CN110251695A - 一种靶向her2的放射性配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有HER2靶向功能的多肽化合物，它是由HER2亲合体和双功能螯合剂通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met‑Val‑Lys；所述多肽化合物结构通式如下式(Ⅰ)所示，其中，R是HER2亲合体分子，X是双功能螯合剂基团。本发明还提供以所述多肽化合物为配体的靶向HER2的放射性标记配合物。本发明所述的放射性标记配合物可作为放射性诊断探针用于乳腺癌HER2受体的评价，该探针可在保持肿瘤摄取不变的情况下，降低肾浓聚，从而提高肿瘤的靶与非靶比，同时降低对肾的辐射剂量。本发明还提供所述多肽化合物和放射性标记配合物的制备方法、及其在制备用于人或动物的HER2阳性乳腺癌放射性诊疗探针中的应用。

Description

一种靶向HER2的放射性配合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种放射性配合物，具体涉及一种靶向HER2的放射性配合物、其制备方法以及其作为诊疗探针的应用。
背景技术
根据国际癌症研究中心的数据显示，2012年世界乳腺癌的年龄标化发病率(43.1/10万人)位列女性癌症之首，遥遥领先于位列第二的结直肠癌(14.3/10万人)，占女性新发肿瘤的35.3％，死亡人数占女性所有癌症死亡人数的20.8％。中国国家癌症中心数据也显示，2015年乳腺癌依然是女性发病率最高的癌种，也是仅次于肺癌的女性癌症死亡的第二大凶手。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题，而提高乳腺癌疗效的关键在于早发现、早诊断和早治疗。
正电子发射计算机断层扫描(PET)是一种功能显像技术，它可以无创地、实时地提供全身功能、代谢、受体等方面的影像信息，具有非常高的灵敏度和特异性。PET/CT将PET的高灵敏度、高特异性与CT的高分辨率结合起来，成为功能显像和解剖显像的集大成者，被广泛用于肿瘤的早期诊断。
人类表皮生长因子受体-2(HER2)是络氨酸激酶家族中四个成员之一，其在约20-30％的乳腺癌患者中过表达，与肿瘤细胞恶性程度、疾病进展速度、复发和转移难易程度以及预后等密切相关，是乳腺癌诊断与治疗的重要靶标。亲和体(Affibody)是一种衍生于葡萄球菌A的人工蛋白质分子，其对靶点的亲和力可与抗体相比拟，除此之外，它还具有许多优势：可通过体外筛选获得，制备简单，易于化学修饰，分子量小、组织穿透性强，血浆清除率高，理化稳定性好等。优异的生物化学性质使得Affibody在靶向诊断与治疗领域具有重要用途。ZHER2:2891是HER2靶向的第二代Affibody，与上一代Affibody相比，其亲水性更强、热稳定性更高。一项以68Ga-ZHER2:2891(68Ga-ABY-025)PET评价转移性乳腺癌的临床试验显示，病灶的SUV与HER2的表达程度正相关，HER2阳性病灶的SUV比HER2阴性病灶的SUV高5倍。鉴于该显像剂对转移灶中HER2表达量的准确评价，16个受试者中有3人因此改变了治疗方案。虽然68Ga-ABY-025肿瘤显像效果极佳，但是由于Affibody在体内主要经肾排泄且代谢产物可经由肾小管重吸收，致使放射性在肾中的浓聚异常高，且滞留时间特别长。高肾本底一方面不利于肾周围转移灶的检出，另一方面增加了病人受到的辐射，成为放射性Affibody临床应用的主要限制因素。
因此，有必要研发一种新型的放射性诊疗探针，在保持肿瘤摄取不变的同时能够显著降低在肾中的放射性浓聚，从而降低病人在核素诊疗过程中受到的不必要的辐射剂量。
发明内容
鉴于上述技术背景，本发明的首要目的在于提供一种可降低肾放射性摄取的核素诊断探针。
本发明的另一目的在于提供制备所述核素诊断探针的方法。
本发明的再一目的是提供所述的探针在人或动物的HER2阳性乳腺癌放射性诊疗中的应用。
为了实现上述首要目的，本发明首先提供一种具有HER2靶向功能的多肽化合物，它是由HER2亲合体和双功能螯合剂通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met-Val-Lys；所述多肽化合物结构通式如下式(Ⅰ)所示，其中，R是HER2亲合体分子，X是双功能螯合剂基团：
