CN101208099A - 利用非天然编码氨基酸的生物合成多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供经修饰生物合成多肽分子、其制造方法和用途。
Description
交叉参考相关申请案
本申请案主张于2004年7月21日申请的美国临时专利申请案第60/590,035号和于2005年3月7日申请的美国临时专利申请案第60/659,709号的优先权，所述专利申请案以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及生物合成多肽，和包含至少一个非天然编码氨基酸或由至少一个非天然编码氨基酸制成的融合蛋白。
背景技术
肽广泛用于研究和医学实践，并且可以预期其重要性将随肽产品的制造和性能所提出的挑战而增加。例如本文所述的治疗肽被称为生物合成多肽(BSP)。许多内源肽已描述成生物过程的关键组分。这些肽中的一些已被鉴别为用于控制各种病症的治疗剂。一般来说，内源肽比具有非天然序列的合成肽更适合用作治疗剂，因为由于其内源特征而不产生免疫应答。此外，内源肽高度特异于其靶受体并且易于合成和制造。然而，传送所述治疗肽的主要困难在于其较短的血浆半衰期，这主要是由于快速血清清除和经由肽酶作用的蛋白水解降解。
当将天然肽或其类似物用于治疗中时，通常发现其具有高降解率和/或清除率。当需要维持长期高血液含量时，高清除率治疗剂是不便利的，因为随后必需重复投药。具有高降解率和/或清除率的肽的实例包括：ACTH、促肾上腺皮质激素释放因子、血管紧张素、降钙素(calcitonin)、胰岛素、胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胃抑制肽、生长激素释放因子、垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylating cyclase activating peptide)、肠泌素、肠促胃泌素(enterogastrin)、生长抑素(somatostatin)、生长激素、生长调节素、甲状旁腺激素、血栓形成素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素(prolactin)、促甲状腺激素、内啡肽(endorphin)、脑啡肽(enkephalin)、血管加压素(vasopressin)、缩宫素(oxytocin)、阿片样物质及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶和核糖核酸酶。在一些情况下，能够通过应用合适医药组合物影响肽的释放曲线，但是此方法具有多种缺点并且通常不适用。
肽酶通过跨肽键插入水分子来破坏肽中的肽键。一般来说，通过体内的肽酶以数分钟或更短的方式破坏大部分肽。此外，一些肽酶对某些类型肽具有特异性，使得其降解更为快速。因此，如果将肽用作治疗剂，那么由于肽酶的作用肽活性通常随体内肽的快速降解而降低。
一种克服所述不利之处的方法在于对患者投与大剂量的令人感兴趣的治疗肽，使得即使一些肽降解，还仍然能够保留足够的治疗有效性。然而，此方法对于患者来说相当不方便。由于大部分治疗肽不能口服投与，因此治疗肽不得不不断地灌输，通过静脉内注射频繁投与，或通过不便的皮下注射途径频繁投与。对于许多潜在的肽治疗法而言，对频繁投药的需要也产生每个治疗疗程不可接受的高预计费用。大量降解肽的存在还可能产生不良副作用。
投药不便和高花费是具有吸引力的生物活性特征的治疗肽为何并未开发成候选药物的两个原因。而是，这些治疗肽用作开发肽模拟化合物的模板以取代治疗肽。生物技术和大医药公司通常进行长期和昂贵的优化程序以试图开发出非肽、有机化合物来模拟利用治疗肽所见的活性而不发生不可接受的副作用。举例来说，由昂贵SAR(结构-活性关系(Structure Activity Relationship))和分子模拟研究所产生的环状肽、肽模拟物和小分子已经致使开发出可惊人的肽模拟物。然而，这些肽模拟物决不反映治疗肽确切的原始生物学性质，并且因此次于作为治疗剂的内源治疗肽。
产生肽模拟物的替代是阻断肽酶作用从而阻止治疗肽的降解，或者修饰治疗肽使得减缓其降解而同时保留生物活性。所述方法包括与例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸的聚合物质结合，与硫酸adroitin结合，以及与多糖、低分子量化合物(例如氨基卵磷脂(aminolethicin))、脂肪酸、维生素B12和糖苷结合。一些方法包括与载体蛋白活体外结合。需要对治疗肽加以改进，致使阻止由添加聚合物质所引起的随机结合物产生和/或治疗活性降低。因此需要经保护以免于肽酶活性并且具有较长活体内作用持续时间并同时维持低毒性但仍保留修饰肽的治疗优势的改进治疗肽。
共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(简称为PEG)是一种增加水溶性、生物利用率，增加血清半衰期，增加治疗半哀期，调节免疫原性，调节生物活性或延长许多生物活性分子(包括蛋白、肽和特定疏水性分子)循环时间的方法。PEG已经广泛用于医药品、人工移植体和其它应用中，在这些应用中生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性是重要的。为了将PEG的所需特性最大化，连接于生物活性分子的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以能够赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加水溶性和增加循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
PEG衍生物通常经例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N端和碳水化合物部分的反应性化学官能团与生物活性分子相连接。蛋白与其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。最适合于经聚合物连接而进行修饰的位点通常在受体结合中起重要作用，并且是要保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上这些反应性位点的不加选择的连接通常导致经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人，(1996)，J.Biol.Chem.，271：21969-21977。为了形成具有足以对靶分子赋予所需优势的聚合物分子量的结合物，先前技术方法通常涉及许多聚合物臂与分子的随机连接，因而增加了母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
形成用于PEG衍生物与蛋白连接的基因座的反应性位点由蛋白结构决定。包括酶在内的蛋白由各种α氨基酸序列组成，其具有一般结构H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N--)结合邻近氨基酸的羧基部分(--COOH)以形成酰胺键，可由--(NH--CHR--CO)n--表示，其中下标“n”可以等于数百或数千。由R所示的片段可以含有用于蛋白生物活性和用于PEG衍生物连接的反应性位点。
举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在--NH2部分。ε位--NH2部分对于在碱性pH条件下的反应而言是游离的。大部分用PEG进行蛋白衍生化的领域的技术已经针对于开发PEG衍生物来用于连接存在于蛋白中的赖氨酸残基的ε位--NH2部分。″Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation″，Nektar MolecularEngineering Catalog，2003，第1-17页。所有这些PEG衍生物均具有一般限制，然而它们不能够被选择性地安置于蛋白表面上所存在的许多赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对于蛋白活性是重要的情况下，例如存在于酶活性位点中，或者在赖氨酸残基对介导蛋白与其它生物分子互作起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这会是一个显著限制。
现有蛋白PEG化方法的第二个且等同重要的复杂因素在于PEG衍生物还会与所需残基之外的残基发生不良副反应。组氨酸含有由结构--N(H)--所示的反应性亚氨基部分，但是许多与ε位--NH2反应的化学反应性物质也可与--N(H)--反应。同样，氨基酸半胱氨酸的侧链具有由结构-SH所示的游离巯基。在一些情况下，针对赖氨酸ε--NH2基团的PEG衍生物也可与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这会产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的、异源混合物，以及破坏靶生物分子活性的风险。需要开发允许化学官能团引入蛋白内的单个位点的PEG衍生物，从而能够使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白表面上明确定义并且可预测的特异性位点处的生物活性分子选择性偶联。
除了赖氨酸残基之外，所属领域中的大量工作是针对于开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N端)的活性PEG试剂。参看，例如美国专利第6,610,281号(其以引用的方式并入本文)和″Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation″，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。可以使用定点突变和所属领域中其它已知技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白结构中，且所得游离巯基部分可以与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，所述方法的复杂之处在于引入游离巯基会使所得蛋白的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有将化学官能团引入生物活性分子中的方法，以便能够使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白选择性偶联，而同时与巯基和其它通常发现于蛋白中的化学官能团相容(即不与其发生不良副反应)。
如所属领域中的取样结果可见，已经证实，所开发出的用于与蛋白的侧链连接，尤其是与赖氨酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分连接的这些衍生物中的许多在其合成与使用中存在问题。一些与遭受水解的蛋白形成不稳定键，并因而分解、降解或者在水环境中不稳定，例如在血流中。一些形成更稳定的键，但在形成键之前遭受水解，意味着PEG衍生物上的反应性基团可能在蛋白被连接之前就失活了。一些具有少许毒性，并因此较不适合在活体内使用。一些反应太慢而实际上不可用。一些因为连接于负责蛋白活性的位点而导致蛋白活性丧失。一些对其所连接的位点不具有特异性，这也可能导致所要活性丧失和结果的再现性缺乏。为了克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白相关的难题，已经开发出更为稳定的PEG衍生物(例如美国专利6,602,498，其以引用的方式并入本文)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应的PEG衍生物(例如美国专利6,610,281，其以引用的方式并入本文)。所属领域明确地需要在生理环境中呈化学惰性直至指定选择性反应以形成稳定化学键的PEG衍生物。
最近，已经报导一种蛋白科学中完全新型技术，其允诺克服许多与蛋白位点特异性修饰相关的限制。明确来说，已经将新组分添加于原核生物大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)(例如L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)和真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)(S.cerevisiae)(例如J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白生物合成机器中，使得能够将非遗传编码氨基酸活体内并入蛋白中。已经使用此方法有效且高保真地将许多具有新颖化学、物理或生物性质的新氨基酸(包括光亲和标记和光异构化氨基酸、酮氨基酸和糖基化氨基酸)响应于琥珀密码子TAG而并入大肠杆菌和酵母蛋白中。参看，例如J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin，& P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024；和L.Wang，& P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-10。这些研究已经证实，能够选择性地且常规地引入在蛋白中所未发现的、对在20个普通的遗传编码的氨基酸中的所有官能团呈化学惰性的且可用于有效地和选择性地反应以形成稳定共价键的化学官能团，例如酮基、炔基和叠氮部分。
将非遗传编码氨基酸并入蛋白中的能力允许引入能够有价值地替换天然发生官能团的化学官能团，所述天然发生官能团为例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等等。已知某些化学官能团对发现于20个普通的、遗传编码氨基酸中的官能团呈惰性，但可明确地且有效地反应以形成稳定键。举例来说，所属领域已知叠氮基和乙炔基在存在催化量铜的情况下在水条件中遭受Huisgen[3+2]环加成反应。参看，例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew. Chem.Int.Ed.41：2596-2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白结构中，能够引入对发现于蛋白中的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性、但可与乙炔部分平稳且有效地反应以形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮保留化学惰性和在存在其它蛋白侧链情况下和在生理条件下的非反应性。
本发明尤其致力于解决与生物合成多肽(BSP)的活性和产生相关的问题，同时也致力于具有改进生物性质或药理学性质(例如改进治疗半衰期)的BSP的产生。
发明内容
本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的生物合成肽(BSP)，其包括(但不限于)胰高血糖素基因衍生多肽，例如GLP-1、T-20多肽；膜融合抑制肽和肽YY肽。本发明可以使用具有治疗活性的任何BSP、其片段、类似物或变体。已经提供可用于本发明的BSP的许多实例。然而，所提供的列表并非详尽，并且决不限制可用于本发明的BSP的数目或类型。因此，可以根据本发明修饰并且治疗使用包括新颖BSP在内的任何BSP和/或产生自任何BSP的片段、类似物和变体。
在一些实施例中，BSP包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，BSP连接于连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，BSP与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它BSP连接。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物连接于第二多肽。在一些实施例中，第二多肽为BSP。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸经连接子连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸经生物可降解的连接子连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，生物可降解的连接子可用于形成包含BSP的前药。在所述前药方法的一个实例中，水溶性聚合物阻断GLP-1活性，并且连接子降解释放出活性GLP-1。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接子连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过聚(乙二醇)连接子或前药连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于血清白蛋白。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接子连接于血清白蛋白。在一些实施例中，连接子为聚(乙二醇)或前药。在一些实施例中，连接子为双裂解前药，其中步骤1为分子(例如白蛋白)的受控释放，并且步骤2为释放连接子或其部分的第二裂解。
在一些实施例中，BSP包含存在于BSP中两个氨基酸之间的分子内桥。在一些实施例中，BSP包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。两个桥残基中的一者可以为非天然编码氨基酸或天然编码氨基酸。非天然编码氨基酸可以通过连接子、聚合物或生物活性分子连接。
在一些实施例中，BSP包含至少两个连接于包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在BSP(例如GLP-1)中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端处)、羧基端添加或其任何组合处并入。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在GLP-1中的任何位置处并入，其包括(但不限于)如下残基：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、29I、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)或其任何组合。
在一些实施例中，在一个或一个以上的这些位置处的非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物，其包括(但不限于)GLP-1位置：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、29I、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)或其任何组合。
在一些实施例中，本发明的GLP-1多肽包含在一个或一个以上的以下位置处提供拮抗剂的非天然发生氨基酸：7、8、9、22、18、29、25、32、21、28、17、24、31、20或其任何组合。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在T-20多肽(包括TEX)中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端)、羧基端添加或其任何组合处并入。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在T-20(包括TEX)中的任何位置处并入，其包括(但不限于)如下残基：W631、D632、1635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651或其任何组合。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在肽YY中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端)、羧基端添加或其任何组合处并入。
在一些实施例中，BSP包含调节BSP与BSP受体或结合伴侣(包括(但不限于)蛋白、多肽、小分子或核酸)亲和力的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的稳定性相比时，增加BSP稳定性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的免疫原性相比时，调节BSP免疫原性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的血清半衰期或循环时间相比时，调节BSP血清半衰期或循环时间的替换、添加或缺失。
在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的水溶性相比时，增加BSP水溶性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的溶解性相比时，增加宿主细胞中所产生的BSP溶解性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的表达或合成相比时，增加宿主细胞中BSP表达或增加活体外合成的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的肽酶或蛋白酶易感性相比时，降低BSP的肽酶或蛋白酶易感性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP的信号转导活性相比时，调节BSP活性的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP与另一分子的结合相比时，调节其与另一分子的结合的替换、添加或缺失。在一些实施例中，BSP包含当与对应无替换、添加或缺失BSP结合后的结合伴侣构象或生物活性相比时，调节其结合伴侣的构象或一种或一种以上生物活性的替换、添加或缺失。
在一些实施例中，可以用天然发生或非天然发生氨基酸进行BSP中的氨基酸替换，其限制条件在于至少一个替换是用非天然编码氨基酸进行。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，多肽是BSP激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，BSP激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，BSP激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸和一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸存在于BSP的受体结合区内，或者干扰BSP的受体结合。在一些实施例中，连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸存在于BSP的结合于结合伴侣或者干扰结合伴侣与BSP结合的区内。
本发明也提供包含在严谨条件下与编码具有SEQ ID NO：1、2、3、21、22、23或24氨基酸序列的多肽的核苷酸序列杂交的分离核酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
本发明还提供制造连接于水溶性聚合物的BSP的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的经分离BSP与包含与非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入BSP中的非天然编码氨基酸对水溶性聚合物具反应性，所述水溶性聚合物对任何20种常见氨基酸不具反应性。在一些实施例中，并入BSP中的非天然编码氨基酸对连接子、聚合物或生物活性分子具反应性，所述连接子、聚合物或生物活性分子对任何20种常见氨基酸不具反应性。
在一些实施例中，通过使包含含羰基氨基酸的BSP与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的BSP。在一些实施例中，氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。
在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含含有氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的BSP反应来制造连接于水溶性聚合物的BSP。
在一些实施例中，通过使包含含炔氨基酸的BSP与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的BSP。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。
在一些实施例中，通过使包含含叠氮氨基酸的BSP与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应来制造连接于水溶性聚合物的BSP。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键连接于聚(乙二醇)分子。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为支链聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)支链聚合物的各分支具有1kDa与100kDa之间或1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，连接于BSP的水溶性聚合物包含聚烷撑二醇部分。在一些实施例中，并入BSP中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入BSP中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入BSP中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入BSP中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明也提供包含含有非天然编码氨基酸的BSP和医药学上可接受载剂的组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。
本发明还提供包含编码BSP且包含选择密码子的多聚核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含用以将非天然编码氨基酸替换至BSP中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制造包含非天然编码氨基酸的BSP的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许BSP表达的条件下培养包含编码BSP的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基纯化BSP。
本发明也提供增加BSP的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明也提供调节BSP免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸替换天然发生BSP中的任何一个或一个以上氨基酸，和/或将BSP连接于连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
本发明还提供用有效量的本发明BSP治疗需要此治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含对患者投与治疗有效量的包含含有非天然编码氨基酸的BSP和医药学上可接受载剂的医药组合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。
本发明还提供包含SEQ ID NO：1、2、3、21所示序列，或任何其它GLP-1多肽序列SEQ ID NO：22、24，或任何其它T-20多肽序列，或SEQ ID NO：23或任何其它肽YY序列的BSP，限制条件是至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸替换。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明还提供包含医药学上可接受的载剂和BSP的医药组合物，其中所述BSP包含SEQ ID NO：1、2、3、21所示序列，或任何其它GLP-1多肽序列SEQ ID NO：22、24，或任何其它T-20多肽序列，或SEQ ID NO：23或任何其它肽YY序列，其中至少一个氨基酸由非天然编码氨基酸替换。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物经糖部分连接于多肽。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子经糖部分连接于BSP。
本发明还提供包含经共价键连接于BSP的单个氨基酸处的水溶性聚合物的BSP。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，共价连接于水溶性聚合物的氨基酸为存在于多肽中的非天然编码氨基酸。
本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的BSP，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入多肽的非天然编码氨基酸的官能团连接于多肽。在一些实施例中，BSP经单PEG化。本发明也提供包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的BSP，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入多肽中的预选位点处。
在另一实施例中，由于用于与非天然氨基酸结合的独特化学反应，因此包含一个或一个以上非天然发生氨基酸的BSP与另一分子(包括(但不限于)PEG)的结合提供实质上纯的BSP。可以执行包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的BSP与另一分子(例如PEG)的结合，而同时在结合步骤之前或之后实施其它纯化技术，以提供实质上纯的BSP。
本发明也提供包含式(LT)-P-T′的多肽，其中(LT)选自由定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)与标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在组成的群组；P包含BSP序列；且T′包含标签或连接子或不存在，其中L、T、P或T′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。本发明也提供包含式F-(LT)-P-T′-F′的多肽，其中F包含多肽序列或不存在；(LT)选自由定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)与标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在组成的群组；P包含具有多达100个氨基酸的所需多肽序列且不同于F或F′；T′包含标签或连接子或不存在，F′包含多肽序列或不存在，其中F、L、T、P、T′或F′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。P可以进一步包含含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的BSP。
本发明也提供包含经操作连接于多肽编码序列的启动子序列的核酸分子，其中所述多肽编码序列具有式(WX)-Z，其中(WX)选自由以下组成的群组：编码定位肽(W)的核苷酸序列、编码标签或连接子(X)的核苷酸序列、任何次序的编码定位肽(W)的核苷酸序列与编码标签或连接子(X)的核苷酸序列，和不存在，且Z包含编码所需BSP的核苷酸序列，其中所述编码W、X或Z的核苷酸序列包含选择密码子。核酸分子可以进一步包含经操作连接于Z的-Y′，其中Y′包含编码标签的核苷酸序列，其中所述编码所述标签的核苷酸序列视情况包含选择密码子。本发明也提供一种方法，所述方法包含：a)在重组宿主细胞中产生包含式(LT)-P-T′的多肽，其中(LT)选自由定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)与标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在组成的群组；P包含BSP序列；且T′包含标签或连接子或不存在，其中L、T、P或T′包含一个或一个以上具有确定在所选条件下裂解一个或一个以上肽键的官能团的非天然编码氨基酸；b)在所选条件下使多肽反应一定时间使得足以至少部分裂解一个或一个以上肽键；和c)从反应产物回收包含P的肽。
本发明也涵盖用于使有此需要的哺乳动物中血液葡萄糖含量达到正常的方法，所述方法包含投与治疗有效量的GLP-1多肽。本发明也涵盖用于调节有此需要的哺乳动物中病毒含量的方法，所述方法包含投与治疗有效量的T-20多肽。本发明也涵盖包含对有此需要的哺乳动物投与治疗有效量PYY多肽的方法。
附图说明
图1显示包含GLP-1-Fc融合蛋白的GLP-1二聚多肽。
图2显示GLP-1与Exendin-4的螺旋比较。
图3显示GLP-1与Exendin-4的结构比较。
图4显示设计Exendin或GLP-1类似物的策略。
图5显示设计具有特定结构特征的GLP-1类似物的策略。
图6显示设计具有分子内桥的GLP-1多肽的策略。
图7显示用于在GLP-1中分子内桥接的可能化学策略。
图8显示用于GLP-1表达的构建体。
图9显示用于将非天然编码氨基酸并入T-20和TEX中的构建体(图9，A)。图9，B显示CNBr裂解之前和之后的T-20多肽。
图10显示野生型T-20与TEX序列的比较，并且用星号标出由经琥珀密码子替换的密码子所编码的残基。
图11显示用于测试T-20和TEX抗病毒活性的活体外融合测定。
图12显示T20 651抑制(图12，A)和TEX 636抑制(图12，B)的考马斯染色聚丙烯酰胺凝胶。图12的C和D显示A和B中所示样品的Western(抗His)。图12的E显示T-20(T-20-Mut651)和TEX(TEX-Mut636)中带有星号的经对乙酰基-苯丙氨酸替换的残基。
具体实施方式
定义
应了解，本发明并不限于本文所述的特定方法、实验方案、细胞系、构建体和试剂，且因此可以变化。也应了解，本文所用术语仅是用于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明的保护范围，本发明的保护范围仅由所附的权利要求书限定。
除非本文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”和“所述”包括复数形式。因此，例如提及“BSP”或“GLP-1”、“T-20”或“PYY”是指一个或一个以上的所述多肽，并且包括所属领域技术人员所已知的它的均等物，等等。
除非另外定义，否则本文所用的所有科技术语均具有与本方面所属领域技术人员所一般理解的相同含义。尽管在本发明的实施或检验中可以使用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料，但是现在描述优选方法、装置和材料。
本文所提及的所有公开案和专利均引入本文用作参考，以用于描述和公开(例如)公开案中所述的可能与本发明相关使用的构建体和方法。仅提供本文所讨论的公开案在本申请案申请日之前的公开内容。本文决不应解释为准许本发明者无权借助先前发明或为任何其它原因提前本发明。
“生物合成多肽”或“BSP”是指由具有选择密码子的mRNA所产生的通过肽键共价连接的约100或更少氨基酸残基的聚合物。BSP包括(但不限于)“GLP-1”、“T-20”和“PYY”以及“GLP-1多肽”、“T-20多肽”和“PYY多肽”。BSP可以为大于约100个氨基酸长度的聚合物片段，并且可以包括或不包括其它氨基酸，例如(但不限于)前导序列或分泌信号序列。
针对“多肽”的描述同样适用于描述“肽”，且反之亦然。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”适用于天然发生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。所属领域技术人员应了解，关于蛋白的技术和修饰可用于多肽和肽，且因此可用于BSP。
术语“实质上纯的”是指实质上或基本上不含通常伴随于天然发生环境中(即，天然细胞或在重组产生BSP的情况下为宿主细胞)发现的蛋白或与所述蛋白互作的组分的BSP。可以实质上不含细胞物质的BSP包括具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(以干重量计)污染蛋白的蛋白制剂。当通过宿主细胞重组产生BSP或其变体时，此污染蛋白可以约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少的细胞干重存在。当通过宿主细胞重组产生BSP或其变体时，培养基中可存在约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少的细胞干重的污染蛋白。因此，如通过例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法测定，由本发明的方法所产生的“实质上纯的”BSP可以具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度，尤其是至少约75％、80％、85％的纯度，且更具体来说至少约90％的纯度，至少约95％的纯度，至少约99％或更高的纯度。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指无论使用何种插入方法(例如，直接摄取、转导、f配合(f-mating)或所属领域已知用于建立重组宿主细胞的其它技术)而包括外源多聚核苷酸的细胞。外源多聚核苷酸可以维持为非整合载体(例如质粒)，或者可整合至宿主基因组中。
如本文所用术语“介质”包括任何培养基、溶液、固体、半固体或可支撑或含有任何宿主细胞的刚性支撑物，所述任何宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌和细胞内容物。因此，所述术语可以涵盖宿主细胞所生长的介质，例如BSP所分泌于其中的介质，包括增殖步骤之前或之后的介质。所述术语也涵盖含有宿主细胞溶解液的缓冲液或试剂，例如在BSP于细胞内产生和宿主细胞被溶解或破坏而释放出BSP的情况下。
如本文关于蛋白重新折叠(protein refolding)所用的“还原剂”定义为维持还原状态的巯基并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。所属领域技术人员轻易地了解许多还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文关于蛋白重新折叠所用的“氧化剂”定义为能够从被氧化的化合物移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤苏糖醇(erythreitol)和氧气。所属领域技术人员轻易地了解许多氧化剂适用于本发明的方法中。
如本文所用“变性剂(denaturing agent或denaturant)”定义为可引起多肽可逆打开的任何化合物或物质。可以通过特定变性剂的性质和浓度来确定变性剂的强度。合适的变性剂可以是离液剂、去污剂、有机溶剂、与水混溶的溶剂、磷脂或两种或两种以上这些试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。可用的去污剂可以包括(但不限于)强去污剂，例如十二烷基硫酸钠和聚氧乙烯醚类(例如Tween或Triton去污剂)，N-十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)；温和非离子去污剂(例如洋地黄皂甙(digitonin))；温和阳离子去污剂，例如N-＞2，3-(二油酰氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子去污剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子去污剂，包括(但不限于)含磺基甜菜碱类(sulfobetaine)(Zwittergent)、3-(3-胆酰胺丙基)二甲基胺-1-丙硫酸盐(3-(3-chlolamidopropyl)dimethylammonio-1-propane sulfate，CHAPS)和3-(3-胆酰胺丙基)二甲基胺-2-羟基-1-丙磺酸盐(3-(3-chlolamidopropyl)dimethylammonio-2-hydroxy-1-propane sulfonate，CHAPSO)。可以将与水混溶的有机溶剂，例如乙腈、较低碳数烷醇(尤其是C2-C4烷醇，例如乙醇或异丙醇)或较低碳数烷二醇(尤其是C2-C4烷二醇，例如乙二醇)用作变性剂。可用于本发明的磷脂可以是天然发生磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇或合成磷脂衍生物或变体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文所用“重新折叠(refolding)”描述将含有二硫键的多肽从不恰当折叠状态或打开状态转化成关于二硫键的天然或恰当折叠构象的任何过程、反应或方法。
如本文所用“共折叠”具体是指采用至少两个相互作用的多肽且导致打开或不恰当折叠多肽转化成天然、恰当折叠多肽的重新折叠过程、反应或方法。
如本文所用“胰高血糖素样肽1”或“GLP-1”应包括具有至少一种人GLP-1生物活性的多肽和蛋白，其包括(但不限于)描述于以下文献中的多肽和蛋白：美国专利公开案第20040127412号、EP 0699686-A2和EP0733,644；美国专利第5,545,618号、第5118,666号、第5,512,549号；WO 91/11457；WO 90/11296；WO 87/06941，其以引用的方式并入本文；以及其GLP-1类似物、GLP-1异型体(isoform)、GLP-1模拟物、GLP-1片段、杂合GLP-1蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、同系物、糖基化类型配体和突变型蛋白，而无论其生物活性如何且进一步无论其合成或制造方法如何，包括(但不限于)重组(无论是从cDNA、基因组DNA、合成DNA产生或是从其它形式核酸产生)、合成、转基因和基因激活法。许多GLP-1类似物和衍生物是已知的，并且本文中称为“GLP-1化合物”。所述GLP-1类似物包括Exendin，其为发现于希拉毒蜥(GILA-monster)毒液中的肽。GLP-1的具体实例包括(但不限于)GLP-1(3-36)、GLP-1(3-37)、GLP-1(1-45)和Exendin 1至4。此外，能够通过使用重组DNA技术获得GLP-1，如Maniatis，T.等人，Molecular Biology：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)中所公开，并且通过所属领域技术人员所已知的方法在宿主细胞中产生GLP-1。
术语“人GLP-1(GLP-1)”或“GLP-1多肽”是指如本文所述的GLP-1，以及保留天然发生GLP-1的至少一种生物活性的多肽。GLP-1多肽也包括天然发生人GLP-1的医药学上可接受的盐和前药、盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体，以及天然发生人GLP-1的激动剂、模拟物和拮抗剂变体、exendin家族(包括exendin 1至4)及其多肽融合体。GLP-1多肽的实例包括(但不限于)描述于美国专利第5,118,666号中的多肽，此专利以引用的方式并入本文。术语“GLP-1多肽”涵盖在氨基端、羧基端或两者处包含其它氨基酸的融合体。示范性融合体包括(但不限于)例如甲硫氨酰基GLP-1(其中蛋氨酸连接于由GLP-1重组表达所产生的GLP-1的N端)、纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和抗原决定基)、与血清白蛋白结合肽的融合体、与血清蛋白(例如血清白蛋白)的融合体、与免疫球蛋白分子(例如Fc)的恒定区的融合体和与脂肪酸的融合体。各种形式的天然发生GLP-1核酸和氨基酸序列已知为变体，例如单个氨基酸变体或剪接变体。
术语“GLP-1多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸替换、添加或缺失的GLP-1多肽。已经描述天然发生GLP-1中多个氨基酸位置中的示范性替换，其包括(但不限于)调节GLP-1的一种或一种以上生物活性的替换，例如(但不限于)激动剂活性增加、多肽溶解性增加、将多肽转化成拮抗剂、肽酶或蛋白酶易感性降低等等，并且由术语“GLP-1多肽”所涵盖。
人GLP-1拮抗剂包括(但不限于)在以下位置处替换的拮抗剂：7、8、9、22、18、29、25、32、21、28、17、24、31和20(SEQ ID NO：1、2、3、21或任何其它GLP-1序列)。在一些实施例中，GLP-1拮抗剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸，所述水溶性聚合物存在于GLP-1分子的受体结合区中。在一些实施例中，水溶性聚合物偶联于GLP-1多肽的以下一个或一个以上氨基酸位置处：7、8、9、22、18、29、25、32、21、28、17、24、31和20(SEQ ID NO：1、2、3、21或任何其它GLP-1多肽)。
关于GLP-1氨基酸序列以及exendin-4和exendin-3氨基酸序列请分别参看本文SEQID NO：1(GLP-1(7-36))、SEQ ID NO：2(GLP-1(7-37))、SEQ ID NO：3(exendin-4)和SEQ ID NO：21(exendin-3)。在一些实施例中，本发明的GLP-1多肽实质上与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：21或任何其他GLP-1多肽序列相同。编码GLP-1突变体和突变GLP-1多肽的核酸分子已熟知。GLP-1突变体的实例包括描述于美国专利公开案第20040127412A1号中的突变体，此专利以引用的方式并入本文。
许多GLP-1制品(包括GLP-1肽类似物、结合物、融合蛋白和药物传送或组合疗法)处于临床前和临床开发中。一些在开发中的制品为Exenatide(AC2993，Amylin/EliLilly)、AVE-0010(ZP10，Zealand Pharm/Aventis)、BIM-51077(Ipsen/Roche)、Liraglutide(NN2211，Novo Nordisk)、CJC-1131(Conjuchem)、Albugon(Human GenomeSciences/Glaxo Smith Kline)、GLP-1转铁蛋白(transferrin)(Biorexis)、AC2993 LAR(Amylin/Alkermes)、GLP-1鼻喷雾(GLP-1 nasal)(Suntory)和GLP-1-INT(TransitionTherapeutics)。
已经公开GLP-1的生物活性且为所属技术领域已知，并且可参看(例如)美国专利公开案第20040082507A1号和第20040232754A1号中，其以引用的方式并入本文。
也已经公开GLP-1(7-37)的变体及其类似物。这些变体和类似物包括(例如)Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、乙酰基-Lys9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys8-GLP-1(7-37)、Lys18-GLP-1(7-37)等等及其衍生物，包括(例如)酸加成盐、羧酸盐、较低碳数烷基酯和酰胺[参看，例如WO 91/11457、EP0733,644(1996)和美国专利第5,512,549(1996)号，其以引用的方式并入本文]。一般来说，已知各种所公开形式的GLP-1刺激胰岛素分泌(促胰岛素作用)和cAMP形成[参看，例如Mojsov，S.，Int.J.Peptide Protein Research，40：333-343(1992)]。
如本文所用“T-20”或“DP-178”应当包括具有人DP-178的至少一种生物活性的多肽和蛋白，以及DP-178类似物、DP-178异型体、DP-178模拟物、DP-178片段、杂合DP-178蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、同系物、糖基化类型变体及其突变型蛋白，而无论其生物活性如何且进一步无论其合成或制造方法如何，所述方法包括(但不限于)重组(无论产自cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式核酸)、合成、转基因和基因激活法。带有连字符号和不带连字符号形式(T20，DP 178)的术语是等同的。
术语“人DP-178”或“DP-178多肽”是指本文所述的DP-178或T-20，以及保留天然发生DP-178的至少一种生物活性的多肽。“DP-178”包括DP-178的部分、类似物和同系物，所有这些均展示抗病毒活性。抗病毒活性包括(但不限于)对HIV传播至未受感染CD-4+细胞的抑制。此外，本发明涉及DP-178和DP-178片段和/或类似物或同系物作为在人类和非人类中逆转录病毒(尤其是HIV)传播至未受感染细胞的抑制剂的用途。传播可以受本发明的肽抑制的非逆转录病毒包括(但不限于)包膜病毒、人类呼吸道合胞病毒、犬瘟热病毒(canine distemper virus)、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、人类副流感病毒和流感病毒。
DP-178多肽也包括天然发生人类DP-178的医药学上可接受的盐和前药、和盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体以及天然发生人类DP-178的激动剂、模拟物和拮抗剂变体及其多肽融合体。术语“DP-178多肽”涵盖在氨基端、羧基端或两者处包含其它氨基酸的融合体。示范性融合体包括(但不限于)例如甲硫氨酰基DP-178(其中蛋氨酸连接于由DP-178重组表达所产生的DP-178的N端)、用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和抗原决定基)、N端延长的T-20、与血清白蛋白结合肽的融合体、与血清蛋白(例如血清白蛋白)的融合体、与免疫球蛋白分子(例如Fc)的恒定区的融合体和与脂肪酸的融合体。天然发生DP-178核酸和氨基酸序列已知为变体，例如单个氨基酸变体或剪接变体。
术语“DP-178多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸替换、添加或缺失的D-178多肽。已经描述天然发生DP-178中多个氨基酸位置中的示范性替换，其包括(但不限于)调节DP-178中一种或一种以上生物活性的替换，例如(但不限于)激动剂活性增加、多肽溶解性增加、将多肽转化成拮抗剂、肽酶或蛋白酶易感性降低等等，并且由术语“DP-178多肽”所涵盖。
关于DP-178氨基酸序列请分别参看本文SEQ ID NO：22。在一些实施例中，本发明的DP-178多肽实质上与SEQ ID NO：22、24或任何其它DP-178多肽序列相同。编码DP-178突变体和突变DP-178多肽的核酸分子已熟知。
市售形式DP-178为
(恩夫韦地(enfuvirtide)，Roche Laboratories Inc.和Trimeris，Inc.)。
具有乙酰化N端和氨甲酰C端。其与尽管进行抗逆转录病毒疗法但仍展示HIV-1复制的HIV-1患者中的抗病毒素结合使用。
如本文所用“PYY”或“肽YY”应当包括具有人PYY的至少一种生物活性的多肽和蛋白，以及PYY类似物、PYY异型体、PYY模拟物、PYY片段、杂合PYY蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、同系物、糖基化类型变体及其突变型蛋白，而无论其生物活性如何且进一步无论其合成或制造方法如何，所述方法包括(但不限于)重组(无论产自cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式核酸)、合成、转基因和基因激活法。
术语“PYY”或“PYY多肽”是指如本文所述的PYY以及保留天然发生PYY的至少一种生物活性的多肽。“PYY”包括PYY的部分、类似物和同系物，包括(但不限于)PYY(3-36)、全长PYY、PYY(22-36)和PYY的DPPIV抗性变体。术语“PYY”包括国际公开案第WO 02/47712号(美国专利公开案第2002/0141985号的PCT对应案，其以引用的方式并入本文)和Tatemoto，Proc Natl Acad Sci U.S.A.79：2514-8，1982(以引用的方式并入本文)中SEQ ID NO：2所述的两个人全长36氨基酸肽。
术语“PYY”也包括PYY激动剂。PYY激动剂包括引起PYY降低营养利用率的作用的任何化合物，例如以下化合物：(1)在WO 02/47712的实例1、2、5或6和美国专利公开案第2002/0141985号中所述的食物摄取、胃排空、胰腺分泌或失重测定中具有活性的化合物，和(2)在Y受体测定中(WO 02/47712中的实例10和美国专利公开案第2002/0141985号)或在竞争性结合测定中与来自于具有丰富Y受体的某些组织(包括例如最后区(area postrema))的经标记PYY或PYY[3-36](WO 02/47712中的实例9和美国专利公开案第2002/0141985号)特异性结合的化合物，其中PYY激动剂不是胰多肽。PYY激动剂优选在所述测定中以大于约1pM的亲和力且更为优选以大于约1至约5nM的亲和力结合。
所述激动剂可以包含具有功能性PYY域的多肽、PYY的活性片段或化学或小分子。PYY激动剂可以是肽或非肽化合物，并且包括“PYY激动剂类似物”，所述“PYY激动剂类似物”是指与通常经由结合PYY受体或其它受体或者另外直接或间接与PYY受体或其它受体互作而具有PYY活性的与PYY结构相似的任何化合物，其中PYY自身可以与所述PYY受体或其它受体互作以产生生物反应。所述化合物包括PYY衍生物、PYY片段、具有多于36个氨基酸的延长PYY分子、具有小于36个氨基酸的截短型PYY分子和具有一个或一个以上不同氨基酸的经取代PYY分子或上述的任何组合。也可以通过以下方法修饰所述化合物，例如PEG化、酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。
一种所述PYY激动剂类似物为WO 02/47712和美国专利公开案第2002/0141985号、Eberlein，Eysselein等人，Peptides 10：797-803(1989)和Grandy，Schimiczek等人，RegulPept 51：151-9(1994)中识别为SEQ ID NO：3的PYY[3-36]。其它PYY片段、类似物和衍生物描述于美国专利公开案20050002927中。所有上文所引用的专利公开案均以引用的方式并入本文。
PYY多肽也包括天然发生人PYY的医药学上可接受的盐和前药、和盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体以及天然发生人PYY的激动剂、模拟物和拮抗剂变体及其多肽融合体。术语“PYY多肽”涵盖在氨基端、羧基端或两者处包含其它氨基酸的融合体。示范性融合体包括(但不限于)例如甲硫氨酰基PYY(其中蛋氨酸连接于由缺乏分泌信号肽或其部分的PYY重组表达所产生的PYY的N端)、用于纯化目的的融合体(包括(但不限于)多聚组氨酸或亲和抗原决定基)、与血清白蛋白结合肽的融合体、与血清蛋白(例如血清白蛋白)的融合体、与免疫球蛋白分子(例如Fc)的恒定区的融合体和与脂肪酸的融合体。天然发生PYY核酸和氨基酸序列已知为变体，例如单个氨基酸变体或剪接变体。
术语“PYY多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸替换、添加或缺失的PYY多肽。已经描述天然发生PYY中多个氨基酸位置中的示范性替换，其包括(但不限于)调节PYY的一种或一种以上生物活性的替换，例如(但不限于)激动剂活性增加、多肽溶解性增加、将多肽转化成拮抗剂、肽酶或蛋白酶易感性降低等等，并且由术语“PYY多肽”所涵盖。
关于PYY(3-36)氨基酸序列请分别参看本文SEQ ID NO：23。在一些实施例中，本发明的PYY多肽实质上与SEQ ID NO：23或任何其它PYY多肽序列相同。编码PYY突变体和突变PYY多肽的核酸分子已熟知。
各种参考文献公开通过聚合物结合或糖基化作用进行多肽修饰。术语BSP包括结合于聚合物(例如PEG)的多肽，并且包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一个或一个以上其它衍生化作用。此外，BSP可以包含连接子或聚合物，其中连接于连接子或聚合物的氨基酸可以为根据本发明的非天然氨基酸，或者可以采用所属技术领域的已知技术结合于天然编码氨基酸，例如偶联于赖氨酸或半胱氨酸。
已经报导多肽的聚合物修饰。美国专利第4,904,584号公开了经PEG化的缺失赖氨酸的多肽，其中缺失至少一个赖氨酸残基，或者经任何其它氨基酸残基替换。WO99/67291公开一种将蛋白与PEG结合的方法，其中缺失蛋白上的至少一个氨基酸残基，并且所述蛋白在足以达到与蛋白结合的条件下接触PEG。WO 99/03887公开了属于生长激素超家族的多肽的PEG化变体，其中用位于多肽特定区域的非必需氨基酸残基替换半胱氨酸残基。WO 00/26354公开用于制造与包含至少一个其它糖基化位点的对应母体多肽相比，具有低过敏原性的糖基化多肽的方法。美国专利第5,218,092号公开粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽的修饰，与天然多肽相比得以引入至少一个其它碳水化合物链。PEG化肽的实例包括GW395058，PEG化肽血小板生成素受体(thrombopoietinreceptor，TPOr)激动剂(de Serres M.等人，Stem Cells.1999；17(4)：203-9)和生长激素释放因子的PEG化类似物(PEG-GRP)(D′Antonio M等人Growth Horm IGF Res.2004年6月；14(3)：226-34)。
术语BSP也包括糖基化BSP，例如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的BSP、经N连接或O连接糖基化形式的多肽。也将含有单核苷酸改变的变体视为BSP的生物活性变体。此外，也包括剪接变体。术语BSP也包括任何一个或一个以上BSP的BSP异源二聚体、同源二聚体、异源多聚体或同源多聚体或任何其它多肽、蛋白、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或其它任何类型的生物活性分子(通过化学方法连接或表达为融合蛋白)，以及含有(例如)特定缺失或其它修饰但仍保留生物活性的多肽类似物。
各种参考文献公开其它GLP-1变体和GLP-1酰化，其包括(但不限于)J.of Med.Chem.(2000)43：1664-1669中所述的GLP-1母体类似物和酰化位点，此参考案以引用的方式并入本文。
除非另外说明，否则本文所述GLP-1中的氨基酸位置均基于SEQ ID NO：1、2、3或21中的位置。所述领域技术人员应了解，可以轻易地确定任何其它GLP-1分子(例如GLP-1融合体、变体、片段等等)中对应于SEQ ID NO：1、2、3、21或任何其它GLP-1序列中的氨基酸位置。举例来说，通过视觉观察法或计算机程序(例如BLAST)的序列比对可用于比对和确定蛋白中符合SEQ ID NO：1、2、3、21或其它GLP-1序列中位置的特定位置。可以对SEQ ID NO：22、24和任何其它DP-178序列或SEQ ID NO：23(PYY(3-36))和任何其它PYY序列进行相似分析。本文关于SEQ ID NO：1、2、3、21或其它GLP-1序列、SEQ ID NO：22、24或其它DP-178序列或SEQ ID NO：23和任何其它PYY序列所述的氨基酸替换、缺失或添加也指本文所述或所属技术领域已知的GLP-1、DP-178或PYY融合体、变体、片段等等中对应位置的替换、缺失或添加，并且明确地由本发明涵盖。
术语BSP涵盖包含一个或一个以上氨基酸替换、添加或缺失的BSP多肽。本发明的BSP可以包含用一个或一个以上天然氨基酸的修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已经描述天然发生BSP中多个氨基酸位置中的示范性替换，其包括(但不限于)调节BSP中一种或一种以上生物活性的替换，例如(但不限于)激动剂活性增加、多肽溶解性增加、将多肽转化成拮抗剂、肽酶或蛋白酶易感性降低等等，并且由术语BSP所涵盖。
人GLP-1拮抗剂包括(但不限于)在以下位置处替换的拮抗剂：19、23、26、27、28、29、30和33(SEQ ID NO：1、2、3、21或任何其它GLP-1序列)。在一些实施例中，GLP-1拮抗剂包含连接于存在于GLP-1分子的受体结合区中的水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物在以下一个或一个以上氨基酸位置处偶联于GLP-1多肽：19、23、26、27、30和33(SEQ ID NO：1、2、3、21或任何其它GLP-1多肽)。
在一些实施例中，BSP进一步包含调节BSP生物活性的添加、替换或缺失。举例来说，添加、替换或缺失可以调节BSP的一种或一种以上性质或活性。举例来说，添加、替换或缺失可以调节与BSP受体或结合伴侣的亲和力，调节(包括(但不限于)增加或减少)受体二聚化，稳定受体二聚体，调节结合伴侣的构象或者一种或一种以上生物活性，调节治疗半衰期，调节多肽稳定性，调节由肽酶或蛋白酶的裂解，调节剂量，调节释放或生物利用率，促进纯化，或者改进或改变特定投药途径。类似地，BSP可以包含蛋白酶裂解序列、反应基团、抗原结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等等)或改进检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它多肽特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
术语BSP也涵盖经连接的BSP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体，包括(但不限于)直接经非天然编码氨基酸侧链连接于相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、连接于天然编码氨基酸侧链或间接经连接子连接的那些。示范性连接子包括(但不限于)小有机化合物、各种长度的水溶性聚合物，例如聚乙二醇或聚葡萄糖，或各种长度的多肽。
“非天然编码氨基酸”是指并非20种普通氨基酸或焦赖氨酸(pyrolysine)或硒半胱氨酸(selenocysteine)中之一种的氨基酸。其它可以与术语“非天然编码氨基酸”同义地使用的术语是“非天然氨基酸(non-natural amino acid)”、“非天然氨基酸(unnaturalamino acid)”、“非天然发生氨基酸”和其各种带有连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸)但自身并非通过翻译复合物天然并入生长中多肽链中所发生的氨基酸。所述非天然发生氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰氨基葡萄糖基-L-丝氨酸(N-acetylglucosaminyl-L-serine)、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
“氨基端修饰基”是指可以连接于多肽氨基端的任何分子。相似地，“羧基端修饰基”是指可以连接于多肽羧基端的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白(例如血清白蛋白)、免疫球蛋白恒定区部分(例如Fc)或其它增加肽的血清半衰期的部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活性基团”、“离去基团”、“反应位点”、“化学反应基”和“化学反应部分”用于所属技术领域和本文中，是指分子独特的、可定义的部分或单元。所述术语在化学领域有时是同义的，且在本文中用来表示执行一些功能或活性并且具有与其它分子的反应性的分子部分。
本文所用术语“键(linkage)”或“连接子(linker)”是指由于化学反应而通常所形成的并且通常为共价键的基团或键(bond)。水解稳定键是指键在水中实质上稳定，且在可用pH值下不与水反应，其包括(但不限于)长时间在生理条件下，可能甚至是无限长。水解不稳定或可降解键是指所述键在水或水性溶液中(例如血液)可降解。酶不稳定或可降解的键是指所述键可以由一种或一种以上的酶降解。如所属技术领域所了解，PEG和相关性聚合物可以在聚合物骨架或连接基团中在聚合物骨架与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间可以包括可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上的醇基团之间反应所形成的酯键通常在生理条件下水解从而释放试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)羧酸酯键；由胺与醛反应所生成的亚胺键；醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；为酰肼与醛反应产物的腙键；为醛与醇反应产物的缩醛键；为甲酸酯与醇反应产物的原酸酯键；由胺基(包括(但不限于)在例如PEG的聚合物的末端)与肽的羧基所形成的肽键；和由亚磷酰胺基(包括(但不限于)在聚合物的末端)与寡核苷酸5′羟基所形成的寡核苷酸键。
本文所用术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”是指能够影响生物系统、途径、分子或涉及生物体(包括(但不限于)病毒、细菌、细菌噬菌体、转座子、朊病毒(prion)、昆虫、真菌、植物、动物和人类)的互作的任何物理或生物化学性质的任何物质。具体来说，如本文所用生物活性分子包括(但不限于)用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物体内疾病或者另外增强人类或动物体身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白、酶、小分子药物、硬药物(hard drug)、软药物(soft drug)、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒(microparticle)和微胞(micell)。适于结合本发明使用的生物活性剂种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显象剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、抗炎性剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物衍生毒素等等。
“双官能聚合物”是指包含两个不连续官能团的聚合物，这两个不连续官能团能够特异地与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价或非共价键。可以使用其中一个官能团可与特定生物活性组分上的基团反应而另一个官能团可与第二生物组分上的基团反应的双官能连接子，来形成包括第一生物活性组分、双官能连接子和第二生物活性组分的结合物。用于将各种化合物连接于肽的许多过程和连接子分子为已知。参看，例如欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号，其均以引用的方式并入本文。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上不连续官能团的聚合物，所属两个或两个以上不连续官能团能够特异地与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)反应以形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可以具有任何所需分子长度或分子量，并且可以经选择以提供一个或一个以上连接于BSP及其结合伴侣或BSP的分子间的所需间距或构象。
当取代基由其常规化学式从左到右书写而指定时，同样涵盖可以自从右到左所书写结构所得到的化学性质相同的取代基，例如结构-CH2O-等同于结构-OCH2-。
术语“取代基”包括(但不限于)“非干扰取代基”。“非干扰取代基”是指那些产生稳定化合物的取代基。合适的非干扰取代基或基团包括(但不限于)卤素、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚硫酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1至8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O--(C1-C10烷基)、--OH、--SO2、＝S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)--CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m为1至8)、--C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2，其盐等等。如本文所用各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另外说明，否则自身或作为另一取代基部分的术语“烷基”表示直链或带分枝的链或环状烃基，或其组合，这些基团可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的，并且可以包括具有所指碳原子数(即C1-C10表示一至十个碳)的二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是指具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和较高碳数同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”也包括下文更加详细定义的烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基命名为“高烷基(homoalkyl)”。
自身或作为另一取代基部分的术语“亚烷基”表示来源于烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，并且另外包括如下文所述“杂亚烷基”的基团。烷基(或亚烷基)通常具有1至24个碳原子，那些具有10个或更少碳原子的基团在本发明中是首选。“较低碳数烷基”或“较低碳数亚烷基”是通常具有八个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，并且分别是指经氧原子、氨基或硫原子连接于分子剩余部分的烷基。
除非另外说明，否则单独或与其它术语组合使用的术语“杂烷基”表示由所述数目碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成群组的杂原子组成(其中氮和硫原子可以视情况经氧化而氮杂原子可以视情况经季铵化)的稳定直链或具有分枝的链或环状烃基。杂原子O、N、S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置处，或者位于烷基连接于分子剩余部分处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一取代基部分的术语“杂亚烷基”表示来源于杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基来说，相同或不同杂原子也可以占据任一链末端或两端(包括(但不限于)亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等等)。此外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基来说，连接基化学式所书写的方向并不表示连接基的定向。举例来说，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。
除非另外说明，否则自身或在与其它术语组合中的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示环状形式的“烷基”和“杂烷基”。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和与不饱和环键。此外，对于杂环烷基来说，杂原子可以占据杂环连接于分子剩余部分的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。此外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，自身或作为另一取代基部分的术语“亚杂环烷基”表示来源于杂环烷基的二价基团，而自身或作为另一取代基部分的术语“亚环烷基”表示来源于环烷基的二价基团。
如本文所用术语“水溶性聚合物”是指任何在水溶液中可溶的聚合物。水溶性聚合物与BSP的键合可以产生以下改变，包括(但不限于)相对于未经修饰形式而言，增加或调节血清半衰期，或者增加或调节治疗半衰期，调节免疫原性，调节物理缔合特征(例如聚集和多聚体形成)，改变受体结合和改表受体二聚化或多聚化作用。水溶性聚合物可以具有或不具有自身生物活性，且可以用作连接子以连接BSP与其它物质，包括(但不限于)一个或一个以上BSP、一个或一个以上生物活性分子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号，其以引用的方式并入本文)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚-顺丁烯二酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧基化多元醇、肝磷脂、肝磷脂片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷撑二醇及其衍生物、聚烷撑二醇与其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等等或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文所用术语“聚烷撑二醇”“聚(烷撑二醇)”是指聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇及其衍生物。术语“聚烷撑二醇”涵盖直链和支链聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它示范性实施例列于商业厂商目录中，例如Shearwater Corporation的目录″Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications″(2001)。
除非另外说明，否则术语“芳基”表示可以是单环或稠合于一起或共价连接的多环(优选为1至3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有一至四个选择N、O和S的杂原子的芳基(芳环)，其中氮原子和硫原子视情况经氧化，而氮原子视情况经季铵化。杂芳基可以经杂原子连接于分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。各上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受取代基的群组。
简单地说，当与其它术语组合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)时，术语“芳基”包括上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”包括其中芳基连接于烷基的那些基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，包括其中碳原子经(例如)氧原子置换的烷基(包括(但不限于)亚甲基)，包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等。
各上述术语(包括(但不限于“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”))包括经取代和未经取代形式的所述基团。各类基团的示范性取代基于下文提供。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自以下多种基团中的一者或一者以上：0至(2m′+1)数目的-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R′″、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R5、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)N″R′″、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R′″)＝NR′″、-NR-C(NR′R″)＝NR′″、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，其中m′是所述基团中碳原子的总数。R′、R″、R′″和R″″各自独立是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基，其包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R′、R″、R′″和R″″基团。当R′和R″连接于相同氮原子时，其可以与氮原子结合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。基于上述取代基的描述，所属领域技术人员应了解术语“烷基”是指包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
与烷基所述取代基相似，芳基和杂芳基的取代基可变化，并且选自(但不限于)：0至芳香族环系统上开放价(open valence)总数的卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R′″、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R′″、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R′″)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR′″、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基；且其中R′、R″、R′″和R″″独立为氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择为当存在一个以上这些基团时如同各R′、R″、R′″和R″″基团。
