CN102603895B - 新颖抗原结合多肽和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新颖抗原结合多肽(ABP)和其用途。

Description

新颖抗原结合多肽和其用途
分案说明
本申请案是申请日为2005年6月17日，申请号为200580019955.0(国际申请号为PCT/US2005/021579)，发明名称为新颖抗原结合多肽和其用途的专利申请的分案申请。
交叉参考相关申请案
本申请案主张于2004年6月18日提出申请的美国临时专利申请案第60/581,334号、2005年1月28日提出申请的美国临时专利申请案第60/648,222号和2005年2月17日提出申请的美国临时专利申请案第60/654,018号的优先权，所述专利申请案的说明书以引用的方式全文并入本文中。
技术领域
本发明涉及包含至少一种非天然编码氨基酸的新颖抗原结合多肽。本发明一般涉及使用化学和重组DNA通过分子生物学方法产生和选择抗原结合多肽的领域。
背景技术
天然产生的抗体(Ab)是由两个相同免疫球蛋白(Ig)重链和两个相同轻链组成的四聚结构。Ab的重链和轻链由不同域组成。各轻链具有一个可变域(VL)和一个恒定域(CL)，而各重链具有一个可变域(VH)和三或四个恒定域(CH)。由约110个氨基酸残基组成的各功能域折叠成由两个β片层相互包装所形成的特征性β三明治结构，称为免疫球蛋白折叠。VL域各具有三个互补决定区(CDR1-3)，而VH域各具有多达四个互补决定区(CDR1-4)，互补决定区为在功能域的一端连接β链的环或转角。轻链和重链的可变区通常有助于抗原特异性，而尽管个别链对特异性的贡献并非必需相等。通过随机CDR环，抗体分子已发展成结合于许多分子。
可以通过蛋白水解和通过重组方法制备Ab的功能子结构。这些功能子结构包括Fab片段、Fv片段和Fc部分，其中Fab片段包含通过一个链内二硫键连接的重链VH-CH1域和轻链VL-CL1域，Fv片段仅包含VH和VL域，并且Fc部分包含分子的非抗原结合区。在一些情况下，单一VH域保留与抗原的显著亲和力(Ward等人，1989，Nature 341，554-546)。也已经显示某些单聚κ轻链应特异地结合于其抗原。(L.Masat等人，1994，PNAS 91：893-896)。已经发现分离的轻链或重链有时也保留一些抗原结合活性(Ward等人，1989，Nature 341，554-546)。
另一功能子结构为单链Fv(scFv)，其包含通过肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。这些小(Mr25,000)蛋白通常保留与单多肽内抗原的特异性和亲和力，并且可以提供对大、抗原特异性分子的便利构件单元(building block)。循环中scFV的短半衰期限制其在许多情况中的治疗效用。
用部分Ig VH域作为模板设计称为“微型抗体(minibody)”的小蛋白骨架(Pessi等人，1993，Nature 362，367-369)。通过使对应于VH的CDR1和CDR2的环随机化并接着使用噬菌体展示法选择突变体来鉴别与白细胞介素-6具有高亲合力(解离常数(Kd)为约10-7M)的微型抗体(Martin等人，1994，EMBO J.13，5303-5309)。
当分析骆驼血清的IgG样物质时，发现骆驼通常缺乏可变轻链域，表明足够的抗体特异性和亲和力可能仅来源于VH域(三或四个CDR环)。已经制出具有高亲和力的“骆驼化”VH域，并且可以仅通过使CDR3随机化来产生高特异性。
“微型抗体”的一个替代是“微型双功能抗体(diabody)”。微型双功能抗体是具有两个抗原结合位点的小、二价、双特异性抗体片段。所述片段包含在同一多肽链(VH-VL)上与轻链可变域(VL)相连接的重链可变域(VH)。微型双功能抗体大小与Fab片段相似。通过使用过短而不能使同一链上的两个功能域之间配对的连接子，使得功能域与另一条链上的互补功能域配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚抗体片段或“微型双功能抗体”是二价的且具有双特异性。参看，P.Holliger等人，PNAS90：6444-6448(1993)。
已经制得CDR肽和有机CDR模拟物(Dougall等人，1994，Trends Biotechnol.12，372-379)。CDR肽是对应抗体CDR环的氨基酸序列的短肽(通常为环状)。CDR环负责抗体-抗原互作。CDR肽和有机CDR模拟物已经显示保留了一些结合亲和力(Smyth &von Itzstein，1994，J.Am.Chem.Soc.116，2725-2733)。已经将小鼠CDR移植到人类Ig框架而不丧失亲和力(Jones等人，1986，Nature 321，522-525；Riechmann等人，1988)。
在身体内，选择特异性Ab并从大文库扩增(亲和力成熟)。可以使用重组文库技术活体外复制所述过程。在细菌噬菌体表面上成功地展示Ab片段已经使产生并筛选许多CDR突变体成为可能(McCafferty等人，1990，Nature 348，552-554；Barbas等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982；Winter等人，1994，Annu.Rev.Immunol.12，433-455)。通过此技术产生越来越多的Fab和Fv(及其衍生物)。重组技术可以与Ab模拟物结合。
可能充当蛋白骨架的许多蛋白域已经表现为与噬菌体衣壳蛋白的融合体。参看Clackson & Wells，Trends Biotechnol.12：173-184(1994)。已经将这些蛋白域中的数种用作骨架以展示随机肽序列，包括牛胰腺胰岛素抑制剂(Roberts等人，PNAS 89：2429-2433(1992))、人类生长激素(Lowman等人，Biochemistry 30：10832-10838(1991)，Venturini etal.，Protein Peptide Letters 1：70-75(1994))和链球菌(Streptococcus)IgG结合域(C′Neil等人，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L，编辑)第517-524页，Academic Press，San Diego(1994))。这些折叠已展示出单一随机环或区。已经将淀粉酶抑肽(tendamistat)用作丝状噬菌体M13上的呈递骨架(presentation scaffold)(McConnell和Hoess，1995，J.Mol.Biol.250：460-470)。
ErbB家族的受体酪氨酸激酶在细胞生长和分化中起至关重要的作用。这些受体的异常活化与人类癌症相关。二聚化(受体配对)是所有ErbB受体信号转导活性所必需的。已经显示，阻断ErbB2二聚活性直接抑制ErbB2与其它ErbB2受体蛋白二聚化的能力。抑制受体二聚化阻止ErbB信号转导途径的激活。下调ErbB信号转导的拮抗分子可以充当抗肿瘤剂。目前，ErbB信号转导网络是开发抗肿瘤药物的主要目标。ErbB-1是EGF的特异性受体，而ErbB-2具有未知的天然配体。ErbB2在添加EGF时能够与ErbB-1形成异源二聚体。ErbB2还充当激酶死亡(kinase-dead)ErbB-3和ErbB-4的首选二聚化伴侣，所述两者均为神经调节素(neuregulin)的受体。也可以在信号转导期间通过细胞因子和G偶联蛋白受体的配体以间接方式激活ErbB信号转导网络，表明其在许多不同细胞类型的生长控制中起重要作用。
原癌基因c-erbB-1编码表皮生长因子受体。其名字起源于从禽类成红细胞增多症病毒(avian erythroblastosis virus，AEV)分离出来的病毒同源v-erbB，其作为缺乏氨基末端配体结合域的鸡c-ErbB-1基因的片段包含于该病毒中。在包括各种位点鳞状癌和腺癌的许多肿瘤中发生erbB-1基因的过度表达。人类c-erbB-1基因位于染色体区7p14和7p12中。
ErbB-2原癌基因(又称为Neu、EGFR-2或HER-2)是跨膜受体酪氨酸激酶家族的成员，其也包括EGF受体和EGFR-3(HER-3或ErbB-3)。ErbB-2编码具有内在酪氨酸激酶活性的185kDa跨膜受体样糖蛋白。尽管ErbB-2并不具有任何已知高亲和力配体，但是可以通过过度表达或与ErbB家族受体的其它成员异质结合而在无配体的情况下激活其激酶活性。已经在将近40％原发性人类乳癌中发现ErbB-2基因的扩增和其产物的过度表达。ErbB-2过度表达也在卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌中被发现。通过与神经调节素受体ErbB-3和ErbB-4形成异源二聚体的神经调节素来活化ErbB-2。人源化抗ErbB-2单克隆抗体贺赛汀(Herceptin)(来自单克隆4D5)已经得到FDA批准而用于治疗过度表达ErbB-2的癌症。正在开发的另一种抗ErbB-2抗体是帕妥珠单抗(Pertuzumab)(来自单克隆2C4)。ErbB-1(EGF受体)的酪氨酸激酶活性的特异性抑制剂也正在进行临床试验。
抗ErbB2抗体在所属技术领域中是已知的，且包括(但不限于)美国专利第4,753,894号、第5,169,774号、第5,677,171号、第5,720,937号、第5,720,954号、第5,725,856号、第5,770,195号、第5,772,997号、第5,783,186号、第6,054,561号、第6,165,464号、第6,333,169号、第6,015,567号、第6,387,371号、第6,399,063号、第6,441,143号、第6,458,356号、第6,627,196号，各专利文献均以引用的方式并入本文。
共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(简称为PEG)是一种增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长许多生物活性分子(包括蛋白、肽和特定疏水性分子)循环时间的方法。PEG已经广泛用于医药品、人工移植体和其它应用中，在这些应用中生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性是重要的。为了将PEG的所需特性最大化，连接于生物活性分子的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以能够赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加水溶性和增加循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
PEG衍生物通常经例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N端和碳水化合物部分的反应性化学官能团与生物活性分子相连接。蛋白与其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。最适合于经聚合物连接而进行修饰的位点通常在受体结合中起重要作用，且是要保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上这些反应性位点的不加选择的连接通常导致经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人，(1996)，J.Biol.Chem.，271：21969-21977。为了形成具有足以对靶分子赋予所需优势的聚合物分子量的结合物，先前技术方法通常涉及许多聚合物臂与分子的随机连接，进而增加母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
形成用于PEG衍生物与蛋白连接的基因座的反应性位点由蛋白结构决定。包括酶在内的蛋白由各种α氨基酸序列组成，其具有一般结构H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N--)结合邻近氨基酸的羧基部分(--COOH)以形成酰胺键，可由--(NH--CHR--CO)n--表示，其中下标“n”可以等于数百或数千。由R所示的片段可以含有用于蛋白生物活性和用于PEG衍生物连接的反应性位点。
举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在--NH2部分。ε位--NH2部分对于在碱性pH条件下的反应而言是游离的。大部分用PEG进行蛋白衍生化的领域的技术已经针对于开发PEG衍生物来用于连接存在于蛋白中的赖氨酸残基的ε位--NH2部分。″Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation″，Nektar MolecularEngineering Catalog，2003，第1-17页。所有这些PEG衍生物均具有一般限制，然而它们不能够被选择性地安置于蛋白表面上所存在的许多赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对于蛋白活性是重要的情况下，例如存在于酶活性位点中，或者在赖氨酸残基对介导蛋白与其它生物分子互作起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这会是一个显著限制。
现有蛋白PEG化方法的第二个且等同重要的复杂因素在于PEG衍生物还会与所需残基之外的残基发生不良副反应。组氨酸含有由结构--N(H)--所示的反应性亚氨基部分，但是许多与ε位--NH2反应的化学反应性物质也可与--N(H)--反应。同样，氨基酸半胱氨酸的侧链具有由结构-SH所示的游离巯基。在一些情况下，针对赖氨酸ε--NH2基团的PEG衍生物也可与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这会产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的、异源混合物，以及破坏靶生物分子活性的风险。需要开发允许化学官能团引入蛋白内的单个位点的PEG衍生物，从而能够使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白表面上明确定义并且可预测的特异性位点处的生物活性分子选择性偶联。
除了赖氨酸残基之外，所属领域中的大量工作是针对于开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N端)的活性PEG试剂。参看，例如美国专利第6,610,281号(其以引用的方式并入本文)和″Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation″，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。可以使用定点突变和所属领域中其它已知技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白结构中，且所得游离巯基部分可以与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，所述方法的复杂之处在于引入游离巯基会使所得蛋白的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有将化学官能团引入生物活性分子中的方法，以便能够使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白选择性偶合，而同时与巯基和其它通常发现于蛋白中的化学官能团相容(即，不与其发生不良副反应)。
如所属领域中的取样结果可见，已经证实，所开发出的用于与蛋白的侧链连接，尤其是与赖氨酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分连接的这些衍生物中的许多在其合成与使用中存在问题。一些与遭受水解的蛋白形成不稳定键，并因而分解、降解或者在水环境中不稳定，例如在血流中。一些形成更稳定的键，但在形成键之前遭受水解，意味着PEG衍生物上的反应性基团可能在蛋白被连接之前就失活了。一些具有少许毒性，并因此较不适合在活体内使用。一些反应太慢而实际上不可用。一些因为连接于负责蛋白活性的位点而导致蛋白活性丧失。一些对其所连接的位点不具有特异性，这也可能导致所要活性丧失和结果的再现性缺乏。为了克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白相关的难题，已经开发出更为稳定的PEG衍生物(例如美国专利6,602,498，其以引用的方式并入本文)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应的PEG衍生物(例如美国专利6,610,281，其以引用的方式并入本文)。所属领域明确地需要在生理环境中呈化学惰性直至指定选择性反应以形成稳定化学键的PEG衍生物。
最近，已经报导一种蛋白科学中完全新型技术，其允诺克服许多与蛋白位点特异性修饰相关的限制。明确来说，已经将新组分添加于原核生物大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)(例如L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)和真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)(S.cerevisiae)(例如J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白生物合成机构中，使得能够将非遗传编码氨基酸活体内并入蛋白中。已经使用此方法有效且高保真地将许多具有新颖化学、物理或生物性质的新氨基酸(包括光亲和力标记和光异构化氨基酸、酮氨基酸和糖基化氨基酸)并入响应于琥珀密码子TAG的大肠杆菌和酵母蛋白中。参看，例如J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin，& P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024；和L.Wang，& P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-10。这些研究已经证实，能够选择性地且常规地引入在蛋白中所未发现的、对在20个普通的遗传编码的氨基酸中的所有官能团呈化学惰性的且可用于有效地和选择性地反应以形成稳定共价键的化学官能团，例如酮基、炔基和叠氮部分。
将非遗传编码氨基酸并入蛋白中的能力允许引入能够有价值地替换天然发生官能团的化学官能团，所述天然发生官能团为例如赖氨酸的-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等等。已知某些化学官能团对发现于20个普通的、遗传编码氨基酸中的官能团呈惰性，但可明确地且有效地反应以形成稳定键。举例来说，所属领域已知叠氮基和乙炔基在存在催化量铜的情况下在水条件中遭受Huisgen[3+2]环化加成反应。参看，例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew. Chem.Int.Ed.41：2596-2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白结构中，能够引入对发现于蛋白中的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性、但可与乙炔部分平稳且有效地反应以形成环化加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮保留化学惰性和在存在其它蛋白侧链情况下和在生理条件下的非反应性。
本发明尤其致力于解决与抗原结合多肽及其片段的活性和产生相关的问题，同时也致力于具有改进生物性质或药理学性质(例如改进治疗半衰期)的抗原结合多肽的产生。
发明内容
本发明提供包含一种或一种以上非天然编码氨基酸的抗原结合多肽(ABP)。在一些实施例中，ABP包含完整抗体重链。在一些实施例中，ABP包含完整抗体轻链。在一些实施例中，ABP包含抗体轻链的可变区。在一些实施例中，ABP包含抗体重链的可变区。在一些实施例中，ABP包含抗体轻链的至少一个CDR。在一些实施例中，ABP包含抗体重链的至少一个CDR。在一些实施例中，ABP包含轻链的至少一个CDR和重链的至少一个CDR。在一些实施例中，ABP包含Fab。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上Fab。在一些实施例中，ABP包含scFv。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上scFv。在一些实施例中，ABP包含微型抗体。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上微型抗体。在一些实施例中，ABP包含微型双功能抗体。在一些实施例中，ABP包含两个或两个以上微型双功能抗体。在一些实施例中，ABP包含轻链可变区和重链可变区。在一些实施例中，ABP包含完整轻链和完整重链。在一些实施例中，ABP包含一个或一个以上Fc域或其部分。在一些实施例中，ABP包含任何上述实施例的组合。在一些实施例中，ABP包含任何上述实施例的同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。在一些实施例中，ABP包含与结合伴侣结合的多肽，其中结合伴侣包含抗原、多肽、核酸分子、聚合物或其它分子或物质。在一些实施例中，ABP与非抗体骨架分子或物质相关。
在一些实施例中，ABP包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，ABP与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，ABP与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它ABP连接。在一些实施例中，ABP连接于并非ABP的多肽。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽连接于一个或一个以上也可包含非天然编码氨基酸的其它抗原结合多肽。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物连接于第二多肽。在一些实施例中，第二多肽为抗原结合多肽。
在一些实施例中，抗原结合多肽包含至少两个连接于包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的亲和力相比时，调节抗原结合多肽对抗原的亲和力的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的稳定性相比时，增加抗原结合多肽稳定性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的免疫原性相比时，调节抗原结合多肽免疫原性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的血清半衰期或循环时间相比时，调节抗原结合多肽血清半衰期或循环时间的替换、添加或缺失。
在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的水溶性相比时，增加抗原结合多肽水溶性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的溶解性相比时，增加宿主细胞中所产生的抗原结合多肽溶解性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的表达相比时，增加宿主细胞中或活体外所合成的抗原结合多肽表达的替换、添加或缺失。在一些实施例中，抗原结合多肽包含当与对应无替换、添加或缺失的抗原结合多肽的蛋白酶抗性相比时，增加抗原结合多肽蛋白酶抗性的替换、添加或缺失。
在一些实施例中，可以用天然发生或非天然发生氨基酸进行ABP中的氨基酸替换，其限制条件在于至少一个替换是用非天然编码氨基酸进行。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，多肽是抗原至少一种活性的激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸和一种或一种以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
本发明还提供包含编码抗原结合多肽的多聚核苷酸的经分离核酸，其中多聚核苷酸包含至少一个选择密码子，其包括(但不限于)SEQ ID NO：18，20，22，25，27，29。在一些实施例中，选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
本发明还提供制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的经分离抗原结合多肽与包含与非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸对水溶性聚合物具反应性，而所述水溶性聚合物对任何20个普通氨基酸不具反应性。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸对连接子、聚合物或生物活性分子具反应性，而所述连接子、聚合物或生物活性分子对任何20个普通氨基酸不具反应性。
在一些实施例中，通过使包含含羰基氨基酸的抗原结合多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。
在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含含有氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。
在一些实施例中，通过使包含含炔氨基酸的抗原结合多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。
在一些实施例中，通过使包含含叠氮氨基酸的抗原结合多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为支链聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)支链聚合物的各分枝具有1kD与100kDa之间或1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，连接于抗原结合多肽的水溶性聚合物包含聚烷撑二醇部分。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入ABP中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且水溶性聚合物包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明还提供包含含有非天然编码氨基酸的抗原结合多肽和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。
本发明还提供包含编码抗原结合多肽的且含有选择密码子的多聚核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含用以将非天然编码氨基酸替换进抗原结合多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制造包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许抗原结合多肽表达的条件下培养包含编码抗原结合多肽的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基纯化抗原结合多肽。
本发明还提供增加抗原结合多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供调节抗原结合多肽免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸替换天然发生抗原结合多肽中的任何一种或一种以上氨基酸，和/或将抗原结合多肽连接于连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
本发明还提供用有效量的本发明抗原结合多肽治疗需要此治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含对患者投与治疗有效量的包含含有非天然编码氨基酸的抗原结合多肽和医药学上可接受的载剂的医药组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。
本发明还提供包含SEQ ID NO：19，21，23，24，26，28，30，31中所示序列及其片段或任何其它抗原结合多肽序列的抗原结合多肽，但条件是至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸替换。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明还提供包含医药学上可接受的载剂和抗原结合多肽的医药组合物，所述抗原结合多肽包含SEQ ID NO：19，21，23，24，26，28，30，31中所示序列及其片段或任何其它抗原结合多肽序列，其中至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物经由糖部分连接于多肽。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子经由糖部分连接于抗原结合多肽。
本发明还提供包含经共价键连接于抗原结合多肽的单一氨基酸处的水溶性聚合物的抗原结合多肽。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，共价连接于水溶性聚合物的氨基酸为存在于多肽中的非天然编码氨基酸。
本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的抗原结合多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接于多肽。在一些实施例中，多肽被单PEG化。本发明还提供包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的ABP多肽，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入多肽中的预选位点处。
在另一实施例中，由于用于与非天然氨基酸结合的独特化学反应，因此包含一个或一个以上非天然发生氨基酸的抗原结合多肽与另一分子(包括，但不限于，PEG)的结合提供实质上纯的抗原结合多肽。可以执行包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的抗原结合多肽与另一分子(例如PEG)的结合，而同时在结合步骤之前或之后实施其它纯化技术，以提供实质上纯的抗原结合多肽。
附图说明
图1是抗体分子(IgG)及其抗原结合部分的一般结构图。抗原识别位点内含CDR。
图2显示用于scFv-108周质(图2，A)和细胞质(图2，B)表达/抑制的构建体。指示琥珀终止密码子的位置。显示用于Fab-108片段(图2，C)表达/抑制的双顺反子级联。显示用于scFv-4D5片段周质表达/抑制的构建体(图2，D和E)。显示用于Fab-4D5片段表达/抑制的的顺反子(图2，F)。
图3显示GlySer连接子(S131Am)内第二丝氨酸中琥珀突变的抑制(图3，A)和相应含pAcF的scFv的IMAC纯化分析(图3，B)。
图4显示scFv细胞质表达期间VL链(L156)中的琥珀突变抑制。
图5，A显示pAcF-scFv-108片段的PEG化和二聚化。分别用单箭头和双箭头指示单PEG化scFv和二聚体的位置。图5，B显示pAcF-scFv-108片段-(S136)的PEG化。图5，C显示未观察到WT scFv片段的PEG化。
图6是显示在scFv-108同源二聚体纯化期间所收集的洗脱份的凝胶。
图7，A-C显示含有pAcF或pAcF-PEG的scFv蛋白与表达EGF受体的A431细胞的结合。
图8，A是显示mAb 108的含有pAcF或pAcF-PEG的Fab片段的凝胶。图8，B-D显示mAb 108的Fab片段与表达EGF受体的A431细胞的结合。
图9显示本发明的异源双官能ABP的实例。
图10是显示C端(图10，A)或N端scFv-4D5(图10，B)片段的GlySer连接子的第二丝氨酸中琥珀突变抑制的凝胶。
图11显示在还原和非还原条件下pAcF-Fab-4D5-(K139)和Fab-4D5-cys(图11，A)的SDS-PAGE分析。图11，B显示使用抗His抗体的图11，A中所示样品的Western印迹。
图12显示连接于肽T20的HIV-1中和人Fab 4E10。
图13是显示二聚化过程的图示。
图14显示scFv二聚体形成的非还原(图14，A)和还原(图14，B)SDS-PAGE分析。
图15显示经纯化scFv二聚体的SDS-PAGE分析。
具体实施方式
定义
应了解，本发明并不限于本文所述的特定方法、实验方案、细胞系、构建体和试剂，且因此可以变化。也应了解，本文所用术语仅是用于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明的保护范围，本发明的保护范围仅由所附的权利要求书限定。
除非本文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”和“所述”包括复数形式。因此，例如提及“抗原结合多肽”或“ABP”是指一个或一个以上的所述蛋白，并且包括所属领域技术人员所已知的它的均等物，等等。
除非另外定义，否则本文所用的所有科技术语均具有与本方面所属领域技术人员所一般理解的相同含义。尽管在本发明的实施或检验中可以使用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料，但是现在描述优选方法、装置和材料。
本文所提及的所有公开案和专利均引入本文用作参考，以用于描述和公开(例如)公开案中所述的可能与本发明相关使用的构建体和方法。仅提供本文所讨论的公开案在本申请案申请日之前的公开内容。本文决不应解释为准许本发明者无权借助先前发明或为任何其它原因提前本发明。
术语“实质上纯的”是指实质上或基本上不含通常伴随于天然发生环境中发现的蛋白或与所述蛋白互作的组分(即，在重组产生ABP的情况下为天然细胞或宿主细胞)的ABP。可以实质上不含细胞物质的ABP包括具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(以干重量计)污染蛋白的蛋白制剂。当通过宿主细胞重组产生ABP或其变体时，此污染蛋白可以约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少的细胞干重存在。当通过宿主细胞重组产生ABP或其变体时，培养基中可存在约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少的细胞干重的污染蛋白。因此，如通过例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法测定，由本发明的方法所产生的“实质上纯的”ABP可以具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度，尤其是至少约75％、80％、85％的纯度，且更具体来说至少约90％的纯度，至少约95％的纯度，至少约99％或更高的纯度。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指无论使用何种插入方法(例如，直接摄取、转导、f配合(f-mating)或所属领域已知用于建立重组宿主细胞的其它技术)而包括外源多聚核苷酸的细胞。外源多聚核苷酸可以维持为非整合载体(例如质粒)，或者可整合至宿主基因组中。
如本文所用术语“介质”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或可支撑或含有任何宿主细胞的刚性支撑物，所述任何宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌和细胞内容物。因此，所述术语可以涵盖宿主细胞所生长的介质，例如ABP所分泌于其中的介质，包括增殖步骤之前或之后的介质。所述术语也涵盖含有宿主细胞溶解液的缓冲液或试剂，例如在ABP于细胞内产生和宿主细胞被溶解或破坏而释放出ABP的情况下。
如本文关于蛋白重新折叠(protein refolding)所用的“还原剂”定义为维持还原状态的巯基并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员轻易地了解许多还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文关于蛋白重新折叠所用的“氧化剂”定义为能够从被氧化的化合物移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤苏糖醇(erythreitol)和氧气。所属领域技术人员轻易地了解许多氧化剂适用于本发明的方法中。
如本文所用“变性剂(denaturing agent或denaturant)”定义为可引起蛋白可逆打开的任何化合物或物质。可以通过特定变性剂的性质和浓度来确定变性剂的强度。合适的变性剂可以是离液剂、去污剂、有机溶剂、与水混溶的溶剂、磷脂或两种或两种以上这些试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。可用的去污剂可以包括(但不限于)强去污剂，例如十二烷基硫酸钠和聚氧乙烯醚类(例如Tween或Triton去污剂)，N-十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)；温和非离子去污剂(例如洋地黄皂甙(digitonin))；温和阳离子去污剂，例如N-＞2，3-(二油酰氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子去污剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子去污剂，包括(但不限于)含磺基甜菜碱类(sulfobetaine)(Zwittergent)、3-(3-胆酰胺丙基丙基)二甲基胺-1-丙硫酸盐(3-(3-chlolamidopropyl)dimethylammonio-1-propane sulfate，CHAPS)和3-(3-胆酰胺丙基丙基)二甲基胺-2-羟基-1-丙磺酸盐(3-(3-chlolamidopropyl)dimethylammonio-2-hydroxy-l-propane sulfonate，CHAPSO)。可以将与水混溶的有机溶剂，例如乙腈、较低碳数烷醇(尤其是C2-C4烷醇，例如乙醇或异丙醇)或较低碳数烷二醇(尤其是C2-C4烷二醇，例如乙二醇)用作变性剂。可用于本发明的磷脂可以是天然发生磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇或合成磷脂衍生物或变体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文所用“重新折叠(refolding)”描述将含有二硫键的多肽从不恰当折叠状态或打开状态转化成关于二硫键的天然或恰当折叠构象的任何过程、反应或方法。
如本文所用“共折叠”具体是指采用至少两个相互作用的多肽且导致打开或不恰当折叠多肽转化成天然、恰当折叠多肽的重新折叠过程、反应或方法。
抗体是指对特异性抗原展示结合特异性的蛋白。天然抗体通常为约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，其由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链组成。各轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。各重链在一端具有可变域(VH)，接种是许多恒定域。各轻链在一段具有可变域(VL)而在另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，而轻链可变域与重链可变域对齐。人们认为，特定氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“可变”事实上是指不同抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同，并且负责各特定抗体与其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并非在抗体的可变域中均匀分布。其集中在轻链和重链可变区域中三个称为互补决定区(CDR)的节段内。更为高度保守的可变域部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个大部分采用β片层构型的由三个或四个CDR连接的FR区，其形成环接，且在一些情况下形成部分β片层结构。各链中的CDR由FR区紧密地固持在一起，与其它链的CDR一起促使形成抗体的抗原结合位点(参看Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。
恒定域并不直接涉及抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子功能。视重链恒定区的氨基酸序列而定，可以将抗体或免疫球蛋白指派为不同类别。存在五类主要免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有几类可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。对应不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。在各种人类免疫球蛋白类别中，仅已知人IgG1、IgG2、IgG3和IgM激活补体。
抗体活体内亲和力成熟受较高亲和力抗体变体的抗原选择所驱动，所述较高亲和力抗体变体主要是通过体细胞超突变(somatic hypermutagenesis)而制得。“组成部分转变(repertoire shift)”也通常发生，其中发现再次应答或第三次应答的主要胚系基因(germline gene)不同于初次或再次应答的那些。
可以通过活体外向抗体基因中引入突变且使用亲和选择法分离具有改进亲和力的突变体来复制免疫系统的亲和力成熟过程。所述突变体抗体可以展示在丝状细菌噬菌体或微生物(例如酵母)的表面上，并且可以通过抗体与抗原的亲和力或通过抗体与抗原解离的动力学(解离速率(off-rate))来选择抗体。Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。已经采用CDR步移突变(walking mutagenesis)来使结合人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的人包膜糖蛋白gp120的人抗体(Barbas III等人，PNAS(USA)91：3809-3813(1994)；和Yang等人，J.Mol.Biol.254：392-403(1995))和抗c-erbB-2单链Fv片段(Schier等人，J.Mol.Biol.263：551567(1996))亲和力成熟。已经采用抗体链改组(clain shuffling)和CDR突变来使针对HIV第三超变环的高亲和力人抗体亲和力成熟(Thompson等人J.Mol.Biol.256：77-88(1996))。Balint和Larrick Gene 137：109-118(1993)描述计算机辅助的寡脱氧核苷酸扫描突变，进而同时且彻底地搜索可变区基因的所有CDR的改进变体。使用起始有限突变使αvβ3特异性人源化抗体亲和力成熟，其中所有六个CDR的每个位置均突变，接着表达并筛选包括最高亲和力突变体的重组文库(Wu等人PNAS(USA)95：6037-6-42(1998))。在Chiswell和McCafferty TIBTECH 10：80-84(1992)；和Rader和Barbas III Current Opinion in Biotech.8：503-508(1997)中评述了噬菌体展示抗体。在上述参考文献报导与亲代抗体相比具有改进亲和力的突变体抗体的各情况下，突变体抗体在CDR中具有氨基酸替换。
本文“亲和力成熟”是指增强抗体与其抗原亲和力的过程。亲和力成熟方法包括(但不限于)计算筛选法和实验法。
本文“抗体”是指由一个或一个以上实质上由所有或部分抗体基因编码的多肽组成的蛋白。免疫球蛋白基因包括(但不限于)κ、λ、α、γ(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。本文抗体是指包括全长抗体和抗体片段，且包括天然存在于任何生物体中或经遗传工程操作(例如变体)的抗体。
“抗体片段”是指除全长形式之外的任何形式抗体。本文抗体片段包括存在于全长抗体内的较小组分的抗体，和经过遗传工程操作的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab和(Fab1)2、单链Fv(scFv)、微型双功能抗体、微型三功能抗体、微型四功能抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、框架区、恒定区等等(Maynard & Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：395-402)。
本文“计算筛选法”是指在蛋白中涉及一个或一个以上突变的任何方法，其中所述方法采用计算机来评价潜在氨基酸侧链替换之间相互作用和/或与蛋白剩余部分相互作用的能量。
本文“Fc”是指包含免疫球蛋白域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)的抗体部分。Fc也可以包括存在于Cγ2与Cγ1(Cγ1)之间N端铰链内的任何残基。Fc可以指分离的所述区，或者在抗体或抗体片段内容中的所述区。Fc也可以包括任何经修饰形式的Fc，其包括(但不限于)天然单体、天然二聚体(经二硫键连接)、经修饰二聚体(经二硫键和/或非共价键连接)和经修饰单体(即，衍生物)。
本文“全长抗体”是指构成抗体H和/或L链的天然生物形式的结构。在包括人和小鼠的大部分哺乳动物中，所述形式为四聚体，且由两对相同的两个免疫球蛋白链组成，各对具有一条轻链和一条重链，各轻链包含免疫球蛋白域VL和CL，且各重链包含免疫球蛋白域VH、Cγ1、Cγ2和Cγ3。在各对中，轻链可变区与重链可变区(VL和VH)一起负责结合抗原，且恒定区(CL、Cγ1、Cγ2和Cγ3，尤其是Cγ2和Cγ3)负责抗体效应子功能。在例如骆驼(camel)和美洲驼(llama)的一些哺乳动物中，全长抗体可以仅由两条重链组成，各重链包含免疫球蛋白域VH、Cγ2和Cγ3。
本文“免疫球蛋白(Ig)”是指由一个或一个以上实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白。免疫球蛋白包括(但不限于)抗体。免疫球蛋白可以具有许多结构形式，其包括(但不限于)全长抗体、抗体片段和个别免疫球蛋白域，包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
本文“免疫球蛋白(Ig)域”是指由实质上由免疫球蛋白基因所编码的多肽组成的蛋白域。如图1所示，Ig域包括(但不限于)VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
本文所用“变体蛋白序列”是指具有一个或一个以上与另一相似蛋白序列在氨基酸一致性上有所不同的蛋白序列。所述相似蛋白序列可以是天然野生型蛋白序列，或者是野生型序列的另一个变体。一般来说，起始序列称为“亲代”序列，并且可以是野生型或变体序列。举例来说，本发明的优选实施例采用人源化亲代序列，已对所述人源化亲代序列进行计算分析以产生变体。
本文抗体的“可变区”是指包含VH免疫球蛋白域、VL免疫球蛋白域或VH和VL免疫球蛋白域的多肽(包括变体)，如图1所示。可变区可以指分离形式的所述多肽，如Fv片段、如scFv片段、如较大抗体片段内容中的此区，或如全长抗体或替代的、非抗体骨架分子的内容中的此区。
本发明也可以用于从许多来源获得的抗体。抗体可以实质上由来自任何生物体的抗体基因所编码，所述生物体包括(但不限于)人、小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、单峰骆驼、猴，尤其是哺乳动物，尤其是人，并且尤其是小鼠和大鼠。在一个实施例中，所述抗体可以是全人抗体，例如通过使用转基因小鼠或其它动物(Bruggemann & Taussig，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8：455-458)或人抗体文库结合选择法(Griffiths & Duncan，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：102-108)从患者或受检者中所获得的。抗体可以来自任何来源，包括人工或天然发生。举例来说，本发明采用包括(但不限于)嵌合抗体和人源化抗体(Clark，2000，Immunol.Today 21：397-402)的经遗传工程操作的抗体，或来源于重组文库。此外，经最优化的抗体可以是实质上由一个或一个以上天然抗体基因所编码的抗体的经遗传工程操作的变体。举例来说，在一个实施例中，经最优化的抗体可以是已经通过亲和力成熟所鉴别的抗体。
就本发明的ABP而言，术语“抗原特异性”或“特异性结合”是指结合抗原或所感兴趣的结合伴侣的一个或一个以上抗原决定基，但实质上不识别且结合含有混合抗原群体的样品中的其它分子的ABP。
本文所用术语“双特异性ABP”或“多特异性ABP”是指包含两个或两个以上抗原结合位点或结合伴侣结合位点的ABP，第一结合位点具有与第一抗原或抗原决定基的亲和力，且第二结合位点具有与第一个不同的与第二抗原或抗原决定基的亲和力。
如本文所用术语“抗原决定基”是指抗原或结合伴侣上由ABP所识别的位点。如果抗原包含多肽，则抗原决定基可以是线性或构象形成序列或外形的氨基酸。抗原决定基也可以是ABP所结合的任何类型抗原上的任何位置。
如本文所用“抗原结合多肽”或“ABP”应包括具有至少特异性结合特定结合伴侣(如抗原)的生物活性的多肽和蛋白，以及ABP类似物、ABP异构形式、ABP模拟物、ABP片段、杂交ABP蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、同源物、糖基化型变体和突变型蛋白，而无论其生物活性如何，且进一步无论其合成或制造方法如何，所述方法包括(但不限于)重组(无论是否产自cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式核酸)、活体外、活体内、通过微注射核酸分子、合成、转基因和基因活化方法。ABP的具体实例包括(但不限于)抗体分子、重链、轻链、可变区、CDR、Fab、scFv、替代性骨架非抗体分子、配体、受体、肽和结合抗原的任何氨基酸序列。
术语“ABP”或“抗原结合多肽”是指上述ABP，以及保留天然发生抗体的至少一种生物活性(包括(但不限于)除抗原结合外的活性)的多肽。除抗原结合外的活性包括(但不限于)任何一种或一种以上与Fc相关的活性。
抗原结合多肽包括天然发生人ABP的医药学上可接受的盐和前药、和盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体以及天然发生人类ABP的激动剂、模拟物和拮抗剂变体及其多肽融合体。术语“抗原结合多肽”涵盖在氨基端、羧基端或两者处均包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)例如，甲硫氨酰基ABP(其中蛋氨酸连接于由重组表达得到的ABP的N端)、用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和力抗原决定基)、用于将ABP连接于生物活性分子目的的融合体、与血清白蛋白结合肽的融合体，和与血清蛋白(血清白蛋白)的融合体。
术语“抗原”或“结合伴侣”是指由ABP所表现的结合活性的目标的物质。事实上任何物质都可以是ABP的抗原或结合伴侣。抗原或结合伴侣的实例包括(但不限于)α-1抗胰蛋白酶、血管抑素(Angiostatin)、抗溶血因子(Antihemolytic factor)、抗体、载脂蛋白(Apolipoprotein)、脱辅基蛋白(Apoprotein)、心房利钠因子(Atrial natriureticfactor)、心房利钠多肽(Atrial natriuretic polypeptide)、心房肽(Atrial peptide)、C-X-C趋化因子(C-X-C chemokine)(例如T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG)、降钙素(Calcitonin)、CC趋化因子(例如单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配体、C-kit配体、胶原质、集落刺激因子(Colony stimulatingfactor，CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子(例如上皮中性粒细胞激活肽-78、GRO/MGSA、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin，“EPO”)、脱落毒素(Exfoliating toxin)A和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、血纤蛋白原(Fibrinogen)、粘连蛋白(Fibronectin)、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶(Glucocerebrosidase)、促性腺素(Gonadotropin)、生长因子、刺猬蛋白(Hedgehog protein)(例如Sonic、Indian、Desert)、血红蛋白(Hemoglobin)、肝细胞生长因子受体(HepatocyteGrowth Factor，HGF)、水蛭素(Hirudin)、人血清白蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、白细胞间素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等等)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、白血病抑制因子、荧光素酶(Luciferase)、神经营养因子(Neurturin)、嗜中性粒细胞抑制因子(Neutrophil inhibitory factor，NIF)、抑瘤素M(oncostatin M)、成骨蛋白(Osteogenicprotein)、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如人生长激素)、调理素(Pleiotropin)、蛋白质A、蛋白质G、热原性外毒素A、B和C、松弛素(Relaxin)、肾素(Renin)、SCF、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受体、生长介素(Somatomedin)、生长抑素(Somatostatin)、生长激素(Somatotropin)、链激酶(Streptokinase)、超抗原(Superantigen)，即，葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、超氧化物歧化酶、毒性休克综合征毒素(Toxic shock syndrome toxin，TSST-1)、胸腺素α1、组织纤维蛋白酶原激活剂、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGEF)、尿激酶以及其它。
这些蛋白中许多是市售的(参看例如Sigma BioSciences 2002目录和价格单)，并且对应蛋白序列和基因和其通常的许多变体是众所周知的(参看例如Genbank)。
其它抗原或结合伴侣包括(但不限于)转录和表达激活剂。转录和表达激活剂实例包括调节细胞生长、分化、调控等等的基因和蛋白。表达和转录激活剂发现于提供广泛治疗靶标的原核生物、病毒和真核生物中，包括真菌、植物和动物，包括哺乳动物。应了解表达和转录激活剂通过许多机制调节转录，例如通过结合受体、刺激信号转导级联、调控转录因子的表达、结合启动子和增强子、结合与启动子和增强子结合的蛋白、解链DNA、剪接pre-mRNA、聚腺苷化RNA和降解RNA。抗原或结合伴侣包括(但不限于)表达激活剂，例如细胞因子、炎性分子、生长因子、其受体和致癌基因产物，例如白细胞介素(例如IL-1、EL-2、IL-8等等)、干扰素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1和hyalurin/CD44；信号转导分子和对应致癌基因产物，例如Mos、Ras、Raf和Met；和转录激活剂和抑制剂，例如p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel和类固醇激素受体，例如雌激素、黄体激素、睾丸激素、醛固酮(aldosterone)、LDL受体配体和皮质酮的类固醇激素受体。
疫苗蛋白可以是抗原或结合伴侣，其包括(但不限于)来自传染性真菌的蛋白，例如曲霉(Aspergillus)、念珠菌(Candida)属；来自细菌的蛋白，尤其是充当病原细菌模型的大肠杆菌以及医药学上重要的细菌，例如葡萄球菌(Staphylococci)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococci aureus))或链球菌(Streptococci)(例如肺炎鏈球菌(Streptococcipneumoniae))；来自原生动物的蛋白，例如孢子虫(sporozoa)(例如疟原虫(Plasmodia))、根足虫(rhizopod)(例如内阿米巴(Entamoeba))和鞭毛虫(flagellate)(锥虫(Trypanosoma)、利什曼虫(Leishmania)、毛滴虫(Trichomonas)、贾第鞭毛虫(Giardia)等等)；来自病毒的蛋白，例如(+)RNA病毒(实例包括痘病毒(Poxviruses)，例如牛痘(vaccinia)；微小核糖核酸病素(Picornaviruses)，例如脊髓灰质炎(polio)；披衣病毒(Togaviruses)，例如风疹(rubella)；黄病毒(Flaviviruses)，例如HCV；和冠病毒(Coronaviruses)、(-)RNA病毒(例如棒状病毒(Rhabdoviruses)，例如VSV；副粘病毒(Paramyxovimses)，例如RSV；正粘病毒(Orthomyxovimses)，例如流行性感冒病毒(influenza)；本杨病毒(Bunyavirus)；和砂粒病毒(Arenaviruses))、dsDNA病毒(例如呼肠孤病毒(Reovirus))、RNA至DNA病毒，即逆转录酶病毒(Retro virus)，例如HIV和HTLV，和某些DNA至RNA病毒，例如乙型肝炎病毒。
抗原或结合伴侣可以是酶，其包括(但不限于)酰胺酶、氨基酸消旋酶、酰基转移酶、脱卤素酶、加双氧酶、二芳基丙烷过氧化物酶、差向异构酶、环氧化物水解酶、酯酶、异构酶、激酶、葡萄糖异构酶、糖苷酶、糖基转移酶、卤素过氧化物酶、单加氧酶(例如p450s)、脂肪酶、木质素过氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酯酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、转氨酶和核酸酶。
