CN101389346A - 人glp-1模拟体、组合物、方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少一种新的人GLP－1模拟体或特定部分或变体，包括编码至少一种GLP－1模拟体或特定部分或变体的分离核酸、GLP－1模拟体或特定部分或变体、载体、宿主细胞、转基因动物或植物，及其制备和使用方法，包括治疗组合物、方法和装置。

Description

人GLP-1模拟体、组合物、方法和用途
发明背景
发明领域
本发明涉及对有生物活性的蛋白、片段或配体具有特异性的哺乳动物GLP-1模拟体(mimetibody)、特定部分或变体，GLP-1模拟体编码核酸和互补核酸、宿主细胞，及其制备和使用方法，包括治疗制剂、施用和装置。
背景技术
重组蛋白是一类新兴的治疗剂。这种重组体疗法在蛋白质制剂和化学修饰方面已取得了进展。这种修饰可潜在地增强治疗性蛋白质的治疗效用，例如通过延长半衰期(例如，通过阻碍其暴露于蛋白水解酶)，增强生物活性或减少有害副作用。一种这样的修饰是利用被融合至受体蛋白，如enteracept的免疫球蛋白片段。人们也曾利用Fc区构建治疗性蛋白质，试图提供较长的半衰期或整合诸如Fc受体结合、A蛋白结合和补体结合的功能。
糖尿病是一种正在发展的流行病，到2025年其估计感染超过3亿人，还没有有效的药物治疗方法。2型糖尿病占所有病例的90-95％。持续提高的血糖水平导致的并发症包括心血管病、肾病、神经病和视网膜病。另外，在2型糖尿病的后期，胰脏的β-细胞死亡，因此停止分泌胰岛素。现在对于糖尿病的治疗与各种各样的副作用相联系，所述的副作用包括低血糖和体重增加。另外，现在对于2型糖尿病的治疗不能治愈疾病，而是简单地延长时间直到病人需要胰岛素疗法为止。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种在口服葡萄糖刺激之后由肠L-细胞分泌的含有37个氨基酸的肽。随后在第6位和第7位之间的内源性裂解产生了有生物活性的GLP-1(7-37)肽。GLP-1(7-37)肽序列可以分为两个结构域。肽的氨基酸末端结构域参与信号活动，而肽的其余部分看来似乎以螺旋构象与GLP-1受体胞外环结合。对葡萄糖作出应答，活性GLP-1与胰脏的GLP-1受体结合，并导致胰岛素分泌的增加(促胰岛素活性)。另外，已经证明GLP-1减少胃排空，其减少释放到循环中的葡萄糖的量，并可能减少食物摄入。这些作用组合起来就降低了血糖水平。也已经证明GLP-1抑制细胞凋亡，促进胰脏中-细胞的增殖。因此，GLP-1是糖尿病患者降低血糖和保护胰脏-细胞的有吸引力的治疗剂。另外，GLP-1的活性受血糖水平的控制。当血糖水平降低到某一阈值水平时，GLP-1无活性。因此，没有发生与GLP-1治疗相关的低血糖症的危险。
临床上已经证明了GLP-1治疗的可行性。六周的GLP-1注射有效地降低了2型糖尿病患者空腹血糖水平和8小时平均血糖水平。GLP-1治疗也导致β-细胞功能的改善。目前在临床试验中Exenatide是一种GLP-1类似物。首先在希拉毒蜥(gila monster)唾液中鉴定出Exenatide，其与GLP-1有53％的同源性。Exenatide能结合GLP-1受体，并起始由GLP-1(7-37)引起的负责多种活性的信号传导级联。迄今为止，其已被证实能降低2型糖尿病患者的HbA1c水平和血清果糖胺水平。另外，其抑制健康受检志愿者的胃排空，并且抑制他们的食物摄入。
但是，GLP-1在体内被蛋白酶二肽基肽酶IV(DPP-IV)所迅速失活。因此，涉及GLP-1肽的治疗的用途受到了它们的迅速清除和短半衰期的限制。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟。当皮下给药时，GLP-1(7-36)酰胺的作用时间为约50分钟。甚至抗内源性蛋白酶裂解的类似物和衍生物也没有足够长的半衰期以避免在24小时的时间段中重复给药。例如，Exenatide抗DPP-IV，然而由于其在体内药物动力学中的短半衰期和显著的变异性，仍然需要每日两次餐前定量给药。在临床试验普遍使用的另一种化合物NN2211，是一种富含脂质的GLP-1类似物。它被认为能每日一次定量给药。
当需要在长时间内维持治疗剂的高血液水平时，治疗剂的迅速清除是不方便的，因为必需重复给药。此外，长效化合物对于过去的治疗方案只包括口服药物的糖尿病患者特别重要。这些患者通常对于包括多次药物注射的方案具有极为困难的时间过渡。具有增长的半衰期的GLP-1治疗相对其它开发中的GLP-1肽和化合物而言具有明显的优势。
因此，需要提供GLP-1治疗性蛋白质的改良和/或修饰型，以克服上述一个或多个难题，以及本领域已知的其它难题。模拟体技术为肽疗法提供了新的递送平台。GLP-1模拟体就可以提供以持续的方式来递送GLP-1肽的方法，提供了对目前开发中的GLP-1肽进行的改进。此外，基于其二聚体结构和组织分布特性，GLP-1模拟体对于胰岛素分泌、β-细胞保存和食物摄入有可辨的特征。
发明概述
如此处所描述和/或实现的内容，并结合本领域所已知的内容，本发明提供了人GLP-1模拟体，包括修饰的免疫球蛋白、裂解产物和其它特定部分及其变体，也提供了GLP-1模拟体组合物、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、装置、转基因动物、转基因植物，及其制备和应用方法。
本发明也提供了如此处所描述和/或本领域已知的至少一种分离GLP-1模拟体或特定部分或变体。该GLP-1模拟体可任选地包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接相连，该铰链区或其片段与至少一个部分可变区(V)直接相连，该部分可变区与任意接头序列(L)直接相连，该接头序列与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。
在一对CH3-CH2-铰链-部分V区序列-接头-治疗性肽序列的一种优选实施方案中，该对序列任选地通过缔合或共价键连接，例如，但不仅限于至少一个Cys-Cys二硫键连接或至少一个CH4或其它免疫球蛋白序列。一种实施方案中，GLP-1模拟体包括式(I)：
a.(P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如，但不仅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE等，或其亚类等，或其组合。
抗体序列的可变区可以是，但不仅限于SEQ ID NO：47-55中至少一种氨基酸序列的至少一个部分，或者如表1所示的其片段，进一步可选择地包含如PCT公开文本WO 05/05604(PCT US04/19898)图1-9所示的相应的SEQ ID NO：1-9的至少一个置换、插入或缺失，该申请在2004年6月24日递交，在2005年1月20日公开。CH2区、CH3区和铰链区可以是，但不仅限于SEQ ID NO：56-64中至少一种氨基酸序列的至少一个部分，或者如表1所示的其片段，进一步可选择地包含如PCT公开文本WO 05/05604(PCT US04/19898)相应的SEQ ID NO：32-40的至少一个置换、插入或缺失，该申请在2004年6月24日递交，在2005年1月20日公开。
因此，本发明的GLP-1模拟体在保持固有特性和功能的情况下，模拟了抗体或免疫球蛋白结构或功能的至少一个部分，同时还提供了一种GLP-1治疗性肽及其所固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。采用此处描述的方法，并结合本领域已知的方法，可改变本发明抗体的多个部分和GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
本发明也提供了此处所描述和/或本领域已知的至少一种分离GLP-1模拟体或特定部分或变体，其中GLP-1模拟体或特定部分或变体具有至少一种活性，例如，但不仅限于与式(I)的P部分对应的至少一种具有生物活性的GLP-1肽或多肽的已知生物活性，如在此所描述或本领域已知的。
本发明一方面提供了至少一种分离的人GLP-1模拟体，其包含了SEQ ID NO：1中至少一种氨基酸序列，或可选择地具有此处描述的或本领域已知的一或多个置换、缺失或插入。另一方面，本发明中的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体模拟了对应于式(I)中的模拟体P部分的至少一种GLP-1肽或多肽与至少一种表位的结合，该表位包含了至少一种配体的至少1-3个氨基酸至完整氨基酸序列，该配体例如，但不仅限于GLP-1受体或其片段，其中配体与SEQ ID NO：1的至少一部分结合，或者可选择地与如此处所描述的或如本领域所已知的具有一个或多个置换、缺失或插入。上述至少一种GLP-1模拟体可任选地与GLP-1受体结合，该结合具有选自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M之一的亲和力。因此，可以用已知方法根据相应的活性来筛选GLP-1模拟体，例如，但不仅限于与受体或其片段的结合活性。
本发明进一步提供了本发明至少一种GLP-1模拟体的至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体或片段特异地与本发明的至少一种GLP-1模拟体相结合。该抗独特型抗体包括任何含有蛋白或肽的分子，该分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，所述部分可以是，但不仅限于重链或轻链的至少一种互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区、或其任意部分，其竞争性结合本发明至少一种GLP-1模拟体的GLP-1配体结合区。本发明的该独特型抗体可以包括或来源于任何哺乳动物，例如，但不仅限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明一方面提供了包含特定多核苷酸的分离核酸分子，与该特定多核苷酸互补的分离核酸分子，与该特定多核苷酸具有显著同一性的分离核酸分子或与其杂交的分离核酸分子，其中该特定多核苷酸编码至少一个GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体或其特定部分或变体，并包括其至少一个特定序列、区域、部分或变体。本发明进一步提供了包含至少一种上述分离GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗遗传型抗体的编码核酸分子的重组载体、含上述核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及上述GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗遗传型抗体的核酸、载体和/或宿主细胞的制备和/或应用方法。
本发明也提供了编码至少一种分离哺乳动物GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的分离核酸；包含该分离核酸的分离核酸载体，和/或包含该分离核酸的原核或真核宿主细胞。该宿主细胞可任选地至少为选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或上述细胞的任意衍生、无限增殖化或转化细胞之一的细胞。
本发明也提供了至少一种用于在宿主细胞中表达至少一种GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的方法，该方法包括在特定条件下培养此处所描述的和/或本领域已知的宿主细胞，在该条件下，至少一种GLP-1模拟体或GPL-1模拟体抗独特型抗体、或特定部分或变体以可检测和/或可回收的量被表达。也提供了一种生成至少一种GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的方法，包括在体外、体内或原位条件下，翻译GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体的编码核酸，使GLP-1模拟体或GLP-1模拟体抗独特型抗体以可检测或可回收的数量被表达。
本发明也提供了一种制备至少一种分离的人GLP-1模拟体或GLP-1抗独特型抗体的方法，该方法包括提供一种宿主细胞或转基因动物或转基因植物，所述的宿主细胞或转基因动物或转基因植物能以可回收的量表达GLP-1模拟体或GLP-1抗遗传型抗体。
本发明进一步提供了用以上方法制备的至少一种GLP-1模拟体。
本发明也提供了至少一种组合物，该组合物包含(a)此处描述的分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体编码核酸和/或GLP-1模拟体；和(b)一种合适的载体或稀释剂。根据已知的方式，该载体或稀释剂可任选为药学可接受载体或稀释剂。该组合物可任选地进一步包含至少一种其它的化合物、蛋白质或组合物。
本发明也提供了一种组合物，该组合物包含至少一种分离的人GLP-1模拟体和至少一种药学可接受的载体或稀释剂。该组合物进一步含有有效量的至少一种化合物或蛋白，该化合物或蛋白选自可检测标记或报道分子、抗感染药物、糖尿病或胰岛素代谢相关药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于平衡体液或电解液的药物、血液系统药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部用药物、营养药、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎症药物(NTHE)、镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
本发明也提供了至少一种用于送递治疗或预防有效量的至少一种本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物、装置和/或方法。
本发明进一步提供了至少一种GLP-1模拟体方法或组合物，当施加治疗有效量时，可用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种GLP-1相关状况，和/或如本领域已知和/或此处所描述的应用于相关状况之前、之后或期间。
本发明进一步提供了至少一种GLP-1模拟体、特定片段或变体的方法或组合物，当施加治疗有效量时，用于调节、治疗或缓解细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种代谢、免疫、心血管、传染性、恶性和/或神经疾病症状，和/或根据多种不同情况，例如，但不仅限于在本领域已知的相关疾病或治疗条件之前、之后或期间的需要而施用。
本发明进一步提供了用于方法或组合物的至少一种GLP-1模拟体、特定片段或变体，当施加治疗有效量时，用于调节、治疗或缓解至少一种糖尿病或胰岛素代谢相关紊乱、骨和关节紊乱、心血管紊乱、牙齿或口腔紊乱、皮肤病紊乱、耳、鼻或喉紊乱、内分泌或代谢紊乱、胃肠道紊乱、妇科紊乱、肝或胆紊乱、产科紊乱、血液紊乱、免疫或变应性紊乱、感染性疾病、肌骨骼紊乱、肿瘤紊乱、神经紊乱、营养紊乱、视觉紊乱、儿科紊乱、中毒紊乱、精神紊乱、肾紊乱、肺紊乱、或任何其它已知的紊乱(见，例如，Merck Manual，17th ed.，Merck ResearchLaboratories，Merck and Co.，Whitehouse Station，NJ(1999)，以其整体在此引入作为参考)，根据多种不同情况，例如，但不仅限于在本领域已知的相关疾病或治疗条件之前、之后或期间的需要而施用。
本发明也提供了本发明的至少一种GLP-1模拟体的至少一种组合物、装置和/或递送的方法，可诊断GLP-1相关状况。
本发明进一步提供了至少一种GLP-1模拟体的方法或组合物，可诊断细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种GLP-1相关状况，和/或如本领域已知和/或此处所描述的施用于相关状况之前、之后或期间。
本发明也提供了用于诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的疾病症状的方法，包括：(a)使细胞、组织、器官或动物接触或对其施用包含有效量的本发明至少一种分离的人GLP-1模拟体的组合物。该方法可任选地进一步包括采用在每0-24小时、1-7天、1-52周、1-24个月、1-30年或此处描述的任何范围或值内每千克细胞、组织、器官或动物重量施用0.001-50mg的有效量。该方法可任选地进一步包括通过至少一种选自肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮的方式接触或施用。该方法可任选地进一步包括在(a)接触或施用之前、同时或之后施用至少一种组合物，该组合物含有有效量的至少一种特定化合物或蛋白质，该化合物或蛋白质选自至少一种可检测标记或报道分子、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于体液或电解液平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部用药物、营养药、TNF拮抗药、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明也提供了包含本发明至少一种分离的人GLP-1模拟体的医学装置，其中该装置适合通过至少一种选自肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮的方式接触或施用至少一种人GLP-1模拟体。
本发明也提供了用于人药物或诊断用途的制品，包括包装材料和含有溶液或冻干形式的本发明至少一种分离人GLP-1模拟体的容器。该制品可任选地包括将容器作为肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮送递装置或系统的一个组成部分。
本发明进一步提供了此处所描述的任何发明。
附图说明
图1说明了显示重要功能域的IgG1支架中GLP-1 MMB的核苷酸和肽序列。
图2A-2C说明了GLP-1 MMB的FACS结合试验。图2A显示了GLP-1 MMB与过表达GLP-1R的HEK293细胞结合。灰色区域：GLP-1 MMB但无二抗；灰线：仅有二抗；虚线：阴性对照MMB和二抗；黑线：GLP-1 MMB和二抗。图2B显示了GLP-1 MMB不与对照的HEK293细胞结合。灰色区域：GLP-1 MMB但无二抗；黑线：仅有二抗；灰线：GLP-1 MMB和二抗。图2C显示了GLP-1肽类似物(A2S)能与GLP-1 MMB竞争性结合过表达GLP-1R的HEK293细胞。灰色区域：GLP-1 MMB但无二抗；黑线：GLP-1 MMB和二抗；断裂线：GLP-1 MMB、0.2nM竞争物、二抗；虚线：GLP-1 MMB，20nM竞争物、二抗；灰线：GLP-1 MMB、100nM竞争物、二抗)。
图3A-3E说明了GLP-1 MMB的cAMP试验。图3A：IgG1支架中的野生型GLP-1 MMB；图3B：GLP-1肽；图3C：IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2G)MMB；图3D：IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2S)MMB；图3E：IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的野生型GLP-1 MMB。
图4说明了GLP-1 MMB对DPP-IV裂解的抗性。
图5说明了GLP-1 MMB在血清中的稳定性。
图6表示GLP-1 MMB导致RINm细胞的胰岛素分泌。图6A显示GLP-1(7-36)肽和毒蜥外泌肽-4肽刺激RINm细胞的胰岛素分泌。图6B显示在IgG1或IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2S)MMB、或在IgG4(Ala/Ala，Ser->Pro)支架中的GLP-1(A2G)MMB在刺激RINm细胞的胰岛素分泌中能起作用。
图7表示GLP-1 MMB以剂量依赖的方式(图7B)来降低葡萄糖(图7A)。
图8显示猕猴的四种GLP-1 MMB(A2G、A2S、Ex-cap和野生型)药物代谢动力学图。
图9显示糖尿病鼠的口服葡萄糖耐量试验中GLP-1 MMB的作用。
图10显示长期给药的糖尿病鼠中GLP-1 MMB对空腹血糖的作用。
图11显示糖尿病鼠长期给药后进行口服葡萄糖耐量试验中GLP-1MMB的作用。
图12显示糖尿病鼠长期给药后GLP-1 MMB对减少HbA1c的作用。
图13显示正常猕猴的口服葡萄糖耐量试验中GLP-1 MMB对血糖(图13A)和胰岛素(图13B)水平的作用。
图14显示在单次给药后，GLP-1 MMB对糖尿病鼠胰岛的胰岛素染色的作用。
图15说明GLP-1 MMB对正常狗延迟胃排空。
图16说明GLP-1 MMB在饮食诱导肥胖鼠的口服葡萄糖耐量试验中降低血糖。
图17说明GLP-1 MMB在糖尿病鼠的腹膜内葡萄糖耐量试验中降低血糖(图17A)和降低胰岛素水平(图17B)。
图18说明GLP-1模拟体以剂量依赖性方式抑制细胞因子诱导的凋亡。将相对于未处理对照的凋亡百分比对GLP-1 MMB的浓度作图。
图19说明GLP-1模拟体增加INS-1E细胞中的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。A.柱形图显示在5.5mM葡萄糖存在下，在每个GLP-1 MMB浓度下分泌的胰岛素的量。此外，仅仅对3和7.5mM葡萄糖时分泌的胰岛素作图。B.用分泌的胰岛素的量对GLP-1 MMB的浓度作图。数据代入Hill公式，得到EC50为0.07nM。
图20说明GLP-1模拟体增加大鼠(图20A)和人胰岛(图20B)中的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。
图21显示GLP-1 MMB处理对正常C57/BLK6小鼠血糖水平的影响。
图22显示GLP-1 MMB处理对移植了人胰岛的边缘团块的STZ处理的糖尿病裸小鼠中的血糖水平(图22A)和葡萄糖耐量(图22B)的影响。在图22A中，用PBS处理的对照小鼠(X)和接受每日IP注射的GLP-1 MMB处理的小鼠(■)的血糖对时间(天)作图。在第0天移植人胰岛的边缘团块(50IEQ/g)，此后监测动物中的血糖。箭头表明当除去移植的胰岛时，导致迅速回复到糖尿病状态。在图22B中，用PBS处理的对照小鼠(X)和GLP-1 MMB(0.5mg/kg)处理的小鼠(■)的血糖对时间(分钟)作图。在小鼠接受每日IP注射持续30天以上后，进行IVGTT。使动物禁食过夜，然后进行IV葡萄糖注射(1.5g/kg)。监测小鼠的血糖，并且对注射后的时间作图。插图表示对照和GLP-1 MMB处理的动物的曲线下面积。
图23显示GLP-1 MMB对非人灵长动物(NHP)胰岛的葡萄糖诱导的胰岛素分泌的影响。
图24显示GLP-1 MMB对移植了边缘团块的STZ糖尿病NHPs的外源性胰岛素要求(图24A)和血红蛋白A1c(HgbA1c)(图24B)的影响。
发明详述
本发明提供了分离的、重组的和/或合成的模拟体或特定部分或变体，以及组合物和包含至少一种多核苷酸的编码核酸分子，该特定多核苷酸编码至少一种GLP-1模拟体。上述本发明模拟体或特定部分或变体包含了特定的GLP-1模拟体序列、区域、片段及其特定变体，且本发明也提供了上述核酸和模拟体或特定部分或变体的制备和应用方法，包括治疗性组合物、方法和装置。
本发明也提供了此处所描述和/或本领域已知的至少一种分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体。该GLP-1模拟体可任选地包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接相连，该铰链区或其片段(H)与至少一个部分可变区(V)直接相连，该部分可变区(V)与任意接头序列(L)直接相连，该任意接头序列(L)与至少一个治疗性肽(P)直接相连。
一种优选实施方案中，GLP-1模拟体包含式(I)：
((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1多肽，L为至少一个接头序列，其为通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，m、n、o、p、q、r、s和t可为0-10的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如，但不仅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE或其亚类等，或其组合。
因此，本发明GLP-1模拟体模拟了具有抗体固有特性和功能的抗体结构，同时提供了一种治疗性肽及其所固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。在t＝1时的优选实施例中，单体CH3-CH2-铰链区-部分J序列-接头序列-治疗性肽可通过缔合或共价键与其它单体相连，例如，但不仅限于Cys-Cys二硫键。采用此处所描述的方法，并结合本领域已知的方法，可改变本发明抗体的多个部分和至少一种GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
如果保持与补救受体的结合，CH3-CH2-铰链区的部分可以依照本发明被大量修饰来形成变体。在这样的受体中，可以去除一个或多个天然位点，这些位点提供了非本发明融合分子所需的结构特征或功能活性。可以通过例如，置换或缺失残基，将残基插入该位点，或截去包含该位点的部分来去除该位点。插入或置换的残基也可以是改变的氨基酸，例如肽模拟体或D-氨基酸。CH3-CH2-铰链区的变体可能缺少一个或多个天然位点或残基，其影响或者参与：(1)二硫键形成，(2)与所选的宿主细胞的不相容，(3)在所选的宿主细胞中表达的不均一，(4)糖基化作用，(5)与补体的相互作用，(6)与除补救受体以外的Fc受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。典型的CH3-CH2-铰链区变体包含如下的分子和序列：1.参与二硫键形成的位点被去除了。这样的去除可以避免与用于产生本发明的分子的宿主细胞表达的其它含半胱氨酸的蛋白质相反应。为了该目的，半胱氨酸残基可被缺失或用其它的氨基酸所置换(例如：丙氨酰基、丝氨酰基)。即使当半胱氨酸残基被缺失时，单链CH3-CH2-铰链区结构域仍然能形成以非共价结合在一起的二聚CH3-CH2-铰链区结构域；2.CH3-CH2-铰链区被修饰了，以便其与选定的宿主细胞相容。例如，当在细菌细胞，例如E.Coli中重组表达该分子时，可去除铰链的PA序列，该序列在E.Coli中可能被消化酶，例如脯氨酸亚氨基肽酶所识别；3.当在选定的宿主细胞中表达时，铰链区的一部分被缺失或用其它的氨基酸所置换来避免异质性；4.一个或多个糖基化位点被去除。典型糖基化(例如：天冬酰胺)的残基参与细胞溶解反应。这样的残基可被缺失或用其它的非糖基化残基所置换(例如：丙氨酸)；5.参与同补体反应的位点，例如C1q结合位点被去除了。补体募集可能对本发明中的分子不利，所以可消除这样的变体；6.影响与Fc受体结合，而非补救受体结合的位点被去除。CH3-CH2-铰链区可能具有与特定的白细胞相互作用的位点，这些位点也不是本发明的融合分子所需要的，所以可被去除；7.ADCC位点被去除了。ADCC位点是本领域公知的，见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)关于IgG1中的ADCC位点。这些位点也不是本发明的融合分子所需要的，所以可被去除。
接头多肽通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而提供了结构柔性。当出现时，它的化学结构不是关键的。接头优先由氨基酸通过肽键连接在一起而形成。因此，在优选实施例中，接头由1到20个氨基酸通过肽键连接在一起而形成，其中氨基酸是从20种天然存在的氨基酸中选择出来的。这些氨基酸中的一些可以是糖基化的，其在本领域是公知的。在一个更优选的实施例中，1到20个氨基酸是从以下氨基酸中选择出来的，所述的氨基酸为：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。更优选地，接头由大多数空间上不受阻碍的氨基酸而形成，例如甘氨酸和丙氨酸。因此，优选的接头是多聚(Gly-Ser)，多聚甘氨酸(特别地，(Gly)4，(Gly)5)，多聚(Gly-Ala)和多聚丙氨酸。其它接头的特定实例是：(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO：65)，(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO：66)，(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO：67)和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO：68)。
为了解释以上的术语，例如，(Gly)3Lys(Gly)4的意思是Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。也优选Gly和Ala的组合体。此处所示的接头是可以模仿的；在本发明范围内的接头可能更长，也可能包含其它残基。
也允许非肽接头。例如，烷基接头，如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中使用了s＝2-20。这些烷基连接可能进一步由非立体阻碍群来替代，如短链烷基(例如：C1-C6)、短链酰基、卤素(例如：Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。一种典型的非肽接头为PEG接头，其具有100到5000kD的分子量，优选100到500kD。如前所述，可能以同样的方式改变肽接头来形成衍生物。
此处所用的“GLP-1肽”、“GLP-1肽、变体或衍生物”可以是至少一种GLP-1肽、GLP-1片段、GLP-1同系物、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。GLP-1肽有从大约25个到大约45个天然存在或非天然存在的氨基酸，其与天然的GLP-1(7-37)有足够的同源性，以至于其通过与胰脏的β-细胞上GLP-1受体结合，显示了促胰岛素活性。GLP-1(7-37)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。