如本文所用术语“经调节血清半衰期”是指相对于未经修饰形式而言经修饰BSP的循环半衰期的正或负改变。通过在投与BSP后各个时间点时取血液样品和测定所述分子在各样品中的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性使得可以计算血清半衰期。血清半衰期有利地具有至少约两倍的增加，但是较小的增加也是可用的，例如当使得能够得到满意给药方案或避免毒性作用时。在一些实施例中，所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文所用术语“经调节治疗半衰期”是指相对于未经修饰形式而言治疗有效量BSP的半衰期的正或负改变。通过在投药后各个时间点时测量分子的药物动力学和/或药效特性和/或治疗作用来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期有利地使得能够得到尤其有益的给药方案，尤其有益的总剂量，或避免不良作用时。在一些实施例中，增加的治疗半衰期源于效能的提高、经修饰分子与其靶标结合的增加或减少、通过酶(例如肽酶或蛋白酶)的分子分解的增加或减少、或者未经修饰分子另一参数或作用机制的增加或减少。
当用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示核酸或蛋白实质上不含天然状态下相关的其它细胞组分。它可以是均态。分离物质可以是干态或半干态，或者在溶液中，包括(但不限于)水溶液。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法等分析化学技术确定纯度和均质性。作为存在于制剂中的主要物种的蛋白实质上是纯化的。具体来说，分离基因是从位于基因侧翼并且编码除感兴趣基因之外的蛋白的开放阅读框架中分离得到的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中实质上产生一条带。具体来说，“纯化的”表示核酸或蛋白具有至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更高纯度。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非另外特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物、具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然发生核苷酸相似的方式代谢的核酸。除非另外特别限制，否则所述术语也指包括PNA(肽核酸)的寡核苷酸类似物，用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰变体(包括(但不限于)简并密码子替换)和互补序列以及明确所指的序列。具体来说，可以通过产生其中一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤残基替换的序列来完成简并密码子替换(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；and Cassol等人(1992)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
术语“氨基酸”是指天然发生和非天然发生的氨基酸，以及以与天然发生氨基酸相似方式行使功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然发生氨基酸相同基本化学结构(即结合于氢的α碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。所述类似物具有经修饰R基团(例如正亮氨酸)或经修饰肽骨架，但是保留与天然发生氨基酸相同的基本化学结构。
本文根据IUPAC-IUB生物化学名词审定委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的一般所知的三字符号或一字符号来表示氨基酸。同样也可以通过一般所接受的单字代码来表示核苷酸。
“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，“保守修饰变体”是指编码相同或基本上相同氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，因此许多功能相同的核酸编码任何给定蛋白。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子所指定的每个位置处，可以将密码子改变成任何上述相应密码子而不改变所编码的多肽。所述核酸变异是“沉默变异(silent variation)”，其是一种保守修饰变异。本文编码多肽的每个核酸序列也描述每种可能的核酸沉默变异。所属领域技术人员应认识到，可以修饰核酸中每个密码子(除AUG(一般仅为蛋氨酸密码子)和TGG(一般仅为色氨酸密码子)之外)以产生功能相同分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异暗含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列而言，所属领域技术人员应认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的个别替换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸经化学相似氨基酸替换。提供功能相似氨基酸的保守替换表为所属技术领域所熟知。所述保守修饰变体是除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因之外的，但不排除这些。
以下八组各含有为相互之间保守替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)。
参看，例如Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman &Co；第2版(1993年12月)。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的内容中，术语“一致”或百分比“一致性”是指两个或两个以上相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域上通过使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察来比较并且比对最大对应度时，如果其具有相同氨基酸残基或核苷酸百分比(即在指定区域上约60％一致性、视情况约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性)，则序列是“实质上一致的”。所述定义也指测试序列的互补序列。所述一致性可以存在于至少约50个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者在75-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者当未指定时为整个序列或多聚核苷酸或多肽上。
对于序列比较来说，通常一个序列充当测试序列所比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如果需要)并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定参数。序列比较算法随后基于程序参数而计算测试序列相对于参考序列的百分比序列一致性。
如本文所用“比较窗口”包括选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150个组成群组的任何数目连续位置的节段，其中在一个序列和参考序列最佳比对之后可以将该序列与相同数目连续位置的参考序列比较。用于比对比较序列的方法为所属领域所熟知。可以执行比较序列的最佳比对，包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的搜寻相似性方法、这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者手动比对和视觉观察(例如，参看Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(1995增刊))。
一种适用于确定百分比一致性和序列相似性的算法实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。执行BLAST分析的软件是经美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4和双链比较。对于氨基酸序列来说，BLASTP使用默认字长3和期望值(E)10，和BLOSUM62计分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和双链比较。通常在关闭“低复杂度”过滤器下进行BLAST算法。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参看，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法所提供的一个相似性度量标准是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其指示可能偶然发生的两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配的概率。举例来说，如果测试核酸与参考核酸比较的最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
短语“选择性(或特异性)杂交”是指当序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中时，所述分子在严谨杂交条件下仅与特定核苷酸序列结合、双联或杂交。
短语“严谨杂交条件”是指如所属领域已知的低离子强度和高温条件。在严谨条件下探针通常应与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的靶子序列杂交，而不与复杂混合物中的其它序列杂交。严谨条件具有序列相关性，并且在不同情况下会有所不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays″(1993)中。通常将严谨条件选择为低于在所定义的离子强度pH下特异性序列的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm是与靶标互补的探针的50％与靶序列杂交平衡(当靶序列过量存在、Tm时，50％探针占据平衡)时的温度(在所定义的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件可以是pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子(通常约0.01至1.0M钠离子浓度)，且对短探针而言温度至少约30℃(包括(但不限于)10至50个核苷酸)而对长探针而言至少约60℃(包括(但不限于)大于50个核苷酸)。也可以通过加入例如甲酰胺的去稳定剂来达到严谨条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号可以为至少两倍背景，视情况为10倍背景杂交。示范性严谨杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下温育；或者5×SSC、1％SDS，在65℃下温育；用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。所述洗涤可以进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
如本文所用术语“真核生物”是指属于种系发生真核生物域(Eucarya)的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微粒子虫、原生生物等等。
如本文所用术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可以属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermitsthermophilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等等)种系发生域；或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、甲烷细菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌属(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和法克隆嗜盐菌(Halobacterium species)NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrumpernix)等等)种系发生域。
如本文所用术语“受检者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。
如本文所用术语“有效量”是指(经修饰)非天然氨基酸多肽可以一定程度地减轻所治疗的疾病、病情或病症的一种或一种以上症状的投药量。可以投用本文所述含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强”表示增加或延长所需作用的功效或持续时间。因此，就增强治疗剂作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统作用的功效或持续时间的能力。如本文所用“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中作用的量。当用于患者时，此用途的有效量将取决于疾病、病症或病情的严重程度和进程、先前疗法、患者健康状况和对药物的反应，和治疗医师的判断。
如本文所用术语“经修饰”是指对给定多肽所进行的任何改变，例如多肽长度改变、氨基酸序列改变、氨基酸组成改变、化学结构改变、多肽的共翻译修饰或多肽的翻译后修饰。形式“(经修饰)”术语是指所讨论的多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可以经修饰或未经修饰。
术语“经翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸在并入多肽链之后所发生的所述氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖活体内共翻译修饰、活体外共翻译修饰(例如在无细胞翻译系统中)、活体内翻译后修饰和活体外翻译后修饰。
在预防性应用中，含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易感于特定疾病、病症或病情或者具有这些风险的患者。将所述量定义为“预防有效量”。在此用途中，准确量也取决于患者的健康状况、体重等等。在所属领域技术范围内可以充分地考虑通过常规实验(例如剂量递增临床试验)来确定所述预防有效量。
术语“受保护”是指存在防止在某些反应条件下化学反应官能团反应的“保护基”或部分。保护基应视所保护的化学反应基的类型而变化。举例来说，如果化学反应基是胺或酰肼，那么保护基可以选自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应基是硫醇，那么保护基可以是邻吡啶基二硫化物(orthopyridyldisulfide)。如果化学反应基是羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可以是苄基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。所属领域已知的其它保护基也可以用于本文所述的方法和组合物，或者与其一起使用。
仅举例来说，封闭基(blocking group)/保护基可以选自：
其它保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中，其以引用的方式并入本文。
在治疗应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病、病症或病情的症状的量投与已经遭受所述疾病、病情或病症的患者。将此量定义为“治疗有效量”，其将取决于疾病、病症或病情的严重程度和进程、先前治疗、患者健康状况和对药物的反应，和治疗医师的判断。在所属领域技术范围内可以充分地考虑通过常规实验(例如剂量递增临床试验)来确定所述治疗有效量。
术语“治疗”是指预防性和/或治疗性治疗。
除非另外说明，否则采用所属领域技术范围内的常规质谱法、NMR、HPLC、蛋白化学法、生物化学法、重组DNA技术和药理学法。
实施方式
I.引言
可用于本发明的BSP或其片段的非限制性实例包括以下。应了解保留特定BSP或任何蛋白的一些或全部活性的其它变体、类似物、片段和/或类似物片段也可用于本发明的实施例。
可用于本发明的代表性非限制性类多肽包括在以下治疗类别中的多肽：促肾上腺皮质激素肽、肾上腺髓质素肽、咽侧体抑制激素肽、胰淀素肽、淀粉样β-蛋白片段、血管紧张素肽、抗生素肽、抗原多肽、抗菌肽、细胞凋亡相关肽、心房利钠肽、袋细胞肽、铃蟾肽、骨GLA肽、舒缓激肽(bradykinin peptide)、脑性利尿钠肽、C肽、C型利尿钠肽、降钙素肽、降钙素基因相关性肽、CART肽、酪啡肽(casomorphin peptide)、趋化肽、胆囊收缩素肽、集落刺激因子肽、促肾上腺皮质释放因子肽、皮质醇稳定蛋白肽(cortistatin peptide)、细胞因子肽、皮啡肽(dermorphin peptide)、强啡肽(dynorphinpeptide)、内啡肽(endorphin peptide)、内皮素肽(endothelin peptide)、ETa受体拮抗剂肽、ETb受体拮抗剂肽、脑啡肽、纤粘连蛋白肽(fibronectin peptide)、甘丙肽、胃泌素肽(gastrin peptide)、胰高血糖素肽、Gn-RH相关肽、生长因子肽、生长激素肽、GTP结合蛋白片段肽、鸟苷素肽、抑制素肽、胰岛素肽、白细胞介素肽、层粘蛋白肽、瘦素肽、白细胞激肽(Leucokinin peptide)、黄体生成激素释放激素肽(Luteinizinghormone-releasing hormone peptide)、蜂毒肽(Mastoparan peptide)、肥大细胞脱粒肽(Mastcell degranulating peptide)、促黑素细胞激素(melanocyte stimulating hormone)肽、吗啡肽(morphiceptin peptide)、胃动素肽(motilin peptide)、神经肽、神经肽Y肽、神经营养因子肽(neurotropic factor peptide)、食欲素肽(orexin peptide)、阿片样肽(opioidpeptide)、缩宫素肽、PACAP肽、胰抑素肽(Pancreastatin peptide)、胰多肽、甲状旁腺激素肽、甲状旁腺激素相关肽、肽T肽、催乳素释放肽、肽YY肽、肾素底物肽、胰泌素(Secretin)肽、生长抑素肽、物质P肽、速激肽(tachykinin)、促甲状腺素释放激素肽(thyrotropin-releasing hormone peptide)、毒素肽、血管活性肠肽(vasoactive intestinalpeptide)、血管加压素肽和病毒相关肽(参看，美国专利第6,858,580号)。
多肽的实例包括(但不限于)垂体激素，例如血管加压素、缩宫素、促黑素细胞激素、促肾上腺皮质激素、生长激素；下丘脑激素，例如生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素释放因子、催乳素释放肽、促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing peptide)及其相关肽、黄体生成激素释放激素、促甲状腺激素释放激素、食欲素和生长抑素；甲状腺激素，例如降钙素、降钙素前驱体和降钙素相关肽；甲状旁腺激素及其相关蛋白；胰腺激素，例如胰岛素和胰岛素样肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、胰淀素、肽YY和神经肽Y；消化激素，例如胃泌素、胃泌素释放肽、胃泌素抑制肽、胆囊收缩素、胰泌素、胃动素和血管活性肠肽；利钠肽，例如心房利钠肽、脑性利尿钠肽和C型利尿钠肽；神经激肽，例如神经激肽A、神经激肽B和物质P；肾素相关肽，例如肾素底物和抑制剂和血管紧张素；内皮素，包括大内皮素、内皮素A受体拮抗剂和蛇毒肽(sarafotoxin peptide)；和其它肽，例如肾上腺髓质素肽、咽侧体抑制激素肽、淀粉样β-蛋白片段、抗生素肽和抗菌肽、细胞凋亡相关肽、袋细胞肽、铃蟾肽、骨Gla蛋白肽、CART肽、趋化肽、皮质醇稳定蛋白肽、纤粘连蛋白片段和纤维蛋白相关肽、FMRF和类似肽、甘丙肽和相关肽、生长因子和相关肽、G治疗肽结合蛋白片段、鸟苷素和尿苷素(uroguanylin)、抑制素肽、白细胞介素和白细胞介素受体蛋白、层粘蛋白片段、瘦素片段肽、白细胞激肽、肥大细胞脱粒肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、胰抑素、肽T、多肽、病毒相关肽、信号转导试剂、毒素和各种肽，例如佐剂肽类似物、α配合因子、抗节律失常肽、抗冻多肽、降低食欲的肽(anorexigenic peptide)、牛松果体抗繁殖肽(bovinepineal antireproductive peptide)、三肽囊素(bursin)、C3肽P16、肿瘤坏死因子、钙粘蛋白肽(cadherin peptide)、嗜铬粒蛋白A片段、避孕四肽、conantokin G、conantokin T、甲壳动物心激肽(crustacean cardioactive peptide)、C-端肽、细胞色素b588肽、抗栓肽(decorsin)、美味肽(delicious peptide)、delta-诱眠肽(delta-sleep-inducing peptide)、diazempam结合抑制剂片段、含氮氧化物合成酶阻断肽、OVA肽、血小板钙蛋白酶抑制剂(platelet calpain inhibitor，P1)、纤溶酶原激活物抑制剂1、rigin、精神分裂症相关肽、血清胸腺因子、钠钾A治疗肽酶抑制剂1(sodium potassium A therapeutic peptideaseinhibitor-1)、精子活化肽(speract)、精子活化肽(sperm activating peptide)、系统素(systemin)、凝血酶受体激动剂、胸腺体液γ2因子、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺素α1(thymosin alpha 1)、胸腺因子、促吞噬素(tuftsin)、脂肪动员激素(adipokinetichormone)、尿毒五肽(uremic pentapeptide)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-1)、exendin-3、exendin-4和其它治疗肽或其片段。肽的其它实例包括饥饿激素(ghrelin)、阿片样肽(酪啡肽、皮啡肽、内啡肽、脑啡肽、新皮啡肽(deltorphin)、强啡肽和其类似与衍生物)、胸腺肽(胸腺生成素(thymopoietin)、胸腺刺激素(thymulin)、胸腺五肽、胸腺素、胸腺体液因子(THF))、细胞粘附肽、补体抑制剂、凝血酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、α-1抗胰蛋白酶、海胆精子活化肽(Sea UrchinSperm Activating Peptide)、SHU-9119 MC3-R和MC4-R拮抗剂、glaspimod(免疫刺激剂，可用于对抗细菌感染、真菌感染、免疫缺失病症、白血球减少症)、HP-228(促黑皮素(melanocortin)，可用于对抗化疗诱导的呕吐、毒性、疼痛、糖尿病、炎症、类风湿性关节炎、肥胖)、α2-纤溶酶抑制剂(alpha 2-plasmin inhibitor)(纤溶酶抑制剂)、APC肿瘤抑制剂(肿瘤抑制剂，可用于对抗肿瘤)、早孕因子(免疫抑制剂)、endozepinediazepam结合抑制剂(受体肽)、γ干扰素(可用于对抗白血病)、腺激肽释放酶-1(glandularkallikrein-1)(免疫刺激剂)、胎盘核糖核酸酶抑制剂、sarcolecin结合蛋白、表面活性剂蛋白D、Wilms氏肿瘤抑制剂、GABAB 1b受体肽、朊病毒相关肽(iPrP13)、胆碱结合蛋白片段(细菌相关肽)、端粒酶抑制剂、cardiostatin肽、血管内皮抑素衍生肽(endostatinderived peptide)(血管生成抑制剂)、朊病毒结合肽、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methylD-aspartate)受体拮抗剂、C肽类似物(可用于对抗糖尿病并发症)、RANTES、NTY受体、NPY2-R(神经肽Y2型受体)配体、NC4R肽或其片段。参看美国专利第6,849,714号，其以引用的方式并入本文。
调控胰岛素分泌的激素属于所谓的肠胰岛轴(enteroinsular axis)，此轴代表一组响应于肠中营养物的存在和吸收而从胃肠粘膜释放出来的激素，所述激素促进胰岛素早期和加强释放。对胰岛素分泌的增强作用(所谓的肠促胰岛素(incretin)作用)可能是正常葡萄糖耐受所必需的。许多胃肠激素(包括胃泌素和胰泌素(胆囊收缩素不是人类的促胰岛激素))为促胰岛激素，但是仅具有生理学重要性的、负责肠促胰岛素作用的是葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)。
GIP包含从153个氨基酸前驱物加工得到的42个氨基酸(Takeda等人，PNAS USA(1987)84：7005-7008)。GIP由存在于十二指肠和小肠粘膜中的K细胞响应于含碳水化合物和脂质的膳食而分泌(Mortensen等人Ann.NY Acad.Sci.(2000)921：469-472)。已经在胰岛(pancreatic islet)、肾上腺皮质、肠、心脏、脂肪组织、一些大脑区域和垂体腺中发现GIP表达(Usdin等人(1993)Endocrinology 133：2861-2870)。
由于具有促胰岛素作用，因此1973年所分离的GIP(Pederson RA.Gastric InhibitoryPolypeptide.In Walsh JH，Dockray GJ(编辑)Gut peptides：Biochemistry and Physiology.Raven Press，New York 1994，第217-259页)立即吸引了许多糖尿病专家的兴趣。然而，在随后几年内所进行的许多研究明确地表明，GIP的有缺陷分泌并不与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的发病机理有牵连(ICrarup T.，EndocrRev 1988；9：122-134)。此外，发现作为促胰岛素激素的GIP在NIDDM中几乎无效(Krarup T.，Endocr Rev 1988；9：122-134)。另一种肠促胰岛素激素，GLP-1，是已知最为有效的促胰岛素物质(O′rskov C，Diabetologia 1992；35：701-711)。与GIP不同，其在刺激NIDDM患者中胰岛素分泌方面惊人地有效。此外，并且与其它促胰岛素激素相反(可能除胰泌素之外)，GLP-1也有效地抑制膜高血糖素分泌。由于这些作用，因此尤其在NIDDM患者中具有显著血糖降低的作用。
作为胰高血糖素原(proglucagon)基因产物的GLP-1(Bell GI等人，Nature 1983；304：368-371)是胰泌素-VIP肽家族的一个成员，并且已经确定为在葡萄糖代谢和胃肠分泌与代谢中具有调控功能的主要胃肠激素(Hoist JJ.，1994；Gastroenterology.1994年12月；107(6)：1848-55)。胰高血糖素基因在胰腺与肠中加工不同。在胰腺中(Hoist JJ等人，J BiolChem，1994；269：18827-18833)，加工引起以下物质的形成和平行分泌：1)胰高血糖素自身，占据高血糖素原(PG)的33-61位；2)通常称为肠高糖素相关胰肽GRPP(glicentin-related pancreatic peptide)的30个氨基酸的N端肽(PG(1-30))(MoodyAJ等人，Nature 1981；289：514-516；Thim L等人，Biochim Biophys Acta 1982；703：134-141)；3)对应PG(64-69)的六肽；4)以及最后所谓的主要高血糖素原片段(PG(72-158))，其中埋藏两个胰高血糖素样序列(Hoist JJ等人，J Biol Chem，1994；269：18827-18833)。胰高血糖素似乎是唯一的生物活性产物。相比之下，在肠粘膜中，胰高血糖素埋藏在较大分子中，而两个胰高血糖素样肽是单独形成(O′rskov C人，Endocrinology 1986；119：1467-1475)。形成并平行分泌以下产物：1)对应PG(1-69)的肠高糖素(glicentin)，其中胰高血糖素序列占据第33-61号残基(Thim L等人，Regul Pept1981；2：139-151)；2)GLP-1(7-36)酰胺(PG(78-107))酰胺(O′rskov C等人，J.Biol.Chem.1989；264：12826-12829)，并非最初所认为的无活性PG(72-107)酰胺或108。也形成少量C端甘氨酸延伸但等同生物活性的GLP-1(7-37)、(PG(78-108))(O′rskovC等人，Diabetes 1991；43：535-539)；3)插入肽-2(PG(111-122)酰胺)(Buhl T等人，J.Biol.Chem.1988；263：8621-8624)；和4)GLP-2(PG(126-158))(Buhl T等人，J.Biol.Chem.1988；263：8621-8624；O′rskov C等人，FEBS letters，1989；247：193-106)。一部分肠高糖素进一步裂解成GRPP(PG(1-30))和胃泌酸调节素(oxyntomodulin)(PG(33-69))(Hoist JJ.Biochem J.1980；187：337-343；Bataille D等人，FEBS Lett 1982；146：79-86)。在这些肽中，GLP-1具有最为显著的生物活性。
与肠高糖素(glicentin)/肠高血糖素(enteroglucagon)平行分泌，随后进行了许多关于肠高血糖素分泌的研究(Hoist JJ.，Gastroenterology 1983；84：1602-1613；Hoist JJ等人，Glucagon and other proglucagon-derived peptides.In Walsh JH，Dockray GJ，编辑Gutpeptides：Biochemistry and Physiology.Raven Press，New York，第305-340页，1993)。一定程度上也适用于GLP-1分泌，但是GLP-1代谢更快，并且在人中的血浆半衰期为2分钟(O′rskov C等人，Diabetes 1993；42：658-661)。富含碳水化合物或脂肪的膳食刺激分泌(Elliott RM人，J Endocrinol 1993；138：159-166)，这可能是由于未经吸收的营养物与肠粘膜的开放型(open-type)L细胞的微绒毛的直接互作。可以存在促进GLP-1分泌的内分泌或神经机制，但是尚未在人类中得以证实。
在用GLP-1受体拮抗剂exendin 9-39进行的实验中明确地说明了GLP-1(29-31)的肠促胰岛素功能，所述拮抗剂显著地减少小鼠中由口服葡萄糖所引起的肠促胰岛素作用(Kolligs F等人，Diabetes 199544：16-19；Wang Z等人，J.Clin.Invest.1995 95：417-421)。激素直接经GLP-1受体与β细胞互作(Thorens B.，Proc Natl Acad Sci 1992；89：8641-4645，美国专利第5,670,360号和第6,051,689号，其以引用的方式并入本文)，所述受体属于G蛋白偶联7-跨膜受体的胰高血糖素/VIP/降钙素家族。GLP-1受体在调控胰岛素分泌中的重要性在最近的实验中有所说明，在这些实验中在小鼠中进行GLP-1受体基因的靶向破坏。用于破坏的动物纯合体具有极度恶化的葡萄糖耐受性和空腹高血糖症，并且甚至杂合动物为葡萄糖不耐受的(Scrocchi L等人，Diabetes 1996；45：21A)。信号转导机制(Fehmaim HC等人，Endocrine Reviews，1995；16：390-410)主要涉及腺苷酸环化酶的活化，但是细胞内Ca2+的升高也是必需的(Fehmann HC等人，EndocrineReviews，1995；16：390-410；Gromada J等人，Diabetes 1995；44：767-774)。Lopez deMaturana，R.等人(2003)J.Bio1.Chem.278，10195-10200中展示GLP-1受体配体互作的模型。Lopez de Maturana，R.等人指出受体的N端域结合exendin-4、GLP-1和exendin(9-39)的中心螺旋的保守面。exendin-4与GLP-1的N端区与GLP-1R的胞外环和/或跨膜区互作。受体的N端域也与exendin-4和exendin(9-39)的Trp笼(Trp-cage)部分互作。Neidigh等人Nature Structural Biology(2002)9(6)：425-430描述Exendin-4及其突变体的Trp笼结构。
激素的作用最好描述为增强葡萄糖刺激胰岛素释放(Fehmann HC等人，EndocrineReviews，1995；16：390-410)，但是偶联葡萄糖与GLP-1刺激的机制还不清楚。这可能涉及钙诱导的钙释放(Gromada J等人，Diabetes 1995；44：767-774；Holz GG等人，J BiolChem，1996；270：17749-17759)。如前文所提及，糖尿病P细胞中保留GLP-1的促胰岛素作用。也不清楚糖尿病P细胞与其将“葡萄糖感受性(glucose competence)”传递给经分离的胰岛素分泌细胞的能力的关系(Gromada J等人，Diabetes 1995，44：767-774；Holz GG等人，Nature 1993，361：362-365)，经分离的胰岛素分泌细胞对单独的葡萄糖或GLP-1响应性较差，但是完全响应两者的组合。然而，同等重要的是，激素也有效地抑制胰高血糖素分泌(O′rskov C等人，Endocrinology 1988；123：2009-2013)。尚不了解其机制，但似乎是经邻近胰岛素或生长抑素细胞的副分泌(paracrine)(Fehmann HC等人，Endocrine Reviews，1995；16：390-410)。抑制胰高血糖素的作用(glucagonostatic)也为葡萄糖依赖性，因此抑制作用随血糖减少而降低。由于所述双重作用，如果血浆GLP-1浓度因分泌增加或因外源灌注而增加，那么经门脉循环到达肝脏的血液中胰岛素与胰高血糖素的摩尔比将极度增加，因而肝葡萄糖产物减少(Hvidberg A人，Metabolism 1994；43：104-108)。因此，血糖浓度降低。由于促胰岛素作用和抑制胰高血糖素作用的葡萄糖依赖性，因此葡萄糖降低效应自身受限，并且因此激素并不引起低血糖而不管剂量如何(Qualmann C等人，Acta Diabetologica，1995；32：13-16)。在患有糖尿病的患者中保留所述效应(Nauck MA等人，J Clin Invest 1993；91：301-307)，所述患者中，尽管磺酰脲药物的代谢控制不良和继发性失效，但是GLP-1的轻微超生理剂量的灌注能够完全使血糖值达到正常(Nauck MA等人，Diabetologia 1993；36：741-744)。发现GLP-1也降低I型糖尿病患者中血糖而无残余P细胞分泌能力，这说明了抑制胰高血糖素的作用的重要性(Creutzfeldt W等人，Diabetes Care 1996；19：580-586)。
GLP-1与增加β细胞量以及调控β细胞分化、β细胞增殖和β细胞存活有关(StaffersDA，Honn Metab Res.2004年11月-12月；36(11-12)：811-21)，并且对增加胰岛素原基因转录和生物合成起作用。
除了对胰岛的作用之外，GLP-1对胃肠道具有有效作用。输入生理量之后，GLP-1有效地抑制五肽胃泌素(pentagastrin)所诱导的以及膳食所诱导的胃酸分泌(SchjoldagerBTG等人，Dig.Dis.Sci.1989；35：703-708；Wettergren A等人，Dig Dis Sci 1993；38：665-673)。也抑制胃排空速率和胰酶分泌(Wettergren A人，Dig Dis Sci 1993；38：665-673)。在回肠灌输含碳水化合物或脂质溶液之后，人体中可以产生对胃与胰腺分泌和运动性的相似抑制作用(Layer P等人，Dig Dis Sci 1995；40：1074-1082；Layer P等人，Digestion 1993；54：385-386)。同时，极度刺激GLP-1分泌，并且据推测，GLP-1可能至少部分负责这所谓的“回肠闸(ileal-brake)”作用(Layer P等人，Digestion 1993；54：385-386)。事实上，最近的研究指出，GLP-1的生理回肠闸作用可能比其对胰岛的作用更为重要。因此，在剂量反应研究中，GLP-1在至少低至为影响岛分泌所需的输液速率下影响胃排空速率(Nauck M等人，Gut 1995；37(增刊2)：A124)。
GLP-1似乎对食物摄取具有作用。心室内投与GLP-1显著抑制大鼠的食物摄取(Schick RR，vorm Walde T，Zimmermann JP，Schusdziarra V，Classen M.Glucagon-likepeptide 1-a novel brain peptide involved in feeding regulation，in Ditschuneit H，Gries FA，Hauner H，Schusdziarra V，Wechsler JG(编辑)Obesity in Europe.John Libbey & CompanyLtd.，1994；第363-367页；42)。此作用似乎为高度特异性。因此，N端延伸GLP-1(PG72-107)酰胺无活性，并且适当剂量的GLP-1拮抗剂、exendin 9-39消除GLP-1作用。急性外周投与GLP-1并不剧烈地抑制大鼠的食物摄取(Turton MD等人，Nature 1996；379：69-72)。然而，仍可能的是，由肠内L细胞所分泌的GLP-1也可能充当过饱信号(satietysignal)。
糖尿病患者中不仅保留促胰岛素作用，而且保留GLP-1对胃肠道的作用(Willms B等人，Diabetologia 1994；37，增刊1：A118)，并且可能有助于缩减膳食诱导的葡萄糖偏移(glucose excursion)，但是更为重要的是，也影响食物摄取。已经证明，静脉内以4ng/kg/min投与GLP-1连续一周会急剧改进NIDDM患者的血糖控制而无显著副作用(Larsen J等人，Diabetes 1996；45，增刊2：233A)。在皮下投与之后，所述肽为完全活性(Ritzel R等人，Diabetologia 1995；38：720-725)，但是主要由于二肽基肽酶IV样酶的降解作用而快速降解(Deacon CF等人，J Clin Endocrinol Metab 1995；80：952-957；DeaconCF等人，Diabetes 44：1126-1131)。
GLP-1的氨基酸序列公开于Schmidt等人Diabetologia 28704-707(1985)中。人GLP-1是来源于前高血糖素原(preproglucagon)的30-31个氨基酸残基肽，所述前高血糖素原是理论上(i.a)在回肠末端、胰腺和大脑中的L细胞中被合成。主要在L细胞中发生前高血糖素原加工成GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2。尽管GLP-1(7-37)及其类似物的令人感兴趣的药理学特性最近吸引了相当多的注意力，但是仅极了解这些分子的结构。Thorton等人(Biochemistry 33：3532-3539(1994))已经描述微胞中GLP-1的二级结构，但是在正常溶液中，认为GLP-1是极具柔性的分子。这种相对小且极具柔性分子的衍生化所产生的化合物具有高度拖延的血浆曲线但仍保留活性。
GLP-1和GLP-1类似物及其片段理论上(i.a)可用于治疗1型和2型糖尿病和肥胖症。
WO 87/06941公开GLP-1片段(包括GLP-1(7-37))及其功能衍生物和用作促胰岛素剂的用途。GLP-1(7-37)、其某些衍生物及其用于治疗哺乳动物糖尿病的用途公开于美国专利第5,120,712号中，该专利以引用的方式并入本文。
WO 90/11296公开GLP-1片段(包括GLP-1(7-36))及其功能衍生物(具有超过GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)促胰岛素活性的促胰岛素活性)，和其用作促胰岛素剂的用途。
GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列为(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X，其中对于GLP-1(7-36)来说，X为NH2而对于GLP-1(7-37)来说X为Gly。
WO 91/11457公开了活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的类似物，这些类似物也可用作GLP-1部分。
EP 0708179-A2(Eli Lilly & Co.)公开了包括连接于34位赖氨酸残基的N端咪唑基和视情况非支链C6-C10酰基的GLP-1类似物和衍生物。
EP 0699686-A2(Eli Lilly & Co.)公开了据报导为生物活性的GLP-1的某些N端截断片段。
另一个肽实例为T-20(DP-178)，其是对应于HIV-1LAI跨膜蛋白(TM)gp41的氨基酸638至673(gp41的胞外部分的羧基末端螺旋节段)的肽。gp41的胞外部分具有另一个为氨基末端建议拉链域(amino-terminal proposed zipper domain)的α螺旋区，DP-107。DP-107通过抑制病毒融合而展示有效的抗病毒活性。DP-107为对应于HIV-1LAI跨膜gp41蛋白的残基558至595的38氨基酸肽。在活体外研究和动物中用DP-107所进行的研究已证明无毒。美国专利第5,656,480号描述DP-107及其抗病毒活性，该专利以引用的方式并入本文。
T-20通过充当病毒融合抑制剂来抑制HIV进入细胞。充分表征了HIV的融合过程。HIV经gp120结合CD4受体，并且在结合于其受体之后，gp120经历一系列构象改变以允许其结合于其辅受体(coreceptor)CCR5或CXCR4。在结合于受体和辅受体之后，gp120暴露gp41以开始融合过程。gp41具有两个叫做七肽重复(heptad repeat)1和2的区(HR1和2)。确定为HR1的胞外域是为所建议拉链域的氨基末端的α螺旋区。HR1与gp41的HR2一起形成发夹。所形成的结构是6螺旋束，其将HIV包膜接近于细胞膜安置以引起两膜的融合。T-20通过结合gp41跨膜糖蛋白的第一段七肽重复(HR1)来阻止病毒融合所需的构象改变。因此，通过T-20与gp41的HR1区的结合来阻断6螺旋束的形成。HIV gp41蛋白的DP107和DP178域(即HR1和HR2域)相互之间非共价复合，并且其互作是病毒正常感染所必需的。破坏DP107与DP178和/或DP107样与DP178样肽之间互作的化合物具有抗融合性(antifusogenic)，包括抗病毒性。
DP-178充当HIV-1介导的CD-4+细胞一细胞融合(即合胞体形成)和CD-4+细胞受无细胞病毒感染的有效抑制剂。所述抗逆转录病毒活性包括(但不限于)HIV传播至未受感染CD-4+细胞的抑制。DP-178在低浓度下作用，并且已经在活体外研究和动物中证明其无毒。已经描述DP-178内的氨基酸保守-HIV-1和HIV-2的对应区。
DP-178肽用于抑制HIV传播相关的融合事件的潜在用途描述于美国专利第5,464,933号和第6,133,418号以及美国第6,750,008号和第6,824,783号中，所有这些均以引用的方式并入本文。
据研究，DP 178与DP-107的部分、同系物和类似物以及DP178/DP107、DP178样/DP107样或HR1/HR2互作的调节剂展示出抗病毒活性和/或展示出抗膜融合能力，或调节涉及除HIV-1和非逆转录病毒之外的逆转录病毒中卷曲螺旋(coiled-coil)肽结构的细胞内过程的能力。这些研究中的病毒包括猴免疫缺陷病毒(美国专利第6,017,536号)、呼吸道融合病毒(美国专利第6,228,983号、第6,440,656号、第6,479,055号、第6,623,741号)、Epstein-Barr病毒(美国专利第6,093,794号、第6,518,013号)、副流感病毒(美国专利第6,333,395号)、流感病毒(美国专利第6,068,973号、第6,060,065号)和麻疹病毒(美国专利第6,013,263号)。所有这些均以引用的方式并入本文。
市售形式DP-178为
(恩夫韦地(enfuvirtide)，Roche Laboratories Inc.和Trimeris，Inc.)。具有乙酰基化N端和氨甲酰C端，并且由以下一级氨基酸序列描述：CH3CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2。其与尽管进行抗逆转录病毒疗法但仍展示HIV-1复制的HIV-1患者中的抗病毒素结合使用。
美国专利第5,464,933号和第6,824,783号(以引用的方式并入本文)描述DP-178、DP-178片段、类似物和同系物，其包括(但不限于)具有氨基和羧基末端切断、替换、插入、缺失、添加或大分子载体基团的分子，以及具有化学基团(例如存在于其氨基和/或羧基末端的疏水性基团)的DP-178分子。其它变体包括(但不限于)描述于美国专利第6,830,893号中的变体和公开于美国专利第6,861,059号中的DP-178衍生物。一组T-20杂合多肽描述于美国专利第6,656,906号、第6,562,787号、第6,348,568号和第6,258,782号中，并且DP-178毒素融合体描述于美国专利第6,627,197号中。
HAART(Highly Active Anti-Retroviral Therapy，高效抗逆转录病毒治疗)是HIV治疗的标准，其组合来自数种抗逆转录病毒剂的药物来降低病毒载量。美国专利第6,861,059号(其以引用的方法并入本文)公开采用DP-178或DP-107或其衍生物与至少一种其它抗病毒治疗剂(如逆转录酶抑制剂(例如AZT、ddI、ddC、ddA、d4T、3TC或其它二脱氧核苷酸或二脱氧氟核苷)或HIV-1蛋白酶抑制剂(例如茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)))结合来治疗HIV-1感染或抑制HIV-1复制的方法。其它抗病毒剂包括细胞因子(例如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ)、病毒mRNA封端抑制剂(例如利巴韦林(ritonavir))、HIV蛋白酶抑制剂(例如ABT-538和MK-639)、作为具有抗HIV活性的脂质结合分子的两性霉素(amphotericin)B和作为糖蛋白加工抑制剂的栗精胺(castanospermine)。其它抗病毒剂(包括(但不限于)逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、细胞因子拮抗剂和具有T-20的趋化受体调节剂)的有效组合治疗描述于许多参考文献中，包括：美国专利第6,855,724号、第6,844,340号、第6,841,558号、第6,833,457号、第6,825,210号、第6,811,780号、第6,809,109号、第6,806,265号、第6,768,007号、第6,750,230号、第6,706,706号、第6,696,494号、第6,673,821号、第6,673,791号、第6,667,314号、第6,642,237号、第6,599,911号、第6,596,729号、第6,593,346号、第6,589,962号、第6,586,430号、第6,541,515号、第6,538,002号、第6,531,484号、第6,511,994号、第6,506,777号、第6,500,844号、第6,498,161号、第6,472,410号、第6,432,981号、第6,410,726号、第6,399,619号、第6,395,743号、第6,358,979号、第6,265,434号、第6,248,755号、第6,245,806号和第6,172,110号。
DP-178的潜在传送系统包括(但不限于)描述于美国专利第6,844,324号和第6,706,892号中的那些。此外，在包涵体中制造T-20的方法描述于美国专利第6,858,410号中。
也已经发现T20/DP178、T21/DP107及其片段与N-甲酰肽受体(FPR成员)互作。T-20激活存在于人嗜菌细胞中的N-甲酰肽受体(Su等人(1999)Blood 93(11)：3885-3892)，并且是单核细胞和嗜中性白细胞的趋化因子和活化剂(见美国专利第6,830,893号)。FPR类受体是结合趋化因子fMLP(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸)并且涉及单核细胞趋化作用和对病原体的宿主免疫应答诱导的G蛋白偶联STM受体。原型FPR类受体FPR以高亲和力结合fMLP，并且由低浓度fMLP活化。由fMLP结合FPR诱导G蛋白介导信号传导事件的级联，引起嗜菌细胞粘附、趋化作用、氧中间体释放、嗜菌作用增强和细菌杀死，以及MAP激酶活化和基因转录。(Krump等人，J Biol Chem 272：937(1997)；Prossnitz等人，Pharmacol Ther 74：73(1997)；Murphy，Annu.Rev.Immuno.12：593(1994)；和Murphy，The N-formyl peptide chemotactic receptors，Chemoattractant ligandsand their receptors.CRC Press，Boca Raton，第269页(1996))。另一类FPR受体为FPR的高度同源变体，名为FPRL1(也称为FPRH2和LXA4R)。FPRL1起初克隆为孤儿受体(orphan receptor)(Murphy等人，J.Biol.Chem.，267：7637-7643(1992)；Ye等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，184：582-589(1992)；Bao等人，Genomics，13：437-440(1992)；Gao，J.L.和P.M.Murphy，J.Biol.Chem.，268：25395-25401(1993)；和Nomura等人，Int.Immunol.，5：1239-1249(1993))，但是随后发现响应于高浓度fMLP而介导Ca2+动员(Ye等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，184：582-589(1992)；和Gao，J.L.和P.M.Murphy，J.Biol.Chem.，268：25395-25401(1993))。
趋化因子受体CCR5是另一种G蛋白偶联STM受体，并且是由人类免疫缺陷型病毒1型(HIV-1)最初级分离体所开发的主要融合辅因子。(Al Khatib等人，Science 1996，272：1955；Doranz等人，Cell 1996，85：1149；Deng等人，Nature 1996，381：661；Dragic等人，Nature 1996；381：667；Horuk，Immunol Today，20：89(1999)；Dimitrov和Broder，″HIVand Membrane Receptors，″HIV and membrane fusion：Medical Intelligence Unit，LandesBioscience，Austin，Tex.，1997：99；和Berger，AIDS 11，增刊A：S3(1997))。不能表达CCR5的个体很大程度上抗HIV-1感染。(Liu等人，Cell 1996，86：367-77；Huang，Y，Nat Med1996，2：1240；Dean等人，Science，273：1856(1996))。由于其在HIV-1融合和进入中的突出作用，因此研究人员将研究的重点放在开发破坏HIV-1包膜与CCR5之间互作的分子上。举例来说，特异于CCR5的趋化因子配体和抗体已经展示出抑制HIV-1进入和复制。(Cocchi等人，Science，270：1811(1995)；Wu等人，J Exp Med，186：373(1997)；Proudfoot等人，J Biol Chem，271：2599(1996)；Arenzana-Seisdedos等人，Nature，383：400(1996)；Gong等人，J Biol Chem，273：4289(1998))。美国专利第6,808,877号讨论DP-178及其通过充当N-甲酰肽受体的配体而引起CCR5的磷酸化和下调和/或HIV感染的抑制的作用。
肽YY(PYY)是36氨基酸长度的肽，首先从猪肠组织中分离并且主要位于肠内分泌细胞中。PYY由胃肠道末端的内分泌细胞在食后分泌，并且在下丘脑信号传导过饱时作用。参看Batterham，R.L.等人，Nature 418：650-654(2002)，其以引用的方式并入本文。肽YY具有许多生物活性，包括消化系统内的许多活性和肠电解质的有效抑制和流体分泌。与其亲缘肽神经肽Y(NPY)和胰多肽(PP)相同，肽YY(PYY)弯曲成发夹构型，这对于将分子的游离末端聚集在一起用于与受体结合是重要的。
最近的研究已显示，在肥胖受检者中空腹和食后PYY含量较低，这可能解释其高食欲和食物消耗量。当静脉内投药时，其抑制消瘦和肥胖受检者的食欲和食物摄取(Batterham，R.L.等人，N Engl J Med 349：941-948(2003))。来自胰肽(PP)家族的其它肽也抑制食欲，如肽YY片段(例如PYY[3-36])和PYY激动剂(包括不是PP家族的那些)。然而，其口服活性很小，因为在胃肠道内的低吸收和快速降解。PYY[3-36]确定为WO 02/47712和美国专利公开案第2002/0141985号、Eberlein，Eysselein等人，Peptides10：797-803(1989)和Grandy，Schimiczek等人，Regul Pept 51：151-9(1994)中的SEQ ID NO：3，这些参考案以引用的方式并入本文。
PYY[3-36]在氨基酸3至36上与PYY序列一致。PYY[3-36]含有大约40％的人和犬肠道提取物中总肽YY样免疫反应性，和约36％的空腹状态的总血浆肽YY免疫反应性至饭后略微超过50％。其明显是肽YY的二肽基肽酶-IV(DPP4)裂解产物。据报导，肽YY[3-36]是Y2和Y5受体的选择性配体，所述受体在优选N端截断(即其C端片段)神经肽Y类似物中显示药理学独特性。与天然PYY相比，PYY激动剂可以较高或较低亲和力结合于PYY受体，这证实活体内或活体外的较长或较短半衰期，或者较高或较低的有效性。
目前抗肥胖药物具有有限的功效和许多副作用。Crowley，V.E.，Yeo，G.S.&O′Rahilly，S.，Nat.Rev.Drug Discov 1，276-86(2002)。随着全世界肥胖达到流行比例，迫切需要开发出此领域的足够治疗方法。近年来，涉及食欲调节、体力支出和脂肪团累积的激素和神经肽(例如PYY)已经作为有效的抗肥胖药物出现。参看，McMinn，J.E.，Baskin，D.G.& Schwartz，M.W.，Obes Rev 1：37-46(2000)，Drazen，D.L.& Woods，S.C，Curr Opin ClinNutr Metab Care 6：621-629(2003)，其以引用的方式并入本文。
根据Batterham等人，Nature 418：650-654(2002)(其以引用的方式并入本文)，肽YY[3-36]系统可以提供用于治疗肥胖症的治疗靶标。国际公开案第WO 02/47712号和美国专利申请公开案第2002/0141985号公开用肽YY和肽YY类似物(如YY[3-36])治疗肥胖症和糖尿病的方法。美国专利申请公开案第20050002927号描述至少一种Y2受体结合肽(例如肽YY、神经肽(NPY)或胰肽(PP))用于治疗哺乳动物受检者的多种疾病和病情(例如肥胖症)的用途。
鼻内PYY(3-36)(Merck，Nastech)正在临床开发中以用于治疗肥胖症。其它处于开发中的PYY(3-36)化合物包括口服PYY(3-36)(Emisphere)和AC162352(Amylin)。
此外，用DPP-IV抑制剂治疗阻止肽YY降解，所述降解与胃肠道病情相联系，例如溃疡、肠激躁症和炎性肠道疾病。肽YY及其类似物或激动剂已经用于操纵细胞增殖、营养运输和肠内水和电解质分泌的内分泌调控。(美国专利第5,604,203号、WO9820885A1、EP692971A1、美国专利第5,912,227号，其以引用的方式并入本文)。也已经揭示肽YY在调控肠运动、分泌和血液流动中的作用，以及其在治疗吸收不良病症(malabsorptive disorder)中的用途。据报导，PYY类似物仿效和增强天然肽在治疗胰腺肿瘤中的持续时间、作用、生物活性和选择性(参看美国第5,574,010号，其以引用的方式并入本文)。
其它合适的PYY激动剂包括描述于国际公开案第WO 98/20885号中的那些，该专利以引用的方式并入本文。
一方面，本发明提供通过投与治疗有效量的PYY、PYY激动剂或其与至少一种传送剂化合物的混合物来治疗肥胖或超重动物的肥胖症的方法。尽管“肥胖”通常定义为体重指数超过30，但为了本发明的目的，包括体重指数小于30、需要或希望减轻体重的受检者在内的任何受检者均涵盖于“肥胖”的范围内。胰岛素抗性、葡萄糖不耐受性或具有任何形式糖尿病(例如1型、2型或妊娠期糖尿病)的受检者均可受益于此方法。
在其它方面，本发明描述减少食物摄取、治疗糖尿病和改善脂质特征(包括降低LDL胆固醇和甘油三酸酯含量和/或改变HDL胆固醇含量)的方法，所述方法包含对受检者投与治疗有效量的PYY、PYY激动剂或其与至少一种传送剂化合物的混合物。在一优选实施例中，本发明的方法用于治疗可以通过降低有此需要的患者的营养利用率而得以减轻的病情或病症，所述方法包含对所述受检者投与治疗有效量的PYY、PYY激动剂或其与至少一种传送剂化合物的混合物。所述病情和病症包括(但不限于)高血压、血脂异常(dyslipidemia)、心血管病、饮食失调症、胰岛素抗性、肥胖症和任何类型糖尿病。
优选PYY激动剂能够在一个描述于WO 02/47712和美国专利公开案第2002/0141985号中的测定(优选为食物摄取、胃排空、胰腺分泌或体重降低测定)中具有效能，其效能大于相同测定中NPY的效能。可以单独或与一种或一种以上展示长期或短期作用以降低营养利用率的化合物和组合物一起投与伴有传送剂化合物的PYY和PYY激动剂，所述化合物和组合物包括(但不限于)其它描述于美国专利公开案20050009748中的包含胰淀素或胰淀素激动剂、胆囊收缩素(CCK)或CCK激动剂、瘦素(OB蛋白)或瘦素激动剂、exendin或exendin激动剂或GLP-1或GLP-1激动剂的化合物和组合物。合适的胰淀素激动剂包括(例如)[25，28，29Pro-]-人类胰淀素(也称为“普兰林肽(pramlintide)”，并且描述于美国专利第5,686,511号和第5,998,367号中)、降钙素(例如鲑鱼降钙素(salmon calcitonin))，包括描述于美国专利第5,739,106号中的那些，该专利以引用的方式并入本文。所用CCK优选为CCK八肽(CCK-8)。举例来说，瘦素讨论于Pelleymounter，C.等人，Science 269：540-543(1995)，Halaas，G.等人，Science269：543-6(1995)和Campfield，S.等人，Science 269：546-549(1995)中。合适的CCK激动剂包括描述于美国专利第5,739,106号中的那些，该专利以引用的方式并入本文。合适的exendin包括exendin-3和exendin-4，并且exendin激动剂化合物包括(例如)描述于PCT公开案WO 99/07404、WO 99/25727和WO 99/25728中的那些，这些公开案均以引用的方式并入本文。根据一个实施例，本发明的组合物包括至少一种传送剂化合物、PYY、PYY激动剂或其混合物、至少一种胰淀素激动剂和CCK激动剂。胰淀素激动剂与CCK激动剂的合适组合包括(但不限于)包括描述于美国专利第5,739,106号中的那些，该专利以引用的方式并入本文。
促肾上腺皮质激素(ACTH)肽包括(但不限于)人ACTH、ACTH 1-10、人ACTH1-13、人ACTH 1-16、ACTH 1-17、人ACTH 1-24、ACTH 4-10、ACTH 4-11、ACTH 6-24、人ACTH 7-38、入ACTH 18-39、大鼠ACTH、大鼠ACTH 12-39、β细胞调理素(tropin)(ACTH 22-39)、人生物素基-ACTH 1-24、人生物素基-ACTH 7-38、人皮质抑素(corticostatin)、兔皮质抑素、人[Met(02)4，DLys8，Phe9]ACTH 4-9、人[Met(0)4，DLys8，Phe9]ACTH 4-9、人N-乙酰基ACTH 1-17和依比拉肽(ebiratide)。
肾上腺髓质素肽包括(但不限于)人肾上腺髓质素肽、肾上腺髓质素肽1-52；人肾上腺髓质素肽1-12；人肾上腺髓质素肽13-52；人肾上腺髓质素肽22-52；人肾上腺髓质素肽原(pro-adrenomedullin)45-92；；人肾上腺髓质素肽原153-185；猪肾上腺髓质素肽1-52；猪肾上腺髓质素肽原(N-20)；大鼠肾上腺髓质素肽1-50；大鼠肾上腺髓质素肽11-50和大鼠AM-N20原(proAM-N20)(肾上腺髓质素肽原N端20肽)。
咽侧体抑制激素肽包括(但不限于)咽侧体抑制激素肽I、咽侧体抑制激素肽II、咽侧体抑制激素肽III和咽侧体抑制激素肽IV。
胰淀素肽包括(但不限于)人乙酰基-胰淀素8-37、大鼠乙酰化胰淀素8-37、AC187胰淀素拮抗剂、AC253胰淀素拮抗剂、AC625胰淀素拮抗剂、人胰淀素8-37、猫胰淀素(IAPP)、胰淀素(胰岛瘤和岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide，IAPP))、人胰淀素酰胺、人胰淀素1-13(糖尿病相关肽1-13)、人胰淀素20-29(IAPP 20-29)、AC625胰淀素拮抗剂、人胰淀素8-37、猫胰淀素(IAPP)、大鼠胰淀素、大鼠胰淀素8-37、大鼠生物素基-胰淀素和人生物素基-胰淀素酰胺。
淀粉样β蛋白片段多肽包括(但不限于)阿尔兹海默氏症(Alzheimer′s disease)β蛋白12-28(SP17)、淀粉样β蛋白25-35、淀粉样β蛋白/A4-蛋白前驱体328-332、淀粉样β蛋白/A4蛋白前驱体(APP)319-335、淀粉样β蛋白1-43、淀粉样β蛋白1-42、淀粉样β蛋白1-40、淀粉样β蛋白10-20、淀粉样β蛋白22-35、阿尔兹海默氏症β蛋白(SP28)、大鼠β淀粉样肽1-42、大鼠β淀粉样肽1-40、β淀粉样蛋白1-11、β淀粉样蛋白31-35、β淀粉样蛋白32-35、β淀粉样蛋白35-25、β淀粉样蛋白/A4蛋白前驱体96-110、β淀粉样蛋白前驱体657-676、β淀粉样蛋白1-38、[Gln11]-阿尔兹海默氏症β蛋白、[Gln11]-β淀粉样蛋白1-40、[Gln22]-β淀粉样蛋白6-40、阿尔兹海默氏症淀粉样蛋白的非Aβ组分(NAC)、P3(Aβ17-40)阿尔兹海默氏症淀粉样β肽和SAP(血清淀粉样P组分)194-204。
血管紧张素肽包括(但不限于)A-779、Ala-Pro-Gly-血管紧张素II、[Ile3，Val5]-血管紧张素II、血管紧张素III抗肽(antipeptide)、血管生成素片段108-122、血管生成素片段108-123、血管紧张素I转换酶抑制剂、人血管紧张素I、血管紧张素I转换酶底物、人血管紧张素I 1-7、血管抑肽(angiopeptin)、人血管紧张素II、血管紧张素II抗肽、人血管紧张素II 1-4、人血管紧张素II 3-8、人血管紧张素II 4-8、人血管紧张素II 5-8、人血管紧张素III([Des-Asp1]-血管紧张素II)、血管紧张素III抑制剂([Ile7]-血管紧张素III)、血管紧张素转换酶抑制剂(Neothunnus macropterus)、美洲鮟鱇鱼(goosefish)[Asn1，Val5]-血管紧张素I、鲑鱼(salmon)[Asn1，Val5，Asn9]-血管紧张素I、鳗鱼(eel)[Asn1，Val5，Gly9]-血管紧张素I、鳗鱼、美洲鮟鱇鱼、鲑鱼[Asn，Val5]-血管紧张素I1-7、[Asn1，Val5]-血管紧张素II、人生物素基-血管紧张素I、人生物素基-血管紧张素II、生物素基--Ala-Ala-Ala-血管紧张素II、人[Des-Asp1]-血管紧张素I、[对氨基苯丙氨酸6]-血管紧张素II、人肾素底物(血管紧张素原(angiotensingen)1-13)、人preangiotensinogen 1-14(肾素底物十四肽)、猪肾素底物十四肽(血管紧张素原1-14)、[Sar1]-血管紧张素II、[Sar1]-血管紧张素II 1-7酰胺、[Sar1，Ala8]-血管紧张素II、[Sar1，Ile8]-血管紧张素II、[Sar1，Thr8]-血管紧张素II、[Sar1，Tyr(Me)4]-血管紧张素II(Sarmesin)、[Sar1，Val5，Ala8]-血管紧张素II、[Sar1，Ile7]-血管紧张素III、合成十四肽肾素底物(第2号)、[Val4]-血管紧张素III、[Val5]-血管紧张素II、人[Val5]-血管紧张素I、[Val5]-血管紧张素I、牛蛙[Val5，Asn9]-血管紧张素I和家禽[Val5，Ser9]-血管紧张素I。
抗生素肽包括(但不限于)Ac-SQNY、牛bactenecin、CAP 37(20-44)、碳甲氧基羰基-DPro-DPhe-OBzl(carbormethoxycarbonyl-DPro-DPhe-OBzl)、CD36肽P 139-155、CD36肽P 93-110、天蚕抗菌肽A-蜂毒素杂合肽(cecropin A-melittin hybrid peptide)[CA(1-7)M(2-9)NH2]、天蚕抗菌肽B游离酸、CYS(Bzl)84CD片段81-92、防御素(defensin)(人)HNP-2、皮抑菌素(dermaseptin)、人免疫刺激肽(immunostimulatingpeptide)、牛乳铁蛋白(BLFC)和蛙皮素隔离物(magainin spacer)。
可以引起强免疫应答、增强免疫应答和/或对疾病和/或疾病引发剂引起免疫有效应答的抗原多肽包括(但不限于)腺病毒、炭疽(anthrax)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussus)、肉毒杆菌(botulism)、牛鼻气管炎、卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis)、犬肝炎、犬瘟热、衣原体(Chlamydiae)、霍乱、球胞子菌(coccidiomycosis)、牛痘、细胞巨化病毒(cytomegalovirus)、登革热(Dengue fever)、登革弓形体病(denguetoxoplasmosis)、白喉、脑炎、产肠毒素的大肠杆菌(E.coli)、Epstein Barr病毒、马脑炎、马传染性贫血、马流行性感冒、马肺炎、马鼻病毒、大肠杆菌(Escherichia coli)、猫白血病、黄病毒属(flavivirus)、球蛋白、流感嗜血杆菌b型、流感嗜血杆菌、百日咳嗜血杆菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜血杆菌、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹病毒、HIV、HIV-1病毒、HIV-2病毒、HTLV、流行性感冒、日本脑炎、克雷伯菌(Klebsiellae species)、肺炎军团菌(Legionella pneumophila)、利什曼虫(leishmania)、麻风病、莱姆病(lyme disease)、疟疾免疫原、麻疹、脑膜炎、脑膜炎球菌、A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖、腮腺炎、腮腺炎病毒、分枝杆菌(mycobacteria)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、奈瑟氏菌(Neisseria)、
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、羊蓝舌病(ovine blue tongue)、羊脑炎、乳头瘤、副流感病毒、副粘病毒、百日咳(Pertussis)、瘟疫、肺炎球菌、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、肺炎、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、变形杆菌种(proteus species)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、风疹、沙门氏菌(salmonellae)、血吸虫病、志贺氏菌(shigellae)、猴免疫缺陷病毒、天花、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、葡萄球菌种(Staphylococcus species)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、链球菌种(Streptococcus species)、猪流行性感冒、破伤风、苍白螺旋体(Treponema pallidum)、伤寒、牛痘、水痘-带状疱疹病毒和霍乱弧菌(vibrio cholerae)。
抗菌肽包括(但不限于)buforin I、buforin II、天蚕抗菌肽(cecropin)A、天蚕抗菌肽B、猪天蚕抗菌肽P1、gaegurin 2(粗皮蛙(Rana rugosa))、gaegurin 5(粗皮蛙)、indolicidin、protegrin-(PG)-I、蛙皮素1与蛙皮素2和T-22[Tyr5，12，Lys7]-聚-phemusin II肽。
细胞凋亡相关肽包括(但不限于)阿尔兹海默氏症β蛋白(SP28)、钙蛋白酶抑制剂肽、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抑制剂V、半胱氨酸蛋白酶-3底物IV、细胞渗透性半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂I、半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂VI、荧光半胱氨酸蛋白酶-3底物III、荧光半胱氨酸蛋白酶-1底物V、细胞渗透性半胱氨酸蛋白酶-3抑制剂I、半胱氨酸蛋白酶-6 ICE抑制剂III、[Des-Ac，生物素]-ICE抑制剂III、IL-1B转换酶(ICE)抑制剂II、IL-1 B转换酶(ICE)底物IV、MDL 28170和MG-132。
心房利钠肽包括(但不限于)鸡α-ANP(α-chANP)；anantin；大鼠ANP 1-11；蛙ANP 8-30；蛙ANP 11-30；蛙ANP-21(fANP-21)；蛙ANP-24(fANP-24)；蛙ANP-30；人、犬ANP片段5-28；人ANP-7-23；人、犬ANP片段7-28；人、犬α-心房利钠多肽1-28；大鼠A71915；大鼠心房利钠因子8-33；人心房利钠多肽3-28；人、犬心房利钠多肽4-28；人心房利钠多肽5-27、鳗鱼心房利钠多肽(ANP)；大鼠、兔、小鼠心房肽(atriopeptin)I；大鼠、兔、小鼠心房肽II；大鼠、兔、小鼠心房肽III；大鼠心房利钠因子(rANF)；心耳肽A(auriculin A)(大鼠ANF 126-149)；心耳肽B(大鼠ANF 126-150)；β-ANP(1-28二聚体，逆平行)；β-rANF 17-48；人、犬生物素基-α-ANP 1-28；大鼠生物素基-心房利钠因子(生物素基-rANF)；人血管扩张素(cardiodilatin)1-16；大鼠C-ANF4-23；大鼠Des-[Cys105，Cys121]-心房利钠因子104-126；人[Met(O)12]ANP 1-28；大鼠[Mpr7，DAla9]ANP 7-28酰胺；人前ANF原(prepro-ANF)104-116；人前ANF原-ANF26-55(proANF 1-30)；人前ANF原56-92(proANF 31-67)；人前ANF原104-123；大鼠、兔、小鼠[Tyr0]-心房肽I；大鼠、兔、小鼠[Tyr0]-心房肽II；人[Tyr0]-前ANF原104-123；尿钠素(urodilatin)(CDD/ANP 95-126)；鳗鱼室性利尿钠肽(ventricular natriureticpeptide，VNP)和虹鳟鱼(rainbow trout)室性利尿钠肽(VNP)。
袋细胞肽包括(但不限于)α袋细胞肽、α-袋细胞肽1-9、α-袋细胞肽1-8、α-袋细胞肽1-7、β-袋细胞因子和γ-袋细胞因子。
铃蟾肽包括(但不限于)α-s1酪蛋白101-123(牛奶)、生物素基-铃蟾素、铃蟾素8-14、铃蟾素、[Leu13-ψ(CH2NH)Leu14]-铃蟾素、[D-Phe6，Des-Met14]-铃蟾素6-14乙酰胺、[DPhe12]铃蟾素、[DPhe12，Leu14]-铃蟾素、[Tyr4]-铃蟾素和[Tyr4，DPhe12]-铃蟾素。
骨GLA肽(BGP)包括(但不限于)骨GLA蛋白、骨GLA蛋白45-49、人[Glu17，Gla21，24]-骨钙素1-49、myclopeptide-2(MP-2)、人骨钙素1-49、人骨钙素37-49和人[Tyr38，Phe42，46]骨GLA蛋白38-49。
舒缓激肽包括(但不限于)[Ala2，6，des-Pro3]-舒缓激肽、舒缓激肽、舒缓激肽(Bowfin.Gar)、舒缓激肽加强肽、舒缓激肽1-3、舒缓激肽1-5、舒缓激肽1-6、舒缓激肽1-7、舒缓激肽2-7、舒缓激肽2-9、[DPhe7]舒缓激肽、[Des-Arg9]-舒缓激肽、[Des-Arg10]-Lys-舒缓激肽([Des-Arg10]-胰激肽(kallidin))、[D-N-Me-Phe7]-舒缓激肽、[Des-Arg9，Leu8]-舒缓激肽、Lys-舒缓激肽(胰激肽)、Lys-[Des-Arg9，Leu8]-舒缓激肽([Des-Arg10，Leu9]-胰激肽)、[Lys0-Hyp3]-舒缓激肽、卵激肽(ovokinin)、[Lys0，Ala3]-舒缓激肽、Met-Lys-舒缓激肽、肽K12舒缓激肽加强肽、[(pCl)Phe5，8]-舒缓激肽、T-激肽(Ile-Ser-舒缓激肽)、[Thi5，8，D-Phe7]-舒缓激肽、[Tyr0]-舒缓激肽、[Tyr5]-舒缓激肽、[Tyr8]-舒缓激肽和激肽释放酶(kallikrein)。
脑性利尿钠肽(BNP)包括(但不限于)犬BNP 32、鳗鱼BNP样肽、人BNP-32、小鼠BNP-45、猪BNP-26、猪BNP-32、猪生物素基-BNP-32、大鼠BNP-32、大鼠生物素基-BNP-32、大鼠BNP45(BNP 51-95，5K心脏利尿钠肽)和人[Tyr0]-BNP 1-32。
C肽包括(但不限于)C肽和人[Tyr0]C肽。
C型利尿钠肽(CNP)包括(但不限于)鸡C型利尿钠肽；猪、大鼠、人C型利尿钠肽-22(CNP-22)；人C型利尿钠肽-53(CNP-53)；猪、大鼠C型利尿钠肽-53(CNP-53)；C-型利尿钠肽-53(猪、大鼠)1-29(CNP-531-29)；大鼠前CNP原(prepro-CNP)1-27；猪、大鼠前CNP原30-50；血管钠肽(vasonatrin peptide)(VNP)；和[Tyr0]-C型利尿钠肽-22([Tyr0]-CNP-22)。
降钙素肽包括(但不限于)人生物素基-降钙素、大鼠生物素基-降钙素、鲑鱼生物素基-降钙素、鸡降钙素、鳗鱼降钙素、人降钙素、猪降钙素、大鼠降钙素、鲑鱼降钙素、人降钙素1-7、鲑鱼降钙素8-32、降钙蛋白(katacalcin)(PDN-21)(C-降钙素原(C-procalcitonin))和人N-proCT(氨基末端降钙素原裂解肽)。
降钙素基因相关肽(CGRP)包括(但不限于)人乙酰基-α-CGRP 19-37、人α-CGRP19-37、人α-CGRP 23-37、人生物素基-CGRP、人生物素基-CGRP II、大鼠生物素基-CGRP、大鼠β-CGRP、大鼠生物素基-β-CGRP、大鼠CGRP、人CGRP、降钙素C端邻近肽、人CGRP 1-19、人CGRP 20-37、人CGRP 8-37、人CGRP II、大鼠CGRP、大鼠CGRP 8-37、大鼠CGRP 29-37、大鼠CGRP 30-37、大鼠CGRP 31-37、大鼠CGRP 32-37、大鼠CGRP33-37、大鼠CGRP 31-37、([Cys(Acm)2，7]-CGRP、依降钙素(elcatonin)、人[Tyr0]-CGRP、人[Tyr0]-CGRP II、大鼠[Tyr0]-CGRP 28-37、大鼠[Tyr0]-CGRP和大鼠[Tyr22]-CGRP 22-37。
CART肽包括(但不限于)人CART、人CART 55-102、大鼠CART和大鼠CART55-102。
酪啡肽包括(但不限于)人β-酪啡肽、β-酪啡肽1-3、β-酪啡肽1-3酰胺、牛β-酪啡肽、牛β-酪啡肽1-4、牛β-酪啡肽1-5、牛β-酪啡肽1-5酰胺、牛β-酪啡肽1-6、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-3酰胺、[DAla2，Hyp4，Tyr5]-β-酪啡肽1-5酰胺、[DAla2，DPro4，Tyr5]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2，Tyr5]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2，4，Tyr5]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2，(pCl)Phe3]-β-酪啡肽酰胺、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-4酰胺、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-5、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2，Met5]-β-酪啡肽1-5、牛[DPro2]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-6、[DPro2]-β-酪啡肽1-4酰胺、牛[Des-Tyr1]-β-酪啡肽、牛[DAla2，4，Tyr5]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2，(pCl)Phe3]-β-酪啡肽酰胺、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-4酰胺、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-5、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2，Met5]-β-酪啡肽1-5、牛[DPro2]-β-酪啡肽1-5酰胺、牛[DAla2]-β-酪啡肽1-6、[DPro2]-β-酪啡肽1-4酰胺、牛[Des-Tyr1]-β-酪啡肽和牛[Val3]-β-酪啡肽1-4酰胺。
