CN101415439A - Glp-1激动剂、组合物、方法和用途 - Google Patents

Glp-1激动剂、组合物、方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及至少一种新的人GLP－1模拟体(mimetibody)或激动剂或特定部分或变体，包括编码至少一种GLP－1模拟体或激动剂或特定部分或变体的分离核酸、GLP－1模拟体或激动剂或特定部分或变体、载体、宿主细胞、转基因动物或植物，及其制备和使用方法，包括糖尿病相关治疗和/或诊断组合物、方法和装置。

Description

GLP-1激动剂、组合物、方法和用途
发明背景
发明领域
本发明涉及对生物活性蛋白、片段或配体特异性的哺乳动物胰高血糖素样肽-1(GLP-1)激动剂(例如GLP-1模拟体)、特定部分和变体、GLP-1激动剂编码核酸和互补核酸、宿主细胞，及其制备和使用方法，包括糖尿病相关治疗配方、使用和装置。
相关技术
重组蛋白是一类新兴的治疗剂。重组蛋白作为潜在治疗剂的用途已提供了一个发展治疗性蛋白制剂的机会，还包括化学修饰的用途。此修饰可潜在地增强治疗性蛋白质的治疗效用，例如潜在地通过增加血清半衰期(例如通过阻断其接触蛋白水解酶)、增强生物活性和/或减少有害副作用。一种这样的修饰是使用融合至受体蛋白的免疫球蛋白片段如enteracept。还已使用抗体Fc结构域构建融合蛋白，试图提供较长的半衰期或整合例如Fc受体结合、A蛋白结合和补体结合的功能。
糖尿病是一种正在增长的流行病，估计在有效的药物治愈之前到2025年有超过3亿人受影响。大部分糖尿病属于两种临床类型。1型也称为青年发作糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，2型也称为成年发作糖尿病，占全部病例的90-95％。
IDDM的特征在于部分或完全无能力生产胰岛素。一般认为，1型糖尿病由进行性自身免疫应答产生，其在有遗传倾向的个体中选择性破坏产胰岛素的Langerhans胰岛β细胞。
诊断为2型糖尿病的患者的胰腺仍能够合成和分泌胰岛素。但是，胰岛素针对其发挥作用的组织的敏感性受损。另外，许多2型糖尿病患者在晚期是胰岛素依赖性的，需要注射胰岛素来改善其胰岛素抗性。
由持续升高的血浆葡萄糖水平产生的并发症包括心血管疾病、肾病、神经病和视网膜病。通过胰岛素注射或胰岛素泵进行的胰岛素替代疗法是IDDM的标准治疗。但是，此胰岛素的传递不受控，经常导致患者血糖在正常范围的上下波动。胰岛素需要型糖尿病治疗研究中的潜在替代疗法是将正常供体的胰腺或胰岛移植给糖尿病患者。如果可使用免疫抑制疗法或其它手段在某种程度上改善移植排斥问题，则胰腺或胰岛细胞可潜在地正常化血糖水平，恢复其中胰岛响应于葡萄糖分泌胰岛素的生理方式。但是，除并发症伴随需要免疫抑制方案来防止移植排斥之外，限制该方法的主要因素是人供体组织的缺乏。另外，用于移植的活供体策略应有可能使供体变成糖尿病患者。
对于大部分2型糖尿病患者，使用口服药物，试图通过部分地增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抗性和/或增加胰岛素生产来降低血糖。然而，这样的疗法最终是无效的，例如，在许多情况下，口服药剂是无效的或随着时间推移而变得无效，在某些阶段需要注射胰岛素来维持合适的葡萄糖水平。
大部分当前的糖尿病治疗伴有各种严重副作用，包括低血糖和体重增加。另外，尽管所有的干预都可用，但仍有显著数量的患者不能将其血糖保持在可接受的范围内。因此，需要提供治疗1型和/或2型糖尿病以及由其产生的并发症的替代方法。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种37个氨基酸的肽，在口服葡萄糖挑战后由肠L细胞分泌。随后在第6和第7位之间的内源切割产生生物活性的GLP-1(7-37)肽。GLP-1(7-37)肽序列可分为2个结构域。所述肽的氨基末端结构域可参与信号传导，而所述肽的其余部分似乎结合螺旋构象中GLP-1受体的胞外环。活性GLP-1似乎响应于葡萄糖结合胰腺上的GLP-1受体，引起胰岛素分泌增加(促胰岛素作用)。另外，已经表明，GLP-1减少胃排空，这降低了释放入循环中的大量葡萄糖，并可减少食物摄取。还已表明，GLP-1抑制胰高血糖素分泌，由此减少肝脏中的储存葡萄糖的内源释放。这些作用单独或组合地降低血糖水平。还已在体外和体内研究中表明，GLP-1抑制凋亡，增加胰腺中β细胞的增殖。另外，还已表明，GLP-1活性受控于血糖水平。当血糖水平降至一定阈值水平时，GLP-1无活性。因此，看起来几乎没有与给予动物GLP-1相关的低血糖风险。
但是，GLP-1在体内被蛋白酶二肽基-肽酶IV(DPP-IV)快速失活。因此，涉及GLP-1肽的治疗潜在有用性受限于其快速清除和短半衰期。例如，GLP-1(7-37)具有仅3-5分钟的血清半衰期。GLP-1(7-36)酰胺在皮下给予时具有约50分钟的时间作用。甚至抗内源蛋白酶切割的类似物和衍生物也不具有足够长的半衰期以避免在24小时时间段内重复给予。例如，exenatide抗DPP-IV，但由于短半衰期和体内药代动力学方面的明显可变性而仍需要每日两次餐前给药。目前处于临床实验中的另一种化合物NN2211是脂化GLP-1类似物。预期每日给药1次。
对于期望在长时间段内保持高药物血液水平的情况，治疗剂的快速清除是不适合的，因为那样就必须重复给予。而且，长效化合物对其过去治疗方案已包括仅采用口服药物的糖尿病患者特别重要。这些患者经常具有极其困难的一段时间过渡到包含多次药物注射的方案。具有增加的半衰期的GLP-1治疗应具有超出GLP-1肽和开发中化合物的明显优势。
因此，需要提供改良和/或修饰形式的GLP-1治疗性蛋白，其克服了一个或多个这些难题以及本领域已知的其它难题。
发明概述
如本文所述和/或本文能实现的，并结合本领域所知，本发明提供人GLP-1激动剂，包括GLP-1模拟体(mimetibody)，包括修饰的蛋白、肽、免疫球蛋白、裂解产物和其它特定部分及其变体，以及GLP-1激动剂或模拟体组合物、编码核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、装置、转基因动物、转基因植物，及其制备和使用方法。
本发明还提供如本文所述和/或本领域已知的至少一种分离的GLP-1模拟体或特定部分或变体。该GLP-1模拟体任选可包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区的至少一部分或其片段(H)直接相连，(H)与至少一部分可变区(V)直接相连，(V)与任选的接头序列(L)直接相连，(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。
在一个优选实施方案中，一对CH3-CH2-铰链-部分V区序列-接头-治疗肽序列任选地通过缔合或共价键(例如但不限于至少一个Cys-Cys二硫键或至少一个CH4或其它免疫球蛋白序列)连接成对。在一个实施方案中，GLP-1模拟体包含式(I)：
(I)  (P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一个接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，而o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM、IgD、IgE或其任何亚型等或其任何组合。
抗体序列的可变区序列可为但不限于SEQ ID NO 47-55中至少一个的至少一部分或其片段，任选还包含至少一个置换、插入或缺失。CH2、CH3和铰链区可为但不限于SEQ ID NO 56-64中至少一个的至少一部分或其片段，任选还包含至少一个置换、插入或缺失。(Kevin，这些序列被纳入到序列表中，但如果你想通过引用并入，那么我们不需要它们)。
因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体或免疫球蛋白结构或功能的至少一部分连同其固有特性和功能，同时提供了GLP-1治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。如本文所述并结合本领域所知，可改变所述抗体的不同部分和本发明GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
如本文所述或本领域所知，本发明还提供至少一种分离的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其具有至少一种活性，例如但不限于与式(I)的P部分对应的至少一种生物活性GLP-1肽或多肽的已知生物活性。
在一个方面，本发明提供至少一种分离的人GLP-1激动剂或模拟体，其包含SEQ ID NO 1的至少一种多肽序列，或任选地具有如本文所述或本领域已知的一个或多个置换、缺失或插入。在另一方面，本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体模拟对应于式(I)模拟体P部分的至少一种GLP-1肽或多肽与含至少一种配体(例如但不限于GLP-1受体)或其片段的至少1-3至完整氨基酸序列的至少一个表位结合，其中所述配体结合SEQ ID NO 1的至少一部分，或任选地具有如本文所述或本领域已知的一个或多个置换、缺失或插入。所述至少一种GLP-1激动剂或模拟体任选地可以至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M、至少10-12M的亲和性结合GLP-1受体。由此可按照已知方法筛选GLP-1激动剂或模拟体的对应活性，例如但不限于针对受体或其片段的结合活性。
本发明还提供针对本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体的至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体或片段特异性结合本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体。抗独特型抗体包括含任何分子的蛋白或肽，其含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分，它们竞争结合本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体的GLP-1配体结合区。本发明的这种独特型抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类动物等。
在一个方面，本发明提供分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体或其特定部分或变体的多核苷酸和与该多核苷酸互补、具有显著同一性或与该多核苷酸杂交的多核苷酸，包括其至少一种特定序列、结构域、部分或变体。本发明还提供重组载体，其包含至少一种所述分离的编码GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体的核酸分子、含此核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及制备和/或使用此GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体核酸、载体和/或宿主细胞的方法。
还提供一种分离核酸、含分离核酸的分离核酸载体和/或含分离核酸的原核或真核宿主细胞，所述分离核酸编码至少一种分离的哺乳动物GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体。所述宿主细胞任选为选自以下的至少一种：COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或其任何衍生物、无限增殖化或转化细胞。
本发明还提供至少一种在宿主细胞中表达至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体或特定部分或变体的方法，所述方法包括如本文所述和/或本领域已知在以下条件下培养宿主细胞：其中至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体或特定部分或变体以可检测和/或可回收量表达。还提供生产至少一种GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体的方法，所述方法包括在体外、体内或原位条件下翻译编码GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体的核酸，使得GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1激动剂或模拟体抗独特型抗体以可检测或可回收量表达。
还提供一种用于生产本发明的至少一种分离的人GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1抗独特型抗体的方法，所述方法包括提供一种能够以可回收量表达GLP-1激动剂或模拟体或GLP-1抗独特型抗体的宿主细胞或转基因动物或转基因植物。
本发明还提供通过以上方法生产的至少一种GLP-1激动剂或模拟体。
本发明还提供至少一种组合物，其包含(a)本文所述的分离的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸和/或GLP-1激动剂或模拟体，和(b)合适的载体或稀释剂。所述载体或稀释剂按照已知方法任选可为药物可接受的。所述组合物任选地还可含有至少一种其它化合物、蛋白或组合物。
还提供一种组合物，其包含至少一种分离的人GLP-1激动剂或模拟体和至少一种药物可接受载体或稀释剂。该组合物任选地还可包含有效量的至少一种化合物或蛋白质，其选自至少一种糖尿病药物、胰岛素代谢相关药物、葡萄糖代谢相关药物、可检测的标记或报告物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部药物、营养药物、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药物(NTHE)、镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明还提供送递治疗或预防有效量的至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的至少一种组合物、装置和/或方法。
本发明还提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体方法或组合物，用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或如本领域所知和/或本文所述在相关病症之前、之后或期间给予治疗有效量，以调节或治疗至少一种GLP-1相关病症。
本发明还在一种方法或组合物中提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体，其在以治疗有效量给予时用于调节、治疗或缓解细胞、组织、器官、动物或患者中的下述至少一种症状：代谢疾病、免疫疾病、心血管疾病、感染性疾病、恶性疾病和/或神经疾病，和/或如本领域所知根据多种不同病症的需要，例如但不仅限于在相关疾病或治疗条件之前、之后或期间进行。
本发明还在一种方法或组合物中提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体，其在以治疗有效量给予时用于调节、治疗或缓解下述至少一种症状：糖尿病或胰岛素代谢相关疾病、葡萄糖代谢相关疾病、骨和关节疾病、心血管疾病、牙或口腔疾病、皮肤病、耳、鼻或咽喉疾病、内分泌或代谢疾病、胃肠疾病、妇科疾病、肝或胆疾病、产科疾病、血液疾病、免疫或变应性疾病、感染性疾病、肌与骨疾病、肿瘤疾病、神经疾病、营养疾病、眼疾病、儿科疾病、中毒疾病、精神疾病、肾疾病、肺疾病或任何其它已知疾病(参见例如The Merck Manual，第17版，Merck ResearchLaboratories，Merck and Co，Whitehouse Station，NJ(1999)，其通过引用整体结合到本文中)，所述给予如本领域所知根据多种不同病症的需要例如但不限于在相关疾病或治疗条件之前、之后或期间进行。
本发明还提供送递本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体的至少一种组合物、装置和/或方法，用于诊断GLP-1相关病症。
本发明还提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体方法或组合物，用于在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在本领域已知和/或本文描述在相关病症之前、之后或期间诊断至少一种GLP-1相关病症。
本发明还提供用于诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的病症的方法，包括(a)使含有效量的至少一种本发明分离人GLP-1激动剂或模拟体的组合物接触或给予细胞、组织、器官或动物。该方法任选地还可包括每0-24小时、1-7天、1-52周、1-24个月、1-50年使用0.001-50mg/kg细胞、组织、器官或动物的有效量或其间的任何范围或值，或者在体外或原位进行的情况下使用等同的浓度或摩尔浓度。该方法任选地还可包括通过选自以下的至少一种模式接触或给予：体外、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或透皮。该方法任选地还可包括在(a)接触或给予之前、同时或之后给予至少一种组合物，该组合物含有效量的至少一种化合物或蛋白质，其选自以下的至少一种：糖尿病药物、胰岛素代谢相关药物、葡萄糖代谢相关药物、可检测的标记或报告物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部药物、营养药物、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎药物(NSAID)、镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、维生素、生长因子或抗氧化剂。
还提供一种医学装置，其包含本发明的至少一种分离的人GLP-1激动剂或模拟体，其中所述装置适于通过选自以下的至少一种模式接触或给予至少一种GLP-1激动剂或模拟体：体外、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或透皮。
还提供用于人类药物或诊断用途的制品，其包括包装材料和容器，该容器含溶液或冻干形式的至少一种本发明分离人GLP-1激动剂或模拟体。该制品任选可包括将容器作为体外、肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或透皮送递装置或系统的组成部分。
本发明还提供本文描述的任何发明。
附图简述
图1图示了IgG1支架中的GLP-1模拟体的核苷酸和肽序列，显示了重要功能结构域。
图2A-2C图解了GLP-1模拟体的FACS结合测定。
图2A表明，GLP-1模拟体结合过表达GLP-1R的HEK293细胞。灰色：GLP-1模拟体但无二抗；黑色：仅二抗；红色：阴性对照模拟体和二抗；蓝色：GLP-1模拟体和二抗。
图2B表明，GLP-1模拟体不结合对照HEK293细胞。灰色：GLP-1模拟体但无二抗；黑色：仅二抗；蓝色：GLP-1模拟体和二抗。
图2C表明，GLP-1肽类似物(A2S)能够与GLP-1模拟体竞争结合过表达GLP-1R的HEK293细胞。灰色：GLP-1模拟体但无二抗；黑色：GLP-1模拟体和二抗；橙色：GLP-1模拟体、0.2nM竞争剂、二抗；蓝色：GLP-1模拟体、20nM竞争剂、二抗；红色：GLP-1模拟体、100nM竞争剂、二抗。
图3A-3E图解了GLP-1模拟体的cAMP测定。图3A：IgG1支架中的野生型GLP-1模拟体；图3B：GLP-1肽；图3C：IgG4(Ala/Ala，Ser→Pro)支架中的GLP-1(A2G)模拟体；图3D：IgG4(Ala/Ala，Ser→Pro)支架中的GLP-1(A2S)模拟体；图3E：IgG4(Ala/Ala，Ser→Pro)支架中的野生型GLP-1模拟体。
图4图解了GLP-1模拟体对DPP-IV裂解的抗性。
图5显示了在人血清中与GLP-1肽相比GLP-1模拟体的提升的稳定性。
图6表明，GLP-1模拟体在RINm细胞中引起胰岛素分泌。图6A表明，GLP-1(7-36)肽和exendin-4肽在RINm细胞中刺激胰岛素释放。图6B表明，IgG1或IgG4(Ala/Ala，Ser→Pro)支架中的GLP-1(A2S)模拟体或IgG4(Ala/Ala，Ser→Pro)支架中的GLP-1(A2G)模拟体对于刺激RINm细胞中的胰岛素分泌有活性。
图7显示了GLP-1模拟体对糖尿病小鼠中的禁食血糖的影响。图7A表明GLP-1模拟体降低了禁食血糖。图7B表明所述影响是剂量依赖性的。
图8A显示了GLP-1模拟体在体外对分离的大鼠胰岛增殖的作用。图8B显示了GLP-1模拟体剂量对大鼠胰岛增殖的影响。
图9显示了GLP-1模拟体在体外对分离的非人灵长类动物(NHP)胰岛增殖的影响。
图10A显示了GLP-1模拟体在体外对分离的人胰岛增殖的影响。图10B显示了GLP-1模拟体剂量对人胰岛增殖的影响。
图11显示了GLP-1模拟体在体外对分离的大鼠胰岛的胰岛素分泌的影响。
图12显示了与小鼠中的GLP-1(A2S)模拟体(图12B)相比GLP-1肽(图12A)的药代动力学模式。
图13显示了小鼠(图13A)、大鼠(图13B)、猕猴(图13C)和人(图13D)血液中的GLP-1模拟体的稳定性。
图14显示了GLP-1模拟体在猕猴中的体内稳定性。
图15图示了在db/db小鼠(图15A)和DIO小鼠(图15B)中口服葡萄糖挑战之后GLP-1模拟体治疗对血糖的影响。
图16表明GLP-1模拟体以剂量依赖性方式抑制细胞因子诱导的凋亡。相对于未治疗对照的凋亡百分率对GLP-1MMB浓度作图。
图17表明，GLP-1模拟体在INS-1E细胞中增加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌。A.柱形图显示了在5.5mM葡萄糖存在下于各个GLP-1MMB浓度分泌的胰岛素量。另外，仅对于3和7.5mM葡萄糖分泌的胰岛素作图。B.分泌的胰岛素量对GLP-1MMB浓度作图。数据拟合为Hill方程，获得0.07nM的EC50。
图18表明，GLP-1模拟体在大鼠胰岛(图18A)和人胰岛(图18B)中增加葡萄糖依赖性的胰岛素分离。
图19显示了GLP-1MMB治疗对正常C57/BLK6小鼠的血糖水平的影响。
图20显示了在STZ治疗的糖尿病裸小鼠中GLP-1MMB治疗对血糖水平(图20A)和葡萄糖耐受(图20B)的影响，所述裸小鼠移植边际量的人胰岛。在图20A中，血糖对接受每日IP注射的PBS治疗的对照小鼠(X)和GLP-1MMB治疗小鼠(■)的时间(天数)作图。在第0天移植边际量的人胰岛(50IEQ/g)，此后监测动物中的血糖。箭头表示在去除移植的胰岛时导致迅速回复到糖尿病状态。在图20B中，血糖对PBS治疗的对照小鼠(X)和GLP-1MMB(0.5mg/kg)(■)的时间(分钟)作图。在小鼠接受每日IP注射达30天以上后进行IVGTT。动物过夜禁食，之后进行IV葡萄糖注射(1.5g/kg)。监测小鼠的血糖，并对注射后时间作图。插图陈述了对照和GLP-1MMB治疗小鼠的曲线下面积。
图21显示了GLP-1MMB对非人灵长类动物(NHP)胰岛中的葡萄糖诱导性胰岛素分泌的影响。
图22显示了GLP-1MMB对移植边际量的STZ糖尿病NHP的外源胰岛素需求(图22A)和血红蛋白Alc(HgbAlc)(图22B)的影响。
发明详述
本发明提供分离的、重组的和/或合成的模拟体或特定部分或变体，以及包含至少一种多核苷酸的组合物和编码核酸分子，该多核苷酸编码至少一种GLP-1激动剂或模拟体。本发明的这种模拟体或特定部分或变体含特定的GLP-1激动剂或模拟体序列、其结构域、片段及特定变体，以及制备和应用所述核酸和模拟体或特定部分或变体的方法，包括治疗性组合物、方法和装置。
本发明还提供如本文所述和/或本领域已知的至少一种分离的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。该GLP-1模拟体可任选包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接相连，(H)与至少一部分可变区(V)直接相连，(V)与任选的接头序列(L)直接相连，(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。
在一个优选实施方案中，GLP-1模拟体包含式(I)：
(I)  ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1多肽，L是至少一个接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，m、n、o、p、q、r、s和t可独立地为0-10之间并包括0和10的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM、IgD、IgE或其任何亚型等或其任何组合。
因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体结构连同抗体的固有特性和功能，同时提供一种治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。在其中t＝1的一个优选实施方案中，单体CH3-CH2-铰链-部分J(J先前未描述)序列-接头-治疗性肽可通过缔合或共价健(例如但不限于Cys-Cys二硫键)连接至其它单体。如本文所述并结合本领域所知，可改变所述抗体的不同部分和至少一种本发明GLP-1模拟体的GLP-1治疗性肽部分。
CH3-CH2-铰链部分可被广泛修饰，以形成符合本发明的变体，前提是保持与补救受体的结合。在这种变体中，人们可去除一个或多个提供本发明融合分子不需要的结构特征或功能活性的天然位点。人们例如可通过置换或缺失残基、向位点中插入残基或截断含位点的部分来去除这些位点。插入或置换的残基还可为改变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。CH3-CH2-铰链变体可缺少一个或多个天然位点或残基，它们影响或参与(1)二硫键形成；(2)与选定宿主细胞不相容；(3)在选定宿主细胞中表达时的不均一性；(4)糖基化；(5)与补体相互作用；(6)结合补救受体之外的Fc受体；或(7)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。代表性的CH3-CH2-铰链变体包括以下的分子和序列，其中1.去除了参与二硫键形成的位点。这样的去除可避免与用于生产本发明分子的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸蛋白反应。为此，半胱氨酸残基可缺失或被其它氨基酸(例如丙氨酰、丝氨酰)取代。即便在去除半胱氨酸残基时，单链CH3-CH2-铰链结构域仍可形成非共价保持在一起的二聚化CH3-CH2-铰链结构域；2.修饰CH3-CH2-铰链区，以使其与选定宿主细胞更相容。例如，当分子在如大肠杆菌的细菌细胞中表达时，人们可去除铰链中的PA序列，该序列可由大肠杆菌中的消化酶如脯氨酸亚氨基肽酶识别；3.一部分铰链区缺失或被其它氨基酸取代，以防止在选定宿主细胞中表达时的不均一性；4.去除一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如天冬酰胺)可赋予细胞溶解响应。这样的残基可缺失或被未糖基化残基(例如丙氨酸)取代；5.去除涉及与补体相互作用的位点，例如Clq结合位点。补体募集可能对本发明的分子不利，所以可用此变体避免；6.去除影响与补救受体之外的Fc受体结合的位点。CH3-CH2-铰链区可具有与某些白细胞相互作用的位点，它们不是本发明的融合分子必需的，所以可被去除；7.去除ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的，关于IgG1中的ADCC位点参见例如Molec.Immunol 29(5)633-9(1992)。这些位点同样不是本发明的融合分子所必需的，所以可去除。
接头多肽通过使激动剂或模拟体具有可变方向和结合特性来提供结构柔性。在存在时，其化学结构不关键。接头优选由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。因此，在优选实施方案中，接头由通过肽键连接的1-20个氨基酸组成，其中所述氨基酸选自20个天然氨基酸。这些氨基酸中有一些可糖基化，这是本领域技术人员众所周知的。在一个更优选的实施方案中，1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。再更优选地，接头大部分由非空间位阻氨基酸如甘氨酸和丙氨酸组成。因此，优选的接头是聚(Gly-Ser)、聚甘氨酸(具体地说为(Gly)4、(Gly)5)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。接头的其它特定实例是(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ IDNO：65)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO 66)、(Gly)3Cys(Gly)4(SEQID NO 67)和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO 68)。
