TW201446804A - 新穎多肽小分子結合物及其用途 - Google Patents

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Tsotne Javahishvili
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Abstract

提供新穎多肽小分子結合物(PSMC)及其用途。

Description

新穎多肽小分子結合物及其用途
本發明是關於包含至少一種非天然編碼之胺基酸之新穎多肽小分子結合物。本發明大體而言是關於藉由分子生物學方法，使用化學及重組DNA來產生及選擇抗原結合及雙特異性多肽之領域。
天然產生之抗體(Ab)為由兩條相同的免疫球蛋白(Ig)重鏈及兩條相同的輕鏈組成之四聚體結構。Ab之重鏈及輕鏈由不同結構域組成。各輕鏈具有一個可變結構域(VL)及一個恆定結構域(CL)，而各重鏈具有一個可變結構域(VH)及三個或四個恆定結構域(CH)。各結構域由約110個胺基酸殘基組成，經摺疊成由兩個彼此抵靠堆疊的β片形成之特徵β夾心結構，即免疫球蛋白摺疊。VL結構域各具有三個互補決定區(CDR1-3)，且VH結構域各具有多達四個互補決定區(CDR1-4)，該等互補決定區為在結構域的一端連接β股的環或轉角。輕鏈及重鏈之可變區一般有助於抗原特異性，不過個別鏈對於特異性之貢獻不必要相等。抗體分子已發展為藉由使用隨機化CDR環結合於大量分子。
Ab之功能子結構可藉由蛋白水解及藉由重組方法製 備。其包括Fab片段，該片段包含藉由單一鏈間雙硫鍵接合的重鏈VH-CH1結構域及輕鏈VL-CL1結構域；及Fv片段，該片段僅包含VH及VL結構域；及Fc部分，該部分包含該分子之非抗原結合區。在一些情形下，單一VH結構域保留對於抗原的顯著親和力(Ward等人，1989,Nature 341,554-546)。亦已顯示，特定單體κ輕鏈將特異性地結合於其抗原。(L.Masat等人，1994,PNAS 91：893-896)。有時發現分離之輕鏈或重鏈亦保留一些抗原結合活性(Ward等人，1989,Nature 341,554-546)。
另一功能子結構為單鏈Fv(scFv)，其包含免疫球蛋白重鏈及輕鏈的可變區，該等可變區藉由肽連接子共價連接(S-z Hu等人，1996,Cancer Research,56,3055-3061)。此等小(Mr 25,000)蛋白質一般在單一多肽中保留對抗原之特異性及親和力，且可提供用於較大抗原特異性分子之便利構築嵌段。scFv在循環中之短半衰期限制其在多種情形中之治療效用。
使用Ig VH結構域之一部分作為模板來設計稱為「微型抗體」之小蛋白質骨架(Pessi等人，1993,Nature 362,367-369)。對介白素-6具有高親和力(解離常數(Kd)約為10-7M)之微型抗體藉由隨機化對應於VH的CDR1及CDR2之環且接著使用噬菌體呈現方法選擇突變體來鑑別(Martin等人，1994,EMBO J.13,5303-5309)。
當分析來自駱駝血清之IgG樣物質時，駱駝通常缺乏輕鏈可變結構域，表明足夠抗體特異性及親和力可源於單獨VH結構域(三個或四個CDR環)。已製得具有高親和力之「駱駝化」VH結構域，且高特異性可藉由僅隨機化CDR3來產生。
「微型抗體」之替代物為「雙功能抗體」。雙功能抗 體為小的二價及雙特異性抗體片段，其具有兩個抗原結合位點。該等片段包含連接於同一多肽鏈(VH-VL)上之輕鏈可變結構域(VL)的重鏈可變結構域(VH)。雙功能抗體的大小類似於Fab片段。藉由使用過短而無法允許同一鏈上的兩個結構域之間配對之連接子，迫使該等結構域與另一鏈的互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。此等二聚體抗體片段或「雙功能抗體」為二價及雙特異性的。參見P.Holliger等人，PNAS 90：6444-6448(1993)。
已製得CDR肽及有機CDR模擬物(Dougall等人，1994,Trends Biotechnol.12,372-379)。CDR肽為對應於抗體CDR環之胺基酸序列的短、典型地環狀肽。CDR環負責抗體-抗原相互作用。CDR肽及有機CDR模擬物已顯示保留一些結合親和力(Smyth及von Itzstein,1994,J.Am.Chem.Soc.116,2725-2733)。小鼠CDR已接枝至人類Ig構架上而不損失親和力(Jones等人，1986,Nature 321,522-525；Riechmann等人，1988)。
在體內，選擇特異性Ab且自大的文庫擴增(親和力成熟)。該等過程可使用組合文庫技術在活體外再現。Ab片段在噬菌體表面上之成功呈現已使得可能產生及篩選大量CDR突變(McCafferty等人，1990,Nature 348,552-554；Barbas等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,7978-7982；Winter等人，1994,Annu.Rev.Immunol.12,433-455)。藉由此技術產生愈來愈多之Fab及Fv(及其衍生物)。該組合技術可與Ab模擬物組合。
可能潛在充當蛋白質骨架之大量蛋白質結構域已表現為與噬菌體衣殼蛋白之融合物。在Clackson及Wells,Trends Biotechnol.12：173-184(1994)中回顧。若干此等蛋白質結構域已經用作呈現隨機肽序列之骨架，包括牛胰臟胰蛋白酶抑制劑 (Roberts等人，PNAS 89：2429-2433(1992))、人類生長激素(Lowman等人，Biochemistry 30：10832-10838(1991)，Venturini等人，Protein Peptide Letters 1：70-75(1994))及鏈球菌之IgG結合結構域(O'Neil等人，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb,L編)第517-524頁，Academic Press,San Diego(1994))。此等骨架已呈現單一隨機化環或區域。澱粉酶抑肽(Tendamistat)已用作絲狀噬菌體M13上之呈遞骨架(McConnell及Hoess,1995,J.Mol.Biol.250：460-470)。
ErbB家族之受體酪胺酸激酶在細胞生長及分化中起 至關重要的作用。此等受體之異常活化與人類癌症相關。二聚化(受體配對)為所有ErbB受體的信號傳導活性所必需的。已顯示，阻斷ErbB2二聚化活性直接抑制ErbB2與其他ErbB受體蛋白二聚化之能力。抑制受體二聚化阻止ErbB信號傳導路徑之活化。 下調ErbB信號傳導之拮抗分子可充當抗腫瘤劑。ErbB信號傳導網路目前為開發抗腫瘤藥物之主要目標。ErbB-1為EGF之特異性受體，而ErbB-2具有未知之天然配位體。ErbB2在添加EGF時能夠與ErbB-1形成雜二聚體。ErbB2亦充當激酶死亡ErbB-3及ErbB-4之較佳二聚化搭配物，ErbB-3及ErbB-4均為神經調節素之受體。ErbB信號傳導網路亦可在信號傳導期間藉由細胞因子及G偶合蛋白受體配位體以間接方式活化，指示其在多種不同細胞類型之生長控制中起重要作用。
原癌基因c-erbB-1編碼表皮生長因子受體。其名稱 源於自禽類紅血球母細胞增多症病毒(avian erythroblastosis virus，AEV)分離之病毒同系物v-erbB，其作為缺乏胺基端配位體結合結構域之雞c-ErbB-1基因的片段含於該病毒中。erbB-1基因之過 度表現發生於多種腫瘤中，包括各種位點之鱗狀癌及腺癌。人類c-erbB-1基因位於染色體區域7p14及7p12中。
ErbB-2原癌基因(亦稱為Neu、EGFR-2或HER-2) 為跨膜受體酪胺酸激酶家族之成員，該家族亦包括EGF受體及EGFR-3(HER-3或ErbB-3)。ErbB-2編碼具有固有酪胺酸激酶活性之185kDa跨膜受體樣醣蛋白。儘管ErbB-2並不具有任何已知高親和力配位體，但其激酶活性可藉由過度表現或與ErbB家族受體之其他成員異質結合而在無配位體的情況下活化。ErbB-2基因之擴增及其產物之過度表現已在幾乎40%之原發性人類乳房腫瘤中偵測到。ErbB-2過度表現亦在卵巢癌、胃癌、唾液腺癌及非小細胞肺癌中觀察到。ErbB-2藉由與神經調節素受體ErbB-3及ErbB-4形成雜二聚體之神經調節素活化。人類化抗ErbB-2單株抗體Herceptin(來自單株4D5)已得到FDA批准而用於治療過度表現ErbB-2之癌症。正在開發之另一抗ErbB2抗體為帕妥珠單抗(Pertuzumab)(來自單株2C4)。ErbB-1(EGF受體)之酪胺酸激酶活性之特異性抑制劑亦在臨床試驗中。
抗ErbB2抗體為此項技術中已知的，且包括(但不 限於)美國專利第4,753,894號、第5,169,774號、第5,677,171號、第5,720,937號、第5,720,954號、第5,725,856號、第5,770,195號、第5,772,997號、第5,783,186號、第6,054,561號、第6,165,464號、第6,333,169號、第6,015,567號、第6,387,371號、第6,399,063號、第6,441,143號、第6,458,356號、第6,627,196號，各專利均以引用之方式併入本文中。
葉酸受體1(FOLR1)亦稱為葉酸受體-α或葉酸結合 蛋白，為在細胞之質膜上表現之N-糖基化蛋白質。FOLR1對葉酸 及若干經還原之葉酸衍生物具有高親和力。FOLR1介導生理葉酸5-甲基四氫葉酸遞送至細胞內部。
FOLR1在大多數卵巢癌中以及在多種子宮癌、子宮 內膜癌、胰臟癌、腎癌、肺癌及乳癌中過度表現，而FOLR1在正常組織上之表現侷限於腎臟近端小管、肺之肺泡細胞、膀胱、睾丸、脈絡叢及甲狀腺中之上皮細胞的頂膜(Weitman S D等人，Cancer Res 52：3396-3401(1992)；Antony A C,Annu Rev Nutr 16：501-521(1996)；Kalli K R等人Gynecol Oncol 108：619-626(2008))。FOLR1之此表現模式使其成為FOLR1導向之癌症療法的所需目標。
因為卵巢癌典型地為無症狀的直至晚期，故其通常 在末期經診斷且當用目前可用程序，典型地為手術減積之後化學治療藥物治療時具有不良預後(von Gruenigen V等人，Cancer 112：2221-2227(2008)；Ayhan A等人，Am J Obstet Gynecol 196：81e81-86(2007)；Harry V N等人，Obstet Gynecol Surv 64：548-560(2009))。因此，存在對於卵巢癌之更有效治療劑之明確、未滿足的醫學需要。
共價連接親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫為PEG)為 增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治療半衰期，調節免疫原性，調節生物活性或延長多種生物活性分子(包括蛋白質、肽和尤其疏水性分子)之循環時間的方法。PEG已廣泛用於醫藥品、人工植入物及其他應用中，在該等其他應用中生物相容性、缺乏毒性及缺乏免疫原性為重要的。為了使PEG之所需特性最大化，連接於生物活性分子之PEG聚合物的總分子量及水合狀態必須足夠高以賦予典型地與PEG聚合物連接相關的有利特 徵(諸如增加之水溶性及循環半衰期)，而不會不利地影響母體分子之生物活性。
PEG衍生物通常經由諸如離胺酸、半胱胺酸及組胺酸殘基、N端及碳水化合物部分之反應性化學官能基鍵聯於生物活性分子。蛋白質及其他分子通常具有有限數目的可用於聚合物連接之反應性位點。最適合於經由聚合物連接而進行修飾的位點通常在受體結合中起重要作用，且為保留分子生物活性所必需。因此，聚合物鏈與生物活性分子上之該等反應性位點之不加選擇的連接通常導致經聚合物修飾之分子的生物活性顯著降低或甚至完全損失。R.Clark等人，(1996),J.Biol.Chem.,271：21969-21977。為了形成具有足以對標靶分子賦予所需優勢之聚合物分子量的結合物，先前技術方法已典型地涉及眾多聚合物臂與分子之隨機連接，藉此增加母體分子生物活性降低或甚至完全損失之風險。
形成用於PEG衍生物與蛋白質連接的基因座之反應性位點由蛋白質結構決定。包括酶在內之蛋白質由各種α-胺基酸序列構成，其具有一般結構H2N--CHR--COOH。一個胺基酸之α胺基部分(H2N--)接合於鄰近胺基酸之羧基部分(--COOH)以形成醯胺鍵聯，可表示為--(NH--CHR--CO)n--，其中下表「n」可等於數百或數千。由R表示之片段可含有用於蛋白質生物活性及用於PEG衍生物連接之反應性位點。
舉例而言，在胺基酸離胺酸之情況下，在ε位置中以及在α位置中存在--NH2部分。ε--NH2對於在鹼性pH條件下之反應而言為游離的。用PEG進行蛋白質衍生化的領域的多種技術已有關於開發PEG衍生物來連接於存在於蛋白質中的離胺酸殘基之ε--NH2部分。「Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation」,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003，第1-17頁。此等PEG衍生物均具有一般限制，然而其無法選擇性地安裝於蛋白質表面上所存在的通常眾多離胺酸殘基中。在離胺酸殘基對於蛋白質活性重要的情況下，例如存在於酶活性位點中，或在離胺酸殘基在介導蛋白質與其他生物分子之相互作用中起作用的情況下，如在受體結合位點之情況下，這可為顯著限制。
現有蛋白質PEG化方法之第二個且同等重要的複雜因素在於PEG衍生物可與所需殘基之外的殘基發生不良副反應。組胺酸含有由結構--N(H)--所表示之反應性亞胺基部分，但多種與ε--NH2反應之化學反應性物質亦可與--N(H)--反應。同樣，胺基酸半胱胺酸之側鏈具有由結構-SH所表示之游離巰基。在一些情況下，針對離胺酸ε--NH2基團之PEG衍生物亦與半胱胺酸、組胺酸或其他殘基反應。此舉可產生PEG衍生之生物活性分子的複雜、異源混合物，及破壞所靶向之生物活性分子的活性之風險。需要開發允許化學官能基引入蛋白質內之單一位點處之PEG衍生物，因而能夠使一或多個PEG聚合物與蛋白質表面上明確定義且可預測的特異性位點處之生物活性分子選擇性偶合。
除離胺酸殘基之外，此項技術中的大量工作亦已針對開發靶向其他胺基酸側鏈(包括半胱胺酸、組胺酸及N端)之活化PEG試劑。參見例如美國專利第6,610,281號，其以引用之方式併入本文中；及「Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation」,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003，第1-17頁。可使用定點突變誘發及此項技術中已知之其他技術將半胱胺酸殘基位點選擇性地引入蛋白質結構中，且所得游離巰基部分可與具有硫醇反應性官能基之PEG衍生物反應。然而， 此方法之複雜之處在於引入游離巰基可使所得蛋白質之表現、摺疊及穩定性變得複雜。因此，需要具有將化學官能基引入生物活性分子中之方法，以便能夠使一或多個PEG聚合物與蛋白質選擇性偶合，而同時與巰基及其他典型地發現於蛋白質中之化學官能基可相容(亦即，不與其發生不良副反應)。
如自此項技術中之取樣可見，已證實，所開發出的 用於連接於蛋白質側鏈、尤其離胺酸胺基酸側鏈上之--NH2部分及半胱胺酸側鏈上之-SH部分之此等衍生物中的多種在其合成及使用中存在問題。一些與遭受水解之蛋白質形成不穩定鍵聯，且因此分解、降解或在其他情況下在水性環境中，諸如在血流中不穩定。一些形成更穩定鍵聯，但在形成該鍵聯之前遭受水解，意謂PEG衍生物上之反應性基團可在蛋白質可經連接之前去活化。 一些具有少許毒性且因此不太適合在活體內使用。一些反應過慢而實際上不可用。一些因為連接於負責蛋白質活性之位點而導致蛋白質活性損失。一些對其將連接的位點不具特異性，這亦可導致所需活性損失及結果再現性缺乏。為了克服與用聚(乙二醇)部分修飾蛋白質相關的難題，已開發出更為穩定之PEG衍生物(例如美國專利6,602,498，其以引用之方式併入本文中)或與分子及表面上之硫醇部分選擇性反應的PEG衍生物(例如美國專利6,610,281，其以引用之方式併入本文中)。此項技術中明確地需要在生理環境中呈化學惰性直至指定選擇性反應以形成穩定化學鍵的PEG衍生物。
最近，已報導一種蛋白質科學中之完全新型技術，其允諾克服與蛋白質位點特異性修飾相關之多種限制。特定言之，已將新組分添加至原核生物大腸桿菌(Escherichia coli)(E.coli) (例如L.Wang等人，(2001),Science 292：498-500)及真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)(S.cerevisiae)(例如J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))之蛋白質生物合成機構中，使得能夠將非遺傳編碼胺基酸活體內併入蛋白質中。已使用此方法有效且高保真地將多種具有新穎化學、物理或生物特性之新胺基酸(包括光親和力標記及光可異構化胺基酸、酮基胺基酸及糖基化胺基酸)併入響應於琥珀密碼子TAG之大腸桿菌及酵母中。參見例如J.W.Chin等人，(2002),Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin及P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002),PNAS United States of America 99：11020-11024；及L.Wang及P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1-10。此等研究已證實，可能選擇性地且常規地引入在蛋白質中未發現、對在20種常見的遺傳編碼胺基酸中之所有官能基呈化學惰性且可用於有效地且選擇性地反應以形成穩定共價鍵聯之化學官能基，諸如酮基、炔基及疊氮部分。
將非遺傳編碼胺基酸併入蛋白質中之能力允許引入 可提供天然存在之官能基(諸如離胺酸之ε-NH2、半胱胺酸之巰基-SH、組胺酸之亞胺基等)的有價值替代物之化學官能基。已知某些化學官能基對發現於20種常見遺傳編碼胺基酸中之官能基呈惰性，但明確地且有效地反應以形成穩定鍵聯。舉例而言，此項技術中已知疊氮基及乙炔基在存在催化量之銅的情況下在水性條件中遭受Huisgen[3+2]環加成反應。參見例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；及Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。舉例而言，藉由將疊氮部分 引入蛋白質結構中，能夠併入對發現於蛋白質中之胺、巰基、羧酸、羥基呈化學惰性、但亦與乙炔部分平穩地且有效地反應以形成環加成產物之官能基。重要的是，在不存在乙炔部分之情況下，疊氮在存在其他蛋白質側鏈的情況下及在生理條件下保留化學惰性及非反應性。
本發明尤其致力於解決與抗原結合多肽及其片段及 尤其多肽小分子結合物之活性及產生相關的問題，且亦致力於具有改良生物或藥理學特性(諸如改良治療半衰期)之抗原結合多肽及多肽小分子結合物之產生。
本發明提供包含一或多個非天然編碼胺基酸之多肽小分子結合物(PSMC)。在一些實施例中，PSMC包含完整抗體重鏈。在一些實施例中，PSMC包含完整抗體輕鏈。在一些實施例中，PSMC包含抗體輕鏈之可變區。在一些實施例中，PSMC包含抗體重鏈之可變區。在一些實施例中，PSMC包含抗體輕鏈之至少一個CDR。在一些實施例中，PSMC包含PSMC抗體重鏈之至少一個CDR。在一些實施例中，PSMC包含輕鏈之至少一個CDR及重鏈之至少一個CDR。在一些實施例中，PSMC包含Fab。在一些實施例中，PSMC包含兩個或兩個以上Fab。在一些實施例中，PSMC包含scFv。在一些實施例中，PSMC包含兩個或兩個以上scFv。在一些實施例中，PSMC包含微型抗體。在一些實施例中，PSMC包含兩個或兩個以上微型抗體。在一些實施例中，PSMC包含雙功能抗體。在一些實施例中，PSMC包含兩個或兩個以上雙功能抗體。在一些實施例中，PSMC包含輕鏈可變區及重鏈可變區。在一些實施例中，PSMC包含完整輕鏈及完整重鏈。 在一些實施例中，PSMC包含一或多個Fc結構域或其部分。在一些實施例中，PSMC包含任何上述實施例之組合。在一些實施例中，PSMC包含任何上述實施例之均二聚體、雜二聚體、均多聚體或雜多聚體。在一些實施例中，PSMC包含結合於結合搭配物之多肽，其中該結合搭配物包含抗原、多肽、核酸分子、聚合物或其他分子或物質。在一些實施例中，PSMC與非抗體骨架分子或物質相關。
在一些實施例中，PSMC包含一或多個轉譯後修飾。在一些實施例中，PSMC鍵聯於連接子、聚合物或生物活性分子。在一些實施例中，PSMC鍵聯於雙官能聚合物、雙官能連接子或至少一個額外PSMC。在一些實施例中，PSMC鍵聯於非PSMC之多肽。在一些實施例中，包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽鍵聯於一或多個亦可包含非天然編碼胺基酸之額外抗原結合多肽。在一些實施例中，包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽鍵聯於一或多個亦可包含非天然編碼胺基酸之多肽小分子結合物。在一些實施例中，包含非天然編碼胺基酸之PSMC鍵聯於一或多個亦可包含非天然編碼胺基酸之額外抗原結合多肽。
在一些實施例中，非天然編碼胺基酸鍵聯於水溶性聚合物。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物鍵聯於第二多肽。在一些實施例中，第二多肽為抗原結合多肽。在一些實施例中，第二多肽為PSMC。
在一些實施例中，抗原結合多肽包含至少兩個鍵聯於包含聚(乙二醇)部分之水溶性聚合物的胺基酸。在一些實施例中，至少一個胺基酸為非天然編碼胺基酸。
在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取 代、添加或缺失之抗原結合多肽的親和力相比時，調節抗原結合多肽對抗原之親和力之取代、添加或缺失。在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取代、添加或缺失之抗原結合多肽的穩定性相比時，增加抗原結合多肽之穩定性之取代、添加或缺失。 在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取代、添加或缺失之抗原結合多肽的免疫原性相比時，調節抗原結合多肽之免疫原性之取代、添加或缺失。在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取代、添加或缺失之抗原結合多肽的血清半衰期或循環時間相比時，調節抗原結合多肽之血清半衰期或循環時間之取代、添加或缺失。
在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取 代、添加或缺失之抗原結合多肽的水溶性相比時，增加對應抗原結合多肽之水溶性之取代、添加或缺失。在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取代、添加或缺失之抗原結合多肽的溶解性相比時，增加宿主細胞中所產生的抗原結合多肽之溶解性之取代、添加或缺失。在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取代、添加或缺失之抗原結合多肽的表現相比時，增加宿主細胞中或活體外所合成的抗原結合多肽之表現之取代、添加或缺失。在一些實施例中，抗原結合多肽包含當與對應無取代、添加或缺失之抗原結合多肽的蛋白酶抗性相比時，增加抗原結合多肽之蛋白酶抗性之取代、添加或缺失。
在一些實施例中，可用天然存在或非天然存在胺基 酸進行PSMC中之胺基酸取代，其限制條件在於至少一個取代是用非天然編碼胺基酸進行的。
在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含羰基、乙醯基、胺氧基、肼基、醯肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。
在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸具有以下結構：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經取代烷基及經取代芳基；且R3為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R4為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含胺氧基。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含醯肼基。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含肼基。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸殘基包含胺基脲基。
在一些實施例中，非天然編碼胺基酸殘基包含疊氮基。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸具有以下結構：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基、經取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含炔基。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸具有以下結構：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基； X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，多肽為抗原至少一種活性之激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑。在一些實施例中，激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑包含鍵聯於水溶性聚合物之非天然編碼胺基酸。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，激動劑、部分激動劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向激動劑包含非天然編碼胺基酸及一或多種轉譯後修飾、連接子、聚合物或生物活性分子。
本發明亦提供包含編碼抗原結合多肽之聚核苷酸之經分離核酸，其中聚核苷酸包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限於)SEQ ID NO：19、21)或其片段。本發明亦提供包含編碼抗原結合多肽之聚核苷酸之經分離核酸，其中聚核苷酸包含至少一個選擇密碼子，其包括(但不限於)SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21。在一些實施例中，選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、乳白密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子及四鹼基密碼子組成之群。
出於本發明之目的，應瞭解經修飾抗體可包含任何類型之可變區，該可變區可提供該抗體與人類FOLR1之多肽的結合。就此而言，可變區可包含或源自任何類型之哺乳動物，其可經誘導以引起體液反應且產生針對所需腫瘤相關抗原之免疫球蛋白。因而，經修飾抗體之可變區可具有例如人類、鼠類、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴、獼猴等)或狼起源。在一些實施例中，經修飾免疫球蛋白之可變區及恆定區均為人類的。在其他實 施例中，相容性抗體之可變區(通常源自非人類來源)可經工程改造或特異性定製以改良結合特性或降低分子免疫原性。就此而言，可用於本發明之可變區可經人類化或藉由包括輸入之胺基酸序列而以其他方式改變。
在某些實施例中，重鏈及輕鏈兩者中之可變結構域 藉由一或多個CDR之至少部分置換及必要時藉由部分構架區置換及序列變化而改變。儘管CDR可源自與產生構架區之抗體相同類別或甚至子類之抗體，但預計CDR將源自不同類別之抗體且在某些實施例中源自不同物種之抗體。可能不必需用來自供體可變區之完整CDR置換所有CDR來轉移一個可變結構域之抗原結合能力至另一可變結構域。更確切地，可能僅必需轉移維持抗原結合位點活性所必需之彼等殘基。已知美國專利第5,585,089號、第5,693,761號及第5,693,762號中陳述之解釋，藉由進行常規實驗或藉由試驗及誤差測試以獲得具有降低之免疫原性的功能抗體完全在熟習此項技術者之能力內。
雖然可變區存在改變，但熟習此項技術者應瞭解， 本發明之經修飾抗體將包含當與包含原生或未改變恆定區之近似相同免疫原性的抗體相比時，其中一或多個恆定區結構域之至少一部分已缺失或以其他方式改變以提供所需生物化學特徵(諸如增加之腫瘤定位或降低之血清半衰期)的抗體(例如全長抗體或其免疫反應性片段)。在一些實施例中，經修飾抗體之恆定區將包含人類恆定區。可與本發明相容之恆定區修飾包含一或多個結構域中之一或多個胺基酸的添加、缺失或取代。亦即，本文所揭示之經修飾抗體可包含三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2或CH3)及/或輕鏈恆定結構域(CL)中一或多者之改變或修飾。在一些 實施例中，涵蓋其中一或多個結構域部分地或完全地缺失之經修飾恆定區。在一些實施例中，經修飾抗體將包含其中整個CH2結構域已經移除之結構域缺失構築體或變異體(△CH2構築體)。在一些實施例中，經刪除之恆定區結構域將由短胺基酸間隔子(例如10個殘基)置換，該間隔子提供典型地由缺失恆定區賦予之一些分子柔順性。
除其組態以外，此項技術中已知恆定區介導數種效應功能。舉例而言，補體之C1組分與抗體之結合活化補體系統。補體活化在細胞病原體之調理及溶解中很重要。補體活化亦刺激發炎反應且亦可牽涉於自體免疫過敏中。此外，抗體經由Fc區結合於細胞，其中抗體Fc區上之Fc受體位點結合於細胞上之Fc受體(FcR)。存在多種對不同類別之抗體，包括IgG(γ受體)、IgE(η受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)具特異性之Fc受體。抗體與細胞表面上之Fc受體的結合觸發多種重要且不同的生物反應，包括經抗體塗覆之粒子的坍陷及破壞、免疫複合物之清除、經抗體塗覆之標靶細胞由殺死細胞溶解(稱為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性或ADCC)、發炎介體之釋放、免疫球蛋白產生的胎盤轉移及控制。
本發明亦提供製造鍵聯於水溶性聚合物之抗原結合多肽之方法。在一些實施例中，該方法包含使經分離之包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽與包含與該非天然編碼胺基酸反應的部分之水溶性聚合物接觸。在一些實施例中，併入抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸對水溶性聚合物具反應性，而該水溶性聚合物在其他情況下對20種常見胺基酸中之任一者無反應性。在一些實施例中，併入抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸對連接 子、聚合物或生物活性分子具反應性，而該連接子、聚合物或生物活性分子在其他情況下對20種常見胺基酸中之任一者無反應性。
在一些實施例中，鍵聯於水溶性聚合物之抗原結合多肽藉由使包含含羰基胺基酸之抗原結合多肽與包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基團之聚(乙二醇)分子反應來製備。在一些實施例中，胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基團經由醯胺鍵聯鍵聯於聚(乙二醇)分子。
在一些實施例中，鍵聯於水溶性聚合物之抗原結合多肽藉由使包含羰基之聚(乙二醇)分子與包含有包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基團之非天然編碼胺基酸的多肽反應來製備。
在一些實施例中，鍵聯於水溶性聚合物之抗原結合多肽藉由使包含含炔胺基酸之抗原結合多肽與包含疊氮部分之聚(乙二醇)分子反應來製備。在一些實施例中，疊氮或炔基團經由醯胺鍵聯鍵聯於聚(乙二醇)分子。
在一些實施例中，鍵聯於水溶性聚合物之抗原結合多肽藉由使包含含疊氮胺基酸之抗原結合多肽與包含炔部分之聚(乙二醇)分子反應來製備。在一些實施例中，疊氮或炔基團經由醯胺鍵聯鍵聯於聚(乙二醇)分子。
在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有在約0.1kDa與約100kDa之間之分子量。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有在0.1kDa與50kDa之間之分子量。
在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為分支聚合物。在一些實施例中，聚(乙二醇)分支聚合物之各分支具有在1kDa與100kDa之間或在1kDa與50kDa之間之分子量。
在一些實施例中，鍵聯於抗原結合多肽之水溶性聚 合物包含聚伸烷基二醇部分。在一些實施例中，併入抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸殘基包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼、胺基脲基、疊氮基或炔基。在一些實施例中，併入PSMC中之非天然編碼胺基酸殘基包含羰基部分且水溶性聚合物包含胺氧基、醯肼、肼或胺基脲部分。在一些實施例中，併入抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸殘基包含炔部分且水溶性聚合物包含疊氮部分。在一些實施例中，併入抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸殘基包含疊氮部分且水溶性聚合物包含炔部分。
本發明亦提供包含包含非天然編碼胺基酸之抗原結 合多肽及醫藥學上可接受之載劑的組合物。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸鍵聯於水溶性聚合物。
本發明亦提供包含編碼抗原結合多肽且包含選擇密 碼子之聚核苷酸之細胞。在一些實施例中，該等細胞包含用於將非天然編碼胺基酸取代入抗原結合多肽中之正交RNA合成酶及/或正交tRNA。
本發明亦提供製造包含非天然編碼胺基酸之抗原結 合多肽之方法。在一些實施例中，該等方法包含在允許抗原結合多肽表現之條件下培養包含編碼抗原結合多肽之聚核苷酸、正交RNA合成酶及/或正交tRNA之細胞；及自細胞及/或培養基純化抗原結合多肽。
本發明亦提供增加抗原結合多肽之治療半衰期、血 清半衰期或循環時間的方法。本發明亦提供調節抗原結合多肽之免疫原性的方法。在一些實施例中，該等方法包含用非天然編碼胺基酸取代天然存在之抗原結合多肽中的任何一或多種胺基酸， 及/或將抗原結合多肽鍵聯於連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
本發明亦提供用有效量之本發明抗原結合多肽治療 需要該治療之患者的方法。在一些實施例中，該等方法包含向患者投與治療有效量之包含包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸鍵聯於水溶性聚合物。
本發明亦提供包含SEQ ID NO：18、20中所示序列、 其片段或SEQ ID NO：19、21中完全或部分所示之聚核苷酸及其片段或任何其他抗原結合多肽序列的抗原結合多肽，除了至少一個胺基酸由非天然編碼胺基酸取代。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸鍵聯於水溶性聚合物。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。
本發明亦提供包含醫藥學上可接受之載劑及抗原結 合多肽之醫藥組合物，該抗原結合多肽包含SEQ ID NO：18、20中所示序列。本發明亦提供包含由聚核苷酸編碼之多肽及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物，其中該抗原結合多肽由SEQ ID NO：19、21中所示序列編碼。本發明亦提供包含具有非天然編碼胺基酸之SP34序列之抗原結合多肽。本發明亦提供包含具有非天然編碼胺基酸之Mabtech CD3-1序列之抗原結合多肽。本發明亦提供包含具有一種以上非天然編碼胺基酸之SP34序列之抗原結合多肽。本發明亦提供包含具有一種以上非天然編碼胺基酸之Mabtech CD3-1序列之抗原結合多肽。本發明亦提供包含醫藥學上可接受之載劑及包含SEQ ID NO：18、20中所示序列、其片段 或SEQ ID NO：19、21中完全或部分所示之聚核苷酸及其片段或任何其他抗原結合多肽序列的抗原結合多肽(其中至少一個胺基酸由非天然編碼胺基酸取代)之醫藥組合物。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含醣部分。在一些實施例中，水溶性聚合物經由醣部分鍵聯於多肽。在一些實施例中，連接子、聚合物或生物活性分子經由醣部分鍵聯於抗原結合多肽。
本發明亦提供包含藉由共價鍵鍵聯於抗原結合多肽 之單一胺基酸處的水溶性聚合物之抗原結合多肽。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，共價鍵聯於水溶性聚合物之胺基酸為存在於多肽中之非天然編碼胺基酸。
本發明提供包含至少一個連接子、聚合物或生物活 性分子之抗原結合多肽，其中該連接子、聚合物或生物活性分子藉由經核糖體併入多肽中的非天然編碼胺基酸之官能基連接於多肽。在一些實施例中，多肽經單PEG化。本發明亦提供包含連接於一或多個非天然編碼胺基酸之連接子、聚合物或生物活性分子之PSMC多肽，其中該非天然編碼胺基酸經核糖體併入多肽中的預選位點處。
在另一實施例中，由於用於與非天然胺基酸結合之 獨特化學反應，因此包含一或多個非天然存在胺基酸之抗原結合多肽與另一分子(包括(但不限於)PEG)之結合提供實質上純化之抗原結合多肽。可執行包含一或多個非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽與另一分子(例如PEG)的結合，且在結合步驟之前或之後執行其他純化技術以提供實質上純的抗原結合多肽。
圖1--顯示抗體分子(IgG)及其抗原結合部分之一般結構圖。CDR含於抗原識別位點內。
圖2--顯示用於scFv-108周質(圖2，圖A)及細胞質(圖2，圖B)表現/抑制之構築體。指示琥珀終止密碼子之位置。
顯示用於Fab-108片段(圖2，圖C)表現/抑制之雙順反子卡匣。顯示用於scFv-4D5片段周質表現/抑制之構築體(圖2，圖D及圖E)。顯示用於Fab-4D5片段表現/抑制之順反子(圖2，圖F)。
圖3--顯示GlySer連接子(S131Am)之第二絲胺酸中琥珀突變的抑制(圖3，圖A)及相應含pAcF之scFv的IMAC純化分析(圖3，圖B)。
圖4--顯示scFv細胞質表現期間VL鏈(L156)中之琥珀突變抑制。
圖5--圖5圖A顯示pAcF-scFv-108片段之PEG化及二聚化。分別用單箭頭及雙箭頭指示單PEG化scFv及二聚體之位置。圖5圖B顯示pAcF-scFv-108片段-(S136)之PEG化。圖5圖C顯示未觀察到WT scFv片段之PEG化。
圖6--顯示說明在scFv-108均二聚體純化期間所收集之溶離份之凝膠。
圖7--圖7圖A-C顯示含pAcF或pAcF-PEG scFv蛋白質與表現EGF受體之A431細胞的結合。
圖8--圖8圖A顯示說明mAb 108之含pAcF及pAcF-PEG Fab片段之凝膠。圖8圖B-D顯示mAb 108之Fab片段與表現EGF受體之A431細胞的結合。
圖9--顯示本發明之異源雙官能PSMC之實例。
圖10--顯示說明C端(圖10，圖A)或N端scFv-4D5(圖10，圖B)片段之GlySer連接子之第二絲胺酸中琥珀突變的抑制之凝膠。
圖11--顯示在還原及非還原條件下pAcF-Fab-4D5-(K139)及Fab-4D5-cys之SDS-PAGE分析(圖11，圖A)。圖11圖B顯示使用抗His抗體之圖11圖A中所示樣品的西方墨點分析。
圖12--顯示鍵聯於肽T20之HIV-1中和人類Fab 4E10。
圖13--顯示二聚化程序圖。
圖14--顯示scFv二聚體形成之非還原(圖14，圖A)及還原(圖14，圖B)SDS-PAGE分析。
圖15--顯示經純化scFv二聚體之SDS-PAGE分析。
圖16--顯示標靶細胞之T細胞接合及由抗CD3 Fab-葉酸引起之劑量依賴性毒性。圖16(A)為在經活化之人類PBMC存在下(標靶：效應細胞比率1：10)使用經抗CD3 Fab-葉酸處理之KB(FR+)、OV-90(FR+)及CAKI-1(FR-)細胞的劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性的圖形。增加濃度之抗CD3 Fab-葉酸或未結合抗CD3 Fab與標靶細胞一起在37℃及5% CO2下培育12-24h。根據製造商之方案(Cytotox 96非放射性細胞毒性分析，Promega)藉由量測自溶解之細胞釋放之LDH含量來量化細胞毒性。圖16(B)顯示SKOV-3細胞在補充有10% FBS之無葉酸RPMI-1640培養基中維持至少三個繼代，接著接種於48孔細胞培養盤中且使其附著於培養盤，之後添加經活化之人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)。抗CD3 Fab 或抗CD3 Fab-葉酸稀釋於無葉酸培養基中且以所指示濃度添加，且培育共培養物16小時。使用25x物鏡顯微鏡攝取影像。
圖17--使用雌性NOD-SCID小鼠在異種移植物模型中分析抗CD3 Fab-葉酸雙特異性試劑之活體內功效。使動物維持低葉酸膳食以降低可能與雙特異性試劑競爭之葉酸的循環血清含量。KB(FR+)或A549(FR-)細胞當與非活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：100)或活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)混合且同時注射至小鼠中時能夠形成腫瘤。與活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)混合之KB細胞植入小鼠中且接著自與腫瘤細胞植入同一天開始，小鼠每天經靜脈內注射1.5mg/kg抗CD3 Fab-葉酸或PBS，持續10天。
圖17(A)顯示來自此實驗之腫瘤體積。腫瘤體積顯示使用約5天之倍增時間，經PBS處理之小鼠中的快速增加。相比之下，經抗CD3 Fab-葉酸處理之小鼠中的腫瘤在研究持續時間期間幾乎不可偵測。在平行研究中，小鼠植入與未活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：100)混合之KB細胞且自與腫瘤細胞植入同一天開始，每天用1.5mg/kg抗CD3 Fab-葉酸或PBS經靜脈內處理，持續10天。圖17(B)顯示來自1：100標靶：效應細胞實驗之腫瘤體積。腫瘤之降低速率高於經抗CD3 Fab-葉酸處理之小鼠中。在研究第35天之後，經PBS處理之小鼠中的腫瘤體積穩固地增加，而經抗CD3 Fab-葉酸處理之小鼠中的腫瘤降低至幾乎不可偵測水準，指示細胞毒性T細胞接合以用於甚至在活化T細胞不存在下由抗CD3 Fab-葉酸結合物消除腫瘤。圖17(C)顯示來自兩個處理組之小鼠的體重變化之圖示。圖17(D)顯示三個測試組中之大鼠中隨時間 變化之血清濃度：注射1mg/kg抗CD3Fab-葉酸之大鼠；注射5mg/kg抗CD3Fab-葉酸之大鼠；及注射1mg/kg抗CD3Fab之大鼠。以常規時間間隔收集血清且由ELISA進行分析。對於抗CD3 Fab-葉酸及相應未結合突變型抗CD3 Fab而言，血清濃度以相同速率降低，血清半衰期為60min。
圖18--顯示葉酸結合物與FR及CD3之結合。圖18(A)為藉由與游離葉酸競爭而分析之葉酸-CF488與KB細胞(FR+)而非與A549細胞(FR-)之結合的圖示。細胞與含有增加濃度之結合物及100nM葉酸之培養基一起在4℃下培育30min且藉由流動式細胞測量術分析細胞結合之螢光。圖18(B)為抗CD3 Fab-CF488與Jurkat細胞(CD3+)而非與KB細胞(CD3-)之結合的圖示。細胞與增加濃度之結合物一起在4℃下培育30min且藉由流動式細胞測量術分析結合。
圖19--顯示由兩種獨立細胞毒性分析來分析抗CD3 Fab-葉酸結合物之T細胞介導之毒性。在非活化之人類PBMC存在下(標靶：效應細胞比率1：10)使用經抗CD3 Fab-葉酸處理之KB細胞(FR+)而非A549細胞(FR-)的劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性。增加濃度之抗CD3 Fab-葉酸與標靶細胞一起在37℃及5% CO2下培育12-24h。在圖19(A)中，細胞用DIO標記(綠色質膜染色)且添加碘化丙錠至1μg/mL之最終濃度。藉由流動式細胞測量術量測細胞毒性。圖19(B)顯示24小時後洗去PBMC且使用Cell Titer Glo(Promega)量測KB細胞之ATP含量的圖示。
圖20--顯示在卵巢癌模型中結合抗CD3-葉酸之ADC的活體內功效之圖示。使雌性NOD-SCID異種移植物模型小鼠維 持低葉酸膳食以降低可能與雙特異性試劑競爭之葉酸的循環血清含量。OV-90(FR+)細胞當與非活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：100)或活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)混合且同時注射至小鼠中時能夠形成腫瘤。與活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)混合之OV-90(FR+)細胞植入小鼠中且接著將小鼠分為不同處理組且每天靜脈內注射，持續細胞植入之後5天。第1組為對照組且注射媒劑(pbs)；第2組注射0.05mg/kg葉酸-抗CD3；第3組注射0.5mg/kg葉酸-抗CD3；組，1.5mg/kg抗CD3 Fab-葉酸；第4組注射5mg/kg葉酸-抗CD3；第5組注射5mg/kg未結合抗CD3。圖20(A)顯示來自此實驗之腫瘤體積。此外，腫瘤體積顯示對於經PBS及未結合抗CD3處理之小鼠中的結合葉酸之抗CD3快速增加之劑量依賴性反應。圖20(B)顯示來自各處理組之小鼠的體重變化之圖示。
圖21--顯示當用以下處理時，組合之腫瘤處理OV-90+SKOV的NOD-SCID異種移植物模型中存活百分比之圖示：第1組，媒劑(PBS)；第2組，在腫瘤植入第17天之後投與之三次注射；及第3組，在腫瘤植入次日投與之三次注射。
圖22--顯示當與過量葉酸一起投與時，在如圖22及23中所示之NCI-H838細胞及KB細胞中量測的細胞毒性百分比之圖示。
圖23--顯示各表現FOLR之細胞組(第1組：NCI-H1651；第2組：NCI-H2405；第3組：NCI-H838；第4組：NCI-H2347；第5組：KB)中細胞毒性百分比之圖示。在以ng/mL量測之不同濃度之結合UCHT1-葉酸(在此實例中包含SEQ ID NO： 18及/或20)下量測細胞毒性。顯示各個別測試組之EC50。第1組：NCI-H1651 EC50 0.22ng/mL；第2組：NCI-H2405 EC50 1.48ng/mL；第3組：NCI-H838 EC50 0.36ng/mL；第4組：NCI-H2347 EC50 .30ng/mL；第5組：KB EC50 0.024ng/mL。
定義
應瞭解，本發明不限於本文所述之特定方法、方案、細胞株、構築體及試劑，且因而可變化。亦應瞭解，本文所用術語僅用於描述特定實施例的目的，而非意欲限制本發明範疇，本發明範疇應僅由隨附申請專利範圍限制。
除非本文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，例如提及「多肽小分子結合物」或「PSMC」是提及一或多種該等蛋白質，並且包括熟習此項技術者已知的其均等物，等等。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本方面所屬領域之一般技術者通常所理解相同的含義。儘管在本發明之實踐或測試中可使用任何與本文所述相似或等同的方法、器件及材料，但現在描述較佳方法、器件及材料。
本文所提及之所有公開案及專利均以引用之方式併入本文中，以用於描述及揭示例如公開案中所述的可能與目前所述發明相關使用之構築體及方法。僅提供本文所論述之公開案在本申請案之申請日之前的揭示內容。本文決不應解釋為承認本發明者由於先前發明或任何其他原因而無權先於該揭示內容。
術語「實質上經純化」是指可實質上或基本上不含 通常伴隨於天然存在環境(亦即，在重組產生之PSMC的情況下為原生細胞或宿主細胞)中發現的蛋白質或與該蛋白質相互作用之組分的PSMC。可實質上不含細胞物質之PSMC包括具有少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%(以乾重計)污染蛋白之蛋白製劑。當藉由宿主細胞重組產生PSMC或其變異體時，該蛋白質可以約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更少之細胞乾重存在。當藉由宿主細胞重組產生PSMC或其變異體時，該蛋白質可以約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更少之細胞乾重存在於培養基中。因此，如藉由諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC及毛細管電泳之適當方法所測定，由本發明方法產生之「實質上經純化」PSMC可具有至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度水準，特定言之至少約75%、80%、85%的純度水準，且更特定言之至少約90%的純度水準，至少約95%的純度水準，至少約99%或更高的純度水準。
「重組宿主細胞」或「宿主細胞」是指無論使用何種插入方法(例如，直接攝取、轉導、f配合(f-mating)或此項技術中已知用於產生重組宿主細胞之其他方法)而包括外源聚核苷酸之細胞。外源聚核苷酸可維持為非整合載體(例如質體)，或者可整合至宿主基因組中。
如本文所用，術語「介質」包括任何培養基、溶液、 固體、半固體或可支撐或含有任何宿主細胞之剛性支撐物，該任何宿主細胞包括細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞或大腸桿菌及細胞內容物。因此，該術語可涵蓋宿主細胞已於其中生長之介質，例如PSMC已分泌於其中之介質，包括增殖步驟之前或之後的介質。該術語亦可涵蓋含有宿主細胞溶解產物之緩衝液或試劑，諸如在PSMC於細胞內產生且宿主細胞經溶解或破壞而釋放出PSMC的情況下。
如本文關於蛋白質再摺疊(protein refolding)所用之「還原劑」是定義為維持還原狀態的巰基並且還原分子內或分子間雙硫鍵之任何化合物或物質。合適之還原劑包括(但不限於)二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱胺酸、半胱胺(2-胺基乙硫醇)及還原型麩胱甘肽。一般技術者容易地瞭解，多種還原劑適合用於本發明方法及組合物中。
除非另外指示，否則如本文所用，術語「人類葉酸受體1」或「FOLR1」是指任何原生人類FOLR1。術語「FOLR1」涵蓋「全長」未加工FOLR1以及藉由在細胞內加工所產生之任何形式的FOLR1。該術語亦涵蓋FOLR1之天然存在變異體，例如剪接變異體、對偶基因變異體及同功異型物。本文所述之FOLR1多肽可自多種來源分離，諸如自人類組織類型或自另一來源分離，或藉由重組或合成方法製備。FOLR1序列之實例包括(但不限於)NCBI索引號碼P15328、NP-001092242.1、AAX29268.1、AAX37119.1、NP-057937.1及NP-057936.1。
術語「抗FOLR1抗體」或「結合於FOLR1之抗體」是指能夠以足夠親和力結合FOLR1之抗體，該親和力使得抗體可 用作靶向FOLR1之診斷及/或治療劑。抗FOLR1抗體與無關非FOLR1蛋白結合之程度小於該抗體與FOLR1之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合於FOLR1之抗體具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM或≦0.1nM之解離常數(Kd)。
術語「抗體片段」是指完整抗體之一部分且是指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「單株抗體」是指牽涉於高度特異性識別及結合單一抗原決定子或抗原決定基中之均一抗體群體。其與多株抗體形成對比，多株抗體典型地包括針對不同抗原決定子之不同抗體。術語「單株抗體」涵蓋完整及全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分之融合蛋白及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」是指以多種方式製備之該等抗體，該等方式包括(但不限於)融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及轉殖基因動物。
術語「人類化抗體」是指作為特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白之非人類(例如鼠類)抗體形式，或其含有最小非人類(例如鼠類)序列之片段。典型地，人類化抗體為人類免疫球蛋白，其中互補決定區(CDR)之殘基由非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR的具有所需特異性、親和力及能力之殘基置換(Jones等人，1986,Nature,321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature,332：323-327；Verhoeyen等人，1988,Science,239：1534-1536)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR) 殘基由來自非人類物種之具有所需特異性、親和力及能力之抗體中的相應殘基置換。人類化抗體可藉由取代Fv構架區中及/或所置換之非人類殘基內的額外殘基以改進及最佳化抗體特異性、親和力及/或能力來進一步修飾。一般而言，人類化抗體將包含含有所有或實質上所有對應於非人類免疫球蛋白之CDR區之至少一個且典型地兩個或三個可變結構域中的實質上所有，而所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等FR區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)之至少一部分，典型地人類免疫球蛋白之恆定區或結構域之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法之實例描述於美國專利第5,225,539號或第5,639,641號中。
「抗體」之可變區是指單獨或組合之抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。重鏈及輕鏈之可變區各由四個構架區(FR)組成，該等構架區藉由三個互補決定區(CDR，亦稱為高變區)連接。各鏈中之CDR藉由FR緊密地保持在一起且與來自另一鏈之CDR保持在一起，有助於形成抗體之抗原結合位點。存在至少兩種測定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列變異性之方法(亦即Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。此外，此兩種方法之組合有時在此項技術中用於測定CDR。
如本文關於蛋白質再摺疊所用之「氧化劑」是定義為能夠自經氧化之化合物移除電子的任何化合物或物質。合適之氧化劑包括(但不限於)氧化型麩胱甘肽、胱胺酸、胱胺、氧化 型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚糖醇(erythreitol)及氧氣。一般技術者容易地瞭解，多種氧化劑適合用於本發明方法中。
如本文所用，「變性劑(Denaturing agent/denaturant)」是定義為將引起蛋白質可逆展開之任何化合物或物質。將藉由特定變性劑之特性及濃度來確定變性劑的強度。合適之變性劑可為離液劑、清潔劑、有機溶劑、與水混溶的溶劑、磷脂或兩種或兩種以上該等試劑之組合。合適之離液劑包括(但不限於)尿素、胍及硫氰酸鈉。可用之清潔劑可包括(但不限於)強清潔劑，諸如十二烷基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清潔劑)、Sarkosyl；溫和非離子清潔劑(例如毛地黃皂苷)；溫和陽離子清潔劑，諸如N-›2,3-(二油醯氧基)-丙基-N,N,N-三甲基銨；溫和離子清潔劑(例如膽酸鈉或去氧膽酸鈉)；或兩性離子清潔劑，包括(但不限於)磺基甜菜鹼(兩性洗滌劑)、3-(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基-1-丙硫酸鹽(CHAPS)及3-(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)。與水混溶的有機溶劑，諸如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4烷醇，諸如乙醇或異丙醇)或低碳烷二醇(尤其C2-C4烷二醇，諸如乙二醇)可用作變性劑。可用於本發明之磷脂可為天然存在之磷脂，諸如磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸及磷脂醯肌醇，或合成磷脂衍生物或變異體，諸如二己醯基磷脂醯膽鹼或二庚醯基磷脂醯膽鹼。
如本文所用，「再摺疊」描述將含有雙硫鍵之多肽自不恰當摺疊狀態或展開狀態轉型成關於雙硫鍵之原生或恰當摺疊構形的任何過程、反應或方法。
如本文所用，「共摺疊」特定言之是指採用至少兩種彼此相互作用的多肽且導致展開或不恰當摺疊多肽轉型成原生、 恰當摺疊多肽之再摺疊過程、反應或方法。
抗體為對特異性抗原展現結合特異性之蛋白質。原生抗體通常為約150,000道爾頓之異源四聚醣蛋白，其由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈構成。各輕鏈藉由一個共價雙硫鍵鍵聯於重鏈，而不同免疫球蛋白同型之重鏈之間的雙硫鍵聯數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋。各重鏈在一端具有可變結構域(VH)，接著為許多恆定結構域。各輕鏈在一段具有可變結構域(VL)且在另一端具有恆定結構域；輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對準，且輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變結構域之間形成界面。
術語「可變」是指以下事實，即不同抗體之間可變結構域之某些部分的序列廣泛不同，並且負責各特定抗體對其特定抗原之結合特異性。然而，可變性並非在抗體的可變結構域中均勻分佈。其集中在輕鏈及重鏈可變結構域中三個稱為互補決定區(CDR)之區段內。可變結構域之更加高度保守部分稱為構架區(FR)。原生重鏈及輕鏈之可變結構域各包含四個大部分採用β片組態的由三個或四個CDR連接之FR區，其形成環連接，且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之CDR藉由FR區緊密地保持在一起且與來自另一鏈之CDR保持在一起，有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。
恆定結構域並不直接涉及抗體與抗原的結合，但展現各種效應功能。視重鏈恆定區之胺基酸序列而定，可將抗體或 免疫球蛋白指派為不同類別。存在五類主要免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中有幾類可進一步劃分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；IgA1及IgA2。對應不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。在各種人類免疫球蛋白類別中，僅已知人類IgG1、IgG2、IgG3及IgM活化補體。
抗體活體內親和力成熟受較高親和力抗體變異體之抗原選擇所驅動，該等較高親和力抗體變異體主要藉由體細胞超突變誘發(somatic hypermutagenesis)而製得。「譜系轉變(repertoire shift)」亦通常發生，其中可見二級反應或三級反應之主要生殖系基因不同於初級反應或二級反應之彼等基因。
