CN105579851A

CN105579851A - Her2结合剂的应用

Info

Publication number: CN105579851A
Application number: CN201480036224.6A
Authority: CN
Inventors: D.R.R.希斯科克; E.阿博亚耶; P.伊维森; Q-D.阮; S.霍普曼恩; S.特劳斯; M.卡里斯扎克; G.托马斯
Original assignee: Imperial Innovations Ltd; GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd; Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2016-05-11
Also published as: BR112015032211A2; US10646600B2; US20160144062A1; EP3014277A1; KR20160055728A; JP2016526556A; WO2014209205A1; EP3014277A4

Abstract

本文描述了一种使用与放射性核素缀合的分离多肽的方法，其中分离的多肽与HER2或其变体特异性地结合。所述方法用于监测对HSP90抑制的反应，和包括使用与18F缀合的分离多肽。本申请还描述了与18F缀合的分离多肽的用途，其中所述分离多肽与HER2或其变体特异性地结合，作为成像剂监测其吸收，以测量HSP90抑制。

Description

HER2结合剂的应用

发明领域

本发明涉及使用与放射性核素缀合的分离多肽的方法；其中所述分离多肽与HER2或其变体特异性地结合。

背景

人表皮生长因子受体2 (HER2，也称为HER2/neu或ErbB-2)是一种属于表皮生长因子受体家族的185 kDa的跨膜受体(1)。HER2基因扩增和蛋白过度表达在许多类型的癌症的发病机理和进展中起着关键作用。HER2在25-30%的乳腺癌、15-35%的胃癌和7-38%的卵巢癌中过度表达并与差的生存相关(2-5)。因而所述蛋白作为癌症疗法的重要的预测生物标记物和靶标近年来已经出现(6)。与其家族的其它成员同源-或异源二聚化促进细胞内酪氨酸激酶结构域的激活并引发通过MAPK和Akt信号传导途径介导的细胞存活和增殖(7、8)。

临床中可利用的HER2-靶向疗法包括抗体，例如曲妥珠单抗(Herceptin,Genentech)和帕妥珠单抗(Perjeta, Genentech)，其防止受体二聚化；抗体-药物缀合物，例如T-DM1 (Kadcyla, Genentech)；或靶向酪氨酸-激酶结构域的小分子抑制剂(如拉帕替尼，Tyverb, GlaxoSmithKline；一种双重HER2和EGFR抑制剂)。细胞外结构域的蛋白水解脱落或在有限的情况下可供选择的剪接可生成一种截短的、信号传导残留p95HER2结构域，其提出抵抗抗-HER2疗法的最主要机制之一(9)。虽然曲妥珠单抗形成抗-HER2靶向疗法的支柱，但它不逆转HER2蛋白表达。因此在该背景下，分子伴侣HSP90的抑制剂(其引起HER2蛋白酶体降解)目前正在研究中。一种这样的抑制剂，NVP-AUY922 (Novartis)正处于II期临床试验。

HER2状态的准确检测对患者的分层，以鉴别很可能从这样的靶向疗法(特别是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)获益的个体是至关重要的。然而，这可能是复杂的，因为HER2表达可从原发性疾病至继发性疾病(伴有往往不适合活检的局部和远端复发)的整个进展过程变化(10)。而且，最近的研究已强调作为不正确评估的潜在来源的空间异质性(11)。绝大多数的FDA-批准的诊断基于免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)。IHC测定HER2蛋白在甲醛固定石蜡包埋的(FFPE)肿瘤活检材料中的表达，而FISH检测HER2基因扩增，其被认为是合理的替代物，因为HER2过度表达一般是由拷贝数变化引起的(12)。通过检测可溶性细胞外结构域的基于血清的替代物的使用也在研究中(13)。

使用放射性标记的亲和体(Affibody)分子(其为非-免疫球蛋白-衍生的亲和力蛋白)的肿瘤标记物-靶向分子成像，可能提供对HER2分子诊断的一种精确和非侵入性的替代。亲和体分子被工程改造为衍生自葡萄球菌蛋白A的三螺旋束Z蛋白(14)。它们的特征在于纳摩尔至皮摩尔的结合亲和力，与抗体或抗体片段(~20-150 kDa)比较的~6.5 kDa的小尺寸，和短的血浆滞留时间，因此允许快速的和均匀的组织分布。因此，高对比度的图像可在施用第一小时或两小时内获得(15、16)。而且，这些分子与全IgG抗体比较非常适合于用短寿命放射性同位素进行放射性标记。

癌症患者的HER2状态的精确评价仍然是一个临床挑战，高达20%的患者有可能退出治疗或暴露于不必要的毒性。非侵入性成像被广泛认为是当前方法的一种可行的备选方案，特别是在不适合活检的局部和远端复发的情况下，但是由正电子发射断层扫描取得的临床成功迄今已受到在肝和肾中延长的示踪剂滞留的阻碍，其阻碍对近端转移的检测。

发明概述

现在已发现，HER2-靶向亲和体[¹⁸F]GE-226提供一个可行的策略，以确定HER2差异表达，而不管谱系或在注射后1小时内用曲妥珠单抗预处理。本文提供使用全长对比p95HER2转染的细胞和siRNA HER2作为对照，或HSP90抑制剂处理以降解HER2，洞察亲和体与HER2的相互作用的动力学特征。

如下文所述，本发明提供一种使用HER2结合剂以监测对HSP90抑制的反应的方法。

本发明提供一种监测对HSP90抑制的反应的方法，其包括以下步骤：

(a) 给予受试者与18F缀合的分离多肽，其中所述分离多肽特异性地结合HER2或其变体；和

(b) 使所述受试者成像；和

(c) 监测所述成像剂组成的吸收以测量HSP90抑制。本发明还涉及所述多肽作为成像剂的用途。

发明详述

分离多肽可以是特异性地结合用适合于诊断成像的放射性同位素缀合或标记的HER2或其变体的任何多肽。虽然不限于此，但合适的分离多肽及其放射性标记的衍生物和制备它们的方法的实例可发现于WO2012/096760、WO2012/087908和WO2012/087912中，其各自通过引用以其全文结合到本文中。优选地，分离多肽包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体，如在WO2012/096760、WO2012/087908和WO2012/087912中所述，其各自通过引用以其全文结合到本文中。更优选地，分离多肽是HER2-结合的18F-放射性标记的Affibody®分子ZHER2:2891 [SEQ ID NO 2]，本文称为[18F]GE-226[SEQ ID NO 2]并在所附的序列表中描述。

实施例：

实验设计：内在的细胞[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]吸收和肿瘤特异性示踪剂结合在用或不用药物处理的细胞和异种移植物中评价。通过比较荧光标记的类似物的肿瘤定位与DAKO HercepTest^TM，进一步测定特异性。

