JP2017502079A - 糖タンパク質ホルモン長時間作用性スーパーアゴニスト - Google Patents
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Abstract
本発明は、野生型対応物と比較して、in vitroとin vivoの両方で増強された生物活性を示す糖タンパク質ホルモンの長時間作用性かつ超活性な類似体を提供する。この類似体は、低い受容体発現、または良好でない受容体反応性を示す対象を処置するのに、および糖タンパク質ホルモン活性と関連している任意の状態の処置に特に有用である。
Description
本発明は、一般に、スーパーアゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質ホルモン、および糖タンパク質ホルモン活性と関連している状態の処置におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、野生型アルファサブユニットと比較して、アルファサブユニットにおけるアミノ酸置換、および1つまたは複数の挿入ペプチドを含有する修飾糖タンパク質分子であって、野生型糖タンパク質と比較して、増強された薬理学的特性を示す修飾糖タンパク質分子に関する。
ゴナドトロピンであるフォリトロピン(卵胞刺激ホルモン、FSH)および絨毛性ゴナドトロピン(CG)、ルトロピン(黄体ホルモン、LH)、およびサイロトロピン(甲状腺刺激ホルモン、TSH)は、糖タンパク質ホルモンのファミリーを構成する。各ホルモンは、2つの非共有結合サブユニット、アルファおよびベータのヘテロ二量体である。同じ種内で、アルファサブユニットのアミノ酸配列は、全てのホルモンにおいて同一である一方、ベータサブユニットの配列は、ホルモン特異的である(Pierce, Ann. Rev. Biochem. 50:465-495 (1981))。サブユニットの配列が魚類から哺乳動物まで高度に保存されているという事実は、これらのホルモンが共通の祖先タンパク質から進化してきたことを暗示している(Fontaine, Gen. Comp. Endocrinol. 32:341-347 (1977))。動物のスペクトルにわたって糖タンパク質ホルモンが広範に分布して存在することも、ホルモンまたはホルモンの任意の修飾バージョンが様々な種における使用の可能性がかなりあることを示している。
修飾糖タンパク質ホルモンを用いた以前の研究からは、有望なデータが得られた。例えば、増加した活性を有する修飾糖タンパク質ホルモンが提供されたことに加えて、さらなる変異は、受容体アフィニティー結合の増加を示した(例えば、WO2005/089445およびWO2005/101000を参照されたい)。しかしながら、アフィニティーが増加した一方、研究では、修飾糖タンパク質ホルモンが、それらの野生型対応物よりも速いわけではないものの同じくらいの迅速さで排除されることが実証された。増強された活性を有する臨床的に有用なスーパーアゴニストを得るために、修飾糖タンパク質スーパーアゴニストは、改善された受容体結合性アフィニティーに加えて、改善された生物学的半減期を有するべきである。しかしながら、半減期を増加させ、生物学的利用能を改善するために糖タンパク質ホルモンをさらに修飾する以前の試みは、満足のいくものではなく、その代わりに、修飾糖タンパク質ホルモンは、減弱された反応しか示さなかった。
本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのQ13、E14、P16またはQ20での少なくとも1つの保存的塩基性アミノ酸置換、およびD3とQ5の間のVNVTINVT(配列番号20)の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンを包含する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Q13、P16およびQ20での少なくとも2つのまたは少なくとも3つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、E14での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号11との少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン(LH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、ヒトアルファサブユニット(配列番号6)に由来する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、Q13、P16およびQ20での少なくとも2つのまたは少なくとも3つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、E14での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号11との少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン(LH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、ヒトアルファサブユニット(配列番号6)に由来する。
本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのK15、K17、K20またはK24での少なくとも1つの保存的塩基性アミノ酸置換、およびF6とT7の間のNVTINV(配列番号1)の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンを包含する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、K15、K17、K20およびK24での少なくとも2つの、または少なくとも3つの、または少なくとも4つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、E18での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号7との少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン(LH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、K15、K17、K20およびK24での少なくとも2つの、または少なくとも3つの、または少なくとも4つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、E18での塩基性アミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号7との少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン(LH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む。
本発明は、糖タンパク質ホルモンのアルファサブユニットのK15、E18、K20またはK24での少なくとも1つの保存的塩基性アミノ酸置換、およびF6とT7の間のNVTINV(配列番号1)の挿入断片または代わりにF6とT7の間のNVの挿入断片に加えてT7とT8の間のINVの挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンを包含する。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、K15、E18、K20およびK24での少なくとも2つの、または少なくとも3つの、または少なくとも4つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、アルファサブユニットのF6とT7の間のNVTINV(配列番号1)の挿入断片を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、アルファサブユニットのF6とT7の間のNVの挿入断片に加えてT7とT8の間のINVの挿入断片を含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、ヒスチジンのアルギニンである。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、K15、E18、K20およびK24での少なくとも2つの、または少なくとも3つの、または少なくとも4つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、アルファサブユニットのF6とT7の間のNVTINV(配列番号1)の挿入断片を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、アルファサブユニットのF6とT7の間のNVの挿入断片に加えてT7とT8の間のINVの挿入断片を含む。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、ヒスチジンのアルギニンである。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、配列番号4との少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、黄体ホルモン(LH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、卵胞刺激ホルモン(FSH)または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、ウマアルファサブユニット(配列番号4)に由来する。
本発明は、アルファサブユニットのアルファ−Llループにおける少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換、およびアルファサブユニットのN末端近くの1つまたは複数の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンであって、挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、NX1T、NX2S、またはNNX3X4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、X1、X2、X3、およびX4が独立に任意のアミノ酸である修飾糖タンパク質ホルモンも包含する。
本発明は、アルファサブユニットのアルファ−Llループにおける少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換、およびアルファサブユニットのN末端近くの1つまたは複数の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンであって、挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、NX1T、NX2S、またはNNX3X4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、X1、X2、X3、およびX4が独立に任意のアミノ酸である修飾糖タンパク質ホルモンも包含する。
一部の実施形態では、挿入断片のそれぞれは、1つまたは複数のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位であって、X1およびX2が独立に、プロリンを除く任意のアミノ酸であるNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、挿入断片は、NX1T、NX2S、またはNNX3X4部位をアルファサブユニットに導入するが、導入されたNX1T、NX2S、またはNNX3X4部位におけるアミノ酸の少なくとも1つが挿入断片の一部ではない。一部の実施形態では、挿入断片は、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのF6とT7の間にある。一部の実施形態では、挿入断片は、NNX3X4グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入してもよく、ここで、X3、およびX4は、独立にTまたはSである。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15、17、18、20、または24での少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K、または24Kでの少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換を含む。
本発明は、修飾アルファサブユニットを含み、黄体ホルモン(LH)のベータサブユニット、絨毛性ゴナドトロピン(CG)のベータサブユニット、卵胞刺激ホルモン(FSH)のベータサブユニット、または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む修飾糖タンパク質ホルモンも包含する。
本発明は、修飾アルファサブユニットを含み、黄体ホルモン(LH)のベータサブユニット、絨毛性ゴナドトロピン(CG)のベータサブユニット、卵胞刺激ホルモン(FSH)のベータサブユニット、または甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む修飾糖タンパク質ホルモンも包含する。
一部の実施形態では、アルファサブユニットは、野生型ヒトアルファサブユニット(配列番号6)、野生型ウシアルファサブユニット(配列番号2)、野生型ブタアルファサブユニット(配列番号5)および野生型ヒツジアルファサブユニット(配列番号3)、野生型イヌアルファサブユニット(配列番号47)、野生型ネコアルファサブユニット(配列番号50)、野生型ウサギアルファサブユニット(配列番号53)、野生型ヤギアルファサブユニット(配列番号55)、野生型オポッサムアルファサブユニット(配列番号57)、野生型コイアルファサブユニット(配列番号67)、野生型サケアルファサブユニット(配列番号69)、野生型ウマアルファサブユニット(配列番号4)、野生型ニワトリアルファサブユニット(配列番号59)、野生型シチメンチョウアルファサブユニット(配列番号61)、野生型ダチョウアルファサブユニット(配列番号63)、または野生型ナマズアルファサブユニット(配列番号65)に由来する。
本発明は、動物における糖タンパク質ホルモン受容体を刺激するための方法であって、上記の修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与することを含む方法を包含する。動物は、哺乳動物、鳥類、または魚類とすることができ、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、ヤク、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、ダチョウ、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、それらの野生型対応物と比較して、驚くほど増強された効力および増加した生物学的半減期を示す修飾超活性糖タンパク質ホルモン分子を提供する。修飾されていることは、タンパク質が野生型糖タンパク質ホルモンとは異なるアミノ酸配列を含有すると同時に、配列が、別の種の既知の糖タンパク質ホルモン配列と同一ではないように変えられていることを意味する。超活性は、効力および有効性を含めたいろいろなパラメーターに従って評価されてもよい。効力は、最大半量反応を測定することによって決定される生物活性のパラメーターである。効力における差は、ベースラインと最大値の中間(EC50)である類似体の糖タンパク質ホルモン反応の値、対、野生型糖タンパク質ホルモンの値を比較することによって決定される。糖タンパク質ホルモン反応は、精製タンパク質を使用してin vitroで測定されても、または修飾タンパク質をコードする核酸の一過性トランスフェクション後に推定されてもよい。糖タンパク質ホルモン反応は、in vivoで、すなわち前記糖タンパク質ホルモン類似体に反応性である動物において測定されてもよい。かかる反応は、その受容体に結合する糖タンパク質ホルモンの任意の既知の細胞または生物学的および定量的または定性的反応、例えばcAMP生成、プロゲステロンなどのタンパク質の合成、受精率、胚盤胞形成率、受精卵母細胞当たりの胚発生などを包含する。有効性(Vmax)または最大反応は、生物活性の別のパラメーターである。ここで考察されるように、生物活性のパラメーターは、アッセイ細胞系における受容体数および受容体カップリングに依存して変動し得る。より低い受容体数または障害性のカップリングを有する系では、差は、Vmax(有効性)の観点からより識別可能である。受容体が過剰発現される系では、効力における差は、より明らかである。
例えば、修飾糖タンパク質ホルモンが修飾FSHまたはCG分子である例では、卵母細胞の量、受精率ならびに胚盤胞および胚形成率などのin vivo定量的および定性的パラメーターは、卵母細胞数に関する最大有効量で測定されてもよい。卵母細胞数に関する最大有効量は、卵母細胞の質と量の両方に関する超活性FSHの最適な量である。卵母細胞数に関する最大有効量は、動物の質量および代謝速度に依存する。例えば、より遅い代謝速度を有するより大きい動物に関する最大有効量は、より高い代謝速度を有するより小さい動物に関する最大有効量よりも大きい。最大有効量は、各動物に関して経験的に決定される。
しかしながら、使用される系にかかわらず、本発明の修飾超活性糖タンパク質ホルモンタンパク質は、野生型対応物と比較して、効力の少なくとも約2〜10倍の増加もしくは効力の少なくとも約20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍もしくはさらに100倍の増加、または野生型対応物と比較して、最大有効性の約2〜10%の増加、もしくは最大有効性の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくはさらに100%の増加を示し得る。本発明の超活性な類似体は、野生型FSHと比較して、効力の約5〜10倍の増加または最大有効性の5%〜10%の増加ももたらし得る。本発明の修飾タンパク質のいくつかは、野生型と比較して、効力の少なくとも約30〜50倍の増加または最大有効性の30%〜50%の増加を示し得る。したがって、本発明の修飾タンパク質は、低受容体数または反応を有する系においてさえ、効力の少なくとも10倍の増加または最大有効性の10%の増加を維持し得るので、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、低受容体数または受容体反応における欠損を有する対象を処置するのに有用であり得る。
