CN111150844B - 抗her2亲合体靶向光敏剂的合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗HER2亲合体靶向光敏剂的合成和应用，光敏剂如通式(Ⅰ)所示，在所述光敏剂中，作为靶向配基的抗HER2亲合体通过具有酸性氨基酸片段的PEG连接部分(Linker)与光敏部分(PS)连接；研究发现，抗HER2亲和体分子偶联的光敏剂分子与抗体偶联的光敏剂分子相同，具有很好的选择性和肿瘤富集能力，并且在一次给药的情况下肿瘤被全部治愈；PS‑Linker‑ZHER2(Ⅰ)。
Description
技术领域
本申请涉及具有肿瘤靶向性的光敏剂、其制备方法及其在肿瘤光动力治疗和肿瘤成像诊 断中的应用。在所述光敏剂中，作为靶向配基的ZHER2通过任选地具有酸性氨基酸片段的聚 乙二醇(PEG)作为连接部分与作为光敏部分焦脱镁叶绿酸a(Pyro)连接。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2)是癌症的重要治疗靶标。它在多种肿瘤中过表达，包括 约25–30％的乳腺癌，20–24％的胃癌和其他癌症，而在正常成人组织中的表达水平最低。HER2 蛋白的过表达可促进肿瘤的生长和转移，并伴有不良的预后。多年来，人们已经成功开发出 了非常有效的针对HER2蛋白的药物作为肿瘤治疗的靶标，尤其是抗体分子，例如曲妥珠单 抗(heceptin赫赛汀)，帕妥珠单抗(pertuzumab)和抗体药物结合物曲妥珠单抗与细胞毒药物 DM1(美登素衍生物)偶联而成的T-DM1，它们已经被广泛使用。由于这些药物的临床应用， HER2阳性肿瘤的临床治疗结果也得到了极大的改善。然而，这些常规抗体药物的临床使用 中仍然存在许多缺点。抗HER2抗体治疗后，大多数患者仍无法完全治愈，而且大量HER2 阳性患者会变得非常虚弱，甚至对这些抗体药物也没有反应。如何开发新的药物分子以进一 步提高靶向HER2的肿瘤的治疗作用具有重要的临床意义。
2011年，Mukeyam等人将抗HER2抗体曲妥珠单抗与光敏剂分子IR700连接，制备了与 抗体偶联的光敏剂分子。在动物模型中，该分子具有理想的肿瘤识别和选择以及理想的肿瘤 富集。在单次剂量与单次光刺激后，该光敏分子可以通过称为光动力疗法(PDT)的方法极 大地重复异种移植肿瘤的生长。基于这种新型的肿瘤典型光敏剂分子的PDT可以大大减少对 正常组织的损伤，并且由于抗体的富集作用还可以增加对肿瘤的杀伤能力，这种新型的具有 高肿瘤选择性的光敏剂为抗HER2阳性肿瘤治疗提供了非常好的新策略，并且为新抗体药物 的设计提供了新概念。目前，它正在三期临床试验中进行测试，并有望在不久的将来被批准 为临床。
然而，在这种类型的抗体缀合的光敏剂分子的临床应用中可能存在一些潜在的问题。抗 体的分子量相对较大，因此对实体瘤的渗透性相对较弱。同时，血液中的抗体分子的半衰期 较长，导致光敏分子在人体内长时间滞留，对皮肤和眼睛产生光毒副作用，患者必须长时间 避光。此外，抗体分子和光敏剂之间的偶联反应是非常复杂的，因为抗体分子具有许多能够 参与偶联反应的官能团，因而得到的总是随机位点缀合的混合物。
此外，由于IR700结构复杂制备相对困难，商业购买价格非常昂贵，而焦脱镁叶绿酸a (Pyro)可以通过几个简单的转化步骤轻松地从叶绿素分子制备，而且其分子结构相对稳定。 因此，我们使用容易获得的Pyro分子作为光敏部分，基于抗体结合策略构建靶向光敏剂分子， 则可以进一步提高制备的便利性。
亲和体分子(Affibody)是一种可以通过人工基因工程获得的亲和体蛋白。与抗体分子相 比，亲和体分子的结构要简单得多，并且分子量要小得多，只有58个氨基酸(约7kDa，比 抗体小20倍)。然而，通过人工基因工程，人们可以轻松获得具有极高亲和力的亲和体分子， 而且获得的亲和体分子不含半胱氨酸残基，因此在分子末端引入一个半胱氨酸，可以实现与 小分子化合物的高特异性偶联。由于这个原因，亲和体分子有时被用来替代抗体分子以执行 其与受体蛋白的亲和结合功能，其中包括一些与HER2具有高结合力的亲和体分子。例如， 针对HER2受体具有约60pM的平衡解离常数的抗HER2亲和体分子ZHER2：2891及其类似 物成为抗体的有用替代物，可作为靶向剂与Tc同位素偶联用于HER2阳性肿瘤的临床诊断， 目前，该偶联物处于二期临床试验中，显示出良好的临床潜力。
本发明将抗HER2亲和体分子ZHER2：2891(简称ZHER2)与光敏基团Pyro偶联来制备靶向HER2的光敏剂分子，并进行了药物在体内外的生物活性评价。研究发现，抗HER2亲和 体分子偶联的光敏剂分子与抗体偶联的光敏剂分子相同，具有很好的选择性和肿瘤富集能力， 并且在一次给药的情况下肿瘤被全部治愈。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗HER2亲合体靶向光敏剂。
本发明的另一个目的是提供一种抗HER2亲合体靶向光敏剂的制备方法。
本发明的技术方案为：
通式(Ⅰ)的光敏剂或其药学上可接受的盐：
PS-Linker-ZHER2
(Ⅰ)
其中Linker可表示为通式(Ⅱ)
(A)n-(L)m-Lys
(Ⅱ)
A表示酸性氨基酸片段；
L表示连接链，其独立地选自如下结构；
-NH-(CH2CH2O)P-CH2CH2-C(O)-
Lys表示
m为1-4的整数；
n为0或1；
p为4-8的整数。
其中所述ZHER2具有如下结构：C端含有一个带有巯基的半胱氨酸
N端和C端分别含有和/或不含有6个氨基酸的His标签。
其中所述光敏部分PS独立地选自Pyro的基团、Ce6的基团、HPPH的基团和Vertoporfin 的基团：
作为优选，所述光敏部分为Pyro的基团，所述Pyro的基团优选具有结构
其中所述酸性氨基酸片段A为谷氨酸片段或天冬氨酸片段；所述谷氨酸片段优选地具有 结构
以及所述天冬氨酸片段优选地具有结构