为解释以上命名，例如(Gly)3LyS(Gly)4指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。还优选Gly和Ala的组合。此处显示的接头是代表性的，本发明范围内的接头可长得多，并可包含其它残基。
非肽接头也是可能的。例如，可使用烷基接头，例如可使用其中s＝2-20的-NH-(CH2)s-C(O)-。这些烷基接头还可被任何非空间位阻基团取代，所述非空间位阻基团例如为低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。代表性的非肽接头是PEG接头，其具有100-5000kD、优选100-500kD的分子量。肽接头可被改变，以和上述相同的方式形成衍生物。
本文使用的“GLP-1肽”或“GLP-1肽、变体或衍生物”可为至少一种GLP-1肽、GLP-1片段、GLP-1同源物、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。GLP-1肽具有约25至约45个天然或非天然氨基酸，它们与天然GLP-1(7-37)具有足够的同源性，使得它们通过结合胰腺中β细胞上的GLP-1受体表现出促胰岛素活性。GLP-1(7-37)具有SEQ IDNO 15的氨基酸序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-De-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。
GLP-1片段是截断GLP-1(7-37)或其类似物或衍生物的N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸后获得的多肽。GLP-1同源物是其中一个或多个氨基酸已加入到GLP-1(7-37)或其片段或类似物的N末端和/或C末端的肽。GLP-1类似物是其中GLP-1(7-37)的一个或多个氨基酸已被修饰和/或置换的肽。GLP-1类似物与GLP-1(7-37)或GLP-1(7-37)的片段具有足够的同源性，使得所述类似物具有促胰岛素活性。GLP-1衍生物被定义为以下分子：其具有GLP-1肽、GLP-1同源物或GLP-1类似物的氨基酸序列，但另外具有一个或多个其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基团的化学修饰。
本领域已知众多的活性GLP-1片段、类似物和衍生物，任何这些类似物和衍生物中也可为本发明的GLP-1激动剂或模拟体的一部分。本领域已知的某些GLP-1类似物和GLP-1片段公开于美国专利第5,118,666、5,977,071和5,545,618号，以及Adelhorst等，J.Biol Chem269 6275(1994)。实例包括但不限于GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。
“GLP-1激动剂或模拟体”、“GLP-1激动剂或模拟体部分”或“GLP-1激动剂或模拟体片段”和/或“GLP-1激动剂或模拟体变体”等具有、模拟或刺激至少一种GLP-1肽、变体或衍生物(例如但不仅限于SEQ ID NO：1中的至少一种)的至少一种生物活性，例如但不仅限于在体外、原位和/或优选在体内的配体结合。例如，合适的GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体也可调节、增加、改变、活化至少一种GLP-1受体信号传导或其它可测量或可检测活性。
在本发明方法和组合物中有用的GLP-1模拟体的特征在于具有与蛋白质配体如GLP-1受体结合的合适亲和性，并任选和优选地具有低毒性。具体而言，具有下述情况的GLP-1模拟体在本发明中有用：其中独立组分如可变区部分、恒定区(无CH1部分)和构架或其任何部分(例如可变重链或轻链的J、D或V区的一部分；至少一个铰链区、恒定重链或轻链的至少一部分等)独立地和/或共同地任选和优选具有低免疫原性。可用于本发明的模拟体任选地特征在于其以良好到极佳的缓解症状且低毒性长期治疗患者的能力。低免疫原性和/或高亲和性以及其它未明特性均可有助于达到的治疗效果。“低免疫原性”在本文被定义为在少于约75％或优选少于约50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2和/或1％的治疗患者中出现显著的HAMA、HACA或HAHA应答，和/或的治疗患者中出现低滴度(采用双抗原酶免疫测定法检测为少于约300、优选少于约100)(参见例如Elliott等，Lancet 344 1125-1127(1994))。
效用。本发明的分离核酸可用于生成至少一种GLP-1激动剂或模拟体、其片段或特定变体，它们可用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人类)中起作用，以调节、治疗、缓解至少一种蛋白质相关病症，帮助预防该蛋白质相关病症发病，或减少该蛋白质相关病症的症状，该蛋白质相关病症选自但不仅限于以下的至少一种：糖尿病相关疾病、胰岛素代谢相关疾病、葡萄糖代谢相关疾病、免疫障碍或疾病、心血管障碍或疾病、感染性疾病、恶性疾病和/或神经障碍或疾病，以及其它已知或特定的蛋白质相关疾病。
这种方法可包括对需要该调节、治疗、缓解、预防或减少症状、影响或机制的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效量的组合物或药物组合物，它们包含至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。该有效量可包括单次或多次给予约0.0001-500mg/kg的量，或单次或多次给予使血清浓度达到0.01-5000μg/ml血清浓度的量，(需要包括体外浓度)或其中的任何有效范围或数值，所述有效量可使用本文所述或相关领域已知的方法实施和测定。
引证。本文所引用的全部出版物或专利由于体现了与本发明同时的本领域现状，和/或提供了本发明的描述和实现，因而被通过引用整体结合到本文中。出版物指任何学术或专利出版物，或可以任何媒介形式获得的任何其它资料，包括所有记录的、电子的或打印的形式。下述参考文献通过引用整体结合到本文中：Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc，NY，NY(1987-2005)；Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，Harlow and Lane，Antibodies，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc，NY(1994-2005)；Colligan等，Current Protocols in Protein Science，John Wiley &Sons，NY，NY，(1997-2005)。
本发明的模拟体。GLP-1模拟体任选地可包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区片段的至少一部分(H)(例如包含至少一个核心铰链区)直接相连，(H)与至少一部分可变区(V)直接相连，(V)与任选的接头序列(L)直接相连，(L)与至少一个GLP-1治疗性肽(P)直接相连。在一个优选实施方案中，一对CH3-CH2-H-V-L-P可通过缔合或共价键(例如但不限于Cys-Cys二硫键)连接。因此，本发明的GLP-1模拟体模拟抗体结构连同抗体的固有特性和功能，同时提供了治疗性肽及其固有或获得的体外、体内或原位特性或活性。如本文所述并结合本领域所知，可改变所述抗体的不同部分和至少一种本发明GLP-1模拟体的治疗性肽部分。
因此，本发明模拟体提供至少一种相比已知蛋白的合适特性，例如但不限于以下的至少一种：增加的半衰期、提高的活性、更为特异的活性、提高的亲和力、提高或降低的清除率、选择的或更为合适的活性亚型、较小免疫原性、至少一种预期疗效的质量或时程的提高、较少副作用等。
式(I)的模拟体片段可通过本领域已知和/或本文所述的酶切、合成或重组技术制备。利用抗体基因也可生产多种截短形式的模拟体，该抗体基因中的一个或多个终止密码子已被导入天然终止位点的上游。模拟体的多个部分可通过常规技术化学连接在一起，或者利用遗传工程技术制备为连续蛋白。例如，可表达编码人类抗体链中至少一个恒定区的核酸，以生成可用于本发明模拟体的连续蛋白。有关单链抗体参见例如Ladner等，美国专利第4,946,778号和Bird，R.E.等，Science，242：423-426(1988)。
本文所用的术语“人模拟体”指抗体，其中期望该蛋白质的基本每一部分(例如GLP-1肽、CH结构域(例如CH2、CH3)、铰链、V)在人中都基本无免疫原性，仅具有较少的序列变化或变异。相对于未修饰的人抗体或本发明模拟体而言，这种变化或变异任选并优选地保留或降低了在人中的免疫原性。因此，人抗体和相应的本发明GLP-1模拟体与嵌合或人源化抗体截然不同。应指出的是，GLP-1模拟体可由能表达人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或细胞产生。
针对合适的配体，例如分离的GLP-1受体或其部分(包括合成分子，例如合成肽)，可设计出对其至少一种蛋白配体有特异性的人模拟体。利用鉴定并表征至少一种蛋白质或其部分的配体结合区或序列的已知技术，可进行该模拟体的制备。
在一个优选实施方案中，本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体由至少一种细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化和/或培养细胞的克隆群体产生。采用合适的方法可产生无限增殖化的蛋白质生产细胞。优选地，该至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体一般通过提供核酸或载体而制备，该核酸或载体包含来源于至少一个人免疫球蛋白基因座的DNA或具有与其基本相似的序列，所述至少一个人免疫球蛋白基因座被功能重排或可接受功能重排，所述核酸或载体可进一步包含本文所述的激动剂或模拟体结构，例如但不限于式(I)，其中如本领域所知，C-末端可变区部分可用作V，铰链区可被用作H，CH2可用作CH2，CH3可用作CH3。
本文所用的术语“功能重排”指来源于免疫球蛋白基因座的核酸节段，所述免疫球蛋白基因座已经历V(D)J重组，从而生成编码免疫球蛋白链(例如重链)或其任何部分的免疫球蛋白基因。功能重排的免疚球蛋白基因可使用合适方法直接或间接鉴定，所述合适方法例如为核苷酸测序、利用可退火至基因节段之间编码结合处的探针进行的杂交(例如蛋白质印迹、RNA印迹)或采用可退火至基因节段之间编码结合处的引物对免疫球蛋白基因进行的酶扩增(例如聚合酶链反应)。细胞是否产生含特定可变区或含特定序列(例如至少一个P序列)可变区的GLP-1激动剂或模拟体或部分或变体也可使用合适方法确定。
本发明的模拟体、特定部分和变体还可如下制备：使用至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸，以提供转基因动物或哺乳动物，例如山羊、奶牛、马、绵羊等，这些动物在其乳汁中产生所述模拟体或特定部分或变体。使用应用于抗体编码序列的已知方法可获得所述动物。参见例如但仅限于美国专利第5,827,690、5,849,992、4,873,316、5,849,992、5,994,616、5,565,362、5,304,489号等，这些专利每个均通过引用整体结合到本文中。
本发明的模拟体、特定部分和变体可另外如下制备：使用至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸，以提供转基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)，其在植物部分或由其所培养的细胞中产生所述模拟体、特定部分或变体。作为非限制性实例，表达重组蛋白的转基因烟草叶已成功地用于提供大量的重组蛋白，例如利用诱导型启动子。参见例如Cramer等，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其引用的参考文献。此外，转基因玉米或谷物也已被用于以工业生产水平表达哺乳动物蛋白质，其具有的生物学活性等同于由其它重组系统生产的或由天然来源纯化的蛋白。参见例如Hood等，Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其引用的参考文献。包括抗体片段如单链模拟体(scFv)在内的抗体也已被大量地从包括烟草种子和马铃薯块茎在内的转基因植物种子中生成。参见例如Conrad等，Plant Mol Biol.38：101-109(1998)及其引用的参考文献。因此，本发明的模拟体、特定部分和变体也可根据已知方法利用转基因植物制备。也参见例如Fischer等，Biotechnol Appl Biochem 30 99-108(1999年10月)；Ma等，TrendsBiotechnol.13.522-7(1995)；Ma等，Plant Physiol 109 341-6(1995)；Whitelam等，Biochem Soc.Trans 22 940-944(1994)及其中引用的参考文献。上述参考文献通过引用整体结合到本文中。
本发明的模拟体可以广泛的亲和性(KD)结合人蛋白配体。在一个优选实施方案中，至少一种本发明人GLP-1激动剂或模拟体可任选地以高亲和性结合至少一种蛋白配体。例如，至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体可以等于或小于约10-7M的KD结合至少一种蛋白配体，或更优选以等于或小于约0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)×10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12或10-13M或其中的任何范围或数值的KD结合。
GLP-1激动剂或模拟体对至少一种蛋白配体的亲和性或亲和力可采用任何合适方法经实验测定，例如用于测定抗体-抗原结合亲和性或亲和力的方法。(参见例如Berzofsky等，“Antibody-AntigenInteractions，”载于Fundamental Immunology，Paul，W.E.编辑，RavenPress New York，NY(1984)，Kuby，Janis Immunology，W H Freeman andCompany New York，NY(1992)，及其中其描述的方法)。在不同条件(例如盐浓度、pH)下检测时，特定GLP-1激动剂或模拟体-配体相互作用的检测亲和性可不同。因此，优选采用GLP-1激动剂或模拟体和配体的标准溶液，和例如本文所述或本领域已知的缓冲剂的标准缓冲剂，测定亲和性及其它配体结合参数(例如KD、Ka、Kd)。
核酸分子。利用本文提供的信息，采用本文描述或本领域已知的方法，可获得例如编码SEQ ID NO 1-6中至少一个的至少90-100％连续氨基酸以及抗体的至少一部分的核苷酸序列，其中上述序列被作为式(I)的P序列插入，以提供本发明的GLP-1激动剂或模拟体，还包括其特定片段、变体或共有序列，或者可获得含这些序列中的至少一种的沉积载体(deposited vector)、编码至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的本发明核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或者是DNA形式，包括但不限于通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA或其任何组合。该DNA可为三链、双链或单链或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分均可为编码链，也称为有义链，或者其可为非编码链，也称为反义链。
本发明的分离核酸分子可包括含有可读框(ORF)并任选地具有一个或多个内含子的核酸分子、含有GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码序列的核酸分子以及含基本上不同于上述核苷酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述不同的核苷酸序列由于遗传密码简并性其仍编码本文所述和/或本领域已知的至少一种GLP-1激动剂或模拟体。当然，所述遗传密码是本领域周知的。因此，对本领域技术人员而言，产生这种编码本发明特定GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的简并核酸变体是常规工作。参见例如上述Ausubel等，这种核酸变体包括在本发明中。
如本文所指出的，包含GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码核酸的本发明核酸分子可包括但不限于：自身编码GLP-1激动剂或模拟体片段的氨基酸序列的核酸分子；完整GLP-1激动剂或模拟体或其部分的编码序列；GLP-1激动剂或模拟体、片段或部分的编码序列，以及其它序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，有或没有上述其它编码序列，例如至少一个内含子，连同其它非编码序列，包括但不仅限于非编码5′和3′序列，例如在转录、mRNA加工(包括剪接和多腺苷酸化信号)中起作用(例如mRNA的核糖体结合和稳定性)的转录、非翻译序列；编码其它氨基酸(例如可提供其它功能性的氨基酸)的其它编码序列。因此，编码GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的序列可融合至标记序列，例如编码特定肽的序列，该肽有助于纯化含有GLP-1激动剂或模拟体片段或部分的融合GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。
与本文所述多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。本发明提供可在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸或包括其特定变体或部分的其它本文公开多核苷酸杂交的分离核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量含有这种多核苷酸的核酸。
低或中等严格性杂交条件典型但并不专有地应用于与互补序列相比具有较低序列同一性的序列。中等和高严格性条件任选地可用于较高同一性的序列。低严格性条件允许具有约40-99％序列同一性的序列的选择性杂交，并可用于鉴定直向同源或共生同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸编码由本文所述多核苷酸编码的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可用于与编码本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如上述Ausubel；上述Colligan，其中每个文献均通过引用整体结合到本文中。
核酸的构建。本发明的分离核酸可采用本领域熟知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或其组合来制备。
所述核酸可方便地包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如，可将含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入该核酸中，以帮助分离该多核苷酸。另外，可插入可翻译序列，以帮助分离本发明的翻译多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白质的方便途径。本发明核酸除为编码序列外，还任选地为用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体、适体或接头。
也可加入其它序列至这种克隆和/或表达序列，以优化其在克隆和/或表达方面的功能、帮助分离多核苷酸或促使多核苷酸导入细胞中。克隆载体、表达载体、适体和接头的用途在本领域众所周知。参见例如上述Ausubel或上述Sambrook。
构建核酸的重组方法。利用本领域技术人员已知的多种克隆方法，可从生物来源中获得本发明的分离核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。在某些实施方案中，采用在合适的严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针来鉴别cDNA或基因组DNA文库中的目标序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文序的构建均是本领域普通技术人员熟知的。(参见例如上述Ausubel或上述Sambrook)。
用于构建核酸的合成方法。本发明的分离核酸还可通过已知方法经直接化学合成制备(参见例如上述Ausubel)。化学合成通常生成单链寡核苷酸，通过与互补序列杂交，或通过使用该单链为模板用DNA聚合酶聚合，可将该单链寡核苷酸转变为双链DNA。本领域技术人员会认识到，尽管DNA的化学合成可被限于约100或更多个碱基的序列，但通过连接较短序列可获得较长序列。
重组表达盒。本发明进一步提供包含本发明核酸的重组表达盒。本发明核酸序列，例如编码本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的cDNA或基因组序列，可用于构建可导入至少一种期望宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒典型地将包含有效连接至转录起动调节序列的本发明多核苷酸，其中该转录起动调节序列将引导所述多核苷酸在预期宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子均可用于引导本发明核酸的表达。
在某些实施方案中，充当启动子、增强子或其它元件的分离核酸可被导入非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置(上游、下游或内含子中)，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，如本领域所知，内源启动子可通过突变、缺失和/或取代在体内或体外被改变。本发明多核苷酸可按所期望的有义或反义方向被表达。应当理解的是，对有义或反义方向基因表达的控制可对可观测特征具有直接影响。另一种抑制方法是有义抑制。导入被设定为有义方向的核酸已被证明是阻断靶基因转录的一种有效途径。
载体和宿主细胞。本发明还涉及包含本发明分离核酸分子的载体、经由该重组载体遗传改造的宿主细胞，以及通过本领域熟知的重组技术生产至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。参见例如上述Sambrook；上述Ausubel等，其中每个文献均通过引用整体结合到本文中。
所述多核苷酸任选地可连接至用于在宿主内增殖的、含可选择标记的载体。通常，采用合适的已知方法，例如电穿孔等，将质粒载体导入细胞中，其它已知方法包括利用载体作为沉淀物，如磷酸钙沉淀，或利用载体与带电脂质形成复合体。如果该载体为病毒，则可用合适包装细胞系将其体外包装，并随后将其转导入宿主细胞中。
DNA插入片段应有效连接至合适启动子。该表达构建体还含有任选用于转录起始、终止中的至少一种和转录区内用于翻译的核糖体结合位点。该构建体所表达的成熟转录物的编码部分优选包括开始的翻译起始密码子和适宜地位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞表达。
表达载体优选但任选地包括至少一种可选择标记。这种标记包括例知但不限于：用于真核细胞培养物的氨甲蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利第4,399,216、4,634,665、4,656,134、4,956,288、5,149,636、5,179,017号)、氨苄西林、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利第5,122,464、5,770,359、5,827,739号)抗性，和用于在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的四环素或氨苄西林抗性基因(上述专利均通过引用整体结合到本文中)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适载体是技术人员容易明白的。将载体构建物导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法实现。本领域描述了这些方法，例如上述Sambrook的1-4和16-18章；上述Ausubel的1、9、13、15、16章。
至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可以以修饰形式表达，例如融合蛋白，且不仅可包括分泌信号，还可包括其它异源功能区。例如，可将附加氨基酸(尤其是带电氨基酸)区加入GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的N末端，以改善在宿主细胞中、纯化期间或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。同样，肽部分也可加入本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，以利于纯化。最终制备GLP-1激动剂或模拟体或其至少一种片段之前可将该区域除去。这种方法在许多标准实验室手册中有描述，例如上述Sambrook的17.29-17.42和18.1-18.74章；上述Ausubel的16、17和18章。
本领域一般技术人员熟知用于表达本发明蛋白质编码核酸的众多表达系统。用于生产所述模拟体、其特定部分或变体的示例性细胞培养物是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常为单层细胞形式，但也可采用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已发展出能够表达完整糖基化蛋白的大量合适宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610，DG-44)和BSC-1(例知ATCC CRL-26)细胞系、hepG2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，均可容易地从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va)获得。优选宿主细胞包括淋巴来源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。尤其优选的宿主细胞为P3X63Ag8.653细胞(ATCC登记号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登记号CRL-1851)。
用于这些细胞的表达载体可包括一个或多个下述表达控制序列，例如但不限于复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(例如美国专利第5,168,062号、第5,385,839号)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(例如美国专利第5,266,491号)、至少一种人免疫球蛋白启动子)；增强子和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T抗原聚腺苷酸加入位点)和转录终止子序列。参见例如上述Ausubel等；上述Sambrook等。用于本发明核酸或蛋白质的生产的其它细胞是已知的和/或可获得的，如来自美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(American Type Culture Collection Catalogueof Cell Lines and Hybridomas)(www.atcc.org)或其它已知或商业来源。