GLP-1片段是在从GLP-1(7-37)或其类似物或衍生物的N-末端和/或C-末端截去一或多个氨基酸所得到的多肽。GLP-1同系物是将一或多个氨基酸添加到GLP-1(7-37)或其片段或类似物的N-末端和/或C-末端的肽。GLP-1类似物是将GLP-1(7-37)的一或多个氨基酸进行修饰和/或置换的肽。GLP-1类似物与GLP-1(7-37)或GLP-1(7-37)的片段具有显著的同源性，以至于类似物具有促胰岛素活性。GLP-1衍生物被定义为这样的分子，其具有GLP-1肽或其同系物或类似物的氨基酸序列，但又具有其一个或多个氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧基的化学修饰。
很多活性GLP-1片段、类似物和衍生物已被本领域所知，任何这些类似物和衍生物也可以是本发明中GLP-1模拟体的部分。本领域所公知的一些GLP-1类似物和GLP-1片段公开于美国专利号5,118,666，5,977,071和5,545,618和Adelhorst，等.，J.Biol.Chem.269：6275(1994)。实例包括，但不仅限于GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。
“GLP-1模拟体”、“GLP-1模拟体部分”、或“GLP-1模拟体片段”和/或“GLP-1模拟体变体”和类似模拟物，均模拟或模仿至少一种GLP-1肽、变体或衍生物的至少一种生物活性，例如，但不仅限于体外、原位和/或优选的体内的配体结合活性，该GLP-1肽、变体或衍生物例如但不限于至少一种的SEQ ID NO：1。例如，合适的GLP-1模拟体、特定部分或变体也可调节、提高、改变、活化至少一种GLP-1受体的信号或其它可测定或可检测活性。
在本发明方法和组合物中有用的GLP-1模拟体的特征在于具有与蛋白质配体(例如GLP-1受体)结合的合适亲和性，并任选和优选地具有低毒性。具体而言，具有下述情况的GLP-1模拟体在本发明中均有用，即其中的独立组分，诸如可变区、恒定区(无CH1部分)和框架部分，或其任意部分(例如可变重或轻链的J、D或V区的一部分；至少一个铰链区、恒定重链或轻链的至少一部分等)独立和/或共同任选和优选地具有低免疫原性。可应用于本发明的模拟体任选的特征在于其具有可长期治疗患者，并可从良好到极佳地缓解症状，且毒性低的能力。低免疫原性和/或高亲和性，以及其它未明特性均可能对其可实现的治疗效果起作用。“低免疫原性”在此处被定义为在少于大约75％，或优选地少于大约50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2和/或1％经过治疗的患者中出现显著的HAMA、HACA或NAHA应答，和/或在经过治疗的患者中出现低的滴度(采用双抗原酶免疫测定法测定为少于大约300，优选地少于大约100)(见，例如：Elliott等.，Lancet 344：1125-1127(1994))。
效用。本发明的分离核酸可被用于生成至少一种GLP-1模拟体、片段或其特定变体，该GLP-1模拟体、片段或其特定变体可被用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中起作用，以调节、治疗、缓解至少一种蛋白质相关状况，帮助预防其发病，或减少其症状，该蛋白质相关状况选自，但不仅限于，至少一种糖尿病相关失调、胰岛素相关失调、免疫失调或疾病、心血管失调或疾病、传染病、恶性病和/或神经失调或疾病，以及其它已知或特定的蛋白质相关状况。
该方法可包括对需要上述调节、治疗、缓解、预防或减少症状、影响或机制的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的特定组合物或药物组合物，该组合物包含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。该有效量可包括单次或多次施用大约0.0001-500mg/kg的量，或单次或多次施用使血清浓度达0.01-5000ug/ml血清的量，或任意有效范围或其中的数值，其施用和浓度测定方法均为此处所描述或相关领域已知的方法。
引证。此处所引用的全部出版物或专利由于体现了与本发明同时的本领域现状，和/或提供了本发明的描述和实施方法，因而被完整引入作为参考。出版物指任何学术或专利出版物，或可以任意媒介格式被提供的其它任何资料，包括所有的记录、电子或打印格式。下述参考文献均被完整引入作为参考：Ausubel，等.，ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2003)；Sambrook，等.，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，2 nd Edition，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Harlow and Lane，Antibo dies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，等.，eds.，Current Protocolsin Immunology，John Wiley &Sons，Inc.，NY(1994-2003)；Colligan等.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley &Sons，NY，NY，(1997-2003)。
本发明的模拟体。GLP-1模拟体可包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接相连，例如包含至少一个核心铰链区，该铰链区或其片段(H)与至少一个部分可变区(V)直接相连，该部分可变区(V)与一个任选接头序列(L)直接相连，该任选接头序列与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。一种优选实施方案中，一对CH3-CH2-H-V-L-P是通过缔合或共价键，例如，但不仅限于Cys-Cys二硫键连接成对的。因此，本发明的GLP-1模拟体模拟了具有抗体固有特性和功能的抗体结构，同时提供了一种治疗性肽及其在体外、体内或原位所固有或获得的特性或活性。采用此处描述的方法，并结合本领域已知的方法，可改变本发明抗体的多个部分和至少一种GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
本发明的模拟体与已知蛋白质相比提供了至少一种合适特性，例如，但不仅限于，延长的半衰期、提高的活性、更为特异的活性、提高的亲和力、提高或降低的清除率、特选或更为合适的活性亚型、较小的免疫原性、至少一种预期治疗效果被提高的质量或延长的持续时间、较少的副作用等特性中的至少一种。
式(I)的模拟体的片段可通过本领域已知和/或此处所描述的酶裂解、合成或重组技术制备。利用抗体基因也可制备多种截短形式的模拟体，在该抗体基因中一个或多个终止密码子已被导入天然终止位点的上游。模拟体的多个部分可通过常规技术被化学连接在一起，或者通过利用遗传工程技术被制备为邻接蛋白。例如，可表达编码人抗体链中至少一个恒定区的核酸，以生成可应用在本发明模拟体中的邻接蛋白。见，例如，Ladner等.，美国专利号4,946,778和Bird，R.E.等.，Science，242：423-426(1988)，有关单链抗体的部分。
此处所用的术语“人模拟体”指一种抗体，其中该蛋白质的每一部分(例如GLP-1模拟肽、CH区(例如CH2、CH3)、铰链、V)基本上均被预期在人中基本无免疫原性，且仅具有较少的序列变化或变异。相对于未修饰的人抗体或本发明模拟体而言，该变化或变异任选并优选地在人中保留或降低了免疫原性。因此，人抗体和相应的本发明GLP-1模拟体与嵌合或人源化抗体截然不同。应指出的是，GLP-1模拟体可由非人的动物或细胞生成，该非人的动物或细胞能够表达人免疫球蛋白(例如：重链和/或轻链)基因。
针对合适的配体，例如分离的GLP-1受体，或其一部分(包括合成分子，例如合成肽)，可设计出特异于其至少一种蛋白质配体的人模拟体。利用可鉴定并表征至少一种蛋白质或其部分的配体结合区或序列的已知技术，可制备上述模拟体。
一种优选实施方案中，本发明的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体由至少一种细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞，或无限增殖化和/或培养细胞的克隆群体生成。采用合适的方法便可获得无限增殖化的蛋白质生产细胞。优选地，该至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体是通过提供特定核酸或载体而得以制备的，该核酸或载体含有来源自至少一个人免疫球蛋白位点的DNA，或者具有与该至少一个人免疫球蛋白位点基本上相似的序列，其中上述至少一个人免疫球蛋白位点被功能重排或可接受功能重排，上述核酸或载体可进一步包含此处所描述的模拟体结构，例如，但不仅限于式(I)，其中如本领域所已知的，C-末端可变区部分可被用作V，铰链区可被用作H，CH2可被用作CH2，CH3可被用作CH3。
此处所用的术语“功能重排”指来源于特定免疫球蛋白位点的核酸片段，其中该片段已经历V(D)J重组，从而生成了编码免疫球蛋白链(例如重链)或其任何部分的免疫球蛋白基因。功能重排的免疫球蛋白基因可通过采用合适方法直接或间接地得到鉴定，合适的方法例如，核苷酸测序、利用可退火至基因片段之间的编码结合处的探针所进行的杂交(例如：Southern印迹、Northern印迹)或采用可退火至基因片段之间的编码结合处的引物对免疫球蛋白基因所进行的酶扩增(例如：聚合酶链反应)。细胞是否生成了GLP-1模拟体或其部分或变体也可通过合适的方法得到确定，其中该GLP-1模拟体或其部分或变体包含了特定的可变区或含特定序列(例如：至少一个P序列)的可变区。
本发明的模拟体、特定部分和变体也可通过下述方法制备，即利用至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体编码核酸，以获得转基因动物或哺乳动物，例如山羊、奶牛、马、绵羊等，使其在乳汁中生成上述模拟体或特定部分或变体。采用与应用于抗体编码序列的方法类似的已知方法便可获得上述动物。见，例如，但不仅限于美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；5,304,489等，这些专利均被完整引入此处作为参考。
本发明的模拟体、特定部分和变体也可另外通过下述方法制备，即利用至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体编码核酸，以获得转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不仅限于烟草和玉蜀黍)，使其在植物部分或从中所培养的细胞中生成上述模拟体或特定部分或变体。一个非限制性实例，即表达重组蛋白的转基因烟草叶已被成功地用于提供大量的重组蛋白，例如，利用诱导型启动子。见，例如Cramer等.，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其引用的参考文献。同样，转基因玉蜀黍或谷物也已被用于以工业生产水平表达哺乳动物蛋白质，这些蛋白的生物学活性等同于由其它重组系统生成或由天然来源纯化所得蛋白质。见，例如Hood等.，Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其引用的参考文献。包括抗体片段，例如单链模拟体(scFv’s)在内的抗体也已被大量地从包括烟草种子和马铃薯块茎在内的转基因植物种子中生成。见，例如Conrad等.，Plant Mol.Biol.38：101-109(1998)及其引用的参考文献。因此，本发明的模拟体、特定部分和变体也可根据已知方法，利用转基因植物而得以制备。也见，例如Fischer等.，Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(1999年10月)，Ma等.，Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma等.，Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam等.，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)；及上述文中所引用的参考文献。上述参考文献均被完整引入在此作为参考。
本发明的模拟体可以广泛的亲和性(KD)结合人蛋白质配体。一种优选实施方案中，本发明至少一种人GLP-1模拟体可任选地以高亲和性结合至少一种蛋白质配体。例如，本发明至少一种GLP-1模拟体可以等于或小于大约10-7M的KD，或更为优选的，等于或小于大约0.1-9.9(或其中的任意范围或数值)x 10-7，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12或10-13M，或其中的任意范围或数值的KD结合至少一种蛋白质配体。
GLP-1模拟体对至少一种蛋白质配体的亲和性或亲和力可通过采用任何合适方法得以实验测定，例如用于测定抗体-抗原结合亲和性或亲和力的方法。(见，例如Berzofsky，等.，在Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York，NY(1984)中的“Antibody-Antigen Interaction”；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman andCompany：New York，NY(1992)；及其描述的方法)。不同条件(例如盐浓度、pH)下所测定的特定GLP-1模拟体-配体相互作用的亲和性不同。因此，优选采用GLP-1模拟体和配体的标准溶液，和诸如此处所描述的或本领域已知的标准缓冲剂测定亲和性及其它配体结合参数(例如KD、Ka、Kd)。
核酸分子。利用此处提供的资料，采用此处描述或本领域已知的方法，可获得诸如编码SEQ ID NO：1和6中至少一个序列的至少90-100％连续氨基酸以及特定抗体的至少一个部分的核苷酸序列，其中上述序列被作为式(I)的P序列插入，可获得本发明的GLP-1模拟体，进一步包括其特定片段、变体或一致序列，或者可获得包含了至少一种上述序列的保藏载体，和编码至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的本发明核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，诸如mRN A、hnRNA、tRNA或其它任何形式，或者是DNA形式，包括，但不仅限于通过克隆或合成或它们的组合所获的cDNA和基因组DNA。该DNA可为三链、双链或单链，或三种链形式的任意组合。DNA或RNA的至少一条链的任意部分均可为编码链，也是通常所说的有义链，或者可以是非编码链，也被称为反义链。
本发明的分离核酸分子可包括含有一个读码框(ORF)，并任选地具有一个或多个内含子的核酸分子，含有GLP-1模拟体或特定部分或变体的编码序列的核酸分子；和含有与上述核苷酸序列基本上不同的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码此处所描述和/或本领域已知的至少一种GLP-1模拟体的核酸分子。当然，该遗传密码是本领域熟知的。因此，对本领域技术人员而言，制备编码本发明特定GLP-1模拟体或特定部分或变体的上述简并核酸变体是常规工作。见，例如上述Ausubel，等.，且上述核酸变体也被包括在本发明中。
如此处所指出的，包含编码GLP-1模拟体或特定部分或变体的核酸的本发明核酸分子可包括，但不仅限于，自身编码GLP-1模拟体片段的氨基酸序列的核酸分子；完整GLP-1模拟体或其部分的编码序列；GLP-1模拟体、片段或部分的编码序列，以及其它序列，诸如至少一种信号前导或融合肽的编码序列，具有或不具有上述其它编码序列，诸如至少一个内含子，连同其它非编码序列，包括但不仅限于非编码5’和3’序列，诸如在转录、mRNA加工中发挥作用的经转录的非翻译序列，包括剪接和多腺苷酸化信号(例如-mRNA的核糖体结合和稳定性)；编码其它氨基酸，诸如可提供其它功能性的氨基酸的其它编码序列。因此，编码GLP-1模拟体或特定部分或变体的序列可被融合至标记序列，诸如编码特定肽的序列，该肽有助于纯化含有GLP-1模拟体片段或部分的融合GLP-1模拟体或特定部分或变体。
与此处所描述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。本发明提供了可在选择性杂交条件下与此处公开的多核苷酸或包括其特定变体或部分的其它多核苷酸杂交的分离核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可被用于分离、检测和/或定量含有该多核苷酸的核酸。
低或中等严格性杂交条件典型地，但并不专有地应用于与互补序列相比序列同一性被降低的序列。中等和高严格性条件可任选地被用于较高同一性的序列。低严格性条件可实现具有大约40-99％序列同一性的序列的选择性杂交，并可被用于鉴定直向同源或共生同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸可编码由此处描述的多核苷酸所编码的GLP-1模拟体或特定部分或变体的至少一个部分。本发明的多核苷酸包含了可被用于与编码本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。见，例如，上述Ausubel；上述Colligan，均被完整引入此处作为参考。
核酸的构建。本发明的分离核酸可采用本领域熟知的(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术，或其组合而得以制备。
该核酸可方便地包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入该核酸中，以助于分离该多核苷酸。同样，可将可翻译序列插入该核酸中，以助于分离本发明的翻译多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白质的方便途径。本发明核酸除了编码序列外，任选地可作为用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体、接合体或接头。
其它序列也可被加入上述克隆和/或表达序列，以优化其在克隆和/或表达方面的功能、以助于分离本发明多核苷酸，或促使本发明多核苷酸被导入细胞。克隆载体、表达载体、接合体和接头的用途均是本领域熟知的。见，例如上述Ausubel；或上述Sambrook。
构建核酸的重组法。利用本领域技术人员已知的任意种克隆方法，均可从生物学来源中获得本发明的分离核酸组合物，诸如RNA、cDNA、基因组DNA或其任意组合。某些实施方案中，采用了在合适的严格性条件下可与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针，以在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需要的序列。RNA的分离、cDNA和基因组文库的构建均是本领域普通技术人员熟知的。(见，例如上述Ausubel；或上述Sambrook)。
用于构建核酸的合成法。本发明的分离核酸也可通过已知的直接化学合成法制备(见，例如上述Ausubel，等.)。化学合成通常生成单链寡核苷酸，通过与互补序列杂交，或通过以该单链为模板，采用DNA聚合酶进行聚合，可将该单链寡核苷酸转化为双链DNA。本领域任何一位技术人员均会认识到，虽然DNA的化学合成可被局限于大约100个或更多碱基的序列，较长序列可通过较短序列的连接获得。
重组表达盒。本发明进一步提供了包含本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如编码本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的cDNA或基因组序列，可被用于构建特定重组表达盒，该盒可被导入至少一种理想的宿主细胞中。重组表达盒将典型地包含被可操作连接至特定转录起动调节序列的本发明多核苷酸，其中该转录起动调节序列将引导本发明多核苷酸在指定宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子均可被用于引导本发明核酸的表达。
在某些实施方案中，充当启动子、增强子或其它元件的分离核酸可被导入本发明非异源形式多核苷酸的合适位置上(上游、下游或内含子中)，以正或负调节本发明多核苷酸的表达。例如，如本领域已知，内源启动子可通过突变、缺失和/或置换在体内或体外被改变。本发明多核苷酸可按指定的有义或反义方向被表达。应当理解的是，对有义或反义方向基因表达的控制可直接影响可观测特征。抑制的另一种方法是有义抑制。导入被设定为有义方向的核酸已被证明是阻断目标基因转录的一种有效途径。
载体和宿主细胞。本发明也涉及包含本发明分离核酸分子的载体、经由该重组载体遗传改造的宿主细胞，以及通过本领域所熟知的重组技术对至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的制备。见，例如上述Sambrook，等.；上述Ausubel，等.，均被完整引入此处作为参考。
本发明多核苷酸可任选地被连接至特定载体，该载体含有用于在宿主内增殖的可选择标记。通常，采用合适的已知方法，诸如电穿孔和类似的其它已知的方法将质粒载体导入细胞，其它已知方法包括利用可作为沉淀物的载体，如磷酸钙沉淀物，或与带电荷脂质形成复合体的载体。如果该载体为病毒，可采用合适的包装细胞系将其体外包装，并随后将其导入宿主细胞。
DNA插入应被操作性地连接至合适启动子。该表达构建体可进一步含有任选用于至少一种转录起始、终止，且位于转录区内的位点，以及用于翻译的核糖体结合位点。该构建体所表达成熟转录物的编码部分将优选地包括开始的翻译起始密码子和适当地位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。
表达载体可优选，但也可任选地包括至少一种可选择标记。这样的标记包括，例如，但不仅限于对真核细胞培养而言的氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS、美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性基因，和用于在E.coli和其它细菌或原核生物中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因(上述专利均被完整引入此处作为参考)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适的载体应是熟练技术人员熟知的。将载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、侵染或其它已知方法实现。本领域诸如上述Sambrook，1-4和16-18章；上述Ausubel，1、9、13、15、16章中描述了这些方法。
本发明至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体均可以修饰形式被表达，诸如融合蛋白质，并且可以不仅包括分泌信号，还包括其它异源功能区。例如，一个区域的附加氨基酸，尤其是带电荷氨基酸可被加入GLP-1模拟体或特定部分或变体的N末端，从而改善该GLP-1模拟体或特定部分或变体在宿主细胞中、纯化期间或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。同样，本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体也可加入肽部分，从而有助于其纯化。最终制备GLP-1模拟体或其至少一个片段之前，可将上述区域除去。许多标准实验室手册，诸如上述Sambrook，17.29-17.42和18.1-18.74章；上述Ausubel，16、17和18章中均描述了上述方法。
本领域的普通技术人员熟知可用于表达编码本发明蛋白质的核酸的诸多表达系统。
对本发明模拟体、特定部分或其变体的制备有用的细胞培养物实例是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常为单层细胞形式，但也可采用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已发展出可表达完整糖基化蛋白的大量合适宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL-1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610，DG-44)和BSC-1(例如ATCCCRL-26)细胞系、hepG2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Agl4、293细胞、HeLa细胞等，均可容易地从例如，American Type Culture Collection(美国典型菌种保藏中心)，Manassas，Va获得。优选宿主细胞包括淋巴来源的细胞，诸如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。尤其优选的宿主细胞为P3X63Ag8.653细胞(ATCC编号CRL-1580)和SP2/0-Agl4细胞(ATCC编号CRL-1851)。
用于上述细胞的表达载体可包括一个或多个下述表达控制序列，例如，但不仅限于复制起点；启动子(例如末期或早期SV40启动子、CMV启动子(例如美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(例如美国专利号5,266,491)、至少一种人免疫球蛋白启动子)；增强子和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag聚腺苷酸加入位点)，和转录终止子序列。见，例如，上述Ausubel等.；上述Sambrook，等.。对本发明核酸或蛋白质的制备有用的其它细胞均是已知的，和/或可从，例如American Type Culture CollectionCatalogue of Cell Lines and Hybridomas(美国典型菌种保藏中心细胞系和杂交瘤目录)(www.atcc.org)或其它已知或商业来源获得。
应用真核宿主细胞时，是将聚腺苷酸化或转录终止序列典型地整合进上述载体中。终止序列的一个实例是牛生长激素基因来源的聚腺苷酸化序列。也可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个实例是SV40来源的VP1内含子(Sprague，等.，J.Virol.45：773-781(1983))。另外，如本领域已知，可将控制宿主细胞内复制的基因序列整合进上述载体中。
GLP-1模拟体或特定部分或其变体的纯化。GLP-1模拟体或特定部分或变体可通过熟知的方法，包括，但不仅限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱，从重组细胞中得以回收及纯化。也可应用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。见，例如Colligan，Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in ProteinScience，John Wiley &Sons，NY，NY，(1997-2002)，例如1、4、6、8、9、10章，均被完整引入此处作为参考。
本发明的模拟体或特定部分或变体包括天然纯化的产物、化学合成操作的产物，和通过重组技术从真核细胞，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中获得的产物。根据重组制备操作中应用的宿主，本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体可以是糖基化或非糖基化的，优选糖基化的。许多标准实验室手册，诸如上述Sambrook，17.37-17.42节；上述Ausubel，10、12、13、16、18和20章，上述Colligan，ProteinScience，12-14章中均描述了上述方法，均被完整引入此处作为参考。
模拟体、特定片段和/或变体。本发明的分离模拟体包括由此处更完整论述的本发明任意一种多核苷酸编码的GLP-1模拟体或特定部分或变体，或任何分离或制备的GLP-1模拟体或特定部分或其变体。
优选的GLP-1模拟体或配体结合部分或变体结合了至少一个GLP-1蛋白配体，并从而提供了相应蛋白质或其片段的至少一种GLP-1生物学活性。多种在治疗或诊断方面具有重要作用的蛋白质均是本领域熟知的，且该蛋白质的合适测定方法或生物学活性也是本领域熟知的。
