CN104244989A - 含有新颖前药的分子组合物和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新颖前药组合物和其用途。
Description
技术领域
本发明涉及含有新颖前药的分子(PDCM),其中所述PDCM包含一或多个含有至少一个非天然编码氨基酸的多肽。本发明大体上涉及使用化学以及重组DNA技术利用分子生物学方法制造和选择用于PDCM的多肽的领域。
背景技术
治疗性分子(如本文所述的那些)被称为含有前药的分子(PDCM)。PDCM包含一或多个含有至少一个非天然编码氨基酸的多肽。
前药包括(但不限于)生物活性母体化合物的化学衍生物,其在投与后最终在体内释放母体化合物。前药可允许技工修改药剂在体内的作用的起始和/或持续时间且可修改药物在体内的输送、分布、可溶性或稳定性以及生物可用性。此外,前药调配物可减小毒性和/或以其它方式克服在投与药物制剂时遇到的困难。一种策略是将药物掩盖为非活性前药,所述非活性前药利用目标细胞的一些特殊特性解除掩盖。丹米德S.R.(Denmeade,S.R.)等人,癌症研究(Cancer Research)58,2537-2540(1998)。
前药是母体或活性化合物的生物惰性或实质上非活性形式。活性药物的释放速率受到数种因素影响,包括(但不限于)键、连接基团或聚合物的类型、母体药物与改性剂的连接。这些前药应仅在体内转化成活性药物。一旦前药被注入患者,其就应有效转化成活性药物。必须注意避免制备在出现足够量的母体化合物水解之前例如经由肾脏或网状内皮系统消除的前药。
前药可能的生物活性母体化合物包括(但不限于)细胞毒性剂、多肽、酶、毒素、药物、放射性核素、抗病毒剂、诊断探针、显影剂以及其它通过从PDCM余部解离而活化的药剂。
细胞毒性剂的前药具有治疗性用途,因为其可将细胞毒性前药传递到特定细胞群体以实现以靶向方式酶促转化成细胞毒性药物。已出现许多针对用单克隆抗体药物结合物靶向肿瘤细胞的报导{塞拉(Sela)等人,免疫结合物(Immunoconjugates),第189-216页(C.沃格尔(C.Vogel)编1987);高斯(Ghose)等人,靶向药物(Targeted Drugs),第1-22页(E.戈德伯格(E.Goldberg)编1983);迪勒(Diener)等人,抗体介导的传递系统(Antibody Mediated Delivery Systems),第1-23页(J.罗德韦尔(J.Rodwell)编1988);彼得斯(Pietersz)等人,抗体介导的传递系统,第25-53页(J.罗德韦尔编1988);布莫(Bumol)等人,抗体介导的传递系统,第55-79页(J.罗德韦尔编1988);G.A.彼得斯(G.A.Pietersz)和K.克劳尔(K.Krauer),2药物靶向杂志(J.Drug Targeting),183-215(1994);R.V.J.夏里(R.V.J.Chari),31先进药物传递综述(Adv.Drug Delivery Revs.),89-104(1998);W.A.布莱特勒(W.A.Blattler)和R.V.J.夏里,抗癌剂,癌症化学疗法前沿(Anticancer Agents,Frontiersin Cancer Chemotherapy),317-338,ACS会议系列796(ACS Symposium Series796);和I.小岛(I.Ojima)等人编,美国化学协会(American Chemical Society)2001}。细胞毒性药物如甲氨蝶呤(methotrexate)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、刺孢霉素(calicheamicin)以及美登醇(maytansinoid)已偶联到多种鼠类单克隆抗体。在一些情况下,药物分子经由如血清白蛋白的中间载体分子与抗体分子连接{伽里特(Garnett)等人,46癌症研究(Cancer Res.)2407-2412(1986);大川(Ohkawa)等人,23癌症免疫与免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.)81-86(1986);远藤(Endo)等人,47癌症研究1076-1080(1980)}、葡聚糖{赫维茨(Hurwitz)等人,2应用生物化学(Appl.Biochem.)25-35(1980);马纳比(Manabi)等人,34生物化学药理学(Biochem.Pharmacol.)289-291(1985);迪尔曼(Dillman)等人,46癌症研究4886-4891(1986);和绍瓦勒(Shoval)等人,85美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)8276-8280(1988)}或多聚谷氨酸{冢田(Tsukada)等人,73国家癌症学会杂志(J.Natl.Canc.Inst.)721-729(1984);加藤(Kato)等人,27医药化学杂志(J.Med.Chem.)1602-1607(1984);冢田等人,52英国癌症杂志(Br.J.Cancer)111-116(1985)}。一系列广泛的连接基团可用于制备这类免疫结合物,包括可裂解和非可裂解连接基团两者。
螯合为前药的药剂包括多肽。所述多肽可包含一或多个非天然编码氨基酸。多肽可螯合为前药,从而例如调节多肽的释放、将多肽靶向特定细胞类型或实现其它所需结果。靶向需要在所需条件下(包括(但不限于)在所需部位处)产生治疗有效量的活性药物的方式。
多种多肽可与前药连接以将前药的母体或活性化合物传递到所需目标。所述多肽包括(但不限于)具有已知结合特异性的靶向药剂如抗原结合多肽(ABP)、肽和多肽。根据所选细胞结合剂所结合的细胞类型,可在体内、离体或体外治疗许多疾病。所述疾病包括(但不限于)癌症,包括淋巴瘤、白血病、肺癌、乳房癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰脏癌等。
前药的释放可通过许多方式实现,包括(但不限于)暴露于生理条件,通过酶促裂解(包括(但不限于)利用由特定细胞类型分泌或表达的酶,利用通过诱导表达或过度表达的酶),或通过暴露于特定条件或药剂实现。作为PDCM的一部分的连接基团或聚合物可变得不稳定且自身从活性化合物解离。PDCM中存在的键可能不稳定且在所需条件下释放活性化合物。
共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)是一种增加许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)的水溶性、生物可用性、增加其血清半衰期、增加其治疗半衰期、调节其免疫原性、调节其生物活性或延长其循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。为了使PEG的所需特性最大化,与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高,以便赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征,如增加的水溶性和循环半衰期,同时不会不利地影响母体分子的生物活性。
PEG衍生物时常经由反应性化学官能团(如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N端和碳水化合物部分)与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的反应性位点可供聚合物连接。通常,最适于经由聚合物连接而修饰的位点在受体结合中起到重要作用,并且是保留分子的生物活性所必需的。因此,聚合物链与生物活性分子上此类反应性位点的不加选择的连接常常导致经聚合物修饰的分子的生物活性明显减少或甚至全部丧失。R.克拉克(R.Clark)等人,(1996),生物化学杂志(J.Biol. Chem.),271:21969-21977。为形成聚合物分子量足够赋予目标分子所需优势的结合物,背景技术方法通常涉及大量聚合物臂与分子的无规连接,由此增加母体分子的生物活性减少或甚至完全丧失的风险。
形成用于将PEG衍生物与蛋白质连接的基因座的反应性位点受蛋白质结构支配。蛋白质(包括酶)是由各种α-氨基酸序列构成,这些序列的一般结构为H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(--COOH)连接形成酰胺键,其可表示为--(NH--CHR--CO)n--,其中下标“n”可等于数百或数千。R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。
举例来说,在氨基酸赖氨酸的情况下,在ε位置以及α位置中存在--NH2部分。ε-NH2在碱性pH条件下自由反应。用PEG进行蛋白质衍生化领域中的很多技术都是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH2部分的PEG衍生物。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives forAdvanced PEGylation)”,奈克塔分子工程目录(Nektar Molecular EngineeringCatalog),2003,第1-17页。然而,这些PEG衍生物都具有共有的局限性,即,无法将其选择性地安装于蛋白质表面上存在的常见的多种赖氨酸残基上。在赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下,或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下,如在受体结合位点的情况下,这将会成为显著的局限性。
用于蛋白质聚乙二醇化的现有方法的第二同样重要的新增问题在于:除所需反应之外,PEG衍生物可经历与残基的不合需要的副反应。组氨酸含有结构以--N(H)--表示的反应性亚氨基部分,而许多与ε-NH2反应的化学反应性物质也可与--N(H)--反应。类似地,氨基酸半胱氨酸的侧链带有游离硫氢基,结构上表示为-SH。在一些情况下,针对赖氨酸ε--NH2基团的PEG衍生物还与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可产生经PEG衍生化的生物活性分子的复杂不均匀混合物,并且有破坏作为目标的生物活性分子活性的风险。需要开发出这样的PEG衍生物,其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团,随后使一或多种PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定且可预测的特定位点与生物活性分子选择性偶联。
除赖氨酸残基外,此项技术中还曾就开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N端)的活性PEG试剂进行了大量尝试。例如,参看以引用的方式并入本文中的美国专利第6,610,281号,以及“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物”,奈克塔分子工程目录,2003,第1-17页。可以使用定点诱变和此项技术中已知的其它技术,将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中,并且可使由此得到的游离硫氢基部分与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦,因为引入游离硫氢基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此,需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方式,其能使一或多种PEG聚合物与蛋白质选择性偶联,同时还与硫氢基以及蛋白质中常见的其它化学官能团相容(即,不会与之发生不当副反应)。
从此项技术的抽样(sampling)中可以了解到,所开发的用于连接蛋白质侧链,尤其赖氨酸氨基酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的许多此类衍生物都证实在其合成和使用方面存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键,这些键将经历水解,并因此分解、降解,或者另外在水性环境(例如血流)中不稳定。一些衍生物可形成较为稳定的键,但会在形成键之前经历水解,这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物略带毒性,因此不太适于体内使用。一些衍生物反应过慢而无法实际使用。一些衍生物会因连接到负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性,这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果的可再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的挑战,已开发出更稳定(例如,美国专利6,602,498,其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如,美国专利6,610,281,其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。此项技术中无疑需要在生理环境中具化学惰性,而只有在需要的情况下才选择性反应形成稳定化学键的PEG衍生物。
近来,在蛋白质科学中已报导一种全新的技术,其有望克服与蛋白质的位点特异性修饰相关的许多局限性。具体点说,已将新的组分加入到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)(例如L.王(L.Wang)等人,(2001),科学(Science)292:498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia,S.cerevisiae)(例如J.秦(J.Chin)等人,科学301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中,使得所述机器能够在体内将非基因编码氨基酸并入蛋白质中。已经使用此方法将多种具有新颖化学、物理或生物学特性的新氨基酸,包括光亲和标记和可光异构化氨基酸、光交联氨基酸(参见例如秦J.W.(Chin,J.W.)等人(2002)美国国家科学院院刊,99:11020-11024;和秦J.W.等人,(2002)美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)124:9026-9027)、酮氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸有效地且高保真地并入大肠杆菌中和酵母中响应于琥珀密码子(TAG)的蛋白质中。参见例如J.W.秦(J.W.Chin)等人,(2002),美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)124:9026-9027;J.W.真和P.G.舒尔茨(P.G.Schultz),(2002),化学生物化学(ChemBioChem)3(11):1135-1137;J.W.秦等人,(2002),美国国家科学院院刊(PNAS United States of America)99:11020-11024;和L.王和P.G.舒尔茨,(2002),化学通讯(Chem.Comm.),1:1-11。所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实,有可能选择性地以常规方式引入未见于蛋白质中、对可见于20种常见的基因编码氨基酸中的所有官能团具化学惰性且可用于有效选择性反应而形成稳定共价键的化学官能团,如酮基、炔基和叠氮部分。
将非基因编码的氨基酸并入到蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在的官能团(如赖氨酸的ε--NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值的替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对见于20种常见的基因编码氨基酸中的官能团是惰性的但完全且有效地反应以形成稳定的键。例如此项技术中已知,叠氮基和乙炔基在催化量铜存在下,可在水性条件中进行胡伊斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应。例如,参见托尔诺(Tornoe)等人,(2002)有机化学杂志(J.Org.Chem.)67:3057-3064;和罗斯托夫采夫(Rostovtsev)等人,(2002)应用化学国际版(Angew.Chem. Int.Ed.)41:2596-2599。举例来说,通过将叠氮部分引入蛋白质结构中,能够并入对见于蛋白质中的胺、硫氢基、羧酸、羟基呈化学惰性但也与乙炔部分平稳并有效地反应以形成环加成产物的官能团。重要的是,在不存在乙炔部分的情况下,叠氮基在其它蛋白质侧链存在下且在生理条件下保持化学惰性,而且不发生反应。
本发明尤其解决与PDCM的活性和制造相关的问题并且还解决生物学或药理学特性改良的PDCM的制造。
发明内容
本发明提供含有前药的分子(PDCM),其包含一或多个含有一或多个非天然编码氨基酸的多肽。在一些实施例中,PDCM是具有通式A-L-B的化合物,其中:A代表包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽;L代表连接基团或聚合物;且B代表可分离的分子。在一些实施例中,PDCM是具有通式A::B的化合物,其中:A代表包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽;“::”代表B的官能团与A中存在的非天然氨基酸之间的键;且B代表可分离的分子。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含完整抗体重链。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含完整抗体轻链。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含抗体轻链的可变区。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含抗体重链的可变区。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含抗体轻链的至少一个CDR。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含抗体重链的至少一个CDR。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含轻链的至少一个CDR和重链的至少一个CDR。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含Fab。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含两个或两个以上Fab'。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含scFv。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含两个或两个以上scFv。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含微抗体。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含两个或两个以上微抗体。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含双功能抗体。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含两个或两个以上双功能抗体。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含轻链的可变区和重链的可变区。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含完整轻链和完整重链。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含一或多个Fc域或其部分。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含以上实施例中的任一者的组合。在一些实施例中,PDCM包含以上实施例中的任一者的同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。
PDCM的多肽组分可为任何长度的多肽,包括(但不限于)源于胰高血糖素基因的多肽,如GLP-1、T-20多肽和肽YY肽,其包含一或多个非天然编码氨基酸。本发明可使用具有治疗活性的任何多肽、片段、类似物或其变异体。已提供可用于本发明的多肽的大量实例。然而,所提供的清单并非穷举性的且不以任何方式限制可用于本发明的多肽的数目或类型。因此,从任何多肽(包括新颖多肽)制造的任何多肽和/或片段、类似物和变异体可根据本发明修饰且以治疗方式使用。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸用连接基团连接于水溶性聚合物。在一些实施例中,非天然编码氨基酸用可生物降解的连接基团或前药连接于水溶性聚合物。在一些实施例中,非天然编码氨基酸连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中,非天然编码氨基酸利用连接基团连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中,非天然编码氨基酸利用聚合物、聚(乙二醇)连接基团、另一分子或前药连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中,非天然编码氨基酸连接于血清白蛋白。在一些实施例中,非天然编码氨基酸利用连接基团、聚合物、另一分子或前药连接于血清白蛋白。在一些实施例中,连接基团是前药。在一些实施例中,连接基团为两次裂解(dual cleavage)的前药,其中第1步骤为如白蛋白的分子的控制释放并且第2步骤为释放连接基团或其部分的第二次裂解。在一些实施例中,非天然编码氨基酸用连接基团连接于生物活性分子。在一些实施例中,非天然编码氨基酸用可生物降解的连接基团或前药连接于生物活性分子。
在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含一或多个翻译后修饰。在一些实施例中,PDCM的多肽组分连接于连接基团、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中,PDCM的多肽组分连接于双官能聚合物、双官能连接基团或至少一个其它分子。在一些实施例中,包含非天然编码氨基酸的PDCM的多肽组分连接于一或多个也可包含非天然编码氨基酸的其它多肽。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸连接于连接基团、聚合物、水溶性聚合物、分子或直接连接于前药组分。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中,聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。在一些实施例中,双官能聚合物连接于第二多肽。
在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分或生物活性分子的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中,至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
在一些实施例中,PDCM包含多肽,所述多肽至少含有利用双官能连接基团连接于分子的非天然编码氨基酸。双官能连接基团可在每一端处具有相同或不同的反应性基团。与多肽或与分子形成的键在某些条件下可能是可降解或不稳定的。PDCM的活性化合物可在包括(但不限于)酸性pH值、酶的存在和活性、辐射、生理条件等的条件下释放。连接基团可具有广泛范围的分子量或分子长度。较大或较小分子量的连接基团可用于提供多肽与所连接实体之间的所需空间关系或构象。具有较长或较短分子长度的连接基团也可用于提供多肽与所连接实体之间的所需空间或柔性。类似地,可利用具有特定形状或构象的连接基团在PDCM到达其目标之前或之后赋予多肽或所连接实体以特定形状或构象。对多肽与所连接实体之间的空间关系的此优化可为分子提供新的经调节的或所需特性。
在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的亲和力相比时调节PDCM的多肽组分对抗原、其目标或结合蛋白的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的稳定性相比时提高PDCM的多肽组分的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的免疫原性相比时调节PDCM的多肽组分的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的血清半衰期或循环时间相比时调节PDCM的多肽组分的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分相比时提高PDCM的相应多肽组分的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的可溶性相比时提高宿主细胞中产生的PDCM的多肽组分的可溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的表达或合成相比时提高宿主细胞中PDCM的多肽组分的表达或提高体外合成的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的蛋白酶抗性相比时提高PDCM的多肽组分的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,PDCM的多肽组分包含在与无取代、添加或缺失的PDCM的相应多肽组分的蛋白酶抗性相比时降低PDCM的多肽组分的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。
本发明的PDCM的特征可不同于其单独多肽组分的特征。可改变的特征包括(但不限于)对抗原、目标或结合蛋白的亲和力;稳定性;免疫原性;血清半衰期;循环时间;水溶性;在宿主细胞中的表达;蛋白酶抗性;和定位在特定部位处的能力。
在一些实施例中,PDCM的多肽组分中的氨基酸取代可以天然存在或非天然存在的氨基酸进行,其限制条件为至少一个取代是以非天然编码氨基酸进行。
在一些实施例中,并入PDCM的多肽组分中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含胺基。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基;且R3为H、氨基酸、多肽,或氨基端修饰基团;且R4为H、氨基酸、多肽,或羧基端修饰基团。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团;且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团,且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中,PDCM或PDCM的多肽为激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中,激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中,激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸和一或多个翻译后修饰、连接基团、聚合物或生物活性分子。
本发明还提供经分离核酸,其包含编码PDCM的多肽组分的多核苷酸,所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中,选择密码子选自由以下各项组成的群组:琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子。
本发明还提供制造PDCM的方法。在一些实施例中,所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的经分离多肽与包含与非天然编码氨基酸反应的部分的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子接触。在一些实施例中,并入PDCM的多肽组分中的非天然编码氨基酸对否则不能与20种常见氨基酸中的任一者反应的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子具有反应性。在一些实施例中,并入PDCM的多肽组分中的非天然编码氨基酸对否则不能与20种常见氨基酸中的任一者反应的连接基团、聚合物或生物活性分子具有反应性。
在一些实施例中,使包含含羰基氨基酸的多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子反应以形成PDCM。在一些实施例中,氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中,通过使包含羰基的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子与包含包括氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制造PDCM。
在一些实施例中,使包含含炔烃氨基酸的多肽与包含叠氮部分的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子反应以形成PDCM。在一些实施例中,叠氮基或炔基经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中,使包含含叠氮基氨基酸的多肽与包含炔烃部分的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子反应以形成PDCM。在一些实施例中,叠氮基或炔基经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。
在一些实施例中,使包含含芳香胺氨基酸的多肽与包含醛部分的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子反应以形成PDCM。在一些实施例中,使包含含醛氨基酸的多肽与包含芳香胺部分的连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子反应以形成PDCM。
在一些实施例中,水溶性聚合物是聚(乙二醇)。在一些实施例中,聚(乙二醇)分子的分子量在约0.1kDa与约100kDa之间。在一些实施例中,聚(乙二醇)分子的分子量在0.1kDa与50kDa之间。
在一些实施例中,聚(乙二醇)分子是分支聚合物。在一些实施例中,聚(乙二醇)分支聚合物的每一分支的分子量在1kDa与100kDa之间或在1kDa与50kDa之间。
本发明还提供PDCM与医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中,PDCM的多肽组分的非天然编码氨基酸与连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子连接。
本发明还提供包含编码PDCM的多肽组分的包含选择密码子的多核苷酸的细胞。在一些实施例中,所述细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代到PDCM的多肽组分中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制造包含非天然编码氨基酸的PDCM的多肽组分的方法。在一些实施例中,所述方法包含在允许PDCM的多肽组分表达的条件下培养包含编码PDCM的多肽组分的一或多个多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞;并且从所述细胞和/或培养基中纯化所述PDCM的多肽组分。
本发明还提供延长前药、PDCM或PDCM的多肽组分的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供调节前药、PDCM或PDCM的多肽组分的免疫原性的方法。在一些实施例中,所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在的多肽中的任何一或多个氨基酸和/或使多肽与连接基团、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
本发明还提供用有效量的本发明的PDCM、PDCM的多肽组分或作为PDCM组分的生物活性分子治疗需要所述治疗的患者的方法。在一些实施例中,所述方法包含对患者投与治疗有效量的医药组合物,所述医药组合物包含PDCM、PDCM的多肽组分或作为PDCM组分的生物活性分子以及医药学上可接受的载剂。在一些实施例中,PDCM的多肽组分的非天然编码氨基酸与连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子连接。
在一些实施例中,PDCM的多肽组分的非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中,水溶性聚合物是通过糖部分与多肽连接。在一些实施例中,连接基团、聚合物或生物活性分子通过糖部分与多肽连接。
本发明还提供一种PDCM,其包含通过共价键在单个氨基酸处与PDCM的多肽组分连接的水溶性聚合物。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中,与水溶性聚合物共价连接的氨基酸是PDCM的多肽组分中存在的非天然编码氨基酸。
本发明提供一种包含至少一个连接基团、聚合物或生物活性分子的PDCM,其中所述连接基团、聚合物或生物活性分子通过以核糖体方式并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与多肽连接。在一些实施例中,所述多肽经单聚乙二醇化。本发明还提供一种PDCM,其包含与一或多个非天然编码氨基酸连接的连接基团、聚合物或生物活性分子,其中所述非天然编码氨基酸在预先选择的位点处以核糖体方式并入多肽组分中。
附图说明
图1-展示抗体分子(IgG)和其抗原结合部分的一般结构的图式。CDR含在抗原识别位点内。
图2-展示用于scFv的周质(图2,图A)和细胞质(图2,图B)表达/抑制的构建体。指示了琥珀终止密码子的位置。展示用于Fab-108片段的表达/抑制的双顺反子盒(图2,图C)。
图3-展示GlySer连接基团(S131Am)的第二丝氨酸中的琥珀突变的抑制(图3,图A)和相应的含pAF的scFv的IMAC纯化的分析(图3,图B)。
图4-展示在scFv的细胞质表达期间VL链中琥珀突变(L156)的抑制。
图5-pAF-scFv-108片段的聚乙二醇化和二聚化展示在图5的图A中。图5的图B展示未观察到野生型scFv片段的聚乙二醇化。
图6-含pAF或PEG的scFv蛋白质与表达EGF受体的A431细胞的结合展示在图6的图A-C中。
图7-含有pAF的Fab片段的结合展示在图7的图A-B中。
图8-展示异质双官能抗原结合多肽(ABP)的实例。
图9-展示其中scFv与喜树碱连接的PDCM的图式。展示喜树碱的控制释放。
图10的图A和图B-展示各自具有连接两个多肽的双官能连接基团(L)的两个PDCM的图式。
图11-图式展示多肽经由可降解连接基团与PEG连接。aAx代表肽GLP-1中的非天然编码氨基酸取代。
图12-展示使用非天然编码氨基酸的前药策略。
图13-图式展示多肽从白蛋白的控制释放。aAx代表多肽中的非天然编码氨基酸取代。
图14-展示两次裂解前药连接基团。
图15-展示其中抗体或载体蛋白质经由非天然编码氨基酸与药物连接的PDCM的图式。药物释放速率可利用X、Y和n的不同组合控制。
图16-展示其中scFv与喜树碱连接的PDCM的图式。展示喜树碱的控制释放。
图17-展示葡萄糖触发的胰岛素释放的模型。
图18-展示涉及芳基硼酸酯的葡萄糖触发的胰岛素释放的策略。
图19-展示涉及氧代半缩醛的葡萄糖触发的胰岛素释放的策略。
具体实施方式
定义
应了解,本发明不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂,且因此可变化。还应了解,本文中使用的术语只是出于描述特定实施例的目的,而不是打算限制本发明的范围,本发明的范围应仅受随附权利要求书限制。
除非上下文另作明确指示,否则如本文和随附权利要求书中所使用,单数形式“一”和“所述”包括多个提及物。因此,举例来说,提及“抗原结合多肽”或“ABP”就是提及一或多种这类蛋白质并且包括所属领域的技术人员已知的其等效物等。
除非另外规定,否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解相同的含义。尽管可使用与本文中所述相似或相同的任何方法、装置和材料来实施或测试本发明,但现描述优选方法、装置和材料。
出于所有目的,包括描述和揭示例如可以与现在所描述的发明联合使用的公开案中所描述的构建体和方法的目的,本文中所提到的所有出版物和专利以引用的方式并入本文中。提供本文中所讨论的公开案仅仅是因为其揭示内容在本申请案的申请日期之前。本文决不应解释为承认本发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
术语“实质上纯化”是指PDCM的多肽组分或其变异体可实质上或基本上不含PDCM的多肽组分天然存在环境(即天然细胞,或者在重组产生多肽的情况下为宿主细胞)中存在的PDCM的多肽组分通常所伴随的组分或与所述PDCM的多肽组分相互作用的组分。可实质上不含细胞物质的PDCM的多肽组分或其变异体包括污染蛋白质小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%(以干重计)的多肽或其变异体的制剂。当多肽或其变异体通过宿主细胞重组产生时,所述多肽或其变异体可以按细胞干重的约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或1%以下存在。当多肽组分或其变异体通过宿主细胞重组产生时,所述蛋白质可以细胞干重计按约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或1mg/L以下存在于培养基中。因此,如由本发明的方法所产生的“实质上纯化”的多肽或其变异体可具有如由适当方法(如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定的至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度水平,尤其至少约75%、80%、85%的纯度水平,且更尤其至少约90%的纯度水平、至少约95%的纯度水平、至少约99%或更大的纯度水平。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞,不管用于插入的方法如何,例如直接摄取、转导、f配对,或此项技术中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法。外源多核苷酸可以保持为非整合载体(例如质粒)的形式,或者可被整合到宿主基因组中。
如本文中使用的术语“培养基”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物,其可支撑或含有任何宿主细胞,包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核生物宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内容物。因此,所述术语可涵盖宿主细胞已生长于其中的培养基,例如,多肽或其变异体己分泌于其中的培养基,包括在增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语还可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂,如在细胞内产生多肽或其变异体和溶解或破坏宿主细胞以释放多肽或其变异体的情况下。
本文中提到蛋白质再折叠时使用的“还原剂”定义为使硫氢基保持还原态,并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。适当还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员易于了解,多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文中关于蛋白质再折叠所用的“氧化剂”定义为能够从经氧化化合物移除电子的任何化合物或物质。适当氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化的二硫苏糖醇、氧化的赤藓醇和氧。所属领域技术人员易于了解,多种氧化剂适用于本发明的方法中。
如本文中所用的“变性剂”定义为将引起蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度决定。适合的变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。适当离液剂包括(但不限于)脲、胍和硫代氰酸钠。有用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂,如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如,Tween或Triton清洁剂)、月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl);温和的非离子型清洁剂(例如,毛地黄皂苷(digitonin));温和的阳离子型清洁剂,例如N->2,3-(二油酰基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵;温和的离子型清洁剂(例如,胆酸钠或去氧胆酸钠);或两性离子型清洁剂,包括(但不限于)硫代甜菜碱(sulfobetaine)(两性离子清洁剂(Zwittergent))、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。可以使用水可混溶的有机溶剂作为变性剂,如乙腈、低碳烷醇(尤其是C2-C4烷醇,如乙醇或异丙醇),或低碳烷二醇(尤其是C2-C4烷二醇,如乙二醇)。适用于本发明中的磷脂可为天然存在的磷脂,如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇,或合成磷脂衍生物或变异体,如二己酰磷脂酰胆碱或二庚酰磷脂酰胆碱。
如本文中使用的“再折叠”描述将含有二硫键的多肽从不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠构象的任何过程、反应或方法。
如本文中使用的“共折叠”特别指使用至少两个彼此相互作用的多肽且使展开或不恰当折叠的多肽转变成天然的适当折叠的多肽的再折叠过程、反应或方法。
PDCM的多肽组分可为包含一或多个非天然编码氨基酸的任何长度的多肽。描述多肽的非限制性实例。PDCM的多肽组分可为已知肽或蛋白质。在一些实施例中,PDCM的多肽组分是新颖肽或蛋白质。在一些实施例中,PDCM的多肽组分具生物活性。在一些实施例中,PDCM的多肽组分一旦从PDCM的余部释放即具生物活性。在一些实施例中,PDCM的多肽组分在从PDCM的余部释放之前、期间或之后经修饰。在一些实施例中,PDCM的多肽组分在从PDCM的余部释放之前、期间或之后经修饰且在其经修饰状态具生物活性。
在一些实施例中,与PDCM的多肽组分连接的一或多个分子具生物活性。在一些实施例中,一旦与PDCM的多肽组分连接的分子从PDCM的多肽组分释放,所述与PDCM的多肽组分连接的分子即具生物活性。在一些实施例中,与PDCM连接的分子在从PDCM的多肽组分释放之前、期间或之后经修饰。在一些实施例中,与PDCM的多肽组分连接的分子在从PDCM的多肽组分释放之前、期间或之后经修饰且在这种经修饰状态具生物活性。
分子可经由连接基团、聚合物或其它分子与PDCM的多肽组分连接。连接基团、聚合物或其它分子中的部分、所有或无一者可有助于PDCM的其它组分(包括(但不限于)PDCM中的多肽和其它分子)的改变。连接基团、聚合物或其它分子作为PDCM的一部分可能具或可能不具生物活性。连接基团、聚合物或其它分子在PDCM的组分以任何方式释放或修饰之后可能具或可能不具生物活性。
PDCM的多肽组分的非限制性实例包括抗体、抗体片段和抗原结合多肽(ABP)。抗体是对特定抗原展现结合特异性的蛋白质。天然抗体通常是约150,000道尔顿的异型四聚物糖蛋白,由两个一致轻链(L)和两个一致重链(H)构成。每一轻链经由一个共价二硫键与重链连接,而不同免疫球蛋白同型的重链之间二硫键的数量不同。每一重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫桥。每一重链的一端具有一可变域(VH),接着为多个恒定域。各轻链在一端具有可变域(VL)且在另一端具有恒定域;轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准,且轻链可变域与重链的可变域对准。特定氨基酸残基被认为可形成轻链与重链可变域之间的界面。由约110个氨基酸残基组成的各域是折叠成由两个彼此堆叠的β-折叠形成的特征性β-夹层结构,即免疫球蛋白折叠。VL域各自具有三个互补决定区(CDR1-3)且VH域各自具有多达四个互补决定区(CDR1-4),所述互补决定区为在域的一端连接β链的环或转角。轻链和重链的可变区通常对抗原特异性有贡献,但个别链对特异性的贡献不必相同。抗体分子已发展到通过使用随机CDR环与大量分子结合。
使用Ig VH域的一部分作为模板设计被称为“微抗体”的小蛋白质骨架(佩西(Pessi)等人,1993,自然(Nature)362,367-369)。通过使对应于VH的CDR1和CDR2的环随机化,且然后使用噬菌体呈现方法选择突变体而鉴别出对白介素-6具有高亲和力(解离常数(Kd)为约10-7M)的微抗体(马丁(Martin)等人,1994,欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)13,5303-5309)。
当分析来自骆驼血清的IgG样物质时,骆驼通常缺乏可变轻链域,这提示足够的抗体特异性和亲和力可能仅源自VH域(三个或四个CDR环)。已制备出具有高亲和力的“骆驼化”VH域,且通过仅随机化CDR3可产生高特异性。
“微抗体”的替代物是“双功能抗体”。双功能抗体是具有两个抗原结合位点的小型二价且具双特异性的抗体片段。所述片段包含连接到同一多肽链上的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)(VH-VL)。双功能抗体的大小与Fab片段类似。通过使用太短而不允许在同一链上的两个域之间配对的连接基团,迫使所述域与另一链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚抗体片段或“双功能抗体”是二价的且具双特异性。参见P.霍利格尔(P.Holliger)等人,美国国家科学院院刊(PNAS)90:6444-6448(1993)。
已制得CDR肽和有机CDR模拟物(杜格尔(Dougall)等人,1994,生物技术趋势(Trends Biotechnol.)12,372-379)。CDR肽是对应于抗体的CDR环的氨基酸序列的通常为环状的短肽。CDR环会引起抗体-抗原相互作用。已显示CDR肽和有机CDR模拟物保留某种结合亲和力(史密斯(Smyth)和冯伊兹施泰因(von Itzstein),1994,美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)116,2725-2733)。已在不损失亲和力的情况下将小鼠CDR移植到人类Ig构架上(琼斯(Jones)等人,1986,自然321,522-525;里希曼(Riechmann)等人,1988)。
可潜在地充当蛋白质骨架的许多蛋白质域已表达为与噬菌体衣壳蛋白质的融合体。综述见于克拉克森(Clackson)和威尔斯(Wells),生物技术趋势12:173-184(1994)中。这些蛋白质域中的数种已用作呈现随机肽序列的骨架,包括牛胰脏胰蛋白酶抑制剂(罗伯茨(Roberts)等人,美国国家科学院院刊89:2429-2433(1992))、人类生长激素(洛曼(Lowman)等人,生物化学(Biochemistry)30:10832-10838(1991))、文图里尼(Venturini)等人,蛋白质肽通讯(Protein Peptide Letters)1:70-75(1994))以及链球菌的IgG结合域(奥尼尔(O'Neil)等人,蛋白质化学中的技术V(Techniques in Protein Chemistry V)(克拉布L(Crabb,L)编)第517-524页,学术出版社(Academic Press),圣地亚哥(San Diego)(1994))。这些骨架已呈现单一随机化环或区。淀粉酶抑肽(Tendamistat)已用于丝状噬菌体M13上的呈递骨架(麦康内尔(McConnell)和赫斯(Hoess),1995,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)250:460-470)。
术语“可变”是指可变域中某些部分的序列在抗体间差别极大,并且负责各特定抗体对其特定抗原的结合特异性的事实。然而,可变性并不是均匀分布于整个抗体可变域中。而是集中于轻链和重链可变域中三个称为互补决定区(CDR)的区段中。可变域中保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个大部分采用β折叠构型的由三个或四个CDR连接的FR区,其形成环接,且在一些情况下形成部分β折叠结构。各链中的CDR通过FR区而紧密地保持在一起,并与来自另一链的CDR一起帮助形成抗体的抗原结合位点(参见卡贝特(Kabat)等人,免疫相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,美国国立卫生研究院公共卫生部(Public Health Service,National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD.)(1991))。
恒定域并不直接涉及抗体与抗原的结合,但是表现出各种效应子功能。视重链恒定区的氨基酸序列而定,可将抗体或免疫球蛋白指定为不同种类。存在五类主要免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且其中有几类可以进一步划分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4;IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。在各种人类免疫球蛋白类别中,仅已知人IgG1、IgG2、IgG3和IgM可活化补体。
在体内,特异性Ab从大型文库选择并扩增(亲和力成熟)。这些过程可在体外使用组合文库技术重现。Ab片段在噬菌体表面上的成功呈现使得有可能产生和筛选大量CDR突变(麦克卡福提(McCafferty)等人,1990,自然348,552-554;巴贝斯(Barbas)等人,1991,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88,7978-7982;温特(Winter)等人,1994,免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)12,433-455)。通过这种技术产生数目增加的Fab和Fv(和其衍生物)。这种组合技术可与Ab模拟技术组合。
在体内,抗体的亲和力成熟受较高亲和力抗体变异体的抗原选择所驱动,所述较高亲和力抗体变异体主要是通过体细胞超突变而制得。在二级或三级反应的优势生殖系基因看起来不同于一级或二级反应的生殖系基因时,常常会发生“谱系移位(repertoire shift)”。
可以通过体外向抗体基因中引入突变且使用亲和选择法分离具有改进亲和力的突变体来复制免疫系统的亲和力成熟过程。可以将这些突变抗体呈现于丝状噬菌体或如酵母等微生物的表面上,并且可根据对抗原的亲和力或与抗原的解离动力学(解离速率)来选择抗体。霍金斯(Hawkins)等人分子生物学杂志226:889-896(1992)。已经采用CDR步移诱变(walking mutagenesis)来使结合人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的人包膜糖蛋白gp120的人类抗体(巴贝斯三世(Barbas III)等人美国国家科学院院刊91:3809-3813(1994);和杨(Yang)等人分子生物学杂志254:392-403(1995))和抗c-erbB-2单链Fv片段(希尔(Schier)等人分子生物学杂志263:551567(1996))亲和力成熟。已使用抗体链改组和CDR诱变使针对HIV第三高变环的高亲和力人类抗体亲和力成熟(辛普森(Thompson)等人,分子生物学杂志256:77-88(1996))。巴林特(Balint)和拉里克(Larrick)基因(Gene)137:109-118(1993)描述计算机辅助的寡脱氧核苷酸引导的扫描诱变,进而同时且彻底地搜索可变区基因的所有CDR的改进变体。使用起始有限诱变策略使αvβ3特异性人类化抗体亲和力成熟,其中所有六个CDR的每个位置均突变,接着表达并筛选包括最高亲和力突变体的组合文库(吴(Wu)等人美国国家科学院院刊95:6037-6-42(1998))。查斯维尔(Chiswell)和麦克卡福提,生物技术趋势(TIBTECH)10:80-84(1992);以及雷德尔(Rader)和巴贝斯三世(Barbas III)现代生物技术观点(Current Opinionin Biotech.)8:503-508(1997)中概述了噬菌体呈现的抗体。上述参考文献中报导,在具有提高的亲和力的突变抗体与亲本抗体相比的各情况下,突变抗体在CDR中具有氨基酸取代。
本文中“亲和力成熟”是指增强抗体与其抗原亲和力的过程。使亲和力成熟的方法包括(但不限于)计算机筛选方法和实验方法。
本文中“抗体”是指由一或多个实质上由所有或部分抗体基因编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白基因包括(但不限于)κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及多个免疫球蛋白可变区基因。本文中的抗体拟包括全长抗体和抗体片段,并且包括任何生物体中天然存在的或经过工程改造(例如变异体)的抗体。
“抗体片段”是指除全长形式之外的任何形式抗体。本文中的抗体片段包括作为存在于全长抗体内的较小组分的抗体,以及经过工程改造的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab')2、单链Fv(scFv)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双功能杂交抗体等(梅纳德(Maynard)和乔治乌(Georgiou),2000,生物医学工程年评(Annu.Rev.Biomed.Eng.)2:339-76;赫德森(Hudson),1998,现代生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol.)9:395-402)。
本文中“计算筛选法”是指在蛋白质中设计一或多个突变的任何方法,其中所述方法采用计算机来评估潜在氨基酸侧链彼此取代的相互作用和/或与蛋白质余部相互作用的能量。
可通过蛋白分解和通过重组方法制备Ab的功能性子结构。所述子结构包括包含通过单一链间双硫键连接的重链的VH-CH1域和轻链的VL-CL1域的Fab片段和仅包含VH和VL域的Fv片段以及包含分子的非抗原结合区的Fc部分。在一些情况下,单一VH域保留显著的对抗原的亲和力(沃德(Ward)等人,1989,自然341,554-546)。也已经显示某些单聚κ轻链应特异性地结合于其抗原。(L.马萨特(L.Masat)等人,1994,美国国家科学院院刊91:893-896)。发现分离的轻链或重链有时也保留某种抗原结合活性(沃德等人,1989,自然341,554-546)。
另一功能子结构是包含经由肽连接基团共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的单链Fv(scFv)(S-z胡(S-z Hu)等人,1996,癌症研究(Cancer Research),56,3055-3061)。这些小(Mr 25,000)蛋白质通常保留对单一多肽中的抗原的特异性和亲和力且可对较大的抗原特异性分子提供便利的结构单元。在多种情况下,scFv在循环中的短半衰期限制其治疗效用。
本文中“Fc”是指包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)的抗体部分。Fc还可包括存在于Cγ2与Cγ1(Cγ1)之间N端铰链内的任何残基。Fc可指独立的这种区或抗体或抗体片段情况下的这种区。Fc还包括Fc的任何修饰形式,包括(但不限于)天然单体、天然二聚物(双硫键连接)、经修饰二聚物(二硫键和/或非共价连接)以及经修饰单体(即,衍生物)。
本文中“全长抗体”是指构成抗体H和/或L链的天然生物形式的结构。在包括人和小鼠的大部分哺乳动物中,这种形式为四聚体,且由两对相同的两个免疫球蛋白链组成,各对具有一条轻链和一条重链,各轻链包含免疫球蛋白域VL和CL,且各重链包含免疫球蛋白域VH、Cγl、Cγ2和Cy3。在各对中,轻链和重链可变区(VL和VH)一起负责与抗原的结合,且恒定区(CL、Cγ1、Cγ2和Cγ3,尤其Cγ2和Cγ3)负责抗体效应功能。在一些哺乳动物中,例如在骆驼和美洲驼中,全长抗体可由仅两个重链组成,各重链包含免疫球蛋白域VH、Cγ2和Cγ3。
本文中“免疫球蛋白(Ig)”是指由一或多个实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白包括(但不限于)抗体。免疫球蛋白可具有多种结构形式,包括(但不限于)全长抗体、抗体片段和个别免疫球蛋白域(包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL)。
本文中“免疫球蛋白(Ig)域”是指由实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白质域。如图1所示,Ig域包括(但不限于)VH、Cγl、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
如本文所用的“变异体蛋白质序列”是指具有一或多个与另一相似蛋白质序列在氨基酸一致性上有所不同的蛋白质序列。所述类似的蛋白质序列可为天然野生型蛋白质序列或野生型序列的另一变异体。起始序列通常称为“亲本”序列且可为野生型或变异序列。举例来说,本发明的实施例可采用人类化亲本序列,已对所述人类化亲本序列进行计算分析以产生变异体。
本文中抗体的“可变区”是指由VH免疫球蛋白域、VL免疫球蛋白域或VH和VL免疫球蛋白域组成的多肽(包括变异体),如图1中所示。可变区可指独立的、呈Fv片段、呈scFv片段、呈较大抗体片段情况下的这种区或呈全长抗体或替代的非抗体骨架分子情况下的这种区的这种多肽。
本发明可应用于从广泛范围的来源获得的抗体。抗体可实质上由来自任何生物体的抗体基因编码,所述生物体包括(但不限于)人类、小鼠、大鼠、兔子、骆驼、美洲驼、单峰骆驼、猴,尤其哺乳动物且尤其人类且尤其小鼠和大鼠。在一个实施例中,所述抗体可以是全人抗体,例如通过使用转基因小鼠或其它动物(布吕格曼(Bruggemann)和陶西格(Taussig),1997,现代生物技术观点8:455-458)或人抗体文库结合选择法(格里菲思(Griffiths)和邓肯(Duncan),1998,现代生物技术观点9:102-108)从患者或个体中所获得的。抗体可以来自任何来源,包括人工或天然发生。举例来说,本发明可采用包括(但不限于)嵌合抗体和人类化抗体(克拉克(Clark),2000,今日免疫学(Immunol.Today)21:397-402)的经工程改造的抗体,或来源于组合文库。另外,所优化的抗体可为实质上由一或多个天然抗体基因编码的抗体的工程改造的变异体。举例来说,在一个实施例中,所优化的抗体是已通过亲和力成熟鉴别的抗体。
就本发明的ABP来说,术语“抗原特异性”或“特异性结合”是指结合所关注的抗原的一或多个抗原决定基,但实质上不识别且结合含有混合抗原群体的样品中的其它分子的ABP。
如本文所用的术语“双特异性ABP”或“多特异性ABP”是指包含两个或两个以上抗原结合位点的ABP,第一结合位点具有与第一抗原或抗原决定基的亲和力,且第二结合位点具有与第一个不同的与第二抗原或抗原决定基的结合亲和力。
如本文所用的术语“抗原决定基”是指抗原上由ABP所识别的位点。如果抗原包含多肽,那么抗原决定基可以是线性或构象形成序列或外形的氨基酸。抗原决定基也可以是ABP结合抗原的任何类型抗原上的任何位置。
如本文所用的“抗原结合多肽”或“ABP”应包括具有至少特异性结合特定抗原的生物活性的多肽和蛋白质,以及其ABP类似物、ABP同工型、ABP模拟物、ABP片段、杂交ABP蛋白质、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同系物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白质,而无论其生物活性如何,且进一步无论其合成或制造方法如何,所述方法包括(但不限于)重组(无论是否产自cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式核酸)、体外、体内、通过微注射核酸分子、合成、转基因和基因活化方法。ABP的具体实例包括(但不限于)抗体分子、重链、轻链、可变区、CDR、Fab、scFv、替代性骨架非抗体分子、配体、受体、肽或结合抗原的任何氨基酸序列。
术语“ABP”或“抗原结合多肽”是指如上文所述的ABP,以及保留天然产生的抗体的至少一种生物活性(包括(但不限于)除抗原结合外的活性)的多肽。除抗原结合外的活性包括(但不限于)任何一或多种与Fc相关的活性。抗原结合多肽包括天然产生的ABP的医药学上可接受的盐和前药、和盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体以及天然产生的ABP的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体和其多肽融合体。术语“抗原结合多肽”涵盖了在氨基端、羧基端或两端包含其它氨基酸的融合体。示例性融合体包括(但不限于)例如甲硫氨酰基ABP(其中甲硫氨酸连接于由重组表达得到的ABP的N端)、用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和力抗原决定基)、用于将ABP连接于其它生物活性分子目的的融合体、与血清白蛋白结合肽的融合体,和与血清蛋白(如血清白蛋白)的融合体。
术语“抗原”是指作为由ABP所表现的结合活性的目标的物质。事实上任何物质都可以是ABP的抗原。各种参考文献揭示利用聚合物结合或糖基化对多肽的修饰。美国专利第4,904,584号揭示聚乙二醇化赖氨酸耗乏的多肽,其中至少一个赖氨酸残基已缺失或被任何其它氨基酸残基置换。WO 99/67291揭示一种将蛋白质与PEG结合的方法,其中所述蛋白质上至少一个氨基酸残基已缺失,并且所述蛋白质是在足以实现与所述蛋白质结合的条件下与PEG接触。WO 99/03887揭示了属于生长激素超家族的聚乙二醇化多肽变异体,其中半胱氨酸残基已经被位于所述多肽指定区域中的非基本氨基酸残基取代。
术语“抗原结合多肽”还包括糖基化ABP,如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、所述多肽的N-连接或O-连接糖基化形式。术语“抗原结合多肽”还包括由化学手段连接或表达为融合蛋白的任何一或多个ABP或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接基团、配体或任何类型的其它生物活性分子的ABP异质二聚物、同型二聚物、异质多聚物或同型多聚物,以及含有例如特异性缺失或其它修饰但维持生物活性的多肽类似物。
在一些实施例中,抗原结合多肽进一步包含调节ABP的生物活性的添加、取代或缺失。举例来说,添加、取代或缺失可以调节ABP的一或多种特性或活性(包括(但不限于)调节对抗原的亲和力);调节(包括(但不限于)增加或降低)抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变;稳定抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变;诱导或引起抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变;调节循环半衰期;调节治疗半衰期;调节多肽稳定性;调节剂量;调节释放或生物可用性;促进纯化;或改进或改变特定投药途径。类似地,抗原结合多肽可以包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或改进多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
术语“抗原结合多肽”还涵盖经连接的ABP同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物和异质多聚物,包括(但不限于)直接经非天然编码氨基酸侧链连接于相同或不同非天然编码氨基酸侧链或连接于天然编码氨基酸侧链作为融合体或间接经连接基团连接的那些。示例性连接基团包括(但不限于)小有机化合物;各种长度的水溶性聚合物,如聚(乙二醇)或葡聚糖;或各种长度的多肽。
术语“抗原结合多肽”涵盖包含一或多个氨基酸取代、添加或缺失的抗原结合多肽。本发明的抗原结合多肽可以包含用一或多种天然氨基酸修饰以及一或多种非天然氨基酸修饰。已经描述天然产生的ABP多肽中多种氨基酸位置中的示例性取代,其包括(但不限于)调节抗原结合多肽的一或多种生物活性的取代,如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂等,并且由术语“ABP”所涵盖。
如本文所用的“多肽”或“肽”应包括具有至少一种生物活性的多肽和蛋白质,以及其类似物、同工型、模拟物、片段、杂交蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同系物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白质,而无论其生物活性如何,且进一步无论其合成或制造方法如何,所述方法包括(但不限于)重组(无论是否产自cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式核酸)、合成、转基因和基因活化方法。此外,可能经由使用如马尼亚迪斯T.(Maniatis,T.)等人,分子生物学:实验室手册(Molecular Biology:A Laboratory Manual),纽约冷泉港(ColdSpring Harbor,N.Y.)(1982)所公开的重组DNA技术获得多肽,并且通过所属领域的技术人员已知的方法在宿主细胞中产生多肽。
多肽还包括天然产生的多肽的医药学上可接受的盐和前药、和盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体以及天然产生的多肽的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体和其多肽融合体。术语“多肽”或“肽”涵盖了在氨基端、羧基端或两端包含其它氨基酸的融合体。示例性融合体包括(但不限于)例如甲硫氨酰基多肽(其中甲硫氨酸连接于由缺乏分泌信号肽或其部分的多肽的重组表达得到的多肽的N端)、用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和力抗原决定基)、与血清白蛋白结合肽的融合体,与血清蛋白(如血清白蛋白)的融合体、与免疫球蛋白分子的恒定区(如Fc)的融合体和与脂肪酸的融合体。已知各种形式的天然产生的多肽核酸和氨基酸序列,也已知其变异体(如单一氨基酸变异体或剪接变异体)。美国专利第5,750,373号(其以引用的方式并入本文中)描述一种选择新颖蛋白质(如对其各别受体分子具有改变的结合特性的生长激素和抗体片段变异体)的方法。所述方法包含将编码所关注的蛋白质的基因与丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基端域融合。
各种参考文献公开通过聚合物结合或糖基化对多肽的修饰。多肽可结合到如PEG的聚合物,并且可包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一或多种其它衍生化。此外,多肽可包含连接基团或聚合物,其中与所述连接基团或聚合物结合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸,或可利用此项技术中已知的技术(如与赖氨酸或半胱氨酸偶联)与天然编码氨基酸结合。
已报导多肽的聚合物结合。参见例如美国专利第5,849,535号、第6,136,563号和第6,608,183号,所述专利以引用的方式并入本文中。美国专利第4,904,584号揭示聚乙二醇化赖氨酸耗乏的多肽,其中至少一个赖氨酸残基已缺失或被任何其它氨基酸残基置换。WO 99/67291揭示一种将蛋白质与PEG结合的方法,其中所述蛋白质上至少一个氨基酸残基已缺失,并且所述蛋白质是在足以实现与所述蛋白质结合的条件下与PEG接触。WO 99/03887揭示了属于生长激素超家族的聚乙二醇化多肽变异体,其中半胱氨酸残基已经被位于所述多肽指定区域中的非基本氨基酸残基取代。WO00/26354公开一种制造糖基化多肽变异体的方法,所述多肽变异体与包含至少一个其它糖基化位点的相应亲本多肽相比具有降低的过敏原性。美国专利第5,218,092号(其以引用的方式并入本文中)揭示对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽进行修饰以便当与天然多肽相比引入至少一个额外的碳水化合物链。
多肽可在任何氨基酸位置处经糖基化。糖基化多肽可为N-连接或O-连接糖基化形式的多肽。含有单一核苷酸变化的变异体也被视为多肽的生物活性变异体。此外,还包括剪接变异体。术语“多肽”还包括由化学手段连接或表达为融合蛋白的任何一或多个多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接基团、配体或任何类型的其它生物活性分子的多肽异质二聚物、同型二聚物、异质多聚物或同型多聚物,以及含有例如特异性缺失或其它修饰但维持生物活性的多肽类似物。
术语“多肽”或“肽”涵盖包含一或多个氨基酸取代、添加或缺失的多肽。多种氨基酸位置中的示例性取代包括(但不限于)调节多肽的一或多种生物活性的取代,如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂、减小肽酶或蛋白酶易感性等并且由术语“多肽”或“肽”所涵盖。