当应用真核宿主细胞时，典型地将聚腺苷酸化或转录终止序列整合入载体中。终止序列实例是牛生长激素基因来源的聚腺苷酸化序列。也可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列实例是SV40来源的VP1内含子(Sprague等，J.Virol 45 773-781(1983))。另外，如本领域已知，可将宿主细胞内控制复制的基因序列整合入载体中。
GLP-1激动剂或模拟体或其特定部分或变体的纯化。GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可通过众所周知的方法由重组细胞培养物回收及纯化，所述方法包括但不限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。也可应用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。参见例如Colligan，Current Protocolsin Immunology，或Current Protocols in Protein Science，John Wiley &Sons，NY，NY，(1997-2002)，例如1、4、6、8、9、10章，每个文献均通过引用整体结合到本文中。
本发明的模拟体或特定部分或变体包括天然纯化产物、化学合成方法的产物和通过重组技术由真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。根据重组生产方法中应用的宿主，本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可为糖基化或非糖基化的，优选糖基化的。这种方法在许多标准实验室手册中有描述，例如上述Sambrook的17.37-17.42节；上述Ausubel的10、12、13、16、18和20章，上述Colligan，Protein Science，12-14章，它们全部通过引用整体结合到本文中。
模拟体、特定片段和/或变体。本发明的分离模拟体包括由本文更完整论述的本发明任何一种多核苷酸编码的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，或任何分离或制备的GLP-1激动剂或模拟体或其特定部分或变体。
优选GLP-1激动剂或模拟体或配体结合部分或变体结合至少一个GLP-1蛋白配体，由此提供相应蛋白质或其片段的至少一种GLP-1生物活性。在治疗或诊断方面具有重要作用的不同蛋白质是本领域熟知的，该蛋白质的合适测定或生物活性也是本领域熟知的。
对于本发明，合适的GLP-1肽、变体和衍生物的非限制性实例为SEQ ID NO 1：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31，其中Xaa2是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa3是Glu、Asp或Lys；Xaa5是Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Arg、His、Glu、Asp或Lys；Xaa6是Phe、His、Trp或Tyr；Xaa7是Thr或Asn；Xaa8是Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa9是Asp或Glu；Xaa10是Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Met、Tyr、Trp、His、Phe、Glu、Asp或Lys；Xaa11是Ser、Val、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp或Lys；Xaa12是Ser、Val、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp或Lys；Xaa13是Tyr、Phe、Trp、Glu、Asp或Lys；Xaa14是Leu、Ala、Met、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa15是Glu、Ala、Thr、Ser、Gly、Gln、Asp或Lys；Xaa16是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Gln、Asn、Arg、Cys、Glu、Asp或Lys；Xaa17是Gln、Asn、Arg、His、Glu、Asp或Lys；Xaa18是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp或Lys；Xaa19是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Met、Glu、Asp或Lys；Xaa20是Lys、Arg、His、Gln、Trp、Tyr、Phe、Glu或Asp；Xaa21是Glu、Leu、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Gln、Thr、Ser、Gly、Asp或Lys；Xaa23是Ile、Ala、Val、Leu或Glu；Xaa24是Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、His、Glu、Asp或Lys；Xaa25是Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp或Lys；Xaa26是Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp或Lys；Xaa27是Val、Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Arg、Glu、Asp或Lys；Xaa28是Lys、Asn、Arg、His、Glu或Asp；Xaa29是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、Glu、Asp或Lys；Xaa30是Arg、His、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Glu、Asp或Lys；以及Xaa31是Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Trp、Tyr、Phe、His、Glu、Asp、Lys。
另一组优选的GLP-1肽、变体或衍生物示例于SEQ ID NO 6：His-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Ser-Xaa12-Tyr-Xaa14-Glu-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30，其中Xaa2是Ala、Gly或Ser；Xaa3是Glu或Asp；Xaa6是Phe或Tyr；Xaa7是Thr或Asn；Xaa8是Ser、Thr或Ala；Xaa9是Asp或Glu；Xaa10是Val、Leu、Met或Ile；Xaa12是Ser或Lys；Xaa14是Leu、Ala或Met；Xaa16是Gly、Ala、Glu或Asp；Xaa17是Gln或Glu；Xaa18是Ala或Lys；Xaa19是Ala、Val、Ile、Leu或Met；Xaa21是Glu或Leu；Xaa23是Ile、Ala、Val、Leu或Glu；Xaa27是Val或Lys；Xaa28是Lys或Asn；而Xaa30是Arg或Glu。
这些肽可通过已公开和/或本领域已知的方法制备。序列中(以及在整个说明书中，除非在特定情况下另有说明)的Xaa包括特定氨基酸残基、衍生物或其修饰的氨基酸。因为酶二肽基-肽酶FV(DPP-IV)可能是导致所观察到的给予GLP-1在体内快速失活的原因，所以优选在激动剂或模拟体背景下受保护免遭DPP-IV活性的GLP-1肽、同源物、类似物和衍生物。
部分地或优选基本上提供至少一种GLP-1生物活性的GLP-1激动剂或模拟体或其特定部分或变体，可结合GLP-1配体，由此提供至少一种活性，否则该活性是由GLP-1与至少一种配体如GLP-1受体结合或其它蛋白质依赖或介导的机制所介导的。此处所用的术语“GLP-1激动剂或模拟体活性”指GLP-1激动剂或模拟体，取决于测定，其可以以约20-10,000％、优选至少约60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000％或以上调节或引起至少一种GLP-1依赖性活性。
GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体提供至少一种蛋白质依赖性活性的能力优选地通过本文所述和/或本领域已知的至少一种合适的蛋白质生物测定来评价。本发明的人GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可与任何类(IgG、IgA、IgM等)或同种型相似，并可包含至少一部分K或λ轻链。在一个实施方案中，人GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体包含至少一种同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的IgG重链可变区片段、铰链区、CH2和CH3。
至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体结合至少一种配体、亚单位、片段、部分或其任何组合。至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体的至少一种GLP-1肽、变体或衍生物任选地可结合该配体的至少一个特定表位。该结合表位可包含蛋白配体(例如GLP-1受体或其部分)序列连续氨基酸的至少1-3个氨基酸至完整指定部分的至少一种氨基酸序列的任何组合。
这种模拟体可通过下述方法制备：采用已知技术将GLP-1激动剂或模拟体的式(I)不同部分连接在一起；采用已知的重组DNA技术或使用其它任何合适方法，例如化学合成法，制备并表达编码GLP-1激动剂或模拟体的至少一种核酸分子。
采用本领域已知的合适方法，例如噬菌体展示(Katsube，Y等，Int JMol Med，1(5)863-868(1998))或使用转基因动物的方法，可制备与人GLP-1配体(例如受体)结合并包含限定重链或轻链可变区或其部分的模拟体。GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或变体可利用编码核酸或其部分在合适宿主细胞中表达。
本发明还涉及含有与本文所述氨基酸序列基本相同的序列中氨基酸的模拟体、配体结合片段和免疫球蛋白链。优选地，该模拟体或其配体结合片段可以高亲和性(例如小于或等于约10-7M的KD)结合人GLP-1配体，例如受体。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括含保守氨基酸置换以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置换指第一个氨基酸被具有与所述第一个氨基酸相似化学和/或物理特性(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二个氨基酸置换。保守置换包括在以下组别内一种氨基酸被另一种置换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)、F、W和Y；C、S和T。
氨基酸密码。组成本发明模拟体或特定部分或变体的氨基酸通常被缩写。通过由本领域熟知的氨基酸单字母代码、三字母代码、名称或三个核苷酸的密码子标明该氨基酸，可表示该氨基酸名称(参见Alberts，B等，Molecular Biology of The Cell，第3版，GarlandPublishing，Inc，New York，1994)。
本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可包括本文特指的来源于自然突变或人为操作的一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。可用于本发明的这种序列或其它序列包括但不限于以下在SEQ ID NO 47-64中提出的序列。
当然，技术人员应根据包括上述因素在内的许多因素来确定氨基酸置换的数量。一般来说，按照本文的说明，对至少一种GLP-1激动剂或模拟体的氨基酸置换、插入或缺失的数量不应超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸，例如1-30或其中的任何范围或数值。
在本发明式I((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t))中，式I的V、H、CH2和CH3部分可为任何合适的人或人相容的序列，例如图1-18和表1提供的序列，或本领域已知的序列，或其任何组合或共有序列，或其任何融合蛋白，优选为人源的，或进行改造，以在给予人时使免疫原性最小。
P部分可包含本领域已知或本文描述的至少一种GLP-1治疗性肽，例如但不限于SEQ ID NO 1提供的肽或其任何组合或共有序列或其任何融合蛋白。在一个优选实施方案中，P部分可包含至少一种GLP-1肽，其具有SEQ ID NO 6中至少一个的序列或其任何组合或共有序列或其任何融合蛋白。
任选的接头序列可为本领域已知的任何合适肽接头。优选序列包括G和S的任何组合，例如X1-X2-X3-X4--Xn，其中X可为G或S，n可为5-30。非限制性实例包括GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO16)、GSGGGS(SEQ ID NO 17)、GGSGGGS(SEQ ID NO 18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO 19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO 20)等。
在本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体中对功能而言必不可少的氨基酸可通过本领域已知方法鉴定，例如定点诱变或丙氛酸扫描诱变(例如上述Ausubel，8、15章；Cunningham和Wells，Science 244 1081-1085(1989))。后一方法在分子中的每一个残基上均导入单丙氨酸突变。随后，检验所获突变分子的生物活性，例如但不限于本文指出或本领域已知的至少一种蛋白质相关活性。对GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体结合关键的位点也可通过例如结晶、核磁共振或光亲和标记的结构分析法来鉴定(Smith等，J Mol Biol224：899-904(1992)和de Vos等，Science 255.306-312(1992))。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含式(I)的P部分，例如但不仅限于SEQ ID NO 1和6中至少一个的至少一部分。GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体任选地还可包含为式(I)P部分的至少一种多肽的至少一个功能部分，SEQ ID NO 1和6中至少一个的至少90-100％。可增强或保持至少一种上述活性的非限制性变体包括但不限于任一上述多肽，该多肽还包含至少一种突变，该突变与不显著影响所述GLP-1激动剂或模拟体的合适生物活性或功能的至少一个置换、插入或缺失相对应。
在一个实施方案中，P氨基酸序列或其部分与SEQ ID NO 1和6中至少一个的相应部分的相应氨基酸序列具有约90-100％同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或数值)。优选地，利用本领域已知的合适计算机算法确定90-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或数值)。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含来源于本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的任何数量的连续氨基酸残基，其中该数量选自GLP-1激动剂或模拟体中连续残基数的10-100％组成的整数。任选地，此连续氨基酸的子序列在长度上为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多个氨基酸，或为其中任何范围或数值的氨基酸。此外，该子序列的数量可为选自1-20的任何整数，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数。
技术人员应理解的是，本发明包括本发明的至少一种生物活性GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。生物活性模拟体或特定部分或变体具有的特定活性为天然(非合成)、内源或相关和已知的插入或融合蛋白或特定部分或变体的活性的至少20％、30％或40％，优选为至少50％、60％或70％，最优选为至少80％、90％或95％-100％。测定并定量检测酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员熟知的。
另一方面，本发明涉及本文所述通过共价连接有机部分而被修饰的人模拟体和配体结合片段。这种修饰可产生具有改良药代动力学特性(例如延长的体内血清半衰期)的GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片段。有机部分可以是线性或分支亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体实施方案中，亲水聚合基团可具有约800至约120,000道尔顿的分子量，可为聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、糖聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
本发明的修饰模拟体和配体结合片段可包含一个或多个与GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体直接或间接地共价键合的有机部分。与本发明GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片段键合的各有机部分均可独立为亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。本文所用的术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。本文所用的术语“亲水聚合基团”指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本发明包括通过共价附着聚赖氨酸而得以修饰的GLP-1激动剂或模拟体。适于修饰本发明模拟体的亲水聚合物可为线性的或分支的，包括例知聚链烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、糖类(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧烷(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明GLP-1激动剂或模拟体的亲水聚合物作为单独分子实体时具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如，可采用PEG2500、PEG5000、PEG7000、PEG9000、PEG10000、PEG12500、PEG15000和PEG20000，其中下标为该聚合物的道尔顿平均分子量。
亲水聚合基团可被1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可通过应用合适的方法制备。例如，包含胺基团的聚合物可被偶联至脂肪酸或脂肪酸酯的羧化物，而脂肪酸或脂肪酸酯上的活性羧化物(例如经由N，N-羰基二咪唑活化)可被偶联至聚合物上的羟基基团。
适于修饰本发明模拟体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可含有一个或多个不饱和单位。适于修饰本发明模拟体的脂肪酸包括例如n-十二烷酸(C12，月桂酸)、n-十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、n-十八烷酸(C18，硬脂酸)、n-二十烷酸(C20，花生酸)、n-二十二烷酸(C22，山嵛酸)、n-三十烷酸(C30)、n-四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、全顺式-Δ5，8，11，14-二十烷四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含线性或分支低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可包含1个至约12个、优选1个至约6个碳原子。
修饰的人模拟体和配体结合片段可采用合适方法制备，例如通过与一种或多种修饰剂反应。本文所用的术语“修饰剂”指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”指一种化学部分或官能团，其可在适当条件下与第二化学基团反应，从而在修饰剂与第二化学基团之间形成共价健。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-巯基-2-硝基硫代苯甲酸(TNB-硫醇)等。醛官能团可被偶联至含有胺或酰肼的分子上，且叠氮基团可与三价磷基团反应，形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团导入分子中的合适方法是本领域已知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press San Diego，CA(1996))。活化基团可直接地或通过接头部分如二价C1-C12基团(其中一个或多个碳原子可被例如氧、氮或硫的杂原子取代)键合至有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。合适的接头部分包括例如四乙二醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含接头部分的修饰剂例如可如下产生：在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)存在下使单-Boc-烷基二胺(例如单Boc-乙烯二胺、单Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，以在游离胺与脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键。可如下除去产物中的Boc保护基：用三氟乙酸(TFA)处理，以暴露可与所述另一羧酸酯偶联或可与马来酸酐反应的伯胺，并使所获产物环化，以生成该脂肪酸的活化马来酰亚胺衍生物(参见例如Thompson等，WO 92/16221，其通过引用整体结合到本文中)。
本发明的修饰模拟体可通过使人GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片段与修饰剂反应而得以生成。例如，通过应用胺反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，可以非位点特异性方式将有机部分键合至GLP-1激动剂或模拟体。修饰的人模拟体或配体结合片段也可通过还原GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片段的二硫键(例如链内二硫键)来制备。随后，可使还原的GLP-1激动剂或模拟体或配体结合片段与硫醇反应性修饰剂反应，以产生本发明的修饰GLP-1激动剂或模拟体。采用合适方法，例如反向蛋白水解(Fisch等，BioconjugateChem，3 147-153(1992)，Werlen等，Bioconjugate Chem，5 411-417(1994)，Kumaran等，Protein Sci 6(10)2233-2241(1997)，Itoh等，BioorgChem.，24(1)59-68(1996)，Capellas等，Biotechnol Bioeng，56(4)：456-463(1997))和Hermanson，G T，Bioconjugate Techniques，AcademicPress：San Diego，CA(1996)中所描述的方法，可制备含有机部分的修饰人模拟体和配体结合片段，其中所述有机部分键合至本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的特定位点。
GLP-1模拟体组合物。本发明还提供至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物，其包含本文所述和/或本领域已知的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种模拟体或其特定部分或变体，它们以非天然组合物、混合物或形态提供。这种组合物的百分率以重量、体积、浓度、摩尔浓度来计，或以本领域所知或本文所述的液体或无水溶液、混合物、悬液、乳剂或胶体的摩尔浓度来计。
以重量、体积、浓度、摩尔浓度或本领域所知或本文所述的液体、气体或无水溶液、混合物、悬液、乳剂或胶体的摩尔浓度计，该组合物可包含0.00001-99.9999％或其中的任何范围或数值，例如但不限于0.00001、0.00003、0.00005、0.00009、0.0001、0.0003、0.0005、0.0009、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。因此，本发明的这种组合物包括但不限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。
本发明提供至少一种GLP-1模拟体组合物，其在以治疗有效量给予时促进胰岛分化、增加β-细胞量和/或增加胰岛素分泌，以及减少胰岛和/或产胰岛素细胞的凋亡、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排空和减少食物摄取。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体组合物，其在以治疗有效剂量给予时在变成糖尿病的高风险个体中延迟糖尿病发作或预防糖尿病。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体组合物，其在以治疗有效剂量给予时调节或治疗由于各种代谢障碍引起的高血糖。本发明还提供至少一种GLP-1模拟体组合物，其在以治疗有效剂量给予时调节或治疗由于疾病或障碍引起的至少一种胰腺机能失调，所述疾病或障碍包括但不限于糖尿病、胰腺炎、胰腺肿瘤、胰腺癌和相关病症。
GLP-1模拟体组合物任选地还可包括有效量的至少一种化合物或蛋白质，其选自以下的至少一种：糖尿病药物、胰岛素代谢相关药物、葡萄糖代谢相关药物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部药物、营养药物等。这种药物均是本领域熟知的，包括本文所列各药物的配方、适应症、剂量和给予(参见例如Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001，Health Professional′sDrug Guide 2001，Shannon，Wilson，Stang编辑，Prentice-Hall，Inc，UpperSaddle River，NJ，Pharmcotherapy Handbook，Wells等编辑，Appleton &Lange，Stamford，CT，各个文献均通过引用整体结合到本文中)。
糖尿病相关药物可为以下的至少一种：格列酮、胰岛素和衍生物、磺酰脲、米格列奈、双胍、α-葡糖苷酶抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、糖原合酶激酶3、糖原异生抑制剂、丙酮酸脱氢酶激酶(PDH)抑制剂、脂解抑制剂、脂肪氧化抑制剂、肉毒碱棕榈酰转移酶I和/或II抑制剂、β-3肾上腺素受体激动剂、钠和葡萄糖共转运体(SGLT)抑制剂或对以下的一种或多种起作用的化合物：T细胞的至少一种自身免疫抑制、免疫调节、活化、增殖、迁移和/或抑制细胞功能、抑制T细胞受体/肽/MHC-II相互作用、诱导T细胞无反应性、缺失自反应性T细胞、减少穿过血脑屏障的运输、改变促炎细胞因子(Th1)和免疫调节细胞因子(Th2)的平衡、抑制基质金属蛋白酶抑制剂、神经保护、减少神经胶质增生、促进髓鞘再生成。