m优选为1、2、3或4，最优选为2；n优选为1；所述L中的重复单元-CH2CH2O-的个 数p优选为4、5、6、7或8，最优选为6。
制备所述的光敏剂的方法，其包括：
1)使m个连接链L与Lys连接以获得片段Lys-(L)m；
2)任选地使片段Lys-(L)m与酸性氨基酸片段A连接以获得连接部分Linker：Lys-(L)m-(A)n；
3)将连接部分Linker：Lys-(L)m-(A)n与光敏化合物Pyro连接以获得片段Lys-(L)m-(A)n-Pyro；
4)将片段Lys-(L)m-(A)n-Pyro与连接头SMCC连接以获得PS-Linker；
5)将PS-Linker与ZHER2偶联以获得通式(I)的光敏剂；
其中Lys、L、A、m、n、p、ZHER2和PS如上所定义。
所述的光敏剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
所述的光敏剂在制备用于肿瘤成像诊断试剂中的用途。
在本发明中，我们设计并合成出了通过2个PEG片段并且连接一个含有羧酸官能团的谷 氨酸的连接链介导的ZHER2作为靶向配基，Pyro作为光敏部分的光敏剂，并进行了光物理性 质研究以及药物在体内外的生物活性评价。研究发现，该偶联物具有优异的肿瘤特异性富集 和肿瘤细胞杀伤能力,由于连接链引入羧酸基团可以提高药物分子的水溶性，因此也可以将谷 氨酸(Glu)片段用同样带有羧酸基团的天冬氨酸(Asp)替代。
简称为Pyro-Linker-ZHER2，以及对照化合物Pyro-Linker-OH，Pyro和中间体Pyro-Linker 的结构式如下：
本发明通过固相合成和液相合成相结合的方式，以非常简单实用的方式得到了ZHER2靶 向光敏化合物。我们利用三苯基二氯树脂采用Fmoc固相合成多肽的方法合成出了含有2个 PEG片段和一个谷氨酸的氨基酸片段的连接链(Linker)，再与光敏基团Pyro进行偶联。最 后，采用液相反应通过马来酰亚胺接头与半胱氨酸上的巯基偶联得到产物。产物利用HPLC 和SDS-PAGE进行纯度分析，HRMS或MALDI-TOF-MS进行分子量表征。
本发明提供所述光敏化合物的制备方法，其合成路线如附图1所示。
我们进一步研究了其光学特性，引入PEG片段和羧基官能团能够显著提高Pyro的水溶 性。与ZHER2偶联后对其光学特性没有影响。
本发明还提供所述光敏剂在制备治疗肿瘤药物和肿瘤成像诊断试剂中的用途。
通过细胞MTT实验和小动物活体成像实验对偶联物在体内外光动力学活性进行了评价。 我们利用人胃癌NCI-N87细胞系(HER2高表达)，人乳腺导管癌BT474细胞系(HER2高表 达)，人乳腺癌MCF7细胞系(HER2低表达)和人前列腺癌PC3细胞系(HER2低表达)将Pyro-Linker-ZHER2与对照光敏剂Pyro-Linker-OH和Pyro在细胞水平上进行了对比， Pyro-Linker-ZHER2具有很好的选择性和HER2高表达细胞杀伤力。我们利用小动物活体成像系 统研究Pyro-Linker-ZHER2与对照光敏剂Pyro-Linker-OH和Pyro在NCI-N87异种移植肿瘤模型小鼠体内的药物分布随时间变化的过程。Pyro-Linker-ZHER2在ZHER2受体高表达的荷瘤小鼠 体内可以在肿瘤位置达到很好的富集效果，24h后基本清除，与Pyro相比可以实现在肿瘤 部位的富集，与Pyro-Linker-OH相比可以延长在肿瘤部位的富集时间。Pyro-Linker-ZHER2在 血液中的半衰期为49min，与全长抗体作为配基的药物相比缩短了很多，减少了毒副作用。 另外利用NCI-N87异种移植肿瘤模型小鼠对化合物Pyro-Linker-ZHER2进行了体内光动力活性 的研究，在一次给药的情况下，Pyro-Linker-ZHER2组经光照后最终被全部治愈。在整个治疗过 程中，小鼠体重没有明显下降，表明光照和化合物都没有对小鼠引起严重的毒副作用。由此 确定Pyro-Linker-ZHER2在肿瘤光动力治疗和成像诊断领域均显示出了很好的临床应用前景。
附图说明
图1是Pyro-Linker和Pyro-Linker-OH的合成过程示意图；(a)DIPEA，DCM，室温，5h； (b)20％哌啶，DMF，30min；Fmoc-PEG6-CH2CH2COOH，HOBt，HBTU，DIPEA，DMF， 室温，5h；(c)20％哌啶，DMF，30min；Fmoc-PEG6-CH2CH2COOH，HOBt，HBTU，DIPEA， DMF，室温，5h；(d)20％哌啶，DMF，30min；Fmoc-Glu-OtBu，HOBt，HBTU，DIPEA， DMF，室温，5h；(e)20％哌啶，DMF，30min；Pyro-NHS，DIPEA，DMSO，室温，5min； (f)TFA:Tris:H2O＝95:2.5:2.5，室温，1h，Et2O；(g)SMCC，DIPEA，DMF，室温，过夜； (h)SHCH2CH2OH，DIPEA，DMF，室温，4h；
图2是Pyro-Linker-ZHER2和ZHER2的SDS-PAGE分析图，其中图2A为用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE图，图2B为SDS-PAGE的荧光成像图；
图3是Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker和ZHER2的高效液相色谱分析图(图3A)以及Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在PBS溶液中的紫外吸收光谱图(图3B)；
图4是Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在体外不同细胞系上的药物活性评价， 图4A为NCI-N87细胞的药物活性，图4B为BT-474细胞的药物活性，图4C为MCF7细胞的药物活性，图4D为PC3细胞的药物活性；