可藉由活體外向抗體基因中引入突變且使用親和力選擇來分離具有改良親和力之突變體來複製免疫系統之親和力成熟過程。該等突變體抗體可呈現於絲狀噬菌體或微生物(諸如酵母)之表面上，並且可藉由抗體對抗原的親和力或藉由抗體自抗原解離之動力學(解離速率)來選擇抗體。Hawkins等人J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。已經採用CDR步移突變誘發(walking mutagenesis)來使結合人類免疫缺乏病毒1型(HIV-1)之人類包膜醣蛋白gp120的人類抗體(Barbas III等人PNAS(USA)91：3809-3813(1994)；及Yang等人J.Mol.Biol.254：392-403(1995))及抗c-erbB-2單鏈Fv片段(Schier等人J.Mol.Biol.263：551567(1996))親和力成熟。使用抗體鏈改組及CDR突變誘發來使針對HIV第三高變環的高親和力人類抗體親和力成熟(Thompson等人J.Mol.Biol.256：77-88(1996))。Balint及Larrick Gene 137：109-118(1993)描述電腦輔助之寡去氧核糖核苷酸定向掃描 突變誘發，進而同時且澈底地搜索可變區基因之所有CDR的改良變異體。使用初始有限突變誘發策略使αvβ3特異性人類化抗體親和力成熟，其中所有六個CDR之每個位置均突變，接著表現並篩選包括最高親和力突變體的重組文庫(Wu等人PNAS(USA)95：6037-6-42(1998))。在Chiswell及McCafferty TIBTECH 10：80-84(1992)；及Rader及Barbas III Current Opinion in Biotech.8：503-508(1997)中回顧噬菌體呈現抗體。在上述參考文獻報導與親本抗體相比具有改良親和力之突變體抗體的各情況下，突變體抗體之CDR中具有胺基酸取代。
本文中「親和力成熟」意謂增強抗體對其抗原之親和力的過程。親和力成熟方法包括(但不限於)計算篩選方法及實驗方法。
本文中「抗體」意謂由一或多個實質上由所有或部分抗體基因編碼的多肽組成之蛋白質。免疫球蛋白基因包括(但不限於)κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、δ、ε和μ恆定區基因，以及大量免疫球蛋白可變區基因。本文中抗體意欲包括全長抗體及抗體片段，且包括天然存在於任何生物體中或經工程改造(例如為變異體)之抗體。
「抗體片段」意謂除全長形式之外的任何形式抗體。本文中抗體片段包括存在於全長抗體內之作為較小組分的抗體，及已經工程改造之抗體。抗體片段包括(但不限於)Fv、Fc、Fab及(Fab')2、單鏈Fv(scFv)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、雙功能雜交抗體、CDR1、CDR2、CDR3、CDR組合、可變區、構架區、恆定區及其類似片段(Maynard及Georgiou,2000,Annu.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson,1998,Curr.Opin. Biotechnol.9：395-402)。
本文中「電腦篩選方法」意謂在蛋白質中設計一或多個突變之任何方法，其中該方法利用電腦來評價潛在胺基酸側鏈取代彼此相互作用及/或與蛋白剩餘部分相互作用的能量。
本文中「Fc」意謂包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3(Cγ2及Cγ3)之抗體部分。Fc亦可包括存在於Cγ2與Cγ1(Cγ1)之間N端鉸鏈內的任何殘基。Fc可指分離之此區，或者在抗體或抗體片段之背景中的此區。Fc亦包括任何經修飾形式之Fc，包括(但不限於)原生單體、原生二聚體(經雙硫鍵鍵聯)、經修飾二聚體(經雙硫鍵及/或非共價鍵鍵聯)及經修飾單體(亦即，衍生物)。
本文中「全長抗體」意謂構成抗體H及/或L鏈之天然生物形式的結構。在包括人及小鼠在內的大部分哺乳動物中，此形式為四聚體，且由相同兩對之兩個免疫球蛋白鏈組成，各對具有一條輕鏈及一條重鏈，各輕鏈包含免疫球蛋白結構域VL及CL，且各重鏈包含免疫球蛋白結構域VH、Cγ1、Cγ2及Cγ3。在各對中，輕鏈可變區與重鏈可變區(VL及VH)一起負責結合抗原，且恆定區(CL、Cγ1、Cγ2及Cγ3，尤其Cγ2及Cγ3)負責抗體效應功能。在一些哺乳動物中，例如在駱駝及美洲駝中，全長抗體可僅由兩條重鏈組成，各重鏈包含免疫球蛋白結構域VH、Cγ2及Cγ3。
本文中「免疫球蛋白」意謂由一或多個實質上由免疫球蛋白基因編碼之多肽組成之蛋白質。免疫球蛋白包括(但不限於)抗體。免疫球蛋白可具有許多結構形式，包括(但不限於)全長抗體、抗體片段及個別免疫球蛋白結構域，包括(但不限於) VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL及CL。
本文中「免疫球蛋白(Ig)結構域」意謂由實質上由免疫球蛋白基因編碼之多肽組成之蛋白質結構域。如圖1所示，Ig結構域包括(但不限於)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL及CL。
如本文所用，「變異體蛋白序列」意謂具有一或多個與另一類似蛋白序列在胺基酸一致性方面有所不同的殘基之蛋白序列。該類似蛋白序列可為天然野生型蛋白序列，或為野生型序列的另一變異體。一般而言，起始序列稱為「親本」序列，並且可為野生型或變異體序列。舉例而言，本發明之較佳實施例可利用人類化親本序列，已對該等人類化親本序列進行計算分析以產生變異體。
本文中抗體之「可變區」意謂由VH免疫球蛋白結構域、VL免疫球蛋白結構域或如圖1所示之VH及VL免疫球蛋白結構域構成之一或多種多肽(包括變異體)。可變區可指分離形式之此或此等多肽，如Fv片段、如scFv片段、如在較大抗體片段背景中之此區，或如在全長抗體或替代、非抗體骨架分子背景中之此區。
本發明可應用於自許多來源獲得之抗體。抗體可實質上由來自任何生物體之一或多種抗體基因編碼，該生物體包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、兔、駱駝、美洲駝、單峰駱駝、猴，尤其哺乳動物，尤其人類，並且尤其小鼠及大鼠。在一個實施例中，抗體可為全人類抗體，例如藉由使用轉殖基因小鼠或其它動物(Bruggemann及Taussig,1997,Curr.Opin.Biotechnol.8：455-458)或人類抗體文庫結合選擇方法(Griffiths及Duncan,1998,Curr.Opin.Biotechnol.9：102-108)自患者或個體獲得。抗 體可來自任何來源，包括人工或天然存在之來源。舉例而言，本發明可利用經工程改造之抗體，包括(但不限於)嵌合抗體及人類化抗體(Clark,2000,Immunol.Today 21：397-402)或來源於重組文庫。此外，經最佳化之抗體可為實質上由一或多種天然抗體基因編碼之抗體的經工程改造之變異體。舉例而言，在一個實施例中，經最佳化之抗體為已藉由親和力成熟鑑別之抗體。
關於本發明之PSMC，術語「抗原特異性」或「特異性結合」是指結合於抗原或所關注的結合搭配物之一或多個抗原決定基，但實質上不識別且結合含有混合抗原群體的樣品中之其他分子的PSMC。
如本文所用，術語「雙特異性PSMC」或「多特異性PSMC」是指包含兩個或兩個以上抗原結合位點或結合搭配物結合位點之PSMC，第一結合位點具有對第一抗原或抗原決定基之親和力，且第二結合位點具有對與第一抗原或抗原決定基不同的第二抗原或抗原決定基之結合親和力。
如本文所用，術語「抗原決定基」是指抗原或結合搭配物上由PSMC識別之位點。若抗原包含多肽，則抗原決定基可為線性或構形形成之胺基酸序列或形狀。抗原決定基亦可為任何類型之抗原上PSMC與該抗原結合之任何位置。
如本文所用，「抗原結合多肽」或「PSMC」應包括至少具有特異性結合於特定結合搭配物(諸如抗原)之生物活性的多肽及蛋白質，以及PSMC類似物、PSMC同功異型物、PSMC模擬物、PSMC片段、雜交PSMC蛋白、其融合蛋白、寡聚物及多聚物、同系物、糖基化型式變異體及突變型蛋白，而無論其生物活性如何，且進一步無論其合成或製造方法如何，該方法包括 (但不限於)重組(無論是否產自cDNA、基因組DNA、合成DNA或其他形式核酸)、活體外、活體內、藉由顯微注射核酸分子、合成、轉殖基因及基因活化方法。PSMC之特定實例包括(但不限於)抗體分子、重鏈、輕鏈、可變區、CDR、Fab、scFv、替代性骨架非抗體分子、配位體、受體、肽或結合於抗原之任何胺基酸序列。
術語「PSMC」或「抗原結合多肽」是指如上所述之PSMC，以及保留天然存在抗體之至少一種生物活性(包括(但不限於)除抗原結合以外的活性)之多肽。除抗原結合以外的活性包括(但不限於)任何一或多種與Fc相關之活性。
抗原結合多肽包括天然存在之人類PSMC的醫藥學上可接受之鹽及前藥、及鹽的前藥、多晶型物、水合物、溶劑合物、生物活性片段、生物活性變異體及立體異構體，以及天然存在之人類PSMC的激動劑、模擬物及拮抗劑變異體及其多肽融合物。術語「抗原結合多肽」涵蓋在胺基端、羧基端或兩者處均包含額外胺基酸之融合物。例示性融合物包括(但不限於)例如甲硫胺醯基PSMC(其中甲硫胺酸鍵聯於由重組表現得到的PSMC之N端)、用於純化目的之融合物(包括(但不限於)與聚組胺酸或親和力抗原決定基之融合物)、用於將PSMC鍵聯於其他生物活性分子之目的的融合物、與血清白蛋白結合肽之融合物，及與血清蛋白(諸如血清白蛋白)之融合物。
術語「抗原」或「結合搭配物」是指作為由PSMC表現之結合活性的目標之物質。實際上，任何物質均可為PSMC之抗原或結合搭配物。抗原或結合搭配物之實例包括(但不限於)α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素(Angiostatin)、抗溶血因子 (Antihemolytic factor)、抗體、脂蛋白元(Apolipoprotein)、去輔基蛋白(Apoprotein)、心房利尿鈉因子(Atrial natriuretic factor)、心房利尿鈉多肽(Atrial natriuretic polypeptide)、心房肽(Atrial peptide)、C-X-C趨化因子(例如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降鈣素(Calcitonin)、CC趨化因子(例如單核細胞化學引誘劑蛋白-1、單核細胞化學引誘劑蛋白-2、單核細胞化學引誘劑蛋白-3、單核細胞發炎性蛋白-1α、單核細胞發炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配位體、C-kit配位體、膠原蛋白、群落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體受體1、細胞因子(例如上皮嗜中性白血球活化肽-78、GRO/MGSA、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1)、表皮生長因子(EGF)、紅血球生成素(Erythropoietin，「EPO」)、脫落毒素A及B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、血纖維蛋白原(Fibrinogen)、纖維結合蛋白(Fibronectin)、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶(Glucocerebrosidase)、促性腺激素(Gonadotropin)、生長因子、刺蝟蛋白(Hedgehog protein)(例如Sonic、Indian、Desert)、血紅蛋白(Hemoglobin)、肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)、水蛭素(Hirudin)、人類血清白蛋白、胰島素、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、干擾素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、介白素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角質細胞生長因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、白血病抑制因子、螢光素酶 (Luciferase)、神經營養因子(Neurturin)、嗜中性白血球抑制因子(Neutrophil inhibitory factor，NIF)、抑瘤素M(oncostatin M)、成骨蛋白(Osteogenic protein)、副甲狀腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如人類生長激素)、多效營養因子(Pleiotropin)、蛋白質A、蛋白質G、熱解外毒素A、B及C、鬆弛素(Relaxin)、腎素(Renin)、SCF、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM 1、可溶性介白素受體(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受體、促生長因子(Somatomedin)、生長抑素(Somatostatin)、促體素(Somatotropin)、鏈激酶(Streptokinase)、超抗原(亦即葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE))、超氧化歧化酶、毒性休克症候群毒素(Toxic shock syndrome toxin，TSST-1)、胸腺素α1、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、腫瘤壞死因子β(TNF β)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、腫瘤壞死因子-α(TNF α)、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGEF)、尿激酶及多種其他抗原或結合搭配物。
此等蛋白中許多為市售的(參見例如Sigma BioSciences 2002目錄及價格單)，並且對應蛋白序列及基因以及典型地其多種變異體為熟知的(參見例如Genbank)。
額外抗原或結合搭配物包括(但不限於)轉錄及表現活化劑。例示性轉錄及表現活化劑包括調節細胞生長、分化、調控或其類似方面之基因及蛋白質。表現及轉錄活化劑發現於提供廣泛治療標靶之原核生物、病毒及真核生物中，包括真菌、植物及動物，包括哺乳動物。應瞭解，表現及轉錄活化劑藉由許多機制調節轉錄，例如藉由結合於受體、刺激信號轉導級聯、調控 轉錄因子之表現、結合於啟動子及增強子、結合於與啟動子及增強子結合的蛋白質、鬆解DNA、剪接pre-mRNA、聚腺苷酸化RNA及降解RNA。抗原或結合搭配物包括(但不限於)表現活化劑，諸如細胞因子、發炎性分子、生長因子、其受體及致癌基因產物，例如介白素(例如IL-1、EL-2、IL-8等)、干擾素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1及hyalurin/CD44；信號轉導分子及對應致癌基因產物，例如Mos、Ras、Raf及Met；及轉錄活化劑及抑制劑，例如p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel及類固醇激素受體，諸如雌激素、孕酮、睪固酮、醛固酮、LDL受體配位體及皮質酮的類固醇激素受體。
疫苗蛋白可為抗原或結合搭配物，包括(但不限於)來自傳染性真菌之蛋白質，例如麴菌(Aspergillus)、念珠菌(Candida)屬；來自細菌之蛋白，尤其充當病原菌模型的大腸桿菌以及醫學上重要之細菌，諸如葡萄球菌(Staphylococci)(例如金黃色葡萄球菌(aureus))或鏈球菌(Streptococci)(例如肺炎鏈球菌(pneumoniae))；來自原生動物之蛋白，諸如孢子蟲(sporozoa)(例如瘧原蟲(Plasmodia))、根足蟲(rhizopod)(例如內阿米巴(Entamoeba))及鞭毛蟲(flagellate)(錐蟲(Trypanosoma)、利什曼蟲(Leishmania)、毛滴蟲(Trichomonas)、賈第鞭毛蟲(Giardia)等)；來自病毒之蛋白，諸如(+)RNA病毒(實例包括痘病毒(Poxviruses)，例如牛痘(vaccinia)；小核糖核酸病素(Picornaviruses)，例如脊髓灰質炎(polio)；披衣病毒(Togaviruses)，例如風疹(rubella)；黃病毒(Flaviviruses)，例如HCV；及冠病毒(Coronaviruses))、(-)RNA病毒(例如棒 狀病毒(Rhabdoviruses)，例如VSV；副黏病毒(Paramyxovimses)，例如RSV；正黏病毒(Orthomyxovimses)，例如流行性感冒病毒(influenza)；本楊病毒(Bunyavirus)；及沙粒狀病毒(Arenaviruses))、dsDNA病毒(例如里奧病毒(Reovirus))、RNA至DNA病毒(亦即逆轉錄酶病毒(Retro virus)，例如HIV及HTLV)及某些DNA至RNA病毒(諸如B型肝炎病毒)。
抗原或結合搭配物可為酶，包括(但不限於)醯胺酶、胺基酸消旋酶、醯酶、去鹵酶、雙加氧酶、二芳基丙烷過氧化酶、差向異構酶、環氧化物水解酶、酯酶、異構酶、激酶、葡萄糖異構酶、糖苷酶、糖基轉移酶、鹵基過氧化酶、單加氧酶(例如p450s)、脂肪酶、木質素過氧化酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酯酶、枯草桿菌蛋白酶、轉胺酶及核酸酶。
農業相關蛋白，諸如抗昆蟲蛋白(例如Cry蛋白)、澱粉及脂質產生酶、植物及昆蟲毒素、抗毒素蛋白、黴菌菌素(Mycotoxin)解毒蛋白、植物生長酶(例如核酮糖1,5-二磷酸羧酶/加氧酶，Ribulose 1，5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase，「RUBISCO」)、脂肪加氧酶(lipoxygenase，LOX)及磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)羧酶亦可為抗原或結合搭配物。
舉例而言，抗原或結合搭配物可為疾病相關分子，諸如腫瘤表面抗原，例如B細胞個體基因型、惡性B細胞上之CD20、白血病胚細胞上之CD33及乳癌上之HER2/neu。或者，抗原或結合搭配物可為生長因子受體。生長因子之實例包括(但不限於)表皮生長因子(EGF)、轉鐵蛋白、胰島素樣生長因子、轉型生長因子(TGF)、介白素-1及介白素-2。舉例而言，已在多種人類上皮原發性腫瘤中發現EGF受體之高表現。已發現TGF-α 介導癌細胞中之自分泌刺激路徑。已證明數種鼠類單株抗體能夠結合EGF受體，阻斷配位體與EGF受體之結合且抑制培養物及異種移植物模型中多種人類癌細胞株之增殖。Mendelsohn及Baselga(1995)Antibodies to growth factors and receptors,Biologic Therapy of Cancer，第2版，JB Lippincott,Philadelphia,第607-623頁。因此，本發明之PSMC可用於治療多種癌症。
抗原或結合搭配物亦可為與冠狀動脈疾病相關之細胞表面蛋白或受體(諸如血小板醣蛋白Iib/IIIa受體)、與自體免疫疾病相關之細胞表面蛋白或受體(諸如CD4、CAMPATH-1及革蘭氏陰性細菌脂多醣的脂質A區)。已經在治療患有蕈樣真菌病(Mycosis fungoides)、全身性膿皰型牛皮癬(generalized postular psoriasis)、嚴重牛皮癬及類風濕性關節炎之患者的臨床試驗中測試抗CD4人類化抗體。已經在敗血性休克之治療中臨床測試了抗革蘭氏陰性細菌脂多醣的脂質A區之抗體。亦已在難治癒性類風濕性關節炎之治療中臨床測試了抗CAMPATH-1之抗體。因此，本發明之PSMC可用於治療多種自體免疫疾病。Vaswani等人(1998)「Humanized antibodies as potential therapeutic drugs」Annals of Allergy,Asthma and Immunology 81：105-115。
抗原或結合搭配物亦可為與人類過敏性疾病相關之蛋白質或肽，諸如發炎介體蛋白(例如介白素-1(IL-1))、腫瘤壞死因子(TNF)、白三烯受體及5-脂肪加氧酶，及黏附分子，諸如V-CAM/VLA-4。此外，因為IgE在諸如哮喘之I型立即過敏性過敏反應中起至關重要的作用，故IgE亦可充當抗原或結合搭配物。研究表明，總血清IgE之含量趨向於與疾病(尤其在哮喘中)的嚴重程度相關。Burrows等人(1989)「Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens」New Engl.L.Med.320：271-277。因此，在過敏性疾病之治療中針對IgE所選擇的PSMC可用於降低IgE含量或阻斷IgE與肥大細胞及嗜鹼細胞之結合，而不實質地影響正常免疫功能。
抗原或結合搭配物亦可為可能充當引發宿主免疫反應之抗原的病毒表面或核心蛋白。此等病毒蛋白之實例包括(但不限於)醣蛋白(或表面抗原，例如GP120及GP41)及衣殼蛋白(或結構蛋白，例如P24蛋白)；A、B、C、D或E型肝炎病毒之表面抗原或核心蛋白(例如B型肝炎病毒之小B型肝炎表面抗原(small hepatitis B surface antigen，SHBsAg)及C型肝炎病毒之核心蛋白、NS3、NS4及NS5抗原)；呼吸道融合性病毒(respiratory syncytial virus，RSV)之醣蛋白(G蛋白)或融合蛋白(F蛋白)；單純疱疹病毒HSV-1及HSV-2之表面及核心蛋白(例如來自HSV-2的醣蛋白D)。
抗原或結合搭配物亦可為已喪失其腫瘤抑制功能且可使細胞更易感染癌症之突變型腫瘤抑制基因產物。腫瘤抑制基因為用以抑制細胞生長及分裂週期並因此阻止贅瘤形成之發育之基因。腫瘤抑制基因中之突變引起細胞忽視抑制信號網路中之一或多種組分，從而克服細胞週期檢查點並導致較高的受控細胞生長(癌症)速率。腫瘤抑制基因之實例包括(但不限於)DPC-4、NF-1、NF-2、RB、p53、WT1、BRCA1及BRCA2。
DPC-4涉及胰臟癌並參與抑制細胞分裂之細胞質路徑。NF-1編碼抑制Ras之蛋白質，即細胞質抑制蛋白。NF-1牽涉於神經系統之神經纖維瘤及嗜鉻細胞瘤以及骨髓白血病中。NF-2編碼牽涉於神經系統之腦膜瘤、神經鞘瘤及室管膜瘤中之核 蛋白。RB編碼pRB蛋白，即作為細胞週期之主要抑制劑的核蛋白。RB牽涉於視網膜母細胞瘤以及骨癌、膀胱癌、小細胞肺癌及乳癌中。p53編碼調控細胞分裂且可誘導細胞凋亡之p53蛋白。 在多種癌症中發現p53之突變及/或不活動。WT1牽涉於腎臟之威爾姆氏腫瘤中。BRCA1牽涉於乳癌及卵巢癌中，而BRCA2牽涉於乳癌中。因此，PSMC可用於阻斷基因產物與腫瘤發作及發展路徑中之其他蛋白質或生物化學品的相互作用。
抗原或結合搭配物可為CD分子，包括(但不限於)CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD110-113、CD114、CD115、CD116、CD117、 CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CD129、CDw130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166及TCRζ。抗原或結合搭配物可為VEGF、VEGF受體、EGFR、Her2、TNFa、TNFRI受體、GPIIb/IIIa、IL-2R α鏈、IL-2R β鏈、RSV F蛋白、α4整合素、IgE、IgE受體、地高辛、鋸鱗蝰蛇毒、補體C5、OPGL、CA-125腫瘤抗原、葡萄球菌蛋白質、表皮葡萄球菌蛋白質、金黃色葡萄球菌蛋白質、葡萄球菌感染相關蛋白(包括(但不限於)金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌)、IL-6受體、CTLA-4、RSV、IL-2受體Tac亞單位、IL-5及EpCam。抗原或結合搭配物可為分子之片段。
雙特異性PSMC之實例包括(但不限於)其中一個PSMC針對腫瘤細胞抗原而另一個PSMC針對細胞毒性引發分子之雙特異性PSMC，諸如抗FcγRI/抗CD 15、抗p185HER2/FcγRIII(CD 16)、抗CD3/抗惡性B細胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗黑素細胞刺激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)/抗CD3、抗葉酸結合蛋白(folate binding protein，FBP)/抗CD3、抗胰臟癌相關抗原(pan carcinoma associated antigen，AMOC-31) /抗CD3；其中一個PSMC特異性結合於腫瘤抗原而另一個PSMC結合於毒素的雙特異性PSMC，諸如抗皂草素(saporin)/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒素A鏈、抗干擾素-α(IFN-α)/抗融合瘤個體基因型、抗CEA/抗長春花屬生物鹼(vinca alkaloid)；用於轉化酶活化之前藥的雙特異性PSMC，諸如抗CD30/抗鹼性磷酸酯酶(催化磷酸絲裂黴素(mitomycin phosphate)前藥轉化成絲裂黴素醇)；可用作纖溶劑之雙特異性PSMC，諸如抗纖維蛋白/抗組織纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)、抗纖維蛋白/抗尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)；用於將免疫複合物靶向細胞表面受體之雙特異性PSMC，諸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用於治療傳染性疾病之雙特異性PSMC，諸如抗CD3/抗單純疱疹病毒(HSV)、抗T細胞受體：CD3複合物/抗流行性感冒病毒、抗FcγR/抗HIV；用於活體外或活體內腫瘤偵測之雙特異性PSMC，諸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作為疫苗佐劑之雙特異性PSMC(參見Fanger,MW等人，Crit Rev Immunol.1992；12(3-4)：101-24，其以引用的方式併入本文中)；及作為診斷工具之雙特異性PSMC，諸如抗兔IgG/抗鐵蛋白、抗辣根過氧化酶(HRP)/抗激素、抗生長抑素/抗物質P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶(參見Nolan,O et R.O'Kennedy,Biochim Biophys Acta.1990年8月1日；1040(1)：1-11，其以引用的方式併入本文中)。三特異性PSMC之實例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37及抗CD3/抗CD8/抗CD37。
各種參考文獻揭示了藉由聚合物結合或糖基化進行 多肽修飾。術語「PSMC」或「抗原結合多肽」包括(但不限於)與諸如PEG之聚合物結合的多肽，且可包含半胱胺酸、離胺酸、N或C端胺基酸或其他殘基之一或多種額外衍生化。此外，PSMC可包含連接子、聚合物或生物活性分子，其中連接子、聚合物或生物活性分子所結合的胺基酸可為根據本發明之非天然胺基酸，或者可利用此項技術中已知之技術(諸如與離胺酸或半胱胺酸偶合)而與天然編碼胺基酸結合。美國專利第4,904,584號揭示了PEG化離胺酸耗乏多肽，其中至少一個離胺酸殘基已缺失或由任何其他胺基酸殘基置換。WO 99/67291揭示了一種使蛋白質與PEG結合之方法，其中該蛋白質上的至少一個胺基酸殘基缺失，且該蛋白質與PEG在足以實現與該蛋白質結合之條件下接觸。 WO 99/03887揭示了屬於生長激素超家族之多肽的PEG化變異體，其中半胱胺酸殘基已由位於多肽指定區域中之非必需胺基酸殘基取代。WO 00/26354揭示了一種製造與包含至少一個額外糖基化位點之對應親本多肽相比，具有降低之變應原性的糖基化多肽變異體之方法。
術語「抗原結合多肽」亦包括糖基化PSMC，例如(但不限於)在任何胺基酸位置處糖基化之多肽、N連接或O連接之糖基化形式的多肽。含有單一核苷酸改變之變異體亦被視為PSMC之生物活性變異體。此外，亦包括剪接變異體。術語「抗原結合多肽」亦包括任何一或多種PSMC之PSMC雜二聚體、均二聚體、雜多聚體或均多聚體或任何其他多肽、蛋白質、碳水化合物、聚合物、小分子、連接子、配位體或其他任何類型的生物活性分子(藉由化學方法鍵聯或表現為融合蛋白)，以及含有例如特定缺失或其他修飾但仍保留生物活性之多肽類似物。
在一些實施例中，抗原結合多肽進一步包含調節PSMC生物活性之添加、取代或缺失。舉例而言，添加、取代或缺失可調節PSMC之一或多種特性或活性(包括(但不限於)調節對抗原的親和力)；調節(包括(但不限於)增加或降低)抗原構形或其他二級、三級或四級結構改變；穩定抗原構形或其他二級、三級或四級結構改變；誘導或引起抗原構形或其他二級、三級或四級結構改變；調節循環半衰期；調節治療半衰期；調節多肽穩定性；調節劑量；調節釋放或生物可用性；促進純化；或改良或改變特定投藥途徑。同樣，抗原結合多肽可包含蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合結構域(包括(但不限於)FLAG或poly-His)或其他基於親和力之序列(包括(但不限於)FLAG、poly-His、GST等)或改良多肽之偵測(包括(但不限於)GFP)、純化或其他特性的鍵聯分子(包括(但不限於)生物素)。
術語「抗原結合多肽」亦涵蓋所鍵聯的PSMC均二聚體、雜二聚體、均多聚體及雜多聚體，包括(但不限於)直接經由非天然編碼胺基酸側鏈鍵聯於相同或不同非天然編碼胺基酸側鏈、鍵聯於天然編碼胺基酸側鏈作為融合體或間接經由連接子鍵聯者。例示性連接子包括(但不限於)小有機化合物、多種長度之水溶性聚合物(諸如聚(乙二醇)或聚葡萄糖)，或多種長度之多肽。
熟習此項技術者應瞭解可在抗原結合多肽或相關抗原結合多肽等之片段中輕易地鑑別出對應於特定抗原結合多肽序列中之位置的胺基酸位置。例如，可使用諸如BLAST之序列比對程式來比對並鑑別蛋白質中符合相關序列中位置的特定位置。
術語「抗原結合多肽」涵蓋包含一或多個胺基酸取 代、添加或缺失之抗原結合多肽。本發明之抗原結合多肽可包含使用一或多種天然胺基酸之修飾以及一或多種非天然胺基酸修飾。 已經描述天然存在PSMC多肽中之多種胺基酸位置中的例示性取代，包括(但不限於)調節抗原結合多肽中一或多種生物活性之取代，諸如(但不限於)增加激動劑活性、增加多肽溶解性、將多肽轉化成拮抗劑等，並且由術語「PSMC」所涵蓋。
「非天然編碼胺基酸」是指並非20種常見胺基酸或焦離胺酸或硒半胱胺酸中之一者的胺基酸。可與術語「非天然編碼胺基酸」同義地使用之其他術語為「非天然胺基酸(non-natural amino acid)」、「非天然胺基酸(unnatural amino acid)」、「非天然存在胺基酸」及其各種帶有連字符及不帶連字符的形式。術語「非天然編碼胺基酸」亦包括(但不限於)藉由修飾(例如，轉譯後修飾)天然編碼胺基酸(包括(但不限於)20種常見胺基酸或焦離胺酸及硒半胱胺酸)而發生但自身並非藉由轉譯複合物天然地併入生長中之多肽鏈中的胺基酸。該等非天然存在胺基酸之實例包括(但不限於)N-乙醯基葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基葡糖胺基-L-蘇胺酸及O-磷酸酪胺酸。
「胺基端修飾基團」是指可連接於多肽胺基端之任何分子。同樣，「羧基端修飾基團」是指可連接於多肽羧基端之任何分子。末端修飾基團包括(但不限於)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質(諸如血清白蛋白)或增加肽之血清半衰期的其他部分。
術語「官能基」、「活性部分」、「活化基團」、「離去基團」、「反應性位點」、「化學反應性基團」及「化學反應性部分」用於此項技術及本文中，是指分子之獨特的、可定義的部分或單元。該等術語在化學技術中為略微同義的，且在本文中用於指示 執行一些功能或活性並且具有與其他分子之反應性的分子部分。
本文所用術語「鍵聯(linkage)」或「連接子(linker)」是指由於化學反應而通常形成並且典型地為共價鍵聯之基團或鍵(bond)。水解穩定鍵聯意謂該等鍵聯在水中實質上穩定，且在可用pH值下(包括(但不限於)在生理條件下)不與水反應，持續一段較長時期，可能甚至為無限的。水解不穩定或可降解鍵聯意謂該等鍵聯在水中或在水溶液(包括例如血液)中可降解。酶不穩定或可降解鍵聯意謂該鍵聯可由一或多種酶降解。如此項技術中應瞭解，PEG及相關聚合物可在聚合物骨架中或在連接子基團中在聚合物骨架與聚合物分子之一或多個末端官能基之間包括可降解鍵聯。例如，由PEG羧酸或活化之PEG羧酸與生物活性劑上之醇基團之間反應所形成的酯鍵聯通常在生理條件下水解以釋放該試劑。其他水解可降解鍵聯包括(但不限於)碳酸酯鍵聯；由胺與醛反應所生成的亞胺鍵聯；藉由使醇與磷酸酯基團反應所形成之磷酸酯鍵聯；為醯肼與醛之反應產物的腙鍵聯；為醛與醇之反應產物的縮醛鍵聯；為甲酸酯與醇之反應產物的原酸酯鍵聯；由胺基(包括(但不限於)在諸如PEG之聚合物的末端)與肽之羧基形成的肽鍵聯；及由胺基磷酸酯基團(包括(但不限於)在聚合物之末端)與寡核苷酸5'羥基形成之寡核苷酸鍵聯。分支連接子可用於本發明之抗原結合多肽中。
術語「生物活性分子」、「生物活性部分」或「生物活性劑」在用於本文中時意謂可影響生物系統、路徑、分子或有關於生物體(包括(但不限於)病毒、細菌、噬菌體、轉座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物及人類)之相互作用的任何物理或生物化學特性之任何物質。特定言之，如本文所用，生物活 性分子包括(但不限於)意欲用於診斷、治癒、緩解、治療或預防人類或其他動物之疾病或者另外增強人類或動物之身體或精神良好狀態的任何物質。生物活性分子之實例包括(但不限於)肽、蛋白質、酶、小分子藥物、硬藥物、軟藥物、染料、脂質、核苷、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質體、微粒及微胞。適合與本發明一起使用之生物活性劑的類別包括(但不限於)藥物、前藥、放射性核素、顯影劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長因子、類固醇劑、微生物衍生毒素及其類似物。
在某些實施例中，本發明之PSMC分子可用於將生物活性分子或可偵測標記針對腫瘤位點。此舉可促進腫瘤殺死、偵測及/或定位或其他作用。診斷探針或成像探針亦可鍵聯於本發明之PSMC分子。在某些特定較佳實施例中，PSMC之生物活性分子組分為「不透射線」標記，例如可輕易地使用例如x射線進行目測之標記。不透射線物質為熟習此項技術者所熟知。最常見之不透射線物質包括碘化物、溴化物或鋇鹽。其他不透射線物質亦為已知的且包括(但不限於)有機鉍衍生物(參見例如美國專利第5,939,045號)、不透射線聚胺基甲酸酯(參見美國專利第5,346,981號)、有機鉍複合物(參見例如美國專利第5,256,334號)、不透射線鋇多聚物複合物(參見例如美國專利第4,866,132號)及其類似物。
本發明之PSMC可直接與不透射線部分偶合，或者其可連接於載運或含有不透射線物質之「封裝」(例如螯合劑、脂質體、多聚物微珠等)。
除不透射線標記之外，其他標記亦適合用於本發明。 適合用作本發明PSMC之生物活性分子組分的可偵測標記包括可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法偵測之任何成分。可用於本發明中之標記包括磁性珠粒(例如DynabeadsTM)、螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德州紅(texas red)、若丹明、綠色螢光蛋白及其類似物)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酯酶及其他通常用於ELISA中之酶)，及比色標記，諸如膠狀金色或有色玻璃或塑膠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠粒。
各種較佳放射性標記包括(但不限於)99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、641Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、175Yb、177Lu、105Rh及111Ag。
偵測該等標記之方法為熟習此項技術者所熟知。因此，例如，可使用照相膠片、閃爍偵測器及其類似物偵測放射性標記。可使用光偵測器偵測發光來偵測螢光標記。典型地藉由對受質提供酶並且偵測由酶作用於受質上所產生之反應產物來偵測酶標記，並且藉由簡單地目測有色標記來偵測比色標記。
在某些特定實施例中，本發明涵蓋免疫結合物(嵌合部分)用於偵測腫瘤及/或其他癌細胞之用途。因此，舉例而言，本發明之雙特異性抗體可結合於γ發射放射性同位素(例如Na-22、Cr-51、Co-60、Tc-99、I-125、I-131、Cs-137、Ga-67、Mo-99)以用γ攝影機偵測；結合於正電子發射同位素(例如C-11、N-13、O-15、F-18及其類似物)以在正電子發射斷層攝影法(Positron Emission Tomography，PET)儀器上偵測；及結合於金屬對比劑(例如含Gd試劑、含Eu試劑及其類似物)以用於磁共振成像(MRI)。此外，本發明之雙特異性抗體可用於傳統免疫組織化學(例如螢光標記、奈米晶標記、酶標記及比色標記等)中。
在另一實施例中，生物活性分子可為增強細胞上之電離輻射(例如可能由60Co或x射線源產生)的細胞毒性作用之放射增敏劑。許多放射增敏劑為已知的且包括(但不限於)苯并卟啉衍生化合物(參見例如美國專利第5,945,439號)、1,2,4-苯并三嗪氧化物(參見例如美國專利第5,849,738號)、含某些二胺之化合物(參見例如美國專利第5,700,825號)、BCNT(參見例如美國專利第5,872,107號)、放射增敏性硝基苯甲醯胺衍生物(參見例如美國專利第4,474,814號)、各種雜環衍生物(參見例如美國專利第5,064,849號)、鉑複合物(參見例如美國專利第4,921,963號)及其類似物。
生物活性分子亦可為配位體、抗原決定基標籤、肽、蛋白質或另一PSMC。配位體及抗體可為結合於免疫細胞上之表面標記者。利用該等抗體作為生物活性分子之嵌合分子充當在承載配體位或PSMC的結合搭配物之免疫細胞與表現EGFR家族成員之腫瘤細胞之間建立連接的雙官能連接子。
尤其在利用預靶向策略之情況下，許多本文所述之醫藥品及/或放射性標記可以螯合劑形式提供。螯合分子典型地與特異性地結合連接於雙特異性及/或多特異性PSMC之抗原決定基標籤的分子(例如生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等)偶合。
螯合基團為熟習此項技術者所熟知。在某些實施例 中，螯合基團來源於乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、環己基1,2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-雙(-2-胺基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、N,N-雙(羥基苄基)-乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N'-,N",N'"-四乙酸(DOTA)、羥基乙二胺三乙酸(HEDTA)、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-N,N',N",N'"-四乙酸(TETA)、經取代DTPA、經取代EDTA及其類似物。
某些較佳螯合劑之實例包括未經取代或經取代2-亞胺基硫雜環戊烷及2-亞胺基硫雜環己烷，尤其2-亞胺基-4-巰基甲基硫雜環戊烷及SAPS(N-(4-[211At]砹代苯乙基)丁二酸酯)。
一種螯合劑1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N,N",N'"-四乙酸(DOTA)尤其令人感興趣，這是由於其螯合許多診斷上及治療上重要之金屬(諸如放射性核素及放射性標記)之能力。
已經描述DOTA與諸如抗體之蛋白質的結合物。舉例而言，美國專利第5,428,156號教示使DOTA與抗體及PSMC片段結合之方法。為了製備此等結合物，將DOTA之一個羧酸基團轉化成活性酯，該活性酯可與PSMC或PSMC片段上的胺或巰基反應。Lewis等人(1994)Bioconjugate Chem.5：565-576描述一種類似方法，其中將DOTA之一個羧基轉化成活性酯，並將經活化之DOTA與PSMC混合，從而使PSMC經由PSMC之離胺酸殘基的ε-胺基鍵聯於DOTA，藉此將DOTA的一個羧基轉化成醯胺部分。
或者，可直接或經連接子將螯合劑偶合於抗原決定基標籤或偶合於結合抗原決定基標籤之部分。已經描述DOTA與生物素之結合物(參見例如Su(1995)J.Nucl.Med.,36(增刊5)： 154P，其揭示DOTA與生物素經由可用胺基側鏈生物素衍生物(諸如DOTA-LC-生物素或DOTA-苄基-4-(6-胺基-己醯胺)-生物素)鍵聯)。Yau等人，WO 95/15335揭示了一種製造可結合於生物素之硝基-苄基-DOTA化合物之方法。該方法包含經由羥基之短暫保護的環化反應；胺之甲苯磺醯化；短暫受保護羥基之保護基脫除；脫除保護基之羥基的甲苯磺醯化；及分子內甲苯磺酸酯環化。Wu等人(1992)Nucl.Med.Biol.,19(2)：239-244揭示了用111IN及90Y放射性標記蛋白質之巨環螯合劑之合成。Wu等人製得經標記DOTA-生物素結合物以研究具有抗生物素蛋白(用於研究之模型蛋白)之結合物的穩定性及生物分佈。使用含有游離胺基以與原位生成之經活化DOTA衍生物反應之生物素醯肼來製造此結合物。
本發明之PSMC可與其他生物活性分子融合，該等生物活性分子包括(但不限於)細胞毒性藥物、毒素、肽、蛋白質、酶及病毒(Chester,(2000)Dis.Markers 16：53-62；Rippmann等人Biochem J.(2000)Biochem J.349(第3部分)：805-812,Kreitman,R.J.(2001)Curr.Pharm.Biotechnol. 2：313-325；Rybak,S.M.(2001)Expert Opin.Biol.Ther. 1：995-1003；van Beusechem,V.W.等人J.Virol.(2002)76：2753-2762)。
有效細胞毒性劑或有效負載可結合於PSMC，該等PSMC靶向且結合於主要發現於標靶細胞(包括(但不限於)癌細胞)上之抗原。有效負載試劑經由血流中穩定之連接子鍵聯於PSMC，或者可在例如腫瘤位點在所存在條件下易於裂解。有效負載試劑(諸如毒素)經遞送至標靶細胞，且因此可經由取決於毒素之機制而起始細胞殺死。
該等毒素之實例包括(但不限於)小分子，諸如真菌衍生之卡奇黴素(calicheamicin)(Hinman等人(1993)Cancer Res.53：3336-3342)及類美登素(Liu等人(1996)PNAS USA 93：8618-8623,Smith,S.(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3(2)：198-203)、trichothene及CC 1065；或蛋白質，例如蓖麻毒素A鏈(Messman等人(2000)Clin.Cancer Res.6(4)：1302-1313)、假單胞菌外毒素(Tur等人(2001)Intl.J.Mol.Med.8(5)：579-584)、白喉毒素(LeMaistre等人(1998)Blood 91(2)：399-405)及核糖體失活蛋白(Tazzari等人(2001),J.Immunol.167：4222-4229)。在特定實施例中，可使用一或多個卡奇黴素分子。卡奇黴素家族之抗生素的成員能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。亦已知卡奇黴素之結構化類似物。參見Hinman等人，Cancer Research 53：3336-42(1993)；Lode等人(1998)Cancer Research 58：2925-28。已獲得FDA批准之免疫毒素的實例為Mylotarg®(Wyeth Ayerst)，即一種用於急性骨髓性白血病之結合卡奇黴素的抗CD33(Sievers等人(1999)Blood 93(11)：3678-3684；Bernstein(2000)Leukemia 14：474-475)。以類似方式，本發明之PSMC可與毒素融合。或者，本發明之PSMC可與肉毒桿菌A神經毒素融合，肉毒桿菌A神經毒素為由細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產生之蛋白複合物。
在另一實施例中，本發明之PSMC可包含一或多種酶活性毒素及/或其片段。該等毒素之實例包括白喉毒素之非結合活性片段、白喉毒素A鏈、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、康乃馨蛋 白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPAII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑(sapaonaria,officinalis inhibitor)、白樹素、有絲分裂素、restrictoein、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素。參見例如WO 93/21232。尤其較佳之細胞毒素包括假單胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、蓖麻毒素及相思子毒素。假單胞菌外毒素及白喉毒素為熟知的。如PE，白喉毒素(DT)藉由ADP核糖基化延伸因子2殺死細胞，藉此抑制蛋白質合成。關於免疫毒素之其他引用文獻包括Brinkmann,U.(2000)In Vivo 14：21-28；Niv等人(2001)Curr.Pharm.Biotechnol.2：19-46；Reiter等人(2001)Adv.Cancer Res.81：93-124；Kreitman,R.J.(1999)Curr.Opin.Immunol.,11：570-578；Hall(2001)Meth.Mol.Biol.166：139-154；Kreitman(2001)Curr.Opin.Investig.Drugs 2(9)：1282-1293。選殖編碼與各種配位體融合之PE或DT的基因之方法為熟習此項技術者所熟知(參見例如Siegall等人(1989)FASEB J.,3：2647-2652；及Chaudhary等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：4538-4542)。所有引用文獻均以引用之方式併入本文中。
其他合適生物活性分子包括藥理學試劑或含有各種藥理學試劑之囊封系統。因此，嵌合分子之靶向分子可直接連接於欲直接遞送至腫瘤之藥物。該等藥物為熟習此項技術者所熟知，且包括(但不限於)多柔比星(doxirubicin)、長春鹼、染料木素、反義分子及其類似物。
或者，生物活性分子可為囊封系統，諸如病毒衣殼、脂質體或含有治療組合物(諸如藥物、核酸(例如反義核酸)或較佳經屏蔽以免於直接暴露於循環系統的另一治療部分)之微胞。 製備連接於抗體之脂質體之方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如美國專利第4,957,735號，Connor等人(1985)Pharm.Ther.,28：341-365。由於具有抗原特異性，因此本發明之PSMC可用於將裝載藥物之脂質體指向其標靶。參見Park,J.W.等人(2002)Clin.Cancer Res.8,1172-1181及Shi,N.等人(2001)Pharm.Res.18,1091-1095。
本發明之PSMC可結合於諸如PEG之分子以改良活體內遞送及藥物動力學特徵。Leong等人描述相比非PEG化形式具有降低之清除率且具有極小或無抗原結合活性損失之抗IL-8抗體的Fab'片段之位點特異性PEG化(Leong,S.R.等人(2001)Cytokine 16：106-119)。
本發明之PSMC可鍵聯於前藥。如本文所用，術語「前藥」意謂活性藥物之藥理學無活性或降低活性之衍生物。可對前藥進行設計以調節藥物或生物活性分子的量，從而藉由操縱藥物之特性(諸如物理化學、生物醫藥學或藥物動力學特性)而到達所需作用位點。前藥在體內經酶反應或非酶反應而轉化成活性藥物。前藥可提供改良之物理化學特性(諸如較佳溶解性)、增強之遞送特徵(諸如特異性靶向特定細胞、組織、器官或配位體)及改良之藥物治療價值。本發明之PSMC可與酶融合而用於前藥活化(Kousparou,C.A.等人(2002)Int.J.Cancer 99,138-148)。(2002)重組分子可包含PSMC及作用於前藥上以釋放細胞毒素(諸如氰化物)之酶。
治療劑可以前藥形式投與，且隨後藉由將如肽基化學治療劑之前藥轉化成活性抗癌藥物之前藥活化酶來活化。參見例如WO 88/07378；WO 81/01145；美國專利第4,975,278號。一 般而言，酶組分包括任何能夠以諸如將前藥轉化成其更具活性之細胞毒性形式的方式作用於前藥之酶。
可用之酶包括(但不限於)可用於將含磷酸酯前藥轉化成游離藥物之鹼性磷酸酯酶；可用於將含硫酸酯前藥轉化成游離藥物之芳基硫酸酯酶；可用於將無毒5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶之胞嘧啶去胺酶；可用於將含肽前藥轉化成游離藥物之蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)；可用於轉化含D-胺基酸取代基之前藥的D-丙胺醯基羧基肽酶；可用於將糖基化前藥轉化成游離藥物之碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺酸酶；可用於將用β-內醯胺衍生的藥物轉化成游離藥物之β-內醯胺酶；及可用於將在胺基氮處分別用苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生的藥物轉化成游離藥物之青黴素醯胺酶，例如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。
或者，可使用在此項技術中又稱為「抗體酶」之具有酶活性的抗體將本發明之前藥轉化成游離活性藥物。參見例如Massey,(1987)328：457-48。
熟習此項技術者應瞭解，本發明之雙特異性及/或多特異性PSMC及生物活性分子部分可典型地以任何次序接合在一起。因此，例如當靶向分子為單鏈蛋白時，生物活性分子可接合於靶向分子之胺基或羧基端。生物活性分子亦可接合於雙特異性及/或多特異性PSMC之內部區，或者相反。同樣，雙特異性及/或多特異性PSMC可接合於生物活性分子之內部位置或末端。在任何情況下，選擇連接點以致不干擾雙特異性及/或多特異性PSMC或生物活性分子之各別活性。
可藉由熟習此項技術者所熟知的多種方式中之任一者連接雙特異性及/或多特異性PSMC及生物活性分子。生物活性分子典型地直接或經連接子(間隔子)結合於雙特異性PSMC。然而，當生物活性分子及雙特異性PSMC均為多肽時，可能需要將嵌合分子重組表現為單鏈融合蛋白。
在一個實施例中，雙特異性及/或多特異性PSMC化學結合於生物活性分子(例如細胞毒素、標記、配位體、藥物、PSMC、脂質體等)。化學結合分子之方法為熟習此項技術者所熟知。
連接試劑與PSMC或其他多肽靶向分子之程序將根據試劑之化學結構而改變。多肽典型地含有多種官能基；例如羧酸(COOH)或游離胺(--NH2)基團，其可用於與生物活性分子上之合適官能基反應以於該處結合生物活性分子。
或者，雙特異性PSMC及/或生物活性分子可經衍生化以暴露或連接額外反應性官能基。該衍生化可涉及連接任何多種連接子分子，諸如獲自Pierce Chemical Company,Rockford,Ill者。
在一些情況下，當嵌合部分已到達其標靶位點時，可能需要使生物活性分子自雙特異性及/或多特異性PSMC游離，或活化前藥。因此，當欲在標靶位點釋放生物活性分子時，可使用包含在鄰近標靶位點處可裂解之鍵聯的嵌合結合物。可藉由酶活性或者免疫結合物在標靶細胞內部或在鄰近標靶位點處所經受的條件來促進鍵聯裂解以自PSMC釋放試劑。當標靶位點為腫瘤時，可使用在腫瘤位點處所存在的條件下(例如當暴露於腫瘤相關酶或酸性pH時)可裂解之連接子。
多種不同可裂解連接子為熟習此項技術者所已知。 參見美國專利第4,618,492號；第4,542,225號；及第4,625,014號。自此等連接子基團釋放試劑之機制包括例如照射光不穩定性鍵及酸催化之水解。舉例而言，美國專利第4,671,958號包括包含連接子之免疫結合物的描述，該等連接子在標靶位點處藉由患者補體系統之蛋白水解酶活體內裂解。連接子之長度可為預定的，或者根據PSMC與其所鍵聯的分子之間之所需空間關係而加以選擇。鑒於許多已經報導用於將多種放射診斷化合物、放射治療化合物、藥物、毒素及其他試劑連接於抗體之方法，熟習此項技術者應能夠確定用於將既定試劑連接於PSMC或其他多肽之合適方法。
在某些實施例中，生物活性分子包含連接於PSMC或連接於抗原決定基標籤之螯合劑。雙特異性及/或多特異性PSMC攜帶有對應之抗原決定基標籤或PSMC，因此雙特異性及/或多特異性PSMC與螯合劑的簡單接觸導致PSMC連接於生物活性分子。可在使用該部分之後(預靶向策略)執行組合步驟，或可在遞送螯合劑之前使標靶組織與雙特異性及/或多特異性PSMC結合。適合與各種靶向部分偶合之螯合物的製造方法為熟習此項技術者所熟知(參見例如美國專利第6,190,923號、第6,187,285號、第6,183,721號、第6,177,562號、第6,159,445號、第6,153,775號、第6,149,890號、第6,143,276號、第6,143,274號、第6,139,819號、第6,132,764號、第6,123,923號、第6,123,921號、第6,120,768號、第6,120,751號、第6,117,412號、第6,106,866號、第6,096,290號、第6,093,382號、第6,090,800號、第6,090,408號、第6,088,613號、第6,077,499號、第6,075,010號、第6,071,494號、第6,071,490 號、第6,060,040號、第6,056,939號、第6,051,207號、第6,048,979號、第6,045,821號、第6,045,775號、第6,030,840號、第6,028,066號、第6,022,966號、第6,022,523號、第6,022,522號、第6,017,522號、第6,015,897號、第6,010,682號、第6,010,681號、第6,004,533及第66,001,329號)。
當雙特異性及/或多特異性PSMC及/或生物活性分子均為單鏈蛋白且相對較短(亦即小於約50個胺基酸)時，其可使用標準化學肽合成技術進行合成。當兩種組分均相對較短時，嵌合部分可合成為單一鄰近多肽。或者，可分別合成雙特異性及/或多特異性PSMC及生物活性分子，且隨後藉由縮合一個分子之胺基端與另一分子之羧基端而進行融合，藉此形成肽鍵。或者，雙特異性及/或多特異性PSMC及生物活性分子可各自與肽間隔子分子之一個末端縮合，藉此形成鄰近融合蛋白。
固相合成為化學合成本發明多肽之較佳方法，其中序列之C端胺基酸連接於不溶性支撐物，接著相繼添加序列中的剩餘胺基酸。固相合成技術由The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2：Special Methods in Peptide Synthesis，部分A.，Merrifield等人J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)中之Barany及Merrifield,Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁，及Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)描述。
「雙官能聚合物」是指包含兩個不連續官能基之聚合物，該等不連續官能基能夠特異地與其他部分(包括(但不限於)胺基酸側基)反應以形成共價或非共價鍵聯。可使用其中一個官能基可與特定生物活性組分上之基團反應而另一基團可與第二生 物組分上之基團反應的雙官能連接子，來形成包括第一生物活性組分、雙官能連接子及第二生物活性組分之結合物。用於將各種化合物連接於肽之許多程序及連接子分子為已知的。參見例如歐洲專利申請案第188,256號、美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4,680,338號、第4,569,789號、第及第4,589,071號，其以引用之方式併入本文中。「多官能聚合物」是指包含兩個或兩個以上不連續官能基之聚合物，該等不連續官能基能夠特異地與其他部分(包括(但不限於)胺基酸側基)反應以形成共價或非共價鍵聯。雙官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需分子長度或分子量，並且可經選擇以提供鍵聯於PSMC之一個分子之間的特定所需間距或構形。
當取代基由其習知化學式自左至右書寫而指定時，其同樣涵蓋將由自右至左書寫結構而得到的化學性質相同之取代基，例如結構-CH2O-等同於結構-OCH2-。
術語「取代基」包括(但不限於)「非干擾取代基」。 「非干擾取代基」為產生穩定化合物之彼等基團。合適之非干擾取代基或基團包括(但不限於)鹵基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12環烷基、C3-C12環烯基、苯基、經取代苯基、甲苯甲醯基、二甲苯基、聯苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亞磺醯基、C1-C10烷基磺醯基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m為1至8)、芳基、經取代芳基、經取代烷氧基、氟烷基、雜環基、經取代雜環基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、 =S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)-CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m為1至8)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2、其鹽及其類似物。如本文所用，各R為H、烷基或經取代烷基、芳基或經取代芳基、芳烷基或烷芳基。
術語「鹵素」包括氟、氯、碘及溴。
除非另外說明，否則單獨或作為另一取代基之一部分的術語「烷基」意謂直鏈或分支鏈或環狀烴基，或其組合，其可為完全飽和的、單不飽和或多不飽和的，並且可包括具有指定碳原子數(亦即C1-C10意謂一至十個碳)之二價及多價基團。飽和烴基之實例包括(但不限於)以下基團，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、異丁基、第二丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基及其類似基團之同系物及異構體。不飽和烷基為具有一或多個雙鍵或參鍵者。不飽和烷基之實例包括(但不限於)乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-及3-丙炔基、3-丁炔基及高碳同系物及異構體。除非另外說明，否則術語「烷基」亦意欲包括下文更詳細定義之彼等烷基衍生物，諸如「雜烷基」。限於烴基之烷基是稱為「高烷基」。
單獨或作為另一取代基之一部分的術語「伸烷基」意謂來源於烷烴之二價基團，例如(但不限於)結構-CH2CH2-及-CH2CH2CH2CH2-，並且進一步包括下文描述為「伸雜烷基」之彼等基團。典型地，烷基(或伸烷基)將具有1至24個碳原子，具 有10個或更少碳原子之彼等基團在本發明中為較佳的。「低碳烷基」或「低碳伸烷基」為通常具有八個或更少碳原子之較短鏈烷基或伸烷基。
術語「烷氧基」、「烷基胺基」及「烷基硫基」(或硫代烷氧基)以其習知含義使用，並且分別是指經由氧原子、胺基或硫原子連接於分子剩餘部分之彼等烷基。
除非另外說明，否則單獨或與另一術語組合之術語「雜烷基」意謂由所述數目之碳原子及至少一個選自由O、N、Si及S組成之群的雜原子組成且其中氮及硫原子可視情況經氧化且氮雜原子可視情況經四級銨化之穩定直鏈或分支鏈或環狀烴基。雜原子O、N及S及Si可位於雜烷基之任何內部位置處，或者位於烷基連接於分子剩餘部分之位置處。實例包括(但不限於)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3及-CH=CH-N(CH3)-CH3。多達兩個雜原子可為連續的，諸如-CH2-NH-OCH3及-CH2-O-Si(CH3)3。同樣，單獨或作為另一取代基之一部分的術語「伸雜烷基」意謂來源於雜烷基之二價基團，例如(但不限於)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對於伸雜烷基，相同或不同雜原子亦可佔據任一或兩個鏈末端(包括(但不限於)伸烷氧基、伸烷二氧基、伸烷基胺基、伸烷基二胺基、胺氧基伸烷基及其類似基團)。此外，對於伸烷基及伸雜烷基鍵聯基團，鍵聯基團化學式所書寫的方向並不表示鍵聯基團之定向。例如，式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-及-R'C(O)2-。