修飾超活性糖タンパク質ホルモンの吸収速度は、作用の期間増加をもたらし得る。減少した吸収速度および作用の期間増加を有する修飾糖タンパク質ホルモン類似体は、受胎障害に罹患したものなどの感受性が低下した対象に有益であり得る。吸収速度は、Kaによって測定される。排出速度は、Keによって測定される。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、哺乳動物、鳥類、および魚類などの全ての動物種の修飾タンパク質を含む。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンは、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、トラ、ライオン、パンダ、オポッサム、ウサギ、マウス、鳥類、または魚アルファサブユニット由来のアルファサブユニットを含んでもよい。魚類糖タンパク質ホルモン(GTH−1としても既知である)は、水産養殖において、すなわち、絶滅危惧または飼育されている他の魚類種の成長を補助するために、使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの他の種は、農業育種に、さらに、様々な雄および雌糖タンパク質ホルモン関連状態に及ぼす種々の複合変異の効果を試験するための実験室環境に使用され得る。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンは、トラ、ライオン、およびシマウマなどであるがこれらに限定されない絶滅危惧種の保護および促進にも使用され得る。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、哺乳動物、鳥類、および魚類などの全ての動物種の修飾タンパク質を含む。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンは、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、トラ、ライオン、パンダ、オポッサム、ウサギ、マウス、鳥類、または魚アルファサブユニット由来のアルファサブユニットを含んでもよい。魚類糖タンパク質ホルモン(GTH−1としても既知である)は、水産養殖において、すなわち、絶滅危惧または飼育されている他の魚類種の成長を補助するために、使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの他の種は、農業育種に、さらに、様々な雄および雌糖タンパク質ホルモン関連状態に及ぼす種々の複合変異の効果を試験するための実験室環境に使用され得る。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンは、トラ、ライオン、およびシマウマなどであるがこれらに限定されない絶滅危惧種の保護および促進にも使用され得る。
修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型アルファサブユニットに由来する変異アルファサブユニットを含んでもよい。一部の実施形態では、アルファサブユニットは、野生型ヒトアルファサブユニット(配列番号6)、野生型ウシアルファサブユニット(配列番号2)、野生型ブタアルファサブユニット(配列番号5)および野生型ヒツジアルファサブユニット(配列番号3)、野生型イヌアルファサブユニット(配列番号47)、野生型ネコアルファサブユニット(配列番号50)、野生型ウサギアルファサブユニット(配列番号53)、野生型ヤギアルファサブユニット(配列番号55)、野生型オポッサムアルファサブユニット(配列番号57)、野生型コイアルファサブユニット(配列番号67)、野生型サケアルファサブユニット(配列番号69)、野生型ウマアルファサブユニット(配列番号4)、野生型ニワトリアルファサブユニット(配列番号59)、野生型シチメンチョウアルファサブユニット(配列番号61)、野生型ダチョウアルファサブユニット(配列番号63)、または野生型ナマズアルファサブユニット(配列番号65)に由来する。
修飾糖タンパク質ホルモン分子は、本明細書で開示された、修飾ヒト(例えば配列番号11)、ウシ(例えば配列番号7)、イヌ(例えば配列番号48)、ネコ(例えば配列番号51)、ウマ(例えば配列番号9)、ブタ(例えば配列番号10)、ヒツジ(例えば配列番号9)、オポッサム(例えば配列番号58)、ウサギ(例えば配列番号54)、鳥類(例えば配列番号60、62、および64)、および魚類(例えば配列番号66、68、70、および71)分子における位置に相当する位置での置換を有してもよく、これは、Gap、BestFit、FrameAlignおよびCompareなどのDNASIS、ALlONment、SIMおよびGCGプログラムを含むが、これらに限定されない任意のアラインメントプログラムを使用して同定されてもよい。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、アルファサブユニットのアルファ−L1ループにおける少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換を含む修飾アルファ−サブユニットを少なくとも含む。ヒトアルファサブユニットでは、塩基性アミノ酸は、野生型ヒトアルファサブユニット(配列番号6)の位置13、14、16および/または20で導入されてもよい。他の種では、塩基性アミノ酸は、野生型ウシアルファサブユニット(配列番号2)、野生型ブタアルファサブユニット(配列番号5)および野生型ヒツジアルファサブユニット(配列番号3)、野生型イヌアルファサブユニット(配列番号47)、野生型ネコアルファサブユニット(配列番号50)、野生型ウサギアルファサブユニット(配列番号53)、野生型ヤギアルファサブユニット(配列番号55)、野生型オポッサムアルファサブユニット(配列番号57)、野生型コイアルファサブユニット(配列番号67)、および野生型サケアルファサブユニット(配列番号69)の位置15、17、18、20および/または24、野生型ウマアルファサブユニット(配列番号4)の位置15、18、20および/または24、野生型ニワトリアルファサブユニット(配列番号59)、野生型シチメンチョウアルファサブユニット(配列番号61)、および野生型ダチョウアルファサブユニット(配列番号63)の位置15、17、18、および/または24、ならびに野生型ナマズアルファサブユニット(配列番号65)の位置12、14、15、17、および/または21に相当する位置で導入されてもよい。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、および/またはリシンとすることができる。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンおよび/またはヒスチジンとすることができる。一部の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンとすることができる。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子は、アルファサブユニットのN末端近くの1つまたは複数の挿入断片を含んでもよい。挿入断片は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、NX1T、NX2S、またはNX3X4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、X1、X2、X3、およびX4は、独立に任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、X1およびX2は、独立にVまたはIまたはAである。一部の実施形態では、X3およびX4は、独立にTまたはSであり、X3X4は、TT、SS、TS、またはSTである。一部の実施形態では、挿入断片は、NX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、NX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位の少なくとも1つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。一部の実施形態では、2つ以上のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位がアルファユニットに導入される。一部の実施形態では、2つ以上のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位は、単一アミノ酸によって隔てられており、ここで、一部の実施形態では、アミノ酸は、VまたはIである。
配列NVTINV(配列番号1)またはTNVTINV(配列番号12)またはVNVTINVT(配列番号20)を有するペプチドは、ヒトアルファサブユニット(配列番号6)のアミノ酸D3とQ5の間、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコアルファサブユニットのF6とT7の間、ウサギアルファサブユニットのF6とA7の間、ヤギアルファサブユニットのF6とM7の間、オポッサムアルファサブユニットのF6とI7の間、ニワトリ、シチメンチョウ、およびダチョウアルファサブユニットのF6とL7の間、およびナマズアルファサブユニットのN3とD4の間に挿入されてもよい。代わりに、ウマの修飾糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットは、F6とT7の間のNVの挿入断片に加えてT7とT8の間のINVの挿入断片を含んでもよい。本発明の修飾タンパク質は、さらなる置換、特にタンパク質の増強された特性を改変しない保存的置換も含有してもよい。しかしながら、典型的には、かかる修飾タンパク質は、上記で列挙したもの以外の位置での5つ未満の置換を含有することになり、上記で列挙した位置以外の位置における相当する野生型糖タンパク質ホルモンアルファとの完全なアミノ酸配列同一性を示し得る。
塩基性アミノ酸は、アミノ酸リシン、アルギニン、およびヒスチジン、ならびにこれら3つのアミノ酸のいずれかへの修飾形とすることができる任意の他の塩基性アミノ酸、通常天然に見出されない合成塩基性アミノ酸、または中性pHで正に荷電している任意の他のアミノ酸を含む。とりわけ、塩基性アミノ酸は、リシンおよびアルギニンからなる群から選択される。
塩基性アミノ酸置換およびペプチド挿入断片を有する例示的修飾アルファ分子は、配列番号11および21(ヒト)、配列番号7、14〜19、および22(ウシ)、配列番号8、46、79〜80(ヒツジ)、配列番号10、45、および77〜78(ブタ)、配列番号9、38〜42、および72〜76(ウマ)、配列番号48〜49(イヌ)、配列番号51〜52(ネコ)、配列番号54(ウサギ)、配列番号56(ヤギ)、配列番号58(オポッサム)、配列番号60(ニワトリ)、配列番号62(シチメンチョウ)、配列番号64(ダチョウ)、配列番号66(ナマズ)、配列番号68(コイ)、ならびに配列番号70〜71(サケ)に示されている。本発明は、配列番号7〜11、14〜19、21〜22、38〜42、45〜46、48〜49、51〜52、54、56、58、60、62、64、66、68、および70〜80のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の修飾アルファサブユニットは、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの塩基性アミノ酸置換を含むアルファサブユニットを有してもよい。置換アミノ酸は、任意の非塩基性アミノ酸とすることができる。一部の実施形態では、非塩基性アミノ酸は、リシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基またはグルタミン残基とすることができる。例えば、野生型ウシアルファサブユニットでは、位置15、17、20、24での1つまたは複数のリシンおよび位置18でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ヒトアルファサブユニットでは、位置13および20での1つまたは複数のグルタミンならびに位置14でのグルタミン酸および位置16でのプロリンは、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ブタアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のリシンおよび位置18でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ヒツジアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のリシンおよび位置18でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ウマアルファサブユニットでは、位置15、20および24での1つまたは複数のリシンおよび位置18でのグルタミン酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。
さらに、野生型イヌアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ネコアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ウサギアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ヤギアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型コイアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型サケアルファサブユニットでは、位置15、17、20および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ニワトリアルファサブユニットでは、位置15、17および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型シチメンチョウアルファサブユニットでは、位置15、17および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ダチョウアルファサブユニットでは、位置15、17および24での1つまたは複数のアミノ酸および位置18でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。野生型ダチョウアルファサブユニットでは、位置12、14、17、および21での1つまたは複数のアミノ酸および位置15でのアミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸と置換されていてもよい。
例えば、修飾ウシアルファサブユニットは、配列番号7、14〜19、および22に示される配列に示されている。本発明は、配列番号7、14〜19および22のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ウマアルファサブユニットは、配列番号9、38〜42および72〜76に示される配列に示されている。本発明は、配列番号9、38〜42および72〜76のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ウマアルファサブユニットは、配列番号9、38〜42および72〜76に示される配列に示されている。本発明は、配列番号9、38〜42および72〜76のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ヒツジアルファサブユニットは、配列番号8、46、および79〜80に示される配列に示されている。本発明は、配列番号8、46、および79〜80のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ブタアルファサブユニットは、配列番号10、45、および77〜78に示される配列に示されている。本発明は、配列番号10、45および77〜78のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾イヌアルファサブユニットは、配列番号48〜49に示される配列に示されている。本発明は、配列番号48〜49のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ブタアルファサブユニットは、配列番号10、45、および77〜78に示される配列に示されている。本発明は、配列番号10、45および77〜78のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾イヌアルファサブユニットは、配列番号48〜49に示される配列に示されている。本発明は、配列番号48〜49のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ネコアルファサブユニットは、配列番号51〜52に示される配列に示されている。本発明は、配列番号51〜52のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ウサギアルファサブユニットは、配列番号54に示される配列に示されている。本発明は、配列番号54との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ウサギアルファサブユニットは、配列番号54に示される配列に示されている。本発明は、配列番号54との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ヤギアルファサブユニットは、配列番号56に示される配列に示されている。本発明は、配列番号56との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾オポッサムアルファサブユニットは、配列番号58に示される配列に示されている。本発明は、配列番号58との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾オポッサムアルファサブユニットは、配列番号58に示される配列に示されている。本発明は、配列番号58との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ニワトリアルファサブユニットは、配列番号60に示される配列に示されている。本発明は、配列番号60との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾シチメンチョウアルファサブユニットは、配列番号62に示される配列に示されている。本発明は、配列番号62との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ダチョウアルファサブユニットは、配列番号64に示される配列に示されている。本発明は、配列番号64との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾シチメンチョウアルファサブユニットは、配列番号62に示される配列に示されている。本発明は、配列番号62との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ダチョウアルファサブユニットは、配列番号64に示される配列に示されている。本発明は、配列番号64との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾ナマズアルファサブユニットは、配列番号66に示される配列に示されている。本発明は、配列番号66との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾コイアルファサブユニットは、配列番号68に示される配列に示されている。本発明は、配列番号68との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾サケアルファサブユニットは、配列番号70〜71に示される配列に示されている。本発明は、配列番号70〜71のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾コイアルファサブユニットは、配列番号68に示される配列に示されている。本発明は、配列番号68との少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
