CN116832180A - 一种靶向乳腺癌的多肽pet分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针及其制备方法和应用。本发明所述靶向乳腺癌的多肽PET分子探针是在AR多肽的基础上，通过对双功能螯合剂修饰的AR多肽用正电子放射性核素标记得到，具有合成简便、分子量小、特异性强、无免疫原性及生物安全性好的优势。此外，本发明所述多肽PET分子探针具有较高的放射性化学性能及体内外稳定性，相较于当前常用的显像剂，其能够更好的实现乳腺癌靶向PET成像，可用于制备乳腺癌诊断用显像剂，有助于乳腺癌的临床诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其准确诊断对乳腺癌的治疗具有重要意义。PET/CT在乳腺癌的诊断、临床分期、疗效评估、随访及预后预测及指导治疗中有着重要作用。PET显像剂是PET/CT成像的灵魂，是可以实现精准活体探测机体分子层面信息的强大工具，开发新型高效PET示踪剂一直是专业人员的不断追求。
目前，18F-FDG是临床上应用最广泛的显像剂，但其敏感性和特异性受病变较小或乳腺癌亚型的限制，无法准确诊断乳腺癌。此外，炎症组织中18F-FDG的积累也使乳腺肿瘤的鉴别变得困难。靶向PET成像在包括乳腺癌的精准探测上显示出重要作用。如基于HER2、EGFR、ER、RGD等肿瘤靶向PET成像显示出在乳腺癌精准诊疗的价值。但这些分子部分由于在乳腺癌中表达不够多、特异性不足使其应用空间受限。因此，开发新型靶向乳腺癌的PET分子探针仍具有重要临床价值及需求。
2017年，毛传斌教授通过活体噬菌体技术筛选出新型乳腺癌靶向多肽，其分子序列为AREYGTRFSLIGGYR(简称AR)，体内外实验结果显示出良好的乳腺癌靶向性。但在以多肽AR为基础制备靶向乳腺癌的PET分子探针的过程中发现，若仅通过常规分子修饰方法，如双功能螯合剂修饰后再标记正电子放射性核素制备得到的PET分子探针的靶向性和稳定性等并不能满足乳腺癌诊断的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以多肽AR为基础，利用常规分子修饰方法制备得到的多肽PET分子探针的靶向性和稳定性等并不能满足乳腺癌诊断的需要的缺陷和不足，提供一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针及其制备方法和应
本发明的第一个目的是提供一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针。
本发明的第二个目的是提供所述多肽PET分子探针在制备靶向乳腺癌的显像产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述多肽PET分子探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述多肽PET分子探针的制备方法。
本发明的第五个目的是提供一种用于乳腺癌诊断的显像剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明实验发现，以多肽AR(AREYGTRFSLIGGYR)为基础，利用NOTA或DOTA进行修饰，再标记正电子放射性核素68Ga制备得到的靶向乳腺癌的多肽PET分子探针不能很好地满足乳腺癌诊断的需要。为解决这一问题，本发明在双功能螯合剂与多肽AR之间连入了Linker嵌段，但连入的Linker嵌段的不同，所得多肽PET分子探针的稳定性、亲水性等性能的变化也千差万别。通过不断的调整优化，本发明最终制备得到了一种稳定性和亲水性高、体内安全性好的可特异性靶向乳腺癌细胞的多肽PET分子探针。
本发明提供了一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针，所述多肽PET分子探针是通过对双功能螯合剂修饰的AR多肽用正电子放射性核素标记得到；所述AR多肽为AREYGTRFSLIGGYR；所述双功能螯合剂与多肽AR之间还含有linker；所述linker为GGGKKKK-PEG3或K-PEG3。
