KR20070090036A - Ｇｌｐ-1 작용제, 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 GLP-1 모방체 또는 작용제 또는 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 분리된 핵산, GLP-1 모방체 또는 작용제 또는 특정 부분 또는 변형체, 벡터, 숙주 세포, 트랜스제닉 동물 또는 식물을 포함하는 적어도 하나의 신규한 인간 GLP-1 모방체 또는 작용제 또는 특정 부분 또는 변형체 및 당뇨병 관련 치료적 및 또는 진단적 조성물, 방법 및 장치를 포함하는 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.

Description

ＧＬＰ-1 작용제, 조성물, 방법 및 용도{GLP-1 AGONISTS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES}

본 발명은 당뇨병 관련된 치료적 제제, 투여 및 장치를 포함하며, 생물학적으로 활성이 있는 단백질, 단편 또는 리간드에 특이적인 GLP-1 모방체, 특정 부분 및 변형체와 같은 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 작용제, GLP-1 작용제 암호화 및 상보적 핵산, 숙주 세포 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질은 치료적 약제의 신흥 분류이다. 잠재적 치료법으로써 재조합 단백질의 용도는 화학적 변형의 용도를 또한 포함하여, 치료적 단백질 제제에서의 발전을 위한 기회를 제공한다. 그러한 변형은 잠재적으로 혈청 반감기 증가(예를 들어, 단백질 가수 분해 효소에 그들의 노출을 차단하여), 생물학적 활성 증진, 및/또는 원하지 않는 부작용 감소에 의해서와 같이 잠재적으로 치료적 유용성을 증가시킬 수 있다. 하나의 그러한 변형은 엔테라셉트(enteracept)와 같이 수용체 단백질에 융합된 면역 글로불린 단편의 용도이다. 융합 단백질은 더 긴 반감기를 제공하기 위한 또는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합 및 보체 결합과 같은 기능을 병합시키기 위한 시도로 항체 Fc 도메인을 이용하여 건설될 수 있다.

효율적 약제학적 치료 중 2025년까지 3억 넘는 사람들에 영향을 미치는 것으 로 알려진 당뇨병은 증대하는 전염성이다. 당뇨병의 대부분 경우는 유아-발병 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)으로도 알려진 제 1형 및 성인-발병 당뇨병으로도 알려진 제 2형, 두 임상적 타입으로 분류되며, 이는 모든 경우의 90-95%를 차지한다.

IDDM은 인슐린을 생산하는 부분 또는 전체 무능력에 의하여 특성화된다. 제 1형 당뇨병은 유전적으로 미리 갖고 있는 개체내에서 랑게르한스섬의 인슐린-생산 β 세포를 선택적으로 파괴하는 점진적 자가면역 반응으로부터 기인한다고 일반적으로 인지된다.

제 2형 당뇨병으로 진단된 환자의 이자는 인슐린을 여전히 합성하고 분비할 수 있다. 그러나 인슐린이 그의 효과를 가하는 조직의 민감성이 손상된다. 덧붙여, 제 2형 당뇨병의 수는 나중의 단계에서 인슐린 의존적이며, 그들의 인슐린 저항성을 개선하기 위하여 인슐린 주입이 필요하다.

증가된 플라스마 당 수치를 보유하여 기인한 합병증은 심혈관 질환, 신장병증, 신경병증 및 망막병증을 포함한다. 인슐린 주입 또는 인슐린 펌프를 통한 인슐린 대체 요법은 EDDM을 위한 표준 치료법이다. 그러나, 그러한 인슐린의 전달이 조절되지 않고, 종종 정상 범위보다 많게 및 적게, 환자의 혈당을 변동시킨다. 인슐린-필요 당뇨병을 치료하기 위한 연구 하에서 잠재적 대체적인 방법은 정상 공여자로부터 당뇨병 환자에게로의 이자 또는 섬 이식이다. 만약 이식 거부의 문제가 면역억제 치료법 또는 다른 수단을 이용한 몇몇 노력으로 개선될 수 있다면, 이자 또는 섬 세포 이식은 잠재적으로 혈중 당 수치를 정상화하고, 섬이 당에 반응하여 인 슐린을 분비하는 생리적 방식을 보유할 수 있다. 그러나 이식의 거부를 예방하기 위하여 필요한 면역저해 치료법으로 합병증 발생을 한편에 두고, 이러한 연구를 제한시키는 주요한 요소는 인간 공여 조직의 부족이다. 덧붙여, 이식을 위한 살아있는 공여자 전략은 공여자가 당뇨병이 되도록 할 수 있다.

대부분의 제 2형 당뇨병 환자를 위하여, 부분적으로 인슐린 민감성의 증가, 인슐린 저항성 감소 및/또는 인슐린 보호를 증가시키는 것에 의하여, 혈당을 낮추기 위한 시도로 경구 약제가 이용된다. 그러나 그러한 치료법은 공극적으로 효율적이지 않고, 예를 들어, 많은 경우에서, 경구 약제는 효과적이지 않거나, 시간을 넘으면 효율적이지 않게 되고, 인슐린 주입은 적합한 당 수치를 유지하기 위하여 몇 단계가 필요하다.

당뇨병의 대부분 최근의 치료는 저혈당 및 체중 증가를 포함한, 수많은 해로운 부작용과 연관된다. 덧붙여, 모든 유효한 중재에도 불구하고, 여전히 허용할 수 있는 범위내에 그들의 혈당을 유지할 수 없는 유의적인 수의 환자가 있다. 이에 따라, 제 1형 및/또는 제 2형 당뇨병, 뿐만 아니라, 그로 인해 기인한 합병증을 치료하는 대체적인 방법을 제공할 필요가 있다.

글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)은 경구 글루코오스 투여 다음으로, 장의 L-세포로부터 분비되는 37-아미노산 펩티드이다. 6번째 그리고 7번째 위치 사이에 적절한 내부 절단은 생물학적으로 활성 있는 GLP-1(7-37) 펩티드를 생성한다. GLP-1(7-37) 펩티드 서열은 2개의 구조적 도메인으로 분리될 수 있다. 펩티드의 나머지가 나선 구조에서 GLP-1 수용체의 세포 외 루프에 결합하는 것으로 보이는 반면, 펩티드의 아미노 말단 도메인은 신호에 관여할 수 있다. 글루코오스에 대한 반응으로, 활성이 있는 GLP-1은 이자의 GLP-1 수용체에 결합하고, 인슐린 분비를 증가(인슐리노트로픽 활동(lnsulinotropic action))시키는 것으로 보인다. 덧붙여, GLP-1이 순환계로 배출되는 글루코오스의 덩어리를 감소시키는 위 배출을 감소시키는 것으로 보이며, 음식 섭취를 감소시킬 수 있다. GLP-1은 또한 글루카곤 분비를 저해하는 것으로 보이며, 이에 따라, 간에서 저장된 당의 내부 배출을 감소시킨다. 이러한 활동, 단일, 또는 더 낮은 혈당 수치와 조합적으로, GLP-1은 또한 생체내, 및 실험상 연구에서, 세포 괴사를 저해하고, 이자에서 β-세포의 증식을 증가시키는 것으로 보인다. 덧붙여, GLP-1 활동은 혈당 수치에 의하여 조절되는 것으로 보인다. 혈당 수치가 특정 역치 수치까지 떨어졌을 때, GLP-1은 활동적이지 않다. 이에 따라, 동물에 GLP-1의 투여와 관련된 저혈당의 위험이 거의 없는 것으로 나타난다.

그러나 GLP-1은 디펩티딜-펩티다제 Ⅳ(DPP-Ⅳ) 펩티다제에 의하여, 생체내에서 빠르게 비활성화된다. 이에 따라, GLP-1 펩티드가 관여하는 치료법의 잠재적 유용성은 그들의 빠른 제거 및 짧은 반감기에 의해 제한된다. 예를 들어, GLP-1(7-37)은 오직 3 내지 5분의 혈청 반감기를 갖는다. GLP-1(7-36) 아미드는 피하내 투여되었을 때 약 50분의 활동 시간을 갖는다. 내부 펩티다제 절단에 저항성있는 유사체 및 유도체조차도 24시간의 기간에 걸친 반복적 투여를 피하기 위한 충분한 반감기를 갖지 않는다. 예를 들어, 엑서나타이드(exenatide)는 DPP-Ⅳ에 대하여 저항성이 있지만, 생체내 약동학 NN2211에서 유의적 변동성과 짧은 반감기 때문에, 여전히 매일 식전 복용을 두번 필요로 하고, 현재 임상적 시험 상태에 있는 또다른 화합물은 지질화된 GLP-1 유사체이다. 매일 한번의 투여일 것이라 예상된다.

반복된 투여가 필요할 것이기 때문에, 치료적 약제의 빠른 제거는 연장된 기간의 시간에 걸쳐 약제의 높은 혈중 수치가 유지되기 원하는 경우에, 불편하다. 더욱이, 긴-활동 화합물은 당뇨병 환자의 빠른 치료 요법이 경구 약제를 가져오는 것에 속하는 당뇨병 환자에게 특히, 중요하다. 이러한 환자는 약제의 다중 주입에 속하는 치료법을 위한 이행의 극심한 어려운 시간을 종종 갖는다. 증가된 반감기를 갖는 GLP-1 치료법은 개발 중에 있는 다른 GLP-1 펩티드 및 화합물에 걸쳐 유의적 장점을 갖는다.

이에 따라, 종래에 알려진 하나 이상의 문제점을 극복하는 개선된 및/또는 변형된 이형의 GLP-1 치료적 단백질을 제공할 필요가 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 본 분야에 알려진 것과 조합하여 여기에서 개시되고/거나 가능한 바와 같은, 변형된 단백질, 펩티드, 면역 글로불린, 절단 생성물 및 다른 특정 부분 및 이의 변형체를 포함하는 GLP-1 모방체를 포함하는 GLP-1 작용제, 뿐만 아니라, GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물 암호화 또는 상보성 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제형, 장치, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 및 이의 제조 및 이용 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 여기에서 개시되고/거나 본 분야에 알려진 바와 같은, 적어도 하나의 분리된 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 제공한다. GLP-1 모 방체는 적어도 하나의 GLP-1 치료적 펩티드(P)에 직접적으로 링크되는, 부가적 링커 서열(L)에 직접적으로 링크되는, 적어도 하나의 부분의 가변 영역(V)에 직접적으로 링크되는, 적어도 하나의 힌지 영역 또는 이의 단편(H)의 적어도 하나의 부분에 직접적으로 링크되는 적어도 하나의 CH2 영역에 직접적으로 링크되는 적어도 하나의 CH3 영역을 부가적으로 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, CH3-CH2-힌지-부분의 V 영역 서열-링커-치료적 펩티드 서열의 쌍은 적어도 하나의 Cys-Cys 이황화 결합 또는 적어도 하나의 CH4 또는 다른 면역글로불린 서열과 같으나, 이에 한정되지 않는 회합 또는 공유 링크에 의하여 부가적으로 링크된다. 일 구체예에서, GLP-1 모방체는 화학식(I)을 포함한다.

화학식 (I) (P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

L은 적어도 하나의 링커 서열이고,

V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,

H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

n은 1 내지 10의 정수이며,

o, p, q, r, s, 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.

여기서, L은 모방체가 대신하는 기원 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써, 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있고,

o, p, q, r, s, 및 t는 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD, IgE 또는 이의 임의의 하류 분류 등 또는 이의 임의의 조합이나, 이에 한정되지 않는 다른 타입의 면역 글로불린 분자를 모방한다.

항체 서열의 가변 영역은 적어도 하나의 서열 번호 47-55 또는 이의 단편의 적어도 한 부분일 수 있으며, 더욱이 부가적으로 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. CH2, CH3 및 힌지 영역은 적어도 하나의 서열 번호 56-64, 또는 이의 단편의 적어도 한 부분, 더욱이 부가적으로 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.(Kevin, 이러한 서열은 서열 목록에 함유되어 있으나, 참조로 삽입되기 원하지 않는다면 그럴 필요가 없다.)

이에 따라, 본 발명의 GLP-1 모방체는 GLP-1 치료적 펩티드와 그것의 고유의 또는 습득된 실험상, 생체내 또는 인 시츄(in-situ) 특성 또는 활성을 제공하는 반면, 그것의 고유의 특성 및 기능을 갖는 항체 또는 면역 글로불린 구조 또는 기능의 적어도 한 부분을 모방한다. 항체 및 본 발명의 GLP-1 모방체의 치료적 펩티드 부분의 다양한 부분은 종래에 공지된 것과의 조합으로 여기에 개시된 바와 같이, 다양할 수 있다.

본 발명은 또한, 종래에 공지되거나, 여기에 개시된 바와 같은 화학식 (Ｉ)의 P 부분에 상응하는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드 또는 폴리펩티드의 공지된 생물학적 활성과 같으나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 활성을 갖 는 적어도 하나의 분리된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 제공한다.

일면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 또는 부가적으로 종래에 공지되거나, 여기에 개시된 대로, 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입이 있는 적어도 하나의 폴리펩티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체를 제공한다. 또다른 면에서, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 화학식 (Ｉ)의 모방체의 P 부분에 상응하는 적어도 하나의 GLP-1 펩티드 또는 폴리펩티드의, 예를 들면, GLP-1 수용체, 또는 이의 단편이지만, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 리간드의 전체 아미노산 서열에 적어도 1-3을 포함하는 적어도 하나의 에피토프에로의 결합을 모방하며, 여기서, 리간드는 서열 번호 1 또는 부가적으로, 종래에 공지되거나, 여기에 개시된 바와 같은 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입의 적어도 한 부분에 결합한다. 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체는 부가적으로, 적어도 10^-9M, 적어도 10^-10M, 적어도 10^-11M, 또는 적어도 10^-12M의 친화도 GLP-1 수용체에 결합할 수 있다. 더욱이, GLP-1 작용제 또는 모방체를 공지된 방법에 따라, 수용체 또는 이의 단편을 향한 결합 활성과 같으나, 이에 한정되지 않는 상응하는 활성을 스크리닝할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체에 적어도 하나의 항-이디오타입(idiotype) 항체를 더욱 포함한다. 항-이디오타입 항체 또는 단편은 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체에 특이적으로 결합한다. 항-이디오타입 항체는 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체의 GLP-1 리간드 결합 영역에 경쟁적으로 결합하는 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(framework) 영역, 또는 이의 임의의 부분과 같으나, 이에 한정되지 않는 면역 글로불린 분자의 적어도 한 부분을 포함하는 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 그러한 이디오타입 항체는 인간, 마우스, 래빗, 랫, 설치류, 영장류 등과 같으나, 이에 한정되지 않는 임의의 동물을 함유하거나 유도될 수 있다.

본 발명은 일면에서, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 부분 또는 이의 변형체를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체, 또는 이의 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 유의적 동일성을 갖거나, 이에 혼성화되는 보체를 포함한 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 적어도 하나의 상기 분리된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체 암호화 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 그러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포, 뿐만 아니라, 그러한 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조 및/또는 이용 방법을 더욱 포함한다.

또한 제공되는 것은, 적어도 하나의 분리된 포유동물 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항이디오타입 항체를 암호화하는 분리된 핵 산, 분리된 핵산을 함유하는 분리된 핵산 벡터, 및/또는, 분리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다. 숙주 세포는 부가적으로 COS-I, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-I, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종 또는 림프종 세포 ㄸ또는 임의의 유도된, 무한증식화된 또는 이의 형질전환된 세포로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.

본 발명은 또한, 감지하거나 회수할 수 있는 양으로 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체 또는 특정 부분 또는 변형체가 발현되도록 하는 환경 하에서, 종래에 공지된 바 및/또는 여기에 개시된 바와 같이 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체, 또는 특정 부분 또는 변형체를 발현하기 위한 적어도 하나의 방법을 제공한다. 또한 제공되는 것은 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체가 감지할 수 있거나 회수할 수 있는 양으로 발현하는, 실험상, 생체내, 인 시츄상에서의 환경 하에서, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체 암호화 핵산을 번역하는 것을 포함하여 적어도 하나의 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 작용제 또는 모방체 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법이다.

또한 제공되는 것은, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 항이디오타입 항체를 회수할 수 있는 양으로 발현시킬 수 있는 숙주 세포 또는 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물을 제공하는 것을 포함하여, 본 발명의 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 GLP-1 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법이다.

본 발명에서 더욱 제공되는 것은 상기 방법에 의하여 제조되는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체이다.

본 발명은 또한, (a) 본 발명에 개시된 바와 같은 분리된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 암호화 핵산 및/또는 GLP-1 작용제 또는 모방체, 및 (b) 적절한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다. 담체 또는 희석제는 부가적으로 공지된 방법에 따라, 약제학적으로 허용가능할 수 있다. 조성물은 부가적으로 적어도 하나의 다른 화합물, 단백질 또는 조성물을 더욱 함유할 수 있다.

또한 제공되는 것은 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이다. 조성물은 부가적으로 적어도 하나의 당뇨병 약물, 인슐린 대사 관련 약물, 글루코오스 대사 관련 약물, 감지할 수 잇는 표지 또는 리셉터, 항-감염성 약물, 심혈관 (CV) 계 약물, 중추신경계 (CNS) 약물, 자율신경계 (ANS) 약물, 기도 약물, 위장 (GI) 관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액 약물, 항암제, 면역조절제, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 항-염증 약물(NTHE), 진통제, 마취제, 진정제, 국부 마취제, 신경근육차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드제, 동화 스테로이드제, 에리쓰로포이에틴, 면역화, 면역 글로불린, 면역억제, 성장 호르몬, 성장 대체 약물, 방사성약물, 항정신병제, 자극제, 천식 약제, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린, 또는 유사체, 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 유효량의 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따라 치료적 또는 예방적 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 전달의 적어도 하나의 조성물, 장치 및/또는 방법을 제공한다.

본 발명은 치료적 유효량을 투여하여, 종래에 알려진 바 및/또는 여기에 개시된 바와 같이, 관련된 증상 전, 후, 동안에, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자 내에서, 적어도 하나의 GLP-1 관련 증상을 조절하거나 치료하기 위한, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 방법 또는 조성물을 더욱 제공한다.

본 발명은 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자 및/또는 종래에 알려진 바와 같은 증상 치료 또는 관련 질환 동안, 전, 후와 같으나, 이에 한정되지 않는 이를 필요로 하는 많은 다른 증상에서 적어도 하나의 대사, 면역, 심혈관, 감염성, 악성, 신경학적 질환의 조절을 위하여, 치료 또는 징후를 감소시키기 위해, 치료적 유효량으로 투여될 때, 방법 또는 조성물에서 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분 또는 변형체를 더욱 제공한다.

본 발명은 종래에 공지된 바와 같이, 증상 치과 또는 관련 질환 전, 후, 동안과 같으나 이에 한정되지 않는 많은 다른 증상에서 필요한 바, 적어도 하나의 당뇨병 또는 인슐린 대사 관련 장애, 글루코오스 대사 관련 장애, 뼈 및 관절 장애, 심혈관 장애, 치아 또는 구강 장애, 피부과 장애, 귀, 코 또는 인후 장애, 내분비 또는 대사 장애, 위장 장애, 부인과 장애, 간 또는 쓸개 장애, 산과학 장애, 혈액 장애, 면역 또는 알러지 장애, 감염성 질환, 근골격 장애, 종양 장애, 신경 장애, 영양 장애, 안과 장애, 소아과 장애, 중독 장애, 정신 장애, 신장 장애, 폐 장애, 또는 임의의 다른 공지된 장애(예를 들어 전체가 여기에 참조로 삽입된, The Merck Manual, 17th ed , Merck Research Laboratories, Merck and Co , Whitehouse Station, NJ (1999)참조)의 징후를 치료하거나 줄이기 위하여, 조절하기 위하여, 치료적 유효량으로 투여될 때, 방법 또는 조성물에서. 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분 또는 변형체를 더욱 포함한다.

본 발명은 또한, GLP-1 관련 증상을 진단하기 위한 본 발명에 따른 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 의 적어도 하나의 조성물, 장치 및/또는 이송 방법을 제공한다.

본 발명은 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자 및/또는 관련 증상 전, 후 또는 동안에 종래에 공지된 바 및/또는 여기에 개시된 바와 같이, 적어도 하나의 GLP-1 관련 증상을 진단하기 위한, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 방법 또는 조성물을 더욱 제공한다.

또한 제공되는 것은 (a) 본 발명의 유효량의 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 투여하는 것을 포함하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 질환 증상을 진단하거나 치료하기 위한 방법이다. 방법은 0-24 시간, 1-7 일, 1-52 주, 1-24 달, 1-50 년 또는 임의의 범위 또는 그 수치 당 세포, 조직, 기관 또는 동물의 0001-50 mg/킬로그램의 유효량 또는 만약 실험상 또는 인 시츄상에서 실행된다면, 당량의 농도 또는 몰 농도를 부가적으로 이용하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 부가적으로 생체내, 비경구, 피하내, 근육내, 정맥내, 관절강내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 뇌내, 공내, 뇌강내, 대장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 결장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 결장, 협측, 설하, 비내, 또는 경피 수단으로 부터 선택된 적어도 하나의 방식에 의하여 접촉 또는 투여를 이용하는 것을 더욱 포함할 수 있다. 방법은 부가적으로 (a) 적어도 하나의 당뇨병 약물, 인슐린 대사 관련 약물, 글루코오스 대사 관련 약물, 감지할 수 있는 표지 또는 리포터, 항-감염성 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추신경계 (CNS) 약물, 자율 신경계 (ANS) 약물, 기도 약물, 위장 (GI) 관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역조절제, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, TNF 길항제, 항류마티즘제, 근육이완제, 마약, 비-스테로이드 항-염증 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화 스테로이드, 에리쓰로포이에틴, 면역화, 면역 글로불린, 면역저해, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성약물, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 비타민, 성장 요소, 또는 항산화제로부터 선택된 유효량의 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 접촉시키거나 투여하는 것 전, 동시, 또는 후에 투여하는 것을 더욱 포함할 수 있다.

또한 제공되는 것은 본 발명의 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체를 포함하는 의학 장치이며, 여기서, 장치는 실험상, 비경구, 피하내, 근육내, 정맥내, 관절강내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 뇌내, 공내, 뇌강내, 대장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 결장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 결장, 협측, 설하, 비내, 또는 경피 수단으로부터 선택된 적어도 하나의 형태에 의하여 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체를 접촉시키거나 투여하기 위하여 적절하다.

또한, 제공되는 것은 물질 및 용액 또는 본 발명의 적어도 하나의 분리된 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체의 동결 건조된 형태를 포함하는 용기를 포장하는 것을 포함하여, 인간 약제학적 또는 진단 용도를 위한 제품이다. 제품은 부가적으로 실험상, 비경구, 피하내, 근육내, 정맥내, 관절강내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 뇌내, 공내, 뇌강내, 대장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 결장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 결장, 협측, 설하, 비내, 또는 경피 운반 장치 또는 계의 조성물로써, 용기를 갖는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 여기에 개시된 임의의 발명을 더욱 제공한다.

도 1은 중요한 기능적 도메인을 나타내는 IgG1 골격에서 GLP-1 모방체의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열을 보여준다.

도 2A-2C는 GLP-1 모방체의 FACS 결합 분석을 보여준다.

도 2A는 GLP-1 모방체가 GLP-1R을 과-발현하는 HEK293 세포에 결합하는 것을 보여준다. 회색 : GLP-1 모방체, 2차 없음, 검은색 : 2차만; 빨간색 : 음성 대조군 모방체 및 2차, 파란색 : GLP-1 모방체 및 2차.

도 2B는 GLP-1 모방체가 대조군 HEK293 세포에 결합하지 않는 것을 보여준다. 회색 : GLP-1 모방체, 2차 없음, 검은색 : 2차만; 파란색 : GLP-1 모방체 및 2차.

도 2C는 GLP-1 펩티드 유사체(A2S)가 GLP-1R을 과-발현하는 HEK293 세포에 결합하기 위하여, GLP-1 모방체와 경쟁할 수 있음을 보여준다. 회색 : GLP-1 모방체, 2차 없음, 검은색 : GLP-1 모방체 및 2차, 오렌지색 : GLP-1 모방체, 0.2nM 경쟁자, 2차, 파란색 : GLP-1 모방체, 20nM 경쟁자, 2차, 빨간색 : GLP-1 모방체, 100nM 경쟁자, 2차.