趋化肽包括(但不限于)防御素1(人)HNP-1(人嗜中性粒细胞肽-1)和N-甲酰基-Met-Leu-Phe。
胆囊收缩素(CCK)肽包括(但不限于)黄蛙素(caerulein)、胆囊收缩素、胆囊收缩素-肠促胰酶素(cholecystokinin-pancreozymin)、人CCK-33、胆囊收缩素八肽1-4(未经硫酸化)(CCK 26-29，未经硫酸化)、胆囊收缩素八肽(CCK 26-33)、胆囊收缩素八肽(未经硫酸化)(CCK 26-33，未经硫酸化)、胆囊收缩素七肽(CCK 27-33)、胆囊收缩素四肽(CCK 30-33)、猪CCK-33、CR 1409、胆囊收缩素拮抗剂、CCK侧肽(flankingpeptide)(未经硫酸化)、未经硫酸化N-乙酰基胆囊收缩素CCK 26-30、未经硫酸化N-乙酰基胆囊收缩素CCK 26-31、未经硫酸化N-乙酰基胆囊收缩素CCK 26-31、前CCK原片段V-9-M和丙谷胺(proglumide)。
集落刺激因子肽包括(但不限于)集落刺激因子(CSF)、GMCSF、MCSF和G-CSF。
促肾上腺皮质释放因子(CRF)肽包括(但不限于)astressin；α-螺旋CRF 12-41；羊生物素基-CRF；人、大鼠生物素基-CRF；牛CRF；人、大鼠CRF；羊CRF；猪CRF；人、大鼠[Cys21]-CRF；CRF拮抗剂(α-螺旋CRF 9-41)；人、大鼠CRF 6-33；人、大鼠[DPro5]-CRF；人、大鼠[D-Phe12，Nle21，38]-CRF 12-41；趋嗜曙红细胞肽(eosinophilotacticpeptide)；羊[Met(0)21]-CRF；羊[Nle21，Tyr32]-CRF；人前CRF原125-151；蛙蛙皮降压肽(sauvagine)；人、大鼠[Tyr0]-CRFt；羊[Tyr0]-CRF；羊[Tyr0]-CRF 34-41；[Tyr0]-优洛可定(urocortin)；人优洛可定酰胺；大鼠优洛可定；尿压素(urotensin)I(北美白鲤(Catostomus commersoni))；尿压素II；和尿压素II(湖蛙(Rana ridibunda))。
皮质醇稳定蛋白肽包括(但不限于)皮质醇稳定蛋白29、皮质醇稳定蛋白29(1-13)、[Tyr0]-皮质醇稳定蛋白29、皮质醇稳定蛋白原(pro-cortistatin)28-47和皮质醇稳定蛋白原51-81。
细胞因子肽包括(但不限于)肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子β(TNF-β)。
皮啡肽包括(但不限于)皮啡肽和皮啡肽类似物1-4。
强啡肽包括(但不限于)猪大强啡肽(强啡肽原(prodynorphin)209-240)、生物素基-强啡肽A(生物素基-强啡肽原209-225)、猪[DAla2，DArg6]-强啡肽A 1-13、猪[D-Ala2]-强啡肽A、猪[D-Ala2]-强啡肽A酰胺、猪[D-Ala2]-强啡肽A 1-13酰胺、猪[D-Ala2]-强啡肽A 1-9、猪[DArg6]-强啡肽A 1-13、猪[DArg8]-强啡肽A 1-13、[Des-Tyr1]-强啡肽A 1-8、猪[D-Pro10]-强啡肽A 1-11、猪强啡肽A酰胺、猪强啡肽A 1-6、猪强啡肽A 1-7、猪强啡肽A 1-8、猪强啡肽A 1-9、猪强啡肽A 1-10、猪强啡肽A 1-10酰胺、猪强啡肽A 1-11、猪强啡肽A 1-12、猪强啡肽A 1-13、猪强啡肽A 1-13酰胺、DAKLI(强啡肽A类似物κ配体)、DAKLI-生物素([Arg11，13]-强啡肽A(1-13)-Gly-NH(CH2)5NH-生物素)、猪强啡肽A 2-17、猪强啡肽2-17酰胺、猪强啡肽A 2-12、猪强啡肽A 3-17酰胺、猪强啡肽A 3-8、猪强啡肽A 3-13、猪强啡肽A 3-17、猪强啡肽A 7-17、猪强啡肽A 8-17、猪强啡肽A 6-17、猪强啡肽A 13-17、猪强啡肽A(强啡肽原209-225)、强啡肽B 1-9、[MeTyr1，MeArg7，D-Leu8]-强啡肽1-8乙酰胺、猪[(nMe)Tyr1]强啡肽A 1-13酰胺、猪[Phe7]-强啡肽A 1-7、猪[Phe7]-强啡肽A 1-7酰胺和猪强啡肽原228-256(强啡肽B 29)(leumorphin)。
内啡肽包括(但不限于)猪α-新内啡肽(alpha-neo-endorphin)；β-新内啡肽；骆驼、牛、羊Ac-β-内啡肽；骆驼、牛、羊Ac-β-内啡肽1-27；人Ac-β-内啡肽；人Ac-β-内啡肽1-26；人Ac-β-内啡肽1-27；Ac-γ-内啡肽(Ac-β-促脂素(Ac-beta-lipotropin)61-77)；乙酰基-α-内啡肽；α-内啡肽(β-促脂素61-76)；α-新内啡肽类似物；α-新内啡肽1-7；[Arg8]-α-新内啡肽1-8；骆驼、牛、羊β-内啡肽(β-促脂素61-91)；骆驼、牛、羊β-内啡肽1-27；马β-内啡肽；人β-内啡肽(β-促脂素61-91)；人β-内啡肽(1-5)+(16-31)；人β-内啡肽1-26；人β-内啡肽1-27；人β-内啡肽6-31；人β-内啡肽18-31；猪β-内啡肽；大鼠β-内啡肽；猪β-促脂素1-10；β-促脂素60-65；β-促脂素61-64；β-促脂素61-69；β-促脂素88-91；生物素基-β-内啡肽(生物素基-β-促脂素61-91)；人生物胞素(biocytin)-β-内啡肽；γ-内啡肽(β-促脂素61-77)；[DAla2]-α-新内啡肽1-2酰胺；[DAla2]-β-促脂素61-69；[DAla2]-γ-内啡肽；人[Des-Tyr1]-β-内啡肽；[Des-Tyr1]-γ-内啡肽(β-促脂素62-77)；骆驼、牛、羊[Leu5]-β-内啡肽；[Met5，Lys6]-α-新内啡肽1-6；[Met5，Lys6，7]-α-新内啡肽1-7；和[Met5，Lys6，Arg7]-α-新内啡肽1-7。
内皮素肽包括(但不限于)内皮素肽-1(ET-1)；内皮素肽-1[生物素-Lys9]；人内皮素肽-1(1-15)；人内皮素肽-1(1-15)酰胺；人Ac-内皮素肽-1(16-21)；人Ac-[DTrp16]-内皮素肽-1(16-21)；[Ala3，11]-内皮素肽-1；[Dprl，Asp15]-内皮素肽-1；人[Ala2]-内皮素肽-3；人[Ala18]-内皮素肽-1；人[Asn18]-内皮素肽-1；[Res-701-1]-内皮素肽B受体拮抗剂；Suc-[Glu9，Ala11，15]-内皮素肽-1(8-21)IRL-1620；内皮素肽-C端六肽；人[D-Val22]-大内皮素肽-1(16-38)；人、犬内皮素肽-2(ET-2)；人、大鼠、猪、兔内皮素肽-3(ET-3)；生物素基-内皮素肽-3(生物素基-ET-3)；猪前内皮素肽原-1(prepro-endothelin-1)(94-109)；BQ-518；BQ-610；BQ-788；内皮依赖性松弛拮抗剂(endothelium-dependentrelaxation antagonist)；FR139317；IRL-1038；JKC-301；JKC-302；PD-145065；PD-142893；蛇毒肽S6a(以色列毒蛇穴蝰(atractaspis engaddensis))；蛇毒肽S6b(以色列毒蛇穴蝰)；蛇毒肽S6c(以色列毒蛇穴蝰)；[Lys4]-蛇毒肽S6c；蛇毒肽S6d；人大内皮素肽-1；人生物素基-大内皮素肽-1；猪大内皮素肽-1(1-39)；人大内皮素肽-3(22-41)酰胺；大鼠大内皮素肽-1(22-39)；猪大内皮素肽-1(1-39)；猪大内皮素肽-1(22-39)；人大内皮素肽-1(19-38)、人大内皮素肽-1(22-38)；人大内皮素肽-2；人大内皮素肽-2(22-37)；人大内皮素肽-3；猪大内皮素肽-1；大内皮素肽-1(22-39)(前内皮素肽原-1(74-91))；大鼠大内皮素肽-1；人大内皮素肽-2(1-38)；人大内皮素肽-2(22-38)；大鼠大内皮素肽-3；人生物素基-大内皮素肽-1；和人[Tyr123]-前内皮素肽原(110-130)酰胺。
ETa受体拮抗剂肽包括(但不限于)[BQ-123]、[BE18257B]、[BE-18257A]/[W-7338A]、[BQ-485]、FR139317、PD-151242和TTA-386。
ETb受体拮抗剂肽包括(但不限于)[BQ-3020]、[RES-701-3]和[IRL-1720]。
脑啡肽包括(但不限于)adrenorphin游离酸、牛amidorphin(脑啡肽原(proenkephalin)A(104-129)-NH2)、BAM-12P(牛肾上腺髓质十二肽(bovine adrenal medulladocosapeptide))、BAM-22P(牛肾上腺髓质十二肽)、苯甲酰基-Phe-Ala-Arg、脑啡肽、[D-Ala2，D-Leu5]-脑啡肽、[D-Ala2，D-Met5]-脑啡肽、[DAla2]-Leu-脑啡肽酰胺、[DAla2，Leu5，Arg6]-脑啡肽、[Des-Tyr1，DPen2，5]-脑啡肽、[Des-Tyr1，DPen2，Pen5]-脑啡肽、[Des-Tyr1]-Leu-脑啡肽、[D-Pen2，5]-脑啡肽、[DPen2，Pen5]-脑啡肽、脑啡肽酶底物、[D-Pen2，pCI-Phe4，D-Pen5]-脑啡肽、Leu-脑啡肽、Leu-脑啡肽酰胺、生物素基-Leu-脑啡肽、[D-Ala2]-Leu-脑啡肽、[D-Ser2]-Leu-脑啡肽-Thr(δ受体肽(delta-receptor peptide))(DSLET)、[D-Thr2]-Leu-脑啡肽-Thr(DTLET)、[Lys6]-Leu-脑啡肽、[Met5，Arg6]-脑啡肽、[Met5，Arg6-脑啡肽-Arg、[Met5，Arg6，Phe7]-脑啡肽酰胺、Met-脑啡肽、生物素基-Met-脑啡肽、[D-Ala2]-Met-脑啡肽、[D-Ala2]-Met-脑啡肽酰胺、Met-脑啡肽-Arg-Phe、Met-脑啡肽酰胺、[Ala2]-Met-脑啡肽酰胺、[DMet2，Pro5]-脑啡肽酰胺、[DTrp2]-Met-脑啡肽酰胺，metorphinamide(adrenorphin)、牛肽B、牛3200道尔顿(Dalton)肾上腺肽(adrenal peptide)E、牛肽F、人前脑啡肽原(preproenkephalin)B 186-204、牛spinorphin和thiorphan(D，L，3-巯基-2-苄基丙酰基-甘氨酸)。
纤粘连蛋白肽包括(但不限于)人血小板因子-4(58-70)；蛇毒锯鳞蝗素(echistatin)(锯鳞蝰(Echis carinatus))；E，P，L选择素保守区(selectin conserved region)；纤粘连蛋白类似物；粘连蛋白结合蛋白；人血纤维蛋白肽A(fibrinopeptide A)；人[Tyr0]-血纤维蛋白肽A；人血纤维蛋白肽B；人[Glu1]-血纤维蛋白肽B；人[Tyr15]-血纤维蛋白肽B；24-42血纤蛋白原(fibrinogen)β链片段；血纤蛋白原结合抑制剂肽；纤粘连蛋白相关肽(胶原蛋白结合片段)；纤维蛋白溶解抑制因子(fibrinolysis inhibiting factor)；FN-C/H-1(纤粘连蛋白发夹结合片段)；FN-C/H-V(纤粘连蛋白发夹结合片段)；发夹结合肽；层粘蛋白五肽酰胺；人、牛、大鼠、鸡Leu-Asp-Val-NH2(LDV-NH2)；人necrofibrin；大鼠necrofibrin；和血小板膜糖蛋白IIB肽296-306。
甘丙肽包括(但不限于)人甘丙肽；人甘丙肽1-19；人前甘丙肽原(preprogalanin)1-30；人前甘丙肽原65-88；人前甘丙肽原89-123；猪甘丙肽；猪、大鼠甘丙肽1-16；大鼠甘丙肽；大鼠生物素基-甘丙肽；大鼠前甘丙肽原28-67；甘丙肽1-13-舒缓激肽2-9酰胺；M40，甘丙肽1-13-Pro-Pro-(Ala-Leu)2-Ala-酰胺；C7，甘丙肽1-13-spantide-酰胺；GMAP 1-41酰胺；GMAP 16-41酰胺；GMAP 25-41酰胺；galantide和肠肛褶蛙肽(entero-kassinin)。
胃泌素肽包括(但不限于)鸡胃泌素；人胃泌素抑制肽(GIP)；人胃泌素I；人生物素基-胃泌素I；人大胃泌素-1；人胃泌素释放肽；人胃泌素释放肽1-16；猪胃泌素抑制多肽(GIP)；猪胃泌素释放肽；猪生物素基-胃泌素释放肽；猪、人胃泌素释放肽14-27；大鼠小胃泌素；五胃泌素(pentagastrin)；猪胃泌素抑制肽1-30；猪胃泌素抑制肽1-30酰胺；人[Tyr0-胃泌素抑制肽23-42；和大鼠胃泌素抑制肽。
胰高血糖素肽包括(但不限于)人[Des-His1，Gh9]-胰高血糖素、exendin-4、胰高血糖素；人生物素基-胰高血糖素；人胰高血糖素19-29；人胰高血糖素22-29；[Des-His1Glu9]-胰高血糖素酰胺；胰高血糖素样肽1酰胺；人胰高血糖素样肽1；胰高血糖素样肽1(7-36)；大鼠胰高血糖素样肽2；生物素基-胰高血糖素样肽1(7-36)(生物素基-前胰高血糖素原(biotinyl-preproglucagon)78-107酰胺)；人胰高血糖素样肽2；插入肽2；胃泌酸调节素/胰高血糖素37；和猪缬酪肽(valosin)(肽VQY)。
Gn-RH相关肽(GAP)包括(但不限于)人Gn-RH相关肽25-53；人Gn-RH相关肽1-24；人Gn-RH相关肽1-13；大鼠Gn-RH相关肽1-13；人促性腺激素释放肽，滤泡性(follicular)；人[Tyr0]-GAP([Tyr0]-Gn-RH前驱物肽14-69)；和猪阿片促黑素皮质素原(proopiomelanocortin，POMC)前驱物27-52。
生长因子肽包括(但不限于)细胞生长因子、表皮生长因子、肿瘤生长因子、大鼠α-TGF、β-TF、α-TGF 34-43、人EGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子13-18、碱性成纤维细胞生长因子120-125、脑源性酸性成纤维细胞生长因子1-11、脑源性酸性成纤维细胞生长因子1-24、脑源性酸性成纤维细胞生长因子102-111、[Cys(Acm20，31)]-表皮生长因子20-31、表皮生长因子受体肽985-996、鸡胰岛素样生长因子(IGF)-I、大鼠IGF-I、人IGF-I、人Des(1-3)IGF-I、人R3IGF-I、人R3IGF-I、人长R3IGF-I、佐剂肽类似物、降低食欲的肽、人Des(1-6)IGF-II、人R6IGF-II、IGF-I类似物、IGF I(24-41)、IGF I(57-70)、IGF I(30-41)、IGF II、IGF II(33-40)、[Tyr0]-IGF II(33-40)、肝细胞生长因子、人中期因子、中期因子60-121、大鼠N-乙酰基α-TGF 34-43甲基酯、小鼠神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子拮抗剂、人转化生长因子-α和大鼠转化生长因子-I。
生长激素肽包括(但不限于)人生长激素(hGH)、人生长激素1-43、人生长激素6-13、人生长激素释放因子、牛生长激素释放因子、猪生长激素释放因子、大鼠生长激素释放因子1-29酰胺、人生长激素释放因子原(pro-releasing factor)、人生物素基-生长激素释放因子、人生长激素释放因子1-29酰胺、人[D-Ala2]-生长激素释放因子1-29酰胺、[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-GRF 1-29酰胺、[His1，Nle27]-生长激素释放因子1-32酰胺、人生长激素释放因子1-37、人生长激素释放因子1-40、人生长激素释放因子1-40酰胺、人生长激素释放因子30-44酰胺、小鼠生长激素释放因子、羊生长激素释放因子、大鼠生长激素释放因子、大鼠生物素基-生长激素释放因子、GHRP-6([His1，Lys6]-GHRP)、海沙瑞林(hexarelin)(生长激素释放六肽)和[D-Lys3]-GHRP-6。
GTP结合蛋白片段肽包括(但不限于)[Arg8]-GTP结合蛋白片段Gsα；GTP结合蛋白片段Gβ；GTP结合蛋白片段Gα；GTP结合蛋白片段Goα；GTP结合蛋白片段Gsα和GTP结合蛋白片段Gαi2。
鸟苷素肽包括(但不限于)人鸟苷素、大鼠鸟苷素和尿苷素。
抑制素肽包括(但不限于)牛抑制素、人抑制素α-亚单位1-32、人[Tyr0]-抑制α-亚单位1-32、人精浆抑制素样肽、人[Tyr0]-精浆抑制素样肽、猪抑制素α-亚单位1-32和猪[Tyr0]-抑制素α-亚单位1-32。
胰岛素肽包括(但不限于)人胰岛素、猪胰岛素、人IGF-I、胰岛素样生长因子II(69-84)、人胰岛素原样(pro-insulin-like)生长因子II(68-102)、人胰岛素原样生长因子II(105-128)、人[AspB28]-胰岛素、人[LysB28]-胰岛素、人[LeuB28]-胰岛素、人[ValB28]-胰岛素、人[AlaB28]-胰岛素、人[AspB28，ProB29]-胰岛素、人[LysB28，ProB29]-胰岛素、人[LeuB28，ProB29]-胰岛素、人[ValB28，Pro329]-胰岛素、人[AlaB28，ProB29]-胰岛素、人[GlyA21-胰岛素、人[GlyA21GlnB3]-胰岛素、人[AlaA21]-胰岛素、人[AlaA21Gln.sup.B3]胰岛素、人[GlnB3]-胰岛素、人[GlnB30]-胰岛素、人[GlyA21GluB30]-胰岛素、人[GlyA21GlnB3GluB30]-胰岛素、人[GlnB3GluB30]-胰岛素、人B22-B30胰岛素、人B23-B30胰岛素、人B25-B30胰岛素、人B26-B30胰岛素、人B27-B30胰岛素、人B29-B30胰岛素、人胰岛素A链和人胰岛素B链。
白细胞介素肽包括(但不限于)大鼠白细胞介素-1β165-181和大鼠白细胞介素-8(IL-8，CINC/gro)。
层粘蛋白肽包括(但不限于)层粘蛋白、大鼠α(I)-CB3435-438和层粘蛋白结合抑制剂。
瘦素肽包括(但不限于)人瘦素93-105、大鼠瘦素22-56、人Tyr-瘦素26-39和小鼠瘦素116-130酰胺。
白细胞激肽包括(但不限于)leucomyosuppressin(LMS)、白细胞激肽(LPK)、白细胞激肽I、白细胞激肽II、白细胞激肽III、白细胞激肽IV、白细胞激肽VI、白细胞激肽VII和白细胞激肽VIII。
黄体生成激素释放激素肽包括(但不限于)安泰得(antide)、鸡Gn-RH II、黄体生成激素释放激素(LH-RH)(GnRH)、生物素基-LH-RH、西曲瑞克(cetrorelix)(D-20761)、[D-Ala6]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH(鸡LH-RH)、[DLeu6，Val7]LH-RH 1-9乙酰胺、[D-Lys6]-LH-RH、[D-Phe2，Pro3，D-Phe6]-LH-RH、[DPhe2，DAla6]LH-RH、[Des-Gly10]-LH-RH乙酰胺、[D-Ala6，Des-Gly10]-LH-RH乙酰胺、[DTrp6]-LH-RH乙酰胺、[D-Trp6，Des-Gly10]-LH-RH乙酰胺(德舍瑞林(Deslorelin))、[DSer(But)6，Des-Gly10]-LH-RH乙酰胺、乙酰胺、亮丙瑞林(leuprolide)、LH-RH 4-10、LH-RH 7-10、LH-RH游离酸、八目鳗(lanprey)LH-RH、鲑鱼LH-RH、[Lys8]-LH-RH、[Trp7，Leu8]LH-RH游离酸和[(t-Bu)DSer6，(Aza)Gly10]-LH-RH。
蜂毒肽包括(但不限于)蜂毒肽、mas7、mas8、mas17和蜂毒肽X。
肥大细胞脱粒肽包括(但不限于)肥大细胞脱粒肽HR-1和肥大细胞脱粒肽HR-2。
促黑素细胞激素(MSH)肽包括(但不限于)[Ac-Cys4，DPhe7，Cys10]α-MSH 4-13酰胺、α-促黑素细胞激素、α-MSH游离酸、猪β-MSH、生物素基-α-促黑素细胞激素、生物素基-[Nle4，D-Phe7]α-促黑素细胞激素、[Des-乙酰基]-α-MSH、[DPhe7]-α-MSH酰胺、γ-1-MSH酰胺、[Lys0]-γ-1-MSH酰胺、MSH释放抑制因子酰胺、[Nle4]-α-MSH酰胺、[Me4，D-Phe7]-α-MSH、N-乙酰基[Nle4，DPhe7]α-MSH 4-10酰胺、人β-MSH和γ-MSH。
吗啡肽包括(但不限于)吗啡肽(β-酪啡肽1-4酰胺)、[D-Pro4]-吗啡肽和[N-MePhe3，D-Pro4]-吗啡肽。
胃动素肽包括(但不限于)犬胃动素、猪胃动素、猪生物素基-胃动素和猪[Leu13]胃动素。
神经肽包括(但不限于)Ac-Asp-Glu、玛瑙螺(achatina)强心肽-1(cardio-excitatorypeptide-1)(ACEP-1)(褐云玛瑙螺(Achatina fulica))、脂肪动员激素(AKH)(蝗虫(Locust))、脂肪动员激素(玉米夜蛾(Heliothis zea)和烟草天蛾(Manduca sexta))、alytesin、Tabanus atratus脂肪动员激素(Taa-AKH)、脂肪动员激素II(东亚飞蝗(Locustamigratoria))、脂肪动员激素II(沙漠蝗(Schistocera gregaria))、脂肪动员激素III(AKH-3)、脂肪动员激素G(AKH-G)(双斑蟋(Gryllus bimaculatus))、促咽侧体素(allatotropin，AT)(烟草天蛾)、促咽侧体素6-13(烟草天蛾)、APGW酰胺(静水椎实螺(Lymnaeastagnalis))、颊肽(buccalin)、小脑肽(cerebellin)、[Des-Ser1]-小脑肽、corazonin(美洲大蠊(American Cockroach Periplaneta Americana))、甲壳动物心激肽(CCAP)、甲壳动物红色素胞(crustacean erythrophore)、DF2(克氏原螯虾(Procambarus clarkii))、人地西泮(diazepam)结合抑制剂片段、地西泮结合抑制剂片段(ODN)、章鱼素(eledoisin)相关肽、FMRF酰胺(软体动物强心神经肽)、人Gly-Pro-Glu(GPE)、颗粒释放肽(granuliberin)R、头激活剂(head activator)神经肽、[His7]-corazonin、竹节虫hypertrehalosaemic因子II、Tabanus atratus hypotrehalosemic激素(Taa-HoTH)、异去甲槟榔次碱盐酸盐(isoguvacine hydrochloride)、甲碘荷包牡丹碱(bicuculline methiodide)、哌啶-4-磺酸、牛阿片促黑素皮质素原(POMC)连接肽(joining peptide)、大鼠连接肽、KSAYMRF酰胺(腐生线虫(P.redivivus))、肛褶蛙肽、kinetensin、levitide、雨滨蛙肽(litorin)、LUQ 81-91(美国加州海兔(Aplysia californica))、LUQ 83-91(美国加州海兔)、肌肉活性肽(myoactive peptide)I(Periplanetin CC-1)(神经激素D)、肌肉活性肽II(Periplanetin CC-2)、肌调蛋白(myomodulin)、神经元特异性肽、大鼠神经元特异性烯醇酶404-443、神经肽FF、猪神经肽K、大鼠NEI(前MCH原(prepro-MCH)131-143)神经肽、大鼠NGE(前MCH原110-128)神经肽、NF1(克氏原螯虾)、PBAN-1(桑蚕(Bombyx mori))、Hez-PBAN(玉米夜蛾)、SCPB(来自海兔(aplysia)的心激肽)、大鼠secretoneurin、耳腺蛙肽(uperolein)、urechistachykinin I、urechistachykinin II、爪蟾肽(xenopsin)相关肽I、爪蟾肽相关肽II、海兔足肽(pedal peptide)，Pep)、龙虾(lobster)肽F1叶母素(phyllomedusin)、马蜂(polistes)蜂毒肽、原肠肽(proctolin)、蛙紧张肽(ranatensin)、Ro I(Lubber Grasshopper、Romalea microptera)、Ro II(Lubber Grasshopper、Romalea microptera)、SALMF酰胺1(S1)、SALMF酰胺2(S2)和SCPA。
神经肽Y(NPY)肽包括(但不限于)人[Leu31，Pro34]-神经肽Y；神经肽F(莫尼茨绦虫(Moniezia expansa))；B1BP3226NPY拮抗剂；双(31/31′){[Cys31，Trp32，Nva34]NPY31-36}；人、大鼠神经肽Y；人神经肽Y 1-24酰胺；生物素基-神经肽Y；[D-Tyr27，36，D-Thr32]-NPY 27-36；Des 10-17(环7-21)[Cys7，21，Pro34]-NPY；C2-NPY；人[Leu31，Pro34]神经肽Y；人神经肽Y游离酸；猪神经肽Y游离酸；人前NPY 68-97原(prepro NPY68-97)；N-乙酰基-[Leu28，Leu31]NPY 24-36；猪神经肽Y；猪[D-Trp32]-神经肽Y；人[D-Trp32]NPY 1-36；人[Leu17，DTrp32]神经肽Y；猪[Leu31，Pro34]-NPY；猪NPY 2-36；人NPY 3-36；猪NPY 3-36；人NPY 13-36；猪NPY 13-36；猪NPY 16-36；猪NPY 18-36；NPY 20-36；NFY 22-36；NPY 26-36；人[Pro34]-NPY 1-36；猪[Pro34]-神经肽Y；PYX-1；PYX-2；T4-[NPY(33-36)]4和人Tyr(OMe)21]-神经肽Y。
神经营养因子肽包括(但不限于)胶质源性神经营养因子(glial derived neurotropicfactor，GDNF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotropic factor，BDNF)和睫状神经营养因子(brain derived neurotropic factor，CNTF)。
食欲素肽包括(但不限于)食欲素A；人食欲素B；大鼠、小鼠食欲素B。
阿片样肽包括(但不限于)α-酪蛋白片段90-95、BAM-18P、casomokinin L、casoxinD、结晶体(crystalline)、DALDA、皮脑啡肽(dermenkephalin)(新皮啡肽)(Phylomedusasauvagei)、[D-Ala2]-新皮啡肽I、[D-Ala2]-新皮啡肽II、内吗啡肽(endomorphin)-1、内吗啡肽-2、京都啡肽(kyotorphin)、[DArg2]-京都啡肽、吗啡耐受肽、吗啡调节肽C端片段、吗啡调节神经肽(A-18-F-NH2)、痛啡肽(nociceptin)[孤啡肤(orphanin)FQ](ORL1激动剂)、TIPP、Tyr-MIF-1、Tyr-W-MIF-1、valorphin、人LW-血啡肽(hemorphin)-6、Leu-valorphin-Arg和Z-Pro-D-Leu。
缩宫素肽包括(但不限于)[Asu6]-缩宫素、缩宫素、生物素基-缩宫素、[Thr4，Gly7]-缩宫素和tocinoic acid([Ile3]-pressinoic acid)。
PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活肽)肽包括(但不限于)人、羊、大鼠PACAP 1-27；人PACAP(1-27)-Gly-Lys-Arg-NH2；人、羊、大鼠[Des-Gln16]-PACAP 6-27；蛙PACAP38；人、羊、大鼠PACAP27-NH2；人、羊、大鼠生物素基-PACAP27-NH2；人、羊、大鼠PACAP 6-27；人、羊、大鼠PACAP38；人、羊、大鼠生物素基-PACAP38；人、羊、大鼠PACAP 6-38；人、羊、大鼠PACAP27-NH2；人、羊、大鼠生物素基-PACAP27-NH2；人、羊、大鼠PACAP 6-27；人、羊、大鼠PACAP38；人、羊、大鼠生物素基-PACAP38；人、羊、大鼠PACAP 6-38；人、羊、大鼠PACAP3816-38；人、羊、大鼠PACAP3831-38；人、羊、大鼠PACAP3831-38；人PACAP相关肽(PRP)和大鼠PACAP相关肽(PRP)。
胰抑素肽包括(但不限于)牛嗜铬粒抑制蛋白(chromostatin)、胰抑素(hPST-52)(嗜铬粒蛋白(chromogranin)A 250-301酰胺)、人胰抑素24-52(hPST-29)、人嗜铬粒蛋白A 286-301酰胺、猪胰抑素、猪生物素基-胰抑素、猪[Nle8]-胰抑素、猪[Tyr0，Nle8]-胰抑素、猪[Tyr0]-胰抑素、猪parastatin1-19(嗜铬粒蛋白A 347-365)、大鼠胰抑素(嗜铬粒蛋白A 264-314-酰胺、生物素基-胰抑素(生物素基-嗜铬粒蛋白A 264-314-酰胺、大鼠[Tyr0]-胰抑素、大鼠胰抑素26-51和猪胰抑素33-49。
胰多肽包括(但不限于)鸟胰多肽、人胰多肽、人C-片段胰多肽酸、人C-片段胰多肽酰胺、胰多肽(林蛙(Rana temporaria))、大鼠胰多肽和鲑鱼胰多肽。
甲状旁腺激素肽包括(但不限于)人[Asp76-甲状旁腺激素39-84、人[Asp76]-甲状旁腺激素53-84、[Asn76]-甲状旁腺激素1-84激素、人[Asn76]-甲状旁腺激素64-84、人[Asn8，Leu18]-甲状旁腺激素1-34、人[Cys5，28]-甲状旁腺激素1-34、高钙血症恶性因子(hypercalcemia malignancy factor)1-40、人[Leu18]-甲状旁腺激素1-34、[Lys(生物素基)13，Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺、[Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺、牛[Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素3-34酰胺、人[Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素1-34、人[Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺、人[Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素3-34酰胺、牛[Nle8，18，Tyr34]-甲状旁腺激素7-34酰胺、大鼠[Nle8，21，Tyr34]-甲状旁腺激素1-34酰胺、人甲状旁腺激素44-68、牛甲状旁腺激素1-34、牛甲状旁腺激素3-34、人甲状旁腺激素1-31酰胺、人甲状旁腺激素1-34、人甲状旁腺激素13-34、大鼠甲状旁腺激素1-34、人甲状旁腺激素1-38、人甲状旁腺激素1-44、人甲状旁腺激素28-48、人甲状旁腺激素39-68、人甲状旁腺激素39-84、人甲状旁腺激素53-84、人甲状旁腺激素69-84、人甲状旁腺激素70-84、人[Pro34]-肽YY(PYY)、[Tyr0]-高钙血症恶性因子1-40、人[Tyr0]-甲状旁腺激素1-44、人[Tyr0]-甲状旁腺激素1-34、人[Tyr1]-甲状旁腺激素1-34、人[Tyr27]-甲状旁腺激素27-48、牛[Tyr34]-甲状旁腺激素7-34酰胺、人[Tyr43]-甲状旁腺激素43-68、人[Tyr52，Asn76]-甲状旁腺激素52-84和人[Tyr63]-甲状旁腺激素63-84。
甲状旁腺激素(PTH)相关肽包括(但不限于)鸡PTHrP([Tyr36]-PTHrP 1-36酰胺)；人hHCF-(1-34)-NH2(体液高钙性因子(humoral hypercalcemic factor))；人PTH-相关蛋白1-34；人生物素基-PTH-相关蛋白1-34；人[Tyr0]-PTH-相关蛋白1-34；人[Tyr34]-PTH-相关蛋白1-34酰胺；人PTH-相关蛋白1-37；人PTH-相关蛋白7-34酰胺；人PTH-相关蛋白38-64酰胺；人PTH-相关蛋白67-86酰胺；人、大鼠、小鼠PTH-相关蛋白107-111；PTH-相关蛋白107-111游离酸；人PTH-相关蛋白107-138和人PTH-相关蛋白109-111。
肽T肽包括(但不限于)肽T、[D-Ala1]-肽T和[D-Ala1]-肽T酰胺。
催乳素释放肽包括(但不限于)人催乳素释放肽31、人催乳素释放肽20、大鼠催乳素释放肽31、大鼠催乳素释放肽20、牛催乳素释放肽31和牛催乳素释放肽20。
肽YY(PYY)肽包括(但不限于)人PYY；人PYY 3-36；人生物素基-PYY；猪、大鼠PYY和人[Leu31，Pro34]-PYY。
肾素底物肽包括(但不限于)人乙酰基血管紧张素原1-14、猪血管紧张素原1-14、大鼠肾素底物十四肽、大鼠[Cys8]-肾素底物十四肽、大鼠[Leu8]-肾素底物十四肽和大鼠[Val8]-肾素底物十四肽。
胰泌素肽包括(但不限于)犬胰泌素、鸡胰泌素、人胰泌素、人生物素基-胰泌素、猪胰泌素和大鼠胰泌素。
生长抑素(GIF)肽包括(但不限于)BIM-23027、生物素基-生长抑素、人生物素基化皮质醇稳定蛋白17、大鼠皮质醇稳定蛋白14、人皮质醇稳定蛋白17、人[Tyr0]-皮质醇稳定蛋白17、大鼠皮质醇稳定蛋白29、[D-Trp8]-生长抑素、[DTrp8，DCys14]-生长抑素、[DTrp8，Tyr11]-生长抑素、[D-Trp11]-生长抑素、NTB(Naltriben)、[Nle8]-生长抑素1-28、奥曲肽(octreotide)(SMS 201-995)、猪生长抑素原(prosomatostatin)1-32、[Tyr0]-生长抑素、[Tyr1]-生长抑素、[Tyr1]-生长抑素28(1-14)、[Tyr11]-生长抑素、[Tyr0，D-Trp8]-生长抑素、生长抑素、生长抑素拮抗剂、生长抑素-25、生长抑素-28、生长抑素28(1-12)、生物素基-生长抑素-28、[Tyr0]-生长抑素-28、[Leu8，D-Trp22，Tyr25]-生长抑素-28、生物素基-[Leu8，D-Trp22，Tyr25]-生长抑素-28、生长抑素-28(1-14)和生长抑素类似物RC-160。
物质P肽包括(但不限于)G蛋白拮抗剂-2、Ac-[Arg6，Sar9，Met(O2)11]-物质P 6-11、[Arg3]-物质P、Ac-Trp-3，5-双(三氟甲基)苄酯、Ac-[Arg6，Sar9，Met(O2)11]-物质P 6-11、[D-Ala4]-物质P 4-11、[Tyr6，D-Phe7，D-His9]-物质P 6-11(sendide)、生物素基-物质P、生物素基-NTE[Arg3]-物质P、[Tyr8]-物质P、[Sar9，Met(O2)11]-物质P、[D-Pro2，DTrp7，9]-物质P、[D-Pro4，O-Trp7，9]-物质P 4-11、物质P 4-11、[DTrp2，7，9]-物质P、[(脱氢)Pro2，4，Pro9]-物质P、[脱氢-Pro4]-物质P 4-11、[Glp5，(Me)Phe8，Sar9]-物质P 5-11、[Glp5，Sar9]-物质P 5-11、[Glp5]-物质P 5-11、七-物质P(hepta-substance P)(物质P 5-11)、六-物质P(物质P 6-11)、[MePhe8，Sar9]-物质P、[Nle11]-物质P、八-物质P(物质P 4-11)、[pGlu1]-六-物质P([pGlu6]-物质P 6-11)、[pGlu6，D-Pro9]-物质P 6-11、[(pNO2)Phe7Nle11]-物质P、五-物质P(物质P 7-11)、[Pro9]-物质P、GR73632物质P 7-11、[Sar4]-物质P 4-11、[Sar9]-物质P、septide([pGlu6，Pro9]-物质P 6-11)、spantide I、spantide II、物质P、鳕鱼(cod)物质P、鳟鱼(trout)物质P、物质P拮抗剂、物质P-Gly-Lys-Arg、物质P 1-4、物质P 1-6、物质P 1-7、物质P 1-9、十-物质P(物质P 2-11)、九-物质P(物质P 3-11)、物质P四肽(物质P 8-11)、物质P三肽(物质P 9-11)、物质P游离酸、物质P甲基酯和[Tyr8，Nle11]物质P。
速激肽包括(但不限于)[Ala5，β-Ala8]神经激肽A 4-10、章鱼素、locustatachykinin I(Lom-TK-I)(东亚飞蝗)、locustatachykinin II(Lom-TK-II)(东亚飞蝗)、神经激肽A4-10、神经激肽A(神经介素(neuromedin)L，物质K)、鳕鱼和鳟鱼神经激肽A、生物素基-神经激肽A(生物素基-神经介素L，生物素基-物质K)、[Ty0]-神经激肽A、[Tyr6]-物质K、FR64349、[Lys3，Gly8-(R)-γ-内酰胺-Leu9]-神经激肽A 3-10、GR83074、GR87389、GR94800、[β-Ala8]-神经激肽A 4-10、[Nle10]-神经激肽A 4-10、[Trp7，β-Ala8]-神经激肽A 4-10、神经激肽B(神经介素K)、生物素基-神经激肽B(生物素基-神经介素K)、[MePhe 7]-神经激肽B、[Pro7]-神经激肽B、[Tyr0]-神经激肽B、猪神经介素B、猪生物素基-神经介素B、猪神经介素B-30、猪神经介素B-32、神经介素B受体拮抗剂、猪神经介素C、猪神经介素N、猪神经介素(U-8)、猪神经介素(U-25)、大鼠神经介素U、神经肽-γ(γ-前速激肽原(gamma-preprotachykinin)72-92)、PG-KII、叶泡雨滨蛙肽(phyllolitorin)、[Leu]-叶泡雨滨蛙肽(Phyllomedusa sauvagei)、泡蛙肽(physalaemin)、泡蛙肽1-11、角鲨(dogfish)scyliorhinin II酰胺、senktide，选择性神经激肽B受体肽、[Ser2]-神经介素C、人β-前速激肽原69-91、人β-前速激肽原111-129、鲎肽素(tachyplesin)I、爪蟾肽和人爪蟾肽25(xenin25)。
促甲状腺素释放激素(TRH)肽包括(但不限于)生物素基-促甲状腺素释放激素、[Glu1]-TRH、His-Pro-二酮哌嗪、[3-Me-His2]-TRH、pGlu-Gln-Pro-酰胺、pGlu-His、[Phe2]-TRH、前TRH原53-74、前TRH原83-106、前TRH原160-169(Ps4，TRH-加强肽)、前TRH原178-199促甲状腺素释放激素(TRH)、TRH游离酸、TRH-SH Pro和TRH前驱物肽。
毒素肽包括(但不限于)ω-agatoxin TK、agelenin(蜘蛛，Agelena opulenta)、蜂毒明肽(apamin)(蜜蜂，意大利蜜蜂(Apis mellifera))、calcicudine(CaC)(绿曼巴蛇(greenmamba)，Dedroaspis angusticeps)、calciseptine(黑曼巴蛇(black mamba，Dendroaspispolylepis polylepis))、卡律蝎毒素(charybdotoxin)(ChTX)(蝎子，Leiurusquinquestriatus var.hebraeus)、氯毒素、芋螺毒素(conotoxin)GI(海螺(marine snail)，地纹芋螺(Conus geographus))、芋螺毒素GS(海螺，地纹芋螺)、芋螺毒素MI(海芋螺(Marine Conus magus))、乌龟芋螺(Conus ermineus)α-芋螺毒素EI、α-芋螺毒素SIA、α-芋螺毒素ImI、ω-芋螺毒素SI(锥螺(cone snail)，线纹芋螺(Conus striatus))、微-芋螺毒素(micro-conotoxin)GIIIB(海螺，地纹芋螺)、ω-芋螺毒素GVIA(海螺，地纹芋螺)、ω-芋螺毒素MVIIA(芋螺)、ω-芋螺毒素MVIIC(芋螺)、ω-芋螺毒素SVTB(锥螺，线纹芋螺)、内毒素抑制剂、geographutoxin I(GTX-I)(μ-芋螺毒素GIIIA)、iberiotoxin(IbTX)(蝎子，Buthus tamulus)、kaliotoxin 1-37、kaliotoxin(蝎子，北非蝎子(Androctonus mauretanicus mauretanicus))、肥大细胞脱粒肽(MCD-肽，肽401)、玛格毒素(margatoxin)(MgTX)(蝎子，墨西哥木蝎(Centruriodes Margaritatus))、神经毒素NSTX-3(巴布亚新几内亚蜘蛛(Papua New Guinean spider)，Nephilia maculata)、PLTX-II(蜘蛛，Plectreurys tristes)、scyllatoxin(leiurotoxin I)和海葵毒素(stichodactylatoxin)(ShK)。
血管活性肠肽(VIP/PHI)包括(但不限于)人、猪、大鼠、羊VIP；VIP-Gly-Lys-Arg-NH2；猪生物素基-PHI(生物素基-PHI-27)；猪[Glp16]VIP 16-28；猪PHI(PHI-27)；大鼠PHI(PHI-27)；人PHM-27(PHI)；人前VIP原81-122；前VIP/PHM原111-122；前VIP/PHM原156-170；人生物素基-PHM-27(生物素基-PHI)；血管活性肠收缩剂(vasoactive intestinal contractor)(内皮素肽-β)；鸡血管活性肠二十八肽；豚鼠血管活性肠肽；人、猪、大鼠生物素基-VIP；人、猪、大鼠血管活性肠肽1-12；人、猪、大鼠血管活性肠肽10-28；人、猪、大鼠、羊血管活性肠肽11-28；血管活性肠肽(鳕鱼，大西洋鳕(Gadus morhua))；血管活性肠肽6-28；血管活性肠肽拮抗剂；血管活性肠肽拮抗剂([Ac-Tyr1，D-Phe2]-GHRF 1-29酰胺)；血管活性肠肽受体拮抗剂(4-Cl-D-Phe6，Leu17)-VIP)和血管活性肠肽受体结合抑制剂L-8-K。
血管加压素(ADH)肽包括(但不限于)血管加压素、[Asu1，6，Arg8]-血管加压素、加压催产素(vasotocin)、[Asu1，6，Arg8]-加压催产素、[Lys8]-血管加压素、pressinoic acid、[Arg8]-去氨基血管加压素脱甘氨酰胺、[Arg8]-血管加压素(AVP)、[Arg8]-血管加压素脱甘氨酰胺、生物素基-[Arg8]-血管加压素(生物素基-AVP)、[D-Arg8]-血管加压素、去氨基-[Arg8]-血管加压素、去氨基-[D-Arg8]-血管加压素(DDAVP)、[去氨基-[D-3-(3′-吡啶基-Ala)]-[Arg8]-血管加压素、[1-(β-巯基-β，β-环五亚甲基丙酸)，2-(O-甲基)酪氨酸]-[Arg8]-血管加压素、血管加压素代谢神经肽[pGlu4，Cys6]、血管加压素代谢神经肽[pGlu4，Cys6]、[Lys8]-去氨基血管加压素脱甘氨酰胺、[Lys8]-血管加压素、[Mpr1，Val4，DArg8]-血管加压素、[Phe2，Ile3，Orn8]-血管加压素([Phe2，Orn8]-加压催产素)、[Arg8]-加压催产素和[d(CH2)5，Tyr(Me)2，Orn8]-加压催产素。
病毒相关肽包括(但不限于)荧光性人CMV蛋白酶底物病毒膜融合蛋白、HCV核心蛋白59-68、HCV NS4A蛋白18-40(JT菌株)、HCV NS4A蛋白21-34(JT菌株)、乙型肝炎病毒受体结合片段、乙型肝炎病毒前S区120-145、[Ala127]-乙型肝炎病毒前S区120-131、肝炎病毒抑制剂2、HIV包膜蛋白片段254-274、HIV gag片段129-135、HIV底物、P 18肽、肽T、[3，5二碘-Tyr7]肽T、R15K HIV-1抑制肽、T20、T21、V3十肽P 18-110和病毒复制抑制肽。
人激素胰高血糖素是在胰腺A细胞中产生的29氨基酸肽激素。所述激素属于包括胰泌素、胃抑制肽、血管活性肠肽和肠高糖素在内的结构相关肽的多基因家族。这些肽不同地调节碳水化合物代谢、胃肠运动和分泌加工。然而，胰腺胰高血糖素的主要公认的作用是促进肝糖原分解和糖原异生作用，从而导致血糖含量上升。就此而言，胰高血糖素的作用是反向调节胰岛素，并且可能有助于伴随糖尿病的高血糖症[Lund，P.K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，79：345-349(1982)]。
发现胰高血糖素能够结合位于产生胰岛素的细胞表面上的特异性受体。当胰高血糖素结合这些受体时，其通过这些细胞刺激cAMP的快速合成。已经发现cAMP又反过来刺激胰岛素表达[Korman，L.Y.等人，Diabetes，34：717-722(1985)]。胰岛素起作用以抑制胰高血糖素合成[Ganong，W.F.，Review of Medical Physiology，Lange Publications，LosAltos，Calif，第273页(1979)]。因此，通过胰岛素并最终通过血清葡萄糖含量来小心地调节胰高血糖素表达。
胰高血糖素基因最初由360碱基对前驱物翻译以形成多肽前胰高血糖素原[Lund等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：345-349(1982)]。随后将这个多肽加工以形成胰高血糖素原。Patzelt，C等人，Nature，282：260-266(1979)证实胰高血糖素原随后被裂解成胰高血糖素和第二多肽。Lund，P.K.等人，上文，Lopez L.C等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：5485-5489(1983)，和Bell，G.I.等人，Nature 302：716-718(1983)随后所进行的工作证实，胰高血糖素原分子在赖氨酸-精氨酸二肽残基之后立即被裂解。关于斑点叉尾鮰(channel catfish(Ictalurus punctata))所产生的胰高血糖素原的研究指出，此动物的胰高血糖素也在邻近赖氨酸-精氨酸二肽残基之后经蛋白水解作用而裂解[Andrews P.C等人，J.Biol.Chem.，260：3910-3914(1985)，Lopez，L.C等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：5485-5489(1983)]。Bell，G.I.等人(上文)发现哺乳动物胰高血糖素原在赖氨酸-精氨酸或精氨酸-精氨酸二肽处裂解，并且证实胰高血糖素原分子含有三个不连续的并且高度均匀的肽分子，命名为胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)和胰高血糖素样肽2(GLP-2)。Lopez等人推断，胰高血糖素样肽1为37个氨基酸残基长度，而胰高血糖素样肽2为34个氨基酸残基长度。对大鼠前胰高血糖素原结构的类似研究显示在赖氨酸-精氨酸或精氨酸-精氨酸二肽残基之间相似类型的蛋白水解引起的裂解，从而导致形成胰高血糖素、GLP-1和GLP-2[Heinrich，G.等人，Endocrinol.，115：2176-2181(1984)]。
胰高血糖素样肽2(GLP-2)是由多效性胰高血糖素基因以组织特异性方式表达的33氨基酸肽。GLP-2在氨基酸序列方面展示与胰高血糖素和胰高血糖素样肽1(GLP-1)的显著同源性。此外，不同哺乳动物形式的GLP-2均高度保守。人类GLP-2序列如下：His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。此外，许多激动剂GLP-2肽描述于1997年4月11日申请的PCT申请案PCT/CA97/00252中。类似物描述于6,051,557中，并且GLP-2变体的实例见美国专利第5,990,077号和第6,184,201号。
最近证实GLP-2是促肠肽激素(intestinotrophic peptide hormone)(Drucker等人，(1996)PNAS，93：7911-7916)。当外源给予时，GLP-2可以引起测试小鼠小肠上皮细胞增殖的显著增加，并且明显无不利副作用。随后显示，具有肽序列某些修饰的天然GLP-2的肽类似物具有增强的促肠活性(美国专利申请案第08/669,791号)。此外，GLP-2也已经展示增加跨越肠管周膜(intestinal basolateral membrane)的D-葡萄糖最大运输速率(Cheeseman和Tseng(1996)American Journal of Physiology 27LG477-G482)。
已经证实，结构上与GLP-2不相关的许多肽激素(IGF-2、IGF-1、GH)具有不同程度的促肠活性。(美国专利第5,482,926号、WO 91/12018、美国专利第5,288,703号)。然而，上述肽激素均不具有GLP-2在促进肠上皮细胞增殖中的功效或特异性。GLP-2与肽激素IGF-1和/或GH协同作用以促进大肠内的细胞增殖。此外，此组合疗法对小肠和大肠的促肠作用大于单独使用任一者的作用。共同投与GLP-2与IGF-2促进小肠和/或大肠组织的生长讨论于美国专利第5,952,301号中。
已经分离出编码GLP-2受体的核酸，并且描述有鉴别GLP-2受体激动剂的方法(美国专利申请案第08/767,224号和美国第08/845,546号)。已经讨论GLP-2在涉及食道和胃的疾病中、在帮助处于发展上胃肠道机能失调危险中的患者中、和在增加上胃肠道内组织生长中的作用(见美国专利第6,051,557号)。GLP-2受体激动剂起作用以增强大肠发挥功能。(美国专利第6,297,214号)。GLP-2和GLP-2肽激动剂可以引起大肠组织的增殖。GLP-2也可用于治疗或预防大肠的炎症，包括炎性肠道疾病(美国专利第6,586,399号)。
已经发现人、大鼠、牛和仓鼠GLP-1序列一致[Ghiglione，M.等人，Diabetologia，27：599-600(1984)]。Lopez等人关于GLP-1大小所达成的推论由L.O.等人，J.Clin.Endocrinol.Metabol.，61：472-479(1985)的研究得以证实。Uttenthal等人检测了存在于人胰腺中的GLP-1的分子形式。他们的研究显示，GLP-1和GLP-2在胰腺中分别作为37氨基酸肽和34氨基酸肽存在。
GLP-1与胰高血糖素之间的相似性向早期研究人员暗示，GLP-1可能具有生物活性。尽管一些研究人员发现GLP-1可以诱导大鼠脑细胞合成cAMP[Hoosein，N.M.等人，FEBS Lett.178：83-86(1984)]，但是其他研究人员未能确定GLP-1的任何生理学作用(Lopez，L.C等人)。未能确定GLP-1的任何生理学作用使得一些研究人员置疑GLP-1事实上是否是激素，以及胰高血糖素与GLP-1之间的相关性是否可能是人为的。
也已经公开GLP-1(7-37)的变体及其类似物。这些变体和类似物包括(例如)Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、乙酰基-Lys9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)、Lys18-GLP-1(7-37)等等及其衍生物，包括(例如)酸加成盐、羧酸盐、较低碳数烷基酯和酰胺[参看，例如WO 91/11457、EP0733,644(1996)和美国专利第5,512,549(1996)号，其以引用的方式并入本文]。一般来说，已知各种公开形式的GLP-1刺激胰岛素分泌(促胰岛素作用)和cAMP形成[参看，例如Mojsov，S.，Int.J.PeptideProtein Research，40：333-343(1992)]。
更为重要的是许多作者已经证实实验室实验与哺乳动物(尤其是人)对外源投与GLP-1(尤其是GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37))的促胰岛素反应之间的联系[参看，例如，Nauck，M.A.等人，Diabetologia，36：741-744(1993)；Gutniak，M.等人，New England J.of Medicine，326(20)：1316-1322(1992)；Nauck，M.A.等人，J.Clin.Invest，91：301-307(1993)；和Thorens，B.等人，Diabetes，42：1219-1225(1993)]。
更具体来说，确定为引起成人糖尿病发病(maturity onset diabetes)中高血糖症的基本缺点在于来自肌肉和肝脏的内源胰岛素分泌减弱和对胰岛素作用的抗性[Galloway，J.S.，Diabetes Care，13：1209-1239，(1990)]。后一缺点导致来自肝脏的葡萄糖产生过量。因此，尽管正常个体以大约2毫克/千克/分钟的速率释放葡萄糖，但是在患有成人糖尿病发病的患者中此量通常超过2.5毫克/千克/分钟，导致每24小时至少净过量70克葡萄糖。如由糖化血红蛋白(glycohemoglobin)测量结果所指示，事实上肝葡萄糖产生、空腹血糖和总体代谢控制之间存在高度相关性[Galloway，J.A.，上文；和Galloway，J.A.等人，Clin.Therap.，12：460-472(1990)]，很显然，控制空腹血糖是实现足以预防高血糖症并发症的总体代谢正常化的必要条件。就目前形式的胰岛素很少将肝葡萄糖产生调至正常而不产生显著高胰岛素血症和高血糖症的实情来说(Galloway，J.A.和Galloway，J.A.等人，上文)，需要替代方法。
然而，GLP-1(尤其是作为用于投与哺乳动物的医药组合物组分的GLP-1)的长期稳定性值得怀疑。事实上，当在4℃低温下储存时，早在样品制备之后11个月时已经发现GLP-1(7-37)的副产物(Mojsov，S.上文)。因此，需要可以安全投给需要此治疗的哺乳动物的更为稳定的GLP-1化合物。
此外，GLP-1分子(尤其是受二肽基-肽酶IV(DPP IV)影响的那些分子)的生物半衰期极短。举例来说，GLP-1(7-37)的生物半衰期仅为3至5分钟(美国专利第5,118,666号)，并且在肠胃外投给哺乳动物后进一步受快速吸收影响。因此，也需要延迟此投药之后吸收的GLP-1化合物。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由肠L细胞响应于食物摄取所分泌的37氨基酸肽。已经发现其刺激胰岛素分泌(促胰岛素作用)，进而引起细胞的葡萄糖摄取和降低的血清葡萄糖含量[参看，例如，Mojsov，S.，(1992)Int.J.Peptide Protein Research，40：333-343]。然而，GLP-1活性很差。随后在第6位与第7位之间的内源裂解产生更为有效的生物活性GLP-1(7-37)OH肽。许多GLP-1类似物和衍生物为已知，并且本文称为“GLP-1化合物”。GLP-1类似物包括Exendin，Exendin是发现于希拉毒晰毒液中的肽。Exendin与天然GLP-1具有序列同源性，并且可以结合GLP-1受体，并且起始负责许多有助于GLP-1(7-37)OH的活性的信号转导级联。
美国专利第6,569,832号讨论投与GLP-1激动剂以调节、抑制或降低或阻止β细胞退化，β细胞功能丧失，β细胞功能紊乱和/或β细胞死亡，例如β细胞的坏死或细胞凋亡。细胞凋亡是在正常发育明间内由外部信号和内部信号所调节的细胞自身破坏的主动过程(active process)。许多文献记载细胞凋亡在调节胰腺内分泌β细胞中起重要作用。有越来越来的证据表明：在成年哺乳动物中，β细胞量经受动态变化来调整胰岛素产生以用于维持特殊病情(妊娠和肥胖症)中的血糖正常(euglycemia)(J.Dev.Physiol.5：373，1983和Endocrinology 130：1459，1992)。β细胞量的控制取决于细胞增殖、生长和细胞死亡(细胞凋亡)之间的微妙平衡。此平衡的破坏可能葡萄糖动态平衡的破坏。举例来说，值得注意的是，当β细胞复制速率降低时，葡萄糖不耐受性随衰老而发展(Diabetes32：14，1983)，并且人类尸体解剖研究反复显示，与非糖尿病受检者相比，患有非胰岛素依赖性糖尿病的患者中有40-60％的β细胞量减少(Am.J.Med.70：105，1981和Diabetes Res.9：151，1988)。通常同意，胰岛素抗性一直伴随肥胖症，但是血糖量正常由补偿性高胰岛素血症(compensatory hyperinsulinemia)维持直至β细胞变得不能够满足胰岛素增加需要，在此时2型糖尿病开始。已经进行其它研究来探究GLP-1和岛细胞增殖以及岛细胞分化。
GLP-1化合物具有许多生理学显著活性。举例来说，已经显示，GLP-1刺激胰岛素释放、降低胰高血糖素分泌、抑制胃排空和增强葡萄糖利用。[Nauck，M.A.等人(1993)Diabetologia 36：741-744；Gutniak，M.等人(1992)New England J.of Med.326：1316-1322；Nauck，M.A.等人，(1993)J.Clin.Invest.91：301-307]。
GLP-1显示可以用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。市场上存在许多用以治疗与NIDDM相关的胰岛素抗性的口服药物。然而，随着疾病进行，必需使患者经受刺激胰岛素释放的治疗，并且最终使其经受包括胰岛素注射的治疗。然而，目前刺激胰岛素释放的药物也会引起如急性投与胰岛素会引起的低血糖症。然而，GLP-1活性由血糖含量控制。当血糖含量下降至特定阈值时，GLP-1无活性。因此，不具有与用涉及GLP-1的治疗相关的低血糖症的风险。
然而，涉及GLP-1肽的疗法的可用性已经受到其快速清除率和短半衰期限制。举例来说，GLP-1(7-37)具有仅为3至5分钟的血清半衰期(美国专利第5,118,666号)。当皮下投与时，GLP-1(7-36)酰胺具有约50分钟的作用时间。即使是抗内源蛋白酶裂解的类似物和衍生物都不具有足以避免24小时内重复投药的半衰期长度。当需要长期维持治疗剂的高血液含量时，试剂的快速清除是不便利的，因为随后必需重复投药。此外，长效化合物对于过去的治疗方案仅涉及口服用药的糖尿病患者尤其重要。当转变成涉及多次注射用药的疗法时，这些患者通常具有极为艰难的时光。
本发明克服与传递具有短血浆半衰期的BSP(例如GLP-1)相关的问题。本发明的化合物涵盖与另一种具有长循环半衰期蛋白(例如免疫球蛋白或白蛋白的Fc部分)融合的BSP。
人类免疫缺陷病毒(HIV)是病原性逆转录病毒，和获得性免疫缺失综合症(AIDS)以及相关病症的病原体(Barre-Sinossi，F.等人，1983，Science 220：868-870；Gallo，R.等人，1984，Science 224：500-503)。已经描述至少两种不同类型的HIV：HIV-1(Barre-Sinossi，F.等人，1983，Science 220：868-870；Gallo，R.等人，1984，Science 224：500-503)和HIV-2(Clavel，F.等人，1986，Science 223：343-346；Guyader，M.等人，1987，Nature326：662-669)。此外，大量遗传异质性存在于这些类型的每一者的群体中。用HIV病毒感染人类CD-4+T-淋巴细胞导致所述细胞类型的消耗，并最终导致机会感染、神经功能紊乱、肿瘤生长和过早死亡。
HIV是逆转录病毒的慢病毒家族的成员(Teich，N.等人，1984；RNA Tumor Viruses，Weiss，R.等人，编辑，CSH出版社，第949-956页)。逆转录病毒是含有二倍体单链RNA基因组的小包膜蛋白，并且经由由病毒编码逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)所产生的DNA中间体进行复制(Varmus，H.，1988，Science 240：1427-1439)。举例来说，其它逆转录病毒包括致瘤病毒，例如人类T细胞白细胞病毒(HTLV-I、-II、-III)和猫白血病病毒。HIV病毒粒子由病毒核心组成，病毒核心由名为p24和p18的蛋白组成。病毒核心含有病毒RNA基因组和复制事件所需的那些酶。肉豆寇酰化(myristylated)gag蛋白形成环绕病毒核心的病毒外壳，病毒外壳又被来源于受感染细胞膜的脂质膜包膜所环绕。HIV包膜表面糖蛋白合成为单个160kD前驱物蛋白，所述蛋白在病毒出芽成两个糖蛋白gp41和gp120期间由细胞蛋白酶裂解。gp41是跨膜蛋白，而gp120是仍与gp41非共价相连的细胞外蛋白，并可能为三聚或多聚形式(Hammerwskjold，M.和Rekosh，D.，1989，Biochem.Biophys.Acta 989：269-280)。
因为CD-4表面蛋白充当HIV-1病毒的细胞受体，所以HIV靶向CD-4+T淋巴细胞(Dalgleish，A.等人，1984，Nature 312：767-768，Maddon等人，1986，Cell 47：333-348)。病毒进入细胞依赖于结合细胞CD-4+受体分子的gp120，而gp41锚定病毒膜中的包膜糖蛋白复合物(McDougal，J.S等人，1986，Science 231：382-385；Maddon，P.J.等人，1986，Cell47：333-348)，并且由此解释CD-4+细胞的HIV向性。
已经将病毒生命循环的一些阶段视为治疗干预的靶标(Mitsuya，H.等人，1991，FASEB J.5：2369-2381)。干预可能潜在地抑制HIV与细胞膜结合、HIV RNA基因组逆转录成DNA或病毒从宿主细胞逃逸和新细胞靶标的感染。
已经试图开发可以在HIV感染最早阶段抑制病毒进入细胞的药物。这里集中于CD-4+(HIV的细胞表面受体)。举例来说，已经显示，重组可溶性CD-4通过在病毒粒子遇到嵌入在细胞膜内的CD-4分子之前与病毒粒子结合来阻断HIV感染性(Smith，D.H.等人，1987，Science 238：1704-1707)。某些最初HIV-1分离株对由重组CD-4产生的抑制作用的敏感性相对较差(Daar，E.等人，1990，Ann.Int.Med.112：247-253)。此外，重组可溶性CD-4临床试验已经产生非确定性结果(inconclusive results)(Schooley，R.等人，1990，Ann.Int.Med.112：247-253；Kalin，J.O.等人，1990，Ann.Int.Med.112：254-261；Yarchoan，R.等人，1989，Proc.Vth Int.Conf.on AIDS，第564页，MCP 137)。
已经开发出包括2′，3′-二脱氧核苷类似物(例如AZT、ddI、ddC和d4T)在内的病毒编码逆转录酶靶向药物，这些药物也显示出抗HIV活性(Mitsuya，H.等人，1991，Science 249：1533-1544)。尽管是有益的，但是这些核苷类似物不是治疗品，这可能是由于药物抗性HIV突变体的快速出现(Lander，B.等人，1989，Science 243：1731-1734)。此外，药物通常表现出毒副作用，例如骨髓抑制、呕吐和肝功能异常。
也已经提出，将涉及某些病毒蛋白的关键病毒特异性二级加工的HIV复制后期作为可能的抗HIV药物靶标。后期加工依赖于病毒蛋白酶的活性，并且正在开发抑制此蛋白酶的药物(Erikson，J.，1990，Science 249：527-533)。
正在开发用于治疗HIV感染的疫苗。已经显示，HIV-1包膜蛋白(gp160、gp120、gp41)是存在于AIDS患者中的抗HIV抗体的主要抗原(Barm等人，1985，Science228：1094-1096)。迄今为止，这些蛋白似乎是充当用于抗HIV发展的抗原的最有前景的候选者。一些团队已经开始将gp160、gp120和/或gp41的各种部分用作宿主免疫系统的免疫原靶标。参看，例如Ivanoff，L.等人，美国专利第5,141,867号；Saith，G.等人，WO92/22,654；Schafferman，A.，WO 91/09,872；Formoso，C.等人，WO 90/07,119。
最近，引起一般免疫应答(general immune response)的双链RNA已经与抗病毒剂(例如干扰素、AZT和膦甲酸盐(phosphonoformate))结合使用来治疗病毒感染。参看，Carter，W.美国专利第4,950,652号。此外，已经开发出组合嘧啶核苷类似物与尿苷磷酸化酶抑制剂的疗法以用于治疗HIV(Sommadossi，J.P.等人，美国专利第5,077,280号)。尽管这些特异性疗法能够证明是有益的，但是如活体外用叠氮胸苷(azidothymidine，AZT)和利巴韦林(ribavirin)所证实，组合疗法通常具有拮抗作用的可能。参看美国专利第4,950,652号。此外，由于大部分抗HIV疗法具有高毒性和低疗效水平，因此组合疗法可能产生问题。
T-20充当HTV-1与CD4+细胞融合的抑制剂，以与其它抗病毒疗法不同的机制靶向HIV。美国专利第6,861,059号公开采用DP-178或DP-107或其衍生物与至少一种其它抗病毒治疗剂(例如逆转录酶抑制剂(例如AZT、ddI、ddC、ddA、d4T、3TC或其它二脱氧核苷酸或二脱氧氟核苷)或HIV-1蛋白酶抑制剂(例如茚地那韦、利托那韦))组合来治疗HIV-1感染或抑制HIV-1复制的方法。其它抗病毒剂包括细胞因子(例如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ)、病毒mRNA封端抑制剂(例如利巴韦林)、HIV蛋白酶抑制剂(例如ABT-538和MK-639)、作为具有抗HIV活性的脂质结合分子的两性霉素B和作为糖蛋白加工抑制剂的栗精胺。
目前抗肥胖药物具有有限的功效和许多副作用。Crowley，V.E.，Yeo，G.S.&O′Rahilly，S.，Nat.Rev.Drug Discov 1，276-86(2002)。随着全世界肥胖达到流行比例，迫切需要开发出此领域的足够治疗方法。近年来，涉及食欲调节、体力支出和脂肪团累积的激素和神经肽(例如PYY和PPY(3-36))已经作为有效的抗肥胖药物出现。McMinn，J.E.，Baskin，D.G.&Schwartz，M.W.，Obes Rev 1：37-46(2000)，Drazen，D.L.& Woods，S.C，Curr Opin ClinNutr Metab Care 6：621-629(2003)。
一般来说，小治疗肽难以操作，因为其结构中甚至轻微的改变也会影响稳定性和/或生物活性。这对于GLP-1化合物来说是尤其真确的，GLP-l化合物可能经历构象改变而从主要α螺旋结构变为主要β片层结构。此β片层形式引起认为是无活性的聚集材料。然而，已经开发出具有增加半衰期的生物活性GLP-1融合蛋白。由于单独用GLP-1(7-37)OH工作的难度和相对于所连接的小GLP-1肽来说较大的融合蛋白，因此这是特别出乎意料的。类似地，可以制造其它BSP融合体以增加血清半衰期或产生具有其它所需特性的分子。
本发明的化合物包括包含融合于第二多肽(具有N端和C端)的第一多肽(具有N端和C端)的异源融合蛋白，其中所述第一多肽是BSP(例如GLP-1化合物)，而所述第二多肽选自由以下各物组成的群组：a)人白蛋白、b)人白蛋白类似物和c)人白蛋白片段，并且其中第一多肽的C端融合于第二多肽的N端。
本发明的化合物也包括包含融合于第二多肽(具有N端和C端)的第一多肽(具有N端和C端)的异源融合蛋白，其中所述第一多肽是BSP(例如GLP-1化合物)，而所述第二多肽选自由以下各物组成的群组：a)人白蛋白、b)人白蛋白类似物和c)人白蛋白片段，并且其中第一多肽的C端经肽连接子、前药连接子和水溶性聚合物融合于第二多肽的N端。肽连接子可以选自由以下各物组成的群组：a)富含甘氨酸的肽、b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(其中n为1、2、3、4、5、6或更大)的肽，和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
本发明的其它化合物包括包含融合于第二多肽(具有N端和C端)的第一多肽(具有N端和C端)的异源融合蛋白，其中所述第一多肽是BSP(例如GLP-1化合物)，而所述第二多肽选自由以下各物组成的群组：a)免疫球蛋白的Fc部分、b)免疫球蛋白的Fc部分类似物，和c)免疫球蛋白的Fc部分片段，并且其中第一多肽的C端融合于第二多肽的N端。BSP(例如GLP-1化合物)可以经肽连接子、前药连接子或水溶性聚合物融合于第二多肽。肽连接子可以选自由以下各物组成的群组：a)富含甘氨酸的肽、b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(其中n为1、2、3、4、5、6或更大)的肽，和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。
为异源融合蛋白部分的GLP-1化合物可以具有多个氨基酸替换，并且可以具有多于6、5、4、3、2或1个不同于GLP-1(7-36)、GLP-1(7-37)、Exendin-4或Exendin-3的氨基酸。为异源融合蛋白部分的GLP-1化合物在第8位具有甘氨酸或缬氨酸。
本发明也包括编码本文所述异源融合蛋白的多聚核苷酸、包含这些多聚核苷酸的载体和经本文所述载体转染或转化的宿主细胞。也包括用于制造异源融合多肽的方法，所述方法包含在一定条件下转录和翻译本文所述多聚核苷酸的步骤，其中异源融合蛋白以可检测量表达。
本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的BSP分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的BSP包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含分子连接，所述分子包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分(photocaged moiety)、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团(intercalating group)、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述任何组合或任何其它所需化合物或物质，其包含采用所属领域技术人员所已知适用于特定反应性基团的化学方法与包含第一反应性基团的至少一种非天然氨基酸具有反应性的第二反应性基团。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分，并且采用[3+2]环加成方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸)，且第二反应性基团为炔基部分。在本发明经修饰BSP的某些实施例中，使用至少一种包含至少一种翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一种翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，在真核细胞中或在非真核细胞中活体内进行翻译后修饰。
在某些实施例中，所述蛋白包括至少一种由一种宿主细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白包括至少一种在由一种真核细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化、糖脂键(glycolipid-linkage)修饰等等。在一个实施例中，翻译后修饰包含寡糖与天冬酰胺通过GlcNAc-天冬酰胺键(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等等)连接。在另一实施例中，翻译后修饰包含寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等等)通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白或多肽可以包含分泌或定位序列或肽、抗原决定基标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体和/或类似物质。可用于本发明的标签或连接子的实例包括(但不限于)多肽、聚合物、亲和标签、抗原、检测标签、成像标签、多膜结合复合物的成员和放射性同位素标签。亲和标签和检测标签的实例包括(但不限于)poly-His标签、生物素(biotin)、抗生物素(avidin)、蛋白A、蛋白G和包括(但不限于)免疫球蛋白抗原决定基的抗原。成像标签的实例包括(但不限于)金属、放射性核素和磁性分子。多成员结合复合物标签的实例包括(但不限于)链菌素(streptavidin)、抗生物素、生物素、蛋白A和蛋白G。
术语“定位肽”包括(但不限于)分泌信号序列的实例。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、5′-经优化用于细菌表达的真核生物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸酯裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bg12(酵母)和来源于转座子的信号序列bla。分泌信号序列包括(但不限于)细菌分泌信号序列、酵母分泌信号序列、昆虫分泌信号序列、哺乳动物分泌信号序列和独特分泌信号序列。“定位肽”的另一实例包括(但不限于)TrpLE序列。
所感兴趣的蛋白或多肽可以含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可以相同或不同，例如在蛋白中可以具有包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同非天然氨基酸的的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位点。在某些实施例中，至少一个(但少于全部)以蛋白的天然发生形式存在的特定氨基酸由非天然氨基酸替换。
本发明可以使用具有治疗活性的任何BSP或其片段。已经提供可用于本发明的BSP的许多实例。然而，所提供的列表并非详尽，并且决不限制可用于本发明的BSP的数目或类型。因此，可以根据本发明修饰并且治疗上使用包括新颖BSP在内的任何BSP和/或产自任何BSP的片段。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的BSP的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入BSP中可以允许涉及与包括(但不限于)一个或一个以上非天然编码氨基酸发生特异性化学反应而不与常见20种氨基酸发生反应的结合化学应用。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的BSP(例如GLP-1、T-20或PYY)经由非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供用PEG衍生物选择性修饰蛋白的高效方法，所述方法涉及将非遗传编码氨基酸响应于选择密码子而选择性并入蛋白和随后用合适的反应性PEG衍生物对这些氨基酸进行修饰，所述非遗传编码氨基酸包括(但不限于)含有并非发现于20种天然并入氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分。一旦并入之后，即可以通过使用所属领域技术人员已知适用于存在于天然编码氨基酸的特定官能团或取代基的化学方法来对氨基酸侧链进行修饰。已知多种化学方法适用于本发明中以将水溶性聚合物并入蛋白中。所述方法包括(但不限于)分别与包括(但不限于)乙炔或叠氮衍生物进行Huisgen[3+2]环加成反应(参看，例如Padwa，A.的Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)编辑Trost，B.M.，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.的1，3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry，(1984)编辑Padwa，A.，Wiley，NewYork，第1-176页)。
由于Huisgen[3+2]环加成法涉及环加成而不是亲核取代反应，因此蛋白可以进行极高选择性的修饰。可以通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐来在室温下水性条件中以良好区域选择性(1，4＞1，5)进行所述反应。参看，例如Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；和WO03/101972。在[3+2]环加成中可以添加到本发明蛋白中的分子实质上包括任何具有合适官能团或取代基的分子，所述合适官能团或取代基包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物。可以将这些分子分别添加于具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)中或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
由Huisgen[3+2]环加成所产生的五元环通常在还原环境中不可逆，并且在水性环境中长时间对水解稳定。因此，多种物质的物理和化学特征可以在所需水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰。更为重要的是，因为叠氮和乙炔部分相互之间具有特异性(例如，不与任何20种常见遗传编码氨基酸反应)，所以可以在一个或一个以上特异性位点处以极高选择性修饰蛋白。
本发明也提供具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的PEG衍生物和相关亲水性聚合物的的水溶性和水解稳定衍生物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对已经响应于选择密码子而选择性引入蛋白中的叠氮部分的偶联具有高度选择性。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物对已经响应于选择密码子而选择性引入蛋白中的乙炔部分的偶联具有高度选择性。
更具体来说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮、芳基叠氮和这些叠氮的衍生物。烷基叠氮和芳基叠氮的衍生物可以包括其它取代基，只要维持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基乙炔和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基乙炔和芳基乙炔的衍生物可以包括其它取代基，只要维持叠氮特异性反应性即可。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的结合物，所述其它物质包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述任何组合或任何其它所需化合物或物质。本发明也提供具有叠氮或乙炔部分的物质与具有对应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的结合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可以在蛋白中含有具有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处偶联于生物活性分子。用于PEG与生物活性分子的偶联的键合包括(但不限于)Huisgen[3+2]环加成产物。
所属技术领域已经充分确定，PEG可以用于修饰生物材料的表而(参看，例如美国专利6,610,281；Mehvar，R.，J.Pharmaceut.Sci.，3(1)：125-136(2000)，所述参考案以引用的方式并入本文)。本发明也提供包含具有一个或一个以上反应性叠氮或乙炔位点的表面和一种或一种以上经Huisgen[3+2]环加成键偶联于所述表面的本发明的含叠氮或乙炔聚合物的生物材料。生物材料和其它物质也可以通过除叠氮或乙炔键之外的键(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)偶联于叠氮或乙炔活化的聚合物衍生物，以留下叠氮或乙炔部分可用于随后反应。
本发明包括合成本发明含有叠氮和乙炔的聚合物的方法。在含有叠氮的PEG衍生物的情况下，叠氮可以直接结合于聚合物的碳原子。或者，可以通过将一个末端具有叠氮部分的连接剂连接于常规活性聚合物来制备含叠氮的PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有叠氮部分。在含有乙炔的PEG衍生物的情况下，乙炔可以直接结合于聚合物的碳原子。或者，可以通过将一个末端具有乙炔部分的连接剂连接于常规活性聚合物来制备含乙炔的PEG衍生物，以使所得聚合物在其末端具有乙炔部分。