本发明所述的方案中，所述的HER2亲合体可以是现有技术中的各种可靶向HER2的人工蛋白质分子；优选靶向分子ZHER2:2891、ZHER2:2395或ZHER2:342。本发明最优选的HER2亲合体是ZHER2:2891，其序列为NH2-AEAKYAKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPKC-COOH(参见序列表SEQID NO.1所示)；
因此，所述式(I)中的R优选ZHER2:2891、ZHER2:2395或ZHER2:342；最优选如式(Ⅱ)所示的ZHER2:2891分子结构：
本发明所述的方案中，所述的双功能螯合剂可以是现有技术中的各种可用于螯合放射性核素的双功能连接剂；本发明优选NOTA-NCS、NOTA-NHS、DOTA-NCS或DOTA-NHS。本发明最优选的双功能螯合剂是NOTA-NCS。
因此，所述式(I)中的X优选NOTA-NCS、NOTA-NHS、DOTA-NCS或DOTA-NHS；最优选结构如式(Ⅲ)所示的NOTA-NCS；
本发明最优选的一个实施方式中，所述的多肽化合物是由ZHER2:2891和NOTA-NCS通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met-Val-Lys；所述多肽化合物结构如式(IV)所示；该化合物记作化合物4：
本发明最优选的另一个实施方式中，所述的多肽化合物是由ZHER2:2891和DOTA-NCS通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met-Val-Lys；所述多肽化合物结构如式(V)所示；该化合物记作化合物6：
本发明所述的多肽化合物，由于其结构中含有用于靶向HER2受体的亲合体结构和用于鳌合放射性核素的双功能螯合剂结构，因此可以作为HER2阳性乳腺癌靶向的核素诊疗探针前体。
中性内肽酶(Neutral endopeptidase，NEP)是一种广泛存在于肾刷状缘的肽酶，其可以选择性地从N端剪切疏水性的氨基酸。基于此，本发明人设计并合成了NEP的酶解底物甲硫氨酸-缬氨酸-赖氨酸(Met-Val-Lys)，并将其插入到双功能螯合剂与HER2亲合体之间得到本发明所述的多肽化合物，如此NEP将会在Met与Val之间进行切割，从而释放螯合剂-Met。螯合剂-Met不能被肾小管重吸收，因而很快到达膀胱被清除体外。
因此，本发明所述的多肽化合物作为前体被放射性核素标记后具有良好的HER2靶向且可以有效降低肾中的放射性浓聚与滞留，可以作为HER2阳性乳腺癌核素诊疗的探针。
本发明还提供一种制备所述多肽化合物的方法，合成路线如下：
如上述合成路线所示，所述制备方法具体包括以下步骤：
(a)将保护的赖氨酸与2-氯三苯基氯树脂以1～1.5:1的摩尔比混合，在N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)作用下，将保护的赖氨酸连接到树脂上；
(b)在步骤a)所得产物的基础上，继续连接氨基酸Val和Boc-Met，得到第二步产物；
(c)步骤(b)得到的第二步产物在水合肼的作用下脱去保护剂Dde，得到第三步产物；
(d)步骤(c)得到的第三步产物在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)的作用下从树脂上切割下来，得到第四步产物；
(e)步骤(d)得到的第四步产物在三乙胺的作用下与3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到第五步反应产物；
(f)步骤(e)得到的第五步产物在三氟乙酸(TFA)条件下脱去保护基团Boc，得到第六步反应产物；
(g)步骤(f)得到的第六步产物在DIPEA作用下，与双功能螯合剂反应，得到第七步产物；
(h)步骤(g)得到的第七步产物在PBS中与HER2亲合体反应，得到本发明所述的多肽化合物。
本发明所述的方案中，步骤(g)所述的双功能螯合剂可以是现有技术中的各种可用于螯合放射性核素的双功能连接剂；本发明优选NOTA-NCS、NOTA-NHS、DOTA-NCS或DOTA-NHS；最优选NOTA-NCS。