도 3A-3E는 GLP-1 모방체의 cAMP 분석을 나타낸다. 도 3A는 IgG1 골격에서, wt GLP-1 모방체이며, 도 3B는 GLP-1 펩티드이고, 도 3C는 IgG4(Ala/Ala, Ser -> Pro) 골격에서, GLP-1(A2G) 모방체이며, 도 3D는 IgG4(Ala/Ala, Ser -> Pro) 골격에서 GLP-1(A2S) 모방체이고, 도 3E는 IgG4(Ala/Ala, Ser -> Pro) 골격에서 wt GLP-1 모방체이다.

도 4는 DPP-Ⅳ 절단을 위한 GLP-1 모방체의 저항성을 나타낸다.

도 5는 인간 혈청에서 GLP-1 펩티드와 비교한 바와 같이, GLP-1 모방체의 개선된 안정성을 보여준다.

도 6은 GLP-1 모방체가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 유발하는 것을 묘사한다. 도 6A는 GLP-1(7-36) 펩티드 및 엑센딘-4 펩티드(exendin-4 peptide)가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 자극하는 것을 보여준다. 도 6B는 IgG1 또는 IgG4 (Ala/Ala, Ser -> Pro) 골격에서 GLP-1(A2S) 모방체, 또는 IgG4(Ala/Ala, Ser -> Pro) 골격에서 GLP-1(A2G) 모방체가 RINm 세포에서 인슐린 분비를 자극하는 데 활성이 있는 것을 보여준다.

도 7은 당뇨병 마우스의 공복 혈당에서 GLP-1 모방체의 효과를 나타낸다. 도 7A는 GLP-1 모방체가 공복 혈당을 낮추는 것을 보여준다. 도 7B는 효과가 투여량-의존적임을 보여준다.

도 8A는 실험상 분리된 랫 섬의 증식에서 GLP-1 모방체의 효과를 보여준다. 도 8B는 랫 섬 증식에서 GLP-1 모방체 투여량의 효과를 나타낸다.

도 9는 실험상 분리된 비-인간 영장류(NHP) 섬의 증식에서 GLP-1 모방체의 효과를 나타낸다.

도 10A는 실험상 분리된 인간 섬의 증식에서 GLP-1 모방체의 효과를 나타낸다. 도 10B는 인간 섬 증식에서 GLP-1 모방체 투여량의 효과를 나타낸다.

도 11은 실험상 분리된 랫 섬으로부터 인슐린 분비에 GLP-1 모방체의 효과를 나타낸다.

도 12는 마우스에서 GLP-1(A2S) 모방체(도 12B)와 비교하여 GLP-1 펩티드(도 12A)의 약동학적 특성을 보여준다.

도 13은 마우스(도 13A), 랫(도 13B), 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이(도 13C) 및 인간(도 13D)로부터의 혈중 GLP-1 모방체의 안정성을 보여준다.

도 14는 사이노몰거스 원숭이에서 GLP-1 모방체의 생체내 안정성을 보여준다.

도 15는 db/db 마우스(도 15A) 및 DIO 마우스(도 15B)에서 경구 글루코오스 투여 다음, 혈당에서 GLP-1 모방체 처리의 효과를 나타낸다.

도 16은 GLP-1 모방체가 투여량-의존적 방식으로 사이토카인-유도 세포자멸사를 저해하는 것을 보여준다. 치료되지 않은 대조군과 비교하여 세포자멸사의 퍼센트는 GLP-1 MMB의 농도에 대하여 작도한다.

도 17은 INS-1E 세포에서 GLP-1 모방체가 글루코오스-의존적 인슐린 분비를 증가시키는 것을 보여준다. A. 막대 그래프는 5.5mM 글루코오스의 퍼센트 내 GLP-1 MMB의 각각 농도에서 분비되는 인슐린의 양을 보여준다. 덧붙여, 3 및 7.5mM 글루코오스에서 분비된 인슐린만 작도하였다. B. 분비되는 인슐린의 양은 GLP-1 MMB의 농도에 대하여 작도하였다. 데이터를 0.07nM의 EC50을 제공하는 힐 방정식에 맞췄다.

도 18은 랫(도 18A) 및 인간 섬(도 18B)에서 GLP-1 모방체가 글루코오스-의존성 인슐린 분비를 증가시킨다는 것을 보여준다.

도 19는 정상적 C57/BLK6 마우스의 혈당에서 GLP-1 MMB 치료의 효과를 보여 준다.

도 20은 인간 섬의 한계 질량으로 이식된 STZ 처리 당뇨 누드 마우스의 혈당 수치(도 20A) 및 당부하(도 20B)에서 GLP-1 MMB 처리의 효과를 보여준다. 도 20A에서 혈당은 PBS(X)로 처리된 대조군 마우스 및 매일 IP 주입을 받은 PBS(X) 및 GLP-1 MMB 처리된 마우스(■)를 위하여 시간(일)에 대하여 작도하였다. 인간 섬(50 IEQ/g)의 한계 질량은 0일째 이식되며, 그 후에 동물에서 혈당을 모니터하였다. 화살표는 이식된 섬이 제거되었을 때 당뇨 상태로 되돌아가도록 시도된다는 것을 지시한다. 도 20B에서, PBS(X)로 처리한 대조군 마우스 및 GLP-1 MMB(0.5 mg/kg) (■)을 위하여 혈당을 시간(분)에 대해 작도하였다. 마우스를 >30일 동안 매일 IP 주입을 시킨 다음, ⅣGTT를 수행하였다. 동물을 오버나이트 공복되도록 하고, 다음, Ⅳ 글루코오스 주입(1.5 g/kg)을 수행하였다. 마우스의 혈당을 모니터하고, 주입후 시간에 대하여 작도하였다. 삽입은 대조군 및 GLP-1 MMB 처리된 동물을 위한 곡선 아래의 영역을 나타낸다.

도 21은 비-인간 영장류(NHP) 섬 내 글루코오스-유도된 인슐린 분비에서 GLP-1 MMB의 효과를 보여준다.

도 22는 한계 질량으로 이식된 STZ 당뇨병 NHP의 외인 인슐린 필요(도 22A) 및 헤모글로불린 A1c(HgbA1c)(도 22B)에서 GLP-1 MMB의 효과를 보여준다.

본 발명은 분리된, 재조합 및/또는 합성 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체, 뿐만 아니라 조성물 및 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암호화 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 그러한 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 특정 GLP-1 작용제 또는 모방체 서열, 도메인 단편 및 이의 특정 변형체, 및 상기 핵산의 제조 및 이용 방법과 치료적 조성물, 방법 및 장치를 함유한 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함한다.

본 발명은 또한 종래에 공지된 바 및/또는 여기에 개시된 바와 같이 적어도 하나의 분리된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 제공한다. GLP-1 모방체는 부가적으로, 적어도 하나의 GLP-1 치료적 펩티드(P)에 직접적으로 링크되는, 부가적 링커 서열(L)에 직접적으로 링크되는, 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)에 직접적으로 링크되는, 적어도 하나의 힌지 영역 또는 이의 단편(H)에 직접적으로 링크되는, 적어도 하나의 CH2 영역에 직접적으로 링크되는 적어도 하나의 CH3 영역을 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, GLP-1 모방체는 화학식 (I)을 포함한다:

화학식 (I) ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드이며,

L은 적어도 하나의 링커 서열이고,

V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단의 적어도 한 부분이며,

H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

m, n, o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10을 포함하는 정수일 수 있다.

여기서, L은 모방체가 대신하는 기원 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써, 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있고,

m, n, o, p, q, r, s 및 t는 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD, IgE 또는 이의 임의의 하류 분류 등 또는 이의 임의의 조합이나, 이에 한정되지 않는 다른 타입의 면역 글로불린 분자를 모방한다.

이에 따라, 본 발명의 GLP-1 모방체는 치료적 펩티드 및 실험상, 생체내 또는 인 시츄 상에서 그것의 본래의 또는 습득된 특성 또는 활성을 제공하는 동안, 그것의 본래 특성 및 기능을 갖는 항체 구조를 모방한다. 바람직한 구체예에서, t=1일 때, 모노머 CH3-CH2-힌지-부분 J(J는 상기에서 개시되지 않음)서열- 링커-치료적 펩티드는 비제한적으로 Cys-Cys 이황화 결합과 같은 회합 또는 공유 링크에 의하여 다른 모노머에 링크될 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체의 GLP-1 치료적 펩티드의 부분과 항체의 다양한 부분은 여기에 개시된 바와 같이 종래에 공지된 것과 조합되어 다양할 수 있다.

CH2-CH3-힌지의 부분은 광범위하게 변형되어, 구제 수용체에 대한 결합의 유지를 제공하는 본 발명에 따른 변형체를 형성할 수 있다. 그러한 변형체에서, 본 발명의 융합 분자에 의하여 요구되지 않는 구조적 특성 또는 기능적 활성을 제공하는 하나 이상의 본래 부위를 결실시킬 수 있다. 예를 들어, 잔기의 치환 또는 결실, 부위로 잔기의 삽입 또는 부위를 함유하는 부위의 절단에 의하여 이러한 부위를 결실시킬 수 있다. 삽입된 또는 치환된 잔기들은 또한, 펩티도모방체 또는 D-아미노산과 같은 변형된 아미노산 일 수 있다. CH3-CH2-힌지의 변형체는 (1) 이황화 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와 부적합, (3) 선택된 숙주 세포 내에서의 발현에 따른 이질성, (4) 당화, (5) 보체와의 상호작용 (6) 구제 수용체 외의 Fc 수용체에 대한 결합 또는 (7) 항체-의존 세포적 세포 독성 (ADCC)에 영향을 미치거나 관여하는 하나 이상의 본래 부위 또는 잔기가 결여될 수 있다. 바람직한 CH3-CH2-힌지 변형체는 이황화 결합 형성에 관여하는 1 부위가 결실된 분자 및 서열을 함유한다. 그러한 결실은 본 발명의 분자를 생산하기 위하여 이용되는 숙주 세포에서 나타나는 다른 시스테인-함유 단백질과 반응을 피할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산(예를 들어, 알라닐, 세릴)으로 치환될 수 있다. 심지어 시스테인 잔기가 결실되었을 때, 단일 사슬 CH3-CH2-힌지 도메인은 여전히 비-공유결합적으로 함께 유지되는 다이머 CH3-CH2-힌지 도메인을 형성할 수 있다. 2. CH3-CH2-힌지 영역은 변형되어 선택된 숙주 세포와 그것이 더욱 호환되도록 한다. 예를 들어, 분자가 E. coli와 같은 박테리아 세포 내에서 재조합적으로 발현될 때, 프롤린 펩티다제와 같은 E. coli내의 소화 효소에 의하여 인지될 수 있는 힌지 내의 PA 서열을 결실시킬 수 있다, 3. 힌지 영역의 부분은 결실되거나, 다른 아미노산으로 치환되어 선택된 숙주 세포에서 발현될 때 이질성을 막는다; 4 하나 이상의 당화 부위는 결실된다. 전형적으로 당화(예를 들어, 아스파라긴)되는 잔기는 세포 용해 반응을 부여할 수 있다. 그러한 잔기는 결실되거나 당화되지 않은 잔기(예를 들어, 알라닌)으로 치환될 수 있다; 5 C1q 결합 부위와 같은 보체와의 상호작용에 속하는 부위는 결실된다. 보체 채용은 본 발명의 분자를 위하여 유리하지 않을 수 있으며, 그러한 변형체와 함께 회피될 수 있다, 6 구제 수용체 외의 Fc 수용체에의 결합에 영향을 미치는 부위는 결실된다. CH3-CH2-힌지 영역은 본 발명의 융합 단백질에 요구되지 않는 특정 백혈 세포와의 상호작용을 위한 부위를 가질 수 있으며, 결실된다, 7 ADCC 부위는 결실된다. 본 발명의 융합 단백질에 요구되지 않으며, 제거될 수 있는 ADCC는 종래에 공지되었다, 예를 들어, IgG1 내에 ADCC 부위로 간주되는 Molec. Immunol 29 (5) 633-9 (1992) 참고.

링커 펩티드는 작용제 또는 모방체가 대신하는 기원 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공한다. 존재할 때, 그것의 화학적 구조는 결정적이지 않다. 링커는 바람직하게 펩티드 결합에 의해 함께 링크된 아미노산으로 구성된다. 이에 따라, 바람직한 구체예에서, 링커는 펩티드 결합에 의하여 링크되는 1 내지 20 아미노산으로 구성되며, 여기서 아미노산은 20 자연적 발생 아미노산으로부터 선택된다. 이러한 아미노산의 몇몇은 종래에 잘 이해되는 바와 같이 당화될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 1 내지 20 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 라이신으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 링커는 글리신 및 알라닌과 같은 입체 구조적으로 방해받지 않는 대부분의 아미노산으로 구성된다. 이에 따라, 바람직한 링커는 폴리(Gly-Ser), 폴리글리신(부분적으로 (Gly)₄, (Gly)₅), 폴리(Gly-Ala), 및 폴리알라닌이다. 링커의 다른 특정 실시예는 (Gly)₃Lys(Gly)₄ (서열 번호 65), (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (서열 번호 66), (Gly)₃Cys(Gly)₄ (서열 번호 67), 및 GlyProAsnGlyGly (서열 번호 68)이다.

상기 명칭을 설명하기 위하여, 예를 들어, (Gly)₃Lys(GIy)₄는 Gly- Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly을 의미한다. Gly 및 Ala의 조합 또한, 바람직하다. 여기에 나타낸 링커는 바람직하다. 본 발명의 관점 내의 링커는 훨씬 더 길 수 있으며, 다른 잔기들을 함유할 수 있다.

비-펩티드 링커 또한 가능하다. 예를들어, -NH-(CH₂)s-C(O)-, 여기서 s=2-20인 것 같은 알킬 링커가 이용될 수 있다. 이러한 알킬 링커는 저급 알킬 (예를 들어, C₁ - C₆) 저급 알킬, 할로겐 (예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 페닐, 등과 같은 임의의 비-입체구조적으로 방해받지 않는 군으로 더욱 치환될 수 있다. 바람직한 비-펩티드 링커는 100 내지 5000 kD, 바람직하게는 100 내지 500kD의 분자량을 갖는 PEG 링커이다. 펩티드 링커는 변형되어, 상기에 개시된 바와 동일한 방식으로 유도체를 형성할 수 있다.

여기서 이용된 바와 같이, "GLP-1 펩티드" 또는 "GLP-1 펩티드, 변형체, 또는 유도체"는 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, GLP-1 단편, GLP-1 호모로그, GLP-1 유사체, 또는 GLP-1 유도체일 수 있다. GLP-1 펩티드는 본래 GLP-1(7-37)에 유효한 상동성을 가져 이자에서 β-세포에 GLP-1 수용체의 결합에 의하여 그들이 인슐리노트로픽 활성을 보유하는 약 24 내지 약 45 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산으로부터 갖는다. GLP-1 (7-37)은 서열 번호 15 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly의 아미노산 서열을 갖는다.

GLP-1 단편은 GLP-1(7-37) 또는 유사체 또는 이의 유도체의 N-말단 및/또는 C-말단의 하나 이상 아미노산의 절단 후에 얻어진 폴리펩티드이다. GLP-1 호모로그는 하나 이상의 아미노산이 GLP-1(7-37) 또는 단편 또는 이의 유사체의 N-말단 및/또는 C-말단펩티드에 삽입된 펩티드이다. GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)의 아미노산이 변형 및/또는 치환된 펩티드이다. GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37) 또는 GLP-1(7-37)의 단편에 충분한 상동성을 가져, 유사체가 인슐리노트로픽 활성을 갖는다. GLP-1 유도체는 GLP-1 펩티드, GLP-1 호모로그 또는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열을 가지나, 부가적으로 하나 이상의 그것의 아미노산 곁그룹, α-탄소 원자, 말단 아미노군, 또는 말단 카복실산 군의 화학적 변형을 갖는 분자로써 정의된다.

수많은 활성이 있는 GLP-1 단편, 유사체 및 유도체는 종래에 공지되어 있으며, 이 유사체 및 유도체의 임의의 것은 또한 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체의 부분일 수 있다. 종래에 공지된 몇몇 GLP-1 유사체 및 GLP-1 단편은은 미국 특허 번호 5,118,666, 5,977,071, 및 5,545,618와 Adelhorst, et al., J. Biol Chem 269 6275 (1994)에 개시된다. 비제한적으로 예는, GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37), 및 Lys18-GLP-1(7-37)을 포함한다.

"GLP-1 작용제 또는 모방체", "GLP-1 작용제 또는 모방체 부분" 또는 "GLP-1 작용제 EH는 모방체 단편" 및/또는 "GLP-1 작용제 또는 모방체 변형체" 등은 비제한적으로 적어도 하나의 서열번호 1과 같은, 비제한적으로 실험상, 인 시츄 및/또는 바람직하게는 생체 내에서 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체의 리간드 결합과 같은, 적어도 하나의 생물학적 활성을 모방하거나 자극한다. 예를 들어, 적절한 GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분, 또는 변형체는 또한 적어도 하나의 GLP-1 수용체 신호 또는 다른 측정가능하거나 감지가능한 활성을 조절, 증가, 변형, 활성화시킬 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 GLP-1 모방체는 단백질 리간드, 예를 들어, GLP-1 수용체에 적절한 친화 결합에 의하여 특성화되며, 부가적으로 및 바람직하게 낮은 독성을 갖는다. 특히, 가변 영역, 불변 영역(CH1 부분 없이) 및 프레임워크(framework) 또는 이의 임의의 부분(예를 들어, 적어도 하나의 힌지 영역, 불변 중쇄 또는 경쇄, 등의 적어도 하나의 부분, 가변 중쇄 또는 경쇄의 J, D 또는 V 영역의 부분)와 같은 개개의 성분이 개별적으로, 및/또는 집단으로 부가적으로 및 바람직하게 낮은 면역원성을 갖는 GLP-1 모방체는 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 모방체는 부가적으로 징후의 좋은 내지 탁월한 완화와 낮은 독성으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 그들의 능력에 의하여 특성화된다. 낮은 면역원성 및/또는 높은 친화도 뿐만 아니라, 다른 정의되지 않은 특성은 성취된 치료적 결과에 공헌할 수 있다. "낮은 면역원성"은 여기서, 치료될 환자(이중 항원 효소 면역분석에 의하여 측정된 300 미만, 바람직하게는 100 미만)에서 낮은 적정량을 높이고/거나 치료되는 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50, 45, 40, 35, 30, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 및/또는 1% 미만에서 유의적으로 HAMA, HACA 또는 HAHA 반응을 증가시키는 것으로써 정의된다.(예를 들어, Elliott et al , Lancet 344 1125-1127 (1994)참고).

이용. 본 발명의 분리된 핵산은 비제한적으로 적어도 하나의 당뇨병 관련 장애, 면역 장애 또는 질환, 심혈관 장애 또는 질환, 감염성, 악성 및/또는 신경 장애 또는 질환, 뿐만 아니라 다른 공지의 또는 특정 단백질 관련 증상으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질 관련 증상의 징수의 감소 또는 발병의 방지에 도움, 조절, 치료, 완화하기 위하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물(포유 동물 및 인간 포함)에 영향을 미치는 데 이용될 수 있는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 단편 또는 이의 특정 변형체의 제조를 위하여 이용될 수 있다.

그러한 방법은 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 그러한 조절, 치료, 완화, 예방 또는 징후, 효과 또는 기작의 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 유효량은 공지된 방법을 이용하여 행해지거나 결정되는 바와 같이, 관련 분야에 공지되거나 여기에 개시된 바와 같이, 단일 또는 다중 투여 당 약 0.0001 내지 500㎎/㎏의 양, 또는 단일 또는 다중 투여 당 0.001-5000㎍/㎖의 혈청 농도의 혈청 농도를 성취하기 위한 것이거나,(실험상 농도를 함유하는 것이 필요) 임의의 유효 범위 또는 그 수치를 포함할 수 있다.

인용. 여기에 개시된 모든 문헌 또는 특허는 본 발명의 시간에 그들이 종래의 상태를 보여주고/거나 본 발명의 설명과 가능함을 제공하기 위한 바와 같이, 전체적으로 참조에 의하여 여기에 삽입된다. 문헌은 임의의 과학적 또는 특허 문헌 또는 모든 기록된, 전자적 또는 프린트된 형식을 포함하는 임의의 매체 형식에서 유효한 임의의 다른 정보를 언급한다. 다음 참조는 전체적으로 참조에 의하여 여기에 삽입된다, Ausubel, et al., ed , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc , NY, NY (1987-2005); Sambrook, et al , Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989), Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc , NY (1994-2005), Colligan et al , Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2005).

본 발명의 모방체

GLP-1 모방체는 적어도 하나의 GLP-1 치료적 펩티드(P)에 직접적으로 링크된, 부가적 링커 서열(L)에 직접적으로 링크된, 적어도 하나의 부분 가변 영역(V)에 직접적으로 링크된 적어도 하나의 코어 힌지 영역을 포함하는 것과 같은 적어도 하나의 힌지 영역 단편(H)의 적어도 한 부분에 직접적으로 링크된 적어도 하나의 CH2 영역에 직접적으로 링크된 적어도 하나의 CH3 영역을 부가적으로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, CH3-CH2-H-V-L-P는 비제한적으로 Cys-Cys 이황화 결합과 같은 회합 또는 공유 링크에 의하여 링크될 수 있다. 이에 따라, 치료적 펩티드 및 그것의 고유한, 또는 실험상, 생체내, 또는 인 시츄 상 얻어진 특성 또는 활성을 제공하는 반면, 본 발명의 GLP-1 모방체는 그것의 본래 특성 및 기능을 갖는 항체 구조를 모방한다. 항체의 가변 부분 및 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 모방체의 치료적 펩티드 부분은 여기서 개시된 바와 같이, 종래에 공지된 것과의 조합으로 다양할 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 모방체는 비제한적으로 적어도 하나의 증가된 반감기, 증가된 활성, 더욱 특이한 활성, 증가된 결합력, 증가된 또는 감소된 분리비, 선택된 또는 더욱 적절한 활성의 집합, 더 낮은 면역원성, 적어도 하나의 원하는 치료적 효과의 증가된 질 또는 기간, 더 적은 부작용, 등과 같은 공지된 단백질과 비교하여, 적어도 하나의 적절한 특성을 제공한다.

화학식 (I)에 따른 모방체의 단편은 종래에 공지된 바 및/또는 여기에 개시된 바와 같은 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의하여 제조될 수 있다. 모방체는 또한, 하나 이상의 정지 코돈이 본래 정지 코돈의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 이용하여 다양한 절단된 형태로 제조될 수 있다. 모방체의 다양한 부분은 관례의 기술을 이용하여 화학적으로 서로 연결될 수 있거나, 유전공학적 기술을 이용한 연속 단백질로써 준비될 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 사슬의 불변 영역의 적어도 하나를 암호화하는 핵산은 발현되어, 본 발명의 모방체의 용도를 위한 연속 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 항체를 간주하는 Bird, R E et al, Science, 242: 423-426 (1988), 및 Ladner et al, 미국 특허 번호No 4,946,778 참조.

여기에 개시된 바와 같이, 용어 "인간 모방체"는 실질적으로 단백질(예를 들어, GLP-1 펩티드, CH 도메인(예를 들어. CH2, CH3), 힌지, V)의 모든 부분이 오직 최소한 서열 변화 또는 변형을 갖는 인간에서 실질적으로 비-면역성이라 기대되는 항체를 언급한다. 그러한 변화 또는 변형은 부가적으로 및 바람직하게, 비-변형된 인간 항체 또는 본 발명의 모방체에 상대적으로 인간에서 면역원성을 보유하거나 감소시킨다. 이에 따라, 인간 항체 및 상응하는 본 발명의 GLP-1 모방체는 키메라 또는 인간화된 항체와 다르다. GLP-1 모방체가 인간 면역 글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 세포 또는 비-인간 동물에 의해 제조될 수 있다는 것이 지적된다.