图5是Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在不同细胞系上暗毒性分析实验和竞 争性抑制实验，图5A为NCI-N87细胞的暗毒性实验，图5B为BT-474细胞的暗毒性实验， 图5C为NCI-N87细胞的竞争性抑制实验，图5D为PC3细胞的竞争性抑制实验；
图6是Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro分别对NCI-N87和PC3细胞的死活 染色实验，图6A为NCI-N87细胞的死活染色图片，图6B为PC3细胞的死活染色图片；
图7是Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker和Pyro分别在NCI-N87和PC3细胞中的选择性 内吞摄取实验；
图8是Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在NCI-N87移植瘤小鼠体内随时间代 谢过程；
图9是Pyro-Linker-ZHER2和Pyro-Linker-OH肿瘤部位结合荧光强度曲线(图9A)以及 Pyro-Linker-ZHER2在小鼠体内的药代动力学曲线(图9B)；
图10是Pyro-Linker-ZHER2对NCI-N87移植瘤小鼠的肿瘤光动力治疗效果，其中图10A 为光动力治疗之后每组选取一只具有代表性的小鼠照片，图10B为光动力治疗之后小鼠肿瘤 曲线照片，图10C为小鼠体重曲线。
具体实施方式
本领域技术人员会理解，下述实施例用于进一步说明本发明但不意味着限制本发明。实 施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品 说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。
缩写语
PDT：光动力治疗；Pyro：焦脱镁叶绿酸a；Lys：赖氨酸；Glu：谷氨酸；Asp：天冬氨酸；Cys：半胱氨酸；His：组氨酸；PEG：聚乙二醇；Et2O：乙醚；Et3N：三乙胺；DIPEA： N,N-二异丙基乙胺；EA：乙酸乙酯；DCM：二氯甲烷；EtOH：乙醇；MeOH：甲醇；DMF： N,N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；HCl：盐酸；NaOH：氢氧化钠；NaHCO3：碳酸 氢钠；TFA：三氟乙酸；Tris：三异丙基硅烷；PIP：哌啶；HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基 脲六氟磷酸酯；HOBt：1-羟基苯并三唑；EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸 盐；NHS：N-羟基丁二酰亚胺；SMCC：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；IPTG： 异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷；TCEP：三羧基乙基膦；Tris：三(羟甲基)氨基甲烷；SDS-PAGE： 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；HPLC：高效液相色谱；HRMS：高分辨质谱； MALDI-TOF-MS：基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪；PBS：磷酸缓冲液；MTT：噻 唑蓝；IC50值：半抑制剂量；NCI-N87：人胃癌细胞；BT474：人乳腺导管瘤细胞；MCF7： 人乳腺癌细胞；PC3：人前列腺癌细胞；SPF：无特定病原体。
实验材料的来源
Pyro购自宁波洞密生物科技有限公司；EDC,NHS,TFA购买自天津希恩思生化科技有限 公司；Glu，Lys，三苯基氯树脂，HATU,HoBt购买自吉尔生化(上海)有限公司；Tris购买自梯希 爱(上海)化成工业发展有限公司；DIEA购买自北京百灵威科技有限公司； Fmoc-PEG6-CH2CH2COOH购买自成都福瑞康生物科技有限公司；CO2天津六方工业气体经销 有限公司；MTT，死活染色试剂盒，异氟烷购自天津百倍生物科技有限公司；其它常规生物 与化学试剂均购买自天津化学试剂经销公司。
实施例1.化学合成
1、简称为Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro化合物的合成
我们首先利用固相的方法合成Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro。合成之前1h先用二氯甲烷对树 脂进行溶胀处理，我们使用的是载量为1.0mmol/g三苯基氯树脂5.0mmol。将 Boc-Lys(Fmoc)-OH(1.0g,1.0mmol)和DIPEA(680.0μL,4.0mmol)溶解于10.0mL DCM中 加入到固相合成器中，室温反应5小时。DCM洗6次，然后将配置封闭液(DCM：MeOH： DIPEA＝17:1:2)，加入到固相合成器中封闭未反应的氯。用含有20％哌啶(PIP)的DMF溶 液脱除Fmoc保护基30分钟，用DMF洗6次。将Fmoc-PEG6-CH2CH2COOH(1.5eq)，缩合 剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq),和 DIEA(4.0eq)，溶于DMF中并加入到固相合成器中，室温反应5小时，DMF洗6次，得到 Lys-PEG。