农业相关性蛋白，例如抗昆虫蛋白(例如Cry蛋白)、产生淀粉和脂质的酶、植物和昆虫毒素、抗毒素蛋白、霉菌菌素(Mycotoxin)解毒蛋白、植物生长酶(例如核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶，Ribulose 1，5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase，“RUBISCO”)、脂加氧酶(lipoxygenase，LOX)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)羧化酶也可以是抗原或结合伴侣。
举例来说，抗原或结合伴侣也可以是疾病相关性分子，例如肿瘤表面抗原，例如B细胞个体基因型、恶性B细胞上的CD20、白血病胚细胞上的CD33和乳癌上的HER2/neu。或者，抗原或结合伴侣也可以是生长因子受体。生长因子的实例包括(但不限于)表皮生长因子受体(EGF)、转铁蛋白(transferrin)、胰岛素样生长因子、转化生长因子(TGF)、白细胞介素-1和白细胞介素-2。举例来说，已经在多种人类上皮原发性肿瘤中发现EGF受体的高表达。已经发现TGF-α介导癌细胞中自分泌刺激途径。已经证明一些鼠科动物单克隆抗体能够结合EGF受体，阻断配体与EGF受体的结合且抑制培养物和异种移植体模型中多种人癌细胞系的增殖。Mendelsohn和Baselga(1995)Antibodies to growthfactors and receptors，Biologic Therapy of Cancer，第2版，JB Lippincott，Philadelphia，第607-623页。因此，本发明的ABP可以用于治疗多种癌症。
抗原或结合伴侣也可以是与冠状动脉疾病相关的细胞表面蛋白或受体(例如血小板糖蛋白Iib/IIIa受体)、与自体免疫疾病相关的细胞表面蛋白或受体(例如CD4、CAMPATH-1和格兰(gram)阴性细菌脂多糖的脂质A区)。已经在治疗患有蕈样肉芽肿(Mycosis fungoides)、泛发性脓疱型银屑病(generalized postular psoriasis)、严重牛皮癣和类风湿性关节炎的患者的临床试验中测试抗CD4的人源化抗体。已经在脓毒性休克(septic shock)的治疗中临床测试了抗格兰阴性细菌脂多糖的脂质A区的抗体。也已经在难愈性类风湿性关节炎的治疗中临床测试了抗CAMPATH-1的抗体。因此，本发明的ABP可以用于治疗多种自体免疫疾病。Vaswani等人(1998)″Humanized antibodies aspotential therapeutic drugs″Annals of Allergy，Asthma and Immunology 81：105-115。
抗原或结合伴侣也可以是与人类过敏疾病相关的蛋白或肽，例如炎性介导蛋白，例如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞三烯受体及5-脂加氧酶，和粘附分子，例如V-CAM/VLA-4。此外，因为IgE在例如哮喘的I型立即超敏变态反应中起至关重要的作用，所以IgE也可以充当抗原或结合伴侣。研究表明，总血清IgE的含量趋向于与疾病(尤其是在哮喘中)的严重程度相关。Burrows等人(1989)″Association ofasthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens″New Engl.L.Med.320：271-277。因此，在治疗过敏疾病中针对IgE所选择的ABP可以用于降低IgE含量或阻断IgE与肥大细胞和嗜碱细胞的结合，而不实质地影响正常免疫功能。
抗原或结合伴侣也可以是能够充当引发宿主免疫应答的抗原的病毒表面或核心蛋白。这些病毒蛋白的实例包括(但不限于)糖蛋白(或表面抗原，例如GP120和GP41)和衣壳蛋白(或结构蛋白，例如P24蛋白)；表面抗原或甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒的核心蛋白(例如乙型肝炎病毒的小乙型肝炎表面抗原(small hepatitis B surfaceantigen，SHBsAg)和丙型肝炎病毒的核心蛋白，NS3、NS4和NS5抗原)；呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的糖蛋白(G蛋白)或融合蛋白(F蛋白)；单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2的表面和核心蛋白(例如来自HSV-2的糖蛋白D)。
抗原或结合伴侣也可以是丧失其肿瘤抑制功能且能够使细胞对癌症更为易感的突变肿瘤抑制剂基因产物。肿瘤抑制剂基因是抑制细胞生长和分裂周期并因此阻止新生瘤发育的基因。肿瘤抑制剂基因中的突变引起细胞忽视抑制信号网络中的一个或一个以上组分，从而克服细胞周期检查点并导致较高的受控细胞生长(癌症)速率。肿瘤抑制剂基因的实例包括(但不限于)DPC-4、NF-1、NF-2、RB、p53、WT1、BRCA1和BRCA2。
DPC-4涉及胰腺癌并且参与抑制细胞分裂的细胞质途径。NF-1编码抑制Ras的蛋白-一种细胞质抑制蛋白。NF-1涉及神经系统和骨髓白血病的纤维神经瘤(neurofibroma)和嗜铬细胞瘤(pheochromocytomas)。NF-2编码涉及神经系统的脑膜瘤(meningioma)、雪旺氏瘤(schwanoma)和室管膜瘤(ependymoma)中的核蛋白。RB编码pRB蛋白，pRB蛋白是细胞周期主要抑制剂的核蛋白。RB涉及视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)以及骨癌、膀胱癌、小细胞肺癌和乳癌。p53编码调控细胞分裂且可以诱导细胞凋亡的p53蛋白。在许多癌症中发现p53的突变和/或不活动。WT1涉及肾脏的肾母细胞瘤(Wilms tumor)。BRCA1涉及乳癌和卵巢癌，而BRCA2涉及乳癌。因此，ABP可以用于阻断基因产物与肿瘤发生和发展途径中其它蛋白和生物化学物质的互作。
抗原或结合伴侣可以是CD分子，其包括(但不限于)CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD110-113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CD129、CDw130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和TCRζ。抗原或结合伴侣可以是VEGF、VEGF受体、EGFR、Her2、TNFa、TNFRI受体、GPIIb/IIIa、IL-2Rα链、IL-2R-β链、RSV F蛋白、α4整合素、IgE、IgE受体、地高辛(dioxin)、锯鳞蝰蛇毒(carpet vipervenom)、补体C5、OPGL、CA-125肿瘤抗原、葡萄球菌蛋白、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白、葡萄球菌感染相关蛋白(包括(但不限于)金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)、IL-6受体、CTLA-4、RSV、IL-2受体Tac亚单位、IL-5和EpCam。抗原或结合伴侣可以是分子片段。
双特异性ABP的实例包括(但不限于)其中一个ABP针对肿瘤细胞抗原而另一个ABP针对细胞毒性引发分子的双特异性ABP，例如抗FcγRI/抗CD 15、抗p185HER2/FcγRIII(CD 16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑素细胞刺激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(folate binding protein，FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(pan carcinoma associatedantigen，AMOC-31)/抗CD3；一个ABP特异性结合肿瘤抗原而另一个ABP结合毒素的双特异性ABP，例如抗肥皂草毒素(saporin)/抗Id-1、抗CD22/抗肥皂草毒素、抗CD7/抗肥皂草毒素、抗CD38/抗肥皂草毒素、抗CEA/抗蓖麻毒素A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤个体基因型、抗CEA/抗长春花属生物碱(vinca alkaloid)；用于转化酶活化前药的双特异性ABP，例如抗CD30/抗碱性磷酸酶(催化磷酸丝裂霉素(mitomycin phosphate)前药转化成丝裂霉素醇)；可以用作纤溶剂(fibrinolytic agent)的双特异性ABP，例如抗纤维蛋白/抗组织纤维蛋白酶原激活剂(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的双特异性ABP，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于治疗传染疾病的双特异性ABP，例如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T-细胞受体：CD3复合物/抗流行性感冒病毒、抗FcγR/抗HrV；用于活体外或活体内肿瘤检测的双特异性ABP，例如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的双特异性ABP(参看Fanger，MW等人，Crit Rev Immunol.1992；12(3-4)：101-24，其以引用的方式并入本文)；和作为诊断工具的双特异性ABP，例如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生长抑素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶(参看Nolan，O et R.O′Kennedy，Biochim BiophysActa.1990年8月1日；1040(1)：1-11，其以引用的方式并入本文)。三特异性ABP的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
各种参考文献公开了通过聚合物结合或糖基化进行多肽修饰。术语“ABP”或“抗原结合多肽”包括(但不限于)与例如PEG等聚合物结合的多肽，且可以包含半胱氨酸、赖氨酸、N或C端氨基酸或其它残基的一种或一种以上其它衍生作用。此外，ABP可以包含连接子、聚合物或生物活性分子，其中连接子、聚合物或生物活性分子所结合的氨基酸可以是根据本发明的非天然发生氨基酸，或者可以采用例如与赖氨酸或半胱氨酸偶联等所属领域中已知的技术而与天然编码氨基酸结合。美国专利第4,904,584号中公开了耗尽PEG化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已经缺失或者用任何其它氨基酸残基替换。WO 99/67291公开了一种将蛋白与PEG结合的方法，其中蛋白上的至少一个氨基酸缺失，且所述蛋白在足以达到与蛋白结合的条件下接触PEG。WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的PEG化变体，其中半胱氨酸残基由位于多肽指定区域的非必需氨基酸残基替换。WO 00/26354公开一种制造与包含至少一个其它糖基化位点的对应母体多肽相比，具有低致敏性的糖基化多肽变体的方法。
术语“抗原结合多肽”也包括糖基化ABP，例如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、经N连接或O连接糖基化形式的多肽。含有单核苷酸改变的变体也被认为是ABP的生物活性变体。此外，也包括剪接变体。术语“抗原结合多肽”也包括任何一个或一个以上ABP的ABP异源二聚体、同源二聚体、异源多聚体或同源多聚体或任何其它多肽、蛋白、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或其它任何类型的生物活性分子(通过化学方法连接或表达为融合蛋白)，以及含有(例如)特定缺失或其它修饰但仍保留生物活性的多肽类似物。
在一些实施例中，抗原结合多肽进一步包含调节ABP生物活性的添加、替换或缺失。举例来说，添加、替换或缺失可以调节ABP的一种或一种以上特性或活性(包括(但不限于)调节与抗原的亲和力)；调节(包括(但不限于)增加或降低)抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；稳定抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；诱导或引起抗原构象或其它二级、三级或四级结构改变；调节循环半衰期；调节治疗半衰期；调节多肽稳定性；调节剂量；调节释放或生物可用性；促进纯化；或改进或改变特定投药途径。同样，抗原结合多肽可以包含蛋白酶裂解序列、反应基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等等)或改进多肽的缺失(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
术语“抗原结合多肽”也涵盖经连接的ABP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体，包括(但不限于)直接经非天然编码氨基酸侧链连接于相同或不同非天然编码氨基酸侧链或连接于天然编码氨基酸侧链作为融合体或间接经连接子连接的那些。示范性连接子包括(但不限于)小有机化合物、多种长度的水溶性聚合物，例如聚乙二醇或聚葡萄糖(polydextran)，或各种长度的多肽。
所属领域技术人员应了解可以在抗原结合多肽或相关抗原结合多肽等的片段中轻易地鉴别出对应特定抗原结合多肽序列中位置的氨基酸位置。举例来说，可以使用例如BLAST的序列比对程序比对并鉴别蛋白中符合相关序列中位置的特定位置。
术语“抗原结合多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸替换、添加或缺失的抗原结合多肽。本发明的抗原结合多肽可以包含用一个或一个以上天然氨基酸的修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已经描述天然发生ABP多肽中多种氨基酸位置中的示范性替换，其包括(但不限于)调节抗原结合多肽中一种或一种以上生物活性的替换，例如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂等等，并且由术语“ABP”所涵盖。
“非天然编码氨基酸”是指并非20种常见氨基酸或焦赖氨酸(pyrolysine)或硒半胱氨酸(selenocysteine)中之一种的氨基酸。其它可以与术语“非天然编码氨基酸”同义地使用的术语是“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然氨基酸(unnatural amino acid)”、“非天然发生氨基酸”和其各种带有连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如，翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸)但自身并非通过翻译复合体天然并入生长中多肽链中所发生的氨基酸。所述非天然发生氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰氨基葡萄糖基-L-丝氨酸(N-acetylglucosaminyl-L-serine)、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
“氨基端修饰基”是指可以连接于多肽氨基端的任何分子。“羧基端修饰基”相似地是指可以连接于多肽羧基端的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白(例如血清白蛋白)或其它增加肽的血清半衰期的部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活性基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应基”和“化学反应部分”用于所属技术领域和本文中，是指分子独特的、可定义的部分或单位。所述术语在化学领域有时是同义的，且在本文中用来表示执行一些功能或活性并且具有与其它分子的反应性的分子部分。
本文所用术语“键(linkage)”或“连接子(linker)”是指由于化学反应而通常所形成的并且通常为共价键的基团或键(bond)。水解稳定键是指键在水中实质上稳定，且在可用pH值下不与水反应，其包括(但不限于)在生理条件下的长反应时间，可能甚至是无限的。水解不稳定或可降解键是指所述键在水或水溶液中(例如血液)可降解。酶不稳定或可降解的键是指所述键可以由一种或一种以上酶降解。如所属技术领域所了解，PEG和相关性聚合物可以在聚合物骨架或连接子基团中在聚合物骨架与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间包括可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上醇基团之间反应所形成的酯键通常在生理条件下水解以释放所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)羧酸酯键；由胺与醛反应所生成的亚胺键；醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；为酰肼与醛反应产物的腙键；为醛与醇反应产物的缩醛键；为甲酸酯与醇反应产物的原酸酯键；由胺基(包括(但不限于)在例如PEG的聚合物的末端)与肽的羧基所形成的肽键；和由亚磷酰胺基(包括(但不限于)在聚合物的末端)与寡核苷酸5′羟基所形成的寡核苷酸键。支链连接子可用于本发明的抗原结合多肽中。
本文所用术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”是指能够影响生物系统、途径、分子或涉及生物体(包括(但不限于)病毒、细菌、细菌噬菌体、转座子、朊病毒(prion)、昆虫、真菌、植物、动物和人类)的互作的任何物理或生物化学性质的任何物质。具体来说，如本文所用生物活性分子包括(但不限于)用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物体内疾病或者另外增强人类或动物体身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白、酶、小分子药物、硬药物(hard drug)、软药物(soft drug)、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒(microparticle)和微胞(micell)。适于结合本发明使用的生物活性剂种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显象剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎性剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物衍生毒素等等。
在某些实施例中，本发明的ABP分子可以用于将生物活性分子或可检测标记针对肿瘤位点。这有助于肿瘤杀死、检测和/或定位或其它作用。诊断探针或成像探针也可以连接于本发明的ABP分子。在某些特别优选的实施例中，ABP的生物活性分子组分是“不透射线(rediopaque)”标记，例如能够使用(例如)x光轻易显现的标记。不透射线物质为所属领域技术人员所熟知。最常用的不透射线物质包括碘化物、溴化物或钡盐。其它不透射线物质也是已知的，包括(但不限于)有机铋衍生物(参看，例如美国专利第5,939,045号)、不透射线多尿烷(multiurethane)(参看，例如美国专利第5,346,981号)、有机铋络合物(参看，例如美国专利第5,256,334号)、不透射线钡多聚体络合物(参看，例如美国专利第4,866,132号)等等。
本发明的ABP可以直接与不透射线部分偶联，或者其可以连接于载运或含有不透射线物质的“包装(package)”(例如螯合剂、脂质体、多聚体微珠等等)。
除不透射线标记之外，其它标记也适用于本发明。适合用作本发明ABP的生物活性分子组分的可检测标记包括任何可以由电镜、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或化学方法检测的成分。可用于本发明中的标记包括磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德州红(texas red)、若丹明(rhodamine)、绿色荧光蛋白等等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA中的酶)和比色标记，例如胶状金或着色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯(multistyrene)、聚丙烯(multipropylene)、乳胶等等)珠。
各种优选放射性标记包括(但不限于)99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、64ICu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、175Yb、177Lu、105Rh和111Ag。
检测所述标记的方法为所属领域技术人员所熟知。因此，例如，可以用照相胶片、闪烁检测器等等检测放射性标记。可以用光检测器检测发光来检测荧光标记。通常通过对底物提供酶并且检测由酶作用于底物上所产生的反应产物来检测酶标记，并且通过简单视觉观察着色标记来检测比色标记。
在一些具体实施例中，本发明预期免疫结合物(嵌合部分)用于检测肿瘤和/或其它癌细胞的用途。因此，举例来说，本发明的双特异性抗体可以与γ发光放射性同位素(例如Na-22、Cr-51、Co-60、Tc-99、I-125、I-131、Cs-137、Ga-67、Mo-99)结合以用γ相机检测；与正电子发光同位素(例如C-11、N-13、O-15、F-18等等)结合以在PositronEmission Tomography(PET)仪器上检测；并且与金属对比剂(例如含Gd试剂、含Eu试剂等等)结合以用于核磁成像(MRI)。此外，本发明的双特异性抗体可以用于传统免疫组织化学(例如荧光标记、纳米晶体标记、酶标记和比色标记等等)中。
在另一实施例中，生物活性分子可以是增强细胞上致电离辐射(例如可能由60Co或x光源产生)的细胞毒性作用的放射增敏剂(radiosensitizer)。许多放射增敏剂是已知的，包括(但不限于)苯并卟啉(benzoporphyrin)衍生化合物(参看，例如美国专利第5,945,439号)、1，2，4-苯并三嗪氧化物(参看，例如美国专利第5,849,738号)、含某些二胺的化合物(参看，例如美国专利第5,700,825号)、BCNT(参看，例如美国专利第5,872,107号)、放射增敏性硝基苯甲酸酰胺衍生物(参看，例如美国专利第4,474,814号)、各种杂环衍生物(参看，例如美国专利第5,064,849号)、铂络合物(参看，例如美国专利第4,921,963号)等等。
生物活性分子也可以是配体，抗原决定基标签、肽、蛋白或另一个ABP。配体和抗体可以结合于免疫细胞上的表面标记。用所述抗体作为生物活性分子的嵌合分子充当在承载配体或ABP的结合伴侣的免疫细胞与表达EGFR家族成员的肿瘤细胞之间建立联系的双功能连接子。
尤其在采用预靶向(pre-targeting)策略的情况下，许多本文所述的医药品和/或放射性标记可以作为螯合剂的形式提供。螯合分子通常与特异性地结合连接于双特异性和/或多特异性ABP的抗原决定基的分子(例如生物素(biotin)、抗生物素(avidin)、链菌素(streptavidin)等等)偶联。
螯合基为所属领域技术人员所熟知。在某些实施例中，螯合基来源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O，O′-双(-2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、N，N-双(羟基苄基)-乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(DOTA)、羟基乙基二胺三乙酸(HEDTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N′″-四乙酸(TETA)、经取代DTPA、经取代EDTA等等。
一些优选螯合剂的实例包括未经取代或经取代2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)和2-亚氨基硫杂环己烷，尤其是2-亚氨基-4-巯基甲基硫烷(2-imino-4-mercaptomethylthiolane)和SAPS(N-(4-[211At]砹氏苯乙基)琥珀酸酯(N-(4-[211At]astatophenethyl)succinimate))。
一种螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N″，N′″-四乙酸(DOTA)尤其令人感兴趣，这是由于其螯合许多诊断上和治疗上重要的金属(例如放射性核苷酸和放射性标记)的能力。
已经描述DOTA与例如抗体的蛋白的结合物。举例来说，美国专利第5,428,156号教示将DOTA与抗体和ABP片段结合的方法。为了制备这些结合物，将DOTA的一个羧酸基转化成活性酯，活性酯可以与ABP或ABP片段上的胺或巯基反应。Lewis等人(1994)Bioconjugate Chem.5：565-576描述一种相似的方法，其中将DOTA的一个羧基转化成活性酯，并将活性DOTA与ABP混合，将ABP与DOTA经ABP赖氨酸残基的ε氨基连接，进而将DOTA的一个羧基转化成酰胺部分。
或者，可以直接或经连接子将螯合剂偶联于抗原决定基标签或偶联于结合抗原决定基标签的部分。已经描述DOTA与生物素的结合物，参看，例如Su(1995)J.Nucl.Med.，36(增刊5)：第154页，其公开DOTA与生物素经由可用氨基侧链生物素衍生物(例如DOTA-LC-生物素或DOTA-苄基-4-(6-氨基-己酰胺)-生物素)连接的键。Yau等人，WO95/15335公开了一种制造可以与生物素结合的硝基-苄基-DOTA的方法。所述方法包含：经羟基暂时保护的环化反应；胺的甲苯磺酰化作用；暂时受保护羟基的去保护；去保护羟基的甲苯磺酰化作用；和分子内甲苯磺酸酯环化。Wu等人，(1992)Nucl.Med.BioL，19(2)：239-244中公开了一种用于合成用111IN和90Y放射性标记蛋白的巨环螯合剂的方法。Wu等人制得经标记DOTA-生物素结合物以研究具有抗生物素(用于研究的模型蛋白)的稳定性和生物分布。使用含有游离氨基以与原位生成的活性DOTA衍生物反应的生物素酰肼来制造此结合物。
本发明的ABP可以与其它生物活性分子融合，所述其它生物活性分子包括(但不限于)细胞毒药物、毒素、肽、蛋白、酶和病毒(Chester，(2000)Dis.Markers 16：53-62；Rippmann等人Biochem J.(2000)Biochem J.349(部分3)：805-812，Kreitman，RJ.(2001)Curr.Pharm.Biotechnol.2：313-325；Rybak，S.M.(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1：995-1003；van Beusechem，V.W.等人J.Virol.(2002)76：2753-2762)。
有效细胞毒性剂或有效负载(payload)可以结合于ABP，所述ABP靶向且结合在靶细胞(包括(但不限于)癌细胞)上所主要发现的抗原。有效负载剂经血流中稳定的连接子连接于ABP，或者在(例如)肿瘤位点在所存在条件下易于裂解。负载剂，例如毒素，被传送到靶细胞，且因此能够通过取决于毒素的机制而起始细胞杀死。
这些毒素的实例包括(但不限于)小分子，例如真菌衍生刺孢霉素(calicheamicin)(Hinman等人(1993)Cancer Res.53：3336-3342)和maytansinoid(Liu等人(1996)PNASUSA 93：8618-8623，Smith，S.(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.3(2)：198-203)、trichothene和CC 1065；或蛋白，例如蓖麻毒素A链(Messman等人(2000)Clin.Cancer Res.6(4)：1302-1313)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)(Tur等人(2001)Intl.J.Mol.Med.8(5)：579-584)、白喉毒素(diphtheria toxin)(LeMaistre等人(1998)Blood91(2)：399-405)和核糖体失活蛋白(Tazzari等人(2001)，J.Immunol.167：4222-4229)。在具体实施例中，可以使用一个或一个以上的刺孢霉素分子。刺孢霉素家族的抗生素的成员能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。也已知刺孢霉素的结构类似物。参看Hinman等人，Cancer Research 53：3336-42(1993)；Lode等人(1998)Cancer Research58：2925-28。获得FDA批准的免疫毒素的实例为 (Wyeth Ayerst)-一种用于急性骨髓性白血病的刺孢霉素结合抗CD33(Sievers等人，(1999)Blood 93(11)：3678-3684；Bernstein(2000)Leukemia 14：474-475)。本发明的ABP可以以类似方式与毒素融合。或者，本发明的ABP可以与肉毒杆菌A神经毒素融合，肉毒杆菌A神经毒素是由细菌肉毒梭状(Clostridium botulinum)所产生的蛋白复合物。
在另一实施例中，本发明的ABP可以包含一种或一种以上的酶活性毒素和/或其片段。这些毒素的实例包括白喉毒素的非结合活性片段、白喉毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、康乃馨(dianthin)蛋白、商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAP AII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树素(gelonin)、mitogellin、restrictoein、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢子菌霉菌毒素(tricothecene)。参看，例如WO 93/21232。尤其优选的细胞毒素包括假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、蓖麻毒素和相思豆毒素。假单胞菌外毒素和白喉毒素均是熟知的。与PE一样，白喉毒素(DT)通过ADP核糖基化延伸因子2杀死细胞，进而抑制蛋白合成。关于免疫毒素的其它引用文献包括Brinkmann，U.In Vivo 14：21-28；Niv等人(2001)Curr.Pharm.Biotechnol.2：19-46；Reiter等人Adv.Cancer Res.81：93-124；Kreitman，R.J.(1999)Curr.Opin.Immunol.，11：570-578；Hall(2001)Meth.Mol.Biol.166：139-154；Kreitman(2001)Curr.Opin.Investig.Drugs 2(9)：1282-1293。所属领域技术人员熟知编码与各种配体融合的PE或DT的基因克隆方法(参看，例如Siegall等人(1989)FASEB J.，3：2647-2652；和Chaudliary等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：4538-4542)。所有引用文献均以引用的方式并入本文。
其它合适生物活性分子包括药理学试剂或含有各种药理学试剂的封装系统(encapsulation system)。因此，嵌合分子的靶向分子可以直接连接于待直接传递至肿瘤的药物。所述药物为所属领域技术人员所熟知，且包括(但不限于)多柔比星(doxirubicin)、长春碱(vinblastine)、染料木素(genistein)、反义分子等等。
或者，生物活性分子可以是封装系统，例如病毒衣壳、脂质体或含有治疗组合物(例如药物、核酸(例如反义核酸)或另一种优选经屏蔽以免于直接暴露于循环系统的治疗部分)的微胞。制备连接于抗体的脂质体的方法为所属领域技术人员熟知。参看，例如美国专利第4,957,735号，Connor等人(1985)Pharm.Ther.，28：341-365。由于具有抗原特异性，因此本发明的ABP可以用于将装载药物的脂质体送往它们的靶标。参看Park，J.W.等人(2002)Clin.Cancer Res.8，1172-1181和Shi，N.等人(2001)Pharm.Res.18，1091-1095。
本发明的ABP可以与例如PEG的分子结合以改进活体内传递和药物动力学曲线。Leong等人描述具有优于未PEG化形式的低清除率以及极小或无抗原结合活性丧失的抗IL-8抗体的Fab′片段的位点特异性PEG化(Leong，S.R.等人(2001)Cytoltine 16：106-119)。
本发明的ABP可以连接于前药。如本文所用术语“前药”是指活性药物的药理学无活性或低活性的的衍生物。可以对前药进行设计以调节药物或生物活性分子的量从而通过操纵药物的特性(例如物理化学、生物医药学或药物动力学特性)而到达所希望的作用位点。前药在体内经酶反应或非酶反应而转化成活性药物。前药可以提供改进的物理化学特性，例如较佳的溶解性、增强的传递特征，例如特异性靶向于特定细胞、组织、器官或配体，和改进的药物治疗价值。本发明的ABP可以与酶融合而用于前药活化(Kousparou，C.A.等人(2002)Int.J.Cancer 99，138-148)。重组分子可以包含ABP和作用于前药上以释放细胞毒素(例如氰化物)的酶。
可以前药形式投用治疗剂，且随后通过将如肽基化学治疗剂的前药转化成活性抗癌药物的前药激活酶来进行活化。参看，例如WO 88/07378、WO 8I/01145、美国专利第4,975,278号。一般来说，酶组分包括任何能够以如将其转化成更具活性的细胞毒性形式的方式作用于前药的酶。
可用的酶包括(但不限于)可用于将含磷酸酯前药转化成游离药物的碱性磷酸酶、可用于将含硫酸酯前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽前药转化成游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶和组织蛋白酶(cathepsin)(例如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧基肽酶；可用于将糖基化前药转化成游离药物的碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶；和可用于将在其氨基氮处分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。
或者，可以使用在所属技术领域中又称为“抗体酶(abzyme)”的具有酶活性的抗体将本发明的前药转化成游离活性药物。参看，例如Massey，(1987)328：457-48。
所属领域技术人员应了解，本发明的双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子部分通常可以以任何次序连接在一起。因此，例如当靶向分子是单链蛋白时，生物活性分子可以连接于靶向分子的氨基端或羧基端。生物活性分子也可以连接于双特异性和/或多特异性ABP的内部区，或者相反。同样，双特异性和/或多特异性ABP也可以连接于生物活性分子的内部位置或末端。在任何情况下，选择连接点以致不干扰双特异性和/或多特异性ABP或生物活性分子的个别活性。
可以借助所属领域技术人员所熟知的任何许多方式连接双特异性和/或多特异性ABP或生物活性分子。生物活性分子通常直接或经连接子(间隔子)与双特异性ABP结合。然而，当生物活性分子和双特异性ABP均为多肽时，可能需要将嵌合分子重组表达为单链融合蛋白。
在一个实施例中，双特异性和/或多特异性ABP化学结合于生物活性分子(例如细胞毒素、标记、配体、药物、ABP、脂质体等等)。化学结合分子的方法为所属领域技术人员所熟知。
试剂与ABP或其它多肽靶向分子的连接过程会随试剂的化学结构而有所不同。多肽通常含有多种官能团，例如羧酸(COOH)或游离胺(--NH2)基团，这些官能团可与生物活性分子上的合适官能团反应以于该处与生物活性分子结合。
或者，双特异性ABP和/或生物活性分子可以经衍生以暴露或连接其它反应官能团。所述衍生化作用可以涉及连接任何许多连接分子，例如那些获自Pierce ChemicalCompany，Rockford，111的连接分子。
在一些情况下，当嵌合部分已经到达其靶位点时，可能需要使生物活性分子从双特异性和/或多特异性ABP游离，或活化前药。因此，当在靶位点释放生物活性分子时，可以使用包含在邻近靶位点处可裂解的键的嵌合结合物。可以通过酶活性或者免疫结合物在靶细胞内或在邻近靶位点中所经受的条件来促进键的裂解以从ABP释放试剂。当靶位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点处所存在的条件下(例如当暴露于肿瘤相关性酶或酸性pH时)可裂解的连接子。
许多不同的可裂解连接子为所属领域技术人员所熟知。参看，美国专利第4,618,492号、第4,542,225号和第4,625,014号。从这些连接子基团释放试剂的机制包括，例如照射光不稳定性键和酸催化水解。举例来说，美国专利第4,671,958号包括包含连接子的免疫结合物的描述，所述连接子在靶位点处通过患者补体系统的蛋白水解酶活体内裂解。连接子的长度可以是预定的，或者可以根据ABP和与其连接的分子之间的所需空间关系而加以选择。鉴于许多所报导的用于将多种放射诊断化合物、放射治疗化合物、药物、毒素和其它试剂与抗体相连接的方法，所属领域技术人员应能够确定将所给试剂与ABP或其它多肽连接的合适方法。
在一些实施例中，生物活性分子包含连接于ABP或连接于抗原决定基标签的螯合剂。双特异性和/或多特异性ABP携带有相应的抗原决定基标签或ABP，因此双特异性和/或多特异性ABP与螯合剂的简单接触导致ABP与生物活性分子的连接。可以在使用所述部分(预靶向策略)之后进行所述结合步骤，或者在传递螯合剂之前可以使靶组织与双特异性和/或多特异性ABP结合。适合与各种靶向部分偶联的螯合物的制造方法为所属领域技术人员所熟知(参看，例如美国专利第6,190,923号、第6,187,285号、第6,183,721号、第6,177,562号、第6,159,445号、第6,153,775号、第6,149,890号、第6,143,276号、第6,143,274号、第6,139,819号、第6,132,764号、第6,123,923号、第6,123,921号、第6,120,768号、第6,120,751号、第6,117,412号、第6,106,866号、第6,096,290号、第6,093,382号、第6,090,800号、第6,090,408号、第6,088,613号、第6,077,499号、第6,075,010号、第6,071,494号、第6,071,490号、第6,060,040号、第6,056,939号、第6,051,207号、第6,048,979号、第6,045,821号、第6,045,775号、第6,030,840号、第6,028,066号、第6,022,966号、第6,022,523号、第6,022,522号、第6,017,522号、第6,015,897号、第6,010,682号、第6,010,681号、第6,004,533号和第6,001,329号)。
当双特异性和/或多特异性ABP和/或生物活性分子均为单链蛋白且相对较短(即小于约50个氨基酸)时，它们可以使用标准化学肽合成技术进行合成。当两种组分均相对较短时，嵌合部分可以合成为单邻近多肽。或者，可以单独合成双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子，且随后通过缩合一个分子的氨基端与另一分子的羧基端而进行融合，从而形成肽键。或者，双特异性和/或多特异性ABP和生物活性分子可以各自与肽间隔子分子的一个末端缩合，进而形成邻近融合蛋白。
固相合成是化学合成本发明多肽的优选方法，其中序列的C末端氨基酸连接于不溶性支撑物，接着相继添加序列中的其余氨基酸。固相合成技术由The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis，部分A.，Merrifield等人J.Am.Chem.Soc，85：2149-2156(1963)中的Barany和Merrifield，Solid-Phase PeptideSynthesis；第3-284页，和Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版.PierceChem.Co.，Rockford，111(1984)描述。
“双官能聚合物”是指包含两个不连续官能团的聚合物，这两个不连续官能团能够特异地与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价或非共价键。可以使用其中一个官能团可与特定生物活性组分上的基团反应而另一个官能团可与第二生物组分上的基团反应的双官能连接子，来形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的结合物。用于将各种化合物连接于肽的许多过程和连接分子是已知的。参看，例如欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号，其均以引用的方式并入本文。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上不连续官能团的聚合物，所属两个或两个以上不连续官能团能够特异地与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可以具有任何所需分子长度或分子量，并且可以经选择以提供连接于ABP的分子间的所需间距或构象。
当取代基由其常规化学式从左到右书写而指定时，同样涵盖可以自从右到左所书写结构所得到的化学性质相同的取代基，例如结构-CH2O-等同于结构-OCH2-。
术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰取代基”。“非干扰性取代基”是指那些产生稳定化合物的取代基。合适的非干扰取代基或基团包括(但不限于)卤素、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚硫酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1至8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)-CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m为1至8)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2，其盐等等。如本文所用各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另外说明，否则自身或作为另一取代基部分的术语“烷基”表示直链或带分枝的链或环状烃基，或其组合，这些基团可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，并且可以包括具有所指碳原子数(即C1-C10表示一至十个碳)的二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是指具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和较高碳数同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”也包括下文更加详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基命名为“高烷基(homoalkyl)”。
自身或作为另一取代基部分的术语“亚烷基”表示来源于烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，并且另外包括如下文所述“杂亚烷基”的基团。烷基(或亚烷基)通常具有1至24个碳原子，那些具有10个或更少碳原子的基团在本发明中是首选。“较低碳数烷基”或“较低碳数亚烷基”是通常具有八个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，并且分别是指经氧原子、氨基或硫原子连接于分子剩余部分的烷基。
除非另外说明，否则单独或与其它术语组合使用的术语“杂烷基”表示由所述数目碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成群组的杂原子组成(其中氮和硫原子可以视情况经氧化而氮杂原子可以视情况经季铵化)的稳定直链或具有分枝的链或环状烃基。杂原子O、N、S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置处，或者位于烷基连接于分子剩余部分处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一取代基部分的术语“杂亚烷基”表示来源于杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基来说，相同或不同杂原子也可以占据任一链末端或两端(包括(但不限于)亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基来说，连接基化学式所书写的方向并不表示连接基的定向。举例来说，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。
除非另外说明，否则自身或在与其它术语组合中的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示环状形式的“烷基”和“杂烷基”。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和与不饱和环键。此外，对于杂环烷基来说，杂原子可以占据杂环连接于分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。此外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，自身或作为另一取代基部分的术语“亚杂环烷基”表示来源于杂环烷基的二价基团，而自身或作为另一取代基部分的术语“亚环烷基”表示来源于环烷基的二价基团。
如本文所用术语“水溶性聚合物”是指任何在水溶液中可溶的聚合物。水溶性聚合物与ABP的键合可以产生以下改变，包括(但不限于)相对于未经修饰形式而言，增加或调节血清半衰期，或者增加或调节治疗半衰期，调节免疫原性，调节物理缔合特征(例如聚集和多聚体形成)，改变受体结合和改表受体二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可以具有或不具有自身生物活性，且可以用作连接子以连接ABP与其它物质，包括(但不限于)一个或一个以上ABP、一个或一个以上生物活性分子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号，其以引用的方式并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚-顺丁烯二酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧基化多元醇、肝磷脂、肝磷脂片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撑二醇及其衍生物、聚烷撑二醇与其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文所用术语“聚烷撑二醇”“聚(烷撑二醇)”是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚烷撑二醇”涵盖直链和支链聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它示范性实施例列于商业厂商目录中，例如Shearwater Corporation的目录″Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications″(2001)。
除非另外说明，否则术语“芳基”表示可以是单环或稠合于一起或共价连接的多环(优选为1至3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有一至四个选择N、O和S的杂原子的芳基(芳环)，其中氮原子和硫原子视情况经氧化，而氮原子视情况经季铵化。杂芳基可以经杂原子连接于分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。各上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受取代基的群组。
简单地说，当与其它术语组合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)时，术语“芳基”包括上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”包括其中芳基连接于烷基的那些基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，包括其中碳原子经(例如)氧原子置换的烷基(包括(但不限于)亚甲基)，包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等。
各上述术语(包括(但不限于“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”))包括经取代和未经取代形式的所述基团。各类基团的示范性取代基于下文提供。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自以下多种基团中的一者或一者以上：0至(2m′+1)数目的-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R′″、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R5、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)N″R′″、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R′″)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR′″、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其中m′是所述基团中碳原子的总数。R′、R″、R′″和R″″各自独立是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基，其包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R′、R″、R′″和R″″基团。当R′和R″连接于相同氮原子时，其可以与氮原子结合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。基于上述取代基的描述，所属领域技术人员应了解术语“烷基”是指包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
与烷基所述取代基相似，芳基和杂芳基的取代基可变化，并且选自(但不限于)：0至芳香族环系统上开放价(open valence)总数的卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R′″、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R′″、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R′″)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR′″、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基；且其中R′、R″、R′″和R″″独立为氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R′、R″、R′″和R″″基团。
如本文所用术语“经调节血清半衰期”是指相对于未经修饰形式而言经修饰ABP的循环半衰期的正或负改变。通过在投与ABP后各个时间点时取血液样品和测定所述分子在各样品中的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性使得可以计算血清半衰期。血清半衰期有利地具有至少约两倍的增加，但是较小的增加也是可用的，例如当使得能够得到满意给药方案或避免毒性作用时。在一些实施例中，所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文所用术语“经调节治疗半衰期”是指相对于未经修饰形式而言治疗有效量ABP或包含经修饰生物活性分子的ABP的半衰期的正或负改变。通过在投药后各个时间点时测量分子的药物动力学和/或药效特性来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期有利地使得能够得到尤其有益的给药方案，尤其有益的总剂量，或避免不良作用时。在一些实施例中，增加的治疗半衰期源于效能的提高、经修饰分子与其靶标结合的增加或减少或者未经修饰分子另一参数或作用机制的增加或减少。
当用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示核酸或蛋白实质上不含天然状态下相关的其它细胞组分。它可以是均态。分离物质可以是干态或半干态，或者在溶液中，包括(但不限于)水溶液。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法等分析化学技术确定纯度和均质性。作为存在于制剂中的主要物种的蛋白实质上是纯化的。具体来说，分离基因是从位于基因侧翼并且编码除感兴趣基因之外的蛋白的开放阅读框架中分离得到的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中实质上产生一条带。具体来说，“纯化的”表示核酸或蛋白具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更高纯度。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非另外特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物、具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然发生核苷酸相似的方式代谢的核酸。除非另外特别限制，否则所述术语也指包括PNA(肽核酸)的寡核苷酸类似物，用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰变体(包括(但不限于)简并密码子替换)和互补序列以及明确所指的序列。具体来说，可以通过产生其中一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤残基替换的序列来完成简并密码子替换(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；and Cassol等人(1992)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中交替使用并且指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白的描述，反之亦然。所述术语适用于天然发生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然发生和非天然发生的氨基酸，以及以与天然发生氨基酸相似方式行使功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然发生氨基酸相同基本化学结构(即结合于氢的α碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。所述类似物具有经修饰R基团(例如正亮氨酸)或经修饰肽骨架，但是保留与天然发生氨基酸相同的基本化学结构。
本文根据IUPAC-IUB生物化学名词审定委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的一般所知的三字符号或一字符号来表示氨基酸。同样也可以通过一般所接受的单字代码来表示核苷酸。
“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列来说，“保守修饰变体”是指编码相同或基本上相同氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，因此许多功能相同的核酸编码任何给定蛋白。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子所指定的每个位置处，可以将密码子改变成任何上述相应密码子而不改变所编码的多肽。所述核酸变异是“沉默变异(silent variation)”，是一种保守修饰变异。本文编码多肽的每个核酸序列也描述每种可能的核酸沉默变异。所属领域技术人员应认识到，可以修饰核酸中每个密码子(除AUG(一般仅为蛋氨酸密码子)和TGG(一般仅为色氨酸密码子)之外)以产生功能相同分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异暗含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列而言，所属领域技术人员应认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的个别替换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸经化学相似氨基酸替换。提供功能相似氨基酸的保守替换表为所属技术领域所熟知。所述保守修饰变体是除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因之外的，但不排除这些。
以下八组各含有为相互之间保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)。