이의 적어도 하나의 단백질 리간드에 특이적인 인간 모방체는 분리된 GLP-1 수용체 또는 이의 부분(합성 펩티드와 같은 합성 분자 포함)와 같은 적절한 리간드에 대하여 디자인될 수 있다. 그러한 모방체의 준비는 적어도 하나의 단백질 또는 이의 부분의 리간드 결합 영역 또는 서열을 특성화하고 확인하기 위한 공지된 방법을 이용하여 수행된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 적어도 하나의 세포주, 혼합 세포주, 무한 증식 세포 또는 무한 증식 및/또는 배양된 세포의 클론 집단에 의하여 생산된다. 무한 증식된 단백질 생산 세포는 적절한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 기능적으로 재배열되거나, 기능적 재배열을 수행할 수 있는 적어도 하나의 인간 면역 글로불린 자리에 실질적으로 유사한 서열을 갖거나 유도된 DNA를 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공하는 것에 의하여 생성되고, 비제한적으로 예를 들어, 종래에 공지된 바와 같이, V를 위한 C-말단 가변 영역의 부분, H를 위한 힌지 영역, CH2를 위한 CH2, CH3를 위한 CH3인 화학식 (I)의 여기에 개시된 바와 같은 작용제 또는 모방체 구조를 더욱 포함한다.

본 발명에서 이용된 바와 같은 용어 "기능적으로 재배열된"은 V(D)J 재조합을 수행하고 이에 따라 면역 글로불린 사슬(예를 들어, 중쇄), 또는 이의 임의의 부분을 암호화하는 면역 글로불린 유전자를 생산하는 면역 글로불린 자리로부터의 핵산 부분을 언급한다. 유전적으로 재배열된 면역 글로불린 유전자는 예를 들어, 유전자 부분 사이 코딩 연결부에 어닐링할 수 있는 프라이머로 면역 글로불린의 효소적 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응) 또는 유전자 사이의 코딩 연결부에 어닐링할 수 있는 프로브를 이용한, 뉴클레오티드 시퀀싱, 혼성화(예를 들어, 서던 블롯팅, 노던 블롯팅)와 같은 적절한 방법을 이용하여 직접적으로 또는 간접적으로 확인할 수 있다. 특정 가변 영역 또는 특정 서열을 포함하는(적어도 하나의 P 서열) 가변 영역을 포함하는 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 부분 또는 변형체를 세포가 생산하는지는 적절한 방법에 의하여 결정될 수 있다.

본 발명의 모방체, 특정 부분, 변형체는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 암호화 핵산을 이용하여 준비될 수 있으며, 그러한 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 그들의 우유내에 생산하는 염소, 말, 양 등과 같은 트랜스제닉 동물 또는 포유 동물을 제공한다. 그러한 동물은 항체 암호화 서열을 위해 적용되는 바, 공지의 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 비제한적으로 예를 들어, 각각의 전체가 여기에 참조에 의하여 삽입된 미국 특허 번호 5,827,690, 5,849,992, 4,873,316, 5,849,992; 5,994,616, 5,565,362; 5,304,489, 등 참조.

본 발명의 모방체, 특정 부분 및 변형체는 부가적으로, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 암호화 핵산을 이용하여 준비될 수 있고, 식물 부분 또는 배양된 세포 내에서 그러한 모방체, 특정 부분 또는 변형체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포(예를 들어, 담배 및 옥수수)를 제공한다. 비-제한적 예로써, 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담배 잎은 성공적으로 많은 양의 재조합 단백질을, 예를 들어, 유도할 수 있는 프로모터를 이용하여, 제공하는 데 이용된다. 예를 들어, 참조가 여기에 인용된 Cramer et al , Curr Top Microbol Immunol 240 95-118(1999) 참조. 또한, 트랜스제닉 옥수수 또는 곡물은 자연 기원으로부터 정재되거나 다른 재조합 계에서 생산된 것과 동등한 생물학적 활성을 갖는 상업적 생산 레벨로 포유동물 단백질을 발현하기 위하여 이용된다. 예를 들어 여기에 참조로 인용된, Hood et al., Adv. Exp Med Biol. 464 127-147 (1999) 참조. 항체는 또한, 담배 씨 및 감자 덩이 줄기를 포함하는 단일 사슬 모방체(scFv's)와 같은 항체 단편을 포함하는 트랜스제닉 식물 씨로부터 많은 양이 생산된다. 예를 들어, 여기에 참조로 인용된 Conrad et al , Plant MoI Biol 38: 101-109 (1998) 참조. 이에 따라, 본 발명의 모방체, 특정 부분 및 변형체는 공지된 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 예를 들어 여기에 참조로 인용된 Fischer et al , Biotechnol Appl Biochem 30 99-108 (Oct., 1999), Ma et al , Trends Biotechnol. 13.522-7 (1995); Ma et al , Plant Physiol 109 341-6 (1995); Whitelam et al , Biochem Soc. Trans 22 940-944 (1994) 참조. 상기 참조는 전체적으로 참조에 의하여 여기에 삽입된다.

본 발명의 모방체는 넓은 범위의 친화도(K_D)로 인간 단백질 리간드와 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 적어도 하나의 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체는 적어도 하나의 단백질 리간드에 높은 친화도로 부가적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체는 적어도 하나의 단백질 리간드와 약 10^-7M 이하인 K_D, 바람직하게는 약 0.1-9.9(또는 임의의 범위 또는 그 수치) x 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 또는 10^-13M 또는 임의의 범위 또는 그 수치 이하의 K_D로 결합할 수 있다.

적어도 하나의 단백질 리간드를 위한 GLP-1 작용제 또는 모방체의 친화도 또는 결합력은 예를 들어, 항체-항원 결합 친화도 또는 결합력을 결정하는데 이용하는 바와 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다.(예를 들어, Berzofsky, et al, "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W E., Ed., Raven Press- New York, NY (1984), Kuby, Jams Immunology, W H Freeman and Company New York, NY (1992), 및 여기에 개시된 방법 참조). 특정 GLP-1 작용제 또는 모방체-리간드 상호작용의 측정된 친화도는 다른 조건(예를 들어, 염 농도, pH)하에서 측정된다면, 변경될 수 있다. 이에 따라, 친화도 및 다른 리간드-결합 파라미터(예를 들어, K_D, K_{a ,} K_d)의 측정은 종래에 공지되거나 여기에 개시된 완충액과 같은 표준화 완충액과 GLP-1 작용제 또는 모방체 및 리간드의 표준화 용액으로 된다.

핵산 분자.

서열 번호 1 및 6 중 적어도 하나의 인접 아미노산, 뿐만 아니라 항체의 적어도 한 부분의 적어도 90-100%를 암호화하는 핵산 서열과 같은 여기서 제공된 정보를 이용하여, 여기서, 상기 서열은 화학식 (I)의 P 서열로써 삽입되어, 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체를 제공하고, 특정 단편, 변형체 또는 이의 인접 서열 또는, 이러한 서열 중 적어도 하나를 포함하는 저장 벡터를 더욱 포함하고, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자가 종래에 공지된 바, 또는 여기에 개시된 방법을 이용하여 수득될 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 클로닝에 의하여 수득된 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태 또는 비제한적으로, cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA의 형태일 수 있거나, 합성적으로 생산되거나, 이의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 적어도 한 가닥의 DNA 또는 RNA의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려져 있는 코딩 가닥일 수 있거나, 안티-센스 가닥으로도 알려져 있는 비-코딩 가닥일 수 있다.

본 발명의 분리된 핵산 분자는 해독틀(ORF), 부가적으로 하나 이상의 인트론을 갖는, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 위한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 상기에서 개시된 바와 실질적으로 다르나, 유전 코드의 퇴화때문에, 여전히 본 분야에 공지되고/거나, 여기에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함한다. 물론, 유전 코드는 본 분야에 잘 알려져 있다. 이에 따라, 본 분야의 숙련자가 본 발명의 특이 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 코딩하는 그러한 퇴화 핵산 변형체를 제조하는 것은 루틴할 것이다. 예를 들어, Ausubel, et al., supra, 참조. 그리고 그러한 핵산 변형체가 본 발명에 함유된다.

여기에 개시된 바와 같이, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부위 또는 변형체를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 비제한적으로 GLP-1 작용제 또는 모방체 단편, 스스로 암호화하는 것, 전체 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 이의 단편을 위한 코딩 서열; GLP-1 작용제 또는 모방체, 단편 또는 부분, 뿐만 아니라, 추가적 기능성을 제공하는 것과 같이, 추가적 아미노산을 코드하는 추가적 코딩 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐레이션 신호(예를 들어, 리보좀 결합 및 mRNA의 안정성)를 포함한, 전사, mRNA 과정에 중요한 역할을 하는 전사된, 비-번역 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 비제한적으로 함유하는 추가적, 비-코딩 서열과 함께 적어도 하나의 인트론과 같이 상기 언급한 추가적 코딩 서열과 함께, 또는 없이, 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열과 같은 추가적 서열을 함유한다. 이에 따라, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 서열은 펩티드를 암호화하여 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 정제를 촉진하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다.

여기서 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화 하는 폴리뉴클레오티드.

본 발명은 특정 변형체 또는 이의 부분을 포함하는 여기에 개시된 폴리뉴클레오티드, 또는 여기에 개시된 다른 것에, 선택된 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 분리된 핵산을 제공한다. 이에 따라, 본 구체예의 폴리뉴클레오티드는 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 분리, 감지, 정량하는 데 이용될 수 있다.

낮은 또는 온건한 가혹 혼성화 조건은 전형적으로 그러나 배타적이지 않게, 상보적 서열에 상대적으로 감소된 서열 상동성을 갖는 서열으로 채용된다. 온건한 그리고 높은 가혹 조건은 더 큰 상동성의 서열을 위하여 부가적으로 채용될 수 있다. 낮은 가혹 조건은 약 40-99% 서열 상동성을 갖는 서열의 선택적 혼성화를 허용하며, 오솔로그 또는 파라로그 서열을 확인하기 위하여 채용될 수 있다.

부가적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 여기에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 적어도 한 부분을 암호화할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 선택적 혼성화를 위해 채용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어 참조에 의해 여기에 전체적으로 삽입된, Ausubel, supra; Colhgan, supra 참조.

핵산의 컨스트럭션 . 본 발명의 분리된 핵산은 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이의 조합, 종래에 잘-알려진 것을 이용하여 제조될 수 있다.

핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 부가적으로, 서열을 편리하게 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 분리를 목적으로. 하나 이상의 엔도뉴클리아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위가 핵산에 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 분리의 목적으로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하기 위한 간편한 수단을 제공한다. 본 발명의 핵산-코딩 서열 배제-은 부가적으로 클로닝 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.

부가적인 서열은 폴리뉴클레오티드의 분리의 목적으로, 또는 세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 향상시키기 위하여, 그러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 삽입되어, 클로닝 및/또는 발현에서 그들의 기능을 적합화할 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 이용은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ausubel, supra, or Sambrook, supra 참조.

핵산을 컨스트럭팅하기 위한 재조합 방법.

RNA, cDNA, 게놈DNA 또는 이의 임의의 조합물과 같은 본 발명의 분리된 핵산 조성물은 본 분야에 숙련자에게 알려진 임의의 수의 클로닝 방법론을 이용하여 생물학적 소스로부터 수득될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 적절한 가혹 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하기 위하여 이용된다. RNA의 분리 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 컨스트럭트는 본 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Ausubel, supra, 또는 Sambrook, supra 참조).

핵산을 컨스트럭팅하기 위한 합성 방법. 본 발명의 분리된 핵산은 또한, 공지된 방법에 의한 직접적 화학 합성에 의하여 준비될 수 있다(예를 들어, Ausubel, et al, supra 참조). 화학적 합성은 일반적으로, 상보적 서열과의 혼성화 또는 기질로써 단일 가닥을 이용한 DNA 폴리머라제로의 중합반응에 의하여 이중-가닥 DNA로 전환될 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 본 분야의 숙련자는 DNA의 화학적 합성이 약 100 또는 그 이상의 염기의 서열에 제한될 수 있는 반면, 더 긴 서열은 짧은 서열의 라이게이션에 의하여 수득될 수 있음을 인지할 것이다.

재조합 발현 카세트. 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 더욱 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포에 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 컨스트럭트하는 데 이용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시할 전사 개시 조절 서열에 기능적으로 링크된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 헤테로로그 및 비-헤테로로그(예를 들어, 내부의) 프로모터는 채용되어, 본 발명의 핵산의 발현을 지시할 수 있다.

몇몇 구체예에서, 프로모터, 인핸서 또는 다른 요소로써 작용하는 분리된 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비-헤테로로그 형태의 적절한 위치(예를 들어, 업스트림, 다운스트림 또는 인트론내)에 도입되어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절할 수 있다. 예를 들어, 내부의 프로모터는 생체내 또는 실험상에서, 본 분야에서 공지된 바와 같이, 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의하여 변형될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원하는 대로, 센스 또는 안티-센스 기원으로 발현될 수 있다. 센스 또는 안티-센스 기원에서 유전자 발현의 조절이 관찰가능한 특성에 직접적 효과를 가질 수 있다는 것이 인식할 것이다. 억제의 또다른 방법은 센스 억제이다. 센스 기원으로 배열된 핵산의 도입은 표적 유전자의 전사를 차단하는 효율적인 수단으로 보여진다.

벡터 및 숙주 세포. 본 발명은 또한, 본 발명의 분리된 핵산 분자를 함유하는 벡터, 재조합 벡터로 유전적 엔지니어링된 숙주 세포 및 본 분야에 알려진 바와 같은 재조합 기술에 의하여 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 제조에 관한 것이다. 예를 들어 여기에 참조에 의하여 각각의 전체가 삽입된, Sambrook, et al , supra; Ausubel, et al , supra 참조.

폴리뉴클레오티드는 부가적으로 숙주에서 증식을 위하여 선택적 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 전하 지질과 복합체내, 또는 인산 칼슘 침전과 같은 침전으로써 벡터의 이용을 포함하는 다른 공지된 방법, 전기 천공법 등과 같은 적절한 공지의 방법을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 만약 벡터가 바이러스라면, 그것은 적절한 패키징 세포 주를 이용하여 실험상에서 패키지되고, 숙주 세포로 형질 도입될 수 있다.

DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 기능적으로 연결될 수 있다. 발현 컨스트럭트는 적어도 하나의 전사 개시, 종결 및 전사 영역 내에서, 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 부가적으로 더욱 포함할 것이다. 컨스트럭트에 의해 발현된 성숙한 전사체의 코딩 부분은 바람직하게, 포유 동물 또는 진핵 세포 발현을 위하여 바람직한 UAA 및 UAG와 함께, 번역될 mRNA의 말단에 적절하게 위치한 개시 및 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA 또는 UAG)에 번역 개시를 함유할 것이다.

발현 벡터는 바람직하게 그러나 부가적으로 적어도 하나의 선택가능한 마커를 함유할 것이다. 그러한 마커는 비제한적으로 예를 들어, 진핵 세포 배양을 위한, 메토트렉세이트(MTX), 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665, 4,656,134, 4,956,288, 5,149,636, 5,179,017, 앰피실린, 네오마이신(G418), 미코페놀릭산 또는 글루타민 신시타제(GS, 미국 특허 번호 5,122,464, 5,770,359, 5,827,739) 저항성 및 E.coli와 다른 박테리아 또는 원핵 생물에서 배양을 위한 테트라사이클린 또는 앰피실린 저항성 유전자를 함유한다. (상기 특허는 전체적으로 참조에 의하여 여기에 삽입된다) 상기-개시된 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 본 분야에서 공지이다. 적절한 벡터는 숙련자에게 즉시 명백할 것이다. 벡터 컨스트럭트의 숙주 세포에로의 도입은 인산 칼슘 형질 감염, DEAE-덱스트란 매개의 형질 감염, 양이온 지질-매개의 형질 감염, 전기천공법, 형질 유도, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의하여 영향을 받을 수 있다. 그러한 방법은 Sambrook, supra, Chapters 1-4 and 16- 18, Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16와 같이, 종래에 개시되어 있다.

본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 신호 뿐만 아니라, 부가적 헤테로로그 기능적 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 부가적 아미노산, 특히 대전된 아미노산의 영역은 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체에 부가되어, 정제하는 동안, 또는 다음의 조작 및 저장하는 동안 숙주 세포 내에서 안정성 및 지속성을 증가시킬 수 있다. 또한, 펩티드 부분은 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체에 부가되어, 정제를 촉진시킬 수 있다. 그러한 영역은 GLP-1 작용체 또는 모방체 또는 이의 적어도 하나의 단편의 마지막 제제 전에 제거될 수 있다. 그러한 방법은 Sambrook, supra, Chapters 17 29-17 42 and 18 1-18.74; Ausubel, supra, Chapters 16, 17 and 18와 같은 많은 표준 실험 매뉴얼에 개시되어 있다.

본 분야에서 숙련자는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 위하여 유효한 수많은 발현 시스템내에서 인지할 수 있다.

모방체, 특정 부분 또는 이의 변형체의 제조를 위하여 유용한 세포 배양의 예는 포유 동물 세포이다. 포유 동물 세포 시스템은 포유 동물 부유 또는 바이오리액터가 이용되긴 하지만, 종종 단층 세포의 형태 내에 있을 것이다. 완전한 당화 단백질을 발현할 수 있는 많은 적절한 숙주 세포 주는 종래에 개발되었고, 예를 들어, American Type Culture Collection, Manassas, Va로부터 상업적으로 유효한 COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7 (예를 들어, ATCC CRL- 1651), HEK293, BHK21 (예를 들어, ATCC CRL-10), CHO (예를 들어, ATCC CRL 1610, DG-44) 및 BSC-I (예를 들어, ATCC CRL- 26) 세포주, hepG2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포, 등을 함유한다. 바람직한 숙주 세포는 골수종 및 림프종 세포와 같은 림프구 기원의 세포를 함유한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC 기탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Agl4 세포 (ATCC 기탁 번호 CRL- 1851)이다.

이러한 세포를 위한 발현 벡터는 복제의 기원, 프로모터 (예를 들면, 초기 및 후기 SV40 프로모터, CMV 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,168,062; 5,385,839), HSV tk 프로모터, pgk (포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-I알파 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,266,491), 적어도 하나의 인간 면역 글로불린 프로모터, 인핸서 및/또는 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐레이션 부위(예를 들어, SV40 large T Ag 폴리A 삽입 부위) 및 전사 종결 서열과 같은 정보 처리 부위와 같으나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 발현 조절 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al , supra 참조. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 제조를 위해 유용한 다른 세포는 공지 및/또는 예를 들어, American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines 및 Hybridomas (www.atcc org) 또는 다른 공지된 것이나 상업적 소스로부터 유효하다.

진핵 숙주 세포가 채용될 때, 폴리아델닐화 또는 전사 종결 서열은 전형적으로 벡터에 도입된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자의 폴리아데닐화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열 또한 함유될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40 (Sprague, et al , J Virol 45 773-781 (1983))으로부터의 VP1 인트론이다. 덧붙여, 숙주 세포내에서 복제를 조절하는 유전자 서열은 본 분야에 공지된 대로, 벡터내로 도입될 수 있다.

GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 이의 변형체의 정제.

GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 단백질 A 정제, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록시라파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마티를 포함하나 이에 한정되지 않는 잘-알려진 방법에 의하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되고 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")는 또한 정제를 위하여 채용될 수 있다. 예를 들어 참조에 의하여 각각의 전체가 여기에 삽입된, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2005), 예를 들어, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10, 참조.

본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 과정의 생성물 및 예를 들어, 이스트, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의하여 생산된 생성물을 함유한다. 재조합 제조 과정에 채용된 숙주에 의존하여, 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 당화되는 것이 바람직하게, 당화될 수 있거나, 비-당화될 수 있다. 그러한 방법은 전체가 참조에 의하여 여기에 삽입된 Sections 17.37-17 42, Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14와 같은 많은 표준 실험 매뉴얼에서 개시된다.

모방체 , 특정 단편 및/또는 변형체

본 발명의 분리된 모방체는 더욱 완전하게 여기에 개시된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 임의의 하나에 의하여 암호화되거나, 임의의 분리되거나 준비된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 이의 변형체인 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함한다.

바람직하게, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 리간드-결합 부분 또는 변형체는 적어도 하나의 GLP-1 단백질 리간드에 결합하고, 이에 따라, 상응하는 단백질 또는 이의 단편의 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 제공한다. 다른 치료적으로 또는 진단적으로 유의적인 단백질은 종래에 잘 알려져 있으며, 그러한 단백질의 적절한 분석 및 생물학적 활성은 또한, 종래에 잘 알려져 있다.

본 발명을 위한 적절한 GLP-1 펩티드, 변형체 및 유도체의 비-제한적 예는 서열 번호 1- His-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31으로써 나타내며, 여기서: Xaa2는 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, 또는 Lys이며, Xaa3는 Glu, Asp, 또는 Lys이고, Xaa5는 Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Arg, His, Glu, Asp, 또는 Lys이며, Xaa6는 Phe, His, Trp, 또는 Tyr이고, Xaa7는 Thr 또는 Asn이며, Xaa8은 Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, 또는 Lys이고, Xaa9는 Asp 또는 Glu이며, Xaa1O은 Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Met, Tyr, Trp, His, Phe, Glu, Asp, 또는 Lys이고; Xaa11은 Ser, Val, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, 또는 Lys이며, Xaa12는 Ser, Val, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa13은 Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp 또는 Lys이며; Xaa14는 Leu, Ala, Met, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa15는 Glu, Ala, Thr, Ser, Gly, Gln, Asp 또는 Lys이며, Xaa16은 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Gln, Asn, Arg, Cys, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa17은 Gln, Asn, Arg, His, Glu, Asp 또는 Lys이며, Xaa18은 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa19는 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Met, Glu, Asp 또는 Lys이며, Xaa20은 Lys, Arg, His, Gln, Trp, Tyr, Phe, Glu 또는 Asp이고; Xaa21은 Glu, Leu, Ala, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, Gln, Thr, Ser, Gly, Asp 또는 Lys이며, Xaa23은 Ile, Ala, Val, Leu 또는 Glu이고; Xaa24는 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, His, Glu, Asp 또는 Lys이며, Xaa25는 Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa26은 Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys이며, Xaa27는 Val, Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Arg, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa28는 Lys, Asn, Arg, His, Glu 또는 Asp이며, Xaa29는 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Trp, Tyr, Phe, Pro, His, Glu, Asp 또는 Lys이고, Xaa30은 Arg, His, Thr, Ser, Trp, Tyr, Phe, Glu, Asp 또는 Lys이며; 그리고 Xaa31은 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Trp, Tyr, Phe, His, Glu, Asp, Lys이다.

GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체의 또다른 바람직한 그룹은 서열 번호 6 His-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Ser-Xaa12-Tyr-Xaa14-Glu-Xaa16 -Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30에 예시화하였고, 여기서 Xaa2는 Ala, Gly, 또는 Ser이며, Xaa3는 Glu 또는 Asp이고, Xaa6는 Phe 또는 Tyr이며; Xaa7은 Thr 또는 Asn이고; Xaa8은 Ser, Thr 또는 Ala이며, Xaa9는 Asp 또는 Glu이고, Xaa1O는 Val, Leu, Met 또는 Ile이며; Xaa12는 Ser 또는 Lys이고, Xaa14는 Leu, Ala 또는 Met이며, Xaa16은 Gly, Ala, Glu 또는 Asp이고, Xaa17은 Gln 또는 Glu이며, Xaa18은 Ala 또는 Lys이고, Xaa19는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Met이며, Xaa21은 Glu 또는 Leu이고; Xaa23은 Ile, Ala, Val, Leu 또는 Glu이며, Xaa27은 Val 또는 Lys이고; Xaa28은 Lys 또는 Asn이며; 그리고 Xaa30은 Arg 또는 Glu이다.

이러한 펩티드는 개시된 및/또는 종래에 공지된 방법에 의하여 준비될 수 있다. 서열에서 Xaa들은(그리고 특정 예에서 다른 특정화된 것이 없으면, 본 상세한 설명을 통하여) 특정 아미노산 잔기, 유도체 또는 이의 변형된 아미노산을 함유한다. 효소, 디펩티딜-펩티다제 FV (DPP-Ⅳ)는 작용제 또는 모방체의 문맥에서 DPP-Ⅳ의 활성으로부터 보호되는 투여된 GLP-1, GLP-1 펩티드, 호모로그, 유사체 및 유도체의 생체내에서 관찰되는 빠른 비활성화에 책임이 있다.