结果：[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]吸收在10个HER2阳性细胞系中比阴性细胞系(体外独立于谱系)高11-67倍。HER2阳性异种移植物中的吸收是快速的，净不可逆结合动力学使得有可能在1小时内区别HER2阴性(MCF7和MCF7-p95HER2: NUV₆₀ (%ID/mL) 6.1 ± 0.7；K_i (mL/cm³/min) 0.0069 ± 0.0014)与HER2阳性肿瘤(NUV₆₀和K_i: MCF7-HER2, 10.9 ±1.5和0.015 ± 0.0035；MDA-MB-361, 18.2 ± 3.4和0.025 ± 0.0052；SKOV-3, 18.7 ±2.4和0.036 ± 0.0065)。肿瘤吸收与由ELISA测定的HER2表达相关(r² = 0.78)，并在细胞水平与HER2表达共定位。示踪剂吸收在保持与差异表位结合方面不受用曲妥珠单抗短期或连续处理的影响，但反映了通过短期NVP-AUY922处理，在SKOV-3异种移植物中的HER2降解(NUV₆₀: 13.5 ± 2.1对比9.0 ± 0.9 % ID/mL，分别对于媒介或药物)。

结论：[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]高特异性地结合HER2 (独立于细胞谱系)。示踪剂具有用于HER2检测(而不管先前的曲妥珠单抗处理)，和监测对HSP90抑制的反应的用途。

结果

对HER2的内在的亲和力(K_D = 76 pM)导致[¹⁸F]GE-226吸收在10个HER2阳性细胞系中比阴性细胞系(体外独立于谱系)高11-67倍。吸收与HER2蛋白表达相关，但独立于其它靶标像EGFR的存在。用[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]和HER2 siRNA处理阻断减少吸收分别达96.8± 2.6%和81.7 ± 9.2%。在HER2阳性异种移植物中的吸收是快速的，稳定状态净不可逆结合动力学使得有可能在1小时内区别HER2阴性(MCF7和MCF7-p95HER2: NUV₆₀ (%ID/mL) 6.1± 0.7；K_i (mL/cm³/min) 0.0069 ± 0.0014)与HER2阳性肿瘤(NUV₆₀和K_i: MCF7-HER2,10.9 ± 1.5和0.015 ± 0.0035；MDA-MB-361, 18.2 ± 3.4和0.025 ± 0.0052；SKOV-3,18.7 ± 2.4和0.036 ± 0.0065)。肿瘤吸收与由ELISA测定的HER2表达相关(r² ≥ 0.74，当变量为NUV₆₀或K_i时)。通过比较荧光标记的示踪剂类似物的肿瘤定位与DAKOHercepTest^TM，进一步测定特异性。亲和体肿瘤信号与HER2表达在细胞水平(独立于空间异质性)上共定位。示踪剂结合在保持与差异表位结合方面不受SKOV-3异种移植物短期或连续暴露于曲妥珠单抗(50 mg/kg腹膜内推注，接着两个剂量25 mg/kg (腹膜内)，经总共7天)的影响。在SKOV-3异种移植物中的3个日剂量50 mg/kg NVP-AUY922后，蛋白伴侣HSP90——其中HER2是客户(client)蛋白——被NVP-AUY922抑制在体外和体内引起剂量依赖性HER2降解并从而减少SKOV-3细胞中的示踪剂吸收(AUC_0-60: 618.4 ± 90.1对比446.7± 42.8 % ID/mL*min，分别对于媒介和药物；P = 0.043)。

材料和方法

化学和放射化学

[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]使用对在FASTlab上自动制备进行优化的氟苯甲醛(FBA)策略来标记。简言之，放射化学使用马来酰亚胺-氨基氧基乙酰基(maleimide-aminooxyacetyl)亲和体分子前体，其结合于[¹⁸F]氟苯甲醛合成子，接着固相提取(SPE)产物纯化。典型的非衰减校正的最终合成产率是25%和放射化学纯度是95%。

表面等离子体共振

为了鉴定[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]对HER2蛋白的亲和力，进行表面等离子体共振研究。人、恒河猴和大鼠HER2-ECD-Fc (SINO Biological，北京，中国，Cat. Nr: 10004-H02H、90020-K02H和80079-R02H)，以及人HER2-ECD-Fc-6XHis (R&D Systems, Minneapolis,MN, Cat. Nr: 1129-ER)和p95HER2 ECD-Fc-6XHis (Syngene, Cambridge, UnitedKingdom)用50 mM乙酸钠pH 4.5 (Biacore (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)偶联缓冲剂)稀释至最终浓度10 μg/mL。至Biacore传感芯片CM5 (Cat. Nr: BR-1005-30)的抗原偶联依据来自仪器手册(Syngene)中的胺偶联方案进行。HBS-EP缓冲液(10 mM HEPES pH7.4,150 mM NaCl, 3 mM EDTA和0.005%表面活性剂P20；GE Healthcare, LittleChalfont, United Kingdom, Cat. Nr: BR-1006-69)被用作运行缓冲液并作为物质的溶剂。亲和力研究使用Biacore T100 (GE Healthcare)进行。[¹⁹F]GE-226在HBS-EP缓冲液中稀释至50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.125 nM、1.56 nM、0.78 nM、0.39 nM、0.195 nM、0.097 nM、0.049 nM和0 nM。第一芯片的流动池包含空白、人HER2-ECD-Fc-6XHis、p95HER2-ECD-Fc-6XHis批I和p95HER2-ECD-Fc-6XHis批II。第二芯片上的流动池包含空白、人HER2-ECD-Fc、恒河猴HER2-ECD-Fc和大鼠HER2 ECD-Fc。蛋白的固定用蛋白-A (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, Cat. Nr: P6031)和抗-人IgG抗体(Perkin Elmer, Waltham, MA, Cat.Nr: NEF803001EA)验证。将[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]以随机的次序，以50 μL/min流速一式两份泵到池上60秒钟，接着经120秒的HBS-EP以监测解离。之后接着用50 mM氢氧化钠，以30 μL/min流速经30秒钟使芯片再生，接着运行HBS-EP 60秒钟以稳定表面。使用Langmuir1:1结合模型和缔合和解离相的同时计算进行动力学计算。

细胞和处理

MCF7-载体(piRES)、MCF7-p95HER2和MCF7-HER2细胞由José Baselga’s实验室馈赠(17)。MCF7克隆、MDA-MB-231 (ATCC, Manassas, VA)、MDA-MB-361 (Sigma-Aldrich)、SKBR-3 (ATCC)和SKOV-3 (Sigma-Aldrich)细胞在DMEM中维持。AGS (Sigma-Aldrich)、HGC-27 (Sigma-Aldrich)、NCI-N87 (ATCC)和OE-33 (ATCC)细胞在RPMI (Sigma-Aldrich)中维持。A431细胞(Sigma-Aldrich)在MEM Eagle培养基(Sigma-Aldrich)中维持。生长培养基补充有10% FCS (Lonza, Basel, Switzerland)、谷氨酰胺和抗生素(二者得自Invitrogen, Paisley, United Kingdom)。A431细胞另外补充有1%非-必需氨基酸。所有细胞于37℃，在含有5% CO₂的潮湿气氛中培养。

对于siRNA-介导的HER2敲除，依据生产商的指示，通过采用LipofectamineRNAiMAX (Invitrogen)的逆湿转染，用25 nM混杂对照(SCR；Dharmacon, Lafayette, CO,ON-TARGETplus非靶向合集, Cat. Nr: D-001810-10-05)或HER2-靶向siRNA (InvitrogenERBB2 Silencer® Select Validated siRNA；Cat. Nr: 4457298)转染SKOV-3细胞。在吸收实验前48小时，将3 x 10⁵个细胞接种到12-孔板。靶标敲除经蛋白质印迹法在平行转染的细胞上验证。