例えば、修飾サケアルファサブユニットは、配列番号70〜71に示される配列に示されている。本発明は、配列番号70〜71のいずれかとの少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する修飾糖タンパク質を提供する。
目的のアルファサブユニットのアミノ酸配列を他の種のものと比較して、他の種のタンパク質における相当する塩基性残基を同定することによって、さらなる修飾アルファサブユニットを設計してもよい。かかる方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,361,992号に開示されている。比較および置換のためにどの種を選択するべきかに関して、様々な種からの糖タンパク質ホルモンの相対的生物活性も考慮に入れることができる。さらに、関連糖タンパク質ホルモンの構造に基づくホモロジーモデリングは、表面曝露アミノ酸残基を同定するのに有用である。追加のアミノ酸位置を修飾するために、ヒトおよび非ヒトからの糖タンパク質ホルモン配列は、DNASIS(Hitachi Software Engineering)などの標準的コンピュータソフトウェアプログラムまたはGap、BestFit、FrameAlignおよびCompareなどのALIONment、SIMおよびGCGプログラムを含むが、これらに限定されない、上記で列挙した他のアラインメントプログラムのいずれかを使用して整列され得る。次いで、ヒトおよび非ヒト糖タンパク質ホルモン間で異なるアミノ酸残基は、上記の技法の1つを使用して置換され、生じた糖タンパク質ホルモンは、本明細書で言及したアッセイの1つを使用してその抗力に関してアッセイされ得る。
したがって、本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型FSHよりも増加した効力を有する修飾FSHタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型LHよりも増加した効力を有する修飾LHタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型TSHよりも増加した効力を有する修飾TSHタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型CGよりも増加した効力を有する修飾CGタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型LHよりも増加した効力を有する修飾LHタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型TSHよりも増加した効力を有する修飾TSHタンパク質も提供する。
本発明は、本明細書で記載された修飾アルファサブユニットを含む、同じ種由来の野生型CGよりも増加した効力を有する修飾CGタンパク質も提供する。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモンを投与することを含む、動物における糖タンパク質ホルモン受容体を刺激するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばFSH類似体)を投与することを含む、動物における過剰排卵を誘導するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばFSH類似体)を投与することを含む、動物における自然もしくは人工授精または胚移植が後に続く体外受精を促進するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばFSH類似体)を投与することを含む、動物における不妊症を処置するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばFSH類似体)を投与することを含む、動物に関する卵子保存を改善するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばLH類似体)を投与することを含む、動物における胚性胎児消失を防ぐための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばLH類似体)を投与することを含む、動物の妊娠を維持するための方法であって、動物が妊娠し得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばLH類似体)を投与することを含む、動物の妊娠を維持するための方法であって、動物が妊娠し得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばLH類似体)を投与することを含む、動物における停留睾丸を処置するための方法であって、動物がこの状態によって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばLH類似体)を投与することを含む、動物における性腺機能低下症を処置するための方法であって、動物がこの状態によって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばCG類似体)を投与することを含む、動物における発情期までの期間を減らし、これを同期させるための方法であって、動物が発情期を有する任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばTSH類似体)を投与することを含む、動物の代謝的健康状態を評価するための方法であって、動物を任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばTSH類似体)を含む、動物における甲状腺および/または他のがんを診断するかつ/または処置するための方法であって、動物がかかるがんによって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
本発明は、動物に修飾糖タンパク質ホルモン(例えばTSH類似体)を含む、動物における甲状腺および/または他のがんを診断するかつ/または処置するための方法であって、動物がかかるがんによって影響され得る任意の種とすることができる方法も提供する。一部の実施形態では、動物は、哺乳動物とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、鳥類とすることができる。一部の実施形態では、鳥類は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウを含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、魚類とすることができる。一部の実施形態では、魚類は、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタを含み得るが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えば、FSH類似体)は、自然もしくは人工授精または胚移植の前に、体外受精を用いる獣医学的過剰排卵に使用され得る。一部の種(例えばヒト)では、修飾糖タンパク質ホルモンは、不妊症を有する対象を処置するために、および卵子バンキング(egg banking)に使用され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えば、LH類似体)は、獣医学的胚性胎児消失を防ぎ、妊娠を維持するために使用され得る。一部の種(例えばヒト)では、修飾糖タンパク質ホルモンは、停留睾丸における精巣の下垂を促進し、性腺機能低下症を処置するために使用され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えば、LH類似体)は、獣医学的胚性胎児消失を防ぎ、妊娠を維持するために使用され得る。一部の種(例えばヒト)では、修飾糖タンパク質ホルモンは、停留睾丸における精巣の下垂を促進し、性腺機能低下症を処置するために使用され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えば、CG類似体)は、未交尾のブタ、周期がない未経産雌ブタ(non−cycling gilt)、周期がある未経産雌ブタ(cycling gilt)、分娩後または離乳後無発情期を有する雌ブタ、通常の繁殖期にない経産雌ヒツジ、およびウシ胚移植レシピエントを含むが、これらに限定されない様々な動物における発情の期間を減らす、これを同期させる、または誘導するために使用され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えばTSH類似体)は、全ての種における甲状腺および/または他のがんを診断するかつ/または処置するために使用され得る。
本発明は、水産養殖において使用され得る薬剤および方法も提供する。アルファユニットにおける挿入および置換は、FSH、TSH、CG、およびLHの活性を著しく増強する。ある種からの修飾糖タンパク質は、著しいヘテロ甲状腺刺激効果(heterothyrotropic effect)とともに別の種を処置するために使用され得る。例えば、修飾ヒトTSH(TR−1401)および修飾ヒトFSH(TR−4401)は、キンギョの血漿T4レベルに及ぼす著しい効果を有することが研究において示された。Miller et al., Thyrotropic activity of recombinant human glycoprotein hormone analogs and pituitary mammalian gonadotropins in goldfish (Carassius auratus): Insights into the evolution of thyrotropin receptor specificity, General and Comparative Endocrinology, 166 (2012), 70-75の図5、表1、および図8を参照されたい。その全体が組み込まれているこの研究も、修飾糖タンパク質ホルモンに関する拡大された潜在的使用を実証しているが、これはなぜならある種由来のスーパーアゴニストは、著しい効果とともに他の種、例えば魚類に使用され得るからである。特に、魚類または他の種由来の修飾糖タンパク質ホルモンは、魚類成長を補助し、繁殖を改善し、魚類集団を維持かつ/または拡大するために使用され得る。
本発明は、水産養殖において使用され得る薬剤および方法も提供する。アルファユニットにおける挿入および置換は、FSH、TSH、CG、およびLHの活性を著しく増強する。ある種からの修飾糖タンパク質は、著しいヘテロ甲状腺刺激効果(heterothyrotropic effect)とともに別の種を処置するために使用され得る。例えば、修飾ヒトTSH(TR−1401)および修飾ヒトFSH(TR−4401)は、キンギョの血漿T4レベルに及ぼす著しい効果を有することが研究において示された。Miller et al., Thyrotropic activity of recombinant human glycoprotein hormone analogs and pituitary mammalian gonadotropins in goldfish (Carassius auratus): Insights into the evolution of thyrotropin receptor specificity, General and Comparative Endocrinology, 166 (2012), 70-75の図5、表1、および図8を参照されたい。その全体が組み込まれているこの研究も、修飾糖タンパク質ホルモンに関する拡大された潜在的使用を実証しているが、これはなぜならある種由来のスーパーアゴニストは、著しい効果とともに他の種、例えば魚類に使用され得るからである。特に、魚類または他の種由来の修飾糖タンパク質ホルモンは、魚類成長を補助し、繁殖を改善し、魚類集団を維持かつ/または拡大するために使用され得る。
本発明は、絶滅危惧種を保護するために使用され得る薬剤および方法も提供する。修飾糖タンパク質ホルモンの交差活性化(cross−activating)効果により、ある動物種、例えばヒトまたはウシからのスーパーアゴニストは、著しい効果とともに別の種、例えばトラまたはライオンに投与され得る。したがって、修飾糖タンパク質ホルモンは、絶滅危惧種の繁殖を促進し、絶滅危惧種の集団を拡大するために使用され得る。
本発明は、スーパーアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する本明細書で記載された類似体の断片も包含する。例えば、本発明の修飾アルファ鎖の断片は、スーパーアゴニスト化合物を創出するために単独でまたは断片もしくは全長ベータ鎖と組み合わせて使用され得る。一部の場合では、本発明の修飾アルファサブユニット分子の断片は、例えば、それが投与された後に糖タンパク質ホルモン療法の活性の持続時間を限定するために、アンタゴニストとしても使用され得る。
本発明は、本明細書で記載された修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸配列も提供する。本発明は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする核酸も提供する。単離核酸は、上記で同定された配列との少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するタンパク質をコードしてもよい。単離核酸は、上記で同定された受託番号によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。輸送体をコードする単離核酸は、上記で同定された核酸配列にハイブリダイズしてもよい。
本発明は、本明細書で記載された修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸配列も提供する。本発明は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする核酸も提供する。単離核酸は、上記で同定された配列との少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するタンパク質をコードしてもよい。単離核酸は、上記で同定された受託番号によってコードされるアミノ酸配列との少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。輸送体をコードする単離核酸は、上記で同定された核酸配列にハイブリダイズしてもよい。
修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質をコードする核酸は、発現のために発現調節配列に遺伝的に融合していてもよい。適した発現調節配列は、標的宿主生物において適用可能であるプロモーターを含む。かかるプロモーターは、原核および真核生物からの多様な宿主に関して当業者に既知であり、文献に報告されている。例えば、かかるプロモーターは、自然発生の遺伝子から単離されても、または合成もしくはキメラプロモーターであってもよい。
本発明は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質をコードする核酸をベクターなどの標的核酸分子に挿入するための発現カセットも提供する。この目的のために、発現カセットは、例えば、制限酵素認識部位、または例えばリコンビナーゼによって触媒される相同組換えのための標的配列などの特定の配列位置から除去され、特定の配列位置に挿入されるように、5’−および3’−隣接領域にあるヌクレオチド配列が加えてある。本発明の核酸分子または発現カセットに加えて、ベクターは、適した宿主細胞における適した条件下での前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含有してもよい。一般に、ベクターは、1つまたは複数の複製開始点も含有する。ベクターは、本発明の輸送体をコードする核酸を超えた転写の長さを限定するための転写終結配列を含んでもよい。
有利なことには、ベクターに含有される核酸分子は、原核または真核細胞における発現を可能にする、すなわち翻訳可能なRNAの転写および合成を保証する発現調節配列に作動可能に連結している。
単離されたという用語は、巨大分子の天然源に存在する他の細胞/組織成分(例えばDNAまたはRNA)から分離された分子を表す。本明細書では、単離されたという用語は、組換えDNA技法によって産生された場合、細胞物質、ウイルス物質、および培養培地を実質的に含まない核酸あるいはペプチド、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸あるいはペプチドも表す。さらに、単離核酸またはペプチドは、天然に断片としてあるのではなく、天然状態で見出されない核酸またはペプチド断片を含んでもよい。