부분적으로 또는 바람직하게 실질적으로 적어도 하나의 GLP-1 생물학적 활성을 제공하는 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 이의 변형체는 GLP-1 리간드에 결합할 수 있으며, 이에 따라, 다른 단백질-의존적 또는 매개의 기작을 통하여 또는 GLP-1 수용체와 같은 적어도 하나의 리간드에 GLP-1의 결합을 통하여 다른 방법으로 매개되는 적어도 하나의 활성을 제공한다. 여기서 이용되는 바, 용어 "GLP-1 작용제 또는 모방체 활성"은 분석에 의존하여 약 20-10,000%에 의해, 바람직하게 적어도 약 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 % 또는 이상에 의해 적어도 하나의 GLP-의존적 활성을 조절하거나 유발할 수 있는 GLP-1 작용제 또는 모방체를 언급한다.

적어도 하나의 단백질-의존 활성을 제공하기 위한 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 능력은 바람직하게 여기서 개시된 바 및/또는 종래에 공지된 바와 같이, 적어도 하나의 적절한 단백질 생물학적 분석에 의하여 평가된다. 본 발명의 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 임의의 종류(IgG, IgA, IgM 등) 또는 이소타입에 유사할 수 있고, 카파 또는 람다 경쇄의 적어도 한 부분을 포함할 수 있다. 일구체예에서, 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 적어도 하나의 이소타입, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 IgG 중쇄 가변 단편, 힌지 영역, CH2 및 CH3를 포함한다.

본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 적어도 하나의 리간드, 소단위체, 단편, 부분 또는 이의 임의의 조합에 결합한다. 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분 또는 변형체의 적어도 하나의 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체는 부가적으로 리간드의 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합할 수 있다. 결합 에피토프는 적어도 1-3 아미노산의 적어도 하나의 아미노산 서열의 GLP-1 수용체 또는 이의 부분과 같은 단백질 리간드 서열의 인접 아미노산의 전체 특정 부위에로의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

그러한 모방체는 GLP-1 작용제 또는 모방체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 준비하고 발현하는 것에 의한 공지된 기술을 이용하여, 재조합 DNA 기술의 공지된 기술을 이용하여, 또는 화학적 합성과 같은 임의의 다른 적절한 방법을 이용하는 것에 의하여, GLP-1 작용제 또는 모방체의 화학식 (I)의 다양한 부분을 함께 연결함으로써 준비될 수 있다.

수용체와 같이, 인간 GLP-1 리간드에 결합하고, 정의된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 그 부분을 포함하는 모방체는 파지 디스플레이(Katsube, Y , et al , Int J Mol Med, 1(5) 863-868 (1998)), 또는 종래에 공지된 바와 같은 트랜스제닉 동물을 채용하는 방법과 같은 적절한 방법을 이용하여 준비될 수 있다. GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분 또는 변형체는 적절한 숙주 세포 내에서 암호화 핵산 또는 그 부분을 이용하여 발현될 수 있다.

본 발명은 또한, 여기에 개시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열 내 아미노산을 포함하는 모방체, 리간드-결합 단편 및 면역글로불린에 관한 것이다. 바람직하게, 그러한 모방체 또는 그 리간드-결합 단편은 수용체와 같은 인간 GLP-1 리간드에 높은 친화도(예를 들어, 약 10^-7M 이하의 K_D)로 결합할 수 있다. 여기에 개시된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 뿐만 아니라 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 함유한다. 보존적 아미노산 치환은 첫번째 아미노산의 것과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성(예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 두번째 아미노산에 의한 첫번째 아미노산의 치환을 언급한다. 보존적 치환은 다음 군 내에서 또다른 것에 의한 하나의 아미노산의 치환을 포함한다, 라이신 (K), 알라닌 (R) 및 히스티딘 (H), 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I), 프롤린 (P), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 시스테인 (C) 및 글리신 (G), F, W 및 Y; C, S 및 T.

아미노산 코드. 본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 구성하는 아미노산은 종종 간략화된다. 아미노산 디자인은 본 분야에서 잘 알려진 대로, 그것의 단일 문자 코드, 그것의 세 문자 코드, 이름, 또는 세 뉴클레오티드 코돈에 의하여 아미노산을 디자인하는 것에 의하여 지시될 수 있다(Alberts, B, et al, Molecular Biology of The Cell, Third Ed , Garland Publishing, Inc , New York, 1994 참조).

본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 여기에 특정화된 대로, 자연적 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 그러한 또는 다른 서열은 비제한적으로 서열번호 47-64에 나타난 다음 서열을 함유한다.

물론, 숙련자가 만들 수 있는 아미노산 치환의 수는 상기에 개시된 것을 함유한 많은 요소에 의존한다. 일반적으로 말하면, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체를 위한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 수는 여기서 특정화된 대로, 1-30 또는 임의의 범위 또는 그 수치와 같이, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 아미노산을 넘지 않을 것이다.

본 발명의 화학식 I ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)에서, 화학식 I에 따른 V, H, CH2, CH3 부분은 예를 들어, 도 1-18 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 또는 종래에 공지된 바와 같이, 바람직하게 인간 기원의 임의의 조합 또는 그 인접 서열, 또는 그 임의의 융합 단백질, 또는 인간에 투여될 때 면역원성을 최소화시키기 위하여 엔지니어링된 임의의 적절한 인간 또는 인간 호환적 서열일 수 있다.

P 부분은 비제한적으로 서열 번호 1, 임의의 조합, 또는 그 인접 서열, 또는 그 임의의 융합 단백질에 나타낸 것과 같은 종래에 알려지거나 여기에 개시된 적어도 하나의 GLP-1 치료적 펩티드를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, P 부분은 서열 번호 6 또는 임의의 조합 또는 그 인접 서열, 또는 그 임의의 융합 단백질 중 적어도 하나의 서열을 갖는 적어도 하나의 GLP-펩티드를 포함할 수 있다.

부가적 링커 서열은 종래에 알려진 바와 같은, 임의의 적절한 펩티드 링커일 수 있다. 바람직한 서열은 G 및 S의 임의의 조합, 예를 들어, X1-X2-X3-X4-. - Xn, 여기서, X는 G 또는 S일 수 있으며, n은 5-30일 수 있다. 비-제한적 예는 GS, GGS, GGGS (서열 번호 16), GSGGGS (서열 번호 17), GGSGGGS (서열 번호 18), GGSGGGSGG (서열 번호 19) 및 GGGSGGGSGG (서열 번호 20), 등을 함유한다.

기능에 필수적인 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체에서 아미노산은 위치-지정 돌연변이 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이(예를 들어, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244 1081-1085 (1989))와 같은 종래에 공지된 방법에 의하여 확인될 수 있다. 마지막의 과정은 분자내 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 다음, 만들어진 돌연변이 분자는 여기에 상세하게 된 바 또는 종래에 공지된 바와 같이, 비제한적으로, 적어도 하나의 단백질 관련 활성과 같은 생물학적 활성이 테스트된다. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 결합에 중요한 부위는 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화표지와 같은 구조적 분석에 의하여 확인될 수 있다.(Smith, et al , J MoI Biol 224:899-904 (1992) and de Vos, et al , Science 255.306-312 (1992))

본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 예를 들어, 비제한적으로 서열 번호 1 및 6 중 적어도 하나의 적어도 한 부분인 화학식 (I)의 P 부분으로써 포함할 수 있다. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 적어도 하나의 서열 번호 1 및 6의 적어도 90-100%, 화학식 (I)의 P 부분으로써 적어도 하나의 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 부분을 부가적으로 더욱 포함할 수 있다. 적어도 하나의 상기 열거된 활성을 증진시키거나 유지할 수 있는 비-제한적 변형체는 상기 임의의 폴리펩티드를 함유하나 이에 한정되지 않고, 상기 GLP-1 작용제 또는 모방체의 적절한 생물학적 활성 또는 기능에 유의적으로 영향을 미치지 않는 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실에 상응하는 적어도 하나의 돌연변이를 더욱 포함한다.

일 구체예에서, P 아미노산 서열, 또는 그 부분은 적어도 하나의 서열 번호 1 및 6의 상응하는 부분의 상응하는 아미노산 서열에 약 90-100% 상동성(예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 임의의 범위 또는 그 수치)을 갖는다. 바람직하게, 90-100% 아미노산 상동성(예를 들어, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 임의의 범위 또는 그 수치)은 종래에 알려진 바와 같은 적절한 컴퓨터 알고르즘을 이용하여 결정된다.

본 발명의 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체로부터의 임의의 수의 인접 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기서, 수는 GLP-1 작용제 또는 모방체에서 인접된 잔기의 수의 10-100%로부터 구성된 정수의 군으로부터 선택된다. 부가적으로, 인접 아미노산의 이러한 서브서열은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 또는 길이가 더 긴 아미노산, 또는 임의의 범위 또는 그 수치이다. 더욱이, 그러한 서브서열의 수는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상과 같이, 1 내지 20으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 정수일 수 있다. 숙련자가 인정할 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 생물학적으로 활성이 있는 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함한다. 생물학적으로 활성이 있는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 본래(비-합성), 내인성 또는 관련된 및 공지된 삽입된 또는 융합된 단백질 또는 특정 부분 또는 변형체의 그것의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 및 바람직하게 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 바람직하게, 80%, 90%, 또는 95%-1000%의 특정 활성을 갖는다. 효소 활성과 기질 특이성의 분석 및 정량 측정 방법은 본 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

또다른 면에서, 본 발명은 유기 부분의 공유 부착에 의하여 변형되는 여기에 개시된 바와 같은 인간 모방체 및 리간드-결합 단편에 관한 것이다. 그러한 변형은 개선된 약동학적 특성(예를 들어, 생체 내에서 증가된 혈청 반-감기)을 갖는 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 리간드-결합 단편을 제조할 수 있다. 유기 부분은 선형 또는 가지형 친수성 폴리머 군, 지방산 군, 또는 지방산 에스테르 군일 수 있다. 특정 구체예에서, 친수성 폴리머 군은 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 폴리알칸 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 군은 약 8 내지 약 40 탄소 원자를 포함할 수 있다.

본 발명의 변형된 모방체 및 리간드-결합 단편은 직접적 또는 간접적으로 GLP-1 작용체 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체에 공유 결합된, 하나 이상의 유기 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 작용체 또는 모방체 또는 리간드-결합 단편에 결합하는 각각의 유기 부분은 독립적으로 친수성 폴리머 군, 지방산 기 또는 지방산 에스테르기일 수 있다. 여기서 이용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복시산 및 디-카르복시산을 함유한다. 여기서 용어가 이용된 바와 같이, "친수성 폴리머 군"은 옥탄에서 보다 물에서 더욱 용해성있는 유기 폴리머를 언급한다. 예를 들어, 폴리라이신은 옥탄에서보다 물에서 더욱 잘 용해된다. 이에 따라, 폴리라이신의 공유적 부착에 의해 변형된 GLP-1 작용제 또는 모방체는 본 발명에 의해 함유된다. 본 발명의 모방체를 변형시키는 데 적절한 친수성 폴리머는 선형 또는 가지상일 수 있으며, 예를 들어, 폴리알칸 글리콜(예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산(예를 들어, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르트산 등)의 폴리머, 폴리알칸 옥시드(예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 함유한다. 바람직하게, 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체를 변형시키는 친수성 폴리머는 분리된 분자 부분으로써, 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, 아래 첨자가 달톤으로 폴리머의 평균 분자량인 PEG_25O0, PEG₅₀₀₀, PEG_750O, PEG₉₀₀₀, PEG₁₀₀₀₀, PEG_1250O, PEG₁₅₀₀₀, 및 PEG₂₀₀₀₀이 이용될 수 있다.

친수성 폴리머 군은 하나 내지 약 6 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 군으로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 폴리머는 적절한 방법을 채용함으로써 준비될 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 폴리머는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르에 활성화된 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 디이미다졸으로 활성화된)는 폴리머에 히드록실 군에 커플될 수 있다.

본 발명의 모방체를 변형시키기 적절한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 단위의 비포화를 함유할 수 있다. 본 발명의 모방체를 변형시키기 적절한 지방산은 예를 들어, n-도데카노에이트 (C₁₂, 라우레이트), n-테트라데카노에이트 (C₁₄, 마이리스테이트), n-옥타데카노에이트 (C₁₈, 스테아레이트), n-에이코사노에이트 (C₂₀, 아라키데이트), n-도코사노에이트 (C₂₂,베헤네이트), n-트리아콘타노에이트 (C₃₀), n-테트라콘타노에이트 (C₄₀), 시스-Δ9-옥타데카노에이트 (C₁₈, 올리에리트), 모든 시스-Δ5,8,ll,14-에이코사테트라에노에이트 (C₂₀, 아라키도네이트), 옥타네디오익산, 테트라데카네디오익산, 옥타데카네디오익산, 도코사네디오익 산, 등을 함유한다. 적절한 지방산 에스테르는 선형 또는 가지형 저급 알킬기를 함유하는 디카르복실산의 모노에스테르를 함유한다. 저급 알킬기는 하나 내지 약 12, 바람직하게는 하나 내지 약 6 탄소 원자를 함유할 수 있다.

변형된 인간 변형체 및 리간드-결합 단편은 하나 이상의 변형 약제와의 반응에 의한 것과 같은 적절한 방법을 이용하여 준비될 수 있다. 여기서 이용된 바와 같은 용어, "변형 약제"는 활성화 군을 포함하는 적절한 유기군(예를 들어, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)을 언급한다. "활성화 군"은 적절한 조건 하에서, 두번째 화학적 군과 반응할 수 있으며, 그것으로 변형 약제와 두번째 화학적 군 사이에 공유 결합을 형성하는 화학적 부분 또는 기능적 군이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 군은 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 아이오도), N-히드록시숙시니미딜 에스테르 (NHS) 등과 같은 친전자군을 함유한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 군은 예를 들어, 말레이미드, 로도아세틸, 아크릴로릴, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조익산 티올(TNB-티올) 등을 함유한다. 알데히드 기능적 군은 아민- 또는 히드라지드- 함유 분자에 커플될 수 있으며, 아지드기는 3가의 인의 군과 반응하여, 포르포라미데이트 또는 포스포리미데이트 링크를 형성할 수 있다. 분자에 활성화 군을 도입하기 위해 적절한 방법은 종래에 공지되었다(예를 들어, Hermanson, G. T , Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, CA (1996)참조). 활성화군은 유기 군(예를 들어, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접적으로, 또는 예를 들어, 이가의 C₁-C₁₂ 군인 링커 부분을 통하여 결합될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자에 의하여 치환될 수 있다. 적절한 링커 부분은 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, - (CH₂)₃-, -NH-(CH₂)₆-NH-, -(CH₂)₂-NH- 및 -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-를 함유한다. 링커 부분을 함유하는 변형 약제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)의 존재 하에서, 지방산과 함께, 예를 들어, 모노-Boc-알킬디아민(예를 들어, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)의 반응에 의하여 생성되어, 자유 아민 및 지방산 카르복실레이트 사이의 아미드 결합을 형성할 수 있다. Boc 보호 군은 트리플루오로아세트산의 처리에 의하여 생성물로부터 제거되어, 개시된 바와 같은 또다른 카르복실레이트에 커플될 수 있는 일차 이민을 노출시키거나, 말레익 무수물과 함께 반응할 수 있고, 만들어진 생성물은 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생산하기 위하여 순환된다(예를 들어 전체 지침이 참조에 의하여 여기에 삽입된, Thompson, et al., WO 92/16221 참조).

본 발명의 변형된 모방체는 변형 약제와 함께 인간 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 리간드-결합 단편의 반응에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 유기 부분은 아민-반응성 변형 약제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르의 채용에 의하여 비-부위 특이적 방식에서 GLP-1 작용제 또는 모방체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 모방체 또는 리간드-결합 단편은 또한, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 리간드-결합 단편의 이황화 결합(예를 들어, 사슬-내 이황화 결합)을 환원시켜 준비될 수 있다. 환원된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 리간드-결합 단편은 그 다음, 티올-반응성 변형 약제와 함께 반응되어, 본 발명의 변형된 GLP-1 작용제 또는 모방체를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 특정 부분에 결합하는, 유기 부분을 포함하는 변형된 인간 모방체 및 리간드-결합 단편은 역 단백질분해(Fisch et al , Bioconjugate Chem , 3 147-153 (1992), Werlen et al , Bioconjugate Chem , 5 411-417 (1994), Kumaran et al, Protein Sci 6(10) 2233-2241 (1997), Itoh et al , Bioorg Chem., 24(1) 59-68 (1996), Capellas et ai, Biotechnol Bioeng , 56(4):456-463 (1997)), 및 Hermanson, G T , Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)에 개시된 방법과 같은 적절한 방법을 이용하여 준비될 수 있다

GLP-1 모방체 조성물. 본 발명은 또한, 비-자연적으로 발생한 조성물, 혼합물 또는 형태로 제공된 종래에 알려진 바 및/또는 여기에 개시된 바와 같이, 적어도 하나의, 적어도 두개의, 적어도 세개의, 적어도 네개의, 적어도 다섯개의, 적어도 6개이상의 모방체 또는 특정 부분 또는 이의 변형체를 포함하는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물을 제공한다. 그러한 조성물 퍼센트는 종래에 알려지거나 여기에 개시된 대로, 액체 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드로써, 중량, 부피, 농도, 몰농도 또는 몰랄농도에 의한다.

그러한 조성물은 종래에 알려지거나 여기에 개시된 대로, 액체, 가스 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드로써, 중량, 부피, 농도, 몰농도 또는 몰랄농도에 의하여 0.00001, 0.00003, 0.00005, 0.00009, 0.0001, 0.0003, 0.0005, 0.0009, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 , 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9%와 같으나 이에 한정되지 않는 임의의 범위 또는 그 수치에서 0.00001-99.9999퍼센트일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 그러한 조성물은 제한없이 0.00001-100㎎/㎖ 및/또는 0.00001-100㎎/g을 함유한다.

본 발명은 치료적 유효량으로 투여될 때, 섬 분화를 촉진시키고, β-세포 질량을 증가시키고/거나 인슐린 분비를 증가시키고, 섬 및/또는 인슐린 생성 세포 자멸사를 감소시키고, 글루카곤 분비를 저해하고, 위배출을 지연시키고, 음식 섭취를 감소시키는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 치료적 유효 투여량으로 투입될 때, 당뇨병으로 될 높은 위험에서 개체내에서 당뇨병의 발병을 지연시키거나, 막는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 치료적 유효 투여량으로 투여될 때, 다양한 대사 장애 때문인 고혈당증을 조절하거나 치료하는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 조성물을 제공한다. 본 발명은 치료적 유효량으로 투여될 때 당뇨병, 이자염, 이자 종양, 이자 암 및 관련 징후를 포함하나 이에 한정되지 않는 질환 또는 장애에 의하여 유발된 적어도 하나의 이자 기능장애를 조절하거나 치료하는 적어도 하나의 GLP-1 모방체 조성물을 더욱 제공한다.

GLP-1 모방체 조성물은 부가적으로, 적어도 하나의 당뇨병 약물, 인슐린 대사 관련 약물, 글루코오스 대사 관련 약물, 항-감염성 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추신경계(CNS) 약물, 자율신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 유체 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제 등으로부터 선택된 유효량의 적어도 하나의 화합물 또는 단백질을 더욱 포함할 수 있다. 제제, 지시, 투여량 및 여기에 나타낸 각각을 위한 투여를 포함한 그러한 약물은 종래에 잘 알려져 있다.(예를 들어 참조에 의하여 각각의 전체가 여기에 삽입된, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001, Health Professional's Drug Guide 2001, ed , Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed , Appleton & Lange, Stamford, CT, 참조)

당뇨병 관련 약물은 적어도 하나의 글리타존(glitazone), 인슐린 및 유도체, 설포닐우레아, 메글리티니드(meglitinide), 비구아니드, 알파-글루코시다제 저해제, 단백질 티로신 포스파타제-1B, 글리코겐 신타제 키나제 3, 글루코네오지네시스 저해제, 피루베이트 디하이드로지나아제 키나아제(PDH) 저해제, 리포라이시스 저해제, 지방 산화 저해제, 카니틴 팔미토일트랜스퍼라제 Ｉ 및/또는 Ⅱ 저해제, 베타-3 아드레노셉터 작용제, 소듐 및 글루코오스 코트랜스포터(SGLT) 저해제, 또는 적어도 하나의 자기면역 억제 중 하나 이상에 활동하는 화합물, 면역 조절, 활성화, 증식, 이동 및/또는 T-세포의 세포 기능 억제자, T 세포 수용체/펩티드/MHC-Ⅱ 상호작용의 저해, T 세포 무력증의 유도, 자기반응성 T 세포의 제거, 혈액뇌장벽을 통한 트래피킹의 감소, 전-염증(Th1) 및 면역조절(Th2) 사이토카인 균형의 변형, 기질 메탈로프로테이즈의 저해, 신경계 보호, 신경아교증의 감소, 재-수초화의 증진일 수 있다.

항-감염성 약물은 아메바구제제 또는 항원충제, 구충제, 항진균제, 항말라리아제, 항결핵제 또는 항나병약, 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 테트라사이클린, 설폰아미드, 플루오로퀴놀론, 항바이러스제, 마크로리드 항-감염제, 및 기타 항감염제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. CV 약물은 수축촉진약, 항부정맥제, 항협심증제, 항고혈압제, 고지혈증 치료제 및 그외 심혈관 약물로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. CNS 약물은 비마약성 진통제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있거나, 해열제, 비스테로이드성 항-염증 약물, 마약 또는 아편유사진통제, 진정수면제, 항경련제, 항우울제, 항불안제 약물, 정신병치료제, 중추신경계 자극제, 항파킨슨병약 및 그외 중추 신경계 약물로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. ANS 약물은 콜린작용약물 (부교감흥분제), 항콜린작용약물, 아드레날린성 (교감신경흥분제), 아드레날린성 차단제 (교감신경억제), 골격근이완제, 신경근육 차단제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 기도 약물은 항히스타민제, 기관지확장제, 거담제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있거나, 진해제 및 그외 호흡기관 약물로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. GI관 약물은 제산제, 흡착제, 고창성 약물, 소화 효소, 담석 가용화제, 지사제, 설사제, 항구토약, 항궤양 제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 호르몬 약물은 코르티코스테로이드, 안드로겐, 단백동화스테로이드, 에스트로겐로, 프로게스틴, 생식샘자극호르몬, 당뇨병약 약물, 적어도 하나의 글루카곤, 갑상샘호르몬, 갑상샘호르몬 길항제, 뇌하수체 호르몬, 부갑상샘-유사 약물로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 체액 및 전해질 균형을 위한 약물은 이뇨제, 전해질, 대체 용액, 산화제, 알킬리화제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 혈액 약물은 조혈제, 항응고제, 혈액 유도체, 혈전용해 효소로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 항종양제는 알킬화제, 항대사물질, 항생제 항종양제, 호르몬 균형을 변경시키는 항종양제 및 그외 항종양제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 면역조절 약물은 면역억제제, 백신, 변성독소, 항독소, 항뱀독소, 면역 혈청 및 생물학적반응 변형제로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 눈, 귀, 및 코 사용을 위한 약물은 안과용 항-감염제 약물, 안과용 항-염증제, 축동제, 동공확대제, 안과용 혈관수축제, 그외의 안과용 약제, 귀, 코 사용 약물로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 국소 약물은 국소용 항-감염제 약물, 옴약, 이살충제 및 국소용 코르티코스테로이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 영양제는 비타민, 미네랄, 또는 고칼로리제(calorics)로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 예로서, Nursing 2001 Drug Handbook, supra 참고.