除非另外說明，否則單獨或與其他術語組合之術語「環烷基」及「雜環烷基」分別表示環狀形式之「烷基」及「雜烷基」。因此，環烷基或雜環烷基包括飽和與不飽和環鍵聯。另外，對於雜環烷基，雜原子可佔據雜環連接於分子剩餘部分之位置。 環烷基的實例包括(但不限於)環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基及其類似基團。雜環烷基的實例包括(但不限於)1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基及其類似基團。另外，該術語涵蓋雙環及三環結構。同樣，單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸雜環烷基」意謂來源於雜環烷基的二價基團，且單獨或作為另一取代基之一部分之術語「伸環烷基」意謂來源於環烷基的二價基團。
如本文所用，術語「水溶性聚合物」是指在水性溶劑中可溶之任何聚合物。水溶性聚合物與PSMC之鍵聯可產生以下改變，包括(但不限於)相對於未經修飾形式增加或經調節之血清半衰期，或者增加或經調節之治療半衰期，經調節之免疫原性，經調節之物理締合特徵(諸如聚集及多聚物形成)，改變之受體結合及改表之受體二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可或可不具有自身生物活性，且可用作連接子以連接PSMC與其他物質，包括(但不限於)一或多種PSMC或者一或多種生物活性分子。 合適之聚合物包括(但不限於)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述於美國專利第5,252,714號中，其以引用的方式併入本文中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚胺基酸、二乙烯基醚順丁烯二酸酐、N-(2- 羥基丙基)-甲基丙烯醯胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、寡醣、聚糖、纖維素及纖維素衍生物(包括(但不限於)甲基纖維素及羧甲基纖維素)、澱粉及澱粉衍生物、多肽、聚伸烷基二醇及其衍生物、聚伸烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚及α-β-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺及其類似物或其混合物。該等水溶性聚合物之實例包括(但不限於)聚乙二醇及血清白蛋白。
如本文所用，術語「聚伸烷基二醇」或「聚(伸烷基二醇)」是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。術語「聚伸烷基二醇」涵蓋直鏈及分支聚合物且平均分子量介於0.1kDa與100kDa之間。其他例示性實施例列於例如商業供應商目錄中，諸如Shearwater公司之目錄「Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications」(2001)。
除非另外說明，否則術語「芳基」意謂可為單環或稠合於一起或共價鍵聯之多個環(較佳為1至3個環)之多不飽和、芳族、烴取代基。術語「雜芳基」是指含有一至四個選自N、O及S之雜原子的芳基(或環)，其中氮原子及硫原子視情況經氧化，且氮原子視情況經四級銨化。雜芳基可經由雜原子連接於分子之剩餘部分。芳基及雜芳基之非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、 5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喏啉基、5-喹喏啉基、3-喹啉基及6-喹啉基。 各上述芳基及雜芳基環系統之取代基選自下述可接受取代基之群。
為簡便起見，術語「芳基」當與其他術語組合使用時(包括(但不限於)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)包括如上文所定義之芳基及雜芳基環。因此，術語「芳基烷基」意欲包括其中芳基連接於烷基之彼等基團(包括(但不限於)苄基、苯乙基、吡啶基甲基及其類似基團)，包括其中碳原子(包括(但不限於)亞甲基)已經例如氧原子置換之彼等烷基(包括(但不限於)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基及其類似基團)。
各上述術語(包括(但不限於)「烷基」、「雜烷基」、「芳基」及「雜芳基」)意欲包括經取代及未經取代形式之所指示基團。各類基團之例示性取代基提供於下文中。
烷基及雜烷基(包括通常稱為伸烷基、烯基、伸雜烷基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基及雜環烯基之彼等基團)之取代基可為多種基團中之一或多者，該等基團選自(但不限於)：-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-鹵素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN及-NO2，其數目介於0至(2m'+1)範圍內，其中m'為該類基團中碳原子的總數。R'、R"、R"'及R""各自獨立地指氫、經取代或未經取代雜烷基、經取代或未經取代 芳基(包括(但不限於)經1-3個鹵素取代之芳基)、經取代或未經取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。舉例而言，當本發明化合物包括一個以上R基團時，各R基團獨立地經選擇，如同當存在R'、R"、R"'及R""基團中之一者以上時，此等基團時各自經選擇。當R'及R"連接於同一氮原子時，其可與氮原子組合以形成5、6或7員環。舉例而言，-NR'R"意欲包括(但不限於)1-吡咯啶基及4-嗎啉基。基於上述取代基論述，熟習此項技術者應瞭解術語「烷基」意欲包括與除氫基團以外之基團結合之包括碳原子的基團，諸如鹵代烷基(包括(但不限於)-CF3及-CH2CF3)及醯基(包括(但不限於)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3及其類似基團)。
與關於烷基所述之取代基類似，芳基及雜芳基的取代基有所改變，並且選自(但不限於)：鹵素、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-鹵素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN及-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基及氟(C1-C4)烷基，其數目介於0至芳環系統上開放價之總數範圍內；且其中R'、R"、R"'及R""獨立地選自氫、烷基、雜烷基、芳基及雜芳基。舉例而言，當本發明化合物包括一個以上R基團時，各R基團獨立地經選擇，如同當存在R'、R"、R"'及R""基團中之一者以上時，此等基團時各自經選擇。
如本文所用，術語「經調節之血清半衰期」意謂相對於未經修飾形式，經修飾PSMC之循環半衰期的正或負改變。 藉由在投與PSMC後之各個時間點時取血液樣品並測定彼分子在各樣品中之濃度來量測血清半衰期。血清濃度與時間之相關性使得可以計算血清半衰期。血清半衰期有利地具有至少約兩倍的增加，但較小增加亦可用，例如當其使得能夠得到滿意給藥方案或避免毒性作用時。在一些實施例中，增加為至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。
如本文所用，術語「經調節之治療半衰期」意謂相對於未經修飾形式，治療有效量之PSMC或包含經修飾生物活性分子之PSMC的半衰期之正或負改變。藉由在投藥後之各個時間點時量測分子之藥物動力學及/或藥效學特性來量測治療半衰期。 增加之治療半衰期有利地使得能夠得到尤其有益的給藥方案、尤其有益的總劑量，或避免不良作用。在一些實施例中，增加之治療半衰期源於增加之效能、增加或減少之經修飾分子與其標靶的結合或者未經修飾分子之另一參數或作用機制的增加或減少。
當用於核酸或蛋白質時，術語「經分離」表示核酸或蛋白質實質上不含天然狀態下與其締合之其他細胞組分。其可為均態。經分離之物質可為乾態或半乾態，或者在溶液中，包括(但不限於)水溶液。典型地使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析型化學技術測定純度及均質性。作為存在於製劑中之主要物質的蛋白質實質上經純化。詳言之，經分離之基因是自側接基因並且編碼除所關注基因之外的蛋白質之開放閱讀框架分離的。術語「經純化」表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中實質上產生一個條帶。特定言之，其意謂核酸或蛋白質為至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少99%純或更純。
術語「核酸」是指呈單股或雙股形式之去氧核糖核 苷酸、去氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物、具有與參考核酸類似之結合特性並且以與天然存在核苷酸類似之方式代謝的核酸。除非另外特定限制，否則該術語亦指包括PNA(肽核酸)之寡核苷酸類似物、用於反義技術中之DNA類似物(硫代磷酸酯、磷醯胺酸及其類似物)。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體(包括(但不限於)簡併密碼子取代)及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，可藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子的第三位經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來完成簡併密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Cassol等人(1992)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物。亦即，針對多肽之描述同樣適用於肽之描述及蛋白質之描述，且反之亦然。該等術語適用於天然存在胺基酸聚合物以及其中一或多個胺基酸殘基為非天然編碼胺基酸之胺基酸聚合物。如本文所用，該等術語涵蓋任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白(亦即抗原)，其中胺基酸殘基藉由共價肽鍵鍵聯。
術語「胺基酸」是指天然存在及非天然存在胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然編碼胺基酸為20種常見胺基酸(丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、 脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸)及吡咯離胺酸及硒半胱胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在胺基酸具有相同基礎化學結構(亦即結合於氫、羧基、胺基及R基團之α-碳)之化合物，諸如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(諸如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然存在胺基酸相同之基礎化學結構。
胺基酸在本文中可由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之其一般所知的三字母符號或單字母符號來指代。核苷酸同樣可由其一般所接受之單字母代碼來指代。
「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列。 關於特定核酸序列，「經保守修飾之變異體」是指編碼相同或基本上相同胺基酸序列之彼等核酸，或者當核酸不編碼胺基酸序列時，是指基本上相同序列。由於遺傳密碼之簡併性，許多功能相同之核酸編碼任何既定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子所指定之每個位置處，密碼子可改變為任何所述對應密碼子而不改變所編碼之多肽。該等核酸變異為「沉默變異」，其為一種經保守修飾之變異。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述每種可能之核酸沉默變異。熟習此項技術者應認識到，可修飾核酸中之每個密碼子(除AUG(其通常僅為甲硫胺酸密碼子)及TGG(其通常僅為色胺酸密碼子)之外)以產生功能相同分子。因此，編碼多肽之核酸的每種沉默變異暗含在每個所述序列中。
關於胺基酸序列，熟習此項技術者應認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白序列進行的改變、添加或缺失編碼序列中單 個胺基酸或小百分比之胺基酸之個別取代、缺失或添加為「經保守修飾之變異體」，其中改變導致胺基酸經化學類似胺基酸取代。 提供功能類似胺基酸之保守取代表在此項技術中為熟知的。該等經保守修飾之變異體為除本發明之多晶型變異體、種間同系物及對偶基因之外的，但不排除此等物質。
以下八組各含有作為彼此之保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)
(參見例如Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.；第2版(1993年12月)
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之背景中，術語「一致」或百分比「一致性」是指兩個或兩個以上相同之序列或子序列。當在比較窗口或指定區域上如使用一種以下序列比較算法或藉由手工比對及視覺觀察來比較並且比對最大對應度時，若序列具有相同胺基酸殘基或核苷酸百分比(亦即在指定區域上約60%一致性、視情況約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%一致性)，則該等序列為「實質上一致的」。此定義亦指測試序列之互補序列。一致性可存在於至少約50個胺基酸或核苷酸長度之區域上，或者在75-100個胺基酸或核苷酸長度之 區域上，或者當未指定時在整個序列或聚核苷酸或多肽上。
對於序列比較，典型地一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，指定子序列座標(必要時)並指定序列算法程式參數。可使用默認程式參數，或者可指定替代參數。序列比較算法隨後基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之百分比序列一致性。
如本文所用，「比較窗口」包括參考選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群的任一連續位置數目之區段，其中在一個序列與相同連續位置數目之參考序列最佳比對之後可將該序列與該參考序列相比較。比對比較序列之方法為此項技術中熟知的。可進行比較序列之最佳比對，包括(但不限於)Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比對算法、Pearson及Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444的搜尋相似性方法、此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或者手動比對及視覺觀察(參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
適用於測定百分比序列一致性及序列相似性之算法的一個實例為BLAST及BLAST 2.0算法，其分別描述於Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402及Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用於執行BLAST分析之軟體是經美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開可用的。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(用於核苷酸序列)使用預設字長(W)11、期望值(E)10、M=5、N=-4及雙股比較。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用預設字長3及期望值(E)10，及BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比對(B)50、期望值(E)10、M=5、N=-4及雙股比較。BLAST算法典型地在關閉「低複雜度」過濾器下執行。
BLAST算法亦執行兩個序列之間相似性的統計學分析(參見例如Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法所提供之一種相似性量度為最小和機率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間將偶然發生匹配之機率。例如，若測試核酸與參考核酸比較之最小和機率小於約0.2、更佳小於約0.01且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
措辭「選擇性(或特異性)雜交」是指當序列存在於複雜混合物(包括(但不限於)總細胞或文庫DNA或RNA)中時，彼分子在嚴謹雜交條件下僅與特定核苷酸序列結合、雙聯或雜交。
措辭「嚴謹雜交條件」是指如此項技術中已知之低離子強度及高溫條件。典型地，在嚴謹條件下探針將與核酸之複雜混合物(包括(但不限於)總細胞或文庫DNA或RNA)中之其標靶子序列雜交，但不與複雜混合物中的其他序列雜交。嚴謹條件具有序列相關性，並且在不同情況下將有所不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交之廣泛指導發現於Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)中。通常將嚴謹條件選擇為低於在確定之離子強度pH下特異性序列的熱熔點(Tm)約5-10℃。Tm為與標靶互補之探針的50%與標靶序列雜交平衡(由於標靶序列過量存在，在Tm下，50%探針佔據平衡)時的溫度(在確定之離子強度、pH及核酸濃度下)。嚴謹條件可為其中在pH 7.0-8.3下鹽濃度低於約1.0M鈉離子，典型地為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，且對短探針(包括(但不限於)10至50個核苷酸)而言溫度至少為約30℃且對長探針(包括(但不限於)大於50個核苷酸)而言溫度至少為約60℃之彼等條件。亦可藉由添加諸如甲醯胺之去穩定劑來實現嚴謹條件。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號可為至少兩倍背景，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴謹雜交條件可如下：50%甲醯胺、5×SSC及1% SDS，在42℃下培育；或者5×SSC、1% SDS，在65℃下培育；用0.2×SSC及0.1% SDS在65℃下洗滌。該等洗滌可執行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。
如本文所用，術語「真核生物」是指屬於系統發生真核生物域之生物體，諸如動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限於)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。
如本文所用，術語「非真核生物」是指非真核生物體。舉例而言，非真核生物體可屬於真細菌(包括(但不限於)大腸桿菌、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽胞 桿菌(Bacillus stearothermophilus)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)系統發生域；或古生菌(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜鹽菌(Halobacterium)(諸如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)及嗜鹽菌種NRC-1)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)、超嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷氣熱菌(Aeuropyrum pernix)等)系統發生域。
如本文所用，術語「個體」是指作為治療、觀察或實驗對象之動物，較佳為哺乳動物，最佳為人類。
如本文所用，術語「有效量」是指(經修飾)非天然胺基酸多肽將一定程度地減輕所治療之疾病、病狀或病症的一或多種症狀之投與量。可投與本文所述之含有(經修飾)非天然胺基酸多肽之組合物以用於預防性、增強性及/或治療性治療。
術語「增強(enhance)」或「增強(enhancing)」意謂增加或延長所需作用之功效或持續時間。因此，就增強治療劑作用而言，術語「增強」是指增加或延長其他治療劑對系統之作用的功效或持續時間之能力。如本文所用，「增強有效量」是指足以增強另一治療劑在所需系統中之作用的量。當用於患者時，此用途之有效量將取決於疾病、病症或病狀的嚴重程度及進程、先前療法、患者之健康狀況及對藥物的反應，及治療醫師之判斷。
如本文所用，術語「經修飾」是指存在對多肽之轉譯後修飾。形式「(經修飾)」術語意謂所論述之多肽視情況經修飾，亦即，所論述之多肽可經修飾或未經修飾。
術語「經轉譯後修飾」及「經修飾」是指在天然或非天然胺基酸已併入多肽鏈中之後關於此類胺基酸所發生之任何修飾。僅舉例而言，該術語涵蓋共轉譯活體內修飾、轉譯後活體內修飾及轉譯後活體外修飾。
在預防性應用中，將含有(經修飾)非天然胺基酸多肽之組合物投與易感染特定疾病、病症或病狀或者在其他情況下處於其風險中之患者。將此類量定義為「預防有效量」。在此用途中，準確量亦取決於患者之健康狀況、體重及其類似因素。在此項技術之技能範圍內應充分地考慮藉由常規實驗(例如劑量遞增臨床試驗)來確定該等預防有效量。
術語「經保護」是指存在防止化學反應性官能基在某些反應條件下反應之「保護基」或部分。保護基應視所保護之化學反應性基團的類型而變化。舉例而言，若化學反應性基團為胺或醯肼，則保護基可選自第三丁氧基羰基(t-Boc)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)之群。若化學反應性基團為硫醇，則保護基可為鄰吡啶基二硫化物。若化學反應性基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，則保護基可為苄基或烷基，諸如甲基、乙基或第三丁基。此項技術中已知之其他保護基亦可用於本文所述之方法及組合物，或者與其一起使用。
僅舉例而言，封端基/保護基可選自：
其他保護基描述於Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons,New York,NY,1999中，其以全文引用的方式併入本文中。
在治療應用中，將含有(經修飾)非天然胺基酸多肽之組合物以足以治癒或至少部分阻止疾病、病症或病狀之症狀的量投與已罹患該疾病、病狀或病症之患者。此類量是定義為「治療有效量」且將取決於疾病、病症或病狀之嚴重程度及進程、先前療法、患者健康狀況及對藥物的反應，及治療醫師之判斷。在此項技術之技能範圍內應充分地考慮藉由常規實驗(例如劑量遞增臨床試驗)來確定該等治療有效量。
術語「治療」用於指預防性及/或治療性治療。
除非另外指示，否則採用此項技術之技能範圍內的習知質譜、NMR、HPLC、蛋白化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學方法。
I. 引言
本發明提供包含至少一種非天然胺基酸之PSMC分 子。在本發明之某些實施例中，具有至少一種非天然胺基酸之PSMC包括至少一種轉譯後修飾。在一個實施例中，該至少一種轉譯後修飾包含連接分子，該分子包括(但不限於)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯劑、細胞毒性化合物、放射性核素、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記、螢光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能基、與其他分子共價或非共價相互作用之基團、光捕獲部分、光可異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、併有重原子之部分、化學可裂解基團、光可裂解基團、長側鏈、碳鍵聯糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性部分、經同位素標記部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、插入基團、發色團、能量轉移劑、生物活性劑、可偵測標記、小分子或上述各物之組合或任何其他所需化合物或物質，其包含利用熟習此項技術者已知適用於特定反應性基團的化學方法連接第二反應性基團與至少一種包含第一反應性基團之非天然胺基酸。舉例而言，第一反應性基團為炔基部分(包括(但不限於)在非天然胺基酸對炔丙氧基苯丙胺酸中，其中炔丙基有時亦稱為乙炔部分)，且第二反應性基團為疊氮基部分，並且利用[3+2]環加成化學方法。在另一實例中，第一反應性基團為疊氮基部分(包括(但不限於)在非天然胺基酸對疊氮基-L-苯丙胺酸中)，且第二反應性基團為炔基部分。在本發明經修飾PSMC多肽之某些實施例中，使用至少一種包含至少一 種轉譯後修飾之非天然胺基酸(包括(但不限於)含有酮基官能基之非天然胺基酸)，其中該至少一種轉譯後修飾包含醣部分。在某些實施例中，在真核細胞中或在非真核細胞中活體內進行轉譯後修飾。
在某些實施例中，蛋白質包括至少一種由一種宿主細胞活體內進行之轉譯後修飾，其中該轉譯後修飾通常不由另一宿主細胞類型進行。在某些實施例中，蛋白質包括至少一種由真核細胞活體內進行之轉譯後修飾，其中該轉譯後修飾通常不由非真核細胞進行。轉譯後修飾之實例包括(但不限於)乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸酯加成、磷酸化、醣脂鍵聯修飾及其類似修飾。在一個實施例中，轉譯後修飾包含寡醣與天冬醯胺藉由GlcNAc-天冬醯胺鍵聯連接(包括(但不限於)其中寡醣包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc及其類似結構)。在另一實施例中，轉譯後修飾包含寡醣(包括(但不限於)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲胺酸或蘇胺酸藉由GalNAc-絲胺酸、GalNAc-蘇胺酸、GlcNAc-絲胺酸或GlcNAc-蘇胺酸鍵聯連接。在某些實施例中，本發明之蛋白或多肽可包含分泌或定位序列、抗原決定基標籤、FLAG標籤、聚組胺酸標籤、GST融合物及/或其類似物。分泌信號序列之實例包括(但不限於)原核生物分泌信號序列、真核生物分泌信號序列、5'-經優化用於細菌表現之真核生物分泌信號序列、新穎分泌信號序列、果膠酸酯解離酶分泌信號序列、Omp A分泌信號序列及噬菌體分泌信號序列。分泌信號序列之實例包括(但不限於)STII(原核生物)、Fd GIII及M13(噬菌體)、Bgl2(酵母)及源於轉座子之信號序列bla。
可使用包含非天然胺基酸之抗原結合多肽來調節生 物活性分子之治療半衰期、血清半衰期或循環時間，該等生物活性分子包括(但不限於)小分子、肽及寡核苷酸。該等小分子、肽及寡核苷酸可具有包括(但不限於)結合及/或識別標靶分子或細胞類型、抗腫瘤活性、抗血管生成活性、抗病毒活性及細胞凋亡活性之生物活性。此外，包含非天然胺基酸之抗原結合多肽可提供所需活性，包括(但不限於)效應功能，諸如ADCC、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性、前藥活化、酶活性、催化活性、阻斷蛋白-蛋白相互作用、結合於所需抗原及將小分子靶向所需位點。 PSMC阻斷蛋白-蛋白相互作用可調節所連接之生物活性分子的一或多種活性。可將小分子用作拮抗劑以干擾其他蛋白或分子之結合活性。
抗原結合多肽及小分子可藉由連接子、聚合物或共價鍵接合。連接子、聚合物或小分子自身可包含對20種常見胺基酸無反應性之官能基。連接子或聚合物可為雙官能的。在所需條件下，牽涉於抗原結合多肽經由連接子、聚合物或共價鍵接合於生物活性分子的一或多個鍵可為不可逆的、可逆的或不穩定的。牽涉於抗原結合多肽經由連接子、聚合物或共價鍵接合於分子之一或多個鍵可允許抗原結合多肽或另一分子之經調節釋放。熟習此項技術者可藉由化學方法、作為天然產物分離或其他方法產生多種小分子。
Rader等人於Proc Natl Acad Sci U S A.2003年4月29日；100(9)：5396-400中描述一種經由使小合成分子與一般抗體分子反應而向該等分子提供效應功能及延長之血清半衰期之方法，該文獻以引用的方式併入本文中。藉由mAb 38C2(模擬天然醛縮酶之催化抗體)經由該抗體上之反應性離胺酸殘基而與靶向 Arg-Gly-Asp肽模擬物的整合素之二酮衍生物之間的可逆共價鍵來產生所述複合物。除了增加肽模擬物之半衰期之外，該複合物亦展示抗體選擇性再靶向表現整合素αvβ3及αvβ5之細胞的表面。
所關注之蛋白或多肽可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或者十個或十個以上非天然胺基酸。該等非天然胺基酸可相同或不同，例如在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種不同非天然胺基酸之蛋白質中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同位點。在某些實施例中，至少一個(但少於全部)以蛋白質之天然存在形式存在的特定胺基酸由非天然胺基酸取代。
本發明提供基於包含至少一種非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽或PSMC之方法及組合物。將至少一種非天然編碼胺基酸引入PSMC中可允許應用結合化學，其涉及與包括(但不限於)一或多種非天然編碼胺基酸發生特異性化學反應，而不與通常存在之20種胺基酸反應。在一些實施例中，包含非天然編碼胺基酸之PSMC經由非天然編碼胺基酸的側鏈與水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))鍵聯。本發明提供用PEG衍生物選擇性修飾蛋白質之高效方法，該方法涉及回應於選擇密碼子將非遺傳編碼胺基酸選擇性併入蛋白質中及隨後用適當反應性PEG衍生物對彼等胺基酸進行修飾，該等非遺傳編碼胺基酸包括(但不限於)含有20種天然併入之胺基酸中未發現的官能基或取代基之彼等胺基酸，該等官能基或取代基包括(但不限於)酮、疊氮或乙炔部分。一旦經併入，接著可藉由利用熟習此項技術者已知適用於存在於天然編碼胺基酸中的特定官能基或取代基之化學方法來 對胺基酸側鏈進行修飾。已知之多種化學方法適用於本發明中以將水溶性聚合物併入蛋白質中。該等方法包括(但不限於)分別與包括(但不限於)乙炔或疊氮衍生物進行Huisgen[3+2]環加成反應(參見例如Padwa,A.Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)編輯Trost,B.M.,Pergamon,Oxford，第1069-1109頁；及Huisgen,R.1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)編輯Padwa,A.,Wiley,New York，第1-176頁)。
由於Huisgen[3+2]環加成方法涉及環加成而非親核取代反應，因此蛋白質可以極高選擇性經修飾。反應可在室溫下於水性條件中藉由向反應混合物中添加催化量之Cu(I)鹽而以卓越區域選擇性(1,4>1,5)進行。參見例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；及Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；及WO 03/101972。在[3+2]環加成中可添加至本發明蛋白質中之分子實際上包括具有合適官能基或取代基之任何分子，包括(但不限於)疊氮基或乙炔衍生物。此等分子可分別添加於具有乙炔基之非天然胺基酸(包括(但不限於)對炔丙氧基苯丙胺酸)中或具有疊氮基之非天然胺基酸(包括(但不限於)對疊氮基-苯丙胺酸)中。
由Huisgen[3+2]環加成產生之五員環通常在還原環境中不可逆，並且在水性環境中長時間對水解穩定。因此，多種物質之物理及化學特徵可在所要求之水性條件下用本發明之活性PEG衍生物修飾。更為重要的是，因為疊氮及乙炔部分彼此具有特異性(且例如不與20種常見遺傳編碼胺基酸中之任一者反應)，故可在一或多個特異性位點處以極高選擇性修飾蛋白質。
本發明亦提供PEG衍生物之水溶性及水解穩定衍生 物，及具有一或多個乙炔或疊氮部分之相關親水性聚合物。含有乙炔部分之PEG聚合物衍生物對與已回應於選擇密碼子選擇性引入蛋白質中之疊氮部分偶合具有高度選擇性。同樣，含有疊氮部分之PEG聚合物衍生物對與已回應於選擇密碼子選擇性引入蛋白質中之乙炔部分偶合具有高度選擇性。
更特定言之，疊氮部分包含(但不限於)烷基疊氮化物、芳基疊氮化物及此等疊氮化物之衍生物。烷基疊氮化物及芳基疊氮化物之衍生物可包括其他取代基，只要維持乙炔特異性反應性即可。乙炔部分包含烷基乙炔及芳基乙炔及每一者之衍生物。烷基乙炔及芳基乙炔之衍生物可包括其他取代基，只要維持疊氮化物特異性反應性即可。
包含非天然編碼胺基酸之PSMC可用於利用抗體特異性之分析中。舉例而言，本發明之PSMC分子可用於篩選潛在抗原群體。
本發明提供具有多種官能基、取代基或部分之物質與其他物質的結合物，該等其他物質包括(但不限於)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯劑、細胞毒性化合物、放射性核素、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記、螢光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能基、與其他分子共價或非共價相互作用之基團、光捕獲部分、光可異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、併有重原子之部分、化學可裂解基團、光可裂解 基團、長側鏈、碳鍵聯糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性部分、經同位素標記部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、插入基團、發色團、能量轉移劑、生物活性劑、可偵測標記、小分子或上述各物之組合或任何其他所需化合物或物質。本發明亦提供具有疊氮或乙炔部分之物質與具有對應乙炔或疊氮部分之PEG聚合物衍生物的結合物。舉例而言，含有疊氮部分之PEG聚合物可與生物活性分子在該蛋白質中含有具有乙炔官能基的非遺傳編碼胺基酸之位置處偶合。用於PEG與生物活性分子之偶合的鍵聯包括(但不限於)Huisgen[3+2]環加成產物。
此項技術中充分確定，PEG可用於修飾生物材料之表面(參見例如美國專利6,610,281；Mehvar,R.,J.Pharmaceut.Sci.,3(1)：125-136(2000)，其以引用的方式併入本文中)。本發明亦包括生物材料，其包含具有一或多個反應性疊氮或乙炔位點之表面及一或多種經由Huisgen[3+2]環加成鍵聯偶合於該表面的本發明之含疊氮或乙炔之聚合物。生物材料及其他物質亦可經除疊氮或乙炔鍵聯之外的鍵聯(諸如經包含羧酸、胺、醇或硫醇部分之鍵聯)偶合於疊氮或乙炔活化之聚合物衍生物，以留下疊氮或乙炔部分可用於隨後反應。
本發明包括合成本發明之含疊氮及乙炔之聚合物的方法。在含疊氮之PEG衍生物的情況下，疊氮可直接鍵結於聚合物之碳原子。或者，可藉由將一個末端具有疊氮部分之鍵聯劑連接於習知經活化聚合物來製備含疊氮之PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有疊氮部分。在含乙炔之PEG衍生物的情況下，乙炔可直接鍵結於聚合物之碳原子。或者，可藉由將一個末端具 有乙炔部分之鍵聯劑連接於習知經活化聚合物來製備含乙炔之PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有乙炔部分。
更特定言之，在含疊氮之PEG衍生物的情況下，具有至少一個活性羥基部分之水溶性聚合物發生反應以生成其上具有更具反應性部分之經取代聚合物，該更具反應性部分諸如甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、甲苯磺酸酯或鹵素離去基團。熟練技術人員熟知含有磺醯鹵、鹵素原子及其他離去基團之PEG衍生物之製備及用途。所得經取代聚合物隨後發生反應以在聚合物末端用疊氮部分取代更具反應性部分。或者，具有至少一個活性親核或親電子部分之水溶性聚合物與在一個末端具有疊氮之鍵聯劑發生反應，以使得在PEG聚合物與鍵聯劑之間形成共價鍵，並且疊氮部分定位於聚合物之末端。熟練技術人員熟知親核及親電子部分，包括胺、硫醇、醯肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯及其類似部分。
更特定言之，在含乙炔之PEG衍生物的情況下，具有至少一個活性羥基部分之水溶性聚合物發生反應以置換含有乙炔部分的前驅物中之鹵素或其他經活化離去基團。或者，具有至少一個活性親核或親電子部分之水溶性聚合物與在一個末端具有乙炔之鍵聯劑發生反應，以使得在PEG聚合物與鍵聯劑之間形成共價鍵，並且乙炔部分定位於聚合物之末端。習此相關技藝之人士完善確立了鹵素部分、經活化離去基團、親核及親電子部分在有機合成背景及PEG衍生物之製備及用途中的用途。
本發明亦提供選擇性修飾蛋白質之方法，以向經修飾蛋白質中添加其他物質，包括(但不限於)水溶性聚合物，諸如含有疊氮或乙炔部分之PEG及PEG衍生物。可使用含疊氮及 乙炔之PEG衍生物修飾表面及分子之特性(其中生物相容性、穩定性、溶解性及缺乏免疫原性為重要的)，同時提供比此項技術中先前已知更具選擇性的連接PEG衍生物與蛋白質之方法。
II. 抗原結合多肽
存在多種PSMC。PSMC自身對多種抗原具有特異性。亦存在大量各種各樣之抗原特異性PSMC片段。因此，PSMC意欲包括展示特異性結合於標靶分子或抗原之能力的任何多肽。任何已知之抗體或抗體片段為PSMC。
本發明之PSMC可包含Fc區或Fc樣區。Fc結構域提供與效應功能之連接，諸如補體或吞噬細胞。免疫球蛋白之Fc部分具有長血漿半衰期，而Fab具有短壽命(Capon等人(1989),Nature,337：525-531)。當連同治療蛋白構築時，Fc結構域可提供更長半衰期或者併入諸如Fc受體結合、蛋白A結合、補體固定及可能甚至胎盤轉移之功能。舉例而言，IgG1抗體之Fc區已融合於CD30-L之N端，CD30-L為結合表現於霍奇金氏病腫瘤細胞、退行性淋巴瘤細胞、T細胞白血病細胞及其他惡性細胞類型上的CD30受體之分子(美國專利第5,480,981號)。抗發炎且抗排斥劑IL-10已融合於鼠類Fcγ2a以增加細胞因子之短循環半衰期。Zheng,X.等人(1995),The Journal of Immunology,154：5590-5600。亦已進行研究以評價與人類IgG1之Fc蛋白鍵聯的腫瘤壞死因子受體用於治療患有敗血性休克(Fisher,C.等人，N.Engl.J.Med.,334：1697-1702(1996)；Van Zee,K.等人，The Journal of Immunology,156：2221-2230(1996))及類風濕性關節炎(Moreland等人(1997),N.Engl.J.Med.,337(3)：141-147)之患者的用途。Fc亦已與CD4受體融合以產生用於治療AIDS之治 療蛋白(Capon等人(1989),Nature,337：525-531)。此外，介白素2之N端亦已融合於IgG1或IgG3之Fc部分以克服介白素2的短半衰期及其全身性毒性(Harvill等人(1995),Immunotechnology,1：95-105)。
熟知抗體Fc區由可藉由雙硫鍵或藉由非共價締合而鍵聯成二聚體或多聚體形式之單體多肽區段構成。原生Fc分子之單體亞單位之間的分子間雙硫鍵之數目取決於所涉及抗體之種類(例如，IgG、IgA、IgE)或子類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)而介於1至4範圍內。如本文所用，術語「Fc」為單體、二聚體及多聚體形式之Fc分子的總稱。應注意，當存在適當Cys殘基時，除非存在阻止經雙硫鍵形成進行二聚化的特定條件，否則Fc單體將自發二聚化。即使通常在Fc二聚體中形成雙硫鍵之Cys殘基經移除或由其他殘基置換，單體鏈通常仍將經非共價相互作用而二聚化。本文中使用術語「Fc」來意謂此等形式中之任一者：原生單體、原生二聚體(經雙硫鍵鍵聯)、經修飾二聚體(經雙硫鍵及/或非共價鍵鍵聯)及經修飾單體(亦即，衍生物)。
可藉由例如在包括非天然編碼胺基酸之殘基或序列上進行各種取代來構築Fc部分之變異體、類似物或衍生物。變異體(或類似物)多肽包括插入變異體，其中一或多個胺基酸殘基補充Fc胺基酸序列。插入可位於蛋白之任一或兩個末端，或者可定位於Fc胺基酸序列之內部區內。在任一或兩個末端具有額外殘基之插入變異體可包括例如融合蛋白及包括胺基酸標籤或標記之蛋白。舉例而言，Fc分子可視情況含有N端Met，尤其當該分子在細菌細胞(諸如大腸桿菌)中重組表現時。在Fc缺失變異體中，Fc多肽中之一或多個胺基酸殘基經移除。可在Fc多肽之一端或 兩端實現缺失，或者可藉由移除Fc胺基酸序列中之一或多個殘基來實現缺失。因此，缺失變異體包括Fc多肽序列之所有片段。在Fc取代變異體中，Fc多肽中之一或多個胺基酸殘基經移除且經替代殘基置換。在一個態樣中，取代實際上為保守的，然而，本發明亦涵蓋非保守取代。舉例而言，半胱胺酸殘基可缺失或經其他胺基酸置換以防止形成Fc序列之一些或全部雙硫交聯。蛋白質可具有一或多個半胱胺酸殘基，且可移除此等半胱胺酸殘基中之每一者或用其他胺基酸(諸如Ala或Ser，或非天然編碼胺基酸)取代一或多個該等半胱胺酸殘基。作為另一實例，亦可進行修飾以引用胺基酸取代，從而(1)消除Fc受體結合位點；(2)消除補體(Clq)結合位點；及/或(3)消除抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位點。該等位點為此項技術中已知的，且任何已知取代均在如本文所用之Fc的範疇內。舉例而言，關於IgG1中之ADCC位點，參見Molecular Immunology，第29卷，第5期，633-639(1992)。同樣，一或多個酪胺酸殘基亦可由苯丙胺酸殘基置換。此外，亦涵蓋其他變異體胺基酸插入、缺失(例如1-25個胺基酸)及/或取代且在本發明範疇內。保守胺基酸取代通常將為較佳的。此外，改變可呈改變之胺基酸形式，諸如肽模擬物或D-胺基酸。
Fc序列亦可衍生化，亦即具有除胺基酸殘基之插入、缺失或取代外的修飾。較佳地，修飾實際上為共價的，且包括例如與聚合物、脂質、其他有機部分及無機部分化學鍵結。本發明衍生物可經製備以增加循環半衰期或可經設計以改良多肽靶向所需細胞、組織或器官之能力。亦可使用完整Fc分子之救助受體結合結構域作為本發明化合物之Fc部分，諸如標題為「Altered Polypeptides with Increased Half-Life」之WO 96/32478中所述。本文中指定為Fc之分子類別的額外成員為標題為「Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives」之WO 97/34631中所述者。此段落中引用之這兩個公開PCT申請案均以引用之方式併入本文中。
將來可能發現額外PSMC。新PSMC可經所預測蛋白序列之電腦輔助二級及三級結構分析且藉由經設計以鑑別結合於特定標靶之分子的選擇技術來鑑別。該等以後發現之PSMC亦包括於本發明中。
因此，提供PSMC之描述以達成說明性目的且僅舉例說明且不為本文所述方法、組合物、策略及技術之範疇的限制。此外，本申請案中提及PSMC意欲使用該通用術語作為任何PSMC之實例。因此，應瞭解本文關於特定抗原結合多肽或蛋白所述之修飾及化學性質可同樣適用於任何抗原結合多肽，包括本文中特定列出者。
III. 用於本發明之一般重組核酸方法
在本發明之眾多實施例中，編碼所關注PSMC之核酸將經分離、選殖且通常使用重組方法發生改變。使用該等實施例，包括(但不限於)用於蛋白表現或在變異體、衍生物、表現卡匣或源於抗原結合多肽之其他序列的產生期間。在一些實施例中，編碼本發明多肽之序列可操作地鍵聯於異源啟動子。
編碼包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽的核苷酸序列可基於親本多肽之胺基酸序列合成且接著改變該核苷酸序列以便實現相關胺基酸殘基之引入(亦即併入或取代)或移除(亦即缺失或取代)。該核苷酸序列可便利地藉由定點突變誘發根據習 知方法來修飾。或者，該核苷酸序列可藉由化學合成來製備，包括(但不限於)藉由使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸基於所需多肽之胺基酸序列來設計，且較佳選擇將產生該重組多肽之宿主細胞中所青睞的彼等密碼子。舉例而言，編碼所需多肽之部分之數種小寡核苷酸可藉由PCR、連接或連接鏈反應來合成及組裝。參見例如Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；美國專利6,521,427，其以引用之方式併入本文中。
本發明利用重組遺傳學領域之常規技術。揭示本發明所用之一般方法的基礎教科書包括Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1994)。
描述分子生物學技術之一般教科書包括Berger及Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989(「Sambrook」)及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人編，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,(補充1999)(「Ausubel」)。此等教科書描述突變誘發、載體用途、啟動子及許多其他相關主題，包括(但不限於)產生包括用於產生蛋白的選擇密碼子之基因，該等蛋白包括非天然胺基酸、正交tRNA、正交合成酶及其對。
各種類型之突變誘發用於本發明中來達成多種目的， 包括(但不限於)產生tRNA文庫、產生合成酶文庫、產生選擇密碼子、將編碼非天然胺基酸之選擇密碼子插入所關注蛋白或多肽中。其包括(但不限於)定點、隨機點突變誘發、同源重組、DNA改組或其他循環突變誘發方法、嵌合構築、使用含尿嘧啶之模板進行的突變誘發、寡核苷酸定向突變誘發、硫代磷酸酯修飾之DNA突變誘發、使用間隙雙螺旋DNA或其類似物進行的突變誘發，或其任何組合。額外合適方法包括點錯配修復、使用修復缺乏宿主菌株進行之突變誘發、限制性選擇及限制性純化、缺失突變誘發、藉由總基因合成進行的突變誘發、雙股破裂修復及其類似方法。突變誘發，包括(但不限於)涉及嵌合構築體，亦包括在本發明中。在一個實施例中，可藉由天然存在分子或者經改變或突變之天然存在分子之已知資訊指導突變誘發，包括(但不限於)序列、序列比較、物理特性、二級結構、三級結構或四級結構、晶體結構及其類似資訊。
本文中發現之教科書及實例描述此等程序。額外資訊發現於以下公開案及其內所引用之參考文獻中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：an overview,Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith,In vitro mutagenesis,Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein及Shortle,Strategies and applications of in vitro mutagenesis,Science 229：1193-1201(1985)；Carter,Site-directed mutagenesis,Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel,The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis,Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein,F.及Lilley,D.M.J. 編輯，Springer Verlag,Berlin)(1987)；Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities,Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller及Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res.10：6487-6500(1982)；Zoller及Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors,Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller及Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA,Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye及Eckstein,Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.14： 9679-9698(1986)；Sayers等人，5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction,Nucl.Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer及Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations,Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E.coli,Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors,Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter,Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors,Methods in Enzymol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh及Henikoff,Use of oligonucleotides to generate large deletions,Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein,Science 223：1299-1301(1984)；Sakmar及Khorana,Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites,Gene 34：315-323(1985)；Grundström等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis,Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83：7177-7181(1986)；Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology,19：456-460(2001)；W.P.C.Stemmer,Nature 370,389-91(1994)；及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。關於多種上述方法之額外詳情可發現於Methods in Enzymology第154卷中，該文獻亦描述用各種突變誘發方法對故障檢查問題進行有效控制。
本發明亦是關於用於經由正交tRNA/RS對活體內併入非天然胺基酸之真核宿主細胞、非真核宿主細胞及生物體。用本發明之聚核苷酸或包括本發明之聚核苷酸的構築體(包括(但不限於)本發明載體，其可例如為選殖載體或表現載體)對宿主細胞進行遺傳工程改造(包括(但不限於)轉型、轉導或轉染)。 載體可例如呈質體、細菌、病毒、裸聚核苷酸或結合聚核苷酸之形式。藉由標準方法將載體引入細胞及/或微生物中，該等標準方法包括電穿孔(From等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985))；由病毒載體感染；藉由小粒子用核酸在小珠粒或粒子之基質內或在表面上進行高速彈道穿透(Klein等人，Nature 327,70-73(1987))。
可在適當時經調節用於諸如篩選步驟、活化啟動子或選擇轉化子之活性的習知營養培養基中培養經工程改造之宿主細胞。此等細胞可視情況在轉殖基因生物體中培養。包括(但不限於)關於細胞分離及培養(例如，關於隨後核酸分離)之其他有用參考文獻包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss,New York及其中所引用之參考文獻；Payne等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons,Inc.New York,NY；Gamborg及Phillips(編)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)及Atlas及Parks(編)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。
將標靶核酸引入細胞中之數種熟知方法可用，其中任一種均可用於本發明。其包括：將受體細胞與含有DNA之細菌原生質體融合、電穿孔、發射轟擊及用病毒載體感染(在下文中進一步論述)等。細菌細胞可用於擴增含有本發明之DNA構築體的質體數目。使細菌生長至對數生長期，並且可藉由多種此項技術中已知之方法(參見例如Sambrook)分離細菌內之質體。 此外，許多市售套組可用於自細菌純化質體(參見例如EasyPrepTM、FlexiPrepTM，均購自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，購自Stratagene；及QIAprepTM，購自Qiagen)。經分離及經純化之質體接著進一步經操縱以產生其他質體，用於轉染細胞或併入相關載體中以感染生物體。典型載體含有轉錄及轉譯終止子、轉錄及轉譯起始序列及可用於調控特定標靶核酸之表現的啟動子。載體視情況包含通用表現卡匣，該等卡匣含有至少一個獨立終止子序列、允許卡匣在真核生物或原核生物或兩者(包括(但不限於)穿梭載體)中複製的序列及用於原核及真核系統之選擇標記。載體適用於真核生物、原核生物或較佳兩者中之複製及整合。參見Giliman及Smith,Gene 8：81(1979)；Roberts等人，Nature,328：731(1987)；Schneider,B.等人，Protein Expr.Purif.6435：10(1995)；Ausubel,Sambrook,Berger(均同上文)。例如由ATCC提供可用於選殖之細菌及噬菌體之目錄，例如由ATCC公開之The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(編)。 用於測序、選殖及分子生物學其他態樣之額外基礎程序及基礎理論考慮因素亦發現於Watson等人(1992)Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books,NY中。此外，基本上任何核酸(及實際上任何經標記核酸，無論標準抑或非標準)均可為自任何多種商業來源定購之定製品或標準品，該等商業來源諸如Midland Certified Reagent Company(Midland,TX，可在全球資訊網上mcrc.com處獲得)、The Great American Gene Company(Ramona,CA，可在全球資訊網上genco.com處獲得)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL，可在全球資訊網上expressgen.com處獲得)、Operon Technologies Inc.(Alameda,CA)及多種其他商業來源。
選擇密碼子
本發明之選擇密碼子擴大蛋白生物合成機器之遺傳密碼子構架。舉例而言，選擇密碼子包括(但不限於)獨特三鹼基密碼子、無意義密碼子(諸如終止密碼子，包括(但不限於)琥珀密碼子(UAG)或乳白密碼子(UGA))、非天然密碼子、四個或四個以上鹼基密碼子、稀有密碼子及其類似物。熟習此項技術者輕易地瞭解，有許多數目之選擇密碼子可引入所需基因中，包括(但不限於)編碼至少一部分PSMC之單一聚核苷酸中的一或多個、兩個或兩個以上、三個以上、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。
在一個實施例中，該等方法涉及使用選擇密碼子，該選擇密碼子為用於在真核細胞中活體內併入非天然胺基酸之終止密碼子。舉例而言，產生識別終止密碼子(包括(但不限於)UAG)之O-tRNA，並且其藉由O-RS用所需非天然胺基酸進行胺醯化。此O-tRNA不由天然存在宿主之胺醯基-tRNA合成酶所識別。習知定點突變誘發可用於在所關注多肽中之所關注位點處引入終止密碼子，包括(但不限於)TAG。參見例如Sayers,J.R.等人(1988),5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res,791-802。當O-RS、O-tRNA及編碼所關注多肽之核酸活體內組合時，非天然胺基酸回應於UAG密碼子而併入，從而產生在指定位置處含有非天然胺基酸之多肽。
可在不顯著擾動真核宿主細胞下進行活體內非天然胺基酸之併入。舉例而言，因為UAG密碼子之抑制效率取決於O-tRNA(包括(但不限於)琥珀抑制基因tRNA)與真核釋放因 子(包括(但不限於)eRF)(其結合於終止密碼子並引發生長肽自核糖體釋放)之間的競爭，故抑制效率可藉由包括(但不限於)增加O-tRNA及/或抑制基因tRNA之表現水準來調節。
選擇密碼子亦包含長密碼子，包括(但不限於)四個或四個以上鹼基密碼子，例如四、五、六個或更多個鹼基密碼子。四鹼基密碼子之實例包括：包括(但不限於)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU及其類似密碼子。五鹼基密碼子之實例包括(但不限於)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC及其類似密碼子。本發明之特徵包括使用基於讀框轉移抑制之長密碼子。四個或四個以上鹼基密碼子可將包括(但不限於)一或多個非天然胺基酸插入同一蛋白中。舉例而言，在突變型O-tRNA(包括(但不限於)具有反密碼子環(例如具有至少8-10個核苷酸反密碼子環)之特殊讀框轉移抑制基因tRNA)存在下，將四個或四個以上鹼基密碼子讀為單一胺基酸。在其他實施例中，反密碼子環可解碼包括(但不限於)至少四鹼基密碼子、至少五鹼基密碼子或至少六鹼基密碼子或更多鹼基密碼子。由於存在256種可能的四鹼基密碼子，因此可使用四個或四個以上鹼基密碼子在同一細胞中編碼多種非天然胺基酸。參見Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9：237-244；Magliery,(2001)Expanding the Genetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of「Shifty」Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli,J.Mol.Biol.307：755-769。
舉例而言，四鹼基密碼子已用於使用活體外生物合成方法將非天然胺基酸併入蛋白中。參見例如Ma等人，(1993) Biochemistry,32：7939；及Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.,121：34。用兩個經化學醯化之讀框轉移抑制基因tRNA，使用CGGG及AGGU同時將2-萘基丙胺酸及離胺酸之NBD衍生物活體外併入抗生蛋白鏈菌素中。參見例如Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.,121：12194。在活體內研究中，Moore等人檢查了具有NCUA反密碼子之tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，並且發現四聯體UAGA可以13至26%的效率由具有UCUA反密碼子之tRNALeu解碼，其中在0或-1框架中發生極少解碼。參見Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.,298：195。在一個實施例中，基於稀有密碼子或無意義密碼子之長密碼子可用於本發明，其可減少在其他非所需位點處的誤義通讀及讀框轉移抑制。