抗感染药物可为选自以下的至少一种：杀阿米巴药或抗原生动物药、驱肠虫药、抗真菌药、抗疟药、抗结核药或抗麻风药、氨基糖苷类药、青霉素、头孢菌素、四环素、磺胺、氟喹诺酮、抗病毒药、大环内酯抗感染药和其它抗感染药。CV药物可为选自以下的至少一种：变力性药、抗心律不齐药、防心绞痛药、抗高血压药、抗血脂药和其它心血管药物。CNS药物可为选自非麻醉性镇痛药中的至少一种或选自以下的至少一种：退热剂、非类固醇抗炎药、麻醉药或阿片样镇痛药、镇静-催眠药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗焦虑药、抗精神病药、中枢神经系统刺激剂、抗帕金森病药和其它中枢神经系统药物。ANS药物可为选自以下的至少一种：胆碱能药物(拟副交感神经药)、抗胆碱能药、肾上腺素能药(拟交感神经药)、肾上腺素能阻断剂(抗交感神经药)、骨骼肌松弛药和神经肌肉阻断剂。呼吸道药物可为选自以下的至少一种：抗组胺剂、支气管舒张药、祛痰剂或镇咳药和其它呼吸药物。GI道药物可为选自以下的至少一种：抗酸剂、吸附剂、抗气胀药、消化酶、胆结石增溶剂、止泻药、缓泻药、止吐剂和抗溃疡药。激素药物可为选自以下的至少一种：皮质类固醇、雄激素、促蛋白合成类固醇、雌激素、孕酮、促性腺激素、抗糖尿病药物、至少一种胰高血糖素、甲状腺激素、甲状腺激素拮抗剂、垂体激素和类甲状旁腺药物。用于体液和电解液平衡的药物可为选自以下的至少一种：利尿剂、电解质、置换溶液、酸化剂或碱化剂。血液药物可为选自以下的至少一种：补血药、抗凝血药、血液衍生物和溶栓酶。抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：烷基化药物、抗代谢物、抗菌素抗肿瘤药物、可改变激素平衡的抗肿瘤药物和其它抗肿瘤药物。免疫调节药物可为选自以下的至少一种：免疫抑制剂、疫苗、类毒素、抗毒素、抗蛇毒素、免疫血清和生物反应调节物。眼、耳和鼻用药可为选自以下的至少一种：眼科抗感染药、眼科抗炎症药、缩瞳药、扩瞳药、眼部血管收缩剂和其它眼、耳、鼻用药。局部用药可为选自以下的至少一种：局部抗感染药、抗疥螨剂、抗虱剂和局部皮质类固醇。营养药可为选自以下的至少一种：维生素、矿物质和热质。参见例如上述Nursing 2001 DrugHandbook中的内容。
至少一种杀阿米巴药或抗原生动物药可为选自以下的至少一种：阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝基羟乙唑、盐酸甲硝基羟乙唑、戊烷脒羟乙基磺酸盐。至少一种驱肠虫药可为选自以下的至少一种：甲苯咪唑、双羟萘酸喹嘧啶、噻苯咪唑。至少一种抗真菌剂可为选自以下的至少一种：两性霉素B、两性霉素B胆固醇基硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、微小尺寸灰黄霉素、超微小尺寸灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素、盐酸特比萘芬。至少一种抗疟药可为选自以下的至少一种：盐酸氯喹、磷酸氯喹、强力霉素、硫酸羟化氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、息疟定、含周效磺胺的息疟定。至少一种抗结核药或抗麻风药可为选自以下的至少一种：氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷汀、硫酸链霉素。至少一种氨基糖苷类药物可为选自以下的至少一种：硫酸卡那霉素、硫酸艮他霉素、硫酸新霉素、硫酸链霉素、硫酸妥布霉素。至少一种青霉素可为选自以下的至少一种：阿莫西林/棒酸钾、三水合阿莫西林、氨苄西林、氨苄西林钠、三水合氨苄西林、氨苄西林钠/舒巴坦钠、氯唑西林钠、双氯西林钠、美洛西林钠、萘夫西林钠、苯唑西林钠、苄星青霉素G、青霉素G钾、青霉素G普普卡因、青霉素G钠、青霉素V钾、哌拉西林钠、哌拉西林钠/他唑巴坦钠、替卡西林二钠、替卡西林二钠/棒酸钾。至少一种头孢菌素可为选自以下的至少一种：头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢唑林钠、头孢地尼、盐酸头孢吡肟、头孢克肟、头孢美唑钠、头孢尼西钠、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢替坦二钠、头孢西丁钠、头孢泊肟普塞酯、头孢丙烯、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟钠、头孢曲松钠、头孢呋辛醋氧乙酯、头孢呋辛钠、盐酸头孢氨苄、一水合头孢氨苄、头孢拉定、氯碳头孢。上述至少一种四环素可为选自以下的至少一种：盐酸地美环素、强力霉素钙、盐酸多西环素(doxycycline hyclate)、盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride)、一水合强力霉素、盐酸米诺环素、盐酸四环素。至少一种磺胺可为选自以下的至少一种：增效磺胺甲基异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺乙酰异噁唑。至少一种氟喹诺酮可为选自以下的至少一种：甲磺酸阿拉曲伐沙星、环丙沙星、依诺沙星、左氧呋沙星、盐酸洛美沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、司帕沙星、甲磺酸曲伐沙星。至少一种抗病毒药物可为选自以下的至少一种：硫酸阿巴卡韦、无环鸟苷钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉维定、去羟肌苷、依非韦伦、泛昔洛韦、福米韦生钠、磷甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米呋啶、拉米呋啶/齐多呋啶、甲磺酸奈非那韦、内维拉平、磷酸奥司他韦、三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那维、甲磺酸沙奎那维、司他呋啶、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎纳米韦、齐多呋啶。至少一种大环内酯抗感染药可为选自以下的至少一种：阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素基质、无味红霉素、琥珀酸乙酰红霉素、乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素。至少一种其它抗感染药可为选自以下的至少一种：氨曲南、杆菌肽、琥珀酸钠氯霉素、盐酸氯洁霉素、盐酸氯洁霉素棕榈酸酯、氯洁霉素磷酸酯、亚胺培南和西司他丁钠、美罗培南、呋喃妥因大晶体、呋喃妥因微晶体、奎奴普丁/达福普汀、盐酸壮观霉素、三甲氧苄二氨嘧啶、盐酸万古霉素。(参见例如Nursing2001 Drug Handbook中的24-214页)。
至少一种变力性药物可为选自以下的至少一种：乳酸氨联吡啶酮、地高辛、乳酸米立农。至少一种抗心律失常药可为选自以下的至少一种：腺苷、盐酸乙胺碘呋酮、硫酸阿托品、甲苯磺酸溴苄胺、盐酸硫氮酮、双异丙吡胺、磷酸双异丙吡胺、盐酸艾司洛尔、乙酸哌氟酰胺、富马酸伊布利特、盐酸利多卡因、盐酸麦西雷丁、盐酸莫雷西嗪、苯妥英、苯妥英钠、盐酸普普卡因胺、盐酸普罗帕酮、盐酸普奈洛尔、酸式硫酸奎尼定、葡糖酸奎尼定、聚半乳糖醛酸奎尼定、硫酸奎尼定、梭达罗、盐酸妥卡尼、盐酸异搏定。至少一种防心绞痛药可为选自以下的至少一种：苯磺酸氨氯地平、亚硝酸戊酯、盐酸苄普地尔、盐酸硫氮酮、二硝酸异山梨醇酯、一硝酸异山梨醇酯、萘情心安、盐酸尼卡地平、硝苯吡啶、硝酸甘油、盐酸心得安、异搏定、盐酸异搏定。至少一种抗高血压药可为选自以下的至少一种：盐酸酯丁酰心安、苯磺酸阿姆罗赫、氨酰心安、盐酸贝那普利、盐酸贝他洛尔、富马酸比索洛尔、坎地沙坦酯、卡托普利、盐酸山羊豆苷、卡维地洛、可乐宁、盐酸可乐宁、二氮嗪、盐酸硫氮酮、甲磺酸多沙唑嗪、依那普利拉、马来酸依那普利、甲磺酸依普罗沙坦、非洛地平、甲磺酸非诺多泮、福辛普利钠、醋酸氯压胍、硫酸胍那决尔、盐酸谷氨法新、盐酸肼苯哒嗪、厄贝沙坦、伊拉地平、盐酸柳胺苄心定、赖诺普利、氯沙坦钾、甲基多巴、盐酸甲基多巴盐、琥珀酸美多心安、酒石酸美多心安、长压定、盐酸莫昔普利、萘羟心安、盐酸尼卡地平、硝峭吡啶、乳链菌肽、硝普盐钠、硫酸环戊丁心安、培哚普利、甲磺酸芬托拉明、心得静、盐酸哌唑嗪、盐酸普奈洛尔、盐酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、盐酸特拉唑嗪、马来酸噻吗心安、群多普利、缬沙坦、盐酸异搏定。至少一种抗血脂药可为选有以下的至少一种：阿托伐他汀钙、西立伐他汀钠、胆苯烯胺、盐酸考来替泊、非诺贝特(微粉化)、氟伐他丁钠、吉非贝齐、洛伐他汀、烟酸、普伐他汀钠、辛伐他汀。至少一种综合性CV药物可为选自以下的至少一种：阿昔单抗、前列地尔、盐酸阿布他明、西洛他唑、二硫酸氯吡格雷、双嘧啶胺醇、埃替非巴肽、盐酸甲氧胺福林、己酮可可碱、盐酸噻嗪氯匹定、盐酸替罗非班。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的215-336页)。
至少一种非麻醉性镇痛药或退热剂可为选自以下的至少一种：醋氨酚、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟苯水杨酸、水杨酸酶。至少一种非甾族抗炎药可为选自以下的至少一种：塞来昔布、环氟拉嗪钾、环氟拉嗪钠、伊托多雷、苯氧苯丙酸钙、氟联苯丙酸、异丁苯丙酸、茚甲新、三水合茚甲新钠、酮丙酸、酮咯酸氨丁三醇、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、丙嗪、吡氧噻嗪、罗非昔布、舒林酸。至少一种麻醉药或阿片样镇痛药可为选自以下的至少一种：盐酸阿芬太尼、盐酸丁丙诺啡、酒石酸布托啡诺、磷酸可待因、硫酸可待因、枸橼酸芬太尼、芬太尼透皮系统、芬太尼经粘膜、盐酸二氢吗啡酮、度冷丁、盐酸美沙酮、盐酸吗啡、硫酸吗啡、酒石酸吗啡、盐酸环丁甲羟氢吗啡、盐酸羟基二氢可待因酮、梳状1，4-羟基二氢可待因酮、盐酸氧吗啡酮、盐酸镇痛新、盐酸镇痛新和盐酸纳络酮、乳酸镇痛新、盐酸丙氧吩、萘磺酸丙氧吩、盐酸瑞芬太尼、柠檬酸舒芬太尼、盐酸曲马多。至少一种镇痛药-催眠药可为选自以下的至少一种：水合氯醛、三唑氮、盐酸氟胺安定、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、双香豆素、三唑苯二氮、扎莱普隆、酒石酸唑吡坦。至少一种抗惊厥药可为选自以下的至少一种：醋唑磺胺钠、卡马西平、氯硝安定、氯氮二钾、安定、双丙戊酸钠、乙琥胺、磷苯妥英钠、加巴喷丁、拉莫三嗪、硫酸镁、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯妥英、苯妥英钠、苯妥英钠(稀释)、普里米酮、盐酸替加宾、托吡酯、丙戊酸钠、丙戊酸。至少一种抗抑郁药可为选自以下的至少一种：盐酸阿米替林、双羟萘酸阿米替林、氯哌氧、盐酸丁氨苯丙酮、氢溴酸西酞普兰、盐酸氯米帕明、盐酸脱甲丙咪嗪、盐酸多虑平、盐酸氟西汀、盐酸丙咪嗪、双羟萘酸丙咪嗪、米氮平、盐酸奈法唑酮、盐酸去甲替林、盐酸帕罗西汀、硫酸苯乙肼、盐酸舍曲林、硫酸反苯环丙胺、马来酸三甲丙咪嗪、盐酸万拉法新。至少一种抗焦虑药可为选自以下的至少一种：阿普唑仑、盐酸丁螺旋酮、甲氨二氮、盐酸甲氨二氮、氯氮二钾、安定、盐酸多虑平、双羟萘酸羟嗪、盐酸羟嗪、双羟萘酸羟嗪、氯羟安定、甲丙氨酯、盐酸咪达唑仑、去甲羟安定。至少一种抗精神病药可为选自以下的至少一种：盐酸氯丙嗪、氯氮平、癸酸氟非那嗪、庚酸氟非那嗪、盐酸氟非那嗪、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、盐酸克塞平、琥珀酸克塞平、苯磺酸甲砜哒嗪、盐酸莫林酮、奥氮平、奋乃静、哌迷清、普鲁氯嗪、富马酸喹硫平、利培酮、盐酸甲硫哒嗪、氨砜噻吨、盐酸氨砜噻吨、盐酸三氟啦嗪。至少一种中枢神经系统刺激剂可为选自以下的至少一种：硫酸安非他明、咖啡碱、硫酸右旋安非他明、盐酸吗吡啉酮、盐酸脱氧麻黄碱、盐酸利他林、莫达非尼、佩默林、盐酸苯丁胺。至少一种抗帕金森病药可为选自以下的至少一种：盐酸金刚胺、甲磺酸苯托品、盐酸比哌立登、乳酸比哌立登、甲磺酸溴麦角环肽、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、左旋多巴、甲磺酸培高利特、二盐酸普拉克索、盐酸罗匹尼罗、盐酸司来吉兰、托卡朋、盐酸三己芬迪。至少一种其它中枢神经系统药物可为选自以下的至少一种：盐酸丁氨苯丙酮、盐酸多奈哌齐、达哌啶醇、马来酸氟伏沙明、碳酸锂、柠檬酸锂、盐酸纳雷曲坦、甲基丙烯酸烟碱、烟碱透皮系统、异丙酚、苯甲酸利扎曲普坦、盐酸西布曲明、琥珀酸舒马普坦、盐酸塔克林、佐米曲普坦。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的337-530页)。
至少一种胆碱能药(例如拟副交感神经药)可为选自以下的至少一种：氯化氨甲酰甲胆碱、氯化膝西隆、溴化新斯的明、甲基硫酸新斯的明、水杨酸毒扁豆碱、溴化3-二甲氨基甲酰氧基-1-甲基吡啶。至少一种抗胆碱能药可为选自以下的至少一种：硫酸阿托品、盐酸双环胺、胃长宁、茛菪碱、硫酸茛菪碱、溴化丙胺太林、东茛菪碱、丁基溴化东茛菪碱、氢溴化东茛菪碱。至少一种肾上腺素能药(拟交感神经药)可为选自以下的至少一种：盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、酸式酒石酸间羟胺、酸式酒石酸去甲肾上腺素、盐酸苯肾上腺素、盐酸假麻黄碱、硫酸假麻黄碱。至少一种肾上腺素能阻断剂(抗交感神经药)可为选自以下的至少一种：甲磺酸双氢麦角胺、酒石酸麦角胺、马来酸二甲麦角新碱、盐酸普奈洛尔。至少一种骨骼肌松弛剂可为选自以下的至少一种：氯苯氮丁酸、肌安宁、氯羟苯唑、盐酸环苯扎林、硝苯呋海因钠、氨甲酸愈甘醚酣、盐酸替扎尼定。至少一种神经肌肉阻断剂可为选自以下的至少一种：苯磺酸阿曲库铵、苯磺酸顺阿曲库铵、多库氯铵、米库氯铵、泮库溴铵、哌库溴铵、雷库溴铵、罗库溴铵、氯琥珀胆碱、氯化筒箭毒碱、维库溴铵。(参见例如Nuring 2001 Drug Handbook中的531-84页)。
至少一种抗组胺剂可为选自以下的至少一种：马来酸溴苯吡胺、盐酸西替利嗪、马来酸氯苯吡胺、富马酸铁线莲亭、盐酸二苯环庚啶、盐酸苯海拉明、盐酸非索非那定、氯雷他定、盐酸异丙嗪、茶异丙嗪、盐酸丙吡咯啶。至少一种支气管扩张药可为选自以下的至少一种：舒喘宁、硫酸舒喘宁、氨茶碱、硫酸阿托品、硫酸麻黄碱、肾上腺素、酒石酸氢肾上腺素、盐酸肾上腺素、异丙托溴铵、异丙基肾上腺素、盐酸异丙基肾上腺素、硫酸异丙基肾上腺素、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸异丙喘宁、胆茶碱、醋酸吡布特罗、羟萘甲酸沙美特罗、硫酸特普他林、茶碱。至少一种祛痰剂或镇咳药可为选自以下的至少一种：退咳露、磷酸可待因、硫酸可待因、氢溴酸右美沙芬、盐酸苯海拉明、愈创木酚甘油醚、盐酸二氢吗啡酮。至少一种其它呼吸药物可为选自以下的至少一种：乙酸半胱氨酸、二丙酸氯地米松、贝雷克坦、布地奈德、小牛表面蛋白(calfactant)、色甘酸钠、链道酶α、前列腺环素钠、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、孟鲁司特钠、奈多罗米钠、帕利珠单抗、丙炎松、扎鲁司特、齐留通。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的585-642页)。
至少一种抗酸剂、吸附剂或抗气胀药可为选自以下的至少一种：碳酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁铝、氮氧化镁、氧化镁、二甲基硅油、碳酸氢钠。至少一种消化酶或胆结石增溶剂可为选自以下的至少一种：胰酶、胰脂肪酶、脱氧熊胆酸。至少一种止泻药可为选自以下的至少一种：硅镁土、碱式水杨酸铋、聚卡波非钙、盐酸氰苯哌酯或硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奥曲肽、阿片酊、阿片酊(含樟脑)。至少一种缓泻药可为选自以下的至少一种：比沙可啶、钙聚丙烯酸树脂、鼠李、鼠李芳香流浸膏、鼠李流浸膏、蓖麻油、琥珀辛酯磺酸钙、琥珀辛酯磺酸钠、甘油、乳果糖、柠檬酸镁、氢氧化镁、硫酸镁、甲基纤维素、矿物油、聚乙二醇或电解质溶液、欧车前、番泻叶、磷酸钠。至少一种止吐剂可为选自以下的至少一种：盐酸氯丙嗪、萘苯海明、多拉司琼甲磺酸盐、屈大麻酚、盐酸格雷西隆、盐酸氛苯苄嗪、甲氧氯普胺盐酸、盐酸奥丹西隆、奋乃静、甲哌氯丙嗪、乙二磺酸甲哌氯丙嗪、马来酸甲哌氯丙嗪、盐酸异丙嗪、东茛菪碱、马来酸硫乙哌丙嗪、盐酸曲美苄胺。至少一种抗溃疡药可为选自以下的至少一种：甲腈咪胍、盐酸甲腈咪胍、法莫替丁、达克普隆、迷索前列醇、尼扎替丁、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、雷尼替丁枸橼酸铋、盐酸雷尼替丁、硫糖铝。(参见例如Nursing 2001Drug Handbook的643-95页)。
至少一种皮质类固醇可为选自以下的至少一种：倍他米松、醋酸倍他米松或倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠、醋酸可的松、地塞米松、醋酸氟美松、地塞米松磷酸钠、醋酸氟氢可的松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、氮化可的松环戊丙酸酯、氢可松磷酯钠、氢化可的松琥珀酸钠、甲基强的松龙、醋酸甲基强的松龙、甲氢泼尼松龙琥珀酸钠、氢化泼尼松、醋酸氢化泼尼松、氮化泼尼松磷酸钠、强的松龙叔丁乙酯、强的松、氟羟泊尼松龙、曲安奈德、双醋酸去炎松。至少一种雄激素或者促蛋白合成类固醇可为选自以下的至少一种：达那唑、氟羟甲睾酮、甲睾酮、癸酸诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、环戊丙酸睾酮、庚酸睾酮、丙酸睾酮、睾酮透皮体系。至少一种雌激素或孕酮可为选自以下的至少一种：酯化雌激素、雌二醇、环戊丙酸雌二醇、雌二醇/醋炔诺酮透皮体系、戊酸雌二醇、雌激素(缀合物)、哌嗪雌酮、乙炔雌二醇、乙炔雌二醇和炔雌醇、乙炔雌二醇和双醋炔诺醇、乙炔雌二醇和炔雌醇、乙炔雌二醇和双醋炔诺醇、乙炔雌二醇和左旋甲炔诺酮、乙炔雌二醇和炔诺酮、乙炔雌二醉和醋炔诺酮、乙炔雌二醇和炔肟酯、乙炔雌二醇和甲基炔诺酮、乙炔雌二醇和炔诺酮和醋酸盐和富马酸铁、左旋甲炔诺酮、醋酸甲羟孕酮、甲氢龙和诺炔酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、甲基炔诺酮、黄体酮。至少一种促性腺激素可为选自以下的至少一种：乙酸加尼瑞克、醋酸高纳瑞林、乙酸希司曲林、绝经促性素。至少一种抗糖尿病药或胰高血糖素可为选自以下的至少一种：阿卡波糖、氯磺丙脲、谷胱甘肽、格列甲嗪、胰高血糖素、优降糖、胰岛素、盐酸甲福明二甲双胍、米格列醇、演算吡咯列酮、瑞格列奈、马来酸罗格列酮、曲格列酮中。至少一种甲状腺激素可为选自以下的至少一种：左旋甲状腺素钠、碘甲腺氨酸钠、复方甲状腺素、干甲状腺粉。至少一种甲状腺激素拮抗剂可为选自以下的至少一种：甲疏咪唑、碘化钾、碘化钾(饱和溶液)、丙硫尿嘧啶、放射性碘(碘化钠131I)、浓碘溶液。至少一种垂体激素可为选自以下的至少一种：促肾上腺皮质激素、α1-24促肾上腺皮质激素、desmophressin acetate、乙酸亮脯利特、长效促肾上腺皮质激素、人蛋氨生长素、生长激素、加压素。至少一种类甲状旁腺药物可为选自以下的至少一种：骨化二醉、降钙素(人)、降钙素(鲑鱼)、钙三醇、二氢速甾醇、依替膦酸二钠。(参见例如Nursing2001 Drug Handbook中的696-796页)。
至少一种利尿剂可为选自以下的至少一种：乙酰唑胺、乙酰唑胺钠、盐酸氨氯吡脒、丁苯氧酸、氯噻酮、利尿酸钠、利尿酸、利尿磺胺、双氰氯噻嗪、茚磺笨酰胺、甘露醇、美拉托宗、安体舒通、托拉塞米、三氨苯蝶啶、脲。至少一种电解质或置换溶液可为选自以下的至少一种：乙酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、磷酸钙(二元)、磷酸钙(三元)、葡聚糖(高分子量)、葡聚糖(低分子量)、羟乙基淀粉、氯化镁、硫酸镁、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、Ringer氏注射液、Ringers氏注射液(乳酸化)、氯化钠。至少一种酸化剂或碱化剂可为选自以下的至少一种：碳酸氢钠、乳酸钠、氨基丁三醇。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的797-833页)。
至少一种补血药可为选自以下的至少一种：富马酸铁、葡萄糖酸铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁(干燥)、右旋糖酐铁、山梨醇铁、多糖-铁复合物、萄糖酸铁钠复合物。至少一种抗凝血剂可为选自以下的至少一种：阿地肝素钠、达肝素钠、达那肝素钠、依诺肝素钠、肝素钙、肝素钠、苄丙酮香豆素钠。至少一种血液衍生物可为选自以下的至少一种：白蛋白5％、白蛋白25％、抗血友病因子、抗抑制剂促凝剂复合物、抗凝血酶III(人)、IX因子(人)、IX因子复合物、血浆蛋白组分。至少一种溶血检药可为选自以下的至少一种：阿替普酶、阿尼链酶、瑞替普酶(重组)、链激酶、尿激酶。(参见例如Nursing2001 Drug Handbook中的834-66页)。
至少一种烷基化药物可为选自以下的至少一种：白消安、卡铂、卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺氯氨铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、环己亚硝脲、盐酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、盐酸苯丙氨酸氮芥、链脲霉素、替莫唑胺、硫替派。至少一种抗代谢物可为选自以下的至少一种：卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、羟基脲、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤钠、硫鸟嘌呤。至少一种抗生素抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：硫酸博莱霉素、放线菌素D、柠稼酸柔红霉素脂质体、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、丝裂霉素、戊糖苷、普卡霉素、戊柔比星。至少一种可改变激素平衡的抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：阿那曲唑、比卡鲁胺、雌二醇氮芥磷酸钠、依西美坦、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、来曲唑、乙酸亮脯利特、醋酸甲地孕酮、尼鲁米特、柠檬酸三苯氧胺、睾内脂、枸橼酸托瑞米芬。至少一种其它抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)(活体膀胱内)、氮烯咪胺、多烯紫衫醇、鬼臼乙叉苷、磷酸鬼臼乙叉苷、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、邻氯苯对氯苯二氯乙烷、盐酸米托蒽醌、紫衫醇、培加帕酶、卟吩姆钠、盐酸甲基下肼、利妥昔单抗、替尼泊苷、盐酸拓扑替康、曲妥珠单抗、全反维生素A酸、硫酸长春花碱、硫酸长春花新碱、酒石酸长春瑞宾。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的867-963页)。
上述至少一种免疫抑制剂可为选自以下的至少一种：硫唑嘌呤、巴利昔单抗、环孢素、达克珠单抗、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单抗-CD3、霉酚酸吗琳乙酯、盐酸霉酚酸吗琳乙酯、西罗莫司、他克莫司。上述至少一种疫苗或类毒素可为选自以下的至少一种：BCG疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附型)、白喉和破伤风类毒素和非细胞百日咳疫苗吸附型、白喉和破伤风类毒素和全细胞百日咳疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、甲型肝炎疫苗(灭活)、乙型肝炎疫苗(重组)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(纯化的表面抗原)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(亚病毒体或纯化的亚病毒体)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(全病毒体)、日本脑炎病毒疫苗(灭活)、Lyme氏疏螺旋体病疫苗(重组OspA)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(活疫苗)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(减毒活疫苗)、麻疹病毒疫苗(减毒活疫苗)、脑膜炎双球菌多糖菌苗、腮腺炎病毒疫苗(活疫苗)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多价疫苗)、脊髓灰质炎病毒疫苗疫苗(灭活)、脊髓灰质炎病毒疫苗(口服三联活疫苗)、狂犬病疫苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人类二倍体细胞)、风疹和腮膝炎病毒疫苗(活疫苗)、风疹病毒疫苗(减毒活疫苗)、破伤风类毒素(吸附型)、破伤风类毒素(液体)、伤寒疫苗(口服)、伤寒疫苗(肠胃外给予)、伤寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黄热病疫苗。至少一种抗毒素或抗蛇毒素可为选自以下的至少一种：黑寡妇蜘蛛抗蛇毒素、响尾蛇科抗蛇毒素(多价的)、白喉抗毒素(马)、金黄珊瑚蛇毒血清。至少一种免疫血清可为选自以下的至少一种：巨细胞病毒免疫球蛋白(静脉内)、乙型肝炎免疫球蛋白(人)、免疫球蛋白肌内、免疫球蛋白静脉内、狂犬病免疫球蛋白(人)、呼吸道合胞体病毒免疫球蛋白静脉内(人)、Rh0(D)免疫球蛋白(人)、Rh0(D)免疫球蛋白静脉内(人)、破伤风免疫球蛋白(人)、水痘-带状疱疹免疫球蛋白。至少一种生物反应调节物可为选自以下的至少一种：阿地流津、依泊艾汀α、非拉司汀、注射用乙酸格拉替雷、复合干扰素-1、干扰素α-2a(重组)、干扰素α-2b(重组)、干扰素β-1a、干扰素β-1b(重组)、干扰素γ-1b、盐酸左旋四咪唑、重组人白介素11、沙格司亭。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的964-1040页)。
至少一种眼科抗感染药可选自以下的至少一种：杆菌肽、氯霉素、盐酸环丙沙星、红霉素、硫酸艮他霉素、吡啶羧酶0.3％、硫酸多粘菌素B、磺胺醋酸钠10％、磺胺醋酸钠15％、磺胺醋酸钠30％、托普霉素、阿糖腺苷。上述至少一种眼科抗炎症药可为选自以下的至少一种：地塞米松、地塞米松磷酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠0.1％、氯甲龙、氟比洛芬钠、酮咯酸氨丁三醇、醋酸强的松龙(悬液)、强的松龙磷酸钠(溶液)。上述至少一种缩瞳剂可为选自以下的至少一种：氯乙酰胆碱、氯甲酰胆碱(眼内)、氨甲酰胆碱(局部)、依可琪酯、毛果芸香碱、盐酸毛果芸香碱、硝酸毛果芸香碱。至少一种扩瞳剂可为选自以下的至少一种：硫酸阿托品、盐酸环戊通、盐酸肾上腺素、硼酸肾上腺素、氢澳酸后马托品、盐酸苯肾上腺素、氢溴酸东莨菪碱、托品酰胺。至少一种眼血管收缩剂可为选自以下的至少一种：盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸四氢萘唑啉。至少一种其它眼药可为选自以下的至少一种：盐酸阿可乐定、盐酸倍他洛尔、酒石酸溴莫尼定、盐酸山羊豆苷、盐酸地匹福林、盐酸杜塞酰胺、富马酸依美斯汀、荧光素钠、延胡索酸甲哌噻庚酮、拉坦前列素、盐酸左布诺洛尔、盐酸美替卜拉格、氯化钠(高渗)、马来酸噻吗心安。至少一种耳用药可为选自以下的至少一种：硼酸、过氧化氢脲、氯霉素、油酸三乙醇胺多肽-冷凝液。至少一种鼻用药可为选自以下的至少一种：二丙酸氯地米松、布地奈德、硫酸麻黄碱、盐酸肾上腺素、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸苯肾上腺素、盐酸四氢萘唑啉、丙炎松、盐酸丁苄唑啉。(参见例如Nursing2001 Drug Handbook中的1041-97页)。