在一些实施例中,多肽进一步包含调节多肽的生物活性的添加、取代或缺失。举例来说,添加、取代或缺失可以调节多肽的一或多种特性或活性。举例来说,添加、取代或缺失可调节对多肽受体或结合搭配物的亲和力、调节(包括(但不限于)增加或降低)受体二聚化、稳定受体二聚物、调节结合搭配物的构象或一或多种生物活性、调节循环半衰期、调节治疗半衰期、调节多肽稳定性、调节由蛋白酶进行的裂解、调节剂量、调节释放或生物可用性、促进纯化或者改进或改变特定投药途径。类似地,多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或改进多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
术语“多肽”还涵盖所连接的同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物和异质多聚物,包括(但不限于)经非天然编码氨基酸侧链与相同或不同非天然编码氨基酸侧链、与天然编码氨基酸侧链直接连接或经连接基团间接连接的那些。示例性连接基团包括(但不限于)小有机化合物;各种长度的水溶性聚合物,如聚(乙二醇)或聚葡聚糖;或各种长度的多肽。
“非天然编码氨基酸”是指不属于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可以使用的其它与术语“非天然编码氨基酸”同义的术语为“非天然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”以及其各种带连字符和不带连字符的型式。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如,翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸,或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而产生,但本身未通过翻译复合物天然地并入到正在生长的多肽链中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖氨基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。
“氨基端修饰基团”是指可与多肽的氨基端连接的任何分子。类似地,“羧基端修饰基团”是指可与多肽的羧基端连接的任何分子。末端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(如血清白蛋白),或者延长肽的血清半衰期的其它部分。
此项技术中和本文中使用的术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应性基团”和“化学反应性部分”是指分子中截然不同的可定义部分或单元。这些术语在某种程度上与在化学技术中的含义同义,且在本文中用于指示分子中执行某种功能或活性并与其它分子反应的部分。
本文中使用的术语“键”或“连接基团”是指通常由化学反应形成且通常为共价键的基团或键。水解稳定性键是指,这些键在水中实质上稳定,并且在有用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)可在一段较长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解性键意思是指,这些键可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解性键是指,这些键可经一或多种酶降解。此项技术中应了解,PEG和相关聚合物可在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一或多个末端官能团之间的连接基团中包括可降解的键。举例来说,由PEG羧酸或经活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应而形成的酯键一般会在生理条件下水解,释放出所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)碳酸酯键;由胺与醛反应产生的亚胺键;通过醇与磷酸根反应形成的磷酸酯键;作为酰肼与醛的反应产物的腙键;作为醛与醇的反应产物的缩醛键;作为甲酸根与醇的反应产物的原酸酯键;由(包括(但不限于))聚合物(如PEG)末端处的胺基与肽的羧基形成的肽键;以及由(包括(但不限于))聚合物末端处的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
在本文中使用时,术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”意思是可影响与生物体相关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质,所述生物体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。具体说来,本文中使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其它动物的疾病,或以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源的毒素等。在本文中使用时,术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”意思是可影响与生物体有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质,所述生物体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。具体说来,本文中使用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人类或其它动物的疾病,或以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬药、软药、前药、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束。适合与本文中所述的方法和组合物一起使用的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、肽、多核苷酸、葡萄糖和/或脂质代谢调节剂、自体免疫性调节剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管药剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源的毒素、细胞毒素、核受体配体等。
“调节生物活性”或“调节剂”是指增加或减小多肽的反应性、改变多肽的选择性、增强或降低多肽的底物选择性。可通过比较非天然多肽的生物活性与天然多肽的生物活性可进行对经改变的生物活性的分析。
如本文所用的“核受体”(NR)是指调节细胞核内基因表达(有时与其它共活化剂和共抑制剂一致)的配体活化的蛋白质。核受体是一类细胞内发现的负责感测(如一个非限制性实例)类固醇和甲状腺激素和某些其它分子的蛋白质。作为响应,这些受体与其它蛋白质一起起作用以调节特定基因的表达,由此控制生物体的发育、内稳定和代谢。核受体能够直接结合于DNA并且调节邻接基因的表达,因此这些受体被归类为转录因子。核受体对基因表达的调节通常仅在配体(影响受体行为的分子)存在时发生。更确切地说,配体与核受体结合引起受体的构象变化,这又活化受体,引起基因表达的调节(上调或下调)。核受体的将其与其它类别的受体区分开来的独特特性是其能够与基因组DNA直接相互作用并且控制基因组DNA的表达。因此,核受体在胚胎发育和成人内稳定两方面起到关键作用。一些核受体可根据机制或同源性归类。
如本文所用的“NR配体”、“核受体配体”和“NRL”是指与核受体相互作用且可包含疏水性或亲脂性部分且在一或多个核受体(NR)处具有生物活性(激动剂或拮抗剂)的分子。NRL可完全或部分非肽。在一些实施例中,NRL是结合于NR并活化NR的激动剂。在其它实施例中,NRL是拮抗剂。在一些实施例中,NRL是通过与天然或非天然配体竞争结合活性位点或阻断天然或非天然配体与活性位点的结合来起作用的拮抗剂。在其它实施例中,NRL是通过与活性位点或异位位点结合并防止NR活化或使NR去活化来起作用的拮抗剂。
在某些实施例中,本发明的PDCM可以用于将生物活性分子或可检测标记引导到肿瘤部位。这可促进肿瘤杀伤、检测和/或定位或其它作用。在某些实施例中,PDCM的生物活性分子组分是“不透射线(rediopaque)”标记,例如可以使用例如X光轻易显现的标记。不透射线物质为所属领域的技术人员所熟知。最常用的不透射线物质包括碘化物、溴化物或钡盐。其它不透射线物质也是已知的,且包括(但不限于)有机铋衍生物(参见例如美国专利第5,939,045号)、不透射线多尿烷(multiurethane)(参见美国专利第5,346,981号)、有机铋络合物(参见例如美国专利第5,256,334号)、不透射线钡多聚物络合物(参见例如美国专利第4,866,132号)等。
本发明的PDCM可以直接与不透射线部分偶联,或者其可以连接于载运或含有不透射线物质的“包装(package)”(例如螯合剂、脂质体、多聚物微珠等)。
除不透射线标记之外,其它标记也适用于本发明。适合用作本发明PDCM的生物活性分子组分的可检测标记包括任何可由分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或化学方法检测的组分。可用于本发明中的标记包括磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德州红(texas red)、若丹明(rhodamine)、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA中的酶)和比色标记,如胶状金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯(multistyrene)、聚丙烯(multipropylene)、乳胶等)珠。
各种放射性标记包括(但不限于)99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、641Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、I61Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、I72Tm、169Yb、175Yb、I75Yb、I77Lu、105Rh以及111Ag。
检测所述标记的方法为所属领域的技术人员所熟知。因此,例如,可以用照相胶片、闪烁检测器等检测放射性标记。可以用光检测器检测发光来检测荧光标记。通常通过对底物提供酶并且检测由酶作用于底物上所产生的反应产物来检测酶促标记,并且通过简单视觉观察着色标记来检测比色标记。
在某些具体实施例中,本发明预期免疫结合物(嵌合部分)用于检测肿瘤和/或其它癌细胞的用途。因此,举例来说,本发明的双特异性抗体可以与γ发光放射性同位素(例如Na-22、Cr-51、Co-60、Tc-99、I-125、I-131、Cs-137、Ga-67、Mo-99)结合以用γ相机检测;与正电子发光同位素(例如C-11、N-13、O-15、F-18等)结合以在正电子发射断层显像(PET)仪器上检测;并且与金属造影剂(例如含Gd试剂、含Eu试剂等)结合以用于磁共振成像(MRI)。此外,本发明的双特异性抗体可以用于传统免疫组织化学(例如荧光标记、纳米晶体标记、酶促标记和比色标记等)中。
在另一个实施例中,生物活性分子可以是增强细胞上电离辐射(例如可能由60Co或X射线来源产生)的细胞毒性作用的放射增敏剂。许多放射增敏剂是已知的,且包括(但不限于)苯并卟啉衍生化合物(参见例如美国专利第5,945,439号)、1,2,4-苯并三嗪氧化物(参见例如美国专利第5,849,738号)、含某些二胺的化合物(参见例如美国专利第5,700,825号)、BCNT(参见例如美国专利第5,872,107号)、放射增敏性硝基苯甲酸酰胺衍生物(参见例如美国专利第4,474,814号)、各种杂环衍生物(参见例如美国专利第5,064,849号)、铂络合物(参见例如美国专利第4,921,963号)等。
生物活性分子也可以是配体,抗原决定基标记、多肽、蛋白质或ABP。配体和抗体可以是结合于免疫细胞上的表面标记的配体和抗体。利用所述抗体作为生物活性分子的嵌合分子充当在承载配体或ABP的结合搭配物的免疫细胞与肿瘤细胞之间建立联系的双功能连接基团。
尤其在采用预靶向策略的情况下,许多本文所述的药物和/或放射性标记可以螯合剂的形式提供。螯合分子通常与特异性地结合连接于双特异性和/或多特异性ABP或其它多肽的抗原决定基标记的分子(例如生物素、抗生物素蛋白、链菌素等)偶联。
螯合基为所属领域的技术人员所熟知。在某些实施例中,螯合基来源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、环己基1,2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-双(-2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、N,N-双(羟基苯甲基)-乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N'-,N",N'"-四乙酸(DOTA)、羟基乙基二胺三乙酸(HEDTA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸(TETA)、经取代DTPA、经取代EDTA等。
螯合剂的实例包括(但不限于)未经取代或经取代2-亚氨基硫烷和2-亚氨基硫杂环己烷,尤其是2-亚氨基-4-巯基甲基硫烷和SAPS(N-(4-[211At]砹氏苯乙基)琥珀酸酯(N-(4-[211At]astatophenethyl)succinimate))。
一种螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N,N",N'"-四乙酸(DOTA)尤其令人感兴趣,这是由于其螯合许多诊断上和治疗上重要的金属(如放射性核素和放射性标记)的能力。
已经描述DOTA与如抗体的蛋白质的结合物。举例来说,美国专利第5,428,156号教示一种将DOTA与抗体和ABP片段结合的方法。为了制备这些结合物,将DOTA的一个羧酸基转化成活性酯,活性酯可以与ABP或ABP片段上的胺或硫氢基反应。路易斯(Lewis)等人(1994)生物结合化学(Bioconjugate Chem.)5:565-576描述一种相似的方法,其中将DOTA的一个羧基转化成活性酯,并将活性DOTA与ABP混合,将ABP与DOTA经ABP赖氨酸残基的ε氨基连接,进而将DOTA的一个羧基转化成酰胺部分。
或者,可以直接或经连接基团将螯合剂偶联于抗原决定基标记或偶联于结合抗原决定基标记的部分。已经描述DOTA与生物素的结合物(参见例如苏(Su)(1995)核医学杂志(J.Nucl.Med.),36(增刊5):154P,其揭示DOTA与生物素经由可用氨基侧链生物素衍生物(如DOTA-LC-生物素或DOTA-苯甲基-4-(6-氨基-己酰胺)-生物素)连接的键)。姚(Yau)等人,WO 95/15335揭示了一种制造可以与生物素结合的硝基-苯甲基-DOTA化合物的方法。所述方法包含:经羟基暂时保护的环化反应;胺的甲苯磺酰化作用;暂时受保护羟基的去保护;去保护羟基的甲苯磺酰化作用;和分子内甲苯磺酸酯环化。吴(Wu)等人,(1992)核医学和生物学(Nucl.Med.Biol),19(2):239-244揭示用111IN和90Y放射性标记蛋白的巨环螯合剂的合成。吴等人制得经标记DOTA-生物素结合物以研究具有抗生物素蛋白(用于研究的模型蛋白)的稳定性和生物分布。使用含有游离氨基以与原位生成的活性DOTA衍生物反应的生物素酰肼来制造这种结合物。
PDCM(如ABP)的多肽组分可以与其它生物活性分子融合,所述其它生物活性分子包括(但不限于)细胞毒性药物、毒素、肽、蛋白质、酶和病毒(切斯特(Chester),(2000)疾病标记(Dis,Markers)16:53-62;里普曼(Rippmann)等人生物化学杂志(Biochem J.)(2000)生物化学杂志349(Pt.3):805-812、克赖特曼R.J.(Kreitman,R.J.)(2001)当代药物生物技术(Curr.Pharm.Biotechnol.)2:313-325;雷巴克S.M.(Rybak,S.M.)(2001)生物疗法专家观点(Expert Opin.Biol.Ther.)1:995-1003;范贝希凯姆V.W.(van Beusechem,V.W.)等人病毒学杂志(J.Virol)(2002)76:2753-2762)。
有效细胞毒性剂或有效负载(payload)可以结合于多肽(如ABP),所述多肽靶向且结合在目标细胞(包括(但不限于)癌细胞)上所主要发现的抗原。有效负载剂经血流中稳定的连接基团连接于多肽,或者在例如肿瘤部位在所存在条件下易于裂解。有效负载剂,如毒素,被传递到目标细胞,且因此可以通过取决于毒素的机制而起始细胞杀伤。
如本文所用的术语“毒性部分”、“毒素”、“细胞毒素”或“毒性基”是指可引起损害、紊乱或死亡的化合物。毒性部分包括(但不限于)奥瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷化剂、烯二炔、莱西托辛(lexitropsin)、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉烷(taxane)、嘌呤霉素(puromycin)、海兔毒素(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞他汀E、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、CC-1065、SN-38、拓扑替康(topotecan)、吗啉基-阿霉素(morpholino-doxorubicin)、根霉素(rhizoxin)、氰基吗啉基-阿霉素(cyanomorpholino-doxorubicin)、海兔毒素-10、棘霉素(echinomycin)、考布他汀(combretatstatin)、卡里奇霉素(chalicheamicin)、美登素(maytansine)、DM-1、纺锤菌素(netropsin)、鬼臼毒素(podophyUotoxin)(例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)等)、浆果赤霉素(baccatin)和其衍生物、抗微管蛋白剂、念珠藻素(cryptophysin)、考布他汀(combretastatin)、奥瑞他汀E、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、VP-16、喜树碱(camptothecin)、埃坡霉素A(epothilone A)、埃坡霉素B(epothilone B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicines)、秋水酰胺(colcimid)、雌氮芥(estramustine)、西马多丁(cemadotin)、迪斯德莫来(discodermolide)、美登素、艾榴塞洛素(eleutherobin)、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲霉素(streptozocin)、氯脲菌素(chlorozotocin)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、氮芥(chlormethine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、哌泊溴烷(pipobroman)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基硫代磷胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安(busulfan)、达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、氟脲嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxuridine)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、喷司他汀(pentostatin)、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二脱氮杂叶酸、5,8-二脱氮杂四氢叶酸、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、氟达拉宾磷酸盐(fludarabine phosphate)、喷司他丁(pentostatine)、吉西他滨(gemcitabine)、Ara-C、太平洋紫杉醇、多西他赛、脱氧柯福霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)、硫唑嘌呤(azathioprine)、布喹那(brequinar)、抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)、庆大霉素(gentamicin)、头孢噻吩(cefalotin)、万古霉素(vancomycin)、特拉万星(telavancin)、达托霉素(daptomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(rocithromycin)、呋喃唑酮(furazolidone)、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、卡本西林(carbenicillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、青霉素(penicillin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、土霉素(oxytetracycline)、四环素(tetracycline)、链霉素(streptomycin)、利福布汀(rifabutin)、乙胺丁醇(ethambutol)、利福昔明(rifaximin)等)、抗病毒药物(例如阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、阿普林津(ampligen)、西多福韦(cidofovir)、地拉韦啶(delavirdine)、地达诺新(didanosine)、依法韦仑(efavirenz)、恩替卡韦(entecavir)、膦乙醇(fosfonet)、苷昔洛韦(ganciclovir)、伊巴他滨(ibacitabine)、异丙肌苷(imunovir)、碘苷(idoxuridine)、肌苷(inosine)、咯匹那韦(lopinavir)、美替沙腙(methisazone)、多吉美(nexavir)、奈韦拉平(nevirapine)、奥司他韦(oseltamivir)、喷昔洛韦(penciclovir)、司他夫定(stavudine)、曲氟尿苷(trifluridine)、特鲁瓦达(truvada)、伐昔洛韦(valaciclovir)、扎那米韦(zanamivir)等)、道诺霉素盐酸盐(daunorubicinhydrochloride)、道诺霉素(daunomycin)、红比霉素(rubidomycin)、柔红霉素(cerubidine)、艾达霉素(idarubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)和吗啉基衍生物、酚噁嗪酮双环肽(例如更生霉素(dactinomycin))、碱性糖肽(例如博莱霉素(bleomycin))、蒽醌糖苷(例如普卡霉素(plicamycin)、光神霉素(mithramycin))、蒽二酮(例如米托蒽醌(mitoxantrone))、氮丙啶吡咯并吲哚二酮(例如丝裂霉素)、巨环免疫抵制剂(例如环孢灵(cyclosporine)、FK-506、他克莫司(tacrolimus)、普乐可复(prograf)、雷帕霉素(rapamycin)等)、诺维本(navelbene)、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、屈洛昔芬(droloxafine)、别秋水仙碱(allocolchicine)、软海绵素B(Halichondrin B)、秋水仙碱(colchicine)、秋水仙碱衍生物、美登素、根霉素(rhizoxin)、太平洋紫杉醇、太平洋紫杉醇衍生物、多西他赛、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、羟基脲、N-甲基肼、表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)、丙卡巴肼(procarbazine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和喃氟啶(tegafur)。“紫杉烷”包括太平洋紫杉醇以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。所述毒素的实例包括(但不限于)小分子,如真菌衍生刺孢霉素(calicheamicins)(欣曼(Hinman)等人(1993)癌症研究(Cancer Res.)53:3336-3342)和美登醇(刘(Liu)等人(1996)美国国家科学院院刊93:8618-8623,史密斯S.(Smith,S.)(2001)分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.)3(2):198-203)、单端孢霉烯(trichothene)和CC 1065;或蛋白质,例如蓖麻毒素A链(迈斯曼(Messman)等人(2000)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)6(4):1302-1313)、假单胞菌外毒素(吐尔(Tur)等人(2001)国际分子医学杂志(Intl.J.Mol.Med.)8(5):579-584)、白喉毒素(勒梅斯特(LeMaistre)等人(1998)血液(Blood)91(2):399-405)和核糖体失活蛋白(塔扎里(Tazzari)等人(2001),免疫学杂志(J.Immunol.)167:4222-4229)。在一个具体实施例中,可使用一或多个刺孢霉素分子。抗生素的刺孢霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。也已知刺孢霉素的结构化类似物。参见欣曼等人,癌症研究53:3336-42(1993);洛德(Lode)等人(1998)癌症研究58:2925-28。获得FDA批准的免疫毒素的实例为(惠氏药厂(Wyeth Ayerst)),一种用于急性骨髓性白血病的刺孢霉素结合抗CD33(西弗斯(Sievers)等人(1999)血液93(11):3678-3684;伯恩斯坦(Bernstein)(2000)白血病(Leukemia)14:474-475)。多肽可以类似方式与毒素融合。或者,多肽可与肉毒杆菌A神经毒素(一种由细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)所产生的蛋白复合物)融合。
或者,本发明的多肽可与喜树碱或其类似物连接。拓扑替康(Hycamtm)和伊立替康(CPT-II,Camptosar)已被FDA批准用于治疗卵巢癌、肺癌和结肠直肠癌。9-硝基喜树碱(Orathecin,另一种喜树碱衍生药物)预期不久将获得FDA批准用于胰脏癌治疗。同时,9-氨基喜树碱(9-AC)也已在临床试验中引入,因为其展示出针对人类结肠癌的治愈能力和针对实体肿瘤异种移植物的强抗肿瘤活性。喜树碱类似物也已展示为有效抗病毒剂、抗HIV剂和化学不育剂。
利用细胞表面方式选择性传递前药已由兰格(Langer)等人(药物化学杂志(JMed Chem).2001年4月26日;44(9):1341-8)描述。兰格等人描述使用神经肽Y结合到道诺霉素以经由NPY受体杀伤成神经细胞瘤细胞。
在另一个实施例中,本发明的PDCM可包含一或多种酶促活性毒素和/或其片段。所述毒素的实例包括白喉毒素的非结合活性片段、白喉A链、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、康乃馨(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPAII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictoein)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢子菌霉菌毒素(tricothecene)。参见例如WO 93/21232。细胞毒素包括(但不限于)假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、蓖麻毒素和相思豆毒素。假单胞菌外毒素和白喉毒素均是熟知的。与PE一样,白喉毒素(DT)通过ADP核糖基化延伸因子2杀死细胞,进而抑制蛋白合成。关于免疫毒素的其它引用包括布林克曼U.(Brinkmann,U.)(2000)体内(In Vivo)14:21-28,尼乌(Niv)等人(2001)当代药物生物技术2:19-46,瑞特(Reiter)等人(2001)癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)81:93-124,克赖特曼R.J.(Kreitman,R.J.)(1999)免疫学当前观点(Curr.Opin.Immunol.),11:570-578;霍尔(Hall)(2001)分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)166:139-154;克赖特曼(Kreitman)(2001)研究药物当前观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)2(9):1282-1293。所属领域的技术人员熟知编码与各种配体融合的PE或DT的基因克隆方法(参见例如西格尔(Siegall)等人(1989)美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.),3:2647-2652;和乔杜里(Chaudhary)等人(1987)美国国家科学院院刊,84:4538-4542)。所有引用均以引用的方式并入本文。
其它适合生物活性分子包括药理学试剂或含有各种药理学试剂的封装系统。因此,嵌合分子的靶向分子可以直接连接于待直接传递到肿瘤的药物。所述药物为所属领域的技术人员所熟知,且包括(但不限于)多柔比星、长春碱、染料木黄酮(genistein)、反义分子等。
或者,生物活性分子可以是封装系统,如病毒衣壳、脂质体或含有治疗组合物(如药物、核酸(例如反义核酸)或另一种优选经屏蔽以免于直接暴露于循环系统的治疗部分)的微胞。制备连接于抗体的脂质体的方法为所属领域的技术人员熟知。参见例如美国专利第4,957,735号,康诺(Connor)等人(1985)药物治疗学(Pharm.Ther.),28:341-365。由于具有抗原特异性,故本发明的ABP可用于将装载药物的脂质体引导到其目标。参见帕克J.W.(Park,J.W.)等人(2002)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)8,1172-1181和史N.(Shi,N.)等人(2001)药物研究(Pharm.Res.)18,1091-1095。
多肽可与如PEG的分子结合以改进体内传递和药物动力学曲线。隆(Leong)等人描述具有优于未聚乙二醇化形式的低清除率以及极小或无抗原结合活性丧失的抗IL-8抗体的Fab'片段的位点特异性聚乙二醇化(隆S.R.(Leong,S.R.)等人(2001)细胞因子(Cytokine)16:106-119)。
ABP或其它多肽可与前药连接。如本文所用的术语“前药”是指活性药物的药理学无活性或低活性的衍生物。可以对前药进行设计以调节药物或生物活性分子的量从而通过操纵药物的特性(如生理化学、生物医药学或药物动力学特性)而到达所希望的作用位点。前药在体内经酶促反应或非酶促反应而转化成活性药物。前药可以提供改进的生理化学特性,如较佳的溶解性、增强的传递特征,如特异性靶向于特定细胞、组织、器官或配体,和改进的药物治疗价值。多肽可与酶融合而用于前药活化(库兹帕柔C.A.(Kousparou,C.A.)等人(2002)国际癌症杂志(Int.J.Cancer)99,138-148)。重组分子可包含ABP或其它多肽和作用于前药上以释放细胞毒素(如氰化物)的酶。
可以前药形式投与治疗剂,且随后通过将如肽基化学治疗剂的前药转化成活性抗癌药物的前药激活酶来进行活化。参见例如WO 88/07378;WO 81/01145;美国专利第4,975,278号。一般来说,酶组分包括任何能够以如将其转化成更具活性的细胞毒性形式的方式作用于前药的酶。
可用的酶包括(但不限于)可用于将含磷酸酯前药转化成游离药物的碱性磷酸酶、可用于将含硫酸酯前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶;可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶;可用于将含肽前药转化成游离药物的蛋白酶,如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶和组织蛋白酶(cathepsin)(如组织蛋白酶B和L);可用于转化含D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧基肽酶;可用于将糖基化前药转化成游离药物的碳水化合物裂解酶,如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶;可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶;和可用于将在其氨基氮处分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶,如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。
或者,可以使用此项技术中又称为“抗体酶(abzyme)”的具有酶促活性的抗体将本发明的前药转化成游离活性药物。参见例如马西(Massey),(1987)328:457-48。
所属领域的技术人员应了解,本发明的双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子部分通常可以任何次序连接在一起。因此,例如当靶向分子是单链蛋白时,生物活性分子可连接于靶向分子的氨基端或羧基端。生物活性分子也可连接于双特异性和/或多特异性ABP的内部区,或者相反。类似地,双特异性和/或多特异性ABP可连接于生物活性分子的内部位置或末端。在任何情况下,选择连接点以致不干扰双特异性和/或多特异性ABP或生物活性分子的各别活性。
可以借助所属领域的技术人员所熟知的任何许多方式连接双特异性和/或多特异性ABP或生物活性分子。生物活性分子通常直接或经连接基团(间隔基)与双特异性ABP结合。然而,当生物活性分子和双特异性ABP均为多肽时,可能需要将嵌合分子重组表达为单链融合蛋白。
在一个实施例中,双特异性和/或多特异性ABP化学结合于生物活性分子(例如细胞毒素、标记、配体、药物、ABP、脂质体等)。化学结合分子的方法为所属领域的技术人员所熟知。
用于连接试剂与ABP或其它多肽靶向分子的程序会根据试剂的化学结构而有所不同。多肽通常含有多种官能团;例如羧酸(COOH)或游离胺(--NH2)基团,这些官能团可用于与生物活性分子上的适合官能团反应以于此处与生物活性分子结合。
或者,双特异性ABP、多肽和/或生物活性分子可经衍生以暴露或连接其它反应官能团。所述衍生化作用可以涉及连接任何许多连接分子,如购自皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Company),罗克福德(Rockford)I11的连接分子。
在一些情况下,当嵌合部分已经到达其目标部位时,可能需要使生物活性分子从双特异性和/或多特异性ABP游离,或活化前药。因此,当在目标部位释放生物活性分子时,可以使用包含在邻近目标部位处可裂解的键的嵌合结合物。可以通过酶促活性或者免疫结合物在目标细胞内或在邻近目标部位中所经受的条件来促进键的裂解以从ABP或其它多肽释放试剂。当目标部位是肿瘤时,可以使用在肿瘤部位处所存在的条件下(例如当暴露于肿瘤相关性酶或酸性pH值时)可裂解的连接基团。
许多不同的可裂解连接基团为所属领域的技术人员已知。参见美国专利第4,618,492号、第4,542,225号和第4,625,014号。从这些连接基团释放试剂的机制包括,例如照射光不稳定性键和酸催化水解。举例来说,美国专利第4,671,958号包括包含连接基团的免疫结合物的描述,所述连接基团在目标部位处通过患者补体系统的蛋白水解酶体内裂解。连接基团的长度可经预定或者视ABP或其它多肽和与其连接的分子之间的所需空间关系而加以选择。鉴于许多所报导的用于将多种放射诊断化合物、放射治疗化合物、药物、毒素和其它试剂与抗体相连接的方法,所属领域的技术人员应能够确定将所给试剂与ABP或其它多肽连接的适合方法。
在某些实施例中,生物活性分子包含连接于ABP或其它多肽或连接于抗原决定基标记的螯合剂。双特异性和/或多特异性ABP携带有相应的抗原决定基标记或ABP,因此双特异性和/或多特异性ABP与螯合剂的简单接触引起ABP与生物活性分子的连接。可以在使用所述部分(预靶向策略)之后进行所述组合步骤,或者在传递螯合剂之前可以使目标组织与双特异性和/或多特异性ABP结合。适合与各种靶向部分偶联的螯合物的制造方法为所属领域的技术人员所熟知(参见例如美国专利第6,190,923号、第6,187,285号、第6,183,721号、第6,177,562号、第6,159,445号、第6,153,775号、第6,149,890号、第6,143,276号、第6,143,274号、第6,139,819号、第6,132,764号、第6,123,923号、第6,123,921号、第6,120,768号、第6,120,751号、第6,117,412号、第6,106,866号、第6,096,290号、第6,093,382号、第6,090,800号、第6,090,408号、第6,088,613号、第6,077,499号、第6,075,010号、第6,071,494号、第6,071,490号、第6,060,040号、第6,056,939号、第6,051,207号、第6,048,979号、第6,045,821号、第6,045,775号、第6,030,840号、第6,028,066号、第6,022,966号、第6,022,523号、第6,022,522号、第6,017,522号、第6,015,897号、第6,010,682号、第6,010,681号、第6,004,533号和第6,001,329号)。
当双特异性和/或多特异性ABP或其它多肽和/或生物活性分子均为单链蛋白且相对较短(即小于约50个氨基酸)时,其可以使用标准化学肽合成技术进行合成。当两种组分均相对较短时,嵌合部分可以合成为单邻近多肽。或者,可以单独合成双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子,且接着通过缩合一个分子的氨基端与另一分子的羧基端而进行融合,从而形成肽键。或者,双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子可以各自与肽间隔基分子的一个末端缩合,进而形成邻近融合蛋白。
固相合成是一种化学合成多肽的方法,其中序列的C端氨基酸连接于不溶性支撑物,接着依序添加序列中的其余氨基酸。固相合成技术由肽:分析、合成、生物学(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology).第2卷:肽合成中的特殊方法(SpecialMethods in Peptide Synthesis),第A部分,梅里菲尔德(Merrifield)等人美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc),85:2149-2156(1963)中的巴拉尼(Barany)和梅里菲尔德(Merrifield),固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis);第3-284页和斯图尔特(Stewart)等人,固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),第2版皮尔斯化学公司,罗克福德,I11.(1984)描述。
“双官能聚合物”是指包含两个个别官能团的聚合物,这两个官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应,形成共价或非共价键。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团以及可与第二生物组分上的基团反应的另一基团的双官能连接基团可用于形成一种结合物,这种结合物包括第一生物活性组分、双官能连接基团和第二生物活性组分。已知许多用于连接各种化合物与肽的程序和连接分子。参见例如欧洲专利申请案第188,256号;美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号;第4,680,338号;和第4,569,789号,其以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上个别官能团的聚合物,这些官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应,形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可以具有任何所需分子长度或分子量,并且可以经选择以提供连接于多肽的一个分子与其结合搭配物或多肽之间的特定所需间距或构象。
当用从左向右书写的常规化学式说明取代基时,这些取代基同样涵盖由从右向左书写结构所得到的化学上一致的取代基,例如,结构-CH2O-与结构-OCH2-相同。
术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰取代基”。“非干扰性取代基”是得到稳定化合物的那些基团。适合的非干扰取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚硫酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、=S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)—CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m为1到8)、--C(O)NR2、-C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2,其盐等。本文中使用的各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另作规定,否则单独或作为另一取代基的一部分的术语“烷基”意思是具有指定碳原子数(即,C1-C10意思是1到10个碳)的直链或支链或者环状烃基或其组合,其可为完全饱和、单或多不饱和的,并且可包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团:如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基;例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构物等。不饱和烷基是具有一或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基(crotyl)、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构物。除非另外指出,否则术语“烷基”还打算包括以下更详细定义的那些烷基衍生物,如“杂烷基”。限于烃基的烷基称为“高烷基(homoalkyl)”。
单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚烷基”是指衍生自烷烃的二价基团,例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-,且另外包括下文描述为“亚杂烷基”的那些基团。通常,烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子,其中具有10个或更少碳原子的那些基团为本文所述方法和组合物的特定实施例。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”是一般具有八个或八个以下碳原子的短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫烷氧基)是以其常规含义使用,并且指分别经由氧原子、氨基或硫原子与分子剩余部分连接的那些烷基。
除非另作规定,否则单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”是指稳定的直链或支链或者环状烃基,或其组合,其是由规定数量的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成,并且其中氮和硫原子可任选经氧化,且氮杂原子可任选经季铵化。杂原子O、N以及S和Si可位于杂烷基的任一内部位置或在烷基与分子其余部分连接的位置。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的,例如-CH2-NH-OCH3及-CH2-O-Si(CH3)3。类似地,单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烷基”意味着衍生自杂烷基的二价基团,例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基,相同或不同杂原子也可占据任一个或两个链末端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。另外,对于亚烷基和亚杂烷基连接基团,连接基团的化学式的书写方向并不表示连接基团的定向。举例来说,式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-和-R'C(O)2-两者。
除非另作规定,否则单独或与其它术语组合时术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此,环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和与完全不饱和的环键。此外,对于杂环烷基,杂原子可占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外,这一术语涵盖双环和三环结构。类似地,单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂环烷基”是指衍生自杂环烷基的二价基团,并且单独或作为另一取代基的一部分的术语“亚环烷基”是指衍生自环烷基的二价基团。
如本文所用的术语“水溶性聚合物”是指任何在水性溶剂中可溶的聚合物。水溶性聚合物与ABP或其它多肽的键合可以产生以下改变,包括(但不限于)相对于未经修饰形式,增加或调节血清半衰期,或者增加或调节治疗半衰期,调节免疫原性,调节物理缔合特征(如聚集和多聚物形成),改变受体结合,改变与一或多个结合搭配物的结合以及改变受体二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可以具有或不具有自身生物活性,且可以用作连接基团以连接ABP或其它多肽与其它物质,包括(但不限于)一或多个ABP或多肽或一或多个生物活性分子。适合的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中,所述专利是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等,或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文所用的术语“聚亚烷基二醇”或“聚(烯烃二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚亚烷基二醇”涵盖线性与分支聚合物,且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它示例性实施例列于例如商业供应商目录中,例如肖尔沃特公司(Shearwater Corporation)的目录“生物医学用聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications)”(2001)。
除非另外说明,否则术语“芳基”意思指可以是单环或稠合于一起或共价连接的多环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环),其中氮和硫原子任选经氧化,且氮原子任选经季铵化。杂芳基可经由杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述每一芳基和杂芳基环系统的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。
为简洁起见,术语“芳基”当与其它术语(包括(但不限于)芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)组合使用时包括如上文所定义的芳基和杂芳基环两者。因此,术语“芳烷基”打算包括芳基与烷基连接的那些基团(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等),所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经被例如氧原子置换的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
各上述术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)打算包括经取代和未经取代形式的所指示基团两者。下文将提供各类基团的示例性取代基。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自(但不限于)以下多种基团中的一或多者:0到(2m'+1)数目的-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR″'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2,其中m'是所述基团中碳原子的总数。R'、R"、R'"和R""各独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基,或芳基烷基。举例来说,当本发明化合物包括一个以上R基团时,各R基团是如各R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上这些基团时那样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子时,其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说,-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域技术人员从上文有关取代基的论述将了解到,术语“烷基”打算包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团,如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与关于烷基所述的取代基相似,芳基和杂芳基的取代基可变化,并且选自(但不限于):0到芳香族环系统上开放价(open valence)总数的卤素、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R'"、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR"'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基;且其中R'、R"、R'"和R""独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说,当本发明化合物包括一个以上R基团时,各R基团是如各R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上这些基团时那样独立地选择。
如本文中使用的术语“经调节的血清半衰期”是指经修饰生物活性分子的循环半衰期相对于其未修饰形式的正或负改变。血清半衰期通过在投药之后的各个时间点处取得血液样品并且测定分子在各样品中的浓度来测量。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期理想的是增加至少约两倍,但例如在其增加可获得令人满意的给药方案或避免有毒作用的情况下,较少的增加也是有用的。在一些实施例中,所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文中使用的术语“经调节的治疗半衰期”是指治疗有效量的经修饰生物活性分子的半衰期相对于其未修饰形式的正或负改变。治疗半衰期是通过测量投药后各个时间点时的药物动力学和/或药效特性来测量。增加的治疗半衰期有利地实现尤其有益的给药方案,尤其有益的总剂量,或避免不良作用。在一些实施例中,增加的治疗半衰期是由增加的效力、增加或降低的经修饰分子与其目标的结合、增加或降低的酶(如蛋白酶)对分子的降解或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或降低引起。
当用于核酸或蛋白质时,术语“分离的”表示核酸或蛋白质不含天然状态下相关的细胞组分中的至少一些,或核酸已浓缩到大于其体内或体外产生的浓度的水平。其可为均质态。经分离的物质可为干燥或半干燥状态;或在溶解状态中,包括(但不限于)水溶液。其可为医药组合物的一种组分,所述医药组合物还包含医药学上可接受的载剂和/或赋形剂。纯度和均质性通常是使用分析化学技术,如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。蛋白质,作为一种在制剂中存在的主要物质,是实质上纯化的。具体说来,经分离基因与侧接所述基因且编码除相关基因外的蛋白质的开放式阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中实质上产生一条谱带。具体来说,其意思可能是核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99%纯或更纯。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特别限制,否则这一术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,这些核酸的结合特性与参考核酸类似,并且代谢方式也与天然存在的核苷酸类似。除非另作明确限制,否则所述术语还指寡核苷酸类似物,包括PNA(肽基核酸(peptidonucleic acid))、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另作指示,否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列,以及明确指出的序列。特定来说,简并密码子取代可以通过产生其中一或多个所选择的(或所有)密码子的第三位置经混合碱基及/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(巴策尔(Batzer)等人,核酸研究(Nucleic Acid Res.)19:5081(1991);大冢(Ohtsuka)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260:2605-2608(1985);罗塞利尼(Rossolini)等人,分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)8:91-98,(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用以指氨基酸残基的聚合物。也就是说,针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述,反之亦然。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物,以及一或多个氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中使用的这些术语涵盖任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白质,其中氨基酸残基是借助于共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸,以及作用方式与天然存在的氨基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指基础化学结构与天然存在的氨基酸相同的化合物,即,α碳与氢、羧基、氨基和R基团结合,如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(如,正亮氨酸)或经修饰的肽主链,但仍保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。
氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。同样,核苷酸也可以利用其普遍认可的单字母代码提及。
“保守修饰变异体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定核酸序列,“保守修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸,或者当核酸不编码氨基酸序列时,是指基本上一致的序列。由于遗传密码具有简并性,使得大量功能一致的核酸可编码任何指定蛋白质。举例来说,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在由密码子指定丙氨酸的每一位置,所述密码子可变成任一所述的相应密码子,而不改变所编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异(silent variation)”,是保守修饰变异的一种。本文中编码一种多肽的每一核酸序列也描述所述核酸的每一可能的沉默变异。所属领域的技术人员将认识到,核酸中的每一密码子(通常为甲硫氨酸唯一密码子的AUG,和通常为色氨酸唯一密码子的TGG除外)可经修饰而得到功能一致的分子。因此,编码多肽的核酸的各个沉默变异暗含于每一所述序列中。
对于氨基酸序列,所属领域的技术人员将认识到,改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守修饰变异体”,其中所述改变引起氨基酸的缺失、氨基酸的添加或者化学上类似的氨基酸对某一氨基酸的取代。提供功能类似氨基酸的保守取代表是所属领域的技术人员已知的。所述保守修饰变体是除本发明的多晶型变异体、种间同系物和等位基因之外的,但不排除这些。
提供功能类似氨基酸的保守取代表是所属领域的技术人员已知的。以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见,例如,克赖顿(Creighton),蛋白质:结构和分子特性(Proteins:Structures and Molecular Properties)(W H弗里曼公司(W H Freeman&Co.);第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形下,术语“一致”或百分比“一致性”是指两个或两个以上相同的序列或子序列。当使用以下序列比较算法(或所属领域的技术人员可用的其它算法)中的一者或通过手工比对和目测来测量,在比较窗或指定区域上比较和比对最大对应性时,如果各序列具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即,在指定区域内约60%一致、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%一致),那么所述序列“实质上一致”。此定义也指测试序列的互补性。一致性可存在于长至少约50个氨基酸或核苷酸的区域,或长75到100个氨基酸或核苷酸的区域,或者(未指定时)跨越整个多核苷酸或多肽序列。
对于序列比较来说,通常一个序列充当测试序列所比较的参考序列。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入计算机内,必要时指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数,或者可以指定替代参数。序列比较算法接着基于程序参数而计算测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。
如本文中使用的“比较窗”包括具有选自由20到600,通常约50到约200,更通常约100到约150组成的群组的相邻位置数量中的任一者的区段,其中在最佳比对两个序列后,序列可与相邻位置数量相同的参考序列相比较。比对序列以用于比较的方法是所属领域的技术人员已知的。用于比较的最佳序列比对可以通过以下方法来进行,包括(但不限于)通过史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)(1970)应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2:482c的局部同源算法,通过尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch),(1970)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443的同源比对算法,通过皮尔逊(Pearson)和利普曼(Lipman),(1988)美国国家科学院院刊85:2444的关于类似性方法的探索,通过这些算法(威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遗传学计算机组(GeneticsComputer Group),科学大道575号(575Science Dr.),威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))的计算机化实施,或通过手动比对及目测(参见例如,奥斯贝(Ausubel)等人,分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology),(1995年增刊))进行。
适用于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST及BLAST 2.0算法,其分别描述于奥特查尔(Altschul)等人,(1997)核酸研究(Nuc.Acids Res.)25:3389-3402和奥特查尔等人,(1990)分子生物学杂志215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可公开获得的,可经由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)在万维网ncbi.nlm.nih.gov获得。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数:字长(W)为11,期望值(E)为10,M=5,N=-4,和双链比较。对于氨基酸序列来说,BLASTP程序使用如下默认参数:字长为3,且期望值(E)为10,和BLOSUM62计分矩阵(参见赫尼霍夫(Henikoff)和赫尼霍夫(1992)美国国家科学院院刊89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M=5、N=-4和双链比较。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”过滤器。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参见卡尔琳(Karlin)和奥特查尔(Altschul)(1993)美国国家科学院院刊90:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性量度为最小和概率(smallest sum probability,P(N)),其可指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然出现的匹配的概率。举例来说,如果测试核酸与参考核酸比较的最小和概率小于约0.2、小于约0.01或小于约0.001,那么认为核酸与参考序列相似。
短语“与……选择性(或特异性)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)全细胞或者DNA或RNA文库)中时,分子只与所述序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列在如此项技术中已知的低离子强度和高温条件下杂交。通常,在严格条件下,探针将与其在核酸复杂混合物中的目标子序列(包括(但不限于)全细胞或DNA或RNA文库)杂交但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件与序列相关,并且会随环境不同而不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详尽指导可见于迪杰森(Tijssen),生物化学和分子生物学技术--核酸探针杂交(Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes),“杂交原理和核酸分析策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays)”(1993)中。通常,在指定离子强度pH值下,选择的严格条件比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为平衡时有50%与目标互补的探针与目标序列杂交的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)(当目标序列过量存在时,在Tm下,平衡时有50%探针被占据)。严格条件可为在pH 7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子,通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)为至少约60℃的条件。严格条件也可通过添加如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交,正信号可为背景杂交的至少两倍,任选为背景杂交的10倍。示例性严格杂交条件可如下:50%甲酰胺,5×SSC和1%SDS,在42℃下培育,或5×SSC,1%SDS,在65℃下培育,其中在65℃下以0.2×SSC和0.1%SDS洗涤。所述洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或120分钟以上。
如本文中使用的术语“真核生物”是指属于真核系统发生域的生物体,如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫、原生生物等。
如本文所用的术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说,非真核生物体可属于真细菌系统发生域,包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、极端嗜热细菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluoresceins)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等;或古菌系统发生域,包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌属NRC-1(Halobacterium species NRC-1))、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈嗜热球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)。
如本文所用的术语“个体”是指作为治疗、观察或实验对象的动物,在一些实施例中为哺乳动物,且在一些实施例中为人。
如本文所用的术语“有效量”是指所投与的PDCM的量将在一定程度地减轻所治疗的疾病、病况或病症的一或多种症状。可以投与本文所述的含有PDCM的组合物以用于防治性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强(enhance或enhancing)”是指增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此,就增强治疗剂的作用来说,术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用效力或持续时间的能力。如本文中使用的“增强有效量”是指足以增强所需系统中另一治疗剂作用的量。在用于患者时,适于此用途的有效量将取决于疾病、病症或病况的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的反应,以及治疗医师的判断。
如本文中使用的术语“经修饰”是指对指定多肽进行的任何改变,如多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变;多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。“(经修饰)”形式的术语是指,所讨论的多肽任选经修饰,也就是说,所讨论的多肽可经修饰或不经修饰。
术语“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸在并入多肽链后发生的对所述氨基酸的任何修饰。仅举例来说,这一术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