对于所有的对药物处理的反应的吸收研究，在吸收实验前48小时，将2.5 x 10⁵SKOV-3细胞接种到完全培养基中。在加入放射示踪剂之前细胞与指定剂量的NVP-AUY922(LC Laboratories, Woburn, MA)一起培养24 h和与10 µg/mL曲妥珠单抗(Roche, Basel,Switzerland)一起培养1或24 h。

体外吸收分析

对于HER2阳性或阴性谱系中的基线吸收，将3 x 10⁵细胞接种到在12-孔板(Corning,Tewksbury MA)中的完全培养基中并允许回收过夜。细胞用无血清-培养基洗涤两次并在500 µL无血清培养基中用370 KBq脉冲1小时。对于阻断研究，使细胞与示踪剂和0.5 mg/mL冷的未标记的[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]共同培养。

细胞用PBS洗涤，经受胰蛋白酶作用，用完全培养基中和并离心。沉淀用PBS洗涤3次并在120 µL RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)中溶胞。100 µL溶胞产物的放射性在PackardCobra IIγ计数器(Perkin Elmer)上计数。放射性被归一化为应用的放射性和蛋白含量，这通过BCA分析对每个样品进行测定(Pierce, Rockford, IL)。

蛋白质印迹法

使细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(得自Sigma-Aldrich)的RIPA缓冲液中溶胞。使等量的蛋白(20 μg)在4-15%小型protean TGX凝胶(Biorad, Hercules, CA)中解析，并转移至PVDF膜(Trans-Blot Turbo Transfer Packs, Biorad)上。膜在含有0.1% v/v tween(TBST, Cell Signaling, Danvers, MA)的Tris-缓冲盐水中的5%牛奶中封闭1小时，并于4℃与抗HER2抗体(Cell Signal, Cat. Nr: 2165，用于p95HER2和全长HER2带的可视化，以及Cat. Nr: 4290，用于其中只有全长HER2被示出的印迹)、抗EGFR抗体(Cell Signal,Cat. Nr: 4267)或抗β-肌动蛋白抗体(Abcam, Cambridge, United Kingdom, Cat. Nr:ab6276)一起培养过夜。于室温下应用HRP-缀合的小鼠和兔第二抗体(Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX)一小时。使用Amersham ECL™蛋白质印迹检测试剂(GEHealthcare)和Amersham Hyper-film (GE Healthcare)使信号可视化。

用于PET的小动物实验模型

所有动物实验根据United Kingdom Home Office Guidance on the Operation ofThe Animals (Scientific Procedures)法案1986修订条例2012和在发布的癌症研究中的动物福利和使用指南(guidelines for the welfare and use of animals in cancerresearch)内由获得批准的研究者实施(18)。体内实验模型在6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠(Harlan, Indianapolis, IN)中建立。在细胞接种前大约2天，对所有(除了SKOV-3)异种移植物，小鼠用0.72 mg/60天释放雌二醇丸粒(Innovative Research of America,Sarasota, FL)皮下(s.c.)植入。异种移植物通过皮下(s.c.)注射100 µL MCF7-载体、MCF7-p95HER2和MCF7-HER2细胞(1.5 x 10⁷细胞在与Matrigel^TM按1:1混合的PBS中，BDBiosciences, San Jose, CA)、MDA-MB-361细胞(5 x 10⁶细胞在与Matrigel^TM按1:1混合的PBS中)或SKOV-3细胞(5 x 10⁶细胞在PBS中)在小鼠背上建立。肿瘤大小通过卡尺量规频繁地测量和肿瘤体积通过以下方程计算：体积mm³ = (π/6) x a x b x c，其中a、b和c代表肿瘤的3个正交轴。当肿瘤体积达到约50-100 mm³(MCF7模型，注射后~4周；MDA-MB-361异种移植物，注射后~3周；和SKOV-3异种移植物，注射后~6周)时，将小鼠用于生物分布或PET成像研究。

对于阻断研究，在给予放射示踪剂之前20分钟，对携带SKOV-3异种移植物的小鼠通过尾静脉静脉内(i.v.)给予500 µg (~25 mg/kg)冷的[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]。为评价放射示踪剂与曲妥珠单抗的相互作用，在扫描前2小时，用50 mg/kg曲妥珠单抗腹膜内(i.p.)处理携带SKOV-3异种移植物的小鼠。使动物恢复，用25 mg/kg曲妥珠单抗腹膜内再处理2次，并在初始剂量后7天再扫描。为研究对HSP90抑制的反应，用50 mg/kg NVP-AUY922或等体积的媒介(~ 5 μL/g体重；含10% DMSO和5% Tween-20的PBS)处理携带SKOV-3异种移植物的小鼠，每天一次腹腔注射(q.d. i.p.) 3天。最后处理后24小时，将动物用于PET成像。

PET-CT成像

通过异氟烷吸入麻醉小鼠并在专门用于小动物的PET-CT扫描仪(SiemensMultimodality Inveon, Erlangen, Germany)上扫描。对于PET衰减校正，首先采集低剂量CT扫描(80 kVp, 0.5 mA, 220度旋转，600 ms每度暴露时间，80 μm重构像素尺寸)，获得解剖参照。在尾静脉内i.v.推注约3.7 MBq [¹⁸F]GE-226后获得PET图像。动态发射扫描以列表模式格式经60分钟获得。获得的数据分类为0.5-mm的正弦图箱(sinogram bins)和通过滤波反投影用于图像重建的19个时帧(4 x 15秒和4 x 60秒，接着11 x 300秒)。使用西门子Inveon研究工作平台软件(Siemens Inveon Research Workplace software)用于观察放射示踪剂吸收。采用30-60分钟的动态数据累积图像以限定感兴趣的三维(3D)区域(ROI)。通过使用0.25-2分钟的累积图像，绘制心腔中心的ROI，估计动脉输入功能。对每一时间点的所有ROI的计数密度进行平均，以获得时间对比放射性曲线(TAC)。肿瘤TAC经VDC-304剂量校正仪(Veenstra Instruments, Joure, Netherlands)被标准化为测量的注入剂量且标准化吸收表示为百分比注入剂量每mL组织(NUV；%ID/mL)。为了比较，使用放射示踪剂于60分钟的标准化吸收(NUV₆₀)。对于定性图像的可视化，动态数据的累积图像(30-60 min)也被迭代重建(OSEM3D)。

生物分布

对携带肿瘤的BALB/c裸小鼠通过尾静脉i.v.给予~3.7 MBq的[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO2]。在不同时间点通过放血处死小鼠。切除组织、称重并使用Packard Cobra IIγ计数器(Perkin Elmer)对放射性计数和修正衰变。数据表示为百分比注射剂量每克组织(%ID/g)。

代谢稳定性

通过尾静脉i.v.给予小鼠3.7 MBq [¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]。在注射后10、30和60分钟，通过心脏穿刺使小鼠放血且移出的血液用于离心。获得血浆并在冰上保存用于通过HPLC对放射性代谢物进行分析。