적어도 하나의 아메바구제제 또는 원충제는 아토바퀴온, 클로로퀸 히로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 메트로니다졸, 메트로니다졸 히드로클로라이드 및 펜타미딘 이스에티오네이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 구충제는 메벤다졸, 피라텔 파모에이트, 티아벤다졸로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항진균제는 암포테리신 B, 암포테리신 B 콜레스테릴 설페이트 복합체, 암포테리신 B 지질 복합체, 암포테리신 B 리포조말, 플루코나졸, 플루시토신, 그리세오풀빈 마이크로사이즈, 그리세오풀빈 울트라마이크로사이즈, 이트라코나졸, 케토코나졸, 니스타틴 및 테르비나핀 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항말라리아제는 클로로퀸 히드로클로라이드, 클로로퀸 포스페이트, 독시사이클린, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 메플로퀸 히드로클로라이드, 프리마퀸 포스페이트, 피리메틸아민, 설파독신을 포함하는 피리메타민으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항결핵약 또는 항나병약은 클로파지민, 사이클로세린, 답손, 에탐부톨 히드로클로라이드, 이소니아지드, 피라진아미드, 리파부틴, 리팜핀, 리파펜틴 및 스트렙토마이신 설페이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 아미노글리코시드는 아미카신 설페이트, 젠타미신 설페이트, 네오마이신 설페이트, 스트렙토마이신 설페이트, 토브라마이신 설페이트으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 페니실린은 아목실린/클라부라네이트 포타슘, 아목실린 트리하이드레이트, 앰피실린, 앰피실린 소듐, 앰피실린트리하이드레이트, 앰피실린 소듐/술박탐 소듐, 클록사실린 소듐, 디클록사실린 소듐, 메즐로실린 소듐, 나프실린 소듐, 옥사실린 소듐, 페니실린 G 벤자틴, 페니실린 G 포타슘, 페니실린 G 프로카인, 페니실린 G 소듐, 페니실린 V 포타슘, 피페라실린 소듐, 피페라실린 소듐/타조칵탐 소듐, 티카르실린 디소듐, 및 티카르실린 디소듐/클라부라네이트 포타슘으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 세팔로스포린은 세파클로르, 세파드록실, 세파졸린 소듐, 세프디니르, 세페피메 히드로클로라이드, 세픽시메, 세프메타졸 소듐, 세포니시드 소듐, 세포페라존 소듐, 세포탁심 소듐, 세포테탄 디소듐, 세폭시틴 소듐, 세포독심 프록세틸, 세프프로질, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심 소듐, 세프트리악손 소듐, 세푸록심 악세틸, 세푸록심 소듐, 세팔렉신 히드로클로라이드, 세팔렉신 모노하이드레이트, 세프라딘 및 로라카르베프로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 테트라사이클린은 데메클로사이클린 히드로클로라이드, 독시사이클린 칼슘, 독시사이클린 하이클레이트, 독시사이클린 히드로클로라이드, 독시사이클린 모노하이드레이트, 미노사이클린 히드로클로라이드, 테트라클린 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 설폰아미드는 코-트리목사졸, 설파디아진, 설파메톡사졸, 설픽속사졸 및 설픽속사졸 아세틸로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 플루오로퀴놀론은 알라트로플록사신 메실레이트, 시프로플록사신, 에녹사신, 레보플록사신, 로메플록사신 히드로클로라이드, 나리딕신산, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신 및 트로바플록사신 메실레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 플루오로퀴놀론은 알라트로플록사신 메실레이트, 시프로플록사신, 에녹사신, 레보플록사신, 로메플록사신 히드로클로라이드, 나리딕신산, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신 및 트로바플록사신 메실레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항바이러스제는 아바카비르 설페이트, 아시클로버 소듐, 아만타딘 히드로클로라이드, 암프레나버, 시도포버, 델라비르딘 메실레이트, 디다노신, 에파비렌즈, 팜시클로버, 포미비르센 소듐, 포스카넷 소듐, 간시클로버, 인디나버 설페이트, 라미부딘, 라미부딘/지도부딘, 넬피나비르 메실레이트, 네비라핀, 오셀타미버 포스페이트, 리바비린, 리만타딘 히드로클로라이드, 리토나버, 사퀴나버, 사퀴나버 메실레이트, 스타부딘, 발라사이클로버 히드로클로라이드, 잘시타빈, 자나미버, 및 지도부딘으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 매크롤린 항감염제는 안지트로 마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리쓰로마이신 염기, 에리쓰로마이신 에스톨레이트, 에리쓰로마이신 에틸숙시네이트, 에리쓰로마이신 락토비오네이트, 및 에리쓰로마이신 스테아레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 항-감염제는 안즈트레오남, 바시트라신, 클로람페니콜 소듐 숙시네이트, 실린다마이신 히드로클로라이드, 실린다마이신팔미테이트 히드로클로라이드, 실린다마이신포스페이트, 이미페남 및 실라스타틴 소듐, 메로페넴, 니트로푸란토인 매크로크리스탈, 니트로푸란토인 마이크로크리스탈, 퀴누프리스틴/달포프리스틴, 스펙티노마이신 히드로클로라이드, 트리메토프림, 및 반코마이신 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.(예컨대, pp. 24-214 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 수축촉진제는 암리논 락테이트, 디곡신, 밀리논 락테이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항부정맥제는 아데노신,아미오다론 히드로클로라이드, 아트로핀 설페이트, 브레틸륨 토실레이트, 딜티아젬 히드로클로라이드, 디이소피라미드, 디이소피라미드 포스페이트, 에스몰롤 히드로클로라이드, 플레카이니드 아세테이트, 이부틸리드 푸마레이트, 리도카인 히드로클로라이드, 메실레틴 히드로클로라이드, 모리시진 히드로클로라이드, 페니토인, 페니토인 소듐, 프로카인아미드 히드로클로라이드, 프로파페논 히드로클로라이드, 프로파놀롤 히드로클로라이드, 퀴니딘 비설페이트, 퀴니딘 글루코네이트, 퀴니딘 폴리갈락트로네이트, 퀴니딘 설페이트, 소탈롤, 토카니드 히드로클로라이드, 베라파밀 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항협심증제는 암로디피딘 베실레이트, 아밀 니트리트, 베피리딜 히드로클로라이드, 딜티아젬 히드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 이소소르비드 모노니트레이트, 나돌롤, 니카디핀 히드로클로라이드, 니페디핀, 니트로글리세린, 프로파놀롤 히드로클로라이드, 베라파밀, 베라파밀 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항고혈압제는 아세부토롤 히드로클로라이드, 암로디핀 베실레이트, 아테노롤, 베나제프릴 히드로클로라이드, 베타졸롤 히드로클로라이드, 비이소프롤 푸마레이트, 칸데사르탄 실렉세틸, 카프토프릴, 카르테오롤 히드로클로라이드, 카르베딜롤, 클로니딘, 클로니딘 히드로클로라이드, 디아족사이드, 딜티아젬 히드로클로라이드, 독사조신 메실레이트, 에날라프릴라트, 에날라프릴 말레이트, 에프로사르탄 메실레이트, 펠로디핀, 페놀도팜 메실레이트, 포시노프릴 소듐, 구아나벤즈 아세테이트, 구아나드렐 설페이트, 구안파신 히드로클로라이드, 하이드랄라진 히드로클로라이드, 이르베사르탄, 이스라디핀, 라베탈롤 히드로클로라이드, 리시노프릴, 로사르탄 포타슘, 메틸도파, 메틸도페이트 히드로클로라이드, 메토프롤롤 숙시네이트, 메타프롤롤 타르트레이트, 미놀시딜, 모엑시프릴 히드로클로라이드, 나돌롤, 니카르디핀 히드로 클로라이드, 니페디핀, 니솔디핀, 니트로프루시드 소듐, 펜부톨롤 설페이트, 페린도프릴 에르부민, 펜톨아민 메실레이트, 핀돌롤, 피라조신 히드로클로라이드, 프로프라놀롤 히드로클로라이드, 퀴나프릴 히드로클로라이드, 라미프릴, 텔미사르탄, 테라조신 히드로클로라이드, 티몰롤 말레이트, 트란돌라프릴, 발사르탄, 베라파밀 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항고지혈제는 아토르바스타닌 칼슘, 세리바스타닌 소듐, 콜레스티르아민, 콜레스티폴 히드로클로라이드, 페노피브레이트(최소화된), 플라바스타틴 소듐, 젬피브로질, 로바스타틴, 니아신, 프라바스타틴 소듐, 심바스타틴으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 CV 약물은 압시시밥, 알프로스타딜, 아르부타민 히드로클로라이드, 실로트타졸, 클로피도그렐 비설페이트, 디피리다몰, 엡티피바티드, 미도드린 히드로클로라이드, 펜톡시필린, 티클로피딘 히드로클로라이드, 티로피반 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp. 215-336 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 비마약성 진통제 또는 해열제는 아세트아미노펜, 아스피린, 콜린성마그네슘 트리살리실레이트, 디플루니살, 마그네슘 살리실레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 비스테로이드성 항-염증 약물은 셀레코시브, 디클로페나크 포타슘, 디클로페나크 소듐, 에토도락크, 페노프로펜 칼슘, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 인도메타신 소듐 트리하이드레이트, 케토프로펜, 케토로락트로메타민, 나부메톤, 나프록센 소듐, 옥사프로진, 피록시캄, 로페코시브, 설린다크로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 마약 또는 아편성 진통제는 알펜타닐 히드로클로라이드, 부프레노이핀 히드로클로라이드, 부토르파놀 타르트레이트, 코데인 포스페이트, 코데인 설페이트, 펜타닐 시트레이트, 펜타닐 경피 시스템, 펜타닐 점막 관통, 히드로모르폰 히드로클로라이드, 메페리딘 히드로클로라이드, 메타돈 히드로클로라이드, 모르핀 히드로클로라이드, 모르핀 설페이트, 모르핀 타르트레이트, 날부핀 히드로클로라이드, 옥시코돈 히드로클로라이드, 옥시코돈 펙티네이트, 옥시모르폰 히드로클로라이드, 펜타조신 히드로클로라이드, 펜타조신 히드로클로라이드 및 날록손 히드로클로라이드, 펜타조신 락테이트, 프로포시펜 히드로클로라이드, 프로포시펜나프실레이트, 레니펜타닐 히드로클로라이드, 수펜타닐 시트레이트, 트라마돌 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 진정수면제는 클로랄 하이드레이트, 에스타조람, 플루라제팜 히드로클로라이드, 펜토바르비탈, 펜토바르비탈 소듐, 펜토바르비탈 소듐, 세코바르비탈 소듐, 테마제팜, 트리아조람, 잘레프론, 졸피뎀 타르트레이트로부터 선택된 적어도 하나 일 수 있다. 적어도 하나의 항경련제는 아세타졸아미드 소듐, 카바마제핀, 클로나제팜, 클로라제페이트 디포타슘, 디아제팜, 디발프고엑스 소듐, 에트리오숙시미드, 포스페니포인 소듐, 가바펜틴, 라모트리진, 마그네슘 설페이트, 페노바르비탈, 페노바르비탈 소듐, 페니토인, 페니토인 소듐, 페니토인 소듐 (기관간), 프리미돈, 티아가빈 히드로클로라이드, 토피라메이트, 발프로에이트 소듐, 발프론산으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항우울제는 아미트립티린 히드로클로라이드, 암트립티린 파모에이트, 아모사핀, 부프로피온 히드로클로라이드, 시탈로프람 히드로브로마이드, 클로미프라민 히드로클로라이드, 데시프라민 히드로클로라이드, 독세핀 히드로클로라이드, 플록세틴 히드로클로라이드, 이미프라민 히드로클로라이드, 이미프라민 파모에이트, 미르타자핀, 네파조돈 히드로클로라이드, 노르트립티린 히드로클로라이드, 파록세틴 히드로클로라이드, 페넬진 설페이트, 세르트라린 히드로클로라이드, 트라닐시프로민 설페이트, 트리미프라민 말레이트, 벤라펙신 히드로클로라이드로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항불안제 약물은 알프라졸람, 부스피론 히드로클로라이드, 클로로디아제프록시드, 클로로디아제프록시드 히드로클로라이드, 클로라제페이트 디포타슘, 디아제팜디아제팜, 독세핀 히드로클로라이드, 하이드록시진 에보네이트, 하이드록시진 히드로클로라이드, 하이드록시진 파모에이트, 로라제팜, 메프로바메이트, 미다조람 히드로클로라이드, 옥사제팜으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 적어도 하나의 정신병치료제는 클로르프로마진 히드로클로라이드, 클로자핀, 플루페나진 데카노에이트, 플루에페나진 에난테이트, 플루페나진 히드로클로라이드, 할로페리돌, 할로페리돌 데카노에이트, 할로페리돌 락테이트, 록사핀 히드로클로라이드, 록사핀 숙시네이트, 메소리다진 베실레이트, 몰린돈 히드로클로라이드, 오란자핀, 페르페나진, 피모지드, 프로클로이페라진, 퀴에티아핀 푸마레이트, 리스페리돈, 티오리다진 히드로클로라이드, 티오티센, 티오티센 히드로클로라이드, 트리플루오페라진 히드로클로라이드로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 적어도 하나의 중추 신경계 자극제는 암페타민 설페이트, 카페인, 덱스트로암페타민 설페이트, 독사프람 히드로클로라이드, 메탐페타민 히드로클로라이드, 메틸페니데이트 히드로클로라이드, 모다피닐, 페몰린 및 펜테르민 히드로클로라이드로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항파킨슨병약은 아만타딘 히드로클로라이드, 벤즈트로핀 메실레이트, 비페리덴 히드로클로라이드, 비페리덴 락테이트, 브롬크립틴 메실레이트, 카비도파-레보도파, 엔타카폰, 레보도파, 페르골리드 메실레이트, 프라미페솔 디히드로클로라이드, 로피니롤 히드로클로라이드, 세레기린 히드로클로라이드, 톨카폰, 트리헥시페니딜 히드로클로라이드로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 적어도 하나의 그외의 중추 신경계 약물은 리루졸, 부프로피온 히드로클로라이드, 도네페질 히드로클로라이드, 드로페리돌, 플루복사민 말레이트, 리튬 카보네이트, 리튬 시트레이트, 나라트립탄 히드로클로라이드, 니코틴 포락크리렉스, 니코틴 경피 시스템, 프로포폴, 리자트립탄 벤조에이트, 시부트라민 히드로클로라이드 모노하이드레이트, 수마트립탄 숙시네이트, 타크린 히드로클로라이드, 졸미트립탄(참조, 예로서,pp. 337-530 of Nursing 2001 Drug Handbook.)으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

적어도 하나의 콜린성약물 (예: 부교감흥분제)는 베타네콜 클로라이드, 에드로포늄 클로라이드, 네오스티그민 브로마이드, 네오스티그민 메틸설페이트,피소스티그민 살리실레이트 및 피리도스티그민 브로마이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항콜린작용약물은 아트로핀 설페이트, 디사이클로민 하0이드로클로라이드, 글리코피롤레이트, 히오스시아민, 히오스시아민 설페이트, 프로판테린 브로마이드, 스코포라민, 스코포라민 부틸브로마이드 및 스코포라민 히드로브로마이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 아드레날린성 약물(교감신경흥분제)은 도부타민 히드로클로라이드, 도파민 히드로클로라이드, 메타라미놀 바이타르트레이트, 노르에피네프린 바이타르트레이트, 페닐에프린 히드로클로라이드, 슈도에페드린 히드로클로라이드, 슈도에페드린 설페이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 아드레날린성 차단제(부교감신경억제제)는 디히드로에르고타민 메실레이트, 에르고타민 타르트레이트, 메티세르기드 말레이트 및 프로파놀로 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 골격근 이완제는 바클로펜, 카리소프로돌, 클로르족사존, 사이클로벤자프린 히드로클로라이드, 단트로렌 소듐, 메토카르바몰 및 티자니딘 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 신경근육 차단제는 아트라쿠리움 베실레이트, 시스아트라쿠리움 베실레이트, 독사쿠리움 클로라이드, 미바쿠리움 클로라이드, 판쿠리움 브로마이드, 페피쿠로니움 브로마이드, 라파쿠로니움 브로마이드, 로쿠로니움 브로마이드, 숙시닐콜린 클로라이드, 투보루라린 클로라이드, 베쿠로니움 브로마이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다 (예를 들어, pp. 531-84 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 항히스타민제는 브롬페니라민 말레이트, 세티리진 히드로클로라이드, 클로페니라민 말레이트, 클레마스틴 푸마레이트, 시프로헵타딘 히드로클로라이드, 디펜하이드라민 히드로클로라이드, 펙소페나딘 히드로클로라이드, 로라타딘, 프로메타진 히드로클로라이드, 프로메타진 티오타진 및 트리프롤리딘 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기관지확장제는 알부테롤, 알부테롤 설페이트, 아미노필린, 아트로핀 설페이트, 에페드린 설페이트, 에피네프린, 에피네프린 비타르트레이트, 에피네프린 히드로클로라이드, 이프라트로피움 브로마이드, 이소프로테레놀, 이소프로테레놀 히드로클로라이드, 이소프로테레놀 설페이트, 레발부테로 히드로클로라이드, 메티프로케레놀 설페이트, 옥스트리필리, 피르부테롤 아세테이트, 살메테롤 시나포에이트, 테르부탈린 설페이트 및 테오필린으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 거담제 또는 진해제는 벤조나테이트, 코데이네 포스페이트, 코데이네 설페이트, 덱스트람메토르판 히드로브로마이드, 디펜하이드라민 히드로클로라이드, 구아이페네신, 히드로모르폰 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 기도 약물은 아세틸시스테인, 베크로메타손 디프로피오네이트, 베락탄트, 부데소나이드, 칼팍탄트, 크로몰린 소듐, 도르나제 알파, 에포프로스테놀 소듐, 프루니솔리드, 프루티카손 프로피오네이트, 몬텔루카스느 소듐, 네도크로밀 소듐, 파리비주맙, 트리암실노론 아세토니드, 자피루카스느, 질레우톤으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook, pp. 585-642 참조)

