카르보닐 함유 화합물을 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 VII의 구조는 하기 화학식 VI에 상응한다;

[화학식 VI]

일 구체예는 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 VII의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 VII의 구조는 하기 화학식 VIII에 상응한다:

[화학식 VIII]

일 구체예는 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 VII의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 VII의 구조는 하기

로 이루어진 군에서 선택된다.

일 구체예는 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 VII의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 VII의 구조는 하기 화학식 IX에 상응한다:

[화학식 IX]

일 구체예는 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 IX의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 IX의 구조는

로 이루어진 군에서 선택된다.

일 측면은 구조 1-6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물과 반을시키는 단계를 포함한다:

[화학식 I]

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")(CO)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 이루어진 군에서 선택된 링커이며;

J는 이고,

여기서 X는 -CH₂-, -NH-, O 또는 S이고, Y는 -CH- 또는 -N-이고, n은 0, 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1, 2, 3, 또는 4이고, 단 m+n은 1, 2, 3 또는 4이며,

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고,

R₁은 H, 아미노산 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로, H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 함께 선택된 R³ 및 R⁴ 또는 함께 선택된 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나, 또는

-A-B-J-R 기는 함께 1,2-디카르보닐 기, 보호된 1,2-디카르보닐 기 또는 마스크된 1,2-디카르보닐 기를 포함하는, 치환되거나 미치환된, 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기는 함께 1,2-디카르보닐 기, 보호된 1,2-디카르보닐 기 또는 마스크된 1,2-디카르보닐 기를 포함하는, 치환되거나 미치환된, 단환 또는 이환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.

일 구체예는 구조 1 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 II의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다:

[화학식 II]

일 구체예는 구조 1 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 III의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다:

[화학식 III]

여기서, 각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR', -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고, 여기서 R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

일 구체예는 구조 1 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 III의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 III의 구조는

로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 X는 -CH₂-, -NH-, -O- 또는 -S-이다.

일 구체예는 구조 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 I의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물가 반응시키는 단계를 포함하고, 화학식 I의 구조는

로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR'-, -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고, 여기서 R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

일 구체예는 구조 1, 3 또는 6을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 화학식 I의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학식 I의 구조는 다음과 같다:

[화학식 IV-A]

여기서, 각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR'-, -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고;

B는 -CH₂-, -N(R')-, -O- 또는 -S-이고,

R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.

또한, 치환된 1,2-카르보닐 및 치환된 1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산의 폴리펩티드로의 도입은 페나진 또는 퀴녹살린 연결의 형성을 통한 부위 특이적 유도체화를 제공한다. 유도체화 및/또는 추가 변형을 위한 방법은 경우에 따라 유도체화 단계 전 또는 유도체화 단계 이후에 정제된 폴리펩티드를 이용하여 수행된다. 또한, 유도체화 및/또는 추가 변형을 위한 방법은 경우에 따라, 이러한 변형 전 또는 후에 정제된 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 수행한다. 또한, 유도체화 단계는 예를 들어, 약 pH 3 내지 약 pH 8, 약 pH 4 내지 약 pH 10, 약 pH 4 내지 약 pH 8, 약 pH 4.5 내지 약 pH 7.5, 약 pH 4 내지 약 pH 7, 약 pH 3 내지 약 pH 4, 약 pH 7 내지 약 pH 8, 약 pH 4 내지 약 pH 6, 약 pH 4 및 약 pH 6을 포함하du, 약 pH 2 내지 약 pH 10을 포함하는 온화한 산성 내지 약한 염기성 조건 하에서 효과적으로 수행한다.

또한, 일정 페나진 또는 퀴녹살린 연결은 형성되어서 다양한 검출 방법에 사용할 수 있는 형광성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 형성을 가능하게 한다. 도 2 내지 11은 페나진과 퀴녹살린 유도체를 생성시키기 위한 1,2-디카르보닐 시약과 1,2-아릴 디아민 시약간의 반응에 대한 몇몇 비제한적인 예를 나타낸 것이다. 1,2-디카르보닐 시약 또는 1,2-아릴디아민 시약은 비천연 아미노산(비천연 아미노산 폴리펩티드 포함)의 측쇄를 나타낸다. 예를 들어, 하기 비천연 아미노산은 페나진 및 퀴녹살린 함유 비천연 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 디카르보닐 함유 및 아릴디아민 함유 아미노산의 유형이다. 페나진 및 퀴녹살린 함유 비천연 폴리펩티드를 형성시키기 위한 이러한 반응은 광범위한 pH 범위에서 일어나고 상당히 빠르고 효율적이다. 또한, 이러한 페나진 및 퀴녹살린의 형성은 페나진 및 퀴녹살린 함유 비천연 폴리펩티드로의 결찰/접합을 위해 사용되거나, 또는 페나진 및 퀴녹살린 함유 비천연 폴리펩티드의 검출을 위해 사용된다.

1,2-디카르보닐 작용기를 갖는 아미노산은 1,2-아릴디아민가 반응하여 퀴녹살린 또는 페나진을 형성하고, 이는 경우에 따라 다른 분자와 더욱 연결된다. 1,2-디카르보닐 작용기는 1,2-디카르보닐 유사기(구조적으로 1,2-디카르보닐 기와 유사하고 1,2-디카르보닐 기와 유사한 방식으로 1,2-아릴디아민과 반응하게 됨), 마스크된 1,2-디카르보닐 기(1,2-디카르보닐 기로 용이하게 전환될 수 있음), 또는 보호된 1,2-디카르보닐 기(탈보호시 1,2-디카르보닐 기와 유사한 반응성을 가짐)를 포함한다. 이러한 아미노산은 상기 기술한 바와 같이, 화학식 I, II, III 또는 IV의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다.

1,2-아릴디아민 기를 함유하는 비천연 아미노산은 다양한 1,2-디카르보닐 또는 1,2-디카르보닐 동등기와 반응하여, 퀴녹살린 또는 페나진 연결을 통해 접합체를 형성한다(이에 제한되는 것은 아니며, PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함함). 따라서, 본 발명에서 기술한 일 구체예는 1,2-아릴디아민 기, 1,2-아릴디아민 유사기(1,2-아릴디아민 기와 구조적으로 유사하고 1,2-아릴디아민 기와 유사한 방식으로 1,2-디카르보닐과 반응하게됨), 마스크된 1,2-아릴디아민 기(1,2-아릴디아민 기로 용이하게 전환될 수 있음), 또는 보호된 1,2-아릴디아민 기(탈보호시 1,2-아릴디아민과 유사한 반응성을 가짐)를 포함하는 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이다. 이러한 아미노산은 상기 기술한 바와 같이, 화학식 V, VI, VII, VIII, IX 및 X의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다.

일 구체예에서, 얻어진 디카르보닐- 또는 아릴디아민 함유 폴리펩티드는 예를 들어, 하기 화학식 XVII의 시약을 이용하여 더욱 변형시키서 페나진- 또는 퀴녹살린-함유 폴리펩티드를 형성한다:

[화학식 XVII]

상기 식에서, 각각의 X는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂이며, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이거나; 또는

각각의 X는 독립적으로 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀, 및 이의 임의 조합에서 선택된다.

각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택되고;

L₁은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 -C(R')_p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이고, 여기서 p는 0, 1 또는 2이고;

각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

W는 이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고, n은 1 내지 3이며, 단 L-L₁-W는 함께 비천연 아미노산 또는 "변형 또는 미변형된" 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에서 각각 아릴 디아민 또는 카르보닐(디카르보닐 포함) 기와 반응할 수 있는 하나 이상의 디카르보닐 또는 아릴디아민 기를 제공한다.

일 구체예에서, X는 수용성 중합체, 폴리알킬렌 산화물, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교제, 하나 이상의 아미노산, 하나 이상의 당 기, 하나 이상의 뉴클레오티드, 하나 이상의 뉴클레오시드, 리간드, 비오틴, 비오틴 유사체, 검출가능 표지 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.

화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬을 포함하는 중합체이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 폴리알킬렌 산화물 또는 치환된 폴리알킬렌 산화물을 포함하는 중합체이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 [(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 약 20 내지 약 10,000임)를 포함하는 중합체이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 분자량이 약 2 내지 약 40 KDa인 m-PEG이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예예서, X는 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포솜, 미세입자 및 미셀로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 활성 제제이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 항생체, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자 및 스테로이드계 제제로 이루어진 군에서 선택된 약물이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알킬리성 포스파타네, β-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제로 이루어진 군에서 선택된 효소이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 형광성, 인광성, 화학발광성, 킬레이팅, 전자 밀집, 자성, 인터컬레이팅, 방사성, 발색단 및 에너지 전이 부분으로 이루어진 군에서 선택된 검출가능 표지이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체에서, X는 디카르보닐 함유 부분 및 아릴 디아민 함유 부분으로 이루어진 반응성 기이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, X는 페나진 도는 퀴녹살린 유도체이다. 화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, L은 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')- 및 -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택된다.

화학식 XVII의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XVIII의 구조를 갖는다:

[화학식 XVIII}

상기 식에서, W는 이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

화학식 XVIII의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XIX의 구조를 갖는다.

여기서 다른 구체예에서 m-PEG 또는 PEG 기는 분자량이 약 5 내지 약 30 kDa 범위이다.

화학식 XVIII의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XX의 구조를 갖는다:

[화학식 XX]

상기 식에서, W는 이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며,

존재하는 경우 Y는 알킬 또는 치환된 알킬이다.

L은 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 XVIII의 화합물의 다른 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XXI의 구조를 갖는다:

[화학식 XXI]

여기서, 화학식 XXI의 화합물의 일 구체예에서, m-PEG 기는 분자량이 약 5 내지 약 30 kDa 범위이다.

화학식 XVIII의 화합물의 다른 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XXII의 구조를 갖는다:

[화학식 XXII]

상기 식에서, W는 이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

존재하는 경우 Y는 알킬 또는 치환된 알킬이다.

L은 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 XXI의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은 화학식 XXIII의 구조를 갖는다:

[화학식 XXIII]

화학식 XXIII의 화합물의 다른 구체예에서, m-PEG 기는 분자량이 약 5 내지 약 30 kDa 범위이다.

일 구체예에서, 화학식 XVIII의 링커는 온화한 산성 조건 하에 수용액 중에서 디카르보닐- 또는 아릴 디아민 함유 폴리펩티드와 반응성이다. 일 구체예에서, 이러한 산성 조건은 약 pH 3 내지 약 pH 8, pH 약 4 내지 약 10, pH 약 4 내지 약 8, pH 약 4.5 내지 약 7.5, pH 약 4 내지 약 7, pH 약 3 내지 약 4, pH 약 7 내지 약 8, pH 약 4 내지 약 6, pH 약 4 및 pH 약 6을 포함하는 pH 약 2 내지 약 10이다.

화학식 XVIII의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XXIV의 구조를 갖는다:

[화학식 XXIV]

여기서, Z는 O 또는 NH이고 n은 1, 2, 3 및 4이며,

W는 이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

화학식 XXIV의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은 하기 화학식 XXV의 구조를 갖는다:

[화학식 XXV}

화학식 XXIV의 화합물의 다른 구체예에서, 화합물은 화학식 XXVI의 구조를 갖는다:

[화학식 XXVI]

일 구체예는 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 범주에 속하는 임의의 하위 화학식 또는 특정 화합물을 포함하여, 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 유도체화를 위한 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 화학식 XVII의 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 폴리펩티드는 화학식 XVII의 시약과 접촉시키기 전 또는 후에 정제한다. 다른 구체예는 하나 이상의 디카르보닐 또는 아릴 디아민을 함유하는 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 아미노산을 포함하는 최종 폴리펩티드이다. 다른 구체예는 화학식 XVII의 시약과 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 화합물을 커플링하여 생성된 하나 이상의 페나진 또는 퀴녹살린 함유 폴리펩티드를 포함하는 최종 폴리펩티드이다.

도 18은 PEG 기에 부착된 페나진 또는 퀴녹살린 함유 폴리펩티드를 형성하기 위하여 화학식 XIX의 시약으로 디카르보닐- 또는 아릴디아민 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드를 번역후 변형시키는 것에 대한 개략적인 도면이다. 도 24는 화학식 XXV의 이작용성 링커의 합성에 대한 일례를 나타낸 도면이다. 이와 같이, 본 발명에서 기술한 방법은 얄 말단에 아민 또는 히드록실 기를 함유하는 스페이서 시약을 산 함유 Boc-보호된 아릴디아민에 커플링하는 단계를 포함한다. Boc 기의 절단은 화학식 XXV의 링커를 생성시킨다.

일 구체예는 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 통해 폴리펩티드 이량체를 생성하는 방법으로서, 이 방법은 디카르보닐- 또는 아릴 디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 화학식 XXIV의 링커를 반응시키는 것으로 이루어진다. 도 23은 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 화학식 XXV의 링커의 축합을 이용하여 이러한 이량체를 형성하는 일례를 나타낸 도면이다. 일 구체예에서, 화학식 XXV의 링커는 말단기로서 디카르보닐 또는 아릴디아민 부분, 및 다른 말단에 상이한 분자가 도입되도록 더욱 변형시킬 수 있는 작용기를 포함한다.

일 구체예는 이작용성 링커의 사용을 통하여 페나진 및 퀴녹살린을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이 방법은

(i) 이작용성 링커를 사용하여 화학식 I의 아미노산을 포함하는 제1 폴리펩티드를 유도체화하는 단계; 및

(ii) 단계 (i)의 최종 유도체화된 단백질을 제2 시약, 예컨대 유도체화된 PEG와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 이작용성 링커와 접촉하기 전 또는 후에 정제된다.

도 23은 PEG 기에 부착된 페나진 또는 퀴녹살린을 함유하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 이작용성 링커 및 이의 용도를 도시한 도면이다.

화학식 XXVII의 이작용성 링커의 예를 하기에 도시하였다:

[화학식 XXVII]

상기 식에서, W는 이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.

일 구체예에서, 다중 링커 화학물은 부위특이적으로 디카르보닐 치환된 또는 아릴디아민 비천연 아미노산 폴리펩티드와 반응한다. 일 구체예에서, 본 발명에서 기술한 링커 방법은 하나 이상의 링커 말단(단작용성, 이작용성 또는 다작용성) 상에 아릴디아민 작용성을 함유하는 링커를 사용한다. 디카르보닐 치환된 단백질과 아릴디아민 유도체화된 링커의 축합은 페나진 또는 퀴녹살린 치환된 비천연 단백질을 생성한다. 다른 구체예에서, 본 명세성서 기술된 링커 방법은 하나 이상의 링커 말단 상(단작용성, 이작용성 또는 다작용성)에 디카르보닐 작용성을 함유하는 링커를 사용한다. 아릴디아민 치환된 단백질과 디카르보닐 유도체화된 링커의 축합으로 페나진 또는 퀴녹살린 치환된 비천연 폴리펩티드가 생성된다.

히드록실아민 함유 페나진 또는 퀴녹살린 치환된 비천연 단백질을 커플링시키기 위한 방법의 예시적은 구체예를 도 20에 나타내었다. 예시적인 구체예에서, 카르보닐 유도체화된 시약을 히드록실아민 함유 페나진 또는 퀴녹살린 치환된 비천연 단백질의 완충 용액(pH 약 4 내지 약 7)에 첨가하였다. 이 반응은 대기 온도에서 수 시간 내지 수일 동안 진행한다.

일 구체예는 페나진 또는 퀴녹살린 유도체를 형성하기 위하여 디카르보닐 또는 아릴디아민 함유 시약으로 디카르보닐 또는 아릴디아민 함유 비천연 폴리펩티드를 포함하는 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 유도체화하는 방법이다.

도 16은 디카르보닐 함유 시약을 이용하여 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드(우로텐신)를 유도체화하는 일례를 나타낸 것이다. 도 17은 아릴디아민 함유 시약을 이용하여 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드(XT-8)를 유도체화한 일례를 나타낸 도면이다.

