CN111574583A

CN111574583A - 蛋白复性试剂及其应用

Info

Publication number: CN111574583A
Application number: CN202010278064.3A
Authority: CN
Inventors: 贡以捷; 周晓玲; 臧美翎; 陆晨琳; 王美玲; 张春来
Original assignee: Shanghai Hailu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Hailu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111574583B

Abstract

本发明涉及蛋白制备领域，具体而言，涉及一种蛋白复性试剂及其应用。该蛋白复性试剂为包含以下主要活性组分的组合物：二硫代苏糖醇、精氨酸和组氨酸；且所述主要活性组分在复性蛋白过程中的工作浓度在以下范围内：二硫代苏糖醇0.25mM～1.25mM；精氨酸0.25mmol/L～6mmol/L；组氨酸0.25mmol/L～6mmol/L。对于GLP‑1受体激动剂Fc融合蛋白使用该复性试剂进行复性，复性得率可以达到60％～95％。

Description

蛋白复性试剂及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白制备领域，具体而言，涉及一种蛋白复性试剂及其应用。

背景技术

抗体类药物具有疗效好、副作用小、靶向性强的特点，是当前药物研发的重点和热点。Fc融合蛋白是抗体类药物的其中一类，指利用基因工程技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的，不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白就是通过结合相关Fc受体延长半衰期。

国际糖尿病联合会最新统计，目前全球范围内估计在20岁～79岁人群中有4.63亿人患有糖尿病，绝大多数为2型糖尿病，相当于每11个成人中就有1名患者。到2030年与2045年，预计这一数字将分别达到5.78亿(10.2％)与7亿(10.9％)。而我国目前拥有1.164亿(未计入港澳台数据)糖尿病患者，位于世界首位，全球1/4糖尿病患者来自中国。根据调整年龄因素之后的统计结果，中国大陆的成年糖尿病发病率接近10％。GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白用于II型糖尿病治疗具有广阔市场前景。

GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白的生产过程中，由于其本身性质和工艺条件的影响，在经过亲和层析后往往存在着蛋白质肽链错误折叠、蛋白质分子间聚集等现象，从而无法得到较高的回收率。

为了减少蛋白质肽链错误折叠、蛋白质分子间聚集，一般可以创建合适的复性条件和复性方法，即最大程度的抑制蛋白质肽链的错误折叠和聚体的生成，提高复性回收率。然而，蛋白质的类型多结构差异性大，因此复性过程影响因素多，而使得复性方法收率偏低。例如公开号为CN103694339A，公开日为20140402的中国专利提及高效复性方法得率在51％～62％。

发明内容

本发明的目的在于创建蛋白合适的复性溶液和复性方法，最大程度提高复性回收率。即在某个复性环境中，蛋白质肽链错误折叠被抑制、蛋白质分子间聚集被抑制，从而提高目的蛋白含量。

具体的，本发明涉及一种蛋白复性试剂，其为包含以下主要活性组分的组合物：

二硫代苏糖醇、精氨酸和组氨酸；

且所述主要活性组分在复性蛋白过程中的工作浓度在以下范围内：

-二硫代苏糖醇0.25mM～1.25mM；

-精氨酸0.25mmol/L～6mmol/L；

-组氨酸0.25mmol/L～6mmol/L。

可选的，所述主要活性组分在复性蛋白过程中的工作浓度在以下范围内：

-二硫代苏糖醇0.4mM～1.1mM；

-精氨酸2mmol/L～6mmol/L；

-组氨酸2mmol/L～6mmol/L。

-二硫代苏糖醇0.5mM～1mM；

-精氨酸2.5mmol/L～5.5mmol/L；

-组氨酸2.5mmol/L～5.5mmol/L。

可选的，所述精氨酸为L-精氨酸，所述组氨酸为L-组氨酸。

可选的，所述试剂还包含TritonX-100，所述TritonX-100在复性蛋白过程中的工作浓度为0.15％(v/v)～0.3％(v/v)。

可选的，所述试剂包含还原型谷胱甘肽，但不包含氧化型谷胱甘肽。

根据本发明的再一方面，本发明涉及一种复性蛋白的方法，包括：

将待复性蛋白与如上所述的蛋白复性试剂在液体环境下接触，并使得所述主要活性组分达到工作浓度；

所述待复性蛋白为GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白，所述GLP-1受体激动剂为人胰高血糖素样肽-1类似物。