對於既定系統，選擇密碼子亦可包括一種天然三鹼基密碼子，其中內源系統並不使用(或極少使用)該天然鹼基密碼子。舉例而言，此系統包括缺乏識別天然三鹼基密碼子之tRNA的系統及/或其中三鹼基密碼子為稀有密碼子之系統。
選擇密碼子視情況包括非天然鹼基對。此等非天然鹼基對進一步擴大現有遺傳字符集。一種額外鹼基對將三聯體密碼子的數目自64增加至125。第三鹼基對之特性包括穩定及選擇性鹼基配對、藉由聚合酶高保真地有效酶法併入DNA中，及在合成初生非天然鹼基對之後有效持續的引子延長。可適於方法及組合物之非天然鹼基對的描述包括例如Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein,Nature Biotechnology,20：177-182。其它相關出版物列於下文中。
對於活體內使用，非天然核苷為膜可滲透的，並且經磷酸化而形成相應三磷酸酯。此外，增加之遺傳資訊為穩定的並且不受細胞酶破壞。Benner及他人之先前工作利用了不同於經典Watson-Crick對之氫鍵結模式，其中最值得注意之實例為iso-C：iso-G對。參見例如Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.,111：8322；及Piccirilli等人，(1990)Nature,343：33；Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4：602。此等鹼基通常與天然鹼基以一定程度錯配，並且不能酶法複製。Kool及同事證明鹼基之間的疏水性填充相互作用可替代氫鍵結以促使鹼基對形成。參見Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4：602；及Guckian及Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825.在開發滿足所有上述要求之非天然鹼基對的工作中，Schultz、Romesberg及同事已經系統地合成並研究了一系列非天然疏水性鹼基。發現PICS：PICS自身對比天然鹼基對更為穩定，並且可藉由大腸桿菌DNA聚合酶I之Klenow片段(KF)有效地併入DNA中。參見例如McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.,121：11586；及Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.,122：3274。可由KF以足以滿足生物功能之效率及選擇性合成3MN：3MN自身對。參見例如Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.,122：8803。然而，兩種鹼基均充當用於進一步複製之鏈終止劑。最近已發展可用於複製PICS自身對之突變型DNA聚合酶。此外，可複製7AI自身對。參見例如Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc.,123：7439。亦已開發出在結合Cu(II)時形成穩定對之新穎金屬鹼基對Dipic：Py。參見Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc.,122：10714。因為長密碼子及非天然密碼子固有地與天然密碼子正交，故本發明方法可利用此特性來針對其產生正交 tRNA。
轉譯繞過系統亦可用於將非天然胺基酸併入所需多肽中。在轉譯繞過系統中，大序列併入基因中，但並未轉譯為蛋白。該序列含有充當誘導核糖體在序列上跳躍並且再繼續插入之下游轉譯的插入物之結構。
在某些實施例中，本發明方法及/或組合物中之所關注蛋白或多肽(或其部分)由核酸編碼。核酸典型地包含至少一個選擇密碼子、至少兩個選擇密碼子、至少三個選擇密碼子、至少四個選擇密碼子、至少五個選擇密碼子、至少六個選擇密碼子、至少七個選擇密碼子、至少八個選擇密碼子、至少九個選擇密碼子、十個或十個以上選擇密碼子。
可使用熟習此項技術者所熟知及本文中所描述之方法對編碼所關注蛋白或多肽之基因誘發突變，以包括例如用於併入非天然胺基酸之一或多個選擇密碼子。舉例而言，對所關注蛋白之核酸誘發突變以包括用於併入一或多個非天然胺基酸之一或多個選擇密碼子。本發明包括任何該變異體，包括(但不限於)突變體、任何蛋白形式，例如包括至少一個非天然胺基酸。同樣，本發明亦包括對應核酸，亦即具有編碼一或多個非天然胺基酸之一或多個選擇密碼子的任何核酸。
可輕易地使編碼所關注蛋白(諸如PSMC)之核酸分子突變以在多肽的任何所需位置處引入半胱胺酸。半胱胺酸廣泛用於在所關注蛋白上引入反應性分子、水溶性聚合物、蛋白或多種其他分子。適於將半胱胺酸引入抗原結合多肽之所需位置中的方法為此項技術中所熟知，諸如美國專利第6,608,183號(其以引用的方式併入本文中)中所述者及標準突變誘發技術。
IV. 非天然編碼胺基酸
多種非天然編碼胺基酸適用於本發明。可將任何數目之非天然編碼胺基酸引入PSMC中。一般而言，所引入之非天然編碼胺基酸實質上對20種常見遺傳編碼胺基酸(亦即丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸)呈化學惰性。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包括與未發現於20種常見胺基酸中之官能基(包括(但不限於)疊氮基、酮基、醛基及胺氧基)有效且選擇性地反應而形成穩定結合物之側鏈官能基。舉例而言，包括含有疊氮基官能基之非天然編碼胺基酸的抗原結合多肽可與聚合物(包括(但不限於)聚(乙二醇))反應，或者與含有炔部分之第二多肽反應以形成穩定結合物，從而產生疊氮與炔官能基之選擇性反應以形成Huisgen[3+2]環加成產物。
α-胺基酸之一般結構如下所示(式I)：
非天然編碼胺基酸典型地為具有上文所列式之任何結構，其中R基團為除用於二十種天然胺基酸中的取代基之外的任何取代基，並且可適用於本發明。因為本發明之非天然編碼胺基酸典型地與天然胺基酸僅在側鏈結構中有所不同，故該非天然編碼胺基酸與其他胺基酸(包括(但不限於)天然或非天然編碼的)以與天然存在多肽中醯胺鍵形成方式相同之方式形成醯胺鍵。 然而，非天然編碼胺基酸具有與天然胺基酸不同之側鏈基團。舉例而言，R視情況包含烷基-、芳基-、醯基-、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵基-、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒-、磺醯基-、硼酸根(borate)、硼酸根(boronate)、磷酸基、膦醯基、膦、雜環基、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺基或其類似基團或其任何組合。其他可適用於本發明之所關注的非天然存在胺基酸包括(但不限於)包含光可活化交聯劑之胺基酸、經自旋標記胺基酸、螢光胺基酸、金屬結合胺基酸、含金屬胺基酸、放射性胺基酸、具有新穎官能基之胺基酸、與其他分子共價或非共價相互作用之胺基酸、光捕獲及/或光可異構化胺基酸、包含生物素或生物素類似物之胺基酸、糖基化胺基酸(諸如經糖取代之絲胺酸)、其他碳水化合物修飾之胺基酸、含酮基胺基酸、包含聚乙二醇或聚醚之胺基酸、經重原子取代的胺基酸、化學可裂解及/或光可裂解胺基酸、與天然胺基酸相比具有長側鏈(包括(但不限於)聚醚或長鏈烴，包括(但不限於)大於約5個或大於約10個碳)之胺基酸、碳鍵聯之含糖胺基酸、氧化還原活性胺基酸、含胺基硫代酸之胺基酸及包含一或多個毒性部分之胺基酸。
可適用於本發明並且可用於與水溶性聚合物反應之例示性非天然編碼胺基酸包括(但不限於)具有羰基、胺氧基、肼、醯肼、胺基脲、疊氮及炔反應性基團之胺基酸。在一些實施例中，非天然編碼胺基酸包含醣部分。該等胺基酸之實例包括N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-胺基半乳糖基-L-絲胺酸、N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-蘇胺酸、N-乙醯基-L-葡糖胺基-L-天冬醯胺及O-胺基甘露糖基-L-絲胺酸。該等胺基酸之實例亦包括以下實例，其中胺基酸與醣之間的天然存在N-或O-鍵聯由通 常未在自然界中發現之共價鍵聯(包括(但不限於)烯烴、肟、硫醯、醯胺及其類似物)置換。該等胺基酸之實例亦包括通常未發現於天然存在蛋白中之醣，諸如2-去氧-葡萄糖、2-去氧半乳糖及其類似物。
本文所提供之多種非天然編碼胺基酸為市售的，例如可購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(EMD Biosciences之一個分部，Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)。未市售之胺基酸視情況如本文所提供或使用熟習此項技術者所已知之標準方法合成得到。關於有機合成技術，參見例如Organic Chemistry Fessendon及Fessendon,(1982,第2版，Willard Grant Press,Boston Mass.)；Advanced Organic Chemistry March(第3版，1985,Wiley and Sons,New York)；及Advanced Organic Chemistry Carey及Sundberg(第3版，部分A及B,1990,Plenum Press,New York)。亦參見美國專利申請公開案2003/0082575及2003/0108885，其以引用之方式併入本文中。除了含有新穎側鏈之非天然胺基酸之外，可適用於本發明之非天然胺基酸視情況亦包含經修飾骨架結構，包括(但不限於)如由式II及III之結構所說明：
其中Z典型地包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R'；X及Y可相同或不同，典型地包含S或O，並且R及R'視情況相同或不同，典型地選自上文對具有式I之非天然胺基酸所述的R基團之相同組成清單以及氫。舉例而言，本發明之非天然胺基酸視情況包含如由式II及III所說明之胺基或羧基中的取代。此類型之非天然胺基酸包括(但不限於)α-羥基酸、α-硫代酸、α-胺基硫代羧酸酯，包括(但不限於)具有對應於常見20種天然胺基酸之側鏈或非天然側鏈。此外，在α-碳處之取代視情況包括(但不限於)L、D或α-α-二取代胺基酸，諸如D-麩胺酸、D-丙胺酸、D-甲基-O-酪胺酸、胺基丁酸及其類似物。其他結構替代物包括環狀胺基酸，諸如脯胺酸類似物以及3、4、6、7、8及9員環脯胺酸類似物；β及γ胺基酸，諸如經取代β-丙胺酸及γ-胺基丁酸。
許多非天然胺基酸是基於天然胺基酸，諸如酪胺酸、麩醯胺酸、苯丙胺酸及其類似物，並且適用於本發明。酪胺酸類似物包括(但不限於)對位取代之酪胺酸、鄰位取代之酪胺酸及間位取代之酪胺酸，其中經取代酪胺酸包含：包括(但不限於)酮基(包括(但不限於)乙醯基)、苯甲醯基、胺基、肼、羥胺、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或分支鏈烴、飽和或不飽和烴、O-甲基、聚醚基團、硝基、炔基或其類似基團。此外，亦涵蓋多取代芳基環。可適用於本發明之麩醯胺酸類似物包括(但不限於)α-羥基衍生物、γ取代之衍生物、環狀衍生物及醯胺取代之麩醯胺酸衍生物。可適用於本發明之例示性苯丙胺酸類似物包括(但不限於)對位取代之苯丙胺酸、鄰位取代之苯丙胺酸及間位取代之苯丙胺酸，其中取代基包含：包括(但不限於)羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、疊氮基、碘、溴、酮基(包括(但 不限於)乙醯基)、苯甲醯基、炔基或其類似基團。可適用於本發明之非天然胺基酸的特定實例包括(但不限於)對乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcβ-絲胺酸、L-多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷酸絲胺酸、膦醯基絲胺酸、膦醯基酪胺酸、對碘-苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸及對炔丙氧基-苯丙胺酸及其類似物。可適用於本發明之多種非天然胺基酸的結構實例提供於例如標題為「In vivo incorporation of unnatural amino acids.」之WO 2002/085923中。關於額外甲硫胺酸類似物，亦參見Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS 99：19-24。
在一個實施例中，提供包括非天然胺基酸(諸如對(炔丙氧基)-苯丙胺酸)之PSMC組合物。亦提供包含對(炔丙氧基)-苯丙胺酸之各種組合物及包括(但不限於)蛋白及/或細胞。在一個態樣中，包括對(炔丙氧基)-苯丙胺酸非天然胺基酸之組合物進一步包括正交tRNA。非天然胺基酸可鍵結(包括(但不限於)共價)於正交tRNA，包括(但不限於)經胺基-醯基鍵共價鍵結於正交tRNA，共價鍵結於正交tRNA之末端核糖的3'OH或2'OH等。
經由非天然胺基酸可併入蛋白中之化學部分提供蛋白的多種優勢及操縱。舉例而言，酮基官能基之獨特反應性允許用任何多種含肼或羥胺之試劑活體外及活體內選擇性修飾蛋白。 舉例而言，重原子非天然胺基酸可用於定相X射線結構資料。使用非天然胺基酸進行重原子位點特異性引入亦在選擇重原子的位置方面提供選擇性及靈活性。舉例而言，光反應性非天然胺基酸(包括(但不限於)具有苯甲酮及芳基疊氮(包括(但不限於)苯基疊氮)側鏈之胺基酸)允許有效的活體內及活體外蛋白光交聯。 光反應性非天然胺基酸之實例包括(但不限於)對疊氮基-苯丙胺酸及對苯甲醯基-苯丙胺酸。具有光反應性非天然胺基酸之蛋白隨後可藉由激發光反應性基團而任意交聯，從而提供暫時控制。在一個實例中，非天然胺基之甲基可經同位素標記取代，包括(但不限於)作為局部結構及動力學探針的甲基，包括(但不限於)藉由使用核磁共振及振動光譜學。舉例而言，炔基或疊氮基官能基允許用分子經[3+2]環加成反應選擇性修飾蛋白。
併入多肽中之胺基端的非天然胺基酸可由R基團(其為除用於20種天然胺基酸中的取代基之外的任何取代基)及第二反應性基團(不同於通常存在於α-胺基酸中之NH2基團)(參見式I)構成。可用不同於通常存在於α-胺基酸中之COOH基團(參見式I)的第二反應性基團在羧基端引入類似非天然胺基酸。
非天然胺基酸之化學合成
許多適用於本發明之非天然胺基酸為市售的，例如可購自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)。未市售之胺基酸視情況如本文所提供或如各種出版物中所提供或使用熟習此項技術者所已知之標準方法合成得到。關於有機合成技術，參見例如Organic Chemistry Fessendon及Fessendon,(1982，第2版，Willard Grant Press,Boston Mass.)；Advanced Organic Chemistry March(第3版，1985,Wiley and Sons,New York)；及Advanced Organic Chemistry Carey及Sundberg(第3版，部分A及B,1990,Plenum Press,New York)。描述非天然胺基酸合成之額外出版物包括例如標題為「In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids」之WO 2002/085923；Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.及Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J.Chem.Soc.,3315-3319；Friedman,O.M.及Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等人(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.及Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,.Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.及Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.及Rapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org.Chem.1989：1859-1866；Barton等人，(1987)Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids,L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett.43：4297-4308；及Subasinghe等人， (1992)Quisqualic acid analogues：synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35：4602-7。亦參見2003年12月22日申請之標題為「Protein Arrays」之專利申請案第10/744,899號，及2002年12月22日申請之專利申請案第60/435,821號。
A. 羰基反應性基團
具有羰基反應性基團之胺基酸允許各種反應以尤其經由親核加成或醛醇縮合反應來鍵聯分子(包括(但不限於)PEG或其他水溶性分子)。
例示性含羰基胺基酸可如下所示：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經取代烷基及經取代芳基；且R3為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R4為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基且R2為簡單烷基(亦即甲基、乙基或丙基)且酮部分定位於相對於烷基側鏈之對位。在一些實施例中，n為1，R1為苯基且R2為簡單烷基(亦即甲基、乙基或丙基)且酮部分定位於相對於烷基側鏈之間位。
對乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸及間乙醯基-(+/-)-苯丙胺酸之合成描述於Zhang,Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中，其以引用之方式併入本文中。熟習此項技術者可相似地製備其他含羰基胺基酸。
在一些實施例中，包含非天然編碼胺基酸之多肽經 化學修飾以產生反應性羰基官能基。舉例而言，可自具有相鄰胺基及羥基之官能基產生可用於結合反應之醛官能基。當生物活性分子為多肽時，例如N-端絲胺酸或蘇胺酸(其通常可存在或者可經由化學或酶消化而暴露)可用於在溫和氧化裂解條件下使用過碘酸鹽產生醛官能基。參見例如Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan,K.及Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。然而，此項技術中已知之方法限於肽或蛋白N-端之胺基酸。
在本發明中，攜帶有相鄰羥基及胺基之非天然編碼胺基酸可併入多肽中作為「經遮蔽」醛官能基。舉例而言，5-羥基離胺酸攜帶有相鄰於ε胺之羥基。用於產生醛之反應條件典型地涉及在溫和條件下添加莫耳過量之偏過碘酸鈉以避免在多肽內之其他位點處的氧化。氧化反應的pH典型地為約7.0。典型反應涉及向多肽之緩衝溶液中添加約1.5莫耳過量之偏過碘酸鈉，接著在黑暗中培養約10分鐘。參見例如美國專利第6,423,685號，其以引用之方式併入本文中。
羰基官能基可與含肼、醯肼、羥胺或胺基脲之試劑在溫和條件下在水溶液中選擇性反應以分別形成在生理條件下穩定的對應腙、肟或縮胺基脲鍵聯。參見例如Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.及Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基之獨特反應性允許在其他胺基酸側鏈存在下進行選擇性修飾。參見例如Cornish,V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.及Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal,L.K.等人， Science 276：1125-1128(1997)。
B. 肼、醯肼或胺基脲反應性基團
含有親核基團(諸如肼、醯肼或胺基脲)之非天然編碼胺基酸允許與多種親電子基團反應以形成結合物(包括(但不限於)與PEG或其他水溶性聚合物)。
例示性含肼、醯肼或胺基脲之胺基酸可如下所示：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，n為4，R1不存在，且X為N。在一些實施例中，n為2，R1不存在，且X不存在。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，且氧原子定位於芳基環上脂族基團之對位。
含肼、醯肼及胺基脲之胺基酸可購自商業來源。舉例而言，L-麩胺酸-γ-醯肼可購自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。熟習此項技術者可製備其他未市售之胺基酸。參見例如美國專利第6,281,211號，其以引用之方式併入本文中。
含有攜帶醯肼、肼或胺基脲官能基之非天然編碼胺基酸的多肽可有效地且選擇性地與多種含有醛或其他官能基之分子以類似化學反應性反應。參見例如Shao,J.及Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。如與存在於20種常見胺基酸上之親核基團(包括(但不限於)絲胺酸或蘇胺酸之羥基或離胺酸之胺基及N端)相比，醯肼、肼及胺基脲官能基的獨特反應性 使得其對醛、酮及其他親電子基團顯著更具反應性。
C. 含胺氧基之胺基酸
含有胺氧基(亦稱為羥胺)之非天然編碼胺基酸允許與多種親電子基團反應以形成結合物(包括(但不限於)與PEG或其他水溶性聚合物)。如同肼、醯肼及胺基脲，胺氧基之增強的親核性允許其與多種含有醛或其他官能基之分子以類似化學反應性有效地且選擇性地反應。參見例如Shao,J.及Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang及C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34：727-736(2001)。儘管與肼基團反應之結果為相應腙，但肟通常來源於胺氧基與含羰基之基團(諸如酮)的反應。
例示性含胺氧基之胺基酸可如下所示：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；Y=C(O)或不存在；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為1且Y存在。在一些實施例中，n為2，R1及X不存在，m為0且Y不存在。
含胺氧基之胺基酸可由輕易可得之胺基酸前驅物(高絲胺酸、絲胺酸及蘇胺酸)製備。參見例如M.Carrasco及R.Brown,J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。某些含胺氧基之胺基酸，諸如L-2-胺基-4-(胺氧基)丁酸已自天然來源分離(Rosenthal,G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。熟習此項技術者可製備其他含胺氧基之胺基酸。
D. 疊氮及炔反應性基團
疊氮及炔官能基之獨特反應性使得其極其可用於多肽及其他生物分子之選擇性修飾。有機疊氮化物(尤其脂族疊氮化物)及炔通常對普通反應性化學條件穩定。特定言之，疊氮及炔官能基對發現於天然存在多肽中之20種常見胺基酸的側鏈(亦即R基團)呈惰性。然而，當緊密接近時，顯示出疊氮及炔基團之「彈簧負載」性質，並且其經由Huisgen[3+2]環加成反應選擇性且有效地反應以生成對應三唑。參見例如Chin J.等人，Science 301：964-7(2003)；Wang,Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)。
因為Huisgen環加成反應涉及選擇性環加成反應(參見例如Padwa,A.COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(Trost,B.M.編輯，1991)，第1069-1109頁；Huisgen,R.1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY,(Padwa,A.編輯，1984)，第1-176頁)而非親核取代，故併入攜帶含疊氮及炔之側鏈的非天然編碼胺基酸允許所得多肽在非天然編碼胺基酸之位置處經選擇性修飾。可在室溫下在水性條件下，藉由添加催化量之Cu(II)(包括(但不限於)呈催化量之CuSO4形式)，在用於將Cu(II)還原成Cu(I)之還原劑存在下原位進行涉及含疊氮或炔之PSMC的環加成反應。參見例如Wang,Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等人，J.Org.Chem.67：3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599(2002)。例示性還原劑包括(包括(但不限於))抗壞血酸鹽、金屬銅、奎寧、氫醌、維生素K、麩胱甘肽、半胱胺酸、Fe2+、Co2+ 及施加電位。
在一些情況下，當需要疊氮化物與炔之間的Huisgen[3+2]環加成反應時，抗原結合多肽包含包含炔部分之非天然編碼胺基酸，且欲連接於該胺基酸之水溶性聚合物包含疊氮部分。或者，亦可執行逆向反應(亦即使用胺基酸上之疊氮部分及存在於水溶性聚合物上之炔部分)。
疊氮官能基亦可與含有芳基酯之水溶性聚合物選擇性反應，並且用芳基膦部分適當官能化以產生醯胺鍵聯。芳基膦基團原位還原疊氮，並且所得胺隨後與最接近的酯鍵聯有效地反應以產生對應醯胺。參見例如E.Saxon及C.Bertozzi,Science 287,2007-2010(2000)。含疊氮之胺基酸可為烷基疊氮化物(包括(但不限於)2-胺基-6-疊氮基-1-己酸)或芳基疊氮化物(對疊氮基-苯丙胺酸)。
含有芳基酯及膦部分之例示性水溶性聚合物可如下所示：
其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物且R可為H、烷基、芳基、經取代烷基及經取代芳基。例示性R基團包括(但不限於)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-鹵素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN及-NO2。R'、R"、R"'及R""各自獨立地指氫、經取代或未經取代雜烷基、經取代或未經取代芳基，包括(但不限於)經1-3個鹵素取代之芳基、經取代或未經取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。舉例而言，當本發明化合物包括一個以上R基團時，各 R基團獨立地經選擇，如同當存在R'、R"、R"'及R""基團中之一者以上時，此等基團時各自經選擇。當R'及R"連接於同一氮原子時，其可與氮原子組合以形成5、6或7員環。舉例而言，-NR'R"意欲包括(但不限於)1-吡咯啶基及4-嗎啉基。基於上述取代基論述，熟習此項技術者應瞭解術語「烷基」意欲包括與除氫基團以外之基團結合之包括碳原子的基團，諸如鹵代烷基(包括(但不限於)-CF3及-CH2CF3)及醯基(包括(但不限於)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3及其類似基團)。
疊氮官能基亦可與含有硫酯之水溶性聚合物選擇性反應，並且用芳基膦部分適當官能化以產生醯胺鍵聯。芳基膦基團原位還原疊氮，並且所得胺隨後與硫酯鍵聯有效地反應以產生對應醯胺。含有硫酯及膦部分之例示性水溶性聚合物可如下所示：
其中n為1-10；X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。
例示性含炔胺基酸可如下所示：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X不存在，m為0，且乙炔部分定位於相對於烷基側鏈之對位。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為1，且炔丙氧基定位於相對 於烷基側鏈之對位(亦即O-炔丙基-酪胺酸)。在一些實施例中，n為1，R1及X不存在且m為0(亦即炔丙基甘胺酸)。
含炔胺基酸為市售的。舉例而言，炔丙基甘胺酸可購自Peptech(Burlington,MA)。或者，含炔胺基酸可根據標準方法製備。舉例而言，對炔丙氧基苯丙胺酸可例如如Deiters,A.等人，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783(2003)中所述來合成，且4-炔基-L-苯丙胺酸可如Kayser,B.等人，Tetrahedron 53(7)：2475-2484(1997)中所述來合成。熟習此項技術者可製備其他含炔胺基酸。
例示性含疊氮之胺基酸可如下所示：
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基、經取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X不存在，m為0，且疊氮部分定位於烷基側鏈之對位。在一些實施例中，n為0-4且R1及X不存在，且m=0。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為2，且β-疊氮基乙氧基部分定位於相對於烷基側鏈之對位。
含疊氮之胺基酸可購自商業來源。舉例而言，4-疊氮基苯丙胺酸可獲自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)。對於未市售之彼等含疊氮之胺基酸，疊氮基可使用熟習此項技術者已知之標準方法相對輕易地製備，包括(但不限於)經由合適離去基團(包括(但不限於)鹵離子、甲磺酸酯基、甲苯磺 酸酯基)之移位或經由經適當保護之內酯的打開。參見例如Advanced Organic Chemistry March(第3版，1985,Wiley and Sons,New York)。
E. 胺基硫醇反應性基團
β取代之胺基硫醇官能基之獨特反應性使得其極其可用於多肽及其他含有醛基團之生物分子經由形成噻唑啶進行選擇性修飾。參見例如J.Shao及J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些實施例中，β取代之胺基硫醇胺基酸可併入PSMC多肽中且隨後與包含醛官能基之水溶性聚合物反應。在一些實施例中，水溶性聚合物、藥物結合物或其他有效負載可經由形成噻唑啶偶合於包含β取代之胺基硫醇胺基酸之PSMC多肽。
非天然胺基酸之細胞攝取
真核細胞攝取非天然胺基酸為當設計及選擇包括(但不限於)用於併入蛋白質中之非天然胺基酸時典型地考慮之一個問題。舉例而言，α-胺基酸之高電荷密度顯示此等化合物不可能為細胞可滲透的。天然胺基酸經由基於蛋白質之轉運系統的集合攝取至真核細胞中。可進行快速篩選來分析由細胞攝取之非天然胺基酸(若攝取的話)。參見例如在例如2003年12月22日申請之標題為「Protein Arrays,」的申請案第10/744,899號及2002年12月22日申請之申請案第60/435,821號以及Liu,D.R.及Schultz,P.G.(1999)Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States 96：4780-4785中之毒性分析。儘管攝取輕易地使用各種分析來分析，但設計服從細胞攝取路徑之非天然胺基酸的替代方案是提供生物合成路徑 來活體內產生胺基酸。
非天然胺基酸之生物合成
多種生物合成路徑已經存在於細胞中用於產生胺基酸及其他化合物。雖然用於特定非天然胺基酸之生物合成方法可能實際上不存在，包括(但不限於)在真核細胞中，但本發明提供該等方法。舉例而言，用於非天然胺基酸之生物合成路徑視情況在宿主細胞中藉由添加新酶或修飾現有宿主細胞路徑來產生。額外新酶視情況為天然存在酶或人工演化酶。舉例而言，對胺基苯丙胺酸(如標題為「In vivo incorporation of unnatural amino acids」之WO 2002/085923中的實例所呈遞)之生物合成依賴於添加來自其他生物體之已知酶的組合。針對此等酶之基因可藉由用包含該等基因之質體轉型真核細胞而引入該細胞中。該等基因當在細胞中表現時，提供合成所需化合物之酶路徑。視情況添加之酶類型的實例提供於以下實例中。額外酶序列發現於例如Genbank中。亦視情況以相同方式將人工演化酶添加至細胞中。以此方式操縱細胞機器及細胞資源以產生非天然胺基酸。
多種方法可用於產生用於生物合成路徑或用於現有路徑演化之新穎酶。舉例而言，包括(但不限於)如由Maxygen,Inc.(可在全球資訊網上maxygen.com處獲得)所開發之遞歸重組視情況用於開發新穎酶及路徑。參見例如Stemmer(1994),Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370(4)：389-391；及Stemmer,(1994),DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91：10747-10751.同樣，由Genencor(可在全球資訊網上genencor.com處獲得)所 開發之DesignPathTM視情況用於代謝路徑工程改造，包括(但不限於)以工程改造在細胞中產生O-甲基-L-酪胺酸之路徑。此技術使用新基因(包括(但不限於)經功能基因組學及分子演化及設計來鑑別)之組合在宿主生物體中重建現有路徑。Diversa Corporation(可在全球資訊網上diversa.com處獲得)亦提供用於快速篩選基因及基因路徑之文庫的技術，包括(但不限於)以建立新路徑。
典型地，用本發明之經工程改造之生物合成路徑產生非天然胺基酸，其濃度足以進行有效蛋白生物合成，包括(但不限於)天然細胞量，但未達到諸如影響其他胺基酸濃度或耗盡細胞資源之程度。以此方式活體內產生之典型濃度為約10mM至約0.05mM。一旦用包含用於產生特異性路徑所需酶之基因的質體轉型細胞並且產生非天然胺基酸，就視情況使用活體內選擇以進一步最佳化用於核糖體蛋白合成及細胞生長之非天然胺基酸的產生。
具有非天然胺基酸之多肽
可為了多種目的進行非天然胺基酸之併入，包括(但不限於)定製蛋白結構及/或功能之改變；改變大小、酸度、親核性、氫鍵結、疏水性、蛋白酶標靶位點可達性；靶向部分(包括(但不限於)用於蛋白陣列)；添加生物活性分子；連接聚合物；連接放射性核素；調節血清半衰期；調節組織滲透(例如腫瘤)；調節主動轉運；調節組織、細胞或器官特異性；調節免疫原性；調節蛋白酶抗性等。包括非天然胺基酸之蛋白可具有增強或甚至全新之催化或生物物理特性。舉例而言，視情況藉由將非天然胺基酸納入蛋白中來調節以下特性：毒性、生物分佈、結構特性、 光譜特性、化學及/或光化學特性、催化能力、半衰期(包括(但不限於)血清半衰期)、與其他分子反應之能力(包括(但不限於)共價或非共價)及其類似特性。包括含有至少一種非天然胺基酸之蛋白的組合物可用於包括(但不限於)新穎治療劑、診斷劑、催化酶、工業酶、結合蛋白(包括(但不限於)抗體)及包括(但不限於)蛋白結構及功能研究。參見例如Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function,Current Opinion in Chemical Biology,4：645-652。
在本發明之一個態樣中，組合物包括至少一種具有至少一個(包括(但不限於)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或者至少十個或十個以上)非天然胺基酸之蛋白。該等非天然胺基酸可相同或不同，包括(但不限於)在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種不同非天然胺基酸之蛋白質中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同位點。在另一態樣中，組合物包括其中至少一個(但少於全部)存在於蛋白質中之特定胺基酸由非天然胺基酸取代之蛋白質。對於具有一個以上非天然胺基酸之既定蛋白，該等非天然胺基酸可相同或不同(包括(但不限於)該蛋白可包括兩種或兩種以上不同類型的非天然胺基酸，或可包括兩種相同非天然胺基酸)。對於具有兩個以上非天然胺基酸之既定蛋白，該等非天然胺基酸可相同、不同或為多個相同類型之非天然胺基酸與至少一個不同非天然胺基酸的組合。
具有至少一個非天然胺基酸之所關注PSMC為本發明的一個特徵。本發明亦包括具有至少一個使用本發明組合物及方法產生之非天然胺基酸的多肽或蛋白。亦可為蛋白提供賦形劑 (包括(但不限於)醫藥學上可接受之賦形劑)。
藉由在真核細胞中產生具有至少一個非天然胺基酸之所關注蛋白或多肽，蛋白或多肽典型地將包括真核細胞轉譯後修飾。在某些實施例中，蛋白質包括至少一個非天然胺基酸及至少一種由真核細胞活體內進行之轉譯後修飾，其中該轉譯後修飾不由原核細胞進行。舉例而言，轉譯後修飾包括(包括(但不限於))乙醯化、醯化、脂質修飾、棕櫚醯化、棕櫚酸酯加成、磷酸化、醣脂鍵聯修飾、糖基化及其類似修飾。在一個態樣中，轉譯後修飾包括寡醣(包括(但不限於)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))與天冬醯胺藉由GlcNAc-天冬醯胺鍵聯連接。參見表1，其列出真核蛋白之一些N鍵聯寡醣實例(亦可存在額外未展示之殘基)。在另一態樣中，轉譯後修飾包括寡醣(包括(但不限於)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲胺酸或蘇胺酸藉由GalNAc-絲胺酸或GalNAc-蘇胺酸鍵聯或GlcNAc-絲胺酸或GlcNAc-蘇胺酸鍵聯連接。
在又一態樣中，轉譯後修飾包括前驅物(包括(但不限於)降鈣素前驅物、降鈣素基因相關肽前驅物、前甲狀旁腺激素原、前胰島素原、胰島素原、前阿黑皮素原、阿黑皮素原及其類似物)之蛋白水解加工；組裝成多亞單位蛋白或大分子組裝體；轉譯至細胞中另一位點(包括(但不限於)至細胞器，諸如內質網、高爾基體、核、溶酶體、過氧化體、粒線體、葉綠體、液泡等，或經分泌路徑)。在某些實施例中，蛋白質包含分泌或定位序列、抗原決定基標籤、FLAG標籤、聚組胺酸標籤、GST融合物或其類似物。
非天然胺基酸之一個優勢在於其提供可用於添加額外分子之額外化學部分。此等修飾可在真核或非真核細胞中活體內或活體外進行。因此，在某些實施例中，轉譯後修飾是經非天然胺基酸進行。舉例而言，轉譯後修飾可經親核-親電子反應進行。目前用於蛋白選擇性修飾之大部分反應涉及親核與親電子反應搭配物之間的共價鍵形成，包括(但不限於)α-鹵基酮與組胺酸或半胱胺酸側鏈之反應。藉由蛋白中親核殘基之數目及可達性來確定此等情況下之選擇性。在本發明蛋白中，可使用其他更具選擇性之反應，諸如非天然酮基-胺基酸與醯肼或胺氧基化合物於活體外及活體內的反應。參見例如Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc.,118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science,276：1125-1128；Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99：11020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry,42：6735-6746；及Chin等人，(2003)Science，在出版中。這允許用許多試劑(包括 螢光團、交聯劑、醣衍生物及細胞毒性分子)選擇性標記實際上任何蛋白。亦參見2003年10月15日申請之標題為「Glycoprotein synthesis」的美國專利申請案第10/686,944號，其是基於2002年10月16日申請之美國臨時專利申請案第60/419,265號、2002年10月23日申請之美國臨時專利申請案第60/420,990號及2003年1月16日申請之美國臨時專利申請案第60/441,450號，其均以引用之方式併入本文中。轉譯後修飾(包括(但不限於)經疊氮基胺基酸)亦可經Staudinger連接(包括(但不限於)使用三芳基膦試劑)進行。參見例如Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS 99：19-24。
本發明提供用於選擇性修飾蛋白之另一高效方法，該方法涉及回應於選擇密碼子將包括(但不限於)含疊氮或炔基部分之非天然胺基酸遺傳併入蛋白中。此等胺基酸側鏈可接著藉由包括(但不限於)分別與包括(但不限於)炔基或疊氮衍生物進行Huisgen[3+2]環加成反應(參見例如Padwa,A.Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)編輯Trost,B.M.,Pergamon,Oxford，第1069-1109頁；及Huisgen,R.1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)編輯Padwa,A.,Wiley,New York，第1-176頁)修飾。因為此方法涉及環加成而非親核取代，因此蛋白質可以極高選擇性經修飾。此反應可在室溫下於水性條件中藉由向反應混合物中添加催化量之Cu(I)鹽而以卓越區域選擇性(1,4>1,5)進行。參見例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；及Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。另一可使用之方法是用四半胱胺酸 基元在二砷化合物上進行配位體交換，參見例如Griffin等人，(1998)Science 281：269-272。
可經[3+2]環加成添加至本發明蛋白中之分子實際上包括任何具有疊氮或炔基衍生物之分子。分子包括(但不限於)染料、螢光團、交聯劑、醣衍生物、聚合物(包括(但不限於)聚乙二醇衍生物)、光交聯劑、細胞毒性化合物、親和標記、生物素衍生物、樹脂、珠粒、第二蛋白或多肽(或更多)、聚核苷酸(包括(但不限於)DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物及其類似物。此等分子可分別添加於具有炔基之非天然胺基酸(包括(但不限於)對炔丙氧基苯丙胺酸)中或具有疊氮基之非天然胺基酸(包括(但不限於)對疊氮基-苯丙胺酸)中。
V. 活體內產生包含非遺傳編碼胺基酸之PSMC
可使用經修飾tRNA及tRNA合成酶添加到並非天然存在系統中所編碼之胺基酸中或取代該等胺基酸來活體內產生本發明之抗原結合多肽。
使用並非天然存在系統中所編碼之胺基酸產生tRNA及tRNA合成酶之方法描述於例如美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)及2003/0108885(第10/126,931號)中，其以引用的方式併入本文中。此等方法涉及產生與轉譯系統之內源合成酶及tRNA無關地起作用之轉譯機器(且因此有時稱為「正交」)。典型地，該轉譯系統包含正交tRNA(O-tRNA)及正交胺醯基tRNA合成酶(O-RS)。典型地，O-RS優先用轉譯系統中之至少一個非天然存在胺基酸胺醯化O-tRNA，並且O-tRNA識別至少一個不由系統中之其他tRNA識別的選擇密碼子。因此，轉譯系統將非天然編碼胺基酸插入系統中回應於所編 碼選擇密碼子而產生之蛋白中，藉此將胺基酸「取代」入所編碼多肽之位置中。
此項技術中已描述多種用於將特定合成胺基酸插入多肽中之正交tRNA及胺醯基tRNA合成酶，並且其通常適用於本發明。舉例而言，酮基特異性O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶描述於Wang,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：56-61(2003)及Zhang,Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分由聚核苷酸序列編碼，並且包括揭示於美國專利申請公開案2003/0082575及2003/0108885中之胺基酸序列，各公開案以引用的方式併入本文中。用於與O-RS一起使用之對應O-tRNA分子亦描述於美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)及2003/0108885(第10/126,931號)中，其以引用的方式併入本文中。
疊氮特異性O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶系統之實例描述於Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)中。對疊氮基-L-Phe之例示性O-RS序列包括(但不限於)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931)中所揭示之核苷酸序列SEQ ID NO：14-16及29-32以及胺基酸序列SEQ ID NO：46-48及61-64，該公開案以引用的方式併入本文中。適用於本發明之例示性O-tRNA序列包括(但不限於)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931號)中所揭示之核苷酸序列SEQ ID NO：1-3，該公開案以引用的方式併入本文中。對特定非天然編碼胺基酸具有特異性之O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶對之其他實例描述於美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，該公開案以引用的方式併入本文中。將含酮基及疊氮之胺基 酸併入釀酒酵母中之O-RS及O-tRNA描述於Chin,J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。
O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶之用途涉及選擇編碼非天然編碼胺基酸之特異性密碼子。儘管可使用任何密碼子，但通常需要選擇O-tRNA/胺醯基-tRNA合成酶所表現之細胞中罕有或從未使用過的密碼子。舉例而言，例示性密碼子包括無意義密碼子，諸如終止密碼子(琥珀、赭石及乳白)；四個或四個以上鹼基密碼子及其他罕有或從未使用過的天然三鹼基密碼子。
可使用此項技術中已知之突變誘發方法(包括(但不限於)位點特異性突變誘發、卡匣突變誘發、限制性選擇突變誘發等)將特異性選擇密碼子引入PSMC聚核苷酸編碼序列中之適當位置中。
用於產生蛋白生物合成機器之組分(諸如O-RS、O-tRNA及可用於併入併入非天然編碼胺基酸的正交O-tRNA/O-RS對)之方法描述於Wang,L.等人，Science 292：498-500(2001)；Chin,J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang,Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中。用於活體內併入非天然編碼胺基酸之方法及組合物描述於美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，該公開案以引用的方式併入本文中。用於選擇用於生物體活體內轉譯系統之正交tRNA-tRNA合成酶對之方法亦描述於美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)及2003/0108885(第10/126,931號)中，其以引用的方式併入本文中。
用於產生至少一種重組正交胺醯基-tRNA合成酶(O-RS)之方法包含：(a)自第一生物體產生源於至少一種胺醯 基-tRNA合成酶(RS)之(視情況為突變型)RS文庫，該第一生物體包括(但不限於)原核生物體，諸如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、閃爍古生球菌、激烈熱球菌、超嗜熱古菌、敏捷氣熱菌、嗜熱棲熱菌或其類似原核生物體，或真核生物體；(b)選擇(及/或篩選)RS(視情況為突變型RS)文庫中在非天然編碼胺基酸及天然胺基酸存在下胺醯化正交tRNA(O-tRNA)的成員，藉此提供活性(視情況為突變型)RS池；及/或(c)選擇(視情況經陰性選擇)該池中在非天然編碼胺基酸不存在下優先胺醯化O-tRNA之活性RS(包括(但不限於)突變型RS)，藉此提供至少一種重組O-RS；其中該至少一種重組O-RS優先用非天然編碼胺基酸胺醯化O-tRNA。
在一個實施例中，RS為非活性RS。可藉由使活性RS突變來產生非活性RS。舉例而言，可藉由使至少約1個、至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個或者至少約10個或10個以上胺基酸突變成不同胺基酸(包括(但不限於)丙胺酸)來產生非活性RS。
可使用此項技術中已知之各種技術來產生突變型RS文庫，該等技術包括(但不限於)基於蛋白質三維RS結構的合理設計，或者隨機或合理設計技術中RS核苷酸之突變誘發。舉例而言，可藉由位點特異性突變、隨機突變、產生多樣性之重組突變、嵌合構築體、合理設計，以及藉由本文所述或此項技術中已知之其他方法來產生突變型RS。
在一個實施例中，選擇(及/或篩選)RS(視情況為突變型RS)文庫中具活性(包括(但不限於)在非天然編碼胺基酸及天然編碼胺基酸存在下胺醯化正交tRNA(O-tRNA))之成員 包括：將陽性選擇或篩選標記(包括(但不限於)抗生素抗性基因或其類似物)及(視情況為突變型)RS文庫引入複數個細胞中，其中該陽性選擇及/或篩選標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限於)琥珀、赭石或乳白密碼子)；使該複數個細胞在選擇劑存在下生長；在選擇及/或篩選劑存在下藉由抑制陽性選擇或篩選標記中的至少一個選擇密碼子來鑑別存活(或展示特異性反應)之細胞，藉此提供含有活性(視情況為突變型)RS池之經陽性選擇細胞的亞組。選擇及/或篩選劑濃度視情況可改變。
在一個態樣中，陽性選擇標記為氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)基因，並且選擇密碼子為CAT基因中之琥珀終止密碼子。視情況，陽性選擇標記為β-內醯胺酶基因，並且選擇密碼子為β-內醯胺酶基因中之琥珀終止密碼子。在另一態樣中，陽性選擇標記包含螢光或發光篩選標記或基於親和力之篩選標記(包括(但不限於)細胞表面標記)。
在一個實施例中，陰性選擇或篩選池中優先在非天然編碼胺基酸不存在下胺醯化O-tRNA之活性RS(視情況為突變型)包括：將陰性選擇或篩選標記及由陽性選擇或篩選得到的活性(視情況為突變型)RS池引入第二生物體之複數個細胞中，其中該陰性選擇或篩選標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限於)抗生素抗性基因，包括(但不限於)氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)基因)；及鑑別在補充有非天然編碼胺基酸及篩選或選擇劑的第一培養基中存活或展示特異性篩選反應、但不能在補充有非天然編碼胺基酸及篩選或選擇劑的第二培養基中存活或展示特異性反應之細胞，藉此提供具有至少一種重組O-RS之存活細胞或經篩選細胞。舉例而言，CAT鑑別方案視情況在適當O-RS重 組體之確定中充當陽性選擇及/或陰性篩選。舉例而言，視情況在含有CAT(其包含至少一個選擇密碼子)且含有或不含一或多種非天然編碼胺基酸之生長盤上複製純系池。因此將僅在含有非天然編碼胺基酸之盤上生長的集落視為含有重組O-RS。在一個態樣中，選擇(及/或篩選)劑之濃度改變。在一些態樣中，第一及第二生物體不同。因此，第一及/或第二生物體視情況包含：原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等。在其他實施例中，篩選標記包含螢光或發光篩選標記或基於親和力之篩選標記。
在另一實施例中，篩選或選擇(包括(但不限於)陰性選擇)池中之活性(視情況為突變型)RS包括：自陽性選擇步驟(b)分離出活性突變型RS池；將陰性選擇或篩選標記(其中該陰性選擇或篩選標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限於)毒性標記基因，包括(但不限於)包含至少一個選擇密碼子之核糖核酸酶barnase基因))及活性(視情況為突變型)RS池引入第二生物體之複數個細胞中；及鑑別在未補充非天然編碼胺基酸的第一培養基中存活或展示特異性篩選反應、但不能在補充有非天然編碼胺基酸的第二培養基中存活或展示特異性篩選反應之細胞，藉此提供具有至少一種重組O-RS之存活或經篩選細胞，其中該至少一種重組O-RS對該非天然編碼胺基酸具特異性。在一個態樣中，該至少一個選擇密碼子包含約兩個或兩個以上選擇密碼子。該等實施例視情況可包括：其中該至少一個選擇密碼子包含兩個或兩個以上選擇密碼子，且其中第一與第二生物體不同(包括(但不限於)各生物體視情況為包括(但不限於)原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸桿菌、真菌、酵母、古細菌、 真細菌、植物、昆蟲、原生生物等)的情況。一些態樣亦包括其中陰性選擇標記包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一個選擇密碼子)之情況。其他態樣包括其中篩選標記視情況包含螢光或發光篩選標記或基於親和力之篩選標記的情況。在本文中之實施例中，篩選及/或選擇視情況包括篩選及/或選擇嚴謹性之變化。
在一個實施例中，用於產生至少一種重組正交胺醯基-tRNA合成酶(O-RS)之方法可進一步包含：(d)分離出至少一種重組O-RS；(e)產生源於至少一種重組O-RS之第二組O-RS(視情況為突變型)；及(f)重複步驟(b)及(c)直至獲得包含優先胺醯化O-tRNA之能力的突變型O-RS。視情況重複步驟(d)-(f)，包括(但不限於)至少約兩次。在一個態樣中，可藉由突變誘發來產生源於至少一種重組O-RS之第二組突變型O-RS，該突變誘發包括(但不限於)隨機突變誘發、位點特異性突變誘發、重組或其組合。
上述方法中之選擇/篩選步驟(包括(但不限於)陽性選擇/篩選步驟(b)、陰性選擇/篩選步驟(c)或陽性與陰性選擇/篩選步驟(b)與(c)兩者)的嚴謹性視情況包括改變選擇/篩選嚴謹性。在另一實施例中，陽性選擇/篩選步驟(b)、陰性選擇/篩選步驟(c)或陽性與陰性選擇/篩選步驟(b)與(c)兩者包含使用報導體，其中藉由螢光活化之細胞分選(FACS)來偵測報導體，或者其中藉由發光來偵測報導體。報導體視情況呈現於細胞表面上、噬菌體呈現或其類似表面上，並且基於涉及非天然編碼胺基酸或類似物的親和力或催化活性進行選擇。在一個實施例中，突變型合成酶呈現於細胞表面上、噬菌體呈現或其類似表 面上。
用於產生重組正交tRNA(O-tRNA)之方法包括：(a)自第一生物體產生源於至少一種tRNA(包括(但不限於)抑制基因tRNA)之突變型tRNA文庫；(b)選擇(包括(但不限於)陰性選擇)或篩選在來自第一生物體的胺醯基-tRNA合成酶(RS)不存在下由來自第二生物體之RS胺醯化的(視情況為突變型)tRNA文庫，藉此提供tRNA(視情況為突變型)池；及(c)選擇或篩選tRNA(視情況為突變型)池中由所引入之正交RS(O-RS)胺醯化的成員，藉此提供至少一種重組O-tRNA；其中該至少一種重組O-tRNA識別選擇密碼子，並且不由來自第二生物體之RS有效識別，並且優先由O-RS胺醯化。在一些實施例中，至少一種tRNA為抑制基因tRNA及/或包含天然及/或非天然鹼基之獨特三鹼基密碼子，或者為無意義密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、包含至少4個鹼基的密碼子、琥珀密碼子、赭石密碼子或乳白終止密碼子。在一個實施例中，重組O-tRNA具有正交性改良。應瞭解，在一些實施例中，無需修飾而視情況將O-tRNA自第二生物體輸入第一生物體中。在各種實施例中，第一與第二生物體相同或不同，並且視情況選自包括(但不限於)原核生物(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養甲烷桿菌、大腸桿菌、嗜鹽菌等)、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等。此外，重組tRNA視情況由非天然編碼胺基酸胺醯化，其中該非天然編碼胺基酸天然地或經遺傳操縱於活體內生物合成。視情況將非天然編碼胺基酸添加於用於至少第一或第二生物體之生長培養基中。
在一個態樣中，選擇(包括(但不限於)陰性選擇) 或篩選文庫中由胺醯基-tRNA合成酶胺醯化(步驟(b))之(視情況為突變型)tRNA包括：將毒性標記基因(其中該毒性標記基因包含至少一個選擇密碼子)(或導致產生毒性劑或靜電劑之基因或為生物體所必需的基因，其中該標記基因包含至少一個選擇密碼子)及(視情況為突變型)tRNA文庫引入來自第二生物體之複數個細胞中；及選擇存活細胞，其中該等存活細胞含有包含至少一種正交tRNA或非功能性tRNA的(視情況為突變型)tRNA池。舉例而言，可藉由使用比較比率細胞密度分析來選擇存活細胞。
在另一態樣中，該毒性標記基因可包括兩個或兩個以上選擇密碼子。在該等方法之另一實施例中，毒性標記基因為核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一個琥珀密碼子。核糖核酸酶barnase基因視情況可包括兩個或兩個以上琥珀密碼子。
在一個實施例中，選擇或篩選(視情況為突變型)tRNA池中由所引入之正交RS(O-RS)胺醯化的成員可包括：將陽性選擇或篩選標記基因(其中該陽性標記基因包含藥物抗性基因(包括(但不限於)包含至少一個選擇密碼子(諸如至少一個琥珀終止密碼子)之β-內醯胺酶基因))或為生物體所必需的基因或引起毒性劑解毒之基因，連同O-RS及(視情況為突變型)tRNA池引入來自第二生物體之複數個細胞中；及鑑別在選擇或篩選劑(包括(但不限於)抗生素)存在下生長的存活或經篩選細胞，藉此提供具有至少一種重組tRNA的細胞池，其中該至少一種重組tRNA由O-RS胺醯化，並將胺基酸插入回應於至少一個選擇密碼子而由陽性標記基因編碼的轉譯產物中。在另一實施 例中，選擇及/或篩選劑之濃度改變。
提供產生特異性O-tRNA/O-RS對之方法。方法包括：(a)自第一生物體產生源於至少一種tRNA之突變型tRNA文庫；(b)陰性選擇或篩選文庫中在來自第一生物體的胺醯基-tRNA合成酶(RS)不存在下由來自第二生物體之RS胺醯化的(視情況為突變型)tRNA，藉此提供(視情況為突變型)tRNA池；(c)選擇或篩選(視情況為突變型)tRNA池中由所引入之正交RS(O-RS)胺醯化之成員，藉此提供至少一種重組O-tRNA。該至少一種重組O-tRNA識別選擇密碼子，並且不由來自第二生物體之RS有效識別，並且優先由O-RS胺醯化。該方法亦包括(d)自第三生物體產生源於至少一種胺醯基-tRNA合成酶(RS)之(視情況為突變型)RS文庫；(e)選擇或篩選突變型RS文庫中優先在非天然編碼胺基酸及天然胺基酸存在下胺醯化至少一種重組O-tRNA之成員，藉此提供活性(視情況為突變型)RS池；及(f)陰性選擇或篩選池中優先在非天然編碼胺基酸不存在下胺醯化至少一種重組O-tRNA之活性(視情況為突變型)RS，藉此提供至少一種特異性O-tRNA/O-RS對，其中該至少一種特異性O-tRNA/O-RS對包含至少一種對該非天然編碼胺基酸具特異性的重組O-RS及至少一種重組O-tRNA。包括藉由該等方法產生之特異性O-tRNA/O-RS對。舉例而言，特異性O-tRNA/O-RS對可包括(包括(但不限於))mutRNATyr-mutTyrRS對，諸如mutRNATyr-SS12TyrRS對、mutRNALeu-mutLeuRS對、mutRNAThr-mutThrRS對、mutRNAGlu-mutGluRS對或其類似物。另外，該等方法包括其中第一及第三生物體相同(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌)的情況。
本發明亦包括選擇用於第二生物體之活體內轉譯系統的正交tRNA-tRNA合成酶對之方法。該等方法包括：將標記基因、tRNA及分離自或源於第一生物體之胺醯基-tRNA合成酶(RS)引入來自第二生物體的第一組細胞中；將標記基因及tRNA引入來自第二生物體之重複細胞組中；及選擇不能在重複細胞組中存活的第一組中之存活細胞，或篩選展示特異性篩選反應而不能在重複細胞組中產生該反應之細胞，其中第一組及重複細胞組在選擇或篩選劑存在下生長，其中存活或經篩選細胞包含用於第二生物體的活體內轉譯系統之正交tRNA-tRNA合成酶對。在一個實施例中，比較及選擇或篩選包括活體內互補分析。選擇或篩選劑濃度可改變。