本发明所述的方案中，步骤(h)所述的HER2亲合体可以是现有技术中的各种可靶向HER2的人工蛋白质分子；优选靶向分子ZHER2:2891、ZHER2:2395或ZHER2:342；最优选ZHER2:2891。
在此基础上，本发明进一步提供一种靶向HER2的放射性标记配合物，它由本发明所述的多肽化合物为配体经放射性核素标记得到。所述的放射性标记配合物可以作为新型的HER2阳性乳腺癌放射性诊疗探针，即可以作为PET影像诊断探针或放射性核素治疗探针。
本发明所述的放射性标记配合物中，所述的放射性核素可以选自正电子核素18F、68Ga、64Cu、62Cu、86Y或89Zr中的任意一种；优选18F、68Ga、64Cu中的任意一种。
本发明所述的放射性标记配合物可以通过含放射性核素的化合物与本发明所述的多肽化合物按照现有的多种标记方法制备得到；本发明优选的标记方法为下述的湿法或冻干法：
湿法标记方案，包括：将适量本发明所述的多肽化合物溶于缓冲溶液或去离子水中；在所得溶液中加入放射性核素溶液，密闭反应5-40min，即生成放射性核素标记的配合物；
或者，冻干法标记方案，包括：将适量本发明所述的多肽化合物溶于缓冲溶液或去离子水中；将所得溶液经无菌过滤后，分装于容器中，经冷冻干燥后加塞密封，得到冻干药盒；向所述冻干药盒中加入适量乙酸溶液或缓冲液溶解，再加入相应的放射性核素溶液，密闭反应5-40min，即生成放射性核素标记的配合物。其中，所述的分装用容器优选为冻存管或管制抗生素瓶。还可以根据药盒冻干粉成型情况选择在药盒中增加赋形剂，比如甘露醇、抗坏血酸等，并通过调节本发明所述的多肽化合物及赋形剂的用量，使药盒成型达到最佳。
所述的湿法标记方案和冻干标记方案得到的产物均可经常规处理(如经色谱分离纯化、旋蒸除去溶剂、以PBS或水或生理盐水溶解剩余物、无菌过滤等)进一步制成注射液。
本发明一种优选的所述放射性标记配合物制备方法，是68Ga的湿法标记法，包括：将本发明所述的化合物4溶于缓冲溶液或去离子水中；在其中加入新鲜淋洗得到的68GaCl3盐酸溶液，密闭37℃反应5-40min，冷却；加水稀释反应液后经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化，以缓冲液或水冲洗色谱柱以除去未反应的68Ga离子，以盐酸乙醇溶液或乙醇溶液淋洗，再经生理盐水或PBS稀释后无菌过滤，即得到结构如式(VI)所述的68Ga标记的配合物的注射液；
其中R是ZHER2:2891分子，结构如式(II)所示。
本发明另一种优选的所述放射性标记配合物制备方法，是18F冻干法标记法，包括：将本发明所述的化合物4和氯化铝溶于缓冲液中，所得溶液经无菌过滤后分装于冻存管中，经冷冻干燥后密封得到冻干药盒；向冻干药盒中加入适量乙酸溶液或缓冲溶液溶解，再加入乙腈或乙醇和新鲜制得的18F离子水溶液，密闭70-120℃反应5-30min，冷却；加水稀释反应液后经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化，以缓冲液或水冲洗色谱柱以除去未反应的18F离子，以盐酸乙醇溶液或乙醇溶液淋洗，再经生理盐水或PBS稀释后无菌过滤得到结构如下式(VII)所示的18F标记的配合物的注射液；
其中R是ZHER2:2891分子，结构如式(II)所示。
上述方法中，所述的缓冲溶液为稳定反应液pH的物质，可以为醋酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、碳酸盐或磷酸盐中的任意一种或两种以上的混合物。
本发明还提供所述的放射性标记配合物在制备用于人或动物的HER2阳性乳腺癌放射性诊疗探针中的应用。
与现有技术相比，本发明所述的具有HER2靶向的放射性配合物作为PET显像探针或放射性核素治疗探针，应用于人或动物时不仅具有优异的显像或治疗效果，同时可以显著地降低肾脏的放射性浓聚与滞留，具有非常高的靶/非靶比值，极大地降低了应用于人或动物时的辐射剂量，更加安全有效，具有极高的临床推广价值。
附图说明
图1为实施例1制备的化合物4的HPLC分析图及LC-MS图。
图2为实施例2制备的化合物6的HPLC分析图及LC-MS图。
图3为实施例4制备的化合物7的HPLC分析图(放射性检测)，及其在PBS及鼠血清中放置2h的HPLC分析图(放射性检测)。
图4为实施例4制备的化合物7在荷SKOV-3瘤裸鼠体内的PET显像图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例和应用例来进一步说明本发明：其中合成步骤中所使用的化学物质均为现有物质实施例或市售商品。