적어도 하나의 제산제, 흡수제, 또는 항고창제는 알루미늄 카보네이트, 루미늄 하이드록사이드, 칼슘 카보네이트, 마갈드레이트, 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 옥사이드, 시메티콘, 소듐 비카보네이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 소화효소 또는 담석 용해화제는 판크레아틴, 판크레리파제, 우르소디올로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 지사제는 아타풀기테, 비스무스 서브살리실레이트, 칼슘폴리카보필, 디페녹실레이트 히드로클로라이드 또는 아트로핀 설페이트, 로페라미드, 옥트레오타이드 아세테이트, 오피움 틴크튜어, 오피움 틴큐어 (캄포레이티드)로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 설사제는 비소코딜, 칼슘 폴리카보필, 카스카라 사그라다, 카스카라 사그라다 아로마틱 프루이덱스트랙트, 카스카라 사그라다 프루이덱스트랙트, 캐스터 오일, 도큐사테 칼슘, 도큐사테 소듐, 글리세린, 락튜로즈, 마그네슘 시트레이트, 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 설페이트, 메틸셀루로오즈, 미네랄 오일, 폴리에틸렌글리콜 또는 전해질 용액, 프실리움, 센나, 소듐 포스페이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항구토제는 클로프로마진 히드로클로라이드, 디멘히드리네이트, 도라세트론 메실레이트, 드로나비놀, 그라니세트론 히드로클로라이드, 메크리진 히드로클로라이드, 메토크로프로아미드 히드로클로라이드, 온단세트론 히드로클로라이드, 페르페나진, 프로크로페라진, 프로클로페라진 에디실레이트, 프로클로페라진 말레이트, 프로메타진 히드로클로라이드, 스코폴아민, 티에틸페라진 말레이트, 트리메토벤즈아미드 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항괴양성 약물은 시메티딘, 시메티딘 히드로클로라이드, 파모티딘, 란소프라졸, 미소프로스톨, 니자티딘, 오메프라졸, 라베프로졸 소듐, 란티딘 비스무스 시트레이트, 라니티딘 히드로클로라이드 및 수크라페이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, Nursing 2001 Drug Handbook, pp. 643-95 참조) 적어도 하나의 코리코스테로이드는 베타메타손, 베타메타손 아세테이트 또는 베타메타손 소듐 포스페이트, 베타메타손 소듐 포스페이트, 코르티손 아세테이트, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 프루도코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 시피오네이트, 히드로코르티손 소듐 포스페이트, 히드로코르티손 소듐 숙시네이트, 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니손, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드 및 트리암시놀론 디아세테이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 안드로겐 또는 단백동화 스테로이드는 다나졸, 프루옥시메스테론, 메틸테스토스테론, 난드롤론 데카노에이트, 난드롤론 펜프로피오네이트, 테스토스테론, 테스토스테론 시피오네이트, 테스토스테론 에난테이트, 테스토스테론 프로피오네이트, 테스토스테론 경피 시스템으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 에스트로겐 또는 프로게스틴은 에스테르화 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라디올 시피오네이트, 에스트라디올/노르에틸드론 아세테이트 경피 시스템, 에스트라디올 발레레이트, 에스트로겐 (콘쥬게이티드), 에스트로피페이트, 에틴일 에스트라디올, 에틴일 에스트라디올 및 데소게스트렐, 에틴일 에스트라디올 및 에틴노디올 디아세테이트, 에틴일 에스트라디올 및 데소게스트렐, 에틴일 에스트라디올 및 에티노디올 디아세테이트, 에틴일 에스트라디올 및 레보노르게스트렐, 에틴일 에스트라디올 및 노르에틴드롤, 에틴일 에스트라디올 및 노르에틴드론 아세테이트, 에틴일 에스트라디올 및 노르게스티메이트, 에틴일 에스트라디올 및 노르게스트렐, 에틴일 에스트라디올 및 노르에틴드론 및 아세테이트 및 페로스 푸마레이트, 레보노르게스트렐, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메스트라놀 및 노르에틴드론, 노르에틴드로네, 노르에틴드로네 아세테이트, 노르게스트렐 및 프로게스테론으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 고나도트로핀(gonadroptropin)은 가니렐릭스 아세테이트, 고나도레린 아세테이트, 히스트레린 아세테이트, 메노트로핀스로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항당뇨성 또는 글루카곤은 아카보제, 클로로프로파미드, 글리메피리드, 글리피지데, 글루카곤, 글리부리데, 인슐린, 메트포림 히드로클로라이드, 미글리톨, 피오글리타존 히드로클로라이드, 레파글리니데, 로시글리타존 말레이트, 트로글리타존으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 갑상선 호르몬은 레보티록신 소듐, 리오티로닌 소듐, 리오트릭스 및 티로이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 갑상선 호르몬 길항제는 메티마졸, 포타슘 아이오다이드, 포타슘 아이오다이드(포화 용액), 프로필티오우라실, 방사성 아이오딘 (소듐아이오다이드 ¹³¹I), 강력한 아이오딘 용액으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 뇌하수체 호르몬은 코르티코트로핀, 코신트로핀, 데스모프레신 아세테이트, 류프롤리드 아세테이트, 저장성 코르티코트로핀, 소마트렘, 소마트로핀, 바소프레신으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 부갑상선-유사 약물은 칼시페디올, 칼시토닌(인간), 칼시토닌(연어), 칼시트리올, 디히드로타키스테롤, 에트리도네이트 디소듐으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp. 696-796 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 이뇨제는 아세타졸아미드, 아세타졸아미드 소듐, 아밀로리드 히드로클로라이드, 부메타니드, 클로르탈리돈, 에타크리네이트 소듐, 에타크린산, 푸로세미드, 히드로클로로티아지드, 인다파미드, 만니톨, 메톨라존, 스피로놀락톤, 토르세미드, 트리암테렌 및 우레아로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 전해질 또는 대체 용액은 칼슘 아세테이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, 칼슘 락테이트, 칼슘 포스페이트 (2염기성), 칼슘 포스페이트 (3염기성), 덱스트란 (고분자량), 덱스트란 (저분자량), 헤타스타치(hetastarch), 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 포타슘 아세테이트, 포타슘 비카보네이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 글루코네이트, 링거주사액, 링거주사액 (락테이트), 소듐 클로라이드으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 산성화제 또는 알킬화제는 소듐 비카보네이트, 소듐 락테이트, 트로메타민으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp. 797-833 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 조혈제는 제1철 푸마레이트, 제1철 글루코네이트, 제1철 설페이트, 제1철 설페이트 (건조된), 철 덱스트란, 철 소르비톨, 폴리사카라이드-철 복합체, 소듐 제2철 글루코네이트 복합체로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항응집제는 아데파린 소듐, 달테파린 소듐, 다나파로이드 소듐, 에녹사파린 소듐, 헤파린 칼슘, 헤파린 소듐, 와파린 소듐으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 혈액 유도체는 알부민 5%, 알부민 25%, 항혈우병 인자, 항-저해제 혈액 응고제 복합체, 항트롬빈III (인간), 인자 Ix(인간), 인자 IX 복합체, 혈장 단백질 분획으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 혈전용해 효소는 알테플라제, 이스프레플라제, 레테플라제(재조합), 스트렙토키나아제, 유로키나아제. (예컨대, pp. 834-66 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 알킬화 약물은 부설판, 카보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 로무스틴, 메틀로레타민 히드로클로라이드, 멜팔란, 멜판란 히드로클로라이드, 스트렙토조신, 테모졸로마이드, 티오테파로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항대사제는 카페시타빈, 클라드리빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로라우실, 하이드록시우레아, 머캅토푸린, 메토트렉사에이트, 메토트렉사에이트 소듐, 티오구아닌으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항생 항종양제는 블레오마이신 설페이트, 닥티노마이신, 다우노루비신 시트레이트 리포조말, 다우노르부신 히드로클로라이드, 독소루비신 히드로클로라이드, 독소루비신 히드로클로라이드 리포조말, 에피루비신 히드로클로라이드, 이다루비신 히드로클로라이드, 미토마이신, 펜토스타틴, 플리카마이신, 발루비신으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 호르몬 균형을 변경하는 적어도 하나의 항종양제는 아나스트로졸, 비칼루타미드, 에스트라무스틴 포스페이트 소듐, 에세메스탄, 플루타미드, 고세렐린 아세테이트, 레트로졸, 류플로리드 아세테이트, 메게스트론 아세테이트, 닐루타미드, 타목시펜 시트레이트, 테스토락톤, 토레미펜 시트레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 항종양제는 아스파라기나제, 바실루스 칼메테-구에렌(BCG)(살아있는 방광내), 다카르바진, 도세탁셀, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 젬시타빈 히드로클로라이드, 이리노테칸 히드로클로라이드, 미토탄, 미토잔트론 히드로클로라이드, 파클리탁셀, 페가스파가제, 포르피머 소듐, 프로카바진 히드로클로라이드, 리투시맙, 테니포시드, 토포테칸 히드로클로라이드, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈플라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 비노렐빈 타르트레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp. 867-963 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 면역억제제는 아자티오프린, 바실리시맙, 사이클로스포린, 다클리주맙, 림프구 면역 글로불린, 뮤로모납-CD3, 미코페놀에이트 모페틸, 미코페놀에이트 모페틸 히드로클로라이드, 시롤리무스, 타크롤리무스로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 백신 또는 변성독소는 BCG 백신, 콜레라 백신, 디프테리아 및 파상풍 변성독소 (흡착된), 디프테리아 및 파상풍 변성독소 및 무세포 백일해 백신(흡착된), 디프테리아 및 파상풍 변성독소 및 전-세포 백일해 백신, 해모필루스 b 컨쥬게이트 백신, 간염 A 백신 (불활성화된), 간염 B 백신 (재조합), 인플루엔자 바이러스 백신 1999-2000 3가 유형 A & B (정제된 표면 항원), 인플루엔자 바이러스 백신 1999-2000 3가 유형 A & B (서브비리온 또는 정제된 서브비리온), 인플루엔자 바이러스 백신 1999-2000 3가 유형 A & B (전체 비리온), 일본 뇌염 바이러스 백신 (불활성화된), 라임병 백신 (재조합 OspA), 홍역 및 볼거리 및 풍진 바이러스 백신 (살아있는), 홍역 및 볼거리 및 풍진 바이러스 백신 (약화되어 살아있는), 홍역 바이러스 백신 (약화되어 살아있는), 수막구균 폴리사카라이드 백신, 볼거리 바이러스 백신 (살아있는), 플라그 백신, 폐렴구균 백신 (다가), 폴리오바이러스 백신 (불활성화된), 폴리오바이러스 백신 (살아있는, 경구, 3가), 광견병 백신 (흡착된), 광견병 백신 (인간 이배체 세포), 풍진 및 볼거리 바이러스 백신 (살아있는), 풍진 바이러스 백신 (약화되어 살아있는), 파상풍 변성독소 (흡착된), 파상풍 변성독소 (액체), 장티푸스 백신 (경구), 장티푸스 백신(비경구), 장티푸스 Vi 폴리사카라이드 백신, 수두 바이러스 백신, 황열병 백신으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 항독소 또는 항뱀독소는 검은 과부 거미 항뱀독소, 크로탈리데 안티베놈(Crotalidae antivenom)(다가), 디프테리아 항독소 (말), 미그루루스 플루비우스(Micrurus fulvius) 항뱀독소)로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 면역 혈청은 사이토메갈로바이러스 면역 글로불린 (정맥내), 간염 B 면역 글로불린 (인간), 면역 글로불린 근육 내, 면역 글로불린 정맥내, 광견병 면역 글로불린 (인간), 호흡기 합포체 바이러스 면역 글로불린 정맥내 (인간), Rh0(D)면역 글로불린 (인간), Rh0(D)면역 글로불린 정맥내 (인간), 파상풍 면역 글로불린 (인간), 수두-대상포진 면역 글로불린으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 생물학적 반응 수정자는 아델스류킨, 에오에틴 알파, 필그라스팀(filgrastim), 주사를 위한 글라티라머(glatiramer) 아세테이트, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-2a (재조합), 인터페론 알파-2b (재조합), 인터페론 베타-la, 인터페론 베타- lb (재조합), 인터페론 감마-lb, 레바미솔 히드로클로라이드, 오프렐베킨, 사르그라모스팀으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp. 964-1040 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 안용 항-감염제는 바시트라신, 클로르암페니콜, 시프로플록사신 히드로클로라이드, 에리쓰로마이신, 젬타마이신 설페이트, 오플록사신 0.3%, 폴리믹신 B 설페이트, 설파아세트아미드 소듐 10%, 설파아세트아미드 소듐 15%, 설프아세트아미드 소듐 30%, 토브라마이신, 비다라빈으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 안용 항염증제는 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 디클로페낙 소듐 0.1%, 플루오로메쏠론, 플루비프로펜 소듐, 케토로락트로메타민, 프레드니솔론 아세테이트 (현탁액) 프레드니솔론 소듐 포스페이트 (용액)으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 축동제는 아세틸로콜린클로라이드, 카바콜 (안 내), 카바콜 (국소용), 에코티오페이트 아이오다이드, 필로카핀, 필로카핀 히드로클로라이드, 필로카핀 니트레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 동공확대제는 아트로핀 설페이트, 사이클로펜톨레이트 히드로클로라이드, 에피네프린 히드로클로라이드, 에피네프릴보레이트, 호마트로핀 히드로브로마이드, 페닐에프린 히드로클로라이드, 스코폴아민 히드로브로마이드, 트로픽 아미드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 안용 혈관수축제는 나파졸린 히드로클로라이드, 옥시메타졸린 히드로클로라이드, 테트라히드로졸린 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 기타 안용제는 아프라클로니딘 히드로클로라이드, 베탁솔롤 히드로클로라이드, 브리모니딘 타르트레이트, 카르테오롤 히드로클로라이드, 디피데프린 히드로클로라이드, 도르졸아미드 히드로클로라이드, 에메다스틴 디푸마레이트, 플루오레세인 소듐, 케토티펜 푸마레이트, 란타노프로스트, 레보부놀롤 히드로클로라이드, 메티프라놀롤 히드로클로라이드, 소듐 클로라이드(고장성), 티몰롤 말레이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 귀용 약물은 보르산, 카바미드 퍼옥사이드, 클로르암페니콜, 트리에탄올아민 폴리펩티드 올레이트-콘덴세이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 코용 약물은 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 에페드린 설페이트, 에피네프린 히드로클로라이드, 플루니솔리드, 풀루티카손 프로피오네이트, 나파졸린 히드로클로라이드,옥시메타졸린 히드로클로라이드, 페닐에프린 히드로클로라이드, 테트라히드로졸린 히드로클로라이드, 트리암시놀론 아세토니드, 자일로메타졸린 히드로클로라이드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.(예컨대, pp. 1041-97 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 국소 항-감염제는 사이클로비르, 암포테리신 B, 젤라산 크림, 바시트라신, 부토코나졸 니트레이트, 실린다마이신 포스페이트, 글로트리마졸, 에코나졸 니트레이트, 에리쓰로마이신, 젬타마이신 설페이트, 케노코나졸, 마페니드 아세테이트, 메트로니다졸 (국소용), 미코나졸 니트레이트, 무피로신, 나프티핀 히드로클로라이드, 네오마이신 설페이트, 이트로푸라존, 니스타틴, 실버 설파디아진, 데르비나핀 히드로클로라이드, 테르코나졸, 테트라사이클린 히드로클로라이드, 티오코나졸, 톨나프테이트로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 옴약 또는 이살충제는 크로타미톤, 린단, 퍼메트린, 피레쓰린스로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 국소용 코르티코스테로이드는 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레이트, 클로베타솔 프로피오네이트, 데소니드, 데속시메타손, 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트, 디플로라손 디아세테이트, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루란드레놀리드, 플루티카손 프로피오네이트, 할시오니드, 히드로코티손, 히드로코티손 아세테이트, 히드로코티손 부티레이트, 히드로코티손 발레이트, 모메타손푸로에이트, 트리암시놀론 아세토니드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp.1098-1136 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

적어도 하나의 비타민 또는 미네랄은 비타민 A, 비타민 B 복합체, 시아노코발라민, 폴산, 하이드록소코발라민, 류코보린 칼슘, 니아신, 니아신아미드, 피리독신 히드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 히드로클로라이드, 비타민 C, 비타민 D, 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 비타민 D 유사체, 도제르칼리페롤, 파리칼시톨, 비타민 E, 비타민 K 유사체, 피토나디온, 소듐 플루오라이드, 소듐 플루오라이드(국소용), 트레이스 요소)(trace elements), 크로뮴, 구리, 아이오딘, 망간, 셀레늄, 아연으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 적어도 하나의 칼로리는 아미노산 주입액 (결정체), 덱스트로스 중의 아미노산 주입액, 전해질을 갖는 아미노산 주입액, 전해질을 갖는 덱스트로스 중의 아미노산 주입액, 간 장애에 대한 아미노산 주입액, 고 대사성 스트레스에 대한 아미노산 주입액, 신장 장애에 대한 아미노산 주입액, 덱스트로스, 지방 유액, 미디움-체인글리세리드로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. (예컨대, pp. 1137-63 of Nursing 2001 Drug Handbook 참조.)

본 발명은 또한, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함하는 적어도 하나의 임의의 적절한 및/또는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하며, 부가적으로 적어도 하나의 TNF 길항제(예를 들어, TNF 화학적 또는 단백질 길항제, TNF 단일 클론 또는 다중 클론 항체 또는 단편, 가용해 TNF 수용체(예를 들어, p55, p70 또는 p85) 또는 단편, 그 융합 폴리펩티드, 소분자 TNF 길항제, 예를 들어, TNF 결합 단백질 Ｉ 또는 Ⅱ(TBP-1 또는 TBP-2), 네르리몬마브(nerelimonmab), 인플릭시마브(infliximab), 이터나셉트(eternacept), CDP-571, CDP-870, 아페리모마브(afelimomab), 레너셉트(lenercept) 등), 항류머티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파잘진), 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경 근육 차단제, 항균제(예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 코르티코스테로이드, 아나볼릭 스테로이드, 당뇨병 관련 약제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완화제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역제, 면역 글로불린, 면역억제제(예, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사약물, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약제, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제를 더욱 포함한다. 러한 사이토카인의 비제한적인 일예는 임의의 IL-1 내지 IL-23을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 적절한 투여량은 본 분야에서 잘 알려져 있다(Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), 각 문헌은 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속한다).

그러한 조성물은 적어도 하나의 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 회합, 결합, 공동 투여 또는 공동-제제화된 독소 분자를 포함할 수 있다. 독소는 임의로 병원 세포 또는 조직을 선택적으로 죽이는 작용을 할 수 있다. 병원 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 독소는 독소의 적어도 하나의 기능적 세포독성 도메인, 예를 들면, 리신, 디프테리아 독소, 베놈 독소, 또는 박테리아 독소 중 적어도 하나로부터 선택된 것을 포함하는 정제된 또는 재조합 독소 또는 독소 단편일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 독소는 어떠한 자연적으로 발생한, 인간 및 기타 포유동물에서, 죽음에 이를 수도 있는 독소 쇼크를 포함하는 병적 증상을 일으킬 수 있는 돌연변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생성될 수 있는 내독소 또는 외독소을 모두 포함할 수 있다. 그러한 독소는, 비제한적으로, 장독성 E. coli 열-불안정 장독소(LT), 열-안정 장독소(heat-stable 장독소 (ST)), Shigella 세포독소, Aeromonas 장독소, 독성 쇼크증상 독소-1 (TSST-1), Staphylococcal 장독소 A (SEA), B (SEB), 또는 C (SEC), Streptococcal 장독소 등을 함유한다. 그러한 박테리아는 장독성 E. coli (ETEC), 장출혈 E. coli (예를 들면, 혈청형 0157의 균주:H7), Staphylococcus 종 (예를 들면, Staphylococcus aureus , Staphylococcus pyogenes), Shigella 종 (예를 들면, Shigella dysenteriae , Shigella flexneri , Shigella boydii , 및 Shigella sonnei), Salmonella 종 (예를 들면, Salmonella typhi, Salmonella cholera- suis , Salmonella enteritidis), Clostridium 종 (예를 들면, Clostridium perfringens , Clostridium dificile , Clostridium botulinum), Camphlobacter 종 (예를 들면, Camphlobacterjejuni , Camphlobacter fetus), Heliobacter 종, (예를 들면, Heliobacter pylori), Aeromonas 종 (예를 들면, Aeromonas sobria , Aeromonas hydrophila , Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica , Vibrios 종 (예를 들면, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella 종, Pseudomonas aeruginosa, 및 Streptococci를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 참조, 예를 들면, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown 및 Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology 및 대조, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991) ; Mandell et al, Principles 및 Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone. New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck 및 Co., Rahway, N. J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248 : 705-711 (1990), 참고문헌의 내용은 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된다.

본 발명의 GLP-1 작용제, 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물은 희석제, 결합제, 안정화제, 완충액, 염, 친유성 용매, 보존제, 어쥬번트 등과 같은 적어도 하나의 임의의 적절한 보조제를 더욱 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용 가능한 보조제가 바람직하다. 그러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적 예는 Gennaro, Ed., Rentington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 선행기술에 널리 공지되어 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 업계에 널리 공지되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물의 투여방법, 용해도 및/또는 안정성에 적절하도록 루틴하게 선택될 수 있다.

본 조성물에 유용한 약제학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지방, 및 탄수화물(예를 들면, 모노사카리드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카리드와 같은 당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등 유도된 당류; 및 다당류 또는 당 폴리머)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용되고, 단독 또는 1-99.99 중량% 또는 부피%의 조합을 포함한다. 예시적 단백질 부형체는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 완충 투여량에서도 역할을 갖는, 대표적 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.

본 발명에 사용에 적절한 탄수화물 부형제는, 예를 들면 프룩토오스, 말토ㅇ오, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노스, 소르보스 등의 단당류; 락토스, 수크로오스, 트레할로스, 셀로비오스등의 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등의 다당류; 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 솔비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등의 알디톨을 포함한다. 본 발명에서 사용에 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및 라피노스이다.

GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물은 완충액 또는 pH 조절제를 포함할 수 있다; 전형적으로, 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산염; 트리스, 트로메타민 염산, 또는 인산 완충액를 포함한다. 본 조성물에의 사용에 바람직한 완충액는 시트레이트와 같은 유기산염이다.

부가적으로, 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜스(중합 당), 덱스트레이트(예를 들면, 2-히드록시프로필-β-사이클로덱스트린 같은 사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향료, 살균제, 감미제, 항산화제, 정균제, 계면활성제(예를 들면, 'TWEEN 20' 및'TWEEN 80' 같은 폴리소르베이트), 지방 (예를 들면, 포스포리피드, 지방산), 스테로이드 (예를 들면, 콜레스테롤), 및 킬레이트제 (예를 들면, EDTA)와 같은 폴리머 부형제/첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물에 사용하는데 적절한 이들 및 부가적 공지 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들면, 'Remington: The Science & Practice of Pharmacy', 19^th ed., Williams & Williams, (1995), 및 'Physician's Desk Reference', 52^td ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)에 공지되어 있고, 그 개시내용은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들면, 당류 및 알디톨) 및 완충액 (예를 들면, 시트레이트) 또는 폴리머제이다.

제제

상기한 바와 같이, 본 발명은 안정한 제제를 제공하는데, 이는 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 갖는 인산 완충액과 더불어 보존된 용액 및 보존제를 함유하는 제제와 더불어 약제학적 또는 수의학적 용도에 적절한 다용도 보존된 제제이고, 약제학적으로 허용가능한 제제 내에 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함한다. 보존된 제제는 수성 희석제 내에, 적어도 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트리트, 페녹시에탄올, 포름알데히드 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드(예를 들면, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 임의로 선택되거나, 적어도 하나의 공지된 보존제를 포함한다. 임의의 적절한 농도 또는 혼합물은 0.001-5%, 또는 임의의 범위 또는 그 값과 같이 업계에 공지된 바대로 사용될 수 있고, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 또는 임의의 범위 또는 그 값을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 비제한적 예는 보존제를 포함하지 않거나, 0.1-2% m-크레졸(예를 들면, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜 (예를 들면, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티머로살 (예를 들면, 0.005, 0.01), 0.001-2.0% 페놀 (예를 들면, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤(s) (예를 들면, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%), 등을 포함한다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 패키징 물질 및 임의로 수성 희석제 내의 처방된 완충액 및/또는 보존제와 함께 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 용액을 포함하는 최소한 하나의 바이얼을 포함하는, 제품을 제공하는데, 여기서 패키징 물질은 그러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 시간 또는 그 이상의 시간 동안 사용가능함을 표시하는 라벨을 포함한다. 본 발명은 패키징 물질 및 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함하는 제 1 바이얼 및, 처방된 완충액 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제 2 바이얼을 포함하는 제품을 제공하는데, 패키징물질은 수성 희석제 내의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체가 24 시간 또는 그 이상의 시간 동안 사용가능한 용액을 형성함을 표시하도록 재구성한다는 것을 환자에게 알려주는 라벨을 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 포유동물 세포 또는 트랜스제닉 제제를 포함하는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있고, 또는 본 명세서에서 기술되거나 업계에 공지된 바와 같이 다른 생물학적 소스으로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 생산에서 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 양의 범위는 습윤/건조 시스템인 경우, 비록 더 낮거나 높은 농도가 사용가능하고 원하는 전달 매체에 의존적이고, 예를 들면 용액 제제는 피부통과 패치, 폐, 점막투과, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과 다르지만, 재구성에 의해 약 1.0μg/ml 내지 약 1000 mg/ml 농도의 농도를 포함한다.

바람직하게는 수성 희석제는 약제학적으로 허용가능한 보존제를 임의로 더욱 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 함유한다. 제제 내에 사용된 보존제의 농도는 항-미생물 효과를 내기에 충분한 농도이다. 그러한 농도는 선택된 보존제에 의존하고 당업자에 의해 쉽게 결정된다.

다른 부형제, 예를 들면 등장화제, 완충액, 항산화제, 보존성 증강제는 희석제에 부가되는 것이 임의적이고 바람직하다. 글리세린과 같은 등장화제는 공지된 농도에서 통상 사용된다. 생리학적으로 허용되는 완충액는 향상된 pH 제어를 제공하도록 바람직하게는 부가된다. 제제는 약 pH4 내지 약 pH10과 같은 넓은 범위의 pH를 포함하고, 바람직한 범위는 약 pH5 내지 약 pH9이고, 가장 바람직하나 범위는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 바람직하게는 본 발명의 제제는 약 6.8 내지 약 7.8 사이의 pH를 갖는다. 바람직한 완충액는 인산 완충액, 더욱 바람직하게는 인산염, 특히인산 완충된 식염수(PBS)를 포함한다.

Tween 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트) Tween 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트), Pluronic F68(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블락 코폴리머) 및 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 또는 폴리소르베이트 20 또는 80 또는 폴록사머 184 또는 188, Pluronic® polyls 같은 비이온 계면활성제 , 기타 블록 코-폴리머, EDTA 및 EGTA 같은 킬레이트제 같은 다른 첨가제는 응집을 감소시키기 위해 제제 또는 조성물에 임의로 부가될 수 있다. 이들 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제제를 투여하는데 사용되면 특히 유용하다. 약제학적으로 허용가능한 계면활성제의 존재는 단백질 응집 성향을 완화한다.

본 발명의 제제는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 및, 수성 희석제 내의 페놀, m-크레졸, p-크레 졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤제소늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 보존제를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 내의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 및 보존제의 혼합은 통상의 용해 및 혼합 절차를 이용하여 수행한다. 적절한 제제를 제조하기 위해, 예를 들면, 계량된 양의 완충액 용액 내의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체가 소기의 농도에서 단백질 및 보존제를 제공하는데 충분한 양의 완충액된 용액 내의 소기의 보존제와 조합시킨다. 이 방법의 변형법은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 부가적 첨가제가 사용되는지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용된 투여 수단 및 농도에 대해 활용될 수 있는 인자이다.

청구된 제제는 맑은 용액으로서, 또는, 물, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 인산 완충액 및/또는 식염수 및 선택된 염을 수성 희석제 내에서 포함하는 제 2 바이얼과 함께 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 바이얼을 포함하는 이중 바이얼로서 환자에 제공될 수 있다. 단일 용액 바이얼 또는 재구성을 요구하는 이중 바이얼은 여러 번 재사용될 수 있고, 단일 또는 여러 주기의 환자 치료에 충분하고 따라서 현재 사용되는 것보다 더욱 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.

여기서 청구된 제품은 즉시부터 24 시간 또는 그 이상에 걸쳐 투여하는데 유용하다. 따라서, 현재 청구된 제품은 환자에 상당한 이점을 준다. 본 발명의 제제는 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안정하게 보존될 수 있고, 연장된 시간동안 생물학적 단백질 활성을 유지하고, 따라서 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 또는 96 시간 또는 그 이상에 걸쳐 이용될 수 있는 용액을 표시하는 패키지 라벨을 허용한다. 보존된 희석제가 사용된 경우, 그러한 라벨은 1-12 달, 반년, 1년 반, 및/또는 2년의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 용액은 수성 희석제에 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 혼합은 통상의 용해 및 혼합법을 사용하여 수행한다. 적절한 희석제를 제조하기 위하여 예를 들면, 물 또는 완충액 중 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 계측된 양은 단백질 및 임의로 보존제 또는 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 배합한다. 본 공정의 변형을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 추가 첨가제의 첨가 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH 모두 사용되는 투여 방법 및 농도에 활용될 수 있는 모든 요소이다.

청구하는 제품은 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이얼과 재구성된 동결 건조된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 바이얼을 포함하는 이중 바이얼 또는 맑은 용액으로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이얼 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이얼은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 다중 사이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 더욱 편리한 치료 요법을 제공한다.

청구하는 제품은 약국, 병원, 또는 다른 기관 및 기구에, 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이얼과 재구성된 동결 건조된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 바이얼을 포함하는 이중 바이얼 또는 맑은 용액을 제공하여 환자에 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 맑은 용액는 1리터 이상 일 수 있고, 이는 소량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 용액이 소량의 바이얼로 전달되기 위해 단회 또는 다회 회수될 수 있고 약국 또는 병원에 의해 손님 및/또는 환자에게 제공되는 다량 저장고를 제공한다.