本發明之生物體包含多種生物體及多種組合。舉例而言，本發明方法之第一及第二生物體可相同或不同。在一個實施例中，生物體視情況為原核生物，包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、閃爍古生球菌、激烈熱球菌、超嗜熱古菌、敏捷氣熱菌、嗜熱棲熱菌或其類似物。或者，生物體視情況包含真核生物，包括(但不限於)植物(包括(但不限於)複雜植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌(包括(但不限於)酵母等)、動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、節肢動物等)或其類似物。在另一實施例中，第二生物體為原核生物，包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、嗜熱自養甲烷桿菌、嗜鹽菌、大腸桿菌、閃爍古生球菌、嗜鹽菌、激烈熱球菌、超嗜熱古菌、敏捷氣熱菌、嗜熱棲熱菌或其類似物。或者，第二生物體可為真核生物，包括(但不限於)酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物細胞或其類似物。在各種實施 例中，第一及第二生物體不同。
VI. 非天然存在胺基酸在PSMC中之位置
本發明涵蓋將一或多種非天然存在胺基酸併入PSMC中。一或多種非天然存在胺基酸可在不破壞多肽活性之特定位置處併入。此舉可藉由進行「保守性」取代而實現，該等取代包括(但不限於)用疏水性胺基酸取代疏水性胺基酸、大胺基酸取代大胺基酸、親水性胺基酸取代親水性胺基酸及/或在不為活性所需之位置處插入非天然存在胺基酸。
可使用多種生物化學及結構方法選擇抗原結合多肽中用於用非天然編碼胺基酸進行取代之所需位點。熟習此項技術者輕易地瞭解，多肽鏈中之任何位置均適於選擇以併入非天然編碼胺基酸，並且選擇可基於合理設計或者藉由隨機選擇而用於任何或非特定所需目的。所需位點之選擇可用於產生具有任何所需特性或活性之PSMC分子，包括(但不限於)激動劑、超激動劑、反向激動劑、拮抗劑、受體結合調節劑、受體活性調節劑、二聚體或多聚體形成、相比於原生分子不改變活性或特性；或者操縱多肽之任何物理或化學特性，諸如溶解性、聚集性或穩定性。舉例而言，可使用此項技術中已知之丙胺酸掃描或同系物掃描方法來鑑別多肽中PSMC生物活性所需之位置。除由丙胺酸或同系物掃描突變誘發所鑑別之對於生物活性至關重要的殘基之外的殘基可為用非天然編碼胺基酸進行取代之良好候選物，視多肽所尋求之所需活性而定。或者，所鑑別之對於生物活性至關重要之位點亦可為用非天然編碼胺基酸進行取代之良好候選物，亦視多肽所尋求之所需活性而定。另一替代方案應為簡單地在多肽鏈上之每個位置中用非天然編碼胺基酸進行連續取代，並且觀察對多肽活 性的影響。熟習此項技術者輕易地瞭解，任何用於選擇供非天然胺基酸取代進任何多肽中的位置之手段、技術或方法均適用於本發明。
一旦已消除可能不容許用非天然編碼胺基酸進行取代之殘基，即可由抗原結合多肽及其結合搭配物的二級、三級或四級結構或三維晶體結構檢查各剩餘位置處所提議之取代的影響。因此，熟習此項技術者可輕易地鑑別可由非天然編碼胺基酸取代之胺基酸位置。
併入非天然編碼胺基酸之例示性殘基包括(但不限於)以下所述者：不含潛在抗原結合區；可完全或部分地溶劑暴露；與鄰近殘基具有最小或無氫鍵結相互作用；可最小程度地暴露於鄰近反應性殘基；可在PSMC之一或多個暴露面上；可為與第二PSMC或其他分子或其片段並置的一或多個PSMC位點；如由結合或未結合於其抗原或者偶合或未偶合於另一PSMC或其他生物活性分子之PSMC的三維、二級、三級或四級結構所預測，可處於高度可撓性或結構剛性區域中；或者必要時可藉由改變完整結構的可撓性或剛性而調節PSMC自身或者包含一或多個PSMC的二聚體或多聚體之構形。用於併入非天然胺基酸之殘基可為裂解序列、接合抗體片段或PSMC之連接序列、抗體結合結構域(包括(但不限於)myc標籤、FLAG或poly-His)或其他基於親和力之序列(包括(但不限於)FLAG、poly-His、GST等)的一部分。用於併入非天然胺基酸之殘基可為PSMC之N端或C端殘基，或者PSMC之非抗原結合殘基。
可用多種非天然編碼胺基酸取代或併入PSMC中之既定位置中。一般而言，基於以下來選擇用於併入之特定非天然 編碼胺基酸：藉由任何其他手段檢查具有其抗原之PSMC的三維晶體結構，或者PSMC之二級、三級或四級結構；保守性取代之優先性(亦即基於芳基之非天然編碼胺基酸，諸如對乙醯基苯丙胺酸或O-炔丙基酪胺酸取代Phe、Tyr或Trp)；及希望引入抗原結合多肽中的特異性結合化學(例如，若希望實現與具有炔部分之水溶性聚合物的Huisgen[3+2]環加成或者與具有芳基酯、接著又併入膦部分之水溶性聚合物的醯胺鍵形成，則引入4-疊氮基苯丙胺酸)。
在一個實施例中，該方法進一步包括將非天然胺基酸併入蛋白中，其中該非天然胺基酸包含第一反應性基團；及使該蛋白接觸包含第二反應性基團之分子(包括(但不限於)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯劑、放射性核素、細胞毒性化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記、螢光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能基、與其他分子共價或非共價相互作用之基團、光捕獲部分、光可異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素衍生物、生物素類似物、併有重原子之部分、化學可裂解基團、光可裂解基團、長側鏈、碳鍵聯糖、氧化還原活性劑、胺基硫代酸、毒性部分、經同位素標記部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、插入基團、發色團、能量轉移劑、生物活性劑、可偵測標記、小分子或上述各物之組合或任何其他所需化合物或物質)。第一反應性基 團與第二反應性基團反應以經[3+2]環加成將分子連接於非天然胺基酸。在一個實施例中，第一反應性基團為炔基或疊氮基部分，並且第二反應性基團為疊氮基或炔基部分。舉例而言，第一反應性基團為炔基部分(包括(但不限於)在非天然胺基酸對炔丙氧基苯丙胺酸中)，且第二反應性基團為疊氮基部分。在另一實例中，第一反應性基團為疊氮基部分(包括(但不限於)在非天然胺基酸對疊氮基-L-苯丙胺酸中)，且第二反應性基團為炔基部分。
在一些情況下，非天然編碼胺基酸取代將與抗原結合多肽中之其他添加、取代或缺失組合以影響PSMC之其他生物學特性。在一些情況下，該等其他添加、取代或缺失可增加PSMC之穩定性(包括(但不限於)對蛋白水解降解之抗性)，或者增加PSMC對PSMC受體或抗原的親和力。在一些情況下，其他添加、取代或缺失可增加抗原結合多肽之穩定性(包括(但不限於)當在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現時)。在一些實施例中，添加、取代或缺失可增加在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表現之後的多肽溶解性。在一些實施例中，除了用於併入非天然胺基酸而使得在大腸桿菌或其他重組宿主細胞中表現之後引起多肽溶解性增加的另一位點之外，亦選擇用於經天然編碼或非天然胺基酸取代的位點。在一些實施例中，抗原結合多肽包含調節對PSMC受體之親和力、調節(包括(但不限於)增加或減少)受體二聚化、穩定化受體二聚體、調節循環半衰期、調節釋放或生物可用性、促進純化或改良或改變特定投藥途徑之另一添加、取代或缺失。同樣，抗原結合多肽可包含化學或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合結構域(包括(但不限於)FLAG或poly-His)或其他基於親和力之序列(包括(但不限於)FLAG、poly-His、 GST等)或改良多肽之偵測(包括(但不限於)GFP)、純化、經組織或細胞膜轉運、前藥釋放或活化、PSMC尺寸減小或其他特性的鍵聯分子(包括(但不限於)生物素)。
在一些情況下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸經一或多個非天然編碼胺基酸取代。在一些情況下，PSMC進一步包括一或多個非天然編碼胺基酸對天然存在胺基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個取代。在一些實施例中，PSMC之以下區中的至少兩個殘基經一或多個非天然編碼胺基酸取代。在一些情況下，兩個或兩個以上非天然編碼殘基鍵聯於一或多個較低分子量的直鏈或分支PEG(大致約5-20kDa質量或更小)，藉此相對於連接於單個、較高分子量PEG之物質增強結合親和力及可相當之血清半衰期。
在一些實施例中，抗原結合多肽之多達兩個殘基經一或多個非天然編碼胺基酸取代。
VII. 在非真核生物及真核生物中之表現
為了獲得經選殖PSMC聚核苷酸之高水準表現，典型地將編碼本發明抗原結合多肽之聚核苷酸亞選殖至含有指導轉錄、轉錄/轉譯終止子的強啟動子之表現載體中，並且若針對編碼蛋白之核酸，則含有用於轉譯起始之核糖體結合位點。合適之細菌啟動子為此項技術中所熟知，且描述於例如Sambrook等人及Ausubel等人中。
用於表現本發明PSMC多肽之細菌表現系統在包括(但不限於)大腸桿菌、牙胞桿菌屬、螢光假單胞菌、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌及沙門氏菌(Salmonella)中可用(Palva等人，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302：543-545(1983))。 用於該等表現系統之套組為市售的。用於哺乳動物細胞、酵母及昆蟲細胞之真核表現系統為此項技術中所熟知的，並且亦為市售的。在使用正交tRNA及胺醯基tRNA合成酶(上述)表現本發明之抗原結合多肽的情況下，用於表現之宿主細胞基於其使用正交組分的能力選擇。例示性宿主細胞包括革蘭氏陽性細菌(包括(但不限於)短芽孢桿菌、枯草桿菌或鏈黴菌)及革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌、螢光假單胞菌、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌)以及酵母及其他真核細胞。可如本文所述使用包含O-tRNA/O-RS對之細胞。
本發明之真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供合成包含大量可用非天然胺基酸之蛋白的能力。在一個態樣中，該組合物視情況包括(包括(但不限於))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1公克或更多之包含非天然胺基酸的蛋白，或者可用活體內蛋白產生方法達成之量(本文提供關於重組蛋白產生及純化之細節)。在另一態樣中，蛋白視情況以包括(但不限於)以下濃度存在於組合物中：包括(但不限於)在細胞溶解產物、緩衝液、醫藥緩衝液或其他液體懸浮液(包括(但不限於)，包括(但不限於)在約1nl至約100L之間任一者之體積)中每公升至少10微克蛋白、每公升至少50微克蛋白、每公升至少75微克蛋白、每公升至少100微克蛋白、每公升至少200微克蛋白、每公升至少250微克蛋白、每公升至少500微克蛋白、每公升至少1毫克蛋白或每公升至少10毫克蛋白或更大濃度。真核細胞中產生大量(包括(但不限於)多於典型地用包括(但不限於)活體外轉譯之其他方法 可能獲得的量)包括至少一種非天然胺基酸之蛋白為本發明的一個特徵。
本發明之真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供生物合成包含大量可用非天然胺基酸之蛋白的能力。舉例而言，可產生包括(但不限於)以下濃度之包含非天然胺基酸的蛋白：細胞提取物、細胞溶解產物、培養基、緩衝液及/或其類似物中至少10微克/公升、至少50微克/公升、至少75微克/公升、至少100微克/公升、至少200微克/公升、至少250微克/公升或至少500微克/公升、至少1毫克/公升、至少2毫克/公升、至少3毫克/公升、至少4毫克/公升、至少5毫克/公升、至少6毫克/公升、至少7毫克/公升、至少8毫克/公升、至少9毫克/公升、至少10毫克/公升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/公升、1公克/公升、5公克/公升、10公克/公升或更多的蛋白。
I. 表現系統、培養及分離
可在任何數目之合適表現系統中表現PSMC，該等表現系統包括例如酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及細菌。下文提供例示性表現系統之描述。
酵母 如本文所用，術語「酵母」包括各種能夠表現編碼PSMC之基因的酵母中之任一者。該等酵母包括(但不限於)產子囊酵母(內孢黴目)、產擔孢子酵母及屬於不完全真菌(芽生菌屬)家族之酵母。產子囊酵母分為兩科：蝕精黴科(Spermophthoraceae)及酵母菌科(Saccharomycetaceae)。後者包含四個亞科，即裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如粟酒裂殖酵母屬(genus Schizosaccharomyces))、拿遜酵母亞科 (Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)及酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如畢赤酵母(Pichia)屬、克魯維酵母(Kluyveromyces)屬及酵母菌(Saccharomyces)屬)。產擔孢子酵母包括白冬孢酵母(Leucosporidium)屬、紅冬孢酵母(Rhodosporidium)屬、鎖擲酵母(Sporidiobolus)屬、黑粉菌(Filobasidium)屬及線狀黑粉菌(Filobasidiella)屬。屬於不完全真菌(芽生菌屬)家族之酵母分為兩科：擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如擲孢酵母屬(Sporobolomyces)及布勒彈孢酵母屬(Bullera))及隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌屬(Candida))。
本發明尤其關注使用畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、酵母菌屬、粟酒裂殖酵母屬、漢森酵母(Hansenula)屬、球擬酵母(Torulopsis)屬及念珠菌屬中之種，包括(但不限於)甲醇酵母(P.pastoris)、(P.guillerimondii)、釀酒酵母、卡爾酵母(S.carlsbergensis)、澱粉酶鏈黴菌(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克氏酵母(S.kluyveri)、諾地酵母(S,norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)、白假絲酵母(C.albicans)、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)及多形漢森酵母(H.polymorpha)。
選擇用於PSMC表現之合適酵母在熟習此項技術者的技能之內。在選擇用於表現之酵母宿主中，合適宿主可包括顯示出具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白產生及總體堅固性之宿主。酵母通常可自多種來源獲得，包括(但不限於)Yeast Genetic Stock Center、Department of Biophysics and Medical Physics、University of California (Berkeley,CA)及美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，「ATCC」)(Manassas,VA)。
術語「酵母宿主」或「酵母宿主細胞」包括可用作或已經用作重組載體或其他轉移DNA之受體的酵母。該術語包括已接收重組載體或其他轉移DNA之初始酵母宿主細胞的後代。應瞭解，由於偶然或有意突變，因此單一親本細胞的後代可能並不必需與初始親代在形態或基因組或總DNA補體方面完全相同。此定義所指後代包括與親代足夠相似之親本細胞後代，特徵在於相關特性，諸如存在編碼PSMC的核苷酸序列。
已開發出包括染色體外複製子或整合載體在內之表現及轉型載體以用於轉化至許多酵母宿主中。舉例而言，已針對以下開發出表現載體：釀酒酵母(Sikorski等人，GENETICS(1998)112：19；Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153：163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75：1929)；白假絲酵母(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6：142)；麥芽糖假絲酵母(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；多形漢森酵母(Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，MOL.GEN.GENET.(1986)202：302)；脆壁克魯維酵母(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)；乳酸克魯維酵母(De Lcuvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154：737；Van den Berg等人，BIO/TECHNOLOGY(1990)8：135)；P.guillerimondii(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；甲醇酵母(美國專利第5,324,639號、第4,929,555號及第4,837,148號；Cregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及Nurse,NATURE(1981) 300：706)；及解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(Davidow等人，CURR.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET.(1985)10：49)；構巢麯黴(A.nidulans)(Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112：284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26：205-221；及Yelton等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81：1470-74)；黑麯黴(A.niger)(Kelly及Hynes,EMBO J.(1985)4：475479)；里氏木黴(T.reesia)(EP 0 244 234)；及絲狀真菌，諸如紅黴菌(Neurospora)、青黴菌(Penicillium)、彎頸黴(Tolypocladium)(WO 91/00357)，各文獻以引用之方式併入本文中。
用於酵母載體之對照序列為熟習此項技術者所熟知，並且包括(但不限於)來自以下基因之啟動子區：諸如醇去氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)(EP 0 284 044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸-去氫酶(GAP或GAPDH)、己醣激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶及丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。編碼酸磷酸酯酶之酵母PHO5基因亦可提供有用之啟動子序列(Myanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80：1)。供酵母宿主使用之其他合適啟動子序列可包括用於以下酶之啟動子：3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255：2073)；及其他醣解酶，諸如丙酮酸去羧酶、磷酸丙醣異構酶及磷酸葡萄糖異構酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17：4900；Hess等人，J.ADV.ENZYME REG.(1968)7：149)。具有轉錄受生長條件控制之額外優勢的誘導性酵母啟動子可包括以下各物之啟動子區：醇去氫酶2、異細胞色素C、酸磷酸酯酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸去氫酶、與氮 代謝相關之降解酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶。適用於酵母表現之載體及啟動子進一步描述於EP 0 073 657中。
酵母增強子亦可與酵母啟動子一起使用。此外，合成啟動子亦可充當酵母啟動子。舉例而言，酵母啟動子之上游活化序列(UAS)可與另一酵母啟動子之轉錄活化區接合，產生合成雜合啟動子。該等雜合啟動子之實例包括鍵聯於GAP轉錄活化區之ADH調控序列。參見美國專利第4,880,734號及第4,876,197號，其以引用的方式併入本文中。雜合啟動子之其他實例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因之調控序列與諸如GAP或PyK之醣解酶基因的轉錄活化區組合而組成之啟動子。參見EP 0 164 556。此外，酵母啟動子可包括具有結合酵母RNA聚合酶並起始轉錄之能力的非酵母起源之天然存在啟動子。
可包含酵母表現載體之一部分的其他控制元件包括例如來自GAPDH或烯醇酶基因之終止子(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)256：1385)。此外，來自2μ質體起源之複製起點適於酵母。適用於酵母之選擇基因為存在於酵母質體中之trp1基因。參見Tschemper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。trp1基因對缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變菌株提供選擇標記。同樣，具有Leu2基因之已知質體涵蓋缺乏Leu2之酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
將外源DNA引入酵母宿主中之方法為熟習此項技術者所熟知，並且典型地包括(但不限於)原生質球狀體或經鹼性陽離子處理的完整酵母宿主細胞之轉型。舉例而言，酵母之轉型可根據Hsiao等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76：3829及Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130：946中所述之方法進行。 然而，亦可如SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL(2001)中一般所述使用將DNA引入細胞中之其他方法，諸如核注射、電穿孔或原生質體融合。接著可使用熟習此項技術者已知之標準技術培養酵母宿主細胞。
用於在酵母宿主細胞中表現異源蛋白之其他方法為熟習此項技術者所熟知。一般參見美國專利公開案第20020055169號；美國專利第6,361,969號、第6,312,923號、第6,183,985號、第6,083,723號、第6,017,731號、第5,674,706號、第5,629,203號、第5,602,034號及第5,089,398號；美國複審專利第RE37,343號及第RE35,749號；PCT公開專利申請案WO 99/078621、WO 98/37208及WO 98/26080；歐洲專利申請案EP 0 946 736、EP 0 732 403、EP 0 480 480、EP 0 460 071、EP 0 340 986、EP 0 329 203、EP 0 324 274及EP 0 164 556。亦參見Gellissen等人，ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(1-2)：79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)：423-488；Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185：3-7，各以引用之方式併入本文中。
可使用熟習此項技術者所熟知之標準進料分批醱酵方法使酵母宿主菌株在擴增階段期間在醱酵罐中生長。該等醱酵方法可適於解釋特定酵母宿主之碳利用路徑或表現控制模式的差異。舉例而言，酵母菌酵母宿主之醱酵可需要單一葡萄糖進料、複雜氮源(例如酪蛋白水解產物)及綜合維生素補充。相比之下，甲基營養型酵母甲醇酵母可需要甘油、甲醇及痕量礦物質進料，但僅簡單銨(氮)鹽用於最佳生長及表現。參見例如美國專利第5,324,639號；Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9：95；及Fieschko等人，BIOTECH.BIOENG.(1987)29：1113，各以引用之 方式併入本文中。
然而，該等醱酵方法可具有某些與所用酵母宿主菌株無關之普通特徵。例如，可在擴增階段期間將生長限制營養物(典型地為碳)添加至醱酵罐中以允許最大程度生長。此外，醱酵方法通常採用經設計以含有足量碳、氮、基礎鹽、磷及其他微量營養物(維生素、痕量礦物質及鹽等)之醱酵培養基。適用於畢赤酵母之醱酵培養基的實例描述於美國專利第5,324,639號及第5,231,178號中，其以引用的方式併入本文中。
經桿狀病毒感染之昆蟲細胞術語「昆蟲宿主」或「昆蟲宿主細胞」是指可用作或已用作重組載體或其他轉移DNA之受體的昆蟲。該術語包括已經轉染之初始昆蟲宿主細胞的後代。應瞭解，由於偶然或有意突變，因此單一親本細胞的後代可能並不必需與初始親代在形態或基因組或總DNA補體方面完全相同。此定義所指後代包括與親代足夠相似之親本細胞後代，特徵在於相關特性，諸如存在編碼PSMC的核苷酸序列。
選擇用於PSMC表現之合適昆蟲細胞為熟習此項技術者所熟知。數種昆蟲種類已在此項技術中充分描述並且市售，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)及粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇用於表現之昆蟲宿主中，合適宿主可包括顯示出尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性及總體堅固性之宿主。昆蟲通常可自多種來源獲得，包括(但不限於)Insect Genetic Stock Center、Department of Biophysics and Medical Physics、University of California(Berkeley,CA)及美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，「ATCC」) (Manassas,VA)。
經桿狀病毒感染之昆蟲表現系統的組分一般包括通常為細菌質體之轉移載體(其含有桿狀病毒基因組之片段及用於插入待表現的異源基因之便利限制性位點)、具有與轉移載體中桿狀病毒特異性片段同源的序列之野生型桿狀病毒(這允許異源基因同源重組進桿狀病毒基因組中)以及適當昆蟲宿主細胞及生長培養基。用於構築載體、轉染細胞、挑選菌斑、在培養物中生長細胞及其類似用途之材料、方法及技術為此項技術中已知，並且可獲得描述此等技術之手冊。
在將異源基因插入轉移載體中之後，將載體及野生型病毒基因組轉染至昆蟲宿主細胞中，載體及病毒基因組在其中重組。經封裝之重組病毒表現，並鑑別及純化重組菌斑。用於桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之材料及方法以來自例如Invitrogen Corp.(Carlsbad,CA)之套組形式市售。此等技術通常為熟習此項技術者所已知，並且完整描述於SUMMERS及SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555期(1987)中，其以引用的方式併入本文中。亦參見RICHARDSON,39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY：BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；KING及POSSEE,THE BACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE(1992)；及O'REILLY等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
實際上，使用桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統產生各種異源蛋白為此項技術中所熟知。參見例如美國專利第6,368,825 號；第6,342,216號；第6,338,846號；第6,261,805號；第6,245,528號；第6,225,060號；第6,183,987號；第6,168,932號；第6,126,944號；第6,096,304號；第6,013,433號；第5,965,393號；第5,939,285號；第5,891,676號；第5,871,986號；第5,861,279號；第5,858,368號；第5,843,733號；第5,762,939號；第5,753,220號；第5,605,827號；第5,583,023號；第5,571,709號；第5,516,657號；第5,290,686號；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/03628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其以引用的方式併入本文中。
可用於桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統之載體為此項技術中所已知，並且包括例如源於桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)之昆蟲表現及轉移載體，其為一種不依賴於輔助病毒的病毒表現載體。源於此系統之病毒表現載體通常使用強病毒多角體蛋白基因啟動子來驅動異源基因之表現。一般參見Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
在將外源基因插入桿狀病毒基因組中之前，典型地將包含啟動子、前導子(必要時)、所關注之編碼序列及轉錄終止序列之上述組分組裝至中間錯位構築體(轉移載體)中。中間錯 位構築體通常維持於複製子中，諸如能夠在諸如細菌之宿主中穩定維持的染色體外元件(例如質體)。複製子將具有複製系統，因此允許其維持在適合於選殖及擴增的宿主中。更特定言之，質體可含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(Miller等人，ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42：177)及原核胺苄青黴素抗性(amp)基因及用於在大腸桿菌中選擇及繁殖之複製起點。
一種通常用於將外源基因引入AcNPV中之轉移載體為pAc373。亦已設計出熟習此項技術者已知之許多其他載體，包括例如pVL985，其將多角體蛋白起始密碼子自ATG改變成ATT且在ATT下游32個鹼基對處引入BamHI選殖位點。參見Luckow及Summers,17 VIROLOGY 31(1989)。其他市售載體包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。
插入異源基因之後，將轉移載體及野生型桿狀病毒基因組共轉染至昆蟲細胞宿主中。用於將異源DNA引入桿狀病毒中之所需位點中的方法為此項技術中所已知。參見SUMMERS及SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555期(1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156；Luckow及Summers,VIROLOGY(1989)17：31。舉例而言，可藉由同源雙交叉重組插入至諸如多角體蛋白基因之基因中；亦可插入至經工程改造至所需桿狀病毒基因中之限制酶位點中。參見Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91。
轉染可藉由電穿孔實現。參見TROTTER及WOOD,39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Mann及King,J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。或者，脂質體可用於與重組表現載 體及桿狀病毒一起轉染昆蟲細胞。參見例如Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1)：36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37：6050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12：323；Siffert等人，NATURE GENETICS(1998)18：45；TILKINS等人，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10：263；Dolphin等人，NATURE GENETICS(1997)17：491；Kost等人，GENE(1997)190：139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271：22203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37)：22376；Reversey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)270：4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)：766；及Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14.2：274。市售脂質體包括例如Cellfectin®及Lipofectin®(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。此外，可使用磷酸鈣轉染。參見TROTTER及WOOD,39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts,NAR(1990)18(19)：5667；及Mann及King,J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。
桿狀病毒表現載體通常含有桿狀病毒啟動子。桿狀病毒啟動子為能夠結合桿狀病毒RNA聚合酶並且起始編碼序列(例如結構基因)下游(3')轉錄成mRNA之任何DNA序列。啟動子將具有通常位於靠近編碼序列5'末端處的轉錄起始區。此轉錄起始區典型地包括RNA聚合酶結合位點及轉錄起始位點。桿狀病毒啟動子亦可具有稱為增強子之第二結構域，該第二結構域若存在，則通常遠離結構基因。此外，表現可經調控或者為組成性 的。
在感染週期後期充足轉錄之結構基因提供尤其可用的啟動子序列。實例包括源於編碼病毒多角體蛋白之基因的序列(FRIESEN等人，The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839及0 155 476)及源於編碼p10蛋白之基因的序列(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69：765)。
新近形成之桿狀病毒表現載體經封裝至傳染性重組桿狀病毒中，並且隨後生長之菌斑可藉由熟習此項技術者所已知之技術純化。參見Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91；SUMMERS及SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO.1555(1987)。
已經開發出重組桿狀病毒表現載體來用於感染至一些昆蟲細胞內。舉例而言，已尤其針對埃及伊蚊(ATCC第CCL-125號)、桑蠶(ATCC第CRL-8910號)、黑腹果蠅(ATCC第1963號)、草地貪夜蛾及粉紋夜蛾開發重組桿狀病毒。參見WO 89/046,699；Wright,NATURE(1986)321：718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56：153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156。一般參看Fraser等人，IN VITRO CELL.DEV.BIOL.(1989)25：225。更特定言之，用於桿狀病毒表現載體系統之細胞株通常包括(但不限於)Sf9(草地貪夜蛾)(ATCC第CRL-1711號)、Sf21(草地貪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目錄號11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉紋夜蛾)及High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉紋夜蛾)。
用於在桿狀病毒/表現中直接及融合表現異源多肽之 細胞及培養基為市售的，並且細胞培養技術大體上為熟習此項技術者所已知。
大腸桿菌、假單胞菌種及其他原核生物 細菌表現技術為此項技術中所熟知。多種載體可用於細菌宿主中。載體可為單複本或者低或高多複本載體。載體可用於選殖及/或表現。鑒於大量關於載體之文獻、許多載體可市售及甚至描述載體及其限制性圖譜與特徵的手冊，本文無需再作廣泛論述。眾所周知，載體通常涉及允許進行選擇之標記，該等標記可提供細胞毒性劑抗性、原營養或免疫性。通常存在複數種提供不同特徵之標記。
細菌啟動子為能夠結合細菌RNA聚合酶並且起始編碼序列(例如結構基因)下游(3')轉錄成mRNA之任何DNA序列。啟動子將具有通常位於靠近編碼序列5'末端處的轉錄起始區。此轉錄起始區典型地包括RNA聚合酶結合位點及轉錄起始位點。細菌啟動子亦可具有稱為操縱子之第二結構域，其可與鄰近RNA聚合酶結合位點重疊，在該位點處RNA合成開始。由於基因阻遏蛋白可結合操縱子，並且藉此抑制特異性基因之轉錄，因此操縱子允許負調控之(誘導性)轉錄。在不存在諸如操縱子之負調控元件的情況下，可發生組成性表現。此外，可藉由基因活化劑蛋白結合序列實現正調控，此序列若存在，則通常接近RNA聚合酶結合序列(5')。基因活化劑蛋白之實例為分解代謝產物活化劑蛋白(CAP)，其有助於起始大腸桿菌(Escherichia coli/E.coli)中lac操縱子之轉錄[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18：173]。因此，經調控表現可為正的或負的，藉此增強或降低轉錄。
編碼代謝路徑酶之序列提供尤其可用之啟動子序列。 實例包括源於糖代謝酶之啟動子序列，諸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198：1056]及麥芽糖。額外實例包括源於生物合成酶之啟動子序列，諸如色胺酸(trp)[Goeddel等人，NUC.ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美國專利第4,738,921號；歐洲專利公開案第036 776號及第121 775號，其以引用的方式併入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)啟動子系統[Weissmann(1981)「The cloning of interferon and other mistakes.」Interferon 3(編輯I.Gresser)]、噬菌體λPL[Shimatake等人，NATURE(1981)292：128]及T5[美國專利第4,689,406號，其以引用的方式併入本文中]啟動子系統亦提供可用之啟動子序列。本發明之較佳方法利用強啟動子，諸如T7啟動子，以誘導高水準PSMC。該等載體之實例為此項技術中所熟知，並且包括來自Novagen之pET29系列，及描述於WO99/05297(其以引用的方式併入本文中)中之pPOP載體。該等表現系統在宿主中產生高水準PSMC而不損害宿主細胞活力或生長參數。pET19(Novagen)為此項技術中已知之另一載體。
此外，自然界中不存在之合成啟動子亦充當細菌啟動子。舉例而言，一種細菌或噬菌體啟動子之轉錄活化序列可與另一細菌或噬菌體啟動子之操縱子序列接合，從而產生合成雜合啟動子[美國專利第4,551,433號，其以引用的方式併入本文中]。舉例而言，tac啟動子為包含trp啟動子及lac操縱子序列之雜合trp-lac啟動子，其受lac阻遏物調控[Amann等人，GENE(1983)25：167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21]。此外，細菌啟動子可包括具有結合細菌RNA聚合酶並起始轉錄之能力的非細菌起源之天然存在啟動子。非細菌起源之天然存在啟 動子亦可與相容性RNA聚合酶偶合以在原核生物中產生一些基因之高水準表現。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統為偶合之啟動子系統的實例[Studier等人，J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：1074]。此外，雜合啟動子亦可包含噬菌體啟動子及大腸桿菌操縱子區(歐洲專利公開案第267 851號)。
除了功能性啟動子序列之外，有效核糖體結合位點亦可用於在原核生物中表現外源基因。在大腸桿菌中，核糖體結合位點稱為Shine-Dalgarno(SD)序列，並且包括起始密碼子(ATG)及位於起始密碼子上游3-11個核苷酸處之3-9個核苷酸長度的序列[Shine等人，NATURE(1975)254：34]。認為SD序列藉由SD序列與大腸桿菌16S rRNA之3'端之間的鹼基配對來促進mRNA與核糖體結合[Steitz等人「Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA」,Biological Regulation and Development：Gene Expression(編輯R.F.Goldberger,1979)]。為了表現具有弱核糖體結合位點之真核基因及原核基因[Sambrook等人「Expression of cloned genes in Escherichia coli」,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,1989]。
術語「細菌宿主」或「細菌宿主細胞」是指可用作或已經用作重組載體或其他轉移DNA之受體的細菌。該術語包括已經轉染之初始細菌宿主細胞的後代。應瞭解，由於偶然或有意突變，因此單一親本細胞的後代可能並不必需與初始親代在形態或基因組或總DNA補體方面完全相同。此定義所指後代包括與親代足夠相似之親本細胞後代，特徵在於相關特性，諸如存在編碼PSMC的核苷酸序列。
選擇用於PSMC表現之合適宿主細菌為熟習此項技術者所熟知。在選擇用於表現之細菌宿主中，合適宿主可包括顯示出尤其具有良好包涵體形成能力、低蛋白水解活性及總體堅固性之宿主。細菌宿主通常可自多種來源獲得，包括(但不限於)Bacterial Genetic Stock Center、Department of Biophysics and Medical Physics、University of California(Berkeley,CA)及美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，「ATCC」)(Manassas,VA)。工業/醫藥醱酵通常使用源於K菌株之細菌(例如W3110)或源於B菌株之細菌(例如BL21)。由於極為熟知此等菌株之生長參數並且其為穩定的，因此此等菌株尤其有用。此外，此等菌株為非病原性的，出於安全及環境原因考慮，其具有商業重要性。在本發明方法之一個實施例中，大腸桿菌宿主為BL21菌株。在本發明方法之另一實施例中，大腸桿菌宿主為蛋白酶負菌株，包括(但不限於)OMP-及LON-。在本發明方法之另一實施例中，宿主細胞菌株為假單胞菌種，包括(但不限於)螢光假單胞菌、綠膿桿菌及惡臭假單胞菌。已知螢光假單胞菌生物型1(指定菌株MB101)可用於重組產生，並且可用於治療性蛋白產生過程。假單胞菌表現系統之實例包括可獲自The Dow Chemical Company之系統作為宿主菌株(Midland,MI，可在全球資訊網上dow.com處獲得)。以引用之方式併入本文中的美國專利第4,755,465號及第4,859,600號描述假單胞菌菌株作為宿主細胞用於人類生長激素產生之用途。
一旦已建立重組宿主細胞菌株(亦即已將表現構築體引入宿主細胞中，並且分離出具有恰當表現構築體之宿主細胞)，即在適於產生PSMC的條件下培養重組宿主細胞菌株。熟習此項 技術者應顯而易見，重組宿主細胞菌株之培養方法將取決於所用表現構築體之性質及宿主細胞的身分。通常使用此項技術中所熟知之方法培養重組宿主菌株。典型地在含有碳、氮及無機鹽之可同化來源並視情況含有維生素、胺基酸、生長因子及此項技術中熟知之其他蛋白培養補充物之液體培養基中培養重組宿主細胞。 用於培養宿主細胞之液體培養基可視情況含有抗生素或抗真菌劑，以防止非所需微生物及/或化合物生長，包括(但不限於)選擇用於含有表現載體之宿主細胞的抗生素。
重組宿主細胞可以分批或連續形式培養，其中以分批或連續形式收集細胞(在PSMC在細胞內積聚之情況下)或收集培養物上清液。對於在原核宿主細胞中產生，分批培養及細胞收集為較佳的。
通常在重組系統中表現之後純化本發明之抗原結合多肽。可藉由此項技術中已知之多種方法自宿主細胞中純化PSMC。在細菌宿主細胞中產生之PSMC通常溶解性較差或不溶(呈包涵體形式)。在本發明之一個實施例中，可輕易地在抗原結合多肽中進行胺基酸取代，其中使用本文所揭示之方法以及此項技術中已知的方法對胺基酸取代進行選擇以達成增加重組產生之蛋白的溶解性之目的。在不溶性蛋白之情況下，可藉由離心自宿主細胞溶解產物中收集蛋白，並可接著進一步使細胞均質化。在較差溶解性蛋白之情況下，可添加包括(但不限於)聚乙烯亞胺(polyethylene imine，PEI)之化合物以誘導部分可溶性蛋白之沈澱。隨後可藉由離心便利地收集沈澱蛋白。可使用熟習此項技術者所熟知之多種方法破壞或均質化重組宿主細胞，以便自細胞內釋放出包涵體。可使用熟知技術進行宿主細胞破壞或均質化，該 等技術包括(但不限於)酶細胞破壞、音波處理、杜恩斯均質化或高壓釋放破壞。在本發明方法之一個實施例中，使用高壓釋放技術破壞大腸桿菌宿主細胞以釋放PSMC之包涵體。當處置PSMC之包涵體時，宜將重複均質化時間減至最少，以使包涵體之產率最大而不會因諸如溶解、機械剪切或蛋白水解之因素而受到損失。
隨後可使用此項技術中已知之許多合適溶解劑中的任一種溶解不溶性或沈澱PSMC。較佳地，PSMC用尿素或鹽酸胍溶解。應將溶解PSMC之體積減至最小，以便可使用便於管理之分批量產生大批量。此因素在可以數千公升體積之批量生長重組宿主之大規模商業裝置中非常重要。此外，當在大規模商業裝置中製造PSMC時，尤其當為了人類醫藥用途時，若可能則應避免可損壞機器及容器或蛋白產物自身之苛刻化學品。本發明方法中已顯示，較為溫和之變性劑尿素可用於溶解PSMC包涵體以代替較為苛刻之變性劑鹽酸胍。使用尿素顯著地降低損壞在PSMC製造及純化製程中所用的不鏽鋼設備之風險，同時有效溶解PSMC包涵體。
在可溶性PSMC之情況下，PSMC可分泌至周質空間中或分泌至培養基中。此外，可溶性PSMC可存在於宿主細胞之細胞質中。可需要在執行純化步驟之前濃縮可溶性PSMC。熟習此項技術者已知之標準技術可用於自例如細胞溶解產物或培養基中濃縮可溶性PSMC。此外，熟習此項技術者已知之標準技術可用於破壞宿主細胞，並且自宿主細胞之細胞質或周質空間釋放可溶性PSMC。
當產生融合蛋白形式之PSMC時，較佳移除融合序 列。可藉由酶裂解或化學裂解(較佳藉由酶裂解)來實現融合序列之移除。可使用熟習此項技術者所熟知之方法實現融合序列的酶法移除。用於移除融合序列之酶的選擇將藉由融合體之身分來確定，並且反應條件將藉由熟習此項技術者將顯而易見之酶的選擇來指定。較佳藉由熟知方法自經裂解之融合序列純化經裂解之PSMC。如熟習此項技術者將顯而易見，該等方法將藉由融合序列及PSMC之身分及特性來確定。純化方法可包括(但不限於)尺寸排阻層析、疏水性相互作用層析、離子交換層析或透析或其任何組合。
亦較佳純化PSMC以自蛋白溶液移除DNA。DNA可藉由此項技術中已知之任何合適方法移除，諸如沈澱或離子交換層析，但較佳使用核酸沈澱劑(諸如(但不限於)硫酸魚精蛋白)藉由沈澱加以移除。PSMC可使用包括(但不限於)離心或過濾之標準熟知方法自沈澱DNA分離。在欲使用PSMC治療人類並且本發明方法將宿主細胞DNA減至醫藥學上可接受之水準的裝置中，宿主核酸分子之移除為一個重要因素。
小規模或大規模醱酵方法亦可用於蛋白表現，包括(但不限於)醱酵罐、振盪燒瓶、流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、輥瓶培養系統及攪拌槽生物反應器系統。此等方法中之每一者均可以分批、分批進料或連續模式製程執行。
本發明之人類PSMC通常可使用此項技術中之標準方法回收。舉例而言，培養基或細胞溶解產物可經離心或過濾以移除細胞碎片。上清液可經濃縮或稀釋至所需體積，或者經透濾至合適緩衝液中以調節製備以用於進一步純化。本發明PSMC之進一步純化包括自完整形式分離出脫醯胺基形式及剪斷形式的 PSMC變異體。
任何以下例示性程序均可用於純化本發明之抗原結合多肽：親和層析、陰離子或陽離子交換層析(使用包括(但不限於)DEAE SEPHAROSE)、二氧化矽層析、逆相HPLC、凝膠過濾(使用包括(但不限於)SEPHADEX G-75)、疏水性相互作用層析、尺寸排阻層析、金屬螯合物層析、超濾/透濾、乙醇沈澱、硫酸銨沈澱、層析聚焦、置換層析、電泳程序(包括(但不限於)製備型等電聚焦)、差異溶解性(包括(但不限於)硫酸銨沈澱)、SDS-PAGE或萃取。
可根據熟習此項技術者已知並且使用之標準程序將本發明蛋白(包括(但不限於)包含非天然胺基酸之蛋白、包含非天然胺基酸之蛋白的抗體、包含非天然胺基酸之蛋白的結合搭配物等)純化成部分或實質上均質。因此，本發明多肽可藉由此項技術中熟知之許多方法中的任一種回收及純化，該等方法包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沈澱、酸或鹼萃取、管柱層析、親和管柱層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、羥磷灰石層析、凝集素層析、凝膠電泳及其類似方法。在製備正確摺疊之成熟蛋白時，必要時可使用蛋白再摺疊步驟。高效液相層析(HPLC)、親和層析或其他合適方法可用於需要高純度之最終純化步驟中。在一個實施例中，針對非天然胺基酸(或包含非天然胺基酸之蛋白)所製備之抗體用作純化試劑，包括(但不限於)用於包含一或多個非天然胺基酸之蛋白的基於親和力之純化。一旦部分經純化或純化至均質(必要時)，多肽即視情況用於多種效用，包括(但不限於)作為分析組分、治療劑、預防劑、診斷劑、研究試劑及/或作為針對抗體產生之免疫原。
除了本文所提及之其他參考文獻之外，多種純化/蛋白摺疊方法亦為此項技術中所熟知，包括(但不限於)以下文獻中所述之方法：R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)；Deutscher,Methods in Enzymology Vol.182：Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)；Sandana,(1997)Bioseparation of Proteins,Academic Press,Inc.；Bollag等人(1996)Protein Methods，第2版Wiley-Liss,NY；Walker,(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ；Harris及Angal,(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England；Harris及Angal,Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England；Scopes,(1993)Protein Purification：Principles and Practice第3版Springer Verlag,NY；Janson及Ryden,(1998)Protein Purification：Principles,High Resolution Methods and Applications,Second Edition Wiley-VCH,NY；及Walker(1998),Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ；及其中所引用之參考文獻。
在真核宿主細胞或非真核宿主細胞中產生所關注的具有非天然胺基酸之蛋白或多肽之一個優勢在於該等蛋白或多肽典型地將以其原生構形經摺疊。然而，在本發明之某些實施例中，熟習此項技術者應認識到，在合成、表現及/或純化之後，蛋白可具有不同於相關多肽所需構形之構形。在本發明之一個態樣中，經表現之蛋白視情況變性且隨後複性。此舉利用此項技術中已知之方法達成，該等方法包括(但不限於)藉由向所關注的蛋白或多肽中添加伴侶蛋白；藉由在離液劑(諸如鹽酸胍)中溶解蛋白 質；利用蛋白質雙硫鍵異構酶等。
一般而言，偶爾需要變性及還原經表現之多肽，且隨後引起多肽再摺疊成較佳構形。舉例而言，胍、尿素、DTT、DTE及/或伴侶蛋白可添加於所關注的轉譯產物中。還原、變性及複性蛋白之方法為熟習此項技術者所熟知(參見上述參考文獻及Debinski等人(1993)J.Biol.Chem.,268：14065-14070；Kreitman及Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4：581-585；及Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.,205：263-270)。舉例而言，Debinski等人描述胍-DTE中包涵體蛋白之變性及還原。蛋白質可在含有包括(但不限於)氧化麩胱甘肽及L-精胺酸之氧化還原緩衝液中再摺疊。再摺疊試劑可流動或以其他方式移動至與一或多種多肽或其他表現產物接觸，或者反之亦然。
在原核產生PSMC之情況下，由此所產生之PSMC可錯摺疊並因而缺乏或具有降低之生物活性。蛋白質之生物活性可藉由「再摺疊」恢復。一般而言，藉由使用例如一或多種離液劑(例如尿素及/或胍)及能夠還原雙硫鍵之還原劑(例如二硫蘇糖醇DTT或2-巰基乙醇2-ME)溶解(其中PSMC亦為不溶性的)、展開及還原多肽鏈來再摺疊錯摺疊之PSMC。在適當離液劑濃度下，隨後添加氧化劑(例如氧氣、胱胺酸或胱胺)，以允許再形成雙硫鍵。PSMC可使用此項技術中已知之標準方法再摺疊，諸如描述於美國專利第4,511,502號、第4,511,503號及第4,512,922號中之方法，該等專利以引用的方式併入本文中。PSMC亦可與其他蛋白共摺疊以形成雜二聚體或雜多聚體。再摺疊或共摺疊之後，較佳進一步純化PSMC。
一般純化方法 可對任何分離步驟中所產生之包含 PSMC的細胞溶解產物或任何PSMC混合物執行多種分離步驟中的任一種，包括(但不限於)親和層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析、凝膠過濾層析、高效液相層析(「HPLC」)、逆相HPLC(「RP-HPLC」)、膨脹床吸附或其任何組合及/或重複且以任何適當次序。
用於執行本文所述技術之設備及其他必需材料為市售的。泵、餾分收集器、監測器、記錄儀及整個系統可購自例如Applied Biosystems(Foster City,CA)、Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)及Amersham Biosciences,Inc.(Piscataway,NJ)。包括(但不限於)交換基質材料、介質及緩衝液之層析材料亦可購自該等公司。
可使用諸如泵之特殊化設備更為快速地達成本文所述之管柱層析過程中的平衡及其他步驟，諸如洗滌及溶離。市售泵包括(但不限於)HILOAD®泵P-50、蠕動泵P-1、泵P-901及泵P-903(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
餾分收集器之實例包括RediFrac餾分收集器、FRAC-100及FRAC-200餾分收集器及SUPERFRAC®餾分收集器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。混合器亦可用於形成pH及線性濃度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1及在線混合器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
可使用任何市售監測器監測層析過程。該等監測器可用於收集如UV、pH及電導率之資訊。偵測器之實例包括監測器UV-1、UVICORD® S II、監測器UV-M II、監測器UV-900、監測器UPC-900、監測器pH/C-900及電導率監測器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。實際上，整個系統為市售的，包括 購自Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)之各種AKTA®系統。
舉例而言，在本發明之一個實施例中，PSMC可經還原且藉由在尿素中首先變性所得經純化PSMC來變性，接著在合適pH下稀釋至含有還原劑(諸如DTT)之TRIS緩衝液中。在另一實施例中，PSMC在介於約2M至約9M之間之濃度範圍內在尿素中變性，接著在介於約5.0至約8.0範圍內之pH下稀釋至TRIS緩衝液中。接著可培育此實施例之再摺疊混合物。在一個實施例中，再摺疊混合物在室溫下培育4至24小時。隨後可進一步分離或純化經還原及變性之PSMC混合物。
如本文所述，可在執行任何後續分離步驟之前調節第一PSMC混合物之pH。此外，可使用此項技術中已知之技術濃縮第一PSMC混合物或其任何後續混合物。此外，可使用熟習此項技術者所熟知之技術將包含第一PSMC混合物或其任何後續混合物之溶離緩衝液交換為適用於下一分離步驟之緩衝液。
離子交換層析 在一個實施例中且作為視情況選用之額外步驟，可對第一PSMC混合物執行離子交換層析。一般參見ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLES AND METHODS(目錄號18-1114-21,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))。市售離子交換管柱包括HITRAP®、HIPREP®及HILOAD®管柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。該等管柱利用強陰離子交換劑，諸如Q SEPHAROSE® Fast Flow、Q SEPHAROSE® High Performance及Q SEPHAROSE® XL；強陽離子交換劑，諸如SP SEPHAROSE® High Performance、SP SEPHAROSE® Fast Flow及SP SEPHAROSE® XL；弱陰離子交換 劑，諸如DEAE SEPHAROSE® Fast Flow；及弱陽離子交換劑，諸如CM SEPHAROSE® Fast Flow(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。可在純化過程之任何階段對PSMC執行陰離子或陽離子交換管柱層析以分離實質上經純化之PSMC。可使用任何合適陽離子交換基質執行陽離子交換層析步驟。可用之陽離子交換基質包括(但不限於)纖維狀、多孔、無孔、微粒狀、珠狀或交聯陽離子交換基質材料。該等陽離子交換基質材料包括(但不限於)纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化矽、聚醚或任何前述物質之複合物。
陽離子交換基質可為任何合適陽離子交換劑，包括強及弱陽離子交換劑。強陽離子交換劑可在廣泛pH範圍內保留離子化，並且因此能夠在廣泛pH範圍內結合PSMC。然而，弱陽離子交換劑可隨pH而喪失離子化。舉例而言，當pH降至低於約pH 4或pH 5時，弱陽離子交換劑可失去電荷。合適之強陽離子交換劑包括(但不限於)帶電官能基，諸如磺丙基(sulfopropyl，SP)、磺酸甲酯(methyl sulfonate，S)或磺乙基(sulfoethyl，SE)。陽離子交換基質可為較佳具有約2.5至約6.0之PSMC結合pH範圍的強陽離子交換劑。或者，強陽離子交換劑可具有約pH 2.5至約pH 5.5之PSMC結合pH範圍。陽離子交換基質可為具有約3.0之PSMC結合pH的強陽離子交換劑。或者，陽離子交換基質可為較佳具有約6.0至約8.0之PSMC結合pH範圍的強陽離子交換劑。陽離子交換基質可為較佳具有約8.0至約12.5之PSMC結合pH範圍的強陽離子交換劑。或者，強陽離子交換劑可具有約pH 8.0至約pH 12.0之PSMC結合pH範圍。