参看，例如Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman &Co.；第2版(1993年12月)。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的内容中，术语“一致”或百分比“一致性”是指两个或两个以上相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域上通过使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察来比较并且比对最大对应度时，如果其具有相同氨基酸残基或核苷酸百分比(即在指定区域上约60％一致性、视情况约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性)，则序列是“实质上一致的”。所述定义也指测试序列的互补序列。所述一致性可以存在于至少约50个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者在75-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者当未指定时为整个序列或多聚核苷酸或多肽上。
对于序列比较来说，通常一个序列充当测试序列所比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如果需要)并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定参数。序列比较算法随后基于程序参数而计算测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。
如本文所用“比较窗口”包括选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150个组成群组的任何数目连续位置的节段，其中在一个序列和参考序列最佳比对之后可以将该序列与相同数目连续位置的参考序列比较。用于比对比较序列方法为所属领域所熟知。可以执行比较序列的最佳比对，包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的搜寻相似性方法、这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者手动比对和视觉观察(例如，参看Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(1995增刊))。
一种适用于确定百分比一致性和序列相似性的算法实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。执行BLAST分析的软件是经美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4和双链比较。对于氨基酸序列来说，BLASTP使用默认字长3和期望值(E)10，和BLOSUM62计分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链比较。通常在关闭“低复杂度”过滤器下进行BLAST算法。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参看，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法所提供的一个相似性度量标准是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其指示可能偶然发生的两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配的概率。举例来说，如果测试核酸与参考核酸比较的最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
短语“选择性(或特异性)杂交”是指当序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中时，所述分子在严谨杂交条件下仅与特定核苷酸序列结合、双联或杂交。
短语“严谨杂交条件”是指如所属领域已知的低离子强度和高温条件。在严谨条件下探针通常应与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的靶子序列杂交，而不与复杂混合物中的其它序列杂交。严谨条件具有序列相关性，并且在不同情况下会有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays″(1993)中。通常将严谨条件选择为低于在所定义的离子强度pH下特异性序列的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm是与靶标互补的探针的50％与靶序列杂交平衡(当靶序列过量存在、Tm时，50％探针占据平衡)时的温度(在所定义的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件可以是pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子(通常约0.01至1.0M钠离子浓度)，且对短探针而言温度至少约30℃(包括(但不限于)10至50个核苷酸)而对长探针而言至少约60℃(包括(但不限于)大于50个核苷酸)。也可以通过加入例如甲酰胺的去稳定剂来达到严谨条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号可以为至少两倍背景，视情况为10倍背景杂交。示范性严谨杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下温育；或者5×SSC、1％SDS，在65℃下温育；用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。所述洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
如本文所用术语“真核生物”是指属于种系发生真核生物域(Eucarya)的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微粒子虫、原生生物等等。
如本文所用术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可以属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermitsthermophilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等等)种系发生域；或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、甲烷细菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌属(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和法克隆嗜盐菌(Halobacterium species)NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrumpernix)等等)种系发生域。
如本文所用术语“受检者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。
如本文所用术语“有效量”是指(经修饰)非天然氨基酸多肽可以一定程度地减轻所治疗的疾病、病情或病症的一种或一种以上症状的投药量。可以投用本文所述含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强”表示增加或延长所需作用的功效或持续时间。因此，就增强治疗剂作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统作用的功效或持续时间的能力。如本文所用“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中作用的量。当用于患者时，此用途的有效量将取决于疾病、病症或病情的严重程度和进程、先前疗法、患者健康状况和对药物的反应，和治疗医师的判断。
如本文所用术语“经修饰”是指存在对多肽的翻译后修饰。形式“(经修饰)”术语是指所讨论的多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可以经修饰或未经修饰。
术语“经翻译后修饰”和“经修饰”是指天然或非天然氨基酸在并入多肽链之后所发生的所述氨基酸的任何修饰。仅举例来说，该术语涵盖活体内共翻译修饰、活体内翻译后修饰和活体外翻译后修饰。
在预防性应用中，含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易感于特定疾病、病症或病情或者具有这些风险的患者。将所述量定义为“预防有效量”。在此用途中，准确量也取决于患者的健康状况、体重等等。在所属领域技术范围内可以充分地考虑通过常规实验(例如剂量递增临床试验)来确定所述预防有效量。
术语“受保护”是指存在防止在某些反应条件下化学反应官能团反应的“保护基”或部分。保护基应视所保护的化学反应基的类型而变化。举例来说，如果化学反应基是胺或酰肼，那么保护基可以选自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应基是硫醇，那么保护基可以是邻吡啶基二硫化物(orthopyridyldisulfide)。如果化学反应基是羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可以是苄基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。所属领域已知的其它保护基也可以用于本文所述的方法和组合物，或者与其一起使用。
仅举例来说，封闭基(blocking group)/保护基可以选自：
其它保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中，其以引用的方式并入本文。
在治疗应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病、病症或病情的症状的量投与已经遭受所述疾病、病情或病症的患者。将此量定义为“治疗有效量”，其将取决于疾病、病症或病情的严重程度和进程、先前治疗、患者健康状况和对药物的反应，和治疗医师的判断。在所属领域技术范围内可以充分地考虑通过常规实验(例如剂量递增临床试验)来确定所述治疗有效量。
术语“治疗”是指预防性和/或治疗性治疗。
除非另外说明，否则采用所属领域技术范围内的常规质谱法、NMR、HPLC、蛋白化学法、生物化学法、重组DNA技术和药理学法。
实施方式
I.引言
本发明提供包含至少一种非天然氨基酸的ABP分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一种非天然氨基酸的ABP包括至少一种翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一种翻译后修饰包含分子连接，其包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、放射性核素、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分(photocaged moiety)、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团(intercalating group)、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述组合或任何其它所需化合物或物质，其包含采用所属领域技术人员所已知适用于特定反应性基团的化学方法与包含第一反应性基团的至少一种非天然氨基酸具有反应性的第二反应性基团。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分，并且采用[3+2]环加成方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸)，且第二反应性基团为炔基部分。在本发明经修饰ABP多肽的某些实施例中，使用至少一种包含至少一种翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一种翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，在真核细胞中或在非真核细胞中活体内进行翻译后修饰。
在某些实施例中，蛋白包括至少一种在由一种宿主细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白包括至少一种在由一种真核细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化、糖脂键(glycolipid-linkage)修饰等等。在一个实施例中，翻译后修饰包含寡糖与天冬酰胺通过GlcNAc-天冬酰胺键(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等等)连接。在另一实施例中，翻译后修饰包含寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等等)通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白或多肽可以包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体和/或类似物质。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、5′-经优化用于细菌表达的真核生物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸酯裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和来源于转座子的信号序列bla。
可以使用包含非天然氨基酸的抗原结合多肽调节生物活性分子的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间，所述生物活性分子包括(但不限于)小分子、肽和寡核苷酸。所述小分子、肽和寡核苷酸可以具有包括(但不限于)结合和/或识别靶分子或细胞类型、抗肿瘤活性、抗血管形成活性、抗病毒活性和细胞凋亡活性的生物活性。此外，包含非天然氨基酸的抗原结合多肽可以提供所需活性，包括(但不限于)效应子功能，例如ADCC、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性、前药活化、酶活性、催化活性、阻断蛋白-蛋白互作、结合所需抗原和将小分子靶向所需位点。ABP阻断蛋白-蛋白互作可以调节所连接生物活性分子的一种或一种以上活性。可以将小分子用作拮抗剂以干扰其它蛋白或分子的结合活性。
抗原结合多肽和小分子可以通过连接子、聚合物或共价键连接。连接子、聚合物或小分子自身可以包含与20种常见氨基酸不具反应性的官能团。连接子或聚合物可以是双官能的。在所需条件下，一个或一个以上涉及抗原结合多肽经连接子、聚合物或共价键结合于生物活性分子的键可以是不可逆的、可逆的或不稳定的。一个或一个以上涉及抗原结合多肽经连接子、聚合物或共价键结合于分子的键可以允许抗原结合多肽或其它分子的受调节释放。所属领域技术人员可以通过化学方法、作为天然产物分离或其它方法产生多种小分子。
Rader等人Proc Natl Acad Sci USA.2003年4月29日；100(9)：5396-400中描述一种经由使小合成分子与一般抗体分子反应而对所述分子提供效应子功能和长血清半衰期的方法，此参考案以引用的方式并入本文。通过mAb 38C2(模拟天然醛缩酶的催化抗体)经抗体上反应性赖氨酸残基而与靶向Arg-Gly-Asp肽模拟物的整合素二酮衍生物之间的可逆共价键来产生所述复合物。除了增加肽模拟物的半衰期之外，复合物还展示抗体选择性重新靶向表达整合素αVβ3、αVβ5的细胞表面。
所感兴趣的蛋白或多肽可以含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同或不同，例如包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同非天然氨基酸的蛋白中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位点。在某些实施例中，至少一个(但少于全部)以蛋白的天然发生形式存在的特定氨基酸由非天然氨基酸替换。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的抗原结合多肽或ABP的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入ABP中可以允许涉及与包括(但不限于)一个或一个以上非天然编码氨基酸发生特异性化学反应而不与常见发生20种氨基酸反应的结合化学应用。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的ABP经由非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供用PEG衍生物选择性修饰蛋白的高效方法，所述方法涉及将非遗传编码氨基酸选择性并入响应于选择密码子的蛋白和随后用合适的反应性PEG衍生物对这些氨基酸进行修饰，所述非遗传编码氨基酸包括(但不限于)含有并非发现于20种天然并入氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分。一旦并入之后，即可以通过使用所属领域技术人员已知适用于存在于天然编码氨基酸的特定官能团或取代基的化学方法来对氨基酸侧链进行修饰。已知多种化学方法适用于本发明中将水溶性聚合物并入蛋白中。所述方法包括(但不限于)分别与包括(但不限于)乙炔或叠氮衍生物进行Huisgen[3+2]环加成反应(参看，例如Padwa，A.的Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)编辑Trost，B.M.，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.的1，3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry，(1984)编辑Padwa，A.，Wiley，NewYork，第1-176页)。
由于Huisgen[3+2]环加成法涉及环加成而不是亲核取代反应，因此蛋白可以经极为高度选择性的修饰。可以通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐来在室温下水性条件中以良好区域选择性(1，4＞1，5)进行所述反应。参看，例如Tornoe等人，(2002)Org. Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；和WO 03/101972。在[3+2]环加成中可以添加到本发明蛋白中的分子实质上包括任何具有合适官能团或取代基的分子，包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物。可以将这些分子分别添加于具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)中或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
由Huisgen[3+2]环加成所产生的五元环通常在还原环境中不可逆，并且在水性环境中长时间对水解稳定。因此，多种物质的物理和化学特征可以在所需水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰。更为重要的是，因为叠氮和乙炔部分相互之间具有特异性(例如，不与任何20种常见遗传编码氨基酸反应)，所以可以在一个或一个以上特异性位点处以极为高选择性修饰蛋白。
本发明也提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物，和具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对已经选择性引入响应于选择密码子的蛋白中的叠氮部分的偶联具有高度选择性。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物对已经选择性引入响应于选择密码子的蛋白中的乙炔部分的偶联具有高度选择性。
更具体来说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮、芳基叠氮和这些叠氮的衍生物。烷基叠氮和芳基叠氮的衍生物可以包括其它取代基，只要维持乙炔特异性反应即可。乙炔部分包含烷基乙炔和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基乙炔和芳基乙炔的衍生物可以包括其它取代基，只要维持叠氮特异性反应即可。
包含非天然编码氨基酸的ABP可以用于采用抗体特异性的试验中。举例来说，本发明的ABP分子可以用于筛选潜在抗原群体。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物，所述其它物质包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、放射性核素、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述组合或任何其它所需化合物或物质。本发明也提供具有叠氮或乙炔部分的物质与具有对应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可以在蛋白中含有具有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处偶联于生物活性分子。用于PEG与生物活性分子的偶联的键合包括(但不限于)Huisgen[3+2]环加成产物。
所属技术领域已经充分确定，PEG可以用于修饰生物材料的表面(参看，例如美国专利6,610,281；Mehvar，R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136(2000)，所述参考案以引用的方式并入本文)。本发明也提供包含具有一个或一个以上反应性叠氮或乙炔位点的表面和一种或一种以上经Huisgen[3+2]环加成键偶联于所述表面的本发明的含叠氮或乙炔聚合物的生物材料。生物材料和其它物质也可以通过除叠氮或乙炔键之外的键(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)偶联于叠氮或乙炔活化的聚合物衍生物，以留下叠氮或乙炔部分可用于随后反应。
本发明包括合成本发明含有叠氮和乙炔的聚合物的方法。在含有叠氮的PEG衍生物的情况下，叠氮可以直接结合于聚合物的碳原子。或者，可以通过将一个末端具有叠氮部分的连接剂连接于常规活性聚合物来制备含叠氮的PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有叠氮部分。在含有乙炔的PEG衍生物的情况下，乙炔可以直接结合于聚合物的碳原子。或者，可以通过将一个末端具有乙炔部分的连接剂连接于常规活性聚合物来制备含乙炔的PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有乙炔部分。
更具体来说，在含叠氮的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经反应以生成其上具有更具反应性部分的经取代聚合物，所述更具反应性部分例如甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯(tresylate)、甲苯磺酸酯或卤素离去基团。所属领域技术人员熟知含有磺酰酸卤化物、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和用途。所得经取代聚合物随后经反应以在聚合物的所述末端用叠氮部分取代所述更具反应性的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与在一个末端具有叠氮的连接剂的反应，以使在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮部分位于聚合物的所述末端。所属领域技术人员熟知亲核和亲电子部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等。
更具体来说，在含有乙炔的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经反应以置换含有乙炔部分的前驱物中的卤素或其它活性离去基团。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与在一个末端具有乙炔的连接剂的反应，以使在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的所述末端。所属领域技术人员完善确立了卤素部分、活性离去基团、亲核和亲电子部分在有机合成内容和PEG衍生物的制备和应用中的用途。
本发明也提供选择性修饰蛋白的方法，以向经修饰蛋白添加其它物质，包括(但不限于)水溶性聚合物，例如含有叠氮或乙炔部分的PEG和PEG衍生物。可以用含叠氮和乙炔的PEG衍生物修饰表面和分子的特性(其中主要是生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性)，而同时提供比所属技术领域先前已知的更具选择性的连接PEG衍生物与蛋白的方法。
II.抗原结合多肽
存在许多种ABP。ABP自身对许多种抗原具有特异性。也存在大量多种类的抗原特异性ABP片段。因此，ABP旨在包括展示特异性结合靶分子或抗原的能力的任何多肽。任何已知的抗体或抗体片段为ABP。
本发明的ABP可以包含Fc区或Fc样区。Fc域提供与效应子功能的连接，例如补体或吞噬细胞。免疫球蛋白的Fc部分具有长血浆半衰期，而Fab具有短寿命(Capon等人(1989)，Nature，337：525-531)。当连同治疗蛋白构建时，Fc域可以提供更长半衰期或者并入例如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固定和可能甚至是胎盘转移的功能。举例来说，IgG1抗体的Fc区已经融合于CD30-L的N端，CD30-L是结合表达于何杰金氏病(Hodgkin′s Disease)肿瘤细胞、间变性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其它恶性细胞型上的CD30受体(美国专利第5,480,981号)。抗炎性和抗排斥剂IL-10已经融合于鼠科动物Fcγ2a以增加细胞因子的短循环半衰期。Zheng，X.等人(1995)，The Journal ofImmunology，154：5590-5600。也已经进行研究以评价与人类IgG1的Fc蛋白相连接的肿瘤坏死因子受体对治疗患有脓毒性休克(Fisher，C.等人，N.Engl.J.Med.，334：1697-1702(1996)；Van Zee，K.等人，The Journal of Immunology，156：2221-2230(1996))和类风湿性关节炎(Moreland，等人(1997)，N.Engl.J.Med.，337(3)：141-147)的患者的用途。Fc也已经与CD4受体融合以产生用于治疗AIDS的治疗蛋白(Capon等人(1989)，Nature，337：525-531)。此外，白细胞介素2的N端也已经融合于IgG1或IgG3的Fc部分以克服白细胞介素2的短半衰期及其全身性毒性(Harvill等人(1995)，Immunotechnology，1：95-105)。
众所周知，抗体的Fc区由可以通过二硫键或通过非共价缔合而连接成二聚或多聚形式的单聚多肽节段组成。天然Fc分子的单聚亚单位之间的分子间二硫键的数目取决于所涉及抗体的种类(例如，IgG、IgA、IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)而为1至4。如本文所用术语“Fc”是单聚、二聚和多聚形式的Fc分子的总称。应注意，当存在适当Cys残基时，除非存在阻止经二硫键形成的二聚化作用的特殊条件，否则Fc单体将自发二聚化。即使通常在Fc二聚体中形成二硫键的Cys残基被移除或由其它残基置换，单聚链通常仍将经由非共价互作而二聚化。本文所用术语“Fc”表示任何的这些形式：天然单体、天然二聚体(经二硫键连接)、经修饰二聚体(经二硫键和/或非共价键连接)和经修饰单体(即衍生物)。
举例来说，可以通过在包括非天然编码氨基酸的残基或序列上进行各种替换来构建Fc部分的变体、类似物或衍生物。变体(或类似物)多肽包括插入变体，其中一个或一个以上氨基酸残基补充Fc氨基酸序列。插入可以位于蛋白的任一末端或两个末端，或者可以位于Fc氨基酸序列中的内部区。在任一末端或两个末端具有其它残基的插入变体可以包括(例如)融合蛋白和包括氨基酸标签或标记的蛋白。举例来说，Fc分子可以视情况含有N端Met，尤其是当所述分子在细菌细胞(例如大肠杆菌)中重组表达时。在Fc缺失变体中，移除Fc多肽中一个或一个以上氨基酸残基。可以在Fc多肽的一端或两端实现缺失，或者可以用移除Fc氨基酸序列中一个或一个以上残基来实现缺失。因此，缺失变体包括Fc多肽序列的所有片段。在Fc替换变体中，移除Fc多肽的一个或一个以上氨基酸残基并且用其它残基置换。一方面，替换为天然保守，然而本发明也涵盖为非保守的替换。举例来说，半胱氨酸残基可以缺失，或者可以用其它氨基酸置换以防止Fc序列的一些或全部二硫交联形成。蛋白可以含有一个或一个以上半胱氨酸残基，并且可以移除各半胱氨酸残基或用其它氨基酸(例如Ala或Ser或非天然编码氨基酸)替换一个或一个以上所述半胱氨酸残基。作为另一实例，也可以进行修饰以引入氨基酸替换以致(1)切除Fc受体结合位点；(2)切除补体(Clq)结合位点；和/或(3)切除抗体依赖性细胞介导细胞毒素(ADCC)位点。所述位点为所属技术领域所已知，并且任何已知替换均是在本文所用Fc的范围以内。举例来说，就IgG1中的ADCC位点而言，请参看Molecular Immunology，Vol.29，No.5，633-639(1992)。同样，一个或一个以上酪氨酸残基也可以由苯丙氨酸残基置换。此外，也涵盖其它变体氨基酸插入、缺失(例如1-25个氨基酸)和/或替换，并且这些是在本发明的范围以内。保守氨基酸替换通常是首选。此外，改变可以为经改变氨基酸形式，例如肽模拟物或D-氨基酸。
Fc序列也可以经衍生化，即承受除氨基酸残基的插入、缺失或替换之外的修饰。修饰优选是天然共价的，并且包括(例如)与聚合物、脂质、其它有机部分和无机部分的化学键接。可以制备本发明的衍生物以增加循环半衰期，或者可以设计本发明的衍生物以改进多肽靶向所需细胞、组织或器官的能力。也可以将完整Fc分子的补救受体结合域(salvage receptor binding domain)用作本发明化合物的Fc部分，例如描述于WO96/32478，标题为“Altered Polypeptides with Increased Half-Life”中。本文指定为Fc的一类分子的其它成员描述于WO 97/34631，标题为“Immunoglobulin-Like Domains withIncreased Half-Lives”中。本段所引用的两个公开PCT申请案以引用的方式并入本文。
可能会在以后发现其它ABP。可以通过预定蛋白序列的计算机辅助二级和三级结构分析并且通过指定用于鉴别结合于特定靶标的分子的选择技术来鉴别新颖ABP。所述后来所发现的ABP也包括于本发明中。
因此，提供ABP的描述以用于说明目的，并且仅作为实例，而并不作为对本文所述方法、组合物、策略和技术的范围的限制。此外，本申请案中提及ABP旨在使用该总称作为任何ABP的实例。因此，应了解，本文关于特异性抗原结合多肽或蛋白所描述的修饰和化学方法同样适用于任何抗原结合多肽，包括本文具体列出的那些在内。
III.本发明使用的一般重组核酸方法
在本发明的许多实施例中，分离、克隆并通常使用重组方法改变编码所感兴趣的ABP的核酸。所述实施例用于包括(但不限于)蛋白表达或用于变体、衍生物、表达级联或其它来源于抗原结合多肽的序列的产生中。在一些实施例中，编码本发明的多肽的序列经操作连接于异源启动子。
可以基于母体多肽的氨基酸序列并接着改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即并入或替换)或移除(即缺失或替换)，来合成编码包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的核苷酸序列。可以根据常规方法通过定点突变来便利地修饰核苷酸序列。或者，可以通过化学合成制备核苷酸序列，包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成剂，其中根据所需多肽的氨基酸序列设计寡核苷酸，并且优选选择在重组多肽将产生于其中的宿主细胞中被喜爱的密码子。举例来说，可以通过PCR、连接(ligation)或连接链反应合成并组装编码所需多肽部分的几种小寡核苷酸。参看，例如Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；美国专利6，521,427，其以引用的方式并入本文。
本发明采用重组遗传学领域的常规技术。公开本发明所用的一般方法的基本内容包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，GeneTransfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人编辑，1994)。
描述分子生物学技术的一般内容包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzvmology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloninfi-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，Current Protocols，a jointventure between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(补充1999)(″Ausubel″)。这些内容描述突变作用、载体用途、启动子和许多其它相关主题，包括(但不限于)产生包括用于产生蛋白的选择密码子的基因，所述蛋白包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶及其配对。
各种类型的突变作用用于本发明的多种目的，包括(但不限于)产生tRNA的文库、产生合成酶的文库、产生选择密码子、将编码非天然氨基酸的选择密码子插入所感兴趣的蛋白或多肽中。所述突变作用包括(但不限于)定点随机点突变、同源重组、DNA改组或其它循环突变(recursive mutagenesis)法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板进行的突变、寡核苷酸定向突变、硫代磷酸酯修饰DNA突变、使用缺口双链DNA等进行的突变，或其任何组合。其它合适方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株进行的突变、限制性选择和限制性纯化、缺失突变、通过总基因合成进行的突变、双链破裂修复等。包括(但不限于)涉及嵌合构建体在内的突变作用也包括在本发明中。在一个实施例中，可以通过天然发生分子或者经改变或变异的天然发生分子的已知信息指导突变，包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、二级结构、三级结构或四级结构、晶体结构等等。
本文所见的内容和实例描述这些程序。其它信息见以下公开案和其内所引用的参考文献：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：an overview，Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonncleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitromutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein & Shortle，Strategies andapplications of in vitro mutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directedmutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，in Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin)(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods in Enzvmol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities，Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzvmol.100：468-500(1983)；Methods in Enzvmol.154：329-350(1987)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for theproduction of point mutations in any DNA fragment，Nucleic Acids Res.10：6487-6500(1982)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned intoM13 vectors，Methods in Enzvmol.100：468-500(1983)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primersand a single-stranded DNA template，Methods in Enzvmol.154：329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nickedDNA，Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye & Eckstein，Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人，5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl. Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presenceofethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure withoutenzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Differentbase/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNAmismatch-repair system of E.coli，Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml 3 vectors，Methods in Enzymol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh & Henikoff，Use ofoligonucleotides to generate large deletions，NucL Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil. Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of agene coding for the ribonuclease S protein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outersegment guanine nucleotide-bindingprotein(transducin)，Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiplemutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis，Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repairin plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.83：7177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering for unusual environments，Current Opinion in BiotechnoloRV 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001)；W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；and，I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8(1995)。其它关于许多上述方法的细节见Methods in Enzymology第154卷，此参考案也描述用各种突变方法进行对故障检测问题(trouble-shooting problem)的有效控制。
本发明也涉及用于经正交tRNA/RS对活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。用本发明的多聚核苷酸或包括本发明的多聚核苷酸的构建体(包括(但不限于)本发明的载体，例如可以是克隆载体或表达载体)来遗传工程操作(包括(但不限于)转化、转导或转染)宿主细胞。举例来说，载体可以为质粒、细菌、病毒、裸露多聚核苷酸或结合多聚核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述标准方法包括电穿孔(From等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985))；病毒载体侵染；通过小粒子用核酸在小珠或粒子基质中或者在表面上进行高速弹道穿透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))。
可以在经过改良而获得适用于筛选步骤、激活启动子或选择转化子等的活性的常规营养培养基中培养经工程操作的宿主细胞。这些细胞视情况可以在转基因生物体中培养。包括(但不限于)用于细胞分离和培养(例如，用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，New York和其中所引用的参考文献；Payne等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)Plant Cell Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)和Atlas和Parks(编辑)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。
将靶核酸引入细胞中的一些熟知方法可用，其中的任何一种均可用于本发明。这些方法包括：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、发射轰击(projectilebombardment)和用病毒载体侵染(在下文进一步讨论)，等等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒数目。使细菌生长至对数生长期，并且可以通过多种所属技术领域已知方法(参看，例如Sambrook)分离细菌内的质粒。此外，许多市售试剂盒可用于从细菌纯化质粒(参看，例如EasyPrepTM、FlexiPrepTM，均购自PharmaciaBiotech；购自Stratagene的StrataCleanTM；和购自Qiagen的QIAprepTM)。进一步操纵经分离和经纯化的质粒以产生其它质粒，用于转染细胞或并入相关载体中以侵染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定靶核酸表达的启动子。载体视情况包含一般表达级联，所述表达级联含有至少一个独立终止子序列、允许级联在真核生物或原核生物或两者(包括(但不限于)穿梭载体)中复制的序列和用于原核和真核系统的选择标记。载体适用于复制和整合进真核生物、原核生物或优选为两者。参看，Giliman & Smith，Gene 8：81(1979)；Roberts等人，Nature，328：731(1987)；Schneider，B.等人，Protein Expr.Purif.6435：10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(均同上文)。举例来说，由ATCC提供可用于克隆的细菌和细菌噬菌体的目录，例如由ATCC所发表的The ATCC CataloRue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(编辑)。其它用于测序、克隆和分子生物学其它方面的基本过程和基础理论考虑事项请见Watson等人(1992)Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books，NY。此外，基本上任何核酸(和基本上任何经标记核酸，无论标准还是非标准)均可以是从任何多种商业来源定购的定制品或标准品，所述商业来源例如Midland Certified ReagentCompany(Midland，TX available on the World Wide Web at mcrc.com)、The Great AmericanGene Company(Ramona，CA available on the World Wide Web at genco.com)、ExpressGenInc.(Chicago，IL available on the World Wide Web at expressgen.com)、OperonTechnologies Inc.(Alameda，CA)，等。
选择密码子
本发明的选择密码子扩大蛋白生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无意义密码子，例如终止密码子(琥珀密码子(UAG)或乳白密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域技术人员轻易地了解，存在许多数目的可以引入所需基因中的选择密码子，包括(但不限于)编码至少一部分ABP的单个多聚核苷酸中的一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
在一个实施例中，所述方法涉及选择密码子的用途，所述选择密码子是在真核细胞中活体内并入非天然氨基酸的终止密码子。举例来说，产生识别终止密码子的O-tRNA，包括(但不限于)UAG，并且通过O-RS用所需非天然氨基酸进行氨酰化作用。所述O-tRNA不由天然发生宿主的氨酰基-tRNA合成酶所识别。常规定点突变可用于在所感兴趣的多肽的所感兴趣的位点处引入终止密码子，包括(但不限于)TAG。参看，例如Sayers，J.R.等人(1988)，5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res，791-802。当编码所感兴趣的多肽的O-RS、O-tRNA和核酸活体内结合时，非天然氨基酸响应于UAG密码子而并入从而产生在特定位置含有非天然氨基酸的多肽。
可以在不显著扰动真核宿主细胞下进行活体内非天然氨基酸的并入。举例来说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制基因tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合终止密码子并引发生长肽从核糖体释放)之间的竞争，所以抑制效率可以通过包括(但不限于)增加O-tRNA和/或抑制基因tRNA的表达水平来调控。
选择密码子也包含长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基密码子，例如四、五、六或更多碱基密码子。四碱基密码子的实例包括：包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包括：包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包括使用基于移码抑制的长密码子。四个或四个以上碱基密码子可以将包括(但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白中。举例来说，在存在突变O-tRNA(包括(但不限于)具有反密码子环(例如具有8-10个核苷酸反密码子环)的移码抑制基因tRNA)下，将四个或四个以上碱基密码子读为单氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可以解码包括(但不限于)至少四碱基密码子、至少五碱基密码子或至少六碱基密码子或更多。由于存在256种可能的四碱基密码子，因此可以使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参看，Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon andAnticodon Size，Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery(2001)Expanding the GeneticCode：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307：755-769。
举例来说，已经使用活体外生物合成方法将四碱基密码子用于将非天然氨基酸并入蛋白中。参看，例如Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am， Chem.Soc.121：34。用两个经过化学酰基化作用的移码抑制基因tRNA，使用CGGG和AGGU同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物活体外并入链菌素中。参看，例如Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121：12194。在活体内研究中，Moore等人检测了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可以为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA能够以13至26％的效率由具有UCUA反密码子的tRNALeu解码，其中在0或-1框架中发生极少解码。参看，Moore等人，(2000)J.Mol.Biol..298：195。在一个实施例中，基于稀有密码子或无意义密码子的长密码子可以用于本发明，其可以减少在其它非希望位点的错义通读(missense readthrough)和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可以包括一种天然三碱基密码子，其中内生系统并不使用(或极少使用)所述天然碱基密码子。举例来说，其包括缺少识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩大现有遗传密码字母。一种额外碱基对将三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定和选择性碱基配对、通过聚合酶有效高保真的酶法并入DNA，和合成初生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可适用于所述方法和组合物的非天然碱基对的描述包括(例如)Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acid analoguesinto protein，Nature Biotechnology，20：177-182。其它相关出版物列于下文中。
对于活体内使用来说，非天然核苷是可穿膜的，并且经磷酸化而形成相应三磷酸酯。此外，增加的遗传信息是稳定的并且不被细胞酶破坏。Benner和他人的先前工作利用了不同于典型Watson-Crick对的氢键类型，其中最值得注意的是iso-C:iso-G对。参看，例如Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：8322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.BioL，4：602。这些碱基通常与天然碱基一定程度的错配，并且不能酶法复制。Kool和合作者证明碱基之间的疏水包装互作可以代替氢键以促使碱基对形成。参看Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.BioL，4：602；和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36，2825。在开发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg和合作者已经系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对(self-pair)比天然碱基对更为稳定，并且可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。参看，例如McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：11586；和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：3274。可以通过KF在具有足够满足生物功能的效率和选择性下合成3MN:3MN自身对。参看，例如Ogawa等人，(2000)L Am.Chem.Soc，122：8803。然而，两种碱基均充当进一步复制的链终止剂。最近开发出可用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外，可以复制7AI自身对。参看，例如Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，123：7439。最近已经开发出在结合Cu(II)后形成稳定对的新颖金属碱基对Dipi:Py。参看Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：10714。因为长密码子和非天然密码子本身与天然密码子呈正交，所以本发明的方法可以利用所述特性来对其产生正交tRNA。
翻译绕过系统(translational bypassing system)也可以用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译绕过系统中，将大序列并入基因中，但是并未翻译为蛋白。所述序列含有充当诱导核糖体在序列上跳跃并且再继续插入的下游翻译的插入物(cue)的结构。
在某些实施例中，本发明的方法和/或组合物中所感兴趣的蛋白或多肽(或其部分)由核酸编码。核酸通常包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可以用所属领域技术人员所熟知的和本文中所描述的方法使编码所感兴趣的蛋白或多肽的基因发生突变，以包括(例如)用于并入非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。举例来说，所感兴趣的蛋白的核酸发生突变以包括用于并入一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。本发明包括任何所述变体，其包括(但不限于)突变体、任何蛋白形式，例如包括至少一个非天然氨基酸。本发明也同样包括对应核酸，即具有编码一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子的任何核酸。
可以轻易地使编码所感兴趣的蛋白(例如ABP)的核酸分子突变以在多肽的任何所希望的位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于在所感兴趣的蛋白上引入反应性分子、水溶性聚合物、蛋白或多种其它分子。适于将半胱氨酸引入抗原结合多肽的所希望部分的方法为所属技术领域熟知(例如美国专利第6,608,183号中所描述的，该专利以引用的方式并入本文)和标准突变技术。
IV.非天然编码氨基酸
多种非天然编码氨基酸适用于本发明。可以将任何数目的非天然编码氨基酸引入ABP中。一般来说，所引入的非天然编码氨基酸对20种常见遗传编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)实质上成化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与未发现于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效且选择性地反应而形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的抗原结合多肽可以与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))反应，或者与含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定结合物，产生叠氮与炔官能团的选择反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。
α-氨基酸的一般结构如下所示(式I)：