プラスミドおよびベクターという用語は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形であるので、互換的に使用される。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たす、現時点以降に当技術分野で既知になる発現ベクターの他の型を含むことが意図されている。ベクターは、望ましい配列が種々の遺伝的環境間の輸送または宿主細胞における発現に関する制限およびライゲーションによって導入されていてもよい多くの核酸のいずれかとすることができる。ベクターは、RNAベクターも利用可能であるけれども、典型的にはDNAからなる。ベクターは、プラスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製することができるクローニングベクターであって、ベクターを決まったかたちで切断し、そこに望ましいDNA配列を、新しい組換えベクターが宿主細胞において複製する能力を保持するようにライゲートできる1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるクローニングベクターである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数が増加するにつれて多数回、または宿主が有糸分裂によって繁殖する前に宿主あたり単回のみ生じてもよい。ファージの場合、複製は、溶解段階中に活発に、または溶原段階中に受動的に生じ得る。
単離されたという用語は、巨大分子の天然源に存在する他の細胞/組織成分(例えばDNAまたはRNA)から分離された分子を表す。本明細書では、単離されたという用語は、組換えDNA技法によって産生された場合、細胞物質、ウイルス物質、および培養培地を実質的に含まない核酸あるいはペプチド、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸あるいはペプチドも表す。さらに、単離核酸またはペプチドは、天然に断片としてあるのではなく、天然状態で見出されない核酸またはペプチド断片を含んでもよい。
プラスミドおよびベクターという用語は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形であるので、互換的に使用される。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たす、現時点以降に当技術分野で既知になる発現ベクターの他の型を含むことが意図されている。ベクターは、望ましい配列が種々の遺伝的環境間の輸送または宿主細胞における発現に関する制限およびライゲーションによって導入されていてもよい多くの核酸のいずれかとすることができる。ベクターは、RNAベクターも利用可能であるけれども、典型的にはDNAからなる。ベクターは、プラスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製することができるクローニングベクターであって、ベクターを決まったかたちで切断し、そこに望ましいDNA配列を、新しい組換えベクターが宿主細胞において複製する能力を保持するようにライゲートできる1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるクローニングベクターである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数が増加するにつれて多数回、または宿主が有糸分裂によって繁殖する前に宿主あたり単回のみ生じてもよい。ファージの場合、複製は、溶解段階中に活発に、または溶原段階中に受動的に生じ得る。
ベクターは、プロモーター配列をさらに含有してもよい。プロモーターは、核酸の転写を開始するための部位を含有するコード領域の上流に通常位置している非翻訳核酸配列を含んでもよい。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして働く他のエレメントも含んでもよい。本発明のさらなる実施形態では、発現ベクターは、組み込まれた発現ベクターを有する細胞の選択を助ける追加の領域を含有する。プロモーター配列は、その3’末端で転写開始部位によってしばしば(包括的に)結合されており、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含むように上流(5’方向)に伸びている。プロモーター配列内では、転写開始部位、およびRNAポリメラーゼの結合を司るタンパク質結合性ドメインが見出されることになる。真核生物プロモーターは、TATAボックスおよびCATボックスをしばしば含有することになるが、常にではない。プロモーターの活性化は、例えばいくつかの組織においてのみ発現される転写因子によって、いくつかの細胞もしくは組織に特異的であってもよいか、またはプロモーターはユビキタスであり、大部分の細胞もしくは組織における発現の能力があってもよい。
ベクターは、ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞の同定および選択における使用に適した1つまたは複数のマーカー配列をさらに含有してもよい。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物への抵抗性または感受性を増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当技術分野で既知の標準的アッセイによって検出可能である酵素(例えば、βガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクト細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に見かけ上影響する遺伝子を含む。ベクターは、自律複製の能力、およびそれが作動可能に結合されているDNAセグメントに存在する構造遺伝子産物を発現させる能力があるベクターとすることができる。発現ベクターは、それが制御配列に作動可能に結合または作動可能に連結し、RNA転写物として発現され得るように、望ましい核酸配列が制限およびライゲーションによってそこに挿入され得る発現ベクターである。発現は、細胞における内在性遺伝子、導入遺伝子またはコード領域の転写および/または翻訳を表す。
コード配列および制御配列は、それらがコード配列の発現または転写を制御配列の影響または調節下に置くような方法で共有結合している場合、作動可能に結合している。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、2つのDNA配列は、5’制御配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらし、かつ2つのDNA配列間の連結の性質が(1)フレームシフト変異の導入をもたらさず、(2)プロモーター領域がコード配列の転写を方向付ける能力に干渉せず、(3)相当するRNA転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉もしない場合、作動可能に結合していると言われる。したがって、プロモーター領域が、生じた転写物が望ましいタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるようにそのDNA配列の転写に影響する能力がある場合、プロモーター領域は、コード配列に作動可能に結合している。
本発明の一部の態様は、核酸の形質転換および/またはトランスフェクションを含む。形質転換は、原核細胞の内部への外来性または異種性核酸の導入である。トランスフェクションは、真核細胞の内部への外来性または異種性核酸の導入である。形質転換するまたはトランスフェクトする核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体DNA中に組み込まれ(共有結合され)ていてもいなくてもよい。原核生物では、例えば、形質転換する核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのエピソームエレメント上で維持されてもよい。真核細胞に関して、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトする核酸が染色体複製を介して娘細胞に遺伝するように染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、真核細胞がトランスフェクト核酸を含有する娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを樹立する能力によって実証される。
核酸挿入断片の発現に有用である当業者に既知の多数の大腸菌(E.coli)(大腸菌(Escherichia coli))発現ベクターがある。使用に適切な他の微生物宿主は、枯草菌などの桿菌、ならびにサルモネラ、セラチア、および様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌を含む。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合する発現制御配列(例えば、複製開始点)を含有する発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(Trp)プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダからのプロモーター系などの任意の数のいろいろな既知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択でオペレーター配列とともに発現を調節し、例えば、転写および翻訳を開始し、完了するためのリボソーム結合部位配列を有する。必要な場合、アミノ末端メチオニンが、下流核酸挿入断片とともに5’およびインフレームのMetコドンの挿入によって提供され得る。また、核酸挿入断片のカルボキシ末端伸長は、標準的オリゴヌクレオチド突然変異誘発手順を使用して除去され得る。
加えて、酵母発現が使用され得る。酵母発現系のいくつかの利点がある。第一に、酵母分泌系において産生されたタンパク質が正確なジスルフィド対形成を示すという証拠が存在する。第二に、翻訳後グリコシル化は、酵母分泌系によって効率的に行なわれる。出芽酵母プレプロアルファ因子(pre−pro−alpha−factor)リーダー領域(MF”−1遺伝子によってコードされる)は、酵母からのタンパク質分泌を方向付けるために常法に従って使用される(Brake, Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 4642-4646 (1984))。プレプロアルファ因子のリーダー領域は、KEX2遺伝子によってコードされる酵母プロテアーゼに関する認識配列を含むシグナルペプチドおよびプロセグメントを含有する:この酵素は、Lys−Argジペプチド切断シグナル配列のカルボキシ側上の前駆体タンパク質を切断する。FSHコード配列は、プレプロアルファ因子リーダー領域にインフレームで融合していてもよい。次いで、この構築物は、アルコール脱水素酵素Iプロモーターまたは解糖プロモーターなどの強力な転写プロモーターの調節下に置かれる。核酸コード配列の後ろには、翻訳終止コドンが続き、この後ろには、転写終止シグナルが続く。代わりに、核酸コード配列は、Sj26またはベータガラクトシダーゼなどの第2のタンパク質コード配列に融合していてもよく、これは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を促進するために使用され得る。融合タンパク質の構成要素を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母における発現に使用される構築物に適用可能である。効率的な翻訳後グリコシル化および組換えタンパク質の発現は、バキュロウイルス系においても達成され得る。
哺乳動物細胞は、フォールディングおよびシステイン対形成などの重要な翻訳後修飾を好む環境におけるタンパク質の発現、複合炭水化物構造体の付加、および活性タンパク質の分泌を可能にする。哺乳動物細胞における活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強力なウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルの間のタンパク質コード配列の挿入によって特徴付けられる。ベクターは、ハイグロマイシン抵抗性、ゲンタマイシン抵抗性を与える遺伝子、または選択マーカーとしての使用に適切な他の遺伝子もしくは表現型、または遺伝子増幅のためのメトトレキサート抵抗性を含有してもよい。キメラタンパク質コード配列は、メトトレキサート抵抗性コードベクターを使用してチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、または適した選択マーカーを使用して他の細胞系に導入されてもよい。形質転換細胞におけるベクターDNAの存在は、サザンブロット分析によって確認されてもよい。挿入断片コード配列に相当するRNAの産生は、ノーザンブロット分析によって確認されてもよい。インタクトなヒトタンパク質を分泌する能力があるいくつかの他の適した宿主細胞系が当技術分野で開発され、これらは、CHO細胞系、HeLa細胞、骨髄腫細胞系、Jurkat細胞などを含む。これらの細胞に関する発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などの必要な情報プロセシング部位を含んでもよい。例示的発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。目的の核酸セグメントを含有するベクターは、細胞宿主の型に依存して変動する既知の方法によって宿主細胞中に移されてもよい。例えば、塩化カルシウム形質転換は、一般に原核細胞に利用され、一方、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、もしくはリポフェクチン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションが、他の細胞宿主に使用され得る。
哺乳動物細胞における遺伝子の発現に関する代替のベクター、ヒトガンマインターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、凝固因子VIII、B型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼNexinl、および好酸性主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたものと同様のものが用いられてもよい。さらに、ベクターは、CMVプロモーター配列および哺乳動物細胞(COS−7など)における挿入された核酸の発現に利用可能なポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現は、in vivoでもin vitroでもよい。in vivo合成は、ベクターのための宿主細胞として役立ち得る原核または真核細胞を形質転換することを含む。代わりに、遺伝子の発現は、in vitro発現系において行ってもよい。例えば、比較的大きな量のmRNAを合成するために常法に従って使用されるin vitro転写系が市販されている。かかるin vitro転写系では、糖タンパク質ホルモンをコードする核酸は、転写プロモーターに隣接する発現ベクター中にクローニングされる。例えば、Bluescript IIクローニングおよび発現ベクターは、強力な原核転写プロモーターが隣接する複数のクローニング部位を含有する(Stratagene)。BluescriptベクターなどのDNA鋳型からのRNAのin vitro合成のための全ての必要な試薬を含有するキットが入手可能である(Stratagene)。次いで、このような系によってin vitroで作製されたRNAは、in vitroで翻訳されて、望ましい糖タンパク質ホルモンを生ずる(Stratagene)。
糖タンパク質ホルモンを作製する別の方法は、タンパク質化学技法によって2つのペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Fmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)またはBoc(tert−ブチルオキシカルボニル)化学的手法(Applied Biosystems)を使用して、現在入手可能な実験装置を使用して化学的に合成され得る。当業者は、ハイブリッド糖タンパク質ホルモンに相当するペプチドまたはポリペプチドが標準的化学反応によって合成され得ることを容易に理解することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成され、その合成樹脂から切断されなくてもよく、一方、ハイブリッドペプチドの他の断片は、合成され、その後樹脂から切断されてもよく、それによって他の断片上で機能的にブロックされている末端基が曝露される。ペプチド縮合反応によって、これら2つの断片は、それぞれ、それらのカルボキシおよびアミノ末端でのペプチド結合を介して共有結合されてハイブリッドペプチドが形成され得る(Grant, Synthetic Peptides: A User Guide, W.H. Freeman (1992)およびBodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1993))。代わりに、ペプチドまたはポリペプチドは、上記のようにin vivoで独立に合成されてもよい。いったん単離されると、これらの独立的なペプチドまたはポリペプチドは、連結されて、同様のペプチド縮合反応を介して糖タンパク質ホルモンを形成し得る。例えば、クローニングされたまたは合成ペプチドセグメントの酵素的または化学的ライゲーションは、比較的短いペプチド断片が連結されて、より大きいペプチド断片、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を作製することを可能にし得る(Abrahmsen, Biochemistry, 30:4151 (1991); Dawson, Science, 266:776-779 (1994))。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンは、そのポリペプチド断片を産生する能力がある発現系においてポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質とすることができる。例えば、ベータサブユニットと一緒に、糖タンパク質ホルモン受容体と相互作用し、糖タンパク質ホルモンと関連する生物学的効果を引き起こすことができる修飾アルファサブユニットの活性ドメインを決定することができる。一例では、糖タンパク質ホルモンの活性または結合特異性もしくはアフィニティーに寄与することが見出されていないアミノ酸は、それぞれの活性を減少させることなく欠失させ得る。