至少一种局部抗感染药可为选自以下的至少一种：无环鸟苷、两性霉素B、壬二酸乳脂、杆菌肽、硝酸布康唑、磷酸氯林肯霉素、克霉唑、硝酸益康唑、红霉素、硫酸艮他霉素、酮康唑、醋酸高磺胺、甲硝基羟乙唑(局部)、硝酸霉抗唑、莫匹罗星、盐酸萘替芬、硫酸新霉素、硝基糖腙、制霉菌素、磺胺嘧啶银、盐酸特比奈酚、特康唑、盐酸四环素、噻康唑、托萘酯。至少一种抗疥螨剂或抗虱剂可为选自以下的至少一种：克罗他米通、林丹、苄氯菊脂、除虫菊酯。至少一种局部皮质类固醇可为选自以下的至少一种：双丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯氟美松、丙缩羟强龙、去氧米松、地塞米松、地塞米松磷酸钠、双醋二氟松、丙酮肤轻松、氟新诺龙酯、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、氯氟松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、戊酸氢化可的松、糠酸莫美他松、丙炎松。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook中的1098-1136页)。
上述至少一种维生素或矿物质可为选自以下的至少一种：维生素A、复合维生素B、氰钴胺素、叶酸、氰钴胺素、甲酰四氢叶酸钙、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素C、维生素D、胆钙化醇、麦角钙化醇、维生素D类似物、度骨化醇、帕利骨化醇、维生素E、维生素K类似物、维生素K1、氟化钠、氟化钠(局部)、痕量元素、铬、铜、碘、锰、硒、锌。至少一种热质可为选自以下的至少一种：氨基酸浸剂(晶状)、右旋糖中的氨基酸浸剂、含电解质的氨基酸浸剂、右旋糖中含电解质的氨基酸浸剂、针对肝衰竭的氨基酸浸剂、针对高代谢压力的氨基酸浸剂、针对肾衰竭的氨基酸浸剂、右旋糖、脂肪乳浊液、中链脂肪酸甘油三酯。(参见例如Nursing2001 Drug Handbook中的1137-63页)。
本发明还提供至少一种任何合适的和/或有效量的组合物或药物组合物，该组合物或药物组合物包含至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，任选地还包含有效量的至少一种其它化合物、蛋白或组合物，所述其它化合物、蛋白或组合物选自以下的至少一种：TNF拮抗剂(例如但不限于TNF化学或蛋白质拮抗剂、TNF单克隆或多克隆抗体或片段、可溶性TNF受体(例如p55、p70或p85)或片段、其融合多肽，或小分子TNF拮抗剂，例如TNF结合蛋白I或II(TBP-I或TBP-II)、奈瑞莫单抗、英利昔单抗、依那西普、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗、来那西普等)、抗风湿药(例如氨甲蝶呤、醋硫葡金、金硫代葡萄糖、硝基咪唑硫嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药物、氨基甲酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醉、糖尿病相关药物、矿物质、营养物质、甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如epoetin α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节物、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷基化药物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链球菌DNA酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。所述细胞因子的非限制性实例包括但不限于IL-1至IL-23中的任一种。合适剂量是本领域熟知的。参见例如Wells等编辑，PharmacotherapyHandbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDRPharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，上述参考文献每个均通过引用整体结合到本文中。
这种组合物还可包括与至少一种本发明抗体或多肽缔合、结合、共同配制或共同给予的毒素分子。该毒素任选地可起选择性杀死病理细胞或组织的作用。该病理细胞可为癌细胞或其它细胞。这种毒素可为但不仅限于纯化或重组毒素或含毒素的至少一个功能性细胞毒素结构域的毒素片段，所述毒素例如选自以下的至少一种：蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或细菌毒素。术语毒素还包括由任何天然、突变或重组细菌或病毒所产生的内毒素和外毒素，所述任何天然、突变或重组细菌或病毒可在人类和其它哺乳动物中引起包括中毒性休克在内的任何病理状况，并可导致死亡。这种毒素可包括但不限于：产肠毒素的大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺菌细胞毒素、气单胞菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、链球菌肠毒素等。这种细菌包括但不限于以下的菌株：产肠毒素大肠杆菌(ETEC)种、肠出血大肠杆菌(例如血清型0157：H7菌株)、葡萄球菌种(例如金黄色葡萄球菌、酿脓葡萄球菌)、志贺菌种(例如志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺杆菌、波伊德氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏杆菌)、沙门氏菌种(例如伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)、梭状芽胞杆菌种(例如产气荚膜梭状芽孢杆菌、艰难杆菌、肉毒杆菌)、弯曲杆菌种(例如空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆菌种(例如幽门螺杆菌)、气单胞菌种(例如温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类志贺邻单胞菌、小肠结肠炎椰尔森菌、弧菌种(例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌)、克雷白杆菌种、铜绿假单胞菌和链球菌。参见例如Stein编辑，INTERNAL MEDICINE，第3版，1-13页，Little，Brown and Co，Boston，(1990)，Evans等编辑，Bacterial Infections of HumansEpidemiology and Control，第2版，239-254页，Plenum Medical BookCo，New York(1991)，Mandell等，Principles and Practice of InfectiousDiseases，第3版，Churchill Livingstone，New York(1990)，Berkow等编辑，The Merck Manual，第16版，Merck and Co，Rahway，N J，1992；Wood等，FEMS Microbiology Immunology，76.121-134(1991)，Marrack等，Science，248 705-711(1990)，上述参考文献的内容通过引用整体结合到本文中。
本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物还可含有至少一种任何的合适助剂，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药物可接受助剂。这些无菌溶液的非限制性实例及制备方法均是本领域熟知的，例如但不限于Gennaro编辑，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。如本领域熟知的或本文所描述的，可以常规方法选择出与GLP-1激动剂或模拟体组合物的给予方式、溶解度和/或稳定性相容的药物可接受载体。
用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于：蛋白质、肽、氨基酸、脂质和糖类(例如糖、包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如醛醇、糖醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，它们可单独或组合存在，单独或组合地占1-99.99％的重量或体积。代表性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可发挥缓冲作用的代表性氨基酸/GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的糖类赋形剂包括例如单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。适用于本发明的优选糖类赋形剂为甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
GLP-1激动剂或模拟体组合物也可包括缓冲剂或pH调节剂，典型的缓冲剂是从有机酸或碱制得的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、盐酸三羟甲基甲烷或磷酸盐缓冲剂。适用于本发明组合物的优选缓冲剂为有机酸盐，例如柠檬酸盐。
另外，本发明的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物可包括聚合的赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(一种聚糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗菌剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，例如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适用于本发明GLP-1激动剂或模拟体组合物的这些及其它已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如在“Remington TheScience & Practice of Pharmacy”第19版，Williams & Williams，(1995)，和在“Physician′s Desk Reference”第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)中所列出的药物赋形剂和/或添加剂，上述参考文献的公开内容通过引用整体结合到本文中。优选的载体或赋形剂材料为糖类(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。
制剂。如上所述，本发明提供了稳定制剂，该制剂优选可包含含盐水或选定盐的合适缓冲剂，以及任选的含有防腐剂的防腐溶液和制剂和适合药用或兽用的多用途防腐制剂，并包含在药物可接受制剂中的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。防腐制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选地选自以下的至少一种：苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或它们在水性稀释剂中的混合物。可据本领域所知使用任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％，或其中的任何范围或数值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或其中的任何范围或数值。非限制性实例包括：无防腐剂、0.1-2％间甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所述，本发明提供一种制品，该制品包括包装材料和至少一个西林瓶，所述西林瓶含有至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体和指定缓冲剂和/或防腐剂的溶液，任选地在水性稀释液中，其中所述包装材料包括标示了上述溶液可在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间段内保存的标签。本发明还包括一种制品，该制品包括包装材料、含至少一种冻干的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的第一个西林瓶以及含指定缓冲剂或防腐剂的水性稀释液的第二个西林瓶，其中所述包装材料包括一个标签，指示患者如何将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体在水性稀释液中重构以形成可在24小时或更长时间段内保存的溶液。
根据本发明应用的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可通过重组方法生产，包括由哺乳动物细胞或转基因制品生产，或者可由如本文所述或本领域所知的其它生物来源纯化。
本发明产品中至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体量的范围包括重构后(如果是湿/干体系的话)产生约10μg/ml至约1000mg/ml浓度的量，但更低和更高浓度也是可行的，取决于拟定送递载体，例如溶液制剂不同于透皮药贴、肺、经粘膜或渗透或微量泵法。
优选地，上述水性稀释液任选地还包含药物可接受防腐剂。优选防腐剂包括选自下列的防腐剂：苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或它们的混合物。用于制剂中的防腐剂浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。该浓度取决于所选防腐剂，且可由技术人员容易地测定。
其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂，可任选和优选地加入稀释剂中。等渗剂，如甘油，通常以已知浓度使用。优选加入生理可耐受缓冲剂，以改善pH控制。所述制剂可覆盖大范围的pH，如由约pH 4至约pH 10，优选范围是约pH 5至约pH9，最优选范围为约pH 6.0至约pH 8.0。优选地，本发明制剂具有约6.8至约7.8之间的pH值。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最优选磷酸钠，尤其是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
其它添加剂，如药物可接受增溶剂，如Tween 20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188，Pluronic
Figure A200580048496D0069124256QIETU
 polyl、其它嵌段共聚物和螯合剂如EDTA和EGTA，任选地可加入所述制剂或组合物中，以减少聚集。如果使用泵或塑料容器给予所述制剂，那么这些添加剂尤其有用。药物可接受的表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向。
本发明制剂可通过一种方法制备，该方法包括将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体与选自以下的防腐剂在水性稀释剂中混合：苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或它们的混合物。使用常规溶解和混合方法将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体与防腐剂在水性稀释剂中混合。为制备合适制剂，例如，将测定量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的缓冲溶液与所需防腐剂的缓冲溶液以一定量组合，该量足以提供所需浓度的蛋白质和防腐剂。本领域一般技术人员应知晓该方法的变化。例如，加入组分的顺序、是否采用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是针对所用浓度和给予途径可优化的因素。
要求保护的制剂可作为澄清溶液或双西林瓶提供给患者，双西林瓶含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其用含有水、防腐剂和/或赋形剂(优选在水性稀释液中的磷酸盐缓冲剂和/或盐水和选定盐)的第二个西林瓶重构。单溶液瓶或需重构的双瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期，因而可提供比现时可用治疗方案更为便利的治疗方案。
本发明要求保护的制品适用于在立即到24小时或以上的时间段内给予。因此，本发明要求保护的制品为患者提供了显著益处。本发明制剂任选地可在约2至40℃的温度下安全保存并长时间保持蛋白质的生物活性，因而允许包装标签标示该溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小时或以上的时间段内保存和/或使用。如采用防腐稀释剂，则该标签可包括使用达1-12个月、半年、一年半和/或两年中的至少一种。
可通过一种方法制备本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的溶液，所述方法包括将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体混合在水性稀释液中。混合使用常规溶解和混合方法进行。为制备合适的稀释液，例如，以足以提供所需浓度的蛋白质和任选的防腐剂或缓冲液的量，将测定量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的水溶液或缓冲液配伍。本领域一般技术人员应知晓该方法的变化。例如，加入组分的顺序、是否采用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是针对所用浓度和给予途径可优化的因素。
要求保护的产品可以澄清溶液或双西林瓶提供给患者，双西林瓶含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其用含有水性稀释剂的第二个西林瓶重构。单溶液瓶或需重构的双瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期，因而可提供比现时可用治疗方案更为便利的治疗方案。
可通过提供给药房、诊所或其它这种机构和设施澄清溶液或双西林瓶，将要求保护的产品间接提供给患者，所述双西林瓶含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其可用含水性稀释液的第二个西林瓶重构。该情况下澄清溶液的大小可达一升乃至更大，提供了一种大储液器，可一次或多次从该储液器取回更小部分的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体溶液，转移到更小的西林瓶中，由药房或诊所提供给它们的顾客和/或患者。
含这些单瓶体系的公知装置包括用于送递溶液的笔式注射器装置，例如
Figure A200580048496D00701
和
Figure A200580048496D00702
含双瓶体系的公知装置包括可用于将冻干药物在药筒中重构并送递该重构溶液的笔式注射器系统，例如
本发明要求保护的产品包括包装材料。除管理机构所要求的信息外，该包装材料还提供应用该产品的条件。本发明的包装材料向患者提供说明书，指示将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体在水性稀释液剂中重构，以形成溶液和在2-24小时或更长的时间段内使用该双瓶、湿/干产品的溶液。对单瓶溶液产品而言，标签标示了该溶液可在2-96小时或更长的时间段使用。本发明要求保护的产品可用于人类药品用途。
可通过一种方法制备本发明制剂，所述方法包括将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体与选定缓冲剂混合，所述缓冲剂优选为含盐水或选定盐的磷酸缓冲剂。在水性稀释液中混合至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体和缓冲剂使用常规溶解和混合方法进行。为制备合适的制剂，例如，将测定量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的水溶液或缓冲液与所需缓冲剂的水溶液以一定量配伍，该量足以提供所需浓度的蛋白质和缓冲剂。本领域一般技术人员应知晓该方法的变化。例如，加入组分的顺序、是否采用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是针对所用浓度和给予途径可优化的因素。
要求保护的稳定或防腐制剂可作为澄清溶液或双西林瓶提供给患者，双西林瓶含有一瓶冻干的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，其用含有防腐剂或缓冲剂或赋形剂的水性稀释液的第二个西林瓶重构。单溶液瓶或需重构的双瓶均可重复使用多次，并可满足患者治疗的一个或多个周期，因而提供比现时可用治疗方案更为便利的治疗方案。
本文描述的稳定或防腐制剂或溶液中的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可根据本发明通过多种送递方法给予患者，包括皮下(SC)或肌内(IM)注射；透皮、肺、经粘膜、植入、渗透泵、药筒、微量泵或技术人员了解、本领域周知的其它途径。
治疗应用。本发明提供一种增加胰腺功能的方法，所述方法包括将有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体组合物给予需要其的细胞、组织、器官或个体。GLP-1激动剂或模拟体可促进胰岛分化、增加β-细胞量和/或增加胰岛素分泌。GLP-1激动剂或模拟体可在试管内、体外或体内给予。
例如，GLP-1激动剂或模拟体治疗可用于胰腺或胰岛移植患者或包含产胰岛素细胞的其它细胞治疗。在有或没有设计用于增强细胞存活或防止免疫排斥的装置支持的情况下，可将细胞治疗静脉内、皮下、肌内或腹膜内传送给患者。其还可用于手术去除部分胰腺后的患者。GLP-1激动剂或模拟体可在所述方法前或后给予活体胰腺或胰岛供体，以增加β-细胞量和胰腺功能。其还可用于在移植前在体外刺激β-细胞增殖，由此增加β-细胞量和防止移植后的胰岛凋亡。其还可用于培养产胰岛素细胞的干细胞、祖细胞或前体细胞，以刺激分化和增殖以及防止凋亡。
本发明提供一种在变成糖尿病的高风险个体中延迟糖尿病发作或防止糖尿病的方法，所述方法包括对需要其的个体给予有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体组合物。
本发明提供一种调节或治疗至少一种胰腺功能失调引起的疾病或障碍的方法，所述方法包括对需要其的个体给予有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体组合物。适合用本发明方法治疗的病症和疾病包括但不限于：糖尿病，例如1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病或青少年发病的成年型糖尿病(MODY)，包括相关征兆和症状，例如但不限于胰岛素抗性、高血糖、低血糖、Cushing综合症、黑色棘皮症、脂肪萎缩型糖尿病、视网膜病、肾病、多神经病、单神经病、自主神经病变、溃疡、脚溃疡、关节问题、感染(例如真菌或细菌)等。参见例如the Merck Manual，第12-17版，Merck & Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，PharmacotherapyHandbook，Wells等编辑，第2版，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2001)，每个文献均通过引用整体结合到本文中。其它非限制性胰腺病症包括胰腺炎、胰腺肿瘤或胰腺癌。
本发明提供一种用于调节或治疗导致高血糖的至少一种代谢障碍的方法。这种障碍的非限制性实例包括与高血压相关的硬化和葡萄糖耐受受损。GLP-1激动剂或模拟体治疗还可与已知诱发高血糖和/或糖尿病的其它药物联用。这种药物的非限制性实例包括免疫抑制药物，例如在器官移植中给予的环孢素或FK-506，指定用于AIDS患者的蛋白酶抑制剂和用于治疗精神分裂症的非典型抗精神病药。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种心血管病的方法，该心血管病包括但不限于以下的至少一种：心脏晕厥综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、糖尿病性动脉硬化病、高血压、动脉高压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、心力衰竭、肺源性心脏病、原发性肺动脉高压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房颤动(持续或阵发的)、紊乱性或多源性房性心动过速、规律性狭窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室纤颤、His束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌局部缺血失调、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张充血性心肌病、限制性心肌病、辫膜心脏病、心内膜炎、心包病、心脏肿瘤、主动脉和周围动脉瘤、主动脉夹层、主动脉炎症、腹主动脉及其分支阻塞、外周血管失调、闭塞性动脉失调、外周动脉粥样硬化病、血栓闭塞性脉管炎、功能性外周动脉失调、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛症、静脉病、血栓静脉炎、曲张静脉、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、体外冠状动脉搭桥术后综合征、局部缺血-再灌注损伤等。这种方法任选地可包括对需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效量的含至少一种GLP-激动剂或模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。
本发明的任何方法都可包括对需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效量的含至少一种GLP-激动剂或模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。这种方法任选地还可包括共同给予或联合疗法，其中所述至少一种GLP-激动剂或模拟体、其特定部分或变体的给予还包括在其之前、同时和/或之后给予选自以下的至少一种：糖尿病或胰岛素代谢相关药物、TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白，或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药物、氨基甲酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养物质、甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如GLP-letin α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节物、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷基化药物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、β激动剂、吸入型类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链球菌DNA酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适剂量是本领域熟知的。参见例如Wells等编辑，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，TarasconPublishing，Loma Linda，CA(2000)，上述参考文献每个均通过引用整体结合到本文中。