在防治性应用中,含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与易感于特定疾病、病症或病况或者以其它方式具有这些风险的患者。所述量是定义为“防治有效量”。在这一用途中,精确量也视患者的健康状况、体重等而定。认为通过常规实验(例如剂量递增临床试验)确定所述防治有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“经保护”是指存在防止在某些反应条件下化学反应官能团反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说,如果化学反应性基团为胺或酰肼,那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇,那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(如丁酸或丙酸)或羟基,那么保护基可为苯甲基或烷基(如甲基、乙基或叔丁基)。也可将此项技术中已知的其它保护基用于本文中所述的方法和组合物或者与其一起使用,包括光不稳定性基团,如Nvoc和MeNvoc。此项技术中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物或者与其一起使用。
仅举例来说,封闭基(blocking group)/保护基可选自:
其它保护基描述于格里尼(Greene)和伍兹(Wuts),有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis),第3版,约翰威立父子出版公司(JohnWiley&Sons),纽约州纽约(New York,NY),1999中,所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在治疗应用中,将含有PDCM的组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病、病症或病况的症状的量投与已经罹患所述疾病、病况或病症的患者。所述量是定义为“治疗有效量”,且将视以下因素而定:疾病、病症或病况的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。普遍认为,所属领域的技术人员将能够通过常规实验(例如,剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量。
术语“治疗”用于指防治性和/或治疗性治疗。
本文中呈现的非天然编码氨基酸多肽可包括一或多个原子经原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子置换的经同位素标记的化合物。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素,分别如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文中所述的某些经同位素标记的化合物,例如并有如3H和14C的放射性同位素的化合物,可用于药物和/或底物组织分布分析中。此外,用同位素(如氘,即2H)取代可能因代谢稳定性较高(例如,体内半衰期增加或剂量需求降低)而提供某些治疗优势。
认为包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体和其混合物的所有异构体是本文中所述的组合物的一部分。在其它或其它实施例中,在投与有需要的生物体非天然编码氨基酸多肽后,这些多肽代谢产生代谢物,所述代谢物随后用于产生所需作用,包括所需治疗作用。其它或其它实施例为非天然编码氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些情形下,非天然编码氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。另外,本文中所述的非天然编码氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。也认为本文中揭示所述溶剂化形式。所属领域的技术人员将认识到,本文中的一些化合物可以数种互变异构体形式存在。所有这些互变异构形式都可视为本文中所述组合物的一部分。
除非另外说明,否则采用所属领域技术范围内的常规质谱法、NMR、HPLC、蛋白化学法、生物化学法、重组DNA技术和药理学法。
I.引言
本发明中提供包含一或多个含有至少一个非天然氨基酸的多肽的PDCM。在本发明的某些实施例中,具有至少一个非天然氨基酸的PDCM的多肽组分包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中,所述至少一个翻译后修饰包含分子连接,包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光致交联剂、细胞毒性化合物、核受体配体、类固醇、糖皮质激素受体调节剂、雄激素受体调节剂、肝特异性核受体配体、葡萄糖代谢调节剂、脂质代谢调节剂、放射性核素、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分(photocaged moiety)、光化辐射可激发部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团(intercalating group)、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述任何组合或任何其它所需化合物或物质,其包含采用所属领域的技术人员所已知适用于特定反应性基团的化学方法与包含第一反应性基团的至少一个非天然氨基酸具有反应性的第二反应性基团。举例来说,第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中,其中炔丙基有时也被称作乙炔部分),并且第二反应性基团为叠氮基部分,并利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中,第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中),而第二反应性基团为炔基部分。在本发明经修饰多肽的某些实施例中,使用至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸),其中所述至少一个翻译后修饰包含糖类部分。在某些实施例中,翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中体内进行。连接基团、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可将所述分子与多肽连接。所述分子可与多肽直接连接。
适用于本发明的多肽的代表性非限制性种类包括属于下列治疗剂类别的种类:促肾上腺皮质激素肽、肾上腺髓质素肽(adrenomedullin peptide)、咽侧体抑制素肽、糊精肽(amylin peptide)、淀粉样β-蛋白质片段肽、血管紧张素肽、抗生素肽、抗原多肽、抗微生物肽、细胞凋亡相关肽、心房利尿钠肽、袋细胞肽(bag cell peptide)、铃蟾肽、骨GLA肽、缓激肽(bradykinin peptide)、脑利尿钠肽、C-肽、C型利尿钠肽、降钙素肽、降钙素基因相关肽、CART肽、酪啡肽、趋化性肽、胆囊收缩素肽、集落刺激因子肽、促肾上腺皮质激素释放因子肽、皮质抑素肽、细胞因子肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、内皮素肽、ETa受体拮抗剂肽、ETb受体拮抗剂肽、脑啡肽、纤维粘连蛋白肽、甘丙肽、胃泌素肽、胰高血糖素肽、Gn-RH相关肽、生长因子肽、生长激素肽、GTP结合蛋白片段肽、鸟苷素肽、抑制素肽、胰岛素肽、白介素肽、层粘连蛋白肽、瘦素肽、白细胞激肽(leucokinin peptide)、促黄体激素释放激素肽、肥大脱粒肽(mastoparan)、肥大细胞脱粒肽(mast cell degranulating peptide)、黑素细胞刺激激素肽、吗啡感受素肽(morphiceptin peptide)、胃动素肽、神经肽、神经肽Y肽、嗜神经性因子肽、食欲素肽、阿片样肽(opioid peptide)、催产素肽、PACAP肽、胰抑制素肽、胰多肽、甲状旁腺激素肽、甲状旁腺激素相关肽、肽T肽、促乳激素释放肽、肽YY肽、肾素底物肽、胰泌素肽、生长抑素肽、P物质肽、速激肽(tachykinin peptide)、促甲状腺激素释放激素肽、毒素肽、血管活性肠肽、加压素肽以及病毒相关肽(参见美国专利第6,858,580号)。标题为“利用非天然编码氨基酸的生物合成多肽(Biosynthetic Polypeptides Utilizing Non-Naturally EncodedAmino Acids)”的US 2006/0019347(其以引用的方式并入本文中)描述包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽。
多肽的实例包括(但不限于)垂体激素,如血管加压素、催产素、黑色素细胞刺激激素、促肾上腺皮质激素、生长激素;下丘脑激素,如生长激素释放因素、促皮质素释放因子、促乳素释放肽、促性腺激素释放激素和其相关肽、促黄体激素释放激素、促甲状腺素释放激素、食欲素和生长抑素;甲状腺激素,如降血钙素、降血钙素前体和降血钙素基因相关肽;副甲状腺激素和其相关蛋白质;胰脏激素,如胰岛素和胰岛素样肽、胰高血糖素、生长抑素、胰脏多肽、淀粉素、肽YY和神经肽Y;消化激素,如胃泌素、胃泌素释放肽、胃泌素抑制肽、胆囊收缩素、肠泌素、蠕动素和血管活性肠道肽;利尿钠肽,如心房利尿钠肽、脑利尿钠肽和C型利尿钠肽;神经激肽,如神经激肽A、神经激肽B和物质P;肾素相关肽,如肾素底物和抑制剂和血管紧缩素;内皮素,包括大内皮素、内皮素A受体拮抗剂和角蝰毒素肽(sarafotoxinpeptide);和其它肽,如肾上腺髓素肽、咽侧体抑制素肽、淀粉状蛋白β蛋白质片段、抗生素和抗微生物肽、细胞凋亡相关肽、袋细胞肽、铃蟾素、骨G1a蛋白质肽、CART肽、趋化性肽、皮质抑素肽、纤维粘连蛋白片段和纤维蛋白相关肽、FMRF和类似物肽、甘丙肽和相关肽、生长因子和相关肽、G治疗肽结合蛋白片段、鸟苷素和尿鸟苷素、抑制素肽、白介素和白介素受体蛋白质、层粘连蛋白片段、瘦素片段肽、白细胞激肽、肥大细胞脱粒肽、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、胰抑制素、肽T、多肽、病毒相关肽、信号转导剂、毒素;和各种肽,如佐剂肽类似物、α交配因子、抗心律失常肽、防冻多肽、食欲减退肽、牛松果体抗生育肽、法氏囊肽(bursin)、C3肽P16、肿瘤坏死因子、钙粘素肽、嗜铬粒蛋白A片段、避孕四肽、芋螺抑制肽G、芋螺抑制肽T、甲壳类心脏活性肽、C-端肽、细胞色素b588肽、抗栓肽、美味肽、△-睡眠诱导肽、安定结合抑制剂片段、氧化氮合成酶阻断肽、OVA肽、血小板需钙蛋白酶抑制剂(P1)、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1、年轻因子激活肽(rigin)、精神分裂症相关肽、血清胸腺因子、钠钾A治疗性肽酶抑制剂-1、精子活化肽、精子激活肽、系统素、凝血酶受体激动剂、胸腺体液γ2因子、胸腺五肽、胸腺素α1、胸腺因子、增免疫苏精肽(tuftsin)、脂肪动员激素、尿毒症五肽、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-1)、肠促胰岛素类似物-3、肠促胰岛素类似物-4和其其它治疗性肽或片段。肽的其它实例包括胃内激素、类鸦片肽(酪吗啡肽、皮啡肽、内啡肽、脑啡肽、δ啡肽、强啡肽以及这些物质的类似物和衍生物)、胸腺肽(胸腺生长素、胸腺九肽、胸腺五肽、胸腺素、胸腺体液因子(THF))、细胞粘附肽、补体抑制剂、凝血酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、α-1抗胰蛋白酶、海胆精子活化肽、SHU-9119MC3-R和MC4-R拮抗剂、格拉莫德(glaspimod)(免疫刺激剂、针对细菌感染、真菌感染、免疫缺陷免疫病症、白细胞减少症有用)、HP-228(黑皮质素、针对化学疗法诱发的呕吐、毒性、疼痛、糖尿病、炎症、类风湿性关节炎、肥胖有用)、α2-纤维蛋白溶酶抑制剂(纤维蛋白溶酶抑制剂)、APC肿瘤抑制剂(肿瘤抑制剂,针对肿瘤有用)、早期怀孕因子(免疫抑制剂)、内源性类苯甲二氮肽安定结合抑制剂(受体肽)、γ干扰素(针对白血病有用)、腺性激肽释放素-1(免疫刺激剂)、胎盘核糖核酸酶抑制剂、sarcolecin结合蛋白、表面活性剂蛋白质D、维尔姆斯氏肿瘤抑制剂(wilms'tumorsuppressor)、维尔姆氏肿瘤抑制剂(wilm's tumor suppressor)、GABAB 1b受体肽、朊病毒相关肽(iPrP13)、胆碱结合蛋白片段(细菌相关肽)、端粒酶抑制剂、心抑素肽、内皮生长抑素衍生肽(血管生成抑制剂)、朊病毒抑制肽、D-天冬氨酸N-甲酯受体拮抗剂、C肽类似物(针对糖尿病并发症有用)、RANTES或其片段。参见美国专利6,849,714,其以引用的方式并入本文中。
PDCM的多肽组分的实例包括(但不限于)以下各项。促肾上腺皮质激素(ACTH)肽包括(但不限于)ACTH,人类;ACTH 140;ACTH 1-13,人类;ACTH1-16,人类;ACTH 1-17;ACTH 1-24,人类;ACTH 4-10;ACTH 4-11;ACTH 6-24;ACTH 7-38,人类;ACTH 18-39,人类;ACTH,大鼠;ACTH 12-39,大鼠;β-细胞调理素(ACTH 22-39);生物素基-ACTH 1-24,人类;生物素基-ACTH 7-38,人类;皮质稳定素,人类;皮质稳定素,兔;[Met(02)4,DLys8,Phe9]ACTH 4-9,人类;[Met(0)4,DLys8,Phe9]ACTH 4-9,人类;N-乙酰基,ACTH 1-17,人类;和依比拉肽(ebiratide)。
肾上腺髓素肽包括(但不限于)肾上腺髓素、肾上腺髓素1-52,人类;肾上腺髓素1-12,人类;肾上腺髓素13-52,人类;肾上腺髓素22-52,人类;原肾上腺髓素45-92,人类;原肾上腺髓素153-185,人类;肾上腺髓素1-52,猪;原肾上腺髓素(N-20),猪;肾上腺髓素1-50,大鼠;肾上腺髓素11-50,大鼠;和原AM-N20(原肾上腺髓素N端20肽),大鼠。
咽侧体抑制素肽包括(但不限于)咽侧体抑制素I;咽侧体抑制素II;咽侧体抑制素III;和咽侧体抑制素IV。
糊精肽包括(但不限于)乙酰基-糊精8-37,人类;乙酰化糊精8-37,大鼠;AC187糊精拮抗剂;AC253糊精拮抗剂;AC625糊精拮抗剂;糊精8-37,人类;糊精(IAPP),猫;糊精(胰岛瘤或胰岛淀粉样多肽(IAPP));糊精酰胺,人类;糊精1-13(糖尿病相关肽1-13),人类;糊精20-29(IAPP 20-29),人类;AC625糊精拮抗剂;糊精8-37,人类;糊精(IAPP),猫;糊精,大鼠;糊精8-37,大鼠;生物素基-糊精,大鼠;和生物素基-糊精酰胺,人类。
淀粉样β-蛋白质片段肽包括(但不限于)阿尔茨海默病β-蛋白质12-28(SP17);淀粉样β-蛋白质25-35;淀粉样β/A4-蛋白质前体328-332;淀粉样β/A4蛋白质前体(APP)319-335;淀粉样β-蛋白质1-43;淀粉样β-蛋白质1-42;淀粉样β-蛋白质1-40;淀粉样β-蛋白质10-20;淀粉样β-蛋白质22-35;阿尔茨海默病β-蛋白质(SP28);β-淀粉样肽1-42,大鼠;β-淀粉样肽1-40,大鼠;β-淀粉样1-11;β-淀粉样31-35;β-淀粉样32-35;β-淀粉样35-25;β-淀粉样/A4蛋白质前体96-110;β-淀粉样前体蛋白质657-676;β-淀粉样1-38;[Gln11]-阿尔茨海默病β-蛋白质;[Gln11]-β-淀粉样1-40;[Gln22]-β-淀粉样6-40;阿尔茨海默病淀粉样(NAC)的非Aβ组分;P3,(Aβ17-40)阿尔茨海默病淀粉样P-肽;和SAP(血清淀粉样P组分)194-204。
血管紧张素肽包括(但不限于)A-779;Ala-Pro-Gly-血管紧张素II;[Ile3,Val5]-血管紧张素II;血管紧张素III抗肽;血管生成素片段108-122;血管生成素片段108-123;血管紧张素I转化酶抑制剂;血管紧张素I,人类;血管紧张素I转化酶底物;血管紧张素I 1-7,人类;血管肽素;血管紧张素II,人类;血管紧张素II抗肽;血管紧张素II 1-4,人类;血管紧张素II 3-8,人类;血管紧张素II 4-8,人类;血管紧张素II 5-8,人类;血管紧张素III([Des-Asp1]-血管紧张素II),人类;血管紧张素III抑制剂([Ile7]-血管紧张素III);血管紧张素-转化酶抑制剂(黄鳍鲔(Neothunnus macropterus));[Asn1,Val5]-血管紧张素I,美洲鮟鱇;[Asn1,Val5,Asn9]-血管紧张素I,鲑鱼;[Asn1,Val5,Gly9]-血管紧张素I,鳗鱼;[Asn1,Val5]-血管紧张素I 1-7,鳗鱼,美洲鮟鱇,鲑鱼;[Asn1,Val5]-血管紧张素II;生物素基-血管紧张素I,人类;生物素基-血管紧张素II,人类;生物素基-Ala-Ala-Ala-血管紧张素II;[Des-Asp1]-血管紧张素I,人类;[对氨基苯丙氨酸6]-血管紧张素II;肾素底物(血管紧张素原1-13),人类;前血管紧张素原1-14(肾素底物十四肽),人类;肾素底物十四肽(血管紧张素原1-14),猪;[Sar1]-血管紧张素II,[Sar1]-血管紧张素II 1-7酰胺;[Sar1,Ala8]-血管紧张素II;[Sar1,Ile8]-血管紧张素II;[Sar1,Thr8]-血管紧张素II;[Sar1,Tyr(Me)4]-血管紧张素II(沙姆新(Sarmesin));[Sar1,Val5,Ala8]-血管紧张素II;[Sar1,He7]-血管紧张素III;合成十四肽肾素底物(第2号);[Val4]-血管紧张素III;[Val5]-血管紧张素II;[Val5]-血管紧张素I,人类;[Val5]-血管紧张素I;[Val5,Asn9]-血管紧张素I,牛蛙;和[Val5,Ser9]-血管紧张素I,家禽。
抗生素肽包括(但不限于)Ac-SQNY;牛抗菌肽(bactenecin),牛;CAP 37(20-44);甲氧甲酰基羰基-DPro-DPhe-OBzl;CD36肽P 139-155;CD36肽P 93-110;杀菌肽A-蜂毒肽杂交肽[CA(1-7)M(2-9)NH2];杀菌肽B,游离酸;CYS(Bzl)84CD片段81-92;防御素(人类)HNP-2;皮抑菌肽;免疫刺激肽,人类;乳铁蛋白(牛;BLFC);和爪蟾抗菌肽间隔子。
抗原多肽可引发增强的免疫反应、增强免疫反应和/或引起对包括(但不限于)以下各项的疾病和/或致病剂的防染有效反应:腺病毒;炭疽病;百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussus);肉毒中毒;牛鼻气管炎;粘膜炎布兰汉球菌(Branhamellacatarrhalis);犬肝炎;犬瘟热;衣原体;霍乱;球霉菌病;牛痘;巨细胞病毒;登革热(Dengue fever);登革热弓形体病;白喉;脑炎;肠毒性大肠杆菌;EB病毒(Epstein Barr virus);马脑炎;马传染性贫血;马流感;马肺炎;马鼻病毒;大肠杆菌;猫白血病;黄病毒;球蛋白;流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)b型;流感嗜血菌;百曰咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis);幽门螺杆菌(Helicobacterpylon);嗜血杆菌(hemophilus);肝炎;甲型肝炎;乙型肝炎;丙型肝炎;疱渗病毒;HIV;HIV-1病毒;HIV-2病毒;HTLV;流感;日本脑炎;克雷伯氏菌属(Klebsiellae species);嗜肺性退伍军人杆菌(Legionella pneumophila);利什曼原虫;麻风病;莱姆病;疟疾免疫原;麻疹;脑膜炎;脑膜炎球菌;脑膜炎球菌多糖A类;脑膜炎球菌多糖C类;腮腺炎;腮腺炎病毒;分枝杆菌;结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis);奈瑟氏球菌属(Neisseria);淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea);脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis);绵羊蓝舌;绵羊脑炎;乳头瘤;副流感;副粘病毒;百日咳;鼠疫;肺炎球菌;肺炎肺囊虫(Pneumocystis carinii);肺炎;脊髓灰质炎病毒;变形杆菌属(Proteus species);铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa);狂犬病;呼吸合胞病毒;轮状病毒;风疹;沙门氏菌属(Salmonellae);血吸虫病;志贺氏菌属(Shigellae);猿免疫缺陷病毒;天花;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);葡萄球菌属(Staphylococcusspecies);肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae);酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes);链球菌属(Streptococcus species);猪流感;破伤风;梅毒螺旋体(Treponema pallidum);伤寒;牛痘;水痘带状疱渗病毒;和霍乱弧菌(Vibriocholerae)。
抗微生物肽包括(但不限于)蟾蜍苷元(buforin)I;蟾蜍苷元II;杀菌肽A;杀菌肽B;杀菌肽P1,猪;杰古林(gaegurin)2(粗皮蛙(Rana rugosa));杰古林5(粗皮蛙);吲哚菌肽;protegrin-(PG)-I;爪蟾抗菌肽1;和爪蟾抗菌肽2;和T-22[Tyr5,12,Lys7]-聚-phemusin II肽。
细胞凋亡相关肽包括(但不限于)阿尔茨海默病β-蛋白质(SP28);需钙蛋白酶抑制剂肽;半胱天冬酶-1抑制剂V;半胱天冬酶-3,底物IV;半胱天冬酶-1抑制剂I,细胞可渗透;半胱天冬酶-1抑制剂VI;半胱天冬酶-3底物III,荧光;半胱天冬酶-1底物V,荧光;半胱天冬酶-3抑制剂I,细胞可渗透;半胱天冬酶-6ICE抑制剂III;[Des-Ac,生物素]-ICE抑制剂III;IL-1B转化酶(ICE)抑制剂II;IL-1B转化酶(ICE)底物IV;MDL 28170;和MG-132。
心房利尿钠肽包括(但不限于)α-ANP(α-chANP),鸡;安南汀(anantin);ANP 1-11,大鼠;ANP 8-30,蛙;ANP 11-30,蛙;ANP-21(fANP-21),蛙;ANP-24(fANP-24),蛙;ANP-30,蛙;ANP片段5-28,人类,犬;ANP-7-23,人类;ANP片段7-28,人类,犬;α-心房利尿钠多肽1-28,人类,犬;A71915,大鼠;心房利尿钠因子8-33,大鼠;心房利尿钠多肽3-28,人类;心房利尿钠多肽4-28,人类,犬;心房利尿钠多肽5-27;人类;心房利尿钠肽(ANP),鳗鱼;心钠素I,大鼠,兔,小鼠;心钠素II,大鼠,兔,小鼠;心钠素III,大鼠,兔,小鼠;心房利尿钠因子(rANF),大鼠,心耳肽A(大鼠ANF 126-149);心耳肽B(大鼠ANF126-150);β-ANP(1-28,二聚物,反平行);β-rANF 17-48;生物素基-α-ANP 1-28,人类,犬;生物素基-心房利尿钠因子(生物素基-rANF),大鼠;心舒血管素1-16,人类;C-ANF 4-23,大鼠;Des-[Cys105,Cys121]-心房利尿钠因子104-126,大鼠;[Met(O)12]ANP 1-28,人类;[Mpr7,DAla9]ANP 7-28,酰胺,大鼠;前原-ANF 104-116,人类;前原-ANF 26-55(原ANF 1-30),人类;前原-ANF 56-92(原ANF 31-67),人类;前原-ANF 104-123,人类;[Tyr0]-心钠素I,大鼠,兔,小鼠;[Tyr0]-心钠素II,大鼠,兔,小鼠;[Tyr0-前原ANF 104-123,人类;尿钠素(CDD/ANP 95-126);血管利尿钠肽(VNP),鳗鱼;和血管利尿钠肽(VNP),虹鳟鱼。
袋细胞肽包括(但不限于)α袋细胞肽;α-袋细胞肽1-9;α-袋细胞肽1-8;α-袋细胞肽1-7;β-袋细胞因子和γ-袋细胞因子。
铃蟾肽包括(但不限于)α-s1酪蛋白101-123(牛乳);生物素基-铃蟾肽;铃蟾肽8-14;铃蟾肽;[Leu13-psi(CH2NH)Leu14]-铃蟾肽;[D-Phe6,Des-Met14]-铃蟾肽6-14乙酰胺;[DPhe12]铃蟾肽;[DPhe12,Leu14]-铃蟾肽;[Tyr4]-铃蟾肽;和[Tyr4,DPhe12]-铃蟾肽。
骨GLA肽(BGP)包括(但不限于)骨GLA蛋白质;骨GLA蛋白质45-49;[Glu17,Gla21,24]-骨钙蛋白1-49,人类;myclopeptide-2(MP-2);骨钙蛋白1-49,人类;骨钙蛋白37-49,人类;和[Tyr38,Phe42,46]骨GLA蛋白质38-49,人类。
缓激肽包括(但不限于)[Ala2,6,des-Pro3]-缓激肽;缓激肽;缓激肽(弓鳍鱼,雀鳝);缓激肽增强肽;缓激肽1-3;缓激肽1-5;缓激肽1-6;缓激肽1-7;缓激肽2-7;缓激肽2-9;[DPhe7]缓激肽;[Des-Arg9]-缓激肽;[Des-Arg10]-Lys-缓激肽([Des-Arg10]-胰激肽);[D-N-Me-Phe7]-缓激肽;[Des-Arg9,Leu8]-缓激肽;Lys-缓激肽(胰激肽);Lys-(Des-Arg9,Leu]-缓激肽([Des-Arg10,Leu9]-胰激肽);[Lys0-Hyp3]-缓激肽;卵激肽;[Lys0,Ala3]-缓激肽;Met-Lys-缓激肽;肽K12缓激肽增强肽;[(pCl)Phe5,8]-缓激肽;T-激肽(Ile-Ser-缓激肽);[Thi5,8,D-Phe7]-缓激肽;[Tyr0]-缓激肽;[Tyr5]-缓激肽;[Tyr8]-缓激肽;和激肽释放酶。
脑利尿钠肽(BNP)包括(但不限于)BNP 32,犬;BNP样肽,鳗鱼;BNP-32,人类;BNP-45,小鼠;BNP-26,猪;BNP-32,猪;生物素基-BNP-32,猪;BNP-32,大鼠;生物素基-BNP-32,大鼠;BNP45(BNP 51-95,5K心利尿钠肽),大鼠;和[Tyr0]-BNP 1-32,人类。
C-肽包括(但不限于)C-肽;和[Tyr0]-C-肽,人类。
C型利尿钠肽(CNP)包括(但不限于)C型利尿钠肽,鸡;C型利尿钠肽-22(CNP-22),猪,大鼠,人类;C型利尿钠肽-53(CNP-53),人类;C型利尿钠肽-53(CNP-53),猪,大鼠;C型利尿钠肽-53(猪,大鼠)1-29(CNP-531-29);前原-CNP 1-27,大鼠;前原-CNP 30-50,猪,大鼠;血管钠肽(VNP);和[Tyr0]-C型利尿钠肽-22([Tyr0]-CNP-22)。
降钙素肽包括(但不限于)生物素基-降钙素,人类;生物素基-降钙素,大鼠;生物素基-降钙素,鲑鱼;降钙素,鸡;降钙素,鳗鱼;降钙素,人类;降钙素,猪;降钙素,大鼠;降钙素,鲑鱼;降钙素1-7,人类;降钙素8-32,鲑鱼;钙抑肽(PDN-21)(C-原降钙素);和N-proCT(氨基端原降钙素裂解肽),人类。
降钙素基因相关肽(CGRP)包括(但不限于)乙酰基-α-CGRP 19-37,人类;α-CGRP 19-37,人类;α-CGRP 23-37,人类;生物素基-CGRP,人类;生物素基-CGRPII,人类;生物素基-CGRP,大鼠;β-CGRP,大鼠;生物素基-β-CGRP,大鼠;CGRP,大鼠;CGRP,人类;降钙素C-末端相邻肽;CGRP 1-19,人类;CGRP 20-37,人类;CGRP 8-37,人类;CGRP II,人类;CGRP,大鼠;CGRP 8-37,大鼠;CGRP 29-37,大鼠;CGRP 30-37,大鼠;CGRP 31-37,大鼠;CGRP 32-37,大鼠;CGRP 33-37,大鼠;CGRP 31-37,大鼠;([Cys(Acm)2,7]-CGRP;依降钙素;[Tyr0]-CGRP,人类;[Tyr0]-CGRP II,人类;[Tyr0]-CGRP 28-37,大鼠;[Tyr0]-CGRP,大鼠;和[Tyr22]-CGRP 22-37,大鼠。
CART肽包括(但不限于)CART,人类;CART 55-102,人类;CART,大鼠;和CART 55-102,大鼠。
酪啡肽包括(但不限于)β-酪啡肽,人类;β-酪啡肽1-3;β-酪啡肽1-3,酰胺;β-酪啡肽,牛;β-酪啡肽1-4,牛;β-酪啡肽1-5,牛;β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;β-酪啡肽1-6,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-3,酰胺,牛;[DAla2,Hyp4,Tyr5]-β-酪啡肽1-5酰胺;[DAla2,DPro4,Tyr5]-β-酪啡肽1-5,酰胺;[DAla2,Tyr5]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2,4,Tyr5]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2,(pCl)Phe3]-β-酪啡肽,酰胺,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-4,酰胺,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-5,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2,Met5]-β-酪啡肽1-5,牛;[DPro2]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-6,牛;[DPro2]-β-酪啡肽1-4,酰胺;[Des-Tyr1]-β-酪啡肽,牛;[DAla2,4,Tyr5]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2,(pCl)Phe3]-β-酪啡肽,酰胺,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-4,酰胺,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-5,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2,Met5]-β-酪啡肽1-5,牛;[DPro2]-β-酪啡肽1-5,酰胺,牛;[DAla2]-β-酪啡肽1-6,牛;[DPro2]-β-酪啡肽1-4,酰胺;[Des-Tyr1]-β-酪啡肽,牛;和[Val3]-β-酪啡肽1-4,酰胺,牛。
趋化性肽包括(但不限于)防卫素1(人类)HNP-1(人类中性粒细胞肽-1);和N-甲酰基-Met-Leu-Phe。
胆囊收缩素肽(CCK)肽包括(但不限于)蛙皮素;胆囊收缩素肽;胆囊收缩素肽-促胰酶素;CCK-33,人类;胆囊收缩素肽八肽1-4(未硫酸化)(CCK 26-29,未硫酸化);胆囊收缩素肽八肽(CCK 26-33);胆囊收缩素肽八肽(未硫酸化)(CCK26-33,未硫酸化);胆囊收缩素肽七肽(CCK 27-33);胆囊收缩素肽四肽(CCK 30-33);CCK-33,猪;CR 1409,胆囊收缩素肽拮抗剂;CCK侧翼肽(未硫酸化);N-乙酰基胆囊收缩素肽,CCK 26-30,硫酸化;N-乙酰基胆囊收缩素肽,CCK 26-31,硫酸化;N-乙酰基胆囊收缩素肽,CCK 26-31,未硫酸化;前原CCK片段V-9-M;和丙谷胺。
集落刺激因子肽包括(但不限于)集落刺激因子(CSF);GMCSF;MCSF;和G-CSF。
促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)肽包括(但不限于)astressin;α-螺旋CRF12-41;生物素基-CRF,绵羊;生物素基-CRF,人类,大鼠;CRF,牛;CRF,人类,大鼠;CRF,绵羊;CRF,猪;[Cys21]-CRF,人类,大鼠;CRF拮抗剂(α-螺旋CRF 9-41);CRF 6-33,人类,大鼠;[DPro5]-CRF,人类,大鼠;[D-Phe12,Nle21,38]-CRF 12-41,人类,大鼠;嗜酸细胞趋化肽;[Met(0)21]-CRF,绵羊;[Nle21,Tyr32]-CRF,绵羊;前原CRF 125-151,人类;蛙皮降压肽,蛙;[Tyr0]-CRF,人类,大鼠;[Tyr0]-CRF,绵羊;[Tyr0]-CRF 34-41,绵羊;[Tyr0]-尿皮质素;尿皮质素酰胺,人类;尿皮质素,大鼠;硬骨鱼紧张肽I(白亚口鱼(Catostomus commersoni));硬骨鱼紧张肽II;和硬骨鱼紧张肽II(湖蛙(Rana ridibunda))。
皮质抑素肽包括(但不限于)皮质抑素29;皮质抑素29(1-13);[Tyr0]-皮质抑素29;原-皮质抑素28-47;和原-皮质抑素51-81。
细胞因子肽包括(但不限于)肿瘤坏死因子;和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)。
皮啡肽包括(但不限于)皮啡肽和皮啡肽类似物1-4。
强啡肽包括(但不限于)大强啡肽(原强啡肽209-240),猪;生物素基-强啡肽A(生物素基-原强啡肽209-225);[DAla2,DArg6]-强啡肽A 1-13,猪;[D-Ala2]-强啡肽A,猪;[D-Ala2]-强啡肽A酰胺,猪;[D-Ala2]-强啡肽A 1-13,酰胺,猪;[D-Ala2]-强啡肽A 1-9,猪;[DArg6]-强啡肽A 1-13,猪;[DArg8]-强啡肽A 1-13,猪;[Des-Tyr1]-强啡肽A 1-8;[D-Pro10]-强啡肽A 1-11,猪;强啡肽A酰胺,猪;强啡肽A 1-6,猪;强啡肽A 1-7,猪;强啡肽A 1-8,猪;强啡肽A 1-9,猪;强啡肽A 1-10,猪;强啡肽A 1-10酰胺,猪;强啡肽A 1-11,猪;强啡肽A 1-12,猪;强啡肽A 1-13,猪;强啡肽A 1-13酰胺,猪;DAKLI(强啡肽A-类似物κ配体);DAKLI-生物素([Arg11,13]-强啡肽A(1-13)-Gly-NH(CH2)5NH-生物素);强啡肽A 2-17,猪;强啡肽2-17,酰胺,猪;强啡肽A 2-12,猪;强啡肽A 3-17,酰胺,猪;强啡肽A 3-8,猪;强啡肽A 3-13,猪;强啡肽A 3-17,猪;强啡肽A 7-17,猪;强啡肽A8-17,猪;强啡肽A 6-17,猪;强啡肽A 13-17,猪;强啡肽A(原强啡肽209-225),猪;强啡肽B 1-9;[MeTyr1,MeArg7,D-Leu8]-强啡肽1-8乙酰胺;[(nMe)Tyr1]强啡肽A 1-13,酰胺,猪;[Phe7]-强啡肽A 1-7,猪;[Phe7]-强啡肽A 1-7,酰胺,猪;和原强啡肽228-256(强啡肽B 29)(亮脑啡肽),猪。
内啡肽包括(但不限于)α-新-内啡肽,猪;β-新内啡肽;Ac-β-内啡肽,骆驼,牛,绵羊;Ac-β-内啡肽1-27,骆驼,牛,绵羊;Ac-β-内啡肽,人类;Ac-β-内啡肽1-26,人类;Ac-β-内啡肽1-27,人类;Ac-γ-内啡肽(Ac-β-促脂解素61-77);乙酰基-α-内啡肽;α-内啡肽(β-促脂解素61-76);α-新-内啡肽类似物;α-新-内啡肽1-7;[Arg8]-α-新内啡肽1-8;β-内啡肽(β-促脂解素61-91),骆驼,牛,绵羊;β-内啡肽1-27,骆驼,牛,绵羊;β-内啡肽,马;β-内啡肽(β-促脂解素61-91),人类;β-内啡肽(l-5)+(16-31),人类;β-内啡肽1-26,人类;β-内啡肽1-27,人类;β-内啡肽6-31,人类;β-内啡肽18-31,人类;β-内啡肽,猪;β-内啡肽,大鼠;β-促脂解素1-10,猪;β-促脂解素60-65;β-促脂解素61-64;β-促脂解素61-69;β-促脂解素88-91;生物素基-β-内啡肽(生物素基-β-促脂解素61-91);生物胞素-β-内啡肽,人类;γ-内啡肽(β-促脂解素61-77);[DAla2]-α-新-内啡肽1-2,酰胺;[DAla2]-β-促脂解素61-69;[DAla2]-γ-内啡肽;[Des-Tyr1]-β-内啡肽,人类;[Des-Tyr1]-γ-内啡肽(β-促脂解素62-77);[Leu5]-β-内啡肽,骆驼,牛,绵羊;[Met5,Lys6]-α-新-内啡肽1-6;[Met,Lys6,7]-α-新-内啡肽1-7;和[Met5,Lys6,Arg7]-α-新-内啡肽1-7。
内皮素肽包括(但不限于)内皮素-1(ET-1);内皮素-1[生物素-Lys9];内皮素-1(1-15),人类;内皮素-1(1-15),酰胺,人类;Ac-内皮素-1(16-21),人类;Ac-[DTrpl6]-内皮素-1(16-21),人类;[Ala3,11]-内皮素-1;[Dprl,Asp15]-内皮素-1;[Ala2]-内皮素-3,人类;[Ala18]-内皮素-1,人类;[Asn18]-内皮素-1,人类;[Res-701-1]-内皮素B受体拮抗剂;Suc-[Glu9,Ala11,15]-内皮素-1(8-21),IRL-1620;内皮素-C-末端六肽;[D-Val22]-大内皮素-1(16-38),人类;内皮素-2(ET-2),人类,犬;内皮素-3(ET-3),人类,大鼠,猪,兔;生物素基-内皮素-3(生物素基-ET-3);前原-内皮素-1(94-109),猪;BQ-518;BQ-610;BQ-788;内皮依赖性松弛拮抗剂;FR139317;IRL-1038;JKC-301;JKC-302;PD-145065;PD-142893;角蝰毒素S6a(以色列穴蝰(atractaspis engaddensis));角蝰毒素S6b(以色列穴蝰);角蝰毒素S6c(以色列穴蝰);[Lys4]-角蝰毒素S6c;角蝰毒素S6d;大内皮素-1,人类;生物素基-大内皮素-1,人类;大内皮素-1(1-39),猪;大内皮素-3(22-41),酰胺,人类;大内皮素-1(22-39),大鼠;大内皮素-1(1-39),牛;大内皮素-1(22-39),牛;大内皮素-1(19-38),人类;大内皮素-1(22-38),人类;大内皮素-2,人类;大内皮素-2(22-37),人类;大内皮素-3,人类;大内皮素-1,猪;大内皮素-1(22-39)(前原-内皮素-1(74-91));大内皮素-1,大鼠;大内皮素-2(1-38),人类;大内皮素-2(22-38),人类;大内皮素-3,大鼠;生物素基-大内皮素-1,人类;和[Tyr123]-前原-内皮素(110-130),酰胺,人类。
ETa受体拮抗剂肽包括(但不限于)[BQ-123];[BE18257B];[BE-18257A]/[W-7338A];[BQ-485];FR139317;PD-151242;和TTA-386。
ETb受体拮抗剂肽包括(但不限于)[BQ-3020];[RES-701-3];和[IRL-1720]。
脑啡肽包括(但不限于)adrenorphin,游离酸;amidorphin(原脑啡肽A(104-129)-NH2),牛;BAM-12P(牛肾上腺髓质十二肽);BAM-22P(牛肾上腺髓质二十二肽);苯甲酰基-Phe-Ala-Arg;脑啡肽;[D-Ala2,D-Leu5]-脑啡肽;[D-Ala2,D-Met5]-脑啡肽;[DAla2]-Leu-脑啡肽,酰胺;[DAla2,Leu5,Arg6]-脑啡肽;[Des-Tyr1,DPen2,5]-脑啡肽;[Des-Tyr1,DPen2,Pen5]-脑啡肽;[Des-Tyr1]-Leu-脑啡肽;[D-Pen2,5]-脑啡肽;[DPen2,Pen5]-脑啡肽;脑啡肽酶底物;[D-Pen2,pCI-Phe4,D-Pen5]-脑啡肽;Leu-脑啡肽;Leu-脑啡肽,酰胺;生物素基-Leu-脑啡肽;[D-Ala2]-Leu-脑啡肽;[D-Ser2]-Leu-脑啡肽-Thr(Δ-受体肽)(DSLET);[D-Thr2]-Leu-脑啡肽-Thr(DTLET);[Lys6]-Leu-脑啡肽;[Met5,Arg6]-脑啡肽;[Met5,Arg6-脑啡肽-Arg;[Met5,Arg6,Phe7]-脑啡肽,酰胺;Met-脑啡肽;生物素基-Met-脑啡肽;[D-Ala2]-Met-脑啡肽;[D-Ala2]-Met-脑啡肽,酰胺;Met-脑啡肽-Arg-Phe;Met-脑啡肽,酰胺;[Ala2]-Met-脑啡肽,酰胺;[DMet2,Pro5]-脑啡肽,酰胺;[DTrp2]-Met-脑啡肽,酰胺,metorphinamide(adrenorphin);肽B,牛;3200道尔顿肾上腺肽E,牛;肽F,牛;前原脑啡肽B186-204,人类;spinorphin,牛;和thiorphan(D,L,3-巯基-2-苯甲基丙酰基-甘氨酸)。
纤维粘连蛋白肽包括(但不限于)血小板因子-4(58-70),人类;锯鳞血抑肽(锯鳞蝰(Echis carinatus));E,P,L选择蛋白保守区;纤维粘连蛋白类似物;纤维粘连蛋白-结合蛋白;血纤肽A,人类;[Tyr0]-血纤肽A,人类;血纤肽B,人类;[Glu1]-血纤肽B,人类;[Tyr15]-血纤肽B,人类;24-42的血纤原β-链片段;血纤原结合抑制剂肽;纤维粘连蛋白相关肽(胶原结合片段);血纤溶解抑制因子;FN-C/H-1(纤维粘连蛋白肝素-结合片段);FN-C/H-V(纤维粘连蛋白肝素-结合片段);肝素-结合肽;层粘连蛋白五肽,酰胺;Leu-Asp-Val-NH2(LDV-NH2),人类,牛,大鼠,鸡;坏死血纤蛋白,人类;坏死血纤蛋白,大鼠;和血小板膜糖蛋白IIB肽296-306。
甘丙肽包括(但不限于)甘丙肽,人类;甘丙肽1-19,人类;前原甘丙肽1-30,人类;前原甘丙肽65-88,人类;前原甘丙肽89-123,人类;甘丙肽,猪;甘丙肽1-16,猪,大鼠;甘丙肽,大鼠;生物素基-甘丙肽,大鼠;前原甘丙肽28-67,大鼠;甘丙肽1-13-缓激肽2-9,酰胺;M40,甘丙肽1-13-Pro-Pro-(Ala-Leu)2-Ala-酰胺;C7,甘丙肽1-13-spantide-酰胺;GMAP 1-41,酰胺;GMAP 16-41,酰胺;GMAP 25-41,酰胺;galantide;和肠-肛褶蛙肽。
胃泌素肽包括(但不限于)胃泌素,鸡;胃抑制肽(GIP),人类;胃泌素I,人类;生物素基-胃泌素I,人类;大胃泌素-1,人类;胃泌素释放肽,人类;胃泌素释放肽1-16,人类;胃抑制多肽(GIP),猪;胃泌素释放肽,猪;生物素基-胃泌素释放肽,猪;胃泌素释放肽14-27,猪,人类;小胃泌素,大鼠;五胃泌素;胃抑制肽1-30,猪;胃抑制肽1-30,酰胺,猪;[Tyr0-胃抑制肽23-42,人类;和胃抑制肽,大鼠。
胰高血糖素肽包括(但不限于)[Des-His1,Glu9]-胰高血糖素,延伸素-4,胰高血糖素,人类;生物素基-胰高血糖素,人类;胰高血糖素19-29,人类;胰高血糖素22-29,人类;[Des-His1-Glu9-胰高血糖素,酰胺;胰高血糖素样肽1,酰胺;胰高血糖素样肽1,人类;胰高血糖素样肽1(7-36);胰高血糖素样肽2,大鼠;生物素基-胰高血糖素样肽-1(7-36)(生物素基-前原胰高血糖素78-107,酰胺);胰高血糖素样肽2,人类;干预肽-2;胃泌酸调节素/胰高血糖素37;和缬酪肽(肽VQY),猪。
Gn-RH相关肽(GAP)包括(但不限于)Gn-RH相关肽25-53,人类;Gn-RH相关肽1-24,人类;Gn-RH相关肽1-13,人类;Gn-RH相关肽1-13,大鼠;促性腺激素释放肽,滤泡,人类;[Tyr0]-GAP([Tyr0]-Gn-RH前体肽14-69),人类;和阿皮素原(POMC)前体27-52,猪。
生长因子肽包括(但不限于)细胞生长因子;表皮生长因子;肿瘤生长因子;α-TGF;β-TF;α-TGF 34-43,大鼠;EGF,人类;酸性成纤维细胞生长因子;碱性成纤维细胞生长因子;碱性成纤维细胞生长因子13-18;碱性成纤维细胞生长因子120-125;脑源性酸性成纤维细胞生长因子1-11;脑源性碱性成纤维细胞生长因子1-24;脑源性酸性成纤维细胞生长因子102-111;[Cys(Acm20,31)]-表皮生长因子20-31;表皮生长因子受体肽985-996;胰岛素样生长因子(IGF)-I,鸡;IGF-I,大鼠;IGF-I,人类;脱(1-3)IGF-I,人类;R3IGF-I,人类;R3IGF-I,人类;长R3IGF-I,人类;佐剂肽类似物;食欲减退肽;脱(1-6)IGF-II,人类;R6IGF-II,人类;IGF-I类似物;IGF I(24-41);IGF I(57-70);IGF I(30-41);IGF II;IGF II(33-40);[Tyr0]-IGF II(33-40);肝细胞生长因子;肝素结合细胞因子;肝素结合细胞因子60-121,人类;N-乙酰基,α-TGF 34-43,甲酯,大鼠;神经生长因子(NGF),小鼠;血小板衍生生长因子;血小板衍生生长因子拮抗剂;转化生长因子-α,人类;和转化生长因子-I,大鼠。
生长激素肽包括(但不限于)生长激素(hGH),人类;生长激素1-43,人类;生长激素6-13,人类;生长激素释放因子,人类;生长激素释放因子,牛;生长激素释放因子,猪;生长激素释放因子1-29,酰胺,大鼠;生长激素原-释放因子,人类;生物素基-生长激素释放因子,人类;生长激素释放因子1-29,酰胺,人类;[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29,酰胺,人类;[N-Ac-Tyr1,D-Arg2]-GRF 1-29,酰胺;[His1,Nle27]-生长激素释放因子1-32,酰胺;生长激素释放因子1-37,人类;生长激素释放因子1-40,人类;生长激素释放因子1-40,酰胺,人类;生长激素释放因子30-44,酰胺,人类;生长激素释放因子,小鼠;生长激素释放因子,绵羊;生长激素释放因子,大鼠;生物素基-生长激素释放因子,大鼠;GHRP-6([His1,Lys6]-GHRP);海沙瑞林(hexarelin)(生长激素释放六肽);和[D-Lys3]-GHRP-6。
GTP-结合蛋白片段肽包括(但不限于)[Arg8]-GTP-结合蛋白片段,Gsα;GTP-结合蛋白片段,Gβ;GTP-结合蛋白片段,Gα;GTP-结合蛋白片段,Goα;GTP-结合蛋白片段,Gsα;和GTP-结合蛋白片段,Gαi2。
鸟苷素肽包括(但不限于)鸟苷素,人类;鸟苷素,大鼠;和尿鸟苷素。
抑制素肽包括(但不限于)抑制素,牛;抑制素,α-亚单位1-32,人类;[Tyr0]-抑制素,α-亚单位1-32,人类;精浆抑制素样肽,人类;[Tyr0]-精浆抑制素样肽,人类;抑制素,α-亚单位1-32,猪;和[Tyr0]-抑制素,α-亚单位1-32,猪。
胰岛素肽包括(但不限于)胰岛素,人类;胰岛素,猪;IGF-I,人类;胰岛素样生长因子II(69-84);原-胰岛素样生长因子II(68-102),人类;原-胰岛素样生长因子II(105-128),人类;[AspB28]-胰岛素,人类;[LysB28]-胰岛素,人类;[LeuB28]-胰岛素,人类;[ValB28]-胰岛素,人类;[AlaB28]-胰岛素,人类;[AspB28,ProB29]-胰岛素,人类;[LysB28,ProB29]-胰岛素,人类;[LeuB28,ProB29]-胰岛素,人类;[ValB28,Pro829]-胰岛素,人类;[AlaB28,ProB29]-胰岛素,人类;[GlyA21]-胰岛素,人类;[GlyA21GlnB3]-胰岛素,人类;[AlaA21]-胰岛素,人类;[AlaA21GlnB3]胰岛素,人类;[GlnB3]-胰岛素,人类;[GlnB30]-胰岛素,人类;[GlyA21GluB30]-胰岛素,人类;[GlyA21GlnB3GluB30]-胰岛素,人类;[GlnB3GluB30]-胰岛素,人类;B22-B30胰岛素,人类;B23-B30胰岛素,人类;B25-B30胰岛素,人类;B26-B30胰岛素,人类;B27-B30胰岛素,人类;B29-B30胰岛素,人类;人类胰岛素的A链和人类胰岛素的B链。
白介素肽包括(但不限于)白介素-1β165-181,大鼠;和白介素-8(IL-8,CfNC/gro),大鼠。
层粘连蛋白肽包括(但不限于)层粘连蛋白;α1(I)-CB3435-438,大鼠;和层粘连蛋白结合抑制剂。
瘦素肽包括(但不限于)瘦素93-105,人类;瘦素22-56,大鼠;Tyr-瘦素26-39,人类;和瘦素116-130,酰胺,小鼠。
白细胞激肽包括(但不限于)白细胞抑激肽(LMS);白细胞焦激肽(LPK);白细胞激肽I;白细胞激肽II;白细胞激肽III;白细胞激肽IV;白细胞激肽VI;白细胞激肽VII;和白细胞激肽VIII。
促黄体激素释放激素肽包括(但不限于)安肽;Gn-RH II,鸡;促黄体激素释放激素(LH-RH)(GnRH);生物素基-LH-RH;西曲瑞克(cetrorelix)(D-20761);[D-Ala6]-LH-RH;[Gln8]-LH-RH(鸡LH-RH);[DLeu6,Val7]LH-RH 1-9,乙酰胺;[D-Lys6]-LH-RH;[D-Phe2,Pro3,D-Phe6]-LH-RH;[DPhe2,DAla6]LH-RH;[脱-Gly10]-LH-RH,乙酰胺;[D-Ala6,脱-Gly10]-LH-RH,乙酰胺;[DTrp6]-LH-RH,乙酰胺;[D-Trp6,脱-Gly10]-LH-RH,乙酰胺(地洛瑞林(Deslorelin));[DSer(But)6,脱-Gly10]-LH-RH,乙酰胺;乙酰胺;亮丙瑞林(leuprolide);LH-RH 4-10;LH-RH 7-10;LH-RH,游离酸;LH-RH,八目鳗;LH-RH,鲑鱼;[Lys8]-LH-RH;[Trp7,Leu8]LH-RH,游离酸;和[(t-Bu)DSer6,(Aza)Gly10]-LH-RH。
肥大脱粒肽包括(但不限于)肥大脱粒肽;mas7;mas8;mas17;和肥大脱粒肽X。
肥大细胞脱粒肽包括(但不限于)肥大细胞脱粒肽HR-1;和肥大细胞脱粒肽HR-2。
黑素细胞刺激激素(MSH)肽包括(但不限于)[Ac-Cys4,DPhe7,Cys10]α-MSH 4-13,酰胺;α-黑素细胞刺激激素;α-MSH,游离酸;β-MSH,猪;生物素基-α-黑素细胞刺激激素;生物素基-[Nle4,D-Phe7]α-黑素细胞刺激激素;[脱-乙酰基]-α-MSH;[DPhe7]-α-MSH,酰胺;γ-1-MSH,酰胺;[Lys0]-γ-1-MSH,酰胺;MSH释放抑制因子,酰胺;[Nle4]-α-MSH,酰胺;[Nle4,D-Phe7]-α-MSH;N-乙酰基,[Nle4,DPhe7]α-MSH 4-10,酰胺;β-MSH,人类;和γ-MSH。
吗啡感受素肽包括(但不限于)吗啡感受素(β-酪啡肽1-4酰胺);[D-Pro4]-吗啡感受素;和[N-MePhe3,D-Pro4]-吗啡感受素。
胃动素肽包括(但不限于)胃动素,犬;胃动素,猪;生物素基-胃动素,猪;和[Leu13]-胃动素,猪。
神经肽包括(但不限于)Ac-Asp-Glu;玛瑙螺属心脏兴奋肽-1(ACEP-1)(褐云玛瑙(Achatina fulica));脂肪动员激素(AKH)(蝗虫);脂肪动员激素(玉米夜蛾(Heliothis zea)和烟草天蛾(Manduca Sexta));产婆蟾肽(alytesin);北美黑虻(Tabanus atratus)脂肪动员激素(Taa-AKH);脂肪动员激素II(马尔加什飞蝗(Locusta migratoria));脂肪动员激素II(沙漠蝗(Schistocera gregaria));脂肪动员激素III(AKH-3);脂肪动员激素G(AKH-G)(二点蟋蟀(Gryllus bimaculatus));促咽侧体神经肽(AT)(烟草天蛾);促咽侧体神经肽6-13(烟草天蛾);APGW酰胺(静水椎实螺(Lymnaea stagnalis));颊肽;小脑肽;[脱-Ser1]-小脑肽;黑化诱导神经肽(美洲蟑螂(American Cockroach)美洲大蠊(Periplaneta americana));甲壳类心脏活性肽(CCAP);甲壳类红色素细胞;DF2(克氏原螯虾(Procambarus clarkii));地西泮结合抑制剂片段,人类;地西泮结合抑制剂片段(ODN);章鱼唾腺精相关肽;FMRF酰胺(软体动物心脏兴奋性神经肽);Gly-Pro-Glu(GPE),人类;颗粒释放肽R;头激活神经肽;[His7]-黑化诱导神经肽;粘性昆虫高海藻糖因子II;北美黑虻低海藻糖激素(Taa-HoTH);盐酸异去甲槟榔次碱;甲碘荷包牡丹碱;哌啶-4-磺酸;阿黑皮素原(POMC)的连接肽,牛;连接肽,大鼠;KSAYMRF酰胺(腐生线虫(P.redivivus));肛褶蛙肽;运动升压素;levitide;雨滨蛙肽;LUQ 81-91(加利福尼亚雨虎(Aplysia californica));LUQ 83-91(加利福尼亚雨虎);肌活性肽I(Periplanetin CC-I)(神经激素D);肌活性肽II(Periplanetin CC-2);肌调蛋白;神经元特异性肽;神经元特异性烯醇酶404-443,大鼠;神经肽FF;神经肽K,猪;NEI(前原MCH 131-143)神经肽,大鼠;NGE(前原MCH 110-128)神经肽,大鼠;NF1(克氏原螯虾);PBAN-1(家蚕(Bombyx mori));Hez-PBAN(棉铃虫(Heliothis zea));SCPB(来自雨虎属的心脏活性肽);分泌神经素,大鼠;耳腺蛙肽;urechistachykinin I;urechistachyldnin II,爪蟾肽相关肽I;爪蟾肽相关肽II;足肽(Pep),雨虎属;肽F1,龙虾;叶母素;蜂舒缓肥大脱粒肽;原肛肽;豹蛙肽;Ro I(钝蝗(Lubber Grasshopper),猛蝗(Romalea microptera));Ro II(钝蝗,猛蝗);SALMF酰胺1(S1);SALMF酰胺2(S2);和SCPA。
神经肽Y(NPY)肽包括(但不限于)[Leu31,Pro34]-神经肽Y,人类;神经肽F(扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa));B1BP3226NPY拮抗剂;Bis(31/31'){[Cys31,Trp32,Nva34]NPY 31-36};神经肽Y,人类,大鼠;神经肽Y 1-24酰胺,人类;生物素基-神经肽Y;[D-Tyr27,36,D-Thr32]-NPY 27-36;脱10-17(环7-21)[Cys7,21,Pro34]-NPY;C2-NPY;[Leu31,Pro34]神经肽Y,人类神经肽Y,游离酸,人类;神经肽Y,游离酸,猪;前原NPY 68-97,人类;N-乙酰基-[Leu28,Leu31]NPY24-36;神经肽Y,猪;[D-Trp32]-神经肽Y,猪;[D-Trp32]NPY 1-36,人类;[Leu17,DTrp32]神经肽Y,人类;[Leu31,Pro34]-NPY,猪;NPY 2-36,猪;NPY 3-36,人类;NPY 3-36,猪;NPY 13-36,人类;NPY 13-36,猪;NPY 16-36,猪;NPY18-36,猪;NPY 20-36;NFY 22-36;NPY 26-36;[Pro34]-NPY 1-36,人类;[Pro34]-神经肽Y,猪;PYX-1;PYX-2;T4-[NPY(33-36)]4;和Tyr(OMe)21]-神经肽Y,人类。
嗜神经性因子肽包括(但不限于)胶质细胞源性嗜神经性因子(GDNF);脑源性嗜神经性因子(BDNF);和睫状嗜神经性因子(CNTF)。
食欲素肽包括(但不限于)食欲素A;食欲素B,人类;食欲素B,大鼠,小鼠。
阿片样肽包括(但不限于)α-酪蛋白片段90-95;BAM-18P;酪激肽L;酪蛋白素D;晶体;DALDA;皮脑啡肽(δ啡肽)(猴树蛙(Phylomedusa sauvagei));[D-Ala2]-δ啡肽I;[D-Ala2]-δ啡肽II;内吗啡肽-1;内吗啡肽-2;京都啡肽;[DArg2]-京都啡肽;吗啡耐受肽;吗啡调节肽,C-末端片段;吗啡调节神经肽(A-18-F-NH2);痛敏肽[孤啡肽FQ](ORL1激动剂);TIPP;Tyr-MIF-1;Tyr-W-MIF-1;valorphin;LW-血吗啡样肽-6,人类;Leu-valorphin-Arg;和Z-Pro-D-Leu。
催产素肽包括(但不限于)[Asu6]-催产素;催产素;生物素基-催产素;[Thr4,Gly7]-催产素;和tocinoic acid(Ile3]-pressinoic acid)。
PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活肽)肽包括(但不限于)PACAP 1-27,人类,绵羊,大鼠;PACAP(l-27)-Gly-Lys-Arg-NH2,人类;[脱-Gln16]-PACAP 6-27,人类,绵羊,大鼠;PACAP38,蛙;PACAP27-NH2,人类,绵羊,大鼠;生物素基-PACAP27-NH2,人类,绵羊,大鼠;PACAP 6-27,人类,绵羊,大鼠;PACAP38,人类,绵羊,大鼠;生物素基-PACAP38,人类,绵羊,大鼠;PACAP 6-38,人类,绵羊,大鼠;PACAP27-NH2,人类,绵羊,大鼠;生物素基-PACAP27-NH2,人类,绵羊,大鼠;PACAP 6-27,人类,绵羊,大鼠;PACAP38,人类,绵羊,大鼠;生物素基-PACAP38,人类,绵羊,大鼠;PACAP 6-38,人类,绵羊,大鼠;PACAP3816-38,人类,绵羊,大鼠;PACAP3831-38,人类,绵羊,大鼠;PACAP3831-38,人类,绵羊,大鼠;PACAP相关肽(PRP),人类;和PACAP相关肽(PRP),大鼠。
胰抑制素肽包括(但不限于)嗜铬粒抑制蛋白,牛;胰抑制素(hPST-52)(嗜铬粒蛋白A 250-301,酰胺);胰抑制素24-52(hPST-29),人类;嗜铬粒蛋白A 286-301,酰胺,人类;胰抑制素,猪;生物素基-胰抑制素,猪;[Nle8]-胰抑制素,猪;[Tyr0,Nle8]-胰抑制素,猪;[Tyr0]-胰抑制素,猪;旁腺抑制素1-19(嗜铬粒蛋白A347-365),猪;胰抑制素(嗜铬粒蛋白A 264-314-酰胺,大鼠;生物素基-胰抑制素(生物素基-嗜铬粒蛋白A 264-314-酰胺;[Tyr0]-胰抑制素,大鼠;胰抑制素26-51,大鼠;和胰抑制素33-49,猪。
胰多肽包括(但不限于)胰多肽,鸟类;胰多肽,人类;C-片段胰多肽酸,人类;C-片段胰多肽酰胺,人类;胰多肽(林蛙(Rana temporaria));胰多肽,大鼠;和胰多肽,鲑鱼。
甲状旁腺激素肽包括(但不限于)[Asp76-甲状旁腺激素39-84,人类;[Asp76]-甲状旁腺激素53-84,人类;[Asn76]-甲状旁腺激素1-84,激素;[Asn76]-甲状旁腺激素64-84,人类;[Asn8,Leu18]-甲状旁腺激素1-34,人类;[Cys5,28]-甲状旁腺激素1-34,人类;高血钙恶性因子1-40;[Leu5,28]-甲状旁腺激素1-34,人类;[Lys(生物素基)13,Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素3-34酰胺,牛;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素1-34,人类;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺人类;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素3-34酰胺,人类;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素7-34酰胺,牛;[Nle8,18,Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺,大鼠;甲状旁腺激素44-68,人类;甲状旁腺激素1-34,牛;甲状旁腺激素3-34,牛;甲状旁腺激素1-31酰胺,人类;甲状旁腺激素1-34,人类;甲状旁腺激素13-34,人类;甲状旁腺激素1-34,大鼠;甲状旁腺激素1-38,人类;甲状旁腺激素1-44,人类;甲状旁腺激素28-48,人类;甲状旁腺激素39-68,人类;甲状旁腺激素39-84,人类;甲状旁腺激素53-84,人类;甲状旁腺激素69-84,人类;甲状旁腺激素70-84,人类;[Pro34]-肽YY(PYY),人类;[Tyr0]-高血钙恶性因子1-40;[Tyr0]-甲状旁腺激素1-44,人类;[Tyr0]-甲状旁腺激素1-34,人类;[Tyr1]-甲状旁腺激素1-34,人类;[Tyr27]-甲状旁腺激素27-48,人类;[Tyr34]-甲状旁腺激素7-34酰胺,牛;[Tyr43]-甲状旁腺激素43-68,人类;[Tyr52,Asn76]-甲状旁腺激素52-84,人类;和[Tyr63]-甲状旁腺激素63-84,人类。
甲状旁腺激素(PTH)相关肽包括(但不限于)PTHrP([Tyr36]-PTHrP 1-36酰胺),鸡;hHCF-(1-34)-NH2(体液高血钙因子),人类;PTH相关蛋白质1-34,人类;生物素基-PTH相关蛋白质1-34,人类;[Tyr0]-PTH相关蛋白质1-34,人类;[Tyr34]-PTH相关蛋白质1-34酰胺,人类;PTH相关蛋白质1-37,人类;PTH相关蛋白质7-34酰胺,人类;PTH相关蛋白质38-64酰胺,人类;PTH相关蛋白质67-86酰胺,人类;PTH相关蛋白质107-111,人类,大鼠,小鼠;PTH相关蛋白质107-111游离酸;PTH相关蛋白质107-138,人类;和PTH相关蛋白质109-111,人类。
肽T肽包括(但不限于)肽T;[D-Ala1]-肽T;和[D-Ala1]-肽T酰胺。
促乳激素释放肽包括(但不限于)促乳激素释放肽31,人类;促乳激素释放肽20,人类;促乳激素释放肽31,大鼠;促乳激素释放肽20,大鼠;促乳激素释放肽31,牛;和促乳激素释放肽20,牛。
肽YY(PYY)肽包括(但不限于)PYY,人类;PYY 3-36,人类;生物素基-PYY,人类;PYY,猪,大鼠;和[Leu31,Pro34]-PYY,人类。
肾素底物肽包括(但不限于)乙酰基,血管紧张素原1-14,人类;血管紧张素原1-14,猪;肾素底物十四肽,大鼠;[Cys8]-肾素底物十四肽,大鼠;[Leu8]-肾素底物十四肽,大鼠;和[Val8]-肾素底物十四肽,大鼠。
胰泌素肽包括(但不限于)胰泌素,犬;胰泌素,鸡;胰泌素,人类;生物素基-胰泌素,人类;胰泌素,猪;和胰泌素,大鼠。
生长抑素(GIF)肽包括(但不限于)BIM-23027;生物素基-生长抑素;生物素化皮质抑素17,人类;皮质抑素14,大鼠;皮质抑素17,人类;[Tyr0]-皮质抑素17,人类;皮质抑素29,大鼠;[D-Trp8]-生长抑素;[DTrp8,DCys14]-生长抑素;[DTrp8Tyr11]-生长抑素;[D-Trp11]-生长抑素;NTB(纳曲苯(Naltriben));[Nle8]-生长抑素1-28;奥曲肽(SMS 201-995);原生长抑素1-32,猪;[Tyr0]-生长抑素;[Tyr1]-生长抑素;[Tyr1]-生长抑素28(1-14);[Tyr11]-生长抑素;[Tyr0,D-Trp8]-生长抑素;生长抑素;生长抑素拮抗剂;生长抑素-25;生长抑素-28;生长抑素28(1-12);生物素基-生长抑素-28;[Tyr0]-生长抑素-28;[Leu8,D-Trp22,Tyr25]-生长抑素-28;生物素基-[Leu8,D-Trp22,Tyr25]-生长抑素-28;生长抑素-28(1-14);和生长抑素类似物,RC-160。
P物质肽包括(但不限于)G蛋白拮抗剂-2;Ac-[Arg6,Sar9,Met(02)11]-P物质6-11;[Arg3]-P物质;Ac-Trp-3,5-双(三氟甲基)苯甲酯;Ac-[Arg6,Sar9,Met(O2)11]-P物质6-11;[D-Ala4]-P物质4-11;[Tyr6,D-Phe7,D-His9]-P物质6-11(sendide);生物素基-P物质;生物素基-NTE[Arg3]-P物质;(Tyr8]-P物质;[Sar9,Met(O2)11]-P物质;[D-Pro2,DTrp7,9]-P物质;[D-Pro4,O-Trp7,9]-P物质4-11;P物质4-11;[DTrp2,7,9]-P物质;[(脱氢)Pro2,4,Pro9]-P物质;[脱氢-Pro4]-P物质4-11;[Glp5,(Me)Phe8,Sar9]-P物质5-11;[Glp5,Sar9]-P物质5-11;[Glp5]-P物质5-11;七-P物质(P物质5-11);六-P物质(P物质6-11);[MePhe8,Sar9]-P物质;[Nle11]-P物质;八-P物质(P物质4-11);[pGlu1]-六-P物质([pGlu6]-P物质6-11);[pGlu6,D-Pro9]-P物质6-11;[(pNO2)Phe7Nle11]-P物质;五-P物质(P物质7-11);[Pro9]-P物质;GR73632,P物质7-11;[Sar4]-P物质4-11;[Sar9]-P物质;septide([pGlu6,Pro9]-P物质6-11);spantide I;spantide II;P物质;P物质,鳕鱼;P物质,鳟鱼;P物质拮抗剂;P物质-Gly-Lys-Arg;P物质1-4;P物质1-6;P物质1-7;P物质1-9;十-P物质(P物质2-11);九-P物质(P物质3-11);P物质四肽(P物质8-11);P物质三肽(P物质9-11);P物质,游离酸;P物质甲酯和[Tyr8,Nle11]P物质。
速激肽包括(但不限于)[Ala5,β-Ala8]神经激肽A 4-10;章鱼唾腺精;飞蝗速激肽I(Lom-TK-I)(马尔加什飞蝗);飞蝗速激肽II(Lom-TK-II)(马尔加什飞蝗);神经激肽A 4-10;神经激肽A(神经调节肽L,K物质);神经激肽A,鳕鱼和鳟鱼;生物素基-神经激肽A(生物素基-神经调节肽L,生物素基-K物质);[Tyr0]-神经激肽A;[Tyr6]-K物质;FR64349;[Lys3,Gly8-(R)-γ-内酰胺-Leu9]-神经激肽A 3-10;GR83074;GR87389;GR94800;[β-Ala8]-神经激肽A 4-10;[Nle10]-神经激肽A 4-10;[Trp7,β-Ala8]-神经激肽A 4-10;神经激肽B(神经调节肽K);生物素基-神经激肽B(生物素基-神经调节肽K);[MePhe7]-神经激肽B;[Pro7]-神经激肽B;[Tyr0]-神经激肽B;神经调节肽B,猪;生物素基-神经调节肽B,猪;神经调节肽B-30,猪;神经调节肽B-32,猪;神经调节肽B受体拮抗剂;神经调节肽C,猪;神经调节肽N,猪;神经调节肽(U-8),猪;神经调节肽(U-25),猪;神经调节肽U,大鼠;神经肽-γ(γ-前原速激肽72-92);PG-KII;叶泡雨滨蛙肽;[Leu8]-叶泡雨滨蛙肽(猴树蛙);泡蛙肽;泡蛙肽1-11;scyliorhinin II,酰胺,狗鲨;senktide,选择性神经激肽B受体肽;[Ser2]-神经调节肽C;β-前原速激肽69-91,人类;β-前原速激肽111-129,人类;速普肽I;爪蟾肽;和爪蟾肽25(xenin 25),人类。
促甲状腺激素释放激素(TRH)肽包括(但不限于)生物素基-促甲状腺激素释放激素;[Glu1]-TRH;His-Pro-二酮基哌嗪;[3-Me-His2]-TRH;pGlu-Gln-Pro-酰胺;pGlu-His;[Phe2]-TRH;前原TRH 53-74;前原TRH 83-106;前原-TRH 160-169(Ps4,TRH-增强肽);前原-TRH 178-199,促甲状腺激素释放激素(TRH);TRH,游离酸;TRH-SH Pro;和TRH前体肽。
毒素肽包括(但不限于)ω-美洲蜘蛛毒素TK;agelenin,(蜘蛛,小草蛛(Agelena opulenta));蜂神经毒肽(蜜蜂,意蜂(Apis mellifera));calcicudine(CaC)(绿曼巴蛇,东非绿曼巴(Dedroaspis angusticeps));钙蛇毒(calciseptine)(黑曼巴蛇,黑曼巴(Dendroaspis polylepis polylepis));卡律布德蝎毒素(ChTX)(蝎子,以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus var.hebraeus));氯毒素;芋螺毒素GI(海螺,地纹芋螺(Conus geographus));芋螺毒素GS(海螺,地纹芋螺);芋螺毒素MI(海洋僧袍芋螺(Marine Conus magus));α-芋螺毒素EI,乌龟芋螺(Conusermineus);α-芋螺毒素SIA;α-芋螺毒素ImI;α-芋螺毒素SI(锥形蜗牛,细线芋螺(Conus striatus));微-芋螺毒素GIIIB(海螺,地纹芋螺);ω-芋螺毒素GVIA(海螺,地纹芋螺);ω-芋螺毒素MVIIA(僧袍芋螺);ω-芋螺毒素MVIIC(僧袍芋螺);ω-芋螺毒素SVIB,(锥形蜗牛,细线芋螺);内毒素抑制剂;海蜗牛毒素I(GTX-I)(μ-芋螺毒素GIIIA);伊比利亚蝎毒素(IbTX)(蝎子,印度红蝎(Buthustamulus));卡利蝎毒素1-37;卡利蝎毒素(蝎子,北非肥尾蝎(Androctonusmauretanicus mauretanicus));肥大细胞脱粒肽(MCD-肽,肽401);玛格毒素(MgTX)(蝎子,墨西哥木蝎(Centruriodes Margaritatus));神经毒素NSTX-3(巴布亚新几内亚蜘蛛,人面蜘蛛(Nephilia maculata));PLTX-II(蜘蛛,Plectreurystristes);黄蝎毒素(海南捕鸟蛛毒素I);和海葵毒素(ShK)。
血管活性肠肽(VIP/PHI)包括(但不限于)VIP,人类,猪,大鼠,绵羊;VIP-Gly-Lys-Arg-NH2;生物素基-PHI(生物素基-PHI-27),猪;[Glp16]VIP 16-28,猪;PHI(PHI-27),猪;PHI(PHI-27),大鼠;PHM-27(PHI),人类;前原VIP 81-122,人类;前原VIP/PHM 111-122;前原VIP/PHM 156-170;生物素基-PHM-27(生物素基-PHI),人类;血管活性肠收缩肽(内皮素-β);血管活性肠二十八肽,鸡;血管活性肠肽,豚鼠;生物素基-VIP,人类,猪,大鼠;血管活性肠肽1-12,人类,猪,大鼠;血管活性肠肽10-28,人类,猪,大鼠;血管活性肠肽11-28,人类,猪,大鼠,绵羊;血管活性肠肽(鳕鱼,大西洋鳕鱼(Gadus morhua));血管活性肠肽6-28;血管活性肠肽拮抗剂;血管活性肠肽拮抗剂([Ac-Tyr1,D-Phe2]-GHRF 1-29酰胺);血管活性肠肽受体拮抗剂(4-Cl-D-Phe6,Leu17]-VIP);和血管活性肠肽受体结合抑制剂,L-8-K。
加压素(ADH)肽包括(但不限于)加压素;[Asu1,6,Arg8]-加压素;血管升压素;[Asu1,6,Arg8]-血管升压素;[Lys8]-加压素;pressinoic acid;[Arg8]-脱氨基加压素脱甘氨酰胺;[Arg8]-加压素(AVP);[Arg8]-加压素脱甘氨酰胺;生物素基-[Arg8]-加压素(生物素基-AVP);[D-Arg8]-加压素;脱氨基-[Arg8]-加压素;脱氨基-[D-Arg8]-加压素(DDAVP);[脱氨基-[D-3-(3'-吡啶基-Ala)]-[Arg8]-加压素;[1-(β-巯基-β,β-环五亚甲基丙酸),2-(O-甲基)酪氨酸]-[Arg8]-加压素;加压素代谢物神经肽[pGlu4,Cys6];加压素代谢物神经肽[pGlu4,Cys6];[Lys8]-脱氨基加压素脱甘氨酰胺;[Lys8]-加压素;[Mpr1,Val4,DArg8]-加压素;[Phe2,Ile3,Orn8]-加压素([Phe2,Orn8]-血管升压素);[Arg8]-血管升压素;和[d(CH2)5,Tyr(Me)2,Orn8]-血管升压素。
病毒相关肽包括(但不限于)荧光人类CMV蛋白酶底物;HCV核心蛋白质59-68;HCV NS4A蛋白质18-40(JT株);HCV NS4A蛋白质21-34(JT株);乙型肝炎病毒受体结合片段;乙型肝炎病毒前-S区120-145;[Ala127]-乙型肝炎病毒前-S区120-131;疱疹病毒抑制剂2;HIV包膜蛋白片段254-274;HIV gag片段129-135;HIV底物;P 18肽;肽T;[3,5二碘-Tyr7]肽T;R15K HIV-1抑制肽;T20;T21;V3十肽P 18-110;和病毒复制抑制肽。