更具体来说，在含叠氮的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经反应以生成其上具有更具反应性部分的经取代聚合物，所述更具反应性部分例如甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯(tresylate)、甲苯磺酸酯或卤素离去基团。所属领域技术人员熟知含有磺酰酸卤化物、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和用途。所得经取代聚合物随后经反应以在聚合物的所述末端用叠氮部分取代所述更具反应性的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与在一个末端具有叠氮的连接剂的反应，以使在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮部分位于聚合物的所述末端。所属领域技术人员熟知亲核和亲电子部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等。
更具体来说，在含有乙炔的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经反应以置换含有乙炔部分的前驱物中的卤素或其它活性离去基团。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物经历与在一个末端具有乙炔的连接剂的反应，以使在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的所述末端。所属领域技术人员完善确立了卤素部分、活性离去基团、亲核和亲电子部分在有机合成内容和PEG衍生物的制备和应用中的用途。
本发明也提供选择性修饰蛋白的方法，以向经修饰蛋白添加其它物质，包括(但不限于)水溶性聚合物，例如含有叠氮或乙炔部分的PEG和PEG衍生物。可以用含叠氮和乙炔的PEG衍生物修饰表面和分子的特性(其中主要是生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性)，而同时提供比所属技术领域先前已知的更具选择性的连接PEG衍生物与蛋白的方法。
II.肽与多肽
采用本发明的方法所制得的BSP可以为具有任何长度或序列的氨基酸(无论天然发生或是非天然编码)的任何组合。唯一要求在于BSP链中至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。如果多肽是通过生物合成制得，那么非天然编码氨基酸并入由包含至少一个选择密码子的mRNA所翻译的肽链中。可以通过化学合成制得的本发明的新颖BSP可以在合成过程期间并入至少一个非天然编码氨基酸。非天然编码氨基酸可以位于氨基酸链的任何位置，并且也可以位于最终BSP的任何部分中，包括(但不限于)位于生物活性肽、连接子或融合伴侣(例如白蛋白或Fc)内。
本申请案中所述的GLP-1多肽旨在将GLP-1用作适用于本发明的肽或多肽的实例。因此，应了解本文所述的关于GLP-1的修饰和化学可以等同用于任何其它BSP，其包括(但不限于)本文具体所列出的那些。
响应于食物而从肠L细胞释放出的GLP-1进入门脉循环。GLP-1由DPP IV(CD26)快速裂解以释放GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)酰胺，这两者在GLP-1R时活性较低。根据一些报导，它们可以充当GLP-IR拮抗剂，并且GLP-1作用于胃肠运动。发现循环GLP-1的半衰期为约4分钟(Kreymann等人，1987 Lancet.Dec 5；2(8571)：1300-4)。二肽基-肽酶IV(DPP IV，EC 3.4.14.5，CD26)(名为CD26)是在一些细胞类型(尤其是CD4T细胞)表面上以及在肾脏、胎盘、血浆、肝脏和肠细胞上表达的胞外膜结合酶。在T细胞上，已经显示，DPP IV与抗原CD26一致。CD26在休眠T细胞的部分上低密度表达，但是在T细胞活化之后强烈地上调(Gorrell等人，2001，Scand J Immunol.2001年9月；54(3)：249-64)。CD26是在T细胞中且在总体免疫系统调节中具有重要功能的多功能分子。CD26与发现于细胞表面上的免疫重要的其它受体相关，所述其它受体例如蛋白酪氨酸磷酸化酶CD45和腺苷脱氨酶(ADA)。DPP IV通过降解GLP-1和GIP来发挥负调葡萄糖移除的作用，因此减小对胰腺β细胞的肠促胰岛素作用。
DPP IV裂解主要循环形式的人类GLP-1的Ala-Glu键(人类GLP-1(7-36)NH2：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2)(SEQ ID NO：1)，从而释放N端二肽。用Gly(Deacon等人，1998，Diabetologia，41：271-278；Burcelin人，1999，Metabolism，48(2)：252-258)、Leu、D-Ala和其它氨基酸替换Ala显示保护GLP-1以免于DPP IV降解，并且加强其活体外和活体内促胰岛素作用(Xiao等人，2001，Biochemistry，40：2860-2869)。氨基末端组氨酸和His7的NH2基团的缺失降低受体亲和力和类似物效能(Adelhorst等人，1994，J.Biol.Chem.，269(9)：6275-6278；Xiao等人2001，上文；Siegel等人，1999，Reg.Peptides，79：93-102)。美国专利第5,545,618号教示使用烷基和酰基修饰在N端所进行的修饰也产生DPP IV抗性类似物。更具体来说，经N-烷基化(C1-C6)或N-乙酰化(C1-C6)L-/D-氨基酸进行的His7替换产生具有DPP IV抗性的类似物。不饱和有机酸(例如反-3-己烯酸)的共价偶联也产生可能降低小鼠口服葡萄糖耐受性测试中的高血糖症的DPP IV抗性GLP-1类似物(Xiao等人2001，上文)。此外，His7可以经α取代羧酸置换以赋予DPP IV抗性，其中一个取代基为5元或6元环结构(例如咪唑)(参看以引用的方式并入本文的WO 99/43707)。His7之后插入6-氨基己酸(AHA)显示赋予DPP IV抗性，而保持活体内受体亲和力和促胰岛素功效(Doyle等人，2001，Endocrinol.，142(10)：4462-4468)。
所属技术领域已知许多证实促胰岛素作用的GLP-1类似物。举例来说，这些变体和类似物包括GLP-1(7-36)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、乙酰基-Lys9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。举例来说，GLP-1衍生物包括酸加成盐、羧酸盐、较低碳数烷基酯和酰胺(参看，WO 91/11457(1991)、EP 0733,644(1996)和美国专利第5,512,549号(1996))。也已经证实N端组氨酸残基(His7)对于GLP-1促胰岛素活性是极为重要的(Suzuki等人，1988，Diabetes Research andClinical Practice XIII Congress of the International Diabetes Federation，5(增刊1)：S30(摘要第ORA-007-007号))。
一组适用于本发明的GLP-1化合物讨论于WO 91/11457中(美国专利第5,545,618号，此专利以引用的方式并入本文)，并且基本上由GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)或其酰胺形式及其医药学上可接受的盐组成，其具有至少一个选自由以下各修饰组成群组的修饰：(a)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-赖氨酸替换26位和/或34位的赖氨酸；或者甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或D-精氨酸替换36位的精氨酸；(b)抗氧化氨基酸替换31位的色氨酸；(c)至少一种以下替换：酪氨酸替换16位的缬氨酸；赖氨酸替换18位的丝氨酸；天冬氨酸替换21位的谷氨酸；丝氨酸替换22位的甘氨酸；精氨酸替换23位的谷氨酰胺；精氨酸替换24位的丙氨酸；和谷氨酰胺替换26位的赖氨酸；和(d)至少一种以下替换：甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸替换8位的丙氨酸；天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸替换9位的谷氨酸；丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸替换10位的甘氨酸；和谷氨酸替换15位的天冬氨酸；和(e)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸或D-或N-乙酰基化或烷基化形式的组氨酸替换7位的组氨酸；其中当替换为(a)、(b)、(d)和(e)时，经替换的氨基酸可以视情况为D形式并且在7位经替换的氨基酸可以视情况为N-乙酰基化或N-烷基化形式。
由于酶二肽基-肽酶IV(DPP IV)可能负责所投与GLP-1的所观察到的活体内快速失活[参看，例如Mentlein，R.等人，Eur.J.Biochem.，214：829-835(1993)]，因此在融合蛋白的内容中受保护以免于DPP IV活性的GLP-1类似物和衍生物是合适的，并且其中GLP-1化合物为Gly8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-37)OH、α-甲基-Ala8-GLP-1(7-37)OH或Gly8-Gly21-GLP-1(7-37)OH的GLP-1化合物是合适的。
另一组可用于本发明的优选GLP-1化合物由公开于美国专利第5,512,549号中的化合物组成，此专利明确地以引用的方式并入本文。
本发明的GLP-1化合物也涵盖Exendin化合物。Exendin-3和Exendin-4是首先从毒蜥科蜥蜴毒液(Helodermatidae lizard venoms)分离出来的生物活性肽，并且显示结合GLP-1受体并且刺激哺乳动物壁细胞(parietal cell)中cAMP依赖性H+产生。Exendin-3和Exendin-4均是与GLP-1大约具有53％同源性的39氨基酸肽。图2是GLP-1与Exendin-4的螺旋比较。用星号标出保守残基。图3说明Exendin-4与GLP-1之间的保守面(conserved face)天然显著疏水，而非保守面(non-conserved face)显著亲水。
Exendin化合物充当GLP-1活性的有效激动剂。特别是，已知为Exendin(9-39氨基酸)的Exendin的N端截断衍生物是Exendin-3、Exendin-4和GLP-1的抑制剂(Goke等人(1993)J.Biol.Chem.268(26)19650-19655)。
Exendin化合物通常包含具有Exendin-3、Exendin-4或其类似物或片段的氨基酸序列的多肽。Exendin-3和Exendin-4公开于美国专利第5,424,286号中。Exendin-3具有His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：21)的氨基酸序列。Exendin-4具有His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。
GLP-1化合物也包括为在从Exendin或Exendin类似物N端和/或C端截断一个或一个以上氨基酸之后所获得的多肽的Exendin片段。此外，GLP-1化合物包括Exendin多肽，其中一个或一个以上氨基酸已经添加到Exendin或其片段的N端和/或C端。此类型的Exendin化合物具有多达约45个氨基酸。
GLP-1化合物也包括“Exendin类似物”。Exendin类似物与Exendin-4、Exendin-3或其片段具有足够的同源性，以便类似物具有促胰岛素活性。可以用描述于EP 619,322和美国专利第5,120,712号中的活体外测定来评估Exendin片段和/或类似物的活性，所述参考案以引用的方式并入本文。可用于本发明的其它Exendin类似物描述于PCT专利公开案WO 99/25728(Beeley等人)、WO 99/25727(Beeley等人)、WO 98/05351(Young等人)、WO 99/40788(Young等人)、WO 99/07404(Beeley等人)、和WO 99/43708(Knudsen等人)中，这些公开案以引用的方式并入本文。本发明所包括的Exendin以及其类似物、衍生物和片段的实例公开于WO 97/46584和美国专利第5,424,286号中。
异源Fc融合蛋白
上文所述的BSP(例如GLP-1化合物)可以直接或经由肽连接子融合于免疫球蛋白的Fc部分。免疫球蛋白是含有通过二硫键固持在一起的多肽链的分子，其通常具有两条轻链和两条重链。在各条链中，一个域(V)具有取决于分子抗体特异性的可变氨基酸序列。另一域(C)具有与相同类别分子所共有的相当恒定的序列。图1显示GLP-1-Fc融合化合物的一个实例。
如本文所用，免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域一般对该术语所给的含义。具体来说，所述术语是指通过从抗体移除两个抗原结合区(Fab片段)所获得的抗体片段。一种移除Fab片段的方法是用木瓜(papain)蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，由来自两条重链恒定区的大约相等大小的片段形成Fc部分，所述大约相等大小的片段经非共价互作和二硫键相关联。Fc部分可以包括铰链区，并且经CH2和CH3域延伸至抗体的C端。人类和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可见于Antibody Engineering，A PracticalGuide，Borrebaeck，C.A.K.，编辑，W.H.Freeman and Co.，1992中，此参考案之教示内容以引用的方式并入本文。Fc部分可以进一步包括一个或一个以上糖基化位点。许多代表性的含有铰链区、CH2与CH3域和一个N糖基化位点的Fc部分的氨基酸序列为所属技术领域所熟知。
存在五种类型具有不同效应子功能和药物动力学特性的人类免疫球蛋白Fc区：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。IgG是血清中最为充足的免疫球蛋白。IgG也是任何免疫球蛋白中具有血清中最长半哀期的(23天)。与其它免疫球蛋白不同，IgG在结合于Fc受体之后有效地再循环。存在四种各自具有不同效应子功能的IgG亚类：G1、G2、G3和G4。G1、G2和G3可以结合C1q并固定补体，而G4不能。尽管G3结合C1q比G1有效，但是G1在介导补体定向细胞溶解中可为有效。G2固定补体的能力极差。IgG中C1q结合位点位于CH2域的羧基末端区。
所有IgG亚类均能够结合Fc受体(CD16、CD32、CD64)，其中G1和G3比G2和G4更为有效。IgG的Fc受体结合区是由位于CH2域的铰链区和羧基末端区的残基形成。
IgA可以以单聚形式和由J链固持而以二聚形式存在。IgA是血清中第二富足的Ig，但是其仅具有6天的半衰期。IgA具有三种效应子功能。其结合于巨嗜细胞和嗜曙红细胞上的IgA特异性受体，而分别驱动嗜菌作用和脱粒作用。IgA也可以经未知的其它途径固定补体。
IgM表达为五聚体或六聚体，这两者均由J链固持。IgM具有5天的血清半衰期。其经位于CH3域中的结合位点较弱地结合于C1q。IgD在血清中具有3天的半衰期。尚不清除哪种效应子功能可归因于此Ig。IgE是单聚Ig，并且具有2.5天的血清半衰期。IgE结合于两个Fc受体，而驱动脱粒作用并且导致前发炎因子(proinflammatory agent)的释放。
取决于所需活体内作用，本发明的异源融合蛋白可以含有任何上文所述的同型(isotype)，或者可以含有突变Fc区，其中已经改变补体和/或Fc受体结合功能。因此，本发明的异源融合蛋白可以含有融合于GLP-1化合物的免疫球蛋白的整个Fc部分、免疫球蛋白Fc部分的片段或其类似物。
本发明的融合蛋白可以由单链蛋白组成，或为多链多肽形式。可以制造两个或两个以上Fc融合蛋白，使得它们经由天然形成于Fc区之间的二硫键互作。就GLP-1化合物而言，这些多聚体可以是同质的，或者可以含有在融合蛋白Fc部分的N端融合的不同GLP-1化合物。
无论融合蛋白的最终结构如何，Fc或Fc样区可以延长在N端融合的GLP-1化合物的活体内血浆半衰期。融合蛋白化合物的GLP-1组分也应该保留GLP-1的至少一种生物活性。可以用本文所述或所属技术领域已知的方法证实治疗或循环半衰期的增加，其中将融合蛋白的半衰期单独与GLP-1化合物的半衰期进行比较。可以通过所属技术领域已知的活体外和活体内方法测定生物活性。
因为由蛋白水解所产生的IgG的Fc部分具有与完整IgG分子相同的活体内半衰期，并且Fab片段快速降解，所以认为用于延长半衰期的相关序列位于CH2和/或CH3域中。此外，文献中已经显示，不结合高亲和力Fc受体或C1q的IgG变体的代谢率(catabolicrate)与母体野生型抗体的清除率无差别，表明代谢位点与涉及Fc受体或C1q结合的位点不同[Wawrzynczak等人，(1992)Molecular Immunology 29：221]。使用鼠科动物IgG1 Fc区的定点突变研究揭示，控制代谢率的IgG1 Fc区的位点位于CH2-CH3域界面处。可以在代谢位点处修饰Fc区以使融合蛋白半衰期达到最佳。用于本发明融合蛋白的Fc区可能来源于IgG1或IgG4Fc区，并且可能含有CH2与CH3区，包括铰链区。
异源白蛋白融合蛋白
本文所述的BSP(例如GLP-1化合物)可以直接或经由肽连接子、水溶性聚合物或前药连接子融合于白蛋白或其类似物、片段或衍生物。为本发明融合蛋白部分的白蛋白通常可能来源于从包括人类在内的任何物种所克隆得到的白蛋白。人血清白蛋白(HSA)由具有66,500分子量的585氨基酸的单个非糖基化多肽链组成。已知人类HAS的氨基酸序列[参看Meloun等人(1975)FEBS Letters 58：136；Behrens等人(1975)Fed.Proc.34：591；Lawn等人(1981)Nucleic Acids Research 9：6102-6114；Minghetti等人(1986)J.Biol.Chem.261：6747，各文献均以引用的方式并入本文]。已经描述白蛋白的多态变体(polymorphic variant)以及类似物和片段。[参看Weitkamp等人，(1973)Ann.Hum.Genet.37：219]。举例来说，在EP 322,094中，各种较短形式的HFA。公开了这些HAS片段中的一些，包括HSA(1-373)、HSA(1-388)，HSA(1-389)、HSA(1-369)和HSA(1-419)以及1-369与1-419之间的片段。EP 399,666公开包括HSA(1-177)和HSA(1-200)的白蛋白片段，和HSA(1-177)与HSA(1-200)之间的片段。
应了解，本发明的异源融合蛋白包括融合于任何白蛋白(包括片段、类似物和衍生物)的GLP-1化合物，其中所述融合蛋白具有生物活性并且具有比单独GLP-1化合物更长的血浆半衰期。因此，融合蛋白的白蛋白部分不必需具有等于天然人白蛋白血浆半哀期的血浆半衰期。已知或者可以产生具有较长半衰期或具有介于天然人白蛋白与所感兴趣GLP-1化合物之间半衰期的片段、类似物和衍生物。
本发明的异源融合蛋白涵盖在融合蛋白的GLP-1化合物和/或Fc或白蛋白部分中具有保守氨基酸替换的蛋白。“保守替换”是用另一种具有相同净电荷和大约相同大小和形状的氨基酸置换氨基酸。当侧链中总碳原子和杂原子数目相差不超过约四时，具有脂肪族或经取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸大致具有相同大小。当侧链中支链数目相差不超过一时，其大致具有相同形状。认为侧链中具有苯基或经取代苯基的氨基酸大约具有相同大小和形状。除非本文另外具体提供，否则优选用天然发生氨基酸进行保守替换。
可以从多种来源获得野生型白蛋白和免疫球蛋白。举例来说，可以从以可检测水平表达感兴趣的mRNA的组织或细胞所制备的cDNA文库获得这些蛋白。可以用使用感兴趣的特定蛋白的公开DNA或蛋白序列所设计出的探针筛选文库。举例来说，免疫球蛋白轻或重链恒定区描述于Adams等人(1980)Biochemistry 19：2711-2719；Goughet等人(1980)Biochemistry 19：2702-2710；Dolby等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：6027-6031；Rice等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7862-7862；Falkner等人(1982)Nature 298：286-288；和Morrison等人(1984)Ann.Rev.Immunol.2：239-256中。一些公开白蛋白和DNA序列的参考文献包括Meloun等人(1975)FEBS Letters 58：136；Behrens等人(1975)Fed.Proc.34：591；Lawn等人(1981)Nucleic Acids Research9：6102-6114；和Minghetti等人(1986)J.Biol.Chem.261：6747。
以许多方式将非天然氨基酸(包括合成非天然氨基酸、经取代氨基酸或者一个或一个以上D-氨基酸)并入本发明的异源融合蛋白中可能有利。与含L-氨基酸的对应肽相比，含D-氨基酸的肽等表现出增加的活体外或活体内稳定性。因此，当需要或必需较高细胞内稳定性时，并入D-氨基酸的肽构建等尤其有用。更具体来说，D-肽等抗内源肽酶和蛋白酶，进而为分子提供活体内改进的生物利用率和延长的寿命(当需要这些特性时)。此外，D-肽等不能被有效加工以供II类主要组织相容性复合物限制性呈递给T辅助细胞，并因此不太可能诱导整个生物体内的体液免疫应答。
可以用非天然编码氨基酸修饰其它肽，包括(但不限于)T-20(DP-178)、PYY(3-36)和RANTES。
称为RANTES的多肽是称作趋化因子的细胞因子大家族的成员，并被归类为β-趋化因子。其具有68氨基酸序列。最近已克隆出RANTES的受体(Gao等人，J.Exp.Med.177：1421-7(1993)；Neote等人，Cell 72：415-25(1993))，所述受体显示以大约MIP-1α＞RANTES的效能结合趋化因子。
趋化因子具有募集并激活许多前发炎(proinflammatory)细胞类型的能力，并且RANTES显示引发活体内炎性反应。发现RANTES与CCR5趋化因子受体的天然配体MTP-1α、MTP-1β一起抑制人免疫缺陷病毒1型(“HIV-1”)感染(Cocchi等人，Science270：1811-1815(1995))，使得将CCR5确定为HIV-1、HIV-2和SIV-1的初级分离株的主要辅受体(Deng等人，Nature 381：661-666(1996)；Doranz等人，Cell 85：1149-1158(1996)；Choe等人，Cell 85：1135-1148(1996)；Chen等人，J.Virol.71：2705-2714(1997)；和Alkhatib等人，Science 272：1955-1958(1996))。然而，尽管RANTES一向抑制周缘血液单核细胞中的HIV-1复制，但是它并不阻断初级巨嗜细胞培养物的感染，暗示RANTES可能影响非淋巴细胞类型中的HIV-1复制。
RANTES的N端修饰产生可以阻断HIV-1感染而不信号传导钙流(calcium flux)的拮抗剂(Mack等人，J.Exp.Med.187：1215-1224(1998)；和Proudfoot等人，J.Biol.Chem.271：2599-2603(1996))。这些修饰包括N端截断[RANTES 9-68](Arenzana-Seisdedos，et al，Nature 383：400(1996))和在RANTES的N端添加蛋氨酸(“Met-RANTES”)或氨氧基戊烷(“AOP-RANTES”)(Mack等人，上文；和Simmons等人，Science 276：276-279(1997))。据报导，Met-RANTES和AOP-RANTES衍生物是RANTES拮抗剂。此外，比天然RANTES具有更高与CCR5的亲和力的N端经修饰RANTES在阻断感染中比天然RANTES更有效(Simmons等人，同上文)。
有效、选择性且达到完全受体占有的趋化因子受体拮抗剂明显可用于治疗受染个体的HIV-1。令人吃惊的是，已经发现具有此活性谱的化合物。这些衍生物抑制许多不同细胞类型的感染，包括巨嗜细胞和淋巴细胞。此外，RANTES的拮抗剂有效阻断其炎性作用，并且因此可用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、病毒疾病、动脉粥样化(atheroma)/动脉粥样硬化(atheroschlerosis)、类风湿性关节炎和器官移植排斥。某些RANTES衍生物公开于Wells等人的国际申请案WO 96/17935中。美国专利第6,168,784号(以引用的方式并入本文)描述通过化学合成所制造的N端修饰RANTES衍生物。包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的RANTES多肽能够提供相似的或改进的治疗活性。
III.用于本发明的一般重组核酸方法
在本发明的许多实施例中，分离、克隆和经常使用重组方法改变编码所感兴趣的BSP的核酸。所述实施例用于包括(但不限于)蛋白表达或用于变体、衍生物、表达级联或其它来源于BSP的序列的产生中。在一些实施例中，编码本发明的多肽的序列经操作连接于异源启动子。分离GLP-1和在宿主细胞中产生GLP-1描述于(例如)美国专利第5,118,666号中，此专利以引用的方式并入本文。
可以基于母体多肽(包括(但不限于)具有SEQ ID NO：1、2、3、21(GLP-1)；SEQ ID NO：22、24(T-20)或SEQ ID NO：23(PYY(3-36))所示的氨基酸序列)的氨基酸序列并接着改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即并入或替换)或移除(即缺失或替换)，来合成编码包含非天然编码氨基酸的BSP的核苷酸序列。可以根据常规方法通过定点突变来便利地修饰核苷酸序列。或者，可以通过化学合成制备核苷酸序列，包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成剂，其中根据所需多肽的氨基酸序列设计寡核苷酸，并且优先选择在重组多肽将产生于其中的宿主细胞中被喜爱的密码子。举例来说，可以通过PCR、连接(ligation)或连接链反应合成并组装编码所需多肽部分的几种小寡核苷酸。参看，例如Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；美国专利6,521,427，所述文献以引用的方式并入本文。
本发明采用重组遗传学领域的常规技术。公开本发明所用的一般方法的基本文本包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，GeneTransfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人编辑，1994)。
描述分子生物学技术的一般文本包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，Current Protocols，a jointventure between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(1999增补)(″Ausubel″)。这些文本描述突变作用、载体用途、启动子和许多其它相关主题，包括(但不限于)产生包括用于蛋白制备的选择密码子的基因，所述蛋白包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶及其配对。启动子包括(但不限于)原核生物启动子、真核生物启动子、细菌启动子、酵母启动子、昆虫启动子、哺乳动物启动子、独特启动子和可诱导启动子。
各种类型的突变作用用于本发明的多种目的，包括(但不限于)产生tRNA的文库、产生合成酶的文库、产生选择密码子、将编码非天然氨基酸的选择密码子插入所感兴趣的蛋白或多肽中。所述突变作用包括(但不限于)定点、随机点突变、同源重组、DNA改组或其它循环突变(recursive mutagenesis)法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板进行的突变、寡核苷酸定向突变、硫代磷酸酯修饰DNA突变、使用缺口双链DNA等进行的突变，或其任何组合。其它合适方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株进行的突变、限制性选择和限制性纯化、缺失突变、通过总基因合成进行的突变、双链破裂修复等。包括(但不限于)涉及嵌合构建体在内的突变作用也包括在本发明范围内。在一个实施例中，可以通过天然发生分子或者经改变或变异的天然发生分子的已知信息指导突变，所述信息包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、晶体结构等等。
本文所见的文本和实例描述这些程序。其它信息见以下公开案和其内所引用的参考文献：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：an ovennew，Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitromutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein & Shortle，Strategies andapplications of in vitro mutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directedmutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J，编辑，Springer Verlag，Berlin)(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities，Science242：240-245(1988)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for theproduction of point mutations in any DNA fragment，Nucleic Acids Res.10：6487-6500(1982)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned intoM13 vectors，Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primersand a single-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nickedDNA，Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.13：8765-8785(1985)；Nakamaye & Eckstein，Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人，5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl. Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presenceofethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure withoutenzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Differentbase/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNAmismatch-repair system of E.coli，Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors，Methods in Enzvmol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh & Henikoff，Use ofoligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil. Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of agene coding for the ribonuclease S protein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outersegment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiplemutations at defined sites，Gene34：315-323(1985)；Grandstrom et al.，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis，Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repairin plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，83：7177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering for unusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001)；W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；和I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8(1995)。其它关于许多上述方法的细节见Methods in Enzymology第154卷，此参考案也描述用各种突变方法进行对故障检测问题(trouble-shootingproblem)的有效控制。
本发明也涉及用于经正交tRNA/RS对活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。用本发明的多聚核苷酸或包括本发明的多聚核苷酸的构建体(包括(但不限于)本发明的载体，例如可以是克隆载体或表达载体)来遗传工程操作(包括(但不限于)转化、转导或转染)宿主细胞。举例来说，载体可以为质粒、细菌、病毒、裸露多聚核苷酸或结合多聚核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述标准方法包括电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985))；病毒载体侵染；通过小粒子用核酸在小珠或粒子基质中或者在表面上进行高速弹道穿透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))。
可以在经过改良而获得适用于筛选步骤、激活启动子或选择转化子等的活性的常规营养培养基中培养经工程操作的宿主细胞。这些细胞视情况可以在转基因生物体中培养。包括(但不限于)用于细胞分离和培养(例如，用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，New York和其中所引用的参考文献；Payne等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)Plant Cell Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)；和Atlas和Parks(编辑)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。
将靶核酸引入细胞中的一些熟知方法可用，其中的任何一种均可用于本发明。这些方法包括：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、发射轰击(projectilebombardment)和用病毒载体侵染(在下文进一步讨论)，等等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒数目。使细菌生长至对数生长期，并且可以通过多种所属技术领域已知方法(参看，例如Sambrook)分离细菌内的质粒。此外，许多市售试剂盒可用于从细菌纯化质粒(参看，例如购自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；购自Stratagene的StrataCleanTM；和购自Qiagen的QIAprepTM)。进一步操纵经分离和经纯化的质粒以产生其它质粒，用于转染细胞或并入相关载体中以侵染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定靶核酸表达的启动子。载体视情况包含一般表达级联(generic expression cassette)，所述表达级联含有至少一个独立终止子序列、允许级联在真核生物或原核生物或两者(包括(但不限于)穿梭载体)中复制的序列和用于原核和真核系统的选择标记。载体适用于复制和整合进真核生物、原核生物或优选为两者。参看，Gillam & Smith，Gene 8：81(1979)；Roberts等人.，Nature，328：731(1987)；Schneider，B.等人，Protein Expr.Purif.6：1(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(均同上文)。举例来说，由ATCC提供可用于克隆的细菌和细菌噬菌体的目录，例如由ATCC所发表的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna等人(编辑)。其它用于测序、克隆和分子生物学其它方面的基本过程和基础理论考虑事项请见Watson等人(1992)Recombinant DNA Second Edition ScientificAmerican Books，NY。此外，基本上任何核酸(和基本上任何经标记核酸，无论标准还是非标准)均可以是从任何多种商业来源定购的定制品或标准品，所述商业来源例如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX，www.mcrc.com上可用)、The GreatAmerican Gene Company(Ramona，CA，www.genco.com上可用)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，www.expressgen.com上可用)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)，等。
选择密码子
本发明的选择密码子扩大蛋白生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无意义密码子，例如终止密码子(包括，但不限于，琥珀密码子(UAG)或乳白密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基密码子、稀有密码子等等。所属领域技术人员轻易地了解，存在许多数目的可以引入所需基因中的选择密码子，包括(但不限于)编码至少一部分BSP的单个多聚核苷酸中的一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
在一个实施例中，所述方法涉及选择密码子的用途，所述选择密码子是在真核细胞中活体内并入非天然氨基酸的终止密码子。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA，并且通过O-RS用所需非天然氨基酸进行氨酰化作用。所述O-tRNA不由天然发生宿主的氨酰基-tRNA合成酶所识别。常规定点突变可用于在所感兴趣的多肽的所感兴趣的位点处引入终止密码子，包括(但不限于)TAG。参看，例如Sayers，J.R.等人(1988)，5′-3′Exonuclease in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res，791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所感兴趣的多肽的核酸活体内结合时，非天然氨基酸响应于UAG密码子而并入从而产生在特定位置含有非天然氨基酸的多肽。
可以在不显著扰动真核宿主细胞下进行活体内非天然氨基酸的并入。举例来说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制基因tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合终止密码子并引发生长肽从核糖体释放)之间的竞争，所以抑制效率可以通过包括(但不限于)增加O-tRNA和/或抑制基因tRNA的表达水平来调控。
选择密码子也包含长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基密码子，例如四、五、六或更多碱基密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本发明的特征包括使用基于移码抑制的长密码子。四个或四个以上碱基密码子可以将包括(但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白中。举例来说，在存在突变O-tRNA(包括(但不限于)具有反密码子环(例如具有8-10个核苷酸反密码子环)的特殊移码抑制基因tRNA)下，将四个或四个以上碱基密码子读为单氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可以解码包括(但不限于)至少四碱基密码子、至少五碱基密码子或至少六碱基密码子或更多。由于存在256种可能的四碱基密码子，因此可以使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参看，Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size，Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code：Selectionof Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-baseCodons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307：755-769。
举例来说，已经使用活体外生物合成方法将四碱基密码子用于将非天然氨基酸并入蛋白中。参看，例如Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am， Chem.Soc.121：34。用两个经过化学酰基化作用的移码抑制基因tRNA，使用CGGG和AGGU同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物活体外并入链菌素中。参看，例如Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121：12194。在活体内研究中，Moore等人检测了具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可以为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA能够以13至26％的效率由具有UCUA反密码子的tRNALeu解码，其中在0或-1框架中发生极少解码。参看，Moore等人，(2000)J.Mol.Biol..298：195。在一个实施例中，基于稀有密码子或无意义密码子的长密码子可以用于本发明，其可以减少在其它非希望位点的错义通读(missense readthrough)和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可以包括一种天然三碱基密码子，其中内生系统并不使用(或极少使用)所述天然碱基密码子。举例来说，这包括缺少识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩大现有遗传密码字母表。一种额外碱基对将三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定和选择性碱基配对、通过聚合酶有效、高保真的酶法并入DNA中，和合成初生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可适用于所述方法和组合物的非天然碱基对描述包括(例如)Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein，Nature Biotechnology，20：177-182。其它相关出版物列于下文中。
对于活体内使用来说，非天然核苷是可穿膜的，并且经磷酸化而形成相应三磷酸酯。此外，增加的遗传信息是稳定的并且不被细胞酶破坏。Benner和他人的先前工作利用了不同于典型Watson-Crick对的氢键类型，其中最值得注意的是iso-C：iso-G对。参看，例如Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：8322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.BioL，4：602。这些碱基通常与天然碱基一定程度的错配，并且不能利用酶法复制。Kool和合作者证明碱基之间的疏水包装互作可以代替氢键以促使碱基对形成。参看Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol，4：602；和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36，2825。在开发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg和合作者已经系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS：PICS自身对(self-pair)比天然碱基对更为稳定，并且可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。参看，例如McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：11585；和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：3274。可以通过KF在具有足够满足生物功能的效率和选择性下合成3MN：3MN自身对。参看，例如Ogawa等人，(2000)J Am.Chem.Soc，122：8803。然而，两种碱基均充当进一步复制的链终止剂。最近开发出可用于复制PICS自身对的突变DNA聚合酶。此外，可以复制7AI自身对。参看，例如Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，123：7439。最近已经开发出在结合Cu(II)后形成稳定对的新颖金属碱基对Dipic：Py。参看Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：10714。因为长密码子和非天然密码子本身与天然密码子呈正交，所以本发明的方法可以利用所述特性来对其产生正交tRNA。
翻译绕过系统(translational bypassing system)也可以用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译绕过系统中，将大序列并入基因中，但是并未翻译为蛋白。所述序列含有充当诱导核糖体在序列上跳跃并且再继续插入的下游翻译的插入物(cue)的结构。
在某些实施例中，本发明的方法和/或组合物中所感兴趣的蛋白或多肽(或其部分)由核酸编码。核酸通常包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可以用所属领域技术人员所熟知的和本文中所描述的方法使编码所感兴趣的蛋白或多肽的基因发生突变，以包括(例如)用于并入非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。举例来说，所感兴趣的蛋白的核酸发生突变以包括用于并入一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子。本发明包括任何所述变体，其包括(但不限于)突变体、任何蛋白形式，例如包括至少一个非天然氨基酸。本发明也同样包括对应核酸，即具有编码一个或一个以上非天然氨基酸的一个或一个以上选择密码子的任何核酸。
可以轻易地使编码BSP(例如GLP-1、T-20或PYY(3-36))的核酸分子突变以在多肽的任何所希望的位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于在所感兴趣的蛋白上引入反应性分子、水溶性聚合物、蛋白或多种其它分子。适于将半胱氨酸引入多肽的所希望位置的方法为所属技术领域熟知(例如美国专利第6,608,183号中所描述的)，并且包括标准突变技术。
IV.非天然编码氨基酸
多种非天然编码氨基酸适用于本发明。可以将任何数目的非天然编码氨基酸引入BSP中。一般来说，所引入的非天然编码氨基酸对20种常见遗传编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)实质上成化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与未发现于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基和氨氧基)有效且选择性地反应而形成稳定结合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的BSP可以与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))反应，或者与含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定结合物，产生叠氮与炔官能团的选择性反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。
α-氨基酸的一般结构如下所示(式I)：
非天然编码氨基酸通常为具有上文所列式的任何结构，其中R基团为除用于二十种天然氨基酸中之外的任何取代基，并且适用于本发明。因为本发明的非天然编码氨基酸通常与所述天然氨基酸仅在侧链结构中有所不同，所以所述非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码的)以与天然发生多肽中酰胺键形成方式相同的方式形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有与天然氨基酸不同的侧链。举例来说，R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤素-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒-、磺酰基-、硼(III)酸根(borate)、硼(V)酸根(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮(enone)、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。其它可以适用于本发明的所感兴趣的非天然发生氨基酸包括(但不限于)包含光可活化交联剂的氨基酸、经自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射活性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价互作的氨基酸、光捕获和/或光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、例如经糖取代丝氨酸的糖基化氨基酸、其它碳水化合物修饰氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、化学可裂解和/或光可裂解氨基酸、与天然氨基酸相比具有长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)大于约5或大于约10个碳)的氨基酸、经碳连接含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明并且可用于与水溶性聚合物反应的示范性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应性基团的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。这些氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例还包括以下实例：其中氨基酸与糖之间的天然发生N-或O-键由通常未发现于天然中的共价键(包括(但不限于)烯、肟、硫醚和酰胺等)置换。这些氨基酸的实例也包括未通常发现于天然发生蛋白中的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等等。
本文所提供的许多非天然编码氨基酸是市售的，例如可购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的一个分公司，Darmstadt，Germany)或Peptech(Burlington，MA，USA)。所述市售的氨基酸可以视情况按照本文所提供或使用所属领域技术人员所已知的标准方法合成得到。关于有机合成技术，请参看，例如Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，BostonMass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，部分A和B，1990，PlenumPress，New York)。也参看美国申请公开案2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式并入本文。除了含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可以适用于本发明的非天然氨基酸视情况也包含经修饰骨架结构，包括(但不限于)由式II和III所示的结构：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可以相同或不同，通常包含S或O，并且R和R′视情况可以相同或不同，通常选自上文对具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的相同组成清单以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含由式II和III所示的氨基或羧基中的取代。此类型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括(但不限于)具有对应常见20种天然氨基酸的侧链或非天然侧链者。此外，在α-碳处的取代视情况包括(但不限于)L、D、或α-α-二取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等。其它可选结构包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物、β和α氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和α-氨基丁酸。
许多非天然氨基酸是基于天然氨基酸，例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等等，并且适用于本发明。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代酪氨酸、邻位取代酪氨酸和间位取代酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含：包括(但不限于)酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等等。此外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明的谷氨酰胺包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ取代衍生物、环状衍生物和酰胺取代谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明的苯丙氨酸的实例包括(但不限于)对位取代苯丙氨酸、邻位取代苯丙氨酸和间位取代苯丙氨酸，其中取代基包含：包括(但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、叠氮基、碘、溴、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等等。可适用于本发明的非天然氨基酸的具体实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸等等。可适用于本发明的多种非天然氨基酸的结构实例提供于(例如)WO2002/085923-标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids.”中。关于另外的蛋氨酸类似物，也参看Kiick等人，(2002)Incorporation ofazides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS 99：19-24。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(例如对(炔丙氧基)-苯丙氨酸)的BSP组合物。也提供包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸的各种组合物，并包括(但不限于)蛋白和/或细胞。一方面，包括对(炔丙氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可以结合(包括(但不限于)共价结合)于正交tRNA，包括(但不限于)经氨基-酰基键共价结合于正交tRNA，共价结合于正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH，等等。
经非天然氨基酸可以并入蛋白中的化学部分提供蛋白的多种优势和操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许用任何多种含肼或羟胺的试剂活体外和活体内选择性修饰蛋白。举例来说，重原子非天然氨基酸可以用于定相(phasing)X光结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子位点特异性引入也在选择重原子的位置方面提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和芳基叠氮(包括(但不限于)苯基叠氮)侧链的氨基酸)允许有效的活体内和活体外蛋白光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。具有光反应性非天然氨基酸的蛋白随后可以通过激发光反应性基团而得以随意(at will)交联-提供暂时控制。在一个实例中，非天然氨基的甲基可以经同位素标记取代，其包括(但不限于)作为局部结构和动力学探针的甲基，包括(但不限于)通过使用核磁共振和振动光谱学。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许用分子经[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白。
在氨基端并入多肽中的非天然氨基酸可由R基团(R基团为除用于20种天然氨基酸中之外的任何取代基)和第二反应性基团(不同于通常存在于α-氨基酸中的NH2基团)(见式I)组成。可以用不同于通常存在于α-氨基酸中的COOH基团(见式I)的第二反应性基团在羧基末端引入相似的非天然氨基酸。
非天然氨基酸的化学合成
许多适用于本发明的非天然氨基酸是市售的，例如可购自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI USA)。所述市售的氨基酸可以视情况如本文所提供或如各种出版物中所提供或使用所属领域技术人员所已知的标准方法合成得到。关于有机合成技术，参看，例如Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，NewYork)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，部分A和B，1990，Plenum Press，New York)。描述非天然氨基酸合成的其它出版物包括(例如)WO2002/085923标题为″In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids″；Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.，38，4660-4669；King，F.E.& Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates J.Chem. Soc.，3315-3319；Friedman，O.M.& Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.& Frappier，F.(1991)Glutamine analogues asPotential Antimalarials，.Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.& Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.& Rapoport，H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org. Chem.50：1239-1246；Barton等人，(1987)Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids andDerivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L-and D-alpha-Amino-Adipic Acids，L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett.43：4297-4308；和Subasinghe等人，(1992)Quisqualic acid analogues：synthesis ofbeta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35：4602-7。也参看2003年12月22日申请的标题为“Protein Arrays”的专利申请案第10/744,899号，和2002年12月22日申请的第60/435,821号。
A.羰基反应性基团
其中具有羰基反应性基团的氨基酸允许各种反应以经由亲核加成或醛醇缩合反应来连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)。
示范性含羰基氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即甲基、乙基或丙基)且酮基部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基且R2为简单烷基(即甲基、乙基或丙基)且酮基部分位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang，Z.等人.，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入本文。所属领域技术人员可以相似地制备其它含羰基氨基酸。
在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可以从具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于结合反应的醛官能团。举例来说，当生物活性分子为多肽时，N端丝氨酸或苏氨酸(其通常可以存在或者经化学或酶消化而暴露)可以用于在温和氧化裂解条件下用高碘酸盐产生醛官能性。参看，例如Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan，K.& Stroh，I，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol Chem.269：7224-7230(1994)。然而，所属技术领域已知的方法仅限于肽或蛋白N端的氨基酸。
在本发明中，携带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可以并入多肽中作为“隐蔽(masked)”醛官能团。举例来说，5-羟基赖氨酸带有相邻于ε胺的羟基。用于产生醛的反应条件通常包括在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠(sodium metaperiodate)以避免在多肽内其它位点处的氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应包括向多肽的缓冲溶液中加入约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中温育约10分钟。参看，例如美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文。
羰基官能团可以与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂在温和条件下在水溶液中选择性反应以分别形成在生理条件下稳定的对应腙、肟或缩氨基脲键。参看，例如Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在其它氨基酸侧链存在下进行选择性修饰。参看，例如Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 276：1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)以形成结合物。
示范性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，n为4，R1不存在，且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在，且X不存在。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，且氧原子位于芳基环上脂肪族基团的对位。
含肼、酰肼和氨基脲的氨基酸可以购自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼可以购自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。其它非市售氨基酸可以由所属领域技术人员制备。参看，例如美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文。
含有携带酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可以有效地和选择性地与多种含有醛基或其它官能团的分子以相似化学反应性反应。参看，例如Shao，J.和Tarn，J.，J.Am.Chern.Soc.117：3893-3899(1995)。与对存在于20种常见氨基酸上的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基和N端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使得其对醛、酮和其它亲电子基团显著更具反应性。
C.含氨氧基氨基酸
含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)以形成结合物。如肼、酰肼和氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性允许其与多种含有醛或其它官能团的分子以相似化学反应性有效地和选择性反应。参看，例如Shao，J.和Tam，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Ace.Chem.Res.34：727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果是相应腙，但是肟通常来源于氨氧基与含羰基基团(例如酮基)的反应。
示范性含氨氧基氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y＝C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，且Y存在。在一些实施例中，n为2，R1和X不存在，m为0，且Y不存在。
可以由轻易可得的氨基酸前驱物(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备含氨氧基的氨基酸。参看，例如M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。已经从天然来源分离出某些含氨氧基氨基酸，例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(Rosenthal，G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。所属领域技术人员可以制备其它含氨氧基氨基酸。
D.叠氮和炔反应性基团
叠氮和炔官能团的独特反应性使得其极其可用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮(尤其是脂肪族叠氮)和炔通常对普通反应化学条件稳定。具体来说，叠氮和炔官能团对发现于天然发生多肽中的20种常见氨基酸的侧链(即R基团)呈惰性。然而，当置于近距离(close proximity)时，显示出叠氮和炔基团的“弹簧负载(spring-loaded)”性质，并且它们经Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应以生成对应三唑。参看，例如Chin J.等人，Science 301：964-7(2003)；Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)。
因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(参看，例如Padwa，A.的COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(Trost，B.M.，1991编辑)，第1069-1109页；Huisgen，R.的1，3-DEPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY，(Padwa，A.，1984编辑)，第1-176页)而不是亲核取代，所以并入携带含叠氮和炔侧链的非天然编码氨基酸允许所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。可以在室温下在水性条件下，通过加入催化量的Cu(II)(包括(但不限于)催化量CuSO4的形式)，在存在用于将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂存在下原位进行涉及含叠氮或炔BSP的环加成反应。参看，例如Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Tornoe，C.W.等人，J.Org.Chem.67：3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599(2002)。示范性还原剂包括(但不限于)抗坏血酸、金属铜、奎宁、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和施加电势。
在一些情况下，当需要叠氮与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应时，BSP包含含有炔部分的非天然编码氨基酸，且待连接于氨基酸的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可以进行反向反应(即氨基酸上的叠氮部分和存在于水溶性聚合物上的炔部分)。
叠氮官能团也可以与含有芳基酯并适当地用芳基膦部分官能化的水溶性聚合物选择性反应，以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮，并且所得胺随后与最接近的酯键有效地反应以产生对应酰胺。参看，例如E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287，2007-2010(2000)。含叠氮的氨基酸可以是烷基叠氮(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮(对叠氮基苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的示范性水溶性聚合物可如下所示：
其中X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可以为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示范性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R′″和R″″各自独立是指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择，如同当存在一个以上这些基团时的各R′、R″、R′″和R ″″基团。当R ′和R″连接于同一氮原子时，其可以与氮原子结合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。对于上述取代基来说，所属领域技术人员应了解术语“烷基”包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
叠氮官能团也可以与含有硫酯并适当地用芳基膦部分官能化的水溶性聚合物选择性反应，以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮，并且所得胺随后与硫酯键有效地反应以产生对应酰胺。含有硫酯和膦部分的示范性水溶性聚合物可如下所示：
其中n为1-10；X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。示范性含炔氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0，且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，且炔丙氧基位于相对于烷基侧链的对位(即O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R1和X不存在，m为0(即炔丙基甘氨酸)。
含炔氨基酸是市售的。举例来说，炔丙基甘氨酸可以购自Peptech(Burlington，MA)。或者，可以根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说，可以(例如)如Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783(2003)中所述合成对炔丙氧基苯丙氨酸，并且如Kayser，B.等人，Tetrahedron 53(7)：2475-2484(1997)中所述合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域技术人员可以制备其它含炔氨基酸。
示范性含叠氮化物氨基酸可如下所示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0，且叠氮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4，且R1和X不存在，且m为0。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为2且β-叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮的氨基酸可以自商业来源购得。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可得自Chem-Impex International，Inc.(Wood Dale，IL)。关于非市售含叠氮氨基酸，可以使用所属领域技术人员所已知的标准方法相对简单地制备叠氮基，包括(但不限于)经由合适离去基团(包括(但不限于)卤素、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯)置换，或者经由打开经适当保护的内酯。参看，例如March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley andSons，New York)。
E.氨基硫醇反应性基团
经β-取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使得其极其可用于多肽和其它含有醛基的生物活性分子经由形成四氢噻唑而进行选择性修饰。参看，例如J.Shao和J.Tam，J.Am.Chem.Soc.1995，117(14)3893-3899。在一些实施例中，经β-取代的氨基硫醇氨基酸可以并入BSP中，并且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物结合物或其它有效负载(payload)可以经由形成四氢噻唑而偶联于包含经β-取代的氨基硫醇氨基酸的BSP。
非天然氨基酸的细胞摄取
当指定并选择非天然氨基酸以用于包括(但不限于)并入蛋白中时，通常必须考虑由真核细胞摄取非天然氨基酸的问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度暗示这些化合物不太可能具有细胞可透性。天然氨基酸经一组基于蛋白的转运系统而被真核细胞所摄取。可以进行快速筛选以评估(若存在)哪些非天然氨基酸由细胞摄取。参看，例如2003年12月22日申请的标题为“ProteinArrays”的申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号中的毒性测定；和Liu，D.R.& Schultz，P.G.(1999)Progresstoward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States96：4780-4785。尽管用各种方法轻易地分析摄取，但是对服从细胞摄取途径的预想非天然氨基酸的替代是提供生物合成途径以活体内产生氨基酸。