非天然编码氨基酸通常为具有上文所列式的任何结构，其中R基团为除用于二十种天然氨基酸中之外的任何取代基，并且适用于本发明。因为本发明的非天然编码氨基酸通常与所述天然氨基酸仅在侧链结构中有所不同，所以所述非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码的)以与天然发生多肽中酰胺键形成方式相同的方式形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有与天然氨基酸不同的侧链。举例来说，R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤素-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒-、磺酰基-、硼(III)酸根(borate)、硼(V)酸根(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮(enone)、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等等或其组合。其它可以适用于本发明的所感兴趣的非天然发生氨基酸包括(但不限于)包含光可活化交联剂的氨基酸、经自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射活性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价互作的氨基酸、光捕获和/或光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、例如经糖取代丝氨酸的糖基化氨基酸、其它碳水化合物修饰氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、化学可裂解和/或光可裂解氨基酸、与天然氨基酸相比具有长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)大于约5或大于约10个碳)的氨基酸、经碳连接含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明并且可用于与水溶性聚合物反应的示范性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应性基团的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。这些氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例包括以下实例，其中氨基酸与糖之间的天然发生N-或O-键由通常未发现于天然中的共价键(包括(但不限于)烯、肟、硫醚和酰胺等等)置换。这些氨基酸的实例也包括未通常发现于天然发生蛋白中的糖，例如2-脱氧基-葡萄糖、2-脱氧基半乳糖等等。
本文所提供的许多非天然编码氨基酸是市售的，例如可购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的一个分部，Darmstadt，Germany)或Peptech(Burlington，MA，USA)。所述市售的氨基酸可以视情况按照本文所提供或使用所属领域技术人员所已知的标准方法合成得到。关于有机合成技术，请参看，例如Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry第3版，部分A和B，1990，Plenum Press，NewYork)。也参看美国申请公开案2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式并入本文。除了含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可以适用于本发明的非天然氨基酸视情况也包含经修饰骨架结构，包括(但不限于)由式II和III所示的结构：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可以相同或不同，通常包含S或O，并且R和R′视情况可以相同或不同，通常选自上文对具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的相同组成清单以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含由式II和III所示的氨基或羧基中的取代。此类型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括(但不限于)具有对应常见20种天然氨基酸的侧链或非天然侧链者。此外，在α-碳处的取代视情况包括(但不限于)L、D、或α-α-二取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等。其它可选结构包括环状氨基酸，例如辅氨基类似物以及3、4、6、7、8和9元环辅氨酸类似物、β和α氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和α-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸是基于天然氨基酸，例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等等，并且适用于本发明。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代酪氨酸、邻位取代酪氨酸和间位取代酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含：包括(但不限于)酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等等。此外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明的谷氨酰胺包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代-取代衍生物、环状衍生物和酰胺取代谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明的苯丙氨酸的实例包括(但不限于)对位取代苯丙氨酸、邻位取代苯丙氨酸和间位取代苯丙氨酸，其中取代基包含：包括(但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、叠氮基、碘、溴、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等等。可适用于本发明的非天然氨基酸的具体实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸等等。可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构实例提供于(例如)WO2002/085923，标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids.”中。关于另外的蛋氨酸类似物，也参看Kiick等人，(2002)Incorporation ofazides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS 99：19-24。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(例如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的ABP组合物。也提供包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸的各种组合物和包括(但不限于)蛋白和/或细胞。一方面，包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可以结合(包括(但不限于)共价)于正交tRNA，包括(但不限于)经氨基-酰基键共价结合于正交tRNA，共价结合于正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH，等等。
经非天然氨基酸可以并入蛋白中的化学部分提供蛋白的多种优势和操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许用任何多种含肼或羟胺的试剂活体外和活体内选择性修饰蛋白。举例来说，重原子非天然氨基酸可以用于定相(phasing)X光结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子位点特异性引入也在选择重原子的位置方面提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有苯甲酮和芳基叠氮(包括(但不限于)苯基叠氮)侧链的氨基酸)允许有效的活体内和活体外蛋白光交联。光反应性氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。具有光反应性非天然氨基酸的蛋白随后可以通过激发光反应性基团而得以交联-提供暂时控制。在一个实例中，非天然氨基酸的甲基可以经同位素标记取代，其包括(但不限于)作为局部结构和动力学探针的甲基，包括(但不限于)通过使用核磁共振和振动光谱学。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许用分子经[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白。
在氨基端并入多肽中的非天然氨基酸可由R基团(R基团为除用于20种天然氨基酸中之外的任何取代基)和第二反应性基团(不同于通常存在于α-氨基酸中的NH2基团)(见式I)组成。可以用不同于通常存在于α-氨基酸中的COOH基团(见式I)的第二反应性基团在羧基末端引入相似的非天然氨基酸。
非天然氨基酸的化学合成
许多适用于本发明的非天然氨基酸是市售的，例如可购自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WL USA)。所述市售的氨基酸可以视情况如本文所提供或如各种出版物中所提供或使用所属领域技术人员所已知的标准方法合成得到。关于有机合成技术，参看，例如Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，NewYork)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry第3版，部分A和B，1990，Plenum Press，New York)。描述非天然氨基酸合成的其它出版物包括(例如)WO2002/085923标题为″In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids；″Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.，38，4660-4669；King，F.E.&Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J.Chem. Soc，3315-3319；Friedman，O.M.& Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.&Frappier，F.(1991)Glutamine analogues asPotential Antimalarials，.Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.&Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.&Rapoport，H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org. Chem.1989：1859-1866；Barton等人，(1987)Synthesis of Novel a-Amino-Acids andDerivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L-and D-a-Amino-Adipic Acids，L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett. 43：4297-4308；和Subasinghe等人，(1992)Quisqualic acid analogues：synthesis ofbeta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35：4602-7。也参看2003年12月22日申请的标题为“Protein Arrays”的专利申请案第10/744,899号，和2002年12月22日申请的第60/435,821号。
A.羰基反应性基团
其中具有羰基反应性基团的氨基酸允许各种反应以经由亲核加成或醛醇缩合反应来连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)。
示范性含羰基氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即甲基、乙基或丙基)且酮基部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即甲基、乙基或丙基)且酮基部分位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang，Z.等人.，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文。所属领域技术人员可以相似地制备其它含羰基氨基酸。
在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可以从具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于结合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时，例如N端丝氨酸或苏氨酸(其通常可以存在或者经化学或酶消化而暴露)可以用于在温和氧化裂解条件下用高碘酸盐产生醛官能性。参看，例如Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan，K.&Stroh，I，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol Chem.269：7224-7230(1994)。然而，所属技术领域已知的方法仅限于肽或蛋白N端的氨基酸。
在本发明中，携带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可以并入多肽中作为“隐蔽(masked)”醛官能团。举例来说，5-羟基赖氨酸带有相邻于ε胺的羟基。用于产生醛的反应条件通常包括在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠(sodium metaperiodate)以避免在多肽内其它位点处的氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应包括向多肽的缓冲溶液中加入约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中温育约10分钟。参看，例如美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文。
羰基官能团可以与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂在温和条件下在水溶液中选择性反应以分别形成在生理条件下稳定的对应腙、肟或缩氨基脲键。参看，例如Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其它氨基酸侧链存在下进行选择性修饰。参看，例如Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 276：1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物)。
示范性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，n为4，R1不存在，且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在，且X不存在。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，且氧原子位于芳基环上脂肪族基团的对位。
含肼、酰肼和氨基脲的氨基酸可以购自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-y-酰肼可以购自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。其它非市售氨基酸可以由所属领域技术人员制备。参看，例如美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文。
含有携带酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可以有效地和选择性地与多种含有醛基或其它官能团的分子以相似化学反应性反应。参看，例如Shao，J.和Tarn，J.，J.Am.Chern.Soc.117：3893-3899(1995)。与对存在于20种常见氨基酸上的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基和N端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使得其对醛、酮和其它亲电子基团显著更具反应性。
C.含氨氧基氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成结合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。如肼、酰肼和氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性允许其与多种含有醛或其它官能团的分子以相似化学反应性有效地和选择性反应。参看，例如Shao，J.和Tarn，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Ace.Chem.Res.34：727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果是相应腙，但是肟通常来源于氨氧基与含羰基基团(例如酮基)的反应。
示范性含氨氧基氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y＝C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，且Y存在。在一些实施例中，n为2，R1和X不存在，m为0，且Y不存在。
可以由轻易可得的氨基酸前驱物(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备含氨氧基的氨基酸。参看，例如M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。已经从天然来源分离出某些含氨氧基氨基酸，例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(Rosenthal，G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。所属领域技术人员可以制备其它含氨氧基氨基酸。
D.叠氮和炔反应性基团
叠氮和炔官能团的独特反应性使得其极其可用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮(尤其是α叠氮)和炔通常对普通反应化学条件稳定。具体来说，叠氮和炔官能团对发现于天然发生多肽中的20种常见氨基酸的侧链(即R基团)呈惰性。然而，当置于近距离(close proximity)时，显示出叠氮和炔基团的“弹簧负载(spring-loaded)”性质，并且它们经Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应以生成对应三唑。参看，例如Chin J.等人，Science 301：964-7(2003)；Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)。
因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参看，例如Padwa，A.的Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(Trost，B.M.，1991编辑)，第1069-1109页；Huisgen，R.的1，3-Depolar Cycloaddition Chemistry，(Padwa，A.，1984编辑)，第1-176页)而不是亲核取代，所以并入携带含叠氮和炔侧链的非天然编码氨基酸允许所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。可以在室温下在水性条件下，通过加入催化量的Cu(II)(包括(但不限于)催化量CuSO4的形式)，在存在用于将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂存在下进行涉及含叠氮或炔ABP的环加成反应。参看，例如Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Tornoe，C.W.等人，J.Org.Chem.67：3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599(2002)。示范性还原剂包括(但不限于)抗坏血酸、金属铜、奎宁、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和施加电势。
在一些情况下，当需要叠氮与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应时，抗原结合多肽包含含有炔部分的非天然编码氨基酸，且待连接于氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可以进行反向反应(即氨基酸上的叠氮部分和存在于水溶性聚合物上的炔部分)。
叠氮官能团也可以与含有芳基酯的水溶性聚合物选择性反应，并且用芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮，并且所得胺随后与最接近的酯键有效地反应以产生对应酰胺。参看，例如E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287，2007-2010(2000)。含叠氮的氨基酸可以是烷基叠氮(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮(对叠氮基苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的示范性水溶性聚合物可如下所示：
其中X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可以为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示范性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R′″和R″″各自独立是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基，包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R′、R″、R′″和R″″基团。当R′和R″连接于同一氮原子时，它们可以与氮原子结合，形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。对于上述取代基来说，所属领域技术人员应了解术语“烷基”是指包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
叠氮官能团也可以与含有硫酯的水溶性聚合物选择性反应，并且用芳基膦部分适当官能化而产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮，并且所得胺随后与硫酯键有效地反应以产生对应酰胺。含有硫酯和膦部分的示范性水溶性聚合物可如下所示：
其中n为1-10；X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
示范性含炔氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0，且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，且炔丙氧基位于相对于烷基侧链的对位(即O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R1和X不存在，m为0(即炔丙基甘氨酸)。
含炔氨基酸是市售的。举例来说，炔丙基甘氨酸可以购自Peptech(Burlington，MA)。或者，可以根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说，可以(例如)如Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783(2003)中所述合成对炔丙氧基苯丙氨酸，并且如Kayser，B.等人，Tetrahedron 53(7)：2475-2484(1997)中所述合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域技术人员可以制备其它含炔氨基酸。
示范性含叠氮氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0，且叠氮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4，且R1和X不存在，且m为0。在一些实施例中，n为1、R1为苯基，X为O，m为2且β-叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮的氨基酸可以自商业来源购得。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可得自Chem-Impex International，Inc.(Wood Dale，IL)。关于非市售含叠氮氨基酸，可以使用所属领域技术人员所已知的标准方法相对简单地制备叠氮基，包括(但不限于)经由合适离去基团(包括(但不限于)卤素、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)置换，或者经由打开经适当保护的内酯。参看，例如March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley andSons，New York)。
E.氨基硫醇反应性基团
经β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使得其极其可用于多肽和其它含有醛基的生物活性分子经由形成四氢噻唑而进行选择性修饰。参看，例如J.Shao和J.Tam，J.Am.Chem.Soc.1995，117(14)3893-3899。在一些实施例中，经β-取代的氨基硫醇氨基酸可以并入ABP多肽中，并且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物结合物或其它有效负载(payload)可以经由形成四氢噻唑而偶联于包含经β-取代的氨基硫醇氨基酸的ABP多肽。
非天然氨基酸的细胞摄取
当指定并选择非天然氨基酸以用于包括(但不限于)并入蛋白时，通常必须考虑由真核细胞摄取非天然氨基酸的问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度暗示这些化合物不太可能具有细胞可透性。天然氨基酸经一组基于蛋白的转运系统而被真核细胞所摄取。可以进行快速筛选以评估(若存在)哪些非天然氨基酸由细胞摄取。参看，例如2003年12月22日申请的标题为“Protein Arrays”的申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435，821号中的毒性试验；和Liu，D.R.&Schultz，P.G.(1999)Progresstoward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States96：4780-4785。尽管用各种方法轻易地分析摄取，但是对服从细胞摄取途径的预想非天然氨基酸的替代是提供生物合成途径以活体内产生氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中已经存在许多生物合成途径用于生产氨基酸和其它化合物。尽管天然(包括(但不限于)真核细胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但是本发明提供所述方法。举例来说，通过加入新酶或修饰现存宿主细胞途径而视情况在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新酶为视情况天然发生酶或人工演化酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(例如WO 2002/085923标题为“In vivoincorporation of unnatural amino acids”中所示)依赖于添加来源于其它生物体的已知酶的组合。通过用包含所述酶的基因的质粒转化细胞而可以将这些基因并入真核细胞中。当在细胞中表达时，所述基因提供酶途径以合成所需化合物。视情况添加的酶类型的实例在下文实例中提供。其它酶序列见(例如)Genbank。视情况也以相同方式将人工演化酶添加至细胞中。以此方式操作细胞机器和细胞来源以产生非天然氨基酸。
多种方法可用于产生用于生物合成途径或用于现有途径演化的新颖酶。举例来说，包括(但不限于)Maxygen，Inc.(www.maxygen.com上可用)所开发的递归重组(recursiverecombination)视情况用于开发新颖酶和途径。参看，例如Stemmer(1994)，Rapidevolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature 370(4)：389-391；和Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination formolecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：10747-10751。由Genencor(www.genencor.com上可用)所开发的DesignPathTM视情况用于代谢途径工程，包括(但不限于)以工程化改造途径以在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸。所述技术采用新基因(包括(但不限于)经功能基因组学、分子演化和设计来鉴别)的组合以在宿主生物体中重建现有途径。Diversa Corporation(www.diversa.com上可用)也提供用于快速筛选基因和基因途径文库的技术，包括(但不限于)以建立新途径。
通常以足以进行有效蛋白生物合成的浓度用本发明经工程操作的生物合成途径产生非天然氨基酸，所述浓度包括(但不限于)天然细胞量，但未达到影响其它氨基酸或耗尽细胞源浓度的程度。以此方式活体内产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。一旦用包含用于产生特异性途径所需酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸，就视情况使用活体内选择以进一步优化用于核糖体蛋白合成和细胞生长的非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
可以为了多种目的进行非天然氨基酸的并入，包括(但不限于)调整蛋白结构和/或功能的改变；改变大小、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点可达性；靶向部分(包括(但不限于)用于蛋白阵列)；添加生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节主动转运；调节组织、细胞或器官特异性；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等等。包括非天然氨基酸的蛋白可以具有增强的或甚至是完全新的催化或生物物理性质。举例来说，视情况通过将非天然氨基酸包括进蛋白来改变以下性质：毒性、生物分布、结构性质、分光性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应的能力，包括(但不限于)共价或非共价，等等。包括含有至少一种非天然氨基酸的蛋白的组合物可用于(包括(但不限于))新颖治疗、诊断、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括(但不限于)抗体)且包括(但不限于)研究蛋白结构和功能。参看，例如Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Syructure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。
在本发明一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白。非天然氨基酸可以相同或不同，包括(但不限于)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同非天然氨基酸的蛋白中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位点。另一方面，组合物包括一种蛋白，该蛋白中至少一个但少于全部蛋白中所存在的特定氨基酸由非天然氨基酸替换。对于给定具有一个以上非天然氨基酸的蛋白来说，非天然氨基酸可以相同或不同(包括(但不限于)所述蛋白可以包括两种或两种以上类型的非天然氨基酸，或者可以包括两种相同非天然氨基酸)。对于给定具有两个以上非天然氨基酸的蛋白来说，非天然氨基酸可以相同、不同或多个相同类型非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
具有至少一个非天然氨基酸的令人感兴趣的ABP是本发明的一个特征。本发明也包括具有至少一个用本发明的组合物和方法产生的非天然氨基酸的多肽或蛋白。也可以为蛋白提供赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)。
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的令人感兴趣的蛋白或多肽，蛋白或多肽通常包括真核细胞翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白包括至少一个非天然氨基酸和至少一种由真核细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并不由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等等。一方面，翻译后修饰包括寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)通过GlcNAc-天冬酰胺键连接于天冬酰胺。参看表1，列出真核蛋白的一些N连接寡糖的实例(也可能存在其它未图示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等等)通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键与丝氨酸或苏氨酸连接。
表1：经GlcNAc-键连接的寡糖实例
另一方面，翻译后修饰包括前驱物(包括(但不限于)降钙素前驱物、降钙素基因相关肽前驱物、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等等)的蛋白水解加工；组装进多亚单位蛋白或大分子组装体；传送至细胞中另一位点(包括(但不限于)至细胞器，例如内质网、高尔基(Golgi)体、核、溶酶体、过氧物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等等或经分泌途径)。在某些实施例中，蛋白包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体等等。
非天然氨基酸的一个优势在于其存在能够用于添加其它分子的其它化学部分。可以在真核或非真核细胞中活体内或活体外进行这些修饰。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是经由非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可以经由亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白选择性修饰的大部分反应涉及亲核与亲电子反应伴侣之间的共价键，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。通过蛋白中亲核残基的数目和可达性来确定这些情况下的选择性。在本发明的蛋白中，可以使用其它更具选择性的反应，例如非天然酮基-氨基酸与酰肼或氨氧基化合物活体外和活体内的反应。参看，例如Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc，118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128；Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.ScL 99：11020-11024；Wan等人，(2003)Proc.Natl.Acad.ScL 100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry，42：6735-6746；和Chin等人，(2003)Science(in press)。这允许用许多试剂(包括(但不限于)荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子)选择性标记实质上任何蛋白。也参看，基于2002年10月16日申请的美国临时专利申请案第60/419,265号、2002年10月23日申请的美国临时专利申请案第60/420,990号和2003年1月16日申请的美国临时专利申请案第60/441,450号的2003年10月15日申请的标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利第10/686,944号，这些参考案均以引用的方式并入本文。包括(但不限于)经由叠氮基氨基酸在内的翻译后修饰也可以通过Staudinger连接(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。参看，例如Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins forchemoselective modification by the Staudinger，ligation，PNAS 99：19-24。
本发明提供用于选择性修饰蛋白的另一高效方法，所述方法涉及遗传并入非天然氨基酸，包括(但不限于)将叠氮或炔基部分包括进响应于选择密码子的蛋白中。随后可以通过以下方法修饰这些氨基酸侧链，所述方法包括(但不限于)分别与包括(但不限于)乙炔或叠氮衍生物进行Huisgen[3+2]环加成反应(参看，例如Padwa，A.的Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)编辑Trost，B.M.，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.的1，3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry，(1984)编辑Padwa，A.，Wiley，New York，第1-176页)。由于所述方法涉及环加成而不是亲核取代，因此蛋白能够以极高选择性进行修饰。可以通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐来在室温下在水性条件中以良好区域选择性(1,4＞1,5)进行反应。参看，例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。另一种可用方法是用四半胱氨酸基序在二砷化合物上进行配体交换，参看，例如Griffin等人，(1998)Science 281：269-272。
可以通过[3+2]环加成反应添加至本发明的蛋白中的分子实质上包括任何具有叠氮或炔基衍生物的分子。分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、小珠、第二蛋白和多肽(或更多)、多聚核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等等。可以将这些分子分别添加于具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)中或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
V.活体内产生包含非遗传编码氨基酸的ABP
可以用经修饰tRNA和tRNA合成酶添加到或取代并非天然发生系统中所编码的氨基酸来活体内产生本发明的抗原结合多肽。
使用并非天然发生系统中所编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的产生方法描述于(例如)美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其以引用的方式并入本文。这些方法涉及产生与对翻译系统为内源的合成酶和tRNA无关地起作用的翻译机器(因此有时称为“正交”)。翻译系统通常包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。O-RS通常优选用翻译系统中的至少一个非天然发生氨基酸氨酰化O-tRNA，并且O-tRNA识别至少一个不由系统中其它tRNA所识别的选择密码子。因此翻译系统将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的响应于所编码选择密码子的蛋白中，进而将氨基酸“替换”进所编码多肽的位置中。
所属技术领域已经描述许多种用于将特定合成氨基酸插入多肽中的正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且通常适用于本发明。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang，L.等人，Proc.Nail.Acad.Sci.USA 100：56-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。示范性O-RS或其部分由多聚核苷酸序列所编码，并且包括公开于美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885中的氨基酸序列，其以引用的方式并入本文。用于与O-RS一起使用的对应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其以引用的方式并入本文。
叠氮特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的示范性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NO：14-16和29-32和氨基酸序列SEQ ID NO：46-48和61-64，所述公开案以引用的方式并入本文。适用于本发明的示范性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NO：1-3，所述公开案以引用的方式并入本文。对特定非天然编码氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，所述公开案以引用的方式并入本文。将含酮基和叠氮的氨基酸并入酿酒酵母中的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的用途包括选择编码非天然编码氨基酸的特异性密码子。尽管可以使用任何密码子，但是通常需要选择O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶所表达的细胞中罕有或从未使用过的密码子。举例来说，示范性密码子包括无意义密码子，例如终止密码子(琥珀、赭石和乳白)；四个或四个以上碱基密码子和其它罕有或从未使用过的天然三碱基密码子。
可以使用所属领域已知的突变方法(包括(但不限于)位点特异性突变、级联突变、限制性选择突变等等)将特异性选择密码子引入ABP多肽编码序列中的适当位置中。
用于产生蛋白生物合成机器的组分(例如O-RS、O-tRNA和可用于并入非天然编码氨基酸的正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于中Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)。用于活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，所述公开案以引用的方式并入本文。用于选择用于生物体活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其以引用的方式并入本文。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)从第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS文库(视情况为突变体)，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，例如甲烷球菌、甲烷细菌、嗜盐菌属、大肠杆菌、闪烁古生球菌、激烈热球菌、超嗜热古菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌等等，或真核生物体；(b)选择(和/或筛选)RS文库(视情况为突变体)中在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA(O-tRNA)的成员，进而提供活性(视情况为突变体RS)RS池；和/或(c)选择(视情况经阴性选择)所述池中在无非天然编码氨基酸存在下优选氨酰化O-tRNA的活性RS(包括(但不限于)突变体RS)，进而提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS优选用非天然编码氨基酸氨酰化O-tRNA。
在一个实施例中，RS为非活性RS。可以通过使活性RS突变来产生非活性RS。举例来说，可以通过将至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或者至少约10个或10个以上氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生非活性RS。
可以用所属技术领域各种已知技术来产生突变体RS文库，所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或者随机或合理设计技术中RS核苷酸的突变。举例来说，可以通过位点特异性突变、随机突变、多样性重组突变(diversity generatingrecombination mutation)、嵌合构建、合理设计，以及通过本文所述或所属技术领域已知的其它方法来产生突变体RS。
在一个实施例中，选择(和/或筛选)RS文库(视情况为突变体RS)中活性(包括(但不限于)在非天然编码氨基酸和天然编码氨基酸存在下氨酰化正交tRNA(O-tRNA))成员包括：将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等等)和(视情况突变体)RS文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀、赭石或乳白密码子)；使所述多个细胞在选择剂存在下生长；在选择和/或筛选剂存在下通过抑制阳性选择和/或筛选标记中的至少一个选择密码子来鉴别存活(或展示特异性反应)细胞，进而提供一亚组含有活性(视情况为突变体)RS池的经阳性选择的细胞。选择和/或筛选剂浓度视情况可以改变。
一方面，阳性选择标记为氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因，并且选择密码子为CAT基因中的琥珀终止密码子。阳性选择标记视情况为β-内酰胺酶基因，并且选择密码子为β-内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性选择标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中，阴性选择/或筛选池中优选在无非天然编码氨基酸存在下氨酰化O-tRNA的活性RS文库(视情况为突变体)包括：将阴性选择或筛选标记和由阳性选择或筛选得到的活性(视情况为突变体)RS池引入第二生物体的多个细胞中，其中所述阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；和鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选或选择剂的第一培养基中存活或展示特异性筛选反应、但不能在补充有非天然编码氨基酸和筛选或选择剂的第二培养基中存活或展示特异性筛选反应的细胞，进而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞。举例来说，CAT鉴别实验方案视情况充当在合适O-RS重组体的确定中的阳性筛选和/或阴性筛选。举例来说，视情况在含有CAT(包含至少一个选择密码子)且含有或不含一种或一种以上非天然编码氨基酸的生长板上复制克隆池。因此将只在含有非天然编码氨基酸的板上生长的集落视为含有重组O-RS。一方面，选择(和/或筛选)剂的浓度可以改变。在一些方面，第一和第二生物体不同。因此，第一和/或第二生物体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacteria)、真细菌、植物、昆虫、原生生物等等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。
在另一实施例中，筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)池中活性(视情况为突变体)RS包括：从阳性选择步骤(b)分离出活性突变体RS池；将阴性选择或筛选标记(其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)毒性标记基因，包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的核糖核酸酶barnase基因))和活性(视情况为突变体)RS池引入第二生物体的多个细胞中；鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或展示特异性筛选反应、但是不能在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中存活或展示特异性筛选反应的细胞，进而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS特异于所述非天然编码氨基酸。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。所述实施例视情况可以包括：其中所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且其中第一与第二生物体不同(各生物体视情况包括(但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等等)的情况。一些方面也包括其中阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情况。其它方面包括其中筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记的情况。在本文的实施例中，筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严谨性的变化。
在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可以进一步包含：(d)分离出至少一种重组O-RS；(e)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况经突变)；和(f)重复步骤(b)和(c)直至获得包含优选氨酰化O-tRNA能力的O-RS。视情况重复步骤(d)-(f)，包括(但不限于)至少约两次。一方面，可以通过突变来产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS，所述突变包括(但不限于)随机突变、位点特异性突变、重组或其组合。
上述方法中的包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者在内的选择/筛选步骤的严谨性视情况包括改变选择/筛选步骤严谨性。在另一实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者包含使用报导子，其中通过荧光激活细胞分选(FACS)来检测报导子，或者其中通过发光检测报导子。报导子视情况展示在细胞表面上、噬菌体展示表面上等等，并且基于涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和力或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶展示在细胞表面上、噬菌体展示表面上等等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)从第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制基因tRNA)的突变体tRNA文库；(b)选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在无来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)存在下由来源于第二生物体的RS氨酰化的(视情况突变体)tRNA文库，进而提供tRNA(视情况突变体)池；和(c)选择或筛选tRNA(视情况突变体)池中由所引入正交RS(O-RS)氨酰化的成员，进而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，并且不由来源于第二生物体的RS所有效识别，并且优选由O-RS氨酰化。在一些实施例中，至少一种tRNA为抑制基因tRNA并且/或者包含天然和/或非天然的独特三碱基密码子，或者为无意义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或乳白终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有改进的正交性。应了解，在一些实施例中，无需修饰而将O-tRNA视情况从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一与第二生物体相同或不同，并且视情况选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)甲烷球菌、甲烷细菌、大肠杆菌、嗜盐菌属等等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等等。此外，重组tRNA视情况由非天然编码氨基酸氨酰化，其中非天然编码氨基酸天然或经遗传操作活体内生物合成。视情况将非天然编码氨基酸添加于用于至少第一或第二生物体的生长培养基中。
一方面，选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选文库中由氨酰基-tRNA合成酶氨酰化(步骤(b))的(视情况为突变体)tRNA包括：将毒性标记基因(其中毒性标记基因包含至少一个所述选择密码子)(或导致产生毒性剂或静电剂(static agent)的基因或为生物体所必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)和(视情况为突变体)tRNA文库引入来源于第二生物体的多个细胞中；和选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包含至少一种正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况为突变体)tRNA池。举例来说，可以通过使用比较比率细胞密度试验(comparison ratio cell density assay)来选择存活细胞。
另一方面，毒性标记基因可以包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可以包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中，选择或筛选(视情况为突变体)tRNA池中由所引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员包括：将阳性选择或筛选标记基因(其中阳性标记基因包含药物抗性基因(包括(但不限于)包含至少一个所述选择密码子(例如至少一个琥珀终止密码子)的β-内酰胺酶基因))或为生物体所必需的基因或引起毒性剂解毒的基因，连同O-RS和(视情况为突变体)tRNA池引入来源于第二生物体的多个细胞中；和鉴别在选择或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)存在下生长的存活或经筛选细胞，进而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池，其中所述至少一种重组tRNA由O-RS氨酰化，并将氨基酸插入响应于至少一个选择密码子而由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，选择(和/或筛选)剂的浓度可以改变。
提供产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包括：(a)从第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变体tRNA文库；(b)阴性选择或筛选文库中在无来自第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)存在下由来自第二生物体的RS氨酰化的(视情况为突变体)tRNA，进而提供(视情况为突变体)tRNA池；(c)选择或筛选(视情况为突变体)tRNA池中由所引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员，进而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，并且不由来自第二生物体的RS有效识别，并且优选由O-RS氨酰化。所述方法也包括(d)从第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况为突变体)RS文库；(e)选择或筛选突变体RS文库中优选在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰化至少一种重组O-tRNA的成员，进而提供活性(视情况为突变体)RS池；和(f)阴性选择或筛选池中优选在无非天然编码氨基酸存在下氨酰化至少一种重组O-tRNA的活性(视情况为突变体)RS，进而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种特异于所述非天然编码氨基酸的重组O-RS和至少一种重组O-tRNA。包括通过所述方法所产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可以包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对，例如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对，等等。此外，所述方法包括其中第一和第三生物体相同(包括(但不限于)甲烷球菌)的情况。