本发明的化合物还包括异源融合蛋白质,其包含与具有N端和C端的第二多肽融合的具有N端和C端的第一多肽,其中第一多肽是例如GLP-1的多肽,且第二多肽是选自包括(但不限于)以下各项的群组:a)人类白蛋白;b)人类白蛋白类似物;和c)人类白蛋白片段,且其中第一多肽的C端经由肽连接基团、前药连接基团或水溶性聚合物与第二多肽的N端融合。肽连接基团可为a)富甘氨酸肽;b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(其中n是1、2、3、4、5或6)的肽;和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
本发明的其它化合物包括异源融合蛋白质,其包含与具有N端和C端的第二多肽融合的具有N端和C端的第一多肽,其中第一多肽是例如GLP-1的多肽,且第二多肽是选自包括(但不限于)以下各项的群组:a)免疫球蛋白的Fc部分;b)免疫球蛋白的Fc部分的类似物;和c)免疫球蛋白的Fc部分的片段,且其中第一多肽的C端与第二多肽的N端融合。多肽可经由肽连接基团、前药连接基团或水溶性聚合物与第二多肽融合。肽连接基团可为a)富甘氨酸肽;b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(其中n是1、2、3、4、5或6)的肽;和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
在某些实施例中,蛋白质包括至少一个由一个宿主细胞在体内进行的翻译后修饰,其中所述翻译后修饰通常不是由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中,蛋白质包括至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰,其中所述翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中,翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键将寡聚糖与天冬酰胺连接在一起(包括(但不限于)寡聚糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情形)。在另一个实施例中,翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡聚糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接在一起。在某些实施例中,本发明蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、针对细菌表达而5'-优化的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和来源于转座子的信号序列bla。
所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。这些非天然氨基酸可相同或不同,例如,蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中,天然存在的蛋白质型式中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的PDCM和PDCM的多肽组分的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入PDCM的多肽组分中可允许应用涉及特定化学反应(包括(但不限于)与一或多个非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应)的结合化学。在一些实施例中,包含非天然编码氨基酸的PDCM的多肽组分经由非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种利用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法,其涉及响应于选择密码子,将非基因编码氨基酸(包括(但不限于)含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸)选择性并入蛋白质中,且随后利用适当的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。并入后,随后可利用所属领域的技术人员已知适于非天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法都适用于本发明中,用以将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)分别与(包括(但不限于))乙炔或叠氮化物衍生物进行胡伊斯根[3+2]环加成反应(Huisgen[3+2]cycloaddition reaction)(参见例如派德沃A.(Padwa,A.)综合有机合成(Comprehensive Organic Synthesis),第4卷,(1991)特罗斯特B.M.(Trost,B.M.)编,培格曼出版社(Pergamon),牛津(Oxford),第1069-1109页;以及胡伊斯根R.(Huisgen,R.)1,3-偶极环加成化学(1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry),(1984)派德沃A.编,威立出版公司(Wiley),纽约,第1-176页)。
因为胡伊斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应,所以可以极高的选择性修饰蛋白质。所述反应可在室温下,于水性条件中,通过将催化量的Cu(I)盐添加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4>1,5)进行。参见例如托尔诺(Tornoe)等人,(2002)有机化学杂志(J.Org.Chem)67:3057-3064;和罗斯托夫采夫(Rostovtsev)等人,(2002)应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)41:2596-2599;和WO 03/101972。可以经由[3+2]环加成而加成到本发明蛋白质上的分子包括几乎任何具有适合官能团或取代基的分子,包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物。这些分子可分别加到具有乙炔基(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸中。
由胡伊斯根[3+2]环加成反应产生的五元环在还原环境中通常是不可逆的,并且可在水性环境中长时间对水解稳定。因此,可在苛求的水性条件下,用本发明的活性PEG衍生物改变多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是,由于叠氮基和乙炔部分彼此具特异性(且例如不会与20种常见的基因编码氨基酸中的任一者反应),故可在一或多个特定位点中以极高的选择性修饰蛋白质。
本发明还提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一或多个乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对于与响应于选择密码子而选择性引入蛋白质中的叠氮部分偶合具有高度选择性。类似地,含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物对于与响应于选择密码子而选择性引入蛋白质中的乙炔部分偶合具有高度选择性。
更特定来说,叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基,只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔,以及各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基,只要保持叠氮基特异性反应性即可。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物,所述其它物质包括(但不限于)标记;染料;聚合物;水溶性聚合物;聚乙二醇的衍生物;光交联剂;放射性核素;细胞毒性化合物;药物;亲和标记;光亲和标记;反应性化合物;树脂;第二蛋白质或多肽或多肽类似物;抗体或抗体片段;金属螯合剂;辅因子;脂肪酸;碳水化合物;多核苷酸;DNA;RNA;反义多核苷酸;糖类;水溶性树枝状聚合物;环糊精;抑制性核糖核酸;生物材料;纳米粒子;自旋标记;荧光团;含金属的部分;放射性部分;新颖官能团;与其它分子共价或非共价相互作用的基团;光笼化部分;光化辐射可激发的部分;光异构化部分;生物素;生物素衍生物;生物素类似物;并入有重原子的部分;可化学裂解的基团;可光裂解的基团;延长的侧链;碳连接的糖;氧化还原活性剂;氨基硫代酸;毒性部分;经同位素标记的部分;生物物理探针;磷光基团;化学发光基团;电子致密基团;磁性基团;插入基团;发色团;能量转移剂;生物活性剂;可检测标记;小分子;量子点;纳米传递素;放射性核苷酸;放射性传递素;中子俘获剂;或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质。本发明还包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说,含有叠氮部分的PEG聚合物可与生物活性分子在此蛋白质中含有带乙炔官能团的非基因编码氨基酸的位置处偶合。使PEG与生物活性分子偶联的键包括(但不限于)胡伊斯根[3+2]环加成产物。
此项技术中充分确定,可使用PEG来修饰生物材料的表面(参见例如美国专利6,610,281;米赫瓦R.(Mehvar,R.),药学与药理学杂志(J.Pharm Pharm Sci.),3(1):125-136(2000),其以引用的方式并入本文中)。本发明还包括包含具有一或多个反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料,和经由胡伊斯根[3+2]环加成键与所述表面偶合的一或多种本发明的含叠氮或含乙炔聚合物。生物材料和其它物质也可经由除叠氮基或乙炔键以外的其它键(例如经由包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)与经叠氮或经乙炔活化的聚合物衍生物偶合,由此留下叠氮或乙炔部分用于后续反应。
本发明包括一种合成本发明的含叠氮基和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基PEG衍生物的情况下,叠氮基可与聚合物的碳原子直接键接。或者,可将在一端具有叠氮部分的连接剂与常规活化聚合物连接,从而使所得聚合物在其一端具有叠氮部分,以此来制备含叠氮基的PEG衍生物。在含乙炔PEG衍生物的情况下,乙炔可与聚合物碳原子直接键接。或者,可将一端具有乙炔部分的连接剂与常规活化聚合物连接,从而使所得聚合物在其一端具有乙炔部分,以此制备含乙炔的PEG衍生物。
更具体地说,在含叠氮PEG衍生物的情况下,具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物发生反应,产生带有更强反应性部分(如甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基、甲苯磺酸酯基或卤素离去基团)的经取代聚合物。含有磺酰卤、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和使用是所属领域的技术人员已知的。所得经取代聚合物随后经历反应以在聚合物末端用叠氮部分取代具有更强反应性部分。或者,具有至少一个活性亲核部分或亲电子部分的水溶性聚合物可与一端具有叠氮基的连接剂发生反应,由此在PEG聚合物与所述连接剂之间形成共价键,且所述叠氮部分位于聚合物的一端。所属领域的技术人员已知亲核部分和亲电子部分,包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。
更具体点说,在含乙炔PEG衍生物的情况下,具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物可发生反应,以代替含有乙炔部分的前体中的卤素或其它活化的离去基团。或者,具有至少一个活性亲核部分或亲电子部分的水溶性聚合物可与一端具有乙炔的连接剂发生反应,由此在PEG聚合物与所述连接剂之间形成共价键,且所述乙炔部分位于聚合物的一端。卤素部分、活化的离去基团、亲核和亲电子部分在有机合成中的使用以及PEG衍生物的制备和使用已经得到了此项技术中的从业人员的充分确认。
本发明也提供一种用于选择性修饰蛋白质以将其它物质添加到经修饰蛋白质中的方法,所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物,如PEG和含有叠氮或乙炔部分的PEG衍生物。可以使用含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物改变表面和分子的特性(其中生物相容性、稳定性、溶解性和免疫原性缺乏是重要的),同时提供一种选择性高于此项技术中先前已知者的将PEG衍生物与蛋白质连接的方式。
II.抗原结合多肽家族
PDCM的多肽组分可为任何长度的已知或新颖的任何多肽。ABP可被视为多肽分子家族。存在多种类的许多抗体分子。这些抗体自身对许多种抗原具有特异性。也存在大量多种类的抗原特异性的抗体片段。因此,ABP家族旨在包括展示特异性结合目标分子或抗原的能力的任何多肽。任何已知的抗体或抗体片段属于ABP家族。
本发明的ABP可以包含Fc区或Fc样区。Fc域提供与效应功能的连接,如补体或吞噬细胞。免疫球蛋白的Fc部分具有长血浆半衰期,而Fab具有短寿命(卡彭(Capon)等人(1989),自然,337:525-531)。当连同治疗蛋白构建时,Fc域可以提供更长半衰期或者并入如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固定和可能甚至是胎盘转移的功能。举例来说,IgG1抗体的Fc区已经融合于CD30-L的N端,CD30-L是结合表达于霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)肿瘤细胞、间变性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其它恶性细胞型上的CD30受体(美国专利第5,480,981号)。消炎性和抗排斥剂IL-10已经融合于鼠类Fcγ2a以增加细胞因子的短循环半衰期。郑X.(Zheng,X.)等人(1995),免疫学杂志(The Journal of Immunology),154:5590-5600。研究也已评估使用与人类IgG1的Fc蛋白相连接的肿瘤坏死因子受体来治疗患有败血性休克(费舍尔C.(Fisher,C.)等人,新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.),334:1697-1702(1996);范泽K.(Van Zee,K.)等人,免疫学杂志,156:2221-2230(1996))和类风湿性关节炎(莫兰德(Moreland)等人(1997),新英格兰医学杂志,337(3):141-147)的患者。Fc也已经与CD4受体融合以产生用于治疗AIDS的治疗蛋白(卡彭等人(1989),自然,337:525-531)。此外,白介素2的N端也已经融合于IgG1或IgG3的Fc部分以克服白介素2的短半衰期和其全身性毒性(哈维尔(Harvill)等人(1995),免疫技术(Immunotechnology),1:95-105)。
众所周知,抗体的Fc区由可以通过二硫键或通过非共价缔合而连接成二聚或多聚形式的单聚多肽区段组成。天然Fc分子的单聚亚单位之间的分子间二硫键的数目取决于所涉及抗体的种类(例如,IgG、IgA、IgE)或亚类(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)而在1到4范围内。如本文所用的术语“Fc”是单聚、二聚和多聚形式的Fc分子的总称。应注意,当存在适当Cys残基时,除非存在防止经二硫键形成的二聚化作用的特殊条件,否则Fc单体将自发二聚化。即使通常在Fc二聚物中形成二硫键的Cys残基被移除或由其它残基置换,单聚链通常仍将经由非共价相互作用而二聚化。本文的术语“Fc”用于表示任何的这些形式:天然单体、天然二聚物(经二硫键连接)、经修饰二聚物(经二硫键和/或非共价键连接)和经修饰单体(即衍生物)。
举例来说,可以通过在包括非天然编码氨基酸的残基或序列上进行各种取代来构建Fc部分的变异体、类似物或衍生物。变异体(或类似物)多肽包括插入变体,其中一个或一个以上氨基酸残基补充Fc氨基酸序列。插入可以位于蛋白的任一末端或两个末端,或者可以位于Fc氨基酸序列中的内部区。在任一末端或两个末端具有其它残基的插入变异体可以包括例如融合蛋白和包括氨基酸标签或标记的蛋白。举例来说,Fc分子可以任选地含有N端Met,尤其是当所述分子在细菌细胞(如大肠杆菌)中重组表达时。在Fc缺失变异体中,移除Fc多肽中的一或多个氨基酸残基。可以在Fc多肽的一端或两端实现缺失,或者可以用移除Fc氨基酸序列中的一或多个残基来实现缺失。因此,缺失变异体包括Fc多肽序列的所有片段。在Fc取代变异体中,移除Fc多肽的一或多个氨基酸残基并且用替代残基置换。在一个方面中,取代为天然保守,然而本发明涵盖也为非保守的取代。举例来说,半胱氨酸残基可以缺失,或者可以用其它氨基酸置换以防止Fc序列的一些或全部二硫交联形成。具体来说,任何已知序列的位置7和10处的氨基酸是半胱氨酸残基。可以移除这些半胱氨酸残基中的每一者或用其它氨基酸(如Ala或Ser或非天然编码氨基酸)取代一或多个所述半胱氨酸残基。作为另一实例,也可以进行修饰以引入氨基酸取代以致(1)切除Fc受体结合位点;(2)切除补体(Clq)结合位点;和/或(3)切除抗体依赖性细胞介导细胞毒素(ADCC)位点。所述位点为此项技术中已知的,并且任何已知取代在如本文所用的Fc的范围以内。举例来说,就IgG1中的ADCC位点来说,参见分子免疫学(Molecular Immunology),第29卷,第5期,633-639(1992)。同样,一或多个酪氨酸残基也可以由苯丙氨酸残基置换。此外,也涵盖其它变异体氨基酸插入、缺失(例如1-25个氨基酸)和/或取代,并且这些是在本发明的范围以内。保守氨基酸取代可为优选的。此外,改变可以为经改变氨基酸形式,如肽模拟物或D-氨基酸。
Fc序列也可以经衍生化,即带有除氨基酸残基的插入、缺失或取代之外的修饰。修饰优选是天然共价的,并且包括例如与聚合物、脂质、其它有机部分和无机部分的化学键接。可以制备本发明的衍生物以增加循环半衰期,或者可以设计本发明的衍生物以改进多肽靶向所需细胞、组织或器官的能力。也可能将完整Fc分子的救助受体结合域(salvage receptor binding domain)用作本发明化合物的Fc部分,如描述于标题为“半衰期延长的改变的多肽(Altered Polypeptides with Increased Half-Life)”的WO 96/32478中。本文指定为Fc的一类分子的其它成员是描述于标题为“半衰期延长的免疫球蛋白样域(Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives)”的WO 97/34631中的那些。本段中所引用的两个公开PCT申请案以引用的方式并入本文中。
可能会在将来发现ABP家族的其它成员。可通过预测蛋白质序列的计算机辅助的二级和三级结构分析并且通过设计用于鉴别与特定目标结合的分子的选择技术来鉴别ABP家族的新成员。所述后来所发现的ABP家族的成员也包括于本发明中。
标题为“新颖抗原结合多肽和其用途(Novel Antigen Binding Polypeptides andTheir Uses)”的WO 2006/009901(其以引用的方式并入本文中)描述包含一或多个非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。
因此,提供ABP家族的描述以用于说明目的,并且仅作为实例,而并不作为对本文所述方法、组合物、策略和技术的范围的限制。此外,本申请案中提及ABP旨在使用所述通用术语作为ABP家族的任何成员的实例。因此,应了解,本文关于特异性抗原结合多肽或蛋白所描述的修饰和化学方法同样可适用于抗原结合多肽家族的任何成员,包括本文具体列出的那些在内。
III.用于本发明的一般重组核酸方法
在许多本发明实施例中,将分离、克隆并且常常使用重组方法改变编码PDCM的多肽组分的核酸。所述实施例是用于(包括(但不限于))蛋白质表达或用于源自PDCM的多肽组分的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间。在一些实施例中,编码本发明多肽的序列可操作性地连接到异源启动子。
编码包含非天然编码氨基酸的PDCM的多肽组分的核苷酸核序列可以基于母体多肽的氨基酸序列,并且然后改变核苷酸序列以便实现相关氨基酸残基的引入(即,并入或取代)或去除(即,缺失或取代)来合成。宜根据常规方法,利用定点诱变来修饰核苷酸序列。或者,可以通过化学合成来制备核苷酸序列,所述化学合成包括(但不限于)使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是基于所需多肽的氨基酸序列来设计),并且可以涉及选择将产生重组多肽的宿主细胞偏好的那些密码子。举例来说,可通过PCR、接合或接合链式反应来合成和组装编码所需多肽的部分的数个小寡核苷酸。参见例如巴拉尼(Barany)等人,美国国家科学院院刊88:189-193(1991);美国专利6,521,427,其以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示本发明中使用的一般方法的基础文章包括萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆实验指南(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)(第3版,2001);克里格勒(Kriegler),基因转移与表达实验指南(Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual)(1990);和分子生物学实验室指南(奥斯贝等人编,1994))。
描述分子生物技术的一般文章包括伯杰(Berger)和基梅尔(Kimmel),酶学方 法中分子克隆技术导言(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology),第152卷,学术出版社公司(Academic Press,Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)(伯杰);萨姆布鲁克等人,分子克隆实验指南(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第2版),第1-3卷,冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory),纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,New York),1989(“萨姆布鲁克”)和分子生物学实验室指南,F.M.奥斯贝等人编,实验室指南(CurrentProtocols),格林出版联合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)和约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)之间的合资企业,(1999年全年增补)(“奥斯贝”))。这些文章描述诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关的课题,所述相关课题涉及(包括(但不限于))包括用于产生包括非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交合成酶和其对的基因或多核苷酸的产生。
多类诱变方法可用于本发明中以实现多种目的,包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的多核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、插入编码相关蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变方法包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰DNA诱变、使用带缺口双链DNA的诱变等,或其任何组合。其它适合的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成诱变、双链断裂修复等。本发明中还包括(包括(但不限于))涉及嵌合构建体的诱变。在一个实施例中,可利用有关天然存在的分子或者改变或突变的天然存在的分子的已知信息,包括(但不限于)序列、序列比较、物理特性、二级、三级或四级结构、晶体结构等,来指导诱变。
本文中发现的正文和实例描述这些程序。其它信息可见于以下公开案和其中引用的参考文献中:凌(Ling)等人,DNA诱变方法综述(Approaches to DNA mutagenesis:an overview),分析生物化学(Anal Biochem.)254(2):157-178(1997);黛尔(Dale)等人,使用硫代磷酸酯方法进行寡核苷酸定向随机诱变(Oligonucleotide-directedrandom mutagenesis using the phosphorothioate method).分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)57:369-374(1996);史密斯(Smith),体外诱变(In vitro mutagenesis),遗传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)19:423-462(1985);博特斯坦(Botstein)和肖特勒(Shortle),体外诱变的策略和应用(Strategies and applications of in vitromutagenesis),科学(Science)229:1193-1201(1985);卡特(Carter),定点诱变(Site-directed mutagenesis),生物化学杂志237:1-7(1986);孔克尔(Kunkel),寡核苷酸定向诱变效率(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis),核酸和分 子生物学(Nucleic Acids&Molecular Biology)(埃克斯坦F.(Eckstein,F.)和利利D.M.J.(Lilley,D.M.J.)编,斯普林格出版社(Springer Verlag),柏林(Berlin))(1987);孔克尔,在无表型选择的情况下快速并且有效的位点特异性诱变(Rapid andefficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection),美国国家科学院院刊82:488-492(1985);孔克尔等人,在无表型选择的情况下快速并且有效的位点特异性诱变,酶学方法(Methods in Enzymol)154,367-382(1987);巴斯(Bass)等人,具有新DNA结合特异性的突变体Trp抑制剂(Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities),科学242:240-245(1988);佐勒(Zoller)和史密斯,使用M13源性载体的寡核苷酸定向诱变:用于在任何DNA片段中产生点突变的有效并且一般性程序(Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors:an efficient andgeneral procedure for the production of point mutations in any DNA fragment),核酸研究(Nucleic Acids Res.)10:6487-6500(1982);佐勒和史密斯,克隆到M13载体中的DNA片段的寡核苷酸定向诱变(Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragmentscloned into M13vectors),酶学方法,100:468-500(1983);佐勒和史密斯,寡核苷酸定向诱变:一种使用两个寡核苷酸引物和单股DNA模板的简单方法(Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template),酶学方法154:329-350(1987);泰勒(Taylor)等人,在限制酶反应中使用经硫代磷酸酯修饰的DNA来制备带切口的DNA(The use ofphosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA),核酸研究13:8749-8764(1985);泰勒等人,使用经硫代磷酸酯修饰的DNA以高频率快速产生寡核苷酸定向突变(The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations athigh frequency using phosphorothioate-modified DNA),核酸研究13:8765-8785(1985);中前(Nakamaye)和埃克斯坦,通过硫代磷酸酯基裂解的限制核酸内切酶Nci I的抑制和其对寡核苷酸定向诱变的应用(Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directedmutagenesis),核酸研究14:9679-9698(1986);塞耶斯(Sayers)等人,在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的5'-3'核酸外切酶(5'-3'Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis),核酸研究,16:791-802(1988);塞耶斯等人,通过在存在溴化乙锭的情况下与限制核酸内切酶反应使含有硫代磷酸酯的DNA股特异性裂解(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containingDNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide),(1988)核酸研究16:803-814;克拉默(Kramer)等人,用于寡核苷酸定向突变构建的带缺口双链DNA方法(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction),核酸研究12:9441-9456(1984);克拉默和弗里兹(Fritz)通过带缺口双链DNA来寡核苷酸定向构建突变(Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA),酶学方法154:350-367(1987);克拉默等人,在用于寡核苷酸定向构建突变的带缺口双链DNA方法中改良酶体外反应(Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations),核酸研究16:7207(1988);弗里兹等人,寡核苷酸定向构建突变:一种无体外酶反应的带缺口双链DNA程序(Oligonucleotide-directedconstruction of mutations:a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions invitro),核酸研究16:6987-6999(1988);克拉默等人,不同碱基/碱基错配通过大肠杆菌的甲基定向的DNA错配修复系统以不同效率校正(Different base/base mismatchesare corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repairsystem of E.coli),细胞38:879-887(1984);卡特等人,使用M13载体改良寡核苷酸定点诱变(Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13vectors),核酸研 究,13;4431-4443(1985);卡特,使用M13载体改良寡核苷酸定向诱变(Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13vectors),酶学方法154:382-403(1987);埃泰德扎德(Eghtedarzadeh)和赫尼霍夫(Henikoff),使用寡核苷酸产生大缺失(Use of oligonucleotides to generate large deletions),核酸研究14:5115(1986);韦尔斯(Wells)等人,在使枯草杆菌蛋白酶的转变状态稳定中形成氢键的重要性(Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin),伦敦皇家学会哲学学报(Phil.Trans.R.Soc.Lond),A辑317:415-423(1986);南比亚尔(Nambiar)等人,编码核糖核酸酶S蛋白的基因的全合成和克隆(Total synthesisand cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein),科学223:1299-1301(1984);萨卡马(Sakamar)和霍拉纳(Khorana),用于牛杆外节鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导蛋白)的α亚单位的基因的全合成和表达(Total synthesis and expression ofa gene for theα-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)),核酸研究14:6361-6372(1988);韦尔斯(Well)等人,盒式诱变:一种用于在定义位点产生多种突变的有效方法(Cassette mutagenesis:an efficient methodfor generation of multiple mutations at defined sites),基因(Gene)34:315-323(1985);格鲁德斯蒂姆()等人,通过微米级‘鸟枪法’基因合成进行寡核苷酸定向诱变(Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale'shot-gun'genesynthesis),核酸研究13:3305-3316(1985);曼德基(Mandecki),在大肠杆菌质粒中寡核苷酸定向双股断裂修复:一种位点特异性诱变方法(Oligonucleotide-directeddouble-strand break repair in plasmids of Escherichia coli:a method for site-specificmutagenesis),美国国家科学院院刊,83:7177-7181(1986);阿诺德(Arnold),异常环境的蛋白质工程改造(Protein engineering for unusual environments),生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)4:450-455(1993);西贝尔(Sieber)等人,自然·生物技术(Nature Biotechnology),19:456-460(2001);W.P.C.施特默尔(W.P.C.Stemmer),自然370,389-91(1994);以及I.A.洛里默(I.A.Lorimer)、I.帕斯坦(I.Pastan),核酸研究23,3067-8(1995)。关于上述众多方法的其它细节可见于酶学方法第154卷中,其中也描述了对于与各种诱变方法相关的故障检修问题的有效控制。
通常根据布克吉(Beaucage)和卡鲁斯(Caruthers),四面体通讯(TetrahedronLetts.)22(20):1859-1862,(1981)中所述的固相亚磷酰胺三酯法,例如使用尼德尔曼-范德瓦特(Needham-VanDevanter)等人,核酸研究,12:6159-6168(1984)所述的自动合成仪,以化学方式合成寡核苷酸,例如用于本发明的诱变过程中,例如使合成酶文库突变,或改变tRNA。
本发明还涉及通过正交tRNA/RS对在体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。利用本发明的多核苷酸或包括本发明多核苷酸的构建体,包括(但不限于)本发明的载体(其可为例如克隆载体或表达载体),对宿主细胞进行基因工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)。举例来说,将正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白质的编码区可操作性地连接到在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件。载体可为例如质粒、柯斯质粒、噬菌体、细菌、病毒、裸多核苷酸或经结合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中,所述方法包括电穿孔(弗洛姆(From)等人,美国国家科学院院刊82,5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上由具有核酸的小粒子高速弹道渗透(科莱恩(Klein)等人,自然327,70-73(1987))等。
可以在经修饰适合于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养工程改造宿主细胞。这些细胞可任选培养入转基因生物体中。包括(但不限于)关于细胞分离和培养(例如,关于后续核酸分离)的其它有用的参考文献包括弗瑞旭尼(Freshney)(1994)动物细胞的培养:基础技术手册(Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique),第三版,威利-利斯(Wiley-Liss),纽约和其中所引用的参考文献;派恩(Payne)等人(1992)液体系统中的植物细胞和组织培养(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)约翰·威利父子公司纽约州纽约;冈堡(Gamborg)和菲利浦(Phillips)(编)(1995)植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell,Tissue and Organ Culture);基本方法施普林格实验指南(Fundamental MethodsSpringer Lab Manual),施普林格出版社(Springer-Verlag)(柏林海德尔堡纽约(Berlin Heidelberg New York))和阿特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编)微生物培 养基手册(The Handbook of Microbiological Media)(1993)CRC出版社,佛罗里达州波卡拉顿(Boca Raton,FL)。
将目标核酸引入到细胞中的若干众所周知的方法是可获得的,其中任何一种都可以用于本发明中。这些方法包括:将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、弹轰击和用病毒载体(下文进一步讨论)感染等。可以使用细菌细胞来扩增含有本发明DNA构建体的质粒的数量。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参见萨姆布鲁克(Sambrook))。另外,也可购买试剂盒来从细菌中纯化质粒(例如参见EasyPrepTM、FlexiPrepTM,都来自法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech);StrataCleanTM,来自赛特杰公司(Stratagene);和QIAprepTM,来自凯杰公司(Qiagen))。随后进一步操作经分离和纯化的质粒以产生其它质粒,来用于转染细胞,或并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定目标核酸表达的启动子。载体任选包含普通表达盒,其含有至少一个独立的终止子序列、允许所述盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体),以及用于原核系统与真核系统的选择标记物。载体适于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参见吉利曼(Giliman)和史密斯,基因8:81(1979);罗伯茨(Roberts)等人,自然328:731(1987);施奈德E.(Schneider,E.)等人,蛋白质表达与纯化(Protein Expr.Purif.)6(1):10-14(1995);奥斯贝、萨姆布鲁克、伯杰(所有同前文献)。例如通过ATCC,例如由ATCC出版的细菌与噬菌体的ATCC目录(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage)(1992)吉尔尼(Gherna)等人(编)提供了适用于克隆的细菌和噬菌体的目录。关于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基础程序和根本理论考虑因素还见于沃森(Watson)等人(1992)重组DNA(Recombinant DNA)第二版科学美国人书籍(Scientific American Books),纽约州。另外,基本上任何核酸(以及实际上任何经标记核酸,无论标准或非标准)都可以从多种商业来源中的任一种定制或标准定购,这些商业来源如米德兰认证试剂公司(MidlandCertified Reagent Company)(德克萨斯州米德兰(Midland,TX),可通过万维网在mcrc.com上获得)、大美国基因公司(The Great American Gene Company)(加利福尼亚州拉蒙纳(Ramona,CA),可通过万维网在genco.com上获得)、艾克斯普锐斯津公司(ExpressGen Inc.)(伊利诺伊州芝加哥(Chicago,IL),可通过万维网在expressgen.com上获得)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)(加利福尼亚州阿拉米达(Alameda,CA))以及许多其它来源。
选择密码子
本发明的选择密码子扩充蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。.举例来说,选择密码子包括(但不限于)独特的三碱基密码子;无义密码子,如终止密码子,包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA);非天然密码子;四个或四个以上碱基的密码子;稀有密码子等。所属领域的技术人员易于了解,在编码PDCM的多肽组分的至少一部分的单一多核苷酸中,可以引入到所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数量范围较宽,包括(但不限于)一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上。
在一个实施例中,所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子以用于在体内并入一或多个非天然氨基酸。举例来说,产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA,并通过带有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨酰基化。天然存在的宿主氨酰基-tRNA合成酶不识别这一O-tRNA。可以使用常规定点诱变在相关多肽中的相关位点引入终止密码子,包括(但不限于)TAG。参见例如塞耶斯J.R.等人(1988),基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的5'-3'核酸外切酶(5'-3'Exonucleasein phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis).核酸研究16:791-802。当在体内组合O-RS、O-tRNA和编码相关多肽的核酸时,响应于UAG密码子并入非天然氨基酸,从而得到在特定位置含有所述非天然氨基酸的多肽。
可以在不显著扰动真核宿主细胞的情况下完成非天然氨基酸的体内并入。举例来说,由于对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制子tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合于终止密码子并启动核糖体释放生长肽)之间的竞争,故可通过(包括(但不限于))增加O-tRNA和/或抑制子tRNA的表达水平来调节抑制效率。
非天然氨基酸还可用稀有密码子编码。举例来说,当降低体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度时,已证实,稀有精氨酸密码子AGG可有效地利用经丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala。参见例如马(Ma)等人,生物化学,32:7939(1993)。在此情况下,合成tRNA将与作为大肠杆菌中的次要物质存在的天然存在tRNAArg竞争。一些生物体不使用所有三联体密码子。已经利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。参见例如科瓦尔(Kowal)和奥利佛(Oliver),核酸研究(Nucl.Acid.Res.),25:4685(1997)。可产生本发明的组分以在体内使用这些稀有密码子。
选择密码子还包含延长的密码子,其包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子,例如,四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的一个特征包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括(但不限于))一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说,在突变O-tRNA存在下,(包括(但不限于))具有反密码子环(例如,具有至少8-10个核苷酸的反密码子环)的特定移码抑制tRNA,四个或四个以上碱基的密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中,反密码子环可解码(包括(但不限于))至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。由于存在256个可能的四碱基密码子,故可在同一细胞中使用四个或四个以上碱基的密码子编码多个非天然氨基酸。参见安德森(Anderson)等人,(2002)探究密码子和反密码子大小的极限(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size),化学和生物学(Chemistry and Biology.),9:237-244;玛格丽瑞(Magliery),(2001)扩充遗传代码:用文库方法在大肠杆菌中选择四碱基密码子的有效抑制剂并且鉴定“变化的”四碱基密码子(Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of“Shifty”Four-base Codons with a Library Approachin Escherichia coli),分子生物学杂志307:755-769。
举例来说,已使用四碱基密码子,使用体外生物合成方法将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见例如马(Ma)等人,(1993)生物化学(Biochemistry),32:7939;和郝萨卡(Hohsaka)等人,(1999)美国化学学会杂志121:34。用两种化学酰化移码抑制剂tRNA,使用CGGG和AGGU将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时体外并入链霉亲和素中。参见例如郝萨卡(Hohsaka)等人,(1999)美国化学学会杂志,121:12194。在一个体内研究中,穆尔(Moore)等人检查了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可以是U、A、G或C)的能力,并且发现四联体UAGA可以通过具有UCUA反密码子的tRNALeu以13%到26%的效率解码,在0或-1框中解码极少。参见穆尔等人,(2000)分子生物学杂志,298:195。在一个实施例中,可以在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子,其可以减少其它不希望位点的错义连读和移码抑制。
对于给定系统,选择密码子也可以包括天然三碱基密码子中的一种,其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说,这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子任选包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩充现有的遗传密码字母。一个额外碱基对使三联体密码子的数量从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定并且选择性碱基配对,通过聚合酶以高保真度将酶有效并入DNA中,和在合成新生非天然碱基对之后有效的继续引物延长。可以适用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如平尾(Hirao)等人,(2002)用于将氨基酸类似物并入蛋白质中的非天然碱基对(An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues intoprotein),自然·生物技术,20:177-182。此外,参见吴Y.(Wu,Y.)等人,(2002)1美国 化学学会杂志124:14626-14630。其它相关出版物列举如下。
对于体内使用,非天然核苷可透过膜,并且经磷酸化形成相应的三磷酸酯。此外,增加的遗传信息也很稳定,且不会被细胞酶破坏。本纳(Benner)和其它人先前的尝试利用了不同于标准沃特森-克里克(Watson-Crick)对的氢键模式,其中最值得关注的实例为iso-C:iso-G对。参见例如斯威策(Switzer)等人,(1989)美国化学学会 杂志,111:8322;和皮奇里利(Piccirilli)等人,(1990)自然.343:33;库尔(Kool),(2000)化学生物学新见(Curr.Opin.Chem.Biol.),4:602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配并且不能以酶促方式复制。库尔(Kool)和同事证实,碱基之间的疏水堆积相互作用可替代氢键来驱动碱基对的形成。参见库尔,(2000)化学生物学新见,4:602;和古基安(Guckian)和库尔,(1998)应用化学国际英文版(Angew.Chem. Int.Ed.Engl.),36,2825。在努力开发满足所有以上要求的非天然碱基对的过程中,舒尔茨(Schultz)、罗姆斯伯格(Romesberg)和合作者已经系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对稳定,并且能够利用大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段(KF)有效地并入DNA中。参见例如麦克明(McMinn)等人,(1999)美国化学学会杂志121:11586;和小川(Ogawa)等人,(2000)美国化学学会杂志122:3274。3MN:3MN自身对可以通过KF以对生物功能来说足够的效率和选择性合成。参见例如小川等人,(2000)美国化学学会杂志,122:8803。然而,两个碱基充当进一步复制的链终止剂。近来已开发出可用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外,可复制7AI自身对。参见例如达(Tae)等人,(2001)美国化 学学会杂志,123:7439。也已经开发出了新颖金属碱基对Dipic:Py,其在结合Cu(II)之后形成稳定对。参见梅格斯(Meggers)等人,(2000)美国化学学会杂志,122:10714。因为延长的密码子和非天然密码子固有地正交于天然密码子,所以本发明方法可以利用这种特性来产生针对其的正交tRNA。
翻译旁路系统(translational bypassing system)也可以用于在所需多肽中并入非天然氨基酸。在翻译旁路系统中,将大序列并入基因中,但并不翻译成蛋白质。所述序列含有的结构可充当诱导核糖体越过所述序列并继续在插入序列下游翻译的提示(cue)。
在某些实施例中,本发明方法和/或组合物中的相关蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常,核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可使用所属领域的技术人员已知且本文中描述的方法来诱变编码相关蛋白质或多肽的基因,以使其包括例如一或多个用于并入非天然氨基酸的选择密码子。举例来说,诱变相关蛋白质的核酸,以使其包括一或多个选择密码子,从而并入一或多个非天然氨基酸。本发明包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何此种变异体(包括(但不限于)突变体)形式。类似地,本发明还包括相应核酸,即,具有一或多个编码一或多个非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
编码如PDCM的多肽组分的相关蛋白质的核酸分子可以容易地突变以在所述多肽的任何所需位置引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入到相关蛋白质上。所属领域的技术人员已知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法,如美国专利第6,608,183号(其以引用的方式并入本文中)中所述的那些方法,以及标准诱变技术。
IV.非天然编码氨基酸
很多种非天然编码氨基酸适用于本发明。可以将任何数目的非天然编码氨基酸引入PDCM的多肽组分中。一般说来,引入的非天然编码氨基酸对20种常见基因编码氨基酸(即,丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)实质上呈化学惰性。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包括与未见于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮、醛和氨氧基)有效且选择性反应形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说,包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的多肽可以与连接基团、聚合物或其它分子(包括(但不限于)聚(乙二醇))反应,或者与含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定结合物,产生叠氮与炔官能团的选择反应以形成胡伊斯根[3+2]环加成产物。
α-氨基酸的通用结构展示如下(式I):
非天然编码氨基酸通常为具有上文所列式的任何结构,其中R基团是除20种天然氨基酸中所用外的任何取代基,并且都可适用于本发明中。由于本发明的非天然编码氨基酸通常仅侧链结构不同于天然氨基酸,故非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键的方式与其在天然存在多肽中形成的方式相同。然而,非天然编码氨基酸的侧链基团使其与天然氨基酸相区别。举例来说,R任选地包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。可适用于本发明中的其它相关的非天然存在的氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(如糖取代的丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解氨基酸、侧链比天然氨基酸长的氨基酸(包括(但不限于)聚醚或长链烃,包括(但不限于)大于约5或大于约10个碳)、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一或多个有毒部分的氨基酸。
可适用于本发明并且可用于与连接基团、聚合物、多肽或其它分子反应的示例性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应性基团的氨基酸。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含糖类部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-天冬酰胺和O-甘露糖氨基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在的N键或O键由自然界中不常见的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。所述氨基酸的实例还包括天然存在的蛋白质中不常见的糖,如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本文中提供的许多非天然编码氨基酸可从市场上购得,例如购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))、诺瓦生物科技公司(Novabiochem)(EMD生物科技公司(EMD Biosciences)的分公司,位于德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))或派普科技公司(Peptech)(美国马萨诸塞州伯灵顿(Burlington,MA,USA))。不可商购的那些任选地如本文中提供的那般或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术,参见例如费森登(Fessendon)和费森登的有机化学(Organic Chemistry),(1982,第二版,威拉德格兰特出版社(Willard Grant Press),马萨诸塞州波士顿(Boston Mass.));马彻(March)的高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第三版,1985,威利父子公司(Wiley and Sons),纽约(New York));以及凯里(Carey)和桑德伯格(Sundberg)的高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)(第三版,第A部分和第B部分,1990,普雷纳姆出版社(Plenum Press),纽约)。还参见美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885,都以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸外,可适用于本发明中的非天然氨基酸还任选包含经修饰的主链结构,包括(但不限于)如式II和III的结构所示:
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R';X和Y可相同或不同,通常包含S或O;且R和R'任选相同或不同,通常选自与上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基相同的组分清单以及氢。举例来说,如式II和III所示,本发明的非天然氨基酸任选在氨基或羧基中包含取代。此类非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯,包括(但不限于)具有与常见20种天然氨基酸对应的侧链或非天然侧链。此外,在α-碳处的取代任选地包括(但不限于)L、D、或α-α-二取代氨基酸,如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸,如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环辅氨酸类似物、β和γ氨基酸,如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸是基于天然氨基酸,如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等,并且适用于本发明。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸,其中这些经取代酪氨酸包含(包括(但不限于))酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。此外,也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代衍生物、环状衍生物和酰胺取代谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸,其中所述取代基包含(包括(但不限于))羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明的非天然氨基酸的具体实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构实例提供于例如标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中。关于其它甲硫氨酸类似物,还参见柯克(Kiick)等人,(2002)将叠氮化物并入重组蛋白质中以用于利用施陶丁格尔接合进行化学选择性修饰(Incorporation of azides intorecombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation),美国国 家科学院院刊99:19-24,其是以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中,提供包括非天然氨基酸(如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的多肽的组合物。也提供包含对(炔丙氧基)-苯丙氨酸和(包括(但不限于))蛋白质和/或细胞的各种组合物。在一个方面中,包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键接(包括(但不限于)共价),包括(但不限于),经由氨酰基键与正交tRNA共价键接、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键接等。
经非天然氨基酸可以并入蛋白质中的化学部分提供蛋白质的多种优势和操作。举例来说,酮基官能团的独特反应性允许在体外和体内利用多种含肼或含羟胺试剂中的任一种选择性修饰蛋白质。重原子非天然氨基酸例如可用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸位点特异性地引入重原子还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和叠氮芳基(包括(但不限于)叠氮苯基)侧链的氨基酸)例如允许在体内和体外有效地光交联蛋白质。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过提供光反应性基团的时间控制激发使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中,非天然氨基酸的甲基可经作为局部结构和动力学探针(包括(但不限于)使用核磁共振和振动光谱)的同位素标记(包括(但不限于))甲基取代。举例来说,炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
并入多肽的氨基端的非天然氨基酸可包含R基团,其为除20种天然氨基酸中所用的取代基以外的任何取代基;和不同于α-氨基酸(参见式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团。可并入羧基端的类似非天然氨基酸中的第二反应性基团不同于通常存在于α氨基酸中的COOH基团(参见式I)。
可对本发明的非天然氨基酸进行选择或设计以提供20种天然氨基酸中不可获得的其它特征。举例来说,可任选对非天然氨基酸进行设计或选择,从而改变例如并有这些非天然氨基酸的蛋白质的生物特性。举例来说,以下特性可通过将非天然氨基酸包括到蛋白质中来经任选地修饰:毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如热、水解、氧化、耐酶促降解等)、纯化和加工的便利性、结构特性、光谱特性、化学和/或光化特性、催化活性、氧化还原电势、半衰期、与其它分子(例如共价或非共价地)反应的能力等。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明中的许多非天然氨基酸可商购,例如购自西格玛(美国)或奥德里奇(美国威斯康辛州密尔沃基(Milwaukee,WI,USA))。不可商购的那些任选地如本文中所提供般或如各种出版物中所提供般或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术,参见例如费森登(Fessendon)和费森登的有机化学,(1982,第二版,威拉德格兰特出版社(Willard Grant Press),马萨诸塞州波士顿(Boston Mass.));马彻的高等有机化学(第三版,1985,威利父子公司(Wiley andSons),纽约);以及凯里(Carey)和桑德伯格(Sundberg)的高等有机化学(第三版,第A部分和第B部分,1990,普雷纳姆出版社(Plenum Press),纽约)。描述非天然氨基酸的合成的其它出版物包括例如标题为“非天然氨基酸的体内并入(In vivoincorporation of Unnatural Amino Acids)”的WO 2002/085923;马楚卡斯(Matsoukas)等人,(1995)医药化学杂志(J.Med.Chem.),38,4660-4669;金F.E.(King,F.E.)和基德D.A.A.(Kidd,D.A.A.)(1949)从邻苯二甲酰化中间物合成谷氨酰胺和谷氨酸的γ-二肽的新方法(A New Synthesis of Glutamine and ofγ-Dipeptides ofGlutamic Acid from Phthylated Intermediates).化学学会杂志(J.Chem.Soc),3315-3319;弗里德曼O.M.(Friedman,O.M.)和查特吉R.(Chatterrji,R.)(1959)合成谷氨酰胺衍生物作为抗肿瘤剂的模型底物(Synthesis of Derivatives of Glutamine as ModelSubstrates for Anti-Tumor Agents).美国化学学会杂志81,3750-3752;克雷格J.C.(Craig,J.C.)等人(1988)7-氯-4[[4-(二乙基氨基)-1-甲基丁基]氨基]喹啉(氯奎)的对映异构体的绝对构型(Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine)).有机化学杂志(J.Org. Chem),53,1167-1170;阿祖莱M.(Azoulay,M.)、维尔蒙特M.(Vilmont,M.)和弗拉皮耶F.(Frappier,F.)(1991)谷氨酰胺类似物作为潜在抗疟疾药(Glutamineanalogues as Potential Antimalarials).欧洲医药化学杂志(Eur.J.Med.Chem.)26,201-5;科斯基宁A.M.P.(Koskinen,A.M.P.)和拉波波特H.(Rapoport,H.)(1989)合成4-取代的脯氨酸作为构型限制的氨基酸类似物(Synthesis of 4-Substituted Prolinesas Conformationally Constrained Amino Acid Analogues).有机化学杂志54,1859-1866;克里斯蒂B.D.(Christie,B.D.)和拉波波特H.(Rapoport,H.)(1985)从L-天冬酰胺合成光学纯甲基哌啶:通过氨基酸脱羰和亚铵离子环化全合成(+)-阿扑长春胺的应用(Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization).有机化学杂志50:1239-1246;巴顿(Barton)等人,(1987)使用自由基化学合成新颖的α-氨基酸和衍生物:合成L-α-氨基己二酸和D-α-氨基己二酸、L-α-氨基庚二酸和适当的不饱和衍生物(Synthesis of Novelα-Amino-Acids and DerivativesUsing Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-α-Amino-Adipic Acids,L-α-aminopimelicAcid and Appropriate Unsaturated Derivatives).四面体通讯(Tetrahedron Lett.)43:4297-4308;以及苏巴辛哈(Subasinghe)等人,(1992)使君子氨酸类似物:合成β-杂环2-氨基丙酸衍生物和其在新颖使君子氨酸酯敏化位点的活性(Quisqualic acidanalogues:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and theiractivity at a novel quisqualate-sensitized site).医药化学杂志35:4602-7。此外,参见标题为“蛋白质阵列(Protein Arrays)”的美国专利公开案第US 2004/0198637号,其以引用的方式并入本文中。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸允许各种反应以尤其经由亲核加成或醛醇缩合反应来连接分子(包括(但不限于)连接基团、聚合物、多肽、PEG或其它水溶性分子、或其它分子)。