具体地，所述双功能螯合剂为DOTA或NOTA。
具体地，所述正电子放射性核素为68Ga或18F。
具体地，本发明中使用的双功能螯合剂为NOTA。
作为一种可选的实施方式，本发明所述多肽PET分子探针为AREYGTRFSLIGGYR-GGGKKKK-PEG3-NOTA，简称NOTA-P-AR。
作为一种可选的实施方式，本发明所述多肽PET分子探针为AREYGTRFSLIGGYR-K-PEG3-NOTA，简称NOTA-P-K-AR。
具体地，本发明在多肽PET分子探针NOTA-P-AR的NOTA端标记68Ga，命名为68Ga-NOTA-P-AR；或在多肽PET分子探针NOTA-P-K-AR的NOTA端标记18F，命名为Al18F-NOTA-P-K-AR。
具体地，本发明所述的靶向乳腺癌的多肽PET分子探针的制备方法包括以下步骤：
S1.人工合成本发明所述的双功能螯合剂修饰的AR多肽；
S2.对步骤S1所述的双功能螯合剂修饰的AR多肽进行正电子放射性核素标记。
具体地，所述正电子放射性核素为68Ga或18F。
具体地，所述正电子放射性核素68Ga的标记方法为：将合成的双功能螯合剂修饰的AR多肽溶于水中得到前体溶液，用0.8～1.2mL 0.1mol/L盐酸溶液淋洗锗镓发生器至容器中，加入80～100μg前体溶液混匀，随后加入80～120μL 1mol/L的醋酸钠溶液混匀，将混合液pH值调至3.5～4.5，98～100℃加热8～12min，反应结束后，将反应液冷却至室温。
更具体地，将利用固相化学方法合成的NOTA-P-AR溶于去离子水中，得到浓度为1μg/μL的前体溶液，用0.1mol/L高纯度盐酸溶液淋洗锗镓(68Ge/68Ga)发生器至EP管中，收集放射性含量最高的1mL，加入100μg前体溶液(1μg/μL，100μL)混匀，随后加入100μL醋酸钠(1mol/L)溶液混匀，将混合液pH值调至3.5～4.5，100℃加热10min，反应结束后，将反应液冷却至室温，得到68Ga-NOTA-P-AR。
具体地，所述正电子放射性核素18F的标记方法为：将合成的双功能螯合剂修饰的AR多肽溶于水中得到前体溶液，用0.4～0.6mL生理盐水洗脱富集在QMA柱上的18F离子，收集淋洗液，加入24～26μL的AlCl3醋酸钠缓冲液以及80～100μg前体溶液混匀，用稀盐酸将混合液pH调至4，110℃加热12～15min，反应结束后，将反应液冷却至室温。
更具体地，将利用固相化学方法合成的NOTA-P-K-AR溶于去离子水中，得到浓度为1μg/μL的前体溶液，用0.5mL生理盐水洗脱富集在QMA柱上的18F离子，收集淋洗液，加入25μL的AlCl3醋酸钠缓冲液，以及100μg前体溶液(1μg/μL，100μL)混匀，随后加入0.05mol/L稀盐酸将混合液pH调至4，110℃加热15min，反应结束后，将反应液冷却至室温，得到Al18F-NOTA-P-K-AR。
本发明还请求保护所述多肽PET分子探针在制备靶向乳腺癌的显像产品中的应用。
本发明还请求保护所述多肽PET分子探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
本发明还提供了一种用于乳腺癌诊断的显像剂，所述显像剂中含有本发明所述多肽PET分子探针。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针及其制备方法。本发明所述靶向乳腺癌的多肽PET分子探针是在AR多肽的基础上，通过对双功能螯合剂修饰的AR多肽用正电子放射性核素标记得到，具有合成简便、分子量小、特异性强、无免疫原性及生物安全性好的优势。此外，本发明所述多肽PET分子探针具有较高的放射性化学性能及体内外稳定性，相较于当前常用的显像剂来说，所述探针能够更好的实现乳腺癌靶向PET成像，可用于制备乳腺癌诊断用显像剂，有助于乳腺癌的临床诊断。
附图说明