非天然氨基酸的生物合成
细胞中已经存在许多生物合成途径用于生产氨基酸和其它化合物。尽管天然(包括(但不限于)真核细胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但是本发明提供这样的方法。举例来说，通过加入新酶或修饰现存宿主细胞途径而视情况在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新酶为视情况天然发生酶或人工演化酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(例如WO 2002/085923-标题为“In vivoincorporation of unnatural amino acids”中所示)依赖于添加来源于其它生物体的已知酶的组合。通过用包含所述酶的基因的质粒转化细胞而可以将这些基因并入真核细胞中。当在细胞中表达时，所述基因提供酶途径以合成所需化合物。视情况添加的酶类型的实例在下文实例中提供。其它酶序列见(例如)Genbank。视情况也以相同方式将人工演化酶添加至细胞中。以此方式操纵细胞机器和细胞来源以产生非天然氨基酸。
多种方法可用于产生用于生物合成途径或用于现有途径演化的新颖酶。举例来说，包括(但不限于)Maxygen，Inc.(www.maxygen.com上可用)所开发的递归重组(recursiverecombination)视情况用于开发新颖酶和途径。参看，例如，Stemmer(1994)，Rapidevolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature 370(4)：389-391；和Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination formolecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：10747-10751。同样，由Genencor(www.genencor.com上可用)所开发的DesignPathTM视情况用于代谢途径工程，包括(但不限于)用于工程化改造途径以在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸。所述技术采用新基因(包括(但不限于)经功能基因组学、分子演化和设计来确定的基因)的组合以在宿主生物体中重建现有途径。Diversa Corporation(www.diversa.com上可用)也提供用于快速筛选基因和基因途径文库的技术，包括(但不限于)用于建立新途径。
通常以足以进行有效蛋白生物合成的浓度制造用本发明经工程操作的生物合成途径所产生的非天然氨基酸，所述浓度包括(但不限于)天然细胞量，但未达到影响其它氨基酸或耗尽细胞源浓度的程度。以此方式活体内产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。一旦用包含用于产生特异性途径所需酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸，就视情况使用活体内选择来进一步优化用于核糖体蛋白合成和细胞生长的非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
可以为了多种目的进行非天然氨基酸的并入，包括(但不限于)调整蛋白结构和/或功能的改变；改变大小、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点可达性；靶向部分(包括(但不限于)用于蛋白阵列)；添加生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节主动转运；调节组织、细胞或器官特异性或分布；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等等。包括非天然氨基酸的蛋白可以具有增强的或甚至是完全新的催化或生物物理性质。举例来说，视情况通过将非天然氨基酸包括进蛋白来改变以下性质：毒性、生物分布、结构性质、分光性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半哀期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应的能力，包括(但不限于)共价或非共价，等等。包括含有至少一种非天然氨基酸的蛋白的组合物可用于(包括(但不限于))新颖治疗法、诊断、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括(但不限于)抗体)，且包括(但不限于)蛋白结构和功能的研究。参看，例如Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。
在本发明一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白。非天然氨基酸可以相同或不同，包括(但不限于)蛋白中可以存在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同非天然氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同位点。另一方面，组合物包括一种蛋白，该蛋白中至少一个但少于全部蛋白中所存在的特定氨基酸由非天然氨基酸替换。对于给定具有一个以上非天然氨基酸的蛋白来说，非天然氨基酸可以相同或不同(包括(但不限于)所述蛋白可以包括两种或两种以上类型的非天然氨基酸，或者可以包括两种相同非天然氨基酸)。对于给定具有两个以上非天然氨基酸的蛋白来说，非天然氨基酸可以相同、不同或为多个相同类型非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。
具有至少一个非天然氨基酸的令人感兴趣的蛋白或多肽是本发明的一个特征。本发明也包括具有至少一个用本发明的组合物和方法产生的非天然氨基酸的多肽或蛋白。也可以为蛋白提供赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)。
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的令人感兴趣的蛋白或多肽，蛋白或多肽通常包括真核细胞翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞活体内所进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并不由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等等。一方面，翻译后修饰包括寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))通过GlcNAc-天冬酰胺键连接于天冬酰胺。参看表1，列出真核蛋白的一些N连接寡糖的实例(也可能存在其它未图示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等等)通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键与丝氨酸或苏氨酸连接。
表1：经GlcNAc-键连接的寡糖的实例
另一方面，翻译后修饰包括前驱物(包括(但不限于)降钙素前驱物、降钙素基因相关肽前驱物、前甲状旁腺原(preproparathyroid)激素、前胰岛素原(preproinsulin)、胰岛素原、前阿片促黑素皮质素原(prepro-opiomelanocortin)、阿片促黑素皮质素原等等)的蛋白水解加工；组装进多亚单位蛋白或大分子组装体；传送至细胞中另一位点(包括(但不限于)至细胞器，例如内质网、高尔基(Golgi)体、核、溶酶体、过氧物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等等或经由分泌途径)。在某些实施例中，蛋白包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、多聚组氨酸标签、GST融合体等等。
非天然氨基酸的一个优势在于其存在能够用于添加其它分子的其它化学部分。可以在真核或非真核细胞中活体内或活体外进行这些修饰。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是经由非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可以经由亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白选择性修饰的大部分反应涉及亲核与亲电子反应伴侣之间的共价键，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。通过蛋白中亲核残基的数目和可达性来确定这些情况下的选择性。在本发明的蛋白中，可以使用其它更具选择性的反应，例如非天然酮基-氨基酸与酰肼或氨氧基化合物活体外和活体内的反应。参看，例如，Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128；Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)J.Am.Chem. Soc.124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99：11020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci，100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry，42：6735-6746；和Chin等人，(2003)Science，301：964-7。这允许用许多试剂(包括(但不限于)荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子)选择性标记实质上任何蛋白。也参看，基于2002年10月16日申请的美国临时专利申请案第60/419,265号、2002年10月23日申请的美国临时专利申请案第60/420,990号和2003年1月16日申请的美国临时专利申请案第60/441,450号的2003年10月15日申请的标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利第10/686,944号，这些参考案均以引用的方式并入本文。包括(但不限于)经由叠氮基氨基酸在内的翻译后修饰也可以通过Staudinger连接(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。参看，例如Kiick等人，(2002)Incorporation ofazides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS 99：19-24。
本发明提供用于选择性修饰蛋白的另一种高效方法，所述方法涉及将非天然氨基酸(包括(但不限于)含有叠氮或炔基部分)响应于选择密码子而遗传并入蛋白中。随后可以通过以下方法修饰这些氨基酸侧链，所述方法包括(但不限于)分别与包括(但不限于)乙炔或叠氮衍生物进行Huisgen[3+2]环加成反应(参看，例如Padwa，A.的Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)编辑Trost，B.M.，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.的1.3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry，(1984)编辑Padwa，A.，Wiley，New York，第1-176页)。由于所述方法涉及环加成而不是亲核取代，因此蛋白能够以极高选择性进行修饰。可以通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐来在室温下在水性条件中以良好区域选择性(1，4＞1，5)进行反应。参看，例如Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。另一可用方法是用四半胱氨酸基序在二砷化合物上进行配体交换，参看，例如Griffin等人，(1998)Science 281：269-272。
可以通过[3+2]环加成反应添加至本发明的蛋白中的分子实质上包括任何具有叠氮或炔基衍生物的分子。分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、小珠、第二蛋白或多肽(或更多)、多聚核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。可以将这些分子分别添加于具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙氧基苯丙氨酸)中或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
V.活体内产生包含非遗传编码氨基酸的BSP
可以用经修饰tRNA和tRNA合成酶添加或取代并非天然发生系统中所编码的氨基酸来活体内产生本发明的BSP。
使用并非天然发生系统中所编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的产生方法描述于(例如)美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，所述文献以引用的方式并入本文。这些方法涉及产生与对翻译系统为内源的合成酶和tRNA无关地行使职责的翻译机器(因此有时称为“正交”)。翻译系统通常包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。O-RS通常优先在翻译系统中用至少一个非天然发生氨基酸氨酰化O-tRNA，并且O-tRNA识别至少一个不由系统中其它tRNA所识别的选择密码子。由此翻译系统响应于所编码的选择密码子将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的蛋白中，进而将氨基酸“替换”进所编码多肽的位置中。
所属技术领域已经描述许多种用于将特定合成氨基酸插入多肽中的正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且通常适用于本发明。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：56-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。示范性O-RS或其部分由多聚核苷酸序列所编码，并且包括公开于美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885中的氨基酸序列，所述公开案以引用的方式并入本文。用于与O-RS一起使用的对应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，所述公开案以引用的方式并入本文。
叠氮特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的示范性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NO：14-16和29-32和氨基酸序列SEQ ID NO：46-48和61-64，所述公开案以引用的方式并入本文。适用于本发明的示范性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所公开的核苷酸序列SEQ ID NO：1-3，所述公开案以引用的方式并入本文。对特定非天然编码氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，所述公开案以引用的方式并入本文。将含酮基和叠氮的氨基酸并入酿酒酵母中的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的用途包括选择编码非天然编码氨基酸的特异性密码子。尽管可以使用任何密码子，但是通常需要选择O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶被表达的细胞中罕有或从未使用过的密码子。举例来说，示范性密码子包括无意义密码子，例如终止密码子(琥珀、赭石和乳白)；四个或四个以上碱基密码子和其它罕有或从未使用过的天然三碱基密码子。
可以使用所属领域已知的突变方法(包括(但不限于)位点特异性突变、级联突变、限制性选择突变等等)将特异性选择密码子引入GLP-1多肽编码序列中的适当位置中。
用于产生蛋白生物合成机器的组分(例如可用于并入非天然编码氨基酸的O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于中Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)。用于活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，所述公开案以引用的方式并入本文。用于选择用于生物体活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，所述公开案以引用的方式并入本文。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)从第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS文库(视情况为突变体)，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，例如甲烷球菌、甲烷细菌、嗜盐菌属、大肠杆菌、闪烁古生球菌、激烈热球菌、超嗜热古菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌等等，或真核生物体；(b)选择(和/或筛选)RS文库(视情况为突变体)中在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA(O-tRNA)的成员，进而提供活性(视情况为突变体RS)RS池；和/或(c)选择(视情况经阴性选择)所述池中在无非天然编码氨基酸存在下优先氨酰化O-tRNA的活性RS(包括(但不限于)突变体RS)，进而提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS优先用非天然编码氨基酸氨酰化O-tRNA。
在一个实施例中，RS为非活性RS。可以通过使活性RS突变来产生非活性RS。举例来说，可以通过将至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或者至少约10个或10个以上氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生非活性RS。
可以用所属技术领域各种已知技术来产生突变体RS文库，所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或者随机或合理设计技术中RS核苷酸的突变。举例来说，可以通过位点特异性突变、随机突变、多样性重组突变(diversity generatingrecombination mutation)、嵌合构建、合理设计，以及通过本文所述或所属技术领域已知的其它方法来产生突变体RS。
在一个实施例中，选择(和/或筛选)RS文库(视情况为突变体RS)中活性(包括(但不限于)在非天然编码氨基酸和天然编码氨基酸存在下氨酰化正交tRNA(O-tRNA))成员包括：将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等等)和(视情况突变体)RS文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀、赭石或乳白密码子)；使所述多个细胞在选择剂存在下生长；在选择和/或筛选剂存在下通过抑制阳性选择和/或筛选标记中的至少一个选择密码子来鉴别存活(或展示特异性反应)细胞，进而提供一亚组含有活性(视情况为突变体)RS池的经阳性选择的细胞。选择和/或筛选剂浓度视情况可以改变。
一方面，阳性选择标记为氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因，并且选择密码子为CAT基因中的琥珀终止密码子。阳性选择标记视情况为β-内酰胺酶基因，并且选择密码子为β-内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性选择标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中，阴性选择/或筛选池中优先在无非天然编码氨基酸存在下氨酰化O-tRNA的活性RS文库(视情况为突变体)包括：将阴性选择或筛选标记和由阳性选择或筛选得到的活性(视情况为突变体)RS池引入第二生物体的多个细胞中，其中所述阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；和鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选或选择剂的第一培养基中存活或展示特异性筛选反应、但不能在补充有非天然编码氨基酸和筛选或选择剂的第二培养基中存活或展示特异性筛选反应的细胞，进而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞。举例来说，CAT鉴别实验方案视情况充当在合适O-RS重组体的确定中的阳性筛选和/或阴性筛选。举例来说，视情况在含有CAT(包含至少一个选择密码子)且含有或不含一种或一种以上非天然编码氨基酸的生长板上复制克隆池。因此将只在含有非天然编码氨基酸的板上生长的集落视为含有重组O-RS。一方面，选择(和/或筛选)剂的浓度可以改变。在一些方面，第一和第二生物体不同。因此，第一和/或第二生物体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacteria)、真细菌、植物、昆虫、原生生物等等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记。
在另一实施例中，筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)池中活性(视情况为突变体)RS包括：从阳性选择步骤(b)分离出活性突变体RS池；将阴性选择或筛选标记(其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)毒性标记基因，包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的核糖核酸酶barnase基因))和活性(视情况为突变体)RS池引入第二生物体的多个细胞中；和鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或展示特异性筛选反应、但是不能在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中存活或展示特异性筛选反应的细胞，进而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或经筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS特异于所述非天然编码氨基酸。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。所述实施例视情况可以包括：其中所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且其中第一与第二生物体不同(各生物体视情况包括(但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等等)的情况。一些方面也包括其中阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情况。其它方面包括其中筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和力的筛选标记的情况。在本文的实施例中，筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严谨性的变化。
在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可以进一步包含：d)分离出至少一种重组O-RS；(e)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况经突变)；和(f)重复步骤(b)和(c)直至获得包含优先氨酰化O-tRNA能力的突变O-RS。视情况重复步骤(d)-(f)，包括(但不限于)至少约两次。一方面，可以通过突变作用来产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS，所述突变作用包括(但不限于)随机突变、位点特异性突变、重组或其组合。
上述方法中的包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者在内的选择/筛选步骤的严谨性视情况包括改变选择/筛选严谨性。在另一实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)两者包含使用报导子，其中通过荧光激活细胞分选(FACS)来检测报导子，或者其中通过发光检测报导子。报导子视情况展示在细胞表面上、噬菌体展示表面上等等，并且基于涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和力或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶展示在细胞表面上、噬菌体展示表面上等等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)从第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制基因tRNA)的突变体tRNA文库；(b)选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在无来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)存在下由来源于第二生物体的RS氨酰化的(视情况突变体)tRNA文库，进而提供tRNA(视情况突变体)池；和(c)选择或筛选tRNA(视情况突变体)池中由所引入正交RS(O-RS)氨酰化的成员，进而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，并且不由来源于第二生物体的RS所有效识别，并且优先由O-RS氨酰化。在一些实施例中，至少一种tRNA为抑制基因tRNA并且/或者包含天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或者为无意义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或乳白终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有改进的正交性。应了解，在一些实施例中，无需修饰而将O-tRNA视情况从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一与第二生物体相同或不同，并且视情况选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)甲烷球菌、甲烷细菌、大肠杆菌、嗜盐菌属等等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等等。此外，重组tRNA视情况由非天然编码氨基酸氨酰化，其中非天然编码氨基酸天然或经遗传操纵而活体内生物合成。视情况将非天然编码氨基酸添加于用于至少第一或第二生物体的生长培养基中。
一方面，选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选文库中由氨酰基-tRNA合成酶氨酰化(步骤(b))的(视情况为突变体)tRNA包括：将毒性标记基因(其中毒性标记基因包含至少一个所述选择密码子)(或导致产生毒性剂或静电剂(static agent)的基因或为生物体所必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)和(视情况为突变体)tRNA文库引入来源于第二生物体的多个细胞中；和选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包含至少一种正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况为突变体)tRNA池。举例来说，可以通过使用比较比率细胞密度测定(comparison ratio cell density assay)来选择存活细胞。
另一方面，毒性标记基因可以包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可以包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中，选择或筛选(视情况为突变体)tRNA池中由所引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员包括：将阳性选择或筛选标记基因(其中阳性标记基因包含药物抗性基因(包括(但不限于)包含至少一个所述选择密码子(例如至少一个琥珀终止密码子)的β-内酰胺酶基因)或为生物体所必需的基因)或引起毒性剂解毒的基因，连同O-RS和(视情况为突变体)tRNA池引入来源于第二生物体的多个细胞中；和鉴别在选择或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)存在下生长的存活或经筛选细胞，进而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池，其中所述至少一种重组tRNA由O-RS氨酰化，并响应于所述至少一个选择密码子将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，选择和/或筛选剂的浓度可以改变。
提供产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包括：(a)从第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变体tRNA文库；(b)阴性选择或筛选文库中在无来自第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)存在下由来自第二生物体的RS氨酰化的(视情况为突变体)tRNA，进而提供(视情况为突变体)tRNA池；(c)选择或筛选(视情况为突变体)tRNA池中由所引入的正交RS(O-RS)氨酰化的成员，进而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子，并且不由来自第二生物体的RS有效识别，并且优先由O-RS氨酰化。所述方法也包括(d)从第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况为突变体)RS文库；(e)选择或筛选突变体RS文库中优先在非天然编码氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰化至少一种重组O-tRNA的成员，进而提供活性(视情况为突变体)RS池；和(f)阴性选择或筛选池中优先在无非天然编码氨基酸存在下氨酰化至少一种重组O-tRNA的活性(视情况为突变体)RS，进而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种特异于所述非天然编码氨基酸的重组O-RS和至少一种重组O-tRNA。包括通过所述方法所产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可以包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对，例如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对，等等。此外，所述方法包括其中第一和第三生物体相同(包括(但不限于)甲烷球菌)的情况。
本发明也包括选择用于第二生物体活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和分离自或来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的重复细胞组中；和选择不能在重复细胞组中存活的第一组中的存活细胞，或筛选展示特异性筛选反应而不能在重复细胞组中产生此反应的细胞，其中第一组和重复细胞组在选择或筛选剂存在下生长，其中存活或经筛选细胞包含用于第二生物体活体内翻译系统的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补测定。选择或筛选剂浓度可以改变。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明的方法中的第一和第二生物体可以相同或不同。在一个实施例中，生物体视情况为原核生物，包括(但不限于)甲烷球菌、甲烷细菌、嗜盐菌属、大肠杆菌、闪烁古生球菌、激烈热球菌、超嗜热古菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌等等。或者，生物体视情况包含真核生物，包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等等)等等。在另一个实施例中，第二生物体为原核生物，包括(但不限于)甲烷球菌、甲烷细菌、嗜盐菌属、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜盐菌属、激烈热球菌、超嗜热古菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌等等。或者，第二生物体可以为真核生物，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等等。在各种实施例中，第一和第二生物体不同。
VI.非天然发生氨基酸在BSP中的位置
本发明涵盖将一种或一种以上非天然发生氨基酸并入BSP中。一种或一种以上非天然发生氨基酸可以在不破坏多肽活性的特定位置处并入。这可以通过进行“保守性”替换而得以实现，包括(但不限于)用疏水性氨基酸替换疏水性氨基酸、大氨基酸替换大氨基酸、亲水性氨基酸替换亲水性氨基酸，和/或将非天然发生氨基酸在并非为活性所必需的位置处插入。
可以采用多种生物化学和结构方法来选择BSP中用于用非天然编码氨基酸进行替换的所需位点。所属领域技术人员轻易地了解，多肽链中的任何位置适于选择以并入非天然编码氨基酸，并且选择可以基于合理设计或者通过随机选择而用于任何或非特殊所需目的。所需位点的选择可以用于产生具有任何所需性质或活性的BSP分子，包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合伴侣结合的调节剂、结合伴侣活性调节剂、结合伴侣构象调节剂、二聚体或多聚体形成、不改变相比于天然分子的活性或性质；或者操纵多肽的任何物理或化学性质，例如溶解性、聚集性或稳定性。举例来说，可以使用所属技术领域已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描法来鉴别多肽中BSP生物活性所必需的位置。GLP-1的相关信息请参看，Adelhorst等人J.of Bio1.Chem.1994 269(9)：6275-6278。取决于多肽的所需活性，除由丙氨酸或同系物扫描突变所鉴别的为生物活性关键的残基之外的残基可以是用非天然编码氨基酸进行替换的良好候选。或者，再次取决于多肽的所需活性，所鉴别的为生物活性关键的位点也可以是用非天然编码氨基酸进行替换的良好候选。另一种选择是可以简单地在多肽链上的每个位置中用非天然编码氨基酸进行连续替换，并且观察对多肽活性的影响。所属领域技术人员轻易地了解，任何用于选择用非天然氨基酸替换进任何多肽中的位置的手段、技术或方法适用于本发明。
也可以检查含有缺失的BSP的天然发生突变体的结构和活性，以确定可以耐受经非天然编码氨基酸替换的蛋白区。以相似的方式使用蛋白酶消化和单克隆抗体来确定BSP中负责结合BSP受体或结合伴侣的区域。一旦排除掉可能不耐受经非天然编码氨基酸替换的残基，就可以根据BSP及其受体或结合伴侣的结构来检查在各剩余位置处所提议替换的影响。因此，所属领域技术人员能够轻易地鉴别可以由非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些实施例中，本发明的BSP包含一个或一个以上位于不破坏多肽螺旋或β片层二级结构的蛋白区域内的非天然发生氨基酸。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在GLP-1中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端)、羧基端添加或其任何组合处并入。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在GLP-1中的任何位置处并入，其包括(但不限于)如下残基：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、291、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)或其任何组合。
在一些实施例中，在这些或其它位置处的非天然发生氨基酸连接于水溶性分子的(包括(但不限于))以下位置：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、29I、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)或其任何组合。在一些实施例中，本发明的GLP-1多肽包含在一个或一个以上的以下位置处提供拮抗剂的非天然发生氨基酸：7、8、9、22、18、29、25、32、21、28、17、24、31、20或其任何组合。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在T-20(包括TEX)中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端)、羧基端添加或其任何组合并入。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在T-20(包括TEX)中的任何位置处并入，其包括(但不限于)如下残基：W631、D632、1635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651或其任何组合。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在肽YY中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端)、羧基端添加或其任何组合处并入。
并入非天然编码氨基酸的示范性残基可以是以下所描述者：不含潜在受体结合区或与结合伴侣结合的区；能够完全或部分溶剂暴露；与邻近残基具有最小或无氢键互作；能够最小程度地暴露于邻近反应性残基；可以在BSP的一个或一个以上暴露面上；如由结合或未结合于其受体或结合伴侣或者偶联或未偶联于另一BSP或其它生物活性分子的BSP的三维、二级、三级或四级结构所预测，可以处在高度柔性或结构刚性的区域中；或者视需要可以通过改变完整结构的柔性或刚性来调节BSP自身或者包含一个或一个以上BSP的二聚体或多聚体的构象。
在一些实施例中，GLP-1拮抗剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸，所述水溶性聚合物存在于GLP-1分子的受体结合区中。在一些实施例中，水溶性聚合物在以下一个或一个以上氨基酸位置处偶联于GLP-1多肽：7、8、9、22、18、29、25、32、21、28、17、24、31和20(SEQ ID NO：1、2、3、21或任何其它GLP-1多肽)。
可以用许多种非天然编码氨基酸替换或并入BSP的给定位置。一般来说，根据以下来选择用于并入的特定非天然编码氨基酸：有或无其受体或结合伴侣的BSP结构检测；保守性替换的优选性(即基于芳基的非天然编码氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸替换Phe、Tyr或Trp)；和希望引入BSP中的特异性结合化学(例如，如果希望实现与具有炔部分的水溶性聚合物之间的Huisgen[3+2]环加成反应或者与具有芳基酯接着又并入膦部分的水溶性聚合物之间的酰胺键形成，那么就引入4-叠氮基苯丙氨酸)。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白中，其中非天然氨基酸包含第一反应性基团；并使蛋白接触包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或任何上述组合或任何其它所需化合物或物质)。第一反应性基团与第二反应性基团反应以经[3+2]环加成反应将分子连接于非天然氨基酸。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分，并且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对炔丙氧基苯丙氨酸)，并且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸)，且第二反应性基团为炔基部分。
在一些情况下，非天然编码氨基酸替换可以与BSP中的其它添加、替换或缺失结合以影响BSP的其它生物学特性。在一些情况下，所述其它添加、替换或缺失可以增加BSP的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解引起的降解作用的抗性)，或者增加BSP与BSP受体或结合伴侣的亲和力。在一些情况下，其它添加、替换或缺失可以增加BSP的溶解性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、替换或缺失可以增加在大肠杆菌重组宿主细胞中表达之后的多肽溶解性。在一些实施例中，除了另一用于并入非天然氨基酸而使得在大肠杆菌重组宿主细胞中表达后引起多肽溶解度增加的位点之外，选择用于经天然编码或非天然氨基酸替换的位点。在一些实施例中，BSP包含调节与BSP受体或结合伴侣的亲和力、调节(包括(但不限于)增加或减少)受体二聚化作用、稳定受体二聚体、调节结合伴侣的构象或者一种或一种以上生物活性、调节循环半衰期、调节释放或生物利用率、促进纯化或改进或改变特定投药途径的另一增加、替换或缺失。类似地，BSP可以包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等等)或改进缺失(包括(但不限于)GFP)、纯化、经组织或细胞膜转运、前药释放或活化、BSP尺寸减小或其它多肽特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。
一些实施例中，非天然编码氨基酸的替换产生BSP拮抗剂。一亚组用于并入非天然编码氨基酸的示范性位点包括GLP-1的7、8、9、22、18、29、25、32、21、28、17、24、31和20。在其它实施例中，将上文所列替换与引起GLP-1多肽成为GLP-1拮抗剂的其它替换组合。在一些实施例中，GLP-1拮抗剂包含连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸，所述水溶性聚合物存在于GLP-1分子的受体结合区中。
在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸经一个或一个以上非天然编码氨基酸替换。在一些情况下，BSP进一步包括一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然发生氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个替换。举例来说，在一些实施例中，GLP-1以下区中的至少两个残基经非天然编码氨基酸替换：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、29I、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)或其任何组合。在一些实施例中，T-20多肽的至少两个残基经非天然编码氨基酸替换，包括(但不限于)：W631、D632、I635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在肽YY中任何位置、第一氨基酸之前(作氨基端)、羧基端添加或其任何组合处并入。
在一些情况下，一个或一个以上非天然编码残基连接于一个或一个以上较低分子量的直链或支链PEG(整体上大约～5-20kDa或更小)，进而相对于连接于单个、较大分子量PEG的物质而言增强结合亲和力和可比的血清半衰期。
VII.在非真核生物和真核生物中的表达
为了获得所克隆BSP的高水平表达，通常将编码本发明BSP的多聚核苷酸亚克隆进含有指引转录、转录/翻译终止子的强启动子的表达载体中，并且如果是对于编码蛋白的核酸，则含有用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为所属技术领域所熟知，且描述于(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中。
用于表达本发明BSP的细菌表达系统在(包括(但不限于))大肠杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌和沙门氏菌(Salmonella)中可用(Palva等人，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302：543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒是市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为所属技术领域所熟知，并且也是市售的。在使用正交tRNA和氨酰基-tRNA合成酶(上述)表达本发明的BSP的情况下，根据其使用正交组分的能力选择用于表达的宿主细胞。示范性宿主细胞包括格兰阳性细菌(包括(但不限于)枯草杆菌或链霉菌(Streptomyces))和格兰阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌)以及酵母和其它真核细胞。可以如本文所述使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包含大量可用非天然氨基酸的蛋白的能力。一方面，组合物视情况包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多的包含非天然氨基酸的蛋白，或者用活体内蛋白产生方法可以达到的量(本文提供关于重组蛋白产生和纯化的细节)。另一方面，在(包括(但不限于))细胞溶解液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)约1nl至约100L的体积)中组合物中视情况存在(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白、每升至少50微克蛋白、每升至少75微克蛋白、每升至少100微克蛋白、每升至少200微克蛋白、每升至少250微克蛋白、每升至少500微克蛋白、每升至少1毫克蛋白、每升至少10毫克蛋白或更高浓度的蛋白。真核细胞中产生大量(包括(但不限于)多于通常用包括(但不限于)活体外翻译在内的其它方法所可能获得的量)的包括至少一种非天然氨基酸的蛋白是本发明的一个特征。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包含大量可用非天然氨基酸的蛋白的能力。举例来说，可以产生包括(但不限于)以下浓度的包含非天然氨基酸的蛋白：细胞提取物、细胞溶解液、培养基、缓冲液等中至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更大。
I.表达系统、培养和分离
可以在任何数目的合适表达系统中表达BSP，合适的表达系统包括(但不限于)酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌。下文提供示范性表达系统的描述。
酵母如本文所用术语“酵母”包括任何各种能够表达编码BSP基因的酵母。所述酵母包括(但不限于)属于半知菌类(Fungi imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、basidiosporogenous酵母。产子囊酵母分为两科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae(例如粟酒裂殖酵母属(genus Schizosaccharomyces))、Nadsonioideae(拿逊酵母亚科)、Lipomycoideae和Saccharomycoideae(例如毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属和酿酒酵母(Saccharomyces)属)。Basidiosporogenous酵母包括白冬孢酵母(Leucosporidium)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、锁掷酵母(Sporidiobolus)属、Filobasidium和线担菌(Filobasidiella)属。属于半知菌类(芽孢纲)的酵母分为两科：掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌属(Candida))。
本发明所使用的尤其令人感兴趣的种类为以下属种：毕赤酵母、克鲁维酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母属、汉逊酵母(Hansenula)、球拟酵母(Torulopsis)和念珠菌，包括(但不限于)巴氏毕赤酵母(P.pastoris)、P.guillerimondii、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、淀粉酶链霉菌(S.diastaticus)、S.douglasii、克氏酵母(S.kluyveri)、S.norbensis、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白假丝酵母(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和多形汉逊酵母(H.polymorph)。
选择用于BSP表达的合适酵母在所属领域技术人员的技能之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适宿主可以包括具有(例如)良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好可溶性蛋白产生和总体坚固性的宿主。酵母通常可以从多种来源获得，包括(但不限于)Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University ofCalifornia(Berkeley，CA)，和American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可以用作或已经用作重组载体或其它转运DNA的受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其它转运DNA的最初酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意突变，因此单亲细胞的后代可能并不必需与最初亲代在形态或基因组或总DNA补体上完全相同。所述定义所指后代包括与亲代足够相似之处在于相关特性(例如存在编码BSP的核苷酸序列)的亲代细胞的后代。
已经开发出包括染色体外复制子或整合载体在内的表达和转化载体以用于转化进许多酵母宿主中。举例来说，已经开发出用于酿酒酵母的表达载体(Sikorski等人，GENETICS(1998)112：19；Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153：163；Hinnen等人，PROCNATL.ACAD.SCI.USA(1978)75：1929)；白假丝酵母的表达载体(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6：142)；麦芽糖假丝酵母的表达载体(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；多形汉逊酵母的表达载体(Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，MOL.GEN.GENET.(1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母的表达载体(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)；乳酸克鲁维酵母的表达载体(DeLouvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154：737；Van den Berg等人，BIO/TECHNOLOGY(1990)8：135)；P.guillerimondii的表达载体(Kunze等人，J.BASICMICROBIOL.(1985)25：141)；巴氏毕赤酵母的表达载体(美国专利第5,324,639号、第4,929,555号和第4,837,148号；和Gregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的表达载体(Beach和Nurse，NATURE(1981)300：706)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)的表达载体(Davidow等人，CURR.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET.(1985)10：49)；构巢曲霉(A.nidulans)的表达载体(Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMON.(1983)112：284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26：205-221；和Yelton等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.niger)的表达载体(Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4：475479)；里氏木霉(T.reesei)的表达载体(EP 0 244 234)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)的表达载体(WO91/00357)，各文献以引用的方式并入本文。
用于酵母载体的对照序列为所属领域技术人员所熟知，并且包括(但不限于)来源于以下基因的启动子区：例如醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)(EP 0 284 044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶和丙酮酸酯激酶(PyK)(EP 0 329203)。编码酸磷酸酯酶的酵母PHO5基因也提供有用的启动子序列(Miyanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80：1)。供酵母宿主使用的其它合适启动子序列可以包括用于3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255：2073)；和用于其它糖酵解酶的启动子，所述其它糖酵解酶例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase)和磷酸葡糖异构酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17：4900；Hess等人，J.ADV.ENZYME REG.(1968)7：149)。具有另外的受生长条件控制的转录的优势的可诱导酵母启动子可以包括以下物质的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸磷酸酯酶、金属硫蛋白(metallothionein)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。
酵母增强子也可以与酵母启动子一起使用。此外，合成启动子也可以充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游激活序列(upstream activating sequences，UAS)可以与另一酵母启动子的转录激活区相连，以产生合成杂合体启动子。所述杂合体启动子的实例包括连接于GAP转录激活区的ADH调控序列。参看，美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以引用的方式并入本文。杂合体启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列结合例如GAP或PyK的糖酵解酶基因的转录激活区组成的启动子。参看EP 0 164 556。此外，酵母启动子可以包括具有结合酵母RNA聚合酶并起始转录的能力的非酵母来源的天然发生启动子。
其它控制元件可以包含包括(例如)来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子的酵母表达载体的部分(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)256：1385)。此外，从2μ质粒起点的复制起点适用于酵母。适用于酵母的选择基因是存在于质粒中的trp1基因。参看Tschemper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。trp1基因对缺乏在色氨酸中生长能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，由具有Leu2基因的已知质粒补充Leu2缺失酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
用于将外源DNA引入酵母宿主中的方法为所属领域技术人员所熟知，并且通常包括(但不限于)原生质球(spheroplast)或经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞的转化。举例来说，可以根据Hsiao等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76：3829和Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130：946中所述的方法进行酵母转化。然而，也可以如SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL(2001)中所概述使用其它将DNA引入细胞中的方法，例如核注射(nuclear injection)、电穿孔或原生质体融合。随后可以用所属领域技术人员所已知的标准技术培养酵母宿主细胞。
其它用于在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的方法为所属领域技术人员所熟知。通常参看，美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号、第6,312,923号、第6,183,985号、第6,083,723号、第6,017,731号、第5,674,706号、第5,629,203号、第5,602,034号和第5,089,398号；美国未复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862、WO 98/37208和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946736、EP 0 732 403、EP 0 480 480、EP 0 460 071、EP 0 340 986、EP 0 329 203、EP 0 324274和EP 0 164 556。也参看Gellissen等人，ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(1-2)：79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)：423-488；Goeddel，METHODS INENZYMOLOGY(1990)185：3-7，这些参考案均以引用的方式并入本文。
可以使用所属领域技术人员所熟知的标准补料分批发酵方法在扩增阶段在发酵罐中生长酵母宿主菌株。发酵方法可以经过修改以符合特定酵母宿主碳利用途径或表达控制模式的差异。举例来说，酿酒酵母酵母宿主发酵可能需要单葡萄糖补料、复杂氮源(例如酪蛋白水解产物)和多种维生素补充物。相比之下，甲醇酵母巴氏毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物质补料，但是仅简单铵(氮)盐用于最佳生长和表达。参看，例如美国专利第5,324,639号；Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9：95；和Fieschko等人BIOTECH.BIOENG.(1987)29：1113，所述文献以引用的方式并入本文。
然而，所述发酵方法可以具有某些与所用酵母宿主菌株无关的普通特征。举例来说，可以在扩增期将生长限制营养物(通常为碳)加入发酵罐中以使得达到最大程度生长。此外，发酵方法通常采用经设计以含有足量碳、氮、基础盐(basal salt)、磷和其它微量营养物质(维生素、痕量矿物质和盐等等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其以引用的方式并入本文。
经杆状病毒侵染的昆虫细胞 术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可以用作或已经用作重组载体或其它转运DNA的受体的昆虫。所述术语包括已经被转染的最初昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意突变，因此单亲细胞的后代可能并不必需与最初亲代在形态或基因组或总DNA补体上完全相同。所述定义所指后代包括与亲代足够相似之处在于相关特性(例如存在编码BSP的核苷酸序列)的亲代细胞的后代。
适用于BSP表达的昆虫细胞的选择为所属领域技术人员所熟知。一些昆虫种类已经在所属领域中充分描述并且有市售，其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主中，合适宿主可以包括尤其是具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体坚固性的宿主。昆虫通常可以从多种来源获得，包括(但不限于)Insect Genetic Stock Center，Department of Biophysics and MedicalPhysics，University of California(Berkeley，CA)；和American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA)。
经杆状病毒侵染的昆虫表达系统的组分一般包括通常为细菌质粒的转运载体(含有杆状病毒基因组片段和用于插入待表达的异源基因的便利限制性位点)、具有与转运载体中杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒(这允许异源基因同源重组进杆状病毒基因组中)以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。用于构建载体、转染细胞、挑选菌斑、在培养基中生长细胞等等的材料、方法和技术为所属领域已知，并且可获得描述这些技术的手册。
将异源基因插入转运载体中之后，将载体和野生型病毒基因组转染进昆虫宿主细胞中，在其中载体和病毒基因组重组。表达经包装重组病毒，并鉴别和纯化重组菌斑。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以(例如)Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)的试剂盒形式市售。这些技术通常为所属领域技术人员所已知，并且完整描述于SUMMERS AND SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555期(1987)中，其以引用的方式并入本文。也参看RICHARDSON，39 METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY：BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；KING和POSSEE，THE BACULO VIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE(1992)；和O′REILLY等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
事实上使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生各种异源蛋白为所属技术领域熟知。参看，例如美国专利第6,368,825号、第6,342,216号、第6,338,846号、第6,261,805号、第6,245,528号、第6,225,060号、第6,183,987号、第6,168,932号、第6,126,944号、第6,096,304号、第6,013,433号、第5,965,393号、第5,939,285号、第5,891,676号、第5,871,986号、第5,861,279号、第5,858,368号、第5,843,733号、第5,762,939号、第5,753,220号、第5,605,827号、第5,583,023号、第5,571,709号、第5,516,657号、第5,290,686号、WO 02/06305、WO 01/90390、WO 01/27301、WO 01/05956、WO 00/55345、WO 00/20032、WO 99/51721、WO 99/45130、WO 99/31257、WO 99/10515、WO 99/09193、WO 97/26332、WO 96/29400、WO 96/25496、WO 96/06161、WO 95/20672、WO 93/03173、WO 92/16619、WO 92/03628、WO 92/01801、WO 90/14428、WO 90/10078、WO 90/02566、WO 90/02186、WO 90/01556、WO 89/01038、WO 89/01037、WO 88/07082，其以引用的方式并入本文。
可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体为所属领域已知，并且包括(例如)来源于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosisvirus，AcNPV)的昆虫表达和转运载体，它是一种不依赖于辅助病毒的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。通常参看，Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：ALABORATORY MANUAL(1992)。
在将外源基因插入杆状病毒基因组之前，通常将包含启动子、前导子(如果需要)、所感兴趣的编码序列和转录终止序列的上述组分组装至中间错位构建体(intermediatetransplacement construct)(转运载体)中。中间错位构建体通常维持于复制子中，例如能够在例如细菌的宿主中稳定维持的染色体外元件(例如质粒)。复制子会具有复制系统，因此允许其维持在适合于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可以含有多面体蛋白聚腺苷信号(Miller等人，ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42：177)和原核氨苄青霉素抗性(ampicillin-resistance)(amp)基因和用于在大肠杆菌中选择和增殖的复制起点。
一个通常用于将外源基因引入AcNPV的转运载体是pAc373。也已经设计出所属领域已知的许多其它载体，包括(例如)pVL985，其将多面体起始密码子从ATG改变成ATT且在ATT下游引入BamHI克隆位点32碱基对。参看Luckow和Summers，170VIROLOGY 31(1989)。其它市售载体包括(例如)PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。
插入异源基因之后，将转运载体和野生型杆状病毒基因组共转染至昆虫细胞宿主中。用于将外源DNA引入杆状病毒中所需位点的方法为所属技术领域已知。参看SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555期(1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156；Luckow和Summers，VIROLOGY(1989)170：31。举例来说，可以通过同源双交叉重组插入至例如多面体基因的基因中；也可以插入至经工程化操作进所需杆状病毒基因内的限制性酶切位点中。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11：91。
可以通过电穿孔完成转染。参看TROTTER和WOOD，39METHODS INMOLECULAR BIOLOGY(1995)；Mann和King，J GEN.VIROL.(1989)70：3501。或者，可以用脂质体与重组表达载体和杆状病毒一起侵染昆虫细胞。参看，例如Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1)：36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37：6050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，PROTEANEXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12：323；Siffert等人，NATURE GENETICS(1998)18：45；TILKINGS等人，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10：263；Dolphin等人，NATURE GENETICS(1997)17：491；Kost等人，GENE(1997)190：139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271：22203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37)：22376；Reverey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)270：4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)：766；和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2)：274。市售脂质体包括(例如)和
(Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。此外，可以使用磷酸钙转染。参看TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)：5667；和Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子为任何能够结合杆状病毒RNA聚合酶并且起始编码序列(3′)下游(例如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有通常位于靠近编码序列5′末端处的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可以具有称为增强子的第二域，如果存在，那么它通常远离结构基因。此外，表达可以被调控或者为组成型。
在侵染周期后期充足转录的结构基因提供尤其可用的启动子序列。实例包括来源于编码病毒多面体蛋白的基因的序列(FRIESEN等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因的序列(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69：765)。
新近形成的杆状病毒表达载体被包装至传染性重组杆状病毒中，并且随后生长的菌斑可以通过所属领域技术人员已知的技术纯化。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11：91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATIONBULLETINN第1555期(1987)。
已经开发出重组杆状病毒表达载体来用于侵染至一些昆虫细胞内。举例来说，其中已经开发出重组杆状病毒用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾。参看WO 89/046,699；Wright，NATURE(1986)321：718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56：153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156。通常参看Fraser等人，IN VITRO CELL.DEV.BIOL.(1989)25：225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于在杆状病毒/表达中直接和融合表达异源多肽的细胞和培养基为市售的，并且细胞培养技术大体上为所属领域技术人员所知。
大肠杆菌、假单胞菌种和其它原核生物
细菌表达技术为所属技术领域熟知。多种载体可用于细菌宿主中。载体可以是单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于大量关于载体的文献、许多载体可商业购得以及描述载体和其限制性图谱与特征的手册，本文无需再作广泛论述。众所周知，载体通常涉及允许进行选择的标记，所述标记可以提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多种提供不同特征的标记。
细菌启动子是任何能够结合细菌RNA聚合酶并且起始编码序列(3′)下游(例如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有通常位于靠近编码序列5′末端处的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可以具有称为操纵基因的第二域，其可以在RNA合成开始处与邻近RNA聚合酶结合位点重叠。由于基因阻遏蛋白能够结合操纵基因，并且进而抑制特异性基因的转录，因此操纵基因允许负调控(可诱导)转录。在不存在例如操纵基因的负调控元件的情况下，可能发生组成型表达。此外，可以通过基因激活剂蛋白结合序列达到正调控，此序列如果存在，则通常接近RNA聚合酶结合序列(5′)端。基因激活剂蛋白的实例为分解代谢产物激活蛋白(catabolite activator protein，CAP)，其有助于起始大肠杆菌(E.coli)中lac操纵子的转录[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18：173]。因此，受调控表达可为正或负，进而增强或降低转录。
编码代谢途径酶的序列提供尤其可用的启动子序列。实例包含来源于糖代谢酶的启动子序列，例如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198：1056]和麦芽糖。其它实例包括来源于生物合成酶的启动子序列，例如色氨酸(trp)[Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美国专利第4,738,921号；欧洲专利公开案第036 776号和第121 775号，其以引用的方式并入本文]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″The cloning of interferon and othermistakes.″In Interferon 3(编辑I.Gresser)]、细菌噬菌体λPL[Shimatake等人，NATURE(1981)292：128]和T5[美国专利第4,689,406号，其以引用的方式并入本文]启动子系统也提供可用的启动子序列。本发明的优选方法采用强启动子以诱导高水平BSP，例如T7启动子。所述载体的实例为所属技术领域熟知，并且包括来源于Novagen的pET29系列，和描述于WO99/05297中的pPOP载体，所述文献以引用的方式并入本文。所述表达系统在宿主中产生高水平BSP而不影响宿主细胞活力或生长参数。
此外，不在天然中发生的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，一种细菌或细菌噬菌体启动子的转录激活序列可以与另一种细菌或细菌噬菌体启动子的操纵子序列相连接，以产生合成杂合体启动子[美国专利第4,551,433号，其以引用的方式并入本文]。举例来说，tac启动子是包含trp启动子和lac操纵子序列的杂合体trp-lac启动子，其受lac阻遏物调控[Amann等人，Gene(1983)25：167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21]。此外，细菌启动子可以包括具有结合细菌RNA聚合酶并起始转录的能力的非细菌来源的天然发生启动子。非细菌来源的天然发生启动子也可以与可相容RNA聚合酶偶联以在原核生物中产生一些基因的高表达水平。细菌噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶联启动子系统的实例[Studier等人，J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：1074]。此外，杂合体启动子也可以包含细菌噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区(欧洲专利公开案第267 851号)。