다른 구체예에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건 하에서 약 1개월 이상 동안 수용액 중에서 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건 하에서 약 2주 이상 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에서 약 5일 이상 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 조건은 pH 약 2 내지 약 8이다. 일 구체예에서, 유도체화된 폴리펩티드의 3차 구조는 보존된다. 다른 구체예에서, 이러한 폴리펩티드의 유도체화는 유도체화된 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드에 결찰시키는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 이러한 유도체화되는 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4. MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학주성 단백질-1, 단핵구 화학주성 단백질-2, 단핵구 화학주성 단백질-3, 단핵구 염증성 단백질-1 알파, 단핵구 염증성 단백질-i 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타낼 수 있다.

B. 비천연 아미노산 폴리펩티드를 번역후 변형시키기 위한 방법: 카르보닐 함유 비천연 아미노산과 히드록실아민 함유 시약의 반응

천연 발생 아미노산의 측쇄는 고도의 친전자성 부위가 부족하다. 따라서, 예를 들어, 카르보닐 또는 디카르보닐 기 예컨대 케톤 또는 알데히드를 함유하는 아미노산을 포함하여 친전자성 함유 측쇄를 갖는 비천연 아미노산의 도입은 카르보닐 또는 디카르보닐 기의 친핵성 공격을 통해 이러한 측쇄의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 한다. 공격하는 친핵이 히드록실아민인 경우, 옥심 유도체화된 단백질이 생성된다. 유도체화 및/또는 추가 변형을 위한 방법은 경우에 따라 유도체화 단계 전이나 유도체화 단계 전에 정제한 폴리펩티드를 이용하여 수행한다. 또한, 유도체화 및/또는 추가 변형 방법은 경우에 따라 이러한 변형 전 또는 이후에 정제한 합성 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 수행한다. 또한, 유도체화 단계는 예를 들어, pH 약 2 내지 약 10, pH 약 3 내지 약 8, pH 약 4 내지 약 10, pH 약 4 내지 약 8, pH 약 4.5 내지 약 7.5, pH 약 4 내지 약 7, pH 약 3 내지 약 4, pH 약 7 내지 약 8, pH 약 4 내지 약 6, pH 약 4 및 pH 약 6을 포함하며, pH 약 2 내지 약 10을 포함하는 온화한 산성 내지 약한 염기성 조건 하에서 일어난다.

히드록실아민 치환된 분자와 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 폴리펩티드의 반응을 기초로하는 폴리펩티드 유도체화 방법은 상당한 장점이 있다. 우선, 히드록실아민은 옥시 부가물을 생성하기 위하여 pH 범위가 약 2 내지 약 8(그리고 추가 구체예에서, pH 약 4 내지 약 8 범위, pH 약 4 내지 약 7 범위, pH 약 7 내지 8 범위)에서 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 화합물과 축합반응한다. 이러한 조건하에서, 천연 발생 아미노산의 측쇄는 비반응성이다. 2번째, 이러한 선택적 화학법은 부위특이적인 재조합 단백질의 유도체화를 가능하게하고, 유도체화된 단백질은 정해진 동종성 생성물로서 제조할 수 있다. 3번째, 본 발명에서 기술한 카르보닐- 또는 디카르보닐 함유 폴리펩티드와 본 발명에서 기술한 히드록실아민의 반응을 실시하는데 요구되는 온화한 조건은 비가역적으로 폴리펩티드의 3차 구조를 파괴하지 않는다(물론, 반응 목적이 3차 구조를 파괴하고자하는 경우는 제외). 마지막으로, 히드록실아민 기 아미노가 이.콜라이에 의해 대사되는 것으로 보일지라도, 카르보닐- 또는 디카르보닐 함유 분자와 히드록실아민의 축합으로 생물학적 조건 하에서 안정한 옥심 부가물이 생성된다.

일 구체예에서, 이러한 유도체화에서 사용되는 히드록실아민 시약은 이의 측쇄에 보호된 디카르보닐 기 또는 아릴디아민 기를 함유한다. 이러한 유도체화로 얻어진 생성물은 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하기 위한 전구체로서 사용할 수 있다. 도 21은 아릴디아민 함유 히드록실아민 시약을 이용하는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성에 대한 비제한적인 예를 나타낸 도면이다.

예를 들어, 하기 히드록실아민 함유 시약은 본 명세서에서 기술하는 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산과 반응성이고 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 더욱 변형시키는데 사용되는 히드록실아민 함유 시약의 유형이다:

[화학식 XXXI]

상기 식에서, 각각의 X는 독립적으로 디카르보닐 함유 기, 아릴디아민 함유 기, 페나진 함유 기 또는 퀴녹살린 함유 기이고,

각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2, 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, =C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 이루어진 군에서 선택되고;

L₁은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우, -C(R')_p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이고, 여기서 p는 0, 1 또는 2이며,

각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고,

W는 -N(R_S)₂이고, 여기서 각각의 R_S는 독립적으로 H이거나 또는 아미노 보호기이고, n은 1 내지 3이며, 단 L-L₁-W는 함께 비천연 아미노산 또는 "변형 또는 비변형된" 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에서 카르보닐(디카르보닐 포함) 기와 반응할 수 있는 하나 이상의 히드록실아민 기를 제공한다.

화학식 XXXI의 화합물의 일 구체예에서, 화합물을 하기 화학식 XXXII의 구조를 갖는다:

[화학식 XXXII]

화학식 XXXII의 화합물의 일 구체예에서, 화합물은

로 이루어진 군에서 선택된다.

일 구체예에서, 이작용성 및/또는 다작용성 링커(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 다른 연결 화학물을 갖는 히드록실아민)은 디카르보닐 또는 아릴 디아민 부위를 함유하는 상이한 분자의 부위 특이적 연결을 가능하게 한다. 본 발명에서 기술한 이러한 링커 전략와 생체 내 번역 방법을 조합하여, 페나진 또는 퀴녹살린 연결된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 상이한 유도체를 형성하여, 높은 형광성 폴리펩티드를 생성시킨다.

카르보닐 함유 비천연 아미노산과 히드록실아민의 부위 특이적 커플링을 위한 방법의 예시적인 구체예를 도 21에 나타내었다. 이러한 예시적인 구체예에서, 아릴아민 함유 히드록실아민 시약을 카르보닐 함유 비천연 아미노산 hGH의 완충 용액(pH 약 3 내지 약 4)에 첨가한다. 이 반응은 대기 온도에서 약 수 시간 내지 약 수일 동안 진행된다. 얻어진 생성물은 완충 용액 중에서 디카르보닐 유도체화 반응하여 강한 형광성을 갖는 hGH 함유 페나진 유도체를 생성시킨다.

예를 들어, 하기 비천연 아미노산은 카르보닐 함유 아미노산 및 히드록실아민 시약의 반응으로 생성된 디카르보닐 및 아릴 디아민 함유 아미노산의 유형이다:

[화학식 XXXIII]

상기 식에서, A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌 또는 치환된 아르알킬렌이고,

B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 이루어진 군에서 선택된 링커이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬이고,

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지이며,

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지이고,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R³ 및 R⁴ 또는 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택되고;

각각의 X는 독립적으로 디카르보닐 함유기, 아릴 디아민 함유 기, 페나진 함유 기 또는 퀴녹살린 함유기이다.

예를 들어, 상기 언급한 목적을 위하여 화학식 XXXIII의 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:

[화학식 XXXIV]

상기 식에서, J는 , 페나진 부분 또는 퀴녹살린 부분이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고,

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지이고,

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지이며,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR'- 및 -S(O)_kR'으로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며,

L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택된다.

예를 들어, 상기 언급한 목적을 위해 화학식 XXXIII의 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:

[화학식 XXXV]

상기 식에서, J는 , 페나진 부분 또는 퀴녹살린 부분이고, R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고,

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지이고,

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지이며,

각각의 R₃은 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 알킬이거나 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고,

L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 이루어진 군에서 선택된다.

일 구체예는 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 범주에 속하는 임의의 하위 화학식 또는 특정 화합물을 포함하는 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 유도체화하는 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 화학식 XXXI의 시약을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 화학식 XXXI의 시약과 접촉 전 또는 후에 정제된다. 다른 구체예는 화학식 XXXIII에 상응하는 아미노산을 함유하는 하나 이상의 옥심을 포함하는 최종 유도체화된 폴리펩티드이다. 다른 구체예는 화학식 XXXI의 시약을 이용하여 화학식 I-X, XXXIII-XXXV 및 XXXVII의 아미노산을 유도체화하여 생성된 하나 이상의 디카르보닐 또는 아릴 디아민 함유 아미노산을 포함하는 최종 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건 하에서 약 1개월 이상 동안 수용액 중에서 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건하에서 약 2주 이상 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 온화한 산성 조건 하에서 약 5일 이상 동안 안정하다. 다른 구체예에서, 이러한 조건은 pH 약 2 내지 약 8이다. 다른 구체예에서, 유도체화된 폴리펩티드의 3차 구조는 보존된다. 다른 구체예에서, 이러한 폴리펩티드의 유도체화는 다른 폴리펩티드에 유도체화된 폴리펩티드를 결찰시키는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 유도체화된 이러한 폴리펩티드는 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포리포단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4. MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학주성 단백질-1, 단핵구 화학주성 단백질-2, 단핵구 화학주성 단백질-3, 단핵구 염증성 단백질-1 알파, 단핵구 염증성 단백질-i 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군으로부터 선택된 치료 단백질과의 상동성을 나타낼 수 있다.

C. 단백질 표지화를 위한 연속 접합

본 명세서에서는 또한, 아릴디아민 또는 디카르보닐 함유 측쇄를 갖는 비천연 아미노산을 포함하는 조성물 및 방법으로서, 여기서 이러한 측쇄 부분의 형성은 번역후에 일어난다. 예를 들어, 도 22에 도시한 바와 같이, 폴리펩티드, 예를 들어 단백질 또는 항체(모든 천연 아미노산 또는 하나 이상의 비천연 아미노산 포함)는 아릴디아민 또는 디카르보닐 기를 함유하는 시약과 반응하여 각각 아릴디아민 또는 디카르보닐 기를 함유하는 하나 이상의 측쇄를 갖는 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 이후, 폴리펩티드 상의 아릴디아민 부분은 디카르보닐 부분을 함유하는 다른 시약과 반응하여 페나진 또는 퀴녹살린 기를 갖는 아미노산 측쇄를 함유하는 폴리펩티드를 형성한다. 다르게, 폴리펩티드 상의 디카르보닐 부분은 아릴디아민 부분을 함유하는 다른 시약과 반응하여 페나진 또는 퀴녹살린 기를 갖는 아미노산 측쇄를 함유하는 폴리펩티드를 형성한다.

D. 작용성 부가의 예; 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체

본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드에 다응한 변형은 본 명세서에 기술한 조성물, 방법, 기법 및 전략을 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유도체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드라이머; 시클로덱스트린, 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학 방사선 여기가능 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분; 화학절단성 기; 광절단성 기; 연장 측쇄; 탄소 결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지된 부분; 생물리성 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터컬레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 제제; 검출가능 표지; 소형 분자; 억제성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획 제제; 비오틴의 유도체; 퀀텀 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 아브자임, 활성화된 착체 활성 인자, 바이러스, 아쥬번트, 아글리칸, 알레르간, 안지오스타틴, 항호르몬, 항산화제, 앱타머, 가이드 RNA, 사포닌, 셔틀 벡터, 거대분자, 미모톱, 수용체, 리버스 미셀, 및 이의 임의 조합을 포함하는, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분 상에 추가의 작용성을 도입하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술한 조성물, 방법, 기법 및 전략의 비제한적인 에로서 나타낸 바와 같이, 하기 설명은 비천연 아미노산 폴리펩티드에 거대분자 중합체를 부가하는데 촛점을 맞추지만, 이에 대해 기술한 조성물, 방법, 기법 및 전략이 상기 열거한 것을 포함하여(이에 제한되지 않음), 다른 작용성을 부가하는데도 적용가능하다.

광범위한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 경우에 따라 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링시켜 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)의 생물학적 특성을 조정하고/하거나 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)에 새로운 생물학적 특성을 제공하게 된다. 이러한 거대분자 중합체는 비천연 아미노산, 또는 임의의 비천연 아미노산의 작용성 치환기, 또는 비천연 아미노산에 부가되는 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된다.

수용성 중합체는 본 명세서에 기술한 폴리펩티드(천연 또는 합성), 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체에 도입딘 비천연 아미노산에 커플링된다. 수용성 중합체는 폴리펩티드에 도입된 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기 또는 비천연 아미노산에 부가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 커플링된다. 일례에서, 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 천연 발생 아미노산 및 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함한다. 생물학적 활성 분자에 대한 친수성 중합체의 공유 부착은 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자를 포함하여 생물학적 활성 분자의 순환 시간 연장, 또는 치료 반감기 증가, 면역원성 조정, 생물학적 활성 조정, 혈청 반감기 증가, 수용성(생리적 환경하에), 생체이용성 증가를 위한 한 접근법을 나타낸다. 이러한 친수성 중합체의 부가적인 중요한 특징은 생체적합성, 독성 결여 및 면역원성 결여를 포함한다. 바람직하게, 최종 생성 조제물의 치료적 용도를 위해서, 중합체는 약학적으로 허용되는 것이다.

이러한 친수성 중합체의 예는 이에 제한되는 것은 아니며, 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시 캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜 및 메톡시 또는 에톡시 캡핑된 이의 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 또한 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로도 알려짐), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알킬 에테르, 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리히드록시알킬 아르킬레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체, 친수성 펩티드 서열; 폴리사카라이드 및 이의 유도체로서, 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란을 포함함; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로스, 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히아루론산 및 이의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르타미드; 칼레산 무수물 공중합체 예컨대 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 이의 공중합체, 이의 터폴리머, 이의 혼합물 및 이의 유도체를 포함한다. 수용성 중합체는 선형, 포크 또는 분지형을 포함한 임의 구조 형태를 가지며, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서 약 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성 중합체 골격이 특히 유용하다. 다작용성 중합체 유도체는 2개의 말단을 가지며, 각 말단이 경우에 따라 상이하거나 동일한 작용기에 결합된 선형 중합체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 또는 그 이상을 포함하여 광범위한 범위이지만, 이에 제한되지 않는다. 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고, 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da. 약 1,000 Da, 약 900 Da, 약 8OO Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 500 Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약 200 Da, 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 4O,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 및 약 1,000 Da을 포함하여, 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 상기 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 실질적으로 수용성 골격에 대해 상기 열거한 것은 제한하고자하는 것이 아니며 단지 예시적인 것이며, 상기 기술한 품질의 모든 중합체 물질을 본 발명에서 기술한 방법 및 조성물에서 사용하기 적당한 것으로 고려한다.

상기 기술한 바와 같이, 친수성 중합체의 일례는 폴리(에틸렌 글리콜)로서, 축약하여 PEG라고 하고, 이는 약학, 또는 인공 이식물 및 생체 적합성, 독성 결핍 및 면역원성 결핍이 중요한 다른 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 본 명세서에서 기술하는 중합체:폴리펩티드 구체예는 다른 친수성 중합체를 이러한 구체예에서 유사하게 이용한다는 것을 이해하면서 친수성 중합체의 예로서 PEG를 든 것이다.

PEG는 시판되거나 또는 공지 방법(문헌 [Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161] 참조)에 따라서 에틸렌 글리콜의 고리 개방 중합법을 통해 제조할 수 있는 수용성 중합체이다. PEG는 대체로 투명하고, 무색, 무향이고 수용해성이며, 열에 안정하고, 다양한 화학제제에 불활성이며, 가수분해되거나 악화되지 않으며, 대체로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합한 것으로 여겨지는데, 다시 말해 PEG는 해를 입히지 않으면서 살아있는 조직 또는 유기체와 함께 공존할 수 있다. 보다 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성으로서, 다시 말해 PEG는 신체 내에서 면역 반응을 일으키지 않는다. 예컨대 생물학적 활성 제제가, 신체 내에 일부 바람직한 기능을 갖는 분자를 공격하는 경우, PEG는 이러한 제제를 마스크하고 임의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있어서 유기체가 상기 제제의 존재를 견딜 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키지 않거나 또는 응고 또는 다른 바람직하지 않은 영향을 주지 않는다.