图1为本发明所述NOTA-P-AR的化学结构式以及由其制备得到的多肽PET分子探针68Ga-NOTA-P-AR的放射性化学纯度检测结果；其中，图A为NOTA-P-AR的化学结构式，图B和C依次为68Ga-NOTA-P-AR在PBS和FBS中的HPLC图谱。
图2为本发明所述NOTA-P-K-AR的化学结构式以及由其制备得到的多肽PET分子探针Al18F-NOTA-P-K-AR的放射性化学纯度检测结果；其中，图A为NOTA-P-K-AR的化学结构式，图B和C依次为Al18F-NOTA-P-K-AR在PBS和FBS中的HPLC图谱。
图3为MCF-7细胞和MCF-10A细胞对AR-FITC的摄取情况。
图4为MCF-7细胞和4T1细胞对68Ga-NOTA-P-AR的内化情况。
图5为MCF-7细胞对Al18F-NOTA-P-K-AR的内化情况。
图6为68Ga-NOTA-P-AR在MCF-7及4T1荷瘤小鼠的PET成像情况及其在不同时间点下的肿瘤放射性摄取及肿瘤/肌肉比值的比较；其中，图A和B分别为68Ga-NOTA-P-AR注射后10、30、60和120min在MCF-7(A)和4T1(B)荷瘤小鼠具有代表性的PET图像；图C和D为基于PET图像定量分析68Ga-NOTA-P-AR的肿瘤摄取情况和肿瘤/肌肉(T/M)比值。
图7为68Ga-NOTA-P-AR在MCF-7荷瘤小鼠的动态成像结果；其中，图A为静脉注射68Ga-NOTA-P-AR后120min动态扫描MCF-7肿瘤模型的代表性冠状面Micro-PET图像；图B为MCF-7肿瘤和肌肉定量时间-活性曲线。
图8为68Ga-NOTA-P-AR、阻断组和18F-FDG在MCF-7荷瘤小鼠的成像情况对比以及68Ga-NOTA-P-AR和阻断组在荷MCF-7小鼠的成像情况；其中，图A为68Ga-NOTA-P-AR注射后30min以及阻断组和18F-FDG在MCF-7荷瘤小鼠的代表性PET图像；图B为阻断组和非阻断组中，MCF-7肿瘤对68Ga-NOTA-P-AR的摄取情况，***p＜0.001；图C为68Ga-NOTA-P-AR与18F-FDG不同时间点的肿瘤/肌肉(T/M)比值。
图9为Al18F-NOTA-P-K-AR在MCF-7荷瘤小鼠的动态成像结果；其中，图A为Al18F-NOTA-P-K-AR在MCF-7荷瘤小鼠体内的PET图像，肿瘤组织为白色箭头的位置；图B为120min内肿瘤和肌肉的时间-活性曲线；图C为定量计算肿瘤和肌肉摄取的比值(T/M)。
图10为Al18F-NOTA-P-K-AR/阻断组在MCF-7荷瘤小鼠的0.5h静态显像情况；其中，图A为MCF-7荷瘤小鼠体内Al18F-NOTA-P-K-AR以及共注射NOTA-AR后30min的正常显像和阻断显像；图B为定量分析阻断实验的肿瘤摄取值；**P＜0.01。
图11为68Ga-NOTA-P-AR在正常balb/c小鼠的重要组织脏器的生物分布和血液半衰期；其中，图A为采用经典的双室模型拟合获得血液样本的时间-活性曲线；图B为68Ga-NOTA-P-AR在正常balb/c小鼠的重要组织脏器的生物分布情况。
图12为Al18F-NOTA-P-K-AR为在正常balb/c小鼠的重要组织脏器的生物分布和血液半衰期；其中，图A为采用经典的双室模型拟合获得血液样本的时间-活性曲线；图B为Al18F-NOTA-P-K-AR在正常balb/c小鼠的重要组织脏器的生物分布情况。
图13为NOTA-P-AR在小鼠体内的安全性实验结果；其中，图A为组织病理H&E染色结果，图B为血常规和血生化结果。
图14为NOTA-P-K-AR在小鼠体内的安全性实验结果；其中，图A为组织病理H&E染色结果，图B为小鼠血常规和血生化结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1分子探针68Ga-NOTA-P-AR及Al18F-NOTA-P-K-AR的制备
1、多肽PET分子探针68Ga-NOTA-P-AR的制备
本发明所述多肽PET分子探针68Ga-NOTA-P-AR的制备具体如下：
S1.利用固相化学方法合成具有NOTA修饰的AR多肽(AREYGTRFSLIGG YR-GGGKKKK-PEG3-NOTA，简称NOTA-P-AR)；所述NOTA-P-AR是委托合肥国肽生物有限公司合成；