对本发明而言，合适的GLP-1肽、变体或衍生物的非限制性实例如下：SEQ ID NO：1：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31，其中：Xaa2为Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；Xaa3为Glu，Asp，或Lys；Xaa5为Thr，Ala，Gly，Ser，Leu，Ile，Val，Arg，His，Glu，Asp，或Lys；Xaa6为Phe，His，Trp，或Tyr；Xaa7为Thr或Asn；Xaa8为Ser，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp，或Lys；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Val，Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Met，Tyr，Trp，His，Phe，Glu，Asp，或Lys；Xaa11为Ser，Val，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Glu，Asp，或Lys；Xaa12为Ser，Val，Ala，Gly，Thr，Leu，Ile，Glu，Asp或Lys；Xaa13为Tyr，Phe，Trp，Glu，Asp或Lys；Xaa14为Leu，Ala，Met，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Glu，Asp或Lys；Xaa15为Glu，Ala，Thr，Ser，Gly，Gln，Asp或Lys；Xaa16为Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Gln，Asn，Arg，Cys，Glu，Asp或Lys；Xaa17为Gln，Asn，Arg，His，Glu，Asp或Lys；Xaa18为Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Glu，Asp或Lys；Xaa19为Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Met，Glu，Asp或Lys；Xaa20为Lys，Arg，His，Gln，Trp，Tyr，Phe，Glu或Asp；Xaa21为Glu，Leu，Ala，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，Gln，Thr，Ser，Gly，Asp或Lys；Xaa23为Ile，Ala，Val，Leu或Glu；Xaa24为Ala，Gly，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，His，Glu，Asp或Lys；Xaa25为Trp，Phe，Tyr，Glu，Asp或Lys；Xaa26为Leu，Gly，Ala，Ser，Thr，Ile，Val，Glu，Asp或Lys；Xaa27为Val，Leu，Gly，Ala，Ser，Thr，Ile，Arg，Glu，Asp或Lys；Xaa28为Lys，Asn，Arg，His，Glu或Asp；Xaa29为Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Trp，Tyr，Phe，Pro，His，Glu，Asp或Lys；Xaa30为Arg，His，Thr，Ser，Trp，Tyr，Phe，Glu，Asp或Lys；和Xaa31为Gly，Ala，Ser，Thr，Leu，Ile，Val，Arg，Trp，Tyr，Phe，His，Glu，Asp，Lys。
另一组优选的GLP-1肽、变体或衍生物的实例如下：SEQ ID NO：6：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Ser-Xaa12-Tyr-Xaa14-Glu-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30，其中：Xaa2为Ala，Gly，或Ser；Xaa3为Glu或Asp；Xaa6为Phe或Tyr；Xaa7为Thr或Asn；Xaa8为Ser，Thr或Ala；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Val，Leu，Met或Ile；Xaa12为Ser或Lys；Xaa14为Leu，Ala或Met；Xaa16为Gly，Ala，Glu或Asp；Xaa17为Gln或Glu；Xaa18为Ala或Lys；Xaa19为Ala，Val，Ile，Leu或Met；Xaa21为Glu或Leu；Xaa23为Ile，Ala，Val，Leu或Glu；Xaa27为Val或Lys；Xaa28为Lys或Asn；和Xaa30为Arg或Glu。
这些肽可通过已公开和/或本领域已知的方法制备。这些序列中(以及通篇该说明书中，在特定实例中如无另外指明)的Xaas包括特定的氨基酸残基或其衍生物，或其经修饰的氨基酸。因为酶，二肽基肽酶IV(DPP-IV)可能负责GLP-1的观测到的迅速体内失活，所以优选在模拟体范围内不受DPP-IV活性影响的GLP-1肽、同系物、类似物和衍生物。
GLP-1模拟体或特定部分或其变体部分地或基本上优选地提供了的至少一种GLP-1生物活性，其可结合GLP-1配体，因此提供了一种活性，该活性是通过使GLP-1与至少一种配体，例如GLP-1受体结合，或通过其它蛋白质依赖或介导机制而被另外介导的。此处所用的术语“GLP-1模拟体活性”指根据测定可以大约20-10,000％，优选地以至少大约60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000％或更高比例调节或引起至少一种GLP-1依赖活性的GLP-1模拟体。
GLP-1模拟体或特定部分或变体可提供至少一种蛋白质依赖活性的能力优选地通过此处所描述和/或本领域已知的至少一种合适的蛋白质生物学测定而得以评定。本发明的人GLP-1模拟体或特定部分或变体可与任何种类的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM等)或同种型相似，并可包含至少一个部分的k或λ轻链。一种实施方案中，人GLP-1模拟体或特定部分或变体包含了IgG重链可变片段、铰链区、CH2和CH3，至少一种同种型，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体结合了至少一种特定配体、亚单位、片段、部分或这几项的任意组合。本发明至少一种GLP-1模拟体、特定部分或变体的至少一种GLP-1肽、变体或衍生物可任选地结合配体的至少一个特定配体表位。该结合表位可包含至少一种特定氨基酸序列的任意组合，该特定氨基酸序列包含蛋白质配体的至少1-3个氨基酸直至蛋白质配体序列的连续氨基酸的完整特定部分，该蛋白质配体诸如GLP-1受体或其部分之一。
该模拟体可通过下述方法制备，即采用已知技术将式(I)的GLP-1模拟体的不同部分连接在一起，通过采用已知的重组DNA技术制备并表达编码该GLP-1模拟体的至少一种核酸分子，或通过使用其它任何合适方法，诸如化学合成法。
采用合适方法，诸如噬菌体展示(Katsube，Y.，等.，Int.J Mol.Med，1(5)：863-868(1998))或本领域已知和/或此处所描述的应用转基因动物的方法，可制备与人GLP-1配体，例如受体结合，并包含确定重或轻链可变区或其部分的模拟体。通过利用GLP-1模拟体、特定部分或变体编码核酸或其部分在合适宿主细胞中便可表达该GLP-1模拟体、特定部分或变体。
本发明也涉及模拟体、配体结合片段和免疫球蛋白链，其包含与此处所描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。优选地，该模拟体或其配体结合片段可与人GLP-1配体，例如受体高亲和性地结合(例如，小于或等于大约10-7M的KD)。与此处所描述序列基本相同的氨基酸序列包括含有保守氨基酸置换，以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置换指第一个氨基酸被具有与其相似的化学和/或物理特性(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二个氨基酸置换。保守置换包括在下组氨基酸范围内，一种氨基酸被另一种氨基酸置换，即：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
氨基酸密码。组成本发明模拟体或特定部分或变体的氨基酸通常被缩写。通过由氨基酸的单字母代码、三字母代码、名称或本领域熟知的三个核苷酸密码子标明该氨基酸，便可表示出该氨基酸名称(见Alberts，B.，等.，Molecular Biology of The Cell，Third Ed.，GarlandPublishing，Ino.，New York，1994)：
单字母        三字母         名称             三核苷酸密码子
代码          代码
A             Ala            丙氨酸           GCA，GCC，GCG，GCU
C             Cys            半胱氨酸         UGC，UGU
D             Asp            天冬氨酸         GAC，GAU
E             Glu            谷氨酸           GAA，GAG
F             Phe            苯丙氨酸         UUC，UUU
G             Gly            甘氨酸           GGA，GGC，GGG，GGU
H             His            组氨酸           CAC，CAU
I             Ile            异亮氨酸         AUA，AUC，AUU
K             Lys            赖氨酸           AAA，AAG
L             Leu            亮氨酸           UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU
M             Met            蛋氨酸           AUG
N             Asn            天冬酰胺         AAC，AAU
P             Pro            脯氨酸           CCA，CCC，CCG，CCU
Q             Gln            谷氨酰胺         CAA，CAG
R             Arg            精氨酸           AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU
S             Ser            丝氨酸           AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU
T             Thr            苏氨酸           ACA，ACC，ACG，ACU
V             Val            缬氨酸           GUA，GUC，GUG，GUU
W             Trp            色氨酸           UGG
Y             Tyr            酪氨酸           UAC，UAU
本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体可以包括来自天然突变或如此处说明的人工操作的一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。在本发明中使用的这样的或其它的序列包括，但不仅限于表1所示的下述序列，如其所示，其与SEQ ID NOS：47-64的特定部分相对应，其中抗体序列的部分可变区可以是，但不仅限于SEQ ID NO：47-55中至少一种氨基酸序列的至少一个部分，或者如表1所示的其片段，进一步可选择地包含如PCT公开文本WO 05/05604(PCT US04/19898)图1-9所示的相应的SEQ ID NO：1-9的至少一个置换、插入或缺失，该申请在2004年6月24日递交，在2005年1月20日公开。CH2区、CH3区和铰链区可以是，但不仅限于SEQ ID NO：56-64中至少一种氨基酸序列的至少一个部分，或者如表1所示的其片段，进一步可选择地包含如PCT公开文本WO05/05604(PCT US04/19898)相应的SEQ ID NO：32-40的至少一个置换、插入或缺失，该申请在2004年6月24日递交，在2005年1月20日公开。当然，熟练技术人员可以进行的氨基酸置换数取决于许多因素，包括上面描述的那些因素。一般来说，至少一种GLP-1模拟体的氨基酸置换、插入或缺失数将不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸，如1-30或其中的任意范围或数值，如此处说明的。
本发明的式I((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)中，根据式I的V部分、H部分、CH2部分、CH3部分可以是任何合适的人序列或人相容序列，例如，如表1所示，其中抗体序列的部分可变区可以是，但不仅限于SEQ ID NO：47-55中至少一种氨基酸序列的至少一个部分，或者如表1所示的其片段，进一步可选择地包含如PCT公开文本WO 05/05604(PCT US04/19898)图1-9所示的相应的SEQ ID NO：1-9的至少一个置换、插入或缺失，该申请在2004年6月24日递交，在2005年1月20日公开。CH2区、CH3区和铰链区可以是，但不仅限于SEQ ID NO：56-64中至少一种氨基酸序列的至少一个部分，或者如表1所示的其片段，进一步可选择地包含如PCT公开文本WO 05/05604(PCT US04/19898)相应的SEQ ID NO：32-40的至少一个置换、插入或缺失，该申请在2004年6月24日递交，在2005年1月20日公开，或其组合或共有序列，或其融合蛋白，当用于人体时优选人源的或设计将免疫原性降到最小的。
P部分包含本领域已知的或此处所描述的至少一种GLP-1治疗性肽，例如但不仅限于，SEQ ID NO：1所示的序列，或其组合或共有序列，或其融合蛋白。在优选的实施例中，P部分可包含至少一种GLP-1肽，其具有SEQ ID NO：6的至少一种的序列，或其组合或共有序列，或其融合蛋白。
可选的接头序列可以是本领域已知的任何合适的肽接头。优选的序列包含G和S的任何组合，例如X1-X2-X3-X4-...-Xn，其中X可以是G或S，n可以是5-30。非限制性实例包括GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：16)、GSGGGS(SEQ ID NO：17)、GGSGGGS(SEQID NO：18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO：19)和GGGSGGGSGG(SEQID NO：20)等。
本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体中的对功能来说必不可少的氨基酸可由本领域已知的方法来鉴别，例如定点突变、丙氨酸检测诱变(例如Ausubel，supra，Chapters 8，15；Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子中每个残基上进行单个丙氨酸突变。然后测定得到的突变体分子的生物活性，例如但不仅限于此处详细说明的或本领域已知的至少一种蛋白相关活性。对GLP-1模拟体或特定部分或变体的结合关键的位点也可用结构分析来鉴别，例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith，等.，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos，等.，Science 255：306-312(1992))。
本发明的模拟体或特定部分或变体可以包含式(I)的P部分，例如但不仅限于SEQ ID NOS：1和6中至少一种的至少一个部分。GLP-1模拟体或特定部分或变体可进一步包含与SEQ ID NOS：1和6中至少一种有至少90-100％同源性的至少一个多肽的至少一个功能部分作为式(I)的P部分。能增强或维持如上所列的至少一种活性的非限制性变体包含，但不仅限于任何以上的多肽，进一步包含与至少一种置换、插入或缺失相应的至少一种突变，所述的置换、插入或缺失不明显影响所述GLP-1模拟体的适合的生物活性或功能。
一种实施方案中，P氨基酸序列或其部分与SEQ ID NO：1和6中至少一个序列的相应部分的相应氨基酸序列具有大约90-100％同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任意范围或数值)。优选地，利用本领域已知的合适计算机算法确定90-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或任意范围或其中的数值)。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含来源于本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的任意数量连续氨基酸残基，其中该数量选自由GLP-1模拟体中连续残基数量的10-100％组成的整数群之一。任选地，连续氨基酸的子序列在长度上至少含有大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多氨基酸，或含有其中任意范围或数值的氨基酸。此外，该子序列的数量可为选自1-20的任意整数，诸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数。
技术人员应理解的是，本发明包括至少一种具有生物活性的本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体。具有生物活性的模拟体或特定部分或变体的特定活性为天然(非合成)、内源或相关和已知的插入或融合蛋白或特定部分或变体的活性的至少20％、30％或40％，优选为至少50％、60％或70％，最为优选的是至少80％、90％或95％-1000％。分析并定量测定酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员熟知的。
另一方面，本发明涉及此处所描述通过共价添加有机部分而被修饰的人模拟体和配体结合片段。该修饰可产生具有改良药物动力学特性(例如延长的体内血清半衰期)的GLP-1模拟体或配体结合片段。有机部分可以是线型或分支亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。特定实施方案中，亲水聚合基团可具有大约800-大约120,000道尔顿的分子量，并可为聚链烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含大约8-大约40个碳原子。
本发明的修饰模拟体和配体结合片段可包含一个或多个与GLP-1模拟体或特定部分或变体直接或间接地共价结合的有机部分。与本发明GLP-1模拟体或配体结合片段结合的各有机部分均可独立为亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。此处所用的术语“脂肪酸”包括单羧基酸和双羧基酸。此处所用的术语“亲水聚合基团”指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本发明包括通过共价添加聚赖氨酸而得以修饰的GLP-1模拟体。适用于修饰本发明模拟体的亲水聚合物可为线型或分支状，且包括，例如聚链烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧链烷(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明GLP-1模拟体的亲水聚合物为单分子实体形式时，具有大约800-大约150,000道尔顿的分子量。例如，可采用PEG2500、PEG5000、PEG7500、PEG9000、PEG10000、PEG12500、PEG15000和PEG20,000，其中下标为该聚合物的道尔顿平均分子量。
亲水聚合基团可被1至大约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团置换。被脂肪酸或脂肪酸酯基团置换的亲水聚合物可通过应用合适的方法制备。例如，包含胺基团的聚合物可被偶联至脂肪酸或脂肪酸酯的羧基上，且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如经由N，N-羰基二咪唑活化)可被偶联至聚合物上的羟基基团。
适用于修饰本发明模拟体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和或可含有一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明模拟体的脂肪酸包括，例如，n-十二烷酸(C12，月桂酸)、n-四癸酸(C14，肉豆蔻酸)、n-八癸酸(C18，硬脂酸)、n-二十烷酸(C20，廿烷酸)、n-二十二烷酸(C22，山嵛酸)、n-三十烷酸(C30)、n-四十烷酸(C40)、顺-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、所有顺-Δ5，8，11，14-二十四烯酸甲酯(C20，花生四烯酸)、辛二酸、四癸二酸、八癸二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含有线型或分支低级烷基基团的二羧酸的单酯。较低级烷基基团可包括1至大约12个，优选的1至大约6个碳原子。
修饰的人模拟体和配体结合片段可采用诸如，通过与一种或多种修饰剂反应的合适方法制备。此处所用的术语“修饰剂”指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”指可在适当条件下与第二化学基团反应，从而在上述修饰剂与第二化学基团之间形成共价键的化学部分或功能基团。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，诸如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤化(氯、溴、氟、碘)、N-羟琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括，例如马来酰亚胺、碘乙酰、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫羟-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能基团可被偶联至含有胺-或酰肼的分子上，且叠氮基团可与三价磷基团反应，从而形成氨基磷酸酯或磷酰胺键。将活化基团导入分子的合适方法是本领域已知的(见，例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。活化基团可被直接结合至有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通过接头部分，例如二价C1-C12基团实现结合，其中一个或多个碳原子可被诸如氧、氮或硫的杂原子置换。合适的接头部分包括，例如四乙二醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含接头部分的修饰剂可通过下述方法制备，例如使单Boc(叔丁基)-烷基二胺(例如单Boc-乙烯二胺、单Boc-二氨基己烷)在1-乙基-3-(3-双甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在条件下与脂肪酸反应，从而在自由胺与脂肪酸羧酸之间形成酰胺键。通过下述方法可从产物中除去Boc保护基团，即采用三氟乙酸(TFA)处理，以暴露可与所述另一羧酸盐偶联，或可与马来酸酐反应的伯胺，并使所获产物环化，生成该脂肪酸被活化的马来酰亚胺衍生物(见，例如Thompson，等.，WO 92/16221，其完整内容被引入此处作为参考)。
本发明的修饰模拟体可通过使人GLP-1模拟体或配体结合片段与修饰剂反应而得以生成。例如，通过应用胺反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，可以无位点特异性方式将有机部分结合至GLP-1模拟体。修饰的人模拟体或配体结合片段也可通过还原GLP-1模拟体或配体结合片段的二硫键(例如链内二硫键)而得以制备。随后，可使还原的GLP-1模拟体或配体结合片段与硫醇反应性修饰剂反应，以获得本发明的修饰GLP-1模拟体。通过采用合适方法，诸如反向蛋白水解(Fisch等.，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen等.，BioconjugateChem.，5：411-417(1994)；Kumaran等.，Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等.，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas等.，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))和Hermanson，G..T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)所描述的方法，可制备含有特定有机部分的修饰人模拟体和配体结合片段，其中该特定有机部分被结合至本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体的特定位点。
GLP-1模拟体组合物。本发明也提供了至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物，该组合物包含了此处所描述和/或本领域已知，以非天然存在组合物、混合物或形态被提供的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多模拟体或特定部分或其变体。该组合物的比例通过重量、体积、浓度、摩尔浓度，或本领域已知或此处所描述的液体或速干剂、混合物、悬液、乳剂或胶体形式的摩尔浓度表示。
该组合物可包括0.00001-99.9999％的重量、体积、浓度、摩尔浓度或本领域已知或此处所描述的液体、气体或速干剂、混合物、悬液、乳剂或胶体形式的摩尔浓度，或其中的任意范围或数值，例如，但不仅限于0.00001、0.00003、0.00005、0.00009、0.0001、0.0003、0.0005、0.0009、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。因此，本发明的该组合物包括，但不仅限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。
该组合物可任选地进一步包括选自至少一种糖尿病或胰岛素代谢相关药物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于体液或电解液平衡的药物、血液系统药物、抗肿瘤、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部用药物、营养药等药物的有效量的至少一种化合物或蛋白质。上述药物均是本领域熟知的，包括此处所列各药物的制剂、适应症、剂量和施用(见，例如Nursing 2001 Handbookof Drugs，21 st edition，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；Health Professional’s Drug Guide 2001，ed.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，NJ；Pharmcotherapy Handbook，Wells等.，ed.，Appleton &Lange，Stamford，CT，均被完整引入此处作为参考)。
与糖尿病相关的药物可以是以下药物中的至少一种：格列酮类、胰岛素和衍生物、磺酰脲类、氯茴苯酸类、缩二胍、α-糖苷酶抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、糖原合酶激酶3、糖异生抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶(PDH)抑制剂、脂肪分解抑制剂、脂肪氧化抑制剂、肉毒碱棕榈酰转移酶I和/或II抑制剂、β-3肾上腺受体显效药、钠与葡萄糖共输送体(SGLT)抑制剂或具有以下一种或多种作用，至少一种作用的化合物：自体免疫抑制、免疫调节、活化、增殖、T-细胞的迁移和/或抑制细胞的功能、自身反应的T细胞的去除、跨越血脑屏障的减少、促炎症反应(Th1)和免疫调制的(Th2)细胞活素类的平衡的改变、基质金属蛋白酶抑制剂的抑制、神经保护、神经胶质增生的减少、髓鞘再形成的促进。
抗感染药物可为选自杀阿米巴药或至少一种抗原生动物药、驱肠虫药、抗真菌药、抗疟药、抗结核药或至少一种抗麻风药、氨基糖苷类药、青霉素、头孢菌素、四环素、磺胺、氟喹诺酮、抗病毒药、大环内酯抗感染药、综合性抗感染药中的至少一种药物。CV药物可为选自变力性药、抗心律不齐药、防心绞痛药、抗高血压药、抗血脂药、综合性心血管药物中的至少一种药物。CNS药物可为选自非麻醉性镇痛药的至少一种药物，或选自退热剂、非类固醇抗炎症药物、麻醉药中的至少一种药物，或至少一种阿片样镇痛药、镇静-催眠药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗焦虑药、抗精神病药、中枢神经系统刺激剂、抗帕金森病药、综合性中枢神经系统药物。ANS药物可为选自胆碱能药物(拟副交感神经药)、抗胆碱能药、肾上腺素能药(拟交感神经药)、肾上腺素能阻断剂(抗交感神经药)、骨骼肌松弛药、神经肌肉阻断剂中的至少一种药物。呼吸道药物可为选自抗组胺剂、支气管舒张药、祛痰剂中的至少一种药物或至少一种镇咳药、综合性呼吸药物。GI道药物可为选自抗酸剂的至少一种药物，或至少一种吸附剂，或至少一种抗气胀药、消化酶或至少一种胆结石增溶剂、止泻药、轻泻药、止吐剂、抗溃疡药。激素药物可为选自皮质激素类、雄激素中的至少一种药物，或至少一种促同化激素类、雌激素或至少一种孕酮、促性腺激素、抗糖尿病药物或至少一种胰高血糖素、甲状腺激素类、甲状腺激素类拮抗剂、垂体激素、类甲状旁腺药物。用于平衡体液和电解液的药物可为选自利尿剂、电解质中的至少一种药物或至少一种置换溶液、酸化剂或至少一种碱化剂。血液系统药物可为选自补血药、抗凝血药、血液衍生物、溶栓酶中的至少一种药物。抗肿瘤药物可为选自烷基化药物、抗代谢物、抗菌素抗肿瘤药物、可改变激素平衡的抗肿瘤药物、综合性抗肿瘤药物中的至少一种药物。免疫调节药物可为选自免疫抑制剂、疫苗中的至少一种药物，或至少一种类毒素、抗毒素或至少一种抗蛇毒素、免疫血清、生物反应调节物。眼、耳和鼻用药可为选自眼科抗感染药、眼科抗炎症药、缩瞳药、扩瞳药、眼部血管收缩剂、综合性眼、耳、鼻用药中的至少一种药物。局部用药物可为选自局部抗感染药、抗疥螨剂中的至少一种药物或至少一种抗虱剂、局部皮质激素类。营养药可为选自维生素、矿物质或热质中的至少一种药物。见，例如上述Nursing 2001Drug Handbook中的内容。