适用于本发明组合物、联合治疗、共同给予、装置和/或方法的TNF拮抗剂(还包括本发明的至少一种抗体、其特定部分和变体)包括但不限于：抗TNF抗体、其配体结合片段和特异性结合TNF的受体分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其对靶细胞的作用的化合物，例如沙利度胺、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可碱和咯利普兰)、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/或抑制TNF受体信号传导的化合物，例如促分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF裂解的化合物，例如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，例如血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF生成和/或合成的化合物，例如MAP激酶抑制剂。
本文所用的“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等降低、阻断、抑制、消除或干扰体外、原位和/或优选体内的TNFα活性。例如，合适的本发明TNF人抗体可结合TNFα，并包括抗TNF抗体、其抗原结合片段和特异性结合TNFα的特定突变体或其结构域。合适的TNF抗体或片段也可降低、阻断、消除、干扰、阻止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体信号传导、膜TNF裂解、TNF活性、TNF生产和/或合成。
嵌合抗体cA2由高亲和性中和性小鼠抗人TNFα IgG1抗体(称A2)的抗原结合可变区和人IgG1恒定区(κ免疫球蛋白)组成。人IgG1 Fc区改善同种异型抗体效应子功能，增加抗体的循环血清半衰期，并降低抗体的免疫原性。嵌合抗体cA2的亲和力和表位特异性来源于鼠抗体A2的可变区。在一个具体实施方案中，编码鼠抗体A2可变区的核酸的优选来源是A2杂交瘤细胞系。
嵌合A2(cA2)以剂量依赖方式中和天然和重组人TNFα这二者的细胞毒效应。由嵌合抗体cA2与重组人TNFα的结合测定计算出嵌合抗体cA2的亲和常数为1.04×1010M-1。通过竞争抑制测定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可见于Harlow等，Antibodies ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1988；Colligan等编辑，Current Protocols inImmunology，Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience，New York，(1992-2005)，Kozbor等，Immunol Today，472-79(1983)，Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，NewYork(1987-2005)；和Muller，Meth.Enzymol.，92.589-601(1983)，这些参考文献通过引用整体结合到本文中。
在一个具体实施方案中，鼠单克隆抗体A2由称为c134A的细胞系生产。嵌合抗体cA2由称为c168A的细胞系生产。本领域已描述了可用于本发明的其它单克隆抗TNF抗体的实例(参见例如美国专利第5,231,024号，Moller，A等，Cytokine 2(3)162-169(1990)，美国申请第07/943,852号(1992年9月11日提交)，Rathjen等，国际公开号WO 91/02078(1991年2月21日公开)，Rubin等，GLP-1专利公开号0218 868(1987年4月22日公开)，Yone等，GLP-1专利公开号0 288 088(1988年10月26日)，Liang等，Biochem Biophys Res Comm.137 847-854(1986)，Meager等，Hybridoma 6 305-311(1987)，Fendly等，Hybridoma6359-369(1987)，Bringman等，Hybridoma 6：489-507(1987)；和Hirai等，J Immunol Meth 96 57-62(1987)，这些参考文献通过引用整体结合到本文中)。
TNF受体分子。用于本发明的优选TNF受体分子是以高亲和力结合TNFα(参见例如Feldmann等，国际公开号WO 92101016(1992年4月30日公开)，Schall等，Cell 61.361-310(1990)，和Loetscher等，Cell 61 351-359(1990)，这些参考文献通过引用整体结合到本文中)并任选地具有低免疫原性的分子。具体地说，55kDa(p55 TNF-R)和75kDa(p75 TNF-R)TNF细胞表面受体可用于本发明。这些受体的截短形式，包括该受体的胞外域(ECD)或其功能部分(参见例如Corcoran等，Eur J.Biochem 223 831-840(1994))也可用于本发明。在尿和血清中已检测到含ECD的截短形式TNF受体，其为30kDa和40kDa的TNFα抑制性结合蛋白(Engelmann，H等，J.Biol Chem 265 1531-1536(1990))。TNF受体多聚分子和TNF免疫受体融合分子及其衍生物和片段或部分是可用于本发明方法和组合物的TNF受体分子的其它实例。可用于本发明的TNF受体分子的特征在于其能够长期治疗患者，并具有良好到极大的症状缓解和低毒性。低免疫原性和/或高亲和力以及其它未明特性均可能有助于所获治疗效果。
用于本发明的TNF受体多聚分子包含经一个或多个多肽接头或其它非肽接头(如聚乙二醇(PEG))连接的两个或更多个TNF受体ECD的全部或功能部分。该多聚分子还可含有分泌性蛋白的信号肽，以引导该多聚分子的表达。这些多聚分子及其生产方法已描述于美国申请号08/437,533(1995年5月9日提交)，该文献的内容完整并入本文作为参考。
用于本发明方法和组合物的TNF免疫受体融合分子包括一种或多种免疫球蛋白分子的至少一部分和一种或多种TNF受体的全部或功能部分。这些免疫受体融合分子可被装配为单体或异多聚体或同多聚体。此免疫受体融合分子也可为单价或多价的。这种TNF免疫受体融合分子的实例是TNF受体/IgG融合蛋白。本领域已描述了TNF免疫受体融合分子及其生产方法(Lesslauer等，Eur J Immunol 21 2883-2886(1991)，Ashkenazi等，Proc Natl Acad Sci USA 88 10535-10539(1991)，Peppel等，JExp Med.174 1483-1489(1991)，Kolls等，Proc.NatlAcad.Sci.USA 91 215-219(1994)，Butler等，Cytokine 6(6)616-623(1994)，Baker等，Eur J Immunol 24 2040-2048(1994)，Beutler等，美国专利第5,447,851号和美国申请第08/442,133号(1995年5月16日提交)，这些参考文献的每一个均通过引用整体结合到本文中)。生产免疫受体融合分子的方法也可见于Capon等，美国专利第5,116,964号，Capon等，美国专利第5,225,538号，和Capon等，Nature 337 525-531(1989)，这些参考文献通过引用整体结合到本文中。
TNF受体分子的功能等价物、衍生物、片段或区域指该TNF受体分子的部分，或编码TNF受体分子的TNF受体分子序列的部分，其具有足够大小和序列，以在功能上类似于可用于本发明的TNF受体分子(例如高亲和力结合TNFα并具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物还包括经修饰的TNF受体分子，其在功能上类似于可用于本发明的TNF受体分子(例如高亲和力结合TNFα并具有低免疫原性)。例如，TNF受体分子的功能等价物可含有“沉默”密码子或一个或多个氨基酸置换、缺失或添加(例如用一个酸性氨基酸置换另一个酸性氨基酸；或用编码相同或不同疏水氨基酸的一个密码子置换编码疏水氨基酸的另一密码子)。参见Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience，NewYork(1987-2005)。
细胞因子包括但不限于所有已知的细胞因子。参见例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括不限于任何抗体、片段或模拟体、任何可溶受体、片段或模拟体、任何小分子拮抗剂或它们的任何组合。
本发明的任何方法均可包括治疗蛋白质介导的病症的方法，该方法包括对需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给予有效量的含至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。这种方法任选地还可包括共同给予或联合疗法，用于治疗这种免疫疾病，其中所述至少一种GLP-1激动剂或模拟体、特定部分或其变体的给予还包括在其之前、同时和/或之后给予至少一种选自以下的至少一种其它细胞因子：例如IL-3、-6和-11、干细胞因子、G-CSF和GM-CSF。
典型地，通过给予有效量或有效剂量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体组合物实现病理状况的治疗，所述组合物平均总范围为至少约0.01-500mg至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体/kg患者/剂，优选至少约0.1至100mg GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体/kg患者/单次或多次给予，这取决于组合物中所含的比活。或者，有效血清浓度可包含0.1-5000μg/ml血清浓度/单次或多次给予。适宜的剂量是医学从业人员公知的，当然将取决于具体疾病状态、所给予组合物的比活和经历治疗的具体患者。在某些情况下，为达到期望的治疗量，必须提供重复给予，即重复具体监视或计量的剂量的单次给予，其中重复单次给予，直至实现期望的日剂量或作用。
优选剂量任选地可包括0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30mg/kg/给予，或其中的任何范围、数值或分数，或实现0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml的血清浓度/单次或多次给予，或其中的任何范围、数值或分数。
或者，给予剂量可根据已知因素而变，所述已知因素例如为特定药剂的药代动力学特征及其给予模式和途径、接受者的年龄、健康情况和体重、症状的性质和程度、共存治疗的种类、治疗频率和预期效果。通常，有效成分剂量可为每公斤体重约0.1-100毫克。一般0.1-50mg/kg体重/给予、优选0.1-10mg/kg体重/给予或持续释放形式对获得预期效果有效。
作为非限制性实例，人类或动物治疗可作为一次性或周期性剂量的至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体提供，所述剂量为：在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少之一，或替代性地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或它们的任何组合，使用单次、输注或重复剂量，每天给予0.01-100mg/kg，如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg。
适合内部给予的剂型(组合物)通常含约0.0001毫克至约500毫克活性成分/单位或容器。在这些药物组合物中，活性成分通常基于组合物总重量以约0.5-95％重量的量存在。
对于肠胃外给予，GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可配制为溶液、悬液、乳浊液或冻干粉，它们结合药物可接受的肠胃外载体，或与所述载体分别提供。这种载体的实例是水、盐水、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可采用脂质体和非水性载体，如不挥发油。载体或冻干粉可含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。该制剂通过已知或合适的技术灭菌。
适宜的药物载体描述于该领域的标准教科书—最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol。
治疗性给予。根据本发明，可采用许多已知和已开发的给予模式来给予药物有效量的至少一种本发明GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。本发明的GLP-1激动剂或模拟体可在载体中、作为溶液、乳浊液、胶体或悬液或作为粉末，使用适于通过吸入给予或本文所述或本领域已知其它模式的各种装置和方法来传递。
肠胃外配方和给予。用于肠胃外给予的制剂可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚烷撑二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。根据已知方法，可通过使用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂制备注射用水性或油性悬液。注射用药剂可以是无毒、非经口给予的稀释剂，如水性溶液或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液。水、Ringer氏溶液、等渗盐水等可用作可用的载体或溶剂；无菌不挥发油可用作普通溶剂或悬浮剂。为此，可使用任何类型的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油单酯或二酯或三酯。肠胃外给予是本领域已知的，包括但不限于：常规注射途径，美国专利第5,851,198号中描述的气压式无针注射装置和美国专利第5,839,446号中描述的激光穿孔器装置，这两项专利均通过引用整体结合到本文中。
可选送递。本发明还涉及通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或透皮途径给予至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。蛋白质GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物可制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)给予，具体地说是以液体溶液或悬浮液形式；用于阴道或直肠给予时，具体地说是以半固体形式，如乳膏和栓剂；对于口腔含化或舌下给予，具体地说为片剂或胶囊形式；鼻内给予时，具体地说为粉末、鼻滴剂或气雾剂或某些药剂形式；透皮给予具体地说为凝胶、软膏、洗剂、悬液或贴剂送递系统形式(例如但不限于Alza，California，USA的MacrofluxTM或任何其它已知方法、装置或技术)，所述贴剂送递系统具有化学增强剂如二甲亚砜，以改变皮肤结构或增加透皮贴剂中的药物浓度(Junginger等，载于“Drug PermeationEnhancement”，Hsieh，D.S.编辑，59-90页(Marcel Dekker，Inc NewYork 1994)，其通过引用整体结合到本文中)，或具有氧化剂，其使得含蛋白质和肽的制剂能够应用到皮肤上(WO 98/53847)，或施加电场，产生瞬时送递途径，如电穿孔，或增加带电药物穿过皮肤的活动性，如离子电渗疗法，或应用超声，如超声波导入法(美国专利第4,309,989和4,767,402号)(上述出版物和专利均被完整引入此处作为参考)。
肺/鼻给予。对于经肺给予，优选至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物以有效达到肺或窦的下气道的颗粒大小递送。根据本发明，至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体可通过本领域已知通过吸入给予治疗剂的任何各种吸入或鼻装置递送。能够将气溶胶化制剂沉积在患者的窦腔或肺泡中的这些装置包括定量吸入器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。适于引导GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体经肺或鼻给予的其它装置也是本领域已知的。所有这种装置都可以使用适于以气溶胶分配GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体来给予的制剂。这种气溶胶可由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。定量吸入器，像剂量吸入器，通常使用推进气体并且需要在吸气期间的启动(参见例如WO94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器，像Inhale Therapeutics上市的TurbuhalerTM(Astra)、
Figure A200580048496D00822
(Glaxo)、
Figure A200580048496D00823
(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)装置和
Figure A200580048496D00824
粉末吸入器(Fisons)使用混合粉末的呼吸启动(breath-actuation)(US 4668218 Astra，EP 237507 Astra，WO97/25086 Glaxo，WO 94/08552 Dura，US 5458135 Inhale，WO 94/06498Fisons，将它们完整并入本文作为参考)。雾化器像AERxTM Aradigm、
Figure A200580048496D00825
雾化器(Mallinckrodt)和Acorn 
Figure A200580048496D00826
雾化器(Marquest MedicalProducts)(US 5404871 Aradigm，WO 97/22376)(将以上参考文献完整并入本文作为参考)，从溶液产生气溶胶，而定量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。通过商业途径可获得的吸入装置的这些具体实例意在代表适于本发明实施的特定装置，无意限制本发明的范围。优选地，含有至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的组合物通过干粉吸入器或者喷雾器送递。给予本发明的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的吸入装置存在几种所需的特征。例如，通过吸入装置递送有利地为可靠的、可再现的和准确的。吸入装置任选可递送小的干燥颗粒，例如，小于约10μm，优选约1-5μm，以得到良好的呼吸能力。
GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体作为喷雾剂给予。通过将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的悬浮液或者溶液加压通过喷嘴，可产生包含GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的喷雾。可选择喷嘴大小和构造、施加的压力和液体加料速率，以实现所需的输出和颗粒大小。例如，通过电场与毛细管或喷嘴加料相结合可以产生电喷雾。有利地，通过喷雾器递送的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的颗粒具有的颗粒大小小于约10μm，优选约1μm到约5μm，最优选约2μm到约3μm。
适宜使用喷雾器的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的制剂通常包括在水性溶液中的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白，浓度为约1mg到约20mg至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白/ml溶液。该制剂可包含例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂的物质且优选包括锌。该制剂还可包含用于稳定GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的赋形剂或物质，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质(bulk protein)或者糖。用于配制GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。用于配制GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的典型糖包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白制剂还可包含表面活性剂，其可以减小或者防止在气溶胶形成中通过溶液喷雾导致的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的表面诱导聚集。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。用量通常在0.001-14％制剂重量的范围内。用于本发明的特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于蛋白质如模拟体或特定部分或变体配制的本领域中公知的其它物质也可以包括在所述制剂中。
通过雾化器给予GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物。可通过雾化器，如喷射雾化器或者超声雾化器，给予GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白。通常，在喷射雾化器中，用压缩气源通过孔产生高速气体喷射。当气体在喷嘴外膨胀时，产生低压区，其通过连接储液器的毛细管吸取GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的溶液。来自毛细管的液流在离开管时被剪切成不稳定的细丝或者小滴，产生气溶胶。可以用一系列构型、流速和挡板类型从给定的喷射雾化器产生所需的性能特征。在超声雾化器中，用高频率电能产生振动的机械能量，通常使用压电转换器。该能量直接地或通过藕合流体传递到GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的制剂，产生含有GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的气溶胶。有利地，通过雾化器递送的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的颗粒具有的颗粒大小小于约10μm，优选在约1μm至约5μm的范围内，最优选约2μm至约3μm。
适于与喷射或超声雾化器一起使用的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的制剂通常包括浓度约1mg至约20mg至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体蛋白/ml溶液的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的水溶液。该制剂可包含例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂的物质且优选包括锌。该制剂还可包括用于稳定至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的赋形剂或物质，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质或者糖。用于配制至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白质包括清蛋白、鱼精蛋白等。用于配制至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的典型糖包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体制剂还可包含表面活性剂，其可以减小或防止在形成气溶胶时通过溶液喷雾导致的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的表面诱导聚集。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。用量通常在0.001-4％(14％以上)制剂重量的范围内。用于本发明的特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于蛋白质如GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物配制的本领域中公知的其它物质也可以包括在所述制剂中。
通过定量吸入器给予GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物。在定量吸入器(MDI)中，在罐中包括推进剂、至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体以及任何赋形剂或者其它添加剂，作为含液化压缩气体的混合物。计量阀的启动释放作为气溶胶的混合物，其优选含有小于约10μm、优选约1μm至约5μm、最优选约2μm至约3μm的大小范围的颗粒。通过使用由本领域技术人员公知的多种方法产生的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的制剂，可以获得期望的气溶胶颗粒大小，所述方法包括喷射碾磨、喷雾干燥、临界点冷凝等。优选的定量吸入器包括3M或Glaxo生产并使用氢氟烷推进剂的定量吸入器。
与定量吸入器装置一起使用的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的制剂通常包括含至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的细小粉末，其为非水性介质中的悬浮液，例如在表面活性剂帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，如氯氟烃、氢氯氟烷、氢氟烷或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。优选地，推进剂为氢氟烷。可以选择表面活性剂以稳定推进剂中作为悬浮液的至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体，保护活性剂免受化学降解等。适宜的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况中，优选使用溶剂如乙醇的溶液气溶胶。用于蛋白质制剂的本领域公知的其它试剂如蛋白质也可以包括在所述制剂中。
本领域一般技术人员将认识到，利用本文未描述的装置通过肺给予至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体组合物可实现本发明的方法。
粘膜制剂和给予。为了通过粘膜表面吸收，给予至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的组合物和方法包括乳剂，其含有多种亚微米颗粒、粘膜粘附性大分子、生物活性肽和水性连续相，其通过实现乳剂颗粒的粘膜粘附促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适宜应用本发明的乳剂的粘膜表面可包括角膜、结膜、颊膜、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给予途径。用于阴道或直肠给予的制剂，例如栓剂，可含有例如聚烷撑二醇、凡士林、可可脂等作为赋形剂。鼻内给予的制剂可以是固体，并含有例如乳糖作为赋形剂，或者可以是鼻滴剂的水性或油性溶液。对于口腔给予，赋形剂可包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利号5,849,695)。