S2.对NOTA-P-AR进行68Ga标记；将利用固相化学方法合成的NOTA-P-AR溶于去离子水中，得到浓度为1μg/μL的前体溶液，用0.1mol/L高纯度盐酸溶液淋洗锗镓(68Ge/68Ga)发生器至EP管中，收集放射性含量最高的1mL，加入100μg前体溶液(1μg/μL，100μL)混匀，随后加入100μL醋酸钠(1mol/L)溶液混匀，将混合液pH值调至3.5～4.5，100℃加热10min，反应结束后，将反应液冷却至室温，得到68Ga-NOTA-P-AR。
2、多肽PET分子探针Al18F-NOTA-P-K-AR的制备
本发明所述多肽PET分子探针Al18F-NOTA-P-K-AR的制备具体如下：
S1.利用固相化学方法合成具有NOTA修饰的AR多肽(AREYGTRFSLIGG YR-K-PEG3-NOTA，简称NOTA-P-K-AR)；所述NOTA-P-K-AR是委托合肥国肽生物有限公司合成；
S2.对NOTA-P-K-AR进行18F标记；将利用固相化学方法合成的NOTA-P-K-AR溶于去离子水中，得到浓度为1μg/μL的前体溶液，用0.5mL生理盐水洗脱富集在QMA柱上的18F离子，收集淋洗液，加入25μL的AlCl3醋酸钠缓冲液，以及100μg前体溶液(1μg/μL，100μL)混匀，随后加入0.05mol/L稀盐酸将混合液pH调至4，110℃加热15min，反应结束后，将反应液冷却至室温，得到Al18F-NOTA-P-K-AR。
实施例2分子探针68Ga-NOTA-P-AR及Al18F-NOTA-P-K-AR的表征
1、高效液相色谱(HPLC)测标记率
(1)利用高效液相色谱(日本岛津公司)对68Ga-NOTA-P-AR的放射性进行检测，方法如下：使用Waters HPLC系统配备Waters C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为水(含0.1％三氟乙酸(TFA))，流动相B为乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱条件：0～20min，15％B～90％B；20～30min，90％B～15％B；洗脱剂中含有0.1％TFA，流速为1mL/min。
(2)使用高效液相色谱(Agilent)对Al18F-NOTA-P-K-AR的放射性进行检测，方法如下：使用Agilent HPLC系统配备Agilent C18分析柱(ZORBAX 300SB-C18 5μm，4.6mm×250mm)，流动相A为水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈，流速为1mL/min，梯度洗脱条件：0～10min，0％B～100％B；10～15min，100％B，流速为1mL/min。4、放化纯和稳定性的测定
取50μL(约7.4MBq)的68Ga-NOTA-P-AR反应液分别加入500μL的PBS和500μL胎牛血清(FBS)，37℃孵育1h和2h后，取少量样品用HPLC法测定其放射化学纯度以观察其体外稳定性。对于胎牛血清，先用等量乙腈稀释沉淀血浆蛋白，然后12000r/min下离心5min，取少量上清液HPLC进行分析。同样地，Al18F-NOTA-P-K-AR与PBS和FBS孵育1h和2h后观察其体外稳定性。
2、脂水分配系数的测定
取10μL(约1.85MBq)的68Ga-NOTA-P-AR反应液，依次加入0.5mL PBS与0.5mL正辛醇，密封后充分混匀，1000r/min离心5分钟，分别收集有机相和水相各100μL用于伽马计数器计数；由公式LogP＝Log(计数正辛醇/计数PBS)计算标记物的平均LogP值，重复三次。采用同样的方法对Al18F-NOTA-P-K-AR计算其脂水分配系数。
3、结果