用含有20％哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30分钟，再次将 Fmoc-PEG6-CH2CH2COOH(1.5eq)，缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0 eq)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq),和DIPEA(4.0eq)，溶于DMF中并加入到固相合成器 中，室温反应5小时，DMF洗6次，得到Lys-PEG-PEG。再次用含有20％哌啶(PIP)的DMF 溶液脱除Fmoc保护基30分钟，将Fmoc-Glu-OtBu(1.5eq)，缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基 脲六氟磷酸酯(HBTU)(2.0eq),1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0eq),and DIPEA(4.0eq)溶于DMF 中，加入到固相合成器中室温反应5小时，DMF洗6次，得到Lys-PEG-PEG-Glu。
Pyro-NHS通过液相进行合成：Pyro(534.3mg,1.0mmol),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亚胺盐酸盐(EDC)(1.9g,10.0mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.2g,10.0mmol)加入 到60.0mL DMF中，室温避光反应过夜。加入水，DCM稀释萃取分液，有机相用水洗3次， 饱和食盐水洗，无水硫酸镁(MgSO4)干燥，旋蒸除去DCM得黑色固体(788.0mg)，产物未经纯化直 接用于下一步反应。
Lys-PEG-PEG-Glu用含有20％哌啶(PIP)的DMF溶液脱除Fmoc保护基30min，DMF 洗3次，再用二甲基亚砜(DMSO)洗3次。将合成的Pyro-NHS溶于DMSO中加入到偶联 上Lys-PEG-PEG-Glu的固相合成器中，加入DIPEA(4.0eq)后室温避光反应过夜。DMSO洗6 次，再用DCM洗6次后，加入8.0mL洗脱液(TFA/Tris/H2O＝95:2.5:2.5)室温下洗脱1h。洗 脱液吹走大部分TFA后加无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤三次后室温干燥得到产物 Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro。
2、简称为SMCC-Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro(Pyro-Linker)化合物的合成
Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro溶于DMF中，SMCC(1.1eq)，DIPEA(5.0eq)加入到反应体系中，室温避光反应过夜。无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤三次后真空干燥得到产物SMCC-Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro。收率80％。
3、Pyro-Linker-OH的合成
SMCC-Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro溶于DMF中，巯基乙醇(1.5eq)加入到反应体系中，室温 避光反应4h。无水乙醚进行沉淀，并用无水乙醚洗涤三次后真空干燥得到产物 Pyro-Linker-OH。收率88.3％。
每步反应产物都经纯度检测，纯度均在90％以上。Pyro-Linker-OH分子量表征：：HRMS (ESI+)m/z：1759.9211；[M+H]+,calculated for C88H130N10O25S 1758.8929。
实施例2.ZHER2的表达与偶联
1.蛋白表达
表达ZHER2的质粒通过北京奥克鼎盛生物科技有限公司合成。ZHER2的C端包含一个半胱氨酸(Cys)和六个氨基酸的His标签，N端包含另外一个His标签。所有构建的质粒转化 到BL21感受态细胞中，取甘油管菌种250μL接入500mL LB培养基(含25mg/L卡那霉素) 中，37℃，220转/分，过夜培养。第二天以5％接种量接入摇瓶，18℃，220转/分，培养至 OD600＝0.6～0.8，加入0.7mM IPTG诱导表达4～5小时，12000rpm/min 4℃离心20min， 弃上清，菌体-20℃冻存)，菌体称重。加入Tris缓冲盐水(500mM NaCl和50mM of Tris-HCl， pH＝8.0,4℃)80mL，1000bar高压破碎3～4次至菌液透亮，12000rpm/min 4℃离心40min， 取上清，过0.22μm的滤膜。通过固定的金属离子亲和色谱法纯化蛋白质，将Ni-NTA树脂与 蛋白在4℃下孵育1小时，然后通过咪唑浓度梯度增加(5mM，10mM，20mM，50mM和 300mM)进行洗脱，通过超微量分光光度计(Nanodrop)检测洗脱液中蛋白质的浓度。纯 化的ZHER2通过截留分子量为3500Da透析膜透析四次，透析液为pH＝7.0磷酸盐缓冲液。
2.偶联
在透析后的ZHER2中加入TCEP(100mM，4.0eq)还原二硫键2h，然后通过阳离子交换柱 除掉过量的TCEP，SMCC-Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro溶于DMSO(10mM,1.0eq)加入到ZHER2中，室温避光反应过夜，加入巯基乙醇(1.0eq)终止反应，然后用PBS超滤。如图2所示，产 物通过SDS-PAGE分析，通过荧光成像检测光敏剂，第一泳道的ZHER2未见荧光，而第二泳 道连接产物可见明显的荧光，再通过考马斯亮蓝染色检测蛋白质，证明光敏基团与ZHER2的 偶联。另外，通过HPLC分析也可证明，ZHER2(21min)与SMCC-Lys-PEG-PEG-Glu-Pyro (45min)的吸收峰消失，出现新的产物峰(35min)。