除了充当启动子序列之外，有效核糖体结合位点也可用于在原核生物中表达外源基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，并且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11核苷酸处的3-9核苷酸长度序列[Shine等人，NATURE(1975)254：34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体结合[Steitz等人″Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA″，In Biological Regulation and Development：Gene Expression(编辑R.F.Goldberger，1979)]。为了表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人″Expression of cloned genes in Escherichia coli″，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可以用作或已经用作重组载体或其它转运DNA的受体的细菌。所述术语包括已经被转染的最初细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意突变，因此单亲细胞的后代可能并不必需与最初亲代在形态或基因组或总DNA补体上完全相同。所述定义所指后代包括与亲代足够相似之处在于相关特性(例如存在编码BSP的核苷酸序列)的亲代细胞的后代。
适用于BSP表达的宿主细菌的选择为所属领域技术人员所熟知。在选择用于表达的细菌宿主中，合适宿主可以包括尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体坚固性的宿主。细菌宿主通常可以从多种来源获得，包括(但不限于)Bacterial GeneticStock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA)；和American Type Culture Collection(″ATCC″)(Manassas，VA)。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。由于这些菌株的生长参数是极为熟知的并且是稳固的，因此这些菌株尤其有用。此外，这些菌株是非病原性的，出于安全和环境原因考虑，其具有商业重要性。在本发明方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主为BL21菌株。在本发明方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶负菌株，包括(但不限于)OMP-和LON-。在本发明方法中的另一实施例中，宿主细胞菌株为假单胞菌种，包括(但不限于)荧光假单胞菌、绿脓杆菌和恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1(指定菌株MB 101)可用于重组产生，并且可用于治疗性蛋白产生过程。假单胞菌表达系统的实例包括作为宿主菌株获自DowChemical Company的系统(Midland，MI，www.dow.com可用)。以引用方式并入本文的美国专利第4,755,465号和第4,859,600号描述假单胞菌菌株用作hGH产生的宿主细胞的用途。
一旦建立重组宿主细胞菌株(即已经将表达构建体引入宿主细胞中，并且分离具有恰当表达构建体的宿主细胞)，便在适于产生BSP的条件下培养重组宿主细胞菌株。所属领域技术人员应了解，重组宿主细胞菌株的培养方法将取决于所用表达构建体的性质和宿主细胞的身份。通常使用所属技术领域所熟知的方法培养重组宿主菌株。通常在含有碳、氮和无机盐的相似源(assimilatable source)并视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和其它所属技术领域已知的似蛋白培养补充物的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基视情况可以含有抗生素或抗真菌剂，以防止非所需微生物和/或化合物的生长，所述非所需微生物和/或化合物包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素。
可以分批或以连续方式培养重组宿主细胞，其中以分批或以连续方式收集细胞(在BSP细胞内积累的情况下)或收集培养物上清液。对于在原核宿主细胞中产生来说，分批培养和细胞收集为首选。
通常在重组系统中表达之后纯化本发明的BSP。可以通过所属技术领域已知的多种方法从宿主细胞中纯化BSP。在细菌宿主细胞中所产生的BSP通常溶解性较差或不溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，可以轻易地在BSP中进行氨基酸替换，其中使用本文所公开的方法以及所属技术领域已知的方法对氨基酸替换进行选择以达成增加由重组产生的蛋白的溶解性的目的。在不溶性蛋白的情况下，可以通过离心从宿主细胞溶解液中收集蛋白，并接着进一步使细胞均质化。在较差溶解性蛋白的情况下，可以添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(polyethylene imine，PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白沉淀。随后可以通过离心便利地收集沉淀蛋白。可以使用所属技术领域所熟知的多种方法破坏或均质化重组宿主细胞，以便从细胞内释放出包涵体。可以使用熟知技术进行宿主细胞破坏或均质化，其包括(但不限于)酶细胞破坏、超声波处理、杜恩斯(dounce)均质化或高压释放破坏。在本发明方法的一个实施例中，可以使用高压释放技术破坏大肠杆菌宿主细胞以释放BSP的包涵体。当操作BSP的包涵体时，可能有利的是将重复均质化时间减至最少，以使包涵体的产量最大而不会因例如溶解、机械裂解或蛋白水解等因素而受到损失。可以通过融合靶蛋白与某些其它蛋白，例如TrpLE[Georgiou，G.(1996)的Protein engineering：Principles and Practice(Cleland，J.L.和Craik，C.S.编辑)，第101-127页，Wiley-Liss，New York，Ford，C.F.，Suominen，I.和Glatz，C.E.(1991)Protein Expression Purif.2，95-107]，或者通过在高温下或在除pH7.0之外的pH值下培养来增强形成包涵体的趋势。
随后可以使用所属技术领域已知的许多合适溶解剂中的任一种溶解不溶性或沉淀BSP。优选用尿素或盐酸胍溶解BSP。应将溶解BSP的体积减至最小，以便可以用便于管理的批次大小产生大批量。当以数千升体积的批量生长重组宿主时，此因素在大规模商业装置中非常重要。此外，当在大规模商业装置中生产BSP时，尤其是当为了人类医药用途时，如果可能则应该避免可能损坏机器和容器或蛋白产物自身的苛刻化学品。在本发明的方法中已经表明，较为温和的变性剂尿素可以用于溶解BSP包涵体以代替较为苛刻的变性剂盐酸胍。使用尿素显著地降低损坏在BSP的制造和纯化工艺中所用的不锈钢设备的风险，而同时有效溶解BSP包涵体。
在可溶性BSP的情况下，BSP可以分泌至周质空间(periplasmic space)或分泌至培养基中。此外，可溶性BSP可以存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性BSP。所属技术领域已知的标准技术可以用于从(例如)细胞溶解液或培养基中浓缩可溶性BSP。此外，所属技术领域已知的标准技术可以用于破坏宿主细胞，并且从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性BSP。
当产生融合蛋白形式的BSP时，优选移除融合序列。可以在许多不同条件下(包括(但不限于))通过酶裂解或化学裂解来完成融合序列的移除。可以用所属技术领域熟知的方法完成融合序列的酶法移除。可以通过融合体的身份来确定用于移除融合序列的酶的选择，并且可以通过所属领域技术人员了解的酶的选择来指定反应条件。可以使用所属技术领域所熟知的试剂完成化学裂解。一种这样的试剂是在蛋氨酸残基上裂解的溴化氰。优选通过熟知方法从经裂解的融合序列纯化经裂解的BSP。如所属领域技术人员所了解，可以通过融合序列和BSP的身份和性质确定所述方法。举例来说，可以在以下情况下裂解用于移除融合序列的肽键：暴露于光子能、增加的温度、降低的温度、增加的pH、降低的pH；暴露于亚原子粒子；添加催化剂；用酶培育；与另一种化学官能团接触和/或其它条件。对于待在这些条件的一种或一种以上条件下裂解的肽键来说，非天然编码氨基酸可以含有具有一个或一个以上特征的官能团，包括(但不限于)光活化官能团、pH活化官能团、温度活化官能团、需要催化剂的官能团和由蛋白酶、酶或另一化学官能团所识别的官能团。纯化方法可以包括(但不限于)尺寸排除色谱法、疏水互作色谱法、离子交换色谱法或透析法或其任何组合。
也优选纯化BSP以从蛋白溶液移除DNA。可以通过所属技术领域已知的任何合适方法移除DNA，例如沉淀或离子交换色谱法，但是优选使用核酸沉淀剂通过沉淀作用来移除，沉淀剂例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白。可以使用(包括(但不限于))离心或过滤的标准熟知方法从沉淀DNA分离BSP。当用BSP治疗人类并且本发明的方法将宿主细胞DNA减至医药学上可接受水平时，宿主核酸分子的移除是装置中的一个重要因素。
小规模或大规模发酵法也可以用于蛋白表达，其包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流体化床生物反应器、中空纤维生物反应器、辊瓶培养系统和搅拌式生物反应器系统。可以用分批式、流加式(fed-batch)或连续模式工艺执行所述各方法。
通常可以用所属技术领域的标准方法回收本发明的人BSP。举例来说，可以离心或过滤培养基或细胞溶解液以移除细胞碎片。可以将上清液浓缩或稀释至所需体积，或者透滤进合适缓冲液中来调节制剂条件以用于进一步纯化。进一步纯化本发明的BSP包括从完整形式分离出脱酰胺基形式和截断形式的BSP变体。
可以采用任何以下示范性过程纯化本发明的BSP：亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法(使用包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)、二氧化硅色谱法、反向HPLC法、凝胶过滤法(使用包括(但不限于)SEPHADEX G-75)、疏水互作色谱法、尺寸排除色谱法、金属螯合色谱法、超滤/透滤法、乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱聚焦法、置换色谱法、电泳过程(包括(但不限于)制备型等电聚焦)、差异溶解性(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取法。
可以根据所属领域技术人员所已知并且使用的标准过程将本发明的蛋白(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白的结合伴侣等等)部分或大体上纯化成均质。因此，可以通过所属领域熟知的许多方法中的任一种回收和纯化本发明的多肽，其包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀法、酸或碱提取法、柱色谱法、亲和柱色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水互作色谱法、羟磷灰石色谱法、凝集素色谱法、凝胶电泳等等。在产生正确折叠成熟蛋白中，视需要可以进行蛋白重新折叠步骤。当需要高纯度时，在最终纯化步骤中可以采用高效液相色谱法(HPLC)、亲和色谱法或其它合适方法。在一个实施例中，所制备的抗非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白或肽)的抗体可用作纯化试剂，包括(但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白或肽的基于亲和力的纯化。一旦部分纯化或纯化至均质(如果需要)，便视情况将多肽用于多种功用，包括(但不限于)作为测定组分、治疗试剂、预防试剂、诊断试剂、研究试剂和/或作为抗体产生的免疫原。
除了本文所提及的其它参考文献之外，多种纯化/蛋白折叠方法为所属技术领域所熟知，包括(但不限于)以下文献中所述：R.Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology第182卷：Guide to Protein Purification.Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana，(1997)Bioseparation of Proteins，AcademicPress，Inc.；Bollag等人(1996)Protein Methods，第2版Wiley-Liss，NY；Walker，(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ，Harris和Angal，(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris和Angal，Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes，(1993)Protein Purification：Principles and Practice第3版Springer Verlag，NY；Janson和Ryden，(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，Second Edition Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)，Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ；和其中所引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生令人感兴趣的具有非天然氨基酸的蛋白或多肽的一个优势在于通常蛋白或多肽以其天然构象折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域技术人员应认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白或肽可以具有不同于相关多肽所需构象的构象。在本发明的一方面，经表达的蛋白或多肽视情况变性且随后复性。这可以采用所属技术领域已知的方法达成，包括(但不限于)通过向所感兴趣的蛋白或多肽中添加伴侣素(chaperonin)；通过在离液剂(例如盐酸胍)中溶解蛋白；采用蛋白质二硫键异构酶等等。
一般来说，偶尔需要变性和还原经表达的多肽，且随后引起多肽再折叠成优选构象。举例来说，胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣素可以添加于所感兴趣的翻译产物中。还原、变性和复性蛋白的方法为所属领域技术人员所熟知(参看，上述参考文献和Debinski等人(1993)J.Biol.Chem..268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.，4：581-585；和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem..205：263-270)。举例来说，Debinski等人描述在胍-DTE中包涵体蛋白的变性和还原。蛋白可以在含有(包括(但不限于))氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。重新折叠试剂可以流动或移动至与一个或一个以上多肽或其它表达产物接触，或者反之亦然。
在原核产生BSP的情况下，由此所产生的BSP可能错折叠并因而缺少或具有低生物活性。可以通过“重新折叠”恢复蛋白的生物活性。一般来说，通过使用(例如)一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇DTT或2-巯基乙醇2-ME)溶解(其中BSP也为不溶性)、打开和还原多肽链来重新折叠错折叠BSP。在适当浓度离液剂下，随后添加氧化剂(例如氧气、胱氨酸或胱胺)，以允许重新形成二硫键。可以使用所属领域已知的标准方法重新折叠BSP，例如描述于美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中，所述专利以引用的方式并入本文。也可以将BSP与其它蛋白共折叠以形成异源二聚体或异源多聚体。重新折叠或共折叠之后，优选进一步纯化BSP。
一般纯化方法可以对包含BSP的细胞溶解液或由任何分离步骤所产生的任何BSP混合物进行多种分离步骤中的任何一种，其包括(但不限于)亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水互作色谱法、凝胶过滤色谱法、高效液相色谱法(“HPLC”)、反向HPLC法(“RP-HPLC”)、扩张床吸附法或任何组合和/或其重复且以任何适当次序。
用于执行本文所述技术的设备和其它必需材料为市售。泵、馏分收集器、监控器、记录仪和整个系统可购自(例如)Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bio-RadLaboratories，Inc.(Hercules，CA)和Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)。包括(但不限于)交换基质材料、介质和缓冲液在内的色谱材料也可以购自这些公司。
可以用例如泵的专门设备更为快速地达成本文所述柱色谱法过程中的平衡和其它步骤，例如洗涤和洗脱。市售泵包括(但不限于)
Pump P-50、Peristaltic PumpP-1、Pump P-901和Pump P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
馏分收集器的实例包括RediFrac Fraction Collector、FRAC-100和FRAC-200 FractionCollectors，和
Fraction Collector(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。也可使用混合器来形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括Gradient Mixer GM-1和In-Line Mixer(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
可以用任何市售监控器监控色谱过程。所述监控器可以用于收集例如UV值、pH值和导电率等信息。检测器的实例包括Monitor UV-1、
S II、Monitor UV-MII、Monitor UV-900、Monitor UPC-900、Monitor pH/C-900和Conductivity Monitor(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。事实上整个系统为市售的，包括各种购自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)的
系统。
举例来说，在本发明的一个实施例中，可以通过首先在尿素中使所得纯化BSP变性，接着在合适pH值下将其稀释至含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中来还原和变性BSP。在另一个实施例中，在约2M至约9M的浓度范围内在尿素中变性BSP，接着在约5.0至约8.0的pH值范围内稀释至TRIS缓冲液中。随后可以温育本实施例的重新折叠混合物。在一个实施例中，在室温下温育重新折叠混合物4至24小时。随后可以进一步分离或纯化经还原和变性的BSP混合物。
如本文所述，可以在进行任何随后分离步骤之前调节第一BSP混合物的pH值。此外，可以用所属技术领域已知技术浓缩第一BSP混合物或其任何后续混合物。此外，可以使用所属领域技术人员所熟知的技术将包含第一BSP混合物或其任何后续混合物的洗脱缓冲液替换为适用于接着的分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱法 在一个实施例中，可以对第一BSP混合物进行作为可选附加步骤的离子交换色谱法。通常参看ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLESAND METHODS(目录号18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换柱包括
和Columns(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。所述柱采用强阴离子交换剂，例如Q
Fast Flow、Q
High Performance和Q
XL；强阳离子交换剂，例如SP
High Performance、SP
Fast Flow和SP
XL；弱阴离子交换剂，例如DEAE
Fast Flow；和弱阳离子交换剂，例如CMFast Flow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可以在纯化过程的任何阶段对BSP进行阴离子或阳离子交换柱色谱层析以分离实质上经纯化的BSP。可以使用任何合适阳离子交换基质进行阳离子交换色谱步骤。可用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒状、珠状或交联阳离子交换基质材料。所述阳离子交换基质包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何前述物质的复合物。
阳离子交换基质可以是包括强和弱阳离子交换剂的任何合适阳离子交换剂。强阳离子交换剂可以在广pH值范围内保留离子化，并且因此能够在广pH值范围内结合BSP。然而，弱阳离子交换剂可能作为pH值函数丧失离子化。举例来说，当pH值下降低于约pH4或pH5时，弱阳离子交换剂可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括(但不限于)带电官能团，例如磺丙基(sulfopropyl，SP)、磺酸甲酯(methyl sulfonate，S)或磺乙基(sulfoethyl，SE)。阳离子交换基质可以是优选具有约2.5至约6.0的BSP结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可以具有约2.5至约5.5的BSP结合pH值范围。阳离子交换基质可以是具有约3.0的BSP结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可以是优选具有约6.0至约8.0的BSP结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可以是优选具有约8.0至约12.5的BSP结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可以具有约8.0至约12.0的BSP结合pH值范围。
在负载BSP之前，例如可以使用若干柱体积的稀弱酸(例如四柱体积的20mM乙酸，pH3)来平衡阳离子交换基质。平衡之后，在洗脱实质上经纯化BSP之前，可以添加BSP，并且也可以使用弱酸溶液(弱乙酸或磷酸溶液)洗涤柱一次至数次。举例来说，可以使用大约2-4柱体积的20mM乙酸(pH3)来洗涤柱。也可以使用(例如)2-4柱体积的0.05M乙酸钠(pH5.5)或0.05M乙酸钠与0.1M氯化钠的混合物(pH5.5)进行附加洗涤。或者，在使用所属技术领域已知的方法时，也可以使用若干柱体积的稀弱碱平衡阳离子交换基质。
或者，可以用具有足够低pH值或离子强度的缓冲液与阳离子交换剂基质接触来洗脱实质上经纯化的BSP，从而将BSP从基质中置换出来。洗脱缓冲液的pH值可以在约pH2.5至约pH6.0范围内。更具体来说，洗脱缓冲液的pH值可以在约pH2.5至约pH5.5范围内，约pH2.5至约pH5.0范围内。洗脱缓冲液可以具有约3.0的pH值。此外，洗脱缓冲液的量可以广泛变化，并且通常在约2至约10柱体积范围内。
在BSP吸附于阳离子交换剂基质之后，可以用具有足够高pH值或离子强度的缓冲液与基质接触来洗脱实质上经纯化的BSP，以将BSP从基质中置换出来。用于高pH值洗脱实质上经纯化BSP的合适缓冲液可以包括(但不限于)至少约5mM至至少约100mM浓度范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。
反相色谱法 可以根据所属领域技术人员已知的合适实验方案执行RP-HPLC来纯化蛋白。参看，例如Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J.CHROM.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359：391-402。可以对BSP进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的BSP。就此而言，可以使用具有为多种长度(包括(但不限于)至少约C3至至少约C30、至少约C3至至少约C20或至少约C3至至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者可以使用聚合树脂。举例来说，可以使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，它是一种苯乙烯聚合物树脂。也可以使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可以用例如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一个实例。
可以使用含有离子配对剂和有机改进剂的合适洗脱缓冲液从RP-HPLC柱中洗脱BSP，所述有机改进剂例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、丙腈或乙醇。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、乙酸四甲基铵、乙酸四丁基铵和乙酸三乙基铵。以使用一种或一种以上梯度或等度(isocratic)条件进行洗脱，其中优选梯度条件来减少分离时间并减小峰宽度。另一方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的梯度。用于本文的合适洗脱缓冲液的实例包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水互作色谱法纯化技术 可以对BSP执行疏水互作色谱法(HIC)。通常参看HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLESAND METHODS(目录号18-1020-90，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其以引用的方式并入本文。合适的HIC基质可以包括(但不限于)烷基或芳基取代基质，例如丁基、己基、辛基或苯基取代基质，包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂，包括(但不限于)聚乙二胺树脂或丁基或苯基取代聚(甲基丙烯酸酯)基质。用于疏水互作柱色谱法的市售来源包括(但不限于)
、
和
柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
简单地说，在装载之前，可以用所属领域技术人员所已知的标准缓冲液平衡HIC柱，所述标准缓冲液例如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES。装载BSP之后，接着可以用标准缓冲液和标准条件洗涤柱以移除非所需物质，但在HIC柱上留下BSP。可以用约3至约10柱体积的标准缓冲液洗脱BSP，所述标准缓冲液例如含有EDTA和低于平衡缓冲液的硫酸铵浓度的HEPES，或乙酸/氯化钠缓冲液，等。也可以将使用(例如)磷酸钾梯度的线性递减盐梯度用于洗脱BSP分子。举例来说，随后可以通过过滤(如透滤或超滤)来浓缩洗脱液。可以采用透滤以移除用于洗脱BSP的盐。
其它纯化技术 举例来说，可以对第一BSP混合物或其任何后续混合物进行使用凝胶过滤(GEL FILTRATION：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1022-18，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，其以引用的方式并入本文)、羟磷灰石色谱法(合适基质包括(但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT CeramicHydroxyapatite(BioRad)、Bio-Gel HTP Hydroxyapatite(BioRad))、HPLC、扩张床吸附、超滤、透滤、冻干等等的另一个分离步骤，以移除任何过量盐并用适用于随后分离步骤或甚至最终药物产物形成的缓冲液置换所述缓冲液。
可以使用所属领域技术人员所已知的技术在本文所述各步骤处监控包括实质上经纯化BSP在内的BSP产率。所述技术也可以用于评估最后分离步骤之后实质上经纯化BSP的产率。举例来说，可以使用具有多种烷基链长度的任何若干反相高压液相色谱柱(例如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC监控BSP产率。
在本发明的具体实施例中，各纯化步骤之后的BSP产率可以为各纯化步骤起始物质中BSP的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
可以使用例如SDS-PAGE的标准技术，或者通过使用Western印迹和ELISA法测量BSP来确定纯度。举例来说，可以产生对抗从负控制酵母发酵(negative control yeastfermentation)和阳离子交换回收所分离出的蛋白的多克隆抗体。所述抗体也可以用于探测污染宿主细胞蛋白的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4烷基链。从似蛋白质杂质分离BSP是基于疏水互作强度的差异。用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢柱(充满2.8至3.2升的Vydac C4硅胶)执行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸酸化Hydroxyapatite Ultroge洗脱液，并且装载在Vydac C4柱上。对于洗涤和洗脱来说，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗脱份并且立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集IPC限定内的BSP洗脱份。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由共价结合于Sepharose珠表面的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。由离子互作介导BSP与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸通过柱而不被留住。洗去这些物质之后，通过在低pH值下用乙酸盐缓冲液洗涤柱来除去痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱，并且用具有增加离子浓度的缓冲液洗脱BSP。色谱柱充满DEAE Sepharose高速流。调节柱体积以确保BSP装载量在3-10mgBSP/ml凝胶范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤柱。装载HPLC洗脱液的经汇集洗脱份，并且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗脱缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸钾)从柱中洗脱BSP，并根据主洗脱曲线收集为单洗脱份。将DEAE Sepharose柱的洗脱液调节至指定电导率。将所得药物物质无菌过滤至特弗隆(Teflon)瓶中，并储存在-70℃下。
可采用的其他方法包括(但不限于)移除内毒素(endotoxin)的步骤。内毒素是位于格兰阴性宿主细胞(例如大肠杆菌)外膜上的脂类多糖(lipopoly-saccharide，LPS)。用于降低内毒素含量的方法为所属领域技术人员所已知，并且包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟磷灰石的纯化技术；反相色谱法、亲和色谱法、尺寸排除色谱法、阴离子交换色谱法、疏水互作色谱法；这些方法的组合等等。可以要求改良或附加方法来从所感兴趣的多肽中除去污染物质，例如共迁移蛋白。
多种方法和过程可以用于评估包含一种或一种以上非天然编码氨基酸的BSP的产率和纯度，包括(但不限于)Bradford测定法、SDS-PAGE、银染SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱法(包括(但不限于)MALDI-TOF)和其它所属领域技术人员已知表征蛋白的方法。
本发明异源融合蛋白的表征
存在许多表征本发明融合蛋白的方法。这些方法中的一些包括(但不限于)结合蛋白染色法的SDS-PAGE，或者使用抗IgG或抗HAS抗体的免疫印迹法。举例来说，其它方法包括基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)、液相色谱/质谱法、等电聚焦法、分析离子交换法、色谱焦聚法和圆二色光谱法。
VIII.交替系统(altern ate system)中的表达
若干策略已经用于将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、经突变宿主细胞或无细胞系统中的蛋白中。这些系统也适用于制造本发明的BSP。用反应性侧链(例如Lys、Cys和Tyr)使氨基酸衍生化引起赖氨酸转化成N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的简单方法。使用最近开发的肽片段的酶连接和天然化学连接，可能制得较大蛋白。参看，例如P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69：923(2000)。一种普通活体外生物合成方法已经用于将超过100个非天然氨基酸位点特异性并入多种实质上任何大小的蛋白中，所述方法中将用所需非天然氨基酸化学酰化的抑制基因tRNA添加于能够支持蛋白生物合成的活体外提取物中。参看，例如V.W.Cornish，D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34：621(1995)；C.J.Noren，S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244：182-188(1989)；和J.D.Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosynthetic site-specificincorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.111：8013-8014(1989)。广泛范围的官能团已经引入蛋白中以用于研究蛋白稳定性、蛋白折叠、酶机制和信号转导。
开发出称为选择性压力并入(selective pressure incorporation)的活体内方法来研究野生型合成酶的混杂(promiscuity)。参看，例如N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber，FASEB J.，13：41(1999)。在含有有限浓度特定天然氨基酸的最小培养基中生长营养缺陷型菌株，而同时抑制靶基因的转录，其中关闭所述营养缺陷型菌株中对细胞提供所述天然氨基酸的相关代谢途径。在固定生长期开始时，缺失天然氨基酸并用非天然氨基酸类似物替代。诱导重组蛋白的表达引起含有非天然类似物的蛋白的积累。举例来说，使用这种策略，已经将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白中，并且在UV光谱中展示可以被轻易鉴别的两个特征性肩部(shoulder)，参看，例如C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，284：29(2000)；三氟蛋氨酸已经用于置换细菌噬菌体T4溶菌酶中的蛋氨酸以通过19FNMR研究与壳寡糖(chitooligosaccharide)的互作，参看，例如H.Duewel，E.Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404(1997)；并且三氟亮氨酸已经被并入以代替亮氨酸，产生亮氨酸拉链(leucine-zipper)蛋白增加的热稳定性和化学稳定性。参看，例如Y.Tang，G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int.Ed.Engl，40：1494(2001)。此外，硒蛋氨酸和碲蛋氨酸已经并入各种重组蛋白中以促进X光结晶学中的相溶解。参看，例如W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，9：1665(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.，1：283(1994)；N.Budisa，B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem..230：788(1995)；和N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol..270：616(1997)。已经有效并入具有烯或炔官能团的蛋氨酸类似物，使得允许通过化学手段另外修饰蛋白。参看，例如J.C.van Hest和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，428：68(1998)；J.C.van Hest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc，122：1282(2000)；和K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097，所述参考案以引用的方式并入本文。
此方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，这通常需要高度选择性以确保蛋白翻译的保真度。一种扩大此方法范围的途径在于放松氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，这已经在有限种情况中达成。举例来说，通过在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294会增大底物结合袋的尺寸，并且导致由p-Cl-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)酰化tRNAPhe。参看M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，33：7107(1994)。具有此突变体PheRS的大肠杆菌菌株允许并入p-Cl-苯丙氨酸或p-Br-苯丙氨酸以替换苯丙氨酸。参看，例如M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.，364：272(1995)；和N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，467：37(2000)。类似地，靠近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser显示允许氮杂酪氨酸比酪氨酸更加有效地并入。参看，F.Hamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soll和S.Nishimura，J.Biol. Chem.275：40324(2000)。
用于将非天然氨基酸活体内并入蛋白的另一个策略在于修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能够辨别并因此不能够激活结构上与同源天然氨基酸相似的氨基酸。在单独位点处修正此错误，使来自tRNA的错电荷氨基酸(mischarged amino acid)脱酰化，以维持蛋白翻译的保真度。如果合成酶的校对活性不能作用，那么经误激活的结构类似物可以逃脱编辑功能并且被并入。最近用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证明了此方法。参看V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science，292：501(2001)。ValRS可以用Cys、Thr或氨基丁酸酯(Abu)误氨酰化tRNAVal；随后通过编辑域水解非同源氨基酸。随机突变大肠杆菌染色体之后，选择在ValRS编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。编辑缺陷型ValRS错误地用Cys使tRNAVal带电。因为Abu空间组装Cys(Abu中Cys的-SH基团由-CH3置换)，因此当此突变大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变体ValRS也将Abu并入蛋白中。质谱分析表明在天然蛋白的各缬氨酸位置处约24％缬氨酸由Abu置换。
固相合成和半合成方法也允许合成许多含有新颖氨基酸的蛋白。举例来说，参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Crick，F.H.C.，Barrett，L.Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature，192：1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements onthe S-protein activating potency of an S-peptide fragment，J.Am Chem，88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteinsincluding enzymes，Acc Chem Res，22：47-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，109：3808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S B H.Constructing proteins bydovetailing unprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease，Science，256(5054)：221-225(1992)；Chaiken，I.M.Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochem，11(3)：255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；和Jackson，D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A withUnnatural Catalytic Residues，Science，266(5183)：243(1994)。
化学修饰已经用于将多种非天然侧链活体外引入蛋白中，所述非天然侧链包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸。参看，例如，Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)：1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymatic specificity，Annu Rev Biochem，54：565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation ofenyzme active sites，Science，226(4674)：505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.et M.L.Bender.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，88：3153-3154(1966)；和Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introductionofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites，Science，242(4881)：1038-1040(1988)。
或者，采用化学修饰氨酰基-tRNA的生物合成方法已经用于将若干生物物理探针并入活体外合成的蛋白中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner，J.NewPhotolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，62：483-514(1993)；和Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascentpreprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle，Proc.Natl. Acad.Sci，83(22)：8604-8608(1986)。
先前已表明，可以通过将经化学氨酰化抑制基因tRNA加入用含有所需琥珀无意义突变的基因进行的蛋白合成反应中而将非天然氨基酸活体外位点特异性地并入蛋白中。通过使用这些方法，可以使用对于特定氨基酸的营养缺陷型菌株用结构密切同源物替换许多常见的20种氨基酸，例如用氟苯丙氨酸替换苯丙氨酸。参看，例如，Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244：182-188(1989)；M.W.Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into apolypeptide，J.Am Chem Soc，111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51(1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosyntheticmethod for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.，第202卷，301-336(1992)；和Mendel，D.，Cornish，V.W.& Schultz，P.G.Site-DirectedMutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24，435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制基因tRNA，并且用非天然氨基酸化学氨酰化。常规定点突变用于在蛋白基因的令人感兴趣的位点处引入终止密码子TAG。参看，例如Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′-3′Exonuclease in phosphorothioate-basedolignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)：791-802(1988)。当在活体外转录/翻译系统中组合酰化抑制基因tRNA和突变基因时，响应于UAG密码子并入非天然氨基酸，从而产生在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白。使用[3H]-Phe的实验和使用α-羟酸的实验证明仅所需氨基酸在UAG密码子所指定的位置处并入，并且此氨基酸不在蛋白的任何其他位点处并入。参看，例如Noren等人，上文；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology 10(6)：425-432；和Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins，Science，255(5041)：197-200(1992)。
微注射技术也已经用于将非天然氨基酸并入蛋白。参看，例如M.W.Nowak，P.C.Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J.Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268：439(1995)；和D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4：645(2000)。将活体外制备的两个RNA物种共注射进爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)中：在所感兴趣的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码靶蛋白的mRNA和用所需非天然氨基酸氨酰化的琥珀抑制基因tRNA。卵母细胞的翻译机器随后在UAG所指定的位置处插入非天然氨基酸。此方法允许整体膜蛋白的活体内结构功能研究，这通常并不服从活体外表达系统。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，参看，例如G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot，M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，271：19991(1996)；并入生物素标记氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露残基，参看，例如J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4：739(1997)；使用捕获酪氨酸类似物以实时监控离子通道中的构象改变，参看，例如J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20：619(1998)；和使用α羟基氨基酸来改变离子通道骨架以用于探测其门控机制。参看，例如P.M.England，Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，96：89(1999)；和T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y.Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4：239(2001)。
将非天然氨基酸直接活体内并入蛋白的能力提供以下优势：高产率突变体蛋白、技术便利、研究细胞中或可能活生物体中的突变体蛋白的可能性以及在治疗性治疗中使用这些突变体蛋白。将具有各种大小、酸度、亲核性、疏水性和其他特性的非天然氨基酸包括进蛋白的能力可以极大地扩大合理且系统地操纵蛋白结构的能力，以探测蛋白功能并且产生具有新颖特性的新蛋白或生物体。然而，由于要求达到蛋白翻译的高度保真度的tRNA合成酶互作的复杂性质，所以此过程是困难的。
在位点特异性并入para-F-Phe的尝试中，在para-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中使用酵母琥珀抑制基因tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对。参看，例如R.Furter，Protein Sci，7：419(1998)。
使用无细胞(活体外)翻译系统也可能获得本发明BSP的表达。在这些包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合活体外转录和翻译)的系统中，由核糖体指导活体外合成。已经进行了大量工作来开发无细胞蛋白表达系统。参看，例如，Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，74：309-316(2001)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology andBioengineering，66，180-188，(1999)；和Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353；WO 90/05785，所述参考案以引用的方式并入本文。可以用于表达包含非天然编码氨基酸的BSP的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。参看，例如R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94：12297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistyy &Biology 10：1043-1050(2003)。在此方法中，连接于嘌呤霉素(puromycin)的mRNA模板在核糖体上翻译为肽。如果已经修饰一种或一种以上tRNA分子，则也可以将非天然氨基酸并入肽中。在读出最后mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C端。如果在活体外测定中发现所得mRNA-肽结合物具有令人感兴趣的特性，那么可以从mRNA序列轻易地显露出它的身份。可以以此方式筛选包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的BSP的文库以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已经报导使用经纯化组分的活体外核糖体翻译允许经非天然编码氨基酸替换的肽的合成。参看，例如A.Forster等人，Proc.NatlAcad.Sci.(USA)100：6353(2003)。
IX.偶联于BSP的大分子聚合物
可以使用本文所述组合物、方法、技术以及策略实现对本文所述非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，所述其它官能团包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反义多聚核苷酸、水溶性树枝状高分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射活性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价互作的基团、光捕获部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述任何组合或任何其它所需化合物或物质。作为本文所述组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中于将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽中，同时应了解，其中所述的组合物、方法、技术和策略也适用于(如果需要，则进行适当修改并且所属领域技术人员可以利用本文公开内容作出适当修改)添加包括(但不限于)上文所列在内的其它官能团。
多种大分子聚合物和其它分子可以连接于本发明的BSP以调节BSP的生物性质和/或对BSP分子提供新生物性质。这些大分子聚合物可以经天然编码氨基酸、经非天然编码氨基酸，或者天然或非天然氨基酸的任何官能取代基，或添加于天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团连接于BSP。聚合物的分子量可以具有广泛范围，包括(但不限于)约100Da与约100,000Da之间或更大。
本发明提供聚合物∶蛋白结合物的实质上的均质制剂。如本文所用“实质上均质”意思是观察到聚合物∶蛋白结合物分子大于总蛋白的一半。聚合物∶蛋白结合物具有生物活性，并且本文所提供的所述“实质上均质的”PEG化BSP制剂具有足以展示均质制剂优势的均质性，所述优势例如临床应用中批次之间(lot to lot)药物动力学可预测性的简易性。
也可以选择制备聚合物∶蛋白结合物分子的混合物，并且本文所提供的优势在于可以选择包括于混合物中的单聚合物∶蛋白结合物的比例。因此，如果需要，则可以制备各种蛋白与各种数目(即二-、三-、四-等等)经连接聚合物部分的混合物，并且组合所述结合物与使用本发明方法所制备的单聚合物∶蛋白结合物，并且使混合物具有预定比例的单聚合物∶蛋白结合物。
所选聚合物可以是水溶性的，以致与其所连接的蛋白不在水性环境(例如生理环境)中沉淀。聚合物可以有支链或无支链。对于终产物制剂的治疗用途来说，聚合物优选为医药学上可接受的。
聚乙二醇分子与蛋白分子的比例可以变化，如同它们在反应混合物中的浓度。一般来说，可以由所选聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的数目确定最佳比率(就反应效率而言在于存在最少过量的未反应蛋白或聚合物)。至于分子量，通常聚合物分子量越大，连接于蛋白的聚合物分子数目越少。同样，当最佳化这些参数时，应考虑到聚合物支链。通常分子量越高(或支链越多)，则聚合物∶蛋白比率越高。
如本文所用并且当考虑PEG∶BSP结合物时，术语“治疗有效量”是指对患者产生所需益处的量。举例来说，术语“治疗有效量”是指如果BSP是GLP-1时，使得血糖降低以对患者提供益处的量。举例来说，术语“治疗有效量”是指如果BSP是T-20时，调节病毒含量以对患者提供益处的量。所述量在不同个体之间不同，并且应取决于许多因素，包括患者的总体身体状况，和待治疗病情的根本起因(例如如果BSP是GLP-1时的高血糖症)。疗法所用BSP的量产生可接受比率的改变，并且将所需反应维持在有益水平。所属领域技术人员使用公开可用的材料和过程可以轻易地探知本发明组合物的治疗有效量。
水溶性聚合物可以呈任何结构形式，包括(但不限于)直链、叉状或分支状。水溶性聚合物通常为聚(烷撑二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但是也可以使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG描述本发明的某些实施例。
PEG是一种熟知的水溶性聚合物，它可以从市场上购得或者根据所属技术领域熟知的方法通过开环聚合化乙二醇来制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)。广泛使用术语“PEG”涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或考虑PEG末端的修饰，并且由下式表示为与BSP连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，
其中n为2至10,000且X为H或末端修饰，包括(但不限于)C1-4烷基。
在一些情况下，本文所用PEG在一个末端用羟基或甲氧基封端，即X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以用反应性基团封端，进而形成双官能聚合物。典型反应性基团可以包括通常用于与发现于20种常见氨基酸中官能团反应的基团(包括(但不限于)顺丁烯二酰亚胺基)、活性碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯基酯)、活性酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯基酯)和醛)；以及对20种常见氨基酸呈惰性但与存在于非天然编码氨基酸中的补充(complementary)官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，上述式中Y所示的PEG另一末端可以直接或经天然发生或非天然编码氨基酸间接连接于BSP。举例来说，Y可以是连接于多肽胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N端)的酰胺、氨基甲酸酯或尿素键。或者，Y可以是连接于硫醇基团(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基团)的顺丁烯二酰亚胺键。或者，Y可以是与通常不可经由20种常见氨基酸到达的残基连接的键。举例来说，PEG上的叠氮基可以与BSP上炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可以与存在于非天然编码氨基酸中的叠氮基反应以形成相似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可以与存在于非天然编码氨基酸中的醛基或酮基反应以形成腙、肟或缩氨基脲，适当时，在一些情况下可以进一步经适当还原剂处理而被还原。或者，强亲核试剂可以经非天然编码氨基酸并入BSP中，并且用于优先与存在于水溶性聚合物中的酮基或醛基反应。
可以视实际需要使用任何分子量的PEG，包括(但不限于)约100道尔顿(Da)至100,000Da或视需要更大(包括(但不限于)有时0.1-50kDa或10-40kDa)。也可以使用支链PEG，包括(但不限于)各链具有1-100kDa(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)范围内MW的PEG分子。广泛范围的PEG分子描述于(包括(但不限于))ShearwaterPolymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，各参考案以引用的方式并入本文。
通常PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，如本文所述，具有用于与氨基酸侧链反应的炔部分和叠氮部分的PEG衍生物可以用于将PEG与非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮，则PEG通常含有炔部分以形成[3+2]环加成产物，或者含有膦基的活性PEG种类(即酯、碳酸酯)以形成酰胺键。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，则PEG通常含有叠氮部分以形成[3+2]Huisgen环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基，则PEG通常包含有效亲核试剂(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以分别形成相应的腙、肟和缩氨基脲键。在其它替代实施例中，可以使用上述反应性基团的反向方位，即非天然编码氨基酸中的叠氮部分可以与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的BSP变体含有与存在于非天然编码氨基酸的侧链上的化学官能团具有反应性的化学官能团。
在一些实施例中，本发明提供包含具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架的含叠氮和含乙炔的聚合物衍生物。水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚(乙二醇)。然而，应了解，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡萄糖)和聚(丙二醇))在内的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，并且使用术语PEG或聚(乙二醇)旨在涵盖并包括所有这样的分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、支链PEG、悬垂式PEG(pendent PEG)(即具有一个或一个以上悬垂于聚合物骨架的官能团的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。
PEG通常透明、无色、无味、可溶于水、对热稳定、对许多化学试剂呈惰性、不水解或变质并且通常无毒。认为聚(乙二醇)具有生物相容性，也就是说，PEG能够与活组织或生物体共存而没有危害。更具体来说，PEG实质上无免疫原性，即PEG不倾向于在体内产生免疫应答。当在体内与具有一些所需功能的分子(如生物活性剂)相连接时，PEG倾向于遮蔽该试剂，并且可以降低或消除任何免疫应答，致使生物体可以忍受所述试剂的存在。PEG结合物不倾向于产生实质免疫应答或者引起凝结或其它不良作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n-CH2CH2--(其中n为约3至约4000，通常约20至约2000)的PEG适用于本发明。具有约800Da至约100,000Da分子量的PEG在本发明的一些实施例中尤其可用作聚合物骨架。
聚合物骨架可以是直链或分支状。支链聚合物骨架通常为所属技术领域已知。支链聚合物通常具有中心分枝核心部分和多个连接于所述中心分枝核心的直链聚合物链。通常所使用的分支形式的PEG可以通过将氧化乙烯添加于各种多元醇中制备，所述多元醇例如甘油、甘油寡聚体、季戊四醇和山梨醇。中心分枝部分也可以来源于一些氨基酸，例如赖氨酸。支链聚(乙二醇)可以由通式R(-PEG-OH)m表示，其中R来源于核心部分，例如甘油、甘油寡聚体或季戊四醇，且m表示臂数目。例如描述于以下文献中的多臂PEG分子也可以用作聚合物骨架：美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO 96/21469；和WO 93/21259，各专利案均以引用的方式并入本文。
支链PEG也可以为由PEG(--YCHZ2)n所示的叉状PEG形式，其中Y为连接基，且Z为通过所定义长度的原子链连接于CH的活性末端基团。
另一种分支形式，悬垂式PEG，沿PEG骨架而不是在PEG链末端具有反应性基团，例如羧基。
除了这些形式的PEG之外，也可以制备骨架中具有弱或可降解键的聚合物。举例来说，可以制备聚合物骨架中具有能够水解的酯键的PEG。如下文所示，此水解导致将聚合物裂解成较低分子量的片段：-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。所属领域技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域已知的所有形式，包括(但不限于)本文所公开的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明。在一些实施例中，水溶性且具有2至约300个末端的聚合物骨架尤其可用于本发明。合适聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(烷撑二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等等。尽管聚合物骨架的各链的分子量可以变化，但是一般在约800Da至约100,000Da范围内，通常在约6,000Da至约80,000Da范围内。
所属领域技术人员应认识到，前文所列实质上水溶性骨架决非是详尽的，而仅是说明性的，并且所有具有上述性质的聚合物质均适用于本发明。
在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能性”，意思是聚合物骨架具有至少两个经官能团官能化或活化的末端，且可能多达约300个。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的直链聚合物，其中各末端结合于可能相同或不同的官能团。
在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-N＝N＝N，
其中：N＝N＝N为叠氮部分；
B为连接部分，其可以存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原聚合物；
A为连接部分，其可以存在或不存在且可与B相同或不同；且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有最多18个且优选为1-10碳原子的多官能化烷基。烷基链可以包括例如氮、氧或硫的杂原子。烷基链也可以在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有最多10个且优选为5-6碳原子的多官能化芳基。芳基可以经又一个碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适连接基的其它实例包括描述于下列专利案中的连接基：美国专利第5,932,462号、第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596，各专利案以引用的方式并入本文。所属领域技术人员应认识到，前文所列连接部分决非为详尽且仅为说明性，并且所有具有上述性质的连接部分均适用于本发明。
适合用作X的官能团实例包括(但不限于)羟基；受保护羟基；烷氧基；活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯；活性碳酸酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯；缩醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯酰胺；活性砜；胺；氨氧基；受保护胺；酰肼；受保护酰肼；受保护硫醇；羧酸；受保护羧酸；异氰酸酯；异硫氰酸酯；顺丁烯二酰亚胺；乙烯基砜；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙酰胺；环氧化物；乙二醛类；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；三氟代乙烷磺酸酯；烯；酮和叠氮。所属领域技术人员应了解，所选X应与叠氮基相容，致使不与叠氮基发生反应。含叠氮聚合物衍生物可以具有同双官能性，意思是第二官能团(即X)也为叠氮部分；或者具有异双官能性，意思是第二官能团为不同官能团。
术语“受保护”是指存在防止化学反应官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基视所保护的化学反应基的类型不同而有所不同。举例来说，如果化学反应基是胺或酰肼，那么保护基可以选自叔丁氧基羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应基是硫醇，那么保护基可以是邻吡啶基二硫化物。如果化学反应基是羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可以是苄基或烷基，例如甲基、乙基或叔丁基。所属技术领域已知的其它保护基团也可用于本发明。
文献中末端官能团的具体实例包括(但不限于)N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参看，例如美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)；胺(参看，例如Buckmann等人Makromol.Chem.182：1379(1981)，Zaplipsky等人Eur.Polym.J.19：1177(1983))；酰肼(参看，例如Andresz等人Makromol.Chem.179：301(1978))；琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(参看，例如Olson等人的Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications，第170-181页，Harris & Zaplipsky编辑，ACS，Washington，D.C.，1997；也参看美国专利第5,672,662号)；琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(参看，例如Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)和Joppich等人Macrolol.Chem.180：1381(1979))；琥珀酰亚胺基酯(参看，例如美国专利第4,670,417号)；苯并三唑碳酸酯(参看，例如美国专利第5,650,234号)；缩水甘油醚(参看，例如Pitha等人Eur.J Biochem.94：11(1979)，Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))；氧基羰基咪唑(参看，例如Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)，Tondelli等人J.Controlled Release 1：251(1985))；对硝基苯基碳酸酯(参看，例如Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))；醛(参看，例如Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)，美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)；顺丁烯二酰亚胺(参看，例如Goodson等人Biotechnology(NY)8：343(1990)，Romani等人的Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984))；和Kogan(Synthetic Comm.22：2417(1992))；邻吡啶基二硫化物(参看，例如Woghiren等人Bioconj.Chem.4：314(1993))；丙烯基醇(acrylol)(参看，例如Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))；乙烯基砜(参看，例如美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N＝N＝N
其中：
X为如上文所述的官能团；且
n为约20至约4000。
在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N
其中：
W为包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接子部分；
n为约20至约4000；且
X为如上文所述的官能团，m为1至10。
可以根据所属技术领域已知和/或本文所公开的多种方法制备本发明的含叠氮PEG衍生物。在一种下文所示的方法中，将具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架与叠氮阴离子(其可以与任何数目的合适反离子配对，包括钠、钾、叔丁铵等等)反应，其中聚合物骨架具有结合于第一官能团的第一末端和结合于合适离去基团的第二末端。离去基团经历亲核取代，并且由叠氮部分置换，得到所需含叠氮PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如所示，适用于本发明的合适聚合物骨架具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)，且X为不与叠氮基反应的官能团，且L为合适的离去基团。合适官能团的实例包括(但不限于)羟基、受保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、受保护胺、受保护酰肼、受保护硫醇、羧酸、受保护羧酸、顺丁烯二酰亚胺、二硫吡啶和乙烯吡啶和酮。合适离去基团的实例包括(但不限于)氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯和甲苯磺酸酯。
在制备本发明的含叠氮聚合物衍生物的另一种方法中，使具有叠氮官能团的连接剂与具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架接触(其中连接剂具有可以与PEG聚合物上化学官能团选择性反应的化学官能团)，以形成含叠氮聚合物衍生物产物，其中通过连接基团将叠氮与聚合物骨架分开。
示范性反应流程如下所示：
X-PEG-M+N-连接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接子-N＝N＝N
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为封端基(例如烷氧基)或如上文所述的官能团；且M为不与叠氮官能团反应但与N官能团有效且选择性反应的官能团。
合适官能团的实例包括(但不限于)：如果N为胺，则M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，则M为酮；如果N为亲核试剂，则M为离去基团。
可以通过已知方法达到粗产物的纯化，包括(但不限于)使产物沉淀，接着(如果需要)进行色谱层析。
在PEG二胺的情况下，下文展示更具体的实例，其中一个胺受保护基团部分(例如叔丁基-Boc)保护，且所得单保护PEG二胺与具有叠氮官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N
在此情况下，可以使用多种活化剂(例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)将胺基团与羧酸基团偶联，以在单胺PEG衍生物与含叠氮连接子部分之间产生酰胺键。成功形成酰胺键之后，所得经N-叔丁基-Boc保护的含叠氮衍生物可以直接用于修饰生物活性分子，或者其可以进一步经精制以安置其它有用官能团。举例来说，可以通常用强酸处理来水解N-t-Boc基团以生成ω-氨基-PEG-叠氮。所得胺可以用作合成把手(synthetic handle)以安装例如顺丁烯二酰亚胺基、活性二硫键、活性酯等其它有用官能团，以用于产生有价值的异双官能试剂。
当需要将不同分子连接于聚合物的各末端时，异双官能衍生物尤其可用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG会允许将具有活性亲电子基团(例如，醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等等)的分子连接于PEG的一个末端，以及将具有乙炔基的分子连接于PEG的另一末端。
在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X-A-POLY-B-C≡C-R
其中：
R为H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或经取代芳基；
B为连接部分，其可以存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原聚合物；