实施例1
制备一种具有HER2靶向功能的多肽化合物，其合成路线如下：
具体制备过程包括以下步骤：
1、化合物1的合成：
在固相合成仪中加入0.5g Fmoc-Lys(Dde)-Resin(Fmoc-Lys(Dde)-OH的物质的量为0.4mmol，1当量)，以DMF为反应溶剂，以0.8M的DIPEA/DMF和0.4M的HBTU/DMF作为活化剂，以20％哌啶的DMF溶液为Fmoc的洗脱剂，按照多肽的序列，依次添加Fmaoc-Val-OH(0.543g，4当量)和Boc-Met-OH(0.399g，4当量)以增长肽链。固相合成结束后，将连有树脂的多肽粗产品置于3mL 2％水合肼的DMF溶液中，室温下搅拌1.5h，抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇和DMF洗涤树脂。之后将该树脂置于3mL 20％HFIP的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌2h，抽滤，取滤液，经乙醚重结晶后，即得到化合物1约160mg，产率约为84％。化合物1经LC-MS鉴定，[M-H]-＝475.26，计算值(m/z)为476.63(C21H40N4O6S)。
2、化合物2的合成：
称取40mg的化合物1(0.08mmol)于10mL玻璃瓶中，依次加入1.2当量的3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，2.6当量的三乙胺，500μL DMSO，于室温下搅拌反应。用HPLC监测反应进度，当观察到原料消失时，加入500μL 0.1％TFA水溶液终止反应。用制备型HPLC对产物进行分离纯化，得化合物2约20mg，产率约为56％。化合物2经LC-MS鉴定，[M-H]-＝626.20，计算值(m/z)为627.75(C28H45N5O9S)。
3、化合物3的合成：
称取20mg的化合物2(0.03mmol)置于10mL玻璃瓶中，加入500μL TFA，室温下静置20min，用HPLC检测反应进度，当所有原料都转化为产物时，停止反应。用氮气将TFA吹干。向反应瓶中加入500μL DMSO，1当量的NOTA-NCS和5当量的三乙胺，于室温下搅拌反应。用HPLC检测反应进度，当观察到原料消失时，加入500μL 0.1％TFA水溶液终止反应。用制备型HPLC对产物进行分离纯化，得化合物3约7.5mg，产率约为50％。化合物3经LC-MS鉴定，[M-H]-＝976.19，计算值(m/z)为977.40(C43H63N9O13S2)。
4、化合物4的合成：
将化合物3(0.65mg，0.66μmol，1.5当量)加入到ZHER2:2891(市售，3mg，0.44μmol，1当量)的PBS溶液中，室温下反应两小时后用HPLC分离纯化，得化合物4约2mg，产率约为59％。化合物4经LC-MS鉴定，[M+H]+＝7794.00，计算值(m/z)为7793.90(C343H543N93O106S4)。化合物4的HPLC分析图及LC-MS图见图1所示。
实施例2
制备另一种具有HER2靶向功能的多肽化合物，其合成路线如下：
具体制备过程包括以下步骤：
1、化合物1的合成：
在固相合成仪中加入0.5g Fmoc-Lys(Dde)-Resin(Fmoc-Lys(Dde)-OH的物质的量为0.4mmol，1当量)，以DMF为反应溶剂，以0.8M的DIPEA/DMF和0.4M的HBTU/DMF作为活化剂，以20％哌啶的DMF溶液为Fmoc的洗脱剂，按照多肽的序列，依次添加Fmaoc-Val-OH(0.543g，4当量)和Boc-Met-OH(0.399g，4当量)以增长肽链。固相合成结束后，将连有树脂的多肽粗产品置于3mL 2％水合肼的DMF溶液中，室温下搅拌1.5h，抽滤，依次用二氯甲烷、甲醇和DMF洗涤树脂。之后将该树脂置于3mL 20％HFIP的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌2h，抽滤，取滤液，经乙醚重结晶后，即得到化合物1约160mg，产率约为84％。化合物1经LC-MS鉴定，[M-H]-＝475.26，计算值(m/z)为476.63(C21H40N4O6S)。