可选的，所述待复性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

可选的，所述待复性蛋白以溶液的形式与所述蛋白复性试剂的溶液接触；

以待复性蛋白溶液与所述蛋白复性试剂的溶液的体积比为1:1计，所述待复性蛋白溶液的pH＝8.9～9.5。

可选的，以待复性蛋白溶液与所述蛋白复性试剂的溶液的体积比为1:1计，所述待复性蛋白溶液中待复性蛋白的浓度2mg/ml～3mg/ml。

可选的，所述接触的时间为4hr～16hr。

根据本发明的再一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含如上所述的蛋白复性试剂。

本发明的有益效果为：

本发明通过在杂质蛋白中添加一定浓度范围的各组分物质形成复性液，然后使用合适的复性方案进行蛋白的复性，最终达到蛋白中聚体含量显著降低，目的蛋白含量显著提高的目的，对于GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白，复性得率可以达到60％～95％。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明提供了一种用于蛋白中降低杂质蛋白的复性液和复性方法。利用本发明的复性液和复性方法对蛋白溶液进行处理，可以有效降低杂质蛋白含量，显著提高主峰含量，且不需要特别的设备，低成本，操作方便，具有广阔市场前景。

本发明涉及一种蛋白复性试剂，其为包含以下主要活性组分的组合物：

二硫代苏糖醇、精氨酸和组氨酸；

-二硫代苏糖醇0.25mM～1.25mM

-精氨酸0.25mmol/L～6mmol/L

-组氨酸0.25mmol/L～6mmol/L。

二硫代苏糖醇(DTT)，又称克莱兰试剂，是一种重要的化合物，用于定量减少二硫键和保持还原状态下的巯基。低浓度时，DTT可以稳定带有自由巯基基团的酶，并且可恢复因体外氧化失活的基团活性。DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。

精氨酸和组氨酸精氨酸在重组蛋白的体外复性中，可以作为一种小分子添加剂用于抑制蛋白聚集。

本发明选择特定配比的上述组分，能有有效实现对GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白的复性，复性得率可以达到60％～95％。

在本发明中，“工作浓度”用于限定所述蛋白复性试剂中主要活性组分的比例，所述蛋白复性试剂可以为固体组合物，但优选为溶液，更优选为水溶液。当其为溶液时，所述蛋白复性试剂中主要活性组分的浓度可以为工作浓度，也可以为能够稀释为该浓度的母液(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍浓缩的母液，优选2倍浓缩)。

在一些实施方式中，所述主要活性组分在复性蛋白过程中的工作浓度在以下范围内：

-二硫代苏糖醇0.4mM～1.1mM

-精氨酸2mmol/L～6mmol/L

-组氨酸2mmol/L～6mmol/L。

-二硫代苏糖醇0.5mM～1mM

-精氨酸2.5mmol/L～5.5mmol/L

-组氨酸2.5mmol/L～5.5mmol/L。

在一些实施方式中，所述精氨酸为L-精氨酸，所述组氨酸为L-组氨酸。

在一些实施方式中，所述试剂还包含TritonX-100，所述TritonX-100在复性蛋白过程中的工作浓度为0.15％(v/v)～0.3％(v/v)。

在一些实施方式中，所述试剂包含还原型谷胱甘肽；

进一步的，所述还原型谷胱甘肽在复性蛋白过程中的工作浓度低于1mM，或者低于0.5mM。

在一些实施方式中，所述试剂不包含氧化型谷胱甘肽。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种复性蛋白的方法，包括：

在一些实施方式中，所述待复性蛋白中的GLP-1受体激动剂部分为人胰高血糖素样肽-1类似物的第3～第37位氨基酸。

在一些实施方式中，所述待复性蛋白中的Fc部分种属来源可以是牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡、人等。