용어 "PEG"는 PEG 말단에 변형을 가하거나 또는 크기와 무관하게 임의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하여 광범위하게 사용되고, 하기 화학식에 의해 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결되는 것으로 나타낸다:

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

상기 식에서, n은 약 2 내지 약 10,000이고, X는 H이거나 또는 이에 제한되는 것은 아니며 C_{1 -4} 알킬, 보호기 또는 말단 작용기를 포함하여, 말단 변형이다. 용어 PEG는 이에 제한되는 것은 아니고, 이작용성 PEG, 다중암 PEG, 유도체화된 PEG, 포크 PEG, 분지형 PEG(각각의 쇄는 분자량이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa, 약 1 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 약 20 kDa임), 펜던트 PEG(즉, 중합체 골격에 펜던트된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체) 또는 이에 분해가능한 연결을 갖는 PEG를 포함하여, 이의 임의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 일 구체예에서, n이 약 20 내지 약 2000인 PEG가 본 명세서에 기술한 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합하다. 일 구체예에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)부분을 포함한다. PEG 중합체의 분자량은 광범위한데, 이에 제한되는 것은 아니고, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함한다. 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고, 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,0OO Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 4O,OOO Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,O0O Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,OOO Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 약 1,000 Da, 약 900 Da, 약 800 Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 5OO Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약, 200 Da 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1OO Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 분자는 분지형 중합체이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da으로서, 이에 제한되는 것은 아니며, 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 9O,00O Da, 약 85,000 Da, 약 8O,OOO Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 3O,00O Da, 약 25,000 Da, 약 20,OOO Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da 및 약 1,000 Da을 포함한다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da 이다. 광범위한 PEG 분자가 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어[Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog]에 기술되어 있으며, 이를 참조하여 포함시킨다.

문헌에 기재된 말단 작용기의 구체적인 예로는 N-숙신이미딜 카르보네이트(예를 들면, 미국 특허 제5,281,698호 및 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들면, 문헌[Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)] 참조), 히드라지드(예를 들면, 문헌[Andresz et al. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들면, 문헌[Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D. C., 1997]; 및, 미국 특허 제5,672,662호 참조), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들면, 문헌[Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) and Joppich et al. Macromol. Chem. 180: 1381 (1979)] 참조), 숙신이미딜 에스테르(예를 들면, 미국 특허 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예를 들면, 미국 특허 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들면, 문헌[Pitha et al. Eur. J Biochem. 94: 11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991)] 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들면, 문헌[Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들면, 문헌[Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)] 참조), 알데히드(예를 들면, 문헌[Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984)], 미국 특허 제5,824,784호 및 미국 특허 제5,252,714호 참조), 말레이미드(예를 들면, 문헌[Goodson et al. Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984), and Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)] 참조), 오르토피리딜-디설피드(예를 들면, 문헌[Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)] 참조), 아크릴올(예를 들면, 문헌[Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)] 참조), 비닐설폰(예를 들면, 미국 특허 제5,900,461호 참조)을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 모든 참고문헌 및 특허는 본 발명에 참고로 도입된다.

일부 경우, PEG는 히드록시 또는 메톡시 즉, X는 H 또는 CH₃를 갖는 한쪽 말단 상에서 종결된다("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 경우에 따라 반응성 기로 종결되어 이작용 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기는 20종의 공통된 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는데 통상적으로 사용되는 반응성 기(말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이로 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 뿐만 아니라, 20종의 공통된 아미노산에 대해 불활성을 나타내지만 비천연 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(옥심, 카르보닐 또는 디카르보닐 및 히드록실아민 기를 포함하나 이로 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다.

상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 말단이 비천연 아미노산을 통해 (합성 또는 천연) 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다는 것을 주목한다. Y가 디카르보닐 기인 경우, 이 디카르보닐 함유 PEg 시약은 폴리펩티드 내 아릴디아민 함유 비천연 아미노산과 반응하여 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 통해 폴리펩티드에 연결된 PEG 기를 형성할 수 있다. Y가 아릴디아민 기인 경우에는, 디카르보닐 함유 PEG 시약이 폴리펩티드 내 아릴디아민 함유 비천연 아미노산과 반응하여 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 통해 폴리펩티드에 연결된 PEG 기를 형성할 수 있다. 적절한 반응 조건, 종저 벵밥 및 시약의 예는 본 명세서 및 첨부된 도면 전반에 걸쳐 기술되어 있다. 예를 들어, 도 29는 디카르보닐 또는 아릴 디아민 기를 함유하는 다양한 PEG 유도체의 일례를 제공한다.

중합체의 각 말단에 상이한 분자가 부착하는 것이 바람직한 경우에 이종이작용성 유도체가 또한 특히 유용하다. 예를 들어, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예컨대 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자가 PEG의 한쪽 말단에 부착하고 PEG의 다른 말든에는 아세틸렌 기를 갖는 분자가 부착가능하게 한다.

따라서, 일 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에, 비천연 아미노산의 측쇄를 통해 연결된다. 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 적절한 반응성 PEG 유도체를 갖는 아미노산의 연속 변형 및 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질에, 20개의 천연 도입된 아미노산에서 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산들을 포함하여(이에 제한되지 않음) 비천연 아미노산의 선택적 도입을 포함하는, PEG 유도체를 이용한 단백질의 선택적 변형을 위해 매우 효율적인 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술한 다양한 화학 방법이 단백질에 수용성 중합체를 도입하기 위해 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 방법 및 조성물을 이용하여 사용하는데 적합하다.

중합체 골격은 경우에 따라 선형이거나 분지형이다. 분지형 중합체 골격은 대체로 공지되어 있다. 대체로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 중심 분지 코어에 연결된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. PEG는 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리쓰리톨 및 솔비톨 등에 에틸렌 산화물을 부가하여 제조할 수 있는 분지형으로 사용된다. 중심 분지 부분은 또한 몇몇 아미노산, 예컨대 리신으로부터 유도체화시킬 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반형 R(-PEG-OH)_m으로서 나타낼 수 있으며, 여기서 R은 코어 부분, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리쓰리톨 등에서 유도되고, m은 암의 수를 나타낸다. 다중암 PEG 분자는 예컨대 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호, 제5,229,490호 및 제4,289,872호; 미국 공개 특허출원 제2003/0143596호; 국제특허공보 제WO 96/21469호; 및 제WO 93/21259호에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있으며, 상기 문헌은 참조하여 보함시킨다.

분지형 PEG는 경우에 따라 PEG(-YCHZ₂)_n(이때, Y는 링커 기이고, Z는 정해진 길이의 원자 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단 기임)로 표시되는 포크 PEG의 형태이다. 하지만, 다른 분지형, 펜던트 PEG도 반응성 기, 예컨대 카르복실을 PEG 쇄의 말단보다는 PEG 골격을 따라 갖는다.

또한, 이러한 PEG 형태에 더하여, 상기 중합체는 경우에 따라 골격내에 분개가능 또는 약한 연결을 갖게 제조된다. 예를 들어, PEG는 가수분해되는 중합체 골격 내에 에스테르 연결을 갖도록 제조된다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수분해는 중합체가 저분자량 단편으로 절단되게 한다:

-PEG-CO₂-PEG- + H₂O → PEG-CO₂H + HO-PEG-

용어 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG는 본 명세서에 기술한 것을 포함하여(이에 제한되는 것은 아님), 모든 형태를 포함하거나, 이를 나타낸다. 상기 중합체의 분자량은 광범위한데 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,00O Da, 약 85,000 Da, 약 8O,OOO Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 약 1,000 Da, 약 900 Da, 약 800 Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 300 Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약 200 Da, 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 50,000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

PEG의 바람직한 특성을 최대화하기 위해서, 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 분자 또는 분자들의 총 분자량 및 수화 상태는 모 분자의 생활성에 역작용을 주지 않으면서, PEG 중합체 부착과 관련된 이로운 특성, 예컨대 수용해성 및 순환 반감기 증가 등에 영향을 줄 정도로 충분히 높아야 한다.

본 명세서에 기술한 방법 및 조성물은 중합체:단백질 접합체의 실질적으로 동종성 조제물을 제조하는데 사용된다. "실질적으로 동종성"은 중합체:단백질 접합체 분자가 전체 단백질의 절반보다 많이 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 물학적 활성을 가지며 "실질적으로 동종성"으로 존재한다. 본 명세서에서 제공하는 PEG화된 폴리펩티드 조제물은 예를 들어, 로트 대 로트(lot to lot) 약동력학의 예측성에서의 임상 용도로의 용이성 등, 동종성 조제물의 장점을 나타내기에 충분하게 동종성이다.

중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 경우에 따라 제조하며, 본 명세서에서 제공하는 장점은 혼합물에 포함되는 단-중합체;단백질 접합체의 비율이 선별적이라는 것이다. 따라서, 바람직하다면, 다양한 수의 중합체 부분이 부착된 다양한 단백질 혼합물(즉, 이-, 삼-, 사- 등)을 제조하고 이러한 접합체를 본 명세서에 기술한 방법을 이용하여 제조한 단-중합체;단백질 접합체와 배합하여서, 사전에 정해진 비율의 단-중합체:단백질 접합체와의 혼합물을 갖는다.

폴리에틸렌 글리콜 분자 대 단백질 분자의 비율은, 반응 혼합물 중 이들 농도에 따라 다양하다. 대체로, 최적 비율(최소한의 잉여 미반응 단백질 또는 중합체가 존재하는 반응 효율 관점에서)은 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기의 수에 따라 결정한다. 분자량과 관련하여, 대체로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착한 중합체 분자는 적어진다. 유사하게, 중합체의 분지는 이러한 매개변수를 최적화할 때 고려되어야 한다. 대체로, 분자량이 높을수록(또는 분지가 많을수록), 중합체:단백질 비율은 높아진다.

본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 친수성 중합체:폴리펩티드/단백질 접합체를 고려하는 경우, 용어 "치료 유효량"은 환자에게 바람직한 혜택을 증가시키는 양을 더욱 의미한다. 이러한 양은 개체에 따라 다양하고 환자의 전체적인 신체 상태 및 치료할 질환, 질병 또는 병태의 중추 원인 등을 포함하는 인자의 수에 따라 좌우된다.

본 명세서에 기술한 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화된 정도)는 경우에 따라 변경된(이에 제한되는 것은 아니고 증가 또는 감소) 약리학, 약력학 또는 약동력학적 특징 예컨대 생체 내 반감기를 제공하도록 조정한다. 일 구체예에서, 폴리펩티드의 반감기는 비변형 폴리펩티드에 비하여 적어도 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90%, 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 50배 또는 적어도 약 100배 이상이다.

일 구체예에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 연결된 말단 히드록실아민 부분을 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.

일 구체예에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 약 2 내지 약 10이며 n은 약 100 내지 약 1,000이다(즉, 평균 분자량은 약 5 내지 약 40 kDa임). 중합체의 분자량은 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,900 Da, 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,00O Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da. 약 8,OOO Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 약 1,OOO Da, 약 900 Da, 약 800 Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 500 Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약 200 Da 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,0OO Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

다른 구체예에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 아미드 연결을 통해서 PEG 골격에 연결된 말단 히드록실아민 부분을 함유하는 PEG 유도체로 변형된다.

일 구체예에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 약 2 내지 약 10이고, n은 약 100 내지 약 1,000이다(즉, 평균 분자량은 약 5 내지 약 40 kDa임). 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고 100,OOO Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,00O Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da. 약 65,000 Da, 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 약 5,0OO Da, 약 900 Da, 약 800 Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 500 Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약 200 Da 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,0000 Da 내지 약 30,000이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5.000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

다른 구체예에서, 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지형 PEG의 각 쇄의 MW 범위가 약 10 내지 약 40 kDa이고, 다른 구체예에서는 약 5 내지 약 20 kDa인, 말단 히드록실아민 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체로 변형시킨다. 분지형 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니며 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하여 광범위한 범위이다. 분지쇄 PEG의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Da, 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da. 약 60,000 Da, 약 55,000 Da, 약 50,0OO Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da 및 약 1,000 Da을 포함하여, 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5, 0000 Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다.

다른 구체예에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 분지 구조를 갖는 하나 이상의 PEG 유도체로 변형된다. 일 구체예에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 다음의 구조를 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식에서, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 경우에 따라 NH, O, S, C(O)이거나 또는 존재하지 않으며, m은 약 2 내지 약 10이고 n은 약 100 내지 약 1,000이다. 중합체의 분자량은 이에 제한되는 것은 아니고, 약 100,000 Da, 약 95,000 Da, 약 90,000 Oa. 약 85,000 Da, 약 80,000 Da, 약 75,000 Da, 약 70,000 Da, 약 65,000 Da, 약 60,000 Da. 약 55,000 Da, 약 50,000 Da, 약 45,000 Da, 약 40,000 Da, 약 35,000 Da, 약 30,000 Da, 약 25,000 Da, 약 20,000 Da, 약 15,000 Da, 약 10,000 Da, 약 9,000 Da, 약 8,000 Da, 약 7,000 Da, 약 6,000 Da, 약 5,000 Da, 약 4,000 Da, 약 3,000 Da, 약 2,000 Da, 약 1,000 Da, 약 900 Da, 약 800 Da, 약 700 Da, 약 600 Da, 약 500 Da, 약 400 Da, 약 300 Da, 약 200 Da, 및 약 100 Da을 포함하여, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,OOOO Da 내지 약 30,000 Da이다. 다른 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 30,000이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,0OO Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 5,00O Da 내지 약 40,000 Da이다. 일 구체예에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

PEG의 작용성 및 접합에 대한 몇몇 리뷰 및 논문 등을 입수할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Harris, Macromol. Macromol. Chem. Phvs. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymiology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microh. Technol 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6; 150-165 (1995)]를 참조한다.

또한, 중합체의 활성화 방법도 WO 94/17039, 미국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제5,281,698호 및 WO 03/15189에서 확인할 수 있고, 활성 중합체와, 이에 제한되는 것은 아니며 응고 인자 VlII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 수퍼옥시드 디스뮤타제(Veronese at al., App. Biochem. Biotech. Vl: 141-152 (1985))을 포함하는 효소간의 접합에 대해서도 참고한다. 이들 모든 문헌은 참조하여 포함시킨다.

필요하다면, 소수성 크로마토그래피를 통해 얻은 본 명세서에 기술한 PEG화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이에 제한되는 것은 아니며, 친화성 크로마토그래피; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(이에 제한되는 것은 아니고, DEAE SEPHAROSE 포함); 실리카 상 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(이에 제한되는 것은 아니고, SEPHADEX G-75); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이팅 크로마토그래피; 한외여과/정용여과, 에탄올 침전; 암모늄 설페이트 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기 영동법(이에 제한디는 것은 아니고, 분취 아이소일렉트릭 포커싱 포함), 차등 가용성(이에 제한되는 것은 아니고 암모늄 설페이트 침전 포함) 또는 추출을 포함하는 하나 이상의 과정을 통해 더욱 정제한다. 겉보기 분자량은 경우에 따라 일반적인 단백질 표준물과 바교하여 GPC를 통해 측정한다((Pteneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH(Harris&Angal, Eds) IRI. Press 1989, 293-306). 비천연 아미노산 폴리펩티드:PEG 접합체의 순도는 경우에 따라 단백질 분해(이에 제한되는 것은 아니고, 트립신 절단 포함) 후 질량 분광분석법을 통해 분석하였다: Pepinsky RB., et. al, J Pharmacol, & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001).

본 명세서에 기술한 폴리펩티드의 비천연 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 경우에 따라 제한없이 유도체화되거나 치환된다.

E. 혈청 알부민에 대한 친화성 증강

또한, 다양한 분자를 본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 중에서의 반감기를 조절할 수 있다. 일부 구체예에서, 분자를 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결시키거나 융합시켜 동물 내에서의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 증강시킨다.