2、化合物2的合成：
称取40mg的化合物1(0.08mmol)于10mL玻璃瓶中，依次加入1.2当量的3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，2.6当量的三乙胺，500μL DMSO，于室温下搅拌反应。用HPLC监测反应进度，当观察到原料消失时，加入500μL 0.1％TFA水溶液终止反应。用制备型HPLC对产物进行分离纯化，得化合物2约20mg，产率约为56％。化合物2经LC-MS鉴定，[M-H]-＝626.20，计算值(m/z)为627.75(C28H45N5O9S)。
3、化合物5的合成：
称取20mg的化合物2(0.03mmol)置于10mL玻璃瓶中，加入500μL TFA，室温下静置20min，用HPLC检测反应进度，当所有原料都转化为产物时，停止反应。用氮气将TFA吹干。向反应瓶中加入500μL DMSO，1当量的DOTA-NCS和5当量的三乙胺，于室温下搅拌反应。用HPLC检测反应进度，当观察到原料消失时，加入500μL 0.1％TFA水溶液终止反应。用制备型HPLC对产物进行分离纯化，得化合物5约8.3mg，产率约为48％。化合物5经LC-MS鉴定，[M-H]-＝1078.44，计算值(m/z)为1079.25(C47H70N10O15S2)。
4、化合物6的合成：
将化合物5(0.71mg，0.66μmol，1.5当量)加入到ZHER2:2891(市售，3mg，0.44μmol，1当量)的PBS溶液中，室温下反应两小时后用HPLC分离纯化，得化合物6约1.8mg，产率约为52％。化合物6经LC-MS鉴定，[M-H]-＝7895.00，计算值(m/z)为7895.01(C347H550N94O108S4)。化合物6的HPLC分析图及LC-MS图见图2所示。
实施例3.
放射性标记用冻干药盒的制备
1)放射性Ga-68和Cu-64标记用冻干药盒的制备(以制备100支为例)
称取4mg实施例1制备的化合物4溶于10mL 0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4)中，经无菌过滤后分装于100支冻存管中，然后置于冷冻干燥剂中冷冻干燥24小时，加塞密封，得到冻干药盒Ⅰ。根据药盒冻干粉针成型情况，可在药盒中增加赋形剂，比如甘露醇、抗坏血酸等，可调节化合物4及赋形剂的用量，以使药盒成型达到最佳。
2)放射性F-18标记用冻干药盒的制备(以制备100支为例)
称取4mg实施例1制备的化合物4溶于10mL 0.5mol/L的酒石酸-酒石酸钾钠缓冲溶液(pH＝4)中，再将0.04mg氯化铝(AlCl3)溶于10mL 0.5mol/L的酒石酸-酒石酸钾钠缓冲溶液(pH＝4)中，将二者混合均匀。经无菌过滤后分装于100支冻存管中，然后置于冷冻干燥剂中冷冻干燥24小时，加塞密封，得到冻干药盒Ⅱ。根据药盒产量以及对每支药盒中组分含量要求的不同，可调节化合物4及氯化铝的用量，使它们的重量比落在(20～100)：1范围内。
实施例4.
一种Ga-68标记的放射性诊断探针(化合物7)的制备：
1)湿法：将约18.5～1850兆贝可(MBq)68GaCl3盐酸溶液(淋洗自锗镓发生器)加入到含0.5mL实施例1制备的化合物4的醋酸-醋酸盐溶液(4.0g/L)的离心管中，置于37℃下反应20min。取一C18分离小柱，先用10mL无水乙醇缓慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水将标记液稀释后，上样到分离柱上，先用10mL水除去未标记的68Ga离子，再用0.3mL 10mMHCl的乙醇溶液淋洗得到化合物7。该淋洗液经生理盐水稀释，并经无菌过滤后即得化合物7注射液。
2)冻干法：将约18.5～1850兆贝可(MBq)68GaCl3盐酸溶液(淋洗自锗镓发生器)加入到含有化合物4的冻干药盒Ⅰ中，混匀后37℃下反应20min。取一C18分离小柱，先用10mL无水乙醇缓慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水将标记液稀释后，上样到分离柱上，先用10mL水除去未标记的68Ga离子，再用0.3mL 10mMHCl的乙醇溶液淋洗得到化合物7。该淋洗液经生理盐水稀释，并经无菌过滤后即得化合物7注射液。
实施例5.