例えば、アミノまたはカルボキシ末端アミノ酸は、天然または修飾糖タンパク質ホルモンから順次除去され、それぞれの活性が上記の多くの利用可能なアッセイの1つにおいて試験され得る。別の例では、本発明の修飾タンパク質は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端アミノ酸の部分、または修飾糖タンパク質ホルモンの精製を促進することができるポリペプチド断片もしくはビオチンなどの他の部分と置き換えられているホルモンの内部領域さえも有してもよい。例えば、修飾糖タンパク質は、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドをもたらすように、2つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸を発現ベクター中にクローニングするペプチド化学的手法によりマルトース結合性タンパク質に融合していてもよい。ハイブリッドポリペプチドは、それをアミロースアフィニティーカラム上を通過させることによってアフィニティー精製されてもよく、次いで、修飾糖タンパク質は、特異的プロテアーゼ因子Xaでハイブリッドポリペプチドを切断することによって、マルトース結合性領域から分離されてもよい。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモン分子の活性断片は、直接的に合成されてもまたはより大きい糖タンパク質ホルモンの化学的もしくは機械的破壊によって得られてもよい。活性断片は、関連する活性、例えば、結合または制御活性を有する、自然発生のアミノ酸配列由来の少なくとも約5つの連続的アミノ酸のアミノ酸配列と定義される。断片は、他の配列に結合していようといまいと、ペプチドの活性が修飾糖タンパク質ホルモンと比較して著しく改変または障害されないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾も含んでもよい。これらの修飾は、ジスルフィド結合の能力があるアミノ酸を除去する/付加する、その生物寿命を増加させるなどのいくつかの追加の特性を提供してもよい。いずれにせよ、ペプチドは、結合活性、結合ドメインでの結合の制御などの生物活性特性を有さなければならない。糖タンパク質ホルモンの機能性または活性領域は、ホルモンの特定の領域の突然変異誘発、その後の発現および発現されたポリペプチドの試験によって同定され得る。かかる方法は、当業者に容易に明らかであり、受容体をコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を含み得る。
本発明は、例えば、FSH糖タンパク質への融合を含めた本明細書で記載された変異を含む融合タンパク質およびキメラタンパク質も包含する。かかる融合タンパク質は、正しいコードフレームで、当技術分野で既知の方法によって望ましいアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートし、上記の手段のいずれかによって融合タンパク質を発現させることによって産生させてもよい。代わりに、かかる融合タンパク質は、例えば、ペプチド合成機を使用して、タンパク質合成技法によって作製されてもよい。本発明の単鎖類似体およびキメラタンパク質は、アルファとベータサブユニット間、またはキメラタンパク質の種々の部分間のペプチドリンカーを組み込んでもよい。
糖タンパク質ホルモンスーパーアゴニストの特徴付け
本明細書で記載された野生型糖タンパク質ホルモンの修飾の効果は、多くの方法で確認され得る。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の第2のメッセンジャー系への変化は、測定され、かつ野生型糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクトされた同様の細胞と比較され得る。代わりに、修飾糖タンパク質ホルモンの活性は、受容体結合性アッセイから、チミジン取込みアッセイから、プロゲステロン産生アッセイから、またはT4分泌アッセイから決定され得る。当業者は、野生型または修飾糖タンパク質ホルモンの活性を決定するために用いる任意の適切なアッセイを容易に決定することができる。
本発明の一実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの効力よりも増加した効力を有する。この増加した効力は、上記の技法のいずれかによってまたは当業者によって容易に決定される任意の他の適切なアッセイで評価され得る。増加した効力は、アッセイ間、または細胞系間で一貫している必要はなく、これらは当然、変動することになる。
本明細書で記載された野生型糖タンパク質ホルモンの修飾の効果は、多くの方法で確認され得る。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の第2のメッセンジャー系への変化は、測定され、かつ野生型糖タンパク質ホルモンをコードする核酸でトランスフェクトされた同様の細胞と比較され得る。代わりに、修飾糖タンパク質ホルモンの活性は、受容体結合性アッセイから、チミジン取込みアッセイから、プロゲステロン産生アッセイから、またはT4分泌アッセイから決定され得る。当業者は、野生型または修飾糖タンパク質ホルモンの活性を決定するために用いる任意の適切なアッセイを容易に決定することができる。
本発明の一実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの効力よりも増加した効力を有する。この増加した効力は、上記の技法のいずれかによってまたは当業者によって容易に決定される任意の他の適切なアッセイで評価され得る。増加した効力は、アッセイ間、または細胞系間で一貫している必要はなく、これらは当然、変動することになる。
本発明の別の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンの最大有効性よりも増加した最大有効性を有する。この増加した最大有効性は、上記の技法のいずれかによってまたは当業者によって容易に決定される任意の他の適切なアッセイで評価され得る。増加した最大有効性は、アッセイ間、または細胞系間で一貫している必要はなく、これらは当然、変動することになる。
本明細書で記載された類似体を特徴付けるのに適した他のアッセイは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているPCT/US99/05908に報告されている。例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA、等電点電気泳動(IEF)アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Aアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技法を使用した競合および非競合アッセイ系を含むが、これらに限定されない様々なイムノアッセイが使用され得る。
本明細書で記載された類似体を特徴付けるのに適した他のアッセイは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているPCT/US99/05908に報告されている。例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA、等電点電気泳動(IEF)アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Aアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技法を使用した競合および非競合アッセイ系を含むが、これらに限定されない様々なイムノアッセイが使用され得る。
例えば、ベータサブユニットがFSHのものである場合、卵母細胞の質および量の改善は、in vitroおよびin vivoアッセイによって評価され得る。超活性FSHは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、ヤク、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、ダチョウ、コイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、およびハタを含むが、これらに限定されない動物からの卵母細胞の質および量を改善するために使用され得る。
一部の実施形態では、超活性FSHは、ヒトまたは任意の動物に投与される。それは、卵母細胞形成、卵母細胞受精、および胚盤胞形成などの体外受精プロセスの種々のエンドポイントを使用して決定される卵母細胞量および質の改善に共通である。体外受精実験は、対象が本発明による超活性FSH類似体で処置され,これが複数の卵母細胞の放出および成熟につながる「過剰排卵プロトコール」に続いてもよい。体外受精実験では、FSH(超活性FSHおよび組換え野生型FSH)は、排卵をトリガーするためのhCGとともに投与されてもよい。hCGまたは妊馬血清性ゴナドトロピン(PMSG)のみを投与される対照動物が使用され得る。卵母細胞の質は、動物における卵母細胞の受精率を増加させることによって改善され得る。超活性卵胞刺激ホルモンの受精率は、超活性FSHで達成された受精率を同量の組換え野生型FSHで達成された受精率と比較することによって、in vivoまたはin vitroで決定されてもよい。hCGを投与される対照動物も使用され得る。受精率は、卵母細胞の総数あたりの発達する2細胞期胚のパーセントによって測定され得る。受精がin vitroで起こる場合、2細胞期胚は、受精皿において計数され得る。マウスでは、2細胞期胚は、受精後約24時間で発達する。受精率は、投与される超活性FSHの量に基づいて変動する。動物は、超活性FSHの複数用量を投与されてもよい。受精率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性FSHの投与の結果として、少なくとも約10パーセント増加する。受精率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性FSHの投与の結果として、少なくとも約20パーセント、好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%増加し得る。
一部の実施形態では、超活性FSHは、ヒトまたは任意の動物に投与される。それは、卵母細胞形成、卵母細胞受精、および胚盤胞形成などの体外受精プロセスの種々のエンドポイントを使用して決定される卵母細胞量および質の改善に共通である。体外受精実験は、対象が本発明による超活性FSH類似体で処置され,これが複数の卵母細胞の放出および成熟につながる「過剰排卵プロトコール」に続いてもよい。体外受精実験では、FSH(超活性FSHおよび組換え野生型FSH)は、排卵をトリガーするためのhCGとともに投与されてもよい。hCGまたは妊馬血清性ゴナドトロピン(PMSG)のみを投与される対照動物が使用され得る。卵母細胞の質は、動物における卵母細胞の受精率を増加させることによって改善され得る。超活性卵胞刺激ホルモンの受精率は、超活性FSHで達成された受精率を同量の組換え野生型FSHで達成された受精率と比較することによって、in vivoまたはin vitroで決定されてもよい。hCGを投与される対照動物も使用され得る。受精率は、卵母細胞の総数あたりの発達する2細胞期胚のパーセントによって測定され得る。受精がin vitroで起こる場合、2細胞期胚は、受精皿において計数され得る。マウスでは、2細胞期胚は、受精後約24時間で発達する。受精率は、投与される超活性FSHの量に基づいて変動する。動物は、超活性FSHの複数用量を投与されてもよい。受精率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性FSHの投与の結果として、少なくとも約10パーセント増加する。受精率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性FSHの投与の結果として、少なくとも約20パーセント、好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%増加し得る。
超活性卵胞刺激ホルモンは、受精卵母細胞あたりの胚盤胞形成率を改善することによって卵母細胞の質を改善し得る。胚盤胞形成率は、胚盤胞を形成する2細胞期胚のパーセンテージを決定することによって測定され得る。胚盤胞形成率は、胚盤胞がin vivoで形成しようとin vitroで形成しようと増加する。胚盤胞形成率は、投与される超活性卵胞刺激ホルモンの量に依存する。胚盤胞形成率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性卵胞刺激ホルモンの投与の結果として、少なくとも約10パーセント増加する。胚盤胞形成率は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性FSHの投与の結果として、少なくとも約20パーセント、好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%増加し得る。
超活性卵胞刺激ホルモンは、受精卵母細胞あたりの胚の総数を増加させることによって卵母細胞の質を改善し得る。受精卵母細胞あたりの胚の総数の増加は、受精がin vivoで起ころうとin vitroで起ころうと増加する。受精卵母細胞あたりの胚の総数の増加は、投与される超活性卵胞刺激ホルモンの量に依存する。受精卵母細胞あたりの胚の総数は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性卵胞刺激ホルモンの投与の結果として少なくとも約10パーセント増加する。受精卵母細胞あたりの胚の総数は、卵母細胞数に関する最大有効量での超活性FSHの投与の結果として、少なくとも約20パーセント、好ましくは少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%増加し得る。
一部の実施形態では、ベータサブユニットがCGのものである場合、強力な黄体ホルモン(LH)様活性は、in vitroおよびin vivoバイオアッセイによって評価され得る。超活性CGは、一部の種において排卵を誘導し、黄体の寿命を延ばし、プロゲステロン合成を増加させ、付属黄体(accessory corpora lutea)の形成を促進する。かかる作用は、一部の種におけるより効果的な卵母細胞収集、卵母細胞の質の増加、妊娠および妊娠維持率の増加をもたらす。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えばFSH類似体)は、自然もしくは人工授精または胚移植が後に続く体外受精を用いる獣医学的過剰排卵に使用され得る。一部の種(例えばヒト)では、修飾糖タンパク質ホルモンは、不妊症を有する対象を処置するためおよび卵子バンキングに使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、過剰排卵、自然または人工授精、不妊症および卵子保存に及ぼす効果によって評価され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えばLH類似体)は、獣医学的胚性胎児消失を防ぎ、妊娠を維持するために使用され得る。一部の種(例えばヒト)では、修飾糖タンパク質ホルモンは、停留睾丸における精巣の下垂を促進し、性腺機能低下症を処置するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、胎児消失、妊娠維持、停留睾丸における精巣の下垂、および性腺機能低下症処置に及ぼす効果によって評価され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えばCG類似体)は、未交尾のブタ、周期がない未経産雌ブタ、周期がある未経産雌ブタ、分娩後または離乳後無発情期を有する雌ブタ、通常の繁殖期にない経産雌ヒツジ、およびウシ胚移植レシピエントを含むが、これらに限定されない、様々な動物における発情の期間を減らす、これを同期させる、またはこれを誘導するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、発情期の期間および同期化に及ぼす効果によって評価され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えばTSH類似体)は、全ての種における甲状腺および/または他のがんを診断するかつ/または処置するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、かかる診断および処置に及ぼす効果によって評価され得る。
一部の実施形態では、修飾糖タンパク質ホルモン(例えばTSH類似体)は、全ての種における甲状腺および/または他のがんを診断するかつ/または処置するために使用され得る。修飾糖タンパク質ホルモンの有効性は、かかる診断および処置に及ぼす効果によって評価され得る。
増加した血清半減期を有する糖タンパク質ホルモン類似体
また、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、血漿半減期が野生型対応物と比較して増加するように、さらに修飾されてもよい。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、N−グリコシル化および/またはO−グリコシル化部位を含む配列を含めた潜在的なグリコシル化部位をさらに含んでもよい。ネオグリコシル化部位は、野生型アルファサブユニットのN末端近くのペプチドの挿入によって導入され得る。グリコシル化部位は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、アルファサブユニットに導入されるNX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位を含んでもよく、X1、X2、X3、およびX4は、独立に任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、X1およびX2は、独立にVまたはIまたはAである。一部の実施形態では、X3およびX4は、独立にTまたはSである。一部の実施形態では、挿入断片は、NX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、NX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位の少なくとも1つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。一部の実施形態では、2つ以上のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位がアルファユニットに導入される。一部の実施形態では、2つ以上のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位は、単一アミノ酸によって隔てられており、ここで、一部の実施形態では、アミノ酸は、VまたはIである。例えば、グリコシル化部位は、NVT、NVTINVT、NIT、NITINIT、NNTT、NNTS、NNSS、またはNNSTを含んでもよい。