本发明所述NOTA-P-AR的化学结构式以及由其制备得到的多肽PET分子探针68Ga-NOTA-P-AR的放射性化学纯度检测结果如图1所示，图1中的A为NOTA-P-AR的化学结构式，图1中的B和C依次为68Ga-NOTA-P-AR在PBS和FBS中的HPLC图谱。由图1中的B和C可知，68Ga-NOTA-P-AR的保留时间为11.098min，放化纯度>97％，其在PBS和FBS中孵育1h和2h后的放射性纯度均高于95％，说明68Ga-NOTA-P-AR的稳定性良好。
本发明所述NOTA-P-K-AR的化学结构式以及由其制备得到的多肽PET分子探针Al18F-NOTA-P-K-AR的放射性化学纯度检测结果如图2所示；图2中的A为NOTA-P-K-AR的化学结构式，图2中的B和C依次为Al18F-NOTA-P-K-AR在PBS和FBS中的HPLC图谱。由图2中的B和C可知，Al18F-NOTA-P-K-AR的保留时间为9.004min，放化纯度>97％，其在PBS和FBS孵育1h和2h后的放射性纯度均高于95％，同样说明Al18F-NOTA-P-K-AR探针稳定性良好。
此外，脂水分配系数的测定结果显示，68Ga-NOTA-P-AR探针的脂水分配系数为-2.98±0.12，Al18F-NOTA-P-K-AR探针的脂水分配系数为-2.73±0.09，提示本发明所述多肽PET分子探针亲水性良好，利于体内代谢清除。
由上述结果可知，本发明制备得到的多肽PET分子探针68Ga-NOTA-P-AR和Al18F-NOTA-P-K-AR的放化纯度高，亲水性和稳定性好，为其在乳腺癌诊断中的应用奠定了良好基础。
实施例3分子探针在荷乳腺癌小鼠模型中的显像应用
本实施对多肽PET分子探针68Ga-NOTA-P-AR和Al18F-NOTA-P-K-AR的活体皮下肿瘤显像效果进行了评估。先用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)修饰AR多肽(AREYGTRFSLIGGYR)获得探针AR-FITC(委托合肥国肽生物有限公司合成)，再通过细胞荧光染色定性评估AR-FITC探针对MCF-7(人乳腺癌细胞系)和MCF-10A(人乳腺上皮细胞)的特异性靶向能力；另通过细胞内化试验评估68Ga-NOTA-P-AR和Al18F-NOTA-P-K-AR对MCF-7和/或4T1细胞的亲和力。此外，构建动物模型，包括MCF-7和4T1荷瘤小鼠模型，分别进行静态和动态PET显像，分析其感兴趣区域(region of interest，ROI)和肿瘤/本底比值，确定最佳显像时间和评估显像效果。其中，实验组为：68Ga-NOTA-P-AR或Al18F-NOTA-P-K-AR，阻断组为：68Ga-NOTA-P-AR+NOTA-AR(AREYGTRFSLIGGYR-NOTA，无Linker嵌段及放射性修饰)或Al18F-NOTA-P-K-AR+NOTA-AR。最后进行生物分布实验并测定探针的血液半衰期，根据各脏器组织的单位质量的放射性摄取百分数(％ID/g)分析其放射性浓聚分布器官和时间代谢特点。其中，68Ga-NOTA-P-AR探针的显像时间设置为10min、0.5、1、2h及2h动态；Al18F-NOTA-P-K-AR探针的显像时间设置为0.5h静态显像及2h动态显像；68Ga-NOTA-P-AR探针的生物分布时间设置为0.5、1和2h；Al18F-NOTA-P-K-AR探针的生物分布时间设置为10min、0.5、1和2h；68Ga-NOTA-P-AR探针血液半衰期时间设置为0、3、5、10、20、30、60、120、240、360min；Al18F-NOTA-P-K-AR探针血液半衰期时间设置为1、3、5、10、20、30、45、60、120、240min。
具体如下：
1、细胞共聚焦实验
将MCF-7肿瘤细胞和MCF-10A细胞以适宜密度(5×105个/孔)种于共聚焦培养皿中，孵育过夜后，每孔加入0.5mL AR-FITC(30μg/mL)，37℃条件下孵育1h，洗涤、固定、DAPI染核后在共焦显微镜下对细胞进行荧光成像。
2、细胞内化实验