示例性含羰基氨基酸可如下所示:
其中n为0到10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基;且R3为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团;且R4为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基且R2为简单烷基(即,甲基、乙基或丙基),并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中,n为1,R1为苯基且R2为简单烷基(即,甲基、乙基或丙基),并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于张Z.(Zhang,Z.)等人,生物化学(Biochemistry)42:6735-6746(2003)中,其以引用的方式并入本文中。其它含羰基的氨基酸可由所属领域的技术人员类似地制备。
在一些实施例中,包含非天然编码氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说,可以从具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于结合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时,例如,可使用N端丝氨酸或苏氨酸(通常存在或者可经由化学或酶促消化而暴露),在温和氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。参见例如盖特纳(Gaertner)等人,生物结合化学(Bioconjug.Chem.)3:262-268(1992);盖根K.(Geoghegan,K.)和斯特罗J.(Stroh,J.),生物结合化学3:138-146(1992);盖特纳等人,生物化学杂志269:7224-7230(1994)。然而,此项技术中已知的方法局限于在肽或蛋白质N端的氨基酸。
在本发明中,携带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可以并入多肽中作为“掩蔽(masked)”醛官能团。举例来说,5-羟基赖氨酸在邻近ε胺处带有羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔数过量的偏高碘酸钠,以避免在多肽内的其它位点发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠添加到多肽缓冲溶液中,随后在暗处培育约10分钟。参见例如美国专利第6,423,685号,其以引用的方式并入本文中。
在温和条件下,羰基官能团可与含肼、含酰肼、含羟胺或含氨基脲的试剂在水溶液中选择性反应,从而分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲键。参见例如詹克斯W.P.(Jencks,W.P.),美国化学学会杂志81,475-481(1959);邵J.(Shao,J.)和达恩J.P.(Tarn,J.P.),美国化学学会杂志117:3893-3899(1995)。此外,羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。参见例如科尼什V.W.(Cornish,V.W.)等人,美国化学学会杂志118:8150-8151(1996);盖根K.F.和斯特罗J.G.,生物结合化学3:138-146(1992);马哈尔L.K.(Mahal,L.K.)等人,科学(Science)276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成结合物(包括(但不限于)与连接基团、聚合物、多肽、PEG或其它水溶性聚合物或其它分子)。
示例性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下所示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团;且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在一些实施例中,n是4,R1不存在,且X是N。在一些实施例中,n是2,R1不存在,且X不存在。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、含肼和含氨基脲的氨基酸购自商业来源。举例来说,L-谷氨酸-γ-酰肼可获自西格玛化学公司(Sigma Chemical)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。其它不可商购的氨基酸可以由所属领域的技术人员制备。参见例如美国专利第6,281,211号,其以引用的方式并入本文中。
含有带酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与多个含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。参见例如邵J.和达恩J.,美国化学学会杂志117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基,或赖氨酸和N端的氨基)相比较,酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团反应性明显较高。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成结合物(包括(但不限于)与连接基团、聚合物、多肽、PEG或其它水溶性聚合物或其它分子反应)。与肼、酰肼和氨基脲类似,增强氨氧基的亲核性使其能够与多个含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的分子有效且选择性反应。参见例如邵J.和达恩J.,美国化学学会杂志117:3893-3899(1995);H.汉格(H.Hang)和C.贝尔托西(C.Bertozzi),化学研究述评(Acc.Chem.Res.)34:727-736(2001)。与肼基反应得到相应腙,而肟一般是由氨氧基与含羰基基团(如酮)反应得到。
示例性含氨氧基的氨基酸可如下所示:
其中n为0到10;R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基,或不存在;X为O、N、S,或不存在;m为0到10;Y为=C(O),或不存在;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团;且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,m为1且Y存在。在一些实施例中,n为2,R1和X不存在,m为0且Y不存在。
可以由轻易可得的氨基酸前驱物(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备含氨氧基的氨基酸。参见例如M.卡拉斯科(M.Carrasco)和R.布朗(R.Brown),有机化学杂志68:8853-8858(2003)。已经从天然来源中分离出某些含氨氧基的氨基酸,如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(罗森塔尔G.(Rosenthal,G.)等人,生命科学(Life Sci.)60:1635-1641(1997))。所属领域的技术人员可制备出其它含氨氧基的氨基酸。
D.叠氮和炔反应性基团
叠氮和炔官能团的独特反应性使得其极其可用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物,尤其是脂肪族叠氮化物,以及炔一般对常用化学反应条件稳定。具体说来,叠氮基和炔官能团对天然存在多肽中所见的20种常见氨基酸的侧链(即,R基)均呈惰性。但当紧密接近时,会呈现叠氮基和炔基的“弹簧加压(spring-loaded)”性,并且其经由胡伊斯根[3+2]环加成反应有效且选择性反应,产生相应的三唑。参见例如秦J.等人,科学301:964-7(2003);王Q.等人,美国化学学会杂志125,3192-3193(2003);秦J.W.等人,美国化学学会杂志124:9026-9027(2002)。
因为胡伊斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参见派德沃A.(Padwa,A.),综合有机合成(COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS),第4卷,(特罗斯特B.M.(Trost,B.M.)编,1991),第1069-1109页;胡伊斯根R.(Huisgen,R.)1,3-偶极环加成化学(1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY),(派德沃A.编,1984),第1-176页)而不是亲核取代,所以并入具有含叠氮和含炔的侧链的非天然编码氨基酸使得所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮或含炔的PDCM的多肽组分的环加成反应可以在室温下在水性条件下通过在存在催化量的原位将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂的情况下添加Cu(II)(包括(但不限于)呈催化量CuSO4的形式)进行。参见例如王Q.等人,美国化学学会杂志125,3192-3193(2003);托尔诺C.W.(Tornoe,C.W.)等人,有机化学杂志67:3057-3064(2002);罗斯托夫采夫(Rostovtsev)等人,应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)41:2596-2599(2002)。示例性还原剂包括(包括(但不限于))抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和所施加的电位。
在需要叠氮与炔之间发生胡伊斯根[3+2]环加成反应的一些情况下,多肽包含包括炔部分的非天然编码氨基酸,并且欲与所述氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者,还可以进行逆反应(即,与氨基酸上的叠氮部分和存在于连接基团、聚合物、多肽、PEG或其它水溶性聚合物或其它分子上的炔部分)。
叠氮官能团也可以与含有芳基酯并且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键的水溶性聚合物选择性反应。芳基膦基在原位还原叠氮基,且随后所得胺与邻近的酯键有效反应,产生相应酰胺。例如参见E.萨龙(E.Saxon)和C.波特兹(C.Bertozzi),科学(Science)287,2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可以是烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可如下所示:
其中X可为O、N、S,或不存在,Ph为苯基,W为水溶性聚合物,且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示例性R基包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN和-NO2。R'、R"、R'"和R""各独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基,或芳基烷基。举例来说,当本发明化合物包括一个以上R基团时,各R基团是如各R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上这些基团时那样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子时,其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说,-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域技术人员从上文有关取代基的论述将了解到,术语“烷基”打算包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团,如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮官能团还可与含有硫酯且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性反应,从而产生酰胺键。芳基膦基在原位还原叠氮基,且随后所得胺与硫酯键有效反应,产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的示例性水溶性聚合物可如下所示:
其中n为1到10;X可为O、N、S,或不存在,Ph为苯基,且W为水溶性聚合物。
示例性含炔氨基酸可如下所示:
其中n为0到10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基,或不存在;X为O、N、S,或不存在;m为0到10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团;且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X不存在,m为0,且乙炔部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,m为1,且炔丙氧基位于相对于烷基侧链的对位(即,O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中,n为1,R1和X不存在,且m为0(即,炔丙基甘氨酸)。
含炔氨基酸在市面上有售。举例来说,炔丙基甘氨酸可购自派普科技公司(Peptech)(马萨诸塞州伯灵顿(Burlington,MA))。或者,可以根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说,可以例如戴特斯A.(Deiters,A.)等人,美国化学学会杂志125:11782-11783(2003)中所述合成对炔丙基氧基苯丙氨酸,并且可以如凯塞B.(Kayser,B.)等人,四面体(Tetrahedron)53(7):2475-2484(1997)中所述合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域的技术人员可制备出其它含炔氨基酸。
示例性含叠氮的氨基酸可如下所示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团;且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X不存在,m为0且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中,n是0-4并且R1和X不存在,并且m=0。在一些实施例中,n是1,R1是苯基,X是O,m是2并且β-叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮的氨基酸可从商业来源得到。举例来说,4-叠氮基苯丙氨酸可从凯姆英派国际公司(Chem-Impex International,Inc.)(伊利诺伊州伍德戴尔(Wood Dale,IL))获得。对于非市售的含叠氮氨基酸,可使用所属领域的技术人员已知的标准方法,包括(但不限于)经由置换适当离去基团(包括(但不限于)卤基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)或经由使适当保护的内酯开环,相对容易地制备出叠氮基。参见例如马彻的高等有机化学(第三版,1985,威利父子公司,纽约)。
E.氨基硫醇反应性基团
β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其特别适用于通过形成噻唑烷选择性修饰多肽和含有醛基的其它生物分子。参见例如J邵和J达恩,美国化学学会杂志1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中,可以将β-取代的氨基硫醇氨基酸并入PDCM的多肽组分中并且然后使其与包含醛官能团的连接基团、聚合物、多肽、PEG或其它水溶性聚合物或其它分子反应。在一些实施例中,连接基团、聚合物、多肽、PEG或其它水溶性聚合物、分子、药物结合物或其它有效负载可以通过形成噻唑烷而与包含β-取代的氨基硫醇氨基酸的PDCM的多肽组分偶联。
非天然氨基酸的细胞摄取
细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择(包括(但不限于))并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说,α-氨基酸的高电荷密度提示这些化合物不可能为细胞可渗透的。天然氨基酸是经由一系列基于蛋白质的转运系统吸收到真核细胞中。可进行快速筛选来评估哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。参见例如毒性分析,例如以引用的方式并入本文中的标题为“蛋白质阵列(ProteinArrays)”的美国专利公开案第US 2004/0198637号;和刘D.R.(Liu,D.R.)和舒尔茨P.G.(Schultz,P.G.)(1999)关于具有经扩充遗传代码的生物体的进化的进展(Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code)美国国家 科学院院刊96:4780-4785中。尽管易于利用各种分析法分析摄取,但设计适用于细胞摄取路径的非天然氨基酸的替代方法是提供生物合成路径以在体内产生氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中已存在许多生物合成路径来产生氨基酸和其它化合物。虽然特定非天然氨基酸的生物合成方法可能不存在于自然界(包括(但不限于)真核细胞)中,但本发明提供了此类方法。举例来说,在宿主细胞中,通过添加新颖酶,或改变现存的宿主细胞路径,来任选产生非天然氨基酸的生物合成路径。其它新颖酶任选为天然存在酶或人工开发酶。举例来说,对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“体内并入非天然氨基酸(In vivo incorporation of unnatural amino acids)”的WO 2002/085923中的实例所提供)依赖于添加来自其它生物体的已知酶组合。可通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时,这些基因提供合成所需化合物的酶促路径。任选添加的酶类型的实例提供于下文的实例中。其它酶序列可见于例如基因库(Genbank)中。也任选以相同方式将人工开发酶添加到细胞中。以此方式,操纵细胞机器和细胞资源产生非天然氨基酸。
多种方法可用来产生用于生物合成路径中或用于发展现存路径中的新颖酶。举例来说,任选地使用包括(但不限于)如马克津公司(Maxygen,Inc.)所开发的递归重组(recursive recombination)(可在万维网maxygen.com上获得)来开发新颖酶和路径。参见例如施特默尔(Stemmer)(1994),通过DNA改组使蛋白质快速体外进化(Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling),自然370(4):389-391;和施特默尔,(1994),通过随机碎裂和重新组装进行DNA改组:分子进化的体外重组(DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecularevolution),美国国家科学院院刊,91:10747-10751。类似地,任选地使用由杰能科(Genencor)开发的DesignPathTM(可在万维网genencor.com上获得)进行代谢路径工程改造,包括(但不限于)工程改造出在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的路径。这项技术使用新基因(包括(但不限于)利用功能性基因组学以及分子进化和设计鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现存路径。迪文萨公司(Diversa Corporation)(可见于万维网diversa.com)也提供有关迅速筛选基因和基因路径文库的技术(包括(但不限于)来建立新路径。
通常,利用本发明的工程改造的生物合成路径所产生的非天然氨基酸的浓度足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量),但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式体内产生的典型浓度是约10mM到约0.05mM。在用包含用于产生特异性路径所需酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸之后,任选地使用体内选择来针对核糖体蛋白质合成和细胞生长两者进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
并入非天然氨基酸可实现多个目的,包括(但不限于)定制蛋白质结构和/或功能的改变;改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶目标位点的可接近性;靶向某一部分(包括(但不限于)用于蛋白质分析);添加生物活性分子;连接聚合物;连接放射性核素;调节血清半衰期;调节组织渗透(例如肿瘤);调节主动输送;调节组织、细胞或器官特异性或分布;调节免疫原性;调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有较强的或甚至全新的催化或生物物理特性。举例来说,任选通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改变以下特性:毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应(包括(但不限于)共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括(但不限于))新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括(但不限于)抗体)以及(包括(但不限于))蛋白质结构和功能研究。参见例如多尔蒂(Dougherty),(2000)非天然氨基酸作为蛋白质结构和功能的探针(Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structureand Function),化学生物学新见(Current Opinion in Chemical Biology),4:645-652。
在本发明一个方面中,组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上非天然氨基酸的蛋白质。这些非天然氨基酸可相同或不同,包括(但不限于)在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上不同的非天然氨基酸。在另一方面,组合物包括蛋白质中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的指定蛋白质,非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于),所述蛋白质可包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸,或者可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的指定蛋白质,非天然氨基酸可相同、不同,或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
具有至少一个非天然氨基酸的PDCM的多肽组分是本发明的特征。本发明也包括使用本发明组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可以与蛋白质或PDCM一起存在。
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽,蛋白质或多肽通常将包括真核翻译后修饰。在某些实施例中,蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰,其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行的。举例来说,翻译后修饰包括(包括(但不限于))乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。在一个方面中,翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键连接寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))与天冬酰胺。参见表1,其列出了真核蛋白质的N连接寡糖的一些实例(也可存在其它未显示的残基)。在另一方面,翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键连接寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸。
表1:通过GlcNAc键连接的寡糖的实例
在另一方面中,翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前原甲状旁腺激素(preproparathyroid hormone)、前原胰岛素、原胰岛素、前原阿黑皮素(prepro-opiomelanocortin)、原阿黑皮素等)的蛋白水解加工,组装成多亚单位蛋白或大分子组装物,翻译到细胞中的另一位点中(包括(但不限于)翻译到如内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中,或通过分泌途径)。在某些实施例中,蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体等。
非天然氨基酸的一个优势在于,其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞体内进行或在体外进行。因此,在某些实施例中,翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说,翻译后修饰可通过亲核-亲电反应进行。当前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应涉及亲核与亲电反应搭配物之间的共价键形成,包括(但不限于)α卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中,选择性是由蛋白质中亲核残基的数量和可接近性决定。在本发明的蛋白质中,可在体外和体内使用其它更具选择性的反应,如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。参见科尼什(Cornish)等人,(1996)美国化学学会,118:8150-8151;马哈尔(Mahal)等人,(1997)科学,276:1125-1128;王等人,(2001)科学292:498-500;秦等人,(2002)美国化学学会124:9026-9027;秦等人,(2002)美国国家科学院院刊,99:11020-11024;王等人,(2003)美国国家科学院院刊,100:56-61;张等人,(2003)生 物化学,42:6735-6746;和秦等人,(2003)科学,所述文献均以引用的方式并入本文中。这使得能够用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子在内的多种试剂选择性标记几乎任何蛋白质。此外,参见标题为“糖蛋白合成(Glycoproteinsynthesis)”的美国专利第6,927,042号,其以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括(但不限于)经由叠氮基氨基酸修饰)也可通过施陶丁格尔接合(Staudingerligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。参见例如柯克等人,(2002)通过施陶丁格尔接合将叠氮并入重组蛋白中以进行化学选择性修饰(Incorporation ofazides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudingerligation),美国国家科学院院刊99:19-24。
本发明提供另一种选择性修饰蛋白质的高效方法,其涉及响应于选择密码子而将(包括(但不限于))含叠氮基或含炔基部分的非天然氨基酸以遗传方式并入蛋白质中。然后,可以包括(但不限于)通过胡伊斯根[3+2]环加成反应(例如参见派德沃A.(Padwa,A.)综合有机合成,第4卷,(1991)特罗斯特B.M.(Trost,B.M.)编,培格曼(Pergamon),牛津(Oxford),第1069-1109页;和胡伊斯根R.1.3-偶极环加成 化学(1.3-Dipolar Cycloaddition Chemistry).(1984)派德沃A.编,威利(Wiley),纽约,第1-176页)分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。由于此方法涉及环加成而非亲核取代反应,故可以极高的选择性修饰蛋白质。所述反应可在室温下,于水性条件中,通过将催化量的Cu(I)盐添加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4>1,5)进行。参见例如托尔诺(Tornoe)等人,(2002)有机 化学67:3057-3064;和罗斯托夫采夫(Rostovtsev)等人,(2002)应用化学国际版41:2596-2599。可以使用的另一种方法是用四半胱氨酸基元更换双砷化合物上的配体,参见例如格里芬(Griffin)等人,(1998)科学281:269-272。
可以通过[3+2]环加成添加到本发明的多肽中的分子包括具有叠氮或炔基衍生物的几乎任何分子。分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可分别添加到具有炔基(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸。
V.体内产生包含非基因编码氨基酸的PDCM的多肽组分
可以使用经修饰tRNA和tRNA合成酶添加或取代不在天然存在系统中编码的氨基酸,而在体内产生本发明的多肽。
使用不在天然存在系统中编码的氨基酸产生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中,所述公开案以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统内源性合成酶和tRNA起作用(且因此有时称为“正交”)的翻译机器。通常,翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)。通常,O-RS优先使翻译系统中具有至少一个非天然存在的氨基酸的O-tRNA氨酰基化,并且O-tRNA识别至少一个不被所述系统中其它tRNA所识别的选择密码子。因此,翻译系统响应于所编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入所述系统中产生的蛋白质中,由此将氨基酸“取代”入所编码多肽的某一位置中。
此项技术中已经描述多种用于将特定合成氨基酸插入多肽中的正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶,并且其一般都适用于本发明中。举例来说,酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于王L(Wang,L)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100:56-61(2003)和张Z.(Zhang,Z.)等人,生物化学(Biochem.)42(22):6735-6746(2003)中。示例性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码并且包括美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885(各自以引用的方式并入本文)中所揭示的氨基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号),所述公开案以引用的方式并入本文中。
叠氮特异性O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶系统的一个实例描述于秦J.W.等人,美国化学学会杂志124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的示例性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64,所述专利以引用的方式并入本文中。适用于本发明中的示例性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:1-3,所述公开案以引用的方式并入本文中。对特定非天然编码氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中,所述公开案以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基氨基酸与含叠氮氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于秦J.W.(Chin,J.W.)等人,科学301:964-967(2003)中。
已经报导数种其它正交对。已经描述来源于酿酒酵母tRNA's和合成酶的谷氨酰胺酰基(参见例如刘D.R.(Liu,D.R.)和舒尔茨P.G.(Schultz,P.G.)(1999)美国国家科 学院院刊96:4780-4785)、天冬氨酰基(参见例如帕斯纳克M.(Pastrnak,M.)等人,(2000)瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)83:2277-2286)和酪氨酰基(参见例如奥诺S.(Ohno S.)等人,(1998)生物化学(日本东京)(J.Biochem.(Tokyo,Jpn.))124:1065-1068;和科瓦尔A.K.(Kowal,A.K.)等人,(2001)美国国家科学院院刊98:2268-2273)系统用于大肠杆菌中非天然氨基酸的潜在并入。已经描述来源于大肠杆菌谷氨酰胺酰基(参见例如科瓦尔A.K.等人,(2001)美国国家科学院院刊98:2268-2273)和酪氨酰基(参见例如爱德华兹H.(Edwards,H.)和斯克墨P.(Schimmel,P.)(1990)分子与细胞 生物学10:1633-1641)合成酶的系统用于酿酒酵母中。大肠杆菌酪氨酰基系统已经用于将3-碘-L-酪氨酸体内并入哺乳动物细胞中。参见坂本K.(Sakamoto,K.)等人,(2002)核酸研究30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子,但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说,示例性密码子包括无义密码子,如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石);四个或四个以上碱基的密码子;和很少或未使用过的其它天然三碱基密码子。
可以使用此项技术中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特定的选择密码子引入多肽的多核苷酸编码序列的适当位置中。
产生可以用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分(如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于王L.(Wang,L.)等人,科学292:498-500(2001);秦J.W.等人,美国化学学会杂志124:9026-9027(2002);张Z.等人,生物化学42:6735-6746(2003)中。用于体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中,其以引用的方式并入本文中。用于选择在生物体体内翻译系统中使用的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中,所述公开案以引用的方式并入本文中。PCT公开案第W004/035743号,标题为“酮基氨基酸位点特异性并入蛋白质中(Site SpecificIncorporation of Keto Amino Acids into Proteins)”(其以全文引用的方式并入本文中),描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。PCT公开案第WO 04/094593号,标题为“扩充真核遗传密码(Expanding the Eukaryotic Genetic Code)”(其以全文引用的方式并入本文中),描述用于将非天然编码氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
产生至少一个重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含:(a)从第一生物体产生来源于至少一个氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选突变)RS文库,所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体,如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐杆菌(Halobacterium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、超嗜热古菌(A.fulgidus)、强烈嗜热球菌(P.furiosus)、堀越火球菌(P.horikoshii)、嗜热泉生古细菌(A.pernix)、极端嗜热菌(T.thermophilus)等;或真核生物体;(b)在RS(任选地突变RS)文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员,从而提供活性(任选突变)RS集合;和/或(c)在集合中选择(任选地通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS),从而得到至少一种重组O-RS;其中在非天然编码氨基酸的情况下,至少一种重组O-RS优先使O-tRNA氨酰基化。
在一个实施例中,RS是无活性RS。可通过使活性RS突变来产生无活性RS。举例来说,可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生无活性RS。
可使用此项技术中已知的各种技术产生突变RS文库,所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计,或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说,可利用位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构建体、合理设计以及本文中所述或此项技术中已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中,选择(和/或筛选)作为活性成员(包括(但不限于)使正交tRNA(O-tRNA)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下氨酰基化)的RS(任选地突变RS)文库包括:将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(任选突变)RS文库引入多个细胞中,其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子,包括(但不限于)琥珀、赭石或蛋白石密码子;使多个细胞在存在选择剂的情况下生长;鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下通过抑制阳性选择或筛选标记中的至少一个选择密码子存活(或显示特异性反应)的细胞,从而得到含有活性(任选突变)RS集合的经阳性选择的细胞子组。任选可改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
在一个方面中,阳性选择标记是氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase;CAT)基因,并且在CAT基因中,选择密码子是琥珀终止密码子。阳性选择标记物任选为β-内酰胺酶基因,且在β-内酰胺酶基因中,选择密码子为琥珀终止密码子。在另一方面中,阳性筛选标记物包含荧光或发光筛选标记,或基于亲和力的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中,在集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(任选突变)包括:将具有来自阳性选择或筛选的活性(任选突变)RS集合的阴性选择或筛选标记引入第二生物体的多个细胞中,其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因,包括(但不限于)氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因);并且鉴别在补充非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应,但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或不显示特异性反应的细胞,从而得到具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞。举例来说,在测定适当O-RS重组体时,CAT鉴别方案任选充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说,在存在或不存在一或多个非天然编码氨基酸的情况下,任选于含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆集合。因此,仅在含有非天然编码氨基酸的板上生长的集落被认为含有重组O-RS。在一个方面,改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中,第一生物体与第二生物体不同。因此,第一和/或第二生物体任选地包含:原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中,筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。
在另一个实施例中,在集合中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(任选突变)RS包括:从阳性选择步骤(b)分离出活性突变RS的集合;将阴性选择或筛选标记和活性(任选突变)RS的集合引入第二生物体的多个细胞中,其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因,包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因);并且鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应,但在补充非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或不显示特异性筛选反应的细胞,从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞,其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。在一个方面中,所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例任选可包括:所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子,且第一与第二生物体不同(包括(但不限于),各生物体任选为(包括(但不限于))原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外,一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记任选包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记的情形。在本文中的实施例中,筛选和/或选择任选包括筛选和/或选择严格度的变化。
在一个实施例中,产生至少一个重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可以进一步包含:(d)分离至少一种重组O-RS;(e)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组O-RS(任选突变);和(f)重复步骤(b)和(c)直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS为止。任选地,重复步骤(d)-(f),包括(但不限于)至少约两次。在一个方面中,可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
上述方法中选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者)的严格度任选包括改变选择/筛选严格度。在另一个实施例中,阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者包含使用报告基因,其中报告基因是利用荧光活化细胞分选法(FACS)检测,或其中报告基因是通过发光检测。报告基因任选展示于细胞表面上、噬菌体展示上等,并且是根据涉及非天然编码氨基酸或其类似物的亲和力或催化活性来选择。在一个实施例中,突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等。
产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括:(a)从第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制子tRNA)的突变tRNA的文库;(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下,通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选突变)tRNA,从而得到tRNA(任选突变)的集合;以及(c)在tRNA(任选突变)集合中选择或筛选通过所引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员,从而得到至少一种重组O-tRNA;其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子,并且不由第二生物体的RS有效识别,并且由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中,所述至少一种tRNA是抑制子tRNA,和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子,或是无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中,重组O-tRNA的正交性得到改进。应了解,在一些实施例中,无需修饰即可任选将O-tRNA从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中,第一生物体与第二生物体相同或不同,并且任选地选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外,重组tRNA任选经非天然编码氨基酸氨酰基化,其中所述非天然编码氨基酸是在体内天然生物合成的,或是通过基因操作来生物合成的。
在一个方面中,在文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选由氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(任选突变)tRNA(步骤(b))包括:将毒性标记基因和(任选突变)tRNA文库引入第二生物体的多个细胞中,其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因,或生物体必需的基因,其中所述标记基因包含至少一个选择密码子);和选择存活细胞,其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(任选突变)tRNA的集合。举例来说,可通过使用比较比率细胞密度分析(comparison ratio cell density assay)来选择存活细胞。
在另一个方面中,毒性标记基因可以包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中,毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因,其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因任选可包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中,在(任选突变)tRNA的集合中选择或筛选通过所引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可以包括:将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(任选突变)tRNA的集合引入第二生物体的多个细胞中,其中阳性标记基因包含抗药性基因(包括(但不限于)β-内酰胺酶基因,其包含至少一个选择密码子,例如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因,或导致毒性剂解毒的基因;并且鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活或经筛选细胞,从而得到具有至少一种重组tRNA的细胞集合,其中至少一种重组tRNA通过O-RS氨酰基化并且响应于至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中,选择剂和/或筛选剂的浓度不同。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括:(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库;(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选突变)tRNA,从而得到(任选突变)tRNA集合;(c)在(任选突变)tRNA集合中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员,从而得到至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子,并且不由第二生物体的RS有效识别,并且由O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)从第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选突变)RS的文库;(e)在突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员,从而得到活性(任选突变)RS的集合;以及(f)在所述集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(任选突变)RS,从而得到至少一个特异性O-tRNA/O-RS对,其中所述至少一个特异性O-tRNA/O-RS对包含对非天然编码氨基酸具有特异性的至少一种重组O-RS和至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说,特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对,如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外,所述方法包括第一生物体与第三生物体相同(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本发明中还包括选择用于第二生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括:将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入第二生物体的第一组细胞中;将标记基因和tRNA引入第二生物体的复制细胞组(duplicate cell set)中;和选择在复制细胞组中不能存活而在第一组中存活的细胞,或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞,其中第一组与复制细胞组都是在选择剂或筛选剂存在下生长,其中存活或经筛选细胞包含用于第二生物体的体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中,比较和选择或筛选包括体内互补分析。选择剂或筛选剂的浓度可变化。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说,本发明方法中的第一生物体与第二生物体可相同或不同。在一个实施例中,生物体任选地为原核生物体,包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者,生物体任选包含真核生物体,包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物,如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中,第二生物体为原核生物体,包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐杆菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者,第二生物体可为真核生物体,包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中,第一生物体与第二生物体不同。
VI.PDCM的多肽组分中非天然存在氨基酸的位置
本发明涵盖将一或多个非天然存在氨基酸并入PDCM的多肽组分中。可将一或多个非天然存在的氨基酸并入不破坏多肽活性的特定位置。这可以通过进行“保守”取代实现,包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸;用大体积氨基酸取代大体积氨基酸;用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸,和/或将非天然存在的氨基酸插入非活性所需的位置中。
可以采用各种生物化学和结构方法来选择在多肽内所希望的用非天然编码氨基酸取代的位点。所属领域的技术人员易于了解,多肽链中的任何位置都适合选择用于并入非天然编码氨基酸,并且选择可建立在合理设计的基础上或者通过随机选择以实现任何或非特别的所需目的。所希望位点的选择可以用于产生具有任何所希望特性或活性的PDCM的多肽组分,包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、结合到结合搭配物的调节剂、结合搭配物活性调节剂、结合搭配物构象调节剂、二聚物或多聚物形成、相比于天然分子活性或特性无改变或操纵所述多肽的任何物理或化学特性,如溶解性、聚集或稳定性。举例来说,可以使用此项技术中已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描方法鉴别出多肽中关于多肽的生物活性所需的位置。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号(所述专利以引用的方式并入本文中)描述通过鉴别影响具有目标物质的多肽的活性的活性域来系统分析多肽的结构和功能的方法。视期望寻求的多肽活性而定,除经丙氨酸或同系物扫描诱变鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可成为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者,视期望寻求的多肽活性而定,鉴别为对生物活性至关重要的位点也可成为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法为,利用非天然编码氨基酸在多肽链上的各个位置中简单地进行连续取代,并观察对多肽活性的影响。所属领域的技术人员易于了解,选择任何多肽中供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。
也可以检查多肽的含有缺失的天然存在突变体的结构和活性以确定有可能耐受非天然编码氨基酸进行的取代的蛋白质区域。以类似方式,可以使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别多肽中负责结合其受体或结合搭配物的区域。在已经消除了有可能不耐受供非天然编码氨基酸取代的残基之后,可以从多肽和其结合蛋白的三维晶体结构检查所建议取代在每一个其余位置的影响。蛋白质数据库(PDB,可在万维网rcsb.org上获得)是一个含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的集中式数据库。如果无法得到三维结构数据,那么可建立研究多肽二级结构和三级结构的模型。因此,所属领域的技术人员可容易地鉴别出可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些实施例中,多肽包含一或多个位于蛋白质中不破坏多肽的螺旋或β夹层二级结构的区域中的非天然存在氨基酸。
非天然编码氨基酸并入的示例性残基包括(但不限于)从用于结合到结合搭配物的潜在受体结合区域中排除的那些残基,可能完全或部分溶剂暴露,与附近残基的氢键相互作用最小或没有,可以最低限度地暴露于附近反应性残基中,可以在多肽的一或多个暴露面上,可以是与第二多肽或其它分子或其片段并列的多肽的一或多个位点,可以在高度柔性或结构上刚性的区域(如由多肽的三维二级、三级或四级结构所预测)中、与其抗原或结合蛋白结合或非结合、或与另一多肽或其它生物活性分子偶合或不偶合,或可以通过按需要改变完整结构的柔性或刚性来调节多肽本身或包含一或多个多肽的二聚物或多聚物的构象。
可以将各种非天然编码氨基酸取代或并入多肽中的指定位置。一般来说,基于以下来选择用于并入的特定非天然编码氨基酸:检查通过任何其它方式测定的多肽的三维晶体结构或多肽的二级、三级或四级结构,优选保守取代(即,基于芳基的非天然编码氨基酸,如用对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp),以及希望引入多肽中的特异性结合化学(例如,如果想要实现与带有炔部分的水溶性聚合物的胡伊斯根[3+2]环加成或与带有芳基酯的水溶性聚合物(其又并入有膦部分)形成酰胺键,那么引入4-叠氮基苯丙氨酸)。
在一个实施例中,所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中,其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团;以及使蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、光化辐射可激发的部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团发生[3+2]环加成反应,以将所述分子与非天然氨基酸连接。在一个实施例中,第一反应性基团为炔基或叠氮基部分,而第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说,第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中),而第二反应性基团为叠氮基部分。在另一个实例中,第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中),而第二反应性基团为炔基部分。
在一些情况下,非天然编码氨基酸取代将与多肽内的其它添加、取代或缺失组合,以影响多肽的其它生物学性状。在一些情况下,其它添加、取代或缺失可以增加多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对多肽受体、抗原、结合蛋白或其它分子的亲和力。在一些情况下,其它添加、取代或缺失可以增加多肽的溶解性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中,添加、取代或缺失在表达于大肠杆菌或其它重组宿主细胞中之后可增加多肽溶解性。在一些实施例中,除并入非天然氨基酸的位点外还选择另一位点以供天然编码或非天然氨基酸取代,这使得在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。在一些实施例中,多肽包含另一添加、取代或缺失,所述添加、取代或缺失会调节对其受体、抗原、结合蛋白或其它分子的亲和力,调节(包括(但不限于)增加或减少)受体二聚化,使受体二聚物稳定,调节循环半衰期,调节释放或生物利用率,促进纯化,或提高或改变特定投药途径。类似地,多肽可包含化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或连接分子(包括(但不限于)生物素),其可改进检测(包括(但不限于)GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、尺寸减小或多肽的其它特性。
在一些情况下,用一或多个非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上氨基酸。在一些情况下,多肽进一步包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上用一或多个非天然编码氨基酸对天然存在的氨基酸的取代。
VII.非真核细胞和真核细胞中的表达
为了获得编码本发明多肽的克隆多核苷酸的高水平表达,通常将编码本发明多肽的多核苷酸亚克隆到含有用于指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果针对编码蛋白质的核酸)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。适合的细菌启动子为所属领域的技术人员已知并且描述在例如萨姆布鲁克等人和奥斯贝等人中。
用于表达本发明多肽的细菌表达系统可以在以下各者中获得:包括(但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和沙门氏菌(Salmonella)(帕尔瓦(Palva)等人,基因(Gene)22:229-235(1983);莫斯巴赫等人,自然(Nature)302:543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒在市面上有售。所属领域的技术人员已知哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统,且在市面上也有销售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上文所述)表达本发明多肽的情况中,用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力来选择。示例性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌),以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述,可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞能够合成较大有效量的包含非天然氨基酸的蛋白质。在一个方面中,组合物任选包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上包含非天然氨基酸的蛋白质,或者利用体内蛋白质制备方法可达到的量(关于重组蛋白制备和纯化的细节如本文中所提供)。在另一方面中,组合物中存在的蛋白质在(包括(但不限于))细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)体积(包括(但不限于))在约1nl到约100L间的任何体积或更高体积)中的浓度任选为(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质,或每升至少10毫克蛋白质或更高的浓度。本发明的一个特征为,在真核细胞中产生大量(包括(但不限于)大于用其它方法(包括(但不限于)体外翻译)通常可能获得的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞能够生物合成较大有效量的包含非天然氨基酸的蛋白质。举例来说,产生的包含非天然氨基酸的蛋白质在细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等中的浓度为(包括(但不限于))至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更多的蛋白质。
I.表达系统、培养和分离
多肽可以在任何数量的适合表达系统中表达,包括例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌。下文将描述示例性表达系统。
酵母如本文中使用的术语“酵母”包括能够表达编码多肽的基因的各种酵母中的任一者。这些酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌(Fungiimperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科:蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。酵母菌科包含四个亚科:裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如,裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如,毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和香灰拟锁担菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科:掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如,掷孢酵母属(Sporoholomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如,假丝酵母属(Candida))。
供本发明使用的特别值得关注的是毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种,其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)内。
用于表达多肽的适合酵母的选择在所属领域的技术人员的技能内。在选择用于表达的酵母宿主过程中,适合的宿主可以包括显示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好溶解性蛋白质产生和整体稳固性的宿主。酵母通常可从多种来源获得,包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Yeast Genetic Stock Center,Department of Biophysicsand Medical Physics,University of California(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection("ATCC")(Manassas,VA))。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可以用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。这一术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解,由于意外或故意突变,单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。与将要以相关特性(如存在编码本发明多肽的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