经口制剂和给予。经口制剂依赖于共同给予佐剂(例如间苯二酚和非离子表面活性剂，如聚氧乙烯油烯基醚和正十六烷基聚乙烯醚)，以人工增加肠壁的渗透性，以及共同给予酶抑制剂(例如胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶(trasylol))，以抑制酶降解。用于经口给予的固体型剂型的活性成分化合物可与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸酯(arginate)、壳多糖、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍树胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、清蛋白、合成的或半合成的聚合物和甘油。这些剂型还可含有其它类型添加剂，例如无活性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯、防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚、抗氧化剂如半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、增甜剂、调味剂、增香剂等。
片剂和丸剂可以进一步加工成肠包衣制剂。用于经口给予的液体制剂包括允许用于医学用途的乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液剂。这些制剂可含有常用于所述领域的无活性稀释剂，例如水。已描述作为胰岛素和肝素的药物递送系统的脂质体(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸的人工聚合物(类蛋白质)微球体已用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，美国专利号5,879,681和美国专利号5，5,871,753中描述的载体化合物用于经口递送本领域已知的生物活性剂。
透皮制剂和给予。对于透皮给予，将至少一种GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体包囊化在递送装置中，所述递送装置例如为脂质体或聚合纳米颗粒、微粒、微胶囊或微球体(除非特别指出，否则统称为微粒)。许多适宜的装置是公知的，包括由合成聚合物和天然聚合物制造的微粒，所述合成聚合物例如为多羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，所述天然聚合物例如为胶原、聚氨基酸、清蛋白和其它蛋白质、藻酸盐和其它多糖以及它们的组合(美国专利号5,814,599)。
延长的给予和制剂。有时需要由一次给予将本发明化合物在延长的时间段内(例如一周到一年的时间段内)传送给受试者。可以利用不同的缓释、储库或植入剂型。例如，剂型可含有在体液中具有低溶解度的化合物的药物可接受无毒盐，例如(a)使用多碱价酸的酸加成盐，所述多碱价酸为例如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)与多价金属阳离子形成的盐，所述阳离子为例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或者与由例如N，N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如单宁酸锌盐。此外，本发明的化合物或优选地如刚描述的相对难溶盐可配制在适宜注射的凝胶中，例如含例如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。尤其优选的盐为锌盐、单宁酸锌盐、双羟萘酸盐等。用于注射的另一种类型的缓释储库制剂应含有经分散以包囊化在缓慢降解、无毒、非抗原性聚合物中的化合物或盐，所述聚合物为例如在美国专利号3,773,919中描述的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。化合物或优选地如上文描述的相对难溶盐还可以配制在胆固醇基质硅橡胶丸中，其尤其用于动物。其它缓释、储库或植入制剂，例如气体或者液体脂质体，是文献中已知的(美国专利号5,770,222和“Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems”，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc，N.Y.，1978)。
已经总体地描述了本发明，通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，所述实施例仅为了阐明而提供，无限制意图。
实施例1：哺乳动物细胞中GLP-1激动剂或模拟体的克隆和表达
一般的哺乳动物表达载体含有至少一种介导mRNA转录起始的启动子元件、GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体的编码序列以及转录物的转录终止和多腺苷酸化所需的信号。额外元件包括增强子、Kozak序列和间插序列，间插序列侧接RNA剪接的供体和受体位点。高效转录可用SV40的早期和晚期启动子、逆转录病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子实现。然而，也可以使用细胞元件(例知人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的适宜表达载体例如包括例如以下的载体：pIRES l neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，基因可以在含有整合入染色体的该基因的稳定细胞系中表达。用选择标记如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素共转染使得可以鉴定和分离所转染的细胞。
还可以扩增所转染的基因，以大量表达所编码的GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于扩展携带目标基因的数百乃至数千拷贝的细胞系。另一种有用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，Biochem J 227：277-279(1991)，Bebbington等，Bio/Technology 10：169-175(1992))。使用这些标记，使哺乳动物在选择性培养基上生长，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合入染色体的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞通常用于产生GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。
表达载体pC1和pC4含有劳斯肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，Molec.Cell Biol.5 438-447(1985))加CMV-增强子的片段(Boshart等，Cell 41 521-530(1985))。例如具有限制性酶切位点BamHI、XbaI和Asp718的多克隆位点促进目的基因的克隆。所述载体还含有大鼠前原胰岛素基因的3′内含子、多腺苷酸化信号和终止信号。
在CHO细胞中的克隆和表达。载体pC4用于表达GLP-1激动剂或模拟体或特定部分或变体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。该质粒含有处于SV40早期启动子控制之下的小鼠DHFR基因。通过在补加化疗剂氨甲蝶呤的选择性培养基(例如α-MEM，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞，可筛选出用这些质粒转染的、缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞。已有文献充分记载了DHFR基因在氨甲蝶呤(MTX)抗性细胞中的扩增(参见例如F WAlt等，J Biol Chem 253 1357-1370(1978)，JL Hamlin和C Ma，Biochem et Biophys Acta 1097 107-143(1990)，以及M J Page和M A Sydenham，Biotechnology 9 64-68(1991))。在递增浓度的MTX中生长的细胞产生了药物抗性，原因是由于DHFR基因扩增所引起的目标酶DHFR的过度产生。如果将第二个基因连接至DHFR基因，则该第二基因通常被共同扩增并过度表达。本领域已知该方法可用于扩展携带1,000多个拷贝的扩增基因的细胞系。随后，当收回氨甲蝶呤时，获得含有扩增基因的细胞系，该扩增基因已整合入宿主细胞的一个或多个染色体中。
质粒pC4含有用于表达目标基因的劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等，Molec Cell Biol 5：438-447(1985))外加分离自人类巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子的片段(Boshart等，Cell 41.521-530(1985))。该启动子的下游是允许所述基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制酶切位点。在这些克隆位点后，该质粒含有大鼠前原胰岛素基因的3′内含子和聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可用于表达，例如人b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒(如HIV和HTLVI)的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可用于在哺乳动物细胞中以可调节途径表达GLP-1(M Gossen和H Bujard，Proc NatlAcad Sci USA 89 5547-5551(1992))。对mRNA的聚腺苷酸化而言，也可采用其它信号，例知来自人生长激素或球蛋白基因的信号。在用可选标记(如gpt、G418或潮霉素)共转染的情况下，也可选出携带整合入染色体中的目标基因的稳定细胞系。有利的是在开始时使用一种以上的选择标记，例如G418加氨甲蝶呤。
通过本领域已知的操作方法，采用限制酶消化质粒pC4，随后采用牛肠磷酸酶脱磷酸化。随后从1％琼脂糖凝胶中分离出该载体。
根据已知方法步骤，使用编码完整GLP-1模拟体或特定部分或变体的DNA序列，其与本发明的GLP-1模拟体的HC和LC可变区对应。该构建体中也可使用编码合适人恒定区(即HC和LC区)的分离核酸。
随后用T4DNA连接酶连接分离的可变区和恒定区编码DNA与脱磷酸化载体。接着，转化大肠杆菌HB 101或XL-1Blue细胞，并使用例如限制酶分析法鉴定含插入到质粒pC4中的片段的细菌。
使用无活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染。使用lipofectin，将5μg表达质粒pC4与0.5μg质粒pSV20-neo共转染。质粒pSV2neo含有显性选择标记neo基因，该基因来源于Tn5，其编码的酶赋予针对包括G418的一组抗生素的抗性。将该细胞接种在补加1μg/ml G418的α-MEM中。2天后，细胞进行胰蛋白酶化，并接种入杂交瘤克隆平板(Gremer，Germany)中补加10、25或50ng/ml氨甲蝶呤外加1μg/ml G418的α-MEM中。约10-14天后，对单个克隆进行胰蛋白酶化，随后接种入使用不同浓度氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔培养皿或10ml摇瓶中。随后，将最高浓度氨甲蝶呤下生长的克隆转移至含有更高浓度氨甲蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6孔平板中。重复相同步骤，直至获得可以100-200mM浓度生长的克隆。例如通过SDS-PAGE和蛋白质印迹或通过反相HPLC分析来分析目标基因产物的表达。
实施例2：本发明GLP-1模拟体的非限制性实例
GLP-1是一种37个氨基酸的肽，在口服葡萄糖挑战后由肠L细胞分泌。预期掺入生物活性GLP-1(7-37)肽、变体或衍生物的模拟体构建物延长该肽的体内半衰期，提供降低2型糖尿病患者中血糖的新疗法。可将编码天然GLP-1(7-37)肽或DPP-IV抗性类似物的肽掺入到模拟体支架中。这些分子中有几个已得以制备，产生的模拟体已在功能性体外细胞型测定中表现出活性。应当指出的是，在这些研究中可使用不同的体外测定与体内模型，效力在彼此之间或与本文提供结果可能不可比。
为产生GLP-1模拟体变体，模拟体中的GLP-1肽、接头、铰链或CH2和CH3序列可进行缺失、添加、置换、突变或修饰，以改善表达、效力、稳定性或效应子功能。
可将野生型GLP-1序列以及DPP-IV抗性GLP-1变体(如GLP-1(A2S)或GLP-1(A2G))掺入到模拟体支架中。可进行肽突变，以改善GLP-1模拟体的特性。例如，氨基末端残基中的突变可改善信号传导，而在螺旋结构域中的突变可稳定螺旋体，由此改善与受体的结合和/或模拟体的稳定性。
接头的长度和组成可变，以改变GLP-1肽和Fc区之间连接的柔性或稳定性。可将不同的同种型掺入到分子的铰链区中。另外，可在模拟体铰链区中进行突变，以稳定该分子。例如，可使人IgG4铰链突变，以产生Ser228→Pro变体，以稳定模拟体中的链间二硫键。可在模拟体Fc区中进行改变，以提升分子稳定性和改变效应子功能，例如FcR结合。例如，人们可使用人或鼠同种型(或这些分子的变体)，如具有Ala/Ala突变的IgG4。
本发明的GLP-1模拟体。本发明的一个特定非限制性实例是符合式(I)的GLP-1模拟体构建物(SEQ ID NO 2)
((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是单拷贝的生物活性GLP-1肽(7-36)，L是Gly-Ser或Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头的串联重复，V是VH序列的C末端，即天然IgG的J区，H是完整IgG1铰链区，CH2和CH3属于IgG1同种型亚型。预期该构建物的半衰期将是单独的GLP-1肽或其变体或衍生物的很多倍，类似于IgG的半衰期。
除上述基础结构外，还描述了具有潜在有利生物学特征的变体。这些变体包括自缔合倾向降低、免疫效应子功能减弱或免疫原性降低的构建体。设想了赋予期望特征例如改善的生物活性肽构型和穿越血脑屏障的其它修饰。提议的变体和修饰可以任何方式组合，以获得具有期望活性的构建体。
利用重组DNA法，将GLP-1肽插入位于免疫球蛋白信号肽与人J序列之间的中间载体中。该操作使用互补合成寡核苷酸进行，所述寡核苷酸的末端与该载体中存在的限制位点相容。这些寡核苷酸含有GLP-1肽编码序列和由两个GGGS重复序列组成的柔性接头。含有上述功能元件的限制片段随后被转移进表达载体中。该载体含有抗CD4免疫球蛋白启动子和增强子以及人IgG1铰链序列的编码序列、HC恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)，还含有对细菌内质粒复制和选择和哺乳动物细胞内稳定表达子选择必需的元件。
将该质粒导入HEK293E细胞中，在瞬时转染细胞中实现野生型GLP-1模拟体的表达。GLP-1模拟体的纯化通过标准A蛋白和Superose12亲和层析完成，获得约1.5mg/L转染细胞。该蛋白是下述实验的起始物质。
GLP-1模拟体的氨基酸序列示于图1。在肽编码序列上注释了功能结构域。一般认为J序列提供甚至更高的柔性，使GLP-1二聚体呈现正确构型，并使该二聚体由免疫球蛋白的球形结构突出，深入两个GLP-1受体之间的裂隙。在IgG1铰链区中有3个半胱氨酸。第一个一般应与免疫球蛋白轻链(LC)配对，另两个参与两个HC之间的链间键。CH2和CH3区构成了蛋白的大部分。免疫球蛋白被认为具有长血清半衰期的其中一个原因是其结合FcRn的能力，FcRn通过将胞饮免疫球蛋白返回到胞外间隙而延长血清半衰期。FcRn的结合位点与CH2和CH3区的连接处重叠(Sheilds等，2001，J Biol Chem，276卷(9)，6591-6604)。
众所周知，两条IgG重链在细胞加工期间经位于铰链区中的半胱氨酸之间的二硫键装配在一起，形成同二聚体。预计该现象也可发生在修饰肽之间，从而形成装配的GLP-1模拟体构建物。另外，预计GLP-1肽中的两个半胱氨酸之间也将形成链间二硫键。GLP-1模拟体的预期结构含两个GLP-1肽。该肽在N末端的空间排列以及邻接序列的柔性应允许该肽形成生物活性二聚体。
实施例3：FACS结合测定
在体外FACS结合测定中检测GLP-1模拟体的活性。为测定GLP-1模拟体是否结合GLP-1R，将过表达GLP-1R的HEK293细胞(1×106细胞)与GLP-1模拟体(20nM)于4℃温育2小时。清洗细胞，加入荧光标记的第二检测抗体(1μg/mL山羊抗人IgG，Fcγ特异性的)，于4℃保持30分钟。利用流式细胞术监测细胞的荧光强度。如图2所示，GLP-1模拟体结合过表达GLP-1R的HEK293细胞(图2A)，但不结合对照HEK293细胞(图2B)。该结合是特异性的，因为GLP-1肽类似物(A2S)能够在结合中与GLP-1模拟体竞争(图2C)。
实施例4：cAMP测定
GLP-1与GLP-1R的结合导致信号传导分子3′，5′-环AMP(cAMP)剂量依赖性增加。可用体外测定检测表达GLP-1R的细胞中的cAMP(Applied Biosystems)。简单地讲，将RINm细胞(1×105细胞)与浓度渐增的GLP-1肽(0-30nM)或GLP-1模拟体(0-100nM)温育。裂解细胞，使用竞争性测定来检测cAMP的量，该竞争性测定使用碱性磷酸酶标记的cAMP缀合物和化学发光底物
Figure A200580048496D00941
。将野生型GLP-1模拟体的浓度依赖性cAMP活性(图3A)与GLP-1肽(图3B)相比(分别为EC50＝11nM对0.4nM)。在相似的实验中，IgG4支架中的GLP-1(A2G)模拟体(图3C)和IgG4支架中的GLP-1(A2S)模拟体(图3D)均将Rinm细胞中的cAMP水平增加至显著高于IgG4支架中的野生型GLP-1模拟体的水平(图3E)。
实施例5：DPP-IV裂解测定
因为GLP-1被DPP-IV快速失活，所以建立一种体外测定来定量完整(即未裂解的)GLP-1模拟体。简而言之，GLP-1模拟体或肽(1.2nM)于室温与DPP-IV(1μg/mL，R&D Systems)温育。在不同时间(0、5、10、15、20、30、40分钟)后，加入DPP-IV抑制剂(100μM，Linco)猝灭反应。使用GLP-1活性ELISA(Linco)和用于各自标准曲线的GLP-1模拟体或肽检测完整GLP-1模拟体或肽的量。图4表明，GLP-1模拟体相比于GLP-1肽对DPP-IV裂解的抗性显著更强。
实施例6：人血清稳定性测定
还测定GLP-1模拟体在血清中的稳定性，以确保其它血清蛋白酶不能裂解和失活GLP-1模拟体。简单地讲，GLP1肽或GLP1模拟体(30nM)在人血清中于37℃温育。不同时间后，评价样品，以测定完整肽或模拟体的量。用DPP-IV抑制剂(100μM，Linco)猝灭反应，使用Linco的GLP-1活性ELISA分析样品。图5表明，在4小时后不足5％的GLP-1肽保持完整，而在24小时后超过90％的GLP-1模拟体保持完整。
实施例7：GLP-1模拟体在RINm细胞中引起胰岛素分泌
为测试GLP-1模拟体在胰岛素分泌中的作用，用浓度渐增的GLP-1(7-36)肽(0-5nM)(图6A)、exendin-4肽(0-5nM)(图6A)或各种GLP-1模拟体(5或50nM)处理RINm细胞，通过ELISA检测分泌的胰岛素的量。测试的所有GLP-1模拟体在RINm细胞中刺激胰岛素分泌方面都有活性。在50nM时，模拟体具有的活性与野生型GLP-1(7-36)肽的活性(图6B)相当。
实施例8：GLP-1模拟体的药代动力学
为检测3种GLP-1模拟体(野生型、A2S和A2G)的药代动力学，用0.062mg/kg GLP-1肽或1.0mg/kg A2S GLP-1模拟体静脉内给药C57Blk/6小鼠。于3个不同时间点处死小鼠后经心脏穿刺获得血浆。使用各种ELISA检测Fc、总模拟体、活性模拟体和活性肽，因为它们随着时间推移在动物中代谢。使用Linco的GLP-1活性ELISA定量完整GLP-1肽。用对GLP-1肽的N-末端特异性的抗体(Linco)捕获完整GLP-1模拟体，并用Fc特异性抗体检测。如图12所示，GLP-1肽的水平在注射后15分钟不再可检测(图12A)，而GLP-1A2S模拟体分子在注射后的72小时内都被检测到(图12B)。
实施例9：GLP-1模拟体降低db/db小鼠中的葡萄糖水平
6周龄db/db小鼠禁食2小时，然后用载体、GLP-1肽或GLP-1(A2S)模拟体静脉内给药。在给药后0.5、1、2、3和4小时监测血糖。GLP-1肽在30分钟时降低血糖，但到60分钟时，血糖又开始增加，这可能是因为GLP-1肽的短半衰期(图7A)。相比之下，GLP-1(A2S)模拟体在GLP-1肽剂量100分之一的剂量于整个4小时时间段内诱导血糖下降(图7A)。图7B显示的结果表明，相比于对照动物，GLP-1模拟体于0.019-1.9nmol的剂量范围有效降低糖尿病动物的禁食血糖。另外，与GLP-1的作用机制相一致，在0.19nmol时实现的最大葡萄糖降低作用未被更高剂量的GLP-1模拟体(1.9nmol)增强。最大葡萄糖降低作用将血糖值保持在正常范围内。
实施例10：GLP-1模拟体对大鼠胰岛增殖的作用
用戊巴比妥(Nembutal)(50mg/kg IP)麻醉10只称重约250g的雄性Sprague-Dawley大鼠。在通过捏趾证实无反应性后，制作中线切口，分离胆总管，夹住其到十二指肠进口。就在胆总管至肝的分支末梢切下胆总管。将溶解在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中的10mLLiberaseTM RI(0.25mg/mL)经连接至10cc注射器的PE-50注射入胆总管，导致胰腺被LiberaseTM溶液扩张。在灌输后，切除动物胰腺，置于50mL测试管中，储存在冰上，直至灌注并收集了所有动物的胰腺。
将含已灌注的胰腺的50mL测试管置于37℃水浴中，使其温育20分钟。在温育后，由水浴中取出管，振摇，用补加10％新生牛血清(NCS)、5mM葡萄糖、10mM HEPES、100U/100μg青霉素/链霉素(P/S)的冷HBSS(HBSS+)充满管。内容物通过425μm不锈钢筛过滤，收集到2×50mL管中。滤器用HBSS+淋洗，离心管。对胰腺消化物施加不连续聚蔗糖密度梯度。将10mL 1.108g/mL聚蔗糖溶液加至沉淀，并悬浮。然后将1.096、1.068和1.037g/mL聚蔗糖溶液各5mL依次加入，以终止不连续梯度。然后于4℃以2000rpm离心管10分钟，不应用制动装置。在离心后，收集含胰岛的界面并清洗。分离的胰岛在补加10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、25mM HEPES和100U/100μg青霉素/链霉素(P/S)的CMRL-1066(CMRL+)培养基中过夜培养。第二天，人工拣选出胰岛，并在3种不同GLP-1模拟体构建物存在下以平行三份温育8小时。阴性对照胰岛未处理，exendin-4用作阳性对照。在温育后，向培养物加入氚化胸苷，回复至37℃培养24-48小时。在温育期后，清洗胰岛，用β计数器计数氚化胸苷掺入。如图8A所示，测试的GLP-1模拟体在两个测试浓度(5nM和50nM)均将胸苷掺入增加至对照以上，达到与exendin-4相当的水平。这提示，每种GLP-1模拟体均能够增加大鼠胰岛增殖。
使用GLP-1A2S模拟体进一步测试对大鼠胰岛增殖的剂量作用。分离和培养的胰岛用渐增剂量(0.05-500nM)处理，检测胸苷掺入。图8B表明，A2S模拟体(0.05-500nM)增加胸苷掺入至对照以上，提示模拟体在所有测试浓度都能够增加大鼠胰岛增殖。
实施例11：GLP-1模拟体对非人灵长类动物(NHP)胰岛和人胰岛增殖的作用
NHP胰岛如Ranuncoli等，Cell Transplant(2002)9，3，409-414所述使用酶消化和密度梯度纯化分离。人胰岛如Ricordi等，Diabetes(1998)37，4，413-420所述使用酶消化和密度梯度纯化分离。分离胰岛并在Miami Media1(University of Miami，Maimi，FL)中过夜培养。如在实施例10中所述评价氚化胸苷掺入。GLP-1A2S模拟体刺激NHP胰岛增殖，达到类似于exendin-4的水平(图9)。同样，其还刺激人胰岛增殖，达到与exendin-4相当的水平(图10A)。图10B表明，A2S模拟体在0.05nM-500nM范围的浓度是有效的。
实施例12：GLP-1模拟体对大鼠胰岛的胰岛素分泌的作用
按照实施例10所述的方案分离大鼠胰岛。胰岛在含3.5或15mM葡萄糖的培养基中培养，胰岛分泌的胰岛素使用ELISA检测。结果表明，多种GLP-1模拟体构建物增强响应于葡萄糖的胰岛素分泌(图11)。
实施例13：GLP-1模拟体稳定性是种特异性的
GLP-1 A2S模拟体在小鼠、大鼠、猕猴和人的全血中温育。在不同时间点回收样品，并通过ELISA测定完整模拟体的量。模拟体稳定性在猕猴血或人血清中显著高于在小鼠或大鼠血中(图13)。在小鼠血(图13A)或大鼠血(图13B)中温育18小时后，大部分模拟体不再是完整的。相反，在猕猴血(图13C)或人血(图13D)中温育24小时后接近100％的模拟体是完整的。
实施例14：GLP-1模拟体在猕猴中的改良的药代动力学
对猕猴静脉内注射1.0mg/kg的4种GLP-1模拟体构建物，在给药后10分钟至5天的不同时间点采集血清样品。通过ELISA评价血清样品，以定量完整模拟体。如在图14中所述，全部4种模拟体都表现出快速分布期，之后是较慢的清除期。计算各种构建物的药代动力学常数，表明在相似暴露下由T＝0至T＝120小时的AUC测定的T1/2约为3天。
实施例15：GLP-1模拟体治疗对小鼠中葡萄糖挑战后的血糖的作用
将8周龄糖尿病db/db小鼠禁食12小时。禁食6小时时，小鼠皮下注射0.02-2mg/kg剂量的A2S模拟体构建物。在GLP-1模拟体给药后6小时暨禁食12小时时，小鼠接受1g/kg口服葡萄糖，于0、15、30、60、90、120、150和180分钟检测其血糖。如图15A所示，与载体对照相比，GLP-1 A2S模拟体在所有剂量都有效降低血糖。对保持高脂肪膳食并禁食12小时的C57/B16小鼠进行相似的实验。如图15B所示，与载体对照相比，GLP-1 A2S模拟体在所有剂量也都有效降低血糖。
实施例16：GLP-1 MMB剂量依赖性抑制细胞因子诱导的凋亡
RIN-m细胞以50,000细胞/孔接种在96孔板中，于37℃过夜温育。第二天，用一定剂量范围的GLP-1 MMB(由100nM连续稀释)处理细胞30分钟，然后加入细胞因子TNFα(10ng/mL)或IL-1β(4ng/mL)。所述板于37℃温育16小时。为测定凋亡，使用Cell DeathELISA-Plus测定试剂盒(Roche Applied Science，目录号11920685001)。由孔中吸出培养基，向每个孔加入200μL裂解缓冲液，所述板于室温温育30分钟。在温育后，将20μL裂解物转移至链霉抗生物素包被的96孔微量滴定板中。另向每个孔加入80μL免疫试剂(抗组蛋白-生物素和抗DNA过氧化物酶在所提供的缓冲液中的1∶20稀释液)。然后将100μL悬浮液于室温温育2小时，轻轻振摇。2小时后，用温育缓冲液清洗板3次，向所述板加入显色溶液。在约5分钟后读取405nm吸光度。数据表明，GLP-1 MMB保护RIN-m细胞免遭TNF-α或IL-1β诱导的凋亡(图16)。
在1型糖尿病(T1D)中，分泌胰岛素的胰腺β细胞有特定毁灭。尽管不知道β细胞毁灭的确切基本分子机制，但T1D患者血清已显示出促进凋亡，提示凋亡在糖尿病发作中起作用。通过用GLP-1 MMB治疗新近发作的患者、处于蜜月期的患者乃至有变成糖尿病倾向的患者，可抑制凋亡和保持β细胞量。
在T1D中，β细胞凋亡可在糖尿病发展中的两个不同疾病期起作用。首先，胰岛凋亡的发育波可影响T细胞生物学，最终影响自身免疫性糖尿病的发作。其次，胰岛凋亡也是细胞死亡模式，最终导致β细胞的大量毁灭。因此，使用GLP-1 MMB抑制β细胞凋亡可用于预防糖尿病的自身免疫发作，或通过保持β细胞量防止发展成明显糖尿病。
T1D是分泌胰岛素的β细胞不可逆损失的结果。但是，胰岛素分泌在某些长期T1D人员中是可检测的，表明存活β细胞的小群体或持续更新的β细胞经历进行性自身免疫破坏。业已表明，T1D具有在复制后经历持续凋亡的β细胞。T1D中β细胞凋亡的频率是对照受试者的2倍。大部分长期T1D人员具有持续受破坏的β细胞。支持增加的β细胞死亡的机制可包括进行性自身免疫和葡萄糖毒性这二者。根据定义，即便有进行性凋亡仍存在β细胞指即便在长期T1D后也一定存在相伴的新β细胞形成。我们推断，对β细胞破坏的靶向GLP-1 MMB抑制可防止或逆转T1D。
在多器官供体中，胰腺中的胰岛在导致尸体器官供体脑死亡的事件当中经历凋亡和坏死，所述事件在器官捐献前的供体临床病程当中延续。另外，胰岛在制备移植用产胰岛素细胞的胰岛分离过程中经历凋亡。而且，当胰岛移植入糖尿病受者的肝脏中时，存在一连串的细胞因子活化，具体地说是TNFα、IL1B和γINF。在供体的胰岛移植当中、在分离过程当中以及在移植当中和之后使用GLP-1MMB减少了凋亡，改善了胰岛功能。其还降低了临床受益所需的胰岛数，提供了在胰岛移植中使用活供体的机会。