在負載PSMC之前，可例如使用若干管柱體積之稀 弱酸(例如四管柱體積之20mM乙酸，pH 3)來平衡陽離子交換基質。平衡之後，可添加PSMC，並且亦可在溶離實質上經純化PSMC之前使用弱酸溶液(諸如弱乙酸或磷酸溶液)洗滌管柱一次至數次。舉例而言，可使用大約2-4管柱體積之20mM乙酸(pH 3)來洗滌管柱。亦可使用例如2-4管柱體積之0.05M乙酸鈉(pH 5.5)或0.05M乙酸鈉與0.1M氯化鈉的混合物(pH 5.5)進行額外洗滌。或者，使用此項技術中已知之方法，可使用若干管柱體積之稀弱鹼平衡陽離子交換基質。
或者，可藉由使陽離子交換劑基質與具有足夠低pH或離子強度之緩衝液接觸以自基質中置換出PSMC，來溶離實質上經純化PSMC。溶離緩衝液之pH可介於約pH 2.5至約pH 6.0範圍內。更特定言之，溶離緩衝液之pH可介於約pH 2.5至約pH 5.5、約pH 2.5至約pH 5.0範圍內。溶離緩衝液可具有約3.0之pH。此外，溶離緩衝液之量可廣泛變化且一般將在約2至約10管柱體積之範圍內。此外，本文中可使用熟習此項技術者已知之合適緩衝液，包括(但不限於)介於至少約5mM至至少約100mM濃度範圍內之檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、HEPES及MES緩衝液。
在PSMC多肽吸附於陽離子交換劑基質之後，可藉由使基質與具有足夠高pH或離子強度之緩衝液接觸以自基質中置換出PSMC，來溶離實質上經純化PSMC多肽。用於高pH溶離實質上經純化PSMC之合適緩衝液可包括(但不限於)介於至少約5mM至至少約100mM濃度範圍內之檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、HEPES及MES緩衝液。
逆相層析 可根據熟習此項技術者已知之合適方案執 行RP-HPLC以純化蛋白。參見例如Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J.CHROM.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359：391-402。可對PSMC執行RP-HPLC以分離實質上經純化PSMC。就此而言，可使用具有多種長度(包括(但不限於)至少約C3至至少約C30、至少約C3至至少約C20或至少約C3至至少約C18)之烷基官能基的二氧化矽衍生樹脂。或者，可使用聚合樹脂。舉例而言，可使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd樹脂，其為苯乙烯聚合物樹脂。亦可使用具有多種烷基鏈長度之氰基或聚合樹脂。此外，RP-HPLC管柱可用諸如乙醇之溶劑洗滌。Source RP管柱為RP-HPLC管柱之另一實例。
可使用含有離子配對劑及有機改質劑(諸如甲醇、異丙醇、四氫呋喃、丙腈或乙醇)之合適溶離緩衝液自RP-HPLC管柱中溶離PSMC。最常用之離子配對劑包括(但不限於)乙酸、甲酸、過氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、乙酸四甲銨、乙酸四丁銨及乙酸三乙銨。可使用一或多種梯度或等度條件執行溶離，其中較佳梯度條件減少分離時間並減小峰寬度。另一方法涉及使用兩種梯度及不同溶劑濃度範圍。用於本文之合適溶離緩衝液的實例可包括(但不限於)乙酸銨及乙腈溶液。
疏水性相互作用層析純化技術 可對PSMC執行疏水性相互作用層析(HIC)。一般參見HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLES AND METHODS(目錄號18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)，其以引用之方式併入本文中。合適之HIC基質可包括(但不限於)烷基或芳基取代之基質，諸如丁基、己基、 辛基或苯基取代之基質，包括瓊脂糖、交聯瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、纖維素、二氧化矽、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基質及混合模式樹脂，包括(但不限於)聚乙烯胺樹脂或丁基或苯基取代之聚(甲基丙烯酸酯)基質。用於疏水性相互作用管柱層析之市售來源包括(但不限於)HITRAP®、HIPREP®及HILOAD®管柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
簡言之，在裝載之前，可使用熟習此項技術者已知之標準緩衝液平衡HIC管柱，該等標準緩衝液諸如乙酸/氯化鈉溶液或含有硫酸銨之HEPES。硫酸銨可用作裝載HIC管柱之緩衝液。在裝載PSMC之後，可接著使用標準緩衝液及條件洗滌管柱以移除非所需物質，但在HIC管柱上保留PSMC。可用約3至約10管柱體積之標準緩衝液，尤其諸如含有EDTA及低於平衡緩衝液的硫酸銨濃度之HEPES緩衝液或乙酸/氯化鈉緩衝液，來溶離PSMC。使用例如磷酸鉀梯度之降低線性鹽梯度亦可用於溶離PSMC分子。隨後可例如藉由過濾(諸如透濾或超濾)來濃縮溶離液。可利用透濾以移除用於溶離PSMC之鹽。
其他純化技術可對第一PSMC混合物或其任何後續混合物執行使用例如凝膠過濾(GEL FILTRATION：PRINCIPLES AND METHODS(目錄號18-1022-18,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)，其以引用的方式併入本文中)、羥磷灰石層析(合適基質包括(但不限於)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)、Bio-Gel HTP Hydroxyapatite(BioRad))、HPLC、膨脹床吸附、超濾、透濾、凍乾及其類似操作之另一分離步驟，以移除任何過量鹽並用適用於下一分離步驟或甚至最終藥物產物調配之緩衝液置 換緩衝液。
存在於PSMC中之非天然編碼胺基酸亦可用於提供自不含有非天然編碼胺基酸之其他細胞蛋白進行分離。由於非天然編碼胺基酸可包含獨特化學官能基，因此該獨特官能基與另一分子之偶合可提供實質性純化步驟。舉例而言，非天然編碼胺基酸可偶合於另一有助於自其他蛋白分離之分子。該等用於偶合於非天然胺基酸之分子包括(但不限於)PEG及其他聚合物、珠粒及其他固體物質。
可使用熟習此項技術者已知之技術在本文所述之各步驟處監測包括實質上經純化PSMC在內的PSMC產率。該等技術亦可用於評估最後分離步驟之後實質上經純化PSMC之產率。舉例而言，可使用具有多種烷基鏈長度之若干逆相高壓液相層析管柱中的任一種(諸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC以及陽離子交換HPLC及凝膠過濾HPLC)監測PSMC產率。
在本發明之特定實施例中，各純化步驟之後的PSMC產率可為用於各純化步驟之起始材料中PSMC的至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%或至少約99.99%。
可使用諸如SDS-PAGE之標準技術，或者藉由使用西方墨點法及ELISA分析量測PSMC來測定純度。舉例而言，可針對自負控制酵母醱酵及陽離子交換回收所分離之蛋白質產生多株抗體。該等抗體亦可用於探測污染性宿主細胞蛋白之存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由矽膠粒子組成，其表面帶有C4烷基鏈。自蛋白雜質分離PSMC是基於疏水性相互作用之強度的差異。用在經稀釋三氟乙酸中之乙腈梯度執行溶離。使用不鏽鋼管柱(填充有2.8至3.2公升之Vydac C4矽膠)執行製備型HPLC。藉由添加三氟乙酸酸化Hydroxyapatite Ultrogel溶離液，並且將其裝載在Vydac C4管柱上。對於洗滌及溶離，使用經稀釋三氟乙酸中之乙腈梯度。收集溶離份並且立即用磷酸鹽緩衝液中和。彙集在IPC界限內之PSMC溶離份。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由共價結合於Sepharose珠粒表面之二乙基胺基乙基(DEAE)-基團組成。由離子相互作用介導PSMC與DEAE基團之結合。乙腈及三氟乙酸通過管柱而未經保留。在已洗去此等物質之後，藉由在低pH下用乙酸鹽緩衝液洗滌管柱來移除痕量雜質。隨後用中性磷酸鹽緩衝液洗滌管柱，並且用具有增加之離子強度的緩衝液溶離PSMC。管柱填充有DEAE Sepharose高速流。調節管柱體積以確保PSMC裝載量在3-10mg PSMC多肽/毫升凝膠範圍內。用水及平衡緩衝液(磷酸鈉/磷酸鉀)洗滌管柱。裝載HPLC溶離液之經彙集溶離份，並且用平衡緩衝液洗滌管柱。隨後用洗滌緩衝液(乙酸鈉緩衝液)洗滌管柱，接著用平衡緩衝液洗滌。隨後，用溶離緩衝液(氯化鈉、磷酸鈉/磷酸鉀)自管柱中溶離PSMC，並根據主溶離曲線收集為單一溶離份。將DEAE Sepharose管柱之溶離液調節至指定電導率。將所得原料藥無菌過濾至鐵氟龍瓶中，並儲存在-70℃下。
可採用之額外方法包括(但不限於)移除內毒素之步驟。內毒素為位於革蘭氏陰性宿主細胞(諸如大腸桿菌)之外 膜上的脂多醣(LPS)。用於降低內毒素含量之方法為熟習此項技術者所已知，並且包括(但不限於)使用二氧化矽支撐物、玻璃粉末或羥磷灰石之純化技術；逆相層析、親和層析、尺寸排阻層析、陰離子交換層析、疏水性相互作用層析、此等方法之組合及其類似方法。可需要改質或額外方法以自所關注的多肽移除污染物，諸如共遷移蛋白。
多種方法及程序可用於評估含有一或多種非天然編碼胺基酸之PSMC蛋白的產率及純度，包括(但不限於)Bradford分析、SDS-PAGE、銀染色SDS-PAGE、庫馬斯染色SDS-PAGE、質譜法(包括(但不限於)MALDI-TOF)及熟習此項技術者已知用於表徵蛋白之其他方法。
VIII. 交替系統中之表現
若干策略已用於將非天然胺基酸引入非重組宿主細胞、經突變誘發宿主細胞或無細胞系統中之蛋白中。此等系統亦適用於製造本發明之抗原結合多肽。用反應性側鏈(諸如Lys、Cys及Tyr)使胺基酸衍生化會引起離胺酸轉化成N2-乙醯基-離胺酸。化學合成亦提供併入非天然胺基酸之簡單方法。使用最近開發之肽片段的酶連接及原生化學連接，可能製得較大蛋白。參見例如P.E.Dawson及S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem.,69：923(2000)。一種普通活體外生物合成方法已用於將超過100個非天然胺基酸以位點特異性方式併入實際上任何大小之多種蛋白中，在該方法中將用所需非天然胺基酸化學醯化之抑制基因tRNA添加於能夠支持蛋白生物合成的活體外提取物中。參見例如V.W.Cornish,D.Mendel及P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34：621(1995)；C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C. Griffith,P.G.Schultz,A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science 244：182-188(1989)；及J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111：8013-8014(1989)。多種官能基已經引入蛋白中用於研究蛋白穩定性、蛋白摺疊、酶機制及信號轉導。
發展出稱為選擇性壓力併入之活體內方法來開發野生型合成酶之混雜。參見例如N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder及R.Huber,FASEB J.,13：41(1999)。在含有有限濃度之天然胺基酸的基本培養基中生長營養缺陷型菌株，而同時抑制標靶基因之轉錄，該營養缺陷型菌株中對細胞提供特定天然胺基酸之相關代謝路徑關閉。在生長停滯期開始時，天然胺基酸耗盡並由非天然胺基酸類似物置換。誘導重組蛋白表現會引起含有非天然類似物之蛋白的積聚。舉例而言，使用此策略，鄰氟苯丙胺酸、間氟苯丙胺酸及對氟苯丙胺酸已經併入蛋白中，並且在UV光譜中展現可輕易地鑑別的兩個特徵性肩部，參見例如C.Minks,R.Huber,L.Moroder及N.Budisa,Anal.Biochem.,284：29(2000)；三氟甲硫胺酸已用於置換噬菌體T4溶菌酶中之甲硫胺酸以藉由19F NMR研究其與殼寡醣配位體之相互作用，參見例如H.Duewel,E.Daub,V.Robinson及J.F.Honek,Biochemistry,36：3404(1997)；並且三氟白胺酸已經併入以代替白胺酸，從而產生白胺酸拉鏈蛋白之增加的熱及化學穩定性。參見例如Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado及D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,40：1494 (2001)。此外，硒甲硫胺酸及碲甲硫胺酸經併入各種重組蛋白中以促進X射線結晶學中之相溶解。參見例如W.A.Hendrickson,J.R.Horton及D.M.Lemaster,EMBO J.,9：1665(1990)；J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda及M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1：283(1994)；N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann及R.Huber,Eur.J.Biochem.,230：788(1995)；及N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder及R.Huber,J.Mol.Biol.,270：616(1997)。亦已有效地併入具有烯烴或炔官能基之甲硫胺酸類似物，使得允許藉由化學手段額外修飾蛋白。參見例如J.C.M.vanHest及D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428：68(1998)；J.C.M.van Hest,K.L.Kiick及D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.,122：1282(2000)；及K.L.Kiick及D.A.Tirrell,Tetrahedron,56：9487(2000)；美國專利第6,586,207號；美國專利公開案2002/0042097，其以引用的方式併入本文中。
此方法之成功取決於胺醯基-tRNA合成酶對非天然胺基酸類似物的識別，這通常需要高度選擇性以確保蛋白轉譯之保真度。一種擴大此方法之範圍的方式在於放鬆胺醯基-tRNA合成酶之受質特異性，這已在有限數目之情形中達成。舉例而言，在大腸桿菌苯丙胺醯基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置換Ala294會增大受質結合袋的尺寸，並且導致由p-Cl-苯丙胺酸(p-Cl-Phe)醯化tRNAPhe。參見M.Ibba,P.Kast及H.Hennecke,Biochemistry,33：7107(1994)。具有此突變型PheRS之大腸桿菌菌株允許併入p-Cl-苯丙胺酸或p-Br-苯丙胺酸以代替苯丙氨酸。參見例如M.Ibba及H.Hennecke,FEBS Lett.,364：272(1995)；及N.Sharma,R. Furter,P.Kast及D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467：37(2000)。類似地，靠近大腸桿菌酪胺醯基-tRNA合成酶之胺基酸結合位點的點突變Phe130Ser顯示允許氮雜酪胺酸比酪胺酸更加有效地併入。參見F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soll及S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275：40324(2000)。
用於將非天然胺基酸活體內併入蛋白中之另一策略在於修飾具有改正機制之合成酶。此等合成酶不能辨別並因此不能活化結構上與同源天然胺基酸相似之胺基酸。此錯誤在單獨位點處經修正，其使得來自tRNA之錯電荷胺基酸去醯化，以維持蛋白轉譯之保真度。若合成酶之改正活性不能作用，則經錯誤活化之結構類似物可逃脫編輯功能並且經併入。最近已用纈胺醯基-tRNA合成酶(ValRS)證明了此方法。參見V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel及P.Marliere,Science,292：501(2001)。ValRS可用Cys、Thr或胺基丁酸酯(Abu)錯胺醯化tRNAVal；此等非同源胺基酸隨後藉由編輯結構域水解。隨機突變誘發大腸桿菌染色體之後，選擇在ValRS編輯位點中具有突變之突變型大腸桿菌菌株。此編輯缺陷型ValRS錯誤地用Cys使tRNAVal帶電。因為Abu空間上類似於Cys(Abu中Cys之-SH基團由-CH3置換)，因此當此突變型大腸桿菌菌株在Abu存在下生長時，突變型ValRS亦將Abu併入蛋白中。質譜分析展示在原生蛋白中之各纈胺酸位置處約24%纈胺酸由Abu置換。
固相合成及半合成方法亦已允許合成許多含有新穎胺基酸之蛋白。舉例而言，參見以下公開案及其中所引用之參考 文獻：Crick,F.J.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192：1227-1232(1961)；Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment,J.Am Chem,88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser,E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes,Acc Chem Res,47-54(1989)；Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,3808-3810(1987)；Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054)：221-225(1992)；Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,11(3)：255-301(1981)；Offord,R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.,1(3)：151-157(1987)；及Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C.,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183)：243(1994)。
化學修飾已用於將多種非天然側鏈活體外引入蛋白中，該等非天然側鏈包括輔因子、自旋標記及寡核苷酸。參見例如Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832)：1401-1403(1987)；Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modification of enzymatic specificity,Annu Rev Biochem,54：565-595(1985)；Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemical mutation of enyzme active sites,Science,226(4674)：505-511(1984)；Neet,K.E.,NanciA,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24)：6392-6401(1968)；Polgar,L.B.,M.L.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,3153-3154(1966)；及Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites,Science,242(4881)：1038-1040(1988)。
或者，採用經化學修飾之胺醯基-tRNA的生物合成方法已用於將若干生物物理探針併入活體外合成之蛋白中。參見以下公開案及其中所引用之參考文獻：Brunner,J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,62：483-514(1993)；及Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl.Acad.Sci,83(22)：8604-8608(1986)。
先前已展示，可藉由將經化學胺醯化之抑制基因tRNA添加至用含有所需琥珀無意義突變之基因程控的蛋白合成反應中而將非天然胺基酸活體外位點特異性地併入蛋白中。使用此等方法，可使用針對特定胺基酸營養缺陷之菌株用結構密切同系物取代許多常見的20種胺基酸，例如用氟苯丙胺酸取代苯丙胺酸。參見例如Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science,244：182-188(1989)；M.W. Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide,J.Am Chem Soc,111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51(1999)；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,Methods in Enz.,301-336(1992)；及Mendel,D.,Cornish,V.W.及Schultz,P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24,435-62(1995)。
舉例而言，製備識別終止密碼子UAG之抑制基因tRNA，並且用非天然胺基酸化學胺醯化。習知定點突變誘發用於在蛋白基因中之所關注位點處引入終止密碼子TAG。參見例如Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis,Nucleic Acids Res,16(3)：791-802(1988)。當在活體外轉錄/轉譯系統中組合經醯化之抑制基因tRNA及突變基因時，回應於UAG密碼子而併入非天然胺基酸，該UAG密碼子產生在指定位置處含有彼胺基酸的蛋白。使用[3H]-Phe之實驗及使用α-羥酸之實驗證明僅所需胺基酸在由UAG密碼子所指定的位置處併入，並且此胺基酸不在蛋白之任何其他位點處併入。參見例如Noren等人，同上；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology 10(6)：425-432；及Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins,Science,255(5041)：197-200(1992)。
顯微注射技術亦已用於將非天然胺基酸併入蛋白中。參見例如M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty及H.A.Lester,Science,268：439(1995)；及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4：645(2000)。用活體外製備之兩個RNA物種共注射爪蟾卵母細胞：在所關注之胺基酸位置處具有UAG終止密碼子之編碼標靶蛋白的mRNA及用所需非天然胺基酸胺醯化的琥珀抑制基因tRNA。卵母細胞之轉譯機器隨後在由UAG所指定之位置處插入非天然胺基酸。此方法允許整體膜蛋白之活體內結構-功能研究，該等研究通常並不服從活體外表現系統。實例包括將螢光胺基酸併入速激肽神經激肽-2受體中以藉由螢光共振能量轉移量測距離，參見例如G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel及A.Chollet,J.Biol.Chem.,271：19991(1996)；併入生物素標記之胺基酸以鑑別離子通道中的表面暴露殘基，參見例如J.P.Gallivan,H.A.Lester及D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4：739(1997)；使用經捕獲酪胺酸類似物以即時監測離子通道中的構形改變，參見例如J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty及H.A.Lester,Neuron,20：619(1998)；及使用α羥基胺基酸來改變離子通道骨架以用於探測其閘控機制。參見例如P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty及H.A.Lester,Cell,96：89(1999)；及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz及J.Yang,Nat.Neurosci.,4：239(2001)。
將非天然胺基酸直接活體內併入蛋白中之能力提供 以下優勢：高產率突變型蛋白、技術便利、研究細胞中或可能活生物體中之突變型蛋白的可能性以及在治療性治療中使用此等突變型蛋白。將具有各種大小、酸度、親核性、疏水性及其他特性之非天然胺基酸納入蛋白中之能力可極大地擴大合理且系統地操縱蛋白結構之能力，以探測蛋白功能並且產生具有新穎特性的新蛋白或生物體。然而，由於需要實現蛋白轉譯之高度保真度的tRNA-合成酶相互作用的複雜性質，故該過程為困難的。
在位點特異性地併入para-F-Phe之一個嘗試中，在p-F-Phe抗性、Phe營養缺陷型大腸桿菌菌株中使用酵母琥珀抑制基因tRNAPheCUA/苯丙胺醯基-tRNA合成酶對。參見例如R.Furter,Protein Sci.,7：419(1998)。
使用無細胞(活體外)轉譯系統亦可能獲得本發明PSMC聚核苷酸之表現。在此等可包括mRNA作為模板(活體外轉譯)或DNA作為模板(組合之活體外轉錄及轉譯)之系統中，由核糖體指導活體外合成。已應用大量工作來開發無細胞蛋白表現系統。參見例如Kim,D.-M.及J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74：309-316(2001)；Kim,D.-M.及J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000)；Kim,D.-M.及J.R.Swartz,Biotechnology Progress,16,385-390,(2000)；Kim,D.-M.及J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,66,180-188,(1999)；及Patnaik,R.及J.R.Swartz,Biotechniques 24,862-868,(1998)；美國專利第6,337,191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO 00/55353；WO 90/05785，其以引用之方式併入本文中。可用於表現包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽的另一方法包括mRNA-肽融合技術。參見例如R.Roberts及J.Szostak,Proc. Natl Acad.Sci.(USA) 94：12297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistry & Biology 10：1043-1050(2003)。在此方法中，鍵聯於嘌呤黴素之mRNA模板在核糖體上經轉譯為肽。若一或多個tRNA分子已經修飾，則亦可將非天然胺基酸併入肽中。在已讀出最後mRNA密碼子之後，嘌呤黴素捕獲肽之C端。若在活體外分析中發現所得mRNA-肽結合物具有令人感興趣的特性，則可自mRNA序列輕易地顯露出其身分。以此方式，可篩選包含一或多個非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽的文庫以鑑別具有所需特性之多肽。 最近，已報導用經純化組分進行活體外核糖體轉譯允許經非天然編碼胺基酸取代之肽的合成。參見例如A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100：6353(2003)。
IX. 偶合於PSMC之大分子聚合物
可使用本文所述之組合物、方法、技術以及策略實現對本文所述之非天然胺基酸多肽的各種修飾。此等修飾包括將其他官能基併入多肽之非天然胺基酸組分上，該等其他官能基包括(但不限於)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交聯劑、放射性核素、細胞毒性化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反義聚核苷酸、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、奈米粒子、自旋標記、螢光團、含金屬部分、放射性部分、新穎官能基、與其他分子共價或非共價相互作用之基團、光捕獲部分、光可異構化部分、生物素、生物素衍生物、生物素類似物、併有重原子之部分、化學可裂解基團、光可裂解基團、長側鏈、碳鍵聯糖、氧化 還原活性劑、胺基硫代酸、毒性部分、經同位素標記部分、生物物理探針、磷光基團、化學發光基團、電子緻密基團、磁性基團、插入基團、發色團、能量轉移劑、生物活性劑、可偵測標記、小分子或上述各物之任何組合或任何其他所需化合物或物質。作為本文所述之組合物、方法、技術及策略的說明性、非限制性實例，以下描述將集中於將大分子聚合物添加至非天然胺基酸多肽中，同時應瞭解，其中所述之組合物、方法、技術及策略亦適用於(必要時進行適當修改並且熟習此項技術者可利用本文揭示內容作出適當修改)添加包括(但不限於)上文所列在內的其他官能基。
多種大分子聚合物及其他分子可鍵聯於本發明之抗原結合多肽以調節PSMC的生物特性及/或對PSMC分子提供新生物特性。此等大分子聚合物可經由天然編碼胺基酸、經由非天然編碼胺基酸，或者天然或非天然胺基酸的任何官能取代基，或添加於天然或非天然胺基酸中之任何取代基或官能基鍵聯於PSMC。聚合物之分子量可具有廣泛範圍，包括(但不限於)介於約100Da與約100,000Da之間或更大。
本發明提供聚合物：蛋白結合物之實質上均質製劑。如本文所用，「實質上均質」意謂觀察到聚合物：蛋白結合物分子大於總蛋白的一半。聚合物：蛋白結合物具有生物活性，並且本文所提供之本發明「實質上均質的」PEG化PSMC製劑為具有足以呈現均質製劑優勢之均質性的製劑，該等優勢例如臨床應用中批次之間藥物動力學可預測性的簡易性。
亦可選擇製備聚合物：蛋白結合物分子之混合物，並且本文所提供的優勢在於可選擇包括於混合物中之單聚合物：蛋白結合物的比例。因此，必要時可製備各種蛋白與各種數目之經 連接(亦即二-、三-、四-等)聚合物部分之混合物，並且組合該等結合物與使用本發明方法所製備的單聚合物：蛋白結合物，並且使混合物具有預定比例之單聚合物：蛋白結合物。
所選聚合物可為水溶性的，以致與其所連接的蛋白不在水性環境(諸如生理環境)中沈澱。聚合物可為分支或未分支的。對於最終產物製劑之治療用途，聚合物較佳將為醫藥學上可接受的。
聚乙二醇分子與蛋白分子之比例將變化，其在反應混合物中之濃度亦將變化。一般而言，可藉由所選聚乙二醇之分子量及可用反應性基團的可用數目測定最佳比率(就反應效率而言在於存在最少過量的未反應蛋白或聚合物)。至於分子量，典型地聚合物之分子量愈高，可連接於蛋白之聚合物分子的數目愈少。同樣，當最佳化此等參數時，應考慮到聚合物分支。通常分子量愈高(或分支愈多)，聚合物：蛋白比率愈高。
如本文所用並且當考慮PEG：PSMC結合物時，術語「治療有效量」是指對患者產生所需益處的量。該量在不同個體之間將不同，並且將取決於許多因素，包括患者之總體身體狀況及待治療病狀之根本起因。療法所用PSMC多肽的量產生可接受比率之改變，並且在有益水準下維持所需反應。熟習此項技術者使用公開可用之材料及程序可輕易地探知本發明組合物之治療有效量。
水溶性聚合物可呈任何結構形式，包括(但不限於)直鏈、叉狀或分支狀。典型地，水溶性聚合物為聚(伸烷基二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，但亦可使用其他水溶性聚合物。舉例而言，使用PEG描述本發明之某些實施例。
PEG為一種熟知之水溶性聚合物，其可為市售的或者可根據此項技術中熟知之方法藉由乙二醇開環聚合來製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。廣泛使用術語「PEG」來涵蓋任何聚乙二醇分子，而不考慮大小或考慮PEG末端的修飾，並且可由下式表示為與PSMC鍵聯：XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n為2至10,000且X為H或末端修飾，包括(但不限於)C1-4烷基。
在一些情況下，本發明所用之PEG在一個末端用羥基或甲氧基封端，亦即X為H或CH3(「甲氧基PEG」)。或者，PEG可用反應性基團封端，藉此形成雙官能聚合物。典型反應性基團可包括通常用於與發現於20種常見胺基酸中之官能基反應的彼等反應性基團(包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺基、經活化碳酸酯(包括(但不限於)對硝基苯基酯)、經活化酯(包括(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺、對硝基苯基酯)及醛)；以及對20種常見胺基酸呈惰性但與存在於非天然編碼胺基酸中的互補官能基特異性反應之官能基(包括(但不限於)疊氮基、炔基)。應注意，上述式中由Y展示之PEG另一末端將直接或經由天然存在或非天然編碼胺基酸間接連接於抗原結合多肽。舉例而言，Y可為連接於多肽之胺基(包括(但不限於)離胺酸之ε胺或N端)之醯胺、胺基甲酸酯或脲鍵聯。或者，Y可為連接於硫醇基團(包括(但不限於)半胱胺酸之硫醇基團)的順丁烯二醯亞胺鍵聯。或者，Y可為與通常不可經由20種常見胺基酸到達的殘基連接之鍵聯。舉例而言，PEG上之疊氮基可與PSMC上之炔基反應以形 成Huisgen[3+2]環加成產物。或者，PEG上之炔基可與存在於非天然編碼胺基酸中的疊氮基反應以形成類似產物。在一些實施例中，強親核試劑(包括(但不限於)肼、醯肼、羥胺、胺基脲)可與存在於非天然編碼胺基酸中之醛或酮基反應以形成腙、肟或縮胺基脲，適當時，其在一些情況下可進一步經適當還原劑處理而經還原。或者，強親核試劑可經由非天然編碼胺基酸併入PSMC中，並且用於優先與存在於水溶性聚合物中的酮或醛基反應。
可視實際需要使用任何分子質量之PEG，包括(但不限於)約100道爾頓(Da)至100,000Da或必要時更大(包括(但不限於)有時0.1-50kDa或10-40kDa)。亦可使用分支鏈PEG，包括(但不限於)各鏈具有介於1-100kDa(包括(但不限於)1-50kDa或5-20kDa)範圍內之MW的PEG分子。各種PEG分子描述於包括(但不限於)Shearwater Polymers,Inc.目錄、Nektar Therapeutics目錄中，各目錄以引用的方式併入本文中。
通常，PEG分子之至少一個末端可用於與非天然編碼胺基酸反應。舉例而言，如本文所述，具有用於與胺基酸側鏈反應之炔及疊氮部分的PEG衍生物可用於使PEG與非天然編碼胺基酸連接。若非天然編碼胺基酸包含疊氮，則PEG將典型地含有炔部分以形成[3+2]環加成產物，或者含有膦基之經活化PEG物質(亦即酯、碳酸酯)以形成醯胺鍵聯。或者，若非天然編碼胺基酸包含炔，則PEG將典型地含有疊氮部分以形成[3+2]Huisgen環加成產物。若非天然編碼胺基酸包含羰基，則PEG將典型地包含有效親核試劑(包括(但不限於)醯肼、肼、羥胺或胺基脲官能基)以分別形成相應的腙、肟及縮胺基脲鍵聯。在其他替代實施例中，可使用上述反應性基團之反向定向，亦即非天 然編碼胺基酸中的疊氮部分可與含有炔之PEG衍生物反應。
在一些實施例中，具有PEG衍生物之PSMC變異體含有與存在於非天然編碼胺基酸的側鏈上之化學官能基具有反應性之化學官能基。
在一些實施例中，本發明提供包含具有約800Da至約100,000Da平均分子量之水溶性聚合物骨架的含疊氮及含乙炔之聚合物衍生物。水溶性聚合物之聚合物骨架可為聚(乙二醇)。然而，應瞭解，包括(但不限於)聚(乙二醇)及其他相關聚合物(包括聚(葡萄糖)及聚(丙二醇))之多種水溶性聚合物亦適用於實施本發明，並且使用術語PEG或聚(乙二醇)意欲涵蓋並包括所有該等分子。術語PEG包括(但不限於)任何形式之聚(乙二醇)，包括雙官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉狀PEG、分支PEG、懸垂PEG(亦即具有一或多個懸垂於聚合物骨架之官能基的PEG或相關聚合物)或其中具有可降解鍵聯之PEG。
PEG典型地透明、無色、無味、可溶於水、對熱穩定、對許多化學試劑呈惰性、不水解或變質並且通常無毒。認為聚(乙二醇)具有生物相容性，亦即PEG能夠與活組織或生物體共存而沒有危害。更特定言之，PEG實質上無免疫原性，亦即PEG不傾向於在體內產生免疫反應。當在體內與具有一些所需功能之分子(諸如生物活性劑)連接時，PEG傾向於遮蔽該試劑，並且可降低或消除任何免疫反應，致使生物體可忍受該試劑的存在。PEG結合物不傾向於產生實質免疫反應或者引起凝結或其他不良作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(其中n為約3至約4000，典型地約20至約2000)之PEG適用於本發明。具有約800Da至約100,000Da分子量之PEG在本發明之一些實施例 中尤其可用作聚合物骨架。
聚合物骨架可為直鏈或分支狀。分支聚合物骨架通常為此項技術中已知的。典型地，分支聚合物具有中央分支核心部分及複數個鍵聯於該中央分支核心之直鏈聚合物鏈。PEG通常以分支形式使用，該等分支形式可藉由將氧化乙烯添加於各種多元醇中來製備，該等多元醇諸如甘油、甘油寡聚物、異戊四醇及山梨糖醇。中央分支部分亦可源於一些胺基酸，諸如離胺酸。分支聚(乙二醇)可由通式R(-PEG-OH)m表示，其中R源於核心部分，諸如甘油、甘油寡聚物或異戊四醇，且m表示臂數目。多臂PEG分子，諸如描述於以下中之多臂PEG分子亦可用作聚合物骨架：美國專利第5,932,462號、第5,643,575號、第5,229,490號、第4,289,872號；美國專利申請案2003/0143596；WO 96/21469；及WO 93/21259，各案均以全文引用的方式併入本文中。
分支PEG亦可呈由PEG(--YCHZ2)n表示之叉狀PEG形式，其中Y為鍵聯基團，且Z為藉由規定長度之原子鏈鍵聯於CH的經活化末端基團。
另一分支形式，即懸垂PEG沿PEG骨架而非在PEG鏈末端具有反應性基團，諸如羧基。
除了此等形式之PEG之外，亦可用骨架中之弱或可降解鍵聯製備聚合物。舉例而言，可用聚合物骨架中經歷水解之酯鍵聯製備PEG。如下文所示，此水解引起聚合物裂解為較低分子量之片段：-PEG-CO2-PEG-+H2O → PEG-CO2H+HO-PEG-。
熟習此項技術者應瞭解，術語聚(乙二醇)或PEG表示或包括此項技術中已知之所有形式，包括(但不限於)本文所揭示之形 式。
許多其他聚合物亦適用於本發明。在一些實施例中，具有2至約300個末端之水溶性聚合物骨架尤其可用於本發明。合適聚合物之實例包括(但不限於)其他聚(伸烷基二醇)，諸如聚(丙二醇)(「PPG」)、其共聚物(包括(但不限於)乙二醇與丙二醇的共聚物)、其三元共聚物、其混合物及其類似物。儘管聚合物骨架之各鏈的分子量可不同，但其典型地在約800Da至約100,000Da範圍內，通常在約6,000Da至約80,000Da範圍內。
熟習此項技術者應認識到，前文關於實質上水溶性骨架之清單決非詳盡的，而僅為說明性的，並且預期所有具有上述量之聚合材料均適用於本發明。
在本發明之一些實施例中，聚合物衍生物為「多官能的」，意謂聚合物骨架具有至少兩個經官能基官能化或活化之末端，且可能多達約300個末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限於)具有兩個末端之直鏈聚合物，各末端鍵結於可能相同或不同之官能基。
在一個實施例中，聚合物衍生物具有以下結構：X-A-POLY-B-N=N=N
其中：N=N=N為疊氮部分；B為鍵聯部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原聚合物；A為鍵聯部分，其可存在或不存在且可與B相同或不同；且X為第二官能基。
用於A及B之鍵聯部分的實例包括(但不限於)含有至多18 個且更佳在1-10個碳原子之間的多官能化烷基。烷基鏈可包括諸如氮、氧或硫之雜原子。烷基鏈亦可在雜原子處分支。用於A及B之鍵聯部分的其他實例包括(但不限於)含有至多10個且更佳在5-6個碳原子之間的多官能化芳基。芳基可經一或多個碳原子、氮、氧或硫原子取代。合適鍵聯基團之其他實例包括描述於以下中之彼等鍵聯基團：美國專利第5,932,462號、第5,643,575號；及美國專利申請公開案2003/0143596，各案以引用的方式併入本文中。熟習此項技術者應認識到，前文關於鍵聯部分之清單決非詳盡的，而僅為說明性的，並且預期所有具有上述量之鍵聯部分均適用於本發明。
適合用作X之官能基的實例包括(但不限於)羥基；經保護羥基；烷氧基；活性酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺基酯及1-苯并三唑基酯；活性碳酸酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺基碳酸酯及1-苯并三唑基碳酸酯；縮醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯醯胺；活性碸；胺；胺氧基；經保護胺；醯肼；經保護醯肼；經保護硫醇；羧酸；經保護羧酸；異氰酸酯；異硫氰酸酯；順丁烯二醯亞胺；乙烯基碸；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙醯胺；環氧化物；乙二醛；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；三氟乙磺酸酯；烯；酮；及疊氮。熟習此項技術者應瞭解，所選X部分應與疊氮基相容，致使不與疊氮基發生反應。含疊氮之聚合物衍生物可具有同雙官能性，意謂第二官能基(亦即X)亦為疊氮部分；或者具有異雙官能性，意謂第二官能基為不同官能基。
術語「經保護」是指存在防止化學反應性官能基在某些反應條件下反應之保護基或部分。保護基應視所保護之化學反應性基團的類型而變化。舉例而言，若化學反應性基團為胺或 醯肼，則保護基可選自第三丁氧基羰基(t-Boc)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)之群。若化學反應性基團為硫醇，則保護基可為鄰吡啶基二硫化物。若化學反應性基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，則保護基可為苄基或烷基，諸如甲基、乙基或第三丁基。此項技術中已知之其他保護基亦可用於本發明。
文獻中末端官能基之特定實例包括(但不限於)N-丁二醯亞胺基碳酸酯(參見例如美國專利第5,281,698號、第5,468,478號)；胺(參見例如Buckmann等人Makromol.Chem.182：1379(1981)，Zaplipsky等人Eur.Polym.J.19：1177(1983))；醯肼(參見例如Andresz等人Makromol.Chem.179：301(1978))；丁二醯亞胺基丙酸酯及丁二醯亞胺基丁酸酯(參見例如Olson等人Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications，第170-181頁，Harris及Zaplipsky編輯，ACS,Washington,D.C.,1997；亦參見美國專利第5,672,662號)；丁二醯亞胺基丁二酸酯(參見例如Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)及Joppich等人Macrolol.Chem.180：1381(1979))；丁二醯亞胺基酯(參見例如美國專利第4,670,417號)；苯并三唑碳酸酯(參見例如美國專利第5,650,234號)；縮水甘油醚(參見例如Pitha等人Eur.J Biochem.94：11(1979)，Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))；氧基羰基咪唑(參見例如Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)，Tondelli等人J.Controlled Release 1：251(1985))；對硝基苯基碳酸酯(參見例如Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.,11：141(1985)；及Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.,27：45(1991))；醛(參見例如Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)，美國專利第5,824,784 號、美國專利第5,252,714號)；順丁烯二醯亞胺(參見例如Goodson等人Bio/Technology 8：343(1990)，Romani等人Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984))；及Kogan(Synthetic Comm.22：2417(1992))；鄰吡啶基-二硫化物(參見例如Woghiren等人Bioconj.Chem.4：314(1993))；丙烯基醇(參見例如Sawhney等人，Macromolecules,26：581(1993))；乙烯基碸(參見例如美國專利第5,900,461號)。所有上述參考文獻及專利均以引用的方式併入本文中。
在本發明之某些實施例中，本發明之聚合物衍生物包含具有以下結構的聚合物骨架：X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N
其中：X為如上文所述之官能基；且n為約20至約4000。
在另一實施例中，本發明之聚合物衍生物包含具有以下結構的聚合物骨架：X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N
其中：W為包含1-10個碳原子之間之脂族或芳族連接子部分；n為約20至約4000；且X為如上文所述之官能基。m介於1與10之間。
可藉由此項技術中已知及/或本文所揭示之多種方法製備本發明之含疊氮之PEG衍生物。在一種下文所示方法中，將具有約800Da至約100,000Da平均分子量之水溶性聚合物骨架與疊氮陰離子(其可與任何數目的合適反離子配對，包括鈉、鉀、 第三丁銨等)反應，其中聚合物骨架具有鍵結於第一官能基之第一末端及鍵結於合適離去基團之第二末端。離去基團經歷親核置換，並且由疊氮部分置換，得到所需含疊氮之PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 - → X-PEG-N3
如所示，用於本發明之合適聚合物骨架具有式X-PEG-L，其中PEG為聚(乙二醇)，且X為不與疊氮基反應之官能基，且L為合適離去基團。合適官能基之實例包括(但不限於)羥基、經保護羥基、縮醛、烯基、胺、胺氧基、經保護胺、經保護醯肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、順丁烯二醯亞胺、二硫吡啶及乙烯吡啶及酮。合適離去基團之實例包括(但不限於)氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯及甲苯磺酸酯。
在製備本發明之含疊氮之聚合物衍生物的另一方法中，使具有疊氮官能基之鍵聯劑與具有約800Da至約100,000Da平均分子量之水溶性聚合物骨架接觸(其中該鍵聯劑具有將與PEG聚合物上之化學官能基選擇性反應的化學官能基)，以形成含疊氮之聚合物衍生物產物，其中疊氮藉由鍵聯基團自聚合物骨架中分離。
例示性反應流程如下所示：X-PEG-M+N-連接子-N=N=N → PG-X-PEG-連接子-N=N=N
其中：PEG為聚(乙二醇)且X為封端基，諸如烷氧基或如上文所述之官能基；且M為不與疊氮官能基反應但將與N官能基有效且選擇性反應之官能基。
合適官能基之實例包括(但不限於)：若N為胺，則 M為羧酸、碳酸酯或活性酯；若N為醯肼或胺氧基部分，則M為酮；若N為親核試劑，則M為離去基團。
可藉由已知方法實現粗產物之純化，包括(但不限於)使產物沈澱，接著必要時進行層析。
在PEG二胺之情況下，下文展示更特定實例，其中一個胺受保護基團部分(諸如第三丁基-Boc)保護，且所得單保護PEG二胺與具有疊氮官能基之鍵聯部分反應：BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N=N=N
在此情況下，可使用多種活化劑(諸如亞硫醯氯或碳化二亞胺試劑及N-羥基丁二醯亞胺或N-羥基苯并三唑)使胺基團與羧酸基團偶合，以在單胺PEG衍生物與含疊氮之連接子部分之間產生醯胺鍵。成功形成醯胺鍵之後，所得經N-第三丁基-Boc保護之含疊氮衍生物可直接用於修飾生物活性分子，或者其可進一步經精製以安裝其他有用官能基。例如，可藉由用強酸處理來水解N-t-Boc基團以生成ω-胺基-PEG-疊氮。所得胺可用作合成把手以安裝諸如順丁烯二醯亞胺基團、經活化二硫化物、經活化酯等其他有用官能基，以用於產生有價值的異雙官能試劑。
當需要將不同分子連接於聚合物之各末端時，異雙官能衍生物尤其可用。舉例而言，ω-N-胺基-N-疊氮基PEG將允許具有經活化親電子基團(諸如醛、酮、經活化酯、經貨哈碳酸酯等)之分子連接於PEG的一個末端，而具有乙炔基之分子連接於PEG的另一末端。
在本發明之另一實施例中，聚合物衍生物具有以下結構：X-A-POLY-B-C≡C-R
其中：R可為H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或經取代芳基；B為鍵聯部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原聚合物；A為鍵聯部分，其可存在或不存在且可與B相同或不同；且X為第二官能基。
用於A及B之鍵聯部分的實例包括(但不限於)含有至多18個且更佳在1-10個碳原子之間的多官能化烷基。烷基鏈可包括諸如氮、氧或硫之雜原子。烷基鏈亦可在雜原子處分支。用於A及B之鍵聯部分的其他實例包括(但不限於)含有至多10個且更佳在5-6個碳原子之間的多官能化芳基。芳基可經一或多個碳原子、氮、氧或硫原子取代。合適鍵聯基團之其他實例包括描述於以下中之彼等鍵聯基團：美國專利第5,932,462號及第5,643,575號；及美國專利申請公開案2003/0143596，各案以引用的方式併入本文中。熟習此項技術者應認識到，前文關於鍵聯部分之清單決非詳盡的，而僅意欲為說明性的，並且預期多種具有上述量之鍵聯部分適用於本發明。
適合用作X之官能基的實例包括(但不限於)羥基；經保護羥基；烷氧基；活性酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺基酯及1-苯并三唑基酯；活性碳酸酯，諸如N-羥基丁二醯亞胺基碳酸酯及1-苯并三唑基碳酸酯；縮醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯醯胺；活性碸；胺；胺氧基；經保護胺；醯肼；經保護醯肼；經保護硫醇；羧酸；經保護羧酸；異氰酸酯；異硫氰酸酯；順丁烯二醯亞胺；乙烯基碸；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙醯胺；環氧化物；乙二醛；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯； 及三氟乙磺酸酯；烯烴；酮；及乙炔。應瞭解，所選X部分應與乙炔基相容，致使不與乙炔基發生反應。含乙炔之聚合物衍生物可具有同雙官能性，意謂第二官能基(亦即X)亦為乙炔部分；或者具有異雙官能性，意謂第二官能基為不同官能基。
在本發明之另一實施例中，聚合物衍生物包含具有以下結構的聚合物骨架：X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH其中：X為如上文所述之官能基；n為約20至約4000；且m介於1與10之間。
各異雙官能PEG聚合物之特定實例如下文所示。
可使用熟習此項技術者已知及/或本文所揭示之方法製備本發明之含乙炔之PEG衍生物。在一種方法中，將具有約800Da至約100,000Da平均分子量之水溶性聚合物骨架與具有乙炔官能基及適於與PEG上之親核基團反應的離去基團之化合物反應，其中聚合物骨架具有鍵結於第一官能基之第一末端及鍵結於合適親核基團之第二末端。當組合具有親核部分之PEG聚合物與具有離去基團之分子時，離去基團經歷親核置換，並且由親核部分置換，生成所需含乙炔之聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'
如所示，用於該反應之較佳聚合物骨架具有式X-PEG-Nu，其中PEG為聚(乙二醇)，Nu為親核部分且X為不與Nu、L或乙炔官能基反應之官能基。
Nu之實例包括(但不限於)將主要經由SN2型機制 反應之胺、烷氧基、芳氧基、巰基、亞胺基、羧酸酯、醯肼、胺氧基。Nu基團之額外實例包括將主要經由親核加成反應而反應之彼等官能基。L基團之實例包括氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯及甲苯磺酸酯，及其他預期經歷親核置換之基團，以及酮、醛、硫酯、烯烴、α-β不飽和羰基、碳酸酯及其他預期經歷親核試劑加成之親電子基團。
在本發明之另一實施例中，A為1-10個碳原子之間的脂族連接子，或6-14個碳原子之間的經取代芳基環。X為不與疊氮基反應之官能基，且L為合適離去基團。
在製備本發明之含乙炔之聚合物衍生物的另一方法中，使乙炔陰離子與具有約800Da至約100,000Da平均分子量之PEG聚合物接觸，該PEG聚合物在一個末端具有經保護官能基或封端劑且在另一末端具有合適離去基團。
例示性反應流程如下所示：X-PEG-L+-C≡CR' → X-PEG-C≡CR'
其中：PEG為聚(乙二醇)且X為封端基，諸如烷氧基或如上文所述之官能基；且R'為H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，或經取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述實例中，當與足夠濃度之乙炔陰離子接觸時，離去基團L應具有足夠反應性以經歷SN2型置換。實現乙炔陰離子對離去基團之SN2置換所需的反應條件為此項技術中所熟知。
通常可藉由此項技術中已知之方法實現粗產物之純化，包括(但不限於)使產物沈澱，接著必要時進行層析。
水溶性聚合物可鍵聯於本發明之抗原結合多肽。水溶性聚合物可經由併入抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸，或者非天然編碼或天然編碼胺基酸的任何官能基或取代基，或者添加於非天然編碼或天然編碼胺基酸中之任何官能基或取代基鍵聯。或者，水溶性聚合物經由非天然存在胺基酸(包括(但不限於)半胱胺酸、離胺酸或N端殘基之胺基)鍵聯於併入非天然編碼胺基酸的抗原結合多肽。在一些情況下，本發明之PSMC包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個非天然胺基酸，其中一或多個非天然編碼胺基酸鍵聯於水溶性聚合物(包括(但不限於)PEG及/或寡醣)。在一些情況下，本發明之PSMC進一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鍵聯於水溶性聚合物之天然編碼胺基酸。在一些情況下，本發明之PSMC包含一或多個鍵聯於水溶性聚合物之非天然編碼胺基酸及一或多個鍵聯於水溶性聚合物之天然存在胺基酸。在一些實施例中，用於本發明之水溶性聚合物增強相對於非結合形式之PSMC的血清半衰期。
可調節鍵聯於本發明之抗原結合多肽的水溶性聚合物數目(亦即PEG化或糖基化之程度)以提供改變之(包括(但不限於)增加或降低之)藥理學、藥物動力學或藥效學特徵，諸如活體內半衰期。在一些實施例中，PSMC之半衰期相比未經修飾多肽增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、10倍、50倍或至少約100倍。
含有強親核基團(亦即醯肼、肼、羥胺或胺基脲)之PEG衍生物
在本發明之一個實施例中，用含有直接鍵聯於PEG骨架之末端肼、羥胺、醯肼或胺基脲部分的PEG衍生物修飾包含 含羰基非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽。
在一些實施例中，羥胺末端PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(亦即平均分子量介於5-40kDa之間)。
在一些實施例中，含肼或含醯肼PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000且X視情況為可存在或不存在之羰基(C=O)。
在一些實施例中，含胺基脲PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000。
在本發明之另一實施例中，用含有藉助於醯胺鍵聯鍵聯於PEG骨架之末端羥胺、醯肼、肼或胺基脲部分的PEG衍生物修飾包含含羰基胺基酸之抗原結合多肽。
在一些實施例中，羥胺末端PEG衍生物具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(亦即平均分子量介於5-40kDa之間)。
在一些實施例中，含肼或含醯肼PEG衍生物具有以 下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，n為100-1,000且X視情況為可存在或不存在之羰基(C=O)。
在一些實施例中，含胺基脲PEG衍生物具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000。
在本發明之另一實施例中，用含有末端肼、羥胺、醯肼或胺基脲部分之分支PEG衍生物修飾包含含羰基胺基酸之PSMC，其中該分支PEG的各鏈具有介於10-40kDa範圍內且更佳介於5-20kDa範圍內之MW。
在本發明之另一實施例中，用具有分支結構之PEG衍生物修飾包含非天然編碼胺基酸之PSMC。舉例而言，在一些實施例中，肼或醯肼末端PEG衍生物將具有以下結構：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000且X視情況為可存在或不存在之羰基(C=O)。
在一些實施例中，含有胺基脲基團之PEG衍生物將具有以下結構：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。
在一些實施例中，含有羥胺基團之PEG衍生物將具有以下結構：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視情況為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2-10且n為100-1,000。
水溶性聚合物鍵聯於PSMC之程度與位點可調節PSMC與抗原或受體之結合。
用於活化聚合物以及用於結合肽之方法及化學在文獻中有所描述並且為此項技術中已知的。通常用於活化聚合物之方法包括(但不限於)用以下物質活化官能基：溴化氰、過碘酸鹽、戊二醛、二環氧化物、表氯醇、二乙烯基碸、碳化二亞胺、磺醯基鹵化物、三氯三嗪等(參見R.F.Taylor,(1991),PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC Press,Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993),IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES,Academic Press,N.Y.；Dunn,R.L.等人編輯POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,ACS Symposium Series第469卷，American Chemical Society,Washington,D.C.1991)。