이들 단일 바이얼 시스템을 포함하는 인식 장치는 Humaject^®, NovoPen^®, B-D^® Pen, AutoPen^®, 및 OptiPen^®와 같은 용액 전달을 위한 펜-인젝터를 포함한다.이중 바이얼 시스템을 포함하는 인식 장치는 HumatroPen^®과 같은 재구성 용액의 전달을 위한 카트리지내 동결 건조 약물 재구성용 펜-인젝터 시스템을 포함한다.

청구하는 제품은 패킹 재료를 포함한다. 패킹 재료는 조절 기구에 의해 요구되는 정보 외에 제품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 패킹 재료는 2 개의 바이얼, 습윤/건식 제품에 대하여 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 수성 희석제에서 재구성하여 용액을 제조하고 상기 용액을 2-24시간 이상의 기간동안 사용하도록 하는 지시사항을 환자에게 제공한다. 단일 바이얼, 용액 제품에 대한 라벨은 상기 용액을 2-96시간 이상의 기간동안 사용할 수 있음을 지시한다. 청구하는 제품은 인간 약제학적 제품 용도로 유용하다.

본 발명의 제제는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 및 선택된 완충액, 바람직하게 염수 또는 선택된 염을 포함하는 인산 완충액과 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제내 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 및 완충액을 혼합하는 것은 통상의 희석법 및 혼합법에 의해 수행된다. 적절한 제제를 제조하기 위하여 예를 들어, 물 또는 완충액중 계측된 양의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 원하는 농도로 단백질 및 완충액을 제공하기 충분한 양으로 물중 원하는 완충제와 혼합한다. 이 과정의 변형을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 추가의 첨가제의 첨가 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH 모두 사용되는 투여 방법 및 농도를 위하여 활용될 수 있는 모든 요소이다.

청구하는 안정 또는 보존 제제는 수성 희석제 또는 완충액 및 수성 희석제 내 부형제를 포함하는 두번째 바이얼과 재구성된 동결 건조된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 바이얼을 포함하는 이중 바이얼 또는 맑은 용액으로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이얼은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 다중 사이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 더욱 편리한 치료 요법을 제공한다.

본 발명에 개시된 안정 또는 보존 제제 또는 용액내의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 본 분야에 공지된 바와 같이 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 이식, 삼투펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 또는 기술자에 이해되는 다른 방법에 의해 본 발명에 따른 환자에게 투여될 수 있다.

치료적 적용. 본 발명은 본 분야에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물을 이용하여, 예를 들어, 치료적 유효량의 IL-12 항체를 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하거나, 접촉시켜, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 IL-12 관련 질환을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 비만, 면역 관련 질환, 심혈관 질환, 감염 질환, 악성 질환 또는 신경질환을 포함하는 적어도 하나의 IL-12 관련 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 류마티스(성) 관절염, 연소성 류마티스(성) 관절염, 전신 발현 연소성(onset juvenile 류마티스(성) 관절염), 건선 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 혈청반응음성 관절병증, 골관절염, 뼈용해, 정형 외과 주입의 무균 이완, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 항인지질증후군, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 과정, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기 접촉피부염, 알레르기 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식거부반응, 이식편대숙주병, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 증후군, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란증후군, 류마티스(성) 관절염, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론 병, 겸상적혈구성 빈혈, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 담마진, 전신성 아나필락시스(systemic anaphalaxis), 피부염, 악성빈혈, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 기관 또는 조직의 이식편거부반응, 신장 이식거부반응, 심장 이식거부반응, 간이식거부반응, 췌장이식거부반응, 폐이식거부반응, 골수이식(BMT) 거부반응, 피부동종이식거부반응, 연골이식거부거부반응, 뼈이식거부반응, 소장이식거부거부반응, 태아 흉선 주입 거부반응, 부갑상선이식거부반응, 기관 또는 조직의 이종이식거부반응, 동종이식거부반응, 항-수용체에 과민반응, 그레이브스 질환, 레이노 질환, B형 인슐린-내성 당뇨볍, 천식, 중증 근무력증, 항체 관련성 세포독성, III형 과민반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군(폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군), 폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군, 항인지질증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활성 당뇨, 원발성 담낭 경변증, 백반, 혈관염, MI 심장절개 증후군, IV형 거부반응, 접속성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식거부반응, 세포내 유기체에 의한 흑색종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색(소)증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병(성) 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부하수체부신계 평가, 원발성 담낭 경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 치료법, 항-cd3 치료법, 사이토카인 치료법, 화학요법, 방사선 요법(예: 제한하는 것은 아니지만, 천식, 빈혈, 악액질 등), 만성 살리실산 중독등의 조절 또는 치료법에 관한 것이다. 참조: 예: the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)(각각 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다).

본 발명은 또한 심인성 졸도 증후군, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸증, 허혈성 뇌졸증, 출혈, 동맥경화(증), 죽상경화, 재협착, 당뇨성 죽상경화증 질환, 고혈압, 동맥(성) 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전증, 폐성심, 원발성 폐 고혈압, 심부정맥, 심방이소성 박동, 심방조동, 심방세동(지효성 또는 발작성), 관류후증후군, 심폐회로 염증 반응, 혼동 또는 다소성 심방 빈맥, 정상협착 QRS 빈맥, 특이 부정맥, 심실세동, 히스속부정맥, 방실차단, 각차단, 심근허혈 질환, 관(상)동맥질환, 협심증, 심근경색, 심근증, 확장형 울혈성 심근증, 제한성 심근병증, 판막성 심장질환, 심내막염, 심낭(심막)질환, 심장암, 대동맥 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 가지 폐색, 초혈관질환, 폐색성 동맥 질환, 말초 아테롬성 동맥 경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 질환, 레이노 현상 및 질환, 말단청색증, 지단홍통증, 정맥질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥류, 림프부종, 지방(성) 부종, 불안정형협심증, 재관류 손상, 펌프후 증후군, 허혈성 재관류 손상 등 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 하나 이상의 심장혈관 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로는, 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

치료적 적용. 본 발명은 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물을, 이를 필요로 하는 세포, 조직, 기관 또는 개체에 투여하는 것을 포함하여, 이자의 기능을 증가시키는 방법을 제공한다. GLP-1 작용제 또는 모방체는 섬 분화를 증진, β-세포 질량 증가 및/또는 인슐린 분비를 증가시킬 수 있다. GLP-1 작용제 또는 모방체는 실험상, 생체 외, 생체 내에서 투여될 수 있다.

예를 들어, GLP-1 작용제 또는 모방체 처리는 이자 또는 섬 이식 환자 또는 인슐린-생산 세포를 포함하는 다른 세포 치료법에서 이용될 수 있다. 세포 치료법은 세포 생존을 증진시키거나 면역 거부를 예방하기 위하여 디자인된 장치의 지지와 함께 또는 없이, 정맥내, 피하내, 근육내, 복막내로 환자에게 운반될 수 있다. 이자의 부분 외과적 제거 후의 환자에서 또한 이용될 수 있다. GLP-1 작용제 또는 모방체는 살아있는 이자 또는 섬 공여자에 투여되어, 과정 전, 또는 후에, 이자의 기능과 β-세포 질량을 증가시킬 수 있다. 그것은 이식 전에, 실험 상에서 β-세포의 증식을 자극하기 위하여 이용될 수 있으며, 이에 따라, 이식된 β-세포 질량을 증가시키고 섬의 자멸사를 예방할 수 있다. 그것은 인슐린-생산 세포의 스템, 전구 세포 또는 전구체의 배양에서 이용되어, 분화와 증식을 자극시키고 세포 자멸사를 예방할 수 있다.

본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 당뇨병이 될 높은 위험에 있는 개체에서 당뇨병을 예방하거나, 발병을 지연시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 질환 또는 장애를 유발하는 적어도 하나의 이자 기능장애를 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료에 적절한 증상 및 질환은 인슐린 저항성, 고혈당증, 저혈당증, 쿠싱증후군, 흑색가시세포증, 지방위측성 당뇨병, 망막병증, 신장병증, 다발신경병증, 단발신경병증, 자율신경병증, 궤양, 족부 궤양, 관절 이상, 감염(예를 들어, 곰팡이 또는 박테리아) 등과 같으나, 이에 한정되지 않는 관련된 신호 및 징후를 포함하여, 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병, 임신성 당뇨 또는 유아에서 당뇨병의 숙성한 발병(MODY)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 각각의 전체가 참조에 의해 삽입된, the Merck Manual, 12th- 17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al , eds , Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2001) 참조. 다른 비제한적 이자 장애는 이자염, 이자 종양 또는 이자 암을 포함한다.

본 발명은 고혈당증으로 되는 적어도 하나의 대사 장애를 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 장애의 비-제한적 예는 경화 및 고혈압과 관련된 글루코오스 부하 부전을 포함한다. GLP-1 작용제 또는 모방체 처리는 고혈당증 및/또는 당뇨병을 유도하기 위하여 알려진 다른 약물과 함께 결합에서 이용될 수 있다. 그러한 약물의 비-제한적 예는 기관 이식에서 주어진 사이클로스포린 또는 FK-506와 같은 면역저해 약물, AIDS를 갖는 환자를 위하여 처방되는 단백질분해효소 저해제 및 정신분열증의 치료에서 이용되는 전형적인 항정신병제를 함유한다.

본 발명은 또한, 세포, 조직 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 심혈관 질환을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 심인성 졸도 증후군, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸증, 허혈성 뇌졸증, 출혈, 동맥경화(증), 죽상경화, 재협착, 당뇨성 죽상경화증 질환, 고혈압, 동맥(성) 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전증, 폐성심, 원발성 폐 고혈압, 심부정맥, 심방이소성 박동, 심방조동, 심방세동(지효성 또는 발작성), 혼동 또는 다소성 심방 빈맥, 정상협착 QRS 빈맥, 특이 부정맥, 심실세동, 히스속부정맥, 방실차단, 각차단, 심근허혈 질환, 관(상)동맥질환, 협심증, 심근경색, 심근증, 확장형 울혈성 심근증, 제한성 심근병증, 판막성 심장질환, 심내막염, 심낭(심막)질환, 심장암, 대동맥 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 가지 폐색, 말초혈관질환, 폐색성 동맥 질환, 말초 아테롬성 동맥 경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 질환, 레이노 현상 및 질환, 말단청색증, 지단홍통증, 정맥질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥류, 림프부종, 지방(성) 부종, 불안정형협심증, 재관류 손상, 펌프후 증후군, 허혈성 재관류 손상 등 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 하나 이상의 심장혈관 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로는, 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 방법은 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 그러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 부가적으로, 공동-투여 또는 조합 치료법을 더욱 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분 또는 이의 변형체의 투여는 전에, 동시에 및/또는 후에, 적어도 하나의 인슐린 대사 관련 약물, TNF 길항제(예를 들어, TNF 항체 또는 단편, 용해성 TNF 수용체, 또는 단편, 이의 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 길항제), 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국부 마취제, 신경근육 차단제, 항균제(예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루로르퀴놀론, 마크로리드, 페니실린, 술폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 코르티코스테로이드, 단백동화 스테로이드, 당뇨 관련 약제, 미네랄, 영양제, 갑상선 약물, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 설사약, 에리스로포이에틴(예를 들어, GLP-렉틴 알파), 과립구집락자극인자 (예를 들어, G-CSF, Neupogen), 사그라모스팀(GM-CSF, 류킨), 면역접종, 면역글로불린, 면역저해제(예를 들어, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브(daclizumab)), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절자, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 저해제, 방사성의약물, 항우울제, 항마니아 약제(antimanic agent), 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경작용제, 자극제, 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 천식 약제, 베타 작용제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 저해제, 메탈잔틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도르나제 알파(dornase alpha (Pulmozyme)), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 적어도 하나를 투여하는 것을 더욱 포함한다. 적절한 투여량은 종래에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 전체가 참조에 의해 여기에 삽입된 Wells et al., eds , Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000), PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000) 참조.

본 발명(본 발명의 적어도 하나의 항체, 특정 부분 및 이의 변형체를 더욱 포함)의 조성물, 조합 치료, 공동-투여, 장치 및/또는 방법에 적절한 TNF 길항제는 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자, 탈리도미드, 테니댑, 포스포디에스터라제 저해제(예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 작용제 및 A2b 아데노신 수용체 인핸서와 같이, 표적 세포에 그것의 TNF 합성, TNF 방출 또는 활성을 예방 및/또는 저해하는 화합물; 미토겐 활성화 단백질 (MAP) 키나제 저해제와 같이 TNF 수용체 신호를 예방 및/또는 저해하는 화합물; 메탈로프로티나제 저해제와 같이 막 TNF 절단을 차단 및/또는 저해하는 화합물; 앤지오텐신 전환 효소(ACE) 저해제(예를 들어, 카프토프릴)와 같이 TNF 활성을 차단 및/또는 저해하는 화합물; 및 MAP 키나제 저해제와 같이 TNF 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 저해하는 화합물을 함유하나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서 이용된 바, "종양 괴사 요소 항체", "TNF 항체", "TNFα 항체" 또는 단편 등은 실험상, 인 시츄 및/또는 바람직하게 생체내에서 TNFα 활성을 감소, 차단, 저해, 폐기 또는 간섭시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 적절한 TNF 인간 항체는 TNFα에 결합할 수 있으며, 항-TNF 항체, 이의 항원-결합 단편 및 특정 돌연변이 또는 TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 도메인을 포함한다. 적절한 TNF 항체 또는 단편은 또한, TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 방출, TNF 수용체 신호, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생산 및/또는 합성을 감소, 차단, 폐기, 간섭, 예방 및/또는 저해시킬 수 있다.

키메라 항체 cA2는 마우스 항-인간 TNFα IgG1 항체, 디자인된 A2, 및 인간 IgG1의 불변 영역, 카파 면역 글로불린을 중화시키는 높은 친화도의 항원 결합 가변 영역으로 구성된다. 인간 IgG1 Fc 영역은 동종이형의 항체 작용자 기능을 개선시키고, 순환하는 혈청 반-감기를 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메라 항체 cA2의 결합력 및 에피토프 특이성은 뮤린 항체 A2의 가변 영역으로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 뮤린 항체 A2의 가변 영역을 암호화하는 핵산을 위한 바람직한 소스는 A2 하이브리도마 세포주이다.

키메라 A2(cA2)는 투여량 의존적 방식으로 자연적 및 재조합 인간 TNFα의 세포독성 효과를 중화시킨다. 키메라 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 분석으로부터, 키메라 항체 cA2의 친화도 상수는 1.04xl0¹⁰M^-1로 측정된다. 경쟁적 저해에 의한 단일 클론 항체 특이성 및 친화도를 결정하기 위한 바람직한 방법은 전체가 참조에 의해 여기에 삽입된 참조인 Harlow, et al , Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al , eds , Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc and Wiley Interscience, New York, (1992- 2005), Kozbor et al , Immunol Today, 4 72-79 (1983), Ausubel et al, eds Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2005); and Muller, Meth. EnzymoL, 92.589-601 (1983)에서 찾을 수 있다.

특정 구체예에서, 뮤린 단일 클론 항체 A2는 c134A를 디자인하는 세포주에 의해 생산된다. 키메라 항체 cA2는 c168A를 디자인하는 세포주에 의해 생산된다.

본 발명에서 이용될 수 있는 단일 클론 항-TNF 항체의 추가적인 예는 종래에 개시되었다(예를 들어, 전체적으로 참조에 의해 여기에 삽입된 참조인, 미국 특허 번호 5,231,024, Moller, A. et al., Cytokine 2(3) 162-169 (1990), U S. Application No. 07/943,852 (filed September 11, 1992), Rathjen et al, International Publication No WO 91/02078 (published February 21, 1991), Rubin et al, GLP-I Patent Publication No. 0 218 868 (published April 22, 1987), Yone et al , GLP-I Patent Publication No 0 288 088 (October 26, 1988), Liang, et al , Biochem Biophys Res Comm. i37-847-854 (1986), Meager, et al , Hybndoma 6 305-311 (1987), Fendly et al , Hybndoma 6 359-369 (1987), Bπngman, et al., Hybndoma 5:489-507 (1987); and Hirai, et al , J Immunol Meth 96 57-62 (1987) 참조)

TNF 수용체 분자. 본 발명에서 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 고 친화도로 TNFα에 결합하고(참고, 예를 들어, Feldmann 등, International Publication No. WO 92/07076 (published April 30,1992); Schall 등, Cell 61 : 361-370 (1990); 및 Loetscher 등, Cell 61 : 351-359 (1990), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다.), 임의의 저 면역원성을 갖는 것이다. 특히, 55 kDa (p55 TNF-R) 및 75 kDa (p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 기능성 부분를 포함하는 이들 수용체의 잘려진(Truncated) 형태(참조, 예, Corcoran 등, Eur. J. Biochem. 223 : 831-840 (1994))도 본 발명에 또한 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 잘려진 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 저해성 결합 단백질로서 검출될 수 있다(Engelmann, H. 등, J. Biol . Chem. 265 : 1531-1536 (1990)). TNF 수용체 다중 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 유도체 및 단편 또는 부분은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가적 예이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 TNF 수용체 분자는 연장된 기간 동안 징후의 좋은 내지 뛰어난 경감 낮은 독성으로 환자를 치료할 수 있는 그들의 능력에 의하여 특성화된다. 낮은 면역원성 및/또는 높은 친화도, 뿐만 아니라 다른 정의되지 않은 특성은 취득되는 치료적 결과에 공헌할 수 있다.

본 발명의 유용한 TNF 수용체 다중 분자는 하나 이상 폴리펩티드 링커 또는 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다른 비펩티드 링커를 통해 링크된 두개 이상의 TNF 수용체의 ECD의 모든 또는 하나의 기능성 부분을 포함한다. 다중 분자는 분비된 단백질의 신호 펩티드를 더욱 포함하여, 다중 분자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 다중 분자 및 그들의 제조 방법은 참조에 의해 전체가 여기에 삽입된 미국 출원 번호 08/437,533(1995.3.9 출원)에 개시되어 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 적어도 한 부분의 하나 이상의 면역 글로불린 분자 및 하나 이상의 TNF 수용체의 모두 또는 하나의 기능적 부분을 포함한다. 이러한 면역수용체 융합 분자는 모노머, 또는 헤테로- 또는 호모- 다중체로써 어셈블될 수 있다. 면역수용체 융합 분자는 일가 또는 다가일 수 있다. 그러한 TNF 면역수용체 융합 단백질의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그들의 제조 방법은 종래에 개시되어 있다(Lesslauer 등, Eur. J. Immunol. 21 : 2883-2886 (1991) ; Ashkenazi 등, Proc. NatL. Acad. Sci. USA 88 : 10535-10539 (1991); Peppel et al., J. Exp . Med. 174 : 1483-1489 (1991); Kolls 등, Proc. NatL., Acad. Sci. USA 91 : 215-219 (1994) ; Butler 등, Cytokine 6(6) : 616-623 (1994); Baker 등, Eur. J. Immunol. 24 : 2040-2048 (1994); Beutler 등, U.S. Patent No. 5,447,851; 및 U.S. Application No. 08/442,133 (filed May 16,1995), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다). 면역수용체 융합 분자를 생산하는 방법은 또한 하기 문헌에서 찾을 수 있다: Capon 등, 미국 특허 번호 5,116,964; Capon 등, 미국 특허 번호 5,225,538; 및 Capon 등, Nature 337 : 525-531 (1989), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다.

TNF 수용체 분자의 기능적 당량, 유도체, 단편 또는 영역은 TNF 수용체 분자의 부분 또는 TNF 수용체 분자를 암호화하는 TNF 수용체 분자 서열의 부분을 언급하며, 그것은 본 발명에서 이용될 수 있는 TNF 수용체 분자(예를 들어, 높은 친화도로 TNFα에 결합하고, 낮은 면역원성을 갖는다)를 기능적으로 닮기에 충분한 크기 및 서열이다. TNF 수용체 분자의 기능적 당량은 또한 기능적으로 본 발명에서 이용될 수 있는 TNF 수용체 분자를 닮은 변형된 TNF 수용체 분자를 함유한다. 예를 들어, TNF 수용체 분자의 기능적 당량은 "침묵" 코돈 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입(예를 들어, 또다른 산성 아미노산을 위한 하나의 산성 아미노산의 치환, 또는 소수성 아미노산을 암호화하는 또다른 코돈을 위한, 같거나 다른 소수성 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈의 치환)을 함유할 수 있다. Ausubel et al , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc and Wiley-Interscience, New York (1987-2005) 참조.

사이토카인은 공지의 사이토카인을 모두 포함한다. 참조, 예, www. Copewithcytokines. com. 사이토카인 길항제는 제한되지는 않지만, 임의의 항체, 단편 또는 모방체, 임의의 용해성 수용체, 단편 또는 모방체, 임의의 소형 분자 길항제, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.

본 발명의 임의의 방법은 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 그러한 조절, 처리 또는 치료법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하는 것을 포함하여 단백질 매개의 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 그러한 방법은 부가적으로 그러한 면역 질환을 치료하기 위한 공동-투여 또는 조합 치료법을 더욱 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 특정 부분 또는 이의 변형체의 투여는 전에, 동시에, 및/또는 후에, 적어도 하나의 IL-3, -6 및 -11과 같은 다른 사이토카인, 줄기 세포 요소, G-CSF 및 GM-CSF로부터 선택된 적어도 하나를 투여하는 것을 더욱 포함한다.

전형적으로, 병리적 증상의 치료는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 조성물의 유효량 또는 투여량에 의해 영향을 받고, 전체, 평균, 범위는 0.01∼500 밀리그램의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체, 또는 특정 부분 또는 변형체/투여량당 환자의 킬로그램이며, 바람직하게는 조성물에 포함된 활성 약제의 특정 활성에 따라 단일 또는 다중 투여당 적어도 약 0.1 내지 100 밀리그램 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체/환자의 킬로그램이다. 대신하여, 유효 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여당 0.1-5000μg/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 투여량은 임상의에 의해 잘 알려져 있고, 물론, 특정 질환의 상태, 투여되는 조성물의 특정 활성 및 치료될 특정환자에 의존할 것이다. 예컨대, 목적하는 치료학적 양을 얻기 위해, 반복된 투여, 즉, 특정 모니터된 또는 계측된 투여량을 반복하여 개인에게 투여하는 것이 필요하며, 여기서, 개인 투여는 원하는 하루 투여량 또는 효과가 달성될 때까지 계속한다.

바람직한 투여량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및/또는 30mg/kg/투여 또는 임의의 범위, 그의 값 또는 이의 단편을 포함하거나, 단일 또는 다중 투여당 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 및/또는 5000 μg/ml 혈청 농도 또는 임의의 범위, 그의 값의 혈청 농도를 달성하기 위한 투여량을 임의로 포함할 수 있다.

대신하여, 상기 투여량은 공지의 인자, 예컨대, 특정 약제의 약물동력학적 특성, 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 무게; 증상의 특징 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 횟수, 원하는 효과에 의해 변화될 수 있다. 일반적으로, 활성 물질의 투여량은 체중의 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 통상 0.1 내지 50, 및 바람직하게는 0.1 내지 10의 투여당 킬로그램당 밀리그램 또는 서방성 유출 형태가 목적하는 결과를 달성하기에 효과적이다.

비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 단일 또는, 1일당 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg과 같이, 0.01 내지 100 mg/kg을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40의 적어도 하나의 일, 또는 교대하거나 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 적어도 하나의 주, 또는 이의 임의의 조합, 단일, 주입, 또는 반복된 투여량을 이용하여, 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 일회 또는 기간적인 투여량으로서 제공될 수 있다.

체내 투여에 적합한 투여량 형태(조성물)는 일반적으로 유니트 또는 용기당 활성 성분의 약 0.0001 밀리그램 내지 약 500 밀리그램을 포함한다. 약제학적 조성물에서, 활성 성분은 일반적으로 조성물의 전체 무게에 기초하여 약 0.5-95 중량%의 양으로 존재한다.

비경구 투여를 위해, 상기 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 약제학적으로 허용되는 비경구 운반자와 회합 또는 분리되어 제공되는 용액, 현탁액, 에멀전, 또는 냉동건조된 분말로 제제화될 수 있다. 상기 운반자의 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로즈 용액 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 고정된 오일과 같은 비수성 운반자도 사용될 수 있다. 운반자 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지하기 위한 첨가제(예, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지하기 위한 첨가제(예, 완충액 및 보존제)를 포함할 수 있다. 상기 제제는 공지 또는 적절한 기술로서 멸균할 수 있다.