实施例17：GLP-1 MMB增加INS-1E细胞中的葡萄糖依赖性胰岛素分泌
将INS-1E细胞以200,000细胞/孔的细胞密度接种入24孔板的RPMI 1640+10％ FBS+1％ L-谷氨酰胺+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+50μM β-巯基乙醇培养基中。使细胞于37℃和5％ CO2中培养7天，并在第3天或第4天补料。用0.4ml KRBH缓冲液/3mM葡萄糖清洗细胞两次，使细胞在该缓冲液中温育30-60分钟。将培养基由细胞中去除，每孔加入含合适量葡萄糖的0.4ml测试品的KRBH溶液。T＝0时间点时去除每孔的20μl上清液，之后于37℃和5％ CO2中温育60分钟，用于胰岛素检测。用Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA试剂盒(Crystal Chem)使用大鼠标准曲线(12.8-0.1ng/ml)测定胰岛素浓度。在测定中使用5μl的1:50稀释度的所述时间点上清液，以便获得落在标准曲线上的值。用Molecular Devices SpectraMax 340PC读板器以OD450减去OD630读取ELISA板。如在图17中所示，GLP-1 MMB以剂量依赖性方式增加胰岛素分泌，但仅在存在增加的葡萄糖时如此。
实施例18：GLP-1 MMB在大鼠和人胰岛中增加葡萄糖依赖性胰岛素分泌
通过胶原酶消化接着Ficoll梯度纯化获得大鼠胰岛。使用在Ricordi等，Diabetes(1998)37，4，413-420中详述的酶消化和密度梯度纯化分离人胰岛。将胰岛置于20×100mm培养皿中的CMRL-1066(Gibco)、青霉素/链霉素(5,000单位/5,000μg)、10％ FBS、1％ L-谷氨酰胺、25mM HEPES、pH 7.2-7.4培养基中过夜，并于37℃和5％ CO2下培养18-24小时。第二天，胰岛漩涡到培养皿中心，将其收集到50mL圆锥管中。让胰岛通过重力在10-15分钟内沉降到管底部。去除上清液，加入功能性/存活力(Functionality/Viability)培养基(MediaTech，目录号99-786-CV)，让胰岛通过重力沉降沉降到管底部。总共清洗胰岛3次。去除上清液，将胰岛以20个胰岛/ml的密度重悬浮在含1％BSA、1％ L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和0.5mM葡萄糖溶液的功能性/存活力培养基中。向24孔板的每孔加入1mL细胞悬浮液(约20个胰岛)，在37℃、5％ CO2下温育2小时。在2小时后，加入含1％ BSA、1％ L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、GLP-1 MMB(50nM终浓度、100nM初始浓度)和3.5mM(n＝12)或15mM(n＝12)终浓度葡萄糖的1mL功能性/存活力培养基。在时间＝0时(胰岛素基线)和加入治疗剂后4小时收集25μl上清液。将上清液储存于-20℃，直至进行胰岛素ELISA。使用Crystal Chem(Downers Grove，IL)Ultra-Sensitive ELISAAssay试剂盒(目录号90060)定量大鼠胰岛素。使用Linco Research(StCharles，MI，目录号EZHI-14K)的Human Insulin ELISA试剂盒定量人胰岛素。图18表明，GLP-1 MMB显著增加大鼠胰岛(图18A)和人胰岛(图18B)的胰岛素分泌。
1型和2型糖尿病最终都是缘于个体β细胞分泌的胰岛素量不足够。通过用GLP-1 MMB治疗糖尿病个体来增强他们的胰岛素分泌的能力应改善或消除其糖尿病病症。重要的是，胰岛素分泌的增加是葡萄糖依赖性的，仅在存在提高的葡萄糖水平时增加。因此，使用GLP-1 MMB使患者经受危险低血糖事件的风险最小。
同样，胰岛素分泌的增加也应对胰岛移植方法有益。通过增加移植胰岛的胰岛素分泌能力，人们可有效降低提供治疗利益所需的胰岛数。在支持胰岛移植的可用尸体胰腺量有限的情况下，使用GLP-1MMB应显著增加可由胰岛移植法获益的患者数量。而且，增加胰岛素分泌的能力可将供体群扩展至活体供体，没有耗尽其胰岛素分泌能力的风险，在没有用GLP-1 MMB干预的情况下，所述风险可导致供体由于不足的胰岛素分泌能力而引起糖尿病发作。
实施例19：GLP-1 MMB对正常小鼠血糖的作用
将正常C57BLK/6小鼠随机分为两组，每组有13只动物。组1每日接受腹膜内(IP)给药的PBS载体或GLP-1 MMB(0.5mg/kg)。两组都治疗10天。每日监测小鼠体重，监测(LifeScan，CA)血糖达32天，在32天的时间点研究终止。
与PBS治疗的小鼠相比，接受GLP-1 MMB治疗的小鼠在10天疗程中显示出血糖降低(图19)。一终止治疗血糖就回复到PBS组的水平。整个研究过程中两组都显示出相同的体重增加(数据未显示)。
高血糖在1型和2型糖尿病中都存在，是引起该病的破坏性继发并发症进展的原因。GLP-1 MMB降低血糖而没有不利地影响接受者总体健康情况的能力(由与以上未治疗对照相同的进行性体重增加证实)应对1型和2型患者均有益。
实施例20：GLP-1 MMB保护糖尿病小鼠β细胞的减少
小鼠(12周龄db/db)过夜禁食。在研究的第1天，小鼠(4组，n＝5/组)皮下给药GLP-1 MMB(1.5mg/kg)或阴性对照模拟体。在研究的第4天，检测禁食血糖，并进行OGTT(口服葡萄糖耐受实验)。使用尾静脉血检测15、30、60、90、120、150和180分钟的血糖水平。使小鼠安乐死，取出胰腺，通过浸入10％中性缓冲福尔马林中固定。将各只小鼠的胰腺包埋在石蜡中，制作切片，用于H&E和免疫组织化学染色。胰岛素染色的形态测定分析表明，与对照相比GLP-1 MMB治疗小鼠中的胰岛素染色的密度显著较高。用给药后14天处死的小鼠重复进行实验，以评价单剂GLP-1 MMB的寿命。再次，胰岛素染色的形态测定分析表明，单剂给予后两周GLP-1 MMB治疗动物中的胰岛素染色的密度较高。胰岛素染色的密度与胰岛中储存的胰岛素的量直接相关，提示GLP-1 MMB治疗在该糖尿病动物模型的胰岛中增加胰岛素分泌和储存。
在2型糖尿病中，不足的胰岛素合成和储存导致高血糖，高血糖是该病的继发性并发症发作和演进的原因。GLP-1MMB增加胰岛素合成和储存的能力应降低2型患者中的高血糖，从而限制了继发性并发症的发作和演进。
实施例21：GLP-1 MMB对糖尿病免疫无应答小鼠中的边际量人胰岛移植的作用
无胸腺nu/nu(裸)小鼠购自Harlan Laboratories。动物圈养在无病毒抗体室中的微型隔离笼中，可自由获取无菌食物和水。所有实验都按照动物实验室看护和使用指引(Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)提出的标准进行。
糖尿病通过静脉内给予新鲜溶解在柠檬酸盐缓冲液中的链脲菌素(200mg/kg)诱发。通过监测诱导后的非禁食血糖值证实诱发糖尿病，只有值≥350mg/dL的动物才用作接受体。在移植边际胰岛量(约50IEQ/g体重)后，通过在移植后第一周每天和此后一周达3次检测非禁食血糖值监测动物的移植功能，所述边际胰岛量指不足以使接受者立即变为正常血糖的量。改善胰岛移植、存活和功能的干预将在移植边际胰岛量的动物中缩短实现血糖量正常的时间。包括两组边际人胰岛量接受者，1组每日接受IP注射GLP-1 MMB(0.5mg/kg)，对照组接受载体IP注射。
当非禁食血糖值的至少2次连续读数≤200mg/dL时，认为动物是血糖良好的。另外，利用葡萄糖耐受测试(1.5g/kg)评价移植功能，葡萄糖耐受测试在移植后超过30天过夜禁食后的治疗和对照动物中进行，以便研究葡萄糖挑战后的葡萄糖清除。实现血糖量正常的动物进行移植物去除，以便排除天然胰腺胰岛的残余功能。
如图20所示，在移植边际胰岛量后，相比于对照小鼠，GLP-1MMB治疗小鼠更快达到血糖量正常。另外，GLP-1 MMB治疗小鼠表现出更有效的葡萄糖挑战清除。这些数据强烈提示，GLP-1 MMB治疗改善移植的人胰岛的移植、存活力和功能，支持GLP-1 MMB在经历胰岛移植方法的供体(包括活体和脑死亡的)和接受者这二者中的用途。这些结果表明，GLP-1 MMB对移植入糖尿病接受者中的人胰岛具有有益作用。而且，数据提示，用GLP-1 MMB治疗提升胰岛移植、存活力和功能，在胰岛移植背景中应是有价值的附属疗法。
实施例22：GLP-1 MMB对非人灵长类动物胰岛中响应于葡萄糖的胰岛素分泌的影响
非人灵长类动物胰岛使用酶消化和密度梯度纯化分离，并分为两组，于37℃在湿润混合的95％空气/5％ CO2下于非组织培养物处理的175cm2摇瓶(Corning，MA)中以约20,000IE的密度培养。1组胰岛单独培养，另一组在补加50nM GLP-1 MMB的MM1中培养。
在培养2天后，收集胰岛，对胰岛样品(2个来自对照组，1个来自GLP-1 MMB组)进行动态刺激测定，以评价葡萄糖浓度对胰岛的胰岛素分泌的作用。胰岛在色谱柱(Bio-gel Fine 45-90nm，Bio-Rad)中用含125mM NaCl、5.9mM KCl、1.28mM CaCl2、1.2mM MgCl2、25mM HEPES、0.1％牛血清白蛋白和3mM葡萄糖的缓冲液于37℃预灌注(perifused)20分钟。胰岛在相同缓冲液中灌注10分钟，然后依次接触11mM和3mM葡萄糖。在用3mM葡萄糖灌注期间每2分钟收集灌注液级分，在刺激期间每分钟收集灌注液级分。通过ELISA测定各个级分中的胰岛素浓度。
在GLP-1 MMB存在下温育的胰岛表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著增加，这与未治疗对照相反(图21)。该数据强有力地支持GLP-1 MMB在体外具有的对胰岛素合成和分泌的积极作用，并进一步支持其在胰岛移植前的用途。在移植前用GLP-1 MMB增加胰岛的效力应在经受胰岛移植方法的1型糖尿病个体中导致实现相同疗效所需的胰岛数减少。而且，人们可由这些结果预见到，用GLP-1 MMB治疗个体将增加体内胰岛效力。这进一步支持对胰岛移植的供体(包括活体和脑死亡的)和接受者这二者的治疗，以增加其边际量胰岛的功能。
实施例23：GLP-1 MMB对猕猴边际量模型中的同种异体胰岛移植和长期存活的作用
非人灵长类动物边际量模型的使用使人们能够研究移植方法，其具有使胰岛数减少的糖尿病逆转的潜力。在边际量模型中，移植约5,000IEQ/kg或实现血糖量正常所需数量(通常为10,000IEQ/kg)的一半。通过利用由同一同种异体供体获得的胰岛，人们消除了供体和分离可变因素。通过移植具有相似移植前胰岛素需求的成对猴子，有可能在药物治疗的猴子中观察到比未接受该药物的猴子增强的胰岛移植，所述药物设计用于增强胰岛功能，限制早期的胰岛损失。
接受者是源自毛里求斯的2-3岁猕猴，相同品系的供体大于4岁。糖尿病用1250mg/m2链脲菌素诱导。糖尿病动物在早餐前用NPH胰岛素治疗，在午餐后用NPH/Lantus治疗，试图将血糖水平保持在150-300mg/dl之间。糖尿病诱发后4周，对猴子进行胰高血糖素挑战，以确认不产生刺激过的c-肽。
收获供体器官，利用在实施例A和实施例B中提到的半自动化方法分离胰岛，接着是2个过夜培养阶段，首先于37℃培养，然后在22℃培养。对照猴的胰岛在标准MM1培养基中培养，实验猴的胰岛在补加50nM GLP-1 MMB的MM1中培养。对猴子进行小型剖腹术，经进入肝脏的门静脉进行胰岛移植。一对猴接受同一供体的约5,000IEQ/kg(如上所述培养)，一只猴子每周两次皮下接受GLP-1MMB(0.2mg/kg)，对照猴不接受。对于对照猴和GLP-1 MMB治疗猴这二者，用临床上使用的无类固醇免疫抑制剂(缩写为SFIS，由低剂量FK506、高剂量雷帕霉素和抗-IL2R诱导疗法组成)防止排斥。一日两次监测动物，以测定禁食和餐后血糖水平(踵刺、血糖仪)，并根据需要用胰岛素治疗，以将血糖保持在餐后100-200mg/dl的范围内。每隔一周测定禁食c-肽，每8周进行1次静脉内葡萄糖耐受测试(IVGTT)，以评价移植功能。
GLP-1 MMB治疗的动物具有优良的葡萄糖控制和外源胰岛素需求显著下降(图22A)。改善的葡萄糖控制由与未治疗对照相比GLP-1MMB治疗动物中的HgbAlc快速降低得到进一步证实(图22B)。该研究进一步支持在经历胰岛移植方法的1型糖尿病患者中使用GLP-1 MMB。
优势：使用该新分子作为治疗剂治疗2型糖尿病提供了几种超越其它GLP-1类似物的优势。例如，其可能延长GLP-1肽的半衰期。另外，模拟体支架中的野生型GLP-1肽抗蛋白酶(具体地说是DPP-IV)降解。这使得可以用野生型GLP-1肽而不是突变肽进行治疗。因为GLP-1是天然肽，所以在GLP-1模拟体治疗的患者中的免疫应答可能低于突变GLP-1类似物治疗的患者中的免疫应答。另外，大尺寸GLP-1模拟体可阻碍其通过血脑屏障。这可提供一种优势，因为恶心和焦虑与GLP-1结合脑中的GLP-1R相关。而且，模拟体平台导致两种肽在各个模拟体分子上表达。这可允许GLP-1肽彼此相互作用，形成可增加对细胞表面GLP-1受体的亲和力的二聚化配体。
以上提供的实例表明，多种GLP-1 MMB构建物对胰岛增殖、胰岛响应于提升的葡萄糖水平分泌的胰岛素量和GLP-1 MMB治疗的糖尿病动物的血糖改善具有积极作用。还已表明，GLP-1 MMB与天然GLP-1肽或其更持久类似物相比具有更优良的药代动力学特性。另外，灵长类动物相对于啮齿动物表现出的改进药代动力学提示，在糖尿病啮齿动物模型中显示出的GLP-1 MMB治疗益处实际上可能低估了GLP-1 MMB用于患者时将具有的临床益处。
所有糖尿病和其它代谢障碍患者都经历的高血糖与胰岛素的相对缺乏直接相关。通过增加产生胰岛素细胞的数量及其胰岛素分泌潜力，产生的胰岛素量显著增加。因此，GLP-1 MMB治疗在胰岛素生产增加应改善患者的临床病症或预后的任何情况下都是有用的。GLP-1 MMB的改善的药代动力学特性将使所述治疗在临床上更加可以接受和便利，因此比现有GLP-1之类的疗法有显著改善。GLP-1MMB疗法有益于所有经受高血糖的患者，无论这种高血糖是缘于糖尿病还是其它代谢障碍。其在测定对糖尿病易感的患者中也用于糖尿病前阶段，以增加胰岛量和延迟糖尿病发作。同样，在全器官和胰岛这二者的移植背景下，其对供体和受体均有益。其还可在体外背景下用于在产胰岛素细胞移植前增加其增殖和刺激产胰岛素祖细胞的分化。
以上实施例提供的证据表明，本发明的GLP-1 MMB在糖尿病和导致高血糖的其它代谢障碍的治疗中具有许多用途。所述实施例无意对GLP-1 MMB的潜在临床用途设定限制，因为对本领域技术人员显而易见的是，本发明的GLP-1 MMB具有的特性使其成为理想抗糖尿病药物，用于远远超出实施例中提出的适应症。
显然，可不同于前述说明书和实施例中的具体描述来实施本发明。根据以上讲述有可能对本发明进行众多修改和变更，因此，这些修改和变更属于本发明范围。

Claims (28)

1.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体核酸包含至少一种编码SEQ ID NO 2或4的氨基酸序列的多核苷酸或与其互补的多核苷酸。
2.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体核酸包含至少一种编码氨基酸序列的多核苷酸或与其互补的多核苷酸，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO 7-14中的至少一个。
3.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体核酸包含编码式(I)的P或多肽的至少一种多核苷酸：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
4.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含SEQ ID NO 2或4的全部连续氨基酸。
5.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体或激动剂包含SEQ ID NO 7-14中至少一个的全部连续氨基酸。
6.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是选自SEQ ID NO 1和6的至少一种生物活性GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO 16)、GSGGGS(SEQ ID NO 17)、GGSGGGS(SEQ ID NO 18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO 19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO 20)，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO 22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO 23)、TVSS(SEQ ID NO 24)和AVSS(SEQ ID NO 25)，H是EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 26)，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO 43)，CH3是GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 44)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
7.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(c)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是SEQ ID NO 6的至少一种生物活性GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO 16)、GSGGGS(SEQ ID NO 17)、GGSGGGS(SEQ ID NO 18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO 19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO 20)，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO 22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO 23)、TVSS(SEQ ID NO 24)和AVSS(SEQ ID NO 25)，H是ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO 27)，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSEKTISKAK(SEQ ID NO 45)，CH3是GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO 46)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
8.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是SEQ ID NO 6的至少一种生物活性GLP-1肽，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO 16)、GSGGGS(SEQ ID NO 17)、GGSGGGS(SEQ ID NO 18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO 19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO 20)，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO 22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO 23)、TVSS(SEQ ID NO 24)和AVSS(SEQ ID NO 25)，H是ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO 28)，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO 45)，CH3是GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO 46)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
9.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO 43)，CH3是GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 44)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
10.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO 45)，CH3是GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO 46)，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
11.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种SEQ ID NO 6的生物活性GLP-1肽，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
12.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L选自GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO 16)、GSGGGS(SEQ ID NO 17)、GGSGGGS(SEQ ID NO 18)、GGSGGGSGG(SEQ ID NO 19)和GGGSGGGSGG(SEQ ID NO 20)，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
13.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V选自GTLVTVSS(SEQ ID NO 21)、GTLVAVSS(SEQ ID NO 22)、GTAVTVSS(SEQ ID NO 23)、TVSS(SEQ ID NO 24)和AVSS(SEQ ID NO 25)，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
14.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H选自EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO26)、ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO 27)和ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO 28)，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
15.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H选自EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO 29)、EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP(SEQ JD NO 30)、EPKSADKTHTCPPCPAPEALGGP(SEQ ID NO 31)、EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP(SEQ ID NO 32)、EPKS SDKTHTCPPCPAPEFLGGP(SEQ ID NO 33)、EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 34)、EPKSADKAHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 35)、EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 36)、ADKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 37)、THTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 38)、ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP(SEQ ID NO 39)、ESKYGPPCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 40)、CPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO 41)和CPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO 42)，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
16.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的GLP-1糖尿病相关病症的方法，所述方法包括使含有效量的至少一种GLP-1激动剂或模拟体核酸、多肽或抗体的组合物接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物，其中所述至少一种GLP-1 CH1缺失的模拟体包含式(I)的P或多肽：
(Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)
其中P是至少一种生物活性GLP-1肽、变体或衍生物，L是至少一种接头序列，该接头序列可为通过使模拟体具有可变方向和结合特性而提供结构柔性的多肽，V是免疫球蛋白可变区C末端的至少一部分，H是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，n是1-10的整数，o、p、q、r、s和t可独立地为0-10的整数。
17.权利要求1的GLP-1 CH1缺失的模拟体核酸或GLP-1 CH1缺失的模拟体多肽，其中所述多肽具有式I的至少一种P多肽的至少一种活性。
18.权利要求1的方法，其中所述方法还包括给予至少一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的至少一种化合物、组合物或多肽，所述化合物、组合物或多肽选自以下的至少一种：糖尿病药物、胰岛素代谢相关药物、可检测的标记或报告物、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻药物、局部药物、营养药物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
19.权利要求1的方法，其中所述有效量为每kg所述细胞、组织、器官或动物0.001-50mg GLP-1 CH1缺失的模拟体或激动剂、0.000001-500mg所述GLP-1 CH1缺失的模拟体或激动剂，或0.0001-100μg所述GLP-1 CH1缺失的模拟体或激动剂核酸，或等同浓度。
20.权利要求1的方法，所述接触或所述给予通过至少一种选自以下的模式：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔含服、舌下、鼻内或透皮。
21.权利要求1的方法，其中所述GLP-1相关病症是代谢疾病。
22.权利要求21的方法，其中所述代谢疾病为高血糖。
23.权利要求21的方法，其中所述代谢疾病为糖尿病。
24.权利要求21的方法，其中所述有效量通过降低需要其的动物中的血糖水平而治疗所述代谢疾病。
25.权利要求21的方法，其中所述有效量通过增加产胰岛素细胞的胰岛素分泌而治疗所述代谢疾病。
26.权利要求21的方法，其中所述有效量通过防止产胰岛素细胞凋亡而治疗所述代谢疾病。
27.权利要求21的方法，其中所述有效量通过增加产胰岛素细胞的增殖治疗所述代谢疾病。
28.权利要求1的方法，其中所述GLP-1相关病症涉及糖尿病。
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