可獲得若干關於PEG官能化及結合之綜述及專論。參見例如Harris,Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten,Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人， Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。
用於活化聚合物之方法亦可發現於WO 94/17039、美國專利第5,324,844號、WO 94/18247、WO 94/04193、美國專利第5,219,564號、美國專利第5,122,614號、WO 90/13540、美國專利5,281,698號及WO 93/15189，以及用於經活化聚合物與酶之間的結合之方法，該等酶包括(但不限於)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利第4,412,989號)、核糖核酸酶及超氧化歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。所引用之所有參考文獻及專利均以引用之方式併入本文中。
藉由任何便利方法進行含有非天然編碼胺基酸(諸如對疊氮基-L-苯丙胺酸)之抗原結合多肽的PEG化(亦即添加任何水溶性聚合物)。舉例而言，用經炔封端之mPEG衍生物PEG化PSMC。簡言之，在室溫下在攪拌下向含對疊氮基-L-Phe之PSMC的水溶液中添加過量固體mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。典型地，用具有接近進行反應時所處之pH的pKa(通常約pH 4-10)之緩衝液緩衝該水溶液。舉例而言，用於在pH 7.5下進行PEG化之合適緩衝液的實例包括(但不限於)HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HCl、EPPS及TES。持續監測並且必要時調節pH。典型地使反應持續約1-48小時之間。
反應產物隨後經歷疏水性相互作用層析以自遊mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH及PEG化PSMC之任何高分子量複合物分離出PEG化PSMC變異體，該等高分子量複合物可在非嵌段PEG在分子之兩個末端均經活化，藉此交聯PSMC變異體分子時 形成。疏水性相互作用層析期間之條件使得游離mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流經管柱，同時任何經交聯PEG化PSMC變異體複合物在所需形式之後溶離，該等PSMC變異體複合物含有一個結合於一或多個PEG基團之PSMC變異體分子。合適條件視交聯複合物對所需結合物之相對大小而變化，並且由熟習此項技術者輕易地確定。藉由超濾來濃縮含有所需結合物之溶離液，並且藉由透濾脫鹽。
必要時，可藉由熟習此項技術者已知之一或多種程序進一步純化自疏水性層析獲得之PEG化PSMC，該等程序包括(但不限於)親和層析、陰離子或陽離子交換層析(使用包括(但不限於)DEAE SEPHAROSE)、二氧化矽層析、逆相HPLC、凝膠過濾(使用包括(但不限於)SEPHADEX G-75)、疏水性相互作用層析、尺寸排阻層析、金屬螯合物層析、超濾/透濾、乙醇沈澱、硫酸銨沈澱、層析聚焦、置換層析、電泳過程(包括(但不限於)製備型等電聚焦)、差異溶解性(包括(但不限於)硫酸銨沈澱)或萃取。可利用GPC藉由與球蛋白標準物比較來評估表觀分子量(PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH(Harris及Angal編輯)IRL Press 1989,293-306)。可藉由蛋白水解降解(包括(但不限於)胰蛋白酶裂解)，接著進行質譜分析來評估PSMC-PEG結合物之純度。Pepinsky B.等人，J.Pharmcol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。
可進一步在不受限制下對鍵聯於本發明PSMC之胺基酸的水溶性聚合物進行衍生化或取代。
含疊氮之PEG衍生物
在本發明之另一實施例中，用含有將與存在於非天 然編碼胺基酸側鏈上之炔部分反應的疊氮部分之PEG衍生物修飾抗原結合多肽。一般而言，PEG衍生物將具有介於1-100kDa範圍內並且在一些實施例中介於10-40kDa範圍內之平均分子量。
在一些實施例中，疊氮末端PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(亦即平均分子量介於5-40kDa之間)。
在另一實施例中，疊氮末端PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000(亦即平均分子量介於5-40kDa之間)。
在本發明之另一實施例中，用含有末端疊氮部分之分支PEG衍生物修飾包含含炔胺基酸之PSMC，其中該分支PEG的各鏈具有介於10-40kDa範圍內且更佳介於5-20kDa範圍內之MW。舉例而言，在一些實施例中，疊氮末端PEG衍生物將具有以下結構：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000，且X視情況為O、N、S或羰基(C=O)，在各情況下其可存在或不存在。
含炔之PEG衍生物
在本發明之另一實施例中，用含有將與存在於非天 然編碼胺基酸側鏈上之疊氮部分反應的炔部分之PEG衍生物修飾抗原結合多肽。
在一些實施例中，炔末端PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10且n為100-1,000(亦即平均分子量介於5-40kDa之間)。
在本發明之另一實施例中，用含有藉助於醯胺鍵聯鍵聯於PEG骨架之末端疊氮或末端炔部分的PEG衍生物修飾包含含炔非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽。
在一些實施例中，炔末端PEG衍生物將具有以下結構：RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000。
在本發明之另一實施例中，用含有末端炔部分之分支PEG衍生物修飾包含含疊氮胺基酸之抗原結合多肽，其中該分支PEG的各鏈具有介於10-40kDa範圍內且更佳介於5-20kDa範圍內之MW。舉例而言，在一些實施例中，炔末端PEG衍生物將具有以下結構：[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH
其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2-10，p為2-10且n為100-1,000，且X視情況為O、N、S或羰基(C=O)，或不存在。
含膦之PEG衍生物
在本發明之另一實施例中，用含有經活化官能基(包括(但不限於)酯、碳酸酯)之PEG衍生物修飾抗原結合多肽，該PEG衍生物進一步包含將與存在於非天然編碼胺基酸側鏈上之疊氮部分反應的芳基膦基團。一般而言，PEG衍生物將具有介於1-100kDa範圍內並且在一些實施例中介於10-40kDa範圍內之平均分子量。
在一些實施例中，PEG衍生物將具有以下結構：
其中n為1-10；X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。
在一些實施例中，PEG衍生物將具有以下結構：
其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物且R可為H、烷基、芳基、經取代烷基及經取代芳基。例示性R基團包括(但不限於)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-鹵素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN及-NO2。R'、R"、R"'及R""各自獨立地指氫、經取代或未經取代雜烷基、經取代或未經取代芳基，包括(但不限於)經1-3個鹵素取代之芳基、經取代或未經取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。舉例而言，當本發明化合物包括一個以上R基團時，各R基團獨立地經選擇，如同當存在R'、R"、R"'及R""基團中之一者以上時，此等基團時各自經選擇。當R'及R"連接於同一氮原子時，其可與氮原子組合以形成5、6或7員環。舉例而言，-NR'R"意欲包括(但不限於)1-吡咯啶基及4-嗎啉基。基於上述取代基 論述，熟習此項技術者應瞭解術語「烷基」意欲包括與除氫基團以外之基團結合之包括碳原子的基團，諸如鹵代烷基(包括(但不限於)-CF3及-CH2CF3)及醯基(包括(但不限於)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3及其類似基團)。
其他PEG衍生物及一般PEG化技術
可鍵聯於抗原結合多肽之其他例示性PEG分子以及PEG化方法包括描述於以下文獻中之方法：例如美國專利公開案第2004/0001838號；第2002/0052009號；第2003/0162949號；第2004/0013637號；第2003/0228274號；第2003/0220447號；第2003/0158333號；第2003/0143596號；第2003/0114647號；第2003/0105275號；第2003/0105224號；第2003/0023023號；第2002/0156047號；第2002/0099133號；第2002/0086939號；第2002/0082345號；第2002/0072573號；第2002/0052430號；第2002/0040076號；第2002/0037949號；第2002/0002250號；第2001/0056171號；第2001/0044526號；第2001/0027217號；第2001/0021763號；美國專利6,646,110號；第5,824,778號；第5,476,653號；第5,219,564號；第5,629,384號；第5,736,625號；第4,902,502號；第5,281,698號；第5,122,614號；第5,473,034號；第5,516,673號；第5,382,657號；第6,552,167號；第6,610,281號；第6,515,100號；第6,461,603號；第6,436,386號；第6,214,966號；第5,990,237號；第5,900,461號；第5,739,208號；第5,672,662號；第5,446,090號；第5,808,096號；第5,612,460號；第5,324,844號；第5,252,714號；第6,420,339號；第6,201,072號；第6,451,346號；第6,306,821號；第5,559,213號；第5,612,460號；第5,747,646號；第5,834,594號；第5,849,860號；第5,980,948號；第6,004,573 號；第6,129,912號；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、WO 98/05363、EP 809 996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503及EP 154 316，該等文獻均以引用的方式併入本文中。可使用呈任何形式之本文所述的任何PEG分子，包括(但不限於)單鏈、分支鏈、多臂鏈、單官能、雙官能、多官能或其任何組合。
增強對血清白蛋白之親和力
亦可將各種分子與本發明之抗原結合多肽融合以調節血清中PSMC的半衰期。在一些實施例中，將分子與本發明之抗原結合多肽鍵聯或融合以增強對動物中內源血清白蛋白之親和力。
舉例而言，在一些情況下，進行抗原結合多肽與白蛋白結合序列之重組融合。例示性白蛋白結合序列包括(但不限於)來自鏈球菌蛋白G之白蛋白結合結構域(參見例如Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277：534-542(1996)及Sjolander等人，J,Immunol.Methods 201：115-123(1997))，或白蛋白結合肽，諸如描述於例如Dennis等人，J.Biol.Chem.277：35035-35043(2002)中之白蛋白結合肽。
在其他實施例中，用脂肪酸醯化本發明之抗原結合 多肽。在一些情況下，脂肪酸促進與血清白蛋白之結合。參見例如Kurtzhals等人，Biochem.J.312：725-731(1995)。
在其他實施例中，本發明之抗原結合多肽直接與血清白蛋白(包括(但不限於)人類血清白蛋白)融合。熟習此項技術者應認識到，多種其他分子亦可鍵聯於本發明中之PSMC以調節與血清白蛋白或其他血清組分之結合。
X. PSMC之糖基化
本發明包括併入一或多種具有醣殘基之非天然編碼胺基酸的抗原結合多肽。醣殘基可為天然的(包括(但不限於)N-乙醯基葡糖胺)或非天然的(包括(但不限於)3-氟半乳糖)。醣可藉由N或O鍵聯之糖苷鍵聯(包括(但不限於)N-乙醯基半乳糖-L-絲胺酸)或非天然鍵聯(包括(但不限於)肟或相應C或S鍵聯之糖苷)與非天然編碼胺基酸鍵聯。
可活體內或活體外將醣(包括(但不限於)糖基)部分添加至抗原結合多肽中。在本發明之一些實施例中，用經胺氧基衍生化之醣修飾包含含羰基非天然編碼胺基酸的抗原結合多肽以產生相應經由肟鍵聯鍵聯之糖基化多肽。一旦連接於非天然編碼胺基酸，醣即可藉由用糖基轉移酶及其他酶處理來進一步精製以產生結合於抗原結合多肽之寡醣。參見例如H.Liu等人J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。
在本發明之一些實施例中，直接用具有如胺氧基衍生物所製備之規定結構的聚糖修飾包含含羰基非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽。熟習此項技術者應認識到，其他官能基(包括疊氮、炔、醯肼、肼及胺基脲)可用於鍵聯醣與非天然編碼胺基酸。
在本發明之一些實施例中，隨後可藉由包括(但不限於)分別與包括(但不限於)炔基或疊氮衍生物之Huisgen[3+2]環加成反應來修飾包含含疊氮或含炔基之非天然編碼胺基酸的抗原結合多肽。此方法允許以極高選擇性修飾蛋白。
XI. PSMC二聚體及多聚體
本發明亦提供包括(但不限於)PSMC均二聚體、雜二聚體、均多聚體或雜多聚體(亦即三聚體、四聚體等)之PSMC組合，其中含有一或多個非天然編碼胺基酸之PSMC多肽結合於另一PSMC或其變異體或任何其他作為非PSMC多肽或其變異體的多肽，其直接結合於多肽骨架或經由連接子結合。由於與單體相比分子量增加，因此PSMC二聚體或多聚體結合物可展現新的或所需特性，包括(但不限於)相對於單體PSMC而言不同的藥理學、藥物動力學、藥效學特性、經調節治療半衰期或經調節血漿半衰期。在一些實施例中，本發明之PSMC二聚體將調節PSMC受體之二聚化。在其他實施例中，本發明之PSMC二聚體或多聚體將充當PSMC受體拮抗劑、激動劑或調節劑。
在一些實施例中，存在於含有二聚體或多聚體之PSMC中的一或多種PSMC包含鍵聯於水溶性聚合物之非天然編碼胺基酸。在一些實施例中，PSMC直接鍵聯，包括(但不限於)經由Asn-Lys醯胺鍵聯或Cys-Cys雙硫鍵聯。在一些實施例中，所鍵聯PSMC及/或所鍵聯非PSMC多肽將包含不同非天然編碼胺基酸以有助於二聚化，包括(但不限於)第一PSMC之一個非天然編碼胺基酸中的炔與第二PSMC之第二非天然編碼胺基酸中的疊氮將經由Huisgen[3+2]環加成而結合。或者，第一PSMC及/或包含含酮非天然編碼胺基酸之所鍵聯非PSMC多肽可與包含含 羥胺之非天然編碼胺基酸的第二PSMC多肽結合，並且該等多肽經由形成相應肟來反應。
或者，兩個PSMC及/或所鍵聯非PSMC多肽經由連接子鍵聯。任何異雙官能或同雙官能連接子均可用於鍵聯可具有相同或不同一級序列之兩個PSMC及/或所鍵聯非PSMC多肽。在一些情況下，用於將PSMC及/或所鍵聯非PSMC多肽繫栓在一起之連接子可為雙官能PEG試劑。連接子可具有各種分子量或分子長度。可使用較大或較小分子量連接子以提供PSMC與所鍵聯實體之間的所需空間關係或構形。亦可使用具有較長或較短分子長度之連接子以提供PSMC與所鍵聯實體之間的所需間距或可撓性。類似地，在PSMC到達其標靶之前或之後，具有特定形狀或構形之連接子可用於對PSMC或所鍵聯實體賦予特定形狀或構形。可對存在於連接子各末端之官能基加以選擇以調節在所需條件下PSMC或非PSMC多肽的釋放。PSMC與所鍵聯實體之間之空間關係的此最佳化可對分子提供新的、經調節的或所需特性。
在一些實施例中，本發明提供具有啞鈴結構之水溶性雙官能連接子，其包括：a)在聚合物骨架之至少第一末端上的疊氮、炔、肼、醯肼、羥胺或含羰基部分；及b)在聚合物骨架之第二末端上的至少一個第二官能基。第二官能基可與第一官能基相同或不同。在一些實施例中，第二官能基對第一官能基不具反應性。在一些實施例中，本發明提供包含分支分子結構之至少一條臂的水溶性化合物。舉例而言，分支分子結構可為樹枝狀。
在一些實施例中，本發明提供藉由與水溶性經活化聚合物反應而形成之包含一或多個PSMC的多聚體，該等水溶性經活化聚合物具有以下結構： R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n為約5至3,000，m為2-10，X可為疊氮、炔、肼、醯肼、胺氧基、羥胺、乙醯基或含羰基部分，且R為封端基、官能基或可與X相同或不同的離去基團。R可為例如選自由以下組成之群的官能基：羥基；經保護羥基；烷氧基；N-羥基丁二醯亞胺基酯；1-苯并三唑基酯；N-羥基丁二醯亞胺基碳酸酯；1-苯并三唑基碳酸酯；縮醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯醯胺；活性碸；胺；胺氧基；經保護胺；醯肼；經保護醯肼；經保護硫醇；羧酸；經保護羧酸；異氰酸酯；異硫氰酸酯；順丁烯二醯亞胺；乙烯基碸；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙醯胺；環氧化物；乙二醛；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；及三氟乙磺酸酯；烯烴；及酮。
XII. 量測PSMC活產及PSMC對PSMC抗原或結合搭配物之親和力
可使用標準活體外或活體內分析來測定PSMC活性。舉例而言，可使用結合PSMC之細胞或細胞株(包括(但不限於)含有原生PSMC抗原或結合搭配物之細胞或產生重組PSMC抗原或結合搭配物之細胞)來監測PSMC結合。對於包含非天然胺基酸之非PEG化或PEG化抗原結合多肽，可藉由使用此項技術中已知之技術(諸如BIAcoreTM生物感測器(Pharmacia))來量測PSMC對其抗原或結合搭配物的親和力。
無論使用何種方法產生PSMC，均對PSMC執行生物活性分析。若適當，則可進行氚化胸苷分析以確定細胞分裂程度。然而，可使用其他生物學分析來確定所需活性。諸如量測抑制抗原生物活性(諸如酶活性、增殖或代謝活性)之能力的生物學分 析亦指示PSMC活性。可使用其他活體外分析來確定生物活性。一般而言，視抗原生物活性需要，生物活性測試應對所需結果進行分析，諸如生物活性之增加或減少(如與未改變之PSMC相比)、不同生物活性(如與未改變之PSMC相比)、受體親和力分析、構形或結構變化或血清半衰期分析。
上文關於分析方法之參考文獻彙編並非詳盡的，並且熟習此項技術者應瞭解其他可用於測試所需最終結果之分析。
XIII. 量測效能、功能性活體內半衰期及藥物動力學參數
本發明之一個重要態樣在於藉由在PSMC與水溶性聚合物部分結合或不結合下構築PSMC所獲得之延長的生物半衰期。PSMC血清濃度之快速降低使得評價對用結合及非結合PSMC及其變異體處理之生物反應具有重要意義。較佳地，本發明之結合及非結合PSMC及其變異體在靜脈內投藥之後亦具有延長的血清半衰期，使得可能藉由例如ELISA方法或藉由初步篩選分析來量測。如本文所述進行活體內生物半衰期之量測。
可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每個處理組N=5隻動物)中評價包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽的藥物動力學參數。動物將接受25微克/大鼠(靜脈內)或50微克/大鼠(皮下)之單次劑量，並且將根據預定時程採集大約5-7個血樣，通常涵蓋對於未結合於水溶性聚合物的包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽而言約6小時以及對於結合於水溶性聚合物的包含非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽而言約4天。在若干物種中充分研究了PSMC之藥物動力學數據，並且可將其直接與關於包含非天然編碼胺基酸之PSMC所獲得的數據進行比較。
可藉由此項技術中已知之各種分析來測定根據本發 明之PSMC的比活性。可藉由本文所述或所提及或者熟習此項技術者已知之方法測試根據本發明獲得及純化之PSMC突變型蛋白或其片段的生物活性。
XIV. 投藥及醫藥組合物
本發明之多肽或蛋白(包括(但不限於)PSMC、合成酶、包含一或多個非天然胺基酸之蛋白等)視情況用於治療用途，包括(但不限於)與合適的醫藥載劑組合。舉例而言，該等組合物包含治療有效量之該化合物，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此類載劑或賦形劑包括(但不限於)生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及/或其組合。調配應配合投藥模式。一般而言，投與蛋白之方法為此項技術中所熟知，並且可適用於投與本發明多肽。
根據此項技術中熟知之方法，視情況在一或多個適當活體外及/或活體內患病動物模型中測試包含一或多種本發明多肽之治療組合物，以證實功效、組織代謝並評估劑量。詳言之，最初可藉由本文中非天然相比天然胺基酸同系物之活性、穩定性或其他合適量度(包括(但不限於)比較經修飾以包括一或多個非天然胺基酸之PSMC與天然胺基酸PSMC)來確定劑量，亦即在相關試驗中。
藉由任何通常用於將分子引入以完全接觸血液或組織細胞之途徑投藥。以任何合適方式，視情況與一或多種醫藥學上可接受之載劑一起投與本發明之非天然胺基酸多肽。向患者投與本發明上下文中之該等多肽的合適方法為可得的，並且儘管可使用一種以上途徑來投與特定組合物，但特定途徑通常可提供比另一途徑更及時且更有效的作用或反應。
部分地藉由所投與之特定組合物以及藉由用於投與該組合物之特定方法來確定醫藥學上可接受之載劑。因此，存在多種本發明醫藥組合物之合適調配物。
多肽組合物可藉由許多途徑投與，包括(但不限於)經口、經靜脈內、經腹膜內、經肌肉內、經皮、經皮下、經表面、經舌下或經直腸方式。亦可經由脂質體投與包含經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽之組合物。該等投藥途徑及適當調配物通常為熟習此項技術者所已知。
亦可將包含非天然胺基酸之PSMC單獨或與其他合適組分組合而製成欲經由吸入來投與之氣霧劑調配物(亦即其可「霧化」)。氣霧劑調配物可置於加壓可接受推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物。
適用於諸如藉由關節內(在關節中)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內及皮下途徑非經腸投與之調配物包括水性及非水性等張無菌注射溶液(其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使得調配物與預期接受者之血液等張的溶質)以及水性及非水性無菌懸浮液(其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑)。經封裝PSMC之調配物可在單位劑量或多劑量密封容器中呈遞，諸如安瓿及小瓶。
非經腸投與及靜脈內投與為較佳投與方法。詳言之，已經用於天然胺基酸同系物治療劑(包括(但不限於)典型地用於EPO、GH、PSMC、G-CSF、GM-CSF、IFN、介白素、抗體及/或任何其他醫藥學遞送蛋白之治療劑)之投藥途徑以及目前所用調配物提供本發明多肽之較佳投與及調配途徑。
在本發明上下文中，投與患者之劑量足以在患者中 隨時間具有有益治療反應，或者包括(但不限於)足以抑制病原體感染，或取決於應用具有其他適當活性。藉由特定載體或調配物之功效及所用非天然胺基酸多肽之活性、穩定性或血清半衰期及患者病狀，以及待治療患者之體重或表面積來確定劑量。亦藉由特定患者中伴隨投與特定載體、調配物或其類似物之任何不利副作用的存在、性質及程度來確定劑量大小。
在確定疾病(包括(但不限於)癌症、遺傳疾病、糖尿病、AIDS或其類似疾病)之治療或預防中欲投與之載體或調配物的有效量時，醫師評價循環血漿含量、調配物毒性、疾病進程及/或(當相關時)抗非天然胺基酸多肽抗體之產生。
投與至例如70公斤患者之劑量典型地在等效於目前使用之治療蛋白的劑量之範圍內，該等劑量針對相關組合物之改變的活性或血清半衰期經調節。本發明之載體可藉由任何已知習知療法補充治療條件，包括抗體投與、疫苗投與、投與細胞毒性劑、天然胺基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應改質劑及其類似物。
對於投藥，以由相關調配物之LD-50或ED-50及/或在各種濃度下所觀察到之非天然胺基酸的任何副作用所確定之速率投與本發明調配物，包括(但不限於)適用於患者之質量及總體健康狀況。投藥可經由單次劑量或分開劑量完成。
若經歷調配物輸注之患者發展出發熱、寒戰或肌肉疼痛，則他/她應接受適當劑量之阿司匹靈、布洛芬、乙醯胺苯酚或其他控制疼痛/發熱之藥物。經歷輸液反應(諸如發熱、肌肉疼痛及寒戰)之患者在將要輸注阿司匹靈、乙醯胺苯酚或包括(但不限於)苯海拉明之前30分鐘進行前驅用藥。度冷丁(Meperidine) 用於不快速回應於退熱劑及抗組織胺之更為嚴重的寒戰及肌肉疼痛。取決於反應之嚴重程度，減緩或停止細胞輸注。
可向哺乳動物個體直接投與本發明之人類抗原結合多肽。藉由任何通常用於向個體引入PSMC之途徑投藥。儘管在任何既定情況下最為合適之途徑應取決於所治療病狀的性質及嚴重程度，但根據本發明實施例之PSMC組合物包括適用於經口、經直腸、經表面、經吸入(包括(但不限於)經由氣霧劑)、經頰(包括(但不限於)舌下)、經陰道、非經腸(包括(但不限於)皮下、肌肉內、皮內、關節內、胸膜內、腹膜內、腦內、動脈內或靜脈內)、經表面(亦即皮膚及黏膜表面，包括氣道表面)及經皮投藥之組合物。投藥可為局部或全身性的。化合物之調配物可在單位劑量或多劑量密封容器中呈遞，諸如安瓿及小瓶。可製備呈單位劑量可注射形式(包括(但不限於)溶液、懸浮液或乳液)之與醫藥學上可接受之載劑混合的本發明PSMC。亦可藉由連續輸注(使用包括(但不限於)微型泵，諸如滲透泵)、單次快速注射或緩慢釋放儲槽式調配物來投與本發明PSMC。
適用於投藥之調配物包括水性及非水性溶液、等張無菌溶液(其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使得調配物等張之溶質)以及水性及非水性無菌懸浮液(其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑)。可由先前所述種類之無菌散劑、顆粒及錠劑製備溶液及懸浮液。
本發明之醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑。部分地藉由所投與之特定組合物以及藉由用於投與該組合物之特定方法來確定醫藥學上可接受之載劑。因此，存在本發明醫藥組合物之多種合適調配物(包括視情況選用之醫藥學上可接受的載 劑、賦形劑或穩定劑)(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版1985))。
合適載劑包括含有磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽及其他有機酸之緩衝液；包括抗壞血酸在內的抗氧化劑；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；二價金屬離子，諸如鋅、鈷或銅；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽反離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如TweenTM、PluronicsTM或PEG。
亦可藉由持續釋放系統或作為持續釋放系統之一部分投與本發明PSMC，包括與諸如PEG之水溶性聚合物鍵聯的PSMC。持續釋放組合物包括(包括(但不限於))呈成形物品形式之半透性聚合物基質，包括(但不限於)薄膜或微膠囊。持續釋放基質包括生物相容性材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美國專利第3,773,919號；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸之聚合物)、聚丙交酯共-乙交酯(乳酸與乙醇酸之共聚物)、聚酸酐、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers,22,547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、玻尿酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸)、聚核苷酸、 聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯啶酮及矽酮。持續釋放組合物亦包括脂質體捕獲之化合物。藉由本身已知之方法製備含有該化合物之脂質體：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請案83-118008；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及EP 102,324。所引用之所有參考文獻及專利均以引用之方式併入本文中。
可藉由描述於以下文獻中之方法製備脂質體捕獲之PSMC：例如DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請案83-118008；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及EP 102,324。脂質體之組成及大小為熟知的，或能夠由熟習此項技術者憑經驗輕易地確定。一些脂質體實例描述於以下文獻中：例如Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1327-1331(1995)；Lasic D及Papahadjopoulos D(編輯)：MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancer therapy,Teicher B(編輯)：CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。所引用之所有參考文獻及專利均以引用之方式併入本文中。
在本發明上下文中投與至患者之劑量應足以引起個體中隨時間之有益反應。一般而言，每一劑量中非經腸投與之本發明PSMC的總醫藥學有效量在約0.01微克/公斤/天至約100微克/公斤患者體重範圍內，或約0.05毫克/公斤至約1毫克/公斤患者體重範圍內，不過此量受治療判斷影響。給藥頻率亦受治療判斷影響，並且可比批准用於人類之市售PSMC產品頻率更高或頻率更低。一般而言，可藉由任何上述投藥途徑投與本發明之PEG化抗原結合多肽。
XV. 本發明抗原結合多肽之治療用途
本發明之PSMC多肽可用於治療許多病症。含有PSMC之醫藥組合物可以有效用於藉由各種手段投與至遭受病症之人類患者的濃度經調配，該等病症可受PSMC激動劑或拮抗劑(諸如(但不限於)使用抗增殖劑、消炎劑或抗病毒劑)影響，其為單獨的或作為病狀或疾病之一部分。PSMC之平均量可不同，並且詳言之，應基於合格醫師之建議及處方。PSMC之準確量偏好受以下因素影響：諸如所治療病狀之準確類型、所治療患者之病狀以及組合物中之其他成分。本發明亦提供投與治療有效量之另一活性劑，諸如抗癌化學治療劑。熟習此項技術者基於PSMC療法可輕易地確定欲給與之量。
實例
提供以下實例進行說明，而非限制所主張之發明。
實例1
此實例描述用於選擇將非天然編碼胺基酸併入PSMC中之較佳位點的許多潛在準則組中的一組。
此實例證實如何選擇抗原結合多肽中用於引入非天 然編碼胺基酸之較佳位點。使用由兩個PSMC分子構成之三維結構或PSMC之二級、三級或四級結構來確定可引入一或多個非天然編碼胺基酸之較佳位置。
以下準則用於評價用於引入非天然編碼胺基酸之PSMC的各位置：殘基(a)不應干擾基於三維結構之結構分析的PSMC，或PSMC之二級、三級或四級結構的結合，b)不應受丙胺酸或同系物掃描突變誘發影響，(c)應表面暴露並且展現與周圍殘基之最小范德華力或氫鍵結相互作用，(d)可在PSMC之一或多個暴露面上，(e)可為與第二PSMC或其他分子或其片段並置的一或多個PSMC位點，(f)應在PSMC變異體中缺失或可變，(g)在用非天然編碼胺基酸取代之後應產生保守性變化，(h)藉由必要時改變完整結構的可撓性或剛性，可調節PSMC自身或者包含一或多個PSMC之二聚體或多聚體的構形，(i)可發現於高度可撓性區域或結構剛性區域中，及(j)發現於或未發現於互補決定區(CDR)中。此外，利用Cx程式(Pintar等人Bioinformatics,18，第980頁)對PSMC分子執行進一步計算以評價各蛋白原子之突出程度。因此，在一些實施例中，非天然編碼胺基酸在(但不限於)PSMC之一或多個位置處進行取代。
實例2
此實例詳述在大腸桿菌中選殖並表現包括非天然編碼胺基酸之PSMC。
包含正交tRNA(O-tRNA)及正交胺醯基tRNA合成酶(O-RS)之所引入轉譯系統用於表現含有非天然編碼胺基酸之PSMC。O-RS優先用非天然編碼胺基酸胺醯化O-tRNA。該轉譯系統又回應於所編碼之選擇密碼子將非天然編碼胺基酸插入 PSMC中。
用含有經修飾PSMC基因及正交胺醯基tRNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼胺基酸具特異性)之質體轉型大腸桿菌允許將非天然編碼胺基酸以位點特異性方式併入PSMC中。在37℃下在含有0.01-100mM之間之特定非天然編碼胺基酸的培養基中生長之經轉型大腸桿菌以高保真度且有效地表現經修飾PSMC。由大腸桿菌宿主細胞產生呈包涵體或聚集體形式之含有非天然編碼胺基酸之經His標記PSMC。溶解聚集體，並且在變性條件下在6M鹽酸胍中親和純化。藉由在4℃下在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4及2%(w/v)Sarkosyl中透析隔 夜來執行再摺疊。隨後使該材料針對20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2透析，接著移除His標籤。參見Boissel等人，(1993)268：15983-93。用於純化PSMC之方法為此項技術中所熟知，並且由SDS-PAGE、西方墨點分析或電噴霧-電離離子阱質譜法及其類似方法證實。
表現構築體
周質scFv-108：將EGFR特異性單株抗體mAb108之可變區(VL及VH)(美國專利第6,217,866號，其以引用的方式併入本文中)選殖為具有酵母BGL2(C7)周質前導序列下游之(GGGGS)4連接序列之scFv片段(Humphreys,DP等人Protein Expr Purif.2000年11月；20(2)：252-64)。在VL結構域之下游選殖由c-myc抗體所識別之抗原決定基序列以及6X-His標籤。在誘導性啟動子之控制下，將野生型scFv-108構築體以及VL結構域中含有琥珀終止密碼子(TAG)之變異體(參見圖2，圖A)選殖至大腸桿菌表現載體中。此質體亦組成性表現來自詹氏甲烷球菌之琥珀抑制基因酪胺醯基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)。指示琥珀終止密碼子之位置。所製備之構築體顯示於表3及4中。
細胞質scFv-108：在T7啟動子之控制下，將含有N端MetGly-序列及6X-His序列之VH-連接子-VL(VH-GlySer-VL)序列選殖至表現載體中(參見圖2，圖B)。指示琥珀終止密碼子及PEG化殘基之位置。所製備之構築體描述於表5中。
Fab-108：將mAb108之VL及VH序列選殖至pFT3中，pFT3為一種編碼g3(VL)及STII(VH)周質前導序列以及人類κ恆定及CH1結構域之質體。CH1結構域之C端含有6-His標籤以促進純化。將琥珀突變引入CH1結構域中，並且將整個雙順反子卡匣選殖至組成性表現來自詹氏甲烷球菌之琥珀抑制基因酪胺醯基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的表現質體中。顯示兩個驅動Fab片段之VL及VH結構域之轉譯的Shine Delgarno序列(SD)。所製備的構築體顯示為Fab 108之VL κ鏈及Fab108之VH-CH1鏈之經轉譯蛋白序列且描述於表6中。
周質scFv-4D5：將HER2特異性單株抗體mAb-4D5 之可變區(VL及VH)(Carter,P.等人，Biotechnology(N Y).1992年2月；10(2)：163-7)選殖為酵母BGL2(C7)周質前導序列下游之scFv片段。在VL序列之C端(scFv-4D5-His；圖2，圖D)或在VH結構域之N端(His-scFv-4D5；圖2，圖E)選殖6X-His標籤。將野生型scFv-4D5構築體以及GlySer連接子結構域中含有琥珀終止密碼子(TAG)之變異體選殖至組成性表現來自詹氏甲烷球菌之琥珀抑制基因酪胺醯基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的大腸桿菌表現載體中。所製備之6X-His C端構築體如SEQ ID NO：25(核苷酸序列)及SEQ ID NO：26(經轉譯蛋白序列)所示。 所製備之6X-His N端構築體展示於以下各表中。6X-His C端構築體描述於表7中，且6X-His N端構築體描述於表8中。
Fab-4D5：將mAb 4D5之VL及VH序列亞選殖至pFT3(一種編碼g3及STII周質前導序列以及人類κ恆定及CH1結構域之質體)中，並且隨後選殖至組成性表現來自詹氏甲烷球菌之琥珀抑制基因酪胺醯基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的表現質體中。圖2圖F顯示用於表現Fab-4D5之順反子。將琥珀突變 引入Fab 4D5之CH1結構域中的離胺酸139處。此離胺酸對應於Fab 108中之K142。藉由重疊PCR(Fab-4D5-cys)來製備在CH1結構域之C端含有額外半胱胺酸殘基(THTCAA)之Fab-4D5構築體。所製備的構築體顯示為Fab 4D5之VL κ鏈、Fab 4D5之VH-CH1鏈之經轉譯蛋白序列且描述於表9中。
表現/抑制
用對乙醯基-苯丙胺酸(pAcF)抑制：使用此項技術中已知之標準方案實現大腸桿菌中琥珀突變之抑制。簡言之，為達成大腸桿菌中抗體片段(scFv及Fab)之周質抑制，將表現載體構築體與編碼來自詹氏甲烷球菌之正交酪胺醯基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)的質體一起轉型至大腸桿菌宿主細胞中。將隔夜細菌培養物1：100稀釋至含有LB培養基(Luria-Bertani)或Superbroth的振盪燒瓶中，並且在37℃下生長至OD大約為0.8。誘導Fab及scFv表現，同時藉由添加對乙醯基-苯丙胺酸(pAcF)至4mM最終濃度來抑制琥珀密碼子。在25℃下培育培養物隔夜。在相同條件下執行野生型(缺乏琥珀密碼子)scFv及Fab片段(包括Fab-4D5-cys)之表現。以類似方式實現細胞質scFv片段之表現/抑制(圖2，圖B)。
用aa9.2抑制：以與pAcF相似之方式達成用pAcF 衍生物(aa 9.2)抑制琥珀突變，除了所用來自詹氏甲烷球菌之正交酪胺醯基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)對此胺基酸具特異性。藉由在誘導時添加aa9.2(4mM)來實現抑制。
蛋白提取及純化
藉由離心收集細胞，並將其再懸浮於補充有100ug/ml溶菌酶之周質釋放緩衝液(50mM NaPO4、20%蔗糖、1mM EDTA，pH 8.0)中，並且在冰上培育30分鐘。離心之後，上清液中之抗體片段藉助於其His標籤固定於ProBind珠粒(Invitrogen；Carlsbad,CA)上，用結合緩衝液充分洗滌該等珠粒，並接著用0.5M咪唑將經結合之片段自珠粒中溶離出來。將經純化片段透析至儲存緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、10%甘油、5%蔗糖，pH 7.8)中。對於在細胞質中表現之scFv片段的小規模分析，藉由離心自15ml培養物收集大腸桿菌，並且再懸浮於1ml補充有10ug/ml DNase之溶解緩衝液(B-PER,Pierce Biotechnology；Rockford,IL)中。在37℃下培育混合物30分鐘，在蛋白質負載緩衝液(Invitrogen；Carlsbad,CA)中稀釋1倍，並且藉由SDS-PAGE分析。
圖3圖A顯示GlySer連接子(S131Am)之第二絲胺酸中琥珀突變的抑制，且顯示相應含pAcF之scFv的純化(圖3，圖B)。圖3圖A顯示之西方墨點分析證實，當細胞在LB或Superbroth培養基中生長時，需要pAcF以抑制琥珀終止突變。pAcF之存在並不影響缺乏TAG終止密碼子之scFv的表現(WT scFv-108)。圖3圖B顯示藉由固定金屬親和層析(IMAC)純化pAcF-scFv 108-(S131)。含pAcF之scFv的估計產量為1.5mg/L。由箭頭指示scFv片段的位置。如下裝載庫馬斯凝膠：泳道1-scFv 對照(1.7ug)；泳道2-IMAC預結合(20ul/70ml)；泳道3-IMAC空隙(20ul/70ml)；泳道4-IMAC溶離(5ul/1.3ml)；泳道5-NAP10緩衝液交換(10ul/1.5ml)；泳道6-IMAC珠粒溶離後；泳道7-scFv對照(3.4ug)。
圖4顯示scFv細胞質表現期間VL鏈(L156)中之琥珀突變抑制。產量為>100mg/L大腸桿菌培養物，並且終止密碼子之抑制完全依賴於pAcF的存在。箭頭指示全長scFv。實心圓圈指示在琥珀密碼子處經截短之產物。
抗體片段(1)之PEG化/二聚化
PEG化：在反應緩衝液(100mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA，pH 4.0)中將大約1mg pAcF-scFv-108蛋白濃縮至50ul最終體積。反應混合物在28℃下與100倍莫耳過量之單官能(羥胺)5K PEG(在反應緩衝液中平衡)一起以100ul最終體積培育32小時。凝膠電泳之後評價PEG化材料，並且直接用於細胞結合分析中。
二聚化：類似程序用於二聚化含pAcF之scFv-108片段。簡言之，將起始含有pAcF之scFv片段在反應緩衝液中濃縮至>5ug/ul之濃度，並且隨後與雙官能結合羥胺之PEG連接子(364Da)一起培育。藉由透析移除未反應PEG，並且向混合物中添加新鮮pAcF-scFv片段等分試樣(1莫耳蛋白：蛋白當量)。混合物接著在28℃下再培育32小時。將二聚體裝載於經20mM乙酸鈉(pH 4.0)平衡之陽離子交換管柱(SP-5PW)上，並且以NaCl梯度(0-0.4M)溶離。
圖5顯示pAcF-scFv-108片段之PEG化及二聚化。圖5圖A顯示pAcF-scFv-108-(L156)及pAcF-scFv-108-(S136)之 PEG化(5K)，及pAcF-scFv-108-(S136)的二聚化。如下裝載凝膠：泳道1-pAcF-scFv-108-(L156)(5K PEG)；泳道2-pAcF-scFv-108-(S136)(5K PEG)；泳道3-pAcF-scFv-108-(S136)(364da PEG)連接子之二聚化；泳道4-pAcF-scFv-108-(S136)之二聚化；第一PEG化反應之後未移除連接子。分別用單箭頭及雙箭頭指示單PEG化scFv片段及scFv-108-(S136)二聚體之位置。 泳道4中無二聚化證明scFv並未經分子間雙硫鍵形成而偶合。圖5圖C顯示PEG與scFv片段之結合完全依賴於pAcF的存在。未觀察到WT scFv片段之PEG化。如下裝載凝膠：泳道1-WT scFv 108對照；泳道2-scFv WT，在反應緩衝液中，無PEG，16小時；泳道3-scFv WT+5K PEG，在反應緩衝液中，16小時。
圖6顯示在scFv均二聚體之陽離子交換層析期間所採集之溶離份的SDS PAGE分析。使用雙官能羥胺364道爾頓PEG連接子均二聚化pAcF-scFv108-(S131)片段。在陽離子交換層析期間NaCl梯度(0-0.4M)中之不同點採集溶離份。如下裝載凝膠：泳道1-標記；泳道2-pAcF-scFv108(S131)-X-pAcF-scFv108(S131)溶離份#1；泳道3-pAcF-scFv108(S131)-X-pAcF-scFv108(S131)溶離份#2；泳道4-pAcF-scFv108(S131)-X-pAcF-scFv108(S131)溶離份#3。
圖8圖A顯示pAcF及pAcF-PEG化Fab片段之SDS PAGE分析。顯示在K142、T204及K219處經修飾之Fab-108片段，並且PEG化之效率為位點特異性的。使用結合羥胺之5K PEG執行含有pAcF之Fab片段的PEG化。
圖10圖A及圖B顯示C端(pAcF-scFv-4D5-His(S133)；圖10，圖A)或N端(pAcF-His-scFv-4D5(S139)；圖10， 圖B)scFv-4D5片段之GlySer連接子的第二絲胺酸中琥珀突變之抑制。藉由添加0.02%阿拉伯糖來誘導scFv蛋白之表現，持續5小時或隔夜(16小時)。藉由伴隨添加aa9.2(4mM)來實現琥珀突變之抑制。箭頭指示受抑制之產物，並且實心圓圈指示經截短蛋白。實現大於50%之抑制產量(1.5mg/L)。指示裝載有scFv 108之對照泳道(C)，它跑膠比scFv-4D5略高。
表現Fab片段pAcF-Fab-4D5-(K139)及Fab-4D5-cys，並且以相同方式純化。圖11圖A顯示在還原及非還原條件下由SDS-PAGE解析之樣品。Fab片段產量如下：pAcF-Fab-4D5-(K139)為0.37mg/L/OD(最終OD600=3.14)，且Fab-4D5-cys為0.23mg/L/OD(最終OD600=3.26)。圖11圖B顯示使用抗His抗體之圖11圖A中所示樣品(5ul)的西方墨點分析。在非還原條件下使樣品跑膠。用箭頭指示來自Fab-4D5-cys構築體之多聚體VH-CH1複合物。未見具有pAcF-Fab-4D5-(K139)之多聚體複合物。
抗體片段(2)之PEG化/二聚化
PEG化：在原生反應緩衝液(20mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA，pH 4.0)及變性反應緩衝液(20mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA、8M尿素，pH 4.0)中將大約1mg pAcF-scFv-108蛋白濃縮至50ul最終體積。反應混合物在28℃下與100倍莫耳過量之單官能(羥胺)5K PEG(在對應反應緩衝液中平衡)一起以100ul最終體積培育32小時。16小時之後，藉由SDS-PAGE評價反應混合物，並且直接用於細胞結合分析中。
在變性條件下多肽與連接子、聚合物、生物活性分子或其他分子之結合可具有一或多個優勢。該等優勢包括(但不 限於)由於反應性基團之改良可達性而使結合更容易；與非結合多肽相比，經結合多肽更容易再摺疊；及與在非變性條件下可用之多肽濃度相比，能夠使用更高濃度多肽用於結合。舉例而言，若多肽不穩定並且不能高度濃縮以用於結合反應，則可需要變性條件。然而，在與標準基於半胱胺酸之結合化學品(諸如順丁烯二醯亞胺化學品)或基於離胺酸之化學品(諸如順丁烯二醯亞胺品)反應時，在變性條件下結合多肽可引起多肽中與一或多個半胱胺酸、離胺酸或其他胺基酸結合的非所需及/或非預期位點。該等非所需及/或非預期結合位點可影響經結合多肽之活性。另一方面，由於涉及結合反應之反應性基團為非天然編碼胺基酸的一部分，因此多肽(諸如包含一或多個非天然編碼胺基酸之PSMC)可在變性條件下以位點特異性方式結合。因此，藉助於包含一或多個非天然編碼胺基酸之多肽可開發出獲自在變性條件下結合之任何優勢。
圖5B顯示PEG化pAcF-scFv-(S136)及對照樣品之SDS-PAGE分析。如下裝載凝膠：泳道1-pAcF-scFv-(S136)；泳道2-pAcF-scFv-(S136)，在28℃下培育16小時；泳道3-pAcF-scFv-(S136)，5K PEG，在28℃下培育16小時，原生條件；泳道4-pAcF-scFv-(S136)，5K PEG，在28℃下培育16小時，變性條件。箭頭指示scFv及PEG化scFv。圖5C顯示PEG與scFv片段之結合完全依賴於pAcF的存在。未觀察到WT scFv片段之PEG化。如下裝載凝膠：泳道1-WT scFv 108對照；泳道2-scFv WT，在反應緩衝液中，無PEG，16小時；泳道3-scFv WT+5K PEG，在反應緩衝液中，16小時。
連續二聚化：簡言之，將起始含有pAcF之scFv片 段在反應緩衝液中濃縮至10mg/ml之濃度，並且隨後與100倍過量之雙官能結合羥胺之PEG連接子(364Da)一起培育。反應混合物在28℃下培育16小時。藉由透析移除未反應PEG，並且向混合物中添加新鮮pAcF-scFv片段等分試樣(1莫耳蛋白：蛋白當量)。混合物接著在28℃下再培育32小時。參見圖13。將二聚體裝載於經20mM乙酸鈉(pH 4.0)平衡之陽離子交換管柱(SP-5PW，20微米)上，並且以NaCl梯度(0-0.4M)溶離。
圖14圖A及圖B顯示二聚化樣品之非還原性及還原性SDS PAGE分析。如下裝載凝膠：泳道1-具有364Da PEG雙官能連接子之最終scFv二聚化反應混合物；泳道2-無364Da PEG雙官能連接子之最終scFv二聚化反應對照物；泳道3-scFv。箭頭指示scFv二聚體及scFv單體。僅在雙官能連接子存在下合成出scFv二聚體。泳道2中無二聚化證明scFv並未經分子間雙硫鍵形成而偶合。由於在還原性與非還原性SDS PAGE凝膠上分析之樣品之間未觀察到差異，因此雙官能連接子之存在並不有助於分子間雙硫鍵形成。
二聚體純化：使用強陽離子交換管柱(SP-5PW，20微米)純化二聚化反應混合物。緩衝液A：20mM NaOAc，pH 4.0；緩衝液B：20mM NaOAc，1M NaCl，pH 4.0。用40% B溶離scFv二聚體。經純化二聚體之SDS PAGE分析(圖15)顯示在一次管柱純化之後，二聚體的純度大約為90%。
圖9顯示本發明之異源雙官能PSMC之實例。基於對結合於同一抗原(例如ErbB2)之不同抗原決定基的兩個不同抗體分子(例如Herceptin及Omnitarg)所測定之已知晶體結構，鑑別特異性胺基酸位置，致使其符合特定所需選擇準則。此實例 中關於胺基酸位置之所需選擇準則包括在各分子之一或多個特異性胺基酸位置上的相對接近性。可需要該等胺基酸位置以使用連接分子形成圖9所示之異雙官能分子。下表10顯示各分子上符合該準則之特異性胺基酸位置，如同可用於形成異雙官能PSMC之連接分子。熟習此項技術者應認識到，清單決非詳盡的，而僅為說明性的，並且預期所有符合特定所需選擇準則之胺基酸位置均適用於本發明。本發明之非天然胺基酸可在各分子中之一或多個此等位置處進行取代，以提供用於連接子連接之化學官能基。多種其他選擇準則亦可用於鑑別胺基酸位置以符合所需準則，包括(但不限於)相同或不同分子之間的接近性，構形變化調節，PSMC之間或鍵聯於PSMC之分子之間的距離調節，連接子長度或形狀，表面暴露，配位體結合特徵調節，受體二聚化調節等。
基於HIV-1中和人類Fab 4E10與HIV gp41 env蛋白之相互作用，鑑別特異性胺基酸位置，使得其符合特定所需選擇準則。此實例中關於胺基酸位置之所需選擇準則包括將用於T-20肽與Fab結合之殘基，致使發生T-20與gp41的結合，而不消極影響4E10互補決定區(CDR)與gp41之結合及4E10互補決定 區(CDR)之識別。T-20(亦稱為DP-178)藉由充當病毒融合抑制劑來抑制HIV進入細胞中。圖12顯示具有模擬g41肽之HIV中和人類Fab 4E10。顯示用於T-20肽連接之潛在殘基。用於併入非天然編碼胺基酸之潛在殘基包括(但不限於)Gln64--Fab重鏈；Glu1--Fab輕鏈；及Gln27--Fab輕鏈。熟習此項技術者應認識到，清單決非詳盡的，而僅為說明性的，並且預期所有符合特定所需選擇準則之胺基酸位置均適用於本發明。多種其他選擇準則亦可用於鑑別胺基酸位置以符合所需準則，包括(但不限於)相同或不同分子之間的接近性，構形變化調節，PSMC之間或鍵聯於PSMC之分子之間的距離調節，連接子包涵，連接子長度或形狀，表面暴露，配位體結合特徵調節，受體二聚化調節等。
實例3
此實例詳述含羰基胺基酸之引入及隨後與含胺氧基PEG之反應。
此實例證實一種用於產生併入含酮非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽的方法，該含酮非天然編碼胺基酸隨後與大約5,000MW之含胺氧基PEG反應。根據實例1之準則所鑑別的各殘基獨立地由具有以下結構之非天然編碼胺基酸取代：
用於將對乙醯基-苯丙胺酸以位點特異性方式併入PSMC中之序列為上文實例2中所述的SEQ ID NO：1(muttRNA，詹氏甲烷球菌 )及13、14或15(TyrRS LW1、5或6)。
一旦經修飾，包含含羰基胺基酸之PSMC變異體即 與以下形式之含胺氧基PEG衍生物反應：R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R為甲基，n為3且N大約為5,000MW。使以10mg/mL溶解於25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 7.0)中或溶解於10mM乙酸鈉(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 4.5)中的含有對乙醯基苯丙胺酸之經純化PSMC與10至100倍過量之含胺氧基PEG反應，並接著在室溫下攪拌10-16小時(Jencks,W.J.Am.Chem.Soc.1959,81，第475頁)。隨後將PEG-PSMC稀釋至適當緩衝液中，用於立即純化及分析。
實例4
與由經由醯胺鍵聯鍵聯於PEG之羥胺基團組成的PEG結合。
使用實例3中所述之程序將具有以下結構的PEG試劑偶合於含酮非天然編碼胺基酸：R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R=甲基，n=4且N大約為20,000MW。反應、純化及分析條件如實例3中所述。
實例5
此實例詳述將兩個不同非天然編碼胺基酸引入PSMC中。
此實例證實一種用於產生併入非天然編碼胺基酸之抗原結合多肽的方法，該非天然編碼胺基酸在兩個根據實例1所鑑別的位置處包含酮官能基，其中X*表示非天然編碼胺基酸。如實例1及2中所述製備抗原結合多肽，除了在核酸內的兩個不同 位點處引入抑制基因密碼子。
實例6
此實例詳述抗原結合多肽與含醯肼PEG之結合，及後續原位還原。
根據實例2及3中所述之程序製備併入含羰基胺基酸之抗原結合多肽。一旦經修飾，具有以下結構之含醯肼PEG即與PSMC結合：R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R=甲基，n=2且N=10,000MW且X為羰基(C=O)。含有對乙醯基苯丙胺酸之經純化PSMC以0.1-10mg/mL之間溶解於25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 7.0)中或溶解於10mM乙酸鈉(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH 4.5)中，與1至100倍過量之含醯肼PEG反應，並且藉由添加1M原料NaCNBH3(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(溶解於H2O中)至10-50mM最終濃度來原位還原相應腙。反應在黑暗中在4℃至RT下進行18-24小時。藉由在約pH 7.6下添加1M Tris(Sigma Chemical,St.Louis,MO)至50mM最終Tris濃度來終止反應，或者將反應稀釋於適當緩衝液中以用於立即純化。
實例7
此實例詳述含炔胺基酸引入PSMC中及用mPEG-疊氮進行衍生化。
任何根據實例1所鑑別之殘基均經以下非天然編碼胺基酸取代：
用於位點特異性併入對炔丙基-酪胺酸之序列為上文實例2中所述的SEQ ID NO：1(muttRNA，詹氏甲烷球菌 )及6、7或8。在大腸桿菌中表現含有炔丙基酪胺酸之抗原結合多肽，並且使用實例3中所述之條件進行純化。
將以0.1-10mg/mL之間溶解於PB緩衝液(100mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH=8)中之含有炔丙基-酪胺酸的經純化PSMC及10至1000倍過量之含疊氮PEG添加至反應混合物中。隨後將催化量之CuSO4及Cu線添加至反應混合物中。在培育(包括(但不限於)在室溫或37℃下約4小時，或在4℃下隔夜)混合物之後，添加H2O，並且將混合物經透析膜過濾。可針對添加分析樣品，包括(但不限於)藉由實例3中所述之類似程序。
在此實例中，PEG將具有以下結構：R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R為甲基，n為4且N為10,000MW。
實例8
此實例詳述由炔丙基酪胺酸取代PSMC中之大、疏水性胺基酸。
如實例7中所述，存在於PSMC序列中之Phe、Trp或Tyr殘基由以下非天然編碼胺基酸取代：
一旦經修飾，PEG即連接於包含含炔胺基酸之PSMC變異體。PEG將具有以下結構：Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
並且偶合程序將遵循實例7中之程序。這將產生包含非天然編碼胺基酸之PSMC變異體，該非天然編碼胺基酸與一種天然存在之大疏水性胺基酸大致等排，並且在多肽內的獨特位點處經PEG衍生物修飾。
實例9
此實例詳述藉由一或多個PEG連接子分開之PSMC均二聚體、雜二聚體、均多聚體或雜多聚體的產生。
實例7中所產生之含炔PSMC變異體與以下形式之雙官能PEG衍生物反應：N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
其中n為4且PEG具有大約5,000之平均MW，以產生對應PSMC均二聚體，其中兩個PSMC分子由PEG物理分開。抗原結合多肽可以類似方式偶合於一或多個其他多肽以形成雜二聚體、均多聚體或雜多聚體。將如同實例7及3中執行偶合、純化及分析。
實例10
此實例詳述醣部分與PSMC偶合。
如實例3中所述，PSMC之一或多個胺基酸殘基由以下非天然編碼胺基酸取代。
一旦經修飾，包含含羰基胺基酸之PSMC變異體即與N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)之β鍵聯胺氧基類似物反應。PSMC變異體(10mg/mL)與胺氧基醣(21mM)在100mM乙酸鈉水性緩衝液(pH 5.5)中混合，並且在37℃下培育7至26小時。藉由在周圍溫度下使結合醣之PSMC(5mg/mL)與UDP-半乳糖(16mM)及β-1,4-半乳糖醯基轉移酶(0.4單位/毫升)一起在150mM HEPES緩衝液(pH 7.4)中培育48小時來將第二醣以酶法偶合於第一醣(Schanbacher等人J.Biol.Chem.1970,245,5057-5061)。
實例11
此實例詳述PEG化PSMC拮抗劑之產生。
如實例3中所述，一或多個PSMC胺基酸殘基由以下非天然編碼胺基酸取代。
一旦經修飾，包含含羰基胺基酸之PSMC變異體將與以下形式之含胺氧基PEG衍生物反應：R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R為甲基，n為4且N為20,000MW，以產生包含非天然編碼胺基酸之PSMC拮抗劑，該非天然編碼胺基酸在多肽內的單一位點處經PEG衍生物修飾。如同實例3中執行偶合、純化及分析。
實例12
其中PSMC分子直接鍵聯之PSMC均二聚體、雜二聚體、均多聚體或雜多聚體的產生
包含含炔胺基酸之PSMC變異體可直接偶合於包含含疊氮基胺基酸之另一PSMC變異體，各PSMC變異體包含在(但不限於)實例10中所述之位點處的非天然編碼胺基酸取代。這將產生對應PSMC均二聚體，其中兩個PSMC變異體物理接合。抗原結合多肽可以類似方式偶合於一或多個其他多肽以形成雜二聚體、均多聚體或雜多聚體。如同實例3、6及7中執行偶合、純化及分析。
實例13
聚伸烷基二醇(P-OH)與烷基鹵(A)反應形成醚(B)。在此等化合物中，n為1至9之整數，且R'可為直鏈或分支鏈、飽和或不飽和C1至C20烷基或雜烷基。R'亦可為C3至C7飽和或不飽和環狀烷基或環狀雜烷基、經取代或未經取代芳基或雜芳基，或經取代或未經取代烷芳基(該烷基為C1至C20飽和或不飽和烷基)或雜烷芳基。典型地，PEG-OH為具有800至40,000道爾頓(Da)之分子量的聚乙二醇(PEG)或單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
實例14
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C≡CH