上述至少一种杀阿米巴药或抗原生动物药可为选自阿托伐醌、盐酸氯奎、磷酸氯奎、甲硝基羟乙唑、盐酸甲硝基羟乙唑、戊烷脒羟乙基磺酸盐中的至少一种药物。上述至少一种驱肠虫药可为选自甲苯咪唑、双羟萘酸喹嘧啶、噻苯咪唑中的至少一种药物。上述至少一种抗真菌剂可为选自两性霉素B、两性霉素B胆固醇基硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、微小尺寸灰黄霉素、超微小尺寸灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素、盐酸特比萘芬中的至少一种药物。上述至少一种抗疟药可为选自盐酸氯奎、磷酸氯奎、强力霉素、硫酸羟化氯奎、盐酸甲氟奎、磷酸伯氨喹、息疟定、含周效磺胺的息疟定中的至少一种药物。上述至少一种抗结核药或抗麻风药可为选自氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷汀、硫酸链霉素中的至少一种药物。上述至少一种氨基糖苷类药物可为选自硫酸丁胺卡那霉素、硫酸艮他霉素、硫酸新霉素、硫酸链霉素、硫酸妥布霉素中的至少一种药物。上述至少一种青霉素可为选自阿莫西林/棒酸钾、三水合阿莫西林、氨苄青霉素、氨苄青霉素钠、三水合氨苄青霉素、氨苄青霉素钠/舒巴坦钠、邻氯苯甲异噁唑青霉素钠、二氯苯甲异噁唑青霉素钠、美洛西林钠、乙氧萘青霉素钠、甲苯异噁唑青霉素钠、苄星青霉素G、青霉素G钾、青霉素G普鲁卡因、青霉素G钠、青霉素V钾、氧哌嗪青霉素钠、氧哌嗪青霉素钠/他唑巴坦钠、羧噻吩青霉素二钠、羧噻吩青霉素二钠/棒酸钾中的至少一种。上述至少一种头孢菌素可为选自至少一种氯头孢菌素、头孢羟氨、头孢钠素、头孢地尼、盐酸头孢吡肟、头孢克肟、氰唑甲氧头孢钠素、头孢尼西钠、氧哌羟苯唑头钠、头孢噻肟钠、头孢双硫唑甲氧二钠、噻吩甲氧头孢钠素、头孢泊肟酯、头孢丙烯、头孢噻甲羧肟、头孢布坦、头孢唑肟钠、头孢三嗪噻肟钠、头孢呋辛酯、头孢呋辛钠、盐酸头孢氨苄、一水合头孢氨苄、头孢环已烯、氯碳头孢中的至少一种。上述至少一种四环素可为选自盐酸地美环素、强力霉素钙、盐酸多西环素、盐酸强力霉素、一水合强力霉素、盐酸米诺环素、盐酸四环素中的至少一种。上述至少一种磺胺可为选自增效磺胺甲基异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺乙酰异噁唑中的至少一种。上述至少一种氟喹诺酮可为选自甲磺酸阿拉曲伐沙星、环丙沙星、依诺沙星、左氧氟沙星、盐酸洛美沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、司帕沙星、甲磺酸曲伐沙星中的至少一种。上述至少一种抗病毒药物可为选自硫酸阿巴卡韦、无环鸟苷钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉维定、去羟肌苷、依非韦伦、泛昔洛韦、福米韦生钠、磷甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米呋啶、拉米呋啶/齐多呋啶、甲磺酸奈非那韦、内维拉平、磷酸奥司他韦、三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那维、甲磺酸沙奎那维、司他呋啶、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎纳米韦、齐多呋啶中的至少一种。上述至少一种大环内酯抗感染药可为选自阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素基质、无味红霉素、琥珀酸乙酯红霉素、乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素中的至少一种。上述至少一种综合抗感染药可为选自氨曲南、杆菌肽、琥珀酸钠氯霉素、盐酸氯洁霉素、盐酸氯洁霉素棕榈酸酯、氯洁霉素磷酸酯、亚胺培南。和西司他丁钠、美罗培南、呋喃妥因大晶体、呋喃妥因微晶体、奎奴普丁/达福普汀、盐酸壮观霉素、三甲氧苄二氨嘧啶、盐酸万古霉素中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的24-214页)。
上述至少一种变力性药物可为选自乳酸氨联吡啶酮、地高辛、乳酸米立农中的至少一种。上述至少一种抗心律失常药可为选自腺苷、盐酸乙胺碘呋酮、硫酸阿托品、甲苯磺酸溴苄胺、盐酸硫氮酮、双异丙吡胺、磷酸双异丙吡胺、盐酸艾司洛尔、乙酸哌氟酰胺、富马酸伊布利特、盐酸利多卡因、盐酸麦西雷丁、盐酸莫雷西嗪、苯妥英、苯妥英钠、盐酸普鲁卡因胺、盐酸普罗帕酮、盐酸普奈洛尔、酸式硫酸奎尼定、葡萄糖酸奎尼定、聚半乳糖醛酸奎尼定、硫酸奎尼定、梭达罗、盐酸妥卡尼、盐酸异搏定中的至少一种。上述至少一种防心绞痛药可为选自苯磺酸氨氯地平、亚硝酸戊酯、盐酸苄普地尔、盐酸硫氮酮、二硝酸异山梨醇酯、一硝酸异山梨醇酯、萘羟心安、盐酸尼卡地平、硝苯吡啶、硝酸甘油、盐酸心得安、异搏定、盐酸异搏定中的至少一种。上述至少一种抗高血压药可为选自盐酸醋丁酰心安、苯磺酸阿姆罗赫、氨酰心安、盐酸贝那普利、盐酸贝他洛尔、富马酸比索洛尔、坎地沙坦酯、卡托普利、盐酸山羊豆苷、卡维地洛、可乐宁、盐酸可乐宁、二氮嗪、盐酸硫氮酮、甲磺酸多沙唑嗪、依那普利拉、马来酸依那普利、甲磺酸依普罗沙坦、非洛地平、甲磺酸非诺多泮、福辛普利钠、醋酸氯压胍、硫酸胍那决尔、盐酸谷氨法新、盐酸肼苯哒嗪、厄贝沙坦、伊拉地平、盐酸柳胺苄心定、赖诺普利、氯沙坦钾、甲基多巴、盐酸甲基多巴盐、琥珀酸美多心安、酒石酸美多心安、长压定、盐酸莫昔普利、萘羟心安、盐酸尼卡地平、硝苯吡啶、乳链菌肽、硝普盐钠、硫酸环戊丁心安、培哚普利、甲磺酸芬托拉明、心得静、盐酸哌唑嗪、盐酸普奈洛尔、盐酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、盐酸特拉唑嗪、马来酸噻吗心安、群多普利、缬沙坦、盐酸异搏定中的至少一种。上述至少一种抗血脂药可为选自阿托伐他汀钙、西立伐他汀钠、胆苯烯胺、盐酸考来替泊、非诺贝特(微粉化)、氟伐他丁钠、吉非贝齐、洛伐他汀、烟酸、普伐他汀钠、辛伐他汀中的至少一种。上述至少一种综合性CV药物可为选自阿昔单抗.、前列地尔、盐酸阿布他明、西洛他唑、二硫酸氯吡格雷、双嘧哌胺醇、埃替非巴肽、盐酸甲氧胺福林、己酮可可碱、盐酸噻氯匹定、盐酸替罗非班中的至少一种(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的215-336页)。
上述至少一种非麻醉性镇痛药或退热剂可为选自醋氨酚、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟苯水杨酸、水杨酸酶中的至少一种。上述至少一种非甾族抗炎症药物可为选自塞来昔布、环氟拉嗪钾、环氟拉嗪钠、伊托多雷、苯氧苯丙酸钙、氟联苯丙酸、异丁苯丙酸、茚甲新、三水合茚甲新钠、酮丙酸、酮咯酸氨丁三醇、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、丙嗪、吡氧噻嗪、罗非昔布、舒林酸中的至少一种。上述至少一种麻醉药或阿片样镇痛药可为选自盐酸阿芬太尼、盐酸丁丙诺啡、酒石酸布托啡诺、磷酸可待因、硫酸可待因、枸橼酸芬太尼、芬太尼经皮系统、芬太尼跨粘膜、盐酸二氢吗啡酮、度冷丁、盐酸美沙酮、盐酸吗啡、硫酸吗啡、酒石酸吗啡、盐酸环丁甲羟氢吗啡、盐酸羟基二氢可待因酮、梳状1，4-羟基二氢可待因酮、盐酸氧吗啡酮、盐酸镇痛新、盐酸镇痛新和盐酸纳络酮、乳酸镇痛新、盐酸丙氧吩、萘磺酸丙氧吩、盐酸瑞芬太尼、柠檬酸舒芬太尼、盐酸曲马多中的至少一种。上述至少一种镇痛药-催眠药可为选自水合氯醛、三唑氮、盐酸氟胺安定、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、双香豆素、三唑苯二氮、扎莱普隆、酒石酸唑吡坦中的至少一种。上述至少一种抗惊厥药可为选自醋唑磺胺钠、卡马西平、氯硝安定、氯氮二钾、安定、双丙戊酸钠、乙琥胺、磷苯妥英钠、加巴喷丁、拉莫三嗪、硫酸镁、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯妥英、苯妥英钠、苯妥英钠(稀释)、普里米酮、盐酸替加宾、托吡酯、丙戊酸钠、丙戊酸中的至少一种。上述至少一种抗抑郁药可为选自盐酸阿米替林、双羟萘酸阿米替林、氯哌氧、盐酸丁氨苯丙酮、氢溴酸西酞普兰、盐酸氯米帕明、盐酸脱甲丙咪嗪、盐酸多虑平、盐酸氟西汀、盐酸丙咪嗪、双羟萘酸丙咪嗪、米氮平、盐酸奈法唑酮、盐酸去甲替林、盐酸帕罗西汀、硫酸苯乙肼、盐酸舍曲林、硫酸反苯环丙胺、马来酸三甲丙咪嗪、盐酸万拉法新中的至少一种。上述至少一种抗焦虑药可为选自阿普唑仑、盐酸丁螺旋酮、甲氨二氮、盐酸甲氨二氮、氯氮二钾、安定、盐酸多虑平、双羟萘酸羟嗪、盐酸羟嗪、双羟萘酸羟嗪、氯羟安定、mephrobamate、盐酸咪达唑仑、去甲羟安定中的至少一种。上述至少一种抗精神病药可为选自盐酸氯丙嗪、氯氮平、癸酸氟非那嗪、庚酸氟非那嗪、盐酸氟非那嗪、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、盐酸克塞平、琥珀酸克塞平、苯磺酸甲砜哒嗪、盐酸莫林酮、奥氮平、奋乃静、哌迷清、普鲁氯嗪、富马酸喹硫平、利培酮、盐酸甲硫哒嗪、氨砜噻吨、盐酸氨砜噻吨、盐酸三氟啦嗪中的至少一种。上述至少一种中枢神经系统刺激剂可为选自硫酸安非他明、咖啡碱、硫酸右旋安非他明、盐酸吗吡啉酮、盐酸脱氧麻黄碱、盐酸利他林、莫达非尼、佩默林、盐酸苯丁胺中的至少一种。上述至少一种抗帕金森病药可为选自盐酸金刚胺、甲磺酸苯托品、盐酸比哌立登、乳酸比哌立登、甲磺酸溴麦角环肽、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、左旋多巴、甲磺酸培高利特、二盐酸普拉克索、盐酸罗匹尼罗、盐酸司来吉兰、托卡朋、盐酸三己芬迪中的至少一种。上述至少一种综合性中枢神经系统药物可为选自盐酸丁氨苯丙酮、盐酸多奈哌齐、达哌啶醇、马来酸氟伏沙明、碳酸锂、柠檬酸锂、盐酸纳雷曲坦、甲基丙烯酸烟碱(一种戒烟口香糖的活性成分)、烟碱经皮系统、异丙酚、苯甲酸利扎曲普坦、盐酸西布曲明、琥珀酸舒马普坦、盐酸塔克林、佐米曲普坦中的至少一种。(见，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的337-530页)。
上述至少一种胆碱能药(例如拟副交感神经药)可为选自氯化氨甲酰甲胆碱、氯化滕西隆、溴化新斯的明、甲基硫酸新斯的明、水杨酸毒扁豆碱、溴化3-二甲氨基甲酰氧基-1甲基吡啶中的至少一种。上述至少一种抗胆碱能药可为选自硫酸阿托品、盐酸双环胺、胃长宁、茛菪碱、硫酸茛菪碱、溴化丙胺太林、东茛菪碱、丁基溴化东茛菪碱、氢溴化东莨菪碱中的至少一种。上述至少一种肾上腺素能药(拟交感神经药)可为选自盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、酸式酒石酸间羟胺、酸式酒石酸去甲肾上腺素、盐酸苯肾上腺素、盐酸假麻黄碱、硫酸假麻黄碱中的至少一种。上述至少一种肾上腺素能阻断剂(抗交感神经药)可为选自甲磺酸双氢麦角胺、酒石酸麦角胺、马来酸二甲麦角新碱、盐酸普奈洛尔中的至少一种。上述至少一种骨骼肌松弛剂可为选自氯苯氨丁酸、肌安宁、氯羟苯唑、盐酸环苯扎林、硝苯呋海因钠、氨甲酸愈甘醚酯、盐酸替扎尼定中的至少一种。上述至少一种神经肌肉阻断剂可为选自苯磺酸阿曲库铵、苯磺酸顺阿曲库铵、多库氯铵、米库氯铵、泮库溴铵、哌库溴铵、雷库溴铵、罗库溴铵、氯琥珀胆碱、氯化筒箭毒碱、维库溴铵中的至少一种。(见，例如Nuring 2001 Drug Handbook中的531-84页)。
上述至少一种抗组胺剂可为选自马来酸溴苯吡胺、盐酸西替利嗪、马来酸氯苯吡胺、富马酸铁线莲亭、盐酸二苯环庚啶、盐酸苯海拉明、盐酸非索非那定、氯雷他定、盐酸异丙嗪、茶异丙嗪、盐酸丙吡咯啶中的至少一种。上述至少一种支气管扩张药可为选自舒喘宁、硫酸舒喘宁、氨茶碱、硫酸阿托品、硫酸麻黄碱、肾上腺素、酒石酸氢肾上腺素、盐酸肾上腺素、异丙托溴铵、异丙基肾上腺素、盐酸异丙基肾上腺素、硫酸异丙基肾上腺素、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸异丙喘宁、胆茶碱、醋酸吡布特罗、羟萘甲酸沙美特罗、硫酸特普他林、茶碱中的至少一种。上述至少一种祛痰剂或镇咳药可为选自退咳露、磷酸可待因、硫酸可待因、氢溴酸右美沙芬、盐酸苯海拉明、愈创木酚甘油醚、盐酸二氢吗啡酮中的至少一种。上述至少一种综合性呼吸药物可为选自乙酰半胱氨酸、二丙酸氯地米松、beractant、布地奈德、calfactant、色甘酸钠、链道酶α、前列腺环素钠、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、孟鲁司特钠、奈多罗米钠、帕利珠单抗、丙炎松、扎鲁司特、齐留通中的至少一种。(见Nursing 2001Drug Handbook中的585-642页)。
上述至少一种抗酸剂、吸附剂或抗气胀药可为选自碳酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁铝、氢氧化镁、氧化镁、二甲基硅油、碳酸氢钠中的至少一种。上述至少一种消化酶或胆结石增溶剂可为选自胰酶、胰脂肪酶、脱氧熊胆酸中的至少一种。上述至少一种止泻药可为选自硅镁土、碱式水杨酸铋、聚卡波非钙、盐酸氰苯哌酯或硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奥曲肽、阿片酊、阿片酊(含樟脑)中的至少一种。上述至少一种轻泻剂可为选自bisocodyl、聚卡波非钙、药鼠李皮、药鼠李皮芳香烃流浸膏、药鼠李皮流浸膏、蓖麻油、多库酯钙、多库酯钠、甘油、半乳糖苷果糖、柠檬酸镁、氢氧化镁、硫酸镁、甲基纤维素、矿物油、聚乙二醇或电解质溶液、车前子、番泻叶、磷酸钠中的至少一种。上述至少一种止吐剂可为选自盐酸氯丙嗪、氯茶硷苯海拉明、甲磺酰基多拉司琼、屈大麻酚、盐酸格拉司琼、美克洛嗪、metocloproamidehydrochloride、盐酸昂丹司琼、羟哌氯丙嗪、普鲁氯嗪、乙二磺酸甲哌氯丙嗪、马来酸甲哌氯丙嗪、盐酸异丙嗪、东茛菪碱、马来酸硫乙哌丙嗪、盐酸曲美苄胺中的至少一种。上述至少一种抗溃疡药可为选自甲氰咪胺、盐酸甲氰咪胺、法莫替丁、羊毛二烯、米索前列醇、对氨基苯、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、rantidine bismuth citrate、盐酸呋喃硝胺、硫酸铝中的至少一种。(见，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的643-95页)。上述至少一种类固醇可为选自倍他米松、醋酸倍他米松或倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、醋酸氟氢可的松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、磷酸钠氢化可的松、氢化考的松琥珀酸钠、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲氢泼尼松琥珀酸钠、波尼松龙、醋酸强的松龙、氢化泼尼松磷酸钠、prednisolone tebutate、脱氢可的松、氟烃氢化泼尼松、去炎舒松、双醋去炎松中的至少一种。上述至少一种雄激素或促同化激素类可为选自炔羟雄烯异唑、氟羟甲睾酮、甲基睾甾酮、癸酸诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、环戊丙酸睾丸甾酮、庚酸睾酮、丙酸睾丸甾酮、estosterone经皮的系统中的至少一种。上述至少一种雌激素或黄体激素类可为选自酯化的雌激素、雌二醇、环戊丙酸雌二醇、雌二醇/醋炔诺酮经皮的系统、戊酸雌二醇、雌激素(偶联的)、雌酮硫酸酯哌嗪、乙炔雌二醇、乙炔雌二醇和去氧孕烯、乙炔雌二醇和双醋炔诺醇、乙炔雌二醇和去氧孕烯、乙炔雌二醇和双醋炔诺醇、乙炔雌二醇和左炔诺孕酮、乙炔雌二醇和炔诺酮、乙炔雌二醇和醋炔诺酮、乙炔雌二醇和炔诺肟酯、乙炔雌二醇和甲基炔诺酮、乙炔雌二醇和炔诺酮和醋酸盐和富马酸铁、左炔诺孕酮、6α甲基17α乙酸基孕甾酮、雌醇甲醚和炔诺酮、炔诺酮、醋炔诺酮、甲基炔诺酮、孕酮。上述至少一种gonadroptropin可为选自醋酸加尼瑞克、醋酸促性腺激素释放因子、醋酸组氨瑞林、menotropins中的至少一种。上述至少一种抗糖尿病药或胰高血糖素可为选自阿卡波糖、氯磺丙脲、谷胱甘肽、格列甲嗪、胰高血糖素、优降糖、胰岛素、盐酸甲福明二甲双胍、米格列醇、盐酸吡咯列酮、瑞格列奈、马来酸罗格列酮、曲格列酮中的至少一种。上述至少一种甲状腺激素可为选自左旋甲状腺素钠、碘甲腺氨酸钠、复方甲状腺素、干甲状腺粉中的至少一种。上述至少一种甲状腺激素拮抗剂可为选自甲疏咪唑、碘化钾、碘化钾(饱和溶液)、丙硫尿嘧啶、放射性碘(碘化钠131I)、浓碘溶液中的至少一种。上述至少一种垂体激素可为选自促肾上腺皮质激素、α1-24促肾上腺皮质激素、desmophressin acetate、乙酸亮脯利特、长效促肾上腺皮质激素、人蛋氨生长素、生长激素、加压素中的至少一种。上述至少一种类甲状旁腺药物可为选自骨化二醇、降钙素(人)、降钙素(鲑鱼)、钙三醇、二氢速甾醇、依替膦酸钠中的至少一种。(见，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的696-796页)。
上述至少一种利尿剂可为选自乙酰唑(磺)胺、乙酰唑(磺)胺钠、盐酸氨氯吡脒、丁苯氧酸、氯噻酮、利尿酸钠、利尿酸、利尿磺胺、双氢氯噻嗪、茚磺苯酰胺、甘露醇、美拉托宗、安体舒通、托拉塞米、三氨苯蝶啶、脲中的至少一种。上述至少一种电解质或置换溶液可为选自乙酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、磷酸钙(二元)、磷酸钙(三元)、葡聚糖(高分子量)、萄聚糖(低分子量)、羟乙基淀粉、氯化镁、硫酸镁、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、Ringer氏注射液、Bingers氏注射液(乳酸化)、氯化钠中的至少一种。上述至少一种酸化剂或碱化剂可为选自碳酸氢钠、乳酸钠、氨基丁三醇中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的797-833页)。
上述至少一种补血药可为选自富马酸铁、葡萄糖酸铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁(干燥)、右旋糖酐铁、山梨醇铁、多糖-铁复合物、葡萄糖酸铁钠复合物中的至少一种。上述至少一种抗凝血剂可为选自阿地肝素钠、达肝素钠、达那肝素钠、依诺肝素钠、肝素钙、肝素钠、苄丙酮香豆素钠中的至少一种。上述至少一种血液衍生物可为选自白蛋白5％、白蛋白25％、抗血友病因子、抗抑制剂促凝剂复合物、抗凝血酶III(人)、IX因子(人)、IX因子复合物、血浆蛋白组分中的至少一种。上述至少一种溶血栓药可为选自阿替普酶、阿尼链酶、瑞替普酶(重组)、链激酶、尿激酶中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的834-66页)。
上述至少一种烷基化药物可为选自白消安、卡铂、卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺氯氨铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、环己亚硝脲、盐酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、盐酸苯丙氨酸氮芥、链脲霉素、替莫唑胺、硫替派中的至少一种。上述至少一种抗代谢物可为选自卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、羟基脲、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤钠、硫鸟嘌呤中的至少一种。上述至少一种抗生素抗肿瘤药物可为选自硫酸博莱霉素、放线菌素D、柠檬酸柔红霉素脂质体、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、丝裂霉素、戊糖苷、普卡霉素、戊柔比星中的至少一种。上述至少一种可改变激素平衡的抗肿瘤药物可为选自阿那曲唑、比卡鲁胺、雌二醇氮芥磷酸钠、依西美坦、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、来曲唑、乙酸亮脯利特、醋酸甲地孕酮、尼鲁米特、柠檬酸三苯氧胺、睾内脂、枸橼酸托瑞米芬中的至少一种。上述至少一种综合性抗肿瘤药物可为选自天冬酰胺酶、杆菌Calmette-Guerin(BCG)(活体膀胱内)、氮烯咪胺、多烯紫杉醇、鬼臼乙叉苷、磷酸鬼臼乙叉苷、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、邻氯苯对氯苯二氯乙烷、盐酸米托蒽醌、紫杉醇、培加帕酶、卟吩姆钠、盐酸甲基下肼、利妥昔单抗、替尼泊甙、盐酸拓扑替康、曲妥珠单抗、全反维生素A酸、硫酸长春花碱、硫酸长春花新碱、酒石酸长春瑞宾中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的867-963页)。
上述至少一种免疫抑制剂可为选自硫唑嘌呤、巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单抗-CD3、霉酚酸吗啉乙酯、盐酸霉酚酸吗啉乙酯、西罗莫司、他克莫司中的至少一种。上述至少一种疫苗或类毒素可为选自BCG疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附型)、白喉和破伤风类毒素和非细胞百日咳疫苗吸附型、白喉和破伤风类毒素和全细胞百日咳疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、甲型肝炎疫苗(灭活)、乙型肝炎疫苗(重组)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(纯化的表面抗原)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(亚病毒体或纯化的亚病毒体)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(全病毒体)、日本脑炎病毒疫苗(灭活)、Lyme氏疏螺旋体病疫苗(重组OspA)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(活)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(减活)、麻疹病毒疫苗(减活)、脑膜炎双球菌多糖菌苗、腮腺炎病毒疫苗(活)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多联)、脊髓灰质炎病毒疫苗(灭活)、脊髓灰质炎病毒疫苗(活、口服、三联)、狂犬病疫苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人二倍体细胞)、风疹和腮腺炎病毒疫苗(活)、风疹病毒疫苗(活、减活)、破伤风类毒素(吸附型)、破伤风类毒素(液体)、伤寒疫苗(口服)、伤寒疫苗(肠胃外施用)、伤寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黄热病疫苗中的至少一种。上述至少一种抗毒素或抗蛇毒素可为选自黑寡妇蜘蛛抗蛇毒素、响尾蛇科抗蛇毒素(多联)、白喉抗毒素(马)、金黄珊瑚蛇毒血清中的至少一种。上述至少一种免疫血清可为选自巨细胞病毒免疫球蛋白(静脉内)、乙型肝炎免疫球蛋白(人)、免疫球蛋白肌肉内、免疫球蛋白静脉内、狂犬病免疫球蛋白(人)、呼吸道合胞病毒免疫球蛋白静脉内(人)、Rho(D)免疫球蛋白(人)、Rho(D)免疫球蛋白静脉内(人)、破伤风免疫球蛋白(人)、水痘-带状疱疹免疫球蛋白中的至少一种。上述至少一种生物反应调节物可为选自阿地流津、依泊艾汀α、非拉司汀、注射用glatiramer acetate、干扰素alfacon-1、干扰素α-2a(重组)、干扰素α-2b(重组)、干扰素β-1a、干扰素β-1b(重组)、干扰素γ-1b、盐酸左旋四咪唑、重组人白介素11、沙格司亭中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的964-1040页)。
上述至少一种眼科抗感染药可选自杆菌肽、氯霉素、盐酸环丙沙星、红霉素、硫酸艮他霉素、吡啶羧酶0.3％、硫酸多粘菌素B、磺胺醋酰钠10％、磺胺醋酰钠15％、磺胺醋酰钠30％、托普霉素、阿糖腺苷中的至少一种。上述至少一种眼科抗炎症药可为选自地塞米松、地塞米松磷酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠0.1％、氯甲龙、氟比洛芬钠、酮咯酸氨丁三醇、醋酸强的松龙(悬液)、强的松龙磷酸钠(溶液)中的至少一种。上述至少一种缩瞳剂可为选自氯乙酰胆碱、氨甲酰胆碱(眼内)、氨甲酰胆碱(局部)、依可碘酯、毛果芸香碱、盐酸毛果芸香碱、硝酸毛果芸香碱中的至少一种。上述至少一种扩瞳剂可为选自硫酸阿托品、盐酸环戊通、盐酸肾上腺素、硼酸肾上腺素、氢溴酸后马托品、盐酸苯肾上腺素、氢溴酸东莨菪碱、托品酰胺中的至少一种。上述至少一种眼血管收缩剂可为选自盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸四氢萘唑啉中的至少一种。上述至少一种综合性眼药可为选自盐酸阿可乐定、盐酸倍他洛尔、酒石酸溴莫尼定、盐酸山羊豆苷、盐酸地匹福林、盐酸杜塞酰胺、富马酸依美斯汀、荧光素钠、延胡索酸甲哌噻庚酮、拉坦前列素、盐酸左布诺洛尔、盐酸美替卜拉格、氯化钠(高渗)、马来酸噻吗心安中的至少一种。上述至少一种耳用药可为选自硼酸、过氧化氢脲、氯霉素、油酸三乙醇胺多肽-冷凝液中的至少一种。上述至少一种鼻用药可为选自二丙酸氯地米松、布地奈德、硫酸麻黄碱、盐酸肾上腺素、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸苯肾上腺素、盐酸四氢萘唑啉、丙炎松、盐酸丁苄唑啉中的至少一种。(见，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的1041-97页)。
上述至少一种局部抗感染药可为选自无环鸟苷、两性霉素B、壬二酸乳脂、杆菌肽、硝酸布康唑、磷酸氯林肯霉素、克霉唑、硝酸益康唑、红霉素、硫酸艮他霉素、酮康唑、醋酸高磺胺、甲硝基羟乙唑(局部)、硝酸霉抗唑、莫匹罗星、盐酸萘替芬、硫酸新霉素、硝基糖腙、制霉菌素、磺胺嘧啶银、盐酸特比奈酚、特康唑、盐酸四环素、噻康唑、发癣退中的至少一种。上述至少一种抗疥螨剂或抗虱剂可为选自克罗他米通、林丹、苄氯菊脂、除虫菊酯中的至少一种。上述至少一种局部皮质类固醇可为选自双丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯氟美松、丙缩羟强龙、去氧米松、地塞米松、地塞米松磷酸钠、双醋二氟松、丙酮肤轻松、氟新诺龙酯、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、halcionide、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、戊酸氢化可的松、糠酸莫美他松、丙炎松中的至少一种。(见，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的1098-1136页)。
上述至少一种微生素或矿物质可为选自维生素A、复合维生素B、氰钴胺素、叶酸、羟钴胺素、甲酰四氢叶酸钙、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素C、维生素D、胆钙化醇、麦角钙化醇、维生素D类似物、度骨化醇、帕利骨化醇、维生素E、维生素K类似物、维生素K1、氟化钠、氟化钠(局部)、痕量元素、铬、铜、碘、锰、硒、锌中的至少一种。上述至少一种热质可为选自氨基酸浸剂(晶状)、右旋糖中的氨基酸浸剂、含电解质的氨基酸浸剂、右旋糖中含电解质的氨基酸浸剂、针对肝衰竭的氨基酸浸剂、针对高代谢压力的氨基酸浸剂、针对肾衰竭的氨基酸浸剂、右旋糖、脂肪乳状液、中链脂肪酸甘油三酯中的至少一种。(见，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的1137-63页)。
本发明也提供至少一种任何合适的和/或有效量的特定组合物或药物组合物中，该特定组合物或药物组合物包含了至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，该特定组合物或药物组合物任选地进一步包含了选自至少一种TNF拮抗剂(例如，但不仅限于TNF化学或蛋白质拮抗剂、TNF单克隆或多克隆抗体或片段、可溶TNF受体(例如p55、p70或p85)或片段、其融合多肽，或小分子TNF拮抗剂，例如TNF结合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II)、nerelimonmab、英利昔单抗、enteracept、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗、来那西普等)、抗风湿药(例如，氨甲蝶呤、醋硫葡金、金硫代葡萄糖、硝基咪唑硫嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯奎、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药物、氨基甲酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养物质、甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如依泊艾汀α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环胞多肽、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节物、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷基化药物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链球菌DNA酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。上述细胞因子的非限制性实例包括，但不仅限于IL-1-IL-23中的任意一种。合适剂量是本领域熟知的。见，例如Wells etal.，eds.，PharmacotherapyHandbook，2 nd Edition，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，DeluxeEdition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，上述参考文献均被完整引入此处，作为参考。