分子量表征：ZHER2，MALDI-TOF m/z，calculated 9532.1Da，found 9526.8Da；Pyro-Linker-ZHER2，MALDI-TOF m/z，calculated 11214.0Da，found 11207.2Da。
实施例3.UV-Vis光谱性质
我们利用日本岛津UV-1900紫外分光光度计对Pyro-Linker-ZHER2与对照光敏剂Pyro-Linker-OH和Pyro进行紫外吸收光谱的测定。样品配置成浓度为10μM的溶液，溶剂为PBS溶液(其中各种不同溶剂中DMSO的含量不超过1％)。室温条件下，扫描波长范围从400nm到800nm，分辨率为0.5nm，扫描速率为每分钟600nm。
与没有偶联Linker和ZHER2的Pyro相比，Pyro-Linker-ZHER2与Pyro-Linker-OH都表现出 了很好的水溶性。因此，我们进一步研究了这两个化合物在PBS溶液中的光学特性，如附图 3所示，Pyro在PBS溶液中发生了聚集，吸收峰变宽。然而，Pyro-Linker-ZHER2与Pyro-Linker-OH 在PBS溶液的光谱图Q带都有明显的吸收峰，吸收波长约为λ＝680nm，表现出了典型的非 聚集形式，严格符合Beer–Lambert定律。以上结果表明，引入linker连接链和羧基官能团能 够显著提高Pyro的水溶性，并帮助解决Pyro在水溶液中的聚集问题。由于只有消除聚集的 光敏剂才有光活性，因此，光敏剂消除聚集在生物应用中非常重要。
实施例4.细胞水平上的药物活性的评价
1.细胞的复苏，培养：
从液氮中取出人胃癌NCI-N87细胞系(HER2高表达)，人乳腺导管癌BT474细胞系(HER2高表达)，人乳腺癌MCF7细胞系(HER2低表达)和人前列腺癌PC3细胞系(HER2 低表达)，置于37℃水浴锅中迅速解冻，然后1000rpm/min，离心5min，弃上清，将NCI-N87 细胞和BT474细胞加入预热的RPMI 1640完全培养基中(基础培养基中添加10％的血清和 1％的抗生素)，MCF7细胞和PC3细胞加入DMEM完全培养基中，置于5％CO2，37℃培养 箱中培养过夜。第二天更换培养基。继续培养至细胞铺满皿底。传代培养2-3次。
2.Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在不同细胞系水平上药物活性的评价及暗毒 性分析(附图4-5，表1)
表1 Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在体外不同细胞系上的药物活性的数据 分析；
将NCI-N87细胞，BT474细胞，MCF7细胞及PC3细胞分别按照1×104个细胞每孔的数目铺于96孔板中，放置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中培养过夜。将上层清液去除后，每孔加入用新鲜的培养基配置的含不同药物浓度的Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro， 将培养板置于细胞培养箱中培养4h，将细胞培养板取出，再置于660nm的光源下，用660nm 光源在距离培养板约2cm处给予40mW/cm2,10min的光辐射剂量，在细胞培养箱中继续过 夜培养，每孔加入10μL MTT(5mg/mL PBS溶液)，与细胞共同孵育4h后，去除细胞培养液，每孔用100μL的二甲基亚砜置换培养基，于多功能酶联免疫仪中测定490nm的吸光度，并根据吸光度计算细胞的存活率，然后绘制细胞存活率和加药浓度之间关系的药物活力抑制 曲线，并计算相应的半抑制浓度(IC50值)。每个实验组做5个孔，数据表示为mean±SEM。每个实验组做5个孔，数据表示为mean±SEM。
暗毒性是指在没有光辐射激发光敏剂的情况下，光敏剂会对细胞产生的毒性。作为理想 的光敏剂应无明显的无激发暗毒性。我们使用体外细胞活力抑制实验来评估Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro的暗毒性水平。按照上述方法将五种细胞铺于96 孔板中培养16h，分别加入相应浓度的Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro。将培养 板置于细胞培养箱中培养4h，用新鲜培养基更换含药物的培养基，将培养基在避光条件下过 夜。通过上述细胞活性试验，使用MTT法测定黑暗条件下药物对细胞活力的影响。
实验结果与结论：如图3和表1所示，Pyro分子具有很强的光动力活性，可以在浓度很 低的条件下杀死细胞，但是对所有细胞系没有选择性，其半抑制浓度(IC50)值分别为47.9nM (NCI-N87细胞)，60.7nM(BT474细胞)，25.8nM(MCF7细胞)和56.nM(PC3细胞)。Pyro-linker-OH的光动力学活性显着降低，对这些细胞的IC50值分别为855.7nM(NCI-N87细胞)，446.1nM(BT474细胞)，426.2nM(MCF7细胞)和813.2nM(PC3细胞)。PEG 链的修饰会降低药物分子对细胞膜的粘附能力以及细胞对药物分子的摄取，这可能是导致其 光动力活性降低的原因。相比之下，Pyro-Linker-ZHER2具有很高的细胞选择性和光动力活性。 在给予24J/cm2的光照下，对HER2阳性的NCI-N87和BT474细胞的IC50值分别为23.0nM 和12.5nM，而对HER2阴性的PC3和MCF7的IC50值均高于1000nM。在细胞水平，HER2 阳性细胞与阴性细胞的杀伤力显示出超过50倍的选择性。这些数据表明，Pyro-Linker-ZHER2在光动力疗法方面具有非常理想的性能。