用于荧光GE-226实验的小动物模型

通过在4-6周龄的雄性CD-1裸小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)的下侧腹，经s.c.注射在与Matrigel^TM按1:1混合的100 μL PBS中的A431 (1 x 10⁷个细胞)和NCI-N87细胞(2 x 10⁶个细胞)，建立双侧A431/NCI-N87模型。如上所述频繁地监测肿瘤体积并当它们达到50-100 mm³(约3-4周)时，通过尾静脉i.v.给予小鼠Hoechst (~ 20 mg/kg)和荧光素-缀合的-GE226[SEQ ID NO 2] (~ 15 mg/kg)在100 μL PBS中的混合物。注射后120分钟切除肿瘤，立即在福尔马林中固定并包埋在石蜡中。切下切片并于-80℃下暗处贮存。以400x放大倍率获得免疫荧光图像。用HercepTest^TM对邻近的肿瘤切片进行免疫组织化学染色。

免疫组织化学

依据生产商的说明书，使用HercepTest^TM (Dako, Ely, United Kingdom, Cat. Nr:K5204)评价在切除的肿瘤中的HER2蛋白表达。

ELISA

在RIPA溶胞缓冲液(Sigma-Aldrich)中，用PreCellys 24匀化器和含有CK14珠粒的管(以6500 rpm的25秒的两个循环)匀化切除和快速冷冻的肿瘤组织样品。依据生产商的指示，通过ELISA (Calbiochem, Darmstadt, Germany, c-ErbB2/c-Neu Rapid FormatELISA Ki, Cat. Nr: QIA10-1EA)测定HER2表达。

动力学模型

应用标准两组织不可逆房室模型进行PET数据的动力学分析，使每个肿瘤TAC与作为输入函数(IF)的相应图像-导出的血浆TAC拟合以估算K₁ (mL/cm³/min)、k₂, (1/min)和k₃(1/min)和血管成分V_b (mL血/mL组织；无单位)。不可逆吸收率K_i (mL/cm³/min)被计算为K₁x k₃/ (k₂ + k₃)。为了估算动力学参数，测量的肿瘤TAC (tTAC)被建模为：

其中h(t)表示未知的组织脉冲函数(impulse function)和表示卷积算子(convolution operator)。用标准加权非线性最小二乘法(WNLLS)，通过使以下加权残差平方和(WRSS)函数最小化，估算参数向量p = [K₁,k₂,k₃,V_b]

其中tTAC(t_i)和t_i分别表示在肿瘤中测量的浓度和第i帧的中间时间(mid-time)，和N表示时帧的数目。加权被设定为：

其中Δ_i和λ表示第i帧的持续时间和¹⁸F的衰减-常数(19)。在肿瘤TAC的视觉评价后选择两组织不可逆模型，其显示在大多数情况下的明显不可逆吸收。而且，当使用两组织可逆房室模型时，获得以高变异为特征的参数的非生理学评估。

统计学分析

数据表示为均值±标准偏差(SD)或均数的标准误(SEM)。两数据集之间比较的显著性使用非配对、双尾Student’s t检验(GraphPad Prism version 5.1)测定和P < 0.05定义为显著性的。

亲和体-HER2结合性质

为确保氟化辅基没有不利地影响亲和体结合动力学，¹⁹F-亲和体类似物的受体相互作用使用表面等离子体共振测量并将此与人全长和截短的p95HER2，以及恒河猴和大鼠全长HER2的结合相比较。虽然示踪剂对人(K_D= 76 pM)和恒河猴HER2 (K_D= 67 pM)显示出非常强的结合，但它不与p95HER2或大鼠HER2相互作用(表1，图6)。

[¹⁸F]GE-226显示特异性的和谱系-独立的HER2结合

示踪剂滞留在源自乳腺癌、上胃肠道癌和卵巢癌的10个不同的细胞系中测试，其中一半是HER2阴性，而另一半是HER2阳性。小图包括包含HER2阴性MCF7细胞(其用空载体(MCF7-载体)、p95HER2 (MCF7-p95HER2)或全长HER2 (MCF7-HER2)转染)的同源模型。虽然所有的HER2阴性和p95HER2转染的细胞系仅有边际背景吸收(1.2 ± 0.5%应用的放射性/mg所有谱系的蛋白)，但所有HER2阳性细胞系以高水平(13.6 ± 3.4和79.9 ± 12.1%应用的放射性/mg蛋白之间)和与内源的HER2表达的良好的一致性保留示踪剂。然而，示踪剂结合独立于另一种表皮生长因子受体家族成员(EGFR)的表达。图1A显示一种代表性吸收实验，因为初始实验揭示吸收强烈依赖于特异性活性。与新鲜准备的[¹⁸F]GE-226比较，相同的放射示踪剂制备仅得到39.5 ± 8.5和24.9 ± 3.8%的示踪剂吸收，如果温育在70和140分钟后开始(图7)。

为进一步研究信号的特异性，将SKOV-3细胞与示踪剂和大过量的其非-放射性¹⁹F类似物共同培养(图1B)。与对照细胞(100 ± 12%；P < 0.0001)比较，这减少吸收至3.1 ±2.6%。而且，与非-靶向混杂对照比较，HER2的瞬时siRNA-介导的敲除减少示踪剂吸收(图1C, 100 ± 12%对比18 ± 9%, P < 0.0001)。目标敲除经蛋白质印迹法证实。

[¹⁸F]GE-226显示与曲妥珠单抗不同的结合位点和预测由NVP-AUY922降解HER2的检测

当开发HER2-靶向成像探针时，一个重要的问题是，示踪剂是否可独立于可能的曲妥珠单抗治疗，正确地确定患者的HER2状态。用10 µg/mL曲妥珠单抗预-处理SKOV-3细胞1 h不改变示踪剂结合，然而，与未用过药物的对照组比较，在吸收实验之前培养24小时减少示踪剂结合达32 ± 11% (图2A；P < 0.0001)。

假定HER2降解随之而来的HSP90抑制(HER2是HSP90的客户蛋白(20))将导致示踪剂吸收的可检测的变化。与未处理的对照组比较，HSP90抑制剂NVP-AUY922引起HER2蛋白表达的剂量依赖性降低，这因而转化为减少示踪剂吸收，进一步支持其特异性(图2B；对于所有的测试浓度与对照组比较均为P < 0.0001)。

[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]鉴别体内HER2差异表达

基于体外数据，需要审视示踪剂区分在复杂肿瘤体内环境中不同程度的HER2表达的能力。图3A显示携带SKOV-3异种移植物的小鼠的代表性小-动物[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]PET图像。高肿瘤吸收在体内与低非-特异性滞留形成对比。示踪剂是代谢稳定的并主要地和迅速地经由肾路线排泄(图8和表2)。在不同的肿瘤模型中，示踪剂很好地区分HER2阳性和阴性异种移植物。两种肿瘤-特异性分布和滞留动力学说明了这些区别。虽然HER2阴性MCF7-载体和MCF7-p95HER2异种移植物在初始递送后显示低肿瘤滞留和稳态组织放射性，但HER2阳性异种移植物增加吸收并遵循净不可逆结合的模式(图3B)。因此[¹⁸F]GE-226[SEQID NO 2] PET能够区分HER2-阴性(MCF7-载体和MCF7-p95HER2)与低(MCF7-HER2)和中度(MDA-MB-361) HER2-表达异种移植物。然而，当对PET分析采用简单吸收测量时，在具有中度和高度(SKOV-3) HER2-表达的肿瘤中，组织放射性是可比较的。尽管如此，放射示踪剂吸收与如经ELISA所测定的HER2蛋白表达很好地相关(r² = 0.78；图3C和图9)。