また、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、血漿半減期が野生型対応物と比較して増加するように、さらに修飾されてもよい。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、N−グリコシル化および/またはO−グリコシル化部位を含む配列を含めた潜在的なグリコシル化部位をさらに含んでもよい。ネオグリコシル化部位は、野生型アルファサブユニットのN末端近くのペプチドの挿入によって導入され得る。グリコシル化部位は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、アルファサブユニットに導入されるNX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位を含んでもよく、X1、X2、X3、およびX4は、独立に任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、X1およびX2は、独立にVまたはIまたはAである。一部の実施形態では、X3およびX4は、独立にTまたはSである。一部の実施形態では、挿入断片は、NX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、NX1T、NX2S、またはNNX3X4グリコシル化部位の少なくとも1つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。一部の実施形態では、2つ以上のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位がアルファユニットに導入される。一部の実施形態では、2つ以上のNX1TまたはNX2Sグリコシル化部位は、単一アミノ酸によって隔てられており、ここで、一部の実施形態では、アミノ酸は、VまたはIである。例えば、グリコシル化部位は、NVT、NVTINVT、NIT、NITINIT、NNTT、NNTS、NNSS、またはNNSTを含んでもよい。
例えば、アルファサブユニットにおいてペプチドNVTINV(配列番号1)またはVNVTINVT(配列番号20)を含めると、アルファサブユニットの潜在的なグリコシル化部位となる。配列番号1または配列番号20のペプチドは、ヒト野生型配列においてD3とQ5の間に含めることができる。配列番号1または配列番号20のペプチドは、ウシ、ウマ、ブタおよびヒツジ野生型配列においてF6とT7の間に含めることができる。挿入ペプチドは、アミノ末端での追加のトレオニン残基をさらに含んでもよい。グリコシル化を改変するために挿入するさらなるペプチドは、NV、INV、およびTNVペプチド、ならびにTNVTINV(配列番号12)を含む。上記のように、目的は、NVTなどのグリコシル化部位をアルファサブユニットに導入することである。一部の実施形態では、グリコシル化部位における全てのアミノ酸は、挿入断片由来である。一部の実施形態では、グリコシル化部位における少なくとも1つのアミノ酸は、挿入断片由来ではない。例えば、グリコホルモン(glycohormone)の修飾アルファサブユニットは、F6とT7の間のNVの挿入断片に加えてT7とT8の間のINVの挿入断片(例えば配列番号38および39)を含んでもよく、これは、アルファサブユニットにグリコシル化部位NVTINVTを導入するが、NVTINVTにおける全てのアミノ酸が挿入断片由来とは限らない。
一部の実施形態では、グリコシル化部位は、NNSS、NNTT、NNTS、およびNNSS(例えば配列番号72〜80を参照されたい)などであるが、これらに限定されない、重複シークオンを含んでもよい。例えば、野生型ウマアルファユニット由来の修飾糖タンパク質ホルモンでは、配列番号72〜76におけるタンパク質配列は、NNTT(配列番号72および73)、NNST(配列番号74)、NNSS(配列番号75)、またはNNTS(配列番号76)グリコシル化部位を含み、ここで、グリコシル化部位のアミノ酸は、挿入断片の一部であってもなくてもよい。野生型ブタアルファサブユニット由来の修飾糖タンパク質ホルモンでは、配列番号77および78におけるタンパク質配列は、NNTTを含んでもよく、ここで、配列番号77では、挿入断片は、F6とT7の間のNNTであり、配列番号78では、挿入断片は、F6とT7の間のNNTTである。さらに、例えば、野生型ヒツジアルファサブユニット由来の修飾糖タンパク質ホルモン(配列番号79および80)は、NNTT部位を含んでもよい。NNX3X4部位をアルファサブユニットに導入する挿入断片は、野生型サブユニットのN末端近くに挿入されてもよい。例えば、NNT、NNS、NNTT、またはNNTSは、野生型ウマ、ブタ、またはヒツジアルファサブユニットのF6とT7の間に挿入されてもよい。
増加した半減期は、他の適切な化学基のペグ化もしくはコンジュゲーションによってまたは増加した半減期を有する融合タンパク質を構築することもしくは任意の他の方法によっても、提供され得る。かかる方法は、例えばそのそれぞれがその全体が参照により組み込まれている、米国特許第5,612,034号、米国特許第6,225,449号、および米国特許第6,555,660号に報告されているように当技術分野で既知である。
半減期は、分子内の負に帯電した残基の数、例えば、グルタミン酸および/またはアスパラギン酸残基の数を増加させることによっても増加され得る。かかる改変は、部位特異的突然変異誘発によって達成され得る。かかる改変は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質への1つまたは複数の負に帯電した残基を含有するアミノ酸配列の挿入によっても達成され得る。
半減期は、分子内の負に帯電した残基の数、例えば、グルタミン酸および/またはアスパラギン酸残基の数を増加させることによっても増加され得る。かかる改変は、部位特異的突然変異誘発によって達成され得る。かかる改変は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質への1つまたは複数の負に帯電した残基を含有するアミノ酸配列の挿入によっても達成され得る。
タンパク質の半減期は、タンパク質安定性の測定値であり、タンパク質の濃度の半分の減少に必要な時間を示す。本明細書で記載された修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の血清半減期は、例えば、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の投与後の期間にわたって採取された血清試料中のレベルを測定するために抗体を使用したイムノアッセイなどであるが、これに限定されない、対象からの試料中のホルモンレベルを経時的に測定するのに適した任意の方法によって、または標識糖タンパク質ホルモンの投与後に対象から採取された試料中の標識ホルモン分子、すなわち、放射性標識分子の検出によって決定され得る。
処置の方法
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、糖タンパク質ホルモン活性と関連している任意の状態を処置するために使用され得る。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。対象は、哺乳動物、爬虫類、魚類、鳥類および両生類などであるが、これらに限定されない動物とすることができる。対象は、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、およびヤクなどであるが、これらに限定されない哺乳動物とすることができる。動物は、ネコおよびイヌなどの家畜および飼い慣らされたペットを含む。対象は、改善された糖タンパク質ホルモン活性を必要としているヒト患者または動物とすることができる。糖タンパク質ホルモン活性と関連している状態は、改変糖タンパク質ホルモン反応性によって完全にもしくは部分的に引き起こされるもの、または糖タンパク質ホルモンの投与から利益を得るものである。例えば、かかる状態は、排卵機能不全、黄体期欠損、未解明の不妊症、雄因子不妊症、時間が限定された受胎、低いFSH受容体発現、低FSH受容体感受性、FSH受容体結合欠損、FSH受容体カップリング欠損、低テストステロン産生、男性型脱毛症、および下垂体機能低下症または損傷を含むが、これらに限定されない。
本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、糖タンパク質ホルモン活性と関連している任意の状態を処置するために使用され得る。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、それを必要とする対象を処置するために使用され得る。対象は、哺乳動物、爬虫類、魚類、鳥類および両生類などであるが、これらに限定されない動物とすることができる。対象は、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、およびヤクなどであるが、これらに限定されない哺乳動物とすることができる。動物は、ネコおよびイヌなどの家畜および飼い慣らされたペットを含む。対象は、改善された糖タンパク質ホルモン活性を必要としているヒト患者または動物とすることができる。糖タンパク質ホルモン活性と関連している状態は、改変糖タンパク質ホルモン反応性によって完全にもしくは部分的に引き起こされるもの、または糖タンパク質ホルモンの投与から利益を得るものである。例えば、かかる状態は、排卵機能不全、黄体期欠損、未解明の不妊症、雄因子不妊症、時間が限定された受胎、低いFSH受容体発現、低FSH受容体感受性、FSH受容体結合欠損、FSH受容体カップリング欠損、低テストステロン産生、男性型脱毛症、および下垂体機能低下症または損傷を含むが、これらに限定されない。
例えば、卵母細胞の量および質は、本明細書に記載の超活性FSH類似体を動物に投与することによって改善され得る。例えば、驚くべきことに、出願者は、修飾アルファサブユニットを含有する超活性FSHを投与することによって、卵母細胞の量および質の劇的な増加が得られることを発見した。卵母細胞量および質に及ぼす超活性FSHの効果は、超活性FSHのFSH血清半減期を増加させることによってさらに増強され得る。FSH血清半減期は、超活性FSHをさらに修飾することによって増加され得る。上記のものを含むがこれらに限定されないさらなる修飾がFSH血清半減期を増加させるために使用され得る。
本発明の修飾FSH、CG、LH、またはTSH糖タンパク質ホルモンタンパク質は、修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質の補助量を対象に投与することを含む、雄または雌対象における補助生殖の治療レジメンにも使用され得る。かかる方法では、類似体は、単独でまたは例えば、クエン酸クロミフェンおよびGnRH(ゴノトロピン(gonotropin)放出ホルモン)を含むが、これらに限定されない他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。本発明の修飾糖タンパク質ホルモンタンパク質は、1つまたは複数の糖タンパク質の組合せとして投与されてもよい。例えば、修飾アルファサブユニットは、一緒にまたは別々に、FSHベータサブユニット、CGベータサブユニット、TSHベータサブユニット、および/またはLHベータサブユニットと組み合わせてもよく、次いで、修飾糖タンパク質が対象に投与される。例えば、単離ゴナドトロピン欠損(IGD)を有する対象では、修飾FSH、CG、TSH、およびLHが正常な性腺機能を回復するために対象に投与されてもよい。FSH、CG、TSH、LHなどの糖タンパク質ホルモンが雌生殖生理学において不可欠であり、これらの糖タンパク質ホルモンがいくつかの繁殖障害を克服し、それによって繁殖を補助するために対象に投与され得ることは、当技術分野で広く知られている。
単回および複数回注射投与レジメンが修飾ウマCG糖タンパク質に関して試験される。マウス、ラット、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクにおけるウマCG(eCG)類似体を使用した超刺激に関して、ここで、単回または2:1分割eCG類似体注射が使用される。eCG類似体に関する用量決定研究は、30、45、60、75、90、105および120mcgの単回im.注射を含む。最適化用量が2:1比で試験され、任意選択の第2の分割用量が第6日または別の日におけるPGF2アルファ処置と一致することになる。修飾eCGでの処置は、マウス、ラット、ウシ、乳牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクにおける過剰排卵を生ずる。
当業者は、投与する糖タンパク質ホルモンの有効量を容易に決定することができ、これは、質量、サイズ、特定の状態の重症度、および対象自体の型などの因子に依存することになる。治療有効量は、通例の最適化手順によって容易に決定され得る。本発明は、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、増加した効力を有する糖タンパク質ホルモンを提供する。これらの修飾糖タンパク質ホルモンは、当業者が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、修飾糖タンパク質ホルモンのより低い用量を投与して、同様の治療効果を達成すること、または代わりに、野生型糖タンパク質ホルモンの用量と同様の修飾糖タンパク質ホルモンの用量を投与して、増加した治療効果を達成することを可能にすることになる。
糖タンパク質ホルモンが経口、非経口、または他の方式で投与されるかどうかに依存して、プロスタグランジンの投与は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、液剤、クリーム、および懸濁剤などの固形、半固形、または液体剤形の形とすることができ、好ましくは正確な投薬量の送達に適した単位剤系である。糖タンパク質ホルモンは、薬学的に許容される担体と組み合わせた有効量の選択された糖タンパク質ホルモンを含んでもよく、さらに、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでもよい。「薬学的に許容される」は、生物学的にまたは別の意味で望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、その物質は、容認できない生物学的効果を引き起こすとも、糖タンパク質ホルモンとの容認できない相互作用もなく、選択された糖タンパク質ホルモンとともに個体に投与され得る。かかる剤形を調製する実際の方法が当業者に既知である、または明らかとなろう;例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, latest edition (Mack Publishing)を参照されたい。
以下の例は、本発明を説明し、例示するために提供される。したがって、これらは、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。当業者は、それが上記および特許請求の範囲に記載されているので、多くの他の実施形態も本発明の範囲内にあるとよく認識するはずである。
アルファサブユニット類似体の設計
野生型β−サブユニットを有し、Q13R+E14R+P16R+Q20R(ヒト4R)でのα−サブユニットへの修飾を有するヒトFSHスーパーアゴニスト糖タンパク質は、それらの野生型対応物を著しく上回る結合を示した。
表1は、ヒトアルファ野生型(WT)および選択されたhFSHスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ヒトアルファ野生型(92総残基のアミノ酸残基1〜28)および変異型のN末端部分を示す。アルギニン(R)への4つのスーパーアゴニスト置換の位置は、影を付けた領域にある。1つまたは2つの追加のN連結炭水化物鎖を導入する選択された4つの異なる挿入断片は、野生型配列のアミノ酸D3とQ5の間にマークを付けてある。
野生型β−サブユニットを有し、Q13R+E14R+P16R+Q20R(ヒト4R)でのα−サブユニットへの修飾を有するヒトFSHスーパーアゴニスト糖タンパク質は、それらの野生型対応物を著しく上回る結合を示した。
表1は、ヒトアルファ野生型(WT)および選択されたhFSHスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ヒトアルファ野生型(92総残基のアミノ酸残基1〜28)および変異型のN末端部分を示す。アルギニン(R)への4つのスーパーアゴニスト置換の位置は、影を付けた領域にある。1つまたは2つの追加のN連結炭水化物鎖を導入する選択された4つの異なる挿入断片は、野生型配列のアミノ酸D3とQ5の間にマークを付けてある。
一部の実施形態におけるウシFSH(bFSH)置換は、ヒトFSHアルファサブユニットにおいて以前突然変異誘発された残基と非常に類似しており、「5R」(K15R+K17R+E18R+K20R+K24R)と称される5つの変異の組合せを含む。例えば配列番号7。導入されたグリコシル化認識配列(NX1TまたはNX2S)がN連結炭水化物鎖の付着につながる可能性を増加させるため、18の異なるウシアルファサブユニット構築物を確立し、以前開発された発現ベクター中にクローニングした。12の構築物は、N末端伸長ペプチド配列ANITV、ANTTA、ANTSA、ANITVNITV、ANTSANTTAおよびANTSANTSAを含有していた。
表2は、ウシアルファ野生型(WT)および選択されたbFSHスーパーアゴニスト一次アミノ酸構造の比較を示す。ウシアルファ野生型(96総残基のアミノ酸残基1〜32)および変異ウシアルファのN末端部分を示す。アルギニン(R)またはリシン(K)への5つのスーパーアゴニスト置換の位置は、4R+1Kの5Rとしてコードされる、アミノ酸C14とP25の間の影を付けた領域でマークを付けてある。1つまたは2つの追加のN連結炭水化物鎖を導入する選択された4つの異なる挿入断片は、野生型配列のアミノ酸F6とT8の間にマークを付けてある。
表2におけるセグメントを以下に列挙する:配列番号44、WT bFSH;配列番号23、bFSHアルファ(5R);配列番号24、bFSHアルファ(4R+1K);配列番号25、bFSHアルファ(5R+Ins1);配列番号26、bFSHアルファ(5R+Ins2);配列番号27、bFSHアルファ(5R+Ins3);配列番号28、bFSHアルファ(5R+Ins4);配列番号29、bFSHアルファ(4R+1K+Ins1);配列番号30、bFSHアルファ(4R+1K+Ins2);配列番号31、bFSHアルファ(4R+1K+Ins3);配列番号32、bFSHアルファ(4R+1K+Ins4)。
ポリエチレンイミン(PEI)を使用したbFSH類似体の一過性トランスフェクションは、リポフェクタミンベースの方法と比較して、bFSH類似体発現の3.7〜4.5倍の増加をもたらした(データは示さず)。ヘテロ二量体特異的ELISAに基づく様々なFSH類似体の発現レベルは、FSH二量体形成の大きな減少は示さず、単鎖構築物が高レベル発現を達成するのに必要であるという以前の主張は支持されない。