一种F-18标记的放射性诊断探针(化合物8)的制备：
1)湿法：在1mL离心管中，加入3μL 2mM的醋酸-醋酸盐溶液(0.5mol/L，pH＝4)和6μL 3mM实施例1制备的化合物4的醋酸-醋酸盐溶液(0.5mol/L，pH＝4)，然后加入0.13mL的乙腈和0.05mL约37MBq的18F-水溶液，充分混合后置于沸水浴中反应10min。取一C18分离小柱，先用10mL无水乙醇缓慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水稀释已冷却的标记液，并将其转移至分离柱上，先用10mL水除去未标记的18F离子，再用0.3mL 10mMHCl溶液淋洗得到化合物8。该淋洗液经生理盐水稀释，并经无菌过滤后即得化合物8注射液。
2)冻干法：向含有化合物4的冻干药盒Ⅱ中加入0.5mL 0.5mol/L的醋酸-醋酸盐溶液(pH＝4)，全部溶解后加入约37～3700MBq18F-乙腈淋洗液(从阴离子捕获柱QMA获得)，密闭120℃反应5min，冷却。取一C18分离小柱，先用10mL无水乙醇缓慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水稀释已冷却的标记液，并将其转移至分离柱上，先用10mL水除去未标记的18F离子，再用0.3mL 10mMHCl溶液淋洗得到化合物8。该淋洗液经生理盐水稀释，并经无菌过滤后即得化合物8注射液。
实施例6.
一种Cu-64标记的放射性诊断探针(化合物9)的制备：
1)湿法：将约18.5～1850MBq64CuCl2醋酸钠溶液加入到含0.5mL实施例1制备的化合物4的醋酸-醋酸盐溶液(4.0g/L)的离心管中，置于37℃下反应20min。取一C18分离小柱，先用10mL无水乙醇缓慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水将标记液稀释后，上样到分离柱上，先用10mL水除去未标记的64Cu离子，再用0.3mL 10mMHCl的乙醇溶液淋洗得到化合物9。该淋洗液经生理盐水稀释，并经无菌过滤后即得化合物9注射液。
2)冻干法：将约18.5～1850MBq64CuCl2醋酸钠溶液加入到含有化合物4的冻干药盒Ⅰ中，混匀后37℃下反应20min。取一C18分离小柱，先用10mL无水乙醇缓慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水将标记液稀释后，上样到分离柱上，先用10mL水除去未标记的64Cu离子，再用0.3mL 10mMHCl的乙醇溶液淋洗得到化合物9。该淋洗液经生理盐水稀释，并经无菌过滤后即得化合物9注射液。
实施例7.分析及应用效果
以下以实施例1制备的多肽化合物4和实施例4制备的放射性68Ga标记探针(化合物7)为例，其性能测定描述如下：
1、HPLC分析鉴定
HPLC体系如下：Agilent 1100；C18色谱柱(ZORBAX，5μm，4.6×250mm)用于多肽分析。化合物4的保留时间约为11.5min，并以此计算化学纯度大于95％。HPLC结果见图1。
淋洗梯度：0～3分钟：15％乙腈(0.1％TFA)和85％水(0.1％TFA)保持不变；3-20分钟：增加到70％乙腈(0.1％TFA)和30％水(0.1％TFA)。
2、化合物7在PBS及鼠血清中的稳定性分析
1)取20μL(7.4MBq)化合物7加入到200μL的PBS溶液中，并置于室温下孵育，分别于1h及2h后用微量注射器取50μL孵育混合物，用radio-HPLC测定放射化学纯度。HPLC结果见图3。
2)取20μL(7.4MBq)化合物7加入到200μL新鲜鼠血清溶液中，并置于37℃孵育，分别于孵育1h及2h后，用微量注射器取50μL孵育混合物，加入等体积的乙腈沉淀蛋白，之后用高速离心机在12000rpm下离心5min，小心取得上清液，用radio-HPLC测定放射化学纯度。HPLC结果见图3。
3、化合物7在荷SKOV-3瘤裸鼠的MicroPET显像试验
按实施例4制备好放射化学纯度大于95％的化合物7溶液，取100μL(约3.7MBq)通过尾静脉注射于荷SKOV-3瘤裸鼠，并于给药后5、20、40、60、120及180min进行PET图像采集。显像结果如图4所示，注射显像剂5min后，肿瘤即有明显的摄取，其后摄取逐渐增强。而肾中摄取在40min时达到顶峰，其后迅速降低。
序列表
<110> 莎穆（上海）生物科技有限公司
<120> 一种靶向HER2的放射性配合物及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg
20 25 30
Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Cys
50 55

Claims (12)

1.一种具有HER2靶向功能的多肽化合物，它是由HER2亲合体和双功能螯合剂通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met-Val-Lys；所述多肽化合物结构通式如下式(Ⅰ)所示，其中，R是HER2亲合体分子，X是双功能螯合剂基团：