已经开发出包括染色体外复制子或整合载体在内的表达和转化载体,用于转化到许多酵母宿主中。举例来说,已经开发出以下各者的表达载体:酿酒酵母(西科尔斯基(Sikorski)等人,遗传学(Genetics)(1998)112:19;伊藤(Ito)等人,细菌学杂志(J.Bacteriol.)(1983)153:163;希嫩(Hinnen)等人,美国国家科学院院刊(1978)75:1929);白色念珠菌(库尔茨(Kurtz)等人,分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)(1986)6:142);麦芽糖假丝酵母(孔泽(Kunze)等人,基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)(1985)25:141);汉森酵母(格利森(Gleeson)等人,普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)(1986)132:3459;罗根坎波(Roggenkamp)等人,分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)(1986)202:302);脆壁克鲁维酵母(达斯(Das)等人,细菌学杂志(1984)158:1165);乳酸克鲁维酵母(德卢旺库尔(DeLouvencourt)等人,细菌学杂志(1983)154:737;范登博格(Van den Berg)等人,生物技术(Bio/Technology)(1990)8:135);谷勒氏酵母(孔泽等人,基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)(1985)25:141);巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号;第4,929,555号;和第4,837,148号;格瑞(Cregg)等人,分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)(1985)5:3376);粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(比奇(Beach),自然(1981)300:706);和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica);构巢曲霉(A.nidulans)(巴兰斯(Ballance)等人,生物化学与生物物理研究通讯(1983)112:284-89;蒂尔伯恩(Tilburn)等人,基因(Gene)(1983)26:205-221;和耶尔顿(Yelton)等人,美国国家科学院院刊(1984)81:1470-74);黑曲霉(A.niger)(凯莉(Kelly)和海因斯(Hynes),欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)(1985)4:475479);木霉(T.reesia)(EP 0 244 234);以及丝状真菌,例如红霉菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉菌(Tolypocladium)(WO 91/00357),每一者都以引用的方式并入本文中。
所属领域的技术人员已知用于酵母载体的控制序列,并且所述序列包括(但不限于)以下基因的启动子区:如醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044);烯醇化酶;葡萄糖激酶;葡萄糖-6-磷酸异构酶;甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH);己糖激酶;磷酸果糖激酶;3-磷酸甘油酸变位酶;和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可以提供有用的启动子序列(宫之原(Myanohara)等人,美国国家科学院院刊(1983)80:1)。适用于酵母宿主的其它启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(海泽曼(Hitzeman)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem)(1980)255:12073);和其它糖解酶(如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(霍兰德(Holland)等人,生物化学(Biochemistry)(1978)17:4900;海斯(Hess)等人,酶调控进展杂志(J.Adv.Enzyme Reg.)(1969)7:149))的启动子。具有由生长条件控制的额外转录优点的诱导性酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、氮代谢相关性降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区适用于酵母表达中的载体和启动子进一步描述于EP 0073 657中。
酵母增强子也可以与酵母启动子一起使用。另外,合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说,酵母启动子的上游活化序列(upstream activating sequence,UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接,产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号,其以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列结合糖解酶基因(如GAP或PyK)的转录活化区所组成的启动子。参见EP 0 164 556。此外,酵母启动子可以包括非酵母来源的具有结合酵母RNA聚合酶并且起始转录的能力的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体一部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(霍兰德(Holland)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1981)256:1385)。另外,来自2μ质粒来源的复制起点也适用于酵母。适用于酵母中的选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参见蒂谢姆普(Tschemper)等人,基因(1980)10:157;金仕曼(Kingsman)等人,基因(1979)7:141。trp1基因提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记。类似地,Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)是由带有Leu2基因的已知质粒补充。
所属领域的技术人员已知将外源DNA引入酵母宿主中的方法,这些方法通常包括(但不限于)转化原生质球状体或转化经碱金属阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说,可以根据在肖(Hsiao)等人,美国国家科学院院刊(1979)76:3829和范索林根(Van Solingen)等人,细菌学杂志(J.Bact.)(1977)130:946中所述的方法进行酵母的转化。然而,如萨姆布鲁克等人,分子克隆实验指南(2001)中大致所述,还可以使用将DNA引入细胞中的其它方法,如通过核注射、电穿孔或原生质体融合。随后,可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
所属领域的技术人员已知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其它方法。一般参见美国专利公开案第20020055169号;美国专利第6,361,969号;第6,312,923号;第6,183,985号;第6,083,723号;第6,017,731号;第5,674,706号;第5,629,203号;第5,602,034号和第5,089,398号;美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号;PCT公开专利申请案WO 99/078621;WO 98/37208;和WO 98/26080;欧洲专利申请案EP 0 946 736;EP 0 732 403;EP 0 480 480;WO 90/10277;EP 0 340 986;EP 0329 203;EP 0 324 274和EP 0 164 556。此外,参见吉利森(Gellissen)等人,安东尼·范·列文虎克(Antonie Van Leeuwenhoek)(1992)62(l-2):79-93;罗曼诺斯(Romanos)等人,酵母(Yeast)(1992)8(6):423-488;戈德尔(Goeddel),酶学方法(1990)185:3-7,每一者都以引用的方式并入本文中。此外,参见吉利森(Gellissen)等人,安东尼·范·列文虎克(Antonie Van Leeuwenhoek)(1992)62(1-2):79-93;罗曼诺斯(Romanos)等人,酵母(Yeast)(1992)8(6):423-488;戈德尔(Goeddel),酶学方法(1990)185:3-7,每一者都以引用的方式并入本文中。
在使用所属领域的技术人员已知的标准进料分批发酵方法进行的扩增阶段期间,可使酵母宿主菌株在发酵罐中生长。发酵方法可经调适以考虑特定酵母宿主的碳利用路径的差异或表达控制模式。举例来说,酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如,酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相比之下,甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)可能需要甘油、甲醇和微量矿物进料,但只需要简单铵(氮)盐以达最佳生长和表达。参见例如美国专利第5,324,639号;埃利奥特(Elliott)等人,蛋白质化学杂志(J.Protein Chem.)(1990)9:95;和菲什科(Fieschko)等人,生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)(1987)29:1113,其以引用的方式并入本文中。
然而,这些发酵方法可能具有某些与所用酵母宿主菌株无关的常见特征。举例来说,在扩增期间,可将限制生长的养分(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外,发酵方法一般使用的发酵培养基是设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、微量矿物和盐等)。适合与毕赤酵母一起使用的发酵培养基的实例描述在美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中,其以引用的方式并入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。这一术语包括经过转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解,由于意外或故意突变,单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。与将要以相关特性(如存在编码本发明多肽的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
所属领域的技术人员众所周知用于表达多肽的适合昆虫细胞的选择。在此项技术中充分描述了若干昆虫物种,并且所述物种在市面上都有销售,包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择供表达的昆虫宿主时,适合的宿主可包括显示(尤其)良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫一般可从多种来源获得,包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Insect Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA));和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(AmericanType Culture Collection("ATCC")(Manassas,VA))。
一般说来,感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括:转移载体,通常为细菌质粒,其含有杆状病毒基因组的片段和供插入欲表达的异源基因的便利限制性位点;序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的野生型杆状病毒(此使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中);以及适当昆虫宿主细胞,和生长培养基。此项技术中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术,并且可以使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中后,将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中,在宿主细胞中,载体和病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒,并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如英杰公司(Invitrogen Corp.)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))。所属领域的技术人员一般已知这些技术,且其完整描述于萨姆斯(Summers)和史密斯(Smith),德克萨斯农业实验站会刊(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin)第1555期(1987)中,此文献以引用的方式并入本文中。此外,参见理查森(Richardson),39分子生物学方法:杆状病毒表达方案(METHODS INMOLECULAR Biology:Baculovirus Expression Protocols)(1995);奥斯贝等人,分子生物学实验指南16.9-16.11(1994);金(King)和迫塞(Possee),杆状病毒系统实验指导(The Baculovirus System:A Laboratory Guide)(1992);和奥莱利(O'Reilly)等人,杆状病毒表达载体实验指南(Baculovirus Expression Vectors:A LaboratoryManual)(1992)。
实际上,所属领域中众所周知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生各种异源蛋白质。参见例如美国专利第6,368,825号;第6,342,216号;第6,338,846号;第6,261,805号;第6,245,528号;第6,225,060号;第6,183,987号;第6,168,932号;第6,126,944号;第6,096,304号;第6,013,433号;第5,965,393号;第5,939,285号;第5,891,676号;第5,871,986号;第5,861,279号;第5,858,368号;第5,843,733号;第5,762,939号;第5,753,220号;第5,605,827号;第5,583,023号;第5,571,709号;第5,516,657号;第5,290,686号;WO 02/06305;WO 01/90390;WO 01/27301;WO 01/05956;WO 00/55345;WO 00/20032WO 99/51721;WO99/45130;WO 99/31257;WO 99/10515;WO 99/09193;WO 97/26332;WO96/29400;WO 96/25496;WO 96/06161;WO 95/20672;WO 93/03173;WO92/16619;WO 92/02628;WO 92/01801;WO 90/14428;WO 90/10078;WO90/02566;WO 90/02186;WO 90/01556;WO 89/01038;WO 89/01037;WO88/07082,其以引用的方式并入本文中。
此项技术中已知可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体且其包括例如从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体,这是一种不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。一般参见奥莱利(O'Reilly)等人,杆状病毒表达载体实验指南(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前,通常将包含启动子、前导序列(必要时)、相关编码序列和转录终止序列的上述组件组装到中间错位构建体(intermediatetransplacement construct)(转移载体)中。中间错位构建体通常保持在能够稳定保持在宿主(如细菌)中的复制子(如染色体外元件,例如质粒)中。复制子将具有复制系统,由此使其能保持在适于克隆和扩增的宿主中。更具体来说,质粒可含有多角体蛋白多聚腺苷酸化信号(米勒(Miller),微生物学年鉴(Ann.Rev.Microbiol.)(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素抗性(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体是pAc373。也已经设计出所属领域的技术人员已知的许多其它载体,包括例如pVL985,其中将多角体蛋白的起始密码子由ATG变为ATT,并将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参见鲁克诺(Luckow)和萨姆斯,病毒学(Virology)170:31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(英杰公司(Invitrogen Corp.),加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))。
在插入异源基因之后,将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。此项技术中已知将异源DNA引入杆状病毒的所希望位点中的方法。参见萨姆斯和史密斯,德克萨斯农业实验站会刊第1555期(1987);史密斯等人,分子与细胞生物学(1983)3:2156;鲁克诺和萨姆斯,病毒学(Virology)(1989)17:31。举例来说,插入可以是通过同源双重交叉重组插入到基因(如多角体蛋白基因)中;插入也可以是插入到经工程改造成所需杆状病毒基因的限制酶位点中。For example,theinsertion can be into a gene such参见米勒等人,生物分析(Bioessays)(1989)11(4):91。
可以通过电穿孔来实现转染。参见托特(Trotter)和伍德(Wood),39分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)(1995);曼和金,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)(1989)70:3501。或者,可以使用脂质体用重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。参见例如利布曼(Liebman)等人,生物技术(BIOTECHNIQUES)(1999)26(1):36;格拉夫(Graves)等人,生物化学(1998)37:6050;野村(Nomura)等人,生物化学杂志(1998)273(22):13570;施密特(Schmidt)等人,蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)(1998)12:323;薛福德(Siffert)等人,自然·遗传学(Nature Genetics)(1998)18:45;迪金(Tilkins)等人,细胞生物学实验手册(Cell Biology:A Laboratory Handbook)145-154(1998);采(Cai)等人,蛋白质表达和纯化(1997)10:263;多尔芬(Dolphin)等人,自然·遗传学(1997)17:491;科斯特(Kost)等人,基因(1997)190:139;雅各布松(Jakobsson),生物化学杂志(1996)271:22203;罗尔斯(Rowles)等人,生物化学杂志(1996)271(37):22376;瑞韦尔西(Reversey)等人,生物化学杂志(1996)271(39):23607-10;史坦利(Stanley)等人,生物化学杂志(1995)270:4121;西斯克(Sisk)等人,病毒学杂志(J.Virol.)(1994)68(2):766;以及彭(Peng)等人,生物技术(1993)14.2:274。市售脂质体包括例如和(英杰公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)。另外,也可使用磷酸钙转染。参见托特和伍德,39分子生物学方法(1995);凯特(Kitts),NAR(1990)18(19):5667;以及曼恩(Mann)和金(King),普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够结合杆状病毒RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区,其通常接近编码序列的5'端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域,当存在时,其通常在结构基因的末梢。此外,表达可为受调控或组成性的。
在感染周期末期大量转录的结构基因将提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于编码病毒多面体蛋白的基因(弗雷森(Friesen)等人,杆状病毒基因表达的调控(The Regulation of Baculovirus Gene Expression),杆状病毒分子生物学(TheMolecular Biology of Baculoviruses)(1986);EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因(沃拉克(Vlak)等人,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)(1988)69:765)的序列。
将新形成的杆状病毒表达载体包装到传染性重组杆状病毒中并且随后可以通过所属领域的技术人员已知的技术纯化生长斑块。参见米勒等人,生物分析(1989)11(4):91;萨姆斯和史密斯,德克萨斯农业实验站会刊第1555期(1987)。
已经开发出重组杆状病毒表达载体用于感染到若干昆虫细胞中。举例来说,已开发(尤其)用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参见赖特(Wright),自然(1986)321:718;卡博内尔(Carbonell)等人,病毒学杂志(1985)56:153;史密斯等人,分子与细胞生物学(1983)3:2156。一般参见弗雷泽(Fraser)等人,体外细胞与发育生物学(In Vitro Cell.Dev,Biol),(1989)25:225。更具体来说,用于杆状病毒表达载体系统的细胞株通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC编号CRL-1711)、Sf21(草地贪夜蛾)(英杰公司,目录编号11497-013(加利福尼亚州卡尔斯巴德))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
可在市面上购得用于在杆状病毒/表达中直接和融合表达异源多肽的细胞和培养基,并且所属领域的技术人员一般已知细胞培养技术。
大肠杆菌、假单胞菌和其它原核生物细菌表达技术是所属领域的技术人员已知的。各种载体可供用于在细菌宿主中使用。这些载体可以是单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于存在丰富的有关载体的文献、许多载体在市面上有售以及甚至存在描述载体和其限制性图谱和特征的手册,故无需在这里深入讨论。众所周知,载体通常涉及允许选择的标记,所述标记可以提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。常常会存在多个标记,其提供不同的特征。
细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶并且起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有转录起始区,其通常接近编码序列的5'端。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵基因的第二域,其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许负调控(诱导性)转录,这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因,并由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(如操纵基因)的情况下,可发生组成性表达。另外,通过基因活化蛋白结合序列可实现正调控,当存在这一序列时,其通常接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的一个实例是代谢物活化蛋白(catabolite activator protein,CAP),其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[雷波德(Raibaud)等人,遗传学年鉴(Annu.Rev.Genet.)(1984)18:173]。因此,表达的调控可以是正调控或负调控,由此增强或减弱转录。
编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(如半乳糖、乳糖(lac)[常(Chang)等人,自然(Nature)(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(如色氨酸(trp))的启动子序列[戈德尔等人,核酸研究(1980)8:4057;耶尔弗顿(Yelverton)等人,核酸研究(1981)9:731;美国专利第4,738,921号;欧洲专利公开案第036 776号和第121 775号,其以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[魏斯曼(Weissmann)(1981)“干扰素的克隆和其它错误(The cloning of interferon and othermistakes)”.干扰素3(Interferon 3)(I.格雷塞尔(I.Gresser)编)]、噬菌体λPL[下竹(Shimatake)等人,自然(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号](所述文献以引用的方式并入本文中)启动子系统还提供适用的启动子序列。优选的本发明方法利用强启动子(如T7启动子)以高水平诱导多肽。所述载体的实例是所属领域的技术人员已知的,并且包括来自诺杰公司(Novagen)的pET29系列,以及WO99/05297(以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高水平多肽,同时不会损害宿主细胞生存能力或生长参数。
另外,自然界中不存在的合成启动子也可以充当细菌启动子。举例来说,可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接,从而产生合成的杂合启动子[美国专利第4,551,433号,以引用的方式并入本文中]。举例来说,tac启动子是包含trp启动子与lac操纵子序列两者的杂合trp-lac启动子,其受lac阻遏物调控[阿曼恩(Amann)等人,基因(Gene)(1983)25:167;德波尔(de Boer)等人,美国国家科学院院刊(1983)80:21]。此外,细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子,其能够与细菌RNA聚合酶结合并起始转录。也可将非细菌来源的天然存在启动子与相容性RNA聚合酶偶联以便在原核生物中高水平表达一些基因。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶联启动子系统的一个实例[斯蒂尔(Studier)等人,分子生物学杂志(1986)189:113;塔波(Tabor)等人,美国国家科学院院刊(1985)82:1074]。另外,杂合启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区(欧洲公开案第267851号)。
除功能性启动子序列之外,有效核糖体结合位点也可以用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中,核糖体结合位点称作沙恩-达尔加诺(Shine-Dalgarno,SD)序列,且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的3-9个核苷酸长的序列[沙恩(Shine)等人,自然(Nature)(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3'之间的碱基配对促进了mRNA与核糖体的结合[施泰茨(Steitz)等人“信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列(Genetic signals andnucleotide sequences in messenger RNA)”,生物调控与发展:基因表达(BiologicalRegulation and Development:Gene Expression)(R.F.戈尔德贝格尔(R.F.Goldberger)编,1979)]。从而用弱核糖体-结合位点表达真核基因和原核基因[萨姆布鲁克等人“克隆基因在大肠杆菌中的表达(Expression of cloned genes in Escherichia coli)”,分子克隆实验指南,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。这一术语包括经过转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解,由于意外或故意突变,单一母体细胞后代在形态学或基因组或总DNA补体上与原始母体可能未必完全相同。与将要以相关特性(如存在编码本发明多肽的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
所属领域的技术人员已知用于表达多肽的适合宿主细菌的选择。在选择用于表达的细菌宿主时,适合的宿主可以包括显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和整体稳固性的宿主。细菌宿主一般可从多种来源获得,包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加利福尼亚州伯克利)(Bacterial Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(北弗吉尼亚州马纳萨斯)(American Type Culture Collection("ATCC")(Manassas,VA))。工业/医药发酵一般使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外,这些菌株为非病原性的,而出于安全性和环境原因,其在商业上相当重要。适当大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)菌株BL21、DH10B或其衍生物。在本发明方法的另一个实施例中,大肠杆菌宿主为缺乏蛋白酶的菌株(protease minus strain),包括(但不限于)OMP-和LON-。在本发明方法的另一个实施例中,宿主细胞菌株是假单胞菌物种,包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。指定为菌株MB101的荧光假单胞菌生物变种1已知适用于重组生产且可用于治疗性蛋白质生产工艺中。假单胞菌表达系统的实例包括从陶氏化学公司(Dow Chemical Company)得到的呈宿主菌株的系统(密歇根州米德兰(Midland,MI),可见于万维网dow.com)。以引用的方式并入本文中的美国专利第4,755,465号和第4,859,600号描述了假单胞菌菌株作为用于产生人类生长激素的宿主细胞的用途。
一旦形成重组宿主细胞菌株(即,已将表达构建体引入宿主细胞中并且分离出具有合适表达构建体的宿主细胞)后,在适于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞菌株。所属领域的技术人员将了解,培养重组宿主细胞株的方法将取决于所用表达构建体的特性和宿主细胞的身份。重组宿主菌株通常使用所属领域的技术人员已知的方法来加以培养。通常在液体培养基中培养重组宿主细胞,所述液体培养基含有可吸收的碳源、氮源和无机盐,并且任选地含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域的技术人员已知的其它蛋白质培养补充剂。用于培养宿主细胞的液体培养基可以任选地含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物和/或包括(但不限于)抗生素的化合物的生长,从而选择含有表达载体的宿主细胞。
重组宿主细胞可以分批或连续模式培养,其中细胞采集(在多肽积聚于胞内的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备,优选分批培养和细胞采集。
本发明的多肽通常在重组系统中表达之后加以纯化。可以通过此项技术已知的各种方法从宿主细胞纯化所述多肽。在细菌宿主细胞中产生的多肽可能是难溶性或不溶性的(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中,可以使用本文中所揭示的方法以及此项技术中已知的那些方法,在多肽中容易地进行经选择以便增加重组地产生的蛋白质的溶解性的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下,可以通过离心从宿主细胞溶解产物收集蛋白质并且可以接着进一步使细胞均质化。在具有弱溶解性蛋白质的情况下,可添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(polyethylene imine,PEI)的化合物以诱导部分可溶蛋白质的沉淀。随后宜通过离心作用收集沉淀蛋白质。可以使用所属领域的技术人员已知的各种方法使重组宿主细胞破碎或均质化以从细胞内释放包涵体。宿主细胞破碎或均质化可以使用众所周知的技术进行,包括(但不限于)酶促细胞破碎、声处理、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破碎。在本发明方法的一个实施例中,使用高压释放技术来使大肠杆菌宿主细胞破裂,从而释放出多肽的包涵体。当处理多肽的包涵体时,由于如溶解、机械剪切或蛋白质水解的因素,将重复均质化时间最小化以便最大化包涵体的产率而不造成损失为有利的。
然后可以使用此项技术已知的多种适合的溶解剂中的任一者来溶解不溶性或沉淀多肽。可以用尿素或盐酸胍来溶解多肽。应该使所溶解的多肽-BP的体积降到最低以使得可以使用可方便管理的批次尺寸产生大批次。在重组宿主可按数千升体积的批次生长的大规模商业环境中,这个因素可能相当重要。另外,当在大规模商业环境中制造多肽时,特别是对于人类医药应用来说,如果可能的话,那么应避免会损害机器和容器的苛刻化学品或蛋白质产物本身。本发明方法中已经显示,较温和的变性剂尿素可代替较苛刻的变性剂盐酸胍用于溶解多肽包涵体。尿素的使用显著降低了对在多肽的制造和纯化工艺中所采用的不锈钢设备的损害的风险同时有效地溶解了多肽包涵体。
在可溶性多肽的情况下,多肽可以分泌到周质间隙或培养基中。另外,可溶性多肽可以存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性多肽。所属领域的技术人员已知的标准技术可以用于从例如细胞溶解产物或培养基中浓缩可溶性多肽。另外,所属领域的技术人员已知的标准技术可以用于使宿主细胞破碎并从宿主细胞的细胞质或周质间隙中释放可溶性多肽。
当以融合蛋白形式产生多肽时,可以去除融合序列。可通过酶促裂解或化学裂解来去除融合序列。可以使用所属领域的技术人员已知的方法实现融合序列的酶促去除。所属领域的技术人员将易于了解,对用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定,并且反应条件将通过酶的选择指定。化学裂解可以使用所属领域的技术人员已知的试剂来实现,包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂。通过所属领域的技术人员已知的方法来从所裂解的融合序列中纯化所裂解的多肽。如所属领域的技术人员将易于了解,所述方法将由融合序列和多肽的身份和特性决定。纯化方法可以包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也可纯化多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。可以通过如沉淀或离子交换色谱法的此项技术中已知的任何适当方法来去除DNA,但也可以通过用核酸沉淀剂(如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可以使用包括(但不限于)离心或过滤的众所周知的标准方法使多肽与沉淀DNA分离。在欲使用多肽治疗人类的情况中,宿主核酸分子的去除是一个重要因素,并且本发明方法将宿主细胞DNA降低到医药学上可接受的水平。
小规模或大规模发酵方法也可用于蛋白质表达中,这些方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可通过分批、分批进料或连续模式过程进行。
本发明的人类多肽一般可以使用此项技术中的标准方法来回收。举例来说,可以对培养基或细胞溶解产物进行离心或过滤,以去除细胞碎片。可以浓缩上清液或将其稀释到所希望的体积或透滤到合适的缓冲液中,为进一步纯化做准备。本发明多肽的进一步纯化包括使所述多肽变异体的脱去酰胺基和剪切形式与完整形式分离。
可以采用以下示例性程序中的任一者来纯化本发明的多肽:亲和色谱;阴离子或阳离子交换色谱(使用包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE);二氧化硅色谱;高效液相色谱法(HPLC);逆相HPLC;凝胶过滤(使用包括(但不限于)塞法戴克斯(SEPHADEX)G-75);疏水相互作用色谱;尺寸排阻色谱;金属螯合色谱;超滤/透滤;乙醇沉淀;硫酸铵沉淀;色谱焦聚;置换色谱;电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦);差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀);SDS-PAGE或萃取。
根据所属领域的技术人员已知和使用的标准程序,本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、对包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、用于包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)可以被纯化成部分或实质上均质。因此,可以通过所属领域的技术人员已知的多种方法中的任一者来回收和纯化本发明的多肽:包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。必要时,在制备正确折叠的成熟蛋白质时,可使用蛋白质再折叠步骤。可将高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适合的方法用于需要高纯度的最终纯化步骤中。在一个实施例中,将制备的针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽)的抗体用作纯化试剂(包括(但不限于))以基于亲和力来纯化包含一或多个非天然氨基酸的蛋白质或肽。必要时,在部分纯化或达到均质后,任选将多肽用于多种应用,包括(但不限于)作为分析组分、治疗剂、防治剂、诊断剂、研究试剂和/或作为产生抗体的免疫原。
除本文中指出的其它参考文献之外,多种纯化/蛋白质折叠方法是所属领域的技术人员已知,包括(但不限于)在以下各者中阐述的那些方法:R.斯科普斯(R.Scopes),蛋白质纯化(Protein Purification),施普林格出版社(Springer-Verlag),纽约州(1982);多伊彻(Deutscher),酶学方法第182卷:蛋白质纯化指导(Guide to Protein Purification),学术出版社公司(Academic Press,Inc.)纽约州(1990);桑德纳(Sandana),(1997)蛋白质的生物分离(Bioseparation of Proteins).学术出版社公司;博拉格(Bollag)等人(1996)蛋白质方法(Protein Methods),第2版威立-利斯出版社(Wiley-Liss),纽约州;沃克(Walker),(1996)蛋白质方案手册(The Protein Protocols Handbook)胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州;哈里斯(Harris)和安格尔(Angal),(1990)蛋白质纯化应用:实用方法(Protein Purification Applications:A Practical Approach)牛津IRL出版社(IRL Press at Oxford),英国牛津(Oxford,England);哈里斯和安格尔,蛋白质纯化应用:实用方法牛津IRL出版社,英国牛津;斯科普斯(Scopes),(1993)蛋白质纯化:原理和实践(Protein Purification:Principles and Practice)第3版施普林格出版社,纽约州;詹森(Janson)和赖登(Ryden),(1998)蛋白质纯化:原理,高分辨率方法和应用(Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications),第二版威立-VCH出版社(Wiley-VCH),纽约州;和沃克(1998),蛋白质方案CD-ROM(Protein Protocols on CD-ROM)胡马纳出版社,新泽西州;和其中引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的相关蛋白质或多肽的一个优点在于,蛋白质或多肽通常将折叠成其天然构象。然而,在本发明的某些实施例中,所属领域的技术人员将认识到,在合成、表达和/或纯化之后,蛋白质或肽可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明一个方面中,表达的蛋白质或多肽任选变性,随后复性。这可利用此项技术中已知的方法来实现,所述方法包括(但不限于)将伴侣蛋白(chaperonin)添加到相关蛋白质或多肽中;将蛋白质溶解于如盐酸胍的离液剂中;利用蛋白质二硫化物异构酶等。
一般来说,有时候需要使表达的多肽变性和还原,随后使所述多肽再折叠成优选的构象。举例来说,可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到相关翻译产物中。还原、变性和复性蛋白质的方法是所属领域的技术人员已知的(参见以上参考文献和德宾斯基(Debinski)等人(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268:14065-14070;克赖特曼(Kreitman)和帕斯坦(Pastan)(1993)生物结合物化学,4:581-585;和毕希纳(Buchner)等人,(1992)分析生物化学(Anal.Biochem.),205:263-270)。举例来说,德宾斯基等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。这些蛋白质可在含有(包括(但不限于))氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动,以便与一或多种多肽或其它表达产物接触,或者反之亦然。
在原核产生多肽的情况下,由此产生的多肽可能错误折叠并因此缺乏生物活性或生物活性降低。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般使用例如一或多种离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇(2-ME))来溶解(其中多肽也不可溶)、展开和还原多肽链,以使错误折叠的多肽再折叠。随后在中等浓度的离液剂下,添加氧化剂(例如氧、胱氨酸或胱胺),以便再形成二硫键。多肽可以使用此项技术中已知的标准方法再折叠,如描述于美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中的那些方法,其以引用的方式并入本文中。多肽也可以与其它蛋白质共折叠以形成异质二聚物或异质多聚物。
在再折叠之后,多肽可经进一步纯化。可以使用所属领域的技术人员已知的多种技术实现多肽的纯化,所述技术包括疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化还可包括干燥或沉淀纯化的蛋白质的步骤。
在纯化之后,可以将多肽交换到不同缓冲液中和/或通过此项技术中已知的多种方法中的任一者(包括(但不限于)透滤和透析)来浓缩。以单一经纯化蛋白质的形式提供的多肽可以经历聚集和沉淀。
经纯化多肽可以是至少90%纯(如由逆相高效液相色谱,RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PAGE所测量的)或至少95%纯、或至少98%纯、或至少99%或99%以上纯的。不论多肽纯度的准确数值如何,多肽纯到足以用作医药产品或用于进一步加工,如与连接基团、聚合物、水溶性聚合物、生物活性分子或其它分子结合。
在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等之外)的情况下,某些PDCM或PDCM的多肽组分可以用作治疗剂,或其可与另一种蛋白质或聚合物复合。
一般纯化方法可以对包含多肽的细胞溶解产物、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞周质间隙、宿主细胞细胞质或其它材料或对由任何分离步骤产生的任何多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种,包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱法(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复和任何适当次序。
用于进行本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上都有售。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统都可从例如应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA))、拜耳雷德实验公司(Bio-RadLaboratories,Inc.)(加利福尼亚州埃库莱斯(Hercules,CA))和安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences,Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))获得。包括(但不限于)交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可从这些公司获得。
可以使用专用设备(如泵)更快速地实现平衡,以及本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤,如洗涤和洗脱。市售的泵包括(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences),新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及馏分收集器(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。混合器也可用于形成pH值和线性浓度的梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。
可以使用任何市售监测器来监测色谱过程。这些监测器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监测器UV-1、S II、监测器UV-M II、监测器UV-900、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和传导率监测器(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。实际上,整个系统在市面上都有售,包括来自安玛西亚生物科技公司(新泽西州皮斯卡塔韦)的各种系统。
在本发明的一个实施例中,举例来说,可以通过首先使所得经纯化的多肽在尿素中变性,接着在合适的pH值下在含有还原剂(如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来使所述多肽还原和变性。在另一个实施例中,在尿素中在浓度介于约2M到约9M之间的范围内使多肽变性,接着在pH值范围为约5.0到约8.0的TRIS缓冲液中稀释。随后可培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中,在室温下,将再折叠混合物培育4小时到24小时。随后可以进一步分离或纯化经还原和变性的多肽混合物。
如本文中所陈述,可以在进行任何后续分离步骤之前调整第一多肽混合物的pH值。另外,第一多肽混合物或其任何后续混合物可以使用此项技术中已知的技术来加以浓缩。此外,可以使用所属领域的技术人员已知的技术将包含第一多肽混合物或其任何后续混合物的洗脱缓冲液交换成适合于后续分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱在一个实施例中,并且作为任选地另外步骤,可以对第一多肽混合物进行离子交换色谱。一般参见离子交换色谱:原理和方法(Ion ExchangeChromatography:Principles and Methods)(目录编号18-1114-21,安玛西亚生物科技公司(新泽西州皮斯卡塔韦))。市售离子交换柱包括和柱(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。这些柱利用强阴离子交换剂,如QFast Flow、QHigh Performance和QXL;强阳离子交换剂,如SPHigh Performance、SPFast Flow和SPXL;弱阴离子交换剂,如DEAEFast Flow;和弱阳离子交换剂,如CMFast Flow(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。可以在纯化过程的任何阶段对多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱,以分离实质上纯化的多肽。可使用任何适合的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的复合物。
阳离子交换基质可以是任何适当的阳离子交换剂,包括强和弱阳离子交换剂。
在将多肽吸附到阳离子交换剂基质上后,可以通过使基质与pH值足够高或离子强度足以从所述基质中置换多肽的缓冲液接触来洗脱实质上纯化的多肽。适用于实质上经纯化的多肽的高pH值洗脱的缓冲液可以包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱可遵循所属领域的技术人员已知的适合方案进行RP-HPLC以纯化蛋白质。参见例如皮尔逊等人,分析生物化学(1982)124:217-230(1982);里维耶(Rivier)等人,色谱杂志(J.Chrom.)(1983)268:112-119;国谷(Kunitani)等人,色谱杂志(1986)359:391-402。可以对多肽进行RP-HPLC以分离实质上纯化的多肽。关于这一点,可以使用含有具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18树脂)的烷基官能团的二氧化硅衍生的树脂。或者,可使用聚合性树脂。举例来说,可使用TosoHaas AmberchromeCG1000sd树脂,其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合性树脂。此外,可用如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。源(Source)RP柱为RP-HPLC柱的另一实例。
含有离子配对剂和有机调节剂(如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的适合洗脱缓冲液可以用于从RP-HPLC柱中洗脱多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和乙酸三乙基铵。可使用一或多种梯度或等度条件来进行洗脱,其中优选减少分离时间并降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。适用于本文中的洗脱缓冲液的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水相互作用色谱纯化技术可以对多肽进行疏水相互作用色谱(HIC)。一般参见疏水相互作用色谱手册:原理和方法(Hydrophobic Interaction ChromatographyHandbook:Principles and Methods)(目录号18-1020-90,安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences,Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ)),其以引用的方式并入本文中。适合的HIC基质可包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质,如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质,所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括但不限于,聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)和柱(安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦)。
简单地说,在装载之前,可使用所属领域的技术人员已知的标准缓冲液(如乙酸/氯化钠溶液,或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。可将硫酸铵用作缓冲液来装载HIC柱。在装载多肽之后,随后可以使用标准缓冲剂和条件洗涤柱以去除非所需材料但保持所述多肽在HIC柱上。可尤其用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液,或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗脱多肽。使用例如磷酸钾梯度的降低线性盐梯度也可以用于洗脱多肽分子。接着可例如通过过滤(如透滤或超滤)来浓缩洗脱液。透滤可以用于去除用于洗脱多肽的盐。
其它纯化技术可对第一多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如以下各者的又另一种分离步骤:凝胶过滤(凝胶过滤的原理和方法(Gel Filtration:Principlesand Methods)(目录编号18-1022-18,安玛西亚生物科技公司,新泽西州皮斯卡塔韦),其以引用的方式并入本文中)、羟磷灰石色谱(适合的基质包括(但不限于)高分辨率HA-Ultrogel(卡尔生物化学公司)、CHT陶瓷羟基磷灰石(拜耳雷德公司(BioRad))、生物凝胶(Bio-Gel)HTP羟基磷灰石(拜耳雷德公司))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等,以去除任何过量盐并且将缓冲液置换成适用于随后分离步骤或甚至最终药品调配的缓冲液。
多肽(包括实质上纯化的多肽)的产率可以在本文中所述的各步骤处使用所属领域的技术人员已知的技术来监测。所述技术也可以用于评估最后一个分离步骤后实质上纯化的多肽的产率。举例来说,可使用具有多种烷基链长度的数个反相高压液相色谱柱(如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC,以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一种来监测多肽的产率。
在本发明的特定实施例中,各纯化步骤之后的多肽产率可以是用于各纯化步骤的起始物质中多肽的至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.9%或至少约99.99%。
纯度可以使用标准技术(如SDS-PAGE)或通过使用蛋白质印迹和ELISA分析测量多肽来测定。举例来说,可产生针对由阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收而分离的蛋白质的多克隆抗体。这些抗体也可用于探查污染性宿主细胞蛋白质的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(维达科公司(Vydac))由硅胶粒子组成,所述硅胶粒子表面带有C4-烷基链。多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水性相互作用强度的差异。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢柱(填充有2.8到3.2升Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液,并将其装载到Vydac C4柱上。使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗涤和洗脱。收集各洗脱份,并立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集处于IPC极限内的多肽洗脱份。
DEAE Sepharose(法玛西亚公司(Pharmacia))材料由与Sepharose珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。多肽与DEAE基团的结合是由离子相互作用介导。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后,通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除微量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱,并且用离子强度增加的缓冲液洗脱多肽。用DEAE Sepharose fast flow填充柱。调整柱体积以确保多肽负载量在3-10毫克多肽/毫升凝胶范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤柱。装载HPLC洗脱液的汇集洗脱份,并用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱,接着用平衡缓冲液洗涤。随后,用洗脱缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸钾)从柱中洗脱多肽并根据主要洗脱概况将其收集成单一洗脱份。将DEAE Sepharose柱的洗脱液调整到指定传导率。将所得药物物质无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中,并在-70℃下储存。
可使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素是位于革兰氏阴性宿主细胞(例如大肠杆菌)的外侧膜上的脂多糖(LPS)。所属领域的技术人员已知用于降低内毒素含量的方法,并且所述方法包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术;反相色谱;亲和色谱;尺寸排阻色谱;阴离子交换色谱;疏水性相互作用色谱;这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从相关多肽中去除污染物,如共迁移蛋白质。用于测量内毒素含量的方法已为所属领域的技术人员所知,且这些方法包括(但不限于)鲎变形细胞溶解物(LimulusAmebocyte Lysate,LAL)分析。
可以使用多种方法和程序来评估包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽的产率和纯度,所述方法包括(但不限于)布拉德福德分析(Bradford assay)、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)以及所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。将PDCM与任何游离组分分离的技术可与所描述且所属领域的技术人员已知的技术类似。上述技术可由所属领域的技术人员修改以进行分离、纯化或将PDCM与其它分子分离或评估PDCM的产率和/或纯度。其它技术可用于分离、纯化或将PDCM与其它分子分离或评估PDCM的产率和/或纯度且为所属领域的技术人员已知。
VIII.替代系统中的表达
已使用数种策略在非重组宿主细胞、诱变的宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统还适用于制造本发明的多肽。具有反应性侧链的氨基酸(如Lys、Cys和Tyr)的衍生化会使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也是一种并入非天然氨基酸的直截了当的方法。随着近来肽片段的酶促接合和天然化学接合的发展,有可能制造出更大的蛋白质。参见例如P.E.道森(P.E.Dawson)和S.B.H.肯特(S.B.H.Kent),生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem),69:923(2000)。化学肽接合和天然化学接合描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO 02/098902和WO03/042235中,这些专利都是以引用的方式并入本文中。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制性tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的体外提取物中的一般体外生物合成方法,将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。参见例如V.W.科尼什(V.W.Cornish),D.孟德尔(D.Mendel)和P.G.舒尔茨(P.G.Schultz),应用化学国际英文版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.),1995,34:621(1995);C.J.诺伦(C.J.Noren),S.J.安东尼-卡希尔(S.J.Anthony-Cahill),M.C.格里菲斯(M.C.Griffith),P.G.舒尔茨,用于将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中的一般方法(A general method for site-specific incorporation ofunnatural amino acids into proteins),科学244:182-188(1989);和J.D.贝恩(J.D.Bain),C.G.格雷布(C.G.Glabe),T.A.迪克斯(T.A.Dix),A.R.张伯伦(A.R.Chamberlin),E.S.迪亚拉(E.S.Diala),将非天然氨基酸生物合成性位点特异性地并入多肽中(Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into apolypeptide),美国化学会志111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机制和信号转导的研究。
已开发出一种称作选择性压力并入(selective pressure incorporation)的体内方法,来研究野生型合成酶的杂乱性(promiscuity)。参见例如N.布迪萨(N.Budisa),C.明克斯(C.Minks),S.阿尔费尔德(S.Alefelder),W.威戈(W.Wenger),F.M.董(F.M.Dong),L.莫洛德尔(L.Moroder)和R.胡贝尔(R.Huber),美国实验生物学 联合会会志(FASEB J.),13:41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度天然氨基酸的基本培养基中,而目标基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时,天然氨基酸被耗尽,并且被非天然氨基酸类似物置换。诱导重组蛋白表达将使含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说,使用此策略,已经将邻、间和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中,并且在UV光谱中展现两个可易于鉴别的特征肩峰,参见例如C.明克斯,R.胡贝尔,L.莫洛德尔和N.布迪萨,分析 生物化学(Anal.Bio chem.).284:29(2000);已经使用三氟甲硫氨酸置换噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过19F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用,参见例如H.杜维尔(H.Duewel),E.多布(E.Daub),V.罗宾逊(V.Robinson)和J.F.霍尼克(J.F.Honek),生物化学,36:3404(1997);以及将三氟亮氨酸并入亮氨酸的位置处,使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。参见例如Y.唐(Y.Tang),G.吉兰达(G.Ghirlanda),W.A.佩特卡(W.A.Petka),T.中岛(T.Nakajima),W.F.德格拉多(W.F.DeGrado)和D.A.蒂雷尔(D.A.Tirrell),应用化学国际英文版,40:1494(2001)。此外,将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白质中以促进X射线结晶学中的相溶解。参见例如W.A.亨德里克森(W.A.Hendrickson),J.R.荷顿(J.R.Horton)和D.M.勒马斯特(D.M.Lemaster),欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.),9:1665(1990);J.O.博尔斯(J.O.Boles),K.雷文斯基(K.Lewinski),M.孔克尔(M.Kunkle),J.D.奥多姆(J.D.Odom),B.邓拉普(B.Dunlap),L.莱贝达(L.Lebioda)和M.畑田(M.Hatada),自然结构与分子生物学(Nat.Struct.Biol.).1:283(1994);N.布迪萨,B.斯特皮(B.Steipe),P.德芒热(P.Demange),C.埃克斯科恩(C.Eckerskorn),J.凯勒曼(J.Kellermann)和R.胡贝尔,欧洲生物化学杂志(Eur.J. Biochem.),230:788(1995);和N.布迪萨,W.卡恩布洛克(W.Karnbrock),S.施泰因巴赫(S.Steinbacher),A.胡姆(A.Humm),L.布雷德(L.Prade),T.纽斐因德(T.Neuefeind),L.莫洛德尔和R.胡贝尔,分子生物学杂志,270:616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物,由此允许借助化学方式对蛋白质进行其它修饰。参见例如J.C.范·赫斯特(J.C.van Hest)和D.A.蒂雷尔,欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.),428:68(1998);J.C.范·赫斯特,K.L.柯克(K.L.Kiick)和D.A.蒂雷尔,美国化学会志122:1282(2000);和K.L.柯克和D.A.蒂雷尔,四面体(Tetrahedron),56:9487(2000);美国专利第6,586,207号;美国专利公开案2002/0042097,其以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别,而这种合成酶一般需要高选择性来确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性,这已在少数情况下实现。举例来说,在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸,并引起对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参见M.伊巴(M.Ibba),P.卡斯特(P.Kast)和H.亨内克(H.Hennecke),生物化学,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯-苯丙氨酸或对溴-苯丙氨酸来替代苯丙氨酸。参见例如M.伊巴和H.亨内克,欧洲生化学会联合会快报,364:272(1995);和N.沙玛(N.Sharma),R.弗特(R.Furter),P.卡斯特和D.A.蒂雷尔,欧洲生化学会联 合会快报.467:37(2000)。类似地,已显示位于大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点附近的点突变Phe130Ser允许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参见F.浜野-高久(F.Hamano-Takaku),T.岩间(T.Iwama),S.齐藤-矢野(S.Saito-Yano),K.高久(K.Takaku),Y.门田(Y.Monden),M.北畠(M.Kitabatake),D.索伊尔(D.Soil)和S.西村(S.Nishimura),生物化学杂志(J.BIOL.CHEM),275:40324(2000)。