在一些实施方式中所述待复性蛋白中的Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的恒定区序列。

在一些实施方式中，所述待复性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1

HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG

说明：______为GLP段，

为linker段，

为Fc段。

在一些实施方式中，所述待复性蛋白以溶液的形式与所述蛋白复性试剂接触；

以待复性蛋白溶液与所述蛋白复性试剂的溶液的体积比为1:1计，，所述待复性蛋白溶液的pH＝8.9～9.5，例如9.0、9.1、9.2、9.3、9.4。

在一些实施方式中，以待复性蛋白溶液与所述蛋白复性试剂的溶液的体积比为1:1计，，所述待复性蛋白溶液中待复性蛋白的浓度2mg/ml～3mg/ml。

在一些实施方式中，所述接触的时间为4hr～16hr，例如6hr、8hr、10hr、12hr、14hr。

在一些实施方式中，所述接触的温度为室温。

本发明还提供试剂盒，其包含如上所述的蛋白复性试剂。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含用于实施上述方法的说明书。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

以下实施例pH值的测量在24.5-25.5℃进行。

若未特别强调，以下实施例中待复性蛋白溶液中待复性蛋白的浓度均为2mg/ml～3mg/ml。

以下实施例中涉及的％均为SEC-HPLC中测定的峰面积百分比。

实施例1-17确定复性液中的复性液氧化还原对的配方。

实施例1-17的复性液配方如表1所示。

表1

实施例1-17的复性液配制方法为分别配制二硫代苏糖醇(DTT)高浓度母液，氧化型谷胱甘肽(GSSG)高浓度母液和还原型谷胱甘肽(GSH)高浓度母液，待用。

亲和层析后的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白(pH7.72，5.04mg/mL，来源于上海海路生物技有限公司)取出20mL，调节pH至8.0。然后按照上表终浓度，在计算后，加入复性液各组分，混合均匀，室温复性过夜。同时以不添加氧化还原剂的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白溶液，混合均匀，室温复性过夜作为对照样品。

第二天将所有样品送检SEC-HPLC，结果如表2所示。

表2

由表2的结果可知，当待复性蛋白溶液pH为8.0，复性液配方中只有低浓度的二硫代苏糖醇(DTT)的复性率较高。因此复性液配方为1-2mM DTT

实施例18-21确定了复性液中的pH范围。

实施例18-21的复性液配方如表3所示。

表3

样品编号	DTT终浓度(mM)	待复性蛋白pH
			对照1	0
实施例18	2	6.5
			实施例19	2	7.7
实施例20	2	8.3
			实施例21	2	9.5

实施例7-22的复性液配制方法为分别配制二硫代苏糖醇(DTT)高浓度母液，待用。

亲和层析后的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白(pH7.72，5.04mg/mL，来源于上海海路生物技术有限公司)取出10mL×2管，分别调节pH至pH 6.5，pH 7.7，pH 8.3，pH9.5。然后按照上表终浓度，在计算后，加入复性液各组分，混合均匀，室温复性过夜。同时以不添加氧化/还原剂的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白溶液，混合均匀，室温复性过夜作为对照样品。

第二天将所有样品送检SEC-HPLC，结果如表4所示。

表4

样品编号	SEC-HPLC(％)
		对照1	43.53
实施例18	61.67
		实施例19	68.8
实施例20	72.18
		实施例21	76.73

由表4的结果可知，待复性的蛋白溶液中在pH8.3-9.5中的复性率最高。

实施例22-32确定了复性液中的添加剂种类和浓度范围。

实施例22-32的复性液配方如表5所示。

表5

实施例22-32的复性液配制方法为分别配制二硫代苏糖醇(DTT)高浓度母液，精氨酸(L-Arginine)高浓度母液，组氨酸(L-Histidine)高浓度母液，待用。

亲和层析后的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白(pH7.72，5.04mg/mL，来源于上海海路生物技术有限公司)取出15mL×1管，调节pH至8.3。然后按照上表终浓度，在计算后，加入复性液各组分，混合均匀，室温复性过夜。同时以不添加氧化还原剂和添加剂的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白溶液，混合均匀，室温复性过夜作为对照样品。

第二天将所有样品送检SEC-HPLC，结果如表6所示。

表6

由表6的结果可知，精氨酸(L-Arginine)和组氨酸(L-Histidine)都对蛋白溶液的复性率有促进作用。且精氨酸(L-Arginine)和组氨酸(L-Histidine)终浓度都在1-10mmol/L时，复性收率提高较显著。