上述组合物也可包括与本发明至少一种抗体或多肽缔合、结合、协同配制或协同施用的毒素分子。该毒素可任选地起选择性杀死病理细胞或组织的作用。该病理细胞可为癌细胞或其它细胞。该毒素可以是，但不仅限于包含了特定毒素的至少一个功能性细胞毒素区的纯化或重组毒素或毒素片段，该特定毒素选自例如，至少一种蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或细菌毒素之一。术语毒素也包括由任何可在人和其它哺乳动物中引起包括中毒性休克在内的病理状况，并可导致死亡的天然存在、突变或重组细菌或病毒所生成的内毒素和外毒素。该毒素可包括，但不仅限于产生肠毒性的大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺菌细胞毒素、气单胞菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、链球菌肠毒素等。上述细菌包括，但不仅限于产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、致肠出血大肠杆菌(例如血清型0157：H7的菌株)、葡萄球菌种(例如金黄色葡萄球菌、酿脓葡萄球菌)、志贺菌种(例如志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺杆菌、波伊德氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏杆菌)、沙门氏菌种(例如伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)、梭状芽胞杆菌种(例如产气荚膜梭状芽胞杆菌、艰难杆菌、肉毒杆菌)、弯曲杆菌种(例如空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆菌种(例如幽门螺杆菌)、气单胞菌种(例如，温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类志贺邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弧菌种(例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌)、克雷白杆菌种、铜绿假单胞菌和链球菌。见，例如Stein，ed.，INTERNAL MEDICINE，3 rd ed.，pp1-13，Little，Brown and Co.，Boston，(1990)；Evans等.，eds.，Bacterial Infectionsof Humans；Epidemiology and Control，2d.Ed.，pp 239-254，PlenumMedical Book Co.，New York(1991)；Mandell等.，Principles and Practiceof Infectious Diseases，3d.Ed.，Churchill Livingstone，New York(1990)；Berkow等.，eds.，The Merck Manual，16 th edition，Merck and Co.，Rahway，N.J.，1992；Wood等.，FEMS Microbiology Immunology，76：121-134(1991)；Marrack等.，Science，248：705-711(1990)，上述参考文献的内容均被完整引入此处作为参考。
本发明GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物可进一步包括至少一种任意的合适辅助物，例如，但不仅限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。药学可接受辅助物是优选的。上述无菌溶液的非限制性实例及制备方法均是本领域熟知的，例如，但不仅限于Gennaro，Ed.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，18 thEdition，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。通过本领域熟知和/或此处描述的常规方法可选择出与GLP-1模拟体组合物的施用方式、溶解度和/或稳定性相配的药学可接受载体。
在本发明组合物中有用的药物赋形剂和添加剂包括，但不仅限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物类(例如，糖、包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，诸如糖醇、糖醛酸、酯化糖等；多糖或糖类聚合物)它们可单独或以组合形式存在，包括单独或在组合中以1-99.99％重量或体积比例存在。蛋白质赋形剂的实例包括血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可发挥缓冲作用的代表性氨基酸/GLP-1模拟体或特定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的碳水化合物类赋形剂包括，例如，单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。适用于本发明的优选糖类赋形剂为甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
GLP-1模拟体组合物也可包括缓冲剂或pH调节剂；典型的缓冲剂是从有机酸或碱制备而得的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，诸如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、盐酸三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲剂。适用于本发明组合物的优选缓冲剂为有机酸盐，诸如柠檬酸盐。
另外，本发明的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物可包括聚合的赋形剂/添加剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、水溶性聚蔗糖(一种聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，诸如2-羟丙基-β环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗菌剂、甜味剂、抗氧剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，诸如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适用于本发明GLP-1模拟体组合物的上述及其它已知药物赋形剂和/或添加剂均是本领域已知的，例如在“Remington：TheScience&Practice of Pharmacy”，19th ed.，Williams&Williams，(1995)，和在“Physician’s Desk Reference”，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)中所列出的药物赋形剂和/或添加剂，上述参考文献的公开内容均被完整引入此处作为参考。优选的载体或赋形剂材料为碳水化合物类(例如糖类和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。
制剂。如上所述，本发明提供了稳定制剂，该制剂可优选地包括含盐水或特定盐的合适缓冲剂和任选的含有防腐溶液，以及提供了含有防腐剂的制剂和适合药用或兽医用途的多用防腐制剂，这些制剂包含了药学可接受制剂形式的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。防腐制剂含有至少一种已知的防腐剂，或选自下列的任选防腐剂，即至少一种苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氨丁醇、氯化镁(例如六水合物)、烷基对羟基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、杀藻胺、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或上述物质在水性稀释剂中的混合物。可根据本领域已知的知识应用任意合适的浓度或混合物，诸如0.001-5％，或其中的任意范围或数值，例如，但不仅限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任意范围或数值。非限制性实例包括，无防腐剂、0.1-2％m-甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％烷基对羟基苯甲酸(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所述，本发明提供了一种制品，该制品包括包装材料和至少一个含有特定溶液的小瓶，该特定溶液含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体和上述缓冲剂和/或防腐剂，并任选地为水性稀释液形式，其中上述包装材料包括标示了上述溶液可保存超过1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间段的标签。本发明进一步包括一种制品，该制品包括包装材料、含至少一种冻干GLP-1模拟体或特定部分或变体的第一个小瓶，和含有上述缓冲剂或防腐剂的水性稀释液的第二个小瓶，其中上述包装材料包括一个标签，可向患者说明如何将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体重新混入水性稀释液中，并从而形成可保存超过24小时或更长时间段的溶液。
根据本发明应用的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体可通过重组途径，包括从哺乳动物细胞或转基因制品中制备，或者可从此处所描述或本领域已知的其它生物学来源纯化获得。
在本发明的产品中，至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的数量范围包括在湿/干体系中的情况下，在复原基础上可获得大约1.0ug/ml-大约1000mg/ml浓度的量，但较低和较高浓度也是可行的，并取决于特定送递载体，例如溶液制剂不同于经皮药帖、肺、跨粘膜，或渗透或微量泵法。
优选地，上述水性稀释液任选地进一步包括药学可接受防腐剂。优选的防腐剂包括选自下列的防腐剂，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、杀藻胺、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或上述物质的混合物。应用在本发明制剂中的防腐剂浓度是足以产生抗微生物效果的浓度。该浓度取决于所选防腐剂，且技术人员可容易地测定该浓度。
其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂，均可被任选和优选地加入上述稀释液中。等渗剂，如甘油，通常采用其已知浓度。生理可耐受缓冲剂被优选加入，以改善pH控制。本发明制剂可覆盖大范围的pH，诸如大约pH4-大约pH10，优选的范围是大约pH5-大约pH9，最为优选的范围是大约pH6.0-大约pH8.0。本发明制剂的优选pH值在大约6.8-大约7.8之间。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最为优选的是磷酸钠，尤其是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
其它添加剂，诸如药学可接受增溶剂，如Tween 20(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯20或80或聚羟亚烃184或188，Pluronic
Figure A200580049931D0061133159QIETU
 polyls、其它嵌段共聚物，和诸如EDTA和EGTA的螯合剂，均可被任选地加入本发明制剂或组合物中，以减少凝聚。当采用泵或塑料容器施用本发明制剂时，上述添加剂尤其有效。药学可接受表面活性剂的存在减低了蛋白质凝聚的倾向。
本发明制剂可通过特定方法制备，该方法包括将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与选自下列之一的防腐剂混合，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、杀藻胺、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或上述物质在水性稀释液中的混合物。将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与防腐剂混合在水性稀释液中，是采用常规溶解和混合操作实现的。为制备合适制剂，例如，将缓冲液中精确量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与缓冲液中的指定防腐剂按特定量值配伍，该特定量值足以提供蛋白质和防腐剂的指定浓度。本领域任何一位普通技术人员均应认可该方法的改动形式。例如，加入组分的顺序，是否采用其它添加剂，制备该制剂的温度和pH，均是可被优化从而适用于所采用浓度和施用途径的因素。
本发明所要求权利的制剂可作为清液或双瓶形式被提供给患者，其中在双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的GLP-1模拟体或特定部分或变体，可利用含有水、防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸盐缓冲剂和/或盐溶液和特定盐，并形成水性稀释液的另一小瓶将其复原。单溶液瓶或需复原的双瓶均可被重复利用多次，并足以满足对患者的单次或多循环治疗需要，因而可提供比现有通用治疗方案更为便利的治疗方法。
本发明所要求权利的制品适用于从立即到24小时或更长时间段跨度的施用。相应地，本发明所要求权利的制品为患者提供了显著的益处。本发明制剂可任选地在大约2-大约40℃的温度下安全保存，并长时间地保持蛋白质的生物活性，因而可在包装标签上标示该溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的时间段跨度上被保存和/或使用。如采用防腐稀释剂，该标签可包括直至1-12个月中的至少一个月数、半年、一年半和/或两年的使用期。
在本发明中，至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的溶液可通过特定方法制备，该方法包括将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体混合在水性稀释液中。该混合是采用常规溶解和混合操作实现的。为制备合适的稀释液，例如，以在水或缓冲液中，以特定量值配伍精确量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，该量值足以提供蛋白质和任选防腐剂或缓冲剂的指定浓度。本领域任何一位普通技术人员均应认可该方法的改动形式。例如，加入组分的顺序，是否采用其它添加剂，制备本发明制剂的温度和pH，均是可被优化从而适用于所采用浓度和施用途径的因素。
本发明所要求权利的产品可作为清液或双瓶形式被提供给患者，其中在双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的GLP-1模拟体或特定部分或变体，可利用含水性稀释液的另一小瓶将其复原。单溶液瓶或需复原的双瓶均可被重复利用多次，并足以满足对患者的单次或多循环治疗需要，因而可提供比现有通用治疗方案更为便利的治疗方法。
通过向药房、诊所或其它类似机构和设施提供本发明所要求权利的清液或双瓶形式的产品，可将其间接提供给患者，其中在双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的GLP-1模拟体或特定部分或变体，可利用含水性稀释液的另一小瓶将其复原。该情况中的清液可达一升或更大体积，因而需提供一种大的储液器，由其分一次或多次地将较少量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体溶液转移进较小的瓶中，该较小的瓶可由药房或诊所向其顾客和/或患者提供。
包含上述单瓶体系的公认装置包括用于送递溶液的笔式-注射器装置，诸如
Figure A200580049931D00621
Figure A200580049931D00622
Figure A200580049931D00624
和
Figure A200580049931D00625
包含双瓶体系的公认装置包括可用于将冻干药物在药筒中复原，并送递该复原溶液的笔式-注射器装置，诸如
Figure A200580049931D00626
本发明所要求权利的产品包括包装材料。除管理机构所要求的信息外，该包装材料还提供了应用该产品的条件。本发明的包装材料向患者提供了说明书，讲述了在产品为双瓶，湿/干形式时，水性稀释剂中复原至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，形成溶液的方法，以及在超过2-24小时或更长时间段的跨度上使用该溶液的方法。对单瓶溶液产品而言，标签标示了该溶液可被使用超过2-24小时或更长时间段。本发明所要求权利的产品在人药物产品用途方面有用。
本发明制剂可通过特定方法制备，该方法包括将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与特定缓冲剂，优选含盐水或特定盐的磷酸盐缓冲剂混合。将至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与缓冲剂混合在水性稀释液中，是采用常规溶解和混合操作实现的。为制备合适制剂，例如，将水或缓冲剂中准确量的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体与水中的指定缓冲剂按特定量值配伍，该量值足以提供蛋白质和缓冲剂的指定浓度。本领域任意一位普通技术人员均应认可该方法的变动形式。例如，加入组分的顺序，是否采用其它添加剂，制备本发明制剂的温度和pH，均是可被优化从而适用于所采用浓度和施用途径的因素。
本发明所要求权利的稳定或防腐制剂可以清液或双瓶形式被提供给患者，该双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的GLP-1模拟体或特定部分或变体，可利用含水性稀释液形式的防腐剂或缓冲剂和赋形剂的另一小瓶将其复原。单溶液瓶或需复原的双瓶均可被重复利用多次，并足以满足对患者的单次或多循环治疗需要，因而可提供比现有通用治疗方案更为便利的治疗方法。
根据本发明，此处所描述的稳定或防腐制剂或溶液中的至少一种GLP-模拟体或特定部分或变体可通过多种送递方法被施用给患者，包括SC或IM注射；经皮、肺、跨粘膜、移植、渗透泵、药筒、微量泵或本领域熟知，并被熟练技术人员理解的其它途径。
治疗应用。关于模拟体的本发明也提供了一种在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗的糖尿病、I型或II型糖尿病的方法，包括成年开始的或幼年的、胰岛素依赖性的、非胰岛素依赖性的等，包括相关的体征和症状，例如但不仅限于胰岛素抗性、高血糖、低血糖、胰腺炎、Sushing氏综合症、黑棘皮病、脂肪萎缩型糖尿病、视网膜病、肾病、多发性神经病、单神经病、自发性神经病、溃疡、足溃疡、关节病、感染(例如，真菌的或细菌的)等。
本发明也提供了一种在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗至少一种与糖尿病相联系的免疫相关疾病的方法，包括但不仅限于I型或II型糖尿病中的至少一种，包括成年开始的或幼年的、胰岛素依赖性的、非胰岛素依赖性的等，包括相关的体征和症状，例如但不仅限于胰岛素抗性、高血糖、低血糖、胰腺炎、Sushing氏综合症、黑棘皮病、脂肪萎缩型糖尿病、视网膜病、肾病、多发性神经病、单神经病、自发性神经病、溃疡、足溃疡、关节病、感染(例如，真菌的或细菌的)等。见，例如Merck Manual，12th-17th Editions，Merck & Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，PharmacotherapyHandbook，Wells等.，eds.，Second Edition，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2001)，每个文献均被完整引入作为参考。
该方法可任选地包括将有效量的至少一种特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。
本发明也提供了在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗至少一种心血管病的方法，该心血管病包括，但不仅限于，至少一种心脏晕厥综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、局部缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、糖尿病动脉硬化性疾病、高血压、动脉性高血压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统的梅毒、心力衰竭、肺源性心脏病、原发性肺动脉高压、心律失常、房性异位搏动、心房扑动、心房纤维性颤动(持续或阵发性)、紊乱性或多病灶房性心动过速、规律性狭窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室纤颤、His束心律失常、房室传导阻滞、束支性传导阻滞、心肌局部缺血性失调、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜性心脏病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和周围动脉动脉瘤、主动脉解剖、主动脉炎症、腹主动脉及其分枝的闭塞、外周血管失调、闭塞性动脉失调、外周动脉粥样硬化病、血栓闭塞性脉管炎、功能性外周动脉失调、雷诺氏现象和疾病、肢端发绀症、红斑性肢痛症、静脉病、血栓静脉炎、曲张静脉、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征、局部缺血-再灌注损伤等。该方法可任选地包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。
本发明的任一方法均可包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。该方法可任选地进一步包括针对治疗上述免疫病的协同施用或联合治疗，其中上述至少一种GLP-1模拟体、特定部分或其变体的施用进一步包括在其之前、同时和/或之后，施用选自下列的至少一种药物，即至少一种TNF拮抗剂(例如，但不仅限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如，氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药、氨基甲酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养物、甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如依泊艾汀α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节物、扩瞳药、睫状肌麻痹药、烷基化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链道酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域熟知的。见，例如Wells等.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2 nd Edition，Appleton andLange，Starnford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，各参考文献均被完整引入此处作为参考。
模拟体也可被应用于体外，诸如自体骨髓培养。简言之，在化学治疗之前，从患者体内取出骨髓，并采用TPO和/或GLP-1处理，任选地结合模拟体，任选地结合一种或多种其它细胞因子。随后，将经过处理的骨髓返还给经过化学治疗的患者，以加速骨髓的恢复。另外，TPO可单独应用和与GLP-1模拟体和/或GLP-1联合应用，也可被用于体外扩展骨髓或外周血祖细胞(PBPC)。在化学治疗之前，可采用干细胞生长因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以将早期祖细胞释放进外周循环中。任选地，从外周血中收集并浓缩这些祖细胞，并随后采用TPO和模拟体处理其培养物，任选地结合一种或多种其它细胞因子，包括，但不仅限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11，使其分化并增生为高密度巨核细胞培养物，随后将其任选地返还给经过高剂量化学治疗后的患者体内。用于体外处理骨髓的TPO剂量范围应为100pg/ml-10ng/ml，优选的为500pg/ml-3ng/ml。模拟体的剂量应在活性上等同于GLP-1，可采用的剂量范围是0.1个单位/ml-20个单位/ml，优选地是0.5个单位/ml-2个单位/ml，或其中的任意范围或数值。
适用于本发明组合物、联合治疗、协同施用、装置和/或方法(进一步包括本发明至少一种抗体、特定部分或其变体)的TNF拮抗剂包括，但不仅限于抗TNF抗体、其配体结合片段，和与TNF特异性结合的受体分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其对目标细胞的作用的化合物，诸如反应停、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可碱和咯利普兰)、A2b腺苷受体拮抗剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/或抑制TNF受体发信号的化合物，诸如促分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻滞和/或抑制膜TNF裂解的化合物，诸如金属蛋白醇抑制剂；阻滞和/或抑制TNF活性的化合物，诸如血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利)；和阻滞和/或抑制TNF生成和/或合成的化合物，诸如MAP激酶抑制剂。
此处所用“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等降低、阻滞、抑制、消除或干扰了体外、原位和/或优选体内的TNFα活性。例如，合适的本发明TNF人抗体可结合TNFα，并包括抗TNF抗体、其抗原结合片段，和特定突变体或其与TNFα特异性结合的区域。合适的TNF抗体或片段也可降低、阻滞、消除、干扰、阻止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体发信号、膜TNF裂解、TNF活性、TNF生成和/或合成。
嵌合抗体cA2由高亲和性中和小鼠抗人TNF α IgG1抗体，即A2的抗原结合可变区和人IgG1，即K免疫球蛋白的恒定区组成。该人IgG1Fc区改善了同种异型抗体效应子功能，延长了该抗体的循环血清半衰期，并降低了其免疫原性。嵌合抗体cA2的亲和力和表位特异性来源于鼠科动物抗体A2的可变区。一种特定实施方案中，对编码该鼠科动物抗体A2可变区的核酸而言，优选的来源是A2杂交瘤细胞系。
嵌合A2(cA2)以剂量依赖方式中和了天然和重组人TNF α二者的细胞毒效应。从嵌合抗体cA2与重组人TNF α的结合试验中，推算出嵌合抗体cA2的亲和常数为1.04×1010M-1。通过竞争抑制测定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可参考Harlow，等.，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1988；Colligan etal.，eds.，Current Protocols inImmunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience，New York.(1992-2002)；Kozbor等.，Immunol.Today，4：72-79(1983)；Ausubel等.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York(1987-2002)；和Muller，Meth.Enzymol.，95：589-601(1983)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考。
本领域已描述了可应用于本发明的其它单克隆抗TNF抗体实例(见，例如美国专利号5,231,024；M
Figure A200580049931D0067133403QIETU
ller，A.等.，Cytokine 2(3)：162-169(1990)；美国申请号07/943,852(1992年9月11日提交)；Rathjen等.，国际公开号WO 91/02078(1991年2月21日出版)；Rubin等，GLP-1专利公开号0218868(1987年4月22日出版)；Yone等.，GLP-1专利公开号0288088(1988年10月26日)；Liang，等.，Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager，等.，Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly等.，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman，等.，Hybridoma 6：489-507(1987)；和Hirai，等.，J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考)。