一過性に発現されたbFSH類似体の選択は、cAMPベースin vitroバイオアッセイおよびPKスクリーニングアッセイを含んだ(図1および2を参照されたい)。ブタFSH(pFSH−Folltropin(登録商標)−V)およびbFSH対照と比較して、5R置換を有するbFSHの効力の著しい3〜4倍の増加があった(図1A)。特筆すべきことには、多くの以前の研究とは対照的に(図1B)(Heikopp, Eur. J. Biochem 261: 81-84, 1999;Trousdale, Fertil. Steril. 91 : 265-270, 2009)、新規なネオグリコシル化挿入断片は、ウシFSH 5R類似体のin vitro生物活性を減少させないことが見出された(図1C)。N末端に加えられた同一のネオグリコシル化部位は、bFSHのin vitro生物活性を減少させたがこれは、エリスロポエチンの内因性活性に及ぼすネオグリコシル化の減弱効果(Elliott, Exp. Hematol. 32: 1146-1155, 2004;Elliott, Nat. Biotechnol. 21 : 4144-421, 2003; Sinclair, J. Pharm. Sci. 94: 1626-1635, 2005)および部位特異的ペグ化を含めた半減期手法の多くの他の延長の効果(Fishburn, J.Pharm. Sci. 97: 4167-4183, 2008;Uchiyama, Vet. J. 184: 208-211, 2010)と類似する。マウスにおける2日間のPKスクリーニング研究は、全てのネオグリコシル化ウシFSH「5R」類似体が、bFSH−WTおよびFolltropin(登録商標)−Vと比較して、末端の半減期を増加させたことを示した(図2Aおよび2B)。PKスクリーニングアッセイからのデータは、bFSH−WT、Folltropin(登録商標)−VおよびTR4401対照と比較して、1つまたは2つの導入されたネオグリコシル化部位(挿入断片1および2)のグリコシル化が、血漿半減期を大きく延長したことを示した。観察されたレベルは、29アミノ酸リンカーおよび4−5O連結炭水化物鎖を有するbFSH−単鎖分子に匹敵した。「挿入断片1および2」と称される、組み合わせたスーパーアゴニストおよびネオグリコシル化挿入断片として作製された、2つの最初に試験された類似体は、5Rスーパーアゴニスト対照単独に匹敵するin vitro生物活性を有していたが(図1C)、マウスにおける半減期は長いままであった(図2B)。スーパーアゴニスト活性が減少していないかかる長時間作用性の類似体は前例がないことから、乳牛におけるin vivoでの素晴らしい成績が期待される。
数百ミリグラムの様々なヒトFSHおよびTSHを、フラスコ、振盪機、ローラーボトルおよびバイオリアクターを使用して、CHO細胞で組換え体として産生させた(rFSHまたはrTSH)。研究の初期に、ジシストロニックなレトロウイルスベクター系をCHO−DG44細胞におけるFSHおよびTSH類似体の高レベル発現のために最適化した。ヒトrFSH調製物を試験した。単回60μg用量のrFSHは、卵胞発達を誘導し、4日にわたって1日2回投与される以前最適化されたFolltropin(登録商標)−V(300mg)の8回の注射に相当する、質の高い多数の胚をもたらした。これから、I.M.注射後の吸収遅延、および増強されたFSH受容体駐在時間などのそのユニークな特性がさらに支持される。図3および5〜8を参照されたい。10μg用量でのrFSHスーパーアゴニストは、12日にわたって、成長中の卵胞、特に、低FSH受容体数を有することがヒトにおいて既知でもある、3〜5mmのサイズ範囲の卵胞の増強されたプールを動員し、維持する別格の能力を示した(データは示さず)。対照Folltropin(登録商標)−Vの以前最適化された投薬では観察されなかった、rFSHによる小卵胞のこの予想外の増強および補助は、サイクルの任意の段階でFSH反応性卵胞を動員し、減少したFSH受容体数または機能に起因する多くの良好でない反応者において、IVFおよび過剰排卵を成功させる可能性を増加させるための新しい方法となる(Perez Mayorga, J. Clin. Endocrinology 152: 3268-3369, 2000;Levallet, Arch. Med. Red. 30: 486-494, 1999;Rannikko, Mol. Hum. Reprod. 8: 311-317, 2002;Cai, Feril. Steril. 87: 1350-1356, 2007)。しかしながら、4アルギニン置換を有するウシFSHとヒトFSHベースのアルファサブユニット間の40アミノ酸相違のために、同じ乳牛におけるrFSHでの以前の処置からの持ち越し効果が観察され、これは、ウサギおよびアカゲザルにおけるヒトFSHの免疫原性特性を示す以前のデータ研究と一致した(Cai, Int. J. Toxicol. 30: 153-161, 2011;De Castro, Theriogenology 72: 655-662, 2009)。
共通のアルファサブユニットの特定の修飾許容領域へのアルギニン(R)またはリシン(K)残基の導入は、進化の過程で糖タンパク質ホルモンの活性を調節し(Szkudlinski, Nat. Biotechnol. 14: 1257-1263, 1996;Szkudlinski, Physiol. Rev. 82: 473-502, 2002)、糖タンパク質ホルモン受容体のヒンジ領域に位置する負に帯電したクラスターとの静電相互作用において重要な役割を果たす(Mueller, Trends Endocrinol. Metab. 21 : 111-122, 2010;Mueller, J. Biol. Chem. 284: 16317-16324, 2009;Mueller, Endocrinol. 152: 3268-3278, 2011)ことが以前示された。特異的bFSHスーパーアゴニスト開発は、本明細書でのデータならびにhFSHおよび他の糖タンパク質ホルモン類似体に関する他の研究(Szkudlinski, Physiol. Rev. 82: 473-502, 2002)に示されたような、作用の持続時間を増加させる吸収遅延の可能性を伴う、より強力かつ有効な分子を作製するための、4〜5Rおよび/またはKへの最小の置換を含む。増加したスーパーアゴニスト効力/有効性を減少させることなく、単回注射類似体を作製するために、半減期を増加させるための1つまたは2つの炭水化物ネオグリコシル化部位を含有する最小の長さのアミノ酸挿入断片も検討されてきた(図4を参照されたい)。さらなる分析のために、野生型配列のアミノ酸6と8の間に位置するペプチド挿入断片NVTINV、NVTINVT、NVおよびNVTを含有する8つの構築物が使用され得る。本明細書でのデータに示されるように、以前のネオグリコシル化およびペグ化研究(Trousdale, Feril. Steril. 91 : 265-270, 2009;Uchiyama, Vet J. 184: 208-211, 2010;Perlman, J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3227-3235, 2003)とは対照的に、増加したスーパーアゴニスト効力/有効性を減らすことなく、半減期を増加させるための複合炭水化物を含有する最小の長さのアミノ酸挿入断片を設計することが可能である。これらの新規な類似体は、PEIおよびローラーボトルを使用した最適化高発現系の方法を使用して、CHO−K1細胞における一過性トランスフェクションによって発現され得る。
一過性トランスフェクションによって発現された、選択された4〜6類似体の精製は、SP Sepharoseカラムを使用した捕獲ステップを使用して行なわれてもよく、その後に、Mono Qイオン交換クロマトグラフィーによる類似体の選択、およびその後のゲルろ過を使用した最終精錬が続く。bFSH類似体の純度は、98%よりも大きくてもよい。累積回収は、総計50倍の精製で50%に達し得る。全ての類似体は、ELISAイムノアッセイ、CHO−FSHR細胞系を使用したロバストin vitro cAMPバイオアッセイ、SDS−PAGE電気泳動および等電点電気泳動(IEF)ゲル分析によって、in vitroで特徴付けられ得る。選択された精製類似体は、逆相HPLCによる厳密な定量化、炭水化物組成分析ならびに安定性および凝集状態の評価によっても分析され得る。
さらなる実験では、ウシFSH類似体TR55601(アルファサブユニット:配列番号7)を作製したがこれは、アルファサブユニットの15K、17K、18K、20K、および24Kにおけるアルギニン(R)への置換、およびアルファサブユニットの6Fと7Tの間のNVTINV(配列番号1)挿入断片を含む。TR55601のいくつかのロットを得、IEFおよびウエスタンブロット分析を使用して試験した。図3A〜Dは、分析の例示的な結果を示す。図3A〜3Dから、部分的に、TR55601/ロット4およびロット5が最適な分布を示すことが実証され、このロットにおける変異の有効性が確認させる。ロット4および5ならびに同様のスクリーニング結果を有するロットを動物処置において使用した。例えば、IEF−ウエスタンブロット分析は、図3A〜Cにおけるロット4およびロット5のTR56001の最適化酸性アイソフォームを例示する。一方、図3Aおよび3Cに示すように、ロット3では完全な確証は得られなかったので、動物処置に使用しなかった。bFSH類似体および特にTR55601の試料もマウスにおけるPKスクリーニングアッセイで研究した。マウスに選択されたbFSH試料を皮下注射し、血液試料を注射後24、32、および48時間で採取した。血漿を単離し、bFSH ELISA(Endocrine Technologies,Inc.)で分析した。TR55601試料のロット4の延長された半減期をPKスクリーニングアッセイで確認した。データは示していない。
選択された候補類似体の完全な薬物動態学的プロファイルは、ラットあたり10μgの単回用量のsc投与および分布と排出期の両方にわたる10の異なる血液採取時間(1、5、15、30分ならびに1、2、6、24および48時間)によって実行してもよい。ウシFSH血漿レベルは、bFSH−ELISAを使用して血漿において定量化され得る。完全なPK分析を行なってもよい。
バイシストロニック発現ベクターを構築するため、ならびに大規模産生、精製およびウシにおける過剰排卵研究のための調製におけるCHO−DG44細胞での類似体発現の選択および増幅のために、類似体を選択した。CHO−DHFR(−)DG44細胞を発現ベクターで同時トランスフェクトし、メトトレキサート(MTX)の段階的増加を含有する培養培地中での遺伝子増幅に供した。細胞は、再び多角形形態をとったら(2〜3週)、次の増幅ステップに適格とした。>2pg/細胞/日の分泌レベルを示すクローンを、GSマーカー遺伝子(MSX)の増幅を誘導する第2の処置に供してもよい。さらに2〜5倍増加し、最大10pg/細胞/日の分泌レベルに達することがある。
調製およびアルファサブユニット類似体での実験
rFSHは、単回筋肉内(I.M.)注射後に過排卵反応を誘導し、60μgが最適用量に非常に近いと思われるが、乳牛を3回以上rFSHに曝露した場合、過排卵反応の著しい減少があった。したがって、「5R」置換、およびF6とT7の間のNVTINVの挿入断片を有するアルファサブユニット(配列番号7)を含む、TR55601 rFSHと称される新しいrFSH製剤を試験するために実験を設計した。目的は、食用牛における過排卵反応を誘導するrFSHでの単回または分割用量処置の効果を最初に決定し、次いでrFSHの単回注射の過排卵反応をさらに評価して、乳牛をrFSHに2または3回曝露した場合に過排卵反応が高いままであるかどうかを決定することであった。
TR55601 FSH試料を、古典的Steelman−Pohley FSHバイオアッセイ(Steelman et al., Endocrinol. 53: 604-616, 1953)によりラットにおいてin vivoで分析した。40IUのhCGを補充した試験物品(例えばbFSH)またはビヒクルの単回用量を、雌スプラーグドーリーラット(200〜220g)に注射した。卵巣質量を投薬後72時間で測定した。図4を参照されたい。各群をhCGで処置して、ベースラインを提供する。全ての濃度でのTR55601 bFSHは、卵巣質量を著しく増加させる。
rFSHは、単回筋肉内(I.M.)注射後に過排卵反応を誘導し、60μgが最適用量に非常に近いと思われるが、乳牛を3回以上rFSHに曝露した場合、過排卵反応の著しい減少があった。したがって、「5R」置換、およびF6とT7の間のNVTINVの挿入断片を有するアルファサブユニット(配列番号7)を含む、TR55601 rFSHと称される新しいrFSH製剤を試験するために実験を設計した。目的は、食用牛における過排卵反応を誘導するrFSHでの単回または分割用量処置の効果を最初に決定し、次いでrFSHの単回注射の過排卵反応をさらに評価して、乳牛をrFSHに2または3回曝露した場合に過排卵反応が高いままであるかどうかを決定することであった。
TR55601 FSH試料を、古典的Steelman−Pohley FSHバイオアッセイ(Steelman et al., Endocrinol. 53: 604-616, 1953)によりラットにおいてin vivoで分析した。40IUのhCGを補充した試験物品(例えばbFSH)またはビヒクルの単回用量を、雌スプラーグドーリーラット(200〜220g)に注射した。卵巣質量を投薬後72時間で測定した。図4を参照されたい。各群をhCGで処置して、ベースラインを提供する。全ての濃度でのTR55601 bFSHは、卵巣質量を著しく増加させる。
図5は、過剰排卵、排卵の誘導および固定時間人工授精に関する卵胞波同調プロトコールを示し、ここで、Folltropin−VR(Bioniche)の8回の注射をTR55601の単回または二重注射で置き換える。処置は、第0日のプロゲステロン(P4)放出腟内デバイスの挿入およびベンゾエートエストラジオール(BE)の投与を含んだ。過排卵処置を単回または二重注射として与えられるTR55601で第4日に開始した。第2の分割用量注射は、第6日のPGF2a処置と同時であった。プロゲステロンデバイスを第7日の最後のFSH注射とともに除去した。第8日に、ドナーにブタLHを投与し、12および24時間後にまたは第8日(pLH後16時間)に1回、発情期検出なしに授精させた。卵子/胚を第15日に非外科的に採取した(2、3)。Folltropin−V(登録商標)を対照として使用した;総計300mg*を4日にわたる1日2回の8回の筋肉内(IM)注射で投与した(mg*−高度に不純なNIH−FSH−P1参照標準に基づく)。
特に、30頭の非泌乳Red Angus乳牛をそれらの以前の胚作製歴に基づいて階層化し、ブロック化し、3つの処置群の1つにランダムに割り当てた。対照群(n=10)の乳牛に、300mg Folltropin−Vを4日の期間にわたって投与される1日2回の減少用量プロトコールでI.M.で投与した。具体的には:第4日、3.0mL(amおよびpm);第5日、2.5mL(amおよびpm);第6日、1.5mL(amおよびpm)および第7日、0.5mL(amおよびpm)。rFSH 60μg処置群の乳牛に60μg rFSHの単回I.M.注射を投与し、rFSH 40〜20μg処置群の乳牛に第4日に40μg rFSHのI.M.注射、その後第6日に20μg rFSHの別のI.M.注射を投与した。
次いで、30頭の乳牛のうち25頭をFolltropin−V(対照)または60μgのrFSHの単回注射で再び超刺激した。対照群(n=10)の動物は、対照群のままであり、実験1におけるrFSH 60μgの10頭の乳牛のうち8頭をrFSHの単回I.M.注射によって再び処置した。さらに、rFSHの分割単回注射(split−single injection)で以前処置した10頭の乳牛のうち7頭をrFSHの単回I.M.注射で処置した。胚採取間の間隔は、29日であった。
第2の実験において使用した25頭の乳牛のうち24頭をFolltropin−V(対照)または60μgのrFSHの単回注射で再び超刺激した。ここでも、対照乳牛は対照群のまま、rFSH乳牛はrFSH群のままとした。胚採取間の間隔は、30日である。
第2の実験において使用した25頭の乳牛のうち24頭をFolltropin−V(対照)または60μgのrFSHの単回注射で再び超刺激した。ここでも、対照乳牛は対照群のまま、rFSH乳牛はrFSH群のままとした。胚採取間の間隔は、30日である。
第0日(実験の開始)に、全ての動物に5mgエストラジオール−17βに加えて50mgプロゲステロンおよびプロゲステロンを含浸させた腟内デバイス(Cue−Mate,Bioniche Animal Health)を与えた。第4日(卵胞波出現の予想日)に、全ての乳牛を上記の群に従って超刺激した。単回I.M.注射rFSHに関する60μg用量は、7.5mLを構成し、Folltropin−Vを減少用量プロトコールで8回のI.M.注射で投与した。全ての動物に500μgのクロプロステノール(Cyclase、Syntex、Argentina)を朝および夕方に第6日にI.M.で与えた。Cue−mateを第6日の夕方に除去した。第8日の朝に、乳牛に100μgのゴナドレリン(Gonasyn、Syntex Argentina)を与え、12および24時間後に授精させた。全ての乳牛を同じ雄ウシからの凍結精液で授精させた。卵子/胚を第15日に非外科的に採取し、IETS推奨に従って評価した。
全ての乳牛をCLの存在ならびに卵胞サイズおよび数に関して第0、4、6および8日に超音波的に試験して、卵胞成長プロファイルを決定した。排卵反応を、第15日に超音波検査および直腸触診によってCLおよび直径が>10mmの卵胞の数を計数することによって、確認した。
各実験では、データポイントを分散の正規性および均一性に関して最初に評価した。分散は、群間で異なったので、データを平方根によって変換し、一元配置ANOVAによって分析した。3つ実験が終わった後、全体的な反応の分析を二元配置ANOVAによって行なって、実験数および処置ならびにそれらの相互作用の効果を検出することになる。平均を保護されたLSD検定によって比較した。卵胞データをMIXED手順によって分析して、卵胞数および成長プロファイルに及ぼす処置、日およびそれらの相互作用の効果を検出した。全ての分析をInfostat Analytical Software(Universidad Nacional de Cordoba,Argentina)を使用して行なった。
各実験では、データポイントを分散の正規性および均一性に関して最初に評価した。分散は、群間で異なったので、データを平方根によって変換し、一元配置ANOVAによって分析した。3つ実験が終わった後、全体的な反応の分析を二元配置ANOVAによって行なって、実験数および処置ならびにそれらの相互作用の効果を検出することになる。平均を保護されたLSD検定によって比較した。卵胞データをMIXED手順によって分析して、卵胞数および成長プロファイルに及ぼす処置、日およびそれらの相互作用の効果を検出した。全ての分析をInfostat Analytical Software(Universidad Nacional de Cordoba,Argentina)を使用して行なった。