本发明也包括选择用于第二生物体活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和分离自或来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的重复细胞组中；和选择不能在重复细胞组中存活的第一组中的存活细胞，或筛选展示特异性筛选反应而不能在重复细胞组中产生此反应的细胞，其中第一组和重复细胞组在选择或筛选剂存在下生长，其中存活或经筛选细胞包含用于第二生物体活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补试验。选择或筛选剂浓度可以改变。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明的方法中的第一和第二生物体可以相同或不同。在一个实施例中，生物体视情况为原核生物，包括(但不限于)甲烷球菌、甲烷细菌、嗜盐菌属、大肠杆菌、闪烁古生球菌、激烈热球菌、超嗜热古菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌等等。或者，生物体视情况包含真核生物，包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等等)等等。在另一个实施例中，第二生物体为原核生物，包括(但不限于)甲烷球菌、甲烷细菌、嗜盐菌属、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜盐菌属、激烈热球菌、超嗜热古菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌等等。或者，第二生物体可以为真核生物，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等等。在各种实施例中，第一和第二生物体不同。
VI.非天然发生氨基酸在ABP中的位置
本发明涵盖将一种或一种以上非天然发生氨基酸并入ABP中。一种或一种以上非天然发生氨基酸可以在不破坏多肽活性的特定位置处并入。这可以通过进行“保守性”替换而得以实现，包括(但不限于)用疏水性氨基酸替换疏水性氨基酸、大氨基酸替换大氨基酸、亲水性氨基酸替换亲水性氨基酸，和/或将非天然发生氨基酸在并非为活性所必需的位置处插入。
可以采用多种生物化学和结构方法选择抗原结合多肽中用于用非天然编码氨基酸进行替换的所需位点。所属领域技术人员轻易地了解，多肽链中的任何位置适于选择以并入非天然编码氨基酸，并且选择可以基于合理设计或者通过随机选择而用于任何或非特殊所需目的。所需位点的选择可以用于产生具有任何所需性质或活性的ABP分子，包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、二聚体或多聚体形成、不改变相比于天然分子的活性或性质；或者操纵多肽的任何物理或化学性质，例如溶解性、聚集性或稳定性。举例来说，可以使用所属技术领域已知的丙氨酸扫描或同系物扫描法来鉴别多肽中ABP生物活性所必需的位置。取决于多肽的所需活性，除由丙氨酸或同系物扫描突变所鉴别的为生物活性关键的残基之外的残基可以是用非天然编码氨基酸进行替换的良好候选。或者，再次取决于多肽的所需活性，所鉴别的为生物活性关键的位点也可以是用非天然编码氨基酸进行替换的良好候选。另一种选择是可以简单地在多肽链上的每个位置中用非天然编码氨基酸进行连续替换，并且观察对多肽活性的影响。所属领域技术人员轻易地了解，任何用于选择用非天然氨基酸替换进任何多肽中的位置的手段、技术或方法适用于本发明。
一旦消除可能不能忍受用非天然编码氨基酸进行替换的残基，即可以从抗原结合多肽及其结合伴侣的二级、三级或四级结构或三维晶体结构检查各剩余位置处所提议的替换的影响。因此，所属领域技术人员能够轻易地鉴别可以由非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
并入非天然编码氨基酸的示范性残基包括(但不限于)以下所描述者：不含潜在抗原结合区；能够完全或部分溶剂暴露；与邻近残基具有最小或无氢键互作；能够最小程度地暴露于邻近反应性残基；可以在ABP的一个或一个以上暴露面上；可以是与第二ABP或其它分子或其片段并置的ABP位点；如由结合或未结合于其抗原或者偶联或未偶联于另一ABP或其它生物活性分子的ABP的三维、二级、三级或四级结构所预测，可以处在高度柔性或结构刚性的区域中；或者视需要通过改变完整结构的柔性或刚性而可以调节ABP自身或者包含一个或一个以上ABP的二聚体或多聚体的构象。用于并入非天然氨基酸的残基可以是裂解序列、连接抗体片段或ABP的连接子序列、抗体结合域(包括(但不限于)myc标签、FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等等)的一部分。用于并入非天然氨基酸的残基可以是ABP的N端或C端残基，或者ABP的非抗原结合残基。
可以用许多种非天然编码氨基酸替换或并入ABP的给定位置。一般来说，根据以下来选择用于并入的特定非天然编码氨基酸：通过任何其它手段检查具有其抗原的ABP的三维晶体结构，或者ABP的二级、三级或四级结构；保守性替换的优选性(即基于芳基的非天然编码氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸替换Phe、Tyr或Trp)；和希望引入抗原结合多肽中的特异性结合化学(例如，如果希望实现与具有炔部分的水溶性聚合物之间的Huisgen[3+2]环加成反应或者与具有芳基酯接着又并入膦部分的水溶性聚合物之间的酰胺键形成，那么就引入4-叠氮基苯丙氨酸)。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白中，其中非天然氨基酸包含第一反应性基团；并使蛋白接触包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或任何上述组合或任何其它所需化合物或物质)。第一反应性基团与第二反应性基团反应以经[3+2]环加成反应将分子连接于非天然氨基酸。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分，并且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸)，并且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸)，并且第二反应性基团为炔基部分。
在一些情况下，非天然编码氨基酸替换可以与抗原结合多肽中的其它添加、替换或缺失结合以影响ABP的其它生物学特性。在一些情况下，所述其它添加、替换或缺失可以增加ABP的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解引起的降解作用的抗性)，或者增加ABP与ABP受体或抗原的亲和力。在一些情况下，其它添加、替换或缺失可以增加抗原结合多肽的稳定性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达之后，添加、替换或缺失可以增加多肽溶解性。在一些实施例中，除了另一用于并入非天然氨基酸而使得在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后引起多肽溶解度增加的位点之外，选择用于经天然编码或非天然氨基酸替换的位点。在一些实施例中，抗原结合多肽包含调节与ABP受体的亲和力、调节(包括(但不限于)增加或减少)受体二聚化作用、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节释放或生物可用性、促进纯化或改进或改变特定投药途径的另一增加、替换或缺失。类似地，抗原结合多肽也可以包含化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等等)或改进缺失(包括(但不限于)GFP)、纯化、经组织或细胞膜转运、前药释放或活化、ABP尺寸减小或其它多肽特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸经一个或一个以上非天然编码氨基酸替换。在一些情况下，ABP进一步包括一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然发生氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个替换。在一些实施例中，ABP以下区中的至少两个残基由一个或一个以上非天然编码氨基酸替换。在一些情况下，两个或两个以上非天然编码残基连接于一个或一个以上较低分子量的直链或支链PEG(整体上大约～5-20kDa或更小)，进而相对于连接于单个、较大分子量PEG的物质而言增强结合亲和力和可比的血清半衰期。
在一些实施例中，抗原结合多肽的多达两个残基由一个或一个以上非天然编码氨基酸替换。
VII.在非真核生物和真核生物中的表达
为了获得所克隆ABP多肽的高水平表达，通常将编码本发明抗原结合多肽的多聚核苷酸亚克隆进含有指引转录、转录/翻译终止子的强启动子的表达载体中，并且如果是对于编码蛋白的核酸，则含有用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为所属技术领域所熟知，且描述于(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中。
用于表达本发明ABP多肽的细菌表达系统在(包括(但不限于))大肠杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、荧光假单胞菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Salmonella)中可用(Palva等人，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302：543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒是市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为所属技术领域所熟知，并且也是市售的。在使用正交tRNA和氨酰基-tRNA合成酶(上述)表达本发明的抗原结合多肽的情况下，根据其使用正交组分的能力选择用于表达的宿主细胞。示范性宿主细胞包括格兰阳性细菌(包括(但不限于)枯草杆菌或链霉菌(Streptomyces))和格兰阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌)以及酵母和其它真核细胞。可以如本文所述使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含大量可用非天然氨基酸的蛋白的能力。一方面，组合物视情况包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多的包含非天然氨基酸的蛋白，或者用活体内蛋白产生方法可以达到的量(本文提供关于重组蛋白产生和纯化的细节)。另一方面，在(包括(但不限于))细胞溶解液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)约1nl至约100L的体积)中组合物中视情况存在(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白、每升至少50微克蛋白、每升至少75微克蛋白、每升至少100微克蛋白、每升至少200微克蛋白、每升至少250微克蛋白、每升至少500微克蛋白、每升至少1毫克蛋白、每升至少10毫克蛋白或更大浓度的蛋白。真核细胞中产生大量(包括(但不限于)多于通常用包括(但不限于)活体外翻译在内的其它方法所可能获得的量)的包括至少一种非天然氨基酸的蛋白是本发明的一个特征。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包含大量可用非天然氨基酸的蛋白的能力。举例来说，可以产生包括(但不限于)以下浓度的包含非天然氨基酸的蛋白：细胞提取物、细胞溶解液、培养基、缓冲液等等中至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更大。
I.表达系统、培养和分离
可以在任何数目的合适表达系统中表达ABP，合适的表达系统包括(但不限于)酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌。下文提供示范性表达系统的描述。
酵母如本文所用术语“酵母”包括任何各种能够表达编码ABP基因的酵母。所述酵母包括(但不限于)属于半知菌类(Fungi imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、basidiosporogenous酵母。产子囊酵母分为两科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae(例如粟酒裂殖酵母属(genus Schizosaccharomyces))、Nadsonioideae(拿逊酵母亚科)、Lipomycoideae和Saccharomycoideae(例如毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属和酿酒酵母(Saccharomyces)属)。Basidiosporogenous酵母包括白冬孢酵母(Leucosporidium)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、锁掷酵母(Sporidiobolus)属、Filobasidium和线担菌(Filobasidiella)属。属于半知菌类(芽孢纲)的酵母分为两科：掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌属(Candida))。
本发明所使用的尤其令人感兴趣的种类为以下属种：毕赤酵母、克鲁维酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母属、汉逊酵母(Hansenula)、球拟酵母(Torulopsis)和念珠菌，包括(但不限于)巴氏毕赤酵母(P.pastoris)、P.guillerimondii、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、淀粉酶链霉菌(S.diastaticus)、S.douglasii、克氏酵母(S.kluyveri)、S.norbensis、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白假丝酵母(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和多形汉逊酵母(H.polymorph)。选择用于ABP表达的合适酵母在所属领域技术人员的技能之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适宿主可以包括具有(例如)良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白产生和总体坚固性的宿主。酵母通常可以从多种来源获得，包括(但不限于)Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and MedicalPhysics，University of California(Berkeley，CA)，和American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可以用作或已经用作重组载体或其它转运DNA的受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其它转运DNA的最初酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意突变，因此单亲细胞的后代可能并不必需与最初亲代在形态或基因组或总DNA补体上完全相同。所述定义所指后代包括与亲代足够相似之处在于相关特性(例如存在编码ABP的核苷酸序列)的亲代细胞的后代。
已经开发出包括染色体外复制子或整合载体在内的表达和转化载体以用于转化进许多酵母宿主中。举例来说，已经开发出用于酿酒酵母的表达载体(Sikorski等人，Genetics(1998)112：19；Ito等人，J.Bacteriol.(1983)153：163；Hinnen等人，PROC Natl.Acad.Sci.USA(1978)75：1929)；白假丝酵母的表达载体(Kurtz等人，Mol.Cell.Biol.(1986)6：142)；麦芽糖假丝酵母的表达载体(Kunze等人，J.BASIC MICROBlOL.(1985)25：141)；多形汉逊酵母的表达载体(Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，Mol.Gen.Genet.(1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母的表达载体(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)；乳酸克鲁维酵母的表达载体(De Louvencourt等人，J.Bacteriol.(1983)154：737；Van den Berg等人，Bio/Technology(1990)8：135)；P.guillerimondii的表达载体(Kunze等人，J.BASIC MlCROBlOL.(1985)25：141)；巴氏毕赤酵母的表达载体(美国专利第5,324,639号、第4,929,555号和第4,837,148号；和Gregg等人，Mol.Cell.Biol.(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的表达载体(Beach和Nurse，Nature(1981)300：706)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)的表达载体(Davidow等人，Curr.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET.(1985)10：49)；构巢曲霉(A.nidulans)的表达载体(Ballance等人，BIOCHEM.Biophys.Res.Common.(1983)112：284-89；Tilburn等人，Gene(1983)26：205-221；和Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.niger)的表达载体(Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4：475479)；里氏木霉(T.reesei)的表达载体(EP 0244 234)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)的表达载体(WO 91/00357)，各文献以引用的方式并入本文。
用于酵母载体的对照序列为所属领域技术人员所熟知，并且包括(但不限于)来源于以下基因的启动子区：例如醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)(EP 0 284 044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶和丙酮酸酯激酶(PyK)(EP 0 329203)。编码酸磷酸酯酶的酵母PH05基因也提供有用的启动子序列(Myanohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80：1)。供酵母宿主使用的其它合适启动子序列可以包括用于3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255：2073)；和其它糖酵解酶，例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡糖异构酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17：4900；Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.(1968)7：149)。具有另外的受生长条件控制的转录的优势的可诱导酵母启动子可以包括以下物质的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸磷酸酯酶、金属硫蛋白(metallothionein)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。
酵母增强子也可以用于酵母启动子。此外，合成启动子也可以充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游激活序列(upstream activating sequences，UAS)可以与另一酵母启动子的转录激活区相连，以产生合成杂合体启动子。所属杂合体启动子的实例包括连接于GAP转录激活区的ADH调控序列。参看，美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以引用的方式并入本文。杂合体启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的调控序列结合例如GAP或PyK的糖酵解酶基因的转录激活区组成的启动子。参看EP 0 164 556。此外，酵母启动子可以包括具有结合酵母RNA聚合酶并起始转录的能力的非酵母来源的天然发生启动子。
其它控制元件可以包含包括(例如)来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子的酵母表达载体的部分(Holland等人，J.BiOL.Chem.(1981)256：1385)。此外，从2μ质粒起点的复制起点适于酵母。适用于酵母的选择基因是存在于质粒中的trp1基因。参看Tschemper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。trp1基因对缺乏在色氨酸中生长能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，具有Leu2基因的已知质粒涵盖Leu2缺失酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
用于将外源DNA引入酵母宿主中的方法为所属领域技术人员所熟知，并且通常包括(但不限于)原生质球(spheroplast)或经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞的转化。举例来说，可以根据Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76：3829和VanSolingen等人，J.Bact.(1977)130：946中所述的方法进行酵母转化。然而，也可以如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Lab.Manual(2001)中所概述使用其它将DNA引入细胞中的方法，例如核注射(nuclear injection)、电穿孔或原生质体融合。随后可以用所属领域技术人员所已知的标准技术培养酵母宿主细胞。
其它用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的方法为所属领域技术人员所熟知。通常参看，美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号、第6,312,923号、第6,183,985号、第6,083,723号、第6,017,731号、第5,674,706号、第5,629,203号、第5,602,034号和第5,089,398号；美国未复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/078621、WO 98/37208和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946736、EP 0 732 403、EP 0 480 480、EP 0 460 071、EP 0 340 986、EP 0 329 203、EP 0 324274和EP 0 164 556。也参看Gellissen等人，Antonie Van Leeuwenhoek(1992)62(1-2)：79-93；Romanos等人，Yeast(1992)8(6)：423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185：3-7，这些参考案均以引用的方式并入本文。
可以使用所属领域技术人员所熟知的标准补料分批发酵方法在扩增阶段在发酵罐中生长酵母宿主菌株。发酵方法也适于解释特定酵母宿主碳利用途径或表达控制模式的差异。举例来说，酿酒酵母酵母宿主发酵可能需要单葡萄糖补料、复杂氮源(例如酪蛋白水解产物)和多种维生素补充物。相反，甲醇酵母巴氏毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物质补料，但是仅简单铵(氮)盐用于最佳生长和表达。参看，例如美国专利第5,324,639号；Elliott等人，J.PROTEIN Chem.(1990)9：95；和Fieschko等人BIOTECH.BlOENG.(1987)29：1113，其引用的方式并入本文。
然而，所述发酵方法可以具有某些与所用酵母宿主菌株无关的普通特征。举例来说，可以在扩增期将生长限制营养物(通常为碳)加入发酵罐中以使得达到最大程度生长。此外，发酵方法通常采用经设计以含有足量碳、氮、基础盐(basal salt)、磷和其它微量营养物质(维生素、痕量矿物质和盐等等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其以引用的方式并入本文。
经杆状病毒侵染的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可以用作或已经用作重组载体或其它转运DNA的受体的昆虫。所述术语包括已经转染的最初昆虫宿主细胞的后代。应了解由于偶然或有意突变，因此单亲细胞的后代可能并不必需与最初亲代在形态或基因组或总DNA补体上完全相同。所述定义所指的后代包括与亲代足够相似之处在于相关特性(例如存在编码ABP的核苷酸序列)的亲代细胞的后代。
适用于ABP表达的昆虫细胞的选择为所属领域技术人员所熟知。一些昆虫种类已经在所属领域中充分描述并且有市售，其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主中，合适宿主可以包括尤其是具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体坚固性的宿主。昆虫通常可以从多种来源获得，包括(但不限于)Insect Genetic Stock Center，Department of Biophysics and MedicalPhysics，University of California(Berkeley，CA)；和American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA)。
经杆状病毒侵染的昆虫表达系统的组分一般包括通常为细菌质粒的转运载体(含有杆状病毒基因组片段和用于插入待表达的异源基因的便利限制性位点)、具有与转运载体中杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒(这允许异源基因同源重组进杆状病毒基因组中)以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。用于构建载体、转染细胞、挑选菌斑、在培养基中生长细胞等等的材料、方法和技术为所属领域已知，并且可获得描述这些技术的手册。
将异源基因插入转运载体中之后，将载体和野生型病毒基因组转染进昆虫宿主细胞中，在其中载体和病毒基因组重组。表达经包装重组病毒，并鉴别和纯化重组菌斑。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以(例如)Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)的试剂盒形式市售。这些技术通常为所属领域技术人员所已知，并且完整描述于Summers and Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555期(1987)中，其以引用的方式并入本文。也参看Richardson，39 Methods in Molecular Biology：Baculovirus Expression Protocols(1995)；Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology 16.9-16.11(1994)；King和Possee，The Baculo virus System：A Laboratory Guide(1992)；和O′Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual(1992)。
事实上使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生各种异源蛋白为所属技术领域熟知。参看，例如美国专利第6,368,825号、第6,342,216号、第6,338,846号、第6,261,805号、第6,245,528号、第6,225,060号、第6,183,987号、第6,168,932号、第6,126,944号、第6,096,304号、第6,013,433号、第5,965,393号、第5,939,285号、第5,891,676号、第5,871,986号、第5,861,279号、第5,858,368号、第5,843,733号、第5,762,939号、第5,753,220号、第5,605,827号、第5,583,023号、第5,571,709号、第5,516,657号、第5,290,686号、WO 02/06305、WO 01/90390、WO 01/27301、WO 01/05956、WO 00/55345、WO 00/20032、WO 99/51721、WO 99/45130、WO 99/31257、WO 99/10515、WO 99/09193、WO 97/26332、WO 96/29400、WO 96/25496、WO 96/06161、WO 95/20672、WO 93/03173、WO 92/16619、WO 92/03628、WO 92/01801、WO 90/14428、WO 90/10078、WO 90/02566、WO 90/02186、WO 90/01556、WO 89/01038、WO 89/01037、WO 88/07082，其以引用的方式并入本文。
可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体为所属领域已知，并且包括(例如)来源于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosisvirus，AcNPV)的昆虫表达和转运载体，它是一种不依赖于辅助病毒的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。通常参看，Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：ALABORATORY MANUAL(1992)。
在将外源基因插入杆状病毒基因组之前，通常将包含启动子、前导子(如果需要)、所感兴趣的编码序列和转录终止序列的上述组分组装至中间错位构建体(转运载体)中。中间错位构建体通常维持于复制子中，例如能够在例如细菌的宿主中稳定维持的染色体外元件(例如质粒)。复制子会具有复制系统，因此允许其维持在适合于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可以含有多面体蛋白聚腺苷信号(Miller等人，Ann.Rev.Microbiol.(1988)42：177)和原核氨苄青霉素抗性(ampicillin-resistance)(amp)基因和用于在大肠杆菌中选择和增殖的复制起点。
一个通常用于将外源基因引入AcNPV的转运载体是pAc373。也已经设计出所属领域已知的许多其它载体，包括(例如)pVL985，其将多面体起始密码子从ATG改变成ATT且在ATT下游引入BamHI克隆位点32碱基对。参看Luckow和Summers，17VIROLOGY 31(1989)。其它市售载体包括(例如)PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。
插入异源基因之后，将转运载体和野生型杆状病毒基因组共转染至昆虫细胞宿主中。用于将异源DNA引入杆状病毒中所需位点的方法为所属技术领域已知。参看Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin第1555期(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156；Luckow和Summers，Virology(1989)17：31。举例来说，可以通过同源双交叉重组插入至例如多面体基因的基因中；也可以插入至经工程化操作成所需杆状病毒基因的限制性酶切位点中。参看Miller等人，BlOESSAYS(1989)4：91。
可以通过电穿孔完成转染。参看TROTTER和Wood，39 Methods in Molecular Biology(1995)；Mann和King，J.Gen.Virol.(1989)70：3501。或者，可以用脂质体与重组表达载体和杆状病毒一起侵染昆虫细胞。参看，例如Liebman等人，Biotechniques(1999)26(1)：36；Graves等人，Biochemistry(1998)37：6050；Nomura等人，J.Biol.Chem.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，Protein Expression and Purification(1998)12：323；Siffert等人，Nature Genetics(1998)18：45；Tilkins等人，Cell Biology：A Laboratory Handbook145-154(1998)；Cai等人，Protein Expression and Purification(1997)10：263；Dolphin等人，Nature Genetics(1997)17：491；Kost等人，Gene(1997)190：139；Jakobsson等人，J.Biol.Chem.(1996)271：22203；Rowles等人，J.Biol.Chem.(1996)271(37)：22376；Reversey等人，J.Biol.Chem.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人，J.Biol.Chem.(1995)270：4121；Sisk等人，J.Virol.(1994)68(2)：766；和Peng等人，BioTechniques(1993)14.2：274。市售脂质体包括(例如) 和 (Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。此外，可以使用磷酸钙转染。参看Trotter和Wood，39 Methods in Molecular Biology(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)：5667；和Mann和King，J.Gen.Virol.(1989)70：3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子为任何能够结合杆状病毒RNA聚合酶并且起始编码序列(3′)下游(例如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有通常位于靠近编码序列5′末端的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可以具有称为增强子的第二域，如果存在，那么它通常远离结构基因。此外，表达可以被调控或者为组成型。
在侵染周期后期充足转录的结构基因提供尤其可用的启动子序列。实例包括来源于编码病毒多面体蛋白的基因的序列(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression in The MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因的序列(Vlak等人，J.Gen.Virol.(1988)69：765)。
新近形成的杆状病毒表达载体被包装至传染性重组杆状病毒中，并且随后生长的菌斑可以通过所属领域技术人员已知的技术纯化。参看Miller等人，BiOESSAYS(1989)4：91；Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin N第1555期(1987)。
已经开发出重组杆状病毒表达载体来用于侵染至一些昆虫细胞内。举例来说，其中已经开发出重组杆状病毒用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾。参看WO 89/046,699；Wright，Nature(1986)321：718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56：153；Smith等人，MOL.CELL.Biol.(1983)3：2156。通常参看Fraser等人，In Vitro Cell.Dev.Biol.(1989)25：225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于在杆状病毒/表达中直接和融合表达异源多肽的细胞和培养基为市售的，并且细胞培养技术大体上为所属领域技术人员所知。
大肠杆菌、假单胞菌种和其它原核生物 细菌表达技术为所属技术领域熟知。多种载体可用于细菌宿主中。载体可以是单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于大量关于载体的文献、许多载体可商业购得以及描述载体和其限制性图谱与特征的手册，本文无需再作广泛论述。众所周知，载体通常涉及允许进行选择的标记，所述标记可以提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多种提供不同特征的标记。
细菌启动子是任何能够结合细菌RNA聚合酶并且起始编码序列(3′)下游(例如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有通常位于靠近编码序列5′末端的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可以具有称为操纵基因的第二域，其可以在RNA合成开始处与邻近RNA聚合酶结合位点重叠。由于基因阻遏蛋白能够结合操纵基因，并且进而抑制特异性基因的转录，因此操纵基因允许负调控(可诱导)转录。在不存在例如操纵基因的负调控元件的情况下，可能发生组成型表达。此外，可以通过基因激活剂蛋白结合序列达到正调控，此序列如果存在，则通常接近(5′)RNA聚合酶结合序列。基因激活剂蛋白的实例为分解代谢产物激活蛋白(catabolite activator protein，CAP)，其有助于起始大肠杆菌(E.coli)中lac操纵子的转录[Raibaud等人，Annu.Rev.Genet.(1984)18：173]。因此，受调控表达可为正或负，进而增强或降低转录。
编码代谢途径酶的序列提供尤其可用的启动子序列。实例包含来源于糖代谢酶的启动子序列，例如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198：1056]和麦芽糖。其它实例包括来源于生物合成酶的启动子序列，例如色氨酸(trp)[Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.Acids Res.(1981)9：731；美国专利第4,738,921号；欧洲专利公开案第036776号和第121775号，其以引用的方式并入本文]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″The cloning of interferon and othermistakes.″In Interferon 3(编辑I.Gresser)]、细菌噬菌体λPL[Shimatake等人，NATURE(1981)292：128]和T5[美国专利第4,689,406号，其以引用的方式并入本文]启动子系统也提供可用的启动子序列。本发明的优选方法采用强启动子以诱导高水平ABP，例如T7启动子。所述载体的实例为所属技术领域熟知，并且包括来源于Novagen的pET29系列，和描述于WO99/05297中的pPOP载体，其以引用的方式并入本文。所述表达系统在宿主中产生高水平ABP而不影响宿主细胞活力或生长参数。pET19(Novagen)是所属领域已知的另一种载体。
此外，不在天然中发生的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，一种细菌或细菌噬菌体启动子的转录激活序列可以与另一种细菌或细菌噬菌体启动子的操纵子序列相连接，以产生合成杂合体启动子[美国专利第4,551,433号，其以引用的方式并入本文]。举例来说，tac启动子是包含trp启动子和lac操纵子序列的杂合体trp-lac启动子，其受lac阻遏物调控[Amann等人，Gene(1983)25：167；de Boer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80：21]。此外，细菌启动子可以包括具有结合细菌RNA聚合酶并起始转录的能力的非细菌来源的天然发生启动子。非细菌来源的天然发生启动子也可以与可相容RNA聚合酶偶联以在原核生物中产生一些基因的高表达水平。细菌噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的实例[Studier等人，J.Mol.BlOL.(1986)189：113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：1074]。此外，杂合体启动子也可以包含细菌噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区(欧洲专利公开案第267851号)。
除了充当启动子序列之外，有效核糖体结合位点也可用于在原核生物中表达外源基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，并且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11核苷酸处的3-9核苷酸长度序列[Shine等人，NATURE(1975)254：34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体结合[Steitz等人″Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA″，In Biological Regulation and Development：Gene Expression(编辑R.F.Goldberger，1979)]。为了表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人″Expression of cloned genes in Escherichia coli″，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可以用作或已经用作重组载体或其它转运DNA的受体的细菌。所述术语包括已经转染的最初细菌宿主细胞的后代。应了解由于偶然或有意突变，因此单亲细胞的后代可能并不必需与最初亲代在形态或基因组或总DNA补体上完全相同。所述定义所指的后代包括与亲代足够相似之处在于相关特性(例如存在编码ABP的核苷酸序列)的亲代细胞的后代。
适用于ABP表达的宿主细菌的选择为所属领域技术人员所熟知。在选择用于表达的细菌宿主中，合适宿主可以包括尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体坚固性的宿主。细菌宿主通常可以从多种来源获得，包括(但不限于)Bacterial GeneticStock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA)；和American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA)。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。由于极为熟悉这些菌株的生长参数并且其为稳定，因此这些菌株尤其有用。此外，这些菌株是非病原性的，出于安全和环境原因考虑，其具有商业重要性。在本发明方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主为BL21菌株。在本发明方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶负菌株，包括(但不限于)OMP-和LON-。在本发明方法中的另一实施例中，宿主细胞菌株为假单胞菌种，包括(但不限于)荧光假单胞菌、绿脓杆菌和恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1(指定菌株MB101)可用于重组产生，并且可用于治疗性蛋白产生过程。假单胞菌表达系统的实例包括作为宿主菌株获自Dow ChemicalCompany的系统(Midland，MI，www.dow.com可用)。以引用方式并入本文的美国专利第4,755,465号和第4,859,600号描述假单胞菌菌株用作人类生长激素产生的宿主细胞的用途。
一旦建立重组宿主细胞菌株(即已经将表达构建体引入宿主细胞中，并且分离具有恰当表达构建体的宿主细胞)，即在适于产生ABP的条件下培养重组宿主细胞菌株。所属领域技术人员应了解，重组宿主细胞菌株的培养方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的身份。通常使用所属技术领域所熟知的方法培养重组宿主菌株。通常在含有碳、氮和无机盐的相似源(assimilatable source)并视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和其它所属技术领域已知的似蛋白培养补充物的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基视情况可以含有抗生素和抗真菌剂，以防止非所需微生物和/或化合物的生长，其包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素。
可以分批或以连续方式培养重组宿主细胞，其中以分批或以连续方式收集细胞(在ABP细胞内积累的情况下)或收集培养物上清液。对于在原核宿主细胞中产生来说，分批培养和细胞收集为首选。
通常在重组系统中表达之后纯化本发明的抗原结合多肽。可以通过所属技术领域已知的多种方法从宿主细胞中纯化ABP。在细菌宿主细胞中所产生的ABP通常溶解性较差或不溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，可以轻易地在抗原结合多肽中进行氨基酸替换，其中使用本文所公开的方法以及所属技术领域已知的方法对氨基酸替换进行选择以达成增加由重组产生的蛋白的溶解性的目的。在不溶性蛋白的情况下，可以通过离心从宿主细胞溶解液中收集蛋白，并接着进一步使细胞均质化。在较差溶解性蛋白的情况下，可以添加(包括(但不限于))聚乙烯亚胺(polyethylene imine，PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白沉淀。随后可以通过离心便利地收集沉淀蛋白。可以使用所属技术领域所熟知的多种方法破坏或均质化重组体宿主细胞，以便从细胞内释放出包涵体。可以使用熟知技术进行宿主细胞破坏或均质化，其包括(但不限于)酶细胞破坏、超声波处理、杜恩斯(dounce)均质化或高压释放破坏。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术破坏大肠杆菌宿主细胞以释放ABP的包涵体。当操作ABP的包涵体时，有利的是将重复均质化时间减至最少，以使包涵体的产量最大而不会因例如溶解、机械剪切或蛋白水解等因素而受到损失。
随后可以使用所属技术领域已知的许多合适溶解剂中的任一种溶解不溶性或沉淀ABP。优选用尿素或盐酸胍溶解ABP。应将溶解ABP的体积减至最小，以便可以用便于管理的批次大小产生大批量。当以数千升体积的批量生长重组宿主时，此因素在大规模商业装置中非常重要。此外，当在大规模商业装置中生产ABP时，尤其是当为了人类医药用途时，如果可能则应该避免可能损坏机器和容器或蛋白产物自身的苛刻化学品。在本发明的方法中已经表明，较为温和的变性剂尿素可以用于溶解ABP包涵体以代替较为苛刻的变性剂盐酸胍。使用尿素显著地降低损坏在ABP的制造和纯化工艺中所用的不锈钢设备的风险，而同时有效溶解ABP包涵体。
在可溶性ABP的情况下，ABP可以分泌至周质空间(periplasmic space)或分泌至培养基中。此外，可溶性ABP可以存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性ABP。所属技术领域已知的标准技术可以用于从(例如)细胞溶解液或培养基中浓缩可溶性ABP。此外，所属技术领域已知的标准技术可以用于破坏宿主细胞，并且从宿主细胞的细胞质或周缘质空间释放可溶性ABP。
当产生融合蛋白形式的ABP时，优选移除融合序列。可以通过酶裂解或化学裂解(优选为酶裂解)来完成融合序列的移除。可以用所属技术领域熟知的方法完成融合序列的酶法移除。可以通过融合体的身份来确定用于移除融合序列的酶的选择，并且可以通过所属领域技术人员了解的酶的选择来指定反应条件。优选通过熟知方法从经裂解的融合序列纯化经裂解的ABP。如所属领域技术人员所了解，可以通过融合序列和ABP的身份和性质确定所述方法。纯化方法可以包括(但不限于)尺寸排除色谱法、疏水互作色谱法、离子交换色谱法或透析或其任何组合。
也优选纯化ABP以从蛋白溶液移除DNA。可以通过所属技术领域已知的任何合适方法移除DNA，例如沉淀或离子交换色谱法，但是优选使用核酸沉淀剂沉淀移除，例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白。可以使用(包括(但不限于))离心或过滤的标准熟知方法从沉淀DNA分离ABP。当用ABP治疗人类并且本发明的方法将宿主细胞DNA减至医药学上可接受水平时，宿主核酸分子的移除是装置中的一个重要因素。
小规模或大规模发酵法也可以用于蛋白表达，其包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流体化床生物反应器、中空纤维生物反应器、辊瓶培养系统和搅拌式生物反应器系统。可以用分批式、流加式(fed-batch)或连续模式工艺执行所述各方法。
通常可以用所属技术领域的方法标准回收本发明的人ABP。举例来说，可以离心或过滤培养基或细胞溶解液以移除细胞碎片。可以将上清液浓缩或稀释至所需体积，或者透滤进合适缓冲液中来调节制剂条件以用于进一步纯化。进一步纯化本发明的ABP包括从完整形式分离出脱酰胺基形式和截断形式的ABP变体。
可以采用任何以下示范性过程纯化本发明的抗原结合多肽：亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法(使用包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)、二氧化硅色谱法、反向HPLC法、凝胶过滤法(使用包括(但不限于)SEPHADEX G-75)、疏水互作色谱法、尺寸排除色谱法、金属螯合色谱法、超滤/透滤法、乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱聚焦法、置换色谱法、电泳过程(包括(但不限于)制备型等电聚焦)、差异溶解性(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取法。
可以根据所属领域技术人员所已知并且使用的标准过程将本发明的蛋白(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白、包含非天然氨基酸的蛋白的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白的结合伴侣等等)纯化成部分或实质上均质。因此，可以通过所属领域熟知的许多方法中的任一种回收和纯化本发明的多肽，其包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀法、酸或碱提取法、柱色谱法、亲和柱色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水互作色谱法、羟磷灰石色谱、凝集素色谱法、凝胶电泳等等。在产生正确折叠成熟蛋白中，视需要可以进行蛋白重新折叠步骤。当需要高纯度时，在最终纯化步骤中可以采用高效液相色谱法(HPLC)、亲和色谱法或其它合适方法。在一个实施例中，所制备的抗非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白)的抗体可用作纯化试剂，包括(但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白的基于亲和力的纯化。一旦部分纯化或纯化至均质之后(如果需要)，即视情况将多肽用于多种功用，包括(但不限于)作为试验组分、治疗试剂、预防试剂、诊断试剂、研究试剂和/或作为抗体产生的免疫原。
除了本文所提及的其它参考文献之外，多种纯化/蛋白折叠方法为所属技术领域所熟知，包括(但不限于)以下文献中所述：R.Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology Vol.182：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana，(1997)Bioseparation of Proteins，AcademicPress，Inc.；Bollag等人(1996)Protein Methods.第2版Wiley-Liss，NY；Walker，(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ；Harris和Angal，(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris和Angal，Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes，(1993)Protein Purification：Principles and Practice第3版Springer Verlag，NY；Janson和Ryden，(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，第2版Wiley-VCH，NY；和Walker (1998)，Protein Protocols on CD-ROMHumana Press，NJ；和其中所引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生令人感兴趣的具有非天然氨基酸的蛋白或多肽的一个优势在于通常蛋白或多肽以其天然构象折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域技术人员应认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白可以具有不同于相关多肽所需构象的构象。在本发明的一方面，经表达的蛋白视情况变性且随后复性。这可以采用所属技术领域已知的方法达成，包括(但不限于)通过向所感兴趣的蛋白或多肽中添加伴侣素(chaperonin)；通过在离液剂(例如盐酸胍)中溶解蛋白；采用蛋白质二硫键异构酶等等。
一般来说，偶尔需要变性和还原经表达的多肽，且随后引起多肽再折叠成优选构象。举例来说，胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣素可以添加于所感兴趣的翻译产物中。还原、变性和复性蛋白的方法为所属领域技术人员所熟知(参看，上述参考文献和Debinski等人(1993)J.Biol.Chem..268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.，4：581-585；和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem..205：263-270)。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白的变性和还原。蛋白可以在含有(包括(但不限于))氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。重新折叠试剂可以流动或移动至与一个或一个以上多肽或其它表达产物接触，或者反之亦然。
在原核产生ABP的情况下，由此所产生的ABP可能错折叠并因而缺少或具有低生物活性。可以通过“重新折叠”恢复蛋白的生物活性。一般来说，通过使用(例如)一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇DTT或2-巯基乙醇2-ME)溶解(其中ABP也为不溶性)、打开和还原多肽链来重新折叠错折叠ABP。在适当浓度离液剂下，随后添加氧化剂(例如氧气、胱氨酸或胱胺)，以允许重新形成二硫键。可以使用所属领域已知的标准方法重新折叠ABP，例如描述于美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中，其以引用的方式并入本文。也可以将ABP与其它蛋白共折叠以形成异源二聚体或异源多聚体。重新折叠或共折叠之后，优选进一步纯化ABP。
一般纯化方法可以在任何分离步骤所产生的包含ABP或任何ABP混合物的细胞溶解液上进行多种分离步骤中的任何一种，其包括(但不限于)亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水互作色谱法、凝胶过滤色谱法、高效液相色谱法(“HPLC”)、反向HPLC法(“RP-HPLC”)、扩张床吸附法或任何组合和/或其重复且以任何适当次序。