实施例33-57通过不同批次样品确定了最终复性条件。

实施例33-57的复性条件如表7所示。

表7

实施例34-56的复性液配制方法为分别配制二硫代苏糖醇(DTT)高浓度母液，精氨酸(L-Arginine)高浓度母液，组氨酸(L-Histidine)高浓度母液，待用。

实施例33-40的样品为亲和层析后的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白(pH6.38，SEC-HPLC纯度82.3％，来源于上海海路生物技术有限公司)取出10mL×2管，分别调节pH至8.9和9.5。

实施例41-48的样品为亲和层析后的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白(pH6.15，SEC-HPLC纯度84.6％，来源于上海海路生物技术有限公司)取出10mL×2管，分别调节pH至8.9和9.5。

实施例49-56的样品为亲和层析后的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白(pH7.72，SEC-HPLC纯度22.47％，来源于上海海路生物技术有限公司)取出10mL×2管，分别调节pH至8.9和9.5。

实施例33-56中样品需要准备两组，然后按照上表终浓度，在计算后，加入复性液各组分，混合均匀，一组室温复性4hr，另一组室温复性16hr。同时以不添加氧化还原剂和添加剂的GLP-1受体激动剂Fc融合蛋白溶液，混合均匀，室温复性4hr作为对照样品。

样品送检SEC-HPLC，结果如表8所示。

表8

由表8结果可知，复性条件为1～2mmol/L二硫代苏糖醇(DTT)+5～10mmol/L精氨酸(L-Arginine)+5～10mmol/L组氨酸(L-Histidine)，其中，待加入复性液的蛋白溶液pH8.9-9.5，室温复性4-16hr。此种配方对不同质量的蛋白溶液都有较好的适应性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海海路生物技术有限公司

<120> 蛋白复性试剂及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly

275

Claims

1.蛋白复性试剂，其为包含以下主要活性组分的组合物：

二硫代苏糖醇、精氨酸和组氨酸；

-二硫代苏糖醇0.25mM～1.25mM；

-精氨酸0.25mmol/L～6mmol/L；

-组氨酸0.25mmol/L～6mmol/L。

2.根据权利要求1所述的蛋白复性试剂，所述主要活性组分在复性蛋白过程中的工作浓度在以下范围内：

-二硫代苏糖醇0.4mM～1.1mM；

-精氨酸2mmol/L～6mmol/L；

-组氨酸2mmol/L～6mmol/L。

3.根据权利要求1所述的蛋白复性试剂，所述主要活性组分在复性蛋白过程中的工作浓度在以下范围内：

-二硫代苏糖醇0.5mM～1mM；

-精氨酸2.5mmol/L～5.5mmol/L；

-组氨酸2.5mmol/L～5.5mmol/L。

4.根据权利要求1～3任一项所述的蛋白复性试剂，所述精氨酸为L-精氨酸，所述组氨酸为L-组氨酸。

5.根据权利要求1～3任一项所述的蛋白复性试剂，所述试剂还包含TritonX-100，所述TritonX-100在复性蛋白过程中的工作浓度为0.15％(v/v)～0.3％(v/v)。

6.根据权利要求1～3任一项所述的蛋白复性试剂，所述试剂包含还原型谷胱甘肽，但不包含氧化型谷胱甘肽。

7.复性蛋白的方法，包括：

将待复性蛋白与权利要求1～6任一项所述的蛋白复性试剂在液体环境下接触，并使得所述主要活性组分达到工作浓度；

8.根据权利要求7所述的复性蛋白的方法，所述待复性蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

9.根据权利要求7或8所述的复性蛋白的方法，所述待复性蛋白以溶液的形式与所述蛋白复性试剂的溶液接触；

10.根据权利要求9所述的复性蛋白的方法，以待复性蛋白溶液与所述蛋白复性试剂的溶液的体积比为1:1计，所述待复性蛋白溶液中待复性蛋白的浓度2mg/ml～3mg/ml。

11.根据权利要求7、8、10任一项所述的复性蛋白的方法，所述接触的时间为4hr～16hr。

12.试剂盒，其包含权利要求1～6任一项所述的蛋白复性试剂。