分别将MCF-7和4T1细胞以适宜密度(5×105个/孔)种于12孔板中，培养过夜后每孔加入含7.4kBq 68Ga-NOTA-P-AR的无血清培养基，37℃条件下孵育30min，用冰冻PBS(pH7.4)洗涤3遍，再用甘氨酸盐酸溶液(1M，pH 2.2)处理10min，分别收集上清液(膜结合探针)和细胞沉淀，然后用氢氧化钠溶液(1N)裂解细胞，测定内化探针，收集细胞悬液用γ计数器测量放射性。利用MCF-7细胞进行Al18F-NOTA-P-K-AR的细胞内化实验，除孵育时间为10、30、60和120min外，其余处理与上述细胞内化实验相同。
3、动物模型构建
构建动物模型所用小鼠为NOG小鼠和BALB/c裸鼠，雌性，4～6周龄，SPF级。每只NOG小鼠右侧腋窝皮下接种1.0×107个MCF-7细胞(100μL基质胶与PBS混合细胞悬液)，BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下接种5.0×106个4T1细胞，待肿瘤体积为0.8～1cm时进行动物实验。
4、PET显像
分别在MCF-7或4T1荷瘤小鼠尾静脉注射3.7～5.55(多次成像，注射量在此区间即可)MBq的68Ga-NOTA-P-AR和18F-FDG(每组3只)，阻断组小鼠同时注射等活度的68Ga-NOTA-P-AR和过量的非放射标记多肽(NOTA-AR)；分别于注射后10min、0.5、1、2h进行静态PET图像采集；MCF-7荷瘤小鼠动态采集2h。采用同样方法对MCF-7荷瘤小鼠注射Al18F-NOTA-P-K-AR进行静态及动态显像。
5、生物分布和药代动力学
每只雌性BALB/c小鼠(n＝3/每个时间点)通过尾静脉注射3.7MBq(100μCi)的68Ga-NOTA-P-AR；在注射0.5h、1h和2h后，通过颈椎脱位处死动物，分别取动物的血液、心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、肌肉、骨和脑，称重并用γ计数器测定放射性计数；同样地，在注射Al18F-NOTA-P-K-AR探针10min、0.5h、1h和2h后，测定放射性计数，结果用每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)表示。为评估68Ga-NOTA-P-AR的血液保留时间，用γ计数仪分别对注射后0、0.05、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、6h采集的血样进行计数；同样，为评估Al18F-NOTA-P-K-AR的血液保留时间，用γ计数仪分别对注射后0.02、0.05、0.08、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4h采集的血样进行计数；使用Origin 8.5进行统计分析。
6、体内安全性实验
小鼠(n＝3/组)静脉注射100μL PBS和NOTA-P-AR或NOTA-P-K-AR(5mg/kg)，于注射后24h和4周采血，检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)和肌酐并进行全血计数；随后处死小鼠，收集主要脏器(脾、肝、肺、心、肾)进行组织病理学分析。
7、结果
MCF-7细胞和MCF-10A细胞对AR-FITC的摄取情况如图3所示，由图3可知，通过细胞免疫荧光可检测到MCF-7细胞和MCF-10A细胞对AR-FITC的摄取，且MCF-7细胞荧光强度明显高于MCF-10A细胞。
MCF-7细胞和4T1细胞对68Ga-NOTA-P-AR的内化情况如图4所示，由图4可知，68Ga-NOTA-P-AR与MCF-7细胞共孵育30min后，细胞内内化(Internalized)和细胞膜结合(Membrane bound)的摄取值分别为0.69±0.06％AD和1.28±0.08％AD，总内化率为34.8±0.6％。4T1细胞内化和细胞膜结合的摄取值分别为0.56±0.02％AD和1.04±0.05％AD，总内化率为35.2±0.3％。MCF-7细胞对Al18F-NOTA-P-K-AR的内化情况如图5所示，由图5可知，随着孵育时间的增加，Al18F-NOTA-P-K-AR与MCF-7细胞内内化和膜结合的摄取值逐渐增加，120min时最高，分别为4.14±0.06％AD和47.58±1.46％AD，120min时总内化率为8.0±0.17％AD。由上述结果可知，本发明所述68Ga-NOTA-P-AR和Al18F-NOTA-P-K-AR的内化率分别为35.2±0.3％，37.41±8.70％。