用于进行本文所述技术的设备和其它必需材料为市售。泵、馏分收集器、监控器、记录仪和整个系统可购自(例如)Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bio-RadLaboratories，Inc.(Hercules，CA)和Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)。包括(但不限于)交换基质材料、介质和缓冲液在内的色谱材料也可以购自这些公司。
可以用例如泵的专门设备更为快速地达成本文所述柱色谱过程中的平衡和其它步骤，例如洗涤和洗脱。市售泵包括(但不限于) Pump P-50、Peristaltic PumpP-1、Pump P-901和Pump P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
馏分收集器的实例包括RediFrac Fraction Collector、FRAC-100和FRAC-200FractionCollectors，和 Fraction Collector(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。也可使用混合器来形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括Gradient Mixer GM-1和In-line Mixer(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
可以用任何市售监控器监控色谱过程。所述监控器可以用于收集例如UV值、pH值和导电率等信息。检测器的实例包括Monitor UV-1、 Monitor UV-MII、Monitor UV-900、Monitor UPC-900、Monitor pH/C-900和Conductivity Monitor(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。事实上整个系统为市售的，包括各种购自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)的 系统。
举例来说，在本发明的一个实施例中，可以还原ABP且通过在尿素中首次变性所得纯化ABP来变性，接着在合适pH值下将其稀释至含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中。在另一个实施例中，在约2M至约9M的浓度范围内在尿素中变性ABP，接着在约5.0至约8.0的pH值范围内稀释至TRIS缓冲液中。随后可以温育本实施例的重新折叠混合物。在一个实施例中，在室温下温育重新折叠混合物4至24小时。随后可以进一步分离或纯化经还原和变性ABP混合物。
如本文所述，可以在进行任何随后分离步骤之前调节第一ABP混合物的pH值。此外，可以用所属技术领域已知技术浓缩第一ABP混合物或其任何后续混合物。此外，可以使用所属领域技术人员所熟知的技术将包含第一ABP混合物或其任何后续混合物的洗脱缓冲液替换为适用于接着的分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱法 在一个实施例中，可以对第一ABP混合物进行作为可选附加步骤的离子交换色谱。通常参看ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLESAND METHODS(目录号18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换柱包括 和 Columns(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。所述柱采用强阴离子交换剂，例如Q Fast Flow、Q High Performance和Q XL；强阳离子交换剂，例如SP HighPerformance、SP Fast Flow和SP XL；弱阴离子交换剂，例如DEAE Fast Flow；和弱阳离子交换剂，例如CM FastFlow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可以在纯化过程的任何阶段对ABP进行阴离子或阳离子交换柱色谱层析以分离实质上经纯化的ABP。可以使用任何合适阳离子交换基质进行阳离子交换色谱步骤。可用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒状、珠状或交联阳离子交换基质材料。所述阳离子交换基质包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何前述物质的复合物。
阳离子交换基质可以是包括强和弱阳离子交换剂的任何合适阳离子交换剂。强阳离子交换剂可以在广pH值范围内保留离子化，并且因此能够在广pH值范围内结合ABP。然而，弱阳离子交换剂可以作为pH函数丧失离子化。举例来说，当pH值下降低于约pH 4或pH 5时，弱阳离子交换剂可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括(但不限于)带电官能团，例如磺丙基(sulfopropyl，SP)、磺酸甲酯(methyl sulfonate，S)或磺乙基(sulfoethyl，SE)。阳离子交换基质可以是优选具有约2.5至约6.0的ABP结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可以具有约2.5至约5.5的ABP结合pH值范围。阳离子交换基质可以是具有约3.0的ABP结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可以是优选具有约6.0至约8.0的ABP结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可以是优选具有约8.0至约12.5的ABP结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可以具有约8.0至约12.0的ABP结合pH值范围。
在负载ABP之前，例如可以使用若干柱体积的稀弱酸(例如四柱体积的20mM乙酸，pH 3)来平衡阳离子交换基质。平衡之后，在洗脱实质上经纯化ABP之前，可以添加ABP，并且也可以使用弱酸溶液(弱乙酸或磷酸溶液)洗涤柱一次至数次。举例来说，可以使用大约2-4柱体积的20mM乙酸(pH 3)来洗涤柱。也可以使用(例如)2-4柱体积的0.05M乙酸钠(pH 5.5)或0.05M乙酸钠与0.1M氯化钠的混合物(pH 5.5)进行附加洗涤。或者，在使用所属技术领域已知的方法时，也可以使用若干柱体积的稀弱碱平衡阳离子交换基质。
或者，可以用具有足够低pH值或离子浓度的缓冲液与阳离子交换剂基质接触来洗脱实质上经纯化的ABP，从而将ABP从基质中置换出来。洗脱缓冲液的pH值可以在约pH 2.5至约pH 6.0范围内。更具体来说，洗脱缓冲液的pH值可以在约pH 2.5至约pH 5.5范围内，约pH 2.5至约pH 5.0范围内。洗脱缓冲液可以具有约3.0的pH值。此外，洗脱缓冲液的量可以广泛变化，并且通常在约2至约10柱体积范围内。此外，本文可以使用所属领域技术人员已知的合适缓冲液，包括(但不限于)至少约5mM至至少约100mM浓度范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、HEPES和MES缓冲液。
在ABP多肽吸附于阳离子交换剂基质之后，可以用具有足够高pH值或离子浓度的缓冲液与基质接触来洗脱实质上经纯化的ABP多肽，以将ABP从基质中置换出来。用于高pH值洗脱实质上经纯化ABP的合适缓冲液可以包括(但不限于)至少约5mM至至少约100mM浓度范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱法 可以根据所属领域技术人员已知的合适实验方案执行RP-HPLC来纯化蛋白。参看，例如Pearson等人，Anal Biochem.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J.Chrom.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.Chrom.(1986)359：391-402。可以对ABP进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的ABP。就此而言，可以使用具有为多种长度(包括(但不限于)至少约C3至至少约C30、至少约C3至至少约C20或至少约C3至至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者可以使用聚合树脂。举例来说，可以使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，它是一种苯乙烯聚合物树脂。也可以使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可以用例如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一个实例。
可以使用含有离子配对剂和有机改进剂的合适洗脱缓冲液从RP-HPLC柱中洗脱ABP，所述有机改进剂例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、丙腈或乙醇。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、乙酸四甲基铵、乙酸四丁基铵和乙酸三乙基铵。可以使用一种或一种以上梯度或等度(isocratic)条件进行洗脱，其中优选梯度条件来减少分离时间并减小峰宽度。另一方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的梯度。用于本文的合适洗脱缓冲液的实例包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水互作色谱法纯化技术 可以对ABP执行疏水互作色谱法(HIC)。通常参看HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLESAND Methods(目录号18-1020-90，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其以引用的方式并入本文。合适的HIC基质可以包括(但不限于)烷基或芳基取代基质，例如丁基、己基、辛基或苯基取代基质，包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂，包括(但不限于)聚乙二胺树脂或丁基或苯基取代聚(甲基丙烯酸酯)基质。用于疏水互作柱色谱法的市售来源包括(但不限于) 和 柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
简单地说，在装载之前，可以用所属领域技术人员所已知的标准缓冲液平衡HIC柱，所述标准缓冲液例如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES。可以将硫酸铵用作装载HIC柱的缓冲液。装载ABP之后，接着可以用标准缓冲液和标准条件洗涤柱以移除非所需物质，但在HIC柱上留下ABP。可以用约3至约10柱体积的标准缓冲液洗脱ABP，其中例如含有EDTA和低于平衡缓冲液的硫酸铵浓度的HEPES，或乙酸/氯化钠缓冲液。也可以将使用(例如)磷酸钾梯度的线性降低盐梯度用于洗脱ABP分子。举例来说，随后可以通过过滤(透滤或超滤)来浓缩洗脱液。可以采用透滤以移除用于洗脱ABP的盐。
其它纯化技术 举例来说，可以对第一ABP混合物或其任何后续混合物进行使用凝胶过滤(Gel Filtration：Principles and Methods(目录号18-1022-18，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，其以引用的方式并入本文)、羟磷灰石色谱(合适基质包括(但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)、Bio-Gel HTP Hydroxyapatite(BioRad))、HPLC、扩张床吸附、超滤、透滤、冻干等等的另一个分离步骤，以移除任何过量盐并用适用于随后分离步骤或甚至最终药物产物形成的缓冲液置换所述缓冲液。
存在于ABP中的非天然编码氨基酸也可以用于提供从不含有非天然编码氨基酸的其它细胞蛋白进行分离。由于非天然编码氨基酸可以包含独特的化学官能团，因此独特官能团与另一分子的偶联可以提供实质性纯化步骤。举例来说，非天然编码氨基酸可以偶联于另一有助于从其它蛋白分离的分子。所述用于偶联非天然氨基酸的分子包括(但不限于)PEG、其它聚合物、小珠和其它固体物质。
可以使用所属领域技术人员所已知的技术在本文所述各步骤处监控包括实质上经纯化ABP在内的ABP产率。所述技术可以用于评估最后分离步骤之后实质上经纯化ABP的产率。举例来说，可以使用具有多种烷基长度的任何若干反相高压液相色谱柱(例如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)监控ABP产率。
在本发明的具体实施例中，各纯化步骤之后的ABP产率可以为各纯化步骤起始物质中ABP的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
可以使用例如SDS-PAGE的标准技术，或者通过使用Western印迹和ELISA试验测定ABP来确定纯度。举例来说，可以产生对抗从负控制酵母发酵和阳离子交换回收所分离出的蛋白的多克隆抗体。所述抗体也可以用于探测污染宿主细胞蛋白的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4烷基链。从似蛋白质杂质分离ABP是基于疏水互作强度的差异。用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢柱(充满2.8至3.2升的Vydac C4硅胶)执行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸酸化Hydroxyapatite Ultroge洗脱液，并且装载在Vydac C4柱上。对于洗涤和洗脱来说，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗脱份并且立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集IPC限定内的ABP洗脱份。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由共价结合于Sepharose小珠表面的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。由离子互作介导ABP与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸通过柱而不被留住。洗去这些物质之后，通过在低pH值下用乙酸盐缓冲液洗涤柱来除去痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱，并且用具有增加离子浓度的缓冲液洗脱ABP。色谱柱充满DEAE Sepharose高速流。调节柱体积以确保ABP装载量在3-10mgABP多肽/毫升凝胶范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤柱。装载HPLC洗脱液的经汇集洗脱份，并且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗脱缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸钾)从柱中洗脱ABP，并根据主洗脱曲线收集为单洗脱份。将DEAE Sepharose柱的洗脱液调节至指定电导率。将所得药物物质无菌过滤至特弗隆(Teflon)瓶中，并储存在-70℃下。
可采用的其它方法包括(但不限于)移除内毒素(endotoxin)的步骤。内毒素是装载于格兰阴性宿主细胞(例如大肠杆菌)外膜上的脂类多糖(lipopoly-saccharide，LPS)。用于降低内毒素含量的方法为所属领域技术人员所已知，并且包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟磷灰石的纯化技术；反相色谱法、亲和色谱法、尺寸排除色谱法、阴离子交换色谱法、疏水互作色谱法；这些方法的组合等等。可以要求改良或附加方法来从所感兴趣的多肽移除污染物质，例如共迁移蛋白。
多种方法和过程可以用于评估含有一种或一种以上非天然编码氨基酸的ABP蛋白的产率和纯度，包括(但不限于)Bradford测定法、SDS-PAGE、银染SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱法(包括(但不限于)MALDI-TOF)和其它所属领域技术人员已知表征蛋白的方法。
VIII.交替系统中的表达
若干策略已经用于将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、经突变宿主细胞或无细胞系统中的蛋白中。这些系统也适用于制造本发明的抗原结合多肽。用反应性侧链(例如Lys、Cys和Tyr)使氨基酸衍生化引起赖氨酸转化成N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的简单方法。使用最近开发的肽片段的酶连接和天然化学连接，可能制得较大蛋白。参看，例如P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69：923(2000)。一种普通活体外生物合成方法已经用于将超过100个非天然氨基酸位点特异性并入多种实质上任何大小的蛋白中，所述方法中将用所需非天然氨基酸化学酰化的抑制基因tRNA添加于能够支持蛋白生物合成的活体外提取物中。参看，例如V.W.Cornish，D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.EngL 1995，34：621(1995)；CJ.Noren，S J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244：182-188(1989)；和J.D.Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosynthetic site-specificincorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.111：8013-8014(1989)。广泛范围的官能团已经引入蛋白中用于研究蛋白稳定性、蛋白折叠、酶机制和信号转导。
发展出称为选择性压力并入(selective pressure incorporation)的活体内方法来开发野生型合成酶的混杂(promiscuity)。参看，例如N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber，FASEB J.，13：41(1999)。在含有有限浓度天然氨基酸的最小培养基中生长营养缺陷型菌株，而同时抑制靶基因的转录，其中关闭所述营养缺陷型菌株中对细胞提供特定天然氨基酸的相关代谢途径。在固定生长期开始，缺失天然氨基酸并用非天然氨基酸类似物替代。诱导重组蛋白的表达引起含有非天然类似物的蛋白的积累。举例来说，使用这种策略，已经将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对苯丙氨酸并入蛋白中，并且在UV光谱中展示可以被轻易鉴别的两个特征性肩部(shoulder)，参看，例如C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，284：29(2000)；三氟蛋氨酸已经用于置换细菌噬菌体T4溶菌酶中的蛋氨酸以通过19FNMR研究与壳寡糖(chitooligosaccharide)的互作，参看，例如H.Duewel，E.Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404(1997)；并且三氟亮氨酸已经并入以代替亮氨酸，产生亮氨酸拉练(leucine-zipper)蛋白增加的热稳定性和化学稳定性，参看，例如Y.Tang，G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int.Ed.EngL，40：1494(2001)。此外，硒蛋氨酸和碲蛋氨酸已经并入各种重组蛋白中以促进X光结晶学中的相溶解。参看，例如W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，9：1665(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.，1：283(1994)；N.Budisa，B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem..230：788(1995)；和N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Hum，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol..270：616(1997)。已经有效并入具有烯或炔官能团的蛋氨酸类似物，使得允许通过化学手段另外修饰蛋白。参看，例如J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，428：68(1998)；J.C.M.van Hest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc，122：1282(2000)；和K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097，所述参考案以引用的方式并入本文。
此方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，这通常需要高度选择性以确保蛋白翻译的保真度。一种扩大此方法范围的途径在于放松氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，这已经在有限种情况中达成。举例来说，通过大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)用Gly置换Ala294会增大底物结合袋的尺寸，并且导致由p-Cl-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)酰化tRNAPhe。参看M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，33：7107(1994)。具有此突变体PheRS的大肠杆菌菌株允许并入p-Cl-苯丙氨酸或p-Br-苯丙氨酸以替换苯丙氨酸。参看，例如M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.，364：272(1995)；和N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，467：37(2000)。类似地，靠近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser显示允许氮杂酪氨酸比酪氨酸更加有效地并入。参看，F.Hamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soil和S.Nishimura，J.Biol. Chem.275：40324(2000)。
用于将非天然氨基酸活体内并入蛋白的另一个策略在于修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能够辨别并因此不能够激活结构上与同源天然氨基酸相似的氨基酸。在单独位点处修正此错误，由tRNA脱酰化错电荷氨基酸(mischarged amino acid)，以维持蛋白翻译的保真度。如果合成酶的校对活性不能作用，那么经错误激活的结构类似物可以逃脱编辑功能并且被并入。最近用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证明了此方法。参看V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，v.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science，292：501(2001)。ValRS可以用Cys、Thr或氨基丁酸酯(Abu)错氨酰化tRNAVal；随后通过编辑域水解非同源氨基酸。随机突变大肠杆菌染色体之后，选择在ValRS编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。编辑缺陷型ValRS错误地用Cys使tRNAVal带电。因为Abu空间组装Cys(Abu中Cys的-SH基团由-CH3置换)，因此当此突变大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变体ValRS也将Abu并入蛋白中。质谱分析表明在天然蛋白的各缬氨酸位置处约24％缬氨酸由Abu置换。
固相合成和半合成方法也允许合成许多含有新颖氨基酸的蛋白。举例来说，参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Crick，FJ.C，Barrett，L.Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature，192：1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bonn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements onthe S-protein activating potency of an S-peptide fragment，J.Am Chem.88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteinsincluding enyzmes，Ace Chem Res，47-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，3808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailingunprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease，Science，256(5054)：221-225(1992)；Chaiken，I.M.Semisynthetic peptides and proteins，CRC Grit Rev Biochem.ll(3)：255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；and，Jackson，D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A withUnnatural Catalytic Residues，Science，266(5183)：243(1994)。
化学修饰已经用于将多种非天然侧链活体外引入蛋白中，所述非天然侧链包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸。参看，例如Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)：1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymatic specificity，Annu Rev Biochem，54：565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutationofenyzmea cctive sites，Science，226(4674)：505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.B.，M.L.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，3153-3154(1966)；和Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction ofnucleophiles and spectroscopicprobes into antibody combining sites，Science，242(4881)：1038-1040(1988)。
或者，采用化学修饰氨酰基-tRNA的生物合成方法已经用于将若干生物物理探针并入活体外合成的蛋白中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner，J.NewPhotolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，62：483-514(1993)；和Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascentpreprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle，Proc.Natl. Acad.Set 83(22)：8604-8608(1986)。
先前已表明，可以通过将经化学氨酰化抑制基因tRNA加入用含有所需琥珀无意义突变的基因进行的蛋白合成反应中而将非天然氨基酸活体外位点特异性地并入蛋白中。通过使用这些方法，可以使用对于特定氨基酸的营养缺陷型菌株用结构密切同源物替换许多常见的20种氨基酸，例如用氟苯丙氨酸替换苯丙氨酸。参看，例如Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244：182-188(1989)；M.W.Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into apolypeptide，J.Am Chem Soc，111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51(1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosyntheticmethod for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.，301-336(1992)；和Mendel，D.，Cornish，V.W.&Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesiswith an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24，435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制基因tRNA，并且用非天然氨基酸化学氨酰化。常规定点突变用于在蛋白基因的令人感兴趣的位点处引入终止密码子TAG。参看，例如Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-basedolignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)：791-802(1988)。当在活体外转录/翻译系统中组合酰化抑制基因tRNA和突变基因时，并入响应于UAG密码子的非天然氨基酸，所述UAG密码子产生在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白。使用[3H]-Phe的实验和使用α-羟酸的实验证明仅所需氨基酸在UAG密码子所指定的位置处并入，并且此氨基酸不在蛋白的任何其它位点处并入。参看，例如Noren等人，supra；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology 10(6)：425-432；和Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins，Science，255(5041)：197-200(1992)。
微注射技术也已经用于将非天然氨基酸并入蛋白。参看，例如M.W.Nowak，P.C.Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J.Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268：439(1995)；和D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4：645(2000)。将活体外制备的两个RNA物种共注射进爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中：在所感兴趣的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码靶蛋白的mRNA和用所需非天然氨基酸氨酰化的琥珀抑制基因tRNA。卵母细胞的翻译机器随后在UAG所指定的位置处插入非天然氨基酸。此方法允许整体膜蛋白的活体内结构功能研究，这通常并不服从活体外表达系统。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，参看，例如G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot，M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，271：19991(1996)；并入生物素标记氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露残基，参看，例如J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4：739(1997)；使用捕获酪氨酸类似物以实时监控离子通道中的构象改变，参看，例如J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20：619(1998)；和使用α羟基氨基酸来改变离子通道骨架以用于探测其门控机制，参看，例如P.M.England，Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，96：89(1999)；和T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y.Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4：239(2001)。
将非天然氨基酸直接活体内并入蛋白的能力提供以下优势：高产率突变体蛋白、技术便利、研究细胞中或可能活生物体中的突变体蛋白的可能性以及在治疗性治疗中使用这些突变体蛋白。将具有各种大小、酸度、亲核性、疏水性和其它特性的非天然氨基酸包括进蛋白的能力可以极大地扩大合理且系统地操纵蛋白结构的能力，以探测蛋白功能并且产生具有新颖特性的新蛋白或生物体。然而，由于要求达到蛋白翻译的高度保真度的tRNA合成酶互作的复杂性质，所以此过程是困难的。
在位点特异性并入para-F-Phe的尝试中，在para-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中使用酵母琥珀抑制基因tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对。参看，例如R.Furter，Protein Sci，7：419(1998)。
使用无细胞(活体外)翻译系统也可能获得本发明ABP多聚核苷酸的表达。在这些包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合活体外转录和翻译)的系统中，由核糖体指导活体外合成。已经进行了大量工作来开发无细胞蛋白表达系统。参看，例如，Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，74：309-316(2001)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66，180-188，(1999)；和Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，所述参考案以引用的方式并入本文。可以用于表达包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。参看，例如R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94：12297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistyy & Biology 10：1043-1050(2003)。在此方法中，连接于嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板在核糖体上翻译为肽。如果已经修饰一种或一种以上tRNA分子，则也可以将非天然氨基酸并入肽中。在读出最后mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C端。如果在活体外测定中发现所得mRNA-肽结合物具有令人感兴趣的特性，那么可以从mRNA序列轻易地显露出它的身份。可以以此方式筛选包含一种或一种以上非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的文库以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已经报导用经纯化组分的活体外核糖体翻译允许经非天然编码氨基酸替换的肽的合成。参看，例如A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100：6353(2003)。
IX.偶联于ABP的大分子聚合物
可以使用本文所述组合物、方法、技术以及策略实现对本文所述非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，所述其它官能团包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述任何组合或任何其它所需化合物或物质。作为本文所述组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽中，同时应了解，其中所述的组合物、方法、技术和策略也适用于(如果需要，则进行适当修改并且所属领域技术人员可以利用本文公开内容作出适当修改)添加包括(但不限于)上文所列在内的其它官能团)。
多种大分子聚合物和其它分子可以连接于本发明的抗原结合多肽以调节ABP的生物性质和/或对ABP分子提供新生物性质。这些大分子聚合物可以经天然编码氨基酸、经非天然编码氨基酸，或者天然或非天然氨基酸的任何官能取代基，或添加于天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团连接于ABP。聚合物的分子量可以具有广泛范围，包括(但不限于)约100Da与约100,000Da之间或更大。
本发明提供聚合物∶蛋白结合物的实质上的均质制剂。如本文所用“实质上均质”意思是观察到聚合物∶蛋白结合物分子大于总蛋白的一半。聚合物∶蛋白结合物具有生物活性，并且本文所提供的所述“实质上均质的”PEG化ABP制剂具有足以展示均质制剂优势的均质性，所述优势例如临床应用中批次之间(lot to lot)药物动力学可预测性的简易性。
也可以选择制备聚合物∶蛋白结合物分子的混合物，并且本文所提供的优势在于可以选择包括于混合物中的单聚合物∶蛋白结合物的比例。因此，如果需要，则可以制备各种蛋白与各种数目经连接(即二-、三-、四-等等)聚合物部分的混合物，并且组合所述结合物与使用本发明方法所制备的单聚合物∶蛋白结合物，并且使混合物具有预定比例的单聚合物∶蛋白结合物。
所选聚合物可以是水溶性的，以致与其所连接的蛋白不在水性环境(例如生理环境)中沉淀。聚合物可以有支链或无支链。对于终产物制剂的治疗用途来说，聚合物优选为医药学上可接受。
聚乙二醇分子与蛋白分子的比例可以变化，它们在反应混合物中的浓度也可以变化。一般来说，可以由所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数目确定最佳比率(就反应效率而言在于存在最少过量的未反应蛋白或聚合物)。至于分子量，通常聚合物分子量越大，连接于蛋白的聚合物分子数目越少。同样，当最佳化这些参数时，应考虑到聚合物支链。通常分子量越高(或支链越多)，则聚合物∶蛋白比率越高。
如本文所用并且当考虑PEGrABP结合物时，术语“治疗有效量”是指对患者产生所需益处的量。所述量在不同个体之间不同，并且取决于许多因素，包括患者的总体身体状况，和待治疗病情的根本起因。疗法所用ABP多肽的量产生可接受比率的改变，并且在有益水平维持所需反应。所属领域技术人员使用公开可用的材料和过程可以轻易地探知本发明组合物的治疗有效量。
水溶性聚合物可以呈任何结构形式，包括(但不限于)直链、叉状或分支状。水溶性聚合物通常为聚(烷撑二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但是也可以使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG描述本发明的某些实施例。
PEG是一种熟知的水溶性聚合物，它可以从市场上购得或者根据所属技术领域熟知的方法通过开环聚合化乙二醇来制备(Sandier和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)。广泛使用术语“PEG”涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或考虑PEG末端的修饰，并且由下式表示为与ABP连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，
其中n为2至10,000且X为H或末端修饰，包括(但不限于)C1-4烷基。
在一些情况下，本文所用PEG在一个末端用羟基或甲氧基封端，即X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以用反应性基团封端，进而形成双官能聚合物。典型反应性基团可以包括通常用于与发现于20种常见氨基酸中官能团反应的基团(包括(但不限于)顺丁烯二酰亚胺基)、活性碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯基酯)、活性酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯基酯)和醛)；以及对20种常见氨基酸呈惰性但与存在于非天然编码氨基酸中补充官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基。应注意，上述式中Y所示的PEG另一末端可以直接或经天然发生或非天然编码氨基酸间接连接于抗原结合多肽。举例来说，Y可以是连接于多肽胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N端)的酰胺、氨基甲酸酯或尿素键。或者，Y可以是连接于硫醇基团(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基团)的顺丁烯二酰亚胺键。或者，Y可以是与通常不可经由20种常见氨基酸到达的残基连接的键。举例来说，PEG上的叠氮基可以与ABP上炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可以与存在于非天然编码氨基酸中的叠氮基反应以形成相似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可以与存在于非天然编码氨基酸中的醛基或酮基反应以形成腙、肟或缩氨基脲，适当时，在一些情况下可以进一步经适当还原剂处理而被还原。或者，强亲核试剂可以经非天然编码氨基酸并入ABP中，并且用于优选与存在于水溶性聚合物中的酮基或醛基反应。
可以视实际需要使用任何分子量的PEG，包括(但不限于)约100道尔顿(Da)至100,000Da或视需要更大(包括(但不限于)有时0.1-50kDa或10-40kDa)。也可以使用支链PEG，包括(但不限于)各链具有1-100kDa(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)范围内MW的PEG分子。广泛范围的PEG分子描述于(包括(但不限于))ShearwaterPolymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，各参考案以引用的方式并入本文。
通常PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，如本文所述，具有用于与氨基酸侧链反应的炔部分和叠氮部分的PEG衍生物可以用于将PEG与非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮，则PEG通常含有炔部分以形成[3+2]环加成产物，或者含有膦基的活性PEG种类(即酯、碳酸酯)以形成酰胺键。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，则PEG通常含有叠氮部分以形成[3+2]Huisgen环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基，则PEG通常包含有效亲核试剂(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以分别形成相应的腙、肟和缩氨基脲键。在其它替代实施例中，可以使用上述反应性基团的反向方位，即非天然编码氨基酸中的叠氮部分可以与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的ABP变体含有与存在于非天然编码氨基酸的侧链上的化学官能团具有反应性的化学官能团。
在一些实施例中，本发明提供包含具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架的含叠氮和含乙炔的聚合物衍生物。水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚乙二醇。然而，应了解，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡萄糖)和聚(丙二醇))在内的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，并且使用术语PEG或聚(乙二醇)旨在涵盖并包括所有这样的分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、支链PEG、悬垂式PEG(pendent PEG)(即具有一个或一个以上悬垂于聚合物骨架的官能团的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。
PEG通常透明、无色、无味、可溶于水、对热稳定、对许多化学试剂呈惰性、不水解或变质并且通常无毒。认为聚(乙二醇)具有生物相容性，也就是说，PEG能够与活组织或生物体共存而没有危害。更具体来说，PEG实质上无免疫原性，即PEG不倾向于在体内产生免疫应答。当在体内与具有一些所需功能的分子(如生物活性剂)相连接时，PEG倾向于遮蔽该试剂，并且可以降低或消除任何免疫应答，致使生物体可以忍受所述试剂的存在。PEG结合物不倾向于产生实质免疫应答或者引起凝结或其它不良作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2--(其中n为约3至约4000，通常约20至约2000)的PEG适用于本发明。具有约800Da至约100,000Da分子量的PEG在本发明的一些实施例中尤其可用作聚合物骨架。
聚合物骨架可以是直链或分支状。支链聚合物骨架通常为所属技术领域已知。支链聚合物通常具有中心分枝核心部分和多个连接于所述中心分枝核心的直链聚合物链。通常所使用的分支形式的PEG可以通过将氧化乙烯添加于各种多元醇中制备，所述多元醇例如甘油、甘油寡聚体、季戊四醇和山梨醇。中心分枝部分也可以来源于一些氨基酸，例如赖氨酸。支链聚(乙二醇)可以由通式R(-PEG-OH)m表示，其中R来源于核心部分，例如甘油、甘油寡聚体或季戊四醇，且m表示臂数目。例如描述于以下文献中的多臂PEG分子也可以用作聚合物骨架：美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO 96/21469；和WO 93/21259，各专利案均以引用的方式并入本文。
支链PEG也可以为由PEG(--YCHZ2)n所示的叉状PEG形式，其中Y为连接基，且Z为通过所定义长度的原子链连接于CH的活性末端基团。
另一种分支形式(悬垂式PEG)沿PEG骨架而不是在PEG链末端具有反应性基团，例如羧基。
除了这些形式的PEG之外，也可以用骨架中的弱或可降解键制备聚合物。举例来说，可以用聚合物骨架中经历水解的酯键制备PEG。如下文所示，此水解导致将聚合物裂解成较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域已知的所有形式，包括(但不限于)本文所公开的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明。在一些实施例中，水溶性且具有2至约300个末端的聚合物骨架尤其可用于本发明。合适聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(烷撑二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等等。尽管聚合物骨架的各链的分子量可以不同，但是其通常在约800Da至约100,000Da范围内，通常在约6,000Da至约80,000Da范围内。
所属领域技术人员应认识到，前文所列实质上水溶性骨架决非是详尽的，而仅是说明性的，并且所有具有上述分子量的聚合物质均适用于本发明。
在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能性”，意思是聚合物骨架具有至少两个经官能团官能化或活化的末端，且可能多达约300个。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的直链聚合物，其中各末端结合于可能相同或不同的官能团。
在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-N＝N＝N，
其中：
N＝N＝N为叠氮部分；
B为连接部分，其可以存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原聚合物；
A为连接部分，其可以存在或不存在且可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有最多18个且优选为1-10碳原子的多官能化烷基。烷基链可以包括例如氮、氧或硫的杂原子。烷基链也可以在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有最多10个且优选为5-6碳原子的多官能化芳基。芳基可以经又一个碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适连接基的其它实例包括描述于下列专利案中的连接基：美国专利第5,932,462号、第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596，各专利案以引用的方式并入本文。所属领域技术人员应认识到，前文所列连接部分决非为详尽且仅为说明性，并且所有具有上述量的连接部分均适用于本发明。
适合用作X的官能团实例包括(但不限于)羟基；受保护羟基；烷氧基；活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯；活性碳酸酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯；缩醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯酰胺；活性砜；胺；氨氧基；受保护胺；酰肼；受保护酰肼；受保护硫醇；羧酸；受保护羧酸；异氰酸酯；异硫氰酸酯；顺丁烯二酰亚胺；乙烯基砜；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙酰胺；环氧化物；乙二醛类；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；三氟代乙烷磺酸酯；烯；酮和叠氮。所属领域技术人员应了解，所选X应与叠氮基相容，致使不与叠氮基发生反应。含叠氮聚合物衍生物可以具有同双官能性，意思是第二官能团(即X)也为叠氮部分；或者具有异双官能性，意思是第二官能团为不同官能团。
术语“受保护”是指存在防止化学反应官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基视所保护的化学反应基的类型不同而有所不同。举例来说，如果化学反应基为胺或酰肼，则保护基可以选自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应基为硫醇，则保护基可以为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应基为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，则保护基可以为苄基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。所属技术领域已知的其它保护基团也可用于本发明。
文献中末端官能团的具体实例包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参看，例如美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)；胺(参看，例如Buckmann等人Makromol.Chem.182：1379(1981)，Zaplipsky等人Eur.Polym.J.19：1177(1983))；酰肼(参看，例如Andresz等人Makromol.Chem.179：301(1978))；琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(参看，例如Olson等人的Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications，第170-181页，Harris & Zaplipsky编辑，ACS，Washington，D.C.，1997；也参看美国专利第5,672,662号)；琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(参看，例如Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich等人Macrolol.Chem.180：1381(1979))；琥珀酰亚胺基酯(参看，例如美国专利第4,670,417号)；苯并三唑碳酸酯(参看，例如美国专利第5,650,234号)；缩水甘油醚(参看，例如Pitha等人Eur.J Biochem.94：11(1979)，Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))；氧基羰基咪唑(参看，例如Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)，Tondelli等人J.Controlled Release 1：251(1985))；对硝基苯基碳酸酯(参看，例如Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))；醛(参看，例如Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)，美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)；顺丁烯二酰亚胺(参看，例如Goodson等人Bio/Technology 8：343(1990)，Romani等人的Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984))；和Kogan(Synthetic Comm.22：2417(1992))；邻吡啶基二硫化物(参看，例如Woghiren等人Bioconj.Chem.4：314(1993))；丙烯基醇(acrylol)(参看，例如Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))；乙烯基砜(参看，例如美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N＝N＝N，
其中：
X为如上文所述的官能团；且
n为约20至约4000。
在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N，
其中：
W为包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接子部分；
n为约20至约4000；且
X为如上文所述的官能团。m为1至10。
可以根据所属技术领域已知和/或本文所公开的多种方法制备本发明的含叠氮PEG衍生物。在一种下文所示的方法中，将具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架与叠氮阴离子(其可以与任何数目的合适反离子配对，包括钠、钾、叔丁铵等等)反应，其中聚合物骨架具有结合于第一官能团的第一末端和结合于合适离去基团的第二末端。离去基团经历亲核取代，并且由叠氮部分置换，得到所需含叠氮PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如所示，适用于本发明的合适聚合物骨架具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)，且X为不与叠氮基反应的官能团，且L为合适的离去基团。合适官能团的实例包括(但不限于)羟基、受保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、受保护胺、受保护酰肼、受保护硫醇、羧酸、受保护羧酸、顺丁烯二酰亚胺、二硫吡啶和乙烯吡啶和酮。合适离去基团的实例包括(但不限于)氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯和甲苯磺酸酯。
在制备本发明的含叠氮聚合物衍生物的另一种方法中，使具有叠氮官能团的连接剂与具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架接触(其中连接剂具有可以与PEG聚合物上化学官能团选择性反应的化学官能团)，以形成含叠氮聚合物衍生物产物，其中通过连接基团将叠氮从聚合物骨架中分离。