예를 들면, 일부 경우, 폴리펩티드와 알부민 결합 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열은 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예를 들면, 문헌[Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277: 534-542 (1996) and Sjolander et al., J. Immunol. Methods 201: 115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합 펩티드, 예를 들면 문헌[Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 (2002)]에 기재된 펩티드들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 일부 경우, 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진시킨다. 예를 들면, 문헌[Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312; 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나 이로 한정되지 않음)에 직접 융합된다. 매우 다양한 다른 분자들도 경우에 따라 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결되어 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다.

F. 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 사카라이드 잔기를 보유하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 사카라이드 잔기는 천연 사카라이드 잔기(N-아세틸글루코사민을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 비천연 사카라이드 잔기(3-플루오로갈락토즈를 포함하나 이로 한정되지 않음)일 수 있다. 사카라이드는 N-연결 또는 O-연결 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토즈-L-세린을 포함하나 이로 한정되지 않음) 또는 비천연 연결(옥심 또는 상응하는 C-연결 또는 S-연결 글리코시드를 포함하나 이들로 한정되지 않음)에 의해 비천연 아미노산에 연결될 수 있다.

사카라이드(글리코실을 포함하나 이로 한정되지 않음) 부분은 경우에 따라 생체내 또는 시험관 내에서 비천연 아미노산 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 일부 구체예에서, 디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 아릴디아민 기로 유도체화된 사카라이드로 변형되어서 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 통해 연결된 상응하는 글리코시로하된 폴리펩티드를 생성한다. 비천연 아미노산에 부착되면, 사카라이드는 경우에 따라 글리코실트랜스퍼라제 및 다른 효소로 처리하여 더욱 변형되어 비천연 아미노산에 결합된 올리고사카라이드를 생성한다. 문헌 [H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조한다.

G. 폴리펩티드 이량체 및 다량체를 포함하는 연결기의 용도 및 응용

비천연 아미노산 폴리펩티드에 작용기를 직접 부가하는 것 외에, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부위는 다작용성(예컨대, 2-, 3-, 4-) 링커 분자에 의해 먼저 변형된 후, 상기 링커 분자가 더 변형될 수 있다. 즉, 다작용성 링커 분자의 하나 이상의 말단은 폴리펩티드 내의 하나 이상의 비천연 아미노산과 반응하고, 다작용성 링커의 다른 하나 이상의 말단은 추가 작용기화를 위해 사용될 수 있다. 다작용성 링커의 모든 말단이 동일하면, (화학양론적 조건에 따라) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종다량체가 형성될 수 있다. 다작용성 링커의 말단이 상이한 화학적 반응성을 가지면, 다작용성 링커 기의 하나 이상의 말단이 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합될 것이고, 그 후 다른 말단은 예를 들어, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속-함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징 부분; 화학선 방사 여기 부분; 리간드; 광이성질화 부분; 비오틴; 비오틴 유사체; 중원자 도입 부분; 화학적 절단성 기; 광절단성 기; 연장된 측쇄; 탄소-결합 당; 리독스 활성제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물리적 프로브; 인광성 기인광성 기광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소형 분자; 저해성 리보핵산; 래디오뉴클레오티드; 중성자-포획제; 비오틴의 유도체; 양자 도트(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 애브자임; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르간; 안지오스타틴; 항호르몬; 항산화제; 앱타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 백터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 리버스 미셀; 및 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 상이한 작용기와 반응할 수 있다.

도 23은 다단계 합성으로 비천연 아미노산 폴리펩티드에 하나 이상의 PEG 기를 부착하기 위한 이작용성 링커의 사용에 대한 비제한적인 예를 개략적으로 예시한 도면이다. 제1 단계에서, 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 디카르보닐 함유 이작용성 링커와 반응시켜서 변형된 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성시킨다. 하지만, 이작용성 링커는 여전히 변형된 페나진 또는 퀴녹살린 함유 작용기화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위해 적절한 반응성을 갖는 시약과 반응할 수 있는 작용기를 보유한다. 일례에서, 작용성은 PEG 기이지만 경우에 따라서 임의의 상기 언급한 작용성을 포함하거나, 아니면 삼 또는 사작용성 링커의 경우 동일한 작용성의 당수 유형 또는 하나 이상의 작용성 유형을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 기술한 링커 기는 부위 선택적인 방식으로 비천연 아미노산 폴리펩티드를 더욱 변형시킬 수 있는 추가 수단을 제공한다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 폴리펩티드의 조합물 예컨대, 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등) 또한 제공한다. 예를 들어, 하기 설명은 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원들에 초점을 맞추고 있으나, 본 단락에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 하기 폴리펩티드를 포함하는, 이량체 및 다량체 형태로 이점을 제공할 수 있는 사실상 임의의 다른 폴리펩티드에 적용될 수 있다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.

따라서, 본 명세서에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 또 다른 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체, 또는 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 그의 변이체인 임의의 다른 폴리펩티드의 폴리펩티드 골격에 직접 결합되거나 링커를 통해 상기 폴리펩티드에 결합된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드도 포함한다. GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 증가된 그의 분자량으로 인해, 단량체 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 비해 상이한 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 성질, 조절된 치료적 반감기 또는 조절된 혈장 반감기를 포함하나 이들로 한정되지 않는 새로운 또는 바람직한 성질을 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체의 이량체화를 조절할 것이다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체 길항제, 작용제 또는 조절제로서 작용할 것이다.

일부 구체예에서, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 Asn-Lys 아미드 연결 또는 Cys-Cys 디설피드 연결을 포함하나 이들로 한정되지 않는 연결을 통해 직접 연결된다. 일부 구체예에서, 아릴 디아민 함유 비천연 아미노산을 포함하는 제2 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드에 접합된 디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 제1 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는 연결된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 이량체화를 촉진하기 위한 상이한 비천연 아미노산을 포함할 것이고, 상기 폴리펩티드들은 상응하는 페나진 또는 퀴녹살린의 형성을 통해 반응하게 된다.

별법으로, 2개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 링커를 통해 연결된다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커는 동일하거나 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 연결시키는 데 사용될 수 있다. 일부 경우, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 연결시키는 데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에서 기술한 방법 및 조성물은 a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상에 아니드, 알킨, 히드라지드, 히드록실아민 또는 카르보닐 또는 디카르보닐 함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상에 적어도 제2 작용기를 포함하는 아령 구조를 갖는 수용성 이작용성 링커를 제공한다. 상기 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이하다. 제2 작용기는, 일 구체예에서, 제1 작용기와 반응성이 아니다. 본 명세서에서 기술하는 방법 및 조성물은 일 구체예에서, 하나 이상의 분지형 분자 구조의 암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에서 기술한 방법 및 조성물은 하기 구조를 갖는 수용성 활성화된 중합체와 반응을 통해 형성된 하나 이상의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원을 포함하는 다량체를 제공한다:

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

상기 식에서, n은 약 5 내지 약 3,000이고, m은 약 2 내지 약 10이며, x는 아지드, 알킨, 히드라지드, 아미노옥시 기, 히드록실아민, 아세틸 또는 카르보닐- 또는 디카르보닐-함유 부분일 수 있고, R은 캡핑기, 작용기 또는 X와 동일하거나 상이할 수 있는 이탈기이다. R은 예를 들어 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트 및 트레실레이트, 칼렌 및 케톤으로 이루어진 군에서 선택된 작용기일 수 있다.

H. 부가 작용기화의 예; 폴리펩티드의 단리 특성의 용이함

천연 발생 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 이에 제한 되는 것은 아니며, 폴리펩티드의 가용성 또는 결합 특징을 포함하는 다수의 이유로 인해 샘플에서 단리하는 것이 용이하지 않을 수 있다. 예를 들어, 치료 용도의 폴리펩티드의 제조시에, 이러한 폴리펩티드는 경우에 따라서 이 폴리펩티드를 과생산하도록 조작된 재조합 시스템에서 단리하게 된다. 하지만, 폴리펩티드의 가용성 또는 결합 특징때문에, 목적하는 순도 수준을 얻는 것이 어려운 것으로 확인되었다. 본 명세서에 기술한 방법, 조성물, 기법 및 전략은 이러한 상황에 대한 해결법을 제공한다.

본 명세서의 방법, 조성물, 기법 및 전략을 이용하여, 목적하는 폴리펩티드에 상동성이 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하며, 여기서 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 개선된 단린 특징을 갖는다. 일 구체예에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생체합성적으로 제조된다. 추가 또는 다른 구체예에서, 비천연 아미노산은 이의 구조을 본 명세서에 기술한 비천연 아미노산 중 하나에 도입시켰다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고 부위 특이적으로 더욱 도입된다.

일 구체예에서, 생합성적으로 생성된 최종 비천연 아미노산은 이미 개선된 단리 특징을 갖는다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 개선된 단리 특성을 제공하는 기에 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 더욱 변형되어서 변형된 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하고, 여기서 변형은 개선된 단리 특징을 제공하는 기에 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 제공한다. 일 구체예에서, 이러한 기는 직접 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 구체예에서, 이러한 기는 링커 기를 통해 비천연 아미노산에 연결된다. 일 구체예에서, 이러한 기는 단일 화학 반응을 통해서 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 구체예에서는, 일련의 화학 반응이 이러한 기를 비천연 아미노산에 연결하기 위해 요구된다. 일 구체예에서, 개선된 단리 특징을 부여하는 기는 비천연 아미노산 폴리펩티드 중 비천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 사용된 반응 조건하에서 천연 발생 아미노산에 연결되지 않는다.

추가 구체예에서, 최종 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 상동성이지만, 본 섹션에서 기술한 방법, 기법 및 조성물은 실제로 이에 제한되는 것은 아니고, 하기 폴리펩티드를 포함하여, 개선된 단리 특징으로 혜택을 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드에도 적용된다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.

추가 구체예에서, 개선된 단리 특징을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용해성을 개선시키고, 다른 구체예에서, 상기 기는 폴리펩티드의 결합 특성을 개선시키며, 다른 구체예에서, 상기 기는 폴리펩티드에 신규한 결합 특성을 제공한다(이에 제한되는 것은 아니고, 비오틴 기 또는 비오틴 결합 기 포함). 기가 폴리펩티드의 수용해성을 개선시키는 구체예에서, 상기 기는 이에 제한되는 것은 아니고, 본 발명에서 기술한 임의의 PEG 중합체 기를 포함하여, 본 발명에서 기술한 수용성 중합체로부터 선택된다.

I. 부가 작용기화의 예: 폴리펩티드 존재의 검출

천연 발생 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 폴리펩티드에 용이하게 결합할 수 있는 시약 또는 표지의 결합 등을 포함하여, 다수의 이유로 인해 샘플(생체 내 샘플 및 시험관 내 샘플 포함) 중에서 검출하는 것이 어려울 수 있다. 본 발명에서 기술한 바법, 조성물, 기법 및 전략은 이러한 상황에 대한 해법을 제공한다.

본 명세서에 기술한 방법, 조성물, 기법 및 전략을 이용하여, 목적하는 폴리펩티드에 상동성인 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하며, 여기서 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생체 내 샘플 및 시험관 내 샘플 중에서 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다. 일 구체예에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 생성한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 이의 구조을 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산 중 하나에 도입한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고 부위 특이적으로 더욱 도입된다.

일 구체예에서, 생합성적으로 생성된 최종 비천연 아미노산 폴리펩티드는 이미 바람직한 검출 특징을 갖는다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 디카르보닐 함유 비천연 아미노산, 아릴 디아민 함유 비천연 아미노산, 및 페나진 또는 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산은 생합성적으로 본 발명에서 기술한 바와 같이 폴리펩티드에 도입되었다. 다른 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII의 아미노산에서 선택된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 디카르보닐 또는 아릴디아민 기에 옥심 연결을 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 더욱 변형되어 변형된 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하고, 여기서 이러한 변형은 개선된 검출 특징을 제공하는 페나진 또는 퀴녹살린 기에 옥심 연결을 제공한다. 일 구체예에서, 이러한 기는 비천연 아미노산에 직접 연결되고, 다른 구체예에서, 이러한 기는 링커 기를 통해 비천연 아미노산에 연결된다. 일 구체예에서, 이러한 기는 단일 화학 반응을 통해 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 구체예에서는, 비천연 아미노산에 이러한 기를 연결하기 위해 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게, 개선된 검출 특징을 부여하는 기는 비천연 아미노산 폴리펩티드 중 비천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 사용된 반응 조건 하에서 천연 발생 아미노산에는 연결되지 않는다.

일 구체예에서, 예를 들어, 상기 기술한 폴리펩티드는 하기 화학식을 갖는 하나 이상의 퀴녹살린 유도체를 함유한다:

[화학식 XXXVI]

일 구체예에서, 하나 이상의 화학식 XXXVI의 화합물을 함유하는 폴리펩티드는 특정 질환의 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 이러한 폴리펩티드는 일 구체예에서, 경우에 따라 상이한 생물학적 매질 내 바이오마커의 존재를 검출하는데 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 화학식 XXXVI의 화합물을 함유하는 폴리펩티드는 암에 대한 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 암은 적절한 포획 매트릭스를 이용하여 바이오마커를 포획하고 적절한 완충액에서 화학식 XXXVI의 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 부가하여 혈액 샘플에서 검출할 수 있다. 세정 이후, 최종 복합체는 형광법을 이용해 분석한다. 양성 결과는 바이오마커가 존재함을 의미한다. 다른 예로서, 암은 소변 샘플에서 검출한다.

다른 구체예에서, 하나 이상의 화학식 XXXVI의 화합물을 함유하는 폴리펩티드를 이용하여 생체 내 분석물을 분석한다. 예를 들어, 하나 이상의 화학식 XXXVI의 화합물을 함유하는 폴리펩티드를 동물에게 투여하고 영상화 방법을 이용하여 하나 이상의 화학식 XXXVI의 화합물을 함유하는 폴리펩티드의 존재, 부재 또는 위치를 검출한다.

일 구체예에서, 상기 기술한 폴리펩티드는 하기 화학식 XXXVII를 갖는 하나 이상의 아릴디아민 유도체를 함유한다:

[화학식 XXXVII]

일 구체예에서, 하나 이항의 화학식 XXXVII의 화합물을 함유하는 폴리펩티드는 특정 질병의 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 일 구체예에서, 이 폴리펩티드는 경우에 하기 화학식 XXXVIII의 디카르보닐 히약을 첨가한 후 상이한 생물학적 매질 중의 바이오마커의 존재를 검출하는데 사용된다:

[화학식 XXXVIII]

예를 들어, 하나 이상의 화학식 XXXVII의 화합물을 함유하는 폴리펩티드는 암에 대한 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 암은 적절한 포획 매트릭스를 이용하여 바이오마커를 포획하고 적절한 완충액 중에서 화학식 XXXVII의 화합물을 함유하는 폴리펩티드를 첨가하여 혈액 샘플에서 검출한다. 세정 후에, 화학식 XXXVIII의 최종 시약을 첨가하고 형성된 복합체를 형광법을 사용하여 분석한다. 양성 결과는 바이오마커의 존재를 의미한다. 다른 예로서, 암은 소변 샘플에서 검출한다.

추가 구체예에서, 최종 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 상동성이지만, 본 섹션에서 기술한 방법, 기법 및 조성물은 실제로, 하기 예시적인 단백질을 포함하여, 생체 내 샘플 및 시험관 내 샘플에서 검출이 필요한 임의의 다른 폴리펩티드에도 적용된다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.

추가 구체예에서, 개선된 검출 특징을 부여하는 기는 표지ㅣ 염료, 친화성 표지; 광친화성 표지; 스핀 표지; 형광단; 방사성 부분; 중원자를 도입한 부분; 방사성 표지된 부분; 생물리 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 발색단; 에너지 전달제; 검출가능 표지; 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.