TNF受体分子。本发明优选采用的TNF受体分子是那些与TNF α高亲和力结合(见，例如Feldmann等.，国际公开号WO 92/07076(1992年4月30日出版)；Schall等.，Cell 61：361-370(1990)；和Loetscher等.，Cell 61：351-359(1990)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考)，并任选地具有低免疫原性的TNF受体分子。55kDa(p55TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF细胞表面受体在本发明中尤其有用。这些受体的截短形式包括该受体的胞外域(ECD)或其功能部分(见，例如Corcoran等，Eur.J.Biochem.223：831-840(1994))，在本发明中也有用。在尿和血清中已检测到该TNF受体包含ECD的截短形式，即30kDa和40kDa的TNF α抑制结合蛋白(Engelmann，H.等.，J.Biol.Chem.265：1531-1536(1990))。TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子，及其衍生物和片段或部分，是可应用于本发明方法和组合物的其它TNF受体分子实例。可应用于本发明的TNF受体分子的特征在于其具有长期治疗患者，并可良好到极好地缓解症状的能力，且毒性低。低免疫原性和/或高亲和力，以及其它未明确的特征，均可能对所获的治疗效果起作用。
在本发明中有用的TNF受体多聚体分子包括经由一个或多个多肽接头或其它非肽接头，诸如聚乙二醇(PEG)，连接在一起的两个或多个TNF受体的ECD的全部或一个功能部分。该多聚体分子可进一步包括分泌性蛋白的信号肽，以引导该多聚体分子的表达。美国申请号08/437，533(1995年5月9日提交)中描述了这些多聚体分子及其制备方法，该参考文献的内容被完整引入此处作为参考。
在本发明方法和组合物中有用的TNF免疫受体融合分子包括一个或多个免疫球蛋白分子的至少一个部分，和一个或多个TNF受体的全部或一个功能部分。这些免疫受体融合分子可被装配为单体，或异源多聚体或同源多聚体。该免疫受体融合分子也可为单价或多价。这种TNF免疫受体融合分子的一个实例是TNF受体/IgG融合蛋白。本领域已描述了TNF免疫受体融合分子及其制备方法(Lesslauer等.，Eur.J.Immunol.21：2883-2886(1991)；Ashkenazi等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Peppel等.，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991)；Kolls等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：215-219(1994)；Butler等.，Cytokine 6(6)；616-623(1994)；Baker等.，Eur.J.Immunol.24：2040-2048(1994)；Beutler等.，美国专利号5,447,851；和美国申请号08/442，133(1995年5月16日提交)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考)。制备免疫受体融合分子的方法也可参考Capon等.，美国专利号5,116,964；Capon等.，美国专利号5,225,538；和Capon等.，Nature 337：525-531(1989)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考。
TNF受体分子的功能等价物、衍生物、片段或区指该TNF受体分子的特定部分，或该TNF受体分子序列中编码TNF受体分子的部分，其尺寸和序列足以使其在功能上与可应用于本发明的TNF受体分子相似(例如，与TNFα高亲和力地结合，并具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物也包括在功能上与可应用于本发明的TNF受体分子相似(例如，与TNFα高亲和力地结合，并具有低免疫原性)的修饰TNF受体分子。例如，TNF受体分子的功能等价物可含有“沉默(SILENT)”密码子或一个或多个氨基酸置换、缺失或添加(例如将一个酸性氨基酸置换为另一个酸性氨基酸；或将一个编码相同或不同疏水氨基酸的密码子置换为另一个编码疏水氨基酸的密码子)。见Ausubel等.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience，New York(1987-2003)。
细胞因子包括，但不仅限于所有已知的细胞因子。见，例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括，但不仅限于任何抗体、片段或模拟体、任何可溶受体、片段或模拟体、任何小分子拮抗剂，或上述物质的任意组合。
本发明的任何方法均可包括用于治疗蛋白质介导的失调的方法，该方法包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。该方法可任选地进一步包括针对治疗免疫病的协同施用或联合治疗，其中上述至少一种GLP-1模拟体、特定部分或其变体的施用进一步包括在其之前、同时和/或之后，施用选自至少一种其它细胞因子，诸如IL-3、-6和-11；干细胞生长因子；G-CSF和GM-CSF中的至少一种物质。
典型地，对病理情况的治疗是通过施用有效量或剂量的至少一种GLP-1模拟体组合物实现的，即根据该组合物所含的特定活性，每一剂量的范围共计平均为，每公斤患者体重施用至少大约0.0001-500毫克的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，优选地是每公斤患者体重单次或多次施用至少大约0.001-100毫克GLP-1模拟体或特定部分或变体。可选地，有效血清浓度可包括单次或多次施用所获的0.001-5000ug/ml血清浓度。合适的剂量是医师已知的，并当然地取决于特定疾病状况、所施用组合物的特定活性和正接受治疗的特定患者。某些情况下，为获得指定治疗量，有必要进行重复施用，即以特定监控剂量或计量剂量的重复单独施用，且在获得指定日剂量或效果之前重复该单独施用。
优选剂量可任选地包括每次施用0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30mg/kg，或其中的任意范围、数值或分数，或通过单次或多次施用获得0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400和/或500ug/ml血清浓度，或其中的任意范围、数值或分数。
可选地，可根据已知因素，诸如特定药剂的药物动力学特性，及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康情况和体重；症状的性质和程度、合并治疗的种类、治疗的频率和预期效果改变施用剂量。通常，活性成分的剂量可为每公斤体重施用大约0.0001-100毫克。普通剂量为0.001-10，优选剂量为每公斤体重每次施用0.001-1毫克，或通过续释放形式有效地获得预期效果。
一个非限制性实例是，对人或动物的治疗可通过一次性或周期性地施用0.0001-100mg/kg的本发明至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体剂量，诸如采用单一、输注或重复剂量，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周内，或上述天数和周数的任意组合周期内的每一天施用0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg的本发明至少一种GLP-1模拟体或或特定部分或变体。
适合内部施用的剂量形式(组合物)通常每单位或每个容器含有大约0.0001毫克-大约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分的量通常按重量计算应为该组合物总重量的大约0.5-99.999％。
对肠胃外施用而言，GLP-1模拟体或特定部分或变体可与药学可接受的肠胃外赋形剂一起或以分别提供的方式被配制为溶液、悬液、乳状液或冻干粉。该赋形剂的实例是水、盐溶液、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可采用脂质体和非水性赋形剂，诸如不挥发油。赋形剂或冻干粉可含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。该制剂通过已知或合适的技术灭菌。
合适的药物载体在该领域内的标准参考文献，即Remington’sPharmaceutical Sciences，A.Osol的最新版本中均有所描述。
治疗性施用。根据本发明，可采用许多已知和已研发的施用模式，用于施用治疗有效量的本发明至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。本发明GLP-1模拟体可在载体内形成溶液、乳状液、胶体或悬液，或以粉末形式，通过利用多种适用于吸入或此处所描述或本领域其它已知模式施用的装置和方法中的任意一种，而得以送递。
肠胃外制剂和施用。用于肠胃外施用的制剂可含有常用赋形剂，无菌水或盐水、诸如聚乙二醇的聚烷撑二醇、植物来源的油、氢化萘等。根据已知方法，可通过采用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂制备注射用的水性或油性悬液。注射用的药剂可以是无毒、不可口服的稀释剂，诸如水性溶液或无菌可注射溶液或在溶剂中形成的悬液。有效的赋形剂或溶剂可采用水、Ringer氏溶液、等渗盐水等；普通溶剂或悬浮溶剂则可采用无菌不挥发油。就这些用途而言，可采用任何种类的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油单酯或二酯或三酯。肠胃外施用是本领域已知的，包括，但不仅限于，常规注射途径，美国专利号5,851,198中描述的气压式无针注射装置，和美国专利号5,839,446中描述的激光穿孔器装置，这两项专利均被完整引入此处作为参考。
可选送递。本发明进一步涉及通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、药丸、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮途径施用至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。蛋白质、GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物可被制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)施用，尤以液体溶液或悬液形式为佳；用于阴道或直肠施用时，则尤以半固体形式，诸如膏状物和栓剂为佳；口腔或舌下施用时，则尤以片剂或胶囊形式为佳；鼻内施用时，尤以粉末、滴鼻剂或气雾剂或特定药剂形式为佳；经皮施用则尤以凝胶剂、软膏剂、洗剂、悬液或药贴送递系统形式为佳，该送递系统含有可改变皮肤结构或提高经皮药帖中药物浓度的化学增强剂，诸如二甲亚砜(Junginger，等.，在“Drug Permeation Enhancement”；Hsieh，D.S.，Eds.，pp59-90(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，完整引入此处作为参考))，或含有可使含蛋白质和肽制剂应用于皮肤的氧化剂(WO 98/53847)，或可施加电场，而造成短暂送递途径，诸如电穿孔，或可提高带电荷药物穿过皮肤的迁移率，诸如离子电渗疗法，或可应用超声波，诸如超声波导入法(美国专利号4,309,989和4,767,402)(上述出版物和专利均被完整引入此处作为参考)。
肺/鼻部施用。对肺部施用而言，优选地，至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物被以使其有效地抵达肺或窦下部的呼吸道的颗粒大小送递。根据本发明，可通过本领域已知用于吸入式施用治疗药剂的多种吸入或鼻用装置中的任意一种送递至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体。这些可使雾化制剂沉积于患者窦腔或肺泡中的装置包括计量剂量吸入器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。适用于引导GLP-1模拟体或特定部分或变体肺或鼻部施用的其它装置也是本领域已知的。上述所有装置均可应用适合施用的制剂，以使GLP-1模拟体或特定部分或变体分配在气溶胶中。该气溶胶可由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。计量剂量吸入器，如
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计量剂量吸入器，典型地采用推进气，并需在吸气期间开动(见，例如WO 94/16970，WO98/35888)。干粉吸入器，如TurbuhalerTM(Astra)、
Figure A200580049931D00722
(Glaxo)、
Figure A200580049931D00723
(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics经销的装置，和
Figure A200580049931D00724
粉末吸入器(Fisons)，均通过呼吸活动吸入混合粉末(US 4668218Astra，EP 237507Astra，WO 97/25086 Glaxo，WO 94/08552 Dura，US 5458135 Inhale，WO 94/06498 Fisons，完整引入此处作为参考)。雾化器如AERxTM Aradigm、
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雾化器(Mallinckrodt)，和
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雾化器(Marquest Medical Products)(US5404871 Aradigm，WO 97/22376)，可由溶液生成气溶胶，而计量剂量吸入器、干粉吸入器等吸入器则可产生小颗粒气溶胶，上述参考文献均被完整引入此处作为参考。商业可提供吸入装置的上述特定实例仅为适用于实践本发明的特定装置的代表，并不对本发明范畴构成限制。优选地，通过干粉吸入器或喷雾器送递包含至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物。适用于施用本发明至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的吸入装置具有若干令人满意的特征。例如，通过吸入装置送递的优势在于可靠、可重现和准确。该吸入装置可任选地送递小的干颗粒，例如对良好的可吸入性而言，该颗粒小于大约10μm，优选地为大约1-5μm。
以喷雾形式施用GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物。包括GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的喷雾可通过迫使至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的悬液或溶液在压力下通过喷嘴而得以制备。该喷嘴的尺寸和构型、应用压力和液体进料速率均可选择以获得预期的输出量和颗粒尺寸。电喷雾可通过，例如电场及毛细管或喷嘴进料获得。通过喷雾器送递至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白颗粒的优势在于，颗粒尺寸小于大约10μm，优选范围是大约1um-大约5μm，最为优选的范围是大约2μm-大约3μm。
适用于喷雾器的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白制剂典型地包括水性溶液形式的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白，其浓度为每毫升溶液含有大约1mg-大约20mg的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白。该制剂可包括诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，和优选的锌。该制剂也可包括用于使GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白稳定的赋形剂或试剂，诸如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白制剂也可包括表面活性剂，可减少或预防由溶液形成气溶胶时的雾化所导致的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的表面诱导性凝聚。多种常规表面活性剂均可被应用，诸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其应用量范围通常应为制剂重量的0.001-14％。对本发明的应用而言尤其优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制诸如模拟体或特定部分或变体的蛋白质的其它试剂是本领域已知的，也被包括在制剂内。
通过雾化器施用GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物。GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白可通过雾化器，诸如喷射雾化器或超声波雾化器而得以施用。典型地，在喷射雾化器中，采用压缩空气源以通过喷嘴形成高速空气喷射流。当气体从喷嘴扩散出时，形成了低压区，将GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的溶液吸入，并使其通过与贮液器相连的毛细管。来源自毛细管的液流离开该毛细管时，被剪切为不稳定的丝状体和液滴，便形成了气溶胶。可应用一系列的构造、流速和导流片类型，以从特定喷射雾化器中获得预期的性能特征。在超声波雾化器中，采用高频电能以形成震荡的机械能，典型地应用压电式转换器。该能量直接或借助于偶联液被传输给GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白制剂，便形成了包含该GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的气溶胶。通过雾化器送递GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白颗粒的优势在于，颗粒尺寸小于大约10μm，优选范围是大约1μm-大约5μm，最为优选的范围是大约2μm-大约3μm。
适用于喷射或起声波型雾化器的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体制剂典型地包括水性溶液形式的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白，其浓度为每毫升溶液含有大约1mg-大约20mg的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体蛋白。该制剂可包括诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，和优选的锌。该制剂也可包括用于使至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白稳定的赋形剂或试剂，诸如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体制剂也可包括表面活性剂，可减少或预防由溶液形成气溶胶时的雾化所导致的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的表面诱导性凝聚。多种常规表面活性剂均可被应用，诸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其应用量范围通常应为制剂重量的0.001-4％。对本发明的应用而言尤其优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制诸如至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体蛋白质的其它试剂是本领域已知的，也被包括在制剂内。
通过计量剂量吸入器施用GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物。在计量剂量吸入器(MDI)中，推进剂，至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，和任意赋形剂或其它添加剂均被包容在金属罐内，形成了包括液化压缩气体在内的混合物。计量阀的开动将该混合物以气溶胶形式释放，该气溶胶优选地含有尺寸范围小于大约10um的颗粒，优选的尺寸范围是大约1um-大约5um，最为优选的尺寸范围是大约2um-大约3um。通过应用由本领域技术人员已知的多种方法，包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点冷凝等方法制备的GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物蛋白制剂，可获得理想的气溶胶颗粒尺寸。优选的计量剂量吸入器包括由3M或Glaxo生产的计量剂量吸入器，并应用了氢化氟代烃推进剂。
适用于计量剂量吸入器装置的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体制剂通常包括含有至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，并可在非水性介质中形成悬液的微细粉末，例如，借助于表面活性剂悬浮在推进剂中。该推进剂可以是可用于该用途的任何常规材料，诸如氯氟代烃、氢化氯氟代烃、氢化氟代烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。优选的推进剂为氢化氟代烃。可选择表面活性剂，以稳定该推进剂中悬浮形式的至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体，以保护该活性剂不被化学降解等。合适的表面活性剂包括山梨糖醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。某些情况中，溶液气溶胶优选地采用诸如乙醇的溶剂。本领域已知可用于配制蛋白质，诸如本发明蛋白质的其它试剂也可被包括在本发明制剂中。
本领域任何一位普通技术人员均应认识到本发明方法可借助此处未描述的装置通过肺部施用至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体组合物而得以实现。
粘膜制剂和施用。对经由粘膜表面的吸收而言，至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体的组合物和施用方法包括含有大量超微末微粒、粘膜附着大分子、具有生物活性的肽和水性连续相的乳状液，可通过实现该乳状液颗粒的粘膜附着促进其经由粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适合应用本发明乳状液的粘膜表面可包括角膜、结膜、口腔、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠的施用途径。用于阴道或直肠施用的制剂，例如栓剂，可含有赋形剂，例如聚烷撑二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻内施用的制剂可为固体，并含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是滴鼻剂的水性或油性溶液。对口服而言，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预糊化淀粉等(美国专利号5,849,695)。
口服制剂和施用。用于口服的制剂依赖于佐剂的协同施用(例如间苯二酚和非离子性表面活性剂，诸如聚氧乙烯油醚和n-十六烷基聚乙烯醚)，以人为提高肠壁的通透性，该制剂也依赖于酶抑制剂的协同施用(例如胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶)，以抑制酶降解。用于口服的固体类型剂型的活性组成化合物可与至少一种添加剂混合，该添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍树胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物，和甘油酯。这些剂型也可含有其它类型的添加剂，例如不活泼稀释剂、润滑剂，诸如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸、诸如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚的防腐剂，诸如半胱氨酸的抗氧化剂、崩解剂、粘合剂、稠化剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂、加香剂等。
片剂和丸剂可被进一步加工进肠溶包衣制剂中。用于口服的液体制剂包括乳剂、糖浆、酏剂、混悬剂和可用于医学用途的溶液制剂。这些制剂可含有常用于该领域的不活泼稀释剂，如水。脂质体也曾被描述为是胰岛素和肝素的药物送递系统(美国专利号4,239,754)。更为新近的是，混合氨基酸人工聚合物的微球体(类蛋白)曾被用于送递药物(美国专利号4,925,673)。此外，美国专利号5,879,681和美国专利号5，5,871,753中描述的载体化合物被用于口服送递生物活性剂是本领域已知的。
经皮制剂和施用。对经皮施用而言，该至少一种GLP-1模拟体或特定部分或变体被密封于送递装置中，诸如脂质体或聚合毫微粒、微粒、微胶囊或微球体(如无另外指出，可被共同称为微粒)。有许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物，如多羟基酸，如聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酸酐和聚聚磷腈，和天然聚合物，诸如胶原蛋白、聚氨基酸、白蛋白及其它蛋白质、海藻酸盐及其它多糖，以及上述物质的组合制成的微粒(美国专利No.5,814,599)。
长期施用和制剂。某些时候，使本发明化合物跨越较长的时间段再施用于患者是理想的，例如，从单次施用开始一周至一年的时间段。可利用多种缓释、dGLP-1t或移植剂型。例如，剂型可含有特定化合物的药学可接受的无毒盐，该盐在体液中具有低溶解度，例如，(a)具有多元酸，诸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、双羟萘酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸或萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等酸的酸加成盐；(b)具有多价金属阳离子，诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或具有由例如N，N’-二苯基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；(c)(a)与(b)的组合，例如鞣酸锌盐。另外，本发明化合物，或优选的，相对不溶性盐，如上述盐，可被配制成凝胶，例如适用于注射，并含有例如，芝麻油的一硬脂酸铝凝胶。尤其优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等。注射用的其它类型缓释dGLP-1t制剂应含有被分散以密封于缓慢降解、无毒、非抗原性多聚物，诸如美国专利号3,773,919所描述的聚乳酸/聚羟基乙酸聚合物中的化合物或盐。该化合物或，优选的相对不溶性盐，如上述盐也可被配制在胆固醇基质硅酮丸中，尤其应用于动物。其它缓释、dGLP-1t或移植制剂，例如气体或液体脂质体可见本领域参考文献(美国专利号5,770,222和“Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems”(持续和控释药物送递系统)，J.R.Robinson ed.，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
上文已概述了本发明，通过下述实例将更容易理解本发明，且下述实例仅用于例证，对本发明不构成限制。
实施例1：GLP-1模拟体在哺乳动物细胞中的克隆化和表达。典型哺乳动物表达载体含有至少一个可介导mRNA转录起始的启动子元件，GLP-1模拟体或特定部分或变体编码序列，以及转录终止和转录产物聚腺苷酸化所需要的信号。其它元件包括增强子、Kozak序列和两侧伴有RNA剪切供体和受体位点的间插序列。高效转录可通过采用SV40来源的早期和晚期启动子、逆转录病毒如RSV、HTLVI、HIVI来源的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)来源的早期启动子实现。但也可采用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。可用于实现本发明的合适表达载体包括，例如，pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN，或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可被采用的哺乳动物细胞包括人Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
可选地，基因可被表达于特定的稳定细胞系中，该细胞系含有被整合进入其染色体中的上述基因。与可选标记，诸如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素的共转染可实现对转染细胞的鉴定和分离。