68Ga-NOTA-P-AR在MCF-7及4T1荷瘤小鼠的PET成像情况及其在不同时间点的肿瘤放射性摄取及肿瘤/肌肉比值的比较如图6所示，68Ga-NOTA-P-AR在MCF-7荷瘤小鼠的动态成像如图7所示，68Ga-NOTA-P-AR和18F-FDG在MCF-7荷瘤小鼠成像的对比以及68Ga-NOTA-P-AR/阻断组在荷MCF-7小鼠的成像情况如图8所示。由图6～8可知，在PET静态和动态显像中，68Ga-NOTA-P-AR可在MCF-7荷瘤小鼠模型中成功靶向显影MCF-7皮下肿瘤。在注射10min后68Ga-NOTA-P-AR即可被MCF-7肿瘤快速、高摄取(3.60±0.14％ID/g)，注射后1h肿瘤/肌肉比值最高，为9.1±1.02。在过量未标记多肽NOTA-AR预处理的MCF-7荷瘤小鼠中，肿瘤摄取明显降低，为0.31±0.06％ID/g，说明68Ga-NOTA-P-AR能特异性被MCF-7皮下肿瘤摄取、滞留，并在注射后60min获得良好的对比分辨图像。与18F-FDG相比，MCF-7肿瘤的68Ga-NOTA-P-AR放射性摄取较弱，但由于其低背景摄取和高病灶摄取，肿瘤在68Ga-NOTA-P-AR图像上更容易识别。
Al18F-NOTA-P-K-AR探针在MCF-7荷瘤小鼠动态PET显像情况如图9所示，Al18F-NOTA-P-K-AR/阻断组在MCF-7荷瘤小鼠的0.5h静态显像情况如图10所示。由图9和图10可知，在PET静态和动态显像中，Al18F-NOTA-P-K-AR可在荷MCF-7小鼠模型成功靶向显影MCF-7皮下肿瘤。在动态显像中，注射10min后Al18F-NOTA-P-K-AR可被MCF-7肿瘤快速、高摄取(1.59±0.42％ID/g)，注射后1h肿瘤/肌肉比值最高，为3.09±0.19。在0.5h静态显像中，可获得良好的对比分辨图像，肿瘤摄取为3.4±0.53％ID/g，而过量未标记多肽NOTA-AR预处理的MCF-7荷瘤小鼠中，肿瘤摄取明显降低，为1.4±0.21％ID/g，说明Al18F-NOTA-P-K-AR能特异性被MCF-7皮下肿瘤摄取、滞留。在不同时间点图像中，肾脏和膀胱均表现出明显的放射性摄取，表明该药物主要通过肾脏途径排泄。
68Ga-NOTA-P-AR在正常balb/c小鼠的重要组织脏器的生物分布和血液半衰期如图11所示，Al18F-NOTA-P-K-AR为在正常balb/c小鼠的重要组织脏器的生物分布和血液半衰期如图12所示。由图11和12可知，所述多肽PET分子探针在重要组织脏器的生物分布和血液半衰期与成像结果基本一致。在正常小鼠的生物分布实验中，分子探针68Ga-NOTA-P-AR和Al18F-NOTA-P-K-AR在肾脏摄取较高，其中，68Ga-NOTA-P-AR在0.5h、1h和2h的摄取(％ID/g)分别为84.02±4.08，89.17±3.94，61.72±6.88(n＝3)；Al18F-NOTA-P-K-AR在10min、0.5h、1h和2h的摄取(％ID/g)分别为14.10±1.91，4.48±0.65，2.44±0.36和2.03±0.18(n＝3)。两种探针在肝脏和胃肠的摄取较低且在血液消除较快，表明68Ga-NOTA-P-AR和Al18F-NOTA-P-K-AR通过肾脏排泄，而非肝胆排泄。采用经典的双室模型拟合获得血液样本的时间-活性曲线，68Ga-NOTA-P-AR的半衰期为12min(图11中的A，r2＝0.99)，Al18F-NOTA-P-K-AR的半衰期为18min(图12中的A，r2＝0.99)，表明两种探针在血液中快速清除。