2.权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，式(I)中的R为ZHER2:2891、ZHER2:2395或ZHER2:342；优选的R是如式(Ⅱ)所示的ZHER2:2891分子结构
3.权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，所述式(I)中的X选自NOTA-NCS、NOTA-NHS、DOTA-NCS或DOTA-NHS；优选结构如式(Ⅲ)所示的NOTA-NCS；
4.权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，它是由ZHER2:2891和NOTA-NCS通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met-Val-Lys；所述多肽化合物结构如式(IV)所示：
5.权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，它是由ZHER2:2891和DOTA-NCS通过多肽序列连接构成的；所述的多肽序列是Met-Val-Lys；所述多肽化合物结构如式(V)所示：
6.一种制备权利要求1所述多肽化合物的方法，具体包括以下步骤：
(a)将保护的赖氨酸与2-氯三苯基氯树脂以1～1.5:1的摩尔比混合，在N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)作用下，将保护的赖氨酸连接到树脂上；
(b)在步骤a)所得产物的基础上，继续连接氨基酸Val和Boc-Met，得到第二步产物；
(c)步骤(b)得到的第二步产物在水合肼的作用下脱去保护剂Dde，得到第三步产物；
(d)步骤(c)得到的第三步产物在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)的作用下从树脂上切割下来，得到第四步产物；
(e)步骤(d)得到的第四步产物在三乙胺的作用下与3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到第五步反应产物；
(f)步骤(e)得到的第五步产物在三氟乙酸(TFA)条件下脱去保护基团Boc，得到第六步反应产物；
(g)步骤(f)得到的第六步产物在DIPEA作用下，与双功能螯合剂反应，得到第七步产物；
(h)步骤(g)得到的第七步产物在PBS中与HER2亲合体反应，得到所述的多肽化合物。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(g)所述的双功能螯合剂选自NOTA-NCS、NOTA-NHS、DOTA-NCS或DOTA-NHS，优选NOTA-NCS；步骤(h)所述的HER2亲合体选自靶向分子ZHER2:2891、ZHER2:2395或ZHER2:342，优选ZHER2:2891。
8.一种靶向HER2的放射性标记配合物，它由权利要求1、4或5所述的多肽化合物为配体经放射性核素标记得到。
9.权利要求8所述的放射性标记配合物，其特征在于，所述的放射性核素选自18F、68Ga、64Cu、62Cu、86Y或89Zr中的任意一种；优选18F、68Ga、64Cu中的任意一种。
10.一种制备权利要求9所述放射性标记配合物注射液的方法，是68Ga的湿法标记法，包括：将权利要求4所述的多肽化合物溶于缓冲溶液或去离子水中；在其中加入新鲜淋洗得到的68GaCl3盐酸溶液，密闭37℃反应5-40min，冷却；加水稀释反应液后经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化，以缓冲液或水冲洗色谱柱以除去未反应的68Ga离子，以盐酸乙醇溶液或乙醇溶液淋洗，再经生理盐水或PBS稀释后无菌过滤，即得到结构如式(VI)所述的68Ga标记的配合物的注射液；其中R是ZHER2:2891分子，结构如式(II)所示；
11.一种制备权利要求9所述放射性标记配合物注射液的方法，是18F冻干法标记法，包括：将权利要求4所述的多肽化合物和氯化铝溶于缓冲液中，所得溶液经无菌过滤后分装于冻存管中，经冷冻干燥后密封得到冻干药盒；向冻干药盒中加入适量乙酸溶液或缓冲溶液溶解，再加入乙腈或乙醇和新鲜制得的18F离子水溶液，密闭70-120℃反应5-30min，冷却；加水稀释反应液后经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化，以缓冲液或水冲洗色谱柱以除去未反应的18F离子，以盐酸乙醇溶液或乙醇溶液淋洗，再经生理盐水或PBS稀释后无菌过滤得到结构如下式(VII)所示的18F标记的配合物的注射液；其中R是ZHER2:2891分子，结构如式(II)所示；
12.权利要求8所述的放射性标记配合物在制备用于人或动物的HER2阳性乳腺癌放射性诊疗探针中的应用。
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