示范性反应流程如下所示：
X-PEG-M+N-连接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接子-N＝N＝N
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为封端基(例如烷氧基)或如上文所述的官能团；且
M为不与叠氮官能团反应但与N官能团有效且选择性反应的官能团。
合适官能团的实例包括(但不限于)：如果N为胺，则M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，则M为酮；如果N为亲核试剂，则M为离去基团。
可以通过已知方法达到粗产物的纯化，包括(但不限于)使产物沉淀，接着(如果需要)进行色谱层析。
在PEG二胺的情况下，下文展示更具体的实例，其中一个胺受保护基团部分(例如叔丁基-Boc)保护，且所得单保护PEG二胺与具有叠氮官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N。
在此情况下，可以使用多种活化剂(例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)将胺基团与羧酸基团偶联，以在单胺PEG衍生物与含叠氮连接子部分之间产生酰胺键。成功形成酰胺键之后，所得经N-叔丁基-Boc保护的含叠氮衍生物可以直接用于修饰生物活性分子，或者其可以进一步经精制以安置其它有用官能团。举例来说，可以通常用强酸处理来水解N-t-Boc基团以生成ω-氨基-PEG-叠氮。所得胺可以用作合成把手(synthetic handle)以安装例如顺丁烯二酰亚胺基、活性二硫键、活性酯等其它有用官能团，以用于产生有价值的异双官能试剂。
当需要将不同分子连接于聚合物的各末端时，异双官能衍生物尤其可用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG会允许将具有活性亲电子基团(例如，醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等等)的分子连接于PEG的一个末端，以及将具有乙炔基的分子连接于PEG的另一末端。
在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-C≡C-R
其中：
R为H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或经取代芳基；
B为连接部分，其可以存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原聚合物；
A为连接部分，其可以存在或不存在并且可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个且优选为1-10碳原子的多官能化烷基。烷基链可以包括例如氮、氧或硫的杂原子。烷基链也可以在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个且优选为5-6碳原子的多官能化芳基。芳基可以经又一个碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适连接基的其它实例包括描述于下列专利案中的连接基：美国专利第5,932,462号、第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596，各专利案以引用的方式并入本文。所属领域技术人员应认识到，前文所列连接部分决非为详尽的而仅为说明性，并且多种具有上述量的连接部分均可用于本发明。
适合用作X的官能团实例包括羟基；受保护羟基；烷氧基；活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯；活性碳酸酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯；缩醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯酰胺；活性砜；胺；氨氧基；受保护胺；酰肼；受保护酰肼；受保护硫醇；羧酸；受保护羧酸；异氰酸酯；异硫氰酸酯；顺丁烯二酰亚胺；乙烯基砜；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙酰胺；环氧化物；乙二醛类；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；和三氟代乙烷磺酸酯；烯；酮和乙炔。应了解，所选X部分应与乙炔基相容，从而不与乙炔基发生反应。含乙炔聚合物衍生物可以具有同双官能性，意思是第二官能团(即X)也为乙炔部分；或者具有异双官能性，意思是第二官能团为不同官能团。
在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH，
其中：
X为如上文所述的官能团；
n为约20至约4000；且
m为1至10。
各异双官能PEG聚合物的具体实例如下文所示。
可以使用所属技术领域已知和/或本文所公开的方法制备本发明的含乙炔PEG衍生物。在一个方法中，使具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架与具有乙炔官能团和适于与PEG上亲核基团反应的离去基团的化合物反应，其中聚合物骨架具有结合于第一官能团的第一末端和结合于合适亲核基团的第二末端。当结合具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基团的分子时，离去基团经历亲核取代，并且由亲核部分置换，以生成所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR′
如所示，用于所述反应的优选聚合物骨架具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)主要经SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚胺基、羧酸酯、酰肼、氨氧基。Nu基团的其它实例包括将主要经亲核加成反应而反应的官能团。L基团的实例包括氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯和甲苯磺酸酯，和其它预期经亲核取代的基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯和其它预期经历亲核试剂加成反应的亲电子基团。
在本发明的另一实施例中，A为1-10个碳原子的脂肪族连接子，或6-14个碳原子的经取代芳基环。X为不与叠氮基反应的官能团，且L为合适的离去基团。
在制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一方法中，使乙炔阴离子与具有约800Da至约100,000Da平均分子量的PEG聚合物接触，所述PEG聚合物在一末端具有受保护官能团或封端剂且在另一末端具有合适离去基团。
示范性反应流程如下所示：
X-PEG-L+-C≡CR′→X-PEG-C≡CR′
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为封端基，例如烷氧基或如上文所述的官能团；且
R′为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基团L应具有足够反应性以经历SN2型取代。为达成离去基团经乙炔阴离子的SN2取代所需的反应条件为所属技术领域所熟知。
可以通过所属技术领域的已知方法达到粗产物的纯化，其包括(但不限于)使产物沉淀，接着(如果需要)进行色谱层析。
水溶性聚合物可以与本发明的抗原结合多肽相连接。水溶性聚合物可以经并入抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸，或者非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基，或者添加于非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物经非天然发生氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N端残基的氨基)连接于并入有非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。在一些情况下，本发明的ABP包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上的非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)。在一些情况下，本发明的ABP进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的ABP包含一个或一个以上连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸和一个或一个以上连接于水溶性聚合物的天然发生氨基酸。在一些实施例中，用于本发明的水溶性聚合物增强相对于非结合形式的ABP的血清半衰期。
可以调节连接于本发明抗原结合多肽的水溶性聚合物数目(即PEG化或糖基化程度)以改变(包括(但不限于)增加或减少)药理学、药物动力学或药效学特征，例如活体内半衰期。在一些实施例中，ABP的半衰期比未经修饰多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中，用含有直接连接于PEG骨架的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可以存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有借助酰胺键连接于PEG骨架的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的抗原结合多肽。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，n为100-1,000且X视情况为可以存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的支链PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的ABP，其中所述支链PEG衍生物的各各链具有10-40kDa范围内的MW，更优选的是5-20kDa。
在本发明的另一实施例中，用具有分支结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的ABP。举例来说，在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可以存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲基团的PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。
在一些实施例中，含羟胺基团的PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。
水溶性聚合物连接于ABP的程度与位点可以调节ABP与抗原或受体的结合。
用于活化聚合物以及用于结合肽的方法和化学在文献中有所描述并且为所属技术领域已知。通常用于活化聚合物的方法包括(但不限于)用以下物质活化官能团：溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、二环氧化物(biepoxide)、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等等(参看，R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等人，编辑POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
可获得若干关于PEG官能化和结合的综述和专论。参看，例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews inTlierapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。
用于活化聚合物的方法也可以参看WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利5,281,698号和WO 93/15189，以及用于活性聚合物与酶之间的结合，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。所用参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
通过任何常规方法进行含有非天然编码氨基酸(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的抗原结合多肽的PEG化(即添加任何水溶性聚合物)。举例来说，用以炔为末端mPEG衍生物PEG化ABP。简单来说，室温下伴随搅拌向含对叠氮基-L-Phe的ABP水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH2-G≡CH。通常用具有接近进行反应的pH值的pKa(通常约pH 4-10)的缓冲液缓冲所述水溶液。举例来说，用于在pH 7.5下进行PEG化的合适缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。持续监控并且(如果需要)调节pH值。通常使反应持续约1-48小时。
反应产物随后经疏水互作色谱法以从游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH和PEG化ABP的任何高分子量复合物分离出PEG化ABP变体，所述高分子量复合物是当非嵌段PEG在分子的两个末端均被活化，进而交联ABP变体分子而形成。疏水互作色谱法中的条件在于使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流经色谱柱，同时任何经交联PEG化的ABP变体复合物在所需形式之后溶离，所述ABP变体复合物含有结合于一个或一个以上PEG基团的一个ABP变体分子。合适条件视交联复合物与所需结合物的相对大小而变化，并且可以由所属领域技术人员轻易地确定。通过超滤来浓缩含有所需结合物的溶离液，并且通过透滤脱盐。
如果需要，则可以通过所属领域技术人员所已知的一种或一种以上过程进一步纯化获自疏水色谱法的PEG化ABP，所述过程包括(但不限于)亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法(使用包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)、二氧化硅色谱法、反相HPLC、凝胶过滤法(使用包括(但不限于)SEPHADEX G-75)、疏水互作色谱法、尺寸排除色谱法、金属螯合色谱法、超滤/透滤法、乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱聚焦法、置换色谱法、电泳过程(包括(但不限于)制备型等电聚焦)、差异溶解性(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)或提取法。可以通过GPC借助与球蛋白标准比较来评估表观分子量(PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris & Angal，Eds.)IRL Press 1989，293-306)。可以通过蛋白水解引起的降解作用(包括(但不限于)胰岛素裂解)，接着进行质谱分析来评估ABP-PEG结合物的纯度。Pepinsky B.等人，J.Pharmcol.&Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。
可以进一步在不受限制下对连接于本发明ABP的氨基酸的水溶性聚合物进行衍生化或取代。
含叠氮PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有可以与存在于非天然编码氨基酸侧链上的炔部分反应的叠氮部分的PEG衍生物修饰抗原结合多肽。一般来说，PEG衍生物可以具有1-100kDa范围内的平均分子量，并且在一些实施例中为10-40kDa。
在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在另一实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在本发明的另一实施例中，用含有末端叠氮部分的支链PEG衍生物修饰包含含炔氨基酸的ABP，其中所述支链PEG的各链具有10-40kDa范围内的MW，更优选的是5-20kDa。举例来说，在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，在各情况下其可以存在或不存在。
含炔PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有可以与存在于非天然编码氨基酸侧链上的叠氮部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰抗原结合多肽。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在本发明的另一实施例中，用含有借助酰胺键连接于PEG骨架的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端炔部分的支链PEG衍生物修饰包含含叠氮氨基酸的抗原结合多肽，其中所述支链PEG的各链具有10-40kDa范围内的MW，更优选的是5-20kDa。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，或不存在。
含膦PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有活性官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰抗原结合多肽，其中所述PEG衍生物进一步包含可以与存在于非天然编码氨基酸侧链上叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物可以具有1-100kDa范围内的平均分子量，并且在一些实施例中为10-40kDa。
在一些实施例中，PEG衍生物具有以下结构：
其中n为1-10；X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中，PEG衍生物具有以下结构：
其中X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可以为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示范性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R′″和R″″各自独立地指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R′、R″、R′″和R″″基团。当R′和R″连接于同一氮原子时，两者可以与氮原子结合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″是指包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。对于上述取代基来说，所属领域技术人员应了解，术语“烷基”是指包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
其它PEG衍生物和一般PEG化技术
可以连接于抗原结合多肽的其它示范性PEG分子以及PEG化方法包括描述于以下专利文献中的方法，例如美国专利公开案2004/0001838、2002/0052009、2003/0162949、2004/0013637、2003/0228274、2003/0220447、2003/0158333、2003/0143596、2003/0114647、2003/0105275、2003/0105224、2003/0023023、2002/0156047、2002/0099133、2002/0086939、2002/0082345、2002/0072573、2002/0052430、2002/0040076、2002/0037949、2002/0002250、2001/0056171、2001/0044526、2001/0027217、2001/0021763；美国专利案6,646,110、5,824,778、5,476,653、5,219,564、5,629,384、5,736,625、4,902,502、5,281,698、5,122,614、5,473,034、5,516,673、5,382,657、6,552,167、6,610,281、6,515,100、6,461,603、6,436,386、6,214,966、5,990,237、5,900,461、5,739,208、5,672,662、5,446,090、5,808,096、5,612,460、5,324,844、5,252,714、6,420,339、6,201,072、6,451,346、6,306,821、5,559,213、5,612,460、5,747,646、5,834,594、5,849,860、5,980,948、6,004,573、6,129,912；WO 97/32607、EP229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921131、、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503和EP 154 316，所述参考案以引用的方式并入本文。可以使用任何形式的本文所述的任何PEG分子，包括(但不限于)单链、分支、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。
增强与血清白蛋白的亲和力
也可以将各种分子与本发明的抗原结合多肽融合以调节血清中ABP的半衰期。在一些实施例中，将分子与本发明的抗原结合多肽连接或融合以增强与动物中内源血清白蛋白的亲和力。
举例来说，在一些情况下，进行抗原结合多肽与白蛋白结合序列的重组融合。示范性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参看，例如Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277：534-542(1996)和Sjolander等人，J，Immunol.Methods 201：115-123(1997))，或例如Dennis等人，J.Biol Chem.277：35035-35043(2002)中所述的白蛋白结合肽。
在其它实施例中，用脂肪酸酰化本发明的抗原结合多肽。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参看，例如Kurtzhals等人，Biochem.J.312：725-731(1995)。
在其它实施例中，本发明的抗原结合多肽直接与血清白蛋白(包括(但不限于)人血清白蛋白)融合。所属领域技术人员应认识到，多种其它分子也可以连接于本发明中的ABP以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
X.ABP的糖基化
本发明包括并入有一种或一种以上具有糖残基的非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。糖残基可以是天然的(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可以通过N或O连接糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应C或S连接糖苷)与非天然编码氨基酸相连接。
可以活体内或活体外将糖(包括(但不限于)糖基)部分添加至抗原结合多肽中。在本发明的一些实施例中，用经氨氧基衍生化的糖修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的抗原结合多肽以产生相应经肟键连接的糖基化多肽。一旦连接于非天然编码氨基酸，即通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精制糖以产生结合于抗原结合多肽的寡糖。参看，例如H.Liu等人J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中，直接用具有如氨氧基衍生物制备所定义的结构的聚糖修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。所属领域技术人员应认识到，其它官能团(包括叠氮、炔、酰肼、肼和氨基脲)也可以用于连接糖与非天然编码氨基酸。
在本发明的一些实施例中，随后可以通过(包括(但不限于))分别与(包括(但不限于))炔基或叠氮衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应来修饰包含含叠氮或含炔基的非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。所述方法允许以极高选择性修饰蛋白。
XI.ABP二聚体和多聚体
本发明也提供包括(但不限于)ABP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体(即三聚体、四聚体等等)的组合，其中含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的ABP多肽结合于另一ABP或其变体或任何其它为非ABP多肽或其变体的多肽，其是直接结合于多肽骨架或经连接子结合。由于与单体相比分子量增加，因此ABP二聚体或多聚体结合物能够展示出新特性或所需特性，包括(但不限于)相对于单体ABP而言不同的药理学、药物动力学、药效学特性、经调节治疗半衰期或经调节血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的ABP二聚体可以调节ABP受体的二聚化作用。在其它实施例中，本发明的ABP二聚体或多聚体可以充当ABP受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中，存在于含有二聚体或多聚体的ABP中的一个或一个以上ABP包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，ABP直接连接，包括(但不限于)经Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键连接。在一些实施例中，所连接ABP和/或所连接非ABP多肽可以包含不同非天然编码氨基酸以有助于二聚化作用，其包括(但不限于)第一ABP的一个非天然编码氨基酸中的炔可以与第二ABP的第二非天然编码氨基酸中的叠氮经Huisgen[3+2]环加成反应而结合。或者，第一ABP和/或包含含酮非天然编码氨基酸的所连接非ABP多肽可以与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二ABP多肽结合，并且多肽通过形成对应肟来反应。
或者，两个ABP和/或所连接非ABP多肽经连接子连接。任何异双官能或同双官能连接子可用于连接可以具有相同或不同主要序列的两个ABP和/或所连接非ABP多肽。在一些情况下，用于将ABP和/或所连接非ABP多肽束缚在一起的连接子可以是双官能PEG试剂。连接子可以具有广范围的分子量或分子长度。可以使用较大或较小分子量连接子以提供ABP与所连接实体之间的所需空间关系或构象。具有较长或较短分子长度的连接子也可以用于提供ABP与所连接实体之间的所需间距或柔性。类似地，在ABP到达其靶标之前或之后，具有特定形状或构象的连接子可以用于对ABP或所连接实体赋予特定形状或构象。可以对存在于连接子各末端的官能团加以选择以调节在所需条件下ABP或非ABP多肽的释放。ABP与所连接实体之间空间关系的最优化可以对分子提供新的、经调节的或所需特性。
在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，其包括：a)在聚合物骨架的至少第一末端上的叠氮、炔、肼、酰肼、羟胺或含羰基部分；以及b)在聚合物骨架的第二末端上的至少一个第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团对第一官能团不具反应性。在一些实施例中，本发明提供包含支链分子结构的至少一条臂的水溶性化合物。举例来说，支链分子结构可以为树枝状。
在一些实施例中，本发明提供包含一个或一个以上由与水溶性活性聚合物反应所形成的ABP的多聚体，所述水溶性聚合物具有以下结构：R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，
其中n为约5至3,000，m为2-10，X可以为叠氮、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基部分，且R为封端基、官能团或可以与X相同或不同的离去基团。举例来说，R可以为选自由以下各物组成群组的官能团：羟基、受保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、受保护胺、酰肼、受保护酰肼、受保护硫醇、羧酸、受保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛类、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟代乙烷磺酸酯、烯和酮。
XII.测量ABP活性和ABP与ABP抗原或结合伴侣的亲和力
可以用标准活体外或活体内试验来测定ABP活性。举例来说，可以使用结合ABP的细胞或细胞系(包括(但不限于)含有天然ABP抗原或结合伴侣的细胞或产生重组ABP抗原或结合伴侣的细胞)来监控ABP结合。对于包含非天然氨基酸的非PEG化或PEG化抗原结合多肽来说，可以通过使用所属技术领域的已知技术(例如BIAcoreTM生物传感器(Pharmacia))来测量ABP与其抗原或结合伴侣的亲和力。
无论使用何种方法产生ABP，均对ABP执行生物活性试验。如果适当，则可以进行氚化胸腺嘧啶核苷试验以确定细胞分裂程度。然而，也可以使用其它生物学试验来确定所需活性。例如测量抑制抗原生物活性(例如酶活性、增殖活性或代谢活性)能力的生物学试验也指示ABP活性。其它活体外试验也可以用于确定生物活性。一般来说，视抗原生物活性需要，生物活性测试应对所需结果进行分析，例如生物活性的增加或减少(与未改变ABP相比)、不同生物活性(与未改变ABP相比)、受体亲和力分析、构象或结构变化或血清半衰期分析。
上文关于试验方法的参考文献汇编并非详尽，并且所属领域技术人员应该了解其它可用于测试所需最终结果的试验。
XIII.测量效能、功能性活体内半衰期和药物动力学参数
本发明的一个重要方面在于通过使或不使ABP与水溶性聚合物部分结合来构建ABP所获得的延长的生物半衰期。ABP血清浓度的快速降低使得评价对以结合和非结合ABP及其变体治疗的生物反应具有重要意义。本发明的结合和非结合ABP及其变体优选在静脉内投药之后也具有延长的血清半衰期，使得能够通过(例如)ELISA法或通过初步筛选试验来进行测量。如本文所述进行活体内生物半衰期的测量。
可以在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每治疗组N＝5只动物)中评价包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的药物动力学参数。动物可以接受25微克/大鼠(静脉内)或50微克/大鼠(皮下)的单次剂量，并且根据预定时程采集大约5-7个血液样本，通常覆盖未结合于水溶性聚合物的包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽6小时以及结合于水溶性聚合物的包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽4天。充分研究了若干种类中的ABP药物动力学数据，并且可以将其直接与包含非天然编码氨基酸的ABP所获的数据进行比较。
可以通过所属技术领域已知的各种试验来测定根据本发明的ABP的特异活性。可以通过本文所述或所参考的或者所属领域技术人员所熟知的方法测试根据本发明所获得和经纯化的ABP突变型蛋白或其片段的生物活性。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白(包括(但不限于)ABP、合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白等等)视情况用于治疗用途，包括(但不限于)与合适的医药载剂相结合。举例来说，所述组合物包含治疗有效量的化合物、医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。剂型应配合投药模式。一般来说，投与蛋白的方法为所属技术领域所熟知，并且适用于投与本发明的多肽。
根据所属技术领域的熟知方法，视情况在一个或一个以上合适的活体外和/或活体内患病动物模型中测试包含一种或一种以上本发明多肽的治疗组合物，以证实功效、组织代谢并评估剂量。具体来说，开始可以通过比较非天然与天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它合适度量标准(包括(但不限于)比较经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的ABP与天然氨基酸ABP)来确定剂量，即在相关试验中。
通过任何通常用于将分子引入以完全接触血液或组织细胞的途径投药。以任何合适方式，视情况用一种或一种以上医药学上可接受载剂来投与本发明的非天然氨基酸多肽。向患者投用本发明内容中所述多肽的合适方法是可得的，并且尽管可以使用一种以上途径来投与特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一途径更及时、更有效的作用或反应。
部分上通过所投与的特定组合物以及通过用于投与组合物的特定方法来确定医药学上可接受载剂。因此，存在多种本发明医药组合物的合适剂型。
可以通过许多途径投与多肽组合物，包括(但不限于)经口、经静脉内、经腹膜内、经肌肉内、经皮肤、经皮下、经局部、经舌下或经直肠手段。也可以经脂质体投与包含经修饰或未经修饰非天然氨基酸多肽的组合物。所述投药途径和适当剂型通常为所属领域技术人员所已知。
也可以将包含非天然氨基酸的ABP单独或与其它合适组分结合而制成通过吸入来投药的气雾剂(即其可被“雾化”)。气雾剂可以置于加压可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等。
适用于通过(例如)关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径肠道外投药的剂型包括水性和非水性等渗无菌注射溶液(可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与预期接受者血液等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可以将经封装ABP的制剂保存在单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶。
肠道外投药和静脉内投药为优选投药方法。具体来说，已经用于天然氨基酸同源物疗法中的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GH、ABP、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药学传送蛋白)以及目前所用剂型提供本发明多肽的优选投药和调配途径。
在本发明的内容中，投与患者的剂量足以在患者中随时间具有有益的治疗反应，或者包括(但不限于)抑制病原体感染，或取决于应用的其它适当活性。通过特定载体或制剂的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者病情，以及待治疗患者的体重或表面积来确定剂量。也可以通过特定患者中伴随投与特定载体、制剂等的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定剂量大小。
在确定治疗或预防疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等等)中待投与的载体或制剂的有效量中，医师评价循环血浆含量、制剂毒性、疾病进程和/或(当相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
举例来说，投与70千克患者的剂量通常在等同于目前使用治疗蛋白的剂量范围内，可调节所述剂量以获得相关组合物的活性或血清半衰期改变。本发明的载体可以通过任何已知常规疗法补充治疗条件，包括投与抗体、投与疫苗、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应修饰剂等等。
对于投药来说，可以在由相关制剂的LD-50或ED-50和/或在各种浓度下所观察的任何非天然氨基酸的副作用所确定的速率下投与本发明的制剂，包括(但不限于)适于患者的质量和总体健康状况。可以经单次剂量或分开剂量完成投药。
如果经制剂输液的患者发生发热、寒战或肌肉疼痛，则他/她应接受适当剂量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它控制疼痛/发烧的药物。对经受输液反应(例如发热、肌肉疼痛和寒战)的患者在将要输液阿斯匹林、醋氨酚或(包括(但不限于))苯海拉明30分钟之前前驱用药。度冷丁(meperidine)用于不迅速响应于退热剂和抗组胺剂的更为严重的寒战和肌肉疼痛。取决于反应的严重程度，减缓或停止细胞输液。
可以对哺乳动物受检者直接投与本发明的人抗原结合多肽。通过任何通常用于向受检者引入ABP的途径投药。尽管任何给定情况下最为合适的途径应取决于待治疗病情的性质和严重程度，但是根据本发明实施例的ABP组合物包括适用于经口、经直肠、经局部、经吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、经面颊(包括(但不限于)舌下)、经阴道、肠道外(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)和经皮投药的组合物。可以局部或全身性的方式投药。可以将化合物制剂保存在单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶。可以制备呈单位剂量注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的与医药学上可接受载剂混合的本发明ABP。也可以通过连续输液(使用包括(但不限于)微型泵，例如渗透泵)、单次快速注射或缓释储库型制剂来投用本发明的ABP。
适用于投药的剂型包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液(可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可以由先前所描述种类的无菌粉末、颗粒和药片制备溶液和悬浮液。
本发明的医药组合物可以包含医药学上可接受载剂。部分上通过所投与的特定组合物以及通过用于投与组合物的特定方法来确定医药学上可接受载剂。因此，存在多种适合于本发明医药组合物的剂型(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)(参看，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版.1985)。
合适载剂包括含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；二价金属离子，例如锌、钴或铜；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐反离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TweenTM、PluronicsTM或PEG。
可以通过持续释放系统或作为持续释放系统一部分投与本发明的ABP，包括与例如PEG的水溶性聚合物相连接的ABP。持续释放组合物包括(包括(但不限于))为成形粒子形式的半透性聚合物基质，包括(但不限于)薄膜或微胶囊。持续释放基质包括生物相容物质，例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯-醋酸乙烯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚乳酸(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙醇酸、乳酸/甘醇酸共聚物、聚酸酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原质、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多聚核苷酸、聚乙烯基丙烯(polyvinyl propylene)、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物也包括脂质捕获化合物(liposomally entrappedcompound)。可以通过本身已知的方法制备含有化合物的脂质体：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324。所用参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
可以通过(例如)下文所述的方法制备脂质体捕获ABP：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP 102,324。脂质体组合物与大小为熟知，并且能够由所属领域技术人员根据经验容易地确定。一些脂质体实例描述于以下文献中：例如Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编辑)：MEDICAL Applications ofLiposomes(1998)；Drammond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancer therapy，in Teicher B(编辑)：Cancer Drug Discovery and Development(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen TJB等人，Biochim.Biophys.Ada1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。所用参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
在本发明的内容中投与患者的剂量应足以引起受检者中随时间的有益反应。一般来说，每剂量肠道外投与的本发明ABP的总医药学有效量为约0.01微克/千克/天至约100微克/千克，或约0.05毫克/千克至约1毫克/千克患者体重，但这受治疗判断影响。给药频率也受治疗判断影响，并且可以比所建议用于人类的市售ABP制品频率更高或更低。一般来说，可以通过任何上述投药途径投与本发明的PEG化抗原结合多肽。
XV.本发明抗原结合多肽的治疗用途
本发明的ABP多肽可用于治疗许多病症。含有ABP的医药组合物可以调配成有效地通过各种手段向遭受病症的人类患者投药的浓度，其中所述病症可能受ABP激动剂或拮抗剂(例如，但不限于，使用抗增殖剂、抗炎性剂或抗病毒素)影响，其是单独的或作为病情或疾病的一部分。ABP的平均量可以不同，并且具体来说，应基于合格医师的建议和处方。ABP的准确量对受检者而言受以下因素影响：例如待治疗的准确病情类型、所治疗的患者状况以及组合物中的其它成分。本发明也提供投与治疗有效量的另一种活性剂，例如抗癌化疗剂。所属领域技术人员基于ABP疗法可以轻易地确定其给药量。
实例
提供以下实例进行说明，而不是要限制所主张的发明。
实例1
本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入ABP的优选位点的许多潜在标准组中的一组。
本实例证实如何选择抗原结合多肽中用于引入非天然编码氨基酸的优选位点。使用包含两个ABP分子的三维结构或ABP的二级、三级或四级结构来确定一个或一个以上非天然编码氨基酸可以引入的优选位置。
以下标准用于评价用于引入非天然编码氨基酸的各位置：残基(a)不应该干扰基于三维结构结构分析的ABP或ABP的二级、三级或四级结构的结合，(b)不应该受丙氨酸或同系物扫描突变的影响，(c)应该表面暴露并且展示与周围残基的最小范德华力(van der Waals)或氢键互作，(d)可以在ABP的一个或一个以上暴露面上，(e)可以为与第二ABP或其它分子或其片段并置的ABP位点，(f)在ABP变体中应该缺失或可变，(g)在用非天然编码氨基酸替换之后应产生保守性变化，(h)通过视需要改变完整结构的柔性或刚性，可以调节ABP自身或者包含一个或一个以上ABP的二聚体或多聚体的构象，(i)可见于高柔性区或结构刚性区中，和(j)可见于或不可见于互补决定区(CDR)中。此外，采用Cx程序(Pintar等人Bioinformatics，18，第980页)对ABP分子进行进一步计算以评价各蛋白原子的突出程度。因此，在一些实施例中，非天然编码氨基酸在(但不限于)ABP的一个或一个以上位置处被替换。
实例2
本实例详述克隆并在大肠杆菌中表达包括非天然编码氨基酸的ABP。
将包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入翻译系统用于表达含有非天然编码氨基酸的ABP。O-RS优选用非天然编码氨基酸氨酰化O-tRNA。翻译系统又将非天然编码氨基酸插入响应于所编码选择密码子的ABP中。
表2：O-RS和O-tRNA序列
用含有经修饰ABP基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(特异于所需非天然编码氨基酸)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码氨基酸位点特异性并入ABP中。在37℃下在含有0.01-100mM特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌高保真度且有效地表达经修饰ABP。由大肠杆菌宿主细胞产生含有非天然编码氨基酸的His标签(His-tagged)ABP为包涵体或聚集体。溶解聚集体，并且在变性条件下在6M盐酸胍中亲和纯化。通过在4℃下在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)Sarkosyl中隔夜透析来进行重新折叠。随后将所述物质对20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2透析，接着移除His标签(His-tag)。参看Boissel等人，(1993)268：15983-93。纯化ABP的方法为所属技术领域熟知，并且由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-离子化离子阱质谱法等等证实。
表达构建体
周质scFv-108：将EGFR特异性单克隆抗体mAb108的可变区(VL和VH)(美国专利第6,217,866号，其以引用的方式并入本文)克隆为具有位于酵母BGL2(C7)周质前导序列下游的(GGGGS)4连接子序列的scFv片段(Humphreys，DP等人Protein ExprPurif 2000年11月；20(2)：252-64)。将由c-myc抗体所识别的抗原决定基序列以及6X-His标签克隆到VL域的下游。在可诱导启动子的控制下，将野生型scFv-108构建体以及VL域中含有琥珀终止密码子(TAG)的变体(见图2，A)克隆进大肠杆菌表达载体中。此质粒也组成型表达来自甲烷球菌的琥珀抑制基因酪氨酰基tRNATyr/CUA(MjtRNATyr/CUA)。指示出琥珀终止密码子的位置。所构建的构建体如SEQ ID NO：18(核苷酸序列)和SEQ ID NO：19(翻译蛋白序列)所示。构建体描述于表3和4中。
表3：
序列 位置(SEQ ID NO：18)
C7前导子 15-83
VH 84-446
GlySer连接子 447-506
VL 507-827
Myc 843-887
His 888-905
TAA 906-908
表4：
序列 位置(SEQ ID NO：19)
C7前导子 1-23
VH 24-144
GlySer连接子 145-164
VL 165-276
Myc 277-291
His 292-297
细胞质scFv-108：在T7启动子的控制下，将含有N端MetGly-序列和6X-His序列的VH-连接子-VL(VH-GlySer-VL)克隆进表达载体中(见图2，B)。指示出琥珀终止密码子和PEG化残基的位置。所构建的构建体如SEQ ID NO：20(核苷酸序列)和SEQID NO：21(翻译蛋白序列)所示。构建体描述于表5中。
表5：
序列 位置(SEQ ID NO：20)
His 3-26
VH 27-389
GlySer连接子 390-449
VL 450-767
Fab-108：将mAb108的VL和VH序列克隆进pFT3中，pFT3是一种编码g3(VL)和STII(VH)周质前导序列以及人类κ恒定和CH1域的质粒。CH1域的C端含有6-His标签进而促进纯化。将琥珀突变引入CH1域，并且将整个双顺反子级联克隆进组成型表达来自甲烷球菌的琥珀抑制基因酪氨酰基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的表达质粒中。显示两个驱动Fab片段VL和VH域的翻译的Shine Delgarno序列(SD)。所构建的构建体如SEQ ID NO：22(核苷酸序列)和SEQ ID NO：23和24(Fab 108的VLκ链和Fab108的VH-CH1链的翻译蛋白序列)所示。构建体描述于表6中。
表6：
序列 位置(SEQ ID NO：22)
g3前导子 15-68
VL 81-416
K链 432-755
STII前导子 788-856
VH 875-1237
CH1域 1247-1543
His 1544-1561
周质scFv-4D5：将HER2特异性单克隆抗体mAb-4D5的可变区(VL和VH)(Carter，P.等人，Biotechnology(N Y).1992年2月；10(2)：163-7)克隆为酵母BGL2(C7)周质前导序列下游的scFv片段。在VL序列的C端(scFv-4D5-His；图2，D)或在VH域的N端(His-scFv-4D5；图2，E)克隆6X-His标签。将野生型scFv-4D5构建体以及GlySer连接子域含有琥珀终止密码子(TAG)的变体克隆进组成型表达来自甲烷球菌的琥珀抑制基因酪氨酰基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的大肠杆菌表达载体。所构建的6X-His C端构建体如SEQ ID NO：25(核苷酸序列)和SEQ ID NO：26(翻译蛋白序列)所示。所构建的6X-His N端构建体如SEQ ID NO：27(核苷酸序列)和SEQ ID NO：28(翻译蛋白序列)所示。6X-His C端构建体描述于表7中，而6X-His N端构建体述于表8中。
表7：
序列 位置(SEQ ID NO：25)
C7前导子 15-83
VH 84-443
GlySer连接子 444-503
VL 504-824
His 825-848
表8
序列 位置(SEQ ID NO：27)
C7前导子 15-83
His 84-107
VH 108-470
GlySer连接子 471-530
VL 531-854
Fab-4D5：将mAb 4D5的VL和VH序列亚克隆进编码g3和STII周质前导序列以及人类κ恒定和CH1域的质粒pFT3中，并且随后克隆进组成型表达来自甲烷球菌的琥珀抑制基因酪氨酰基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的表达质粒。图2，F显示用于表达Fab-4D5的顺反子。将琥珀突变引入Fab 4D5的CH1域的赖氨酸139位。此赖氨酸对应Fab 108中的K142。通过重叠PCR(Fab-4D5-cys)构建在CH1域C端含有额外半胱氨酸残基(THTCAA)的Fab-4D5构建体。所构建的构建体如SEQ ID NO：29(核苷酸序列)和SEQ ID NO：30和31(Fab 4D5的VLκ链和Fab 4D5的VH-CH1链的翻译蛋白序列)所示。构建体描述于表9中。
表9：
序列 位置
g3前导子 1-54
VL 67-386
K链 403-726
STII前导子 759-827
VH 846-1205
CH1域 1215-1511
His 1512-1529
表达/抑制
用对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)抑制：使用所属技术领域已知的标准实验方案完成大肠杆菌中琥珀突变的抑制。简单来说，为达成大肠杆菌中抗体片段(scFv和Fab)的周质抑制，将表达载体构建体与编码来自甲烷球菌的正交酪氨酰基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)的质粒一起转化进大肠杆菌宿主细胞中。将隔夜细菌培养物1∶100稀释至含有LB培养基(Luria-Bertani)或Superbroth的振荡烧瓶中，并且在37℃下生长至OD大约为0.8。诱导Fab和scFv表达，同时通过加入对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)至4mM终浓度来抑制琥珀密码子。在25℃下隔夜温育培养物。在相同条件下进行野生型(缺乏琥珀密码子)scFv和Fab(包括Fab-4D5-cys)的表达。以相似方式达成细胞质scFv片段的表达/抑制(图2，B)。
用aa9.2抑制：以与pAcF相似的方式达成用pAcF衍生物(aa9.2)抑制琥珀突变，除了所用来自甲烷球菌的正交酪氨酰基-tRNA-合成酶(MjTyrRS)特异于此氨基酸。通过在诱导时添加aa9.2(4mM)来完成抑制。
蛋白提取与纯化
离心收集细胞，并重悬于补充有100μg/ml溶菌酶的周质释放缓冲液(50mM NaPO4、20％蔗糖、1mM EDTA，pH 8.0)中，并且在冰上培育30分钟。离心之后，将上清液中的抗体片段借助其His标签固定在ProBind小珠(Invitrogen；Carlsbad，CA)上，用结合缓冲液充分洗涤，并接着用0.5M咪唑将经结合的片段从小珠中溶离出来。将经纯化片段透析至储存缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、10％甘油、5％蔗糖，pH 7.8)中。对于在细胞质中表达的scFv片段的小规模分析来说，从15ml培养物中离心收集大肠杆菌，并且重悬于1ml补充有10μg/ml DNase的溶解缓冲液(B-PER，Pierce Biotechnology；Rockford，IL)中。在37℃下温育混合物30分钟，在Protein Loading缓冲液(Invitrogen；Carlsbad，CA)中稀释1倍，并且通过SDS-PAGE分析。
图3，A显示GlySer连接子(S131Am)内第二丝氨酸中琥珀突变的抑制，并且显示相应含pAcF的scFv的纯化(图3，B)。如图3，A所示Western印迹分析证明，当细胞在LB或Superbroth培养基中生长时，需要pAcF以抑制琥珀终止突变。pAcF的存在并不影响缺乏TAG终止密码子的scFv的表达(WT scFv-108)。图3，B显示通过固定金属亲和色谱法(IMAC)纯化pAcF-scFv 108-(S131)。含pAcF的scFv的估计产量为1.5mg/L。由箭头指示scFv片段的位置。如下装载考马斯凝胶：泳道1-scFv对照(1.7μg)；泳道2-IMAC预结合(20μl/70ml)；泳道3-IMAC空(20μl/70ml)；泳道4-IMAC洗脱(5μl/1.3ml)；泳道5-NAP10缓冲液交换(10μl/1.5ml)；泳道6-IMAC小珠洗脱后；泳道7-scFv对照(3.4μg)。
图4显示细胞质表达scFv期间内VL链(L156)中琥珀突变的抑制。产量为＞100mg/L大肠杆菌培养物，并且终止密码子抑制完全依赖于pAcF的存在。箭头指示全长scFv。实心圆圈指示在琥珀密码子处经截短的产物。
抗体片段(1)的PEG化/二聚化
PEG化：在反应缓冲液(100mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA，pH 4.0)中将大约1mg pAcF-scFv-108蛋白浓缩至50μl终体积。以100μl终体积用100倍摩尔过量的单官能(羟胺)5K PEG(在反应缓冲液中平衡)于28℃下温育反应混合物32小时。凝胶电泳之后评价PEG化物质，并且直接用于细胞结合试验中。
二聚化：相似过程用于二聚化含pAcF的scFv-108片段。简单来说，将起始含有pAcF的scFv片段在反应缓冲液中浓缩至＞5μg/μl，并且随后用与双官能羟胺结合的PEG连接子(364Da)温育。透析移除未反应PEG，并且向混合物中添加新鲜等分试样的pAcF-scFv片段(1摩尔蛋白：蛋白当量)。随后在28℃下再温育混合物32小时。将二聚体装载于经20mM乙酸钠(pH 4.0)平衡的阳离子交换柱(SP-5PW)上，并且以NaCl梯度(0-0.4M)洗脱。
图5显示pAcF-scFv-108片段的PEG化和二聚化。图5，A显示pAcF-scFv-108-(L156)与pAcF-scFv-108-(S136)的PEG化(5K)，和pAcF-scFv-108-(S136)的二聚化。如下装载凝胶：泳道1-pAcF-scFv-108-(L156)(5K PEG)；泳道2-pAcF-scFv-108-(S136)(5KPEG)；泳道3-pAcF-scFv-108-(S136)(364da PEG)连接子的二聚化；泳道4-pAcF-scFv-108-(S136)的二聚化；第一PEG化反应之后未移除连接子。分别由单箭头和双箭头指示单PEG化scFv片段和scFv-108-(S136)二聚体的位置。泳道4中无二聚化证明scFv并未经分子间二硫键形成而偶联。图5，C显示PEG与scFv片段的结合完全依赖于pAcF的存在。未观察到WT scFv片段的PEG化。如下装载凝胶：泳道1-WT scFv108对照；泳道2-scFv WT，在反应缓冲液中，无PEG，16小时；泳道3-scFv WT+5KPEG，在反应缓冲液中，16小时。
图6显示在scFv同源二聚体的阳离子交换色谱法期间所收集的洗脱份的SDS PAGE分析。使用双官能羟胺364道尔顿PEG连接子同型二聚化pAcF-scFvl08-(S131)片段。在阳离子交换色谱法期间NaCl梯度(0-0.4M)中的不同点时收集洗脱份。如下装载凝胶：泳道1-标示；泳道2-pAcF-scFv108(S131)-X-pAcF-scFv108(S131)洗脱份#1；泳道3-pAcF-scFv108(S131)-X-pAcF-scFv108(S131)洗脱份#2；泳道4-pAcF-scFv108(S131)-X-pAcF-scFv108(S131)洗脱份#3.