在相同的药物浓度范围内，Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在没有光照的情 况下对HER2高表达的细胞系均没有明显的细胞毒性，证明Pyro-Linker-ZHER2在没有光的情 况下没有毒副作用。
3.Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro分别与Her2蛋白对NCI-N87和PC3细胞活 性的竞争性抑制实验(附图5)
为进一步验证ZHER2配基在Pyro-Linker-ZHER2的药物活性中发挥的重要作用，我们按照上 述的方法将NCI-N87和PC3细胞以1×104/孔的细胞数铺于96孔板中，放置于37℃，5％的 二氧化碳培养箱中培养过夜。将上层清液去除后，每孔先加入浓度为10μM的ZHER2与细胞 共孵育4h，再加入用新鲜培养基配置的含不同药物浓度的Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH 和Pyro，将培养板置于细胞培养箱中再培养4h，将细胞培养板取出，再置于660nm的光源 下，同样给予40mW/cm2,10min的光辐射剂量，在细胞培养箱中继续过夜培养，使用MTT 法测定加入ZHER2封闭后药物对细胞杀伤力的影响。
实验结果与结论：如图5所示，ZHER2进行封闭处理后，Pyro-Linker-ZHER2分子对HER2阳性NCI-N87细胞的光动力学活性大大降低，在光照处理后，1.6μM的药物浓度下，几乎没有细胞死亡。与没有进行封闭时(IC50值为23nM)相比，HER2阳性NCI-N87细胞杀伤力 至少降低了50倍。但是，Pyro对NCI-N87细胞的杀伤力与封闭没有显着相关性，封闭后的 IC50值为90nM，与没有封闭的IC50值无显着差异(47.9nM)。对于阴性的PC3细胞，封 闭与不封闭都不会对Pyro-Linker-ZHER2和Pyro的光动力活性产生影响。这些结果清楚地表明， Pyro-Linker-ZHER2的光动力活性与细胞表面的HER2直接相关，这也验证了我们分子设计的正 确性。
4.Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro分别对NCI-N87和PC3细胞的死活染色实 验(附图6)
Pyro-Linker-ZHER2的光动力学活性和靶向选择性也可以通过细胞活/死染色进行观察。将 NCI-N87细胞和PC3细胞分别按照1×104个细胞每孔的数目铺于96孔板中，放置于37℃，5％ 的二氧化碳培养箱中培养过夜。将上层清液去除后，每孔加入用新鲜的培养基配置的含不同 药物浓度(0nM，30nM，125nM，500nM)的Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro， 将培养板置于细胞培养箱中培养4h，将细胞培养板取出，再置于660nm的光源下，用660nm 光源在距离培养板约2cm处给予40mW/cm2,10min的光辐射剂量，在细胞培养箱中继续过 夜培养。除去含药物的培养基，并用PBS洗1遍，每孔加入100μL死活染色试剂(CaledinAM: Ethidium homodimer-1(EthD-1):PBS＝1:4:1000)，放置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中 孵育15min，再用荧光显微镜观察。
实验结果与结论：如图6所示，Pyro进行光动力处理后，对HER2阳性的NCI-N87细胞和HER2阴性的PC3表现出相似的结果。对于两种细胞系，大多数细胞在30nM浓度下均显 示绿色活细胞信号，而在125nM浓度下仅显示红色死细胞信号。结果表明，Pyro具有显着 的光动力活性，但对HER2阳性或阴性细胞没有选择。Pyro-linker-OH对于这两种细胞系，细 胞在浓度为125nM时基本上显示活细胞的绿色信号，而即使在浓度高达500nM时也仅显示 少量死细胞的信号，而且在HER2阳性和阴性细胞之间的差异并不明显。与Pyro和 Pyro-Linker-OH不同，Pyro-Linker-ZHER2显示出非常理想的选择性和光动力活性。 Pyro-Linker-ZHER2即使在较低浓度30nM下，HER2阳性的NCI-N87细胞也显示出大量的红 色细胞死亡的信号，而HER2阴性的PC3细胞当浓度增加到500nM时仍然为绿色细胞存活 的信号。这些结果清楚地表明，Pyro-Linker-ZHER2具有出色的光动力学活性和对HER2阳性和 阴性细胞的理想选择性。
5.Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro分别在NCI-N87和PC3细胞系中的选择性 内吞摄取实验(附图7)
使用流式细胞仪也可以检测Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro对HER2的靶向 选择性。将NCI-N87细胞和PC3细胞分别按照1×105个细胞每孔的数目铺于12孔板中，放 置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中培养过夜。将上层清液去除后，每孔加入用新鲜的培养 基配置的含不同药物浓度(0nM，10nM，100nM)的Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro，在细胞培养箱中继续避光培养4h。除去含药物的培养基，并用PBS洗2遍，每孔加 入500μL胰酶37℃消化3～5min，分别转移至流式管中，4℃1000rpm/min离心3min，用 200μLPBS重悬细胞，用BD FACSCalibur流式细胞仪检测每管细胞的荧光强度(λex＝635 nm；λem＝645-677nm)。