過排卵反応および卵子/胚データを表3に要約する。CLおよび卵子/胚採取日に≦2CLを有する乳牛の平均数は、群間で異ならなかったが、rFSHの分割注射は、より高い(P<0.05)数の非排卵卵胞をもたらした。総卵子/胚、受精卵および移植可能な胚(グレード1、2&3)の平均数も異ならなかった。
表3は、TR55601(rFSH)の単回または分割単回用量での過剰排卵を示す。
第2の投薬に関する過排卵反応および卵子/胚データを表4および5に要約する。CL、>10mmの卵胞および卵子/胚採取日に≦2CLを有する乳牛の平均数は、群間で異ならなかった。総卵子/胚、受精卵および移植可能な胚(グレード1、2および3)の平均数も群間で異ならなかった。
表4および5は、TR55601(rFSH)の単回用量での過剰排卵を示す。
表3は、TR55601(rFSH)の単回または分割単回用量での過剰排卵を示す。
表4および5は、TR55601(rFSH)の単回用量での過剰排卵を示す。
表6は、30日間隔でのTR55601(rFSH)での3つ過剰排卵を示す。
表7は、非泌乳乳牛における過剰排卵モデルの卵胞数を示す。卵胞発達(平均±SEM)を単回I.M.注射によって与えた60μgのrFSHまたは4日にわたる1日2回のI.M.注射によって与えた300mg Folltropin(登録商標)−Vで処置した食用牛の超音波検査によって検出した。
この一連の実験で得られた結果は、rFSH産物が、Folltropin−Vのものと異ならない、食用牛における過排卵反応を誘導するということを示唆すると解釈され得る。乳牛を連続的に3回処置した場合、Folltropin−Vと比較して、過排卵反応の減少を示す証拠もない。最終投薬における過排卵反応は、最初の2回と同様であると思われ、これは、後の卵子/胚採取で確認されることになる。rFSHで処置した乳牛における非排卵(>10mm)卵胞がより多数であることに関する懸念があり(主に2頭の乳牛における非排卵卵胞の多さによる)、これについてはさらに検討すべきである。食用および酪農乳牛を過剰排卵させるためのrFSHの最適な投薬量を決定するため、およびrFSHで3回より多く連続的に処置することの長期効果を決定するためのさらなる研究も必要である。
改善された半減期に関する挿入断片の特異性
観察された、改善された半減期が配列番号1の挿入断片の配列に特異的であるかどうかを決定するために、挿入断片を有するヒトアルファサブユニットを修飾して、アミノ末端バリンを除去した。次いで、2つを、挿入断片を欠く類似体とともにcAMPを生成するそれらの能力に関して試験した。研究において、この挿入断片が配列特異的であり、優れた結合および半減期をアルファサブユニットに与えることが示された(図10を参照されたい)。次いで、生成条件を、生成が最大になるように最適化するために、様々な成長条件において試験した(表8を参照されたい)。
表8は、ヒトアルファサブユニットの産生の最適化を示す。
観察された、改善された半減期が配列番号1の挿入断片の配列に特異的であるかどうかを決定するために、挿入断片を有するヒトアルファサブユニットを修飾して、アミノ末端バリンを除去した。次いで、2つを、挿入断片を欠く類似体とともにcAMPを生成するそれらの能力に関して試験した。研究において、この挿入断片が配列特異的であり、優れた結合および半減期をアルファサブユニットに与えることが示された(図10を参照されたい)。次いで、生成条件を、生成が最大になるように最適化するために、様々な成長条件において試験した(表8を参照されたい)。
表8は、ヒトアルファサブユニットの産生の最適化を示す。
例示的eCG類似体
試料変異ウマアルファサブユニットを野生型ウマサブユニットに基づいて構築した。変異ウマアルファサブユニットを用いて機能的eCGを産生させた。以下の表9は、ウマアルファサブユニットにおける置換(下線でマークを付けた)および挿入(下線およびイタリック体でマークを付けた)を示す。変異アルファサブユニットに基づくeCG類似体を類似体#2、#3および#4として標識した。
eCGでのLH受容体アッセイ
黄体ホルモン(LH)受容体を発現する細胞に及ぼすウマCG類似体の効果を試験するために実験を行なった。
図12は、野生型および変異ウマCGによる3時間のげっ歯類LH受容体を発現する293細胞におけるcAMP刺激を示す。特に、CHO−rLHR細胞を刺激の24時間前に96ウェルプレートに蒔いた。次いで、細胞を37℃で3時間、1mMイソブチル−メチルキサンチン(IBMX)を補充した成長培地に希釈された種々の濃度のeCG調製物および負の対照Gonal−F(精製ヒトFSH)と共にインキュベートした。培地中に蓄積したcAMPを、市販のcAMP ELISA(cAMP EIA Kit、Cayman Chemical)によって測定した。全ての類似体を、CHO−K1細胞における一過性トランスフェクションを使用して産生させた。EMD Millipore製のCentriprep YM−10、10kDaを使用してろ過した培地中の類似体の濃度を、ウマCG Elisa(Endocrine Technologies)を使用して決定した。PMSG(妊馬血清性ゴナドトロピン、ウマCG)を、メタリン酸でのpH分画および二段階エタノール沈降によって得た。
図13は、ラットLH受容体(rLHR)を発現するMLTC−1細胞におけるプロゲステロン刺激に基づくeCG類似体(#2、#3および#4)のin vitro LH生物活性を示す。具体的には、MLTC−1−rLHR細胞を刺激の24時間前に96ウェルプレートに蒔いた。次いで、細胞を37℃で6時間、1mMイソブチル−メチルキサンチン(IBMX)を補充した成長培地に希釈された種々の濃度のeCG調製物および対照Gonal−F(ヒトFSH)と共にインキュベートした。培地中に蓄積したプロゲステロンを市販のプロゲステロンELISA(EIA Kit、DRG Instruments)によって測定した。全ての類似体を、CHO−K1細胞における一過性トランスフェクションを使用して産生させた。EMD Millipore製のCentriprep YM−10、10kDaを使用してろ過した培地中の類似体の濃度を、ウマCG Elisa(Endocrine Technologies,Inc.)を使用して決定した。生物活性対免疫反応性(B/I)比を計算し、対照PMSG調製物に関するB/I比と比較した。
図12〜13に示すように、野生型および変異ウマCGは、げっ歯類LH受容体を活性化する能力がある。図12〜13からは、位置15、18、20および24での置換を含む変異ウマCGが野生型ウマCGおよびPMSGと比較して増強された生物活性を示したことも分かる。
eCGでのFSH受容体アッセイ
卵胞刺激ホルモン(FSH)受容体を発現する細胞に及ぼすウマCG類似体の効果を試験するために実験を行なった。
eCGでのFSH受容体アッセイ
卵胞刺激ホルモン(FSH)受容体を発現する細胞に及ぼすウマCG類似体の効果を試験するために実験を行なった。
図14は、野生型ヒトFSH受容体(hFSHR)を安定に発現するCHO細胞におけるcAMP刺激に基づくeCG類似体(#2、#3および#4)のin vitro FSH生物活性を示す。PMSG(妊馬血清性ゴナドトロピン、ウマCG)は、メタリン酸でのpH分画および二段階エタノール沈降によって得る。具体的には、CHO−hFSHR細胞を刺激の24時間前に96ウェルプレートに蒔いた。次いで、細胞を37℃で2時間、1mMイソブチル−メチルキサンチン(IBMX)を補充した成長培地に希釈された種々の濃度のeCG調製物および対照Gonal−F(高精製ヒトFSH)と共にインキュベートした。培地中に蓄積したcAMPを、市販のcAMP ELISA(cAMP EIA Kit、Cayman Chemical)によって測定した。全ての類似体を、CHO−K1細胞における一過性トランスフェクションを使用して産生させた。EMD Millipore製のCentriprep YM−10、10kDaを使用してろ過した培地中の類似体の濃度を、ウマCG Elisa(Endocrine Technologies)を使用して決定した。
図14に示すように、野生型および変異ウマCGには、ヒトFSH受容体を活性化する能力がある。図14から、位置15、18、20および24での置換を含む変異ウマCGが野生型eCGおよびPMSGと比較して増強された生物活性を示したことも分かる。
Claims (40)
- アルファサブユニットのアルファ−L1ループにおける少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換、およびアルファサブユニットのN末端近くの1つまたは複数の挿入断片を有するアミノ酸配列を含む修飾糖タンパク質ホルモンであって、前記挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して、NX1T、NX2S、またはNNX3X4、グリコシル化部位をアルファサブユニットに導入し、X1、X2、X3、およびX4が独立に任意のアミノ酸である修飾糖タンパク質ホルモン。
- 前記挿入断片のそれぞれがNX1TまたはNX2Sを含み、X1およびX2が独立に、プロリンを除く任意のアミノ酸である、請求項1に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 前記挿入断片のそれぞれがNX1Tを含む、請求項1または2に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 前記挿入断片が、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのF6とT7の間にあり、野生型糖タンパク質が、配列番号2、3、4、5、47、および50からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 単一の挿入断片があり、前記挿入断片がΝΧ1ΤyΝΧ1であり、yがVまたはIである、請求項1から4のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 前記挿入断片がNVTINV(配列番号1)である、請求項1から5のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- X1およびX2が独立にV、I、またはAである、請求項1から6のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 前記挿入断片が2つのNX1Tグリコシル化部位をアルファサブユニットに導入する、請求項1から7のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 2つのNX1Tグリコシル化部位が単一アミノ酸VまたはIによって隔てられている、請求項8に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 前記挿入断片のそれぞれがNNを含み、X3およびX4が独立にTまたはSである、請求項1から9のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- X3X4がTT、TS、ST、またはSSである、請求項1から10のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- NX1T、NX2S、およびNNX3X4グリコシル化における少なくとも1つのアミノ酸が前記挿入断片の一部ではない、請求項1から11のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15、17、18、20、または24での少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15、17、18、20、または24での少なくとも2つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項1から13のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15、17、18、20、または24での少なくとも3つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項1から14のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15、17、18、20、または24での少なくとも4つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15、17、18、20、および24での5つの塩基性アミノ酸置換を含む、請求項1から16のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K、または24Kでの少なくとも1つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号2、3、4、5、47、50、53、55、57、59、61、63、67、および69から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から17のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K、または24Kでの少なくとも2つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号2、3、4、5、47、50、53、55、57、59、61、63、67、および69から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から18のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K、または24Kでの少なくとも3つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号2、3、4、5、47、50、53、55、57、59、61、63、67、および69から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から19のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K、または24Kでの少なくとも4つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号2、3、4、5、47、50、53、55、57、59、61、63、67、および69から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から20のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、20K、および24Kでの5つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号2、3、4、5、47、50、53、55、57、67、および69から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から21のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置15K、17K/17G/17L、18K/18E、および24Kでの4つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが、配列番号59、61、および63から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1から22のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットのアミノ酸位置12K、14K、15E、17N、および21Kでの5つの塩基性アミノ酸置換を含み、野生型糖タンパク質ホルモンアルファサブユニットが配列番号65のアミノ酸配列を有する、請求項1から23のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 黄体ホルモン(LH)のベータサブユニットをさらに含む、請求項1から24のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 絨毛性ゴナドトロピン(CG)のベータサブユニットをさらに含む、請求項1から25のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 卵胞刺激ホルモン(FSH)のベータサブユニットをさらに含む、請求項1から26のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 甲状腺刺激ホルモン(TSH)のベータサブユニットをさらに含む、請求項1から27のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項1から28のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- アルファサブユニットが哺乳動物アルファサブユニット由来である、請求項1から29のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- アルファサブユニットがヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、トラ、ライオン、パンダ、オポッサム、またはウサギアルファサブユニット由来である、請求項30に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- アルファサブユニットが鳥類アルファサブユニット由来である、請求項1から31のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- アルファサブユニットが魚アルファサブユニット由来である、請求項1から32のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモン。
- 請求項1から33のいずれか1項に記載の修飾糖タンパク質ホルモンを動物に投与することを含む、動物における糖タンパク質ホルモン受容体を刺激するための方法。
- 動物が哺乳動物である、請求項34に記載の方法。
- 哺乳動物がウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、シカ、イヌ、トラ、ライオン、パンダ、シマウマ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ラマ、ウサギ、トナカイ、水牛、またはヤクである、請求項35に記載の方法。
- 動物が鳥類である、請求項34に記載の方法。
- 鳥類がニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ハト、ホロホロチョウ、またはダチョウである、請求項37に記載の方法。
- 動物が魚類である、請求項34に記載の方法。
- 魚類がコイ、サケ、テラピア、ナマズ、シーバス、タイ、またはハタである、請求項39に記載の方法。
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