假定动力学建模，其说明了与单独的组织吸收相反的相对于血浆的组织吸收，可进一步帮助辨别各种HER2组。两-组织不可逆房室模型被用来推导净不可逆吸收速率常数，K_i (图3D)。使用这种模型，发明人可辨别所有各组，甚至区分MDA-MB-361与SKOV-3异种移植物(图3D)。如所期望的，在所有各组中K_i与NUV₆₀高度相关(r²=0.82；P = 0.008；图3E)。

为了提供对亲和体的特异性的进一步的支持，发明人在PET扫描(~1000倍的放射性标记的示踪剂)前20分钟，通过i.v.注射30 mg/kg [¹⁹F]GE-226进行阻断研究。冷的配体，通过阻断特异性结合位点，导致显著减少的示踪剂吸收(NUV₆₀ 18.7 ± 2.4对比7.1 ±1.6，在对照组和阻断肿瘤组中，P = 0.0003)和K_i (图3F-H)。值得注意的是，示踪剂吸收的动力学在对照组和阻断样品之间的显著不同之处在于，后者分享HER2阴性肿瘤的特征。

荧光GE-226的定位和强度与DAKO HercepTest^TM相关

为检查细胞定位，GE-226[SEQ ID NO 2]用荧光素标记并用FDA批准的DAKOHercepTest^TM比较肿瘤切片中的定位和荧光强度。与PET实验相反，对荧光化合物的注射剂量不可能标准化。为消除受试者之间的变异，在携带双侧肿瘤的小鼠中进行实验。因为在图3中描述的HER2阳性和阴性异种移植物具有大幅度变化的生长速率并需要不同的激素处理，因此发明人采用A431 (HER2阴性)和NCI-N87 (HER2阳性)异种移植物。经i.v.注射20mg/kg Hoechst和15 mg/kg荧光素-GE-226在PBS中的混合物并在注射后2小时切除肿瘤，用福尔马林固定和石蜡包埋并制备邻近肿瘤切片，用于HercepTest^TM染色或荧光显微镜检查。图4显示，荧光染色与NCI-N87肿瘤中为HER2阳性的区域共定位，和A431肿瘤中HercepTest^TM和荧光染色二者是可以忽略的。

[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]可正确地评价独立于之前的曲妥珠单抗处理的HER2状态并预测对NVP-AUY922的体内反应

携带SKOV-3肿瘤的小鼠用3个剂量的曲妥珠单抗处理并在初始剂量后2小时成像和在最后处理后48小时(即初始扫描后7天)再次成像。两种处理对肿瘤示踪剂滞留均无不利的影响(图5A)，虽然连续处理7天减少K_i达24% (P = 0.025)，其为动脉输入功能增高和改变肾排泄的结果(图5B，图10)。这证实亲和体具有不同的结合曲妥珠单抗的位点。最后，为评价[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]是否也可用作为体内HSP90抑制对处理生物标记物的反应，携带SKOV-3异种移植物的小鼠用3个剂量的50 mg/kg NVP-AUY922或媒介处理。这导致HER2表达减少，从而降低示踪剂吸收(图5C-D，图11)。

讨论

借助于动力学建模，发明人证实Z_HER2:2891亲和体，[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]，独立于谱系和之前的曲妥珠单抗处理，在1小时内定量区别HER2阴性和阳性肿瘤。已开发亲和体放射示踪剂以克服大的(150 kDa)抗体的缺点。到目前为止，在文献中已报道的放射标记的亲和体分子的大多数研究已采用用放射性金属或放射性卤素标记的Z_HER2:342的类似物(16、21-26)。最近，由Feldwisch和同事(27)对这种亲和体再工程改造导致在亲和体的非结合表面含有11个氨基酸取代的最佳骨架，这消除与原始蛋白A结构域-Z_HER2:2891的相似性。除了对于在FASTlab上自动位点-特异性GMP-级生产以允许对HER2成像剂的广泛临床评价的潜力之外，Z_HER2:2891还通过避免脱酰胺作用具有改进的热稳定性和化学稳定性，以及增加的非-结合表面的亲水性；易于肽合成和体内药代动力学的积极属性。后一个性质对于在放射示踪剂注射后1-2 h内允许进行成像研究是可取的。然而，在这种早期内，非-特异性吸收可能促进组织信号。使用内在的细胞吸收和体内动态成像二者以定量地区分HER2阴性和阳性肿瘤，评价¹⁸F-放射性标记的Z_HER2:2891亲和体[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]用于早期成像(1 h)的特异性。

对比度优化是成功开发成像剂的关键。高对比度主要是由放射示踪剂的高亲和力和快速的药代动力学所致。通过与其它分子成像探针比较，亲和体分子得益于短的血液循环时间和高靶标亲和力，导致在注射后相对短的时间内的高对比图像，和较慢的内化速率(internalization rates)的(23, 28, 29)。这允许利用较广泛使用的短寿命放射性同位素，例如¹⁸F和⁶⁸Ga，最大限度的减少患者的放射量测定。在与纳米体(nanobodies)的比较中，亲和体分子通过更低的K_D、更高的k_on和更慢的k_off速率而胜出(30)。关于亲和力，使用冷的未标记[¹⁹F]-GE-226[SEQ ID NO 2]的表面等离子体共振实验揭示，对人和恒河猴HER2-ECD-Fc的高亲和力结合可比得上母体Z_HER2:2891亲和体对人HER2-ECD-Fc (76pM (27))的结合。作为对比，[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]不与大鼠HER2-ECD-Fc或人p95HER2相互作用，显示出对含有ECD的人蛋白的特异性。产生[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]的放射性氟化反应(Radiofluoridation)不影响放射任一示踪剂亲和力，如通过在HER2阳性(高约11-67倍)对比阴性人乳腺癌、上胃肠道癌和卵巢癌细胞系中的高特异性细胞内在吸收所证实的。特别地，观察到的谱系独立性也提供放射示踪剂对HER2对比其它靶标像EGFR的特异性和在癌症(并非乳腺癌)中的潜在用途的支持。