实验结果与结论：如图7所示，在10nM的较低浓度下，NCI-N87和PC3两种细胞对Pyro 基本都没有摄取，荧光强度非常弱，在100nM的高浓度下，两个细胞都可以大量摄取Pyro， 显示出非常高的荧光强度。相比，在100nM的高浓度下，Pyro-Linker-OH在两个细胞系中都 没有显示出明显的摄取。但是，Pyro-Linker-ZHER2显示出明显的细胞选择性。在浓度为100nM 时，Pyro-Linker-ZHER2可以被HER2阳性的NCI-N87细胞明显摄取，而HER2阴性的PC3细 胞基本上却仅有与背景相同的荧光强度。Pyro是一种高度疏水的化合物，它可以粘附在细胞 膜上自由进入细胞内部，因此对HER2受体的表达没有选择性。对于Pyro-Linker-OH，由于 高度亲水的PEG链的修饰，大大降低了细胞膜的粘附性和细胞摄取，从而也降低了其光动力 学活性。与ZHER2抗体进一步偶联后，Pyro-Linker-ZHER2对HER2具有非常理想的选择性，并 且可以明显区分HER2阳性和阴性细胞，这对于PDT治疗期间减少对正常组织的副作用非常 有益。
实施例5.Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在小鼠体内的分布特点及对肿瘤的治 疗效果的评价。
1.小鼠皮下肿瘤模型的建立
本发明中使用的是人胃癌NCI-N87细胞系建立的小鼠的皮下肿瘤模型。所用小鼠是我们 从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的6～8周龄的雌性BALB/c裸鼠，并一直饲养于 SPF级的环境中。实验具体方法如下：首先按照小鼠的数量计算所需的肿瘤细胞的数量，合 理的大量培养相应的肿瘤细胞。在本实验中，各肿瘤模型每只小鼠须3×106个细胞。待细胞 长到培养皿底板80％左右空间后，把细胞用与传代类似的方式消化下来，在预冷至4℃的离 心机中1000rpm/min离心3分钟。吸弃上清，细胞用PBS悬浮均匀后，吸取10μL置于细胞 计数板中计数，根据计数结果配制成细胞悬液，按每只小鼠皮下注射100μL的量计算。
小鼠皮下肿瘤接种方法：将小鼠用15％异氟烷麻醉后，在小鼠的背部右侧用75％酒精 擦拭消毒，然后用注射器吸取100μL(3×106个细胞)肿瘤细胞悬液后，将细胞打入小鼠的 皮下，将针尖倒转，拔出小鼠体内，并做好标记。
2.Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro在NCI-N87移植瘤小鼠体内随时间代谢过 程(附图8)
由于光敏药物的荧光特性，为此我们可以很容易利用Xenogen IVIS小动物活体成像系统 研究光敏药物在体内的分布情况。首先构建HER2阳性的小鼠NCI-N87肿瘤模型，待小鼠的 皮下瘤长到200mm3左右时，首先，将小鼠用15％异氟烷短时麻醉后，放入到XenogenIVIS 小动物活体成像仪中，用λex＝640nm；λem＝695-770nm，曝光时间为5s的参数扫描各组 小鼠，将此时小鼠肿瘤部位和身体其余部位的自发荧光值作为背景扣除。然后将小鼠分别通 过尾静脉注射20nmol Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro，并由注射时间点算起，用 活体成像系统扫描给药后1h，2h，3h，4h，6h，9h，24h的药物分布情况。
实验结果与结论：Pyro-Linker-ZHER2，Pyro-Linker-OH和Pyro通过尾静脉以20nmol/小 鼠的剂量注射。如图8所示，Pyro在整个观察期间(注射后1h至24h)，在肿瘤部位未检 测到荧光富集信号，但在肝脏和肾脏中却有强烈的荧光信号。Pyro-Linker-OH分子具有一定 的肿瘤富集能力，注射后一小时可以在肿瘤组织中检测到很强的荧光信号，肝脏中也有很强 的荧光信号。但是，肿瘤和肝组织中的荧光信号迅速衰减，注射后4h仅有非常弱的荧光信 号。Pyro-Linker-OH分子中PEG链的修饰赋予其肿瘤富集能力，但是，却大大降低了Pyro 的光动力学活性。相比之下，Pyro-Linker-ZHER2具有非常理想的肿瘤富集能力，注射后1h内 开始在肿瘤部位积聚，但此时肿瘤组织，肝组织和肾组织中的荧光信号明显强于周围组织。 随着时间的延长，肝脏和肾脏中的荧光迅速下降，而肿瘤区域仍保持非常强的荧光强度。在 注射后4至9h，肿瘤区域几乎是唯一具有强荧光的部位，显示出肿瘤与正常组织之间非常明 显的对比。在此之后，肿瘤的荧光信号开始衰减，并且在注射后24h仅保留了微量的荧光信 号。Pyro-Linker-ZHER2通过与NCI-N87肿瘤细胞表面的HER2受体结合，从而在HER2阳性 NCI-N87肿瘤中具有比Pyro和Pyro-Linker-OH更强的靶向富集能力。从上述结果还可以看出， 缀合物中PEG链的修饰显然有助于肿瘤部位中的富集，与靶向亲和配体偶联和用PEG链修 饰的协同作用使Pyro-Linker-ZHER2具有非常理想的肿瘤富集能力。
3.Pyro-Linker-ZHER2在NCI-N87移植瘤小鼠体内随时间药物在血液中的代谢情况(附图9)
在验证了Pyro-Linker-ZHER2的体内特异性肿瘤富集之后，我们进一步评估了该分子在小 鼠循环系统中的代谢清除特性。将20nmol Pyro-Linker-ZHER2通过尾静脉注射给予雌性BALB /c小鼠(n＝3小鼠)。定期收集血液(3min，10min，30min，1h，2h，4h，6h，24h)， 并使用BioTek Cytation/5酶标仪通过测量荧光定量结合血清的Pyro-Linker-ZHER2。药物注射 后3min时，认为药物在血液中含量为100％，不同时间点血清结合Pyro-Linker-ZHER2的荧光 百分比相对于时间作图，并使用GraphPad Prism5软件计算药物在血液中的半衰期。