转染基因也可被扩增，以表达大量编码的GLP-1模拟体或特定部分或变体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记有助于开发携带了所关心基因的数百或甚至数千个拷贝的细胞系。另一有用的选择标记为谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy，等.，Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington，等.，Bio/Technology 10：169-175(1992))。利用这些标记，可在选择性培养基中培养哺乳动物细胞，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有被整合进入其染色体中的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞通常被用于生成GLP-1模拟体或特定部分或变体。
表达载体pC1和pC4含有劳斯(Rous)肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen，等.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))，外加CMV-增强子的一个片段(Boshart，等.，Cell 41：521-530(1985))。多克隆位点，例如具有限制酶裂解位点BamHI、XbaI和Asp718，有助于目的基因的克隆化。该载体除含有3’内含子外，还含有大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化和终止信号。
在CHO细胞中的克隆化和表达。载体pC4被用于GLP模拟体或特定部分或变体的表达。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr的衍生物(ATCC编号为No.37146)。该质粒含有受SV40早期启动子控制的小鼠DHFR基因。通过在补充有化学治疗剂氨甲蝶呤的选择性培养基(例如α负型MEM，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞，可筛选出由这些质粒转染，并缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞。许多参考文献均记录了DHFR基因在对氨甲蝶呤(MTX)具有抗性的细胞中的扩增(见，例如F.W.Alt，等，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；J.L.Hamlin和C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta 1097：107-143(1990)；和M.J.Pa ge和M.A.Sydenham，Biotechnology 9：64-68(1991))。在递增浓度MTX中生长的细胞通过因扩增DHFR基因所导致目标酶DHFR的过度产生，从而产生了对药物的抗性。如果将第二基因连接至该DHFR基因，则该第二基因通常被共同扩增并过度表达。本领域已知该方法可被用于开发携带了超过该扩增基因1,000个拷贝的细胞系。随后，当提取出氨甲蝶呤时，可获得含有扩增基因的细胞系，该扩增基因已被整合进宿主细胞的一个或多个染色体中。
质粒pC4含有用于表达目的基因的劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen，等.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))，外加分离自人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子的一个片段(Boshart，等.，Cell 41：521-530(1985))。该启动子的下游是可实现上述基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制酶裂解位点。在这些克隆位点后，该质粒含有3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可被用于表达，例如人b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒如HIV和HTLVI来源的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可被用于在哺乳动物细胞中以可调节途径表达GLP-1(M.Gossen，和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对mRNA的聚腺苷酸化而言，也可采用其它信号，例如来自人生长激素或球蛋白基因的信号。在采用可选标记，诸如gpt、G418或潮霉素共同转染的基础上，也可选择出携带了所关心基因的稳定细胞系，该基因已被整合进其染色体中。首先采用一种以上可选标记是有优势的，例如G418外加氨甲蝶呤。
通过本领域已知的操作方法，采用限制酶消化质粒pC4，并随后采用小牛肠内磷酸酶脱磷酸化。随后从1％琼脂糖凝胶中分离出该载体。
根据已知方法步骤，采用编码完整GLP-1模拟体或特定部分或变体的DNA序列，该DNA序列与本发明GLP-1模拟体的HC和LC可变区对应。该构建体中也可采用编码合适人恒定区(即HC和LC区)的分离核酸。
随后使编码DNA的分离可变和恒定区和脱磷酸化载体与T4DNA连接酶连接。随后，转染大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并采用，例如限制酶分析法鉴定质粒pC4中含有上述插入片段的细菌。
采用缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于转染。采用阳离子脂质体lipofectin，由0.5ug质粒pSV20-neo共转染5μg表达质粒pC4。质粒pSV2neo含有显性选择标记，来源于Tn5的neo基因编码可使其对一组抗生素，包括G418具有抗性的酶。将该细胞接种进补充有1ug/ml G418的α负型MEM中。2天后，胰蛋白酶消化该细胞，并接种进杂交瘤克隆化平板(Greiner，Germany)中，该平板已加入了补充有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤外加1ug/ml G418的α负型MEM。大约10-14天后，胰蛋白酶消化单个克隆，并随后接种进含有不同浓度氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔培养皿或10ml摇瓶中。随后，将最高浓度氨甲蝶呤条件下生长的克隆转移至含有还要高浓度氨甲蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6孔平板中。重复相同步骤直至获得可于100-200mM浓度条件下生长的克隆为止。分析理想的基因产物的表达，例如，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹(Western blot)，或通过反相HPLC分析。
实施例2：本发明GLP-1模拟体的非限制性实例。GLP-1为在口服葡萄糖刺激之后由肠L-细胞所分泌的37个氨基酸长的肽。包括生物活性GLP-1(7-37)肽、变体或衍生物的模拟体构建体被认为能延长体内肽的半衰期且对于2型糖尿病患者来说，提供一种新的用于降低血糖的治疗方法。编码天然GLP-1(7-37)肽或DPP-IV抗性类似物的肽能被插入到模拟体支架结构中。已制备了一些这样的分子，并且证明了产生的模拟体在体外基于细胞的试验中有活性。应当指出的是，上述研究中可采用不同的体外实验与体内模型，且所报导效价彼此之间或与此处所介绍结果不可比较。
为了产生GLP-1模拟体变体，模拟体中的GLP-1肽、接头序列、铰链序列或CH2和CH3序列可被缺失、添加、置换、变异或修饰来改进其表达、效价、稳定性或效应器功能。
野生型GLP-1序列以及DPP-IV抗GLP-1变体，例如GLP-1(A2S)或GLP-1(A2G)，能被插入到模拟体支架结构中。可以进行肽的突变来改进GLP-1模拟体的特性。例如在氨基末端残基的突变可能改进信号作用，而在螺旋结构域的突变可能稳定螺旋，从而改进与受体的结合和/或模拟体的稳定性。
可以突变接头序列的长度和组成来改变GLP-1肽与Fc区之间的连接的柔性和稳定性。不同的同种型能被插入到分子的铰链区中。另外，可在模拟体的铰链区进行突变来稳定该分子。例如，可突变人IgG4铰链区来制备Ser228->Pro的突变体，从而稳定模拟体中的链间二硫键。模拟体Fc部分的变异能导致改进分子的稳定性，并改变效应器功能，如FcR连接。例如，可以使用人或鼠类的同种型(或这些分子的变体)，如Ala/Ala突变的IgG4。
本发明的GLP-1模拟体。本发明的一个特定非限制性实例是根据式(I)的GLP-1模拟体构建体(SEQ ID NO：2)：
(P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为具有生物活性的GLP-1肽(7-36)的单拷贝，L为Gly-Ser或Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头的串联重复，V为VH序列的C-末端，即天然存在IgG的J区，H为完整IgG1铰链区，而CH2&CH3属于IgG1同种型亚类。该构建体的半衰期被认为应是GLP-1肽本身或其变体或衍生物半衰期的许多倍，并与IgG的半衰期近似。
除上述基础结构外，本文也描述了具有潜在有利生物学特征的变体。这些变体包括自联接倾向可能降低、免疫效应子功能减弱或免疫原性降低的构建体。本发明也展望了其它可赋予特定特征，诸如生物活性肽的改善构象，和可跨越血脑屏障的修饰。建议的变体和修饰可以任何方式组合，以获得具有特定活性的构建体。
利用重组DNA法，将GLP-1肽插入中间载体中，位于免疫球蛋白信号肽与人J序列之间。该操作采用了互补合成寡核苷酸，其末端与该载体中的限制位点相容。这些寡核苷酸含有GLP-1肽的编码序列，和由两个GGGS重复组成的柔性接头编码序列。含有上述功能元件的限制片段随后被转移进表达载体中。该载体含有抗CD4免疫球蛋白启动子和增强子、人IgG1铰链区的编码序列、HC恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)，也含有对细菌内质粒复制和筛选，以及对哺乳动物细胞内稳定表达子的筛选而言所必需的元件。
该载体被导入到HEK293E细胞中，并在瞬时转染细胞中获得了野生型GLP-1 MMB的表达。用标准蛋白A和Superose 12亲合色谱法来完成GLP-1 MMB的纯化，大约产生1.5mg/L转染细胞。该蛋白是下面所述实验的起始材料。
GLP-1的氨基酸序列如图1所示。功能域为上述肽的编码序列。J序列被认为可提供更大的柔性，使GLP-1二聚体呈现正确构象，并使该二聚体从免疫球蛋白的球形结构中突出，并深入至两个GLP-1受体之间的裂口中。IgG1铰链区中含有三个半胱氨酸。第一个半胱氨酸通常与免疫球蛋白轻链(LC)配对，另外两个半胱氨酸则参与了两个HC之间的链间键。CH2 & CH3区构成了该蛋白的填充部分。免疫球蛋白被认为具有长血清半衰期的原因之一是其与FcRn结合的能力，该FeRn可通过将胞饮免疫球蛋白恢复至胞外间隙，从而延长血清半衰期。FeRn的结合位点与CH2和CH3区的连接处重叠(Sheilds等.，2O01，J.Bio.Chem.，vol.276(9)，6591-6604)。
众所周知，两条IgG重链在细胞加工期间通过铰链区中两个半胱氨酸之间的二硫键而被装配在一起，形成了同二聚体。人们认为该现象也可发生在修饰肽之间，从而形成装配的GLP-1模拟体构建体。另外，人们认为GLP-1肽中的两个半胱氨酸之间也将形成链内二硫键。GLP-1模拟体的预期结构含有两个GLP-1肽。该肽在N末端的空间排列，以及邻接序列的柔性使该肽形成了具有生物活性的二聚体。
实施例3：FACS结合试验。用体外FACS结合试验来检测GLP-1模拟体的活性。为了确定GLP-1 MMB是否与GLP-1R结合，将过表达GLP-1R的HEK293细胞(1 x 106细胞)与GLP-1 MMB(20nM)在4℃下培养2小时。洗涤细胞，在4℃下加入荧光标记的二次检测抗体(1ug/mL，羊抗人IgG，Fc γ特异性)，保持30分钟。这些细胞的荧光强度通过流式细胞光度计进行检测。图2A显示GLP-1 MMB与过表达GLP-1R的HEK293细胞(灰色，GLP-1 MMB但无二抗；黑色，仅有二抗；红色，阴性对照MMB和二抗；蓝色，GLP-1 MMB和二抗)结合。图2B显示GLP-1 MMB不与对照的HEK293细胞(灰色，GLP-1 MMB但无二抗；黑色，仅有二抗；蓝色，GLP-1 MMB和二抗)结合。图2C显示GLP-1肽类似物(A2S)能够与GLP-1 MMB竞争性结合过表达GLP-1R的HEK293细胞(灰色，GLP-1 MMB但无二抗；黑色，阴性对照MMB和二抗；橙色，GLP-1 MMB，0.2nM竞争者，二抗；蓝色，GLP-1 MMB，20nM竞争者，二抗；红色，GLP-1MMB，100nM竞争者，二抗)。
实施例4：cAMP试验。GLP-1与其受体G-蛋白偶联受体相结合，导致信号分子3’，5’-环AMP(cAMP)的计量依赖性增加。可在表达GLP-1R的细胞(AppliedBiosystems)中通过体外分析来测定cAMP。简要地说，将Rinm细胞(100,000细胞)与浓度递增的GLP-1肽(0-30nM)或GLP-1 MMB(0-100nM)一起培养。细胞被溶解，使用竞争分析法来确定cAMP的量，该竞争分析法使用碱性磷酸酶标记的cAMP结合物和化学发光底物(Tropix
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CDPD
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)。野生型GLP-1 MMB的浓度依赖性cAMP活性(图3A)可以比得上GLP-1肽(图3B)(各自是：EC50＝11nM对0.4nM)。在相似的试验中，在IgG4支架结构中的GLP-1(A2G)(图3C)和在IgG4支架结构中的GLP-1(A2S)MMB(图3D)，与在IgG4支架结构中的野生型GLP-1 MMB相比，都使Rinm细胞中的cAMP水平增加到一个显著更高的水平。
实施例5：DPP-IV裂解试验。因为GLP-1被DPP-IV迅速失活，所以进行体外试验对完整的(即：未裂解的)GLP-1 MMB定量。简要地说，将GLP-1 MMB或肽(1.2nM)与DPP-IV(1μg/mL，R&D系统)在室温下培养。在不同时间(0，5，10，15，20，30，40分钟)之后，加入DPP-IV抑制剂(100uM，Linco)来终止该反应。用GLP-1活性ELISA测定完整的GLP-1 MMB或肽的量，并绘制GLP-1 MMB或肽各自的标准曲线。图4显示相对于GLP-1来说，GLP-1 MMB对DPP-IV的裂解明显有更强抗性。
实施例6：人血清稳定性试验。也测定了血清中GLP-1 MMB的稳定性来确保其它血清蛋白酶不能裂解或失活GLP-1 MMB。简要地说，将GLP-1肽或GLP-1 MMB(30nM)在人血清中在37℃下培养。在不同时间之后，用DPP-IV抑制剂(100uM，Linco)来终止该反应，用来自Linco的GLP-1活性ELISA分析样品。图5显示GLP-1MMB在人血清中24小时内稳定，而肽被迅速分解了。
实施例7：GLP-1 MMB导致RINm细胞中的胰岛素分泌。为了测定GLP-1 MMB在胰岛素分泌中的作用，使用浓度递增的GLP-1(7-36)肽(0-5nM)、毒蜥外泌肽-4肽(0-5nM)或各种GLP-1模拟体(5或50nM)来处理RINm细胞，并用ELISA测定胰岛素分泌的量。测试的在RINm细胞中的所有GLP-1 MMB都具有增强胰岛素分泌的活性(图6)。在50nM时，MMB具有比得上野生型GLP-1(7-36)肽的活性。
实施例8：GLP-1 MMB降低db/db鼠的葡萄糖水平。六周龄的db/db鼠禁食两小时，然后用载体静脉定量注射GLP-1肽或GLP-1(A2S)MMB。在注射后0.5、1、2、3和4小时监测血糖。GLP-1肽在30分钟内降低血糖，但在60分钟内血糖可能由于GLP-1肽的短半衰期而开始再次增加。相比而言，剂量比GLP-1肽剂量低100倍的GLP-1(A2S)MMB在整个4小时的周期中引起血糖的降低(图7A)。另外，血糖的降低是剂量依赖性的(图7B)。
实施例9：在鼠和猕猴中GLP-1 MMB的药物代谢动力学。为了测定四种GLP-1模拟体(A2G，A2S，exedin-cap和野生型)的药物代谢动力学，向C57/B16鼠静脉注射1mg/kg的MMB。在不同的时间点通过处死鼠进行心脏穿刺来获得血浆。应用不同的ELISA来测定在动物体内代谢的Fc、总MMB、活性MMB和活性片段。活性MMB表现肽的完整N-末端仍然与模拟体的Fc区相连。肽的第二个氨基酸(丙氨酸)置换为丝氨酸或甘氨酸，延长了循环中活性MMB的半衰期。
以1.0mg/kg向猕猴鼠静脉注射四种不同的GLP-1 MMB构建体，在注射后从10分钟到5天的不同时间点取血清样品。用ELISA鉴定血清样品来进行活性MMB的定量。如图8所示，所有四种MMB都显示了快速的分布相，其后为较慢的间隔相。适合每一种构建体的药物代谢动力学常数显示T1/2为大约3天，其与从T＝0到T＝120小时的AUC所决定的暴露相近似。
实施例10：在糖尿病鼠口服葡萄糖耐量试验中GLP-1 MMB的作用。八周龄的db/db鼠在皮下注射GLP-1 MMB(0.02至2mg/kg)之前禁食6小时。在注射后，鼠再被禁食6小时，并测得空腹血糖基线。当t＝0时，对鼠从口强饲1.0mg/g的葡萄糖，并在不同时间测定血糖。图9所示的结果暗示在所有剂量的口服葡萄糖耐量试验中GLP-1 MMB对于减小葡萄糖变化范围是有效的。
实施例11：GLP-1 MMB对糖尿病鼠慢性用药中空腹血糖的作用。对十周龄的糖尿病db/db鼠，连续六周每天皮下注射载体或GLP-1MMB(1mg/kg)。在研究过程中每周两次测定空腹血糖。研究中，处理的动物的空腹血糖比对照要低(图10)，经过六周，差距超过了200mg/dL(对照和处理的动物分别为：466 vs 221mg/dL)。
实施例12：GLP-1 MMB在对糖尿病鼠慢性用药后口服葡萄糖耐量试验中的作用。如实施例11，对十周龄的糖尿病db/db鼠，连续六周每天皮下注射载体或GLP-1 MMB(1mg/kg)。40天的给药之后，对鼠进行口服葡萄糖耐量试验。简要地说，当t＝0时，对鼠从口强饲1.0
mg/g的葡萄糖，并在不同时间测定血糖。图11所示的结果暗示在口服葡萄糖耐量试验中GLP-1 MMB对于减小葡萄糖变化范围是有效的，该口服葡萄糖耐量试验说明长期用GLP-1 MMB处理的鼠与对照动物相比能够更有效地解决葡萄糖负载。
实施例13：GLP-1 MMB对糖尿病鼠慢性用药后降低HbA1c的作用。如实施例11和12，对十周龄的糖尿病db/db鼠，连续六周每天皮下注射载体或GLP-1 MMB(1mg/kg)。40天的给药之前或之后，取全血样品，并分析HbA1c的百分数。如图12所示，在六周时间内，用GLP-1处理的动物的HbA1C增加109％，而对照的动物增加142％。该数据说明经处理的动物与对照相比，能更好地调节它们的长期血糖。
实施例14：GLP-1 MMB在对正常猕猴的口服葡萄糖耐量试验中的作用。在对正常猕猴单次给药GLP-1 MMB(1mg/kg)之前或六天之后，进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。简要地说，当t＝0时，对猴从口强饲2.0mg/g的葡萄糖，并在不同时间测定血糖。在给药六天后所做的OGTT中血糖水平明显降低(图13A)，胰岛素水平明显升高(图13B)。这说明GLP-1 MMB导致胰脏在高葡萄糖浓度时分泌胰岛素。
实施例15：GLP-1 MMB在单次剂量用药后对胰岛素鼠(db/db)的胰岛染色中的作用。十二周龄的糖尿病鼠(db/db)，皮下注射单次剂量的GLP-1 MMB(1.5mg/kg)，4周后取胰腺。为了确定胰岛素的存在，将胰腺切片、染色。如图14所示，经处理的动物与对照动物相比，明显有更多的胰岛素染色。
实施例16：GLP-1 MMB对正常狗延迟胃排空。通过外科手术将胃管插入到全身麻醉的雌性猎犬(10-15kg)体内，并允许其恢复至少两周。狗被禁食24小时，之后水可自由获取。打开胃管，用40-50ml温水除去胃液和残余的食物。在餐前60分钟对六只狗的组皮下注射利达脒，α2激动剂(0.63mg/kg)，即胃排空的延迟的阳性对照。对狗餐前15分钟头静脉注射载体对照或GLP-1 MMB(0.1mg/kg)。餐前5分钟，打开胃管来确定当时在胃中流体的量，作为基线值，将流体迅速再次导入胃中。然后通过插管给予包含250ml葡萄糖溶液(5g/l)的试验餐，并允许其在胃中停留30分钟。在30分钟后，将胃内容物从胃中导出来测定总量。留下1ml的胃内容物来进行分析，将余量通过插管再次导入胃中。在60、90和120分钟时重复胃内容物量的测定和样品的提取。对收集的样品测定葡萄糖浓度，并用于测定在每个时间点处胃中剩余的葡萄糖的绝对数量。通过起始值、在每个时间点处葡萄糖的浓度并作为时间的函数描点作图可以确定胃中剩余的葡萄糖的百分数。胃内容物剩余50％的时间通过曲线对一次幂的拟合确定。如图15所示，给予载体的狗在之后12.35±3.69分钟内50％的胃内容物被排空，而利达脒阳性对照和给予GLP-1 MMB的狗显示了明显的胃排空的延迟(分别为：30.60±6.47和59.23±14.46)。
实施例17：GLP-1 MMB在对饮食诱导肥胖的鼠的口服葡萄糖耐量试验(IPGTT)中降低血糖。为了建立一种饮食诱导肥胖的鼠类模型，至少27周使鼠保持提供高脂肪饮食。鼠变得肥胖，并当其空腹血糖值超过120mg/dl时，确定其患糖尿病。为了评价GLP-1 MMB治疗对餐后血糖水平的作用，饮食诱导肥胖的鼠被禁食过夜，且皮下注射0.02，0.2，or 2mg/kg GLP-1 MMB或载体对照。注射后六小时，对鼠胃管饲1.5mg/g葡萄糖。在注射MMB之前、t＝0、15、30、60、90、120、150和180分钟时用尾静脉血来测定血糖水平。如图16所示，在t＝0和所有后来的时间点处，空腹血糖值有明显的GLP-1 MMB剂量依赖性降低。计算了t＝0和t＝180之间的曲线下面积，显示所有剂量下葡萄糖处理都显著降低。
实施例18：GLP-1 MMB在对db/db鼠的腹膜内葡萄糖耐量试验中(IPGTT)降低血糖。将大约13-15周龄的雄性db/db鼠根据空腹血糖水平，随机地分为每组6只的治疗组。在葡萄糖耐量试验6小时前，将GLP-1 MMB按0.02mg/kg或0.1mg/kg对鼠给药，或将阴性对照MMB按0.1mg/kg对鼠给药。在葡萄糖耐量试验5分钟前，用手提式血糖测计仪从尾部静脉血液中测定葡萄糖。然后向鼠腹膜注射1mg/g D-葡萄糖，在10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟监测血糖水平。如图17A所示，在用GLP-1 MMB处理的两组中血糖水平在全部时间内明显降低。处死用同样方式处理的另外几组动物，在t＝10分钟时测定胰岛素水平。在10分钟内释放的胰岛素的量有伴随GLP-1 MMB给药量的剂量依赖性增加。
实施例19：GLP-1 MMB剂量依赖性地抑制细胞因子诱导的凋亡。将RIN-m细胞以50,000个细胞/孔种植在96孔板上，37℃下温育过夜。第二天，用一定剂量范围的GLP-1 MMB(从100nM系列稀释)处理细胞30分钟，然后加入细胞因子TNFα(10ng/mL)或IL-1β(4ng/mL)。将平板37℃下温育16小时。为了测定凋亡，采用了Cell Death ELISA-Plus测定试剂盒(Roche Applied Science，Cat.No.11920685001)。从孔中吸出培养基，在每个孔中加入200μL裂解缓冲液，室温下将平板温育30分钟。温育后，将20μL裂解液转移到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中。也在每孔中加入80μL免疫试剂(抗组蛋白-生物素和抗DNA-过氧化物酶在提供的温育缓冲液中的1:20稀释液)。然后将100μL悬浮液在室温下温育2小时，轻柔振荡。2小时后，用温育缓冲液洗涤平板3次，在平板中加入显影溶液。大约5分钟后在405nm读出吸光度。数据表明GLP-1 MMB保护RIN-m细胞免受TNF-α或IL-1β诱导的凋亡(图18)。
在1型糖尿病(T1D)中，存在分泌胰岛素的胰腺β细胞的特异性破坏。尽管β细胞破坏的确切分子机理是未知的，但已经显示T1D患者的血清促进凋亡，表明凋亡在糖尿病发病中起作用。通过用GLP-1MMB治疗最近发病的患者(一个患者在蜜月期)，甚至是有发生糖尿病倾向的患者，可以抑制凋亡并且保留β-细胞团。
在T1D中，β-细胞凋亡可能在糖尿病的两个不同阶段的疾病发展中起作用。首先，胰岛凋亡的发展波可能影响T-细胞生物，其最终影响自身免疫性糖尿病的发病。其次，胰岛凋亡也是最终导致β-细胞大量破坏的细胞死亡模式。因此，GLP-1 MMB抑制β-细胞凋亡的用途可以用于通过保留β-细胞团，预防自身免疫性糖尿病发病或进展为明显糖尿病。
T1D由分泌胰岛素的β-细胞的不可逆丧失导致。但是，在某些具有长期T1D的人体内可以检测到胰岛素分泌，表明存在一小群存活的β-细胞或正在进行自身免疫破坏的β-细胞的持续更新。已经显示T1D具有在复制后持续进行凋亡的β-细胞。β-细胞在T1D中发生的频率是对照受试者中的两倍。大多数具有长期T1D的人具有持续破坏的β-细胞。β-细胞死亡增加的机理可能涉及正在进行的自身免疫和葡萄糖毒性。通过定义，尽管正在进行凋亡，但仍然存在β-细胞的事实说明必须发生伴随的新β-细胞形成，即使在长期T1D之后。我们得出结论，可以通过β-细胞破坏的靶向GLP-1 MMB抑制，防止或逆转T1D。
在多器官供体中，胰腺中的胰岛在导致尸体器官供体脑死亡的事件中进行凋亡和坏死，所述事件在器官捐献前的临床期持续进行。此外，胰岛在制备用于移植的胰岛素生成细胞的胰岛分离过程中进行凋亡。此外，当胰岛移植到糖尿病受体的肝脏中时，存在细胞因子激活的级联，特别是TNFα、IL1B和γINF。在分离过程和随后的移植中将GLP-1MMB用于供体的胰岛移植，减少凋亡并且改进胰岛功能。其也减少为了达到临床益处所需要的胰岛数目，并且提供了活供体在胰岛移植中应用的机会。
实施例20：GLP-1 MMB增加INS-1E细胞中的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。以200,000个细胞/孔的细胞密度将INS-1E细胞在RPMI1640+10％FBS+1％ L-谷氨酰胺+1％丙酮酸钠+1％非必须氨基酸+50μM β-巯基乙醇培养基中铺板于24孔板中。37℃和5％CO2的条件下使细胞生长7添，第3或4天补料。用0.4ml KRBH缓冲液/3mM葡萄糖洗涤细胞两次，在该缓冲液中温育30-60分钟。从细胞除去培养基，每孔加入0.4ml KRBH中的测试物和适量葡萄糖。在T＝0时间点从每孔取出20微升上清液，37℃和5％CO2的条件下温育60分钟，用于测量胰岛素。采用超敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem)，用大鼠标准曲线(12.8-0.1ng/ml)确定胰岛素浓度。在测定中采用时间点上清液的5微升1:50稀释液，以获得落入标准曲线的值。在OD450对ELISA板读数，扣除Molecular Devices SpectraMax 340PC板读数器的OD630。如图19所示，GLP-1 MMB以剂量依赖性方式增加胰岛素分泌，但仅仅在血糖升高的情况下如此。
实施例21：GLP-1 MMB增加大鼠和人胰岛中的葡萄糖依赖性胰岛素分泌。通过胶原酶消化和随后的Ficoll梯度纯化，获得大鼠胰岛。用Ricordi et al.Diabetes(1998)37；4，413-420中详细描述的酶消化和密度梯度纯化分离人胰岛。将胰岛在20 x 100mm的培养皿中，在CMRL-1066(Gibco)，青霉素/链霉素(5,000单位/5,000μg)，10％FBS，1％ L-谷氨酰胺25mM HEPES，pH7.2-7.4培养基中铺板过夜，37℃下在5％CO2中培养18-24小时。第二天，将胰岛涡旋到培养皿中心，收集到50mL锥形试管中。通过重力，使胰岛沉降到试管底部，持续大约10-15分钟。除去上清液，加入功能性/存活力培养基(MediaTech，cat#99-786-CV)，通过重力，使胰岛沉降到试管底部。总共将胰岛洗涤3次。除去上清液，将胰岛以每mL20个胰岛的密度重悬于含有1％BSA，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素和0.5mM葡萄糖溶液的功能性/存活力培养基中。在24孔板的每个孔中加入1mL细胞悬浮液(约20个胰岛)，37℃下在5％CO2中温育2小时。2小时后，加入1mL含有1％BSA，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素，GLP-1 MMB(50nM终浓度；100nM初始浓度)和终浓度为3.5mM(n＝12)或15mM(n＝12)的葡萄糖的功能性/存活力培养基。在时间＝0(胰岛素的基线)和加入处理后4小时收集25μL上清液。上清液在-20℃下保存直到进行胰岛素ELISA。用CrystalChem(Downers Grove，IL)超敏ELISA测定试剂盒(cat # 90060)对大鼠胰岛素进行定量。用Linco Research(St.Charles，MI，cat#EZHI-14K)的人胰岛素ELISA试剂盒对人胰岛素进行定量。图20显示GLP-1MMB显著增加大鼠(图20A)和人胰岛(图20B)的胰岛素分泌。
1型和2型糖尿病最终都是由于个体的β-细胞分泌的胰岛素量不足。通过用GLP-1 MMB治疗，增强糖尿病个体的胰岛素分泌能力将改进或消除他们的糖尿病状况。重要的是，胰岛素分泌的增加是葡萄糖依赖性的，仅仅在血糖水平升高的情况下增加。因此，通过使用GLP-1 MMB，患者经历危险的低血糖发作的风险降低到最小。
同样，胰岛素分泌的增加也使胰岛移植程序受益。通过增加移植的胰岛的胰岛素分泌能力，可以有效减少提供临床益处所需要的胰岛数目。由于可以用于支持胰岛移植的尸体胰腺的量有限，GLP-1 MMB的使用将显著增加可以从胰岛移植程序受益的患者数目。此外，增加胰岛素分泌的能力可以将供体群体延伸到活供体，而不会带来使他们的胰岛素分泌能力耗竭的风险，而这在没有GLP-1 MMB干预的情况下，导致供体由于胰岛素分泌能力不足而发生糖尿病。