用¹¹¹In经由DOTA缀合物放射标记的Z_HER2:2891临床前成像在SKOV-3异种移植物中显示良好的肿瘤靶向性(28)。虽然已报道大的放射性卤素例如¹²⁵I与¹¹¹In比较，影响亲和体分子的肿瘤靶向性，但仍观察到[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]在体内的相当高的吸收。确实，在1h的早期时间点，[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]在高HER2表达的SKOV-3肿瘤中的吸收(~60的肿瘤/肌肉比)可与对[¹¹¹In]-DOTA-Z_HER2:2891报道的吸收(~50的肿瘤/肌肉比)相当。由于与单光子计算机发射断层成像(SPECT；用于¹¹¹In放射性同位素成像(28))相比，PET的卓越的敏感性、分辨率和量化，预期[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]将在早期时间点提供比类似的基于[¹¹¹In]-DOTA-Z_HER2:2891的SPECT优越的对比度。在其它方面，延迟的成像如4 h (如果适宜的话)可导致对SPECT放射示踪剂的对比度显著增加。SKOV-3异种移植物的研究显示肿瘤示踪剂吸收在2 h时更高，但这种增加对于保证进一步评价的这个时间点的选择不是重要的。关于系统的示踪剂分布，由于在近端小管的重吸收，高的肾积聚是放射性金属示踪剂的特征(31)。在这方面，先前的用¹¹¹In标记的亲和体分子显示实质的肾定位(28、29)比肿瘤中所见的定位高约10倍，这排除在肾周围区域中的肿瘤成像，以及具有对放射量测定的影响。相反，证实了[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]的快速肾清除，在肾中没有示踪剂的显著积聚；肾放射性水平比得上于60分钟在肿瘤中的水平(表2)。其它器官(包括肝)的吸收是可以忽略的并且它仍然是难以发现的，无论以前在临床环境中的其它亲和体分子检测到的肝吸收是否归因于亲和体分布或标记策略；较早代的亲和体分子的临床进展受到高的肾和肝滞留的阻碍，这阻碍了对近端转移的看法(32)。这种作用可能至少部分是由于放射性金属的损失和在肾中放射性离子的滞留，这在临床前模型中也已经观察到，其中肾放射性比肿瘤吸收高>15倍并且超过72 h (33)。亲和体分子与白蛋白或¹⁸F放射性标记物的生物缀合(Bioconjugation)已提出为避免肾小管重吸收和允许快速肾小球滤过的替代方法(23、34、35)。发明人的结果支持用¹⁸F作为维持亲和体分子在体内的有利药代动力学性质的一种手段的放射性卤素策略。

HER2结合的特异性在体外和体内评价。许多证据表明，[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]与HER2的结合是高度特异性的：a) 示踪剂区分HER2阳性和阴性细胞和肿瘤，包括缺乏或减少对表达突变体p95HER2蛋白的细胞的结合，与体外和体内同源载体对照细胞比较，所述细胞缺乏HER2受体的细胞外结构域(17)，b) 细胞中HER2蛋白的siRNA敲除减少示踪剂吸收，c) 用冷的未标记[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]预处理细胞或小鼠导致吸收的显著减少和d)荧光标记的-GE-226的肿瘤分布与HER2蛋白共定位，如经DAKO HercepTest^TM所测定的。后者也证实亲和体的肿瘤分布在研究的异质肿瘤模型中是非限制性的。发明人宣布，[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]的以上所需的亲和力和药代动力学特性与其HER2特异性一起，导致在该研究中观察到的[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]的极高对比度PET图像。发明人承认，在该研究中的高对比图像或许也部分是由于缺乏示踪剂与啮齿动物HER2的结合导致(图6)，虽然如此，它进一步证实[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]的低的非-特异性结合，因为用于亲和体分子的啮齿动物数据已表明很好地转换成人类的成像特征。

PET成像证实在HER2阳性异种移植物中的快速示踪剂吸收。动态吸收遵循随时间推移的净不可逆结合动力学，这导致两-组织不可逆房室模型的选择以拟合肿瘤数据；代谢物的校正是不必要的，因为示踪剂在体内是稳定的(图8A)。不可逆吸收(随着成像的时间推移)使得在1小时内区分HER2阴性(NUV₆₀, MCF7和MCF7-p95HER2: 6.1 ± 0.7 %ID/mL)和HER2阳性肿瘤(NUV₆₀ MCF7-HER2: 10.9 ± 1.5；MDA-MB-361: 18.2 ± 3.4；SKOV-3: 18.7± 2.4 %ID/mL)成为可能。在示踪剂注射后的早期时间点缺乏亲和体PET数据的详细动力学分析。时间对比放射性曲线揭示在HER2阴性异种移植物中的稳态(有限洗去)背景吸收，这与在文献(23、33、36)中的这些类型的肽的正态分布动力学保持一致。为进一步研究这种现象，采用动力学建模，这强调了感兴趣的示踪剂-HER2相互作用的生物学特性。在HER2阴性异种移植物(例如，MCF7和MCF7 p95HER2)中，吸收是快速的并在60-分钟扫描期间保持稳定。由于清洗的机制主要由大小确定，亲和体分子的组织滞留长于小-分子，但是比全免疫球蛋白更有利。因此，在HER2阴性肿瘤中观察到的吸收可归因于非-特异性背景组织分布。相反，所有的HER2阳性模型在整个图像采集时帧中表现出吸收量的持续增加。发明人证实示踪剂在肿瘤中的净不可逆捕获并不是由于示踪剂递送(K₁)或血液体积(V_b)的差异导致，而是由于特异性吸收(k₃；图9B)。肿瘤吸收与由ELISA测定的HER2表达相关(r² = 0.78和0.82，当变量分别是NUV₆₀或净不可逆结合常数K_i时)。发明人将这种相关性归因于特异性亲和体-HER2相互作用，以及可能的某些受体内在化(23、28、29)；在本研究中不评价受体内在化，但荧光标记的亲和体的体内定位在该研究的时帧内并未提出实质性的内在化。重要的是，动力学建模允许定义用于HER2阳性的阈值(或更准确地确定在HER2阳性肿瘤中的不可逆吸收)。

鉴于曲妥珠单抗是最重要的HER2-靶向疗法，发明人要确保示踪剂和抗体不竞争相同的细胞外表位。发明人证实，无论是体外还是体内，[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]的吸收都不被曲妥珠单抗的存在所遮蔽。示踪剂吸收在保持与差异表位结合方面不受用曲妥珠单抗短期或连续处理的影响。由于使用的高浓度，用妥珠单抗体外预处理24小时后吸收的较少但显著的降低很可能与改变的受体内在化或其它动力学相关(37, 38)。

最后，发明人证实[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]适合作为HSP90抑制的药效学的标记物。这些化合物中的最有前景的NVP-AUY922 (39)目前处于II期临床试验中并且先前已表明下调HER2表达(40)，其在体外和体内经[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2] PET正确的确认。这与Smith-Jones和同事们的报告一致，他们类似地证明HSP90抑制剂，17-烯丙基氨基格尔德霉素，降解HER2，导致曲妥珠单抗的[⁶⁸Ga]-标记的F(ab’)₂片段的吸收减少(36)。

总之，[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2] PET成像允许准确地区分HER2受体表达，而不管肿瘤异质性、细胞谱系，或先前的曲妥珠单抗处理。由于所述示踪剂的低的非特异性结合，短寿命放射性标记的使用及其有利的药代动力学特性，发明人期望其具有良好的安全性和放射量测定特征。这些数据支持所计划的这种示踪剂在癌症患者中的临床开发。

表

表1：GE-226[SEQ ID NO 2]与人和恒河猴HER2的结合动力学概述。

表1:

表2:

[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]在携带肿瘤的BALB/c裸小鼠中的生物分布。组织吸收表示为%ID/g组织± SD (每个时间点n=3)。

附图描述

图1. [¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]高选择性和灵敏性地与HER2结合。(A) 不同谱系和差异HER2状态的细胞系暴露于[¹⁸F]GE-226 [SEQ ID NO 2] 60分钟并保持作为对总蛋白标准化的%应用放射性而测量的放射性(n=1，5-6个重复的均值 ± SD)。如经蛋白质印迹法测定的全长和截短的p95 HER2蛋白表达对于相同细胞系示于上小图中。(B) 在0.5 mg/mL阻断剂量的[¹⁹F]GE-226[SEQ ID NO 2]的存在或不存在下，使SKOV-3细胞与[¹⁸F]GE-226[SEQID NO 2]一起培养60分钟并测量细胞-结合的活性(P < 0.0001；在不同的3天，n=3 (一式三份)的均值 ± SD)。(C) 与非-靶向混杂对照比较，60分钟后HER2表达经siRNA和示踪剂滞留短暂废除(P < 0.0001；在不同的3天，n=3 (一式三份)的均值 ± SD)；经蛋白质印迹法证实敲除。