实验结果与结论：全长抗体在血液中的半衰期可能长达一到两周，其从循环系统中完全 代谢需要很长时间，体内长期保留的光敏分子可能对皮肤和眼睛产生光毒副作用。相比之下， Pyro-Linker-ZHER2分子的血液半衰期仅为49min，多余的光敏剂分子可以从血液中快速代谢， 这有利于大大减少对皮肤和眼睛的光毒副作用，减少患者避光的时间。
4.Pyro-Linker-ZHER2对NCI-N87移植瘤小鼠的肿瘤光动力治疗效果(附图10)
我们使用NCI-N87肿瘤模型对Pyro-Linker-ZHER2的治疗效果进行研究。
3×106个NCI-N87细胞皮下接种于BALB/c裸鼠的背部右侧，大约14天后，小鼠的肿瘤 体积达到约100mm3，小鼠被随机分为2组：(1)治疗组：20nmol Pyro-Linker-ZHER2(2)对照组：PBS，每组4只小鼠，分别给予光照能量为180J/cm2(200mW/cm2，15min)，根据 上述活体成像结果，Pyro-Linker-Her2在给药后4h在肿瘤中的富集效果非常好，且在肝脏组 织或肿瘤周围组织中的含量较低，因此选择小鼠光动力治疗的照射时间点为尾静脉给药后4 h。每三天用游标卡尺记录小鼠肿瘤的体积变化，并记录小鼠的体重变化，当小鼠的肿瘤体积 达到1500mm3时，小鼠被认为死亡并停止记录。小鼠持续观察至40天。小鼠的肿瘤体积计 算公式为：肿瘤体积＝长×宽2×0.5。
实验结果与结论：如图10A和B，在Pyro-Linker-ZHER2光动力治疗后，小鼠肿瘤部位产 生炎症和水肿。两天后，水肿减轻，肿瘤部位结疤，肿瘤体积开始缩小。两周后，肿瘤完全消失。连续观察至40天未发现复发。Pyro-Linker-ZHER2有望仅用一次PDT治疗就能完全消除移植的肿瘤，这种超强的治疗效果，一方面可能与该分子的理想特异性肿瘤富集能力有关， 另一方面与该分子的小尺寸具有良好的肿瘤通透性有关，这将进一步增加肿瘤深部的光敏剂 浓度。然而，在对照组中，PDT后肿瘤部位没有明显变化，光照后肿瘤仍迅速生长，在18-20 天左右肿瘤体积达到1000mm3以上。在整个治疗过程中，我们还监测了两组小鼠的体重变 化，如图10C所示，Pyro-Linker-ZHER2组的体重在治疗后3-4天内有所降低，然后在治疗后约 7-8天迅速增加至正常体重。PDT治疗会在肿瘤部位产生水肿，可能对身体产生一定程度的 炎症作用，从而导致体重减轻，但是下降并不严重，很快便可恢复。此外，从另一个角度来 看，PDT产生的炎症反应可以刺激机体的抗肿瘤免疫力，这可能有助于肿瘤治疗。对于对照 组，小鼠的体重没有明显变化，表明光对小鼠的没有影响。
综上所述Pyro-Linker-ZHER2在肿瘤光动力治疗和成像诊断领域均显示出了很好的临床应 用前景。
上述对本发明中涉及的一般性描述和对其具体实施方式的描述不应理解为是对该发明 技术方案构成的限制。本领域所属技术人员根据本发明，在不违背所涉及的发明构成要素的 前提下，对上述一般性描述或/和具体实施方式(包括实施例)中公开的技术特征进行增加， 减少或组合，形成属于所属发明的其它的技术方案，同样在本发明的保护范围。本发明的全 部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (7)
1.通式(Ⅰ)的光敏剂或其药学上可接受的盐：
PS-Linker-ZHER2
(Ⅰ)
其中Linker可表示为通式(Ⅱ)
(A)n-(L)m-Lys
(Ⅱ)
A表示酸性氨基酸片段；
L表示连接链，其独立地选自如下结构；
-NH-(CH2CH2O)P-CH2CH2-C(O)-
Lys表示
m为1-4的整数；
n为1；
p为4-8的整数；
所述PS为Pyro的基团，所述Pyro的基团具有结构
所述ZHER2 C端含有一个带有巯基的半胱氨酸
所述Lys-(L)m-(A)n与光敏化合物Pyro连接以获得片段Lys-(L)m-(A)n-Pyro，片段Lys-(L)m-(A)n-Pyro与连接头SMCC连接以获得PS-Linker，将PS-Linker与ZHER2偶联获得通式(I)的光敏剂。
2.如权利要求1所述的光敏剂，其特征在于，其中所述ZHER2具有如下结构：N端和C端分别含有和/或不含有6个氨基酸的His标签。
3.如权利要求1所述的光敏剂，其中所述酸性氨基酸片段A为谷氨酸片段或天冬氨酸片段；所述谷氨酸片段具有结构
以及所述天冬氨酸片段具有结构
4.如权利要求1所述的光敏剂，m为2；所述L中的重复单元-CH2CH2O-的个数p为6。
5.制备权利要求1-4中任一项所述的光敏剂的方法，其包括：
1)使m个连接链L与Lys连接以获得片段Lys-(L)m；
2)使片段Lys-(L)m与酸性氨基酸片段A连接以获得连接部分Linker：Lys-(L)m-(A)n；
3)将连接部分Linker：Lys-(L)m-(A)n与光敏化合物Pyro连接以获得片段Lys-(L)m-(A)n-Pyro；
4)将片段Lys-(L)m-(A)n-Pyro与连接头SMCC连接以获得PS-Linker；
5)将PS-Linker与ZHER2偶联以获得通式(I)的光敏剂；
其中Lys、L、A、m、n、p、ZHER2和PS如权利要求1-4中任一项所定义。
6.权利要求1-4中任一项所述的光敏剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
7.权利要求1-4中任一项所述的光敏剂在制备用于肿瘤成像诊断试剂中的用途。
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