在体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制(proofreading mechanism)的合成酶。这些合成酶不能区分结构与同源天然氨基酸类似的氨基酸,并因此将其活化。此错误在单独位点上得到校正,使得来自tRNA的错配(mischarged)氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性,那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能,并被并入。近来已利用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实了这种方法。参见V.多林(V.Doring),H.D.莫兹(H.D.Mootz),L.A.南格尔(L.A.Nangle),T.L.亨德里克森(T.L.Hendrickson),V.德·克雷西-拉加德(V.de Crecy-Lagard),P.舒密尔(P.Schimmel)和P.马里埃尔(P.Marliere),科学,292:501(2001)。ValRS可使带有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化;随后经由编辑域水解这些非同源氨基酸。在大肠杆菌染色体的随机诱变之后,选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团经Abu中的-CH3置换),以致当这种突变大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时,突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示,在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24%的缬氨酸经Abu置换。
固相合成和半合成方法也已能够合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说,参见以下公开案和其中引用的参考文献,所述公开案和参考文献如下:克里克F.J.C.(Crick,F.J.C.),巴雷特L.(Barrett,L.),勃伦那S.(Brenner,S.),瓦茨-托宾R.(Watts-Tobin,R.)蛋白质遗传编码的一般特性(General nature of the genetic code forproteins).自然,192:1227-1232(1961);霍夫曼K.(Hofmann,K.),博恩H.(Bohn,H.)多肽研究.XXXVI.吡唑-咪唑置换对S-肽片段的S-蛋白质活化效力的作用(Studieson polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-proteinactivating potency of an S-peptide fragment),美国化学杂志(J.Am Chem),88(24):5914-5919(1966);凯泽E.T.(Kaiser,E.T.)包括酶的生物活性肽和蛋白质的合成方法(Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins includingenyzmes),化学研究述评(Acc Chem Res),47-54(1989);中冢T.(Nakatsuka,T.),佐佐木T.(Sasaki,T.),凯泽E.T.通过半合成酶枯草杆菌蛋白酶催化的肽区段偶合(Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin),美国化 学会志3808-3810(1987);施诺泽M.(Schnolzer,M.),肯特S B H(Kent,S B H.)通过接合无保护合成肽来构建蛋白质:主链经工程改造的HIV蛋白酶(Constructingproteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIVprotease),科学,256(5054):221-225(1992);柴肯I.M.(Chaiken,I.M.)半合成肽和蛋白质(Semisynthetic peptides and proteins),CRC生物化学评论(CRC Crit Rev Biochem.)11(3):255-301(1981);奥弗德R.E.(Offord,R.E.)通过化学手段的蛋白质改造?(Protein engineering by chemical means?)蛋白质工程(Protein Eng.),1(3):151-157(1987);和杰克逊D.Y.(Jackson,D.Y.),邦米尔J.(Bumier,J.),权C(Quan,C),斯坦利M.(Stanley,M.),汤姆J.(Tom,J.),威尔斯J.A.(Wells,J.A.)用于全合成具有非天然催化性残基的核糖核酸酶A的经设计肽连接酶(A DesignedPeptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues),科学,266(5183):243(1994)。
已使用化学修饰在体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸在内的多种非天然侧链引入蛋白质中。参见例如科里D.R.(Corey,D.R.),舒尔茨P.G.混合序列特异性单股脱氧核糖核酸酶的产生(Generation of a hybrid sequence-specific single-strandeddeoxyribonuclease),科学.238(4832):1401-1403(1987);凯泽E.T.,劳伦斯D.S.(Lawrence D.S.),罗基塔S.E.(Rokita,S.E.)酶特异性的化学修改(The chemicalmodification of enzymatic specificity),生物化学年鉴,54:565-595(1985);凯泽E.T.,劳伦斯D.S.酶活性位点的化学突变(Chemical mutation of enyzme active sites),科学,226(4674):505-511(1984);尼特K.E.(Neet,K.E.),南奇A(Nanci A),科什兰D.E.(Koshland,D.E).硫氢基-枯草杆菌蛋白酶的特性(Properties of thiol-subtilisin),生 物化学杂志(J.BIOL.CHEM),243(24):6392-6401(1968);波加L.(Polgar,L.)和M.L.本德(M.L.Bender.)含有以合成方式形成的活性位点的新酶.硫氢基-枯草杆菌蛋白酶(A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin).美国 化学会志,3153-3154(1966);和波拉克S.J.(Pollack,S.J.),中山G.(Nakayama,G.),舒尔茨P.G.亲核基团和光谱探针在抗体组合位点中的引入(Introduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites),科学.242(4881):1038-1040(1988)。
或者,也已经使用采用化学修饰氨酰基-tRNA的生物合成方法来将数种生物物理探针并入体外合成的蛋白质中。参见以下公开案和其中引用的参考文献:布伦纳J.(Brunner,J.)新光学标记和交联方法(New Photolabeling and crosslinking methods),生物化学年鉴,62:483-514(1993);和克里格U.C.(Krieg,U.C.),沃尔特P.(Walter,P.),约翰逊A.E.(Hohnson,A.E.)信号识别粒子的54,000道尔顿多肽的新生预催乳激素信号序列的光交联(Photocrosslinking of the signal sequence of nascentpreprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle),国家科 学院院刊,83(22):8604-8608(1986)。
先前已显示,在体外通过将以化学方式氨酰基化的抑制性tRNA添加到经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中,可将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法,可使用对于特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株,用密切结构同系物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸,例如,用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。参见例如诺伦C.J.(Noren,C.J.),安东尼-卡希尔,格里菲斯M.C.(Griffith,M.C.),舒尔茨P.G.用于将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中的一般方法,科 学,244:182-188(1989);M.W.诺瓦克(M.W.Nowak)等人,科学268:439-42(1995);贝恩J.D.(Bain,J.D.),格雷布C.G.(Glabe,C.G.),迪克斯T.A.(Dix,T.A.),张伯伦A.R.(Chamberlin,A.R.),迪亚拉E.S.(Diala,E.S.)将非天然氨基酸生物合成性位点特异性地并入多肽中,美国化学会志,111:8013-8014(1989);N.布迪萨等人,美国实验 生物学联合会会志13:41-51(1999);埃尔曼J.A.(Ellman,J.A.),孟德尔D.(Mendel,D.),安东尼-卡希尔S.(Anthony-Cahill,S.),诺伦C.J.,舒尔茨P.G,用于将非天然氨基酸位点特异性地引入蛋白质中的生物合成方法(Biosynthetic method for introducingunnatural amino acids site-specifically into proteins).酶学方法(Methods in Enz.),第202卷,301-336(1992);和孟德尔D.,科尼什V.W.和舒尔茨P.G.使用扩展遗传编码的定点诱变(Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code),生物物理学与 生物分子结构年鉴(Annu Rev Biophys.Biomol Struct.)24,435-62(1995)。
举例来说,制备识别终止密码子UAG的抑制子tRNA,并用非天然氨基酸以化学方式氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的相关位点处引入终止密码子TAG。参见例如塞耶斯J.R.,施密特W.(Schmidt,W.),埃克斯坦F.在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向诱变中的5'-3'核酸外切酶(5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis),核酸研究,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制性tRNA和突变基因组合于体外转录/翻译系统中时,响应于UAG密码子而并入非天然氨基酸,得到在指定位置含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验以及使用α-羟基酸的实验证实,在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。参见例如诺伦(Noren)等人,同前文献;小林(Kobayashi)等人,(2003)自然结构生物学(Nature Structural Biology)10(6):425-432;和埃尔曼J.A.,孟德尔D.,舒尔茨P.G.将新颖主链结构位点特异性地并入蛋白质中(Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins),科 学,255(5041):197-200(1992)。
可以通过任何方法或技术(包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化)利用所需氨基酸将tRNA氨酰基化。
氨酰基化可以通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)实现。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。切赫(Cech)和同事(切赫,1987,科学,236:1532-1539;麦考科克(McCorkle)等人,1987,生物化学概念(Concepts Biochem.)64:221-226)证实可以充当催化剂的天然存在RNA(核酶)的存在。然而,尽管仅显示这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物作用而实现裂解和剪接,但近来核糖酶人为进化的发展已将催化谱系扩充到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2')3'-末端的氨酰基RNA键的RNA分子(艾兰加克凯尔(Illangakekare)等人,1995科学267:643-647),以及可以将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA分子的RNA分子(洛斯(Lohse)等人,1996,自然381:442-444)。
美国专利申请公开案2003/0228593(其以引用的方式并入本文中)描述了构建核糖酶的方法和其在利用天然编码和非天然编码氨基酸将tRNA氨酰基化中的用途。可使tRNA氨酰基化的酶促分子(包括(但不限于)核糖酶)的底物固定形式(Substrate-immobilized forms)能够有效亲和纯化氨酰基化的产物。适合底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。用于氨酰基化的底物固定形式核糖酶的制备和用途描述于化学与生物学2003,10:1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中,其以引用的方式并入本文中。
化学氨酰化方法包括(但不限于)由赫克特(Hecht)和同事(赫克特S.M.(Hecht,S.M.)化学研究述评1992,25,545;赫克勒T.G.(Heckler,T.G.);罗塞尔J.R.(Roesser,J.R.);徐C(Xu,C);常P.(Chang,P.);赫克特S.M.生物化学1988,27,7254;赫克特S.M.;奥尔福德B.L.(Alford,B.L.);黑田Y.(Kuroda,Y.);北野S.(Kitano,S.)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1978,253,4517)和由舒尔茨(Schultz)、张伯伦(Chamberlin)、多尔蒂(Dougherty)等(科尼什V.W.;孟德尔D.;舒尔茨P.G.应用化学国际英文版1995,34,621;罗伯森S.A.(Robertson,S.A.);埃尔曼J.A.;舒尔茨P.G.美国化学会志1991,113,2722;诺伦C.J.;安东尼-卡希尔S.J.(Anthony-Cahill,S.J.);格里菲斯M.C;舒尔茨P.G.科学1989,244,182;贝恩J.D.;格雷布C.G.;迪克斯T.A.;张伯伦A.R.美国化学会志1989,111,8013;贝恩J.D.等人自然1992,356,537;加利文J.P.(Gallivan,J.P.);莱斯特H.A.(Lester,H.A.);多尔蒂D.A.(Dougherty,D.A.)化学与生物学(Chem.Biol.)1997,4,740;图卡迪(Turcatti)等人生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1996,271,19991;诺瓦克M.W.(Nowak,M.W.)等人科学,1995,268,439;萨克斯M.E.(Saks,M.E.)等人生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1996,271,23169;郝萨卡T.(Hohsaka,T.)等人美国化学会志1999,121,34)介绍的那些方法以避免在氨酰化中使用合成酶,所述文献以引用的方式并入本文中。所述方法或其它化学氨酰基化方法可用于使tRNA分子氨酰基化。
产生催化性RNA的方法可涉及产生随机核糖酶序列的单独集合;对所述集合进行定向演化;针对所需氨酰基化活性筛选所述集合;和选择展现所需氨酰基化活性的核糖酶序列。
核酶可以包含促进酰化活性的基序和/或区域,如GGU基序和富U区域。举例来说,已报导富U区域可促进氨基酸底物的识别,而GGU基序可与tRNA的3'端形成碱基对。GGU基序与富U区域的组合将促进同时识别氨基酸与tRNA,并因此促进tRNA 3'端的氨酰基化。
可通过使用与tRNAAsn CCCG结合的部分随机化r24mini进行体外选择,随后系统地工程改造活性克隆体中所见的共有序列,来产生核糖酶。利用此方法获得的示例性核糖酶称为“Fx3核糖酶”,并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号(其内容以引用的方式并入本文中)中,所述核糖酶充当合成载有同源非天然氨基酸的各种氨酰基-tRNA的通用催化剂。
在底物上固定可以用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和纯化。I适合底物的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上,如RNA核糖上的3'-顺-二醇可经高碘酸盐氧化得到相应的二醛,从而促使将RNA固定于树脂上。可使用各种类型的树脂,包括廉价的酰肼树脂,其中还原胺化使得树脂与核糖酶之间相互作用形成不可逆键联。借助于此种柱上氨酰基化技术(on-column aminoacylation technique)可显著促进氨酰基-tRNA的合成。库洛克里斯(Kourouklis)等人方法(Methods)2005;36:239-4描述基于柱的氨酰化系统。
氨酰基化tRNA的分离可以用多种方式实现。一种适合的方法是利用缓冲液(如具有10mM EDTA的乙酸钠溶液;含有50mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH 7.0)、10mM EDTA的缓冲液;或者简单的EDTA缓冲的水(pH7.0))从柱中洗脱出氨酰基化tRNA。
可以将氨酰基化tRNA添加到翻译反应中,以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶解产物。细胞溶解产物提供由输入mRNA体外翻译多肽必需的反应组件。所述反应组件的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延伸因子以及其它与翻译有关的因子。此外,翻译系统也可为批量翻译(batch translation)或区室化翻译(compartmentalized translation)。批量翻译系统组合了单一区室中的反应组件,而区室化翻译系统使翻译反应组件与可能会抑制翻译效率的反应产物分开。这些翻译系统在市面上都有销售。
此外,可以使用偶联的转录/翻译系统。偶联的转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA,而所述mRNA接着又由反应组件翻译。市售的偶联转录/翻译的一个实例为Rapid Translation System(RTS,罗氏公司(Roche Inc.))。这一系统包括含有大肠杆菌溶解产物的混合物,用于提供如核糖体和翻译因子的翻译组件。此外,还包括RNA聚合酶,用于将输入DNA转录成mRNA模板,供翻译使用。RTS可借助于插入反应区室(包括供料/废料区室和转录/翻译区室)之间的膜来将反应组件区室化。
可利用包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白等的其它试剂来将tRNA氨酰基化。
斯蒂芬(Stephan)在科学家(Scientist),2005年10月10日;第30-33页中描述将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的其它方法。卢等人在分子细胞(Mol Cell).2001年10月;8(4):759-69中描述一种其中蛋白质以化学方式与含有非天然氨基酸的合成肽接合的方法(经表达蛋白质接合)。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见例如M.W.诺瓦克,P.C.科尔尼(P.C.Kearney),J.R.桑普森(J.R.Sampson),M.E.萨克斯(M.E.Saks),C.G.拉瓦尔卡(C.G.Labarca),S.K.西尔弗曼(S.K.Silverman),W.G.钟(W.G.Zhong),J.索尔森(J.Thorson),J.N.阿贝尔森(J.N.Abelson),N.戴维森(N.Davidson),P.G.舒尔茨,D.A.多尔蒂(D.A.Dougherty)和H.A.莱斯特(H.A.Lester),科学.268:439(1995);和D.A.多尔蒂,化学生物学新见(Curr.Opin.Chem. Biol.),4:645(2000)。将非洲爪蟾属(Xenopus)卵母细胞与体外制得的两种RNA物质共注射:编码在相关氨基酸位置处具有UAG终止密码子的目标蛋白的mRNA和用所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制子tRNA。随后,卵母细胞的翻译机器在UAG指定的位置插入非天然氨基酸。这种方法允许进行一般不适用于体外表达系统的整合膜蛋白的体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量传递法测量距离,参见例如G.图卡迪(G.Turcatti),K.奈米斯(K.Nemeth),M D.埃杰顿(M D.Edgerton),U.梅塞思(U.Meseth),F.塔拉波(F.Talabot),M.佩施(M.Peitsch),J.诺尔斯(J.Knowles),H.沃格尔(H.Vogel)和A.肖莱(A.Chollet),生物化学杂志(J.BIOL.CHEM),271:19991(1996);并入生物素化氨基酸以识别离子通道中的表面暴露残基,参见例如J.P.加利文(J.P.Gallivan),H.A.莱斯特(H.A,Lester)和D.A多尔蒂,化学与生物学,4:739(1997);使用笼状酪氨酸类似物来实时监测离子通道中的构象变化,参见例如J.C.米勒(J.C.Miller),S.K.西尔弗曼,P.M.英格兰(P.M.England),D.A多尔蒂和H.A.莱斯特,神经元(Neuron),20:619(1998);和使用α羟基氨基酸来改变离子通道主链以探查其选通机制。参见例如P.M.英格兰,Y.张(Y.Zhang),D.A多尔蒂和H.A.莱斯特,细胞,96:89(1999);和T.卢(T.Lu),A.Y.廷(A.Y.Ting),J.梅因兰(J.Mainland),L.Y.简(L.Y.Jan),P.G.舒尔茨和J.杨(J.Yang),自然神经科学(Nat.Neurosci.),4:239(2001)。
在体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力具有多种益处,包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白用于治疗性治疗和诊断应用的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展合理且系统地操纵蛋白质结构的能力,从而探查蛋白质功能,并产生具有新颖特性的新蛋白质或生物体。
在位点特异性地并入对F-Phe的一次尝试中,在p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中使用酵母琥珀抑制子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对。参见例如R.弗特,蛋白质科学(Protein Sci.),7:419(1998)。
也有可能使用无细胞(体外)翻译系统获得本发明的多核苷酸的表达。翻译系统可为细胞翻译系统或无细胞翻译系统,并且可以是原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)全细胞制剂,如其中可以将所需核酸序列转录成mRNA并且翻译所述mRNA的渗透细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统在市面上有售,并且众所周知许多不同类型和系统。无细胞系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶解产物,如大肠杆菌溶解产物;和真核细胞溶解产物,如麦胚提取物、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人细胞溶解产物。当将所得蛋白质糖基化、磷酸化,或以其它方式进行修饰时,由于许多此类修饰只可能在真核系统中发生,故真核提取物或溶解产物可为优选的。这些提取物和溶解产物中有一些在市面上有售(普洛麦格公司(Promega),威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.);赛特杰公司,加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla,Calif.);安玛西亚公司(Amersham),伊利诺伊州阿灵顿海茨(Arlington Heights,Ill.);GIBCO/BRL公司,纽约州格兰德岛(GrandIsland,N.Y.))。也有膜提取物(如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)可用,其适用于翻译分泌蛋白质。在这些可包括mRNA作为模板(体外翻译)或DNA作为模板(组合的体外转录与翻译)的系统中,体外合成是由核糖体所引导。曾进行过相当多的尝试来开发无细胞蛋白质表达系统。参见例如金姆D.M.(Kim,D.M.)和J.R.斯沃茨(J.R.Swartz),生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering),74:309-316(2001);金姆D.M.和J.R.斯沃茨,生物技术快报(Biotechnology Letters),22,1537-1542,(2000);金姆D.M.和J.R.斯沃茨,生物技术进展(Biotechnology Progress),16,385-390,(2000);金姆D.M.和J.R.斯沃茨,生物技术与生物工程,66,180-188,(1999);和帕特奈克R.(Patnaik,R.)和J.R.斯沃茨,生物技术(Biotechniques)24,862-868,(1998);美国专利第6,337,191号;美国专利公开案第2002/0081660号;WO00/55353;WO 90/05785,其以引用的方式并入本文中。另一种可以应用于表达包含非天然编码氨基酸的多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。参见例如R.罗伯茨(R.Roberts)和J.绍斯塔克(J.Szostak),美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.(USA))94:12297-12302(1997);A.弗兰克尔(A.Frankel)等人,化学与生物学(Chemistry&Biology)10:1043-1050(2003)。在此方法中,在核糖体上将连接嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板翻译成肽。如果已对一或多个tRNA分子进行修饰,那么也可将非天然氨基酸并入所述肽中。在读取了最后一个mRNA密码子后,嘌呤霉素捕获肽的C端。如果发现所得mRNA-肽结合物在体外分析中具有引人关注的特性,那么可以容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式,可筛选出包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽文库,以鉴别具有所需特性的多肽。最近,已报导利用纯化组分进行的体外核糖体翻译,其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。参见例如A.福斯特(A.Forster)等人,美国国家科学院院刊100:6353(2003)。
还可以使用重构的翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶解产物或补充有经纯化翻译因子(如,起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延长因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶解产物的组合将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可为偶联的转录/翻译系统,其中如现代分子生物学技术(Current Protocols inMolecular Biology)(F.M.奥斯贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑,威立出版公司(WileyInterscience),1993)(其以引用的方式清楚地并入本文中)中所述,将DNA引入所述系统中,转录成mRNA并翻译mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或者5'端戴帽(7-甲基鸟苷)且3'端加多聚腺苷酸尾的成熟mRNA形式,这在某些翻译系统中可为有利条件。举例来说,在网织红细胞溶解产物系统中,以高效率翻译戴帽的mRNA。
IX.与多肽偶联的连接基团和其它分子
可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略对本文中所述的非天然氨基酸多肽进行各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入多肽的非天然氨基酸组分上,所述官能团包括(但不限于)标记;染料;聚合物;水溶性聚合物;聚乙二醇的衍生物;光交联剂;放射性核素;细胞毒性化合物;药物;亲和标记;光亲和标记;反应性化合物;树脂;第二蛋白质或多肽或多肽类似物;抗体或抗体片段;金属螯合剂;辅因子;脂肪酸;碳水化合物;多核苷酸;DNA;RNA;反义多核苷酸;糖类;水溶性树枝状聚合物;环糊精;抑制性核糖核酸;生物材料;纳米粒子;自旋标记;荧光团;含金属的部分;放射性部分;新颖官能团;与其它分子共价或非共价相互作用的基团;光笼化部分;光化辐射可激发的部分;光异构化部分;生物素;生物素衍生物;生物素类似物;并入有重原子的部分;可化学裂解的基团;可光裂解的基团;延长的侧链;碳连接的糖;氧化还原活性剂;氨基硫代酸;毒性部分;经同位素标记的部分;生物物理探针;磷光基团;化学发光基团;电子致密基团;磁性基团;插入基团;发色团;能量转移剂;生物活性剂;可检测标记;小分子;量子点;纳米传递素;放射性核苷酸;放射性传递素;中子俘获剂;或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述的组合物、方法、技术和策略的一个说明性非限制性实例,以下描述将集中于将连接基团、聚合物和其它分子添加到非天然氨基酸多肽上,同时理解对其所述的组合物、方法、技术和策略(必要时进行适当修改并且所属领域的技术人员可以用本文所揭示内容进行所述修改)还可适用于添加其它官能团,包括(但不限于)上文所列的那些官能团。
多种连接基团、聚合物和其它分子可以与本发明的多肽连接,以调节所述多肽的生物学特性和/或为所述多肽和/或PDCM提供新生物学特性。这些连接基团、聚合物和其它分子可以经由天然编码氨基酸、经由非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与多肽连接。聚合物的分子量可在广泛范围内,包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或更高。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。
本发明提供实质上均质的连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物制剂。如本文所用的“实质上均质”意味着观测到连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物分子大于总蛋白质的一半。连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物具有生物活性,并且本文中提供的本发明“实质上均质”修饰的多肽制剂是均质到足以显示均质制剂优势(例如在临床应用中易于预测批次之间的药物动力学)的那些制剂。
也可选择制备连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物分子的混合物,并且本文中提供的优势在于可选择包括在所述混合物中的单-连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物的比例。因此,必要时,可制备各种蛋白质与各种数量的所连接的连接基团、聚合物或分子部分(即,二聚物、三聚物、四聚物等)的混合物,并将所述结合物与使用本发明方法制备的单-连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物组合,并且得到具有预定的连接基团、聚合物或分子:蛋白质结合物比例的混合物。
所选连接基团、聚合物或其它分子可以是水溶性聚合物,以致其连接的蛋白质不会在水性环境(如生理环境)中沉淀。连接基团、聚合物或其它分子可为分支或未分支的。对治疗性使用最终产品制剂来说,连接基团、聚合物或其它分子应是医药学上可接受的。
聚合物的实例包括(但不限于)聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如,聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚氧乙二醇/丙二醇以及其经甲氧基或乙氧基封端的类似物,尤其聚氧乙二醇,后者也被称作聚乙二醇(polyethyleneglycol)或PEG);聚乙烯吡咯烷酮;聚乙烯基烷基醚;聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉;聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如,聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物);聚羟基烷基丙烯酸酯;聚唾液酸和其类似物;亲水性肽序列;聚糖和其衍生物,其包括葡聚糖和葡聚糖衍生物,例如,羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖;纤维素和其衍生物,例如,羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素;几丁质和其衍生物,例如,壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖;透明质酸和其衍生物;淀粉;海藻酸盐;硫酸软骨素;白蛋白;支链淀粉和羧甲基支链淀粉;聚氨基酸和其衍生物,例如,聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺;马来酸酐共聚物,如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙醚马来酸酐共聚物;聚乙烯醇;其共聚物;其三聚物;其混合物;以及上述物质的衍生物。
连接基团、聚合物或其它分子与蛋白质分子的比例将改变,其在反应混合物中的浓度也将改变。一般来说,最佳比率(就反应效率来说,因为存在极少量过量的未反应的蛋白质或连接基团或聚合物或其它分子)可通过所选连接基团、聚合物或其它分子的分子量和可用反应性基团的可用数量来确定。对于分子量,通常分子的分子量越高,则可与蛋白质连接的分子的数量就越少。类似地,在优化这些参数时应考虑连接基团、聚合物或其它分子的分支。一般来说,分子量越高(或分支越多),则连接基团、聚合物、分子:蛋白质的比率就越高。
如本文所用并在考虑PDCM或PDCM的组分(包括(但不限于)多肽或非多肽组分)时,术语“治疗有效量”是指向患者提供所需益处的量。所述量将随个体差异而不同,并且视多种因素而定,包括患者的总体身体状况和欲治疗的病况的潜在病因。用于疗法的PDCM的量在有利的含量下提供可接受的变化率并维持所需响应。所属领域的技术人员使用公开可用的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
连接基团、聚合物或其它分子可为任何结构形式,包括(但不限于)直链、叉状或分支形式。通常,水溶性聚合物为聚(烷二醇),如聚(乙二醇)(PEG),但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说,使用PEG描述本发明的某些实施例。
PEG是一种众所周知的水溶性聚合物,其为市售产品,或者可根据所属领域的技术人员所知的方法,通过使乙二醇开环聚合来制备(萨德勒(Sandler)和卡罗(Karo),聚合物合成(Polymer Synthesis),学术出版社(Academic Press),纽约(New York),第3卷,第138-161页)。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而不用考虑PEG的尺寸或其末端的修饰,并且可由下式表示为与多肽连接:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n为2到10,000并且X为H或末端修饰,包括(但不限于)C1-4烷基、保护基或末端官能团。
在一些情况下,本发明中使用的PEG的一个末端以羟基或甲氧基封端,即,X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者,PEG可以用反应性基团封端,从而形成双官能聚合物。典型的反应性基团可包括常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的那些反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活性碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活性酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意,上式中以Y表示的PEG的另一末端将直接或者经由天然存在或非天然编码氨基酸间接连接到多肽。举例来说,Y可为与多肽胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N端)形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲键。或者,Y可为与硫醇基(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基)形成的马来酰亚胺键。或者,Y可为与经由20种常见氨基酸通常不可得的残基形成的键。举例来说,PEG上的叠氮基可以与多肽上的炔基反应以形成胡伊斯根[3+2]环加成产物。或者,PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应形成类似产物。在一些实施例中,强亲核基团(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮基反应形成腙、肟或缩氨基脲,适当时,在一些情况下可通过用适当的还原剂处理,再将其还原。或者,强亲核基团可以经由非天然编码氨基酸而并入多肽中,并且用于优先与存在于水溶性聚合物中的酮或醛基反应。
连接基团、聚合物或其它分子的任何分子质量可视实际需要使用,包括(但不限于)约100道尔顿(Da)到100,000Da,或必要时更高(包括(但不限于)有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可在广泛范围内,包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或为更高。PEG可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中,PEG介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约10,000Da与40,000Da之间。还可使用支链PEG,包括(但不限于)各链的MW在1-100kDa(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)范围内的PEG分子。支链PEG各链的分子量可(包括(但不限于))介于约1,000Da与约100,000Da之间或为更高。支链PEG的各链的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与20,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括(但不限于))肖尔沃特聚合物公司(Shearwater Polymers,Inc.)目录、奈克塔治疗品公司(NektarTherapeutics)目录中,二者都以引用方式并入本文中。
一般来说,连接基团、聚合物或其它分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说,可使用带有供与氨基酸侧链反应的炔和叠氮部分的PEG衍生物将PEG与本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基,那么PEG通常会含有炔部分以形成[3+2]环加成产物,或者会含有含膦基的活性PEG物质(即,酯、碳酸酯)以形成酰胺键。或者,如果非天然编码氨基酸包含炔,那么PEG通常会含有叠氮部分以形成[3+2]胡伊斯根环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基,那么PEG通常会包含有效的亲核基团(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团),以便分别形成相应腙、肟和缩氨基脲键。在其它替代方案中,可将上述反应性基团的方向反过来,即,非天然编码氨基酸中的叠氮部分可与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中,本发明提供含叠氮基和含乙炔的连接基团、聚合物或其它分子衍生物,其包含平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而,应了解,多种水溶性聚合物,包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇)),也适用于实践本发明,且术语PEG和聚(乙二醇)的使用意涵盖并包括所有这些分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇),包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、分支PEG、侧接PEG(即,有一或多个官能团侧接到聚合物主链的PEG或相关聚合物),或其中具有可降解键的PEG。
PEG通常透明,无色,无臭,可溶于水,对热稳定,对许多化学剂呈惰性,不水解或变质,并且一般无毒。聚(乙二醇)被认为是生物相容的,也就是说,PEG能够与活组织或生物体共存而不引起危害。更具体地说,PEG实质上为非免疫原性的,也就是说,PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与在体内具有某种所需功能的分子(如生物活性剂)连接时,PEG倾向于遮蔽这种试剂,并且可减少或消除任何免疫反应,从而使生物体能够容忍所述试剂的存在。PEG结合物不倾向于产生实质免疫反应,或者引起凝血(clotting)或其它不合需要的作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(其中n为约3到约4000,通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明一些实施例中,分子量为约800Da到约100,000Da的PEG尤其适用作聚合物主链。PEG的分子量可在广泛范围内,包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da之间或为更高。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200D以及100Da。在一些实施例中,PEG的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。
聚合物主链可为直链或分支的。分支聚合物主链一般来说是此项技术中已知的。通常,分支聚合物具有中央分支核心部分和与中央分支核心连接的多个线性聚合物链。常用的PEG为分支形式,可通过将环氧乙烷与各种多元醇(如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成来制备。中央分支部分也可从数种氨基酸(如赖氨酸)衍生得到。分支聚(乙二醇)可以通式R(-PEG-OH)m表示,其中R衍生自核心部分,如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇,且m表示臂的数量。多臂PEG分子(如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号;美国专利申请案2003/0143596、WO 96/21469和WO 93/21259中所述的分子,各专利以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。
分支PEG也可呈由PEG(--YCHZ2)n(其中Y为连接基团且Z为经由规定长度的原子链连接于CH的经活化末端基)表示的叉状PEG形式。
又另一种分支形式(侧接PEG)具有沿PEG主链而不是在PEG链末端的反应性基团,如羧基。
除这些形式的PEG外,聚合物还可制备成在主链中具有弱键或可降解键。举例来说,PEG可制备成在聚合物主链中具有可水解的酯键。如下文所示,此水解导致聚合物裂解成分子量较低的片段:
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域的技术人员应理解,术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括此项技术中已知的所有形式,包括(但不限于)本文中揭示的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中,具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。适合聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(亚烷基二醇),如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其四聚物、其混合物等。尽管聚合物主链各链的分子量可变化,但通常在约800Da到约100,000Da、常常约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物主链的各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。
所属领域的技术人员将认识到,实质上水溶性主链的上述清单并不详尽而仅为说明性的,并且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。
在本发明一些实施例中,聚合物衍生物为“多官能的”,意思是聚合物主链有至少两个末端且可能多达约300个末端经官能团官能化或活化。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物,各末端与相同或不同官能团键接。
在一个实施例中,聚合物衍生物具有以下结构:
X—A—POLY—B—N=N=N
其中:
N=N=N为叠氮部分;
B为连接部分,其可能存在或不存在;
POLY为水溶性非抗原性聚合物;
A为连接部分,其可能存在或不存在,并且可与B相同或不同;且
X为第二官能团。
连接部分A和B的实例包括(但不限于)含有至多18个且可含有介于1到10个之间的碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括杂原子,如氮、氧或硫。烷基链还可在杂原子处分支。连接部分A和B的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可含有5到6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一或多个碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号、第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团,所述专利各以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员将认识到,连接部分的上述清单并不详尽而仅为说明性的,并且预期具有上述品质的所有连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如所属领域的技术人员所了解,所选X部分应能与叠氮基相容,因此不会与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能性(homobifunctional)的,意思指第二官能团(即,X)也为叠氮部分;或异双官能性的(heterobifunctional),意思指第二官能团为不同官能团。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说,如果化学反应性基团为胺或酰肼,那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇,那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(如丁酸或丙酸)或羟基,那么保护基可为苯甲基或烷基(如甲基、乙基或叔丁基)。此项技术中已知的其它保护基也可用于本发明中。
文献中末端官能团的特定实例包括(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(参见例如美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(参见例如巴克曼(Buckmann)等人大分子化学(Makromol.Chem.)182:1379(1981),塞里普斯基(Zalipsky)等人欧洲聚合物杂志(Eur.Polym.J.)19:1177(1983))酰肼(参见例如安德烈斯(Andresz)等人大分子化学179:301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(参见例如奥尔森(Olson)等人在聚(乙二醇)化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry&Biological Applications),第170-181页,哈里斯(Harris)和塞里普斯基编,ACS,华盛顿哥伦比亚特区.(Washington,D.C.),1997中;还参见美国专利第5,672,662号)琥珀酰亚胺基丁二酸酯(参见例如阿布丘夫斯基(Abuchowski)等人癌生物化学和生物物理(Cancer Biochem.Biophys.)7:175(1984)和约皮希(Joppich)等人大分子化学180:1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(参见例如美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑酯(参见例如美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(参见例如皮塔(Pitha)等人欧洲生物化学杂志(Eur.J Biochem),94:11(1979),埃林(Elling)等人,生物技术与应用生物化学(Biotech.Appl.Biochem.)13:354(1991))、氧基羰基咪唑(参见例如比彻姆(Beauchamp)等人,分析生物化学,131:25(1983),通代利(Tondelli)等人控制释放杂志(J.Controlled Release)1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(参见例如韦罗内塞(Veronese)等人,应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotech.),11:141(1985);和萨托尼(Sartore)等人,应用生物化学与生物技术,27:45(1991))、醛(参见例如哈里斯等人聚合物科学杂志(J.Polym.Sci.Chem.Ed.)22:341(1984),美国专利第5,824,784号,美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(参见例如古德森(Goodson)等人生物技术(NY)8:343(1990),罗马尼(Romani)等人在肽和蛋白质化学(Chemistry of Peptides andProteins)2:29(1984)中,和科根(Kogan),合成通讯(Synthetic Comm.)22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(参见例如沃依伦(Woghiren)等人,生物结合物化学(Bioconj.Chem.)4:314(1993))、丙烯酰醇(参见例如索尼(Sawhney)等人,大分子(Macromolecules),26:581(1993))、乙烯基砜(参见例如美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
在本发明的某些实施例中,本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链:
X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N
其中:
X为如上文所述的官能团;且
n为约20到约4000。
在另一个实施例中,本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链:
X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N
其中:
W为包含1到10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分;
n为约20到约4000;且
X为如上文所述的官能团;m介于1与10之间。
可通过此项技术中已知和/或本文中揭示的多种方法制备本发明的含叠氮基PEG衍生物。在下文所示的一种方法中,平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链的第一末端与第一官能团键接且第二末端与适当离去基团键接)与叠氮阴离子(其可与多种适合的平衡离子中的任一种配对,包括钠、钾、叔丁基铵等)反应。离去基团经历亲核置换且经叠氮部分置换,从而提供所需含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如所示,适用于本发明中的聚合物主链具有式X-PEG-L,其中PEG为聚(乙二醇),X为不与叠氮基反应的官能团,且L为适当的离去基团。适合的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶,以及酮。适合离去基团的实例包括(但不限于)氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基。
在制备本发明含叠氮基聚合物衍生物的另一方法中,使带有叠氮基官能团的连接剂与平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链接触,其中所述连接剂带有会与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应形成含叠氮基聚合物衍生物产物的化学官能团,其中所述叠氮基经连接基团与聚合物主链分开。
示例性反应方案显示如下:
X-PEG-M+N-连接基团-N=N=N→PG-X-PEG-连接基团-N=N=N
其中:
PEG为聚(乙二醇),且X为封端基团,如烷氧基或如上文所述的官能团;且
M为不与叠氮官能团反应但与N官能团有效选择性反应的官能团。
适合官能团的实例包括(但不限于):如果N为胺,那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯;如果N为酰肼或氨氧基部分,那么M为酮;如果N为亲核基团,那么M为离去基团。
可利用已知方法纯化粗产物,所述方法包括(但不限于)沉淀产物,随后视需要进行色谱分离。
更具体实例展示于下文中,在PEG二胺的情况下,其中一个胺经如叔丁基-Boc的保护基部分保护,且所得单保护PEG二胺与具有叠氮基官能团的连接部分反应:
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N=N=N
在此情况下,可使用多种活化剂,如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑,将胺基与羧酸基偶联,从而在单胺PEG衍生物与带有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键后,可直接使用所得含N-叔丁基-Boc保护的叠氮基的衍生物修饰生物活性分子,或者可进一步精细设计以安装其它有用官能团。举例来说,可通过用强酸处理来水解N-t-Boc基团,产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作合成手柄(handle)来安装其它有用官能团,如马来酰亚胺基、活性二硫化物、活性酯等,以便产生有价值的异双官能试剂。
异双官能衍生物在需要将不同分子连接到聚合物的各末端上时尤其适用。举例来说,ω-N-氨基-N-叠氮基PEG允许将具有活性亲电基团的分子(如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)与PEG的一个末端连接,并将具有乙炔基的分子与PEG的另一末端连接。
在本发明的另一个实施例中,聚合物衍生物具有以下结构:
X—A—POLY—B—C≡C-R
其中:
R可为H或烷基、烯烃、烷氧基,或者芳基或经取代芳基;
B为连接部分,其可能存在或不存在;
POLY为水溶性非抗原性聚合物;
A为连接部分,其可能存在或不存在,并且可与B相同或不同;且
X为第二官能团。
连接部分A和B的实例包括(但不限于)含有至多18个且可含有介于1到10个之间的碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括杂原子,如氮、氧或硫。烷基链还可在杂原子处分支。连接部分A和B的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可含有5到6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一或多个碳原子、氮、氧或硫原子取代。适合的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团,所述专利各以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员将认识到,连接部分的上述清单并不详尽而仅为说明性的,并且预期具有上述品质的多种连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括:羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟甲磺酸酯、烯烃、酮和乙炔。如应了解的,所选X部分应能与乙炔基相容,以致不会与乙炔基发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能性的,意指第二官能团(即,X)也为乙炔部分;或异双官能性的,意指第二官能团为不同官能团。
在本发明的另一个实施例中,聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链:
X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
其中:
X为如上文所述的官能团;
n为约20到约4000;并且
m介于1与10之间。
各异双官能PEG聚合物的具体实例显示于下文中。
可使用所属领域的技术人员已知和/或本文中揭示的方法制备本发明的含乙炔PEG衍生物。在一种方法中,平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链的第一末端与第一官能团键联且第二末端与适当亲核基团键联)与带有乙炔官能团和适合于与PEG上的亲核基团反应的离去基团两者的化合物反应。当将带有亲核部分的PEG聚合物与带有离去基团的分子组合时,所述离去基团经历亲核置换且经亲核部分置换,从而得到所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR'
如所示,用于所述反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu,其中PEG为聚(乙二醇),Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)将主要经由SN2类机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要经由亲核加成反应来反应的那些官能团。L基团的实例包括氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲苯磺酸酯基,和预期会经历亲核置换的其它基团,以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯基,和预期会经历亲核试剂加成的其它亲电基团。
在本发明的另一个实施例中,A为具有介于1到10个之间碳原子的脂肪族连接基团或具有介于6到14个之间碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团,并且L为适当的离去基团。
在制备本发明含乙炔聚合物衍生物的另一方法中,使平均分子量为约800Da到约100,000Da且在一个末端带有经保护官能团或封端剂以及在另一末端带有适当离去基团的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
示例性反应方案显示如下:
X-PEG-L+-C≡CR'→X-PEG-C≡CR'
其中:
PEG为聚(乙二醇),且X为封端基团,如烷氧基或如上文所述的官能团;且
R'为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或者经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述实例中,离去基团L应具有足够的反应性以在与足够浓度的乙炔阴离子接触时发生SN2型置换。所属领域的技术人员已知实现乙炔阴离子对离去基团的SN2置换所需的反应条件。
通常可通过此项技术中已知的方法纯化粗产物,所述方法包括(但不限于)沉淀产物,随后视需要进行色谱分离。
水溶性聚合物可与本发明的多肽连接。水溶性聚合物可通过并入多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基或添加到非天然编码或天然编码氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者,水溶性聚合物是通过天然存在的氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N端残基的胺基)与并有非天然编码氨基酸的多肽连接。在一些情况下,PDCM的多肽组分包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸,其中一或多个非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡聚糖)连接。在一些情况下,PDCM的多肽组分进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码氨基酸。在一些情况下,PDCM的多肽组分包含一或多个与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸和一或多个与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中,相对于未结合形式,用于本发明的水溶性聚合物增强多肽的血清半衰期。
与本发明的多肽连接的水溶性聚合物的数量(即聚乙二醇化或糖基化的程度)可以经调节以提供改变(包括(但不限于)增加或减少)的药理学、药物动力学或药效学特征,如体内半衰期。在一些实施例中,多肽或PDCM的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、增加到2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即,酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中,用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的多肽。
在一些实施例中,以羟胺为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,且n为100到1,000(即,平均分子量介于5到40kDa之间)。
在一些实施例中,含肼或含酰肼的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000并且X任选地为可存在或不存在的羰基(C=O)。
在一些实施例中,含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,且n为100到1,000。
在本发明的另一个实施例中,用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的多肽。
在一些实施例中,以羟胺为末端的PEG衍生物具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,且n为100到1,000(即,平均分子量介于5到40kDa之间)。
在一些实施例中,含肼或含酰肼的PEG衍生物具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10,n为100-1,000并且X任选地为可存在或不存在的羰基(C=O)。
在一些实施例中,含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,且n为100到1,000。
在本发明的另一个实施例中,用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分支PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的多肽,其中所述分支PEG的各链的MW在10到40kDa范围内并且可为5到20kDa。
在本发明的另一个实施例中,用具有分支结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的多肽。举例来说,在一些实施例中,以肼或以酰肼为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10且n为100到1,000,并且X任选为存在或不存在的羰基(C=O)。
在一些实施例中,含有氨基脲基的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),X任选为NH、O、S、C(O),或不存在,m为2到10且n为100到1,000。
在一些实施例中,含有羟胺基的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),X任选为NH、O、S、C(O),或不存在,m为2到10且n为100到1,000。
水溶性聚合物与多肽连接的角度和位点可以调节多肽与抗原、受体、结合蛋白或其它分子的结合。
用于使聚合物活化以及用于结合肽的方法和化学描述于文献中并且是此项技术中已知的。常用的使聚合物活化的方法包括(但不限于)用溴化氰、过碘酸盐、戊二醛、双环氧化合物、表氯醇、二乙烯砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团(参见R.F.泰勒(R.F.Taylor),(1991),蛋白质固定.基础与应用(ProteinImmobilisation.Fundamental and Applications),马塞尔·德克公司(Marcel Dekker),纽约州;S.S.王(S.S.Wong),(1992),蛋白质结合与交联化学(Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking),CRC出版社(CRC Press),波卡拉顿(BocaRaton);G.T.赫曼森(G.T.Hermanson)等人,(1993),固定亲和力配体技术(Immobilized Affinity Ligand Techniques),学术出版社(Academic Press),纽约州;邓恩R.L.(Dunn,R.L.)等人编聚合性药物和药物传递系统(POLYMERIC DRUGSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS),ACS会议系列(ACS Symposium Series)第469卷,美国化学学会(American Chemical Society),华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.)1991)。