图2. [¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]具有与曲妥珠单抗不同的结合位点并在HSP90抑制时检测HER2降解。(A) SKOV-3细胞用10 µg/mL曲妥珠单抗处理1或24 h并与[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]一起培养另外1小时和保留活性(与未处理的对照组比较) (*** P <0.0001；在不同的5天，n=5 (一式三份)的均值 ± SD)。对HER2蛋白表达的作用示于下小图中。(B) HSP90抑制剂NVP-AUY922对HER2表达的作用和随之发生的对示踪剂吸收的影响(与对照组比较，对于所有浓度，P < 0.0001；在不同的3天，n=3 (一式三份)的均值 ± SD)。

图3. [¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]在可区分的HER2表达异种移植物模型中的肿瘤特性。(A) 携带SKOV-3异种移植物的小鼠的代表性OSEM3D重建的PET-CT图像。白色箭头表示肿瘤，橙色箭头表示肾。(B) 比较在指示的异种移植物模型中的肿瘤时间对比放射性曲线(均数(n=6) ± SEM，除了MCF7-p95HER2 n=3 ± SEM外)。(C) NUV60和HER2表达之间的相关性，如经ELISA对肿瘤溶胞产物所测定的。(D) 组织药代动力学分析，使用单一输入2-组织3k模型以推导K_i，对于在肿瘤中示踪剂的净不可逆滞留的速率常数。(E) NUV₆₀和K_i(E)之间的相关性。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。(F) 在PET扫描前，用在PBS中的30 mg/kg [¹⁹F]GE-226经静脉注射20分钟处理携带SKOV-3异种移植物的小鼠并与未处理的对照组比较。曲线图显示平均肿瘤时间对比放射性曲线(每组n=6 ± SEM, P = 0.0002)。(G) 用或不用如在(F)中描述的阻断剂量处理的小鼠的代表性PET-CT图像，和阻断实验的动力学分析。

图4. 在特定异质性的肿瘤中GE-226[SEQ ID NO 2]与HER2蛋白表达共同定位。GE-226[SEQ ID NO 2]用荧光素标记并注入携带NCI-N87和A431两种肿瘤的小鼠中，其分别表达高和低水平的HER2。对肿瘤切片并对相邻的切片用DAKO HercepTest^TM染色，或者用于免疫荧光显微镜检测。

图5. [¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]结合不干扰曲妥珠单抗处理并可预测对HSP90抑制的反应。(A) 携带SKOV-3异种移植物的小鼠在扫描前2小时用50 mg/kg曲妥珠单抗经腹膜内注射处理。使动物恢复，用25 mg/kg曲妥珠单抗再处理两次并在初始扫描后7天再成像(n=6 ± SEM)。一只小鼠，其在早期和晚期的扫描中都是具有低示踪剂吸收的异常值(outlier)并单独显示。(B) A的药代动力学分析(P = 0.025)。(C) 在SKOV-3异种移植物模型中比较NVP-AUY922处理(n=5 ± SEM)与媒介处理的对照组(n=4 ± SEM)和(D) 抑制常数的动力学分析(P = 0.011)。

图6. GE-226 [SEQ ID NO 2]高亲和力地结合于人(A)和恒河猴(B) HER2，但不结合于人p95HER2 (C)或大鼠HER2 (D)，如通过表面等离子体共振所测定的。

图7：示踪剂吸收依赖于特异性活性。SKOV-3细胞在接受示踪剂后立即(t₀)、在第一次培养后70 min (t₇₀)或者140 min (t₁₄₀)用20 µCi/mL [¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]脉冲并测定细胞-结合的放射性。N=1，至少一式两份。误差：SD。

图8：A，小鼠经静脉内注射给予3.7 MBq [¹⁸F]GE-226 [SEQ ID NO 2]并在注射后10、30和60分钟通过放射-HPCL量化代谢产物。代谢稳定性通过比较母体峰(滞留时间(RT)~10.6分钟)与代谢产物(RT ~29分钟)评价并表示为%放射化学纯度(RCP)。B，从对携带SKOV-3异种移植物的小鼠(n=6)的心、肿瘤和肾中的吸收的PET数据推导的时间对比放射性曲线。

图9：A，在各种异种移植物模型中的HER2表达，如经ELISA测定的。B，在这些异种移植物中的[¹⁸F]GE-226[SEQ ID NO 2]结合的动力学参数。

图10：未用过药物的或曲妥珠单抗-处理的携带SKOV-3异种移植物的小鼠的心(A、B)和肾(C、D)中的吸收的TAC和AUC_0-60 (***P = 0.0004)。

图11：与媒介(10% DMSO和5% Tween-20，在PBS中)比较，用3个剂量的50 mg/kgNVP-AUY922处理后在SKOV-3肿瘤中的HER2表达。

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20. Calderwood SK, Khaleque MA, Sawyer DB, Ciocca DR. 癌症中的热休克蛋白：肿瘤发生的伴侣蛋白(Heat shock proteins in cancer: chaperones oftumorigenesis). Trends Biochem Sci 2006; 31:164-72.

21. Kramer-Marek G, Bernardo M, Kiesewetter DO, Bagci U, Kuban M, Aras O等乳腺癌鼠模型中的含有18F-ZHER2:342亲和体的HER2-阳性肺转移的PET：与18F-FDG的比较(PET of HER2-positive pulmonary metastases with 18F-ZHER2:342 affibody ina murine model of breast cancer: comparison with 18F-FDG). J Nucl Med 2012;53:939-46.

22. Kramer-Marek G, Gijsen M, Kiesewetter DO, Bennett R, Roxanis I,Zielinski R等 PET预测曲妥珠单抗处理在ErbB2-阳性人异种移植物肿瘤模型中的反应的可能性(Potential of PET to predict the response to trastuzumab treatment inan ErbB2-positive human xenograft tumor model). J Nucl Med 2012; 53:629-37.

23. Kramer-Marek G, Kiesewetter DO, Capala J. 在治疗后乳腺癌异种移植物中的HER2表达变化可使用PET和(18)F-标记的亲和体分子量化(Changes in HER2expression in breast cancer xenografts after therapy can be quantified usingPET and (18)F-labeled affibody molecules). J Nucl Med 2009; 50:1131-9.

24. Malmberg J, Sandstrom M, Wester K, Tolmachev V, Orlova A. 用于携带前列腺癌异种移植物的小鼠中播散性前列腺癌的体内分子模式的成像剂生物分布的比较：聚焦于111In-和125I-标记的抗-HER2人源化单克隆曲妥珠单抗和ABY-025亲和体(Comparative biodistribution of imaging agents for in vivo molecularprofiling of disseminated prostate cancer in mice bearing prostate cancerxenografts: focus on 111In- and 125I-labeled anti-HER2 humanized monoclonaltrastuzumab and ABY-025 affibody). Nucl Med Biol 2011; 38:1093-102.