用含NaH(12mg，0.5mmol)之THF(35mL)處理具有20,000Da分子量之mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g， 0.1mmol，Sunbio)。隨後向溶液中添加炔丙基溴溶液(溶解於二甲苯中呈80重量%溶液)(0.56mL，5mmol，50當量，Aldrich)及催化量之KI，並且將所得混合物加熱至回流持續2小時。隨後添加水(1mL)，並且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)，並分離有機層，經無水Na2SO4乾燥，並將體積減少至大約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚(150mL)中。收集所得沈澱物，用若干份冷乙醚洗滌，並乾燥，得到炔丙基-O-PEG。
實例15
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH → mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用含NaH(12mg，0.5mmol)之THF(35mL)處理具有20,000Da分子量之mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。隨後向混合物中添加50當量之5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)及催化量之KI。所得混合物加熱至回流持續16小時。隨後添加水(1mL)，並且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)，並分離有機層，經無水Na2SO4乾燥，並將體積減少至大約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚(150mL)中。收集所得沈澱物，用若干份冷乙醚洗滌，並乾燥，得到對應炔。5-氯-1-戊炔可用於類似反應中。
實例16
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH → m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3 → m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr → m-Br-CH2C6H4O- CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
向3-羥基苄醇(2.4g，20mmol)於THF(50mL)及水(2.5mL)中之溶液中首先添加粉末狀氫氧化鈉(1.5g，37.5mmol)，且接著添加炔丙基溴溶液(溶解於二甲苯中呈80重量%溶液)(3.36mL，30mmol)。反應混合物在回流下加熱6小時。向混合物中添加10%檸檬酸(2.5mL)，並且在真空下移除溶劑。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取殘餘物，並且用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌經組合之有機層，經MgSO4乾燥並濃縮得到3-炔丙氧基苄醇。
在0℃下將甲烷磺醯氯(2.5g，15.7mmol)及三乙胺(2.8mL，20mmol)添加至化合物3(2.0g，11.0mmol)於CH2Cl2中之溶液中，並將反應置於冰箱中16小時。通常處理生成呈淺黃色油狀之甲磺酸酯。將此油狀物(2.4g，9.2mmol)溶解於THF(20mL)中，並且添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。將反應混合物加熱至回流持續1小時，並接著冷卻至室溫。向混合物中添加水(2.5mL)，並且在真空下移除溶劑。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取殘餘物，並且用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌經組合之有機層，經無水Na2SO4乾燥並濃縮得到所需溴化物。
將mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解於THF(20mL)中，並且在冰浴中冷卻溶液。在劇烈攪拌下經數分鐘時間添加NaH(6mg，0.25mmol)，接著添加上述所獲得之溴化物(2.55g，11.4mmol)及催化量之KI。移除冷卻浴且所得混合物加熱至回流持續12小時。水(1.0mL)添加至混合 物中，並且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)，並分離有機層，經無水Na2SO4乾燥，並將體積減少至大約2mL。逐滴添加至乙醚溶液(150mL)中生成白色沈澱物，收集白色沈澱物，產生PEG衍生物。
實例17
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR' → mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
如上文所示，亦可藉由將含有末端官能基之聚(乙二醇)聚合物與含有炔官能基之反應性分子偶合來獲得含末端炔之聚(乙二醇)聚合物。n介於1與10之間。R'可為H或C1至C4之小烷基。
實例18
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC → NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH → mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
將4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解於CH2Cl2(25mL)中。添加N-羥基丁二醯亞胺(3.80g，3.3mmol)及DCC(4.66g，3.0mmol)，並且在室溫下攪拌溶液隔夜。所得粗NHS酯7未經進一步純化用於以下反應。
將具有5,000Da分子量之mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，Sunbio)溶解於THF(50mL)中，並且將混合物冷卻至4℃。在劇烈攪拌下逐份添加NHS酯7(400mg，0.4mmol)。將混合物攪拌3小時，同時溫至室溫。隨後添加水(2mL)，並且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(50mL)，並分離有機層， 經無水Na2SO4乾燥，並將體積減少至大約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚(150mL)中。收集所得沈澱物且在真空中乾燥。
實例19
此實例表示聚(乙二醇)之甲烷磺醯酯之製備，該酯亦可稱為聚(乙二醇)之甲烷磺酸酯或甲磺酸酯。可藉由類似程序製備對應甲苯磺酸酯及鹵化物。
mPEG-OH+CH3SO2Cl+N(Et)3 → mPEG-O-SO2CH3 → mPEG-N3
在氮氣下將150mL甲苯中之mPEG-OH(MW=3,400，25g，10mmol)共沸蒸餾2小時，並且將溶液冷卻至室溫。向溶液中添加40mL無水CH2Cl2及2.1mL無水三乙胺(15mmol)。在冰浴中冷卻溶液，並且逐滴添加1.2mL經蒸餾甲烷磺醯氯(15mmol)。在氮氣下於室溫下攪拌溶液隔夜，並且藉由添加2mL無水乙醇來淬滅反應。在真空下蒸發混合物以移除溶劑，主要為除甲苯之外的溶劑，過濾，再在真空下濃縮，並接著於100mL乙醚中沈澱。用若干份冷乙醚洗滌濾液，並在真空中乾燥，得到甲磺酸酯。
將甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解於75ml THF中，並且將溶液冷卻至4℃。向經冷卻溶液中添加疊氮化鈉(1.56g，24mmol)。反應在氮氣下加熱至回流持續2小時。隨後蒸發溶劑，並且用CH2Cl2(50mL)稀釋殘餘物。用NaCl溶液洗滌有機溶離份，並且經無水MgSO4乾燥。將體積減少至20ml，並藉由添加至150ml冷無水乙醚中而沈澱出產物。
實例20
(1)N3-C6H4-CO2H → N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH → Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3 → mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可使用美國專利5,998,595中所述之方法產生4-疊氮基苄醇，該專利以引用的方式併入本文中。在0℃下將甲烷磺醯氯(2.5g，15.7mmol)及三乙胺(2.8mL，20mmol)添加至4-疊氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)於CH2Cl2中之溶液中，並將反應置於冰箱中16小時。通常處理生成呈淺黃色油狀之甲磺酸酯。將此油狀物(9.2mmol)溶解於THF(20mL)中，並且添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。將反應混合物加熱至回流持續1小時，並接著冷卻至室溫。向混合物中添加水(2.5mL)，並且在真空下移除溶劑。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取殘餘物，並且用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌經組合之有機層，經無水Na2SO4乾燥並濃縮得到所需溴化物。
用含NaH(12mg，0.5mmol)之THF(35mL)處理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)，並且向混合物中添加溴化物(3.32g，15mmol)以及催化量之KI。所得混合物加熱至回流持續12小時。水(1.0mL)添加至混合物中，並且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)，並分離有機層，經無水Na2SO4乾燥，並將體積減少至大約2mL。逐滴添加至乙醚溶液(150mL)中生成沈澱物，收集該沈澱物，產生mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
實例21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS → N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
將NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400Da，2.0g) 溶解於飽和NaHCO3水溶液(10mL)中，並且將溶液冷卻至0℃。在劇烈攪拌下添加3-疊氮基-1-N-羥基丁二醯亞胺基丙酸酯(5當量)。3小時之後，添加20mL H2O，並且在室溫下再攪拌混合物45分鐘。用0.5N H2SO4將pH調節至3，並且添加NaCl至大約15wt%濃度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反應混合物，經Na2SO4乾燥且濃縮。用冷乙醚沈澱之後，藉由過濾收集產物，並且在真空下乾燥，生成ω-羧基-疊氮PEG衍生物。
實例22
mPEG-OMs+HC≡CLi → mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
在劇烈攪拌下，向如此項技術中已知而製備並冷卻至-78℃之乙炔化鋰(4當量)於THF中之溶液中逐滴添加mPEG-OMs溶解於THF中的溶液。3小時之後，使反應溫至室溫，並且藉由添加1mL丁醇來淬滅。隨後添加20mL H2O，並且在室溫下再攪拌混合物45分鐘。用0.5N H2SO4將pH調節至3，並且添加NaCl至大約15wt%濃度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反應混合物，經Na2SO4乾燥且濃縮。用冷乙醚沈澱之後，藉由過濾收集產物，並且在真空下乾燥，生成1-(丁-3-炔氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
實例23
使用以下文獻中所述之方法將含疊氮及含乙炔之胺基酸以位點選擇性方式併入蛋白中：L.Wang等人，(2001),Science 292：498-500；J.W.Chin等人，Science 301：964-7(2003))；J.W.Chin等人，(2002),Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin及P.G.Schultz,(2002),Chem Bio Chem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002),PNAS United States of America 99：11020-11024；及L.Wang及P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1-10。一旦胺基酸經併入，即在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4及約1mg Cu線存在下於37℃下用含0.01mM蛋白之磷酸鹽緩衝液(PB)(pH 8)進行環加成反應，持續4小時。
實例24
此實例描述量測包含非天然編碼胺基酸之PSMC及PEG化PSMC之活體外及活體內活性的方法。
細胞結合分析
在各種濃度(體積：10μl)之未經標記PSMC、PSMC或陰性對照物不存在或存在下，且在125I-PSMC(大約100,000cpm或1ng)存在下，於0℃下在PBS/1% BSA(100μl)中雙重複培育細胞(3×106個)，持續90分鐘(總體積：120μl)。隨後將細胞再懸浮於350μl塑膠離心管中之200μl冰冷FCS中，並分層，並且離心(1000g；1分鐘)。藉由切下管末端來收集離心塊，並且分別在γ計數器(Packard)上計數離心塊及上清液。
將特異性結合(cpm)確定為在競爭者不存在下之總結合(雙重複之平均值)減去100倍過量之未經標記PSMC存在下的結合(非特異性結合)(cpm)。對所使用之各細胞類型量測非特異性結合。使用相同125I-PSMC製劑在不同天中進行實驗，並且該等實驗應展示內部一致性。由未經標記天然PSMC或PSMC，而非由陰性對照物以劑量依賴性方式抑制結合。PSMC競爭結合天然125I-PSMC之能力表明，受體同樣識別這兩種形式。
對於用scFv-108進行結合分析，在用胰蛋白酶處理之後收集A431細胞，再懸浮於FACS緩衝液(PBS，2% FBS，0.01% NaN3)中，並且隨後接種於96孔圓底微量滴定板(3×105 個細胞/孔)中。用不同濃度之野生型或含pAcF之scFv-108片段在冰上培育細胞30分鐘。藉由在離心後洗滌(重複2-3次)來移除未結合scFv蛋白。細胞隨後與7.5nM(EC80)濃度之mAb-108(ATCC # HB 9764)一起培育30分鐘。兩次洗滌之後，細胞與APC標記(別藻藍蛋白)之抗小鼠抗體(10ug/ml)一起在冰上培育30分鐘。兩次洗滌細胞以移除二級抗體之後，將細胞再懸浮於補充有碘化丙啶(0.5ug/ml)之FACS緩衝液中，並藉由流式細胞術進行分析。對於用Fab-108進行結合分析，細胞在與scFv-108分析所用相同之條件下與遞增量之Fab-108一起培育。使用抗His抗體，接著使用APC標記之抗小鼠二級抗體來偵測Fab結合。
圖7圖A-C展示含有對乙醯基-苯丙胺酸(pAcF)或pAcF與PEG之scFv蛋白以及WT scFv與表現EGF受體之A431細胞的競爭性結合曲線。在洗滌以移除未結合scFv之後細胞與各種濃度之scFv蛋白一起培育，並且如上文所述用mAb108處理細胞。所有蛋白均在周質中表現。表11概述了經修飾scFv(pAcF，及pAcF與PEG)相對於野生型scFv之結合：
圖8圖B-D顯示含pAcF或pAcF-PEG之Fab-108片 段及WT Fab與表現EGF受體之A431細胞的結合。Fab片段之PEG化導致該等片段與EGF受體之親和力以最小程度減少。表12顯示經修飾Fab片段相對於野生型Fab之結合。結合條件如先前所述。
PEG化PSMC之活體內研究
對小鼠或大鼠投與PEG-PSMC、未經修飾PSMC及緩衝溶液。結果將顯示與未經修飾PSMC相比，本發明之PEG化PSMC之極佳活性及延長的半衰期。
經結合及非結合PSMC及其變異體之活體內半衰期量測
使用雄性Sprague Dawley大鼠(約7週齡)。在投藥當天，量測各動物之重量。將每kg體重100μg非結合及經結合PSMC樣品各自經靜脈內注射至三隻大鼠之尾部靜脈中。在注射後1分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時及24小時，在CO2麻醉下自每隻大鼠抽出500μl血液。血樣在室溫下儲存1.5小時，接著藉由離心(4℃，18000xg，持續5分鐘)分離血清。將血清樣品儲存在-80℃下直至分析當天。在冰上解凍樣品之後，藉由PSMC活體外活性分析來定量血清樣品中活性PSMC的量。
實例31
包含非天然編碼胺基酸之PEG化PSMC的安全性及/或功效之人類臨床試驗
目的 比較皮下投與之包含非天然編碼胺基酸的 PEG化重組人類PSMC與對相同標靶抗原具特異性之市售產品(例如Herceptin®、Bexxar®、Campath®、CEA-Scan®、Enbrel®、Erbitux®、Humira®、Myoscint®、Prostascint®、Raptiva®、Remicade®、ReoPro®、Rituxan®、Simulect®、Synagis®、Verluma®、Xolair®、Zenapax®、Zevalin®或Avastin®)的安全性及藥物動力學。
患者 本研究招募了18名介於20-40歲範圍內且重量在60-90kg之間之健康志願者。該等個體將無血液學或血清化學之臨床顯著異常實驗值，且具有陰性尿液毒理學篩選、HIV篩選及B型肝炎表面抗原。其不應具有任何以下跡象：高血壓；任何原發性血液疾病之病史；顯著肝、腎、心血管、胃腸、泌尿生殖、代謝、神經疾病之病史；貧血或發作病症之病史；已知對細菌或哺乳動物衍生之產品、PEG或人類血清白蛋白敏感；含有咖啡鹼之飲料的習慣性及大量消耗者；參與任何其他臨床試驗或在研究登記30天內輸血或獻血；在研究登記三個月內暴露於PSMC；在研究登記7天內患有疾病；以及在研究前體檢中或在研究登記14天內之臨床實驗評估中具有顯著異常情況。可對所有個體評估安全性，並且根據時程安排收集所有血液收集物用於藥物動力學分析。所有研究均在機構倫理委員會批准及患者同意下執行。
研究設計 此研究將為在健康男性志願者中進行之I期、單中心、開放標記、隨機、兩階段交叉研究。將18名個體隨機指派為兩個治療順序組之一(9名個體/組)。經兩個單獨給藥階段，在上部大腿使用等劑量之包含非天然編碼胺基酸的PEG化PSMC及所選市售產品以快速皮下注射之方式投與PSMC。市售產品之投與劑量及頻率如封裝標籤中所說明。藉由包括額外個體 組而將使用市售產品之額外給藥、給藥頻率或其他所需參數添加至本研究中。各給藥階段由14天清洗期隔開。個體在兩個給藥階段中之每一者之前至少12小時及給藥之後72小時，而非在該等給藥階段之間限定在研究中心。若亦存在欲針對PEG化PSMC測試之額外給藥、頻率或其他參數，則可添加額外個體組。PSMC之實驗調配物為包含非天然編碼胺基酸之PEG化PSMC。
血液採樣藉由在投與PSMC之前及之後直接刺破靜脈來抽出連續血液。用於測定血清PSMC濃度之靜脈血樣(5mL)是在給藥之前約30、20及10分鐘(3個基線樣品)以及在給藥之後大約以下時間處獲得：30分鐘及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60及72小時。將各血清樣品分為兩個等分試樣。將所有血清樣品儲存在-20℃下。將血清樣品置於乾冰上裝運。在第一天初始劑量之前即刻、第4天早晨、第16天給藥之前即刻以及第19天早晨執行快速臨床實驗測試(血液學、血清化學及尿分析)。
生物分析方法 放射免疫分析(RA)或ELISA套組程序用於測定血清PSMC濃度。
安全性測定 在各次給藥之前即刻(第1天及第16天)及在各次給藥之後6、24、48及72小時記錄生命指征。安全性測定是基於不利事件之發生率及類型，以及臨床實驗測試偏離基線之變化。此外，評價生命指征量測結果(包括血壓)及體檢結果中與研究前相比之變化。
數據分析藉由自各給藥後值減去平均基線PSMC濃度來針對給藥前基線PSMC濃度修正給藥後血清濃度值，其中該平均基線PSMC濃度是藉由計算給藥之前30、20及10分鐘所收 集的三份樣品之PSMC含量的平均值而得以測定。若給藥前血清PSMC濃度低於該分析之定量含量，則將此等濃度排除在平均值的計算之外。由針對基線PSMC濃度修正之血清濃度數據測定藥物動力學參數。藉由在使用最新版本BIOAVL軟體之Digital Equipment Corporation VAX 8600電腦系統上進行模型獨立方法來計算藥物動力學參數。確定以下藥物動力學參數：峰值血清濃度(Cmax)；達到峰值血清濃度之時間(tmax)；藉助於線性梯形法則所計算的濃度-時間曲線(AUC)下自時間零至最後血液採樣時間(AUC0-72)之面積；及自消除速率常數計算之末期消除半衰期(t1/2)。藉由log-線性濃度-時間曲線之末期線性區中連續數據點的線性回歸來估計消除速率常數。計算各治療之藥物動力學參數的平均值、標準差(SD)及變異係數(CV)。計算參數平均值之比率(保留之調配物/非保留調配物)。
安全性結果 整個治療組中不利事件之發生率均等分佈。不存在偏離基線或研究前臨床實驗測試或血壓之臨床顯著變化，並且體檢結果及生命指征量測結果與研究前相比無顯著變化。兩個治療組之安全性曲線應看來類似。
藥物動力學結果 在所量測之各時間點，所有18名個體中接受單次劑量之一或多種對相同標靶抗原具特異性之市售產品之後的平均血清PSMC濃度-時間曲線(未針對基線PSMC含量修正)與包含非天然編碼胺基酸之PEG化PSMC進行比較。所有個體均應具有在正常生理範圍內之給藥前基線PSMC濃度。自針對給藥前平均基線PSMC濃度修正之血清數據測定藥物動力學參數，並且測定Cmax及tmax。所選臨床比較者之平均tmax顯著短於包含非天然編碼胺基酸之PEG化PSMC的tmax。與包含非天 然編碼胺基酸之PEG化PSMC的末期半衰期相比，所測試之市售PSMC產品的末期半衰期顯著較短。
儘管本研究是在健康男性個體中進行，但類似吸收特徵及安全性曲線應為在其他患者群體中所預期的；諸如患有癌症或慢性腎衰竭之男性或女性患者，兒科腎衰竭患者，自體預積程式中之患者或安排時程進行擇期手術之患者。
總之，皮下投與單次劑量之包含非天然編碼胺基酸的PEG化PSMC將為安全的，並且由健康男性個體充分耐受。基於不利事件發生率、臨床實驗值、生命指征及體檢結果之比較，市售形式之PSMC及包含非天然編碼胺基酸的PEG化PSMC之安全性曲線將為相同的。包含非天然編碼胺基酸之PEG化PSMC可能對患者及健康照護提供者提供較大的臨床效用。
實例32
使用FR+及FR-細胞株評估抗CD3 Fab-葉酸結合物之親和力及特異性。在葉酸缺乏培養基中培養之後，FR在鼻咽(KB)及卵巢(OV-90，SKOV-3)癌細胞株中過度表現，如藉由流式細胞術所測定。腎癌細胞株CAKI-1及不表現FR之肺泡基底上皮細胞癌A549用作陰性對照物。抗CD3 Fab-葉酸結合物能夠以類似於游離葉酸之親和力結合於KB細胞(FR+)，指示由於與抗CD3 Fab結合而使得結合於葉酸受體之損失最小。同樣，抗CD3 Fab-葉酸以類似於抗CD3之親和力結合於Jurkat細胞(CD3+)；未觀察到結合於A549細胞(FR-)。
實例33
接著測試抗CD3 Fab-葉酸結合物在活體外細胞毒性分析中之活性，使用KB及OV-90細胞(FR+)及CAKI-1及A549 細胞(FR-)作為對照物。細胞與經活化之人類末梢血液單核細胞(PBMC；標靶：效應細胞之比率1：10)共培養且用各種濃度之抗CD3 Fab-葉酸或單獨抗CD3 Fab處理。藉由量測自溶解之細胞釋放的LDH含量且使用基於CellTiter-Glo及FACS之毒性分析來定量細胞毒性。抗CD3 Fab-葉酸結合物證實，在PBMC存在下分別以10pM及100pM之EC50有效殺死KB及OV-90細胞(圖2A，補充圖4)，而CAKI-1細胞(圖2A)及A549細胞(補充圖4)在100nM結合物下未受影響。用單獨抗CD3 Fab治療誘導對所有所測試之細胞株均可忽略不計之毒性(圖2A)。此外，SKOV-3細胞(圖2B)或KB細胞(補充圖5)與經活化PBMC一起(標靶：效應細胞之比率1：10)在葉酸缺乏培養基中在抗CD3 Fab-葉酸結合物存在下培育(16小時)導致形成瓣狀體，從而提供關於T細胞靶向之額外證據。相比之下，抗CD3 Fab對T細胞接合無影響且在PBMC或KB細胞不存在下未觀察到團簇(補充圖5)。
實例34
接著檢查抗CD3 Fab-葉酸結合物及未結合抗CD3 Fab在嚙齒動物中之藥物動力學。在3隻大鼠中經靜脈內注射含1mg/kg或5mg/kg單一劑量之抗CD3 Fab-葉酸結合物的PBS或1mg/kg未結合抗CD3 Fab，且藉由ELISA分析以規則時間間隔收集之血清。對於抗CD3 Fab-葉酸及相應未結合突變型抗CD3 Fab而言，血清濃度以相同速率降低，血清半衰期為60min(圖3D)。因此，抗CD3 Fab-葉酸具有類似於未結合抗CD3 Fab之藥物動力學，指示該結合物之PK曲線未受葉酸衍生化影響。
實例35
接著使用雌性NOD-SCID小鼠在異種移植物模型中 分析抗CD3 Fab-葉酸雙特異性試劑之活體內功效。使動物維持低葉酸膳食以降低可能與雙特異性試劑競爭之葉酸的循環血清含量。KB(FR+)或A549(FR-)細胞當與非活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：100)或經活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)混合且同時注射至小鼠中時能夠形成腫瘤。因此，將與經活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：10)混合之KB細胞植入小鼠中且自與腫瘤細胞植入同一天開始，小鼠每天經靜脈內注射1.5mg/kg抗CD3 Fab-葉酸或PBS，持續10天。此給藥方案是基於抗CD3 Fab-葉酸結合物之藥物動力學特性及使用雙特異性抗體之先前研究10來選擇。腫瘤體積顯示使用約5天之倍增時間，經PBS處理之小鼠中的快速增加。相比之下，經抗CD3 Fab-葉酸處理之小鼠中的腫瘤在研究持續時間期間幾乎不可偵測(圖3A)。在平行研究中，小鼠植入與未活化人類PBMC(標靶：效應細胞比率1：100)混合之KB細胞且自與腫瘤細胞植入同一天開始，每天用1.5mg/kg抗CD3 Fab-葉酸或PBS經靜脈內處理，持續10天。兩個小鼠組之腫瘤體積均在研究之最初30天內降低，這可能由於注射位點處PBMC之高負荷。然而，腫瘤之降低速率高於經抗CD3 Fab-葉酸處理之小鼠中。在研究第35天之後，經PBS處理之小鼠中的腫瘤體積穩固地增加，而經抗CD3 Fab-葉酸處理之小鼠中的腫瘤降低至幾乎不可偵測水準，指示細胞毒性T細胞接合以用於甚至在活化T細胞不存在下由抗CD3 Fab-葉酸結合物消除腫瘤。為測試抗CD3 Fab-葉酸結合物對表現FR之腫瘤的活體內選擇性，將A549細胞(FR-)與未經活化之人類PBMC混合(標靶：效應細胞比率1：100)且植入小鼠中。小鼠以類似方式經10個每天靜脈內劑量(1.5mg/kg)之抗CD3 Fab-葉酸處理，且顯示在處理之 後20天與經PBS處理之腫瘤無顯著差異。在所有此等研究中，在經抗CD3 Fab-葉酸及PBS處理之小鼠中均未觀察到重量損失或其他明顯毒性(圖3C，補充圖6B)。在有及無抗CD3 Fab-葉酸注射下，對小鼠進一步執行組織病理學分析。來自經抗CD3 Fab-葉酸或PBS處理之小鼠之腎臟的染色顯示無T細胞浸潤；對於諸如脾、肺及肝之其他組織觀察到在處理組與對照組之間蘇木精及曙紅(H&E)染色無明顯病理學差異。
實例36
使用標準肽合成裝置執行固相肽合成(SPPS)。所有肽及肽結合物均使用製備型逆相高效液相層析(RP-HPLC)儀器(Waters,xTerra C18 10μm；19×250mm)純化且藉由分析型RP-HPLC(Waters,X-Bridge C18 5μm；3.0×50mm)及液相層析/質譜法(LC/MS)進行分析。使用Varian 400MHz NMR光譜儀獲得1H光譜。樣品在DMSO-d6/D2O中操作；所有1H信號均關於殘餘或DMSO(2.50ppm)以ppm記錄，且資料報告為s=單峰，d=雙重峰，t=三重峰，q=四重峰，及m=多重峰或未解析，b=寬峰，耦合常數以Hz表示。在Ambrx質譜設施(La Jolla,CA)處獲得蛋白質量。
實例37
表現質體之構築、大腸桿菌細胞株W3110B60、蛋白產生
由pET-20b(+)及pET-24(+)質體(EMD4Biosciences)構築表現質體(AXID)。將由經修飾詹氏甲烷球菌tRNA合成酶(對pAcPhe具特異性)組成之琥珀抑制卡匣選殖至AXID之BamHI位點中(II型選殖)。由文獻1,2獲得UCHT1 Version.2 Fab CD3序列，且亞選殖至開放閱讀框架內phoA啟動子下游之AXID載 體中。重鏈之離胺酸136(HC-Lys136)快速變換(Stratagene)成TAG琥珀無意義密碼子。藉由同源重組3工程改造野生型大腸桿菌K-12 W3110細胞株(ATCC)以使其具有以下基因型：F-IN(rrnD-rrnE)λ-araB：：g1 tetA fhuA：：dhfr proSW375R：：cat。 W3110B60基因組中proS之溫度敏感性表型由此表現質體中proS之野生型功能複本補充。將載體轉型至W311B60細胞中且使細胞在醱酵罐中在補充有硫酸康黴素(50ug/mL)之合成培養基(2.1L)中於37℃、pH 7及480-1200rpm(級聯)下生長，在OD600=30下，針對生產階段將pH轉移至6.8，且添加合成培養基。接著將溶解於水中之pAcPhe(100g/L)添加至醱酵罐中。溶解氧為設定點以在初期攪動(480-1200rpm)下維持30%。24小時之後，收集細胞且藉由與TES緩衝液[0.2M Tris pH 8.0，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖)一起以4：1(v/w)比率在4℃下培育而由滲壓衝擊自細胞提取UCHT1。藉由離心(18000rpm，20min及4℃)澄清提取物，經0.22微米過濾器過濾，且裝載於蛋白G管柱(GE healthcare)上。用5個床體積之PBS在pH 7.4下洗滌管柱，且用10個床體積之0.1M甘胺酸-HCl(pH 3.0)溶離蛋白質。將溶離份收集至含有10% 1M Tris-HCl(pH 8)之管中。經彙集之溶離份進一步藉由陽離子交換[管柱：SP650S(Tosoh Bioscience)，緩衝液A：0.02M磷酸鹽(pH 6.0)，緩衝液B：0.02M磷酸鹽(pH 6.0)及0.5M NaCl]進行純化且藉由SDS-PAGE凝膠及質譜法進行分析。
表現/抑制
用對乙醯基-苯丙胺酸(pAcF)抑制：使用標準方案實現大腸桿菌中琥珀突變之抑制。
實例38
合成葉酸-N 10 (TFA)-Lys連接子(1)
使用標準固相肽合成以 H-Lys-(Boc)-2-ClTrt-Resin樹脂(Peptide international)為起始物來合成葉酸-Lys。4簡言之，相繼用DCM(5mL)、(二甲基甲醯胺)(DMF，5mL)使H-Lys-(Boc)-2-ClTrt-Resin樹脂(500mg，0.89mM)溶脹。添加Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(1.5eq)、HATU(1.5eq)及DIPEA(4.0eq)於DMF(3mL)中之溶液。用氬氣鼓泡2小時，且用DMF(3×3mL)及i-PrOH(3×3mL)洗滌樹脂。藉由Kaiser Test分析偶合效率。在DMF(3mL)中溶脹樹脂之後，添加喋酸(1.5eq)、HATU(1.5eq)及DIPEA(4.0eq)於DMF(3mL)中之溶液。用氬氣鼓泡2小時，且用DMF(3×3mL)及i-PrOH(3×3mL)洗滌樹脂。藉由Kaiser Test分析偶合效率。 在DCM(3mL)中溶脹樹脂，接著在氬氣下乾燥之後，使用三氟乙酸(TFA)：H2O：三異丙基矽烷(95.5：2.5：2.5)混合液(3×5mL)自樹脂裂解最終化合物，直接進入含有乙醚(300mL)之圓底燒瓶中以獲得沈澱之粗產物。過濾且乾燥之後，使用製備型逆相(RP)-HPLC(C18管柱，0% B-50% B，25min，緩衝液A：含0.1 TFA之水，緩衝液B：含0.1 TFA之乙腈，λ=280nm)純化粗產物。在真空下移除ACN，且冷凍乾燥純溶離份以生成呈淺黃色固體狀之1。1H NMR(DMSO-d6/D2O)：δ 1.18(m,2H,Pep-H)；1.45(m,1H,Pep-H)；1.54(m,3H,Pep-H)；1.81(m,1H,Pep-H)；1.95(m,1H,Pep-H)；2.11(m,2H,Pep-H)；2.88(m,2H,Pep-H)；3.94(m,1H,Lys-αH)；4.12(m,1H,Glu-αH)；4.46(s,2H,Pte-H)；6.61(d,J=8.5Hz,2H,Pte-Ar-H)；7.56(d,J=8.5Hz,2H,Pte-Ar-H)；8.60(s,1H,Pte-Ar-H)。LC-MS(M+H)+：C27H30F3N9O8計算值=665.6；實驗值=666.0g/mol。
實例39
合成鄰苯二甲醯亞胺-PEG4-COOH
在0℃下在氬氣下，向三苯膦(TPP， 216.7mg，0.826mmol)及偶氮二甲酸二乙酯(DEAD，143.9mg，0.826mmol)於無水THF(0.50mL)中之溶液中添加含tBuOOC-PEG4-OH(200.0mg，0.751mmol)之無水THF。攪拌反應15分鐘之後，經10分鐘添加N-羥基鄰苯二甲醯亞胺(134.8mg，0.826mmol)於無水THF中之溶液。反應混合物在室溫下在氬氣下攪拌12小時。在真空下移除溶劑之後，將TFA：三異丙基矽烷：水(95：2.5：2.5；5mL)添加至粗產物中且在室溫下攪拌1小時以 脫除第三丁基保護基。藉由急驟層析(己烷：EtOAc=1：1)純化最終產物。在真空下蒸發經組合純溶離份之溶劑以生成呈油性液體狀之最終產物。1HNMR(CDCl3)：δ 2.63(m,2H)；3.59~3.65(m,14H)；3.88(m,2H)；4.38(m,2H)；7.75(m,2H),7.84(m,2H)LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+ C19H25NO9計算值411.4，實驗值411.4g/mol。
實例40
合成鄰苯二甲醯亞胺-PEG4-NHS(2)
在氬氣下向HOOC-PEG4-O-N-鄰 苯二甲醯亞胺(50mg，0.122mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS，15.4mg，0.134mmol)及4-二甲基胺基吡啶(DMAP，1.5mg，0.0122mmol)於無水DCM(0.5mL)中之溶液中添加含乙基(二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC，20.8mg，0.134mmol)之無水DCM(0.5mL)反應混合物在室溫下在氬氣下攪拌4小時且使用急驟層析(己烷：DCM=1：1)純化以生成NHS-PEG4-O-N-鄰苯二甲醯亞胺。在真空下移除經組合純溶離份之溶劑以生成呈油性液體狀之最終產物。1HNMR：δ 2.90(t,J=6.4,2H)；2.75(bs,4H)；3.56~3.63(m,12H),3.83~3.87(m,4H),4.37(t,J=4.5,2H)；7.75(m,2H),7.83(m,2H)。LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+ C23H28N2O11計算值508.5，實驗值509.0g/mol。
實例41
合成葉酸-Lys-PEG4-鄰苯二甲醯亞胺(3)
在氬氣下向 NHS-OC-PEG4-O-N-鄰苯二甲醯亞胺(21mg，0.041mmol)及葉酸-N10(TFA)-Lys(25mg，0.037mmol)於無水DMSO(300μL)中之溶液中添加DIPEA(101.4μL，0.601mmol)。反應混合物繼續在室溫下攪拌2小時且反應進程之後為LC/MS。使用RP製備型HPLC(C18管柱，0% B-50% B，25min，緩衝液A：含0.1 TFA之水，緩衝液B：含0.1 TFA之乙腈，λ=280nm)純化最終產物。在真空下移除ACN之後，冷凍乾燥純溶離份以生成淺黃色固體。LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+ C46H53F3N10O16計算值1058.9，實驗值1059.0g/mol。
實例42
合成葉酸-Lys-PEG4-胺氧基連接子(4)
向葉酸 -N10(TFA)-Lys-PEG-鄰苯二甲醯亞胺(30mg，0.028mmol)於DMSO(1mL)中之溶液中添加肼(13μL，0.42mmol)，且將反應pH維持於9.35下。使用LC/MS監測鄰苯二甲醯亞胺及TFA基團之保護基脫除。使用逆相製備型HPLC(C18管柱，0% B-50% B，25min，緩衝液A：含0.1 TFA之水，緩衝液B：含0.1 TFA之乙腈，λ=280nm)純化葉酸-Lys-PEG4-胺氧基連接子。在真空下移除ACN之後，冷凍乾燥純溶離份以提供黃色固體。1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ 1.88(m,1H,Pep-H)；2.03(m,1H,Pep-H)；2.15(t,J=7.4,2H)；2.28(t,J=6.4,2H)；3.05(m,4H)；3.20-3.60(m,xH)；3.94(m,1H,Lys-αH)；4.23(m,1H,Glu-αH)；4.48(s,2H,Ptc-H)；6.64(d,J=8.8Hz,2H,Ptc-Ar-H)；7.64(d,J=8.8Hz,2H,Ptc-Ar-H)；8.63(s,1H,Pte-Ar-H)；LC/MS(ESI)(m/z)：(M+H)+ C36H52N10O13計算值832.9g/mol，實驗值833.0g/mol。
實例43
葉酸-抗CD3結合
將含 pAcPhe之抗CD3 Fab(10mg，0.21μmol)於PBS pH 7.4(1mL)中之溶液緩衝液交換成50mM乙酸鈉pH 4.0(900μL)。在添加1M乙醯肼(100μL)之後，將葉酸-Lys-PEG4-胺氧基連接子(1.7mg，2.10μmol)添加至反應混合物中且在28℃下在震盪(50rpm)下培育48小時。藉由RP-HPLC(Zorbax 300SB C3管柱，4.6×150mm；Agilent)監測反應進展。用30% B至90% B之線性梯度(A，水、0.1% TFA；B，乙腈、0.1% TFA)溶離結合物。Agilent 1100系列HPLC系統及Chemstation軟體用於解析及定量與葉酸-連接子結合之Fab的百分比。反應在48小時內完成，具有>95%轉化效率。使用陽離子交換管柱(SP 650S，Tosoh Biosciences)純化最終結合物，緩衝液交換成PBS，且儲存於4℃下直至使用。預期MS：48539.64Da，觀察MS：48538.89Da。
實例44
活體外功效研究
標靶細胞KB、OVCAR-3、SKOV-3及OV-90細胞維持於補充有10% FBS及100單位/ml之青黴素及100μg/ml之鏈黴素的無葉酸RPMI-1640中，持續至少5個繼代，接著將其用於分析。Jurkat及A549細胞維持於補充有10% FBS及100單位/ml之青黴素及100μg/ml之鏈黴素的RPMI-1640中。所有細胞均在 5%二氧化碳、95%空氣潮濕氛圍中在37℃下生長為單層。
對於FR表現，細胞與來自R&D系統之抗FR-PE抗體(藍色)及IgG1-同型-PE對照物(紅色)一起在4℃下培育1小時且藉由流式細胞術分析結合。KB或A549細胞接種於T75燒瓶中且使其經48小時形成單層。在胰蛋白酶消化之後，將細胞轉移至離心管(1×106個細胞/管)中且離心。用含有遞增濃度之葉酸-FITC之新鮮培養基替換該培養基且在4℃下培育30分鐘。用新鮮培養基(2×1.0mL)及PBS(1×1.0mL)沖洗之後，將細胞再懸浮於PBS(1.0mL)中，且使用流式細胞儀分析(30,000個細胞/樣品)細胞結合螢光。KB細胞接種於T75燒瓶中且使其經48小時形成單層。在胰蛋白酶消化之後，將釋放細胞轉移至離心管(1×106個細胞/管)中且離心。用新鮮培養基(0.5mL)中在遞增濃度(0.1nM-0.8nM)之抗CD3 Fab-葉酸存在下之100nM FA-FITC替換各管中之廢棄培養基。在4℃下培育30分鐘之後，用培養基(2×1.0mL)及PBS(1×1.0mL)沖洗細胞以移除任何未結合放射性。接著將細胞再懸浮於PBS(0.5mL)中且使用流式細胞儀計數細胞結合螢光。
使用Ficoll Hypaque Plus(GE Heathcare)梯度離心自白血球層(San Diego Blood Bank)分離人類末梢血液單核細胞(PBMC)。若單一供體不存在充足細胞，則使用若干供體，但各供體當活體外或活體內使用時保持獨立(亦即，未混合在一起)。在rhIL-2(100ng/ml)及GMCSF(100ng/ml)存在下用aCD3/aCD28超磁性珠粒(Life Technologies)活化PBMC。
對於細胞毒性分析，標靶細胞自具有Accutase之燒瓶脫離且接種於U型底96孔培養盤中。經活化PBMC(效應細 胞)或非活化PBMC(效應細胞)以規定標靶：效應細胞比率添加至靶向細胞中。抗CD3葉酸稀釋於添加至共培養物中之完全培養基中，且在短暫離心之後，培養盤在5% CO2下且在37℃下培育24小時。對於藉由LDH釋放獲得之細胞毒性，使用來自Promega之套組根據製造商之說明書量測LDH。對於藉由流式細胞術獲得之細胞毒性，細胞用DIO標記(綠色質膜染色)且添加碘化丙錠至1μg/mL之最終濃度。9對於藉由ATP含量獲得之細胞毒性，24小時後洗去PBMC且使用Cell Titer Glo(Promega)量測KB細胞之ATP含量。
實例45
藥物動力學研究
抗CD3 Fab-葉酸及未結合CD3 Fab以單次快速靜脈內注射液形式投與至Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories)。以規則時間間隔收集血液且藉由ELISA定量大鼠血清中之抗CD3 Fab-葉酸。該等結合物之藥物動力學特性經量測為時間對血清濃度。
實例46
活體內功效研究
自TSRI動物設施或自The Jackson Laboratory購買6至8週齡雌性NOD-SCID小鼠且在研究開始之前至少兩週維持γ照射之葉酸缺乏特殊膳食(Teklad)。動物以每籠5隻圈養於具障壁、無病原體之經遮蓋架上。高壓蒸汽滅菌自來水及食物隨意給予。藉由在尾巴底部刺紋或耳穿孔來個別地鑑別小鼠。所有動物程序均由Scripps研究機構動物照護及使用委員會(The Scripps Research Institute Animal Care and Use Committee)及Ambrx公 司動物照護及使用委員會(Ambrx,Inc.Animal Care and Use Committee)批准且根據關於動物之人道處理之國家及國際準則執行。
腫瘤細胞(每隻小鼠5×105個細胞)與經活化或未經活化PBMC混合(在規定之標靶：效應細胞比率中)且以200ul注射液形式皮下植入左側脅腹中。在腫瘤細胞植入當天開始用抗CD3 Fab-葉酸或PBS每天靜脈內處理動物，持續10次注射(黑色箭頭)，在給藥中有偶爾2天中斷以適應週末。每兩週藉由在兩個垂直方向量測來監測腫瘤生長，且使用式V=(L×W×W)/2(其中V=體積，W=最短直徑且L=最長直徑)來估算體積。藉由在電子稱重機上對小鼠稱重來測定體重。當組平均腫瘤尺寸達到約1,000mm3時或在給藥開始後35天(取首先發生之情況)，終止實驗。
對於免疫組織化學分析，使用異氟烷處死動物且分離腫瘤以及各種器官，且固定於福馬林-鋅中隔夜。組織包埋於石蠟中且切片以供染色。根據標準方案執行蘇木精及曙紅(H&E)染色且使用Leica掃描儀掃描載片。
實例47
如圖22及23中所示，在NCI-H838細胞及KB細胞中量測在經活化PBMC及表現FOLR之細胞存在下抗CD3-葉酸之細胞毒性。已顯示，投與過量葉酸可調節具有2nM葉酸之抗CD3-葉酸ADC的毒性。各表現FOLR之細胞(第1組：NCI-H1651；第2組：NCI-H2405；第3組：NCI-H838；第4組：NCI-H2347；第5組：KB)中之細胞毒性百分比。在以ng/mL量測之不同濃度之結合UCHT1-葉酸(在此實例中包含SEQ ID NO：18及/或20) 下量測細胞毒性。各別測試組中每一者之EC50為：第1組：NCI-H1651 EC50 0.22ng/mL；第2組：NCI-H2405 EC50 1.48ng/mL；第3組：NCI-H838 EC50 0.36ng/mL；第4組：NCI-H2347 EC50.30ng/mL；第5組：KB EC50 0.024ng/mL。
應瞭解，本文所述之實例及實施例僅為達成說明性目的，並且將對熟習此項技術者建議根據其作出各種修改或變化，且該等修改或變化欲包括在本申請案之精神及範圍以及所附申請專利範圍之範疇以內。所有本文所引用之公開案、專利及專利申請案均以所有目的以全文引用之方式併入本文中。
本發明之額外及替代實施例
1.一種包含一或多個非天然編碼胺基酸之多肽小分子結合物(PSMC)。
2.如技術方案1之PSMC，其中該抗原結合多肽包含一或多個轉譯後修飾。
3.如技術方案1之PSMC，其中該抗原結合多肽鍵聯於連接子、聚合物或生物活性分子。
4.如技術方案3之PSMC，其中該多肽鍵聯於水溶性聚合物。
5.如技術方案1之PSMC，其中該多肽鍵聯於雙官能聚合物、雙官能連接子或至少一個額外抗原結合多肽。
6.如技術方案5之PSMC，其中該雙官能連接子或聚合物鍵聯於第二多肽。
7.如技術方案6之PSMC，其中該第二多肽為抗原結合多肽。
8.如技術方案6之PSMC，其中該第二多肽為非抗原結合多 肽。
9.如技術方案4之PSMC，其中該水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
10.如技術方案5之PSMC，其中該雙官能聚合物為聚(乙二醇)部分。
11.如技術方案4之PSMC，其中該水溶性聚合物鍵聯於存在於該抗原結合多肽中之非天然編碼胺基酸。
12.如技術方案1之PSMC，其包含至少兩個鍵聯於包含聚(乙二醇)部分之水溶性聚合物的胺基酸。
13.如技術方案12之PSMC，其中至少一個鍵聯於該水溶性聚合物之胺基酸為非天然編碼胺基酸。
14.如技術方案1之PSMC，其中該抗原結合多肽包含一或多個胺基酸取代、添加或缺失，其調節該抗原結合多肽對PSMC受體或抗原之親和力。
15.如技術方案1之PSMC，其中該抗原結合多肽包含一或多個胺基酸取代、添加或缺失，其調節該抗原結合多肽之穩定性、在重組宿主細胞中或活體外合成之表現水準、免疫原性、蛋白酶抗性、組織或器官特異性或溶解性。
16.如技術方案1之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸對連接子、聚合物或生物活性分子具反應性，而該連接子、聚合物或生物活性分子在其他情況下對該多肽中之20種常見胺基酸中之任一者無反應性。
17.如技術方案1之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含羰基、胺氧基、肼基、醯肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。
18.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含羰 基。
19.如技術方案18之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸具有以下結構： 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；R2為H、烷基、芳基、經取代烷基及經取代芳基；且R3為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R4為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
20.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含胺氧基。
21.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含醯肼基。
22.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含肼基。
23.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含胺基脲基。
24.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含疊氮基。
25.如技術方案24之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸具有以下結構： 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基、經取代芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端 修飾基團。
26.如技術方案17之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含炔基。
27.如技術方案26之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸具有以下結構： 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或胺基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
28.如技術方案4之PSMC，其中該水溶性聚合物具有在約0.1kDa與約100kDa之間之分子量。
29.如技術方案28之PSMC，其中該水溶性聚合物具有在約0.1kDa與約50kDa之間之分子量。
30.如技術方案4之PSMC，其藉由使包含含羰基胺基酸之抗原結合多肽與包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基團之水溶性聚合物反應來製備。
31.如技術方案30之PSMC，其中該胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基團經由醯胺鍵聯鍵聯於該水溶性聚合物。
32.如技術方案4之PSMC，其藉由使包含羰基之水溶性聚合物與包含非天然編碼胺基酸之多肽反應而製得，該非天然編碼胺基酸包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲基團。
33.如技術方案4之PSMC，其藉由使包含含炔胺基酸之抗原結合多肽與包含疊氮部分之水溶性聚合物反應來製備。
34.如技術方案4之PSMC，其藉由使包含含疊氮胺基酸之 PSMC與包含炔部分之水溶性聚合物反應來製備。
35.如技術方案17之PSMC，其中該疊氮或炔基經由醯胺鍵聯鍵聯於水溶性聚合物。
36.如技術方案4之PSMC，其中該水溶性聚合物為分支或多臂聚合物。
37.如技術方案36之PSMC，其中該水溶性聚合物之各分支具有在約1kDa與100kDa之間之分子量。
38.如技術方案1之PSMC，其中該多肽為拮抗劑。
39.如技術方案38之PSMC，其中該多肽包含一或多個轉譯後修飾、連接子、聚合物或生物活性分子。
40.如技術方案39之PSMC，其中該聚合物包含選自由水溶性聚合物及聚(乙二醇)組成之群之部分。
41.如技術方案1之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含醣部分。
42.如技術方案3之PSMC，其中該連接子、聚合物或生物活性分子經由醣部分鍵聯於該多肽。
43.一種經分離核酸，其包含在嚴謹條件下與編碼PSMC之聚核苷酸雜交的聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至少一個選擇密碼子。
44.如技術方案43之經分離核酸，其中該選擇密碼子是選自由琥珀密碼子、赭石密碼子、乳白密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子及四鹼基密碼子組成之群。
45.一種製備如技術方案3之PSMC的方法，該方法包含使包含非天然編碼胺基酸之經分離PSMC與包含與該非天然編碼胺基酸反應之部分的連接子、聚合物或生物活性分子接觸。
46.如技術方案45之方法，其中該聚合物包含選自由水溶性聚合物及聚(乙二醇)組成之群之部分。
47.如技術方案45之方法，其中該非天然編碼胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。
48.如技術方案45之方法，其中該非天然編碼胺基酸包含羰基部分且該連接子、聚合物或生物活性分子包含胺氧基、肼、醯肼或胺基脲部分。
49.如技術方案48之方法，其中該胺氧基、肼、醯肼或胺基脲部分經由醯胺鍵聯鍵聯於該連接子、聚合物或生物活性分子。
50.如技術方案45之方法，其中該非天然編碼胺基酸包含炔部分且該連接子、聚合物或生物活性分子包含疊氮部分。
51.如技術方案45之方法，其中該非天然編碼胺基酸包含疊氮部分且該連接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
52.如技術方案47之方法，其中該疊氮或炔部分經由醯胺鍵聯鍵聯於連接子、聚合物或生物活性分子。
53.如技術方案46之方法，其中該聚(乙二醇)部分具有在約0.1kDa與約100kDa之間之平均分子量。
54.如技術方案46之方法，其中該聚(乙二醇)部分為分支或多臂聚合物。
55.一種組合物，其包含如技術方案1之PSMC及醫藥學上可接受之載劑。
56.如技術方案55之組合物，其中該非天然編碼胺基酸鍵聯於水溶性聚合物。
57.一種治療具有由PSMC調節之病症的患者之方法，其包含向該患者投與治療有效量之如技術方案55之組合物。
58.一種細胞，其包含如技術方案43之核酸。
59.如技術方案58之細胞，其中該細胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
60.一種製備包含非天然編碼胺基酸之PSMC之方法，該方法包含在允許該包含非天然編碼胺基酸的PSMC表現之條件下培養細胞，該等細胞包含編碼PSMC並且包含選擇密碼子之一或多種聚核苷酸、正交RNA合成酶及正交tRNA；及純化該PSMC。
61.一種調節PSMC之血清半衰期或循環時間之方法，該方法包含用一或多個非天然編碼胺基酸取代該PSMC中的任何一或多個天然存在胺基酸。
62.一種由聚核苷酸編碼之PSMC，其中該聚核苷酸包含選擇密碼子，並且其中該多肽包含至少一個非天然編碼胺基酸。
63.如技術方案62之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸鍵聯於連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
64.如技術方案63之PSMC，其中該水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
65.如技術方案62之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸包含羰基、胺氧基、醯肼基、肼基、胺基脲基、疊氮基或炔基。
66.如技術方案64之PSMC，其中該聚(乙二醇)部分具有在約0.1kDa與約100kDa之間之分子量。
67.如技術方案64之PSMC，其中該聚(乙二醇)部分為分支或多臂聚合物。
68.如技術方案67之PSMC，其中該聚(乙二醇)部分具有在約1kDa與約100kDa之間之分子量。
69.一種組合物，其包含如技術方案62之PSMC及醫藥學上 可接受之載劑。
70.一種包含彼此接合之第一PSMC及第二PSMC之雙特異性PSMC，其中該第一PSMC與該第二PSMC特異性結合於不同抗原決定基，其中該第一PSMC具有對第一抗原上至少一個抗原決定基之結合特異性，且該第二PSMC具有對該第一抗原或第二抗原上不同於該第一抗原決定基之第二抗原決定基的結合特異性，並且其中該雙特異性PSMC包含至少一個非天然編碼胺基酸。
71.如技術方案70之雙特異性PSMC，其中該第一PSMC及該第二PSMC藉由連接子接合。
72.如技術方案71之雙特異性PSMC，其中該連接子為肽連接子。
73.如技術方案72之雙特異性PSMC，其中該連接子為缺乏蛋白水解裂解位點之肽連接子。
74.如技術方案70之雙特異性PSMC，其中該第一PSMC為單鏈PSMC且該第二PSMC為單鏈PSMC，並且該第一PSMC藉由肽連接子偶合於該第二PSMC。
75.一種組合物，其包含如技術方案70之雙特異性PSMC及醫藥學上可接受之載劑。
76.一種治療疾病或病狀之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之如技術方案75之組合物。
77.一種包含如技術方案70之雙特異性PSMC之PSMC，其偶合於生物活性分子。
78.如技術方案77之PSMC，其中該生物活性分子是選自由細胞毒素、標記、放射性核素、藥物、脂質體、配位體及PSMC組成之群。
79.如技術方案77之PSMC，其中該PSMC為融合蛋白。
80.一種偵測表現一或多種抗原之細胞或組織的方法，該方法包含：使細胞或組織與連接於可偵測標記之如技術方案70之PSMC接觸；及偵測該標記，其中與細胞或組織締合的該標記之偵測指示表現一或多種由PSMC結合之抗原的細胞或組織之存在。
81.如技術方案80之方法，其中該可偵測標記是選自由r發射體、正電子發射體、MRI標記及螢光標記組成之群。
82.如技術方案80之方法，其中該可偵測標記為r發射體且該偵測包含用r攝影機成像。
83.如技術方案80之方法，其中該可偵測標記為正電子發射體且該偵測包含用正電子發射斷層攝影法(PET)成像。
84.如技術方案80之方法，其中該可偵測標記為MRI標記且該偵測包含用磁共振成像偵測。
85.一種PSMC，其包含藉由共價鍵鍵聯於該PSMC之單一胺基酸處的水溶性聚合物。
86.如技術方案85之PSMC，其中該水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
87.如技術方案85之PSMC，其中共價鍵聯於該水溶性聚合物之該胺基酸為非天然編碼胺基酸。
88.一種包含至少一個連接子、聚合物或生物活性分子之PSMC，其中該連接子、聚合物或生物活性分子藉由經核糖體併入該多肽中的非天然編碼胺基酸之官能基連接於該多肽。
89.如技術方案88之PSMC，其中該PSMC經單PEG化。
90.一種包含連接於一或多個非天然編碼胺基酸之連接子、聚 合物或生物活性分子之PSMC，其中該非天然編碼胺基酸經核糖體併入該多肽中的預選位點處。
91.如技術方案90之PSMC，其中該PSMC包含一個該連接子、聚合物或生物活性分子。
92.如技術方案1之PSMC，其中該PSMC包含一或多個胺基酸取代、添加或缺失，其調節該PSMC之血清半衰期或循環時間。
93.一種調節PSMC之免疫原性之方法，該方法包含用一或多個非天然編碼胺基酸取代該PSMC中的任何一或多個天然存在胺基酸。
94.如技術方案43之經分離核酸，其中該經分離核酸之序列是選自由SEQ ID NO：19、21或其片段組成之群。
95.一種抗原結合多肽，其中該多肽是選自由SEQ ID NO：18、20或其片段組成之群。
96.如技術方案3之抗原結合多肽，其中該抗原結合多肽在變性條件下鍵聯於該連接子、聚合物或生物活性分子。
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Claims (10)

  1. 一種包含一或多個非天然編碼胺基酸之多肽小分子結合物(PSMC)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該抗原結合多肽包含一或多個轉譯後修飾。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該抗原結合多肽鍵聯於連接子、聚合物或生物活性分子。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之PSMC，其中該多肽鍵聯於水溶性聚合物。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該多肽鍵聯於雙官能聚合物、雙官能連接子或至少一個額外抗原結合多肽。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之PSMC，其中該雙官能連接子或聚合物鍵聯於第二多肽。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該抗原結合多肽包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該抗原結合多肽包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該PSMC為抗CD3-葉酸Fab。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之PSMC，其中該結合物具有式(A)-(L)-(C)，其中：(A)包含如請求項1之抗體或抗原結合片段；(L)包含連接子；且(C)包含細胞毒性劑，其中該連接子(L)鍵聯(A)至(C)且其中(A)包含包含SEQ ID NO：20之重鏈及SEQ ID NO：18之輕鏈的抗體。
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