NOTA-P-AR及NOTA-P-K-AR在小鼠体内的安全性实验结果分别如图13和图14所示，图13和图14中的A均为病理组织HE染色结果，图13和14中的B均为血常规和血生化结果。由图13和图14可知，脏器组织切片未见结构或组织病理性改变；与对照组相比，注射后24h，实验组ALT、BUN和肌酐水平有轻微的瞬时变化，而注射2周后，水平几乎回落到基线水平，但AST水平稍微升高，全血检查结果显示除白细胞数量稍微变化，其他细胞无明显差异，表明本发明所述多肽PET分子探针的安全性良好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向乳腺癌的多肽PET分子探针，其特征在于，所述多肽PET分子探针是通过对双功能螯合剂修饰的AR多肽用正电子放射性核素标记得到；所述AR多肽为AREYGTRFSLIGGYR；所述双功能螯合剂与多肽AR之间还含有linker；所述linker为GGGKKKK-PEG3或K-PEG3。
2.根据权利要求1所述多肽PET分子探针，其特征在于，所述双功能螯合剂为DOTA或NOTA。
3.根据权利要求1所述多肽PET分子探针，其特征在于，所述正电子放射性核素为68Ga或18F。
4.根据权利要求2所述多肽PET分子探针，其特征在于，所述双功能螯合剂为NOTA。
5.权利要求1～4任一所述的多肽PET分子探针在制备靶向乳腺癌的显像产品中的应用。
6.权利要求1～4任一所述的多肽PET分子探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
7.权利要求1～4任一所述的多肽PET分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.合成权利要求1～4中任意所述的双功能螯合剂修饰的AR多肽；
S2.对步骤S1所得双功能螯合剂修饰的AR多肽进行正电子放射性核素标记。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当所述正电子放射性核素为68Ga时，其标记方法为：将合成的双功能螯合剂修饰的AR多肽溶于水中得到前体溶液，用0.8～1.2mL0.1mol/L盐酸溶液淋洗锗镓发生器至容器中，加入80～100μg前体溶液混匀，随后加入80～120μL 1mol/L的醋酸钠溶液混匀，将混合液pH值调至3.5～4.5，98～100℃加热8～12min，反应结束后，将反应液冷却至室温。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，当所述正电子放射性核素为18F时，其标记方法为：将合成的双功能螯合剂修饰的AR多肽溶于水中得到前体溶液，用0.4～0.6mL生理盐水洗脱QMA柱上的18F离子，收集淋洗液，加入24～26μL的AlCl3醋酸钠缓冲液以及80～100μg前体溶液混匀，用稀盐酸将混合液pH调至4，110℃加热12～15min，反应结束后，将反应液冷却至室温。
10.一种用于乳腺癌诊断的显像剂，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述多肽PET分子探针。
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| CN202310614183.5A CN116832180A (zh) | 2023-05-26 | 2023-05-26 | 一种靶向乳腺癌的多肽pet分子探针及其制备方法和应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN117338961A (zh) * | 2023-10-13 | 2024-01-05 | 江南大学 | 一种pd-l1靶向分子探针及其制备方法和应用 |
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2023
- 2023-05-26 CN CN202310614183.5A patent/CN116832180A/zh active Pending
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