25. Orlova A, Magnusson M, Eriksson TL, Nilsson M, Larsson B, Hoiden-Guthenberg I等使用皮摩尔亲和力HER2结合亲和体分子的肿瘤成像(Tumor imagingusing a picomolar affinity HER2 binding affibody molecule). Cancer Res 2006;66:4339-48.

26. Tolmachev V, Nilsson FY, Widstrom C, Andersson K, Rosik D, Gedda L等In-111-苄基-DTPA-Z(HER2 : 342)，一种用于恶性肿瘤中HER2表达的体内成像的基于亲和体的缀合物(In-111-benzyl-DTPA-Z(HER2 : 342), an affibody-based conjugate forin vivo imaging of HER2 expression in malignant tumors). J Nucl Med 2006; 47:846-53.

27. Feldwisch J, Tolmachev V, Lendel C, Herne N, Sjoberg A, Larsson B等亲和体分子的最佳构架的设计(Design of an optimized scaffold for affibodymolecules). J Mol Biol 2010; 398:232-47.

28. Ahlgren S, Orlova A, Wallberg H, Hansson M, Sandstrom M, Lewsley R等使用111In-ABY-025，一种具有根本上重新工程改造的骨架的第二代亲和体分子的HER2-表达肿瘤的靶向(Targeting of HER2-expressing tumors using 111In-ABY-025, asecond-generation affibody molecule with a fundamentally reengineeredscaffold). J Nucl Med 2010; 51:1131-8.

29. Malmberg J, Perols A, Varasteh Z, Altai M, Braun A, Sandstrom M等使用N-末端DOTA、NOTA和NODAGA螯合剂在携带前列腺癌异种移植物的小鼠中用111In位点-特异性标记的合成抗-HER2亲和体分子的比较性评价(Comparative evaluation ofsynthetic anti-HER2 Affibody molecules site-specifically labelled with 111Inusing N-terminal DOTA, NOTA and NODAGA chelators in mice bearing prostatecancer xenografts). Eur J Nucl Med Mol Imaging 2012;39:481-92.

30. Xavier C, Vaneycken I, D'Huyvetter M, Heemskerk J, Keyaerts M, VinckeC等用于癌症中HER2受体表达的iPET成像的68Ga-NOTA-抗-HER2纳米体的合成、临床前验证、放射量测定和毒性(Synthesis, Preclinical Validation, Dosimetry, andToxicity of 68Ga-NOTA-Anti-HER2 Nanobodies for iPET Imaging of HER2 ReceptorExpression in Cancer). J Nucl Med 2013.

31. Behr TM, Goldenberg DM, Becker W. 减少用于诊断和治疗的放射标记的抗体片段和肽的肾吸收：目前的现状、未来展望和限制(Reducing the renal uptake ofradiolabeled antibody fragments and peptides for diagnosis and therapy:present status, future prospects and limitations). Eur J Nucl Med 1998; 25:201-12.

32. Baum RP, Prasad V, Müller D, Schuchardt C, Orlova A, Wennborg A等在乳腺癌患者中，使用合成111In-或68Ga-标记的亲和体分子的HER2-表达恶性肿瘤的分子成像(Molecular Imaging of HER2-Expressing Malignant Tumors in Breast CancerPatients Using Synthetic 111In- or 68Ga-Labeled Affibody Molecules). J NuclMed 2010; 51:892-7.

33. Orlova A, Tolmachev V, Pehrson R, Lindborg M, Tran T, Sandström M等合成的亲和体分子：一类新的用于HER2-表达恶性肿瘤的分子成像的亲和力配体(Synthetic Affibody Molecules: A Novel Class of Affinity Ligands forMolecular Imaging of HER2-Expressing Malignant Tumors). Cancer Res 2007; 67:2178-86.

34. Hoppmann S, Miao Z, Liu S, Liu H, Ren G, Bao A等用于HER2-阳性癌症靶向的放射标记的亲和体−白蛋白生物缀合物(Radiolabeled Affibody−AlbuminBioconjugates for HER2-Positive Cancer Targeting). Bioconj Chem 2011; 22:413-21.

35. Orlova A, Jonsson A, Rosik D, Lundqvist H, Lindborg M, Abrahmsen L等使用ABY-027，一种新的HER2-靶向亲和体分子-白蛋白-结合结构域融合蛋白的位点-特异性放射性金属标记和改进的生物分布(Site-Specific Radiometal Labeling andImproved Biodistribution Using ABY-027, A Novel HER2-Targeting AffibodyMolecule-Albumin-Binding Domain Fusion Protein). J Nucl Med 2013.

36. Smith-Jones PM, Solit DB, Akhurst T, Afroze F, Rosen N, Larson SM. 应答于Hsp90抑制剂的HER2降解的药效学成像(Imaging the pharmacodynamics of HER2degradation in response to Hsp90 inhibitors). Nat Biotech 2004; 22:701-6.

37. Shukla R, Thomas TP, Peters JL, Desai AM, Kukowska-Latallo J, PatriAK等用树状聚体缀合的抗-HER2 mAb的HER2特异性肿瘤靶向(HER2 Specific TumorTargeting with Dendrimer Conjugated Anti-HER2 mAb). Bioconj Chem 2006;17:1109-15.

38. Valabrega G, Montemurro F, Aglietta M. 曲妥珠单抗：在HER2-过度表达乳腺癌中的作用机理、抗性和未来展望(Trastuzumab: mechanism of action, resistanceand future perspectives in HER2-overexpressing breast cancer). Ann Oncol2007.

39. Eccles SA, Massey A, Raynaud FI, Sharp SY, Box G, Valenti M等 NVP-AUY922：一种对抗异种移植物肿瘤生长、血管生成和癌转移的新的热休克蛋白90抑制活性剂(NVP-AUY922: A Novel Heat Shock Protein 90 Inhibitor Active againstXenograft Tumor Growth, Angiogenesis, and Metastasis). Cancer Res 2008;68:2850-60.

40. Oude Munnink TH, Korte MAd, Nagengast WB, Timmer-Bosscha H, SchröderCP, Jong JRd等 89Zr-曲妥珠单抗PET使人肿瘤异种移植物中通过HSP90抑制剂NVP-AUY922的HER2下调可视化(89Zr-trastuzumab PET visualises HER2 downregulation bythe HSP90 inhibitor NVP-AUY922 in a human tumour xenograft). Eur J Cancer2010; 46:678-84。

Claims

1. 一种监测对HSP90抑制的反应的方法，其包括以下步骤：

(a) 给予受试者与18F缀合的分离多肽，其中所述分离多肽与HER2或其变体特异性地结合；和

(b) 使所述受试者成像；和

(c) 监测所述成像剂组分的吸收以测量HSP90抑制。

2.依据权利要求1的方法，其中所述分离多肽是HER2-结合的18F-放射性标记的Affibody®分子ZHER2:2891，其序列在序列表中描述。

3.与18F缀合的分离多肽的用途，其中所述分离多肽与HER2或其变体特异性地结合，其用作监测其吸收的成像剂以测量HSP90抑制。

4.权利要求3的用途，其配制成像剂以监测其吸收，以测量HSP90抑制。

5.权利要求3或4的用途，其中18F-放射性标记的Affibody®分子ZHER2:2891，其序列在序列表中描述，被用于监测癌症患者(乳腺癌、胃癌和其它表达HER2的肿瘤)对HSP90抑制的反应。