实施例22：GLP-1 MMB对正常小鼠血糖的影响。将正常C57BLK/6小鼠随机分为两组，每组13只动物。第1组每日接受腹膜内(IP)施用PBS载体或GLP-1 MMB(0.5mg/kg)。两组都处理10天。每日监测小鼠体重，并且监测(LifeScan，CA)血糖32天，在32天时结束研究。
与PBS处理的小鼠相比，接受GLP-1 MMB处理的小鼠表现出在10天的处理期间血糖降低(图21)。一旦处理终止，血糖回到PBS组的水平。两组在研究期间表现出相同的体重增加(数据未示出)。
1型和2型糖尿病中都存在高血糖，并且导致该疾病的破坏性继发合并症的进展。GLP-1 MMB降低血糖而没有不利影响受体的总体健康的能力(如与上文未处理对照相同的进行性体重增加所示)将对1型和2型糖尿病都有益。
实施例23：GLP-1 MMB防止糖尿病小鼠β-细胞减少。使小鼠(12周龄db/db)禁食过夜。在研究的第1天，给小鼠(4组；n＝5/组)皮下施用GLP-1 MMB(1.5mg/kg)或阴性对照模拟体。在研究第4天，测量空腹血糖并且进行OGTT(口服糖耐量测试)。用尾静脉血在15、30、60、90、120、150和180分钟测量血糖水平。麻醉小鼠，取出胰腺，浸入10％的中性缓冲福尔马林中固定。将来自每只小鼠的胰腺包埋在石蜡中，切片，用H&E和免疫组化染色。胰岛素染色的形态分析显示与对照相比，GLP-1 MMB处理的小鼠具有显著更高的胰岛素染色强度。用给药后14天处死的小鼠重复实验，以评估单次施用GLP-1 MMB的持续时间。胰岛素染色的形态分析再次显示单次施用后2周时GLP-1MMB处理的动物中的胰岛素染色具有更高强度。胰岛素染色的强度与胰岛内储存的胰岛素量直接相关，表明GLP-1 MMB处理增加糖尿病动物模型的胰岛内的胰岛素分泌和储存。
在2型糖尿病中，胰岛素合成和储存不足导致高血糖，这导致该疾病的激发合并症的起病和进展。GLP-1 MMB增加胰岛素合成和储存的能力将减少2型糖尿病的高血糖，从而限制激发合并症的起病和进展。
实施例24：GLP-1 MMB对免疫受损的糖尿病小鼠中的人胰岛边缘团块移植物的效力的影响。从Harlan Laboratories购买无胸腺nu/nu(裸)小鼠。将动物在无病毒抗体室中的分开的小笼中饲养，自由摄取消毒食物和水。所有实验都是根据实验动物管理和使用指导中的标准进行的。
通过静脉内施用新溶解于柠檬酸缓冲液中的链脲霉素(200mg/kg)诱发糖尿病。在诱发之后监测非空腹血糖值证实糖尿病的诱发，仅仅具有≥350mg/dL的值的动物被用作受体。移植边缘胰岛团块(≈50IEQ/g体重，表明该团块不足以立即使受体血糖正常)后，通过在移植后第一周每日测量非空腹血糖值，监测动物的移植物功能，此后多达一周监测3次。改进胰岛植入、存活力和功能的治疗干预将减少移植了边缘胰岛团块的动物中达到正常血糖需要的时间。包括了两组人边缘胰岛团块的受体；一种接受每日IP注射GLP-1 MMB(0.5mg/kg)，对照组接受载体IP注射。
当至少连续两次测量值≤200mg/dL时，认为动物是血糖正常的。此外，通过在移植后30天以上，禁食过夜后在处理的和对照动物中进行的糖耐量测试(1.5g/kg)评估移植物功能，以便研究葡萄糖刺激后的葡萄糖清除。达到血糖正常的动物进行移植物去除，以便排除天然胰岛的残留功能。
如图22所示，在移植胰岛的边缘团块后，相对于对照小鼠，GLP-1 MMB处理的小鼠更快达到正常血糖。此外，GLP-1 MMB处理的小鼠表现更有效清除葡萄糖刺激。这些数据强烈表明GLP-1 MMB处理改进了移植的人胰岛的植入、存活力和功能，并且支持将GLP-1MMB用于供体(包括活供体和脑死亡供体)和进行胰岛移植程序的受体。这些结果证明了GLP-1 MMB对移植到糖尿病受体的人胰岛的有益作用。此外，数据表明用GLP-1 MMB处理改进了胰岛植入、存活和功能，将成为胰岛移植情况下的有价值的辅助治疗。
实施例25：GLP-1 MMB对非人灵长动物胰岛中反应于葡萄糖的胰岛素分泌的影响：用酶消化和密度梯度纯化分离非人灵长动物的胰岛，并且分为两组，在非组织培养处理的175cm2烧瓶(Corning，MA)中以约20,000 IE的密度37℃下在潮湿的混合95％空气/5％CO2中培养。一组胰岛单独培养，另一组在补加了50nM GLP-1 MMB的MM1中培养。
培养2天后，收集胰岛，对胰岛样品(2个来自对照，1个来自GLP-1 MMB组)进行动态刺激测定，以评估葡萄糖浓度对胰岛的胰岛素分泌的影响。37℃下用含有125-mM NaCl，5.9-mM KCl，1.28-mMCaCl2，1.2-mM Mg Cl2，25-mM HEPES，0.1％牛血清白蛋白和3-mM葡萄糖的缓冲液将胰岛预先灌注在色谱柱(Bio-gel Fine 45-90nm；Bio-Rad)中，持续20分钟。将胰岛灌注在相同缓冲液中，持续十分钟，然后依次暴露于11-mM和3-mM葡萄糖。在用3-mM葡萄糖灌注期间每2分钟收集灌注液的级分，刺激过程中每分钟收集。通过ELISA测定每个级分中的胰岛素浓度。
在GLP-1 MMB存在下温育胰岛，证明与未处理的对照相比，葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著增加(图23)。该数据强烈支持GLP-1 MMB在体外对胰岛素合成和分泌的正面影响，进一步支持其在胰岛移植前的使用。在移植前用GLP-1 MMB增加胰岛的效力，将导致在进行胰岛移植程序的1型糖尿病个体中达到相同的疗效所需的胰岛数目减少。此外，从这些结果可以预测，用GLP-1 MMB处理个体，将增加胰岛的体内效力。这进一步支持处理胰岛移植的供体(包括活供体和脑死亡供体)和受体，以增加他们的边缘胰岛团块的功能。
实施例26：GLP-1 MMB对猕猴边缘团块模型中同种异体胰岛植入和长期存活的影响。非人灵长动物边缘团块模型的使用使得人们能够研究具有用数目减少的胰岛逆转糖尿病的潜能的移植方法。在边缘团块模型中，移植了大约5,000IEQ/kg，或者说是达到正常血糖所需数目(通常是10,000IEQ/kg)的一半。通过利用获自相同同种异体供体的胰岛，消除了供体和分离的变异。通过具有相似的移植前胰岛素需要的猴的移植配对，可以观察到与不接受试剂的猴相比，用设计用于增强胰岛功能和限制早期胰岛损失的试剂处理的猴中胰岛植入增强。
受体是2-3岁的来自毛里求斯的猕猴，相同株的供体大于四岁。用1250mg/m2链脲霉素诱发糖尿病。早饭前用NPH胰岛素处理糖尿病动物，晚饭前用NPH/Lantus处理，以试图将血糖水平保持在150-300mg/dl。诱发糖尿病后4周，猴进行胰高血糖素刺激，以证实没有产生刺激的c-肽。
收获供体器官，通过实施例A和实施例B引用的半自动方法分离胰岛，然后是2次过夜的培养期，第1次是在37℃，然后是在22℃。在标准MM1中培养对照猴的胰岛，在补加了50nM GLP-1 MMB的MM1中培养实验猴的胰岛。通过门静脉到肝，猴进行了微剖腹手术和移植。一对猴接受了来自相同供体的约5,000IEQ/kg(按照上文描述培养)；一只猴接受GLP-1 MMB(0.2mg/kg)每周皮下注射2次，而对照猴则没有注射。对于对照和GLP-1 MMB处理的猴，用临床上使用的不含类固醇的免疫抑制(缩写为SFIS，由低剂量FK506、高剂量雷帕霉素、抗IL2R诱导治疗组成)防止排斥。每日监测动物两次，以确定空腹和餐后血糖水平(后跟粘贴，血糖计)，并且在移植后根据需要用胰岛素处理，将血糖维持在100-200mg/dl范围。每隔一周测定空腹c-肽，每8周进行静脉内葡萄糖耐量测试(IVGTT)，以评估移植物功能。
GLP-1 MMB处理的动物具有良好的葡萄糖控制，外源胰岛素需要显著减少(图24A)。与未处理的对照相比，GLP-1 MMB处理的动物中HgbA1c的迅速减少进一步说明了葡萄糖水平的改进(图24B)。该研究进一步支持将GLP-1 MMB用于进行胰岛移植程序的1型糖尿病患者。
优点：这个新分子作为治疗2型糖尿病的治疗剂的应用，提供了超过其它GLP-1类似物的一些优点。例如，它可能延长GLP-1肽的半衰期。而且，模拟体结构支架中的野生型GLP-1肽耐蛋白酶降解，尤其是DPP-IV。这可能使得野生型GLP-1肽能用于治疗，而不是突变体肽。因为GLP-1是一种天然的肽，所以可能在用GLP-1模拟体治疗的病人中的免疫反应比在用突变体GLP-1类似物治疗的病人中的免疫反应要小。另外，GLP-1 MMB的大尺寸可能防止了其穿越血脑屏障。这可能提供了一个优点，因为恶心和焦虑与脑中GLP-1结合的GLP-1R相关联。此外，模拟体平台导致在一个模拟体分子上的两个肽的表达。这可能使GLP-1肽能够相互作用，形成一个能够增加对细胞表面GLP-1受体亲和力的二聚体配体。
应当清楚的是，可采用与上述说明和实例中具体描述方法不同的其它方法实践本发明。
根据上述内容，本发明的许多改进和变化均是可能的，因而也在本发明的范围内。
序列表
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Claims (49)

1.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体核酸，包含编码SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的至少一种多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
2.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体核酸，包含编码SEQ ID NO:7-14中至少一种氨基酸序列的至少一种多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
3.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体核酸，包含编码式(I)的多肽的至少一种多核苷酸:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
4.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，包含SEQ ID NO:2或4中的所有连续氨基酸。
5.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，包含SEQ ID NO:7-14中至少一种的所有连续氨基酸。
6.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为选自SEQ ID NO:1和6的至少一种具有生物活性的GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:16)、GSGGGS(SEQ ID NO:17)、GGSGGGS(SEQ ID NO:18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO:19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO:20)；V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO:21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO:22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO:23)、TVSS(SEQ ID NO:24)和AVSS(SEQ ID NO:25)；H为EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:26)，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO:43)，CH3为GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:44)，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
7.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个SEQ ID NO:6的具有生物活性的GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:16)、GSGGGS(SEQ ID NO:17)、GGSGGGS(SEQ ID NO:18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO:19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO:20)；V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO:21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO:22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO:23)、TVSS(SEQ ID NO:24)和AVSS(SEQ ID NO:25)；H为ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO:27)，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO:45)，CH3为GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:46)，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
8.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个SEQ ID NO:6的具有生物活性的GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:16)、GSGGGS(SEQ ID NO:17)、GGSGGGS(SEQ ID NO:18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO:19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO:20)；V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO:21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO:22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO:23)、TVSS(SEQ ID NO:24)和AVSS(SEQ ID NO:25)；H为ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO:28)，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO:45)，CH3为GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:46)，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
9.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO:43)，CH3为GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:44)，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
10.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO:45)，CH3为GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:46)，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
11.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个SEQ ID NO:6的具有生物活性的GLP-1肽，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
12.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:16)、GSGGGS(SEQ ID NO:17)、GGSGGGS(SEQ ID NO:18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO:19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO:20)；V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
13.至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物；L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽；V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO:21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO:22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO:23)、TVSS(SEQ ID NO:24)和AVSS(SEQ ID NO:25)；H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分；CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分；CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分；n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
14.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽；V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H选自EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:26)，ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO:27)和ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO:28)，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
15.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽，V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H选自EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO:29)、EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP(SEQ ID NO:30)、EPKSADKTHTCPPCPAPEALGGP(SEQ ID NO:31)、EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP(SEQ ID NO:32)、EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP(SEQ ID NO:33)、EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:34)、EPKSADKAHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:35)和EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:36)、ADKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ IDNO:37)、THTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:38)、ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP(SEQ ID NO:39)、ESKYGPPCPPCPAPELLGGP(SEQID NO:40)、CPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:41)及CPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO:42)，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
16.至少一种GLP-1CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽:
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)，
其中P为至少一个具有生物活性的GLP-1肽、变体或衍生物，L为至少一个接头序列，其可以是通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而为其提供了结构柔性的多肽；V为免疫球蛋白可变区C-末端的至少一个部分，H为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n为1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
17.根据权利要求1-16任一项中所述的GLP-1 CH1缺失模拟体核酸或GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，其中所述多肽具有至少一种P多肽的至少一种活性。
18.一种抗独特型单克隆或多克隆抗体，融合蛋白，或其片段，其与权利要求4-16任一项中的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽特异性结合。
19.根据权利要求1-3任一项中所述的GLP-1 CH1缺失模拟体核酸或编码权利要求4-18任一项中的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽或GLP-1 CH1缺失模拟体抗体的GLP-1 CH1缺失模拟体核酸，或与其互补的多核苷酸。
20.包含权利要求19的至少一种分离核酸的GLP-1 CH1缺失模拟体载体。
21.包含权利要求19的分离核酸的GLP-1 CH1缺失模拟体宿主细胞。
22.根据权利要求21中所述的GLP-1 CH1缺失模拟体宿主细胞，其中所述宿主细胞为选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、NSO、DG44 CHO、CHO K1、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或上述细胞的任意衍生、无限增殖化或转化细胞中的至少一种细胞。
23.一种生成至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽或GLP-1 CH1缺失模拟体抗体的方法，包括在体外、体内或原位条件下，翻译权利要求19的核酸，使GLP-1 CH1缺失模拟体或抗体以可检测或可回收的数量被表达。
24.一种组合物，包含权利要求1-19任一项中的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸、GLP-1 CH1缺失模拟体多肽，或GLP-1 CH1缺失模拟体抗体。
25.根据权利要求24中所述的组合物，其中该组合物进一步包含至少一种药学可接受的载体或稀释剂。
26.根据权利要求24中所述的组合物，进一步包括至少一种组合物，该组合物含有治疗有效量的至少一种化合物、组合物或多肽，该化合物、组合物或多肽选自糖尿病或胰岛素代谢相关药物、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于平衡体液或电解液的药物、血液系统药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部用药物、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
27.根据权利要求24中所述的组合物，其形式为选自液体、气体或干燥物、溶液、混合物、悬液、乳状液或胶体、冻干制剂或粉末中的至少一种。
28.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1相关状况的方法，包括:
(a)使细胞、组织、器官或动物接触或对其施用一种组合物，该组合物含有有效量的权利要求1-19任一项中的至少一种GLP-1CH1缺失模拟体核酸、多肽或抗体。
29.根据权利要求28中所述的方法，其中GLP-1相关状况是糖尿病或充血性心力衰竭。
30.根据权利要求28中所述的方法，其中所述有效量为每千克上述细胞、组织、器官或动物0.0001-50mg的GLP-1 CH1缺失模拟体抗体；0.1-500mg的上述GLP-1 CH1缺失模拟体；或0.0001-100μg的上述GLP-1 CH1缺失模拟体核酸。
31.根据权利要求28中所述的方法，其中上述接触或施用是通过选自肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径中的至少一种模式实现的。
32.根据权利要求28中所述的方法，进一步包括在上述(a)接触或施用之前、同时或之后，施用至少一种组合物，该组合物含有有效量的至少一种化合物或多肽，该化合物或多肽选自糖尿病或胰岛素代谢相关药物、可检测标记或受体、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于平衡体液或电解液的药物、血液系统药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部用药物、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
33.根据权利要求28中所述的方法，其中所述有效量降低有需要的动物中的血糖水平。
34.根据权利要求28中所述的方法，其中所述有效量增加胰岛素生成细胞的胰岛素分泌。
35.根据权利要求28中所述的方法，其中所述有效量防止胰岛素生成细胞的凋亡。
36.根据权利要求28中所述的方法，其中所述有效量增加胰岛素生成细胞的增殖。
37.一种处理细胞、组织、器官或动物的方法，包括使其接触或对其施用有效量的权利要求1-19任一项中的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体核酸、多肽或抗体。
38.根据权利要求37中所述的方法，其中所述有效量为每千克上述细胞、组织、器官或动物0.0001-50mg的GLP-1 CH1缺失模拟体抗体；0.1-500mg的上述GLP-1 CH1缺失模拟体；或0.0001-100μg的上述GLP-1 CH1缺失模拟体核酸。
39.根据权利要求37中所述的方法，其中上述接触或施用是通过选自肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径中的至少一种模式实现的。
40.根据权利要求37中所述的方法，进一步包括在上述(a)接触或施用之前、同时或之后，施用至少一种组合物，该组合物含有有效量的至少一种化合物或多肽，该化合物或多肽选自糖尿病或胰岛素代谢相关药物、可检测标记或受体、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于平衡体液或电解液的药物、血液系统药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部用药物、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
41.根据权利要求37中所述的方法，其中所述有效量降低有需要的动物中的血糖水平。
42.根据权利要求37中所述的方法，其中所述有效量增加胰岛素生成细胞的胰岛素分泌。
43.根据权利要求37中所述的方法，其中所述有效量防止胰岛素生成细胞的凋亡。
44.根据权利要求37中所述的方法，其中所述有效量增加胰岛素生成细胞的增殖。
45.一种装置，含有权利要求1-19任一项中的至少一种分离的GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸，其中该装置适用于通过选自肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径中的至少一种模式，接触或施用所述至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
46.一种用于人药物或诊断用途的制品，包括包装材料和容器，该容器含有权利要求1-19任一项中的至少一种分离的GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
47.权利要求46的制品，其中上述容器为肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮送递装置或系统的一个组成部分。
48.一种用于生成权利要求1-19任一项中的至少一种分离的GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸的方法，该方法包括提供至少一种能够以可检测或可回收的量表达上述多肽、抗体或核酸的宿主细胞、转基因动物、转基因植物、植物细胞。
49.由权利要求48的方法所生成的至少一种GLP-1 CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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