J. 부가 작용기화의 예; 폴리펩티드의 치료 특성 개선

천연 발생 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 특정 질환, 질병 또는 병태를 갖는 환자에 일정한 치료 혜택을 제공할 수 있다. 이러한 치료적 혜택은 이에 제한되는 것은 아니고, 폴리펩티드의 안정성 프로파일 및 폴리펩티드의 약력학, 약리학 및/또는 약동력학(예를 들어, 수용해성, 생체이용성, 혈청 반감기, 치료 반감기, 면역원성, 생물학적 활성 또는 순환 시간 등)을 포함하여, 다수의 인자에 따라 좌우된다. 또한, 예를 들어, 예컨대 부착된 세포독성 화합물 등 폴리펩티드에 부가 작용헝을 제공하는 것이 이롭거나, 또는 예를 들어, 본 명세서에 기술한 동종다량체 및 이종다량체를 형성하도록 추가 폴리펩티드를 부착하는 것이 바람직하다. 이러한 변형은 바람직하게 원래 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는다. 본 명세서에 기술한 방법, 조성물, 기법 및 전략은 이러한 쟁점들에 해법을 제공한다.

본 명세서에 기술한 방법, 조성물, 기법 및 전략은 목적하는 폴리펩티드에 상동성인 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 가능하게 하며, 여기서 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 개선된 치료적 특징을 갖는다. 일 구체예에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성적으로 제조된다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 이의 구조를 본 발명에서 기술한 비천연 아미노산 중 하나에 도입시킨다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고 추가로 부위 특이적으로 도입된다.

일 구체예에서, 생합성적으로 제조된 최종 비천연 아미노산은 이미 바람직한 개선된 치료적 특징을 갖는다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 개선된 치료적 특징을 제공하는 기에 옥심, 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 포함한다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산은 더욱 변형되어 변형된 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하고, 여기서 변형은 개선된 치료적 특징을 제공하는 기에 옥심, 페나진 또는 퀴녹살린 연결을 제공한다. 일 구체예에서, 이러한 기는 직접 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 구체예에서, 이러한 기는 링커 기를 통해 비천연 아미노산에 연결된다. 일 구체예에서, 이러한 기는 단일 화학 반응을 통해 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 구체예에서는, 비천연 아미노산에 이러한 기를 연결하기 위해 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게, 개선된 치료적 특징을 부여하는 기는 비천연 아미노산 폴리펩티드 중 비천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 사용된 반응 조건 하에서 천연 발생 아미노산에 연결되지 않는다.

추가 구체예에서, 최종 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 상동성이지만, 본 섹션에서 기술한 방법, 기법 및 조성물은 실제로, 하기 에시적인 폴리펩티드를 포함하여, 개선된 치료적 특징의 혜택을 받을 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드에도 적용된다: 알파-1 항트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨이뇨 인자, 심방 나트륨이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인제 단백질-1, 단핵구 화학유인제 단백질-2, 단핵구 화학유인제 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드, 에리쓰로포이에틴(EPO), 엑스폴리에이팅 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4-나선 다발 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, 각질세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 저해 인자, 루시퍼라제, 뉴르투린, 호중구 저해 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골생성 단백질, 종양유전자 생성물, 파라시토닌, 갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 렐랙신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 수퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화제, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.

추가 구체예에서, 개선된 치료적 특징을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용해성을 개선시키고, 다른 구체예에서, 상기 기는 폴리펩티드의 결합 특성을 개선시키며, 다른 구체예에서, 상기 기는 폴리펩티드에 신규한 결합 특성을 제공한ㄷ(예를 들어, 비오틴 기 또는 비오틴 결합 기 포함). 상기 기가 폴리펩티드의 수용해성을 개선시키는 구체예에서, 상기 기는 이에 제한되는 것은 아니고, PEG 중합체 기를 포함하여, 본 발명에서 기술한 수용성 중합체로부터 선택된다. 추가 구체예에서, 상기 기는 세포독성 화합물인 반면, 다른 구체예에서, 상기 기는 약물이다. 추가 구체예에서, 연결된 약물 또는 세포독성 화합물은 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 절단되어 약물 또는 세포독성 화합물을 목적하는 치료 위치에 전달시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 기는 이에 제한되는 것은 아니고, 제1 비천연 아미노산 폴리펩티드와 동일한 아미노산 구조를 갖는 폴리펩티드를 더욱 포함하여, 이에 제한되는 것은 아니며 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하여, 제2 폴리펩티드이다.

추가 구체예에서, 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 각각 변형된 디카르보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 아릴디아민 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 페나진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 퀴녹살린 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 옥심 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 생체 이용성이 증가한다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 안정성 프로파일이 증가한다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 수용해성이 증가된다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 치료적 반감기가 증가된다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 혈청 반감기가 증가한다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 순환 시간이 연장된다. 추가 구체예에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 활성이 조정된다. 추가 구체예에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 발생 아미노산 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드의 면역원성이 조정된다.

XI. 변형 폴리펩티드의 치료적 용도

편의를 위해, 본 섹션에서 기술하는 "변형 또는 비변형" 비천연 폴리펩티드는 총칭적으로 및/또는 특정예를 들어 기술하였다. 하지만, 본 섹션에서 기술하는 "변형 또는 비변형" 비천연 폴리펩티드는 이 섹션에서 제공하는 특정예 및 일반 설명에 한정되는 것이 아니며, 본 섹션에서 기술하는 "변형 또는 비변형" 비천연 폴리펩티드는 본 명세서, 청구항 및 도면에 기술한 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 임의의 하위 화학식 또는 특정 화합물을 포함하여, 화학식 I-XI 및 XXXIII-XXXVII 및 화합물 1-6의 범주에 속하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 모든 "변형 또는 비변형" 비천연 폴리펩티드에 동등하게 적용된다.

본 명세서에 기술하는 "변형 및 비변형' 비천연 아미노산 폴리펩티드는 이의 동종다량체 및 이종다량체를 포함하여, 이에 제한되는 것은 아니고, 치료, 진단, 분석기반, 산업, 미용, 식물 생물학, 환경, 에너지 생산, 및/또는 군대 용도를 비롯한 다양한 용도로 사용된다. 비제한적이고 예시적인 예로서, 하기에 "변형 또는 비변형' 비천연 아미노산 폴리펩티드의 치료적 용도를 제공한다.

본 명세서에서 기술하는 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드는 광범위한 질병, 질환 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 본 명세서에서 기술하는 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드 생성물은 인간에서 시판 폴리펩티드 조제물에서 정의하는 임의 활성을 생성한다. "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드생성물의 평균 양은 다양할 수 있고 구체적으로는 전문의의 추천 및 처방을 기초로 해야 한다. "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료할 병태의 정확한 유형, 치료할 환자의 상태를 비롯하여 조성물 중 다른 성분 등의 인자에 대해 우선적으로 고려해야하는 문제이다.

A. 투여 및 약학 조성물

본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드와 이의 동종다량체 및 이종다량체를 포함하여, 이들은 이에 제한되는 것은 아니고, 치료 용도, 진단 용도, 분석-기재 용도, 산업 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경 용도, 에너지-생성 용도 및/또는 방위산업 용도를 포함하는 다수의 용도로 사용된다. 비제한적 예로서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 하기 치료적 용도를 제공한다.

본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드는 매우 다양한 질병의 치료에 유용하다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 투여는 인간에서 시판되는 폴리펩티드 제제에 의해 입증된 활성들 중 임의의 활성을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 평균 양은 다양할 수 있고, 특히 일정한 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방에 기초해야 한다. 본 명세서에 기재된 "변형 또는 비변형" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료할 증상의 정확한 유형, 치료할 환자의 상태, 및 조성물 중의 다른 성분들과 같은 인자들에 달려 있다.

경우에 따라, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 합성효소, 단백질 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 예컨대, 적절한 약학적 담체와 함께 치료적 용도로 사용된다. 예를 들면, 이러한 조성물은 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 조합물이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 만들어진다. 일반적으로, 천연 아미노산의 단백질을 투여하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.

경우에 따라, 효능 및 조직 기전을 확인하고 투여량을 평가하기 위해, 1종 이상의 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 치료용 조성물은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 1종 이상의 적합한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질환 모델에서 시험한다. 특히, 투여량은 즉, 관련 분석에서 천연 아미노산 상동체에 대한 비천연 아미노산 상동체의 활성, 안정성 또는 다른 적절한 측정치(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 폴리펩티드와 천연 아미노산 폴리펩티드의 비교를 포함하나 이로 한정되지 않음)에 의해 초기에 결정될 수 있다.

투여는 분자를 최종적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉시키는 데 통상적으로 이용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 임의의 적절한 방식에 의해 투여된다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 환자에게 투여하기에 적합한 방법이 이용가능하고, 비록 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 종종, 특정 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 보다 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여될 구체적인 조성물뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 이용되는 구체적인 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물로 된 매우 다양한 적절한 제형이 존재한다.

본 명세서에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 이를 포함하는 조성물은 비경구 경로 예컨대, 피하 또는 정맥 주사 또는 임의의 다른 형태의 주사 또는 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 주사를 포함하나 이로 한정되지 않는, 단백질 또는 펩티드에 적합한 임의의 통상적인 경로에 의해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 약학 조성물(본 명세서에 기술한 다양한 비천연 아미노산 폴리펩티드 포함)은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 리포솜을 통해서도 투여될 수 있다. 본 명세서에 기술된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 단독으로 사용되거나 또는 이에 제한되는 것은 아니며 약학 담체를 포함하는 다른 적절한 성분과 함께 조합되어 사용된다.

또한, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드를, 단독으로 또는 다른 적절한 성분과 함께 흡입 투여용 에어로졸 제형(즉, 이들은 "분사"될 수 있음)으로 만들 수 있다. 에어로졸 제형은 가압된 허용가능한 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 내에 배치될 수 있다.

예를 들면, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제, 및 해당 수용자의 혈액과 등장성을 나타내는 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증량제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포장된 핵산 제형은 단회 투여 또는 다회 투여 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로서 제공될 수 있다.

비경구 투여 및 정맥내 투여는 투여의 바람직한 방법이다. 특히, 현재 사용되는 제형과 함께, 천연 아미노산 상동체 치료제에 대해 이미 이용되고 있는 투여 경로(EPO, IFN, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및/또는 임의의 다른 약학적으로 전달되는 단백질에 대해 전형적으로 이용되는 투여 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않음)는 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드에 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다.

본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간에 따라 유익한 치료 반응을 나타내기에 충분하다. 투여량은 구체적인 제형의 효능, 및 사용된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 치료될 환자의 상태 뿐만 아니라, 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량은 구체적인 환자에서 구체적인 제형 등의 투여에 동반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정된다.

질환(암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나 이로 한정되지 않음)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 제형의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수치, 제형의 독성, 질환의 진행, 및/또는, 관련되는 경우, 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생성을 평가한다.

전형적으로, 예를 들면, 70 킬로그램 환자에게 투여되는 투여량은 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 대해 조정된, 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 등가의 범위 내에 있다. 본 명세서에 기재된 제형은 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 변경제 등의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 상태를 보충할 수 있다.

투여에 있어서, 본 명세서에 기재된 제형은 관련 제형의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 다양한 농도에서의 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 부작용의 관찰, 예컨대, 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태에 의해 결정된 속도로 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 달성될 수 있다.

제형을 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 일으키는 경우, 적합한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 조절 약물을 투여한다. 제형을 주입하기 30분 전, 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜히드라민을 포함하나 이들로 한정되지 않는 약물을 주입에 대한 반응, 예를 들면 고열, 근육통 및 오한을 보이는 환자에게 미리 처방한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 보다 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘(meperidine)을 사용한다. 반응의 심각도에 따라 세포 주입을 늦추거나 또는 중단한다.

본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 포유동물 피험체에게 직접 투여할 수 있다. 투여는 폴리펩티드를 피험체 내로 통상적으로 도입하는 데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 어떠한 경우에도, 가장 적합한 경로는 치료될 증상의 특성 및 심각도에 달려 있지만, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 통한 흡입을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 협측(설하를 포함하나 이로 한정되지 않음), 질, 비경구(피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막내, 복막내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 양쪽 모두) 및 경피 투여에 적합한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 제형은 단회 투여량 또는 다회 투여량 밀봉 용기, 예를 들면 앰플 및 바이알로서 제공될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 투여량의 주사가능한 형태(용액, 현탁액 또는 에멀션을 포함하나 이들로 한정되지 않음)의 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 연속 관주(미니펌프, 예를 들면, 삼투압 펌프를 사용하는 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 단일 볼러스(bolus) 또는 지연 방출 데포 제형에 의해 투여될 수 있다.

투여에 적합한 제형은 제형을 등장성 제형으로 만들 수 있는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수용액, 비-수용액 및 등장성 멸균 용액 뿐만 아니라, 현탁제, 가용화제, 증량제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 멸균 현탁액 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 종래 공지된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

동결-건조는 원하는 단백질 제제로부터 물을 제거하는 데 기여하는 단백질을 제공하기 위해 통상적으로 이용되는 기법이다. 냉동-건조 또는 동결-건조는 건조될 물질을 먼저 동결시킨 후 진공 환경 하의 승화로 얼음 또는 동결된 용매를 제거하는 방법이다. 동결-건조 과정 동안 안정성을 증강시키고 저장 시 동결-건조된 생성물의 안정성을 개선하기 위해 경우에 따라 부형제를 동결-건조 전에 미리 제형에 포함시킬 수 있다[Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3): 285-291 (1991)].

약제의 분무 건조는 예를 들어, 예를 들어, 문헌[Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm., 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]에 기술된 방법을 포함한다. 소형 분자 약제 이외에, 다양한 생물학적 물질이 분무 건조되어 왔고 이들로는 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효소가 있다. 분무 건조는 1-단계 과정으로 액상 약학 제제를 미세한, 먼지 없는 또는 응집된 분말로 전환할 수 있기 때문에 유용한 기법이다. 기본적인 기법은 하기 4개 단계를 포함한다: a) 공급 용액을 스프레이 내로 분사하는 단계; b) 스프레이-공기를 접촉시키는 단계; c) 스프레이를 건조하는 단계; 및 d) 건조된 생성물을 건조 공기로부터 분리하는 단계. 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,235,710호 및 제6,001,800호에는 스프레이 건조에 의한 재조합 에리쓰로포이에틴 제조가 기재되어 있다.

본 명세서에 기재된 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 아미노산 폴리펩티드에 대한 약학 조성물(경우에 따라, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함)로 이루어진 매우 다양한 적절한 제형이 존재한다(예를 들면, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)] 참조). 적절한 담체로는 석시네이트, 포스페이트, 보레이트, 헤페스, 시트레이트, 히스티딘, 이미다졸, 아세테이트, 중탄산염 및 다른 유기산을 함유하는 완충제; 아스코르브산을 포함하나 이로 한정되지 않는 항산화제; 저 분자량의 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기를 가진 폴리펩티드가 포함되나, 이로 한정되지 않음); 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린을 포함하나 이들로 한정되지 않는 단백질; 폴리비닐피롤리돈을 포함하나 이로 한정되지 않는 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 라이신을 포함하나 이들로 한정되지 않는 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물(트레할로스, 수크로스, 글루코즈, 만노스 또는 덱스트린을 포함하나 이들로 한정되지 않음); EDTA를 포함하나 이들로 한정되지 않는 킬레이팅제; 아연, 코발트, 또는 구리를 포함하나 이들로 한정되지 않는 2가 금속 이온; 만니톨 및 소르비톨을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당 알코올; 나트륨 및 염화나트륨을 포함하나 이들로 한정되지 않는 염 형성 반대 이온; 및/또는 트윈^TM(트윈 80(폴리소르베이트 80) 및 트윈 20(폴리소르베이트 20)을 포함하나 이들로 한정되지 않음), 플루로닉스(Pluronics)^TM 및 다른 플루론산(플루론산 F68(폴록사머 188) 또는 PEG를 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 비이온성 계면활성제가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 적합한 계면활성제로는 예를 들면, 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드), 즉 (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드), 즉 (PPO-PEO-PPO)에 기초한 폴리에테르 또는 이들의 조합물이 있으나 이들로 한정되지 않는다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 상표명 플루로닉스™, R-플루로닉스™, 테트로닉스™ 및 R-테트로닉스™(BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) 하에 시판되며, 본 명세서에 그 전문이 참고로 도입되는 미국 특허 제4,820,352호에 더 기재되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체도 경우에 따라 적절한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 이들의 조합물을 경우에 따라 사용하여, 교반으로부터 생기는 스트레스를 포함하나 이로 한정되지 않는 1종 이상의 스트레스로부터 PEG화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있다. 상기 물질들 중 일부 물질은 증량제(bulking agent)로서 지칭될 수 있다. 또한, 일부 물질은 "강직성 개질제"로서 지칭될 수 있다.

PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것들을 비롯한 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드는 서방형 시스템 또는 이의 일부에 의해 투여될 수도 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐(microcapsule)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 서방형 매트릭스는 생체적합성 물질, 예를 들면 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981): Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트(문헌[Langer et al., supra] 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 제133,988호), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허 제58,481호), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물(polyanhydride), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌[U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)] 참조), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포솜으로 포획되는 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포솜은 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조된다: 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호, 제88,046호, 제143,949호, 제142,641호; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호 및 유럽 특허 제102,324호.

리포솜에 의해 포획되는 폴리펩티드는 예를 들면, 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82; 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호, 제88,046호, 및 제143,949호; 유럽 특허 제142,641호; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 유럽특허 제102,324호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포솜의 조성 및 크기는 실험적으로 결정할 수 있다. 리포솜의 일부 예는 예를 들면, 문헌[Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8: 1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3): 109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 기재되어 있다.

본 명세서에 기재된 조성물, 제형 및 방법에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험체에게 유리한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 일반적으로, 1회 투여 당 비경구로 투여되는 본 명세서에 기재된 변형 또는 비변형 비천연 아미노산 폴리펩티드의 총 약학적 유효량은 치료하는 의사의 재량에 달려 있지만, 환자 체중 1 kg 당 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 ㎍/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 범위이다. 또한, 투여 빈도 역시 치료하는 의사의 재량에 달려 있지만, 경우에 따라 인간에게 사용할 수 있는 것으로 승인된 시판되는 생성물의 투여 빈도보다 더 적거나 더 많을 수 있다. 일반적으로, 예컨대, 본 명세서에 기재된 PEG화된 폴리펩티드를 비롯한 중합체:폴리펩티드 접합체는 전술한 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.

실시예 1: 2-아미노-3-(4-(프로필-1,2-디온)페닐)프로판산의 히드로클로라이드염의 합성

1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산은 하기 합성 반응에 따라 제조하였다:

90℃에서 벤젠(300 mL) 중 4'-메닐프로피오페논(20, 122 mmol) 및 N-브로모숙신이미드(NBS, 23 g, 130 mmol)의 용액에 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, 0.6 g, 3.6 mmol)을 첨가하였다. 이렇게 얻어진 용액을 밤새 환류 온도로 가열하였다. 이후 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 갈색 용액을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물은 헥산으로부터 결정화시켜서 연한 노란색의 고체로서 생성물을 얻었다(27 g, 87%).

0℃에서 EtOH(400 mL) 중 EtONa(14.5 g, 203 mmol)의 용액에 디에틸 아세트아미도말로네이트(39 g, 180 mmol)를 첨가한 후 EtOH(100 mL) 중 상기 브로마이드(27 g, 119 mmol)의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 1시간 동안 환류 온도로 가열시키고 시트르산(30 g)으로 급냉시키고 H₂O(300 mL)로 희석시켰다. 대부분의 용매를 진공 제거시킨 후, 잔류물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물은 플래시 크로마토그래피(실리카, 10:1-3:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 노란 고체로서 생성물을 얻었다(37 g, 88%).

0℃에서 에테르(100 mL) 중 케톤(5 g, 13.8 mmol)의 용액에 Br₂(0.8 mL, 15.6 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후 포화된 수성 NaHCO₃로 급냉시켰다. 이 혼합물을 Et₂O로 추출하였다. 유기층을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켜 노란색 고체로서 생성물을 얻고(5.4 g, 88%), 이를 추가 정제하여 다음 단계에 직접 사용하였다.

DMSO(20 mL) 중 α-브로모 케톤(5.4 g, 12.2 mmol) 및 Na₂CO₃(2.0 g, 18.9 mmol)의 용액에 KI(2.1 g, 13.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기하에서 28시간 동안 90℃에서 교반하였다. 이후 반응물을 H₂O로 급냉하고 EtOAc로 희석하였다. 유기층을 분리하고 H₂O 및 염수로 연속적으로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카, 6:1-1:10 헥산:EtOAc)를 통해 정제하여 고체 생성물을 얻었다(1.12 g, 24%).

농축 HCl(10 mL) 및 디옥산(10 mL) 중 디케톤(1.12 g, 2.0 mmol)의 용액을 밤새 환류 온도로 가열하였다. 용매를 진공 제거한 후, MeOH(3 mL)을 첨가하여 잔류물을 용해시켰다. 에테르(300 mL)를 첨가하여 연한 노란색 고체로서 생성물(302 mg, 42%)을 침전시켰다.

실시예 2: 2-아미노-3-(4-(부틸-1,2-디온)페닐)프로판산의 히드로클로라이드 염의 합성

1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 하기 합성 반응에 따라 제조하였다:

0℃에서 에테르(25 mL) 중 C₃H₂MgCl(2 M, 50 mmol)의 용액에 에테르(50 mL) 중 벤즈알데히드(5 mL, 42.5 mmol)를 첨가하였다. 얻어진 용액을 0℃에서 30분간 교반하였다. 반응물을 포화된 NH₄Cl로 급냉시키고 에테르로 희석하였다. 유기층을 분리하고 H₂O 및 염수로 연속적으로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켜 미정제 생성물(7.2 g)을 얻었으며 이를 정제없이 다음 단계에 직접 사용하였다.

0℃에서 CH₂Cl₂(300 mL) 중 상기 알콜(7.2 g, 43.9 mmol) 및 피리딘(7 mL, 86.7 mmol)의 용액에 데스-마틴 페리오디난(19.2 g, 45.3 mmol)을 첨가하였다. 이렇게 얻어진 혼합물을 밤새 교반하고 포화된 수성 Na₂S₂O₃ 및 포화된 수성 NaHCO₃(1:1)로 급냉시켰다. 유기층을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카, 8:1-4:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 무색 오일로서 생성물을 얻었다(2단계 동안 6.28 g, 91%).

벤젠(150 mL) 중 상기 케톤(4.43 g, 27.3 mmol) 및 N-브로모숙신이미드(NBS, 5.5 g, 30.9 mmol)의 용액에 90℃에서 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, 0.2 g, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 이렇게 얻어진 용액을 밤새 환류 온도로 가열하고 실온으로 냉각시켰다. 갈색 용액을 연속적으로 H₂O 및 염수로 연속적으로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물은 헥산으로부터 결정화하여 흰색 고체로서 생성물을 얻었다(6.21 g, 95%).

0℃에서 EtOH(200 mL) 중 EtONa(2.5 g, 34.9 mmol)의 용액에 디에틸아세트아미도말로네이트(6.7 g, 30.9 mmol)를 첨가한 후 EtOH(100 mL) 중 상기 브로마이드(6.2 g, 25.8 mmol)의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 1시간 동안 환류 온도로 가열시킨 후 시트르산(9 g)으로 급냉시키고 H₂O로 희석하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔류물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층은 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물은 플래시 크로마토그래피(실리카, 4:1-2:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 연한 노란색 고체로서 생성물을 얻었다(8.92 g, 92%).

HOAc(50 mL) 중 상기 케톤(1.4 g, 3.71 mmol)의 용액에 Br₂(0.7 mL, 13.6 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후 포화된 수성 NaHCO₃로 급냉시켰다. 이 혼합물을 Et₂O로 추출하였다. 유기층을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카, 5:1-3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 노란색 고체로서 생성물을 얻었다(1.23 g, 73%).

DMSO(30 mL) 중 α-브로모 케톤(1.12 g, 2.46 mmol) 및 Na₂CO₃(0.4 g, 3.77 mmol)의 용액에 KI(0.45 g, 13.2 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 90℃에서 밤새 교반한 후 시트르산(2 g) 및 H₂O(200 mL)로 급냉시켰다. 이 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카, 6:1-1:10 헥산:EtOAc)로 정제하여 오일로서 α-히드록실 케톤(0.62 g, 64%)을 얻었다.

0℃에서 CH₂Cl₂(100 mL) 중 상기 알콜(0.62 g, 1.58 mmol) 및 피리딘(0.5 mL, 6.19 mmol)의 용액에 데스-마틴 페리오디난(0.9 g, 2.12 mmol)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 밤새 교반하고 이어서 포화된 수성 Na₂S₂O₃ 및 포화된 수성 NaHCO₃(1:1)로 급냉시켰다. 유기층을 연속적으로 H₂O 및 염수로 세정한 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(실리카, 9:1-3:2 헥산:EtOAc)로 정제하여 노란색 오일로서 생성물(2단계 동안 287 mg, 30%)을 얻었다.

농축 HCl(10 mL) 및 디옥산(10 mL) 중 상기 디케톤(272 mg, 0.7 mmol)의 혼합물을 밤새 환류 온도로 가열하였다. 용매를 진공 제거한 후, MeOH(1 mL)을 부가하여 잔류물을 용해시켰다. 에테르(200 mL)를 이후 첨가하여 노란 고체로서 생성물을 침전시켰다(162 mg, 81%).

실시예 3: 2-아미노-3-(3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디에닐)프로판산의 히드로클로라이드 염의 합성

1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 하기 합성 반응에 따라 제조하였다:

실시예 4: 2-아미노-3-(1,2-디히드로-1,2-디옥소나프탈렌-6-일)프로판산의 히드로클로라이드 염의 합성

1,2-디카르보닐 함유 비천연 아미노산을 하기 합성 반응에 따라 제조하였다:

실시예 5: 2-아미노-3-(3,4-디아미노페닐)프로판산의 히드로클로라이드 염의 합성

1,2-아릴디아민 함유 비천연 아미노산을 하기 합성 반응에 따라 제조하였다:

실시예 6

하기 합성 반응에 요약한 바에 따른 2-페닐퀴녹살린의 합성. 이 반응의 HPLC 추적 결과를 도 3에 나타내었다:

실시예 7

하기 합성 반응에 요약한 바에 따른 2-에틸-3-메틸퀴녹살린의 합성. HPLC 추적 결과를 도 4에 나타내었다:

실시예 8

하기 합성 반응에 요약한 바에 따른 2-메틸-3-페닐퀴녹살린의 합성. HPLC 추적 결과를 도 5에 나타내었다:

실시예 9

이 실시예에서는 하기 합성 반응에 요약한 바와 같이, 2,3-디페닐퀴녹살린의 합성을 설명하는 것이다. HPLC 추적 결과를 도 6에 나타내었다:

실시예 10

이 실시예는 하기 합성 반응에 요약한 바와 같이, 2,3-디(피리딘-2-일)퀴녹살린의 합성을 설명하는 것이다. HPLC 추적 결과를 도 7에 나타내었다:

실시예 11

이 실시예는 하기 합성 반응에 요약한 바와 같이, 벤조[a]페나진의 합성을 설명하는 것이다. HPLC 추적 결과는 도 8에 나타내었다:

실시예 12

이 실시예는 하기 합성 반응에 요약한 바와 같이, 4-설포닐벤조[a]페나진의 합성을 설명하는 것이다. HPLC 추적 결과는 도 9에 나타내었다:

실시예 13

하기 합성 반응에 요약한 바에 따른 1,10-펜안트롤린-5,6-디온 및 o-페닐디아민 간의 반응을 통한 페나진 합성. HPLC 추적 결과를 도 10에 나타내었다:

실시예 14

하기 합성 반응에 요약한 바에 따른 펜안트렌-9,10-디온 및 o-페닐디아민 간의 반응을 통한 페나진 합성. HPLC 추적 결과는 도 11에 나타내었다:

실시예 15: 이.콜라이에서 변형 폴리펩티드의 클로닝 및 발현

오르쏘고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 소개한 번역 시스템을 이용하여 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 발현시켰다. 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 갖는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시킨다. 이후 상기 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여, 폴리펩티드에 비천연 아미노산을 삽입시킨다. 비천연 아미노산의 도입에 유용한 O-tRNA 및 O-RS의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 미국 특허 출원 제10/126,927호(발명의 명칭: 비천연 아미노산의 생체 내 도입) 및 미국 특허 출원 제10/126,931호(발명의 명칭: 오르쏘고날 tRNA-아미노아실 tRNA 합성효소쌍의 제조를 위한 방법 및 조성물)에 기술되어 있으며, 이들을 참조하여 포함시킨다. 하기 O-RS 및 O-tRNA 서열을 또한 경우에 따라 사용한다:

서열번호 1	엠.잔나스키(M.jannaschii) mRNATyr CUA	tRNA
서열번호 2	HLAD03; 최적화된 앰버 서프레서 tRNA	tRNA
서열번호 3	HL325A; 최적화된 AGGA 프레임쉬프트 서프레서 tRNA	tRNA
서열번호 4	p-아지도-L-페닐알라닌 p-Az-PheRS(6)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 5	p-벤조일-L-페닐알라닌 p-BpaRS(1)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 6	프로파르길-페닐알라닌 프로파르길-PheRS의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 7	프로파르길-페닐알라닌 프로파르길-PheRS의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 8	프로파르길-페닐알라닌 프로파르길-PheRS의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 9	p-아지도-페닐알라닌 p-Az-PheRS(1)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 10	p-아지도-페닐알라닌 p-Az-PheRS(3)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 11	p-아지도-페닐알라닌 p-Az-PheRS(4)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 12	p-아지도-페닐알라닌 p-Az-PheRS(2)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 13	p-아지도-페닐알라닌(LW1)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 14	p-아지도-페닐알라닌(LW5)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 15	p-아지도-페닐알라닌(LW6)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 16	p-아지도-페닐알라닌(AzPheRS-5)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 17	p-아지도-페닐알라닌(AzPheRS-6)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS

상동성 서열을 사용하여 화학식 1, 3 및 6의 화합물을 도입시켰다.

변형된 유전자 및 오르쏘고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(목적 비천연 아미노산에 특이적임)을 함유하는 플라스미드로 이.콜라이를 형질전환시켜 폴리펩티드에 부위 특이적으로 비천연 아미노산을 도입하는 것이 가능하다. 약 0.01 내지 약 100 mM의 특정 비천연 아미노산을 함유하는 배지 중 37℃에서 성장시킨 형질전환된 이.콜라이에서 높은 충실도 및 효율로 변형된 폴리펩티드를 발현시켰다. 비천연 아미노산을 함유하는 His-태그된 폴리펩티드를 인클루젼 바디 또는 응집체로서 이.콜라이 숙주 세포에서 생성시켰다. 상기 응집체는 6 M 구아니딘 HCl 중의 변성 조건 하에서 가용화시키고 친화성 정제하였다. 50 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 40 uM CuSO₄ 및 2%(w/v)사르코실 중에 밤새 4℃에서 투석시켜 리폴딩을 수행하였다. 상기 물질을 이후 20 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂에 대해 투석한 후, His-태그를 제거하였다. 문헌 [Boissel et al, J. Biol. Chem., (1993) 268: 15983-93]을 참조한다. 폴리펩티드의 정제 방법은 공지되어 있고, SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 분석 또는 전기분사-이온화 이온 트랩 질량 분광분석법 등으로 확인한다.

실시예 16: 비천연 아미노산의 테스트

이 실시예에서는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 도입하기 위해 그 특성을 예측하데 도움이 되도록 일정한 예시적인 비천연 아미노산에 대해 4가지 테스트를 수행한 결과를 제공한다.

실시예 17

본 실시예에서는 도 16의 화학적으로 합성된 UT-II의 유도체화를 기술한다:

실시예 18

이 실시예에서는 도 17의 화학적으로 합성된 XT의 유도체화를 기술한다:

실시예 19: 아드릴디아민 기를 갖는 비천연 아미노산을 함유하는 인간 성장 호르몬(hGH)의 PEG화

아미노산 35에 위치한 0-페닐디아민(oPDA)을 갖는 인간 성장 호르몬(hGH)을 펜탄-2,3-디온을 함유하는 mPEG30k와 반응시켜 퀴녹살린 연결을 통해 hGH를 PEG화 시켰다.