可获得关于PEG的官能化和结合的若干评论和专论。参见例如哈里斯(Harris),大分子化学和物理学(Macromol.Chem.Phys.)C25:325-373(1985);斯考滕(Scouten),酶学方法135:30-65(1987);王(Wong)等人,酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol),14:866-874(1992);德尔加多(Delgado)等人,治疗药物载剂系统关键评论(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)9:249-304(1992);塞里普斯基,生物结合物化学(Bioconjugate Chem.)6:150-165(1995)。
活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO 93/15189中,且使活化聚合物与酶之间结合的方法可见于以下对应不同酶的参考文献中,所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(韦罗内塞(Veronese)等人,应用生物化学与生物技术(App.Biochem.Biotech.)11:141-52(1985))。引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
含有非天然编码氨基酸的多肽(如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的聚乙二醇化(即添加任何水溶性聚合物)通过任何便利方法来进行。举例来说,用以炔封端的mPEG衍生物来使多肽聚乙二醇化。简言之,在搅拌下,在室温下向含对叠氮基-L-Phe的多肽水溶液中添加过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-C=CH。通常,用pKa接近欲进行反应的pH值(一般为约pH 4-10)的缓冲液对水溶液进行缓冲。举例来说,适于pH7.5下聚乙二醇化的缓冲液实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。持续监测pH值,并视需要加以调节。反应通常持续约1到48小时。
随后使反应产物经历疏水性相互作用色谱以分离聚乙二醇化多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-OCH,并且在未封端PEG时可以形成的聚乙二醇化多肽的任何高分子量复合物在所述分子的两个末端处活化,由此使多肽变异体分子交联。在疏水性相互作用色谱期间的条件使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C=CH流动穿过柱,同时任何交联聚乙二醇化多肽变异体复合物在所需形式之后洗脱,所述复合物含有与一或多个PEG基团结合的多肽变异体分子。适合的条件取决于交联复合物对比所需结合物的相对尺寸而变化,并且容易由所属领域的技术人员确定。通过超滤来浓缩含有所需结合物的洗脱液,并且通过透滤来脱盐。
必要时,可由所属领域的技术人员已知的一或多种程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化多肽,所述程序包括(但不限于)亲和色谱;阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括(但不限于))DEAE琼脂糖凝胶);硅胶色谱;反相HPLC;凝胶过滤(使用(包括(但不限于))SEPHADEX G-75);疏水性相互作用色谱;尺寸排阻色谱;金属螯合物色谱;超滤/透滤;乙醇沉淀;硫酸铵沉淀;色谱聚焦;置换色谱;电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦);差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀);或萃取。表观分子量可以用GPC通过与球状蛋白质标准样品比较来估计(普利内塔AZ(Preneta,AZ)在蛋白质纯化方法,实用方法(Proteinpurification methods,a practical approach)(哈里斯(Harris)和安格尔(Angal)编)IRL出版社(IRL Press)1989,293-306中)。多肽-PEG结合物的纯度可以通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)之后进行质谱分析来评估。佩平斯基RB(Pepinsky RB)等人,药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmcol.&Exp.Ther.)297(3):1059-66(2001)。
与本发明的PDCM的多肽组分的氨基酸连接的水溶性聚合物可以不受限制地进一步经衍生或取代。
含叠氮基的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中,用含有将与非天然编码氨基酸侧链上存在的炔部分反应的叠氮部分的PEG衍生物修饰多肽。一般来说,PEG衍生物的平均分子量将在1到100kDa范围内,且在一些实施例中,在10到40kDa范围内。
在一些实施例中,以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,且n为100到1,000(即,平均分子量介于5到40kDa之间)。
在另一个实施例中,以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,p为2到10且n为100到1,000(即,平均分子量介于5到40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中,用含有末端叠氮部分的分支PEG衍生物修饰包含含炔氨基酸的多肽,其中分支PEG的各链的MW在10到40kDa的范围内并且可以是5到20kDa。举例来说,在一些实施例中,以叠氮基为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,p为2到10,且n为100到1,000,且X任选为O、N、S或羰基(C=O),其在各情况下可存在或不存在。
含炔的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中,用含有将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰多肽。
在一些实施例中,以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)m-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,且n为100到1,000(即,平均分子量介于5到40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中,用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔的非天然编码氨基酸的多肽。
在一些实施例中,以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,p为2到10且n为100到1,000。
在本发明的另一个实施例中,用含有末端炔部分的分支PEG衍生物修饰包含含叠氮基氨基酸的多肽,其中分支PEG的各链的MW在10到40kDa的范围内并且可以是5到20kDa。举例来说,在一些实施例中,以炔为末端的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2到10,p为2到10且n为100到1,000,并且X任选为O、N、S或羰基(C=O),或不存在。
含膦的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中,用含有经活化官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰多肽,所述经活化官能团进一步包含将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说,PEG衍生物的平均分子量将在1到100kDa范围内,且在一些实施例中在10到40kDa范围内。
在一些实施例中,PEG衍生物将具有以下结构:
其中n为1到10;X可为O、N、S,或不存在,Ph为苯基,且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中,PEG衍生物将具有以下结构:
其中X可为O、N、S,或不存在,Ph为苯基,W为水溶性聚合物,且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示例性R基包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN以及-NO2。R'、R"、R'"和R""各独立地指氢、经取代或未取代的杂烷基、经取代或未取代的芳基(包括(但不限于)经1到3个卤素取代的芳基)、经取代或未取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基,或芳基烷基。举例来说,当本发明化合物包括一个以上R基团时,各R基团是如各R'、R"、R'"和R""基团在存在一个以上的这些基团时那样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子时,其可与所述氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说,-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。所属领域的技术人员从上文有关取代基的论述将了解到,术语“烷基”打算包括碳原子与除氢基外的基团结合的基团,如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术
可与多肽连接的其它示例性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括描述于例如以下各项中所述者:美国专利公开案第2004/0001838号;第2002/0052009号;第2003/0162949号;第2004/0013637号;第2003/0228274号;第2003/0220447号;第2003/0158333号;第2003/0143596号;第2003/0114647号;第2003/0105275号;第2003/0105224号;第2003/0023023号;第2002/0156047号;第2002/0099133号;第2002/0086939号;第2002/0082345号;第2002/0072573号;第2002/0052430号;第2002/0040076号;第2002/0037949号;第2002/0002250号;第2001/0056171号;第2001/0044526号;第2001/0021763号;美国专利第6,646,110号;第5,824,778号;第5,476,653号;第5,219,564号;第5,629,384号;第5,736,625号;第4,902,502号;第5,281,698号;第5,122,614号;第5,473,034号;第5,516,673号;第5,382,657号;第6,552,167号;第6,610,281号;第6,515,100号;第6,461,603号;第6,436,386号;第6,214,966号;第5,990,237号;第5,900,461号;第5,739,208号;第5,672,662号;第5,446,090号;第5,808,096号;第5,324,844号;第5,252,714号;第6,420,339号;第6,201,072号;第6,451,346号;第6,306,821号;第5,559,213号;第5,612,460号;第5,747,646号;第5,834,594号;第5,849,860号;第5,980,948号;第6,004,573号;第6,129,912号;WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、WO 98/05363、EP 809 996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503和EP 154 316,所述专利是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任何PEG分子都可以任何形式使用,包括(但不限于)单链、分支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。
增强对血清白蛋白的亲和力
各种分子也可以与本发明的多肽融合以调节多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中,分子与本发明的多肽连接或融合以增强对动物中内源性血清白蛋白的亲和力。
举例来说,在一些情况下,进行多肽与白蛋白结合序列的重组融合。示例性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参见例如马克里德斯(Makrides)等人,药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)277:534-542(1996)和索兰德(Sjolander)等人,免疫法杂志(J.Immunol Methods)201:115-123(1997))或如描述于例如丹尼斯(Dennis)等人,生物化学杂志(J.BiolChem.)277:35035-35043(2002)中那些的白蛋白结合肽。
在其它实施例中,用脂肪酸酰化本发明的多肽。在一些情况下,脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参见卡兹霍尔(Kurtzhals)等人,生物化学杂志(Biochem.J.)312:725-731(1995)。
在其它实施例中,本发明的多肽与血清白蛋白(包括(但不限于)人类血清白蛋白)直接融合。所属领域的技术人员将认识到,也可将多种其它分子与本发明中的多肽连接,以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。包括(但不限于)双官能连接基团的连接基团可连接分子。
本文中所述的多肽(如GLP-1化合物)可以直接或经由肽连接基团、水溶性聚合物或前药连接基团与白蛋白或其类似物、片段或衍生物融合。一般说来,作为本发明融合蛋白的一部分的白蛋白可来源于从包括人类在内的任何物种克隆得到的白蛋白。人类血清白蛋白(HSA)由具有585个氨基酸且式分子量为66,500的单个非糖基化多肽链组成。人类HSA的氨基酸序列是已知的[参见梅劳恩(Meloun)等人(1975)欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)58:136;贝伦斯(Behrens)等人(1975)美国实验生物学联合会会报(Fed.Proc.)34:591;朗(Lawn)等人(1981)核酸研究(Nucleic Acids Research)9:6102-6114;明格蒂(Minghetti)等人(1986)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261:6747,其中每一者都以引用的方式并入本文中]。已描述白蛋白的多种多形变异体以及类似物和片段。[参见维特坎普(Weitkamp)等人,(1973)人类遗传学年报(Ann.Hum.Genet.)37:219]。举例来说,在EP 322,094中,各种较短形式的HSA。揭示这些HSA片段中的一些,包括HSA(1-373)、HSA(1-388)、HSA(1-389)、HSA(1-369)和HSA(1-419)和介于1-369与1-419之间的片段。EP399,666揭示包括HSA(1-177)和HSA(1-200)和介于HSA(1-177)与HSA(1-200)之间片段的白蛋白片段。
X.多肽的糖基化
本发明包括并入有一或多个带糖残基的非天然编码氨基酸的多肽。糖残基可为天然(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然(包括(但不限于)3-氟半乳糖)的。可通过N或O连接糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或者相应的C或S连接糖苷)将糖与非天然编码氨基酸连接。
糖(包括(但不限于)糖基)部分可以体内或体外加成到多肽上。在本发明一些实施例中,用经氨氧基衍生化的糖修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的多肽,以产生经由肟键连接的相应糖基化多肽。一旦连接到非天然编码氨基酸上后,糖可以进一步通过用糖基转移酶和其它酶处理来加工,以产生结合于多肽上的寡聚糖。参见例如H.刘(H.Liu)等人美国化学学会杂志125:1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中,包含含羰基的非天然编码氨基酸的多肽经制备为氨氧基衍生物的具有所定义结构的聚糖直接修饰。所属领域的技术人员将认识到,可使用其它官能团,包括叠氮基、炔、酰肼、肼和氨基脲,将糖与非天然编码氨基酸连接。
在本发明的一些实施例中,包含含叠氮基或炔基的非天然编码氨基酸的多肽随后可以通过分别与包括(但不限于)炔基或叠氮基衍生物进行包括(但不限于)胡伊斯根[3+2]环加成反应来修饰。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。
XI.二聚物和多聚物
本发明还提供组合(包括(但不限于)多肽和多肽类似物),如同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物(即三聚物、四聚物等),其中含有一或多个非天然编码氨基酸的多肽与另一个多肽或其变异体直接结合到多肽主链上或经由连接基团结合。归因于其与单体相比较增加的分子量,多肽二聚物或多聚物结合物可以相对于单体多肽展现新的或所需的特性,包括(但不限于)不同药理学、药物动力学、药效性、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中,本发明的多肽二聚物可调节多肽受体的二聚化。在其它实施例中,本发明的多肽二聚物或多聚物可充当多肽受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中,多肽直接连接,包括(但不限于)经由Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键。在一些实施例中,所连接的多肽将包含不同非天然编码氨基酸以促使二聚化,包括(但不限于)第一多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔烃和第二多肽的第二非天然编码氨基酸中的叠氮化物将经由胡伊斯根[3+2]环加成结合。或者,包含含酮的非天然编码氨基酸的第一多肽可以与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二多肽结合,并且所述多肽经由形成相应肟而反应。
或者,两个多肽经由连接基团连接。任何异质或同型双官能连接基团可以用于连接两个多肽,所述多肽可以具有相同或不同的一级序列。在一些情况下,用于将多肽系在一起的连接基团可以是双官能分子,包括(但不限于)PEG试剂。连接基团可具有多种分子量或分子长度。较大或较小分子量的连接基团可以用于在多肽与所连接的实体之间或在多肽与其受体之间或在所联合的实体与其结合搭配物(如果存在的话)之间提供所需空间关系或构象。分子长度较长或较短的连接基团也可以用于在多肽与所连接的实体之间或在多肽与其结合搭配物之间或在所连接的实体与其结合搭配物(如果存在的话)之间提供所需间距或柔性。类似地,在PDCM到达其目标之前或之后,具有特定形状或构象的连接基团可以用于对多肽或所连接实体赋予特定形状或构象。多肽与所连接实体和结合搭配物之间空间关系的最优化可以对分子提供新的、经调节的或所需特性。
在一些实施例中,本发明提供水溶性双官能连接基团,其具有包括以下各者的哑铃结构:a)处于聚合物主链的至少一个第一端的含有叠氮基、炔烃、肼、酰肼、羟胺或羰基的部分;和b)处于所述聚合物主链第二端的至少一个第二官能团。第二官能团与第一官能团可相同或不同。在一些实施例中,第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中,本发明提供包含分支分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说,分支分子结构可为树枝状。
在一些实施例中,本发明提供包含一或多个多肽的多聚物,其通过与具有以下结构的水溶性经活化聚合物反应来形成:
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n为约5到3,000,m为2-10,X可为含有叠氮基、炔烃、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或羰基的部分,并且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基团。R可为例如选自由以下各者组成的群组的官能团:羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫氢基、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。
XII.测量多肽活性和多肽的亲和力
多肽活性可以使用标准的体外或体内分析来测定。举例来说,可以使用结合ABP的细胞或细胞株(包括(但不限于)含有天然ABP抗原的细胞或产生重组ABP抗原的细胞)来监测ABP结合。对于非聚乙二醇化或聚乙二醇化的包含非天然氨基酸的抗原结合多肽,ABP对其抗原的亲和力可以通过使用此项技术中已知的技术如BIAcoreTM生物传感器(法玛西亚公司(Pharmacia))来测量。可以用多肽的结合搭配物进行类似的研究。
不论使用何种方法来产生多肽,均对多肽进行生物活性分析。适当时,可进行氚化胸腺嘧啶分析来确定细胞分裂的程度。然而,可使用其它生物分析来确定所需活性。如测量抑制抗原生物活性(如酶促活性、增殖活性或代谢活性)能力的生物学分析也指示ABP活性。可以使用其它体外分析来确定生物活性。一般来说,视抗原生物活性需要,生物活性测试应对所需结果进行分析,如生物活性的增加或减少(与未改变ABP相比)、不同生物活性(与未改变ABP相比)、受体亲和力分析、构象或结构变化或血清半衰期分析。评估多肽对受体或结合搭配物的生物活性和结合的分析为所属领域的技术人员已知。
上文关于分析方法的参考文献汇编并非详尽,并且所属领域的技术人员将认识到其它可用于测试所需最终结果的分析。
XIII.效力、功能性体内半衰期和药物动力学参数的测量
本发明的一个重要方面是通过在存在或不存在ABP与如水溶性聚合物部分或白蛋白的分子的结合的情况下构造多肽(如ABP)来获得的生物学半衰期延长。ABP血清浓度的快速减少已经使其对评估对使用经结合和未经结合的ABP和其变异体来治疗的生物学响应至关重要。经结合和未经结合的ABP和其变异体可以在皮下或静脉内投药之后也具有延长的血清半衰期,使其可能通过例如ELISA方法或通过初步筛选分析来测量。体内生物半衰期的测量是如本文中所述进行的。
包含非天然编码氨基酸的多肽的药物动力学参数可以在正常史泊格-多利(Sprague-Dawley)雄性大鼠中进行评估(每治疗组N=5只动物)。动物接受静脉内25微克/大鼠或皮下50微克/大鼠的单一剂量,并且将根据预定时间过程取得大致5-7份血液样品,一般来说对未与水溶性聚合物结合的包含非天然编码氨基酸的多肽覆盖约6小时,并且对包含非天然编码氨基酸且与水溶性聚合物结合的多肽是约4天。多肽的药物动力学数据已在数个物种中进行充分研究并且可以与包含非天然编码氨基酸的多肽所获得的数据直接比较。
药物动力学参数也可以在灵长类动物(例如,食蟹猴)中评估。
根据本发明的多肽(包括(但不限于)ABP)的比活性可以通过此项技术中已知的各种分析来测定。根据本发明获得和纯化的ABP突变蛋白质或其片段的生物活性可以通过本文中所描述或所提及的方法或所属领域的技术人员已知的方法来测试。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)PDCM、合成酶、包含一或多个非天然氨基酸的蛋白质、PDCM的非多肽组分等)任选地(包括但不限于)与适合的医药载剂组合用于治疗用途。所述组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。调配物被制备成与投药模式相适应。一般来说,所属领域的技术人员已知投与蛋白质和前药结合物的方法,并且这些方法可适用于投与本发明的PDCM或PDCM的组分。
根据所属领域的技术人员已知的方法,包含一或多种本发明多肽的治疗组合物任选地在一或多种适当体外和/或体内疾病动物模型中进行测试以确认功效、组织代谢并估计剂量。具体来说,最初可以通过本文中非天然氨基酸与天然氨基酸同系物的活性、稳定性或其它适合测量值(包括(但不限于)比较经修饰以包括一或多个非天然氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽),亦即在相关分析中测定剂量。
投药通过常用于引入分子最终使其与血液或组织细胞接触的任何途径进行。本发明的PDCM以任何适合的方式任选地与一或多种医药学上可接受的载剂一起投与。向患者投与本发明上下文中所述的这些多肽的适当方法都可使用,而且,尽管可使用一种以上途径投与特定组合物,但某种特定途径经常可提供比另一途径快捷和有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂在部分程度上由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。因此,存在本发明医药组合物的多种适当调配物。
PDCM可以通过适合于蛋白质或肽的任何常规途径来投与,所述途径包括(但不限于)肠外,例如包括(但不限于)皮下或静脉内注射或任何其它形式的注射或输液。PDCM组合物可通过多种途径投与,包括(但不限于)经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可经由脂质体投与包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所述投药途径和适当调配物一般是所属领域的技术人员已知的。PDCM可以单独使用或与如医药载剂的其它适合组分组合使用。
单独或与其它适合组分组合的PDCM还可以制成待经由吸入投与的气雾剂调配物(即其可以被“喷雾”)。可将气雾剂调配物放入如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等加压可接受的推进剂中。
适于不经肠投与(如,经由关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径投与)的调配物包括水性与非水性等渗无菌注射液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定接受者的血液等渗的溶质;以及水性与非水性无菌悬浮液,其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。经包装核酸的调配物可提供于单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中。
不经肠投药和静脉内投药是优选的投药方法。具体说来,已经用于天然氨基酸同系物治疗的投药途径(包括(但不限于),通常用于前药结合物、EPO、GH、ABP、G-CSF、GM-CSF、IFN、白介素、抗体和/或任何其它以医药学方式传递的蛋白质的途径)连同当前使用的调配物,将提供优选的投药途径和本发明分子的调配物。
在本发明上下文中,取决于应用,投与患者的剂量足以在患者体内随时间引起有益的治疗反应,或引起任何适当的活性。所述剂量由特定载体或调配物的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期,和患者的病况,以及欲治疗患者的体重或表面积决定。剂量大小还由在特定患者体内伴随投与特定载体、调配物等的任何不利副作用的存在、特性和程度来决定。
在确定治疗或防治疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)时应投与的载体或调配物的有效量时,医师将评估循环血浆水平、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
举例来说,投与70千克患者的剂量通常在相当于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内,可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而调整。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法,包括抗体投药、疫苗投药、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应修饰剂的投药等来补充治疗条件。
关于投药,本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对各种浓度的非天然氨基酸多肽的任何副作用(包括(但不限于)当关系到患者的体重和整体健康时)的观测结果所确定的速率投与。投药可经由单次剂量或分次剂量实现。
如果输注调配物的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛,那么他/她可接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。经历如发烧、肌肉疼痛和寒战的输注反应的患者,在将进行输注之前30分钟,预先给予阿司匹林、对乙酰氨基酚或包括(但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。哌替啶(Meperidine)用于不能对退热剂和抗组织胺快速响应的较为严重的寒战和肌肉疼痛。视反应的严重性而减慢或中断细胞输注。
本发明的PDCM可以直接向哺乳动物个体投与。投药通过常用于向个体引入多肽或前药结合物的任何途径进行。尽管在任何给定情况下,最适合的途径将视所治疗病况的特性和严重性而定,但是根据本发明实施例的PDCM组合物包括适于以下投药的组合物:经口、直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、颊内(包括(但不限于)舌下)、阴道、不经肠(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜內、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即,皮肤和粘膜表面,包括气道表面)和透皮投药。投药可为局部的或全身投药。化合物调配物可提供于单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中。本发明的PDCM可以制备成单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。本发明PDCM还可以通过连续输注(使用包括(但不限于)微型泵,如渗透泵)、单一推注或缓慢释放贮存调配物投与。
适于投药的调配物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等渗的溶质的水性与非水性溶液、等渗无菌溶液,以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性与非水性无菌悬浮液。溶液和悬浮液可由前文所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备得到。
冷冻干燥是常用于提供用以从所关注的蛋白质制剂中去除水的蛋白质的技术。冷冻干燥或冻干法是一种首先将欲干燥的材料冷冻,且随后通过在真空环境中升华来去除冰或冷冻溶剂的方法。预先冻干的调配物中可包括赋形剂,以在冷冻干燥过程中增强稳定性和/或改进储存时冻干产物的稳定性。皮卡尔M.(Pikal,M.),生物医药(Biopharm.)3(9)26-30(1990),和荒川(Arakawa)等人,医药研究(Pharm.Res.)8(3):285-291(1991)。
医药的喷雾干燥也是所属领域的技术人员已知的。举例来说,参见布罗德黑德J.(Broadhead,J.)等人,“医药喷雾干燥(The Spray Drying of Pharmaceuticals)”,在药物开发与工业制药学(Drug Dev.Ind.Pharm),18(11和12),1169-1206(1992)中。除小分子药物之外,已经喷雾干燥多种生物学材料,并且这些材料包括:酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是一项有用的技术,这是因为其可在单步骤方法中将液体医药制剂转化成精细、无尘的或成团的粉末。基本技术包含以下四个步骤:a)使进料溶液雾化成喷雾;b)喷雾-空气接触;c)干燥喷雾;和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其以引用的方式并入本文中)描述通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。
本发明的医药组合物可以包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂在部分程度上由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。相应地,存在本发明医药组合物(包括任选使用的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的多种适当调配物(例如参见雷氏药学大全(Remington'sPharmaceutical Sciences),第17版,1985)。
适合的载剂包括(但不限于)含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸的缓冲剂;抗氧化剂,包括(但不限于)抗坏血酸;低分子量多肽,包括(但不限于)少于约10个残基的那些多肽;蛋白质,包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸盐或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,包括(但不限于)EDTA;二价金属离子,包括(但不限于)锌、钴或铜;糖醇,包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇;形成盐的平衡离子,包括(但不限于)钠;和/或非离子表面活性剂,包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普朗尼克酸(包括(但不限于)和其它普朗尼克酸,包括(但不限于)普朗尼克酸F68(泊洛沙姆(poloxamer)188))或PEG。例如,适合的表面活性剂包括(但不限于)以聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(即,(PEO-PPO-PEO))或聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)(即,(PPO-PEO-PPO))或其组合为基础的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO在市面上以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(巴斯夫怀恩多特公司(BASF Wyandotte Corp.),密歇根州怀恩多特(Wyandotte,Mich.))销售,并且进一步描述于美国专利第4,820,352号中,所述专利以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适合的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可以用于使聚乙二醇化的hGH针对一或多种压力(包括(但不限于)由搅拌产生的压力)稳定上述一些表面活性剂可称为“增积剂(bulking agent)”。一些也可称为“张力改变剂(tonicity modifier)”。
本发明的多肽(包括与如PEG的水溶性聚合物连接的那些多肽)还可以通过持续释放系统或作为其一部分投与。持续释放组合物包括(包括(但不限于))呈包括(但不限于)膜或微胶囊的成形物件形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物可相容材料,如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(兰格(Langer)等人,生物医学材料研究杂志(J.Biomed,Mater.Res.),15:266-277(1981);兰格,化学技术(Chem.Tech.),12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(兰格等人,同上文)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号;EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(希德曼(Sidman)等人,生物聚合物(Biopolymers),22,547-556(1983))、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及硅酮。持续释放组合物还包括脂质体包埋的化合物。含有化合物的脂质体通过本身已知的方法制备:DE3,218,121;爱泼斯坦(Eppstein)等人,美国国家科学院院刊,82:3688-3692(1985);黄(Hwang)等人,美国国家科学院院刊,77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP36,676;美国专利第4,619,794号;EP 143,949;美国专利第5,021,234号;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号;EP 102,324。引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
脂质体包埋的多肽通过以下各者中所述的方法制备:例如DE 3,218,121;爱泼斯坦(Eppstein)等人,美国国家科学院院刊,82:3688-3692(1985);黄(Hwang)等人,美国国家科学院院刊,77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36,676;美国专利第4,619,794号;EP 143,949;美国专利第5,021,234号;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号;EP 102,324。脂质体的组成和尺寸是所属领域的技术人员众所周知的或能够容易地由其凭经验确定。脂质体的一些实例如以下各者中所述,例如帕克JW(Park JW)等人,美国国家科学院院刊92:1327-1331(1995);拉西克D(Lasic D)和帕帕哈乔泡洛斯D(Papahadjopoulos D)(编):脂质体医学应用(Medical Applications of Liposomes)(1998);德拉蒙德DC(DrummondDC)等人,癌症疗法的脂质体药物传递系统(Liposomal drug delivery systems forcancer therapy),在泰彻B(Teicher B)(编):癌症药物发现与发展(Cancer DrugDiscovery and Development)(2002)中;帕克JW等人,临床癌症研究(Clin.CancerRes.)8:1172-1181(2002);尼尔森UB(Nielsen UB)等人,生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)1591(1-3):109-118(2002);马莫特C(Mamot C)等人,癌症研究(Cancer Res.)63:3154-3161(2003)。引用的所有参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。
在本发明的上下文中,投与患者的剂量应足以随时间在个体体内引起有益的反应。一般来说,每剂不经肠投与的本发明的多肽的总医药有效量在每天每千克患者体重约0.01微克到约100微克,或者每天每千克患者体重约0.05毫克到约1毫克的范围内,但这应服从治疗判断。给药频率也受制于治疗判断,并且可以比市售的核准用于人类的产品更频繁或更不频繁。一般来说,本发明的PDCM可以通过上述投药途径中的任一者来投与。
XV.本发明抗原结合多肽的治疗和/或诊断用途
本发明的PDCM适用于治疗多种病症。含有PDCM的医药组合物可以一种可有效通过各种方式向人类患者投药的强度调配,所述人类患者正在经历可以受多肽激动剂或拮抗剂(如(但不限于)所用的抗增殖、抗发炎或抗病毒剂)影响的单独或作为病况或疾病的一部分的病症。PDCM的平均量可以变化,并且具体来说应基于合格医生的建议和处方。PDCM的确切量应优先考虑例如以下因素:所治疗病况的确切类型、所治疗患者的状况以及组合物中的其它成分。本发明也投与治疗有效量的另一活性剂,如抗癌化疗剂。待给予的量可容易由所属领域的技术人员基于用PDCM的疗法来确定。
本发明的PDCM可具有诊断用途。PDCM的平均量可以变化,并且具体来说应基于合格医生的建议和处方。
实例
提供以下实例以说明,而非限制所要求的发明。
实例1
本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入PDCM的多肽组分中的优选位点的多组潜在准则之一。
本实例说明如何选择多肽内用于引入非天然编码氨基酸的优选位点。使用多肽的三维结构或二级、三级或四级结构来确定一或多个非天然编码氨基酸可以引入的优选位置。
以下准则用于评估PDCM的多肽组分内用于引入非天然编码氨基酸的各位置:残基(a)不应该干扰基于三维结构的结构分析的多肽或多肽的二级、三级或四级结构的结合,b)不应该受丙氨酸或同系物扫描诱变的影响,(c)应该表面暴露并且展示与周围残基的最小范德华力(van der Waals)或氢键相互作用,(d)可以在多肽的一或多个暴露面上,(e)可以为与第二多肽或其它分子或其片段并置的多肽位点,(f)在多肽变异体中应该缺失或可变,(g)在用非天然编码氨基酸取代之后应产生保守性变化,和(h)通过视需要改变完整结构的柔性或刚性,可以调节多肽自身或者包含一或多个多肽的二聚物或多聚物的构象和(i)可见于高柔性区或结构刚性区中。此外,采用Cx程序(平塔尔(Pintar)等人生物信息学(Bioinformatics),18,第980页)对多肽进行进一步计算以评估各蛋白原子的突出程度。因此,在一些实施例中,非天然编码氨基酸在(但不限于)多肽的一或多个位置处被取代。
实例2
本实例详述包括非天然编码氨基酸的ABP在大肠杆菌中的克隆和表达。
使用引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统表达含有非天然编码氨基酸的ABP。O-RS优先利用非天然编码氨基酸将O-tRNA氨酰基化。接着,翻译系统响应于所编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入ABP中。
表2:O-RS和O-tRNA序列
用含有经修饰的编码PDCM的多肽组分的基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对的质粒(对所需非天然编码氨基酸具有特异性)转化大肠杆菌使非天然编码氨基酸位点特异性地并入多肽中。37℃下在含有介于0.01到100mM之间的特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌以高保真度和效率表达经修饰多肽。由大肠杆菌宿主细胞产生含有非天然编码氨基酸的His标签多肽为包涵体或聚集体。溶解聚集体,并在变性条件下于6M盐酸胍中亲和纯化。通过在4℃下于50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2%(w/v)月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)中透析过夜,来执行再折叠。随后针对20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mMCaCl2透析所述材料,接着去除His标签。参见博伊塞尔(Boissel)等人,(1993)268:15983-93。纯化多肽的方法为此项技术中熟知,并且由SDS-PAGE、蛋白质印迹分析或电喷雾-离子化离子阱质谱法等证实。
周质scFv-108:将EGFR特异性单克隆抗体mAb108的可变区(VL和VH)(美国专利第6,217,866号,其以引用的方式并入本文)克隆为具有位于yBGL2(C7)周质前导序列下游的(GGGGS)4连接基团序列的scFv片段(汉弗莱斯DP(Humphreys,DP)等人蛋白质表达与纯化(Protein Expr Purif.)2000年11月;20(2):252-64)。将由c-myc抗体所识别的抗原决定基序列以及6X-His标签克隆到VL域的下游。在可诱导启动子的控制下,将野生型scFv-108构建体以及VL域中含有琥珀终止密码子(TAG)的变异体(参见图2,图A)克隆进大肠杆菌表达载体中。此质粒也组成型表达来自詹氏甲烷球菌的琥珀抑制子酪氨酰基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)。指示出琥珀终止密码子的位置。
细胞质scFv-108:在T7启动子的控制下,将含有N端MetGly-序列和6X-His序列的VH-连接基团-VL序列克隆进表达载体中(参见图2,图B)。指示出琥珀终止密码子的位置。
Fab-108:将mAb108的VL和VH序列克隆进pFT3中,pFT3是一种编码g3和STII周质前导序列以及人类κ恒定和CH1域的质粒。将琥珀突变引入CH1域,并且将整个双顺反子盒克隆进表达质粒中(参见图2,图C)。显示两个驱动Fab片段的VL和VH域的翻译的Shine Delgarno序列(SD)。
表达/抑制:使用此项技术中已知的标准方案完成大肠杆菌中琥珀突变的抑制。简单来说,为达成大肠杆菌中抗体片段(scFv和Fab)的周质抑制,将表达载体构建体与编码来自詹氏甲烷球菌的正交酪氨酰基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)的质粒一起转化进大肠杆菌宿主细胞中。将过夜细菌培养物1:100稀释到含有LB培养基(卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani))或超级肉汤(Superbroth)的振荡烧瓶中,并且在37℃下生长到OD大约为0.8。诱导Fab和scFv表达,同时通过加入对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)到4mM最终浓度来抑制琥珀密码子。在25℃下过夜温育培养物。在相同条件下进行野生型(缺乏琥珀密码子)scFv和Fab片段的表达。以相似方式实现细胞质scFv片段的表达/抑制(图2,图B)。
图3的图A显示GlySer连接基团(S131Am)内第二丝氨酸中琥珀突变的抑制,并且显示相应含pAF的scFv的纯化(图3,图B)。如图3的图A所示,西方印迹分析证明,当细胞在LB或超级肉汤培养基中生长时,需要pAF以抑制琥珀终止突变。pAF的存在并不影响缺乏TAG终止密码子的scFv的表达(WT scFv-108)。图3的图B显示通过如文本中所述的固定金属亲和色谱法(IMAC)纯化scFv 108-(S131-pAF)。含pAF的scFv的估计产量为1.5mg/L。由箭头指示scFv片段的位置。如下装载考马斯凝胶:泳道1-scFv对照(1.7μg);泳道2-IMAC预结合(20μl/70ml);泳道3-IMAC空(20μl/70ml);泳道4-IMAC洗脱(5μl/1.3ml);泳道5-NAP10缓冲液交换(10μl/1.5ml);泳道6-IMAC小珠洗脱后;泳道7-scFv对照(3.4μg)。
图4显示细胞质表达scFv期间内VL链(L156)中琥珀突变的抑制。产量为>100mg/L大肠杆菌培养物,并且终止密码子抑制完全依赖于pAF的存在。箭头指示全长scFv。
蛋白提取与纯化:通过离心收集细胞,并再悬浮于补充有100μg/ml溶菌酶的周质释放缓冲液(50mM NaPO4、20%蔗糖、1mM EDTA,pH 8.0)中,并且在冰上培育30分钟。离心后,将上清液中的抗体片段借助其His标签固定在ProBind珠粒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))上,用结合缓冲液充分洗涤珠粒,并接着用0.5M咪唑将经结合的片段从珠粒中洗脱出来。将经纯化片段透析到储存缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、10%甘油、5%蔗糖)中。对于在细胞质中表达的scFv片段的小规模分析来说,通过离心从15ml培养物中收集大肠杆菌,并且将其再悬浮于1ml补充有10μg/ml DNase的溶解缓冲液(B-PER,伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Rockford,IL))中。在37℃下培育混合物30分钟,在蛋白质装载缓冲液(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中稀释1倍,并且装载在SDS凝胶上。
抗体片段的聚乙二醇化/二聚化:聚乙二醇化:在反应缓冲液(100mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA,pH 4.0)中将约1mg pAF-scFv-108蛋白浓缩到50μl最终体积。以100μl最终体积用100倍摩尔过量的单官能(羟胺)5K PEG(在反应缓冲液中平衡)于28℃下培育反应混合物32小时。凝胶电泳之后评估聚乙二醇化物质,并且直接用于细胞结合分析中。
二聚化:相似过程用于二聚化含pAF的scFv-108片段。简单来说,将起始scFv-108-136pAF在反应缓冲液中浓缩到30μl,并且随后与双官能(羟胺)PEG连接基团(364Da)一起培育。通过凝胶电泳来监测第一反应的完成。通过透析来移除未反应PEG,并且向混合物中添加新鲜等分试样的scFv-108-136pAF(1摩尔蛋白:蛋白当量)。随后在28℃下再培育混合物32小时。
图5显示pAF-scFv-108片段的聚乙二醇化和二聚化。图5的图A显示scFv-108-L156-pAF与scFv-108-S136-pAF的聚乙二醇化(5K),和scFv-108-S136-pAF的二聚化。如下装载凝胶:泳道1-scFv-108-L156pAF(5K PEG);泳道2-scFv-108-S136pAF(5K PEG);泳道3-scFv-108-S136pAF(364da PEG)连接基团的二聚化;泳道4-scFv-108-S136pAF的二聚化;第一聚乙二醇化反应之后未移除连接基团。分别由单箭头和双箭头指示单聚乙二醇化scFv片段和scFv-108-S136二聚物的位置。不存在二聚化(泳道4)证明scFv并未经分子间二硫键形成而偶联。图5的图B显示PEG与scFv片段的结合完全依赖于pAF的存在。未观察到WT scFv片段的聚乙二醇化。如下装载凝胶:泳道1-WT scFv 108输入;泳道2-scFv WT,在反应缓冲液中,无PEG;泳道3-scFv WT+5K PEG。
图8显示本发明的异质双官能ABP的实例。基于对结合于同一抗原(例如ErbB2)的不同抗原决定基的两个不同抗体分子(例如赫赛汀(Herceptin)和奥密塔克(Omnitarg))所测定的已知晶体结构,鉴别特异性氨基酸位置,使得其符合特定所需选择准则。本实例中氨基酸位置的所需选择准则包括在各分子的一或多个特异性氨基酸位置上的相对接近性。可能需要所述氨基酸位置使用连接分子形成图8所示的异质双官能分子。下表3显示各分子上符合准则的特异性氨基酸位置,如同可用于形成异质双官能ABP的连接分子。本发明的非天然氨基酸可以在各分子中的一或多个这些位置处经取代,以提供用于连接基团连接的化学官能团。多种其它选择准则也可以用于鉴别氨基酸位置以符合所需准则,包括(但不限于)相同或不同分子之间的接近性,构象变化调节,ABP或连接于ABP的分子之间的距离调节,连接基团长度或形状,表面暴露,配体结合特征调节,受体二聚化调节等。
实例3
本实例详述含羰基氨基酸的引入和与含氨氧基PEG的后续反应。
本实例展示一种产生并入有含酮非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的方法,所述抗原结合多肽随后与约5,000MW的含氨氧基PEG反应。根据实例1的准则所鉴别的各残基分别由具有以下结构的非天然编码氨基酸取代:
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入ABP的序列为上文实例2中所述的SEQ ID NO:4(muttRNA,詹氏甲烷球菌)和13、14或15(TyrRS LW1、5或6)。
一旦经修饰,包含含羰基氨基酸的ABP变异体即与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R为甲基,n为3且N为约5,000MW。使以10mg/mL溶解于25mM MES(西格玛化学品公司(Sigma Chemical),密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))(pH6.0)、25mM Hepes(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)(pH 7.0)中或者溶解于10mM乙酸钠(西格玛化学品公司,密苏里州圣路易斯)(pH 4.5)中的含对乙酰基苯丙氨酸的纯化ABP与10到100倍过量的含氨氧基PEG反应,且随后在室温下搅拌10到16小时(杰克斯W.(Jencks,W.),美国化学学会会志,1959,81,第475页)。随后将PEG-ABP稀释到适当缓冲液中,进行立即纯化和分析。
实例4
本实例详述通过一或多个PEG连接基团所分开的ABP同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生。
含炔ABP变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应:
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
(其中n为4且PEG具有约5,000的平均MW)以产生对应ABP同型二聚物,其中两个ABP分子由PEG在物理上分开。抗原结合多肽能够以类似方式偶联于一或多个其它多肽以形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。将如实例3中般进行偶联、纯化和分析。
实例5
本实例详述将糖部分与ABP偶联。
如实例3中所述,ABP的一或多个氨基酸残基由以下非天然编码氨基酸取代。
一旦经修饰,包含含羰基氨基酸的ABP变异体即与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β连接氨氧基类似物反应。将ABP变异体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM)在100mM乙酸钠水缓冲液(pH 5.5)中混合,并且在37℃下培育7到26小时。通过在环境温度下将经糖结合的ABP(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1,4-半乳糖酰基转移酶(0.4单位/毫升)一起在150mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中培育来将第二糖酶促偶联于第一糖(肖恩巴彻(Schanbacher)等人生物化学杂志1970,245,5057-5061)。
实例6
其中ABP分子是经直接连接的ABP同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生
包含含炔氨基酸的ABP变异体可以直接偶联于包含含叠氮基氨基酸的另一ABP变异体,各ABP变异体包含非天然编码氨基酸取代。这将产生对应ABP同型二聚物,其中两个ABP变异体物理相连。抗原结合多肽可以类似方式偶联于一或多个其它多肽以形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。
实例7
本实例描述测量聚乙二醇化ABP的体外和体内活性的方法。
细胞结合分析
在存在或不存在各种浓度(体积:10μl)未经标记ABP、ABP或阴性对照的情况下,且在125I-ABP(约100,000cpm或1ng)存在下,于0℃下在PBS/1%BSA(100μl)中一式两份地培育细胞(3×106)90分钟(总体积:120μl)。随后将细胞再悬浮于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS中,并分层,并且离心(1000g;1分钟)。通过切掉离心管的末端来收集离心小块,并且分别在γ计数器(Packard)上分别计数离心小块和上清液。通过切断所述管的末端收集球粒并且在γ计数器(帕卡德公司(Packard))中单独地计数球粒和上清液。
根据在不存在竞争者的情况下的全部结合(重复实验的平均值)减去在存在100倍过量的未标记ABP的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)来测定特异性结合(cpm)。测量所用细胞类型中的每一者的非特异性结合。使用相同的125I-ABP制剂在分开的数天执行实验并且所述实验应该展示内部一致性。所述结合以一种剂量依赖性方式受到未标记天然ABP或ABP的抑制,但不受阴性对照抑制。ABP竞争结合天然125I-ABP的能力表明所述受体同等程度地良好识别两种形式。
在用胰岛素处理之后收集A431细胞,将其再悬浮于FACS缓冲液(PBS,1%FBS,0.01%NaN3)中,并且随后接种于96孔圆底微量滴定板(3×105个细胞/孔)中。用不同浓度野生型或含pAF的scFv-108片段在冰上培育细胞30分钟。通过离心后洗涤(重复2-3次)来移除未结合的scFv蛋白。随后用mAb-108(ATCC#HB9764)在7.5nM(EC80)浓度下培育细胞30分钟。两次洗涤之后,在冰上用APC标记(别藻蓝素(allophycocyanin))的抗小鼠抗体(100nM)培育细胞30分钟。两次洗涤细胞以移除第二抗体之后,将细胞再悬浮于补充有碘化丙啶(0.5μg/ml)的FACS缓冲液中,并通过流式细胞术进行分析。
图6的A-C显示含有对乙酰基-苯丙氨酸(pAF)或pAF与PEG的scFv蛋白与表达EGF受体的A431细胞的竞争性结合曲线。在洗涤移除未结合scFv's之后用各种浓度的scFv蛋白培育细胞,并且如上文所述用mAb108处理细胞。所有蛋白均在周质中表达。表4总结了经修饰scFv's相对于野生型scFv的结合:
图7的图A-B显示Fab片段的结合曲线。含pAF的Fab片段的结合相对于野生型Fab的结合显示于表5中。结合条件如前文所述。
聚乙二醇化ABP的体内研究
向小鼠或大鼠投与PEG-ABP、未经修饰ABP和缓冲溶液。结果将显示与未经修饰ABP相比,本发明的聚乙二醇化ABP的极佳活性和延长的半衰期。
经结合和非结合ABP和其变异体的体内半衰期的测量
使用雄性史泊格多利大鼠(约7周龄)。投药当天,测量每只动物的重量。将每千克体重100μg非结合和经结合ABP样品各自经静脉内注射到三只大鼠的尾部静脉中。注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时,在CO2麻醉下从每只大鼠抽取500μl血液。在室温下储存血液样品1.5小时,随后通过离心(4℃,18000×g,5分钟)分离出血清。将血清样品储存在-80℃下直到分析当天。通过在冰上融化样品之后ABP的体外活性分析来定量血清样品中活性ABP的量。
实例8
含有前药的分子(PDCM)包含一或多个含有至少一个非天然编码氨基酸的多肽。非天然编码氨基酸可取代天然编码氨基酸或可为氨基酸添加。PDCM的非限制性实例展示在图9-16中。PDCM的多肽部分可为任何长度的蛋白质或肽,包括(但不限于)抗体、抗体片段、载体蛋白质、治疗性蛋白质和治疗性肽。举例来说,PDCM的多肽部分可为将PDCM靶向体内特定位置的多肽。与多肽或与分子形成的键在某些条件下可能是可降解或不稳定的。PDCM的活性化合物可在包括(但不限于)酸性pH值、酶的存在和活性、辐射、生理条件等的条件下释放。PDCM的多肽部分在从PDCM余部释放之后可含有非天然编码氨基酸或天然编码氨基酸。
图9展示PDCM的形成。喜树碱与包含非天然编码氨基酸的scFv反应。在所示实例中,非天然编码氨基酸具有酮基。举例来说,非天然编码氨基酸可为对乙酰基苯丙氨酸。scFv-毒素结合物是通过使用为喜树碱活性所需的-OH基的反应形成的。scFv和喜树碱可在某些条件下分离使得活性喜树碱、scFv和连接基团得以释放。连接基团的组成可控制药物释放。其它PDCM可通过使非活性形成的喜树碱与包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽反应而形成。图16展示另一实例,其中喜树碱在使用多肽中的非天然编码氨基酸的结合反应之后从多肽-毒素结合物中释放出来。举例来说,非天然编码氨基酸可为对氨基苯丙氨酸。在所示实例中连接基团未释放。
图10的图A和B展示两个各自具有连接两个多肽的双官能连接基团(L)的PDCM。
图11展示包含肽的PDCM。aAx代表肽GLP-1中的非天然编码氨基酸取代。在所示实例中,GLP-1经由可降解连接基团与PEG连接。PDCM的多肽部分可为在任何一或多个位置处包含一或多个非天然编码氨基酸的任何多肽。图12中展示使用非天然编码氨基酸的前药策略。
图13展示白蛋白与多肽之间的结合的形成。多肽从白蛋白的控制释放涉及所指示的结合的部分。aAx代表多肽中的非天然编码氨基酸取代。图14展示两次裂解前药连接基团的一个非限制性实例。在这个实例中,多肽GLP-1、白蛋白和连接基团以控制方式从结合物中释放。
图15展示展示其中抗体或载体蛋白质经由非天然编码氨基酸与药物连接的PDCM的图式。抗体或载体蛋白质包含一或多个非天然编码氨基酸。对氨基苯丙氨酸是非天然编码氨基酸的一个非限制性实例。结合物通过还原性烷基化形成。药物释放速率可利用X、Y和n的不同组合控制。
实例9
图17展示葡萄糖触发的胰岛素释放的模型。包含非天然编码氨基酸的胰岛素或胰岛素类似物可参与这种模型。非天然编码氨基酸可作为胰岛素或胰岛素类似物中的添加或取代存在(AX-Ins)。B链的N端(XNB-Ins)、B链的C端(XCB-Ins)、在Lys29或B链(XKB-Ins)是在可以对胰岛素或胰岛素类似物作出的许多不同可能的修饰之中。包括(但不限于)聚合物的分子直接或经由连接基团或其它分子间接与非天然编码氨基酸结合。胰岛素或胰岛素类似物的控制释放是由血糖水平触发的。可能的聚合物包括(但不限于)PEG、PLGA、壳聚糖和糊精。可能的聚合物特性包括(但不限于)线性、PEG接枝、共聚物和树枝状聚合物。许多可能的策略可用于葡萄糖触发的胰岛素释放。一种涉及芳基硼酸酯的策略展示为图18。另一种涉及氧代半缩醛化学过程的策略展示为图19。
实例10
PDCM的安全性和/或功效的人类临床试验。PDCM的一个非限制性实例是具有ABP组分的PDCM。
目的 为了比较皮下或静脉内投与的PDCM或PDCM的组分的安全性和药物动力学特性
患者 本研究招募了18名20-40岁年龄和60-90kg之间体重的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和乙型肝炎表面抗原的实验值。其不应当具有任何以下迹象:高血压;任何原发性血液病史;显著肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖系统、代谢系统、神经系统疾病史;贫血或抽搐病史;已知对细菌或哺乳动物衍生产物、PEG或人血清白蛋白过敏;习惯和严重依赖含有咖啡因的饮料;参与任何其它临床试验或在研究登记30天内输血或献血;在研究登记三个月内暴露于PDCM或PDCM的任何组分;在研究登记7天内患有疾病;以及在研究登记14天内在研究前体检中或临床实验评估中具有显著异常情况。可对所有个体评估安全性,并且根据进程收集所有血液收集物用于药物动力学分析。所有研究是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。
研究设计 这将是在健康男性志愿者中所进行的I期、单中心、开放标记、随机、两阶段交叉研究。将18名个体随机分到两个治疗顺序组的一组中(9名个体/组)。经两个单独给药阶段,在上部大腿使用等剂量的PDCM和所选用于比较的任何市售产品以皮下快速注射的方式投与PDCM。市售产品的投药剂量和频率在包装标签中说明。需要时可通过包括其它个体组而将使用市售产品的其它给药、给药频率或其它参数加入到研究中。各给药期由14天的清洗期分隔开。在两个给药期中的每一个中给药之前至少12小时和之后72小时,将个体限定在研究中心,而在给药期之间不用。如果还存在对PDCM所要测试的附加给药、频率或其它参数,那么可以加入其他个体组。
血液采样 在投与PDCM之前和之后,通过直接静脉穿刺连续抽取血液。在给药(3个基线样品)之前约30、20和10分钟时以及在给药之后的大致以下时间获得用于测定血清PDCM或PDCM组分浓度的静脉血液样品(5mL):30分钟和在1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时时。将各血清样品分成两个等分试样。所有血清样品储存在-20℃下。在干冰上运送血清样品。在第1天初始剂量之前立即、第4天早晨、第16天给药之前立即以及第19天早晨,进行空腹临床实验室测试(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 放射免疫分析法(RA)或ELISA试剂盒程序用于测定血清PDCM或PDCM组分浓度。
安全性测定 在各次给药之前立即(第1天和第16天)和在各次给药后6、24、48和72小时记录生命指征。安全性测定是建立在不利事件的发生率和类型以及临床实验室测试相比基线的改变的基础上。此外,评估生命指征测量(包括血压)和身体检查结果相比研究前的改变。
数据分析 通过从各给药后值减去平均基线PDCM或PDCM组分浓度来针对给药前基线PDCM或PDCM组分浓度校正给药后血清浓度值,其中所述平均基线PDCM或PDCM组分浓度是从给药之前30、20和10分钟所收集的三份样品的PDCM或PDCM组分含量的平均值而得以确定。如果给药前血清PDCM或PDCM组分浓度低于本分析的定量含量,那么这些数据不会包括在平均值的计算中。由针对基线PDCM或PDCM组分浓度校正的血清浓度数据确定药物动力学参数。在数字设备公司(DigitalEquipment Corporation)的VAX 8600计算机系统上,使用最新版本的BIOAVL软件,通过模型独立方法计算药物动力学参数。确定以下药物动力学参数:峰值血清浓度(Cmax);达到峰值血清浓度的时间(tmax);借助线性梯形法则所计算的浓度-时间曲线(AUC)下从时间零点至最后血液采样时间(AUC0-72)的面积;和从消除速率常数所计算的末期消除半衰期(t1/2)。消除速率常数是通过线性浓度对数-时间曲线图的终末线性区域中连贯数据点的线性回归来估算的。计算每种治疗的药物动力学参数的平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保存的调配物/非保存的调配物)。
安全性结果 不利事件的发生率在治疗组之间均等分布。与基线或研究前临床实验室测试或血压相比不存在临床上显著的改变,并且身体检查结果和生命指征测量值与研究前相比不存在明显改变。两个治疗组的安全性概况看来应类似。
药物动力学结果 将各测量时间点时,所有18名个体中接受单次剂量的一或多种特异于相同目标抗原的市售产品之后的平均血清PDCM或PDCM组分浓度-时间曲线(未对基线PDCM或PDCM组分含量校正)与PDCM或PDCM组分进行比较。所有个体均应当具有在正常生理范围内的给药前基线PDCM或PDCM组分浓度。从对给药前平均基线PDCM或PDCM组分浓度校正的血清数据确定药物动力学参数,并且确定Cmax和tmax。所选临床比较者的平均tmax显著短于PDCM或PDCM组分的tmax。与PDCM或PDCM组分的末端半衰期相比,所测试的任何市售PDCM或PDCM组分产品的末端半衰期显著较短。
尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行,但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况;所述群体如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、自体预存程序中的患者或计划进行选择性手术的患者。
总之,皮下投与单次剂量的PDCM将是安全的,并且由健康男性个体充分耐受。基于不利事件发生率、临床实验值、生命指征和体检结果的比较,市售形式的PDCM或PDCM组分和PDCM或PDCM组分的安全性概况等同。PDCM或PDCM组分可能对患者和卫生保健医疗人员提供很大的临床效用。
应了解,本文所述的实例和实施例仅出于说明性目的,并且将对所属领域的技术人员暗示根据所述实例和实施例的各种修改或改变,这些修改和改变都将包括在本申请案的精神和范围以及随附权利要求书的范围内。所有本文所引用的公开案、专利和专利申请案均出于所有目的以引用的方式全文并入本文中。
Claims (17)
1.一种具有通式A-L-B的化合物,其中:A代表包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽;L代表连接基团或聚合物;且B代表可分离的分子。
2.根据权利要求2所述的化合物,其中A-L-B的一或多个组分在L水解之后变得有活性。
3.根据权利要求3所述的化合物,其中变得有活性的所述A-L-B的组分选自由以下组成的群组:A、B或(A以及B)。
4.根据权利要求2所述的化合物,其中连接基团L在生理条件下水解。
5.根据权利要求2所述的化合物,其中所述连接基团L以酶促方式裂解。
6.根据权利要求2所述的化合物,其中所述连接基团L利用酸性pH值水解。
7.根据权利要求2所述的化合物,其中所述连接基团L利用辐射水解。
8.根据权利要求2所述的化合物,其中所述连接基团L在目标部位处水解。
9.根据权利要求1所述的化合物,其中所述可分离的分子B选自由以下组成的群组:生物活性部分和生物惰性部分。
10.一种具有通式A::B的化合物,其中:A代表包含一或多个非天然编码氨基酸的多肽;“::”代表B的官能团与A中存在的非天然氨基酸之间的键;且B代表可分离的分子。
11.根据权利要求10所述的化合物,其中A-::B的一或多个组分在“::”水解之后变得有活性。
12.根据权利要求11所述的化合物,其中变得有活性的所述A::B的组分选自由以下组成的群组:A、B或(A以及B)。
13.根据权利要求11所述的化合物,其中“::”在生理条件下水解。
14.根据权利要求11所述的化合物,其中“::”利用酸性pH值水解。
15.根据权利要求11所述的化合物,其中“::”利用辐射水解。
16.根据权利要求11所述的化合物,其中“::”在目标部位处水解。
17.根据权利要求10所述的化合物,其中所述可分离的分子B选自由以下组成的群组:生物活性部分和生物惰性部分。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141224 |