图8，A显示pAcF和pAcF-PEG化Fab片段的SDS PAGE分析。显示在K142、T204和K219处修饰的Fab-108片段，并且PEG化的效率为位点特异性。使用经羟胺结合的5K PEG进行含pAcF的Fab片段的PEG化。
图10，A和B显示C端(pAcF-scFv-4D5-His(S133)；图10，A)或N端(pAcF-His-scFv-4D5(S139)；图10，B)scFv-4D片段的GlySer连接子第二丝氨酸中琥珀突变的抑制。通过加入0.02％阿拉伯糖来诱导scFv蛋白的表达，历时5小时或隔夜(16小时)。通过伴随加入aa9.2(4mM)来完成琥珀突变的抑制。箭头指示受抑制的产物，并且实心圆圈指示截短蛋白。达到大于50％的抑制产量(1.5mg/L)。指示装载有scFv 108的对照泳道(C)，它跑的比scFv-4D5略高。
表达Fab片段pAcF-Fab-4D5-(K139)和Fab-4D5-cys，并且以相同方式纯化。图11，A显示在还原和非还原条件下SDS-PAGE所分析的样品。Fab片段产量如下：pAcF-Fab-4D5-(K139)为0.37mg/L/OD(最终OD600＝3.14)，而Fab-4D5-cys为0.23mg/L/OD(最终OD600＝3.26)。图11，B显示使用抗His抗体的图11，A所示样品(5μl)的Western印迹。在非还原条件下使样品跑电泳。箭头指示Fab-4D5-cys构建体的多聚VH-CH1复合物。未发现具有pAcF-Fab-4D5-(K139)的多聚复合物。
抗体片段(2)的PEG化/二聚化
PEG化：在天然反应缓冲液(20mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA，pH 4.0)中和变性反应缓冲液(20mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA、8M尿素，pH 4.0)中将大约1mg的pAcF-scFv-108蛋白浓缩至50μl终体积。以100μl终体积用100倍摩尔过量的单官能(羟胺)5K PEG(在相应反应缓冲液中平衡)于28℃下温育反应混合物32小时。16小时之后，通过SDS-PAGE评价反应混合物，并且直接用于细胞结合试验。
在变性条件下多肽与连接子、聚合物、生物活性分子或其它分子的结合可以具有一个或一个以上优势。这些优势包括(但不限于)由于反应性基团的改进可达性而使结合更容易；与未结合多肽相比，经结合多肽更容易重新折叠；和与在非变性条件下可用的多肽浓度相比，能够使用更高浓度多肽以用于结合。举例来说，如果多肽不稳定并且不能高度浓缩以用于结合反应，则可能需要变性条件。然而，在与标准基于半胱氨酸的结合化学(例如顺丁烯二酰亚胺化学)或基于赖氨酸的化学(例如顺丁烯二酰亚胺化学)反应之后，在变性条件下结合多肽可以产生多肽中与一个或一个以上半胱氨酸、赖氨酸或其它氨基酸结合的非所需和/或非预期位点。所述结合的非所需和/或非预期位点可能会影响经结合多肽的活性。另一方面，由于涉及结合反应的反应性基团为非天然编码氨基酸的部分，因此多肽(例如包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的ABP)可以在变性条件下以位点特异性的方式结合。因此，借助于包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的多肽可以开发出在变性条件下获自结合的优势。
图5B显示PEG化pAcF-scFv-(S136)和对照样品的SDS-PAGE分析。如下装载凝胶：泳道1-pAcF-scFv-(S136)；泳道2-pAcF-scFv-(S136)，在28℃下温育16小时；泳道3-pAcF-scFv-(S136)，5K PEG，在28℃下温育16小时，天然条件；泳道4-pAcF-scFv-(S136)，5K PEG，在28℃下温育16小时，变性条件。箭头指示scFv和PEG化scFv。图5C显示，PEG与scFv片段的结合完全依赖于pAcF的存在。未观察到WT scFv片段的PEG化。如下装载凝胶：泳道1-WT scFv 108对照；泳道2-scFv WT，在反应缓冲液中，无PEG，16小时；泳道3-scFv WT+5K PEG，在反应缓冲液中，16小时。
连续二聚化：简单来说，将起始含有pAcF的scFv片段在反应缓冲液中浓缩至10mg/ml，并且随后用100倍过量的经双官能羟胺结合的PEG连接子(364Da)温育。在28℃下温育反应混合物16小时。透析移除未反应PEG，并且向混合物中添加新鲜等分试样的pAcF-scFv片段(1摩尔蛋白∶蛋白当量)。随后在28℃下再温育混合物32小时。见图13。将二聚体装载于经20mM乙酸钠(pH 4.0)平衡的阳离子交换柱(SP-5PW，20微米)上，并且以NaCl梯度(0-0.4M)洗脱。
图14，A和B显示二聚化样品的非还原性和还原性SDS PAGE分析。如下装载凝胶：泳道1-具有364Da PEG双官能连接子的最终scFv二聚化反应混合物；泳道2-无364Da PEG双官能连接子的最终scFv二聚化反应对照混合物；泳道3-scFv。箭头指示scFv二聚体和scFv单体。仅在双官能连接子存在下合成出scFv二聚体。泳道2中无二聚化证明scFv并未经分子间二硫键形成而偶联。由于对还原性与非还原性SDSPAGE凝胶所分析的样品之间未观察到差异，因此双官能连接子的存在并不有助于分子间二硫键形成。
二聚体纯化：使用强阳离子交换柱(SP-5PW，20微米)纯化二聚化反应混合物。缓冲液A：20mM NaOAc，pH 4.0；缓冲液B：20mM NaOAc，1M NaCl，pH 4.0。用40％B洗脱scFv二聚体。经纯化二聚体的SDS PAGE分析(图15)显示一个柱纯化之后，二聚体的纯度大约为90％。
图9显示本发明异双官能ABP的实例。基于对结合于同一抗原(例如ErbB2)的不同抗原决定基的两个不同抗体分子(例如贺赛汀和Omnitarg)所测定的已知晶体结构，鉴别特异性氨基酸位置，致使其符合特定所需选择标准。本实例中氨基酸位置的所需选择标准包括在各分子的一个或一个以上特异性氨基酸位置上的相对接近性。需要所述氨基酸位置使用连接分子形成图9所示的异双官能分子。下表10显示各分子上符合标准的特异性氨基酸位置，如同可用于形成异双官能ABP的连接分子。所属领域技术人员应认识到所述列表决非为详尽而仅为说明性，并且所有符合特定所需选择标准的氨基酸位置均适用于本发明。本发明的非天然氨基酸可以在各分子中的一个或一个以上这些位置处经替换，以提供用于连接子连接的化学官能团。多种其它选择标准也可以用于鉴别氨基酸位置以符合所需标准，包括(但不限于)相同或不同分子之间的接近性，构象变化调节，ABP之间或连接于ABP的分子之间的距离调节，连接子长度或形状，表面暴露，配体结合特征调节，受体二聚化调节等等。
基于HIV-1中和人Fab 4E10与HIV gp41 env蛋白的互作，鉴别特异性氨基酸位置，使得其符合特定所需选择标准。本实例中氨基酸位置的所需选择标准包括可用于T-20肽与Fab结合的残基，致使发生T-20与gp41的结合，而不消极影响4E10互补决定区(CDR)与gp41的结合和4E10互补决定区(CDR)的识别。T-20(也称为DP-178)通过充当病毒融合抑制剂来抑制HIV进入细胞。图12显示具有模拟g41肽的HIV中和人Fab 4E10。显示用于T-20肽连接的潜在残基。用于并入非天然编码氨基酸的潜在残基包括(但不限于)Fab的Gln64重链、Fab的Glul轻链和Fab的Gln27轻链。所属领域技术人员应认识到所述列表决非为详尽而仅为说明性，并且所有符合特定所需选择标准的氨基酸位置均适用于本发明。多种其它选择标准也可以用于鉴别氨基酸位置以符合所需标准，包括(但不限于)相同或不同分子之间的接近性，构象变化调节，ABP之间或连接于ABP的分子之间的距离调节，连接子的包涵，连接子长度或形状，表面暴露，配体结合特征调节，受体二聚化调节等等。
实例3
本实例详述含羰基氨基酸的引入和随后与含氨氧基PEG的反应。
本实例示范产生并入有含酮非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的方法，其中所述抗原结合多肽随后与大约5,000MW的含氨氧基PEG反应。根据实例1的标准所鉴别的各残基分别由具有以下结构的非天然编码氨基酸替换：
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入ABP的序列为上文实例2中所述的SEQID NO：1(muttRNA，M.jannaschii mtRNATyr CUA)和13、14或15(TyrRS LW1、5或6)。
一旦经修饰，包含含羰基氨基酸的ABP变体即与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n为3且N大约为5,000MW。将溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 7.0)或溶解于10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 4.5)中的含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化ABP(10mg/mL)与10至100倍过量的含氨氧基PEG反应，并接着在室温下搅拌10-16小时(Jencks，W.J.Am.Chem.Soc.1959，81，第475页)。随后将PEG-ABP稀释至适当缓冲液中，进行立即纯化和分析。
实例4
与由经酰胺键连接于PEG的羟胺基团组成的PEG结合。
使用实例3中所述的过程将具有以下结构的PEG试剂偶联于含酮非天然编码氨基酸：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R＝甲基，n＝4且N大约为20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。
实例5
本实例详述将两个独特非天然编码氨基酸引入ABP中。
本实例示范产生并入有非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的方法，其中所述非天然编码氨基酸在两个根据实例1所鉴别的位置处包含酮官能团，其中X*表示非天然编码氨基酸。如实例1和2中所述制备抗原结合多肽，除了在核酸内的两个独特位点处引入抑制基因密码子。
实例6
本实例详述抗原结合多肽与含酰肼PEG的结合，和随后的原位还原。
根据实例2和3中所述的过程制备并入有含羰基氨基酸的抗原结合多肽。一旦修饰之后，具有以下结构的含酰肼PEG即与ABP结合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW且X为羰基(C＝O)。将溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 6.0)、溶解于25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 7.0)或溶解于10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 4.5)中的含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化ABP(0.1-10mg/mL)与1至100倍过量含酰肼PEG反应，并且通过加入1M原料NaCNBH3(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(溶解于H2O)至10-50mM终浓度来原位还原相应腙。在黑暗中4℃至RT下反应18-24小时。通过在pH 7.6下加入1M Tris(Sigma Chemical，St.Louis，MO)至50mM Tris终浓度来终止反应，或者将反应稀释于适当缓冲液中以用于立即纯化。
实例7
本实例详述将含炔氨基酸引入ABP中，和用mPEG-叠氮进行衍生化。
任何根据实例1所鉴别的残基经以下非天然编码氨基酸替换：
用于位点特异性并入对炔丙基-酪氨酸的序列为上文实例2中所述的SEQ ID NO：1(muttRNA，M.jannaschii )和6、7或8。在大肠杆菌中表达含有炔丙基酪氨酸的抗原结合多肽，并且使用实例3中所述条件纯化。
将溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH＝8)的含有炔丙基-酪氨酸的经纯化ABP(0.1-10mg/mL)和10至1000倍过量的含叠氮PEG添加至反应混合物中。随后将催化量的CuSO4和Cu线添加至反应混合物中。在温育(包括(但不限于)室温或37℃下约4小时，或4℃下隔夜)混合物之后，加入H2O，并且将混合物经透析膜过滤。通过(包括(但不限于))与实例3中所述相似的过程分析样品以用于添加。在本实例中，PEG具有以下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R＝甲基，n＝4且N大约为10,000MW。
实例8
本实例详述由炔丙基酪氨酸替换ABP中大的、疏水性氨基酸。
如实例7所述，存在于ABP序列中的Phe、Trp或Tyr残基由以下非天然编码氨基酸替换。
一旦修饰之后，PEG即连接于包含含炔氨基酸的ABP变体。PEG具有以下结构：Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3，
并且偶联过程将遵循实例7中所述。这可以产生包含非天然编码氨基酸的ABP变体，所述非天然编码氨基酸与一种天然发生、大疏水性氨基酸大致同配位(isosteric)，并且在多肽内的独特位点处经PEG衍生物修饰。
实例9
本实例详述通过一个或一个以上PEG连接子所分开的同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体的产生。
实例7中所产生的含炔ABP变体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3，
(其中n为4且PEG具有大约为5,000的平均MW)以产生对应ABP同源二聚体，其中两个ABP分子由PEG物理位置上分开。抗原结合多肽能够以类似方式偶联于一个或一个以上其它多肽以形成异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。如实例7和3中所述进行偶联、纯化和分析。
实例10
本实例详述将糖部分与ABP偶联。
如实例3中所述，ABP的一个或一个以上氨基酸残基由以下非天然编码氨基酸替换。
一旦经修饰，包含含羰基氨基酸的ABP变体即与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β连接氨氧基类似物反应。将ABP变体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM)在100mM乙酸钠水缓冲液(pH 5.5)中混合，并且在37℃下温育7至26小时。通过在周围温度下用在150mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中的UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖酰基转移酶(galacytosyltransferase)(0.4单位/毫升)温育经糖结合的ABP(5mg/mL)来将第二糖酶法偶联于第一糖(Schanbacher等人，J.Biol.Chem.1970，245，5057-5061)。
实例11
本实例详述PEG化ABP拮抗剂的产生。
如实例3中所述，一个或一个ABP氨基酸残基由以下非天然编码氨基酸替换。
一旦经修饰，包含含羰基氨基酸的ABP变体即与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
(其中R为甲基，n为4且N为20,000MW)以产生包含非天然编码氨基酸的ABP拮抗剂，其中所述非天然编码氨基酸在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰。如实例3进行偶联、纯化和分析。
实例12
其中ABP分子是经直接连接的ABP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体和异源多聚体的产生
包含含炔氨基酸的ABP变体可以直接偶联于包含含叠氮基氨基酸的另一ABP变体，各ABP变体包含(但不限于)在实例10中所述的位点处的非天然编码氨基酸替换。这可以产生对应ABP同源二聚体，其中两个ABP变体物理相连。抗原结合多肽能够以类似方式偶联于一个或一个以上其它多肽以形成异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。如实例3、6和7进行偶联、纯化和分析。
实例13
PEG-OH+Br-(CH2)n-C≡CR′→PEG-O-(CH2)n-C≡CR′
A. B
聚烷撑二醇(P-OH)与烷基卤(A)反应形成醚(B)。在这些化合物中，n为1至9的整数，且R′可以为直链或支链、饱和或不饱和C1至C20烷基或杂烷基。R′也可以为C3至C7饱和或不饱和环烷基或环状杂烷基、经取代或未经取代芳基或杂芳基，或经取代或未经取代烷芳基(烷基为C1至C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。PEG-OH通常为具有800至40,000道尔顿(Da)分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例14
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH
用在THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后向所述溶液中加入溶解于二甲苯中所形成的80重量％炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich)和催化量的KI，并且将所得混合物加热回流2小时。随后加入水(1mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入至乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用若干份冷乙醚洗涤，并干燥，得到炔丙基-O-PEG。
实例15
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用于THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后向混合物中加入50当量5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量KI。将所得混合物加热至回流16小时。随后加入水(1mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并且将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入至乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用若干份冷乙醚洗涤，并干燥得到对应炔。5-氯-1-戊炔可以用在相似反应中。
实例16
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MSOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
向3-羟基苄醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中首先加入粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，接着加入溶于二甲苯中所形成的80重量％炔丙基溴溶液(3.36mL，30mmol)。将反应混合物加热至回流6小时。向混合物中加入10％柠檬酸(2.5mL)，并且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并后的有机层，MgSO4干燥并浓缩得到3-炔丙氧基苄醇。
0℃下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入化合物3(2.0g，11.0mmol)的CH2Cl2溶液，并将反应置于冰箱中16小时。通常反应生成浅黄色油状甲磺酸酯。将所述油(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热至回流1小时，并接着冷却至室温。向混合物中加入水(2.5mL)，并且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并后的有机层，无水Na2SO4干燥并浓缩得到所需溴化物。
将mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中，并且在冰浴中冷却溶液。伴随剧烈搅拌在数分钟内加入NaH(6mg，0.25mmol)，接着加入上述所获的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量KI。移除冷却浴，并将所得混合物加热至回流12小时。向混合物中加入水(1.0mL)，并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中生成白色沉淀物，收集白色沉淀物产生PEG衍生物。
实例17
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR′→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR′
如上文所述，也可以通过将含有末端官能团的聚(乙二醇)聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶联来获得含末端炔的聚(乙二醇)聚合物。n介于1与10之间。R′可以为H或C1至C4的小烷基。
实例18
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)，并且在室温下隔夜搅拌溶液。将所得粗NHS酯7在未经进一步纯化下用于以下反应。
将具有5,000Da分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中，并且将混合物冷却至4℃。伴随剧烈搅拌逐份加入NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时使其温热至室温。随后加入水(2mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(50mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入至乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，并在真空中干燥。
实例19
本实例是关于聚(乙二醇)的甲烷磺酰基酯的制备，聚(乙二醇)的甲烷磺酰酯也可以称为聚(乙二醇)的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯。可以通过相似过程制备对应甲苯磺酸酯和卤化物。
mPEG-OH+CH3SO2Cl+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
在氮气下将于150mL甲苯中的mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)共沸蒸馏2小时，并且将溶液冷却至室温。向溶液中加入40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)。在冰浴中冷却溶液，并且逐滴加入1.2mL经蒸馏甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下室温下隔夜搅拌溶液，并且通过加入2mL无水乙醇来终止反应。在真空下蒸发混合物以移除主要是除甲苯之外的溶剂，过滤，再在真空下浓缩，并接着于100mL乙醚中沉淀。用数份冷乙醚洗涤滤出液，并且在真空中干燥以生成甲磺酸酯。
将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中，并且将溶液冷却至4℃。向冷溶液中加入叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下将反应加热至回流2小时。随后蒸发溶剂，并且用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机份，并且用无水MgSO4干燥。将体积减少到20ml，并通过加入150ml冷无水乙醚中而沉淀出产物。
实例20
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可以使用美国专利5,998,595中所述方法生成4-叠氮基苄醇，所述专利以引用的方式并入本文。0℃下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入到4-叠氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)的CH2Cl2溶液中，并将反应置于冰箱中16小时。通常反应生成浅黄色油状甲磺酸酯。将所述油(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热至回流1小时，并且随后冷却至室温。向混合物中加入水(2.5mL)，并且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并后的有机层，无水Na2SO4干燥并浓缩得到所需溴化物。
用于THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)，并且向混合物中加入溴化物(3.32g，15mmol)以及催化量KI。将所得混合物加热至回流12小时。向混合物中加入水(1.0mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并且将体积减少至大约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中生成沉淀物，收集沉淀物产生mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400Da，2.0g)溶解于NaHCO3(10mL)饱和水溶液中，并且将溶液冷却至0℃。伴随剧烈搅拌加入3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(5当量)。3小时之后，加入20mL H2O，并且在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节至3，并且加入NaCl至大约15重量％浓度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀之后，过滤收集产物，并且在真空下干燥生成ω-羧基-叠氮PEG衍生物。
实例22
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
伴随剧烈搅拌，向如所属技术领域已知制备并冷却至-78℃的乙炔化锂(4当量)的THF溶液中逐滴加入溶于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时之后，使反应温热至室温，并且通过加入1mL丁醇来终止。随后加入20mL H2O，并且在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节至3，并且加入NaCl至大约15重量％浓度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀之后，过滤收集产物，并且在真空下干燥生成1-(丁-3-炔氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例23
使用以下文献中所述的方法将含叠氮和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白中：L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500，J.W.Chin等人，Science 301：964-7(2003))，J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，Chem Bio Chem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024：和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem. Comm..1-10。一旦并入氨基酸之后，即在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg Cu线存在下于37℃下用于磷酸盐缓冲液(PB)(pH 8)中的0.01mM蛋白进行环加成反应4小时。
实例24
本实例描述测量包含非天然编码氨基酸的ABP和PEG化ABP的活体外和活体内活性的方法。
细胞结合试验
在有或无各种浓度(体积：10ul)未经标记ABP、ABP或阴性对照存在下，且在125I-ABP(大约100,000cpm或1ng)存在下，于0℃下在PBS/1％BSA(100μl)中培养细胞(3×106)90分钟(总体积：120μl)，并进行一次重复。随后将细胞重悬于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS中，并分层，并且离心(1000g；1分钟)。通过切掉离心管的末端来收集离心小块，并且分别在γ计数器(Packard)上分别计数离心小块和上清液。
将特异性结合(cpm)确定为在无竞争者存在下的总结合(双份平均值)减去100倍过量未经标记ABP存在下的结合(非特异性结合)(cpm)。对所使用的各细胞类型测量非特异性结合。使用同一125I-ABP制剂在不同天中进行实验，并且应当显示内部一致性。未经标记天然ABP或ABP，而不是阴性对照以剂量依赖性方式抑制结合。ABP竞争结合天然125I-ABP的能力表明，受体同样识别这两种形式。
对于用scFv-108进行结合试验来说，在用胰岛素处理之后收集细胞，重悬于FACS缓冲液(PBS，2％FBS，0.01％NaN3)中，并且随后接种于96孔圆底微量滴定板(3×105细胞/孔)中。用不同浓度野生型或含pAcF的scFv-108片段在冰上培养细胞30分钟。通过离心后洗涤(重复2-3次)来移除未结合scFv蛋白。随后用mAb-108(ATCC#HB9764)在7.5nM(EC80)浓度下培养细胞30分钟。两次洗涤之后，在冰上用APC标记(别藻蓝素(allophycocyanin))的抗小鼠抗体(10μg/ml)培养细胞30分钟。两次洗涤细胞以移除第二抗体之后，将细胞重悬于补充有碘化丙啶(propidium iodine)(0.5μg/ml)的FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。对于用Fab-108进行结合试验来说，在与scFv-108试验所用相同条件下用递增量的Fab-108培养细胞。使用抗His抗体，接着使用APC标记的抗小鼠第二抗体来检测Fab结合。
图7，A-C显示含有对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)或pAcF与PEG的scFv蛋白以及WT scFv与表达EGF受体的A431细胞的竞争性结合曲线。在洗涤移除未结合scFv之后用各种浓度的scFv蛋白培养细胞，并且如上文所述用mAb108处理细胞。所有蛋白均在周质中表达。表11总结了经修饰scFv(pAcF，与pAcF和PEG)相对于野生型scFv的结合：
图8，B-D显示含pAcF或pAcF-PEG的Fab-108片段和WT Fab与表达EGF受体的A431细胞的结合。Fab片段的PEG化导致片段与EGF受体亲和力最小程度的减少。表12显示经修饰Fab片段相对于野生型Fab的结合。结合条件如前文所述。
PEG化ABP的活体内研究
对小鼠或大鼠投与PEG-ABP、未经修饰ABP和缓冲溶液。结果将显示与未经修饰ABP相比，本发明的PEG化ABP的极佳活性和延长的半衰期。
经结合和非结合ABP及其变体的活体内半衰期的测量
使用雄性Sprague Dawley大鼠(约7周龄)。在投药当天，测量各动物的重量。将每千克体重100μg非结合和经结合ABP样品各自经静脉内注射至三只大鼠的尾部静脉中。在注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时，在CO2麻醉下从每只大鼠抽出500μl血液。将血液样品储存在室温下1.5小时，接着离心(4℃，18000×g 5分钟)分离血清。将血清样品储存在-80℃下直至分析当天。
通过在冰上融解样品之后ABP的活体外活性试验来定量血清样品中活性ABP的量。
实例31
包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP的安全性和/或功效的人类临床试验
目的比较经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的PEG化重组人ABP与特异于相同靶抗原的市售制品(例如 或 )的安全性和药物动力学性质。
患者本研究招募了18名20-40岁年龄和60-90kg之间体重的的健康志愿者。这些受检者无任何临床显著异常的血液学或血清化学的实验值，和阴性尿毒性筛选、HIV筛选和乙肝表面抗原。他们不应当具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液病史；显著肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖系统、代谢系统、神经系统疾病史；贫血或抽搐病史；已知对细菌或哺乳动物衍生产物、PEG或人血清白蛋白过敏；习惯和严重依赖含有咖啡因的饮料；参与任何其它临床试验或在研究登记30天内输血或献血；在研究登记三个月内暴露于ABP；在研究登记7天内患有疾病；以及在研究登记14天内在研究前体检中或临床实验评估中具有显著异常情况。可对所有受检者评估安全性，并且根据进程收集所有血液收集物用于药物动力学分析。所有研究是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。
研究设计 是在健康男性志愿者中所进行的I期、单中心、开放标记、随机、两阶段交叉(two-period crossover)研究。将18名受检者随机分为两个治疗顺序组(9名受检者/组)。经两个单独给药阶段，在上部大腿使用等剂量的包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP和所选市售制品以皮下快速注射的方式投与ABP。市售制品的投药剂量和频率如包装标签中所说明。通过包括进附加受检者组而将使用市售制品的附加给药、给药频率或其它所需参数增加到本研究中。各给药阶段由14天清洗期(washout period)隔开。将受检者在两个给药阶段的每一个给药阶段之前至少12小时至给药之后72小时限定在研究中心，而不是在给药阶段之间。如果还存在对PEG化ABP所要测试的附加给药、频率或其它参数，则可以加入其他受检者组。ABP的实验制剂是包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP。
血样采集 通过在投与ABP之前和之后直接刺破静脉来抽出连续血液。用于测定血清ABP浓度的静脉血液样品(5mL)是在给药之前约30、20和10分钟(3个基线样品)以及在给药之后大约30分钟和1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时取得。将各血清样品分为两等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。将血清样品置于干冰上装运。在第一天初次给药即刻之前、第4天早晨、第16天给药即刻之前以及第19天早晨进行快速临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 放射免疫测定法(RA)或ELISA试剂盒过程用于测定血清ABP浓度。
安全性测定 在各次给药即刻之前(第1天和第16天)和在各次给药后6、24、48和72小时记录生命指征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型，以及临床实验测试偏离基线的变化。此外，评价生命指征测量结果(包括血压)和体检结果中与研究前相比的变化。
数据分析 通过从各给药后值减去平均基线ABP浓度来针对给药前基线ABP浓度修正给药后血清浓度值，其中所述平均基线ABP浓度是通过计算给药之前30、20和10分钟所收集的三份样品的ABP含量的平均值而得以确定。如果给药前血清ABP浓度低于本测定的定量含量，则将这些数据排除在平均值的计算之外。由针对基线ABP浓度修正的血清浓度数据确定药物动力学参数。通过使用最新版本BIOAVL软件在DigitalEquipment Corporation VAX 8600计算机系统上的模型独立方法来计算药物动力学参数。确定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；达到峰值血清浓度的时间(tmax)；借助线性梯形法则所计算的浓度-时间曲线(AUC)下从0至最后血液采样时间(AUC0-72)的面积；和从消除率常数所计算的末期消除半衰期(t1/2)。通过对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区中连续数据点的线性回归来估计消除率常数。计算各治疗的药物动力学参数的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保留制剂/非保留制剂)。
安全性结果 整个治疗组中不利事件的发生率均等分布。不存在任何偏离基线或研究前临床实验测试或血压的临床显著变化，并且体检结果和生命指征测量结果与研究前相比无显著变化。两治疗组的安全性曲线类似。
药物动力学结果 将各测量时间时，所有18名受检者中接受单次剂量的一种或一种以上特异于相同靶抗原的市售制品之后的平均血清ABP浓度-时间曲线(未对基线ABP含量修正)与包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP进行比较。所有受检者均应当具有在正常生理范围内的给药前基线ABP浓度。从对给药前平均基线ABP浓度修正的血清数据确定药物动力学参数，并且确定Cmax和tmax。所选临床比较者的平均tmax显著短于包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP的tmax。与包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP的末端半衰期相比，所测试的市售ABP制品的末端半衰期显著较短。
尽管本研究是在健康男性受检者中进行，但是相似吸收特征和安全性曲线也应当是在其他患者群体中所预期的；例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者，儿科肾衰竭患者，自体储血项目(autologous predeposit program)中的患者或安排进行择期手术的患者。
总之，皮下投与单次剂量的包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP将是安全的，并且由健康男性受检者充分耐受。基于不利事件发生率、临床实验值、生命指征和体检结果的比较，市售形式的ABP和包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP的安全曲线等同。包含非天然编码氨基酸的PEG化ABP可能对患者和卫生保健医疗人员提供很大的临床效用。
应了解，本文所述的实例和实施例仅为说明性目的，并且所属领域技术人员对根据所述内容做出各种修改或变化，这些修改和变化包括在本申请案的精神和范围以及所附权利要求书的范围以内。所有本文所引用的公开案、专利和专利申请案均以所有目的以引用的方式全文并入本文中。
本发明的其它实施例和替代实施例
1.一种包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的抗原结合多肽。
2.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽连接于连接子、聚合物或生物活性分子。
4.根据权利要求3所述的抗原结合多肽，其中所述多肽连接于水溶性聚合物。
5.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述多肽连接于双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它抗原结合多肽。
6.根据权利要求5所述的抗原结合多肽，其中所述双官能连接子或聚合物连接于第二多肽。
7.根据权利要求6所述的抗原结合多肽，其中所述第二多肽是抗原结合多肽。
8.根据权利要求6所述的抗原结合多肽，其中所述第二多肽是非抗原结合多肽。
9.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
10.根据权利要求5所述的抗原结合多肽，其中所述双官能聚合物是聚(乙二醇)部分。
11.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物连接于存在于所述抗原结合多肽中的非天然编码氨基酸。
12.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其包含至少两个连接于包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。
13.根据权利要求12所述的抗原结合多肽，其中至少一个连接于所述水溶性聚合物的氨基酸是非天然编码氨基酸。
14.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽包含一个或一个以上调节所述抗原结合多肽与ABP受体或抗原的亲和力的氨基酸替换、添加或缺失。
15.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽包含一个或一个以上调节所述抗原结合多肽稳定性、在重组宿主细胞中或活体外合成的表达水平、免疫原性、蛋白酶抗性、组织或器官特异性或溶解性的氨基酸替换、添加或缺失。
16.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸对连接子、聚合物或生物活性分子具有反应性，而所述连接子、聚合物或生物活性分子对所述多肽中任何20种常见氨基酸无反应性。
17.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
18.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
19.根据权利要求18所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
20.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
21.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
22.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
23.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨基脲基。
24.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮基。
25.根据权利要求24所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
26.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
27.根据权利要求26所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
28.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
29.根据权利要求28所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
30.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其由使包含含羰基氨基酸的抗原结合多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应而制得。
31.根据权利要求30所述的抗原结合多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经酰胺键连接于所述水溶性聚合物。
32.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其由使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然编码氨基酸的多肽反应而制得，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。
33.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其由使包含含炔氨基酸的抗原结合多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应而制得。
34.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其由使包含含叠氮氨基酸的抗原结合多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应而制得。
35.根据权利要求17所述的抗原结合多肽，其中所述叠氮基或炔基经酰胺键连接于水溶性聚合物。
36.根据权利要求4所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物为支链或多臂聚合物。
37.根据权利要求36所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物的各分枝具有约1kDa与约100kDa之间的分子量。
38.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述多肽是抗原结合多肽拮抗剂。
39.根据权利要求38所述的抗原结合多肽，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
40.根据权利要求39所述的抗原结合多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成群组的部分。
41.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
42.根据权利要求3所述的抗原结合多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子经糖部分连接于所述多肽。
43.一种分离核酸，其包含在严谨条件下与编码抗原结合多肽的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
44.根据权利要求43所述的分离核酸，其中所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
45.一种制备根据权利要求3所述的抗原结合多肽的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离抗原结合多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成群组的部分。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分经酰胺键连接于所述连接子、聚合物或生物活性分子。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
51.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
52.根据权利要求47所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分经酰胺键连接于连接子、聚合物或生物活性分子。
53.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量。
54.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分为支链或多臂聚合物。
55.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的抗原结合多肽和医药学上可接受载剂。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。
57.一种治疗患有受ABP调节的病症的患者的方法，所述方法包含对所述患者投与治疗有效量的根据权利要求55所述的组合物。
58.一种细胞，其包含根据权利要求43所述的核酸。
59.根据权利要求58所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
60.一种制备包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽的方法，所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的抗原结合多肽表达的条件下培养细胞，所述细胞包含编码抗原结合多肽并且包含选择密码子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA；和纯化所述抗原结合多肽。
61.一种调节抗原结合多肽血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸替换所述抗原结合多肽中的任何一个或一个以上天然发生氨基酸。
62.一种由多聚核苷酸编码的抗原结合多肽，其中所述多聚核苷酸包含选择密码子，并且其中所述多聚核苷酸包含至少一个非天然编码氨基酸。
63.根据权利要求62所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸连接于连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
64.根据权利要求63所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
65.根据权利要求62所述的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
66.根据权利要求64所述的抗原结合多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
67.根据权利要求64所述的抗原结合多肽，其中所述聚(乙二醇)部分为支链或多臂聚合物。
68.根据权利要求67所述的抗原结合多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有约1kDa与约100kDa之间的分子量。
69.一种组合物，其包含根据权利要求62所述的抗原结合多肽和医药学上可接受载剂。
70.一种包含相互连接的第一ABP与第二ABP的双特异性ABP，其中所述第一ABP与所述第二ABP特异性结合于不同抗原决定基，其中所述第一ABP具有对第一抗原上至少一个抗原决定基的结合特异性，且所述第二ABP具有对第一抗原或第二抗原上不同于所述第一抗原决定基的第二抗原决定基的结合特异性，并且其中所述双特异性ABP包含至少一个非天然编码氨基酸。
71.根据权利要求70所述的双特异性ABP，其中所述第一ABP与所述第二ABP通过连接子连接。
72.根据权利要求71所述的双特异性ABP，其中所述连接子为肽连接子。
73.根据权利要求72所述的双特异性ABP，其中所述连接子为缺少蛋白裂解位点的肽连接子。
74.根据权利要求70所述的双特异性ABP，其中所述第一ABP为单链ABP，且所述第二ABP为单链ABP，并且所述第一ABP通过肽连接子偶联于所述第二ABP。
75.一种组合物，其包含根据权利要求70所述的双特异性ABP和医药学上可接受载剂。
76.一种治疗疾病或病情的方法，所述方法包含对有此需要的患者投与治疗有效量的根据权利要求75所述的组合物。
77.一种包含根据权利要求70所述的双特异性ABP的ABP，所述ABP偶联于生物活性分子。
78.根据权利要求77所述的ABP，其中所述生物活性分子是选自由细胞毒素、标记、放射性核素、药物、脂质体、配体和ABP组成的群组。
79.根据权利要求77所述的ABP，其中所述ABP为融合蛋白。
80.一种检测表达一种或一种以上抗原的细胞或组织的方法，所述方法包含：使细胞或组织与连接于可检测标记的根据权利要求70所述的ABP接触；和检测所述标记，其中与细胞或组织缔合的所述标记的检测指示表达一种或一种以上由ABP结合的抗原的细胞或组织的存在。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述可检测标记是选自由γ射线发射体、正电子发射体、MRI标记和荧光标记组成的群组。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述可检测标记是γ射线发射体，并且所述检测包含用γ相机成像。
83.根据权利要求80所述的方法，其中所述可检测标记是正电子发射体，并且所述检测包含用正电子发射断层扫描法(positron emission tomography，PET)成像。
84.根据权利要求80所述的方法，其中所述可检测标记是MRI标记，并且所述检测包含用磁共振成像检测。
85.一种抗原结合多肽，其包含经共价键连接于所述抗原结合多肽的单一氨基酸处的水溶性聚合物。
86.根据权利要求85所述的抗原结合多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
87.根据权利要求85所述的抗原结合多肽，其中所述共价连接于所述水溶性聚合物的氨基酸是非天然编码氨基酸。
88.一种包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的抗原结合多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽的非天然编码氨基酸的官能团连接于所述多肽。
89.根据权利要求88所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽经单PEG化。
90.一种包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的抗原结合多肽，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。
91.根据权利要求90所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽包含一个所述连接子、聚合物或生物活性分子。
92.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽包含一个或一个以上调节所述抗原结合多肽血清半衰期或循环时间的氨基酸替换、添加或缺失。
93.一种调节抗原结合多肽免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸替换所述抗原结合多肽中的任何一个或一个以上天然发生氨基酸。
94.根据权利要求43所述的分离核酸，其中所述分离核酸的序列是选自由SEQ IDNO：18、20、22、25、27和29或其片段组成的群组。
95.一种抗原结合多肽，其中所述多肽是选自由SEQ ID NO：19、21、23、24、26、28、30、31或其片段组成的群组。
96.根据权利要求3所述的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽是在变性条件下连接于所述连接子、聚合物或生物活性分子。

Claims (6)

1.一种包含以一共价键相互连接的第一ABP与第二ABP的双特异性抗原结合多肽(ABP)，所述共价键是由至少一非天然编码氨基酸的官能团所形成，前述至少一非天然编码氨基酸则是位于第一ABP以及/或第二ABP的恒定域；其中所述第一ABP结合于一表皮生长因子受体；而所述第二ABP则是预定与一表皮生长因子受体或一第二抗原特异性结合，并且其中所述官能团包含所述非天然编码氨基酸的至少一酮基或疉氮基。
2.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的双特异性抗原结合多肽和医药学上可接受载剂。
3.一种抗原结合多肽(ABP)，其包含根据权利要求1所述的双特异性抗原结合多肽，所述抗原结合多肽则偶联于一毒素分子。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合多肽，其包含经共价键连接于所述抗原结合多肽的单一氨基酸处的水溶性聚合物。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合多肽，包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接于所述多肽。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合多肽，包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入多肽中的预选位点处。
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