실시예 20: 아드릴디아민 기를 갖는 비천연 아미노산을 함유하는 형광 표지된 인간 성장 호르몬(hGH)

아미노산 35에 위치한 o-페닐디아민(oPDA)을 갖는 인간 성장 호르몬(hGH)을 나프탈렌-1,2-디온과 반응시켜 안에 hGH가 형광 표지된 페나진, 벤조[a]페나진을 형성시켰다.

하기 실시예들은 치료적으로 활성이 있는 천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 내 및 시험관 내 활성과 변형된 치료적으로 활성이 있는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관 내 생체 내 활성을 측정하고 비교하기 위한 방법을 기술하였다.

실시예 21: 세포 결합 분석

90분 동안 0℃에서 다양한 농도(부피: 10㎕)의 미표지된 GH, hGH 또는 GM-CSF의 존재 또는 부재하 및 ¹²⁵I-GH(대략 100,000 cpm 또는 1 ng) 존재하에 PBS/1% BSA(100 ㎕) 중에 이중으로 세포(3×10⁶)를 배양하였다(총 부피: 120 ㎕). 이후 세포를 재현탁하고 350 ㎕ 플라스틱 원심분리 튜브 중에 200 ㎕ 빙냉 FCS 상에 층을 이루게 두고 원심분리하였다(1000 g, 1분). 튜브의 말단을 잘라서 펠렛을 회수하고 펠렛과 상층액을 개별적으로 감마 카운터(Packard)에서 계측하였다.

비결합성(specific binding)(cpm)은 경쟁인자 부재하의 총 결합(이중물의 평균)에서 미표지된 GH(비특이적 결합)의 100 배 과량 존재하에서 결합(cpm)을 뺀 것으로서 결정하였다. 비특이적 결합은 사용된 세포 각 유형에 대해 측정하였다. 실험은 ¹²⁵I-GH의 동일 조제물을 이용하여 개별일에 수행하였고 내부 일관성을 나타내야 한다. ¹²⁵I-GH는 GH-수용체 생성 세포에 대한 결합을 검증하였다. 이 결합은 미표지된 천연 GH 또는 hGH에 의해 용량 의존적 방식으로 억제되었지만 GM-CSF 또는 다른 음성 대조군에 의해서는 그렇지 않았다. 천연 GH와 유사하게 천연 ¹²⁵I-GH의 결합에 대해 경쟁하는 hGH의 능력은 수용체가 두 형태를 동등하게 인식한다는 것을 시사한다.

실시예 22: PEG화 hGH의 생체 내 실험

PEG-hGH, 비변형 hGH 및 완충 용액을 마우스 또는 래트에 투여하였다. 그 결과, 상당히 체중이 증가한 것으로 나타나는 비변형 hGH와 비교하여 본 발명의 PEG화된 hGh는 반감기가 길어지고 활성이 우수한 것으로 나타났다.

실시예 23: 접합 및 비접합된 hGH 및 이의 변이체의 생체 내 반감기의 측정

세인트 루이스 대학의 동물 실험 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜하에서 AAALAC 설비 상에서 모든 동물 실험을 수행하였다. 래트는 12시간 명/암 주기로 실내 케이지에 개별 수용시켰다. 동물들은 공증된 퓨리나 로덴트 초우 5001 및 물에 원하는대로 접근하도록 제공하였다. 하수체적출술을 받을 래트에 대해서는, 음용수에 5% 글루코스를 추가로 함유시켰다.

실시예 24: 약동력학 실험

각각의 PEG화된 돌연변이체 hGH의 품질은 동물 실험에 들어가기 전 3번의 분석을 통해 평가하였다. PEG-hGH의 순도는 비환원 조건 하에 MES SDS 러닝 완충액을 이용하여 4-12% 아크릴아미드 NuPAGE Bis-Tris 겔을 러닝시켜 조사하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA). 상기 겔은 쿠마시 블루로 염색하였다. PEG-hGH 밴드는 농도계 스캔을 기초로 순도가 95% 이상이었다. 각 PEG-hGH의 내독소 수준은 Carles River Laboratories(Wilmington, MA)의 KTA² 키트를 이용하여 동력학 LAL 분석을 통해 테스트하였고, 1회 용량 당 5 EU 보다 작았다. PEG-hGH의 생물학적 활성은 IM-9 pSTA5 바이오분석으로 평가하였고, EC₅₀ 값은 15 nM 미만으로 확인되었다.

PEG-변형된 성장 호르몬 화합물의 약동력학적 특성은 Carles River Laboratories에서 구입한 숫컷 스프라그-다우리 래트(261-425 g)에서 상호 비교하였고 비PEG화 성장 호르몬과도 비교하였다. 혈액 수집물에 대해 카테터를 외과적으로 경동맥에 설치하였다. 성공적인 카테터 설치후, 동물을 투약전에 치료군(그룹 당 3 내지 6 마리)으로 할당하였다. 동물에게 투여 용량 약 0.41 내지 약 0.55 mL/kg 중 약 1 mg/kg의 화합물을 피하 투여하였다. 유치 카테터를 통해 다양한 시점에서 혈액 샘플을 수집하고 EDTA-피복된 마이크로퓨즈 튜브에 넣었다. 혈청을 원심 분리후에 회수하고 분석 전까지 -80℃에 보관하였다. 화합물 농도는 BioSource Internationa(Camarillo, CA) 또는 Diagnostic Systems Laboratories(Webster, TX)의 항체 샌드위치 성장 호르몬 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 농도는 투여한 유사체에 상응하는 표준물을 이용하여 계산하였다. 약동력학 매개변수는 모델링 프로그램 WinNonlin(Pharsight, version 4.1)을 이용하여 측정하였다. 선형-업/로그-다운 사다리꼴 적분을 이용한 비구획 분석을 사용하였고, 농도 결과는 균일하게 가중치를 주었다.

혈장 농도는 래트에서 단일 피하 투여후에 일정 간격으로 얻었다. 래트(n= 그룹 당 3-6마리)에 1 mg/kg 단백질의 단일 볼러스 용량을 투여하였다. 각각 여섯개의 상이한 위치에서 30 kDa PEG에 공유 연결된 화학식 1의 비천연 아미노산을 포함하는 His-태그된 hGH 폴리펩티드, His-태그된 hGH 폴리펩티드(his-hGH) 또는 hGH 야생형 단백질(WHO hGH)을 WHO hGH 및 (his)-hGH와 비교하였다. 혈장 샘플을 정기적으로 회수하였고 기술한 바와 같이 주입한 화합물에 대해 분석하였다.

실시예 25: 약력학 실험

하수체적출술한 숫컷 스프라그-다우리 래트를 Charles River Laboratories에서 구입하였다. 뇌하수체를 3-4주령시에 외과적으로 제거하였다. 동물들을 3주 동안 순응시켰으며, 이 기간 동안 체중을 모니터링하였다. 시험 시작 전 7일 기간 동안 체중이 0-8 g 늘어난 동물을 포함시켰고 무작위로 치료군으로 나누었다. 래트에게 볼러스 용량 또는 1일 용량을 피하 투여하였다. 실험 전반에 걸쳐 래트를 날마다 연속적으로 체중을 재고, 마취시키고, 채혈하고 투약하였다(적용가능한 경우). 헤파린처리한 모세관을 이용하여 안와 공동에서 혈액을 채취하고 EDTA 피복된 마이크로퓨즈 튜브에 넣었다. 원심분리를 통해 혈장을 단리하고 분석전까지 -80℃에 보관하였다. 시간 간격에 따라서 평균(+/-S.D.) 혈장 농도를 그래프화하였다.

펩티드 IGF-1은 소마토메딘 또는 인슐린 유사 성장 인자 패밀리의 구성원이다. IGF-1은 성장 호르몬의 수많은 성장 촉진 효과를 매개한다. IFG-1 농도는 제공되는 래트/마우스 IGF-1 표준물(Diagnosic Systems Laboratories)에 대하여 경쟁적 결합 효소 면역 분석 키트를 이용해 측정하였다. 하수체적출술한 래트. 래트(n=그룹 당 5-7마리)에게 단일 용량 또는 1일 용량을 피하 투여하였다. 동물을 날마다 연속적으로 체중을 재고, 마취시키고, 채혈하고 투약하였다(적용가능시). 체중 결과는 위치 35 및 92에 30 kDa PEG 공유 연결된 화학식 3의 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드, His-태그된 hGH((his)hGH), 야생형 hGH(hGH) 위약 치료에 대해 얻었다.

실시예 26: 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 안정성 및/또는 효능에 대한 인간 임상 시험

하기 임상 실험의 실시예를 사용하여 어린이 및 성인 성장 호르몬 결핍증, 터너 증후군, 만성 신부전, 프레이더-윌리 증후군, 자궁내 성장 지연 아동, 특발성 저신장증, 만성 고용량 글루코코르티코이드 사용과 관련된 성장 부전, 이식후 성장 부전, X-연관 저인산염혈증 구루병, 염증성 장질환, 누난 증후군, 골섬유 이형성증, 만성소화장애증와 관련된 성장 부전, 예를 들어, 진행성 후천성 면역 결핍증과 관련된 근쇠약, 화상의 촉진 치유, 비만 개체에 대한 엄격 식이법의 부작용, 섬유근통, 만성 피로 증후군, 노화 관련 쇠약증 및 다른 인간 성장 호르몬의 사용을 치료한다.

목적: 하나 이상의 시판 hGH 생성물(이에 제한되는 것은 아니며, Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer) 및/또는 Saizen/Serostim™(Serono)를 포함)과, 화학식 1의 비천연 아미노산을 포함하는 피하 투여된 PEG화 재조합 인간 hGH의 약동력학 및 안정성을 비교하기 위한 것이다.

환자: 연령이 20 내지 40세이고 체중이 60 내지 90 kg인 18명의 건강한 지원자들을 이 연구에 등록시킨다. 이 피험체들은 혈액학 또는 혈청 화학, 및 음성 요독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대해 임상적으로 유의한 비정상적인 실험 값을 갖지 않는다. 이들은 하기 경우 중 어떠한 경우에도 해당하지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 원발성 혈액학적 질환의 병력; 심각한 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식, 대사, 신경 질환의 병력; 빈혈 또는 발작 장애의 병력; 박테리아 또는 포유동물 유래 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 공지된 과민성; 카페인을 함유하는 음료에 대해 습관적이고 과도한 소비; 연구 시작 전 30일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했거나 혈액을 수혈받거나 또는 수혈한 경험; 연구 시작 전 3개월 이내에 hGH에 노출된 경험; 연구 시작 전 7일 이내에 질환을 앓은 경험; 및 연구 시작 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가 시 유의한 이상 증세가 있는 경우. 모든 피험체를 안정성에 대해 평가하였고, 약동학적 분석을 위한 모든 채혈을 예정대로 수행하였다. 모든 연구는 윤리 위원회의 승인 및 환자의 동의하에 수행된다.

연구 디자인: 이는 건강한 남성 지원자들을 대상으로 한 임상 I 단계 단일 센터에서, 공개되고, 무작위화한 2-기 교차 연구이다. 18 명의 피험체를 두 치료 순서 군 중 하나(군 당 9 명의 피험체)에 무작위로 배정하였다. GH는 선택한 시판 생성물 및 화학식 1의 비천연 코딩왼 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 등가 투여량을 사용하여 대퇴부에서 볼러스 s.c. 주사로서 2종의 개별 투여 기간에 걸쳐 투여하였다. 시판 제품의 투여량 및 투여 빈도는 팩키지 표지에 지시된 대로 따랐다. 추가 군의 피험체를 포함시켜서, 시판되는 제품을 사용하여, 추가 투여량, 투여 빈도 또는, 필요에 따라, 다른 매개변수를 연구에 포함시킬 수 있다. 각각의 투여 기간은 14일간의 워시아웃(washout) 기간에 의해 나뉜다. 피험체는 투여 기간 사이가 아닌, 각각의 두 투여 기간 동안 투여 전 12시간 이상부터 투여 후 72시간까지 연구 센터에만 거주시켰다. PEG화된 hGH에 대해서도 시험될 추가 투여량, 투여 빈도 또는 다른 매개변수가 존재하는 경우 추가 군의 피험체를 연구에 포함시킬 수 있다. 인간에 대해 사용이 승인된 GH의 다중 제형을 경우에 따라 이 실험에 사용한다. Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer) 및/또는 Saizen/Serostim™(Serono)이 인간 사용에 승인된 시판 GH 제품이다. hGH의 실험 제형은 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH이다.

혈액 샘플링: hGH의 투여 전 및 후에 직접적인 정맥 천자를 통해 연속적으로 채혈하였다. 혈청 GH 농도의 측정을 위해 정맥혈 샘플(5 ㎖)을 투여(3 개의 기준 샘플) 전 약 30, 20 및 10 분에서 얻고, 투여 후 대략 하기 시간에서 얻었다: 30분 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간. 각각의 혈청 샘플을 2 개의 분취액으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20 ℃에서 저장하였다. 혈청 샘플을 드라이 아이스 상에 두었다. 금식 임상 실험실 시험(혈액학, 혈청 화학 및 뇨검사)을 제1일에 첫 투여 직전, 제4일 아침, 제16일 투여 직전 및 제19일 아침에 수행하였다.

생체분석 방법: 혈청 GH 농도를 측정하는 데 ELISA 키트 절차(BioSource International(Camarillo, CA))를 사용하였다.

안전성 측정: 생명 징후를 각각의 투여 직전(제1일 및 제16일), 및 각각의 투여 후 6, 24, 48 및 72시간에 기록하였다. 안전성은 불리한 사건의 유형 및 발생률 및 임상 실험실 시험에서의 기준과의 차이를 기초로 하여 측정하였다. 또한, 혈압을 비롯한 생명 징후 측정 및 신체 검사 결과에 있어서 연구 전과의 차이를 평가하였다.

데이터 분석: 투여 전 30분, 20분 및 10분에 수집된 3개의 샘플로부터의 GH 농도를 평균내어 결정한 평균 기준 GH 농도를 투여 후 값들 각각으로부터 차감하여 투여 후 혈청 농도 값을 투여 전 기준 GH 농도에 대해 보정하였다. 투여 전 혈청 GH 농도가 분석의 정량화 수준 미만인 경우, 이 농도는 평균 값 계산에 포함시키지 않았다. 약동력학적 매개변수는 기준 GH 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 측정하였다. 약동력학적 매개변수는 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 VAX 8600 컴퓨터 시스템(Digital Equipment Corporation)에서 모델 독립적 방법에 의해 산출되었다. 하기의 약동학적 매개변수를 결정하였다: 피크 혈청 농도(C_max); 피크 혈청 농도에 대한 시간(t_max); 선형 사다리꼴 법칙을 이용하여 계산한 0 내지 마지막 채혈 시간(AUC_{0 -72})에서의 농도-시간 곡선하 면적(AUC); 및 제거율 상수로부터 산정된 최종 제거 반감기(t_{1 /2}). 제거율 상수는 로그-선형 농도-시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속적인 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정하였다. 각각의 치료에 대해 약동학적 매개변수의 평균, 표준 편차(SD) 및 변이 계수(CV)를 산출하였다. 매개변수 평균 비율(보존된 제형/보존되지 않은 제형)을 산출하였다.

안전성 결과: 불리한 사건 발생률은 치료군에 걸쳐 동일하게 분포하였다. 기준 또는 연구 전 임상 실험실 시험 또는 혈압과의 임상적으로 유의한 차이는 없고, 연구 전 신체 검사 결과 및 활력 징후 측정에 있어서도 연구 전과의 뚜렷한 차이가 없었다. 두 치료군에 대한 안전성 프로파일은 유사하게 나타나야 한다.