A为连接部分，其可以存在或不存在并且可与B相同或不同；且X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有最多18个且优选为1-10碳原子的多官能化烷基。烷基链可以包括例如氮、氧或硫的杂原子。烷基链也可以在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有最多10个且优选为5-6碳原子的多官能化芳基。芳基可以经又一个碳原子、氮、氧或硫原子取代。合适连接基的其它实例包括描述于下列专利案中的连接基：美国专利第5,932,462号、第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596，各专利案以引用的方式并入本文。所属领域技术人员应认识到，前文所列连接部分决非为详尽的而仅为说明性，并且多种具有上述性质的连接部分均可用于本发明。
适合用作X的官能团实例包括羟基；受保护羟基；烷氧基；活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1-苯并三唑基酯；活性碳酸酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和1-苯并三唑基碳酸酯；缩醛；醛；醛水合物；烯基；丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯；丙烯酰胺；活性砜；胺；氨氧基；受保护胺；酰肼；受保护酰肼；受保护硫醇；羧酸；受保护羧酸；异氰酸酯；异硫氰酸酯；顺丁烯二酰亚胺；乙烯基砜；二硫吡啶；乙烯吡啶；碘乙酰胺；环氧化物；乙二醛类；二酮；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；和三氟代乙烷磺酸酯；烯；酮和乙炔。应了解，所选X部分应与乙炔基相容，从而不与乙炔基发生反应。含乙炔聚合物衍生物可以具有同双官能性，意思是第二官能团(即X)也为乙炔部分；或者具有异双官能性，意思是第二官能团为不同官能团。
在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物骨架：
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
其中：
X为如上文所述的官能团；
n为约20至约4000；且
m为1至10。
各异双官能PEG聚合物的具体实例如下文所示。
可以使用所属技术领域已知和/或本文所公开的方法制备本发明的含乙炔PEG衍生物。在一个方法中，使具有约800Da至约100,000Da平均分子量的水溶性聚合物骨架与具有乙炔官能团和适于与PEG上亲核基团反应的离去基团的化合物反应，其中聚合物骨架具有结合于第一官能团的第一末端和结合于合适亲核基团的第二末端。当结合具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基团的分子时，离去基团经历亲核取代，并且由亲核部分置换，以生成所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR’
如所示，用于所述反应的优选聚合物骨架具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)主要经SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚胺基、羧酸酯、酰肼、氨氧基。Nu基团的其它实例包括将主要经亲核加成反应而反应的官能团。L基团的实例包括氯、溴、碘、甲磺酸酯、三氟代乙烷磺酸酯和甲苯磺酸酯，和其它预期经亲核取代的基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯和其它预期经历亲核试剂加成反应的亲电子基团。
在本发明的另一实施例中，A为1-10个碳原子的脂肪族连接子，或6-14个碳原子的经取代芳基环。X为不与叠氮基反应的官能团，且L为合适的离去基团。
在制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一方法中，使乙炔阴离子与具有约800Da至约100,000Da平均分子量的PEG聚合物接触，所述PEG聚合物在一末端具有受保护官能团或封端剂且在另一末端具有合适离去基团。
示范性反应流程如下所示：
X-PEG-L+-C≡CR’→X-PEG-C≡CR’
其中：
PEG为聚(乙二醇)且X为封端基，例如烷氧基或如上文所述的官能团；且
R′为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上述实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基团L应具有足够反应性以经历SN2型取代。为达成离去基团经乙炔阴离子的SN2取代所需的反应条件为所属技术领域所熟知。
可以通过所属技术领域的已知方法达到粗产物的纯化，其包括(但不限于)使产物沉淀，接着(如果需要)进行色谱层析。
水溶性聚合物可以与本发明的BSP相连接。水溶性聚合物可以经并入BSP中的非天然编码氨基酸，或者非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基，或者添加于非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物经非天然发生氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N端残基的氨基)连接于并入有非天然编码氨基酸的BSP。在一些情况下，本发明的BSP包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上的非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)。在一些情况下，本发明的BSP进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的BSP包含一个或一个以上连接于水溶性聚合物的非天然编码氨基酸和一个或一个以上连接于水溶性聚合物的天然发生氨基酸。在一些实施例中，用于本发明的水溶性聚合物增强相对于非结合形式的BSP的血清半衰期。
可以调节连接于本发明BSP的水溶性聚合物数目(即PEG化或糖基化程度)以改变(包括(但不限于)增加或减少)药理学、药物动力学或药效学特征，例如活体内半衰期。在一些实施例中，BSP的半衰期比未经修饰多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中，用含有直接连接于PEG骨架的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的BSP。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物应具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可以存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有借助酰胺键连接于PEG骨架的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的BSP。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，n为100-1,000且X视情况为可以存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的支链PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的BSP，其中所述支链PEG衍生物的各链具有10-40kDa范围内的MW，更优选的是5-20kDa。
在本发明的另一实施例中，用具有分支结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的BSP。举例来说，在一些实施例中，含肼或含酰肼PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000且X视情况为可以存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲基团的PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。
在一些实施例中，含羟胺基团的PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。
水溶性聚合物连接于BSP的程度与位点可以调控BSP与BSP受体或结合伴侣的结合。在一些实施例中，以一定方式安置键使得BSP以约400nM或更低的Kd、以150nM或更低的Kd与BSP受体结合，并且在一些情况中，以100nM或更低的Kd结合，其中Kd是通过平衡结合测定测量。
用于活化聚合物以及用于结合肽的方法和化学在文献中有所描述并且为所属技术领域已知。通常用于活化聚合物的方法包括(但不限于)用以下物质活化官能团：溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、二环氧化物(biepoxide)、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等等(参看，R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKIN G，CRC Press，BocaRaton；G.T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等人，编辑POLYMERIC DRUGS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
可获得若干关于PEG官能化和结合的综述和专论。参看，例如Harris，Macromol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews inTlierapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。
用于活化聚合物的方法也可以参看WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利5,281,698号和WO 93/15189，以及用于活性聚合物与酶之间的结合，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。所有参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
通过任何常规方法进行含有非天然编码氨基酸(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的BSP的PEG化(即添加任何水溶性聚合物)。举例来说，用以炔为末端mPEG衍生物PEG化BSP。简单来说，室温下伴随搅拌向含对叠氮基-L-Phe的BSP水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。通常用具有接近进行反应的pH值的pKa(通常约pH4-10)的缓冲液缓冲所述水溶液。举例来说，用于在pH7.5下进行PEG化的合适缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。持续监控并且(如果需要)调节pH值。通常使反应持续约1-48小时。
反应产物随后经疏水互作色谱法以从游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH和PEG化BSP的任何高分子量复合物分离出PEG化BSP变体，所述高分子量复合物是当非嵌段PEG在分子的两个末端均被活化，进而交联BSP变体分子而形成。疏水互作色谱法中的条件在于使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流经色谱柱，同时任何经交联PEG化的BSP变体复合物在所需形式之后溶离，所述BSP变体复合物含有结合于一个或一个以上PEG基团的一个BSP变体分子。合适条件视交联复合物与所需结合物的相对大小而变化，并且可以由所属领域技术人员轻易地确定。通过超滤来浓缩含有所需结合物的溶离液，并且通过透滤脱盐。
如果需要，则可以通过所属领域技术人员所已知的一种或一种以上过程进一步纯化获自疏水色谱法的PEG化BSP，所述过程包括(但不限于)亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法(使用包括(但不限于)DEAE SEPHAROSE)、二氧化硅色谱法、反相HPLC、凝胶过滤法(使用包括(但不限于)SEPHADEX G-75)、疏水互作色谱法、尺寸排除色谱法、金属螯合色谱法、超滤/透滤法、乙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱聚焦法、置换色谱法、电泳过程(包括(但不限于)制备型等电聚焦)、差异溶解性(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)或提取法。可以通过GPC借助与球蛋白标准比较来评估表观分子量(PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris & Angal编辑)IRL Press 1989，293-306)。可以通过蛋白水解引起的降解作用(包括(但不限于)胰岛素裂解)，接着进行质谱分析来评估BSP-PEG结合物的纯度。Pepinsky RB.等人，J.Pharmcol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。
可以进一步在不受限制下对连接于本发明BSP的氨基酸的水溶性聚合物进行衍生化或取代。
含叠氮PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有可以与存在于非天然编码氨基酸侧链上的炔部分反应的叠氮部分的PEG衍生物修饰BSP。一般来说，PEG衍生物可以具有1-100kDa范围内的平均分子量，并且在一些实施例中为10-40kDa。
在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在另一实施例中，叠氮末端PEG 衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在本发明的另一实施例中，用含有末端叠氮部分的支链PEG衍生物修饰包含含炔氨基酸的BSP，其中所述支链PEG的各链具有10-40kDa范围内的MW，更优选的是5-20kDa。举例来说，在一些实施例中，叠氮末端PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，在各情况下其可以存在或不存在。
含炔PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有可以与存在于非天然编码氨基酸侧链上的叠氮部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰BSP。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10且n为100-1,000(即5-40kDa的平均分子量)。
在本发明的另一实施例中，用含有借助酰胺键连接于PEG骨架的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔非天然编码氨基酸的BSP。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。
在本发明的另一实施例中，用含有末端炔部分的支链PEG衍生物修饰包含含叠氮氨基酸的BSP，其中所述支链PEG的各链具有10-40kDa范围内的MW，更优选的是5-20kDa。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，或不存在。
含膦PEG衍生物
在本发明的另一实施例中，用含有活性官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰BSP，其中所述PEG衍生物进一步包含可以与存在于非天然编码氨基酸侧链上叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物可以具有1-100kDa范围内的平均分子量，并且在一些实施例中为10-40kDa。
在一些实施例中，PEG衍生物具有以下结构：
其中n为1-10；X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。在一些实施例中，PEG衍生物具有以下结构：
其中X可以为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可以为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。示范性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R′″和R″″各自独立地指氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团独立选择，如同当存在一个以上这些基团时的各R′、R″、R′″和R″″基团。当R′和R″连接于同一氮原子时，其可以与氮原子结合以形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。对于上述取代基来说，所属领域技术人员应了解，术语“烷基”包括与除氢原子外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
其它PEG衍生物和一般PEG化技术
可以连接于BSP的其它示范性PEG分子以及PEG化方法包括描述于以下专利文献中的那些：例如美国专利公开案2004/0001838、2002/0052009、2003/0162949、2004/0013637、2003/0228274、2003/0220447、2003/0158333、2003/0143596、2003/0114647、2003/0105275、2003/0105224、2003/0023023、2002/0156047、2002/0099133、2002/0086939、2002/0082345、2002/0072573、2002/0052430、2002/0040076、2002/0037949、2002/0002250、2001/0056171、2001/0044526、2001/0027217、2001/0021763；美国专利案6,646,110、5,824,778、5,476,653、5,219,564、5,629,384、5,736,625、4,902,502、5,281,698、5,122,614、5,473,034、5,516,673、5,382,657、6,552,167、6,610,281、6,515,100、6,461,603、6,436,386、6,214,966、5,990,237、5,900,461、5,739,208、5,672,662、5,446,090、5,808,096、5,612,460、5,324,844、5,252,714、6,420,339、6,201,072、6,451,346、6,306,821、5,559,213、5,612,460、5,747,646、5,834,594、5,849,860、5,980,948、6,004,573、6,129,912；WO 97/32607、EP229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503和EP 154 316，所述参考案以引用的方式并入本文。可以使用任何形式的本文所述的任何PEG分子，包括(但不限于)单链、分支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。
增强与血清白蛋白的亲和力
也可以将各种分子与本发明的BSP融合以调节血清中BSP的半哀期。在一些实施例中，将分子与本发明的BSP连接或融合以增强与动物中内源血清白蛋白的亲和力。
举例来说，在一些情况下，进行BSP与白蛋白结合序列的重组融合。示范性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参看，例如Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277：534-542(1996)和Sjolander等人，J.Immunol.Methods201：115-123(1997))，或例如Dennis等人，J.Biol Chem.277：35035-35043(2002)中所述的白蛋白结合肽。
在其它实施例中，用脂肪酸酰化本发明的BSP。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参看，例如Kurtzhals等人，Biochem.J.312：725-731(1995)。
在其它实施例中，将本发明的BSP直接与血清白蛋白(包括(但不限于)人血清白蛋白)融合。所属领域技术人员应认识到，多种其它分子也可以连接于本发明中的BSP以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
X.BSP的糖基化
本发明包括并入有一种或一种以上具有糖残基的非天然编码氨基酸的BSP。糖残基可以是天然的(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可以通过N或O连接糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应C或S连接糖苷)与非天然编码氨基酸相连接。
可以活体内或活体外将糖(包括(但不限于)糖基)部分添加至BSP中。在本发明的一些实施例中，用经氨氧基衍生化的糖修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的BSP以产生相应经肟键连接的糖基化多肽。一旦连接于非天然编码氨基酸，便通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精制糖以产生结合于BSP的寡糖。参看，例如H.Liu等人J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中，直接用具有如氨氧基衍生物制备所定义的结构的聚糖修饰包含含羰基非天然编码氨基酸的BSP。所属领域技术人员应认识到，其它官能团(包括叠氮、炔、酰肼、肼和氨基脲)也可以用于连接糖与非天然编码氨基酸。
在本发明的一些实施例中，随后可以通过(包括(但不限于))分别与(包括(但不限于))炔基或叠氮衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应来修饰包含含叠氮或含炔基的非天然编码氨基酸的BSP。所述方法允许以极高选择性修饰蛋白。
XI.含BSP的二聚体和多聚体
本发明也提供BSP组合(包括(但不限于)GLP-1和GLP-1类似物、T-20和T-20类似物、PYY和PYY类似物)，例如同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体(即三聚体、四聚体等等)，其中含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的特定BSP结合于另一BSP、其类似物或变体或任何其它为非GLP-1(或非T-20或非PYY)肽的多肽或其变体，其是直接结合于多肽骨架或经连接子结合。由于与单体相比分子量增加，因此BSP(例如GLP-1、T-20或PYY)二聚体或多聚体结合物能够展示出新特性或所需特性，包括(但不限于)相对于单体BSP而言不同的药理学、药物动力学、药效学特性、经调节治疗半衰期或经调节血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的结合物或融合体可以调节BSP与其受体或结合伴侣的互作。在其它实施例中，本发明的BSP结合物、融合体、二聚体或多聚体可以充当受体拮抗剂、激动剂、超级激动剂(super agonist)或调节剂。
在一些实施例中，存在于含有BSP的二聚体或多聚体中的一个或一个以上BSP包含连接于存在于受体结合区或用于与结合伴侣结合的区中的水溶性聚合物的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，BSP直接连接，包括(但不限于)经Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键连接。在一些实施例中，所连接的BSP可以包含不同非天然编码氨基酸以有助于结合、融合、二聚化作用或多聚化作用，其包括(但不限于)第一BSP的一个非天然编码氨基酸中的炔可以与第二BSP的第二非天然编码氨基酸中的叠氮经Huisgen[3+2]环加成反应而结合。或者，第一BSP和/或包含含酮非天然编码氨基酸的所连接的BSP可以与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二BSP结合，并且多肽通过形成对应肟来反应。
或者，两个BSP经连接子连接。任何异双官能或同双官能连接子可用于连接可以具有相同或不同一级序列的两个BSP。在一些情况下，用于将BSP束缚在一起的连接子可以是双官能PEG试剂。连接子可以具有广范围的分子量或分子长度。可以使用较大或较小分子量的连接子以提供BSP与所连接实体之间，或BSP与其结合伴侣之间，或所连接的实体与其结合伴侣之间(如果存在)的所需空间关系或构象。可以使用较长或较短分子长度的连接子以提供BSP与所连接实体之间，或BSP与其结合伴侣之间，或所连接的实体与其结合伴侣之间(如果存在)的所需空间或柔性。类似地，在BSP到达其靶标之前或之后，具有特定形状或构象的连接子可以用于对BSP或所连接实体赋予特定形状或构象。BSP与所连接实体和结合伴侣之间空间关系的最优化可以对分子提供新的、经调节的或所需特性。
在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，所述结构包括：a)在聚合物骨架的至少第一末端上的叠氮、炔、肼、酰肼、羟胺或含羰基部分；以及b)在聚合物骨架的第二末端上的至少一个第二官能团。第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团对第一官能团不具反应性。在一些实施例中，本发明提供包含支链分子结构的至少一条臂的水溶性化合物。举例来说，支链分子结构可以为树枝状。
在一些实施例中，本发明提供包含一个或一个以上由与水溶性活性聚合物反应所形成的GH超基因家族成员(例如BSP)的多聚体，所述水溶性聚合物具有以下结构：R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，其中n为约5至3,000，m为2-10，X可以为叠氮、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基部分，且R为封端基、官能团或可以与X相同或不同的离去基团。举例来说，R可以为选自由以下各物组成群组的官能团：羟基、受保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、受保护胺、酰肼、受保护酰肼、受保护硫醇、羧酸、受保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛类、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟代乙烷磺酸酯、烯和酮。
XII.BSP活性和BSP与BSP受体或结合伴侣的亲和力的测量
可以用标准活体外或活体内测定来测定BSP活性。
许多测定可以用于监控本发明GLP-1多肽的活性。肽激素(例如GLP-1)活化特异性D蛋白偶联受体，并且因此可以通过检测GLP-1受体依赖性cAMP形成的测定来评价本发明的GLP-1多肽。可以通过各种方法测量下游细胞内cAMP产生，这些方法包括(但不限于)比色法、荧光法、时间分辨荧光法(time-resolved fluorescence)或FP法。大鼠胰岛瘤来源的RIN-m5F细胞具有偶联于腺苷酸环化酶的内源GLP-1受体(Fehmann等人，Mol Cell Endocrinol 85：C39-C44；Goke等人Res Exp Med(Berl).1989；189(4)：257-64)，并且可用于测量受体活化后的cAMP。相似地，可以使用仓鼠HIT-T15细胞(ATCC，Manassas，VA)或大鼠BRIN-BD11β细胞(Green等人J MolEndocrinol.2003年12月；31(3)：529-4)。
或者，可以在经重组hGLP-1受体转染的细胞中(包括(但不限于)CHO(Kim等人2003 Diabetes 52：751-59)、BHK(幼年仓鼠肾脏；Knudsen等人2000 J.Med.Chem.43：1664-1669)和CHL(中国仓鼠肺)细胞)，或者原初细胞(primary cell)，例如从大鼠、小鼠或仓鼠分离的胰岛细胞中测量cAMP产生。可以如Thorens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89(18)：8641-5或美国专利第5,670,360号和第6,051,689号中所述制备GLP-1受体，所述文献以引用的方式并入本文。可以将福斯高林(forskolin)(EMD Biosciences，San Diego，CA)、腺苷酸环化酶活化剂和腺苷酸环化酶抑制剂、PI3K、MAPK或p38用作测定对照。激动剂对照包括GLP-1(7-37)和exendin-4-有效GLP-1受体激动剂，并且拮抗剂对照包括GLP-1受体拮抗剂Exendin(9-39)(购自Bachem AG)。参看Goke等人，J Biol Chem.1993年9月15日；268(26)：19650-5。画出每个所测试化合物的剂量应答曲线，并且计算EC50值。或者，可以通过其它测定来测量cAMP。这些测定通常是所属技术领域所熟知的。
胰岛素分泌也是测量本发明GLP-1多肽的生物活性的指标。可以在用各种浓度的GLP-1多肽和葡萄糖培育后的细胞中通过胰岛素RIA或ELISA来计算胰岛素分泌的活体外研究。Green等人(上文)评价了GLP-1多肽在大鼠BRIN-BDllβ细胞中的促胰岛素作用。或者，大鼠胰岛可用于胰岛素分泌研究中(Goke等人，J.Biol.Chem.1993268(26)19650-19655)。
或者，可以用例如XTT或BrdU或CREB(环状AMP反应元件结合蛋白)转录因子的试剂通过使用CRE报告基因测定来测量β岛细胞生长。
可以通过使用BIAcoreTM生物感应器(Pharmacia)来测量包含非天然氨基酸的GLP-1多肽与其受体的亲和力。可以使用调节生长或结合GLP-1的细胞或细胞系(包括(但不限于)含有活性GLP-1受体的细胞，例如人细胞，或重组GLP-1受体产生细胞)来监控GLP-1受体结合。举例来说，可以使用调节生长或结合GLP-1的细胞或细胞系(包括(但不限于)含有活性GLP-1受体的细胞，例如人细胞，或重组GLP-1受体产生细胞)来监控GLP-1受体结合。
或者，也可以使用经重组hGLP-1受体转染的细胞(包括(但不限于)CHO、BHK(幼年仓鼠肾脏)和CHL(中国仓鼠肺纤维原细胞)细胞)来测量结合。参看，Kim等人(上文)在经转染CHO细胞中所进行的结合研究，和Green等人J Mol Endocrinol.2003年12月；31(3)：529-40在经转染CHL细胞中所进行的研究。可以如Thorens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89(18)：8641-5或美国专利第5,670,360号和第6,051,689号中所述制备GLP-1受体，所述文献以引用的方式并入本文。
可以通过液相色谱/质谱(LC/MS)或通过其它方法监控由DPP IV或人血浆对本发明GLP-1多肽的降解。可以用DPP IV或0、6或12小时所汇集的人血浆和在分析之前添加以终止任何酶学反应的试剂(例如TFA)来培育本发明的GLP-1肽。所有引用的参考文献均以引用的方式并入本文。
用于测试GLP-1活性的活体内动物模型以及人临床试验包括描述于美国专利申请公开案第20040082507A1号和第20030232754A1号中的那些，所述专利案以引用的方式并入本文。
许多测定可以用于监控本发明T-20(DP-178)多肽的活性。可以如美国专利第5,464,933号所述使用测试DP-178多肽抑制合胞体形成的能力或其抑制受无细胞病毒感染的能力的活体外测定，所述文献以引用的方式并入本文。所测量的参数包括所展示的抗所给病毒菌株的相对抗病毒活性和/或肽的菌株特异性抑制活性。可以采用细胞融合测定来测试肽活体外抑制HrV所诱导的合胞体形成的能力。这种测定包含在存在慢性HIV感染细胞和各种浓度待测定的肽的情况下，培养未受感染的CD-4+细胞(例如(但不限于)Molt或CEM细胞)。培养适当时期之后，显微镜观察培养物中是否存在多核巨细胞，存在多核巨细胞就指示细胞融合和合胞体形成。
可以采用逆转录酶(RT)测定来测试肽抑制CD-4+细胞受无细胞HIV感染的能力。这种测定可以包含在待测试的肽存在的情况下，培养适当浓度(即TCID50)的病毒和CD-4+细胞。使用所属领域技术人员所熟知的培养条件。除其中未添加肽的对照培养物之外，可以使用许多肽浓度。培养适当时期之后(例如7天)，使用标准过程制备无细胞上清液，并且作为成功感染的测量指标，测试RT活性的存在。可以使用标准技术测试RT活性，例如描述于Goff等人(Goff，S.等人，1981，J.Virol.38：239-248)和/或Willey等人(Willey，R.等人，1988，J.Virol.62：139-147)中的那些技术。这些参考文献以全文引用的方式并入本文。其它测量抗病毒活性的测定是所属领域技术人员所已知的。为测试与另一种抗病毒剂的组合疗法而对这些测定的改进也是所属领域技术人员所已知的。
所属领域技术人员所熟知的标准方法也可用于测定非逆转录酶病毒活性。参看，例如Pringle等人(Pringle，C.R.等人，1985，J.Medical Virology 17：377-386)关于呼吸道合胞病毒和副流感病毒活性测定技术的讨论。另外参看，例如“Zinsser Microbiology”，1988，Joklik，W.K.等人编辑，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.，第19版关于这些技术的一般概述。这些参考文献以全文引用的方式并入本文。
优选的PYY激动剂可以在一个描述于WO 02/47712和美国专利公开案第2002/0141985号中的测定(优选为食物摄取、胃排空、胰腺分泌或体重降低测定)中具有效力，其大于相同测定中NPY的效力。
无论使用何种方法产生BSP类似物，均对类似物执行生物活性测定。一般来说，生物活性测试应对所需结果进行分析，例如生物活性的增加或减少(与未改变BSP相比)、不同生物活性(与未改变BSP相比)、受体或结合伴侣的亲和力分析、BSP自身或结合伴侣的构象或结构变化(与未改变BSP相比)或血清半衰期分析。
上文关于测定方法的参考文献汇编并非详尽，并且所属领域技术人员应该了解其它可用于测试所需最终结果的测定。
XIII.效能、功能性活体内半衰期和药物动力学参数的测量
本发明的一个重要方面在于通过使或不使多肽与水溶性聚合物部分结合来构建BSP所获得的延长的生物半衰期。BSP血清浓度的快速降低使得评价对以结合和非结合BSP及其变体治疗的生物反应具有重要意义。本发明的结合和非结合BSP及其变体优选在静脉内投药之后也具有延长的血清半衰期，使得能够通过(例如)ELISA法或通过初步筛选测定来进行测量。用于测量GLP-1或其变体活体内半衰期的测定的另一实例描述于美国专利第5,118,666号、美国专利申请公开案第20040082507A1号和第20030232754A1号中，所述专利案均以引用的方式并入本文。如本文所述进行活体内生物半衰期的测量。
可以根据描述于美国专利第5,118,666号、美国专利申请公开案第20040082507A1号和第20030232754A1号中的实验方案确定包含非天然编码氨基酸的GLP-1多肽的效能和功能性活体内半衰期。
可以在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每治疗组N＝5只动物)中评价包含非天然编码氨基酸的GLP-1多肽的药物动力学参数。动物将接受25微克/大鼠(静脉内)或50微克/大鼠(皮下)的单次剂量，并且根据预定时程采集大约5-7个血液样本，通常覆盖未结合于水溶性聚合物的包含非天然编码氨基酸的GLP-1多肽约6小时以及结合于水溶性聚合物的包含非天然编码氨基酸的GLP-1多肽约4天。充分研究了若干物种内GLP-1的药物动力学数据，并且可以将其直接与包含非天然编码氨基酸的GLP-1所获的数据进行比较。
可用于评价本发明GLP-1肽的动物模型包括(但不限于)：肥胖Zucker(fa/fa；ZDF)大鼠、ob/ob小鼠和db/db小鼠。可以通过单基因隐性遗传产生这些模型(Bray，G.A.1977.Fed Proc.36：148-153；Bray，G.A.和D.A.York.1979.Physiol.Rev.51：598-646；Kasiske，B.L.等人1992.Hypertension 19增刊I：I110-I115；Bray，G.A.1992.Am.J.Clin.Nutr.55增刊488S-494S)。GLP-1受体剔除(GLP-1R-/-)小鼠也可以用于动物研究中以展示本发明GLP-1分子的葡萄糖降低作用依赖于功能性GLP-1受体。(美国专利第5,846,937号，Scrocchi等人1996 Nat Med.1996年11月；2(11)：1254-8，Scrocchi等人Diabetes 199645：21 A)。db/db小鼠是遗传肥胖和糖尿病种的小鼠。db/db小鼠伴随其肥胖发展而发展高血糖症和高胰岛素血症，并且因此充当肥胖2型糖尿病(NIDDM)的模型。db/db小鼠可以购自(例如)Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine)。Young等人Diabetes 199948：1026-1034描述在肥胖Zucker(fa/fa)大鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠和糖尿病恒河猴(rhesus monkey)中比较未经修饰GLP-1与Exendin-4的研究。Zucker糖尿病肥胖fa/fa(ZDF)大鼠是胰岛素依赖型，但是在出生时血糖量正常，并且在约第7周龄至第10周龄发展出糖尿病。在过渡期内，动物经葡萄糖耐量降低的状态。尽管在糖尿病开始前和糖尿病的早期阶段期间动物为高胰岛素性，但是随后其丧失葡萄糖刺激的胰岛素分泌并且最终变为几乎完全缺乏胰岛素(insulinopenic)。
对db/db或ob/ob小鼠给予包含非天然编码氨基酸的GLP-1肽或作为比较剂(comparator)的exendin-4。以每剂量0.1微克皮下投与化合物，并且比较两个群体之间的血浆葡萄糖、胰高血糖素和血液胰岛素、体重降低和食欲减退作用。结果展示与exendin-4相比，本发明的GLP-1肽具有较低频率给药下的极佳活性，和延长的半衰期。可以如Baggio等人Diabetes(2004)53：2492-2500所述在GLP-1受体剔除小鼠中进行研究。
存在许多检测GLP-1活性以及GLP-1融合体和类似物活性的方法。例如描述于Gelfand等人的EP 619,322和美国专利第5,120,712号中的测定可用于测试活体外GLP-1活性。以引用的方式并入本文的美国专利公开案US20040053370A1也描述GLP-1类似物和融合蛋白及其对肽活体内半衰期的影响。可以通过ELISA(Linco Research Co.)测量活体内研究中的血清GLP-1浓度。
可以活体外(例如合胞体测定中，感染性测定)或活体内(例如适当动物模型中或人中)评估DP-178抑制HIV进入细胞的能力。Kilby等人Nature Medicine(1998)4(11)：1302-1307描述静脉内投与HIV感染人类中的DP-178的安全性、药物动力学和抗病毒活性。可以用本发明的DP-178分子进行相似的研究。
可以通过肽YY的免疫学测定来确定测定肽YY在血清、中枢神经系统(CNS)组织或液体、脑脊液(CSF)或其它组织或液体中浓度的程序。举例来说，可以使用用于肽YY的放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)和用于免疫组织化学或免疫荧光法的抗体试剂(Bachem AG；King of Prussia，Pa.)。用于测试PYY活性的活体内动物模型以及人临床试验包括描述于美国专利申请公开案第20050002927号中的那些。
可以通过所属技术领域已知的各种测定来测定根据本发明的BSP的特异活性。可以通过本文所述或所参考的或者所属领域技术人员所熟知的方法测试根据本发明所获得和经纯化的BSP突变型蛋白或其片段的生物活性。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白(包括(但不限于)BSP、合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白等等)视情况用于治疗用途，包括(但不限于)与合适的医药载剂相结合。举例来说，所述组合物包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。剂型应配合投药模式。一般来说，投与蛋白的方法为所属技术领域所熟知，并且适用于投与本发明的多肽。
根据所属技术领域所熟知的方法，视情况在一个或一个以上合适的活体外和/或活体内患病动物模型中测试包含一种或一种以上本发明多肽的治疗组合物，以证实功效、组织代谢并评估剂量。具体来说，开始可以通过比较非天然与天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它合适度量标准(包括(但不限于)比较经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的BSP与天然氨基酸BSP)来确定剂量，即在相关测定中。
通过任何通常用于将分子引入以完全接触血液或组织细胞的途径投药。以任何合适方式，视情况用一种或一种以上医药学上可接受载剂来投与本发明的非天然氨基酸多肽。向患者投用本发明内容中所述多肽的合适方法是可得的，并且尽管可以使用一种以上途径来投与特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一途径更及时、更有效的作用或反应。
部分上通过所投与的特定组合物以及通过用于投与组合物的特定方法来确定医药学上可接受载剂。因此，存在多种本发明医药组合物的合适剂型。
可以通过许多途径投与多肽组合物，包括(但不限于)经口、经静脉内、经腹膜内、经肌肉内、经皮肤、经皮下、经局部、经舌下或经直肠手段。也可以经脂质体投与包含经修饰或未经修饰非天然氨基酸多肽的组合物。所述投药途径和适当剂型通常为所属领域技术人员所已知。
也可以将包含非天然氨基酸的BSP单独或与其它合适组分结合而制成通过吸入来投药的气雾剂(即其可被“雾化”)。气雾剂可以置于加压可接受推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等。
适用于通过(例如)关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径肠道外投药的剂型包括水性和非水性等渗无菌注射溶液(可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与预期接受者血液等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可以将BSP制剂保存在单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶。
肠道外投药和静脉内投药为优选投药方法。具体来说，已经用于天然氨基酸同源物疗法中的投药途径(包括(但不限于)通常用于GLP-1、DP-178、PYY、EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药学传送多肽或蛋白)以及目前所用剂型提供本发明多肽的优选投药和调配途径。
在本发明的内容中，投与患者的剂量足以在患者中随时间具有有益的治疗反应，或者包括(但不限于)抑制病原体感染，或取决于应用的其它适当活性。通过特定载体或制剂的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者病情，以及待治疗患者的体重或表面积来确定剂量。也可以通过特定患者中伴随特定载体、制剂等投药的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定剂量大小。
在确定治疗或预防疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等等)中待投与的载体或制剂的有效量中，医师评价循环血浆含量、制剂毒性、疾病进程和/或(当相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
举例来说，投与70千克患者的剂量通常在等同于目前使用治疗蛋白的剂量范围内，可调节所述剂量以获得相关组合物的活性或血清半衰期改变。本发明的载体可以通过任何已知常规疗法补充治疗条件，包括投与抗体、投与疫苗、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应修饰剂等等。
对于投药来说，可以在由相关制剂的LD-50或ED-50和/或在各种浓度下所观察的任何非天然氨基酸的副作用所确定的速率下投与本发明的制剂，包括(但不限于)适于患者的质量和总体健康状况。可以经单次剂量或分次剂量完成投药。
如果经制剂输液的患者发生发热、寒战或肌肉疼痛，则他/她应接受适当剂量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它控制疼痛/发烧的药物。对经受输液反应(例如发热、肌肉疼痛和寒战)的患者在将要输液阿斯匹林、醋氨酚或(包括(但不限于))苯海拉明30分钟之前前驱用药。度冷丁(meperidine)用于不迅速响应于退热剂和抗组胺剂的更为严重的寒战和肌肉疼痛。取决于反应的严重程度，减缓或停止细胞输液。
可以对哺乳动物受检者直接投与本发明的人BSP。通过任何通常用于向受检者引入BSP的途径投药。尽管任何给定情况下最为合适的途径应取决于待治疗病情的性质和严重程度，但是根据本发明实施例的BSP组合物包括适用于经口、经直肠、经局部、经吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、经面颊(包括(但不限于)舌下)、经阴道、肠道外(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即皮肽和粘膜表面，包括气道表面)和经皮投药的组合物。可以局部或全身性的方式投药。可以将化合物制剂保存在单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶。可以制备呈单位剂量注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的与医药学上可接受载剂混合的本发明BSP。也可以通过连续输液(使用包括(但不限于)微型泵，例如渗透泵)、单次快速注射或缓释储库型制剂来投用本发明的BSP。
适用于投药的剂型包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液(可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可以由先前所描述种类的无菌粉末、颗粒和药片制备溶液和悬浮液。
本发明的医药组合物可以包含医药学上可接受载剂。部分上通过所投与的特定组合物以及通过用于投与组合物的特定方法来确定医药学上可接受载剂。因此，存在多种适合于本发明医药组合物的剂型(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)(参看，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版1985)。
合适载剂包括含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；二价金属离子，例如锌、钴或铜；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐反离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TweenTM、PluronicsTM或PEG。
可以通过持续释放系统或作为持续释放系统一部分投与本发明的BSP，包括与例如PEG的水溶性聚合物相连接的BSP。持续释放组合物包括(包括(但不限于))为成形粒子形式的半透性聚合物基质，包括(但不限于)薄膜或微胶囊。持续释放基质包括生物相容物质，例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯-醋酸乙烯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚乳酸(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙醇酸、乳酸/甘醇酸共聚物、聚酸酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原质、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多聚核苷酸、聚乙烯基丙烯(polyvinyl propylene)、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。持续释放组合物也包括脂质捕获化合物(liposomally entrappedcompound)。可以通过本身已知的方法制备含有所述化合物的脂质体：DE 3,218,121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324。所用参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
可以通过(例如)DE 3,218,121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP 102,324中所述的方法制备脂质捕获BSP。脂质体组合物与大小为熟知，并且能够由所属领域技术人员根据经验容易地确定。一些脂质体实例描述于以下文献中：例如Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编辑)：MEDICAL APPLICATIONS OFLIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancer therapy，Teicher B(编辑)：CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。所用参考文献和专利均以引用的方式并入本文。
在本发明的内容中投与患者的剂量应足以引起受检者中随时间的有益反应。一般来说，每剂量肠道外投与的本发明BSP的总医药学有效量为约0.01微克/千克/天至约100微克/千克，或约0.05毫克/千克至约1毫克/千克患者体重，但这受治疗判断影响。给药频率也受治疗判断影响，并且可以比所建议用于人类的市售BSP制品频率更高或更低。一般来说，可以通过任何上述投药途径投与本发明的PEG化BSP。
XV.本发明BSP的治疗用途
本发明的BSP可用于治疗许多病症。
投与本发明的BSP产物产生由人类中其它制剂所证实的任何活性。含有BSP产物的医药组合物可以调配成有效地通过各种手段向遭受病症的人类患者投药的浓度，其中所述病症可能受BSP激动剂或拮抗剂影响，其是单独的或作为病情或疾病的一部分。BSP产物的平均量可以不同，并且具体来说，应基于合格医师的建议和处方。BSP的准确量对受检者而言受以下因素影响：例如待治疗的准确病情类型、所治疗的患者状况以及组合物中的其它成分。本发明也提供投与治疗有效量的另一种活性剂。所属领域技术人员基于BSP疗法可以轻易地确定其给药量。
本发明的多肽和融合蛋白可用于治疗许多疾病和病情。本发明的GLP-1多肽和融合蛋白主要通过在称为“GLP-1受体”的受体处作用来发挥其生物效应。因此可以用本发明的GLP-1多肽和融合蛋白治疗患有疾病和/或病情的受检者，所述疾病和/或病情有利地响应于GLP-1受体刺激或响应于GLP-1化合物的投药。这些受检者是“需要经GLP-1化合物治疗”或“需要GLP-1受体刺激”。包括患有以下疾病的受检者：非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(参看WO 00/16797)、心肌梗塞(参看WO98/08531)、肥胖症(参看WO 98/19698)、手术后代谢变化(参看美国专利第6,006,753号)、机能性消化不良和肠易激综合征(参看WO 99/64060)。也包括需要经GLP-1化合物预防治疗的受检者，例如具有发展非胰岛素依赖性糖尿病风险的受检者(参看WO00/07617)。具有葡萄糖耐量降低或空腹葡萄糖受损的受检者、体重高于正常身高和体型的受检者体重约25％的受检者、胰腺被部分切除的受检者、一个或一个以上双亲患有非胰岛素依赖性糖尿病的受检者、患有妊娠期糖尿病的受检者和患有急性或慢性胰腺炎的受检者都具有发展非胰岛素依赖性糖尿病的风险。
本发明包含由于融合于白蛋白、白蛋白片段、白蛋白类似物、Fc蛋白、Fc片段、Fc类似物、水溶性聚合物或脂肪酸而具有改进的生物化学和生物物理学性质的GLP-1化合物。这些异源蛋白可以成功地在宿主细胞中表达，保留与活化GLP-1受体相关的信号传导活性，并且具有延长的半衰期。
DP-178的治疗用途包括(但不限于)治疗HIV-1感染或抑制HIV-1复制。本发明的DP-178肽优选表现抗病毒活性。因此，所述肽可以用作人类和非人类病毒逆转录酶病毒(尤其是HIV)传播至未受感染细胞的抑制剂。传播可受本发明肽抑制的人类逆转录酶病毒包括(但不限于)HIV-1和HIV-2和人T淋巴细胞病毒(HTLV-I和II)的所有菌株。传播可由本发明肽抑制的非人类逆转录酶病毒包括(但不限于)牛白血病病毒、猫肉瘤和白血病病毒、猴免疫缺陷肉瘤和白血病病毒和羊行进肺炎病毒(sheep progresspneumonia virus)。传播可由本发明的肽抑制的非逆转录酶病毒包括(但不限于)人呼吸道合胞病毒、犬温热症毒、新城鸡瘟病毒、人副流感病毒和感冒病毒。本发明进一步涵盖使用肽与至少一种其它治疗(包括(但不限于))抗病毒剂的组合疗法来治疗上述逆转录酶病毒和非逆转录酶病毒。
PYY的治疗用途包括(但不限于)治疗肥胖症、糖尿病、胃肠病情(例如溃疡、肠激躁症和炎性肠道疾病)或任何涉及细胞增殖、营养运输和肠内水和电介质分泌的内分泌调节的病情。PYY的治疗用途也包括治疗代谢病情或病症，尤其是那些可以通过降低热量利用率而得以减轻的病情或病症，例如饮食失调症、胰岛素抗性综合症(综合症X)、葡萄糖不耐受、血脂异常(dyslipidemia)和心血管病症。
实例
提供以下实例进行说明，而不是要限制所主张的发明。
实例1
本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入GLP-1的优选位点的许多潜在标准组中的一组。
本实例证实如何选择GLP-1多肽中用于引入非天然编码氨基酸的优选位点。本实例中所用的序列编号方式是根据SEQ ID NO：2所示的GLP-1(7-37)的氨基酸序列。除非另外说明，否则所引用的位置编号是基于肽的位置7-37。举例来说，第8位对应SEQ IDNO：2中第二氨基酸。所属领域技术人员应了解可以在SEQ ID NO：1、3、21或任何其它GLP-1分子中轻易地确定对应于SEQ ID NO：2中位置的氨基酸位置。
根据Neidigh，J.W.，Fesinmeyer.R.M.，Prickett K.S.，Andersen，N.H.：Exendin-4 andGlucagon-Like-Peptide-1：NMR Structural Comparisons in the Solution andMicelle-Associated States.Biochemistry 40第13188页(2001)进行GLP-1潜在α螺旋结构的建模。以下标准用于评价用于引入非天然编码氨基酸的各GLP-1的位置：残基(a)不应该受丙氨酸扫描突变的影响(参看Adelhorst等人J.of Biol.Chem.1994269(9)：6275-6278)，(b)基于建模应该表面暴露并且展示与周围残基的最小范德华力(van der Waals)或氢键互作，(c)可以为可变或非必需而不影响GLP-1变体中的活性，(d)在用非天然编码氨基酸替换之后应产生保守性替换，并且(e)可以发现于高度柔性区域中或结构刚性区域中。此外，采用Cx程序(Pintar等人(2002)Bioinformatics，18，第980页)基于模型结构对GLP-1分子进行进一步计算以评价肽中各蛋白原子的突出程度。因此，在一些实施例中，非天然编码氨基酸在(但不限于)GLP-1的一个或一个以下位置处被替换(如在SEQ ID NO：2中，和其它GLP-1类似物中的对应氨基酸)：在第7位前(即N端)、第19位、第23位、第26位、第27位、第28位、第29位、第30位或第33位。在一些实施例中，本发明的GLP-1多肽包含在一个或一个以上在一个或一个以上的以下位置处提供拮抗剂的非天然发生氨基酸：22、18、29、25、32、21、28、17、24、31和20。
GLP-1融合蛋白可以包含免疫球蛋白的Fc部分。图1图示包含GLP-1-Fc融合蛋白的GLP-1二聚多肽。两个GLP-1多肽经连接子序列连接于人IgG1Fc。各GLP-1多肽的C端融合于与IgG1的Fc部分融合的连接子序列(Ala-Ala-Ala-Glu-Pro-Lys-Ser-Ser)。GLP-1多肽包含在第1位、第2位或第3位的非天然编码氨基酸，其中第1位＝GLP-1(SEQ ID NO：2)的第一氨基酸。GLP-1的其它修饰包含在第8-12位、第16位的Ala替换，或者Arg缺失(其中第1位＝GLP-1的第一氨基酸)。
图4显示设计Exendin或GLP-1类似物的策略。一个策略是用并入GLP-1中的非天然编码氨基酸熵捕获(entropically trap)GLP-1的螺旋成核。用非天然氨基酸替换包括(但不限于)沿α螺旋非保守区的残基以最佳化螺旋功能。另一个策略是连接存在于GLP-1中的两个或两个以上非天然氨基酸以锁定螺旋形成。用非天然氨基酸替换包括(但不限于)沿α螺旋非保守区的残基。为了调节潜在的免疫原性，可以在靠近键位点处添加聚(乙二醇)。图5图示设计具有特定结构特征的GLP-1类似物的策略。生物合成途径：优势-Cys结合形式中的成本、均匀性、柔性。关键观察：1)Exendin-4与GLP-1共享前10个氨基酸，除了A8G之外；2)A8G替换是GLP-1中而不是exendin-4中易受影响的DPPIV；并且3)Exendin-4具有在Y28、W33...处的基于芳香族堆叠(aromatic stacking)的螺旋结构，而未发现于GLP-1中。结论：非天然氨基酸替换以促进螺旋结构可以保持稳定性并且增强功效...Y28优选位点。
评价残基对改进代谢稳定性、稳定螺旋结构、减少分子的潜在聚集和调节受体结合亲和力中的贡献。Lopez de Maturana，R.等人(2003)J.Biol.Chem.278，10195-10200中详细描述GLP-1受体配体互作的模型。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在GLP-1中任何位置、第一氨基酸之前(在氨基端)、羧基端添加或其任何组合处并入。在一些实施例中，本发明的GLP-1多肽包含在以下位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：在第7位的第一氨基酸之前(即N端)、7H、8A、9E、VI6、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、291、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、第38位添加(即羧基端)或其任何组合。在一些实施例中，本发明的GLP-1多肽可以包含在以下位置处的一个或一个以上非天然编码氨基酸：18S、19Y、20L、22G、23Q、25A、26K、27E、30A、W31至G37的任何氨基酸、第38位添加(即羧基端)或其任何组合。在优选实施例中，GLP-1多肽包含在19Y、23Q、26K、27E、30A或38(即羧基端)处的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物是聚(乙二醇)。一些实施例中，非天然编码氨基酸经由连接子连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，非天然编码氨基酸经由生物可降解的连接子连接于水溶性聚合物。在一些实施例中，生物可降解的连接子可用于形成包含BSP的前药。在所述前药方法的一个实例中，水溶性聚合物阻断GLP-1活性，并且连接子降解释放活性GLP-1。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接子连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过聚(乙二醇)连接子或前药连接于酰基部分或酰基链。在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接于血清白蛋白。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接子连接于血清白蛋白。在一些实施例中，连接子是聚(乙二醇)或前药。在一些实施例中，连接子为双裂解前药，其中步骤1为分子(例如白蛋白)的受控释放，并且步骤2为连接子或其部分的第二裂解释放。
GLP-1多肽的另一个策略包括在存在于GLP-1分子中的两个非天然编码氨基酸之间形成分子内桥。形成桥能够增强分子的α螺旋结构，减少肽酶或蛋白酶消化，增加溶解性和/或改进多肽的PK/PD曲线。在一些实施例中，GLP-1分子包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。两个桥残基的一者可以为非天然编码氨基酸或天然编码氨基酸。两个非天然编码氨基酸或者非天然编码氨基酸与天然编码氨基酸可以通过连接子、聚合物或生物活性分子连接。两个氨基酸之间的键可以通过两个氨基酸之间的共价键。桥接中所涉及到的连接子或聚合物可以是双官能连接子或双官能聚合物。在一些实施例中，非天然氨基酸通过亲水性桥(miniPEG)连接。图6显示可以通过分子内桥连接的许多潜在组残基中的一组。在一些实施例中，在16与19或20，或者16与23；19与23或19与26；20与27；23与26或27，或者23与30；27与30或31或27与33或34；30与34位之间形成分子内桥。残基17-33形成α螺旋结构。图7显示内桥接的可能化学策略。GLP-1中的非天然编码氨基酸通过连接子、聚合物或生物活性分子连接于存在于同一多肽中的天然编码氨基酸。连接于连接子、聚合物或生物活性分子的天然编码氨基酸可能是由氨基酸替换所致。
在与任何上述策略的组合中，GLP-1多肽可以包含一个或一个以上天然氨基酸替换。在一些实施例中，GLP-1多肽包含一个或一个以上的以下替换：8A替换成G；16V替换成F或L；22G替换成E；30A替换成E；34K替换成R。在一些实施例中，GLP-1多肽包含一个或一个以上的以下替换：8A替换成V或8A替换成S。在一些实施例中，GLP-1多肽包含一个或一个以上经半胱氨酸的替换。在一些实施例中，GLP-1多肽包含一个或一个以上在第17位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位、第23位、第24位、第25位、第26位、第27位、第28位、第29位、第30位、第31位、第32位、第33位或其任何组合的位置处经半胱氨酸的替换。在一些实施例中，化学反应性半胱氨酸结合于水溶性聚合物或酰基部分。在一些实施例中，GLP-1多肽包含一个或一个以上在螺旋的非保守面内残基处的亲水性氨基酸替换。
实例2
本实例详细描述包括非天然编码氨基酸的BSP在大肠杆菌中的表达。举例来说，GLP-1分离和GLP-1在宿主细胞中的产生描述于美国专利第5,118,666号中，其以引用的方式并入本文。
将包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的经引入的翻译系统用于表达含有非天然编码氨基酸的BSP。O-RS优先氨酰化具有非天然编码氨基酸的O-tRNA。翻译系统又响应于经编码选择密码子将非天然编码氨基酸插入BSP中。
表2：O-RS和O-tRNA序列
| SEQ ID NO：4 | 甲烷球菌mt RNACUA Tyr | tRNA |
| SEQ ID NO：5 | HLAD03；最优化琥珀抑制基因tRNA | tRNA |
| SEQ ID NO：6 | HL325A；最优化A GGA移码抑制基因tRNA | tRNA |
| SEQ ID NO：7 | 用于并入对叠氮基-L-苯丙氨酸p-Az-PheRS(6)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：8 | 用于并入对苯甲酰基-L-苯丙氨酸p-BpaRS(1)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：9 | 用于并入炔丙基-苯丙氨酸Propargyl-PheRS的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：10 | 用于并入炔丙基-苯丙氨酸Propargyl-PheRS的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：11 | 用于并入炔丙基-苯丙氨酸Propargyl-PheRS的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：12 | 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(1)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：13 | 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(3)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：14 | 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(4)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：15 | 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸p-Az-PheRS(2)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：16 | 用于并入对乙酰基-苯丙氨酸(LW1)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：17 | 用于并入对乙酰基-苯丙氨酸(LW5)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：18 | 用于并入对乙酰基-苯丙氨酸(LW6)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：19 | 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸(AzPheRS-5)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
| SEQ ID NO：20 | 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸(AzPheRS-6)的氨酰基tRNA合成酶 | RS |
用含有经修饰BSP基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(特异于所需非天然编码氨基酸)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码氨基酸位点特异性并入BSP中。在37℃下在含有0.01-100mM特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌高保真度且有效地表达经修饰BSP。由大肠杆菌宿主细胞产生含有非天然编码氨基酸的His标签(His-tagged)BSP为包涵体或聚集体。溶解聚集体，并且在变性条件下在6M盐酸胍中亲和纯化。通过在4℃下在50mM TRIS-HCl(pH8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)Sarkosyl中隔夜透析来进行重新折叠。随后将所述物质对20mM TRIS-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2透析，接着移除His标签(His-tag)。参看Boissel等人，(1993)268：15983-93。纯化BSP的方法为所属技术领域熟知，并且由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-离子化离子阱质谱法等证实。
图8显示用于GLP-1表达的构建体。设计引物对以获得具有侧翼BamHI和HindIII位点的GLP-1插入体。将GLP-1引物退火并且连接于经BamHI-HindIII消化的表达载体中。表达载体包含T7启动子、N端His标签和位于GLP-1插入体上游的编码TrpLE前导多肽序列的多聚核苷酸。图8显示为SEQ ID NO：25的TrpLE前导多肽序列。多聚核苷酸插入物可能编码或可能不编码GLP-1序列N端的氨基酸蛋氨酸。构建体包括(但不限于)编码Y19、Q23、K26、E27或A30位非天然编码氨基酸替换的GLP-1多聚核苷酸序列。GLP-1多肽也可以包含一个或一个以上天然氨基酸替换。
实例3
本实例详述含羰基氨基酸的引入和随后与含氨氧基PEG的反应。
本实例示范产生并入有含酮非天然编码氨基酸的BSP的方法，其中所述BSP随后与大约5,000MW的含氨氧基PEG反应。举例来说，根据实例1的标准所鉴别的GLP-1的各残基或根据实例32的标准所鉴别的T-20的各残基分别由具有以下结构的非天然编码氨基酸替换：
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入GLP-1中的序列为任何实例1中所述的那些和上文实例2中所述的SEQ ID NO：4(muttRNA，M.jannaschii 
)和16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性并入T-20的序列为任何实例32中所述的那些和上文实例2中所述的SEQ ID NO：4(muttRNA，M.jannaschii 
)和16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。
一旦经修饰，包含含羰基氨基酸的BSP变体即与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，其中R为甲基，n为3且N大约为5,000MW。将溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH6.0)、25mM Hepes(SigmaChemical，St.Louis，MO)(pH7.0)或溶解于10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH4.5)中的含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化BSP(10mg/mL)与10至100倍过量的含氨氧基PEG反应，并接着在室温下搅拌10-16小时(Jencks，W.J.Am.Chem.Soc.1959，81，第475页)。随后将PEG-BSP稀释至适当缓冲液中，进行立即纯化和分析。
实例4
与由经酰胺键连接于PEG的羟胺基团组成的PEG结合。
使用实例3中所述的过程将具有以下结构的PEG试剂偶联于含酮非天然编码氨基酸：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R＝甲基，n＝4且N大约为20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。
实例5
本实例详述将两个独特非天然编码氨基酸引入BSP中。
本实例示范产生并入有非天然编码氨基酸的GLP-1多肽的方法，其中所述非天然编码氨基酸在两个根据实例1所鉴别的残基中的位置处包含酮官能团，其中X*表示非天然编码氨基酸。如实例1和2中所述制备GLP-1多肽，除了在核酸内的两个独特位点处引入选择密码子。本实例示范产生并入有非天然编码氨基酸的T-20多肽的方法，其中所述非天然编码氨基酸在两个根据实例32所鉴别的残基中的位置处包含酮官能团，其中X*表示非天然编码氨基酸。如实例32和33中所述制备T-20多肽，除了在核酸内的两个独特位点处引入选择密码子。
实例6
本实例详述BSP与含酰肼PEG的结合，和随后的原位还原。
根据实例2和3中所述的过程制备并入有含羰基氨基酸的GLP-1多肽，或者根据实例32和33中所述的过程制备并入有含羰基氨基酸的T-20多肽。一旦修饰之后，具有以下结构的含酰肼PEG即与GLP-1或T-20多肽结合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000MW且X为羰基(C＝O)。将溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH6.0)、溶解于25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH7.0)或溶解于10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH4.5)中的含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化GLP-1(0.1-10mg/mL)与1至100倍过量含酰肼PEG反应，并且通过加入1M原料NaCNBH3(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(溶解于H2O中)至10-50mM终浓度来原位还原相应腙。在黑暗中4℃至RT下反应18-24小时。通过在pH7.6下加入1M Tris(Sigma Chemical，St.Louis，MO)至50mM Tris终浓度来终止反应，或者将反应稀释于适当缓冲液中以用于立即纯化。
实例7
本实例详述将含炔氨基酸引入BSP中，和用mPEG-叠氮进行衍生化。
任何根据实例1(GLP-1)或实例32(T-20)所鉴别的残基各经以下非天然编码氨基酸替换：
用于位点特异性将对炔丙基-酪氨酸并入GLP-1的序列为SEQ ID NO：2(GLP-1)、SEQ ID NO：4(muttRNA，M.jannaschii 
)和上文实例2中所述的9、10或11。在大肠杆菌中表达含有炔丙基酪氨酸的GLP-1多肽，并且使用实例3中所述条件纯化。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性并入T-20的序列为SEQ ID NO：22或24和SEQ IDNO：4(muttRNA，M.jannaschii 
)和上文实例2中所述的9、10或11在大肠杆菌中表达含有炔丙基酪氨酸的T-20多肽，并且使用实例3中所述条件纯化。
将溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH＝8)的含有炔丙基-酪氨酸的经纯化GLP-1或T-20(0.1-10mg/mL)和10至1000倍过量的含叠氮PEG添加至反应混合物中。随后将催化量的CuSO4和Cu线添加至反应混合物中。在温育(包括(但不限于)室温或37℃下约4小时，或4℃下隔夜)混合物之后，加入H2O，并且将混合物经透析膜过滤。通过(包括(但不限于))与实例3中所述相似的过程分析样品以用于添加。
在本实例中，PEG具有以下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。
实例8
本实例详述由炔丙基酪氨酸替换BSP中大的、疏水性氨基酸。
如实例7所述，存在于GLP-1或T-20中的Phe、Trp或Tyr残基由以下非天然编码氨基酸替换：
一旦修饰之后，PEG即连接于包含含炔氨基酸的BSP变体。PEG将具有以下结构：Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3，并且偶联过程将遵循实例7中所述。这可以产生包含非天然编码氨基酸的BSP变体，所述非天然编码氨基酸与一种天然发生、大疏水性氨基酸大致同配位(isosteric)，并且在多肽内的独特位点处经PEG衍生物修饰。
实例9
本实例详述通过一个或一个以上PEG连接子所分开的BSP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体的产生。
实例7中所产生的含炔BSP变体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
其中n为4且PEG具有大约为5,000的平均MW，以产生对应BSP同源二聚体，其中两个BSP分子由PEG物理位置上分开。BSP能够以类似方式偶联于一个或一个以上其它多肽以形成异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。如实例7和3中所述进行偶联、纯化和分析。
实例10
本实例详述将糖部分与BSP偶联。
如实例3中所述，一个以下所述残基由下面的非天然编码氨基酸替换：19、23、26、27、28、29、30或33(如SEQ ID NO：1、2、3、21中，或者其它GLP-1多肽中的相应氨基酸)。或者，如实例3中所述，一个T-20残基由以下非天然编码氨基酸替换。
一旦经修饰，包含含羰基氨基酸的BSP变体即与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β连接氨氧基类似物反应。将BSP变体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM)在100mM乙酸钠水缓冲液(pH5.5)中混合，并且在37℃下温育7至26小时。通过在周围温度下用在150mM HEPES缓冲液(pH7.4)中的UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖酰基转移酶(galacytosyltransferase)(0.4单位/毫升)温育经糖结合的BSP(5mg/mL)来将第二糖酶法偶联于第一糖(Schanbacher等人，J.Biol.Chem.1970，245，5057-5061)。
实例11
本实例详述PEG化BSP拮抗剂的产生。
如实例3所述，GLP-1残基19、23、26、27、28、29、30或33中的一个残基由以下非天然编码氨基酸替换。
一旦经修饰，包含含羰基氨基酸的BSP即与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应：R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，(其中R为甲基，n为4且N为20,000MW)以产生包含非天然编码氨基酸的BSP拮抗剂，其中所述非天然编码氨基酸在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰。如实例3进行偶联、纯化和分析。
实例12
其中BSP分子是经直接连接的BSP同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体和异源多聚体的产生。
包含含炔氨基酸的GLP-1变体可以直接偶联于包含含叠氮基氨基酸的另一GLP-1变体，各GLP-1变体包含(但不限于)在实例1中所述的位点处的非天然编码氨基酸替换。GLP-1多肽能够以类似方式偶联于一个或一个以上其它多肽以形成异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。如实例3、6和7进行偶联、纯化和分析。
包含含炔氨基酸的T-20变体可以直接偶联于包含含叠氮基氨基酸的另一T-20变体，各T-20变体包含(但不限于)在实例32中所述的位点处的非天然编码氨基酸替换。T-20多肽能够以类似方式偶联于一个或一个以上其它多肽以形成异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。如实例3、6和7进行耦偶联、纯化和分析。
实例13
PEG-OH+Br-(CH2)n-C≡CR’→PEG-O-(CH2)n-C≡CR’
A B
聚烷撑二醇(P-OH)与烷基卤(A)反应形成醚(B)。在这些化合物中，n为1至9的整数，且R′可以为直链或支链、饱和或不饱和C1至C20烷基或杂烷基。R′也可以为C3至C7饱和或不饱和环烷基或环状杂烷基、经取代或未经取代芳基或杂芳基，或经取代或未经取代烷芳基(烷基为C1至C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。PEG-OH通常为具有800至40,000道尔顿(Da)分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例14
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH
用在THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后向所述溶液中加入溶解于二甲苯中所形成的80重量％炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich)和催化量的KI，并且将所得混合物加热回流2小时。随后加入水(1mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入至乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用若干份冷乙醚洗涤，并干燥，得到炔丙基-O-PEG。
实例15
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用于THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后向混合物中加入50当量5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量KI。将所得混合物加热至回流16小时。随后加入水(1mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并且将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入至乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用若干份冷乙醚洗涤，并干燥得到对应炔。5-氯-1-戊炔可以用在相似反应中。
实例16
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
向3-羟基苄醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中首先加入粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，接着加入溶于二甲苯中所形成的80重量％炔丙基溴溶液(3.36mL，30mmol)。将反应混合物加热至回流6小时。向混合物中加入10％柠檬酸(2.5mL)，并且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并后的有机层，MgSO4干燥并浓缩得到3-炔丙氧基苄醇。
0℃下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入化合物3(2.0g，11.0mmol)的CH2Cl2溶液中，并将反应置于冰箱中16小时。通常反应生成浅黄色油状甲磺酸酯。将所述油(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热至回流1小时，并接着冷却至室温。向混合物中加入水(2.5mL)，并在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并后的有机层，无水Na2SO4干燥并浓缩得到所需溴化物。
将mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中，并且在冰浴中冷却溶液。伴随剧烈搅拌在数分钟内加入NaH(6mg，0.25mmol)，接着加入上述所获的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量KI。移除冷却浴，并将所得混合物加热至回流12小时。向混合物中加入水(1.0mL)，并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中生成白色沉淀物，收集白色沉淀物产生PEG衍生物。
实例17
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C＝CR’→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR’
如上文所述，也可以通过将含有末端官能团的聚(乙二醇)聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶联来获得含末端炔的聚(乙二醇)聚合物。n介于1与10之间。R′可以为H或Cl至C4的小烷基。
实例18
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)，并且在室温下隔夜搅拌溶液。将所得粗NHS酯7在未经进一步纯化下用于以下反应。
将具有5,000Da分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中，并且将混合物冷却至4℃。伴随剧烈搅拌逐份加入NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时使其温热至室温。随后加入水(2mL)，并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(50mL)，并且分离有机层，无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入至乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，并真空中干燥。
实例19
本实例是关于聚(乙二醇)的甲烷磺酰基酯的制备，聚(乙二醇)的甲烷磺酰酯也可以称为聚(乙二醇)的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯。可以通过相似过程制备对应甲苯磺酸酯和卤化物。
mPEG-OH+CH3SO2Cl+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
在氮气下将于150mL甲苯中的mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)共沸蒸馏2小时，并且将溶液冷却至室温。向溶液中加入40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)。在冰浴中冷却溶液，并且逐滴加入1.2mL经蒸馏甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下室温下隔夜搅拌溶液，并且通过加入2mL无水乙醇来终止反应。在真空下蒸发混合物以移除主要是除甲苯之外的溶剂，过滤，再在真空下浓缩，并接着于100mL乙醚中沉淀。用数份冷乙醚洗涤滤出液，并且在真空中干燥以生成甲磺酸酯。
将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中，并且将溶液冷却至4℃。向冷溶液中加入叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下将反应加热至回流2小时。随后蒸发溶剂，并且用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机份，并且用无水MgSO4干燥。将体积减少到20ml，并通过加入150ml冷无水乙醚中而沉淀出产物。
实例20
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可以使用美国专利5,998,595中所述方法生成4-叠氮基苄醇，所述专利以引用的方式并入本文。0℃下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入到4-叠氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)的CH2Cl2溶液中，并将反应置于冰箱中16小时。通常反应生成浅黄色油状甲磺酸酯。将所述油(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中，并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热至回流1小时，并接着冷却至室温。向混合物中加入水(2.5mL)，并在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物，并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并后的有机层，无水Na2SO4干燥并浓缩得到所需溴化物。
用于THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)，并且向混合物中加入溴化物(3.32g，15mmol)以及催化量K1。将所得混合物加热至回流12小时。向混合物中加入水(1.0mL)，并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)，并分离有机层，经无水Na2SO4干燥，并将体积减少至大约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中生成沉淀物，收集沉淀物产生mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW 3,400Da，2.0g)溶解于NaHCO3(10mL)饱和水溶液中，并且将溶液冷却至0℃。伴随剧烈搅拌加入3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(5当量)。3小时之后，加入20mL H2O，并且在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节至3，并且加入NaCl至大约15重量％浓度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀之后，过滤收集产物，并且在真空下干燥生成ω-羧基-叠氮PEG衍生物。
实例22
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
伴随剧烈搅拌，向如所属技术领域已知制备并冷却至-78℃的乙炔化锂(4当量)的THF溶液中逐滴加入溶于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时之后，使反应温热至室温，并且通过加入1mL丁醇来终止。随后加入20mL H2O，并且在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节至3，并且加入NaCl至大约15重量％浓度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀之后，过滤收集产物，并且在真空下干燥生成1-(丁-3-炔氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例23
使用以下文献中所述的方法将含叠氮和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白中：L.Wang等人，(2001)，Science292：498-500，J.W.Chin等人，Science 301：964-7(2003))，J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，Chem Bio Chem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024：和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem. Comm.，11。一旦并入氨基酸之后，即在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg Cu线存在下于37℃下用于磷酸盐缓冲液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白进行环加成反应4小时。
实例24
本实例描述测量包含非天然编码氨基酸的GLP-1和PEG化GLP-1的活体外和活体内活性的方法。
许多测定可以用于监控本发明GLP-1多肽的活性。肽激素(例如GLP-1)活化特异性D蛋白偶联受体，并且因此可以通过检测GLP-1受体依赖性cAMP形成的测定来评价本发明的GLP-1多肽。可以通过各种方法测量下游细胞内cAMP产生，这些方法包括(但不限于)比色法、荧光法、时间分辨荧光法(time-resolved fluorescence)或FP法。大鼠胰岛瘤来源的RIN-m5F细胞具有偶联于腺苷酸环化酶的内源GLP-1受体(Fehmann等人，Mol Cell Endocrinol 85：C39-C44；Goke等人Res Exp Med(Berl).1989；189(4)：257-64)，并且可用于测量受体活化后的cAMP。相似地，可以使用仓鼠HIT-T15细胞(ATCC，Manassas，VA)或大鼠BRIN-BD11β细胞(Green等人J MolEndocrinol.2003年12月；31(3)：529-4)。
或者，可以在经重组hGLP-1受体转染的细胞中(包括(但不限于)CHO(Kim等人2003 Diabetes 52：751-59)、BHK(幼年仓鼠肾脏；Knudsen等人2000 J.Med.Chem.43：1664-1669)和CHL(中国仓鼠肺)细胞)，或者原初细胞，例如从大鼠、小鼠或仓鼠分离的胰岛细胞中测量cAMP产生。可以如Thorens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89(18)：8641-5或美国专利第5,670,360号和第6,051,689号中所述制备GLP-1受体，所述文献以引用的方式并入本文。可以将福斯高林(EMD Biosciences，San Diego，CA)、腺苷酸环化酶活化剂和腺苷酸环化酶抑制剂、PI3K、MAPK或p38用作测定对照。激动剂对照包括GLP-1(7-37)和exendin-4-有效GLP-1受体激动剂，并且拮抗剂对照包括GLP-1受体拮抗剂Exendin(9-39)(购自Bachem AG)。画出每个所测试化合物的剂量应答曲线，并且计算EC50值。或者，可以通过其它测定来测量cAMP。这些测定通常是所属技术领域所熟知的。
胰岛素分泌也是测量本发明GLP-1多肽的生物活性的指标。可以在用各种浓度的GLP-1多肽和葡萄糖培育后的细胞中通过RIA或ELISA来计算胰岛素分泌的活体外研究。Green等人(上文)评价了GLP-1多肽在大鼠BRIN-BD11β细胞中的促胰岛素作用。或者，大鼠胰岛可用于胰岛素分泌研究中(Goke等人，J.Biol.Chem.1993268(26)19650-19655)。
或者，可以使用例如XTT或BrdU的试剂来测量β岛细胞生长。也可以进行用CRE报告子测定测量CREB(环状AMP反应元件结合蛋白)转录因子的活体外测定。
可以通过使用BIAcoreTM生物感应器(Pharmacia)来测量包含非天然氨基酸的GLP-1多肽与其受体的亲和力。可以使用调节生长或结合GLP-1的细胞或细胞系(包括(但不限于)含有活性GLP-1受体的细胞，例如人细胞，或重组GLP-1受体产生细胞)来监控GLP-1受体结合。举例来说，可以使用调节生长或结合GLP-1的细胞或细胞系(包括(但不限于)含有活性GLP-1受体的细胞，例如人细胞，或重组GLP-1受体产生细胞)来监控GLP-1受体结合。
或者，也可以使用经重组hGLP-1受体转染的细胞(包括(但不限于)CHO、BHK(幼年仓鼠肾脏)和CHL(中国仓鼠肺纤维原细胞)细胞)来测量结合。参看，Kim等人(上文)在经转染CHO细胞中所进行的结合研究，和Green等人J Mol Endocrinol.2003年12月；31(3)：529-40在经转染CHL细胞中所进行的研究。可以如Thorens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89(18)：8641-5或美国专利第5,670,360号和第6,051,689号中所述制备GLP-1受体，所述文献以引用的方式并入本文。
可以通过液相色谱/质谱(LC/MS)或通过其它方法监控由DPP IV或人血浆对本发明GLP-1多肽的降解。可以用DPP IV或0、6或12小时所汇集的人血浆和在分析之前添加以终止任何酶学反应的试剂(例如TFA)来培育本发明的GLP-1肽。所有引用的参考文献均以引用的方式并入本文。
细胞结合测定
在有或无各种浓度(体积：10μl)未经标记GLP-1、GLP-1或GLP-1类似物存在下，且在125I-GLP-1(大约100,000cpm或1ng)存在下，于0℃下在PBS/1％BSA(100μl)中培养细胞(3×106)90分钟(总体积：120μl)，并进行一次重复。随后将细胞重悬于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS中，并分层，并且离心(1000g；1分钟)。通过切掉离心管的末端来收集离心小块，并且分别在γ计数器(Packard)上分别计数离心小块和上清液。
将特异性结合(cpm)确定为在无竞争者存在下的总结合(双份平均值)减去100倍过量未经标记GLP-1存在下的结合(非特异性结合)(cpm)。对所使用的各细胞类型测量非特异性结合。使用同一125I-GLP-1制剂在不同天中进行实验，并且应当显示内部一致性。125I-GLP-1证实与细胞结合。未经标记天然GLP-1或GLP-1，而不是阴性对照以剂量依赖性方式抑制结合。GLP-1竞争结合天然125I-GLP-1(与天然GLP-1相似)的能力表明，受体同样识别这两种形式。
PEG化GLP-1的活体内研究
对小鼠或大鼠投与PEG-GLP-1、未经修饰GLP-1和缓冲溶液。结果将显示与未经修饰GLP-1相比，本发明的PEG化GLP-1的极佳活性和延长的半衰期，这由血糖显著降低所指示。
用于测试GLP-1活性的活体内动物模型包括描述于美国专利申请公开案第20040082507A1号和第20030232754A1号中的那些，所述专利案以引用的方式并入本文。
经结合和非结合GLP-1及其变体的活体内半衰期的测量
使用雄性Sprague Dawley大鼠(约7周龄)。在投药当天，测量各动物的重量。将每千克体重100μg非结合和经结合GLP-1样品各自经静脉内注射至三只大鼠的尾部静脉中。在注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时，在CO2麻醉下从每只大鼠抽出500μl血液。将血液样品储存在室温下不超过1.5小时，接着离心(4℃，18000×g 5分钟)分离血清。将血清样品储存在-80℃下直至分析当天。通过在冰上融解样品之后GLP-1的活体外活性测定来定量血清样品中活性GLP-1的量。
动物模型
可用于评价本发明GLP-1肽的动物模型包括(但不限于)：肥胖Zucker(fa/fa；ZDF)大鼠、ob/ob小鼠和db/db小鼠。可以通过单基因隐性遗传产生这些模型(Bray，G.A.1977.Fed Proc.36：148-153；Bray，G.A.和D.A.York.1979.Physiol.Rev.51：598-646；Kasiske，B.L.等人1992.Hypertension 19增刊I：I110-I115；Bray，G.A.1992.Am.J.Clin.Nutr.55增刊488S-494S)。GLP-1受体剔除(GLP-1R-/-)小鼠也可以用于动物研究中以展示本发明GLP-1分子的葡萄糖降低作用依赖于功能性GLP-1受体。(美国专利第5,846,937号，Scrocchi等人1996 Nat Med.1996年11月；2(11)：1254-8，Scrocchi等人Diabetes 199645：21 A)并与野生型小鼠比较以确定葡萄糖耐受性。Young等人Diabetes 199948：1026-1034描述在肥胖Zucker(fa/fa)大鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠和糖尿病恒河猴中比较未经修饰GLP-1与Exendin-4的研究。
db/db小鼠是遗传肥胖和糖尿病种的小鼠。db/db小鼠伴随其肥胖发展而发展出高血糖症和高胰岛素血症，并且因此充当肥胖2型糖尿病(NIDDM)的模型。这些小鼠的关键表型特征在于其为肥胖、高血糖、高胰岛素和胰岛素抗性。db/db小鼠可以购自JacksonLaboratories(Bar Harbor，Maine)。Zucker糖尿病肥胖fa/fa(ZDF)大鼠是胰岛素依赖型，但是在出生时血糖量正常，并且在约第7周龄至第10周龄发展出糖尿病。在过渡期内，动物经葡萄糖耐量降低的状态。尽管在糖尿病开始前和糖尿病的早期阶段期间动物为高胰岛素，但是随后其丧失葡萄糖刺激的胰岛素分泌并且最终变为几乎完全缺乏胰岛素(insulinopenic)。这些大鼠的关键表型特征在于其为肥胖、高血脂、高胰岛素、胰岛素抗性和高胆固醇。
对db/db或ob/ob小鼠给予包含非天然编码氨基酸的GLP-1肽或作为对照的未经修饰的GLP-1或作为比较剂的exendin-4。以每剂量0.1微克皮下投与化合物，并且比较两个群体之间的血糖、胰高血糖素和血液胰岛素、体重降低和食欲减退作用。结果将显示与exendin-4相比，本发明GLP-1肽的极佳活性和延长的半衰期。
在急性和慢性研究中，对Zucker肥胖大鼠给予包含非天然编码氨基酸的GLP-1肽或作为对照的未经修饰的GLP-1或作为比较剂的exendin-4。在急性研究中，测量对葡萄糖和胰岛素含量影响的持续时间。在慢性研究中，监控这些大鼠的减少的食物摄取、体重和HbAlc含量。结果显示与exendin-4相比，本发明GLP-1肽在较低频率给药下的极佳活性和延长的半衰期。
实例31
包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1的安全性和/或功效的人类临床试验
目的 比较经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的PEG化重组人GLP-1与exendin-4的安全性和药物动力学性质。
患者 本研究招募了18名20-40岁年龄和60-90kg之间体重的健康志愿者。这些受检者无任何临床显著异常的血液学或血清化学的实验值，和阴性尿毒性筛选、HIV筛选和乙肝表面抗原。他们不应当具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液病史；显著肝、肾、心血管、胃肠、泌尿生殖系统、代谢系统、神经系统疾病史；贫血或抽搐病史；已知对细菌或哺乳动物来源产物、PEG或人血清白蛋白过敏；习惯和严重依赖含有咖啡因的饮料；参与任何其它临床试验或在研究登记30天内输血或献血；在研究登记三个月内暴露于GLP-1；在研究登记7天内患有疾病；以及在研究登记14天内在研究前体检中或临床实验评估中具有显著异常情况。可对所有受检者评估安全性，并且根据进程收集所有血液收集物用于药物动力学分析。所有研究是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。
研究设计 是在健康男性志愿者中所进行的I期、单中心、开放标记、随机、两阶段交叉(two-period crossover)研究。将18名受检者随机分为两个治疗顺序组(9名受检者/组)。经两个单独给药阶段，在上部大腿使用等剂量的包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1和exendin-4以皮下快速注射的方式投与GLP-1。exendin-4的投药剂量和频率如包装标签中所说明。通过包括进附加受检者组而将使用市售制品的附加给药、给药频率或其它所需参数增加到本研究中。各给药阶段由14天清洗期(washout period)隔开。将受检者在两个给药阶段的每一个给药阶段之前至少12小时至给药之后72小时限定在研究中心，而不是在给药阶段之间。如果还存在对PEG化BSP所要测试的附加给药、频率或其它参数，则可以加入其他受检者组。本研究中可以使用经批准可为人类使用的GLP-1的多种制剂。GLP-1的实验制剂是包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1。
血样采集 通过在投与GLP-1之前和之后直接刺破静脉来抽出连续血液。用于测定血清GLP-1浓度的静脉血液样品(5mL)是在给药之前约30、20和10分钟(3个基线样品)以及在给药之后大约30分钟和1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小时取得。将各血清样品分为两等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。将血清样品置于干冰上装运。在第一天初次给药即刻之前、第4天早晨、第16天给药即刻之前以及第19天早晨进行快速临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 ELISA试剂盒过程(Linco Research Co.)用于测定血清GLP-1浓度。
安全性测定 在各次给药即刻之前(第1天和第16天)和在各次给药后6、24、48和72小时记录生命指征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型，以及临床实验测试偏离基线的变化。此外，评价生命指征测量结果(包括血压)和体检结果中与研究前相比的变化。
数据分析 通过从各给药后值减去平均基线GLP-1浓度来针对给药前基线GLP-1浓度修正给药后血清浓度值，其中所述平均基线GLP-1浓度是通过计算给药之前30、20和10分钟所收集的三份样品的GLP-1含量的平均值而得以确定。如果给药前血清GLP-1浓度低于本测定的定量含量，则将这些数据排除在平均值的计算之外。由针对基线GLP-1浓度修正的血清浓度数据确定药物动力学参数。通过使用最新版本BIOAVL软件在Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统上的模型独立方法来计算药物动力学参数。确定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；达到峰值血清浓度的时间(tmax)；借助线性梯形法则所计算的浓度-时间曲线(AUC)下从0至最后血液采样时间(AUC0-72)的面积；和从消除率常数所计算的末期消除半衰期(t1/2)。通过对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区中连续数据点的线性回归来估计消除率常数。计算各治疗的药物动力学参数的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保留制剂/非保留制剂)。
安全性结果 整个治疗组中不利事件的发生率均等分布。不存在任何偏离基线或研究前临床实验测试或血压的临床显著变化，并且体检结果和生命指征测量结果与研究前相比无显著变化。两治疗组的安全性曲线类似。
药物动力学结果 将各测量时间时，所有18名受检者中接受单次剂量的一种或一种以上可用GLP-1之后的平均血清GLP-1浓度-时间曲线(未对基线GLP-1含量修正)与包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1进行比较。所有受检者均应当具有在正常生理范围内的给药前基线GLP-1浓度。从对给药前平均基线GLP-1浓度修正的血清数据确定药物动力学参数，并且确定Cmax和tmax。GLP-1的平均tmax显著短于包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1的tmax。与包含非天然编码氨基酸的PEG化BSP的末端半衰期相比，所测试的市售BSP制品的末端半衰期显著较短。
尽管本研究是在健康男性受检者中进行，但是相似吸收特征和安全性曲线也应当是在其他患者群体中所预期的；例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者，儿科肾衰竭患者，自体储血项目(autologous predeposit program)中的患者或安排进行择期手术的患者。
总之，皮下投与单次剂量的包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1将是安全的，并且由健康男性受检者充分耐受。基于不利事件发生率、临床实验值、生命指征和体检结果的比较，GLP-1和包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1的安全曲线等同。包含非天然编码氨基酸的PEG化GLP-1可能对患者和卫生保健医疗人员提供很大的临床效用。
实例32
本实例描述用于选择将非天然编码氨基酸并入T-20的优选位点的许多潜在标准组中的一组。
本实例证实如何选择T-20多肽中用于引入非天然编码氨基酸的优选位点。本实例中所用的序列编号方式是根据T-20(SEQ ID NO：22)和TEX(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列。TEX是T-20的N端延伸多肽。除非另外说明，否则所引用的位置编号是基于T-20肽的638-673和TEX肽的630-673。举例来说，第639位对应SEQ ID NO：22中第二氨基酸。所属领域技术人员应了解，可以在SEQ ID NO：24或任何其它T-20分子中轻易地确定对应于SEQ ID NO：22中位置的氨基酸位置。
根据W.Shu，J.Liu，H.Ji，L.Rading，S.Jiang，M.Lu，Helical Interactions in the HIV-1gp41 Core Reveal Structural Basis for the Inhibitory Activity of gp41 Peptides(Biochemistry39：1634(2000)进行T-20潜在α螺旋结构的建模。以下标准用于评价用于引入非天然编码氨基酸的T-20的各位置：残基(a)不应该受丙氨酸扫描突变的影响，(b)基于建模应该表面暴露并且展示与周围残基的最小范德华力或氢键互作，(c)可以为可变或非必需而不影响T-20变体中的活性，(d)在用非天然编码氨基酸替换之后应产生保守性替换，并且(e)可以发现于高度柔性区域中或结构刚性区域中。此外，采用Cx程序(Pintar等人(2002)Bioinformatics，18，第980页)对T-20分子进行进一步计算以评价肽中各蛋白原子的突出程度。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在T-20(包括TEX)中任何位置、在第一氨基酸之前、羧基端添加或其任何组合处并入。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在T-20(包括TEX)中的任何位置处并入，其包括(但不限于)如下残基：W631、D632、I635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651或其任何组合。
实例33
用生物合成方法制造T-20和TEX的克隆策略
图9A显示经设计以将非天然编码氨基酸并入T-20多肽内和并入在N端延伸的T-20多肽(TEX)内的示范性构建体。使用HIV前病毒DNA扩增编码T-20和TEX的序列，包括肽产物N端的蛋氨酸。用于由HIV前病毒DNA扩增T-20序列的引物是F-T20 5′AAGCTT TGG ATG TAG ACA AGT TTA ATA CAC TCC3′(SEQ ID NO：26)和R-T20 5′GCGGAT CCC ATT AAA ACC AAT TCC ACA AAC TTG C3′(SEQ ID NO：27)。用于由HIV前病毒DNA扩增TEX序列的引物是F-EXT20 5′CG AAG CTT TGG ATG GAG TGG GATAGA GAA ATT AAC AAT TAC ACA AGT TTA ATA CAC TCC3′(SEQ ID NO：28)和R-T20(SEQ ID NO：27)。F-T20和F-EXT20含有用于克隆的HindIII限制性位点，并且R-T20含有用于克隆的BamHI位点。
以顺读(in frame)方式将T-20和TEX序列克隆进含有TrpLE融合伴侣(FP)和在融合伴侣N端的九组氨酸标签的表达载体中。
图10显示野生型T-20与TEX序列的比较。使用上述引物扩增gp41七重复2(HR2)的对应DNA区来产生延伸形式的肽T-20(TEX)。TEX在N端比T-20长8个氨基酸，提供44个氨基酸长度的多肽。TEX对应HIVNL4-3跨膜蛋白(TM)的630至673位氨基酸。T-20对应HIVNL4-3跨膜蛋白(TM)的638至673位氨基酸。
用生物合成方法产生的T20和TEX肽类似物的纯化
在细菌内用生物合成方法产生所得融合肽。表达正交tRNA及其特异性正交氨酰基tRNA合成酶以进行T-20或TEX构建体的抑制。为了避免细菌细胞质中蛋白的降解，通过将融合肽引入包涵体(IB)中来发生表达。将含有融合肽的IB重悬于含有10μg/ml溶菌酶和10μg/ml DNase的包涵体重悬缓冲液(IBRB；50mM Tris，pH7.5，200mM NaCl，2mM EDTA)中。重悬液六轮超声波处理之后，离心样品以旋转沉淀离心小块。通过用含有1％ Triton X-100的包涵体洗涤缓冲液(50mM Tris，pH7.5，30mM NaCl，1mMEDTA)超声波处理并且在洗涤之间离心来洗涤IB离心小块四次以消除残余污染物。接着通过用包涵体洗涤缓冲液(50mM Tris，pH7.5，100mM NaCl，1mM EDTA)超声波处理并且在洗涤之间离心来洗涤IB离心小块两次。将离心小块溶解于胍盐结合缓冲液(pH7.8)(6 M胍盐酸盐，20mM NaPO4，pH7.8，500nM NaCl)中，并且结合于经平衡的ProBond树脂以用于融合肽的His标签纯化。用胍盐结合缓冲液(pH7.8)洗涤树脂两次；用胍盐洗涤缓冲液(pH6.0)(6 M胍盐酸盐，20mM NaPO4，pH6.0，500nM NaCl)洗涤两次；并且用胍盐洗涤缓冲液(pH5.3)(6 M胍盐酸盐，20mM NaPO4，pH5.3，500nM NaCl)洗涤两次。用胍盐洗脱缓冲液(pH4.0)(6 M胍盐酸盐，200mM 乙酸，20mMNaPO4(pH4)，500nM NaCl)洗脱His标签结合融合肽。
冻干样品之前，使用PD-10脱盐柱用含有10％甲酸的胍盐洗脱缓冲液进行缓冲液交换。冻干之后，接着将样品重悬于70％甲酸中进行隔夜溴化氰(CNBr)裂解。由于CNBr特异性地将C端裂解成蛋氨酸，因此用CNBr裂解允许T-20或TEX从其融合伴侣分离，并且进一步经纯化以获得纯肽，以用于在抗病毒活性测定中进行测试。图9，B中泳道4显示CNBr处理的裂解产物。用箭头指示T-20和融合伴侣(FP)。如下装载其它泳道：泳道1-标示，泳道2-诱导前，泳道3-诱导后。
用CNBr裂解之后，冻干样品并且重悬于8M尿素中，并经制备型HPLC分离。将样品在C8 prep HPLC柱上跑样以纯化去除残余CNBr。冻干产物，并接着重悬于胍盐结合缓冲液(pH7.8)中。将已溶解的产物结合于经平衡的ProBond Resin，并且收集流出液(flow through)。接着将样品在C8 prep HPLC柱上跑样以纯化T-20或TEX，并冻干。接着将经纯化的肽重悬于以下缓冲液中：22.5mg/ml甘露醇，2.39mg/ml碳酸钠，pH9。
突变以修饰T20和TEX
将选择密码子引入编码T-20和TEX类似物肽的多聚核苷酸中以在指定保守位置处并入非天然编码氨基酸。根据HIV融合期间6螺旋束形成的公开晶体结构，选择各选择密码子的位置。根据厂商说明(Stratagene)通过QuickChange突变来引入选择密码子，并且通过各单独突变体的测序来证实。
用编码经非天然编码氨基酸替换的选择密码子产生T-20的五个不同构建体。图10显示由经琥珀密码子替换的密码子所编码的T-20的五个残基图谱：苏氨酸指定为T20639；丝氨酸指定为T20 640；亮氨酸指定为T20 641；亮氨酸指定为T20 645；且天冬酰胺指定为T20 651。
用编码经非天然编码氨基酸替换的选择密码子产生TEX的十一个不同构建体。图10也显示由经琥珀密码子替换的密码子所编码的TEX的十一个残基图谱：色氨酸指定为TEX 631；天冬氨酸指定为TEX 632；异亮氨酸指定为TEX 635；天冬酰胺指定为TEX636；天冬酰胺指定为TEX 637，酪氨酸指定为TEX 638；苏氨酸指定为TEX 639；丝氨酸指定为TEX 640；亮氨酸指定为TEX 641；亮氨酸指定为TEX 645；且天冬酰胺指定为TEX 651。图12显示在T20 651(A)和TEX 636(B)中均发生抑制。sup.是受抑制的缩写。图12，C和D显示图12，A和B中所进行的样品的Western印迹。E显示T-20(T-20-Mut651)和TEX(TEX-Mut636)中带有星号的经对乙酰基-苯丙氨酸替换的残基。
实例34
本实例描述测量包含非天然编码氨基酸的T-20的生物活性的方法。
活体外融合测定以测试T20和TEX的抗病毒活性
为了评价T20或TEX的抗病毒活性，基于单循环传染性使用融合测定。图11图示所述测定。简单来说，用两个质粒共转染293-T细胞：一个质粒仅表达HIV包膜基因(JRFL或JC2 env)，而第二个质粒表达载运荧光素酶基因以代替HIV Nef基因的经修饰的HIV前病毒DNA并且不表达其内源包膜基因(pHTV.Luc)。所述伪型env HTV-Luc病毒能够仅通过一轮感染而感染靶细胞。HIV在转染后48小时产生，并且在经转染细胞的上清液中收集。通过ELISA测量p24gag来进行病毒定量。一旦确定HIV浓度，便在有或无T20、TEX及其对应突变体存在下，在不同MOI下感染表达人CD4受体和两种人共受体CCR5或CXCR4中一种的人靶细胞。感染之后3天溶解细胞，并且装载底物以通过照度计测量来确定荧光素酶活性。本测定是定量的，并且评价不同肽的HIV融合体的抑制水平。
或者，可以使用许多其它测定来监控本发明T-20或TEX多肽的活性，这些其它测定包括(但不限于)测量抗病毒活性的其它测定，包括(但不限于)所属领域技术人员所已知的测量病毒进入或病毒融合的测定。对这些测定进行修改以测试与另一抗病毒剂的组合疗法也是所属领域技术人员所已知的。
所属领域技术人员所熟知的标准方法也可用于测定非逆转录酶病毒活性。参看，例如Pringle等人(Pringle，C.R.等人，1985，J.Medical Virology 17：377-386)关于呼吸道合胞病毒和副流感病毒活性测定技术的讨论。另外参看，例如“Zinsser Microbiology”，1988，Joklik，W.K.等人编辑，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.，第19版关于这些技术的一般概述。这些参考文献以全文引用的方式并入本文。
可以用本发明的T-20多肽进行动物研究。这些研究包括(但不限于)毒性研究。
应了解，本文所述的实例和实施例仅为说明性目的，并且所属领域技术人员可根据所述内容做出各种修改或变化，这些修改和变化包括在本申请案的精神和范围以及所附权利要求书的范围以内。所有本文所引用的公开案、专利和专利申请案均以所有目的以引用的方式全文并入本文中。
表3：
| SEQID# | 注释 |
| 1 | GLP-1(7-36)的氨基酸序列 |
| 2 | GLP-1(7-37)的氨基酸序列 |
| 3 | Exendin-4的氨基酸序列 |
| 21 | Exendin-3的氨基酸序列 |
| 22 | T-20(DP-178)的氨基酸序列 |
| 23 | 肽YY(3-36)的氨基酸序列 |
| 24 | TEX的氨基酸序列 |
| 25 | TrpLE的氨基酸序列 |
| 26 | F-T20的引物序列 |
| 27 | R-T20的引物序列 |
| 28 | F-EXT20的引物序列 |
本发明的其它实施例和替代实施例
1.一种包含下式的多肽：
(LT)-P-T′，
其中(LT)是选自由以下各物组成的群组：定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)和标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在；
P包含BSP序列；且
T′包含标签或连接子，或不存在，
其中所述L、T、P或T′包含一个或一个以上的非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述L是选自由TrpLE序列、原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、5′优化用于细菌表达的真核生物分泌信号序列、细菌分泌信号序列、酵母分泌信号序列、昆虫分泌信号序列、哺乳动物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、独特分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列组成的群组。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述T或T′是选自由多肽、聚合物、亲和标签、抗原、检测标签、成像标签、多成员结合复合物的成员和放射性同位素标签组成群组的标签或连接子。
4根据权利要求3所述的多肽，其中所述T或T′是选自由poly-His标签、生物素、抗生物素、蛋白A、蛋白G和抗原组成群组的亲和标签。
5.根据权利要求3所述的多肽，其中所述T或T′是选自由poly-His标签、生物素、抗生物素、蛋白A、蛋白G和抗原组成群组的检测标签。
6.根据权利要求3所述的多肽，其中所述T或T′是选自由免疫球蛋白抗原决定基组成群组的抗原。
7.根据权利要求3所述的多肽，其中所述T或T′是选自由金属、放射性核素和磁性分子组成群组的成像标签。
8.根据权利要求3所述的多肽，其中所述T或T′是选自由链菌素、抗生物素、生物素、蛋白A和蛋白G组成群组的多成员结合复合物标签的成员。
9.根据权利要求1所述的多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有在所选条件下确定裂解肽键的官能团，所述官能团是选自由光活化官能团、pH活化官能团、温度活化官能团、需要催化剂的官能团、由蛋白酶、酶或另一化学官能团所识别的官能团组成的群组。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述所选条件是选自由以下条件组成的群组：暴露于光子能、增加的温度、降低的温度、增加的pH值、降低的pH值、暴露于亚原子粒子、添加催化剂、用酶培育和与另一种化学官能团接触。
11.根据权利要求1所述的多肽，其中所述BSP是GLP-1。
12.根据权利要求1所述的多肽，其中所述BSP是T-20。
13.一种包含下式的多肽：
F-(LT)-P-T′-F′，
其中F包含多肽序列或不存在；
(LT)是选自由以下各物组成的群组：定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)和标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在；
P包含具有多达100个氨基酸的所需多肽序列并且不同于F或F′；
T′包含标签或连接子或不存在；
F′包含多肽序列或不存在，
其中所述F、L、T、P、T′或F′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述T或T′是选自由多肽、聚合物、亲和标签、抗原、检测标签、成像标签、多成员结合复合物的成员和放射性同位素标签组成群组的标签或连接子。
15.根据权利要求14所述的多肽，其中所述T或T′是选自由poly-His标签、生物素、抗生物素、蛋白A、蛋白G、抗原组成群组的亲和标签。
16.根据权利要求13所述的多肽，其中所述F或F′是融合于P的多肽。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述F或F′是选自由Fc、白蛋白和白蛋白结合蛋白组成的群组。
18.根据权利要求13所述的多肽，其中所述F包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
19.根据权利要求13所述的多肽，其中所述F′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
20.根据权利要求13所述的多肽，其中所述P进一步包含含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的BSP。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述BSP中的非天然编码氨基酸具有在所选条件下确定裂解肽键的官能团，所述官能团是选自由光活化官能团、pH活化官能团、温度活化官能团、需要催化剂的官能团、由蛋白酶、酶或另一化学官能团所识别的官能团组成的群组。
22.根据权利要求21所述的多肽，其中所述所选条件是选自由以下条件组成的群组：暴露于光子能、增加的温度、降低的温度、增加的pH值、降低的pH值、暴露于亚原子粒子、添加催化剂、用酶培育和与另一种化学官能团接触。
22.根据权利要求20所述的多肽，其中所述BSP是GLP-1。
23.根据权利要求20所述的多肽，其中所述BSP是T-20。
24.一种核酸分子，其包含：
经操作连接于多肽编码序列的启动子，其中所述多肽编码序列具有式(WX)-Z，其中(WX)是选自由以下各物组成的群组：编码定位肽(W)的核苷酸序列、编码标签或连接子(X)的核苷酸序列、任何次序的编码定位肽(W)的核苷酸序列和编码标签或连接子(X)的核苷酸序列、和不存在；且
Z包含编码所需BSP的核苷酸序列，
其中所述编码W、X或Z的核苷酸序列包含选择密码子。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述启动子是选自由原核生物启动子、真核生物启动子、细菌启动子、酵母启动子、昆虫启动子、哺乳动物启动子、独特启动子和可诱导启动子组成的群组。
26.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述W编码TrpLE序列、原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、5′优化用于细菌表达的真核生物分泌信号序列、细菌分泌信号序列、酵母分泌信号序列、昆虫分泌信号序列、哺乳动物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、独特分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体信号序列。
27.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述X编码选自由以下各物组成群组的标签：亲和标签、抗原、检测标签、成像标签、多成员结合复合物的成员和放射性同位素标签。
28.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、乳白密码子、赭石密码子、四碱基密码子和独特密码子组成的群组。
29.根据权利要求24所述的核酸分子，其进一步包含经操作连接于Z的-Y′，其中Y′包含编码标签的核苷酸序列，其中所述编码所述标签的核苷酸序列视情况包含选择密码子。
30.根据权利要求29所述的核酸分子，其中所述Y′编码选自由以下各物组成群组的标签：亲和标签、抗原、检测标签、成像标签、多成员结合复合物的成员和放射性同位素标签。
31.一种表达载体，其包含根据权利要求24或29所述的核酸分子。
32.一种宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的表达载体。
33.根据权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自由原核生物、真核生物、昆虫、酵母、细菌、哺乳动物或植物细胞组成的群组。
34.一种方法，其包含：
a)在重组宿主细胞中产生包含下式的多肽：
(LT)-P-T′，
其中(LT)是选自由以下各物组成的群组：定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)和标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在；
P包含BSP序列；且
T′包含标签或连接子，或不存在，
其中所述L、T、P或T′包含一个或一个以上具有在所选条件下确定裂解一个或一个以上肽键的官能团的非天然编码氨基酸；
b)使所述多肽在所述所选条件下反应一段足以至少部分裂解一个或一个以上肽键的时间；和
c)从反应产物中回收包含P的肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤c)所回收的包含P的肽在N端或C端包含所需官能团。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述N端的所需官能团是选自由光活化官能团、pH活化官能团、温度活化官能团、需要催化剂的官能团、由蛋白酶、酶或另一化学官能团所识别的官能团组成的群组。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述C端的所需官能团是选自由光活化官能团、pH活化官能团、温度活化官能团、需要催化剂的官能团、由蛋白酶、酶或另一化学官能团所识别的官能团组成的群组。
38.根据权利要求34所述的多肽，其中所述所选条件是选自由以下条件组成的群组：暴露于光子能、增加的温度、降低的温度、增加的pH值、降低的pH值、暴露于亚原子粒子、添加催化剂、用酶培育和与另一种化学官能团接触。
39.一种BSP，其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
40.根据权利要求39所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上翻译后修饰。
41.根据权利要求39所述的BSP，其中所述多肽连接于连接子、聚合物或生物活性分子。
42.根据权利要求41所述的BSP，其中所述多肽连接于水溶性聚合物。
43.根据权利要求39所述的BSP，其中所述多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其他BSP连接。
44.根据权利要求43所述的BSP，其中所述双官能连接子或聚合物连接于第二多肽。
45.根据权利要求44所述的BSP，其中所述第二多肽是BSP。
46.根据权利要求42所述的BSP，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
47.根据权利要求42所述的BSP，其中所述水溶性聚合物连接于存在于所述BSP中的非天然编码氨基酸。
48.根据权利要求39所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸在选自由来自SEQ IDNO：2(GLP-1)的以下残基组成的群组的位置处经替换：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、29I、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)和其任何组合。
49.根据权利要求39所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸在选自由来自SEQ IDNO：22或24(T-20)的以下残基组成的群组的位置处经替换：W631、D632、I635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651和其任何组合。
50.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上调节BSP与其受体或结合伴侣亲和力的氨基酸替换、添加或缺失。
51.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上增加BSP稳定性或溶解性的氨基酸替换、添加或缺失。
52.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上增加重组宿主细胞中或活体外合成的BSP表达的氨基酸替换、添加或缺失。
53.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上增加BSP蛋白酶抗性的氨基酸替换、添加或缺失。
54.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸对连接子、聚合物或生物活性分子具有反应性，而所述连接子、聚合物或生物活性分子对所述多肽中任何20种常见氨基酸无反应性。
55.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
56.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
57.根据权利要求56所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
58.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
59.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
60.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
61.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
62.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
63.根据权利要求62所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
64.根据权利要求55所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
65.根据权利要求64所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
66.根据权利要求42所述的BSP，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
67.根据权利要求66所述的BSP，其中所述水溶性聚合物具有约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
68.根据权利要求42所述的BSP，其是通过使包含含羰基氨基酸的BSP与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应而制得。
69.根据权利要求68所述的BSP，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经酰胺键连接于所述水溶性聚合物。
70.根据权利要求42所述的BSP，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然编码氨基酸的多肽反应而制得，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。
71.根据权利要求42所述的BSP，其是通过使包含含炔氨基酸的BSP与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应而制得。
72.根据权利要求42所述的BSP，其是通过使包含含叠氮氨基酸的BSP与包含炔部分的水溶性聚合物反应而制得。
73.根据权利要求55所述的BSP，其中所述叠氮基或炔基经酰胺键连接于水溶性聚合物。
74.根据权利要求42所述的BSP，其中所述水溶性聚合物为支链或多臂聚合物。
75.根据权利要求74所述的BSP，其中所述水溶性聚合物的各分枝具有约1kDa与约100kDa之间的分子量。
76.根据权利要求39所述的BSP，其中所述多肽是拮抗剂。
77.根据权利要求76所述的BSP，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
78.根据权利要求77所述的BSP，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成群组的部分。
79.根据权利要求39所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
80.根据权利要求41所述的BSP，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子经糖部分连接于所述多肽。
81.一种分离核酸，其包含在严谨条件下与编码SEQ ID NO：1、2、3、21、22、23或24的多聚核苷酸序列杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
82.根据权利要求81所述的分离核酸，其中所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、乳白密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
83.一种制备根据权利要求41所述的BSP的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离BSP与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成群组的部分。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
86.根据权利要求83所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分经酰胺键连接于所述连接子、聚合物或生物活性分子。
88.根据权利要求83所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
89.根据权利要求83所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
90.根据权利要求85所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分经酰胺键连接于连接子、聚合物或生物活性分子。
91.根据权利要求84所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量。
92.根据权利要求84所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分为支链或多臂聚合物。
93.一种组合物，其包含根据权利要求39所述的BSP和医药学上可接受的载剂。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸连接于水溶性聚合物。
95.一种治疗患有受BSP调节的病症的患者的方法，所述方法包含对所述患者投与治疗有效量的根据权利要求93所述的组合物。
96.一种细胞，其包含根据权利要求81所述的核酸。
97.根据权利要求96所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
98.一种制备包含非天然编码氨基酸的BSP的方法，所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的BSP表达的条件下培养细胞，所述细胞包含编码BSP并且包含选择密码子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA；和纯化所述BSP。
99.一种调节BSP血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸替换所述BSP中的任何一个或一个以上天然发生氨基酸。
100.一种由多聚核苷酸编码的BSP，其中所述多聚核苷酸包含选择密码子，并且其中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
101.根据权利要求100所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸连接于连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子。
101.根据权利要求101所述的BSP，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
102.根据权利要求100所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
103.根据权利要求101所述的BSP，其中所述聚(乙二醇)部分具有约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
104.根据权利要求101所述的BSP，其中所述聚(乙二醇)部分为支链或多臂聚合物。
105.根据权利要求104所述的BSP，其中所述聚(乙二醇)部分具有约1kDa与约100kDa之间的分子量。
106.一种组合物，其包含根据权利要求100所述的BSP和医药学上可接受的载剂。
107.一种BSP，其包含经共价键在单个氨基酸处连接于所述BSP的水溶性聚合物。
108.根据权利要求107所述的BSP，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
109.根据权利要求107所述的BSP，其中所述共价连接于所述水溶性聚合物的氨基酸是非天然编码氨基酸。
110.根据权利要求48所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸连接于聚(乙二醇)分子。
111.根据权利要求49所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸连接于聚(乙二醇)分子。
112.一种包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的BSP，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接于所述多肽。
113.根据权利要求112所述的BSP，其中所述BSP经单PEG化。
114.一种包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的BSP，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。
115.根据权利要求114所述的BSP，其中所述BSP包含一个所述连接子、聚合物或生物活性分子。
116.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上调节BSP免疫原性的氨基酸替换、添加或缺失。
117.根据权利要求1、20、24或34所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上调节BSP血清半衰期或循环时间的氨基酸替换、添加或缺失。
118.一种调节BSP免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸替换所述BSP中的任何一个或一个以上天然发生氨基酸。
119.一种BSP，其中所述多肽是选自由SEQ ID NO：1、2、3、21、22、23、24及其片段组成的群组。
序列表
<110>Cho，Ho Sung
Daniel，Thomas O.Hays，Anna-Maria Wilson，Troy E.Litzinger，David C.Mariani，Roberto Kimmel，Bruce E.Keefe，William M.
<120>采用非天然编码氨基酸的生物合成多肽
<130>AMBX-OO41.OOPCT
<150>60/590,035<151> 2004-07-21
<150>60/659,709<151> 2005-03-07
<160>28
<170>PatentIn version 3.3
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<212>PRT
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<212>PRT
<213>智人
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20 25 30
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<212>PRT
<213>智人
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35
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<212>DNA
<213>法克隆嗜盐菌NRC-1
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<213>甲烷球菌
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<213>甲烷球菌
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Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
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Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
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<211>306
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<213>甲烷球菌
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35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His
145 150 155 160
Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu 305
<210>18
<211>306
<212>PRT
<213>甲烷球菌
<400>18
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gin
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys
100 105 110
Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys
115 120 125
Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro
130 135 140
Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His
145 150 155 160
Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile
165 170 175
His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His
180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu
305
<210>19
<211>306
<212>PRT
<213>甲烷球菌
<400>19
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
50 55 SO
Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu 305
<210>20
<211>306
<212>PRT
<213>甲烷球菌
<400>20
Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly
20 25 30
Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln
35 40 45
Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile
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Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser
195 200 205
Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala
210 215 220
Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro
225 230 235 240
Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys
245 250 255
Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys
275 280 285
Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Arg Leu 305
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<211>39
<212>PRT
<213>智人
<400>21
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
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Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210>22
<211>36
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>22
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1 5 10 15
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Trp Asn Trp Phe 35
<210>23
<211>34
<212>PRT
<213>智人
Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn
1 5 10 15
Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln
20 25 30
Arg Tyr
<210>24
<211>44
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>24
Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
35 40
<210>25
<211>107
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>25
Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Ile Glu Leu Glu Leu Arg Thr Asp His Lys Glu Leu Ser Glu His
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Leu Leu Leu Val Asp Leu Ala Arg Asn Asp Leu Ala Arg Ile Ala Thr
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>26
aagctttgga tgtacacaag tttaatacac tcc 33
<210>27
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>27
gcggatccca ttaaaaccaa ttccacaaac ttgc 34
<210>28
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>28
cgaagctttg gatggagtgg gatagagaaa ttaacaatta cacaagttta atacactcc 59
Claims (26)
1.一种包含下式的多肽：
(LT)-P-T′，
其中(LT)是选自由以下各物组成的群组：定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)和标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在；
P包含BSP序列；且
T′包含标签或连接子或不存在，
其中所述L、T、P或T′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
2.一种包含下式的多肽：
F-(LT)-P-T′-F′，
其中F包含多肽序列或不存在；
(LT)是选自由以下各物组成的群组：定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)和标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在；
P包含具有多达100个氨基酸的所需多肽序列并且不同于F或F′；
T′包含标签或连接子或不存在；
F′包含多肽序列或不存在，
其中所述F、L、T、P、T′或F′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述P进一步包含含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的BSP。
4.一种核酸分子，其包含：
经操作连接于多肽编码序列的启动子，其中所述多肽编码序列具有式(WX)-Z，其中(WX)是选自由以下各物组成的群组：编码定位肽(W)的核苷酸序列、编码标签或连接子(X)的核苷酸序列、任何次序的编码定位肽(W)的核苷酸序列和编码标签或连接子(X)的核苷酸序列和不存在；且
Z包含编码所需BSP的核苷酸序列，
其中所述编码W、X或Z的核苷酸序列包含选择密码子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其进一步包含经操作连接于Z的-Y′，其中Y′包含编码标签的核苷酸序列，其中所述编码所述标签的核苷酸序列视情况包含选择密码子。
6.一种表达载体，其包含根据权利要求4或5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的表达载体。
8.一种方法，其包含：
a)在重组宿主细胞中产生包含下式的多肽：
(LT)-P-T′，
其中(LT)是选自由以下各物组成的群组：定位肽(L)、标签或连接子(T)、任何次序的定位肽(L)和标签或连接子(T)、蛋氨酸和不存在；
P包含BSP序列；且
T′包含标签或连接子，或不存在，
其中所述L、T、P或T′包含一个或一个以上具有在所选条件下确定裂解一个或一个以上肽键的官能团的非天然编码氨基酸；
b)使所述多肽在所述所选条件下反应一段足以至少部分裂解一个或一个以上肽键的时间；和
c)从反应产物中回收包含P的肽。
9.一种BSP，其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
10.根据权利要求9所述的BSP，其中所述BSP包含一个或一个以上翻译后修饰。
11.根据权利要求9所述的BSP，其中所述多肽连接于连接子、聚合物或生物活性分子。
12.根据权利要求9所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸在选自由来自SEQ IDNO：2(GLP-1)的以下残基组成的群组的位置处经替换：第7位的第一氨基酸之前(即在N端)、7H、8A、9E、V16、17S、18S、19Y、20L、21E、22G、23Q、24A、25A、26K、27E、28F、29I、30A、31W、32L、33V、34K、35G、36R、37G、在第38位添加(即在羧基端)和其任何组合。
13.根据权利要求9所述的BSP，其中所述非天然编码氨基酸在选自由来自SEQ IDNO：22 或24(T-20)的以下残基组成的群组的位置处经替换：W631、D632、I635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651和其任何组合。
14.一种分离核酸，其包含在严谨条件下与编码SEQ ID NO：1、2、3、21、22、23或24的多聚核苷酸序列杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
15.一种制备根据权利要求11所述的BSP的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离BSP与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
16.一种组合物，其包含根据权利要求9所述的BSP和医药学上可接受的载剂。
17.一种治疗患有受BSP调节的病症的患者的方法，所述方法包含对所述患者投与治疗有效量的根据权利要求16所述的组合物。
18.一种细胞，其包含根据权利要求14所述的核酸。
19.一种制备包含非天然编码氨基酸的BSP的方法，所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的BSP表达的条件下培养细胞，所述细胞包含编码BSP并且包含选择密码子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA；和纯化所述BSP。
20.一种调节BSP血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸替换所述BSP中的任何一个或一个以上天然发生氨基酸。
21.一种由多聚核苷酸编码的BSP，其中所述多聚核苷酸包含选择密码子，并且其中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
22.一种组合物，其包含根据权利要求21所述的BSP和医药学上可接受的载剂。
23.一种BSP，其包含经共价键在单个氨基酸处连接于所述BSP的水溶性聚合物。
24.一种包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的BSP，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团连接于所述多肽。
25.一种包含连接于一个或一个以上非天然编码氨基酸的连接子、聚合物或生物活性分子的BSP，其中所述非天然编码氨基酸经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。
26.一种BSP，其中所述多肽是选自由SEQ ID NO：1、2、3、21、22、23、24及其片段组成的群组。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080625 |