약동력학적 결과: 시판 hGH(Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer) 및/또는 Saizen/Serostim™(Serono)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아님) 중 하나 이상의 단일 용량을 투여한 후, 모든 18 피험체에서의 평균 혈청 GH 농도-시간 프로파일(기준 GH 농도에 대해 미보정)을 측정한 각 시간 점에서 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH와 비교하였다. 모든 피험체는 정상적인 생리적 범위내에서 사전 투여된 기준 GH 농도를 가져야 한다. 약동력학적 매개변수는 투여 전 기준 GH 농도에 대해 보정한 혈청 데이타로부터 결정하였고 C_max 및 t_max를 결정하였다. 선택된 임상 비교기(들)(Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer) 및/또는 Saizen/Serostim™(Serono))에 대한 평균 t_max는 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH에 대한 t_max보다 상당히 짧았다. 최종 반감기 값은 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH에 대한 최종 반감기와 비교하여 테스트한 시판 hGH 생성물에 대해 상당히 짧았다.

본 실험이 건강한 남성 개체에 대해 수행되었지만, 유사한 흡수 특징 및 안정성 프로파일을 다른 환자군; 예컨대 암 또는 만성 신부전, 소아 신부전 환자, 자가 프리디포짓 프로그램의 환자 또는 선택적 수술이 계획된 환자 등의 남성 또는 여성 환자에서도 기대할 수 있다.

결론적으로, 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 단일 용량을 피하 투여한 것은 안정하고 건강한 남성 개체가 견딜만 하였다. 상대적인 부작용의 발생률, 임상 실험실 값, 생명 징후 및 신체 검사 결과를 기초로, 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH 및 hGH의 시판 형태의 안정성 프로파일은 동등하다. 화학식 1의 비천연 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH는 가능하게는 환자 및 건강 의료 제공자에게 상당한 임상 유용성을 제공한다.

실시예 27: PEG화 hGH 및 비 PEG화 hGH의 수용성 비교

hGH 야생형 단백질(WHO hGH), His-태그된 hGH 폴리펩티드(his-hGH) 또는 위치 92에 30 kDa PEG가 공유 연결된 화학식 1의 비천연 아미노산을 포함하는 His-태그된 hGH 폴리펩티드의 수용성은 100 ㎕ 물에 용해될 수 있는 개별 폴리펩티드의 양을 측정하여 얻었다. PEG화 hGH의 양은 WHO hGH 및 hGH의 양보다 많은데 이는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 PEG화가 수용성을 증가시킴을 보여주는 것이다.

실시예 28: 변형된 치료적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체 내 실험

췌장암 종양 이종이식편을 마우스에 이식하고 이들을 2그룹으로 나누었다. 한 그룹은 변형된 치료적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 날마다 치료하고 다른 한 그룹은 치료적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드를 날마다 치료하였다. 종양 크기를 매일 측정하였는데 변형된 치료적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드로 치료한 그룹의 종양 크기가 감소하는 것으로 나타난 바와 같이, 변형된 치료적 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드가 치료적 활성 천연 아미노산 폴리펩티드와 비교하여 치료 효능이 개선되었다.

본 명세서에 기술한 실시예 및 구체예는 단지 예시적인 목적이며 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화는 첨부된 청구항의 범주 및 본 출원의 범위 내에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Miao, Zhenwei <120> Phenazine and Quinoxaline Substituted Amino Acids and Polypeptides <130> AMBX-0107.00PCT <140> PCT/US2007/089142 <141> 2007-12-28 <150> 60/882,500 <151> 2006-12-28 <160> 17 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 1 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized amber supressor tRNA <400> 2 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 3 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An optimized AGGA frameshift supressor tRNA <400> 3 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-L-phenylalanine <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 5 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-benzoyl-L-phenylalanine <400> 5 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys 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incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 16 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 17 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305

Claims (64)

1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 활성 대사산물, 프로드러그, 용매화물, 다형체, 호변이성질체 또는 거울상 이성질체:

   [화학식 1]

   상기 식에서,

   A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;

   B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이고, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

   R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

   R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

   각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나; 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

   각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")₂, 또는 -L-Z이거나; 또는

   함께 선택된 2개의 R₅ 기는 경우에 따라 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴을 형성하며;

   각각의 R"은 독립적으로 H, 보호기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬이거나, R" 기가 하나보다 많이 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하고;

   Z는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 산화물; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당 기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 비오틴; 비오틴 유사체; 검출가능 표지; 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택되며;

   L은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 치환된 아르알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)O-, -C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -OC(O)-, -OC(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO- (알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CS-, -N(R')CS- (알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, OC(O)N(R')-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')S(O)_k-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -N=C(R')-, -N=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 또는 -C(R')₂-N(R')-N(R')-이며, 여기서 k는 0, 1 또는 2이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
2. 하기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 활성 대사산물, 프로드러그, 용매화물, 다형체, 호변이성질체 또는 거울상 이성질체:

   [화학식 3]

   상기 식에서,

   A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;

   B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이고, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

   R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

   R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

   각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

   각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")₂ 또는 -L-Z이거나; 또는

   함께 선택된 2개의 R₅ 기는 경우에 따라 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴을 형성하고;

   각각의 R"은 독립적으로 H, 보호기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬이거나, 또는 R" 기가 하나보다 많이 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하며;

   Z는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 산화물; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당 기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 비오틴; 비오틴 유사체; 검출가능 표지; 및 이의 임의 조합로 이루어진 군에서 선택되며;

   L는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 치환된 아르알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)O-, -C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -OC(O)-, -OC(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CS-, -N(R')CS-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, OC(O)N(R')-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')S(O)_k-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -N=C(R')-, -N=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, 또는 -C(R')₂-N(R')-N(R')-이고; 여기서 k는 0, 1 또는 2이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
3. 하기 화학식 6의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 활성 대사산물, 프로드러그, 용매화물, 다형체, 호변이성질체 또는 거울상 이성질체:

   [화학식 6]

   상기 식에서,

   A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;

   B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이고, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

   R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

   R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

   각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

   각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 산화물, 치환된 폴리알킬렌 산화물, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")₂ 또는 -L-Z이거나; 또는

   함께 선택된 2개의 R₅ 기는 경우에 따라 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴을 형성하고;

   각각의 R"은 독립적으로 H, 보호기, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬이거나, 또는 R" 기가 하나보다 많이 존재하는 경우, 2개의 R"은 경우에 따라 헤테로시클로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하고;

   Z는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 산화물; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당 기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 비오틴; 비오틴 유사체; 검출가능 표지; 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택되며;

   L은 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 치환된 아르알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)O-, -C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -OC(O)-, -OC(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CS-, -N(R')CS-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, OC(O)N(R')-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')S(O)_k-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -N=C(R')-, -N=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 또는 -C(R')₂-N(R')-N(R')-이고; 여기서, k는 0, 1 또는 2이고 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 R₃ 및 R₄는 결합인 화합물.
5. 제4항에 있어서, A 및 B는 결합인 화합물.
6. 제4항에 있어서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, B는 결합인 화합물.
7. 제5항에 있어서, R₁ 및 R₂는 각각 하나 이상의 아미노산인 화합물.
8. 제6항에 있어서, R₁ 및 R₂는 각각 하나 이상의 아미노산인 화합물.
9. 제7항에 있어서, R₁ 및 R₂는 각각 2 이상의 아미노산인 화합물.
10. 제8항에 있어서, R₁ 및 R₂는 각각 2 이상의 아미노산인 화합물.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, B는 -O-, -S- 또는 -N(R')-이고, R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬인 화합물.
12. 제3항에 있어서,

    로 이루어진 군에서 선택된 화합물.
13. 제2항에 있어서,

    로 이루어진 군에서 선택된 화합물.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, Z는 하나 이상의 아미노산인 화합물.
15. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, Z는 형광성, 인광성, 화학발광성, 킬레이팅, 전자 밀집성, 자성, 인터컬레이팅, 방사성, 발색단 및 에너지 전이 부분으로 이루어진 군에서 선택된 검출가능 표지인 화합물.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, X는 수용성 중합체인 화합물.
17. 제16항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리알킬렌 산화물 또는 치환된 폴리알킬렌 산화물을 포함하는 것인 화합물.
18. 제16항에 있어서, 수용성 중합체는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 20∼10,000임)를 포함하는 것인 화합물.
19. 제16항에 있어서, 수용성 중합체는 분자량이 약 2∼40 kDa 범위인 m-PEG인 화합물.
20. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 화합물 구조를 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드.
21. 제20항에 있어서, 치료적 폴리펩티드의 천연 아미노산을 비천연 아미노산으로 치환시킨 것인 폴리펩티드.
22. 제21항에 있어서, 치료적 폴리펩티드는 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론으로 이루어진 군에서 선택된 것인 폴리펩티드.
23. 폴리펩티드의 말단 또는 내부 위치에 하나 이상의 비천연 아미노산을 도입하는 단계를 포함하는 제21항의 폴리펩티드의 제조 방법.
24. 제23항에 있어서, 비천연 아미노산은 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드의 특정 부위에 도입되는 것인 제조 방법.
25. 제24항에 있어서, 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 박테리아 및 진핵생물 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포를 포함하는 생체 내 번역 시스템인 제조 방법.
26. 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디카르보닐 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 제2항 또는 제3항의 화합물의 제조 방법;

    [화학식 VII]

    상기 식에서,

    A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌;

    B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 한쪽 말단에서 페나진 함유 부분 또는 퀴녹살린 함유 부분에 연결된 링커이고, 상기 링커는 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -S- 또는 -N(R")-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

    R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

    R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

    각각의 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃ 및 R₄ 또는 2개의 R₃ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

    각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR', -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고, R'은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
27. 제26항에 있어서, A는 결합인 제조 방법.
28. 제26항에 있어서, 화학식 VII의 구조는 하기 화학식 VIII에 상응하는 것인 제조 방법:

    [화학식 VIII]
29. 제28항에 있어서, 화학식 VIII의 구조는

    로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
30. 제26항에 있어서, 화학식 VII의 구조는 하기 화학식 IX에 상응하는 것인 제조 방법:

    [화학식 IX]
31. 제30항에 있어서, 화학식 IX의 구조는

    로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제조 방법.
32. 하기 화학식 I의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 1,2-디아릴아민 함유 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 제1항의 화합물의 제조 방법:

    [화학식 I]

    상기 식에서,

    A는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;

    B는 경우에 따라 존재하고, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- -C(O)R"-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R")CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 이루어진 군에서 선택되는 링커이며, 여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;

    J는 이고,

    R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알크아릴, 치환된 알크아릴, 아르알킬 또는 치환된 아르알킬이고;

    R¹은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이고;

    R²는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산 또는 하나 이상의 뉴클레오티드이며;

    각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 함께 선택된 R³ 및 R⁴ 또는 함께 선택된 2개의 R³ 기는 경우에 따라 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
33. 제32항에 있어서, 화학식 I의 구조는 하기 화학식 II에 상응하는 것인 제조 방법:

    [화학식 II]
34. 제33항에 있어서, 화학식 II의 구조는 하기 화학식 III에 상응하는 것인 제조 방법:

    [화학식 III]

    상기 식에서, 각각의 R_a는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, -OR', -SR', -N(R')₂, -C(O)R' 또는 -C(O)OR'이고, 여기서 R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이다.
35. 제34항에 있어서, B는 결합인 제조 방법.
36. 제32항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, R¹은 하나 이상의 아미노산이고, R²는 하나 이상의 아미노산인 제조 방법.
37. 질병, 병태 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 질병, 병태 또는 질환은 치료적 폴리펩티드를 투여하여 치료가능하고, 상기 방법은 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 폴리펩티드의 변형된 형태의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 치료적 폴리펩티드는 상기 질병, 병태 또는 질환을 치료하는 치료 활성을 가지며, 상기 변형은 치료적 폴리펩티드의 변형된 형태의 치료 활성을 파괴하지 않고, 상기 치료적 폴리펩티드의 변형된 형태는 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 화합물 구조를 갖는 비천연 아미노산을 도입시킨 것이고, 상기 비천연 아미노산은 치료적 폴리펩티드 내 특정 부위에 존재하는 것인 치료 방법.
38. 제37항에 있어서, 각각의 R₃ 및 R₄는 결합인 치료 방법.
39. 제38항에 있어서, A 및 B는 결합인 치료 방법.
40. 제38항에 있어서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, B는 결합인 치료 방법.
41. 제38항에 있어서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, B는 -O-, -S- 또는 -N(R')-이고, R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬인 치료 방법.
42. 제38항에 있어서, Z는 하나 이상의 아미노산인 치료 방법.
43. 제38항에 있어서, Z는 형광성, 인광성, 화학발광성, 킬레이팅, 전자 밀집성, 자성, 인터컬레이팅, 방사성, 발색단 및 에너지 전이 부분으로 이루어진 군에서 선택된 검출가능 표지인 치료 방법.
44. 제38항에 있어서, X는 수용성 중합체인 치료 방법.
45. 제44항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리알킬렌 산화물 또는 치환된 폴리알킬렌 산화물을 포함하는 것인 치료 방법.
46. 제44항에 있어서, 수용성 중합체는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 20∼10,000임)를 포함하는 것인 치료 방법.
47. 제44항에 있어서, 수용성 중합체는 분자량이 약 2∼약 40 kDa 범위인 m-PEG인 치료 방법.
48. 제37항에 있어서, 치료적 폴리펩티드는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 치료 방법.
49. 환자에서 폴리펩티드의 변형된 형태의 존재를 검출하는 방법으로서, 폴리펩티드의 변형된 형태의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 변형은 폴리펩티드의 변형된 형태의 활성을 파괴하지 않으며, 상기 폴리펩티드의 변형된 형태는 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 화합물의 구조를 갖는 비천연 아미노산을 도입시킨 것이고, 상기 비천연 아미노산은 폴리펩티드 내 특정 부위에 존재하며, 상기 폴리펩티드의 비변형된 형태는 천연 발생 폴리펩티드 또는 치료적 폴리펩티드인 검출 방법.
50. 제49항에 있어서, 각각의 R₃ 및 R₄는 결합인 검출 방법.
51. 제50항에 있어서, A 및 B는 결합인 검출 방법.
52. 제50항에 있어서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, B는 결합인 검출 방법.
53. 제50항에 있어서, A는 페닐렌 또는 치환된 페닐렌이고, B는 -O-, -S- 또는 -N(R')-이고, R'은 H, 알킬 또는 치환된 알킬인 검출 방법.
54. 제50항에 있어서, Z는 하나 이상의 아미노산인 검출 방법.
55. 제50항에 있어서, Z는 형광성, 인광성, 화학발광성, 킬레이팅, 전자 밀집성, 자성, 인터컬레이팅, 방사성, 발색단 및 에너지 전이 부분으로 이루어진 군에서 선택된 검출가능 표지인 검출 방법.
56. 제50항에 있어서, X는 수용성 중합체인 검출 방법.
57. 제56항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리알킬렌 산화물 또는 치환된 폴리알킬렌 산화물을 포함하는 것인 검출 방법.
58. 제56항에 있어서, 수용성 중합체는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 20∼10,000임)를 포함하는 것인 검출 방법.
59. 제56항에 있어서, 수용성 중합체는 분자량이 약 2∼약 40 kDa 범위인 m-PEG인 검출 방법.
60. 제37항에 있어서, 폴리펩티드의 비변형된 형태는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 에리쓰로포이어틴, 상피세포 성장 인자, 과립구 세포 자극 인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론(IFN), 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 및 코르티코스테론으로 이루어진 군에서 선택된 치료적 폴리펩티드인 검출 방법.
61. 제49항에 있어서, 비천연 아미노산은 형광성인 검출 방법.
62. 제49항에 있어서, 비천연 아미노산의 측쇄는 하기 화학식 XXXVI의 구조에 상응하는 부분을 포함하는 것인 검출 방법:

    [화학식 XXXVI]
63. 제62항에 있어서, 화학식 XXXVI의 구조를 포함하는 폴리펩티드는 질병, 병태 또는 질환에 대한 바이오마커에 결합하는 것인 검출 방법.
64. 제63항에 있어서, 질환은 암인 검출 방법.