적절한 약제학적 담체는 본 기술의 표준 참고 문헌인 Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol의 최신판에 기재되어 있다.

치료적 투여, 많은 공지 및 개발된 유형을 약제학적으로 유효량의 본 발명에 따른 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 투여하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 작용제 또는 모방체는 흡입 또는 여기서 개시된 다른 방법에 의한 투여에 적합한 다양한 모든 장치 및 방법 또는 공지된 다른 방법을 사용하여 용액, 에멀젼, 콜로이드 또는 현탁액으로써, 또는 분말로써, 담체내에서 운반될 수 있다.

비경구 제제 및 투여. 비경구 투여를 위한 제제는 통상의 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리알킬렌글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지의 방법에 따라 적절한 유화제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 주사용 약제는 용매 중에 수용액 또는 멸균 주사용액 또는 현탁액과 같은 비독성의, 비경구 투여가능한 희석제일 수 있다. 사용가능한 운반자 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 식염수 등이 허용된다; 보통의 용매 또는 현탁화제로서, 멸균 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 이들 목적을 위하여, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산, 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 다이- 또는 트리-글리세리드를 포함하여 임의의 종류의 비휘발성 오일과 지방산을 사용할 수 있다. 비경구 투여가 당업계에 알려져 있으며, 참조에 의해 전체적으로 여기에 삽입된 미국특허 제5,851,198호에 기재된 바와 같은 가스 가압 무-바늘 주사 장치 및 미국특허 제5,839,446호에 기재된 바와 같은 레이저 천공 장치와 같은 통상적인 주사 수단을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

대체 전달. 본 발명은 또한 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 볼루스, 질, 결장, 협측, 설하, 비내, 또는 경피 수단에 의해 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 투여에 관한 것이다. 단백질, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물은 비경구(피하내, 근육 내 또는 정맥 내) 투여를 위해 특히 액상 수용액 또는 현탁액으로, 질 또는 결장 투여를 위해 특히 크림과 좌약을 포함하는 반고체 형태로, 협측 또는 설하 투여를 위해 특히 정제 또는 캡슐제의 형태로; 비강내를 위하여, 특히 분말, 비강내 드롭 또는 에어로졸 또는 특정 제제 형태로; 피부내를 위하여, 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 패치 운반 시스템(비제한적으로 예를 들어, Macroflux™ by Alza, California, USA, 또는 임의의 다른 공지된 방법, 장치 또는 기술) 형태로, 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위한, 디메틸설폭사이드와 같은 화학적 증진제와 함께(Junginger, et al. In 'Drug Permeation Enhancement'; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90(Marcel Dekker, Inc. New York 1994, 전체를 참조로서 인용함), 또는, 피부에서 단백질과 펩타이드를 함유하는 제제의 적용(WO 98/53847), 또는 전기천공과 같은 일시적인 수송 경로를 만들거나, 이온 삼투요법과 같은 피부를 통한 전하를 띤 약물의 이동성을 증가시키는 전기장의 적용, 또는 초음파 치료와 같은 초음파의 적용(미국특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)을 가능하게 하는 산화제와 함께, 준비될 수 있다(상기 간행물 및 특허는 전체가 참조로서 인용된다).

폐/ 비강내 투여. 폐 투여를 위해, 바람직하게는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물은 폐 또는 동(sinus)의 하부 기도에 도달하기 위해 유효한 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 흡입에 의해 치료제를 투여하기 위한 당업계에 알려진 임의의 다양한 흡입 또는 비강내 장치에 의해 전달된다. 환자의 동강 또는 폐포에서 에어로졸화된 제제를 침적할 수 있는 이들 장치는 계측 투여량 흡입기, 분무기, 건조 분말 생성기, 스프레이어 등을 포함한다. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 폐 또는 비강내 투여를 유도하는데 적당한 다른 장치 또한 당업계에 알려져 있다. 모든 그러한 장치는 에어로졸 중의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 분배를 위한 투여에 적당한 제제를 사용할 수 있다. 그러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. Ventolin^® 계측 투여량 흡입기와 같은 계측 투여량 흡입기는 전형적으로 추진 가스를 사용하고 흡입 중 작동을 요구한다(예를 들어 WO94/16970, WO98/35888 참조). Turbuhaler™(Astra), Rotahaler^®(Glaxo), Diskus^®(Glaxo), Spiros™ 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판된 장치, 및 Spinhaler^® 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 분말의 호흡-작동을 사용한다(US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 전체가 참조로서 인용된다). AUERx™ Aradigm, Ultravent^® 분무기(Mallinckrodt), 및 Acorn Ⅱ^® 분무기(Marquest Medical Products)(US 5404871 Aradigm, WO 97/22376)(상기 참조문헌들은 전체가 참조로서 인용된다)와 같은 분무기는 계측 투여량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등이 소입자 에어로졸을 생성하는데 비해, 용액으로부터 에어로졸을 생산한다. 상업적으로 유효한 흡입 장치의 이들 특정 예들은 본 발명의 실시를 위해 적당한 특정 장치의 대표적인 예이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 바람직하게는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 스프레이어에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 우수하게는 신뢰할 수 있고, 재현가능하며, 정확하다. 흡입 장치는 임의로 양호한 호흡성을 위해 예를 들어, 약 10 ㎛, 바람직하게는 약 1-5 ㎛의 소 건조 입자를 전달한다.

스프레이로서 GLP -1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물의 투여. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 현탁액이나 용액을 가압하의 노즐을 통해 통과시켜 제조할 수 있다. 노즐 크기와 형태, 적용되는 압력과, 액체 유입 속도를 원하는 결과와 입자 크기를 얻을 수 있도록 선택할 수 있다. 예를 들어, 전기스프레이를 모세관 또는 노즐 피드와 연결된 전기장에 의해 제조할 수 있다, 우수하게는, 스프레이어에 의해 전달되는 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 입자는 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 입자 크기를 갖는다.

스프레이어로의 용도를 위하여 적절한 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 제제는 전형적으로 용액 ㎖당, 약 1 ㎎ 내지 약 20 ㎎의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 농도에서 액상 용액 중에 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질을 전형적으로 포함한다. 제제는 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 약제를 포함할 수 있다. 제제는 또한 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 약제, 예를 들어 완충액, 환원제, 벌크 단백질, 탄수화물을 포함할 수 있다. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물을 제제화하는데 유용한 전형적인 탄수화물은 슈크로오스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코오스 등을 포함한다. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질 제제는 또한 에에로졸 형성에서 용액의 분무에 의해 유발된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 보편적인 계면활성제가 채용될 수 있다. 양은 일반적으로 제제의 0.001 내지 14중량% 범위이다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20 등이다. 모방체, 또는 특정 부분 또는 변형체와 같은 단백질 제제를 위해 당업계에 알려진 부가적인 약제 또한 제제에 포함될 수 있다.

분무기에 의한 GLP -1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물의 투여. GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질은 제트 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 분무기에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로는, 제트 분무기에서, 압축 공기 소스를 사용하여 오리피스를 통하여 고-속도 공기 제트를 생성시킨다. 가스가 노즐을 넘어 팽창함에 따라, 저-압력 부분이 생겨, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 용액을 액체 저장소에 연결된 모세관 튜브를 통해 끌어낸다. 모세관 튜브로부터의 액체 흐름은 튜브를 나갈 때 불안정한 필라멘트와 드롭렛으로 전단되어, 에어로졸을 생성시킨다. 일정 범위의 형태, 유속과 배플 유형을 사용하여 주어진 제트 분무기로부터 원하는 행동 특성을 얻을 수 있다. 초음파 분무기에서는, 고-주파 전기 에너지를 사용하여 전형적으로 압전성 튜랜스듀서를 사용하여 진동의, 기계적 에너지를 생성시킨다. 이 에너지는 직접 또는 커플링 유체를 통해 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 제제로 전달되어 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성시킨다. 우수하게는, 분무기에 의해 전달된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 입자는 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛ 범위의 입자 크기를 갖는다.

제트 또는 초음파 분무기로 사용하기에 적당한 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 제제는 전형적으로 용액 ㎖당 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 단백질의 약 1 ㎎ 내지 약 20 ㎎의 농도에서 액상 용액 내에 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 단백질을 포함한다. 제제는 부형제, 완충액, 등장화제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연을 포함할 수 있다. 제제는 또한 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질의 부형제 또는 안정화제, 예를 들어 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 또는, 탄수화물을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 제제화하는데 유용한 전형적인 탄수화물은 수크로오스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 제제는 또한 에에로졸 형성에서 용액의 분무에 의해 유발된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 보편적인 계면활성제를 사용할 수 있다. 양은 일반적으로 제제의 0.001 내지 4중량%(14% 위) 범위일 것이다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20 등이다. 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 단백질과 같은 단백질 제제를 위해 당업계에 알려진 부가적인 약제 또한 제제에 포함될 수 있다.

계측 투여량 흡입기에 의한 GLP -1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물의 투여. 계측 투여량 흡입기(MDI)에서, 추진제, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체, 및 어떠한 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 상자에 함유된다. 계측 밸브의 작동은 혼합물을 바람직하게는 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛ 범위 크기의 입자를 함유하는 에어로졸로서 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트-밀링, 분무 건조, 임계점 응축 등을 포함하는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 제조된 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 단백질 조성물의 제제를 사용하여 수득될 수 있다. 바람직한 계측 투여량 흡입기는 히드로플루오로카본 추진제를 사용하며 3M이나 글락소에 의해 제작된 것들을 포함한다.

계측-투여량 흡입기 장치로 사용하기 위한 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 제제는 일반적으로 예를 들어 계면활성제의 도움으로 추진제 중에 현탁된, 비수성 매질중의 현탁액으로서 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 함유하는 미세 분할 분말을 포함한다. 추진제는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a(히드로플루로알칸-134a), HFA-227(히드로플루로알칸-227) 등을 포함하는, 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본 또는 탄화수소와 같이, 이 목적을 위해 사용되는 임의의 통상적인 재료일 수 있다. 바람직하게는 추진제는 히드로플루오로카본이다. 계면활성제는 추진제 중에 현탁액으로서 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 안정화하거나, 활성 약물을 화학적 분해 등에 대해 보호하기 위하여 선택될 수 있다. 적당한 계면활성제는 솔비탄 트리올레에이트, 콩 레시틴, 올레산 등을 포함한다. 일부 경우 에탄올과 같은 용매를 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 단백질 제제를 위해 당업계에 알려진 부가적인 약제 또한 제제에 포함될 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법이 여기에 기재되지 않은 장치를 통해 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 조성물의 폐 투여에 의해 달성될 수 있음을 인지할 것이다.

점막 제제 및 투여. 점막 표면을 통한 흡수를 위한, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 투여하는 조성물 및 방법은 서브마이크론 입자, 점막부착 마크로분자, 생활성 펩티드, 및 점막 표면을 통한 흡수를 증진시켜, 유액 입자의 점막부착을 달성하는 수성 연속상을 포함하는 유액을 포함한다 (미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀젼의 적용을 위해 적합한 점막 표면은 각막, 결막, 협측, 설하, 비강, 질, 폐, 위, 장, 및 직장 투여 경로를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여를 위한 제제, 예컨대 좌약은 부형제로서, 예를 들어, 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아버터 등을 포함할 수 있다. 비강내 투여를 위한 제제는 고체일 수 있으며, 부형제로서, 예를 들어, 락토오스를 포함할 수 있거나, 또는 수성 또는 비강 점적제의 유성 용액일 수 있다. 협측 투여를 위한 부형제는 당, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 프리젤리네이틴된 녹말(pregelinatined starch) 등을 포함한다 (미국 특허 제5,849,695호).

경구 제제 및 투여. 경구 제제는 소장 벽의 투과성을 인공적으로 증가시키는 애쥬번트(예를 들어, 레조르시놀 및 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르와 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르와 같은 비이온성 계면활성제)의 공동-투여, 및 효소 분해를 저해하는 효소 저해제(예를 들어, 이자 트립신 저해제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실롤)의 공동-투여에 의존한다. 경구 투여를 위한 고형 제형의 활성 성분 화합물은 수크로오스, 락토오스, 셀룰로오스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 아가, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 폴리머, 및 글리세라이드를 포함하는 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 제형은 또한 다른 유형의 첨가제, 예를 들어 불활성 희석제, 파라벤, 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 소르브산과 같은 보존제, 시스테인과 같은 항산화제, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충화제, 감미제, 향료, 방향제 등을 함유할 수 있다.

정제와 환제는 추가로 장용 제제로 가공될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 의학적 용도에 허용되는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 제제를 포함한다. 이들 제제는 동 분야에서 보통 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 리포좀이 또한 인슐린과 헤파린의 약물 전달 시스템으로서 기재된 바 있다(미국 특허 제4,239,754호). 더욱 최근에, 혼합된 아미노산(프로티노이드)의 인공적 폴리머 마이크로스피어가 약제를 운반하는 데 이용된다(미국 특허 제 4,925,673호). 더욱이, 미국특허 제5,879,681호 및 미국특허 제5,5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 당압계에 알려진 바와 같이 경구로 생물학적 활성 약물을 전달하는데 사용된다.

경피 제제 및 투여. 경피 투여를 위해, 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체는 리포좀 또는 폴리머성 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 마이크로스피어와 같은 전달 장치에 캡슐화된다(다르게 언급하지 않는 한 총괄적으로 마이크로입자로 언급한다). 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 그의 코폴리머와 같은 폴리하이드록시산, 폴리오르소에스테르, 폴리언하이드라이드 및 폴리포스파진과 같은 합성 폴리머 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 알기네이트 및 다른 다당류와 같은 천연 폴리머, 및 그들의 조합물로 제조된 마이크로입자를 포함하여 많은 적당한 장치가 알려져 있다.(미국 특허 번호 5,814,599호)

지속 투여 및 제제

때때로 본 발명의 화합물을 대상에게 장시간, 예를 들어 단일 투여로부터 1 주 내지 1 년에 걸쳐 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방성, 데포 또는 이식 제형을 사용할 수 있다. 예를 들어, 제형은 체액에서 낮은 용해도를 갖는 화합물의 약제학적으로 허용되는 비독성 염, 예를 들어 a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알진산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 다염기 산으로 산 부가된 염; b) 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온 또는 예를 들어 N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온을 갖는 염; 또는 (c (a)와 (b)의 조합물, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 상기한 바와 같은 상대적 불용성 염은 젤, 예를 들어, 주사에 적합한, 예를 들어 참깨유와 함께 알루미늄 모노스테아레이트 젤에서 제제화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 주사용의 또 다른 유형의 서방성 데포 제제는 예를 들어 미국특허 제3,773,919호에 기재된 바와 같이 폴리락트산/폴리글리콜산 폴리머와 같은 서서히 분해되고, 비독성이며, 비-항원성인 폴리머에서 캡슐화되기 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유한다. 화합물, 또는 바람직하게는 상기한 바와 같은 상대적 불용성 염은 또한 특히 동물에서 사용하기 위하여 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛으로 제제화될 수 있다. 부가적인 서방성 데포 또는 이식 제제, 예를 들어 가스 또는 액체 리포좀이 문헌에 알려져 있다(미국특허 제5,770,222호 및 'Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems', J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

본 발명에서 일반적으로 기술된 것을 가지고, 동일한 것은 설명의 방식으로 제공되며, 제한으로서 간주되지 않는, 하기 실시예에 참고로서 보다 쉽게 이해될 것이다.

실시예 1: 포유동물 세포에서 GLP -1 작용제 또는 모방체의 클로닝 및 발현. 전형적 포유동물 발현 벡터는 mRNA, GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 코딩 서열의 전사 개시와 전사체의 폴리아데닐화 및 전사의 종결에 필요한 신호를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소를 함유한다. 추가적인 요소는 RNA 스플라이싱을 위한 공여자 및 수용자 부위에 의하여 프랭크되는 인핸서, 코작 서열 및 조정 서열을 함유한다. 고도로 효율적인 전사는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스로부터의 긴말단반복(LTR), 예를 들어, RSV, HTLVⅠ, HIVⅠ 및 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 초기 프로모터와 함께 성취될 수 있다. 그러나, 세포성 인자 또한 사용될 수 있다(예: 인간 액틴 프로모터). 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 발현 벡터는 예를 들어, pIRES1 neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX(Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1(+/-), pcDNA/Zeo(+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen), PSVL 및 PMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 인간 Hela 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 세포 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV1, 퀘일 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.

다르게는, 유전자는 염색체로 도입된 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 하이그로마이신과 같은 선별 마커 로의 공동-형질감염은 형질감염된 세포의 확인 및 분리를 가능하게 한다.

형질감염된 유전자는 또한 대량의 암호화된 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 관심 있는 유전자의 수백 또는 수천 카피를 운반하는 세포주를 발생시키는데 유용하다. 다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 합성효소(GS)(Murphy 등, Biochem J. 227: 277-279(1991); Bebbington 등, Bio/Technology10: 169-175(1992))이다. 이들 마커를 사용하여, 포유 동물 세포를 선별 배지에서 증식시키고 최고의 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이들 세포주는 염색체로 도입된 증폭 유전자(들)을 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포는 종종 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체 생산에 사용된다.

발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 사르코마 바이러스의 강력한 프로모터(LTR)(Cullen 등, Molec. Cell. Biol. 5: 438-447(1985))플러스 CMV-인핸서(Boshart 등, Cell 41: 521-530(1985)의 단편을 함유한다. 예를 들어 제한효소 절단위치 BamHⅠ, XbaⅠ 및 Asp718을 갖는, 다중 클로닝 부위는 관심 있는 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터들은 부가적으로, 랫 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.

CHO 세포에서의 클로닝 및 발현. 벡터 pC4를 GLP-1 작용제 또는 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체의 발현을 위해 사용하였다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC 수탁 번호 37146)의 유도체이다. 상기 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절하에 있는 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드에 형질감염되어 디히드로폴레이트 활성을 상실한 중국 햄스터 난소 또는 다른 세포는 선택적 배지(예, 알파 마이너스 MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD)에서 화학 약물인 메토트렉세이트(MTX)를 첨가하여 선택된 배지 내에서 세포를 생육함으로써, 선택할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 문헌에 잘 나타나 있다(참조, 예, F. W. Alt, 등, J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978) ; J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); 및 M. J. Page 및 M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). MTX 농도의 증가에서 배양한 세포는 DHFR 유전자의 증폭의 결과로서, DHFR, 표적 효소를 과생산함에 의해 약물에 내성을 만든다. 만일 2차 유전자가 DHFR 유전자에 링크된다면, 일반적으로 공동 증폭 및 과발현된다. 이러한 연구가 증폭된 유전자의 1,000 Ⅰ복제 이상을 운반하는 세포주의 개발을 위해 수행되는 것은 본 분야에서 공지이다. 계속하여, 메토트렉세이트를 철회하면, 세포주는 숙주세포의 하나 이상의 염색체(들)내로 삽입된 증폭된 유전자를 포함하여 얻어진다.

플라스미드 pC4는 관심있는 유전자의 발현을 위하여, 라우스 사코마 바이러스(Cullen, et al., Molec Cell Biol 5:438-447(1985))의 말단 반복 서열(LTR)의 강력한 프로모터 플러스 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)(Boshart, et al, Cell 41.521-530(1985))의 즉시 초기 유전자의 인핸서로부터 분리된 단편을 함유한다. 프로모터의 다운스트림은 유전자의 삽입을 허용하는 BamHⅠ, XbaⅠ, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위이다. 이러한 클로닝 부위 뒤에 플라스미드는 3' 인트론 및 랫 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐레이션 부위를 함유한다. 다른 고효율 프로모터를 발현에 이용할 수 있으며, 예를 들어, 인간 b-액틴 프로모터, SV40 초기, 또는 후기 프로모터 또는 예를 들어, HIV 및 HTLVI와 같은 다른 레트로바이러스로부터의 말단 반복 서열이 있다. Clontech's Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 포유동물 세포에서 조절된 방법으로 GLP-1을 발현하기 위해 사용될 수 있다(M. Gossen, 및 H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). mRNA의 폴리아데닐화를 위하여, 예컨대, 인간 성장 호르몬으로부터의 또는 글로빈 유전자로부터의 다른 신호가 사용될 수 있다. 염색체 내로 도입된 목적 유전자를 운반하는 안정한 세포주는 선별할 수 있는 마커, 예컨대, gpt, G418 또는 히그로마이신를 이용하여 공동형질감염하여 선별할 수 있다. 시작에서 하나이상의 선별 마커, 예를 들어, G418 플러스 메토트렉세이트를 사용하는 것이 바람직하다.

플라스미드 pC4를 제한 효소로 분해하고, 그 후 송아지 내장 포스파타제를 이용하여 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 탈인산화시킨다. 벡터를 그 후 1% 아가로즈 겔로부터 분리한다.

공지의 단계에 따라, 본 발명의 GLP-1 모방체의 HC및 LC 가변 영역에 상응하는 완전한 GLP-1 모방체 또는 특정 부분 또는 변형체를 암호화하는 DNA 서열을 이용하였다. 적절한 인간 불변 영역 (즉, HC 및 LC 영역)을 암호화하는 분리된 핵산도 또한 본 컨스트럭트에서 사용된다.

상기 분리된 가변 및 불변 영역을 암호화하는 DNA 및 탈인산화된 벡터를 그후 T4 DNA 라이게이즈로 라이게이션시킨다. E. coli HB 101 또는 XL-1 Blue 세포를 형질전환 하고, 예컨대, 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4에 삽입된 단편을 함유하는 박테리아를 확인하였다.

활성이 있는 DHFR 유전자가 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 형질감염에 이용하였다. 5 마이크로그램의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 마이크로그램의 플라스미드 pSV2-neo에 리포펙틴을 사용하여 공동형질감염시켰다. 플라스미드 pSV2neo는 주된 선택 마커, G418를 포함하는 항생체 군에 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 네오 유전자를 포함한다. 세포를 1 ㎍/㎖ G418이 보충된 알파 마이너스 MEM에서 배양하였다. 2일 후, 세포를 트립신 처리하고, 10, 25 또는 50 ng/㎖의 메토트렉세이트 플러스 1 ㎍/㎖ G418를 보충한 알파 마이너스 MEM에서 하이브리도마 클로닝 플레이트에서 시딩하였다(Greiner,Germany). 약 10-14일 후에, 단일 클론을 트립신 처리하고, 다른 농도의 메토트렉세이트 (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 이용한 6-웰 페트리 디쉬 또는 10㎖ 플라스크에 시딩하였다. 메토트렉세이트의 가장 높은 농도에서 자란 클론을 그 후 더 높은 농도의 메토트렉세이트(1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 포함하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮겼다. 같은 방법을 100-200 mM의 농도에서 자란 클론이 얻어질 때까지 반복하였다. 목적하는 유전자 생성물의 발현을 예컨대, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석법에 의해 분석하였다.

실시예 2: 본 발명의 GLP -1 모방체의 비-제한적 예. GLP-1은 경구 글루코오스 투여 다음, 장의 L-세포로부터 분비되는 37-아미노산 펩티드이다. 생물학적으로 활성이 있는 GLP-1(7-37) 펩티드, 변형체 또는 유도체를 도입하는 모방체 컨스트럭트가 펩티드의 생체내 생체 시간을 연장하는 것으로 기대되며, 제 2형 당뇨병 환자에서 혈당을 낮추기 위한 신규한 치료법을 제공한다. 원래 GLP-1(7-37) 펩티드 또는 DPP- Ⅳ 저항성 유사체를 암호화하는 펩티드는 모방체 구조에 도입될 수 있다. 이러한 분자의 몇몇은 만들어지고 만들어진 모방체는 기능적 실험상 세포-기초 분석에서 활성을 묘사한다. 다른 실험상 분석 및 생체내 모델은 본 연구에서 이용될 수 있으며, 능력은 서로 또는 여기에 나타낸 결과에 비교될 수 없다.

GLP-1 모방체 변형체, GLP-1 펩티드, 링커, 힌지 또는 CH2 및 CH3 서열을 모방체 내에서 형성하기 위하여, 발현, 능력, 안정석 또는 효과자 기능을 증가 시키기 위하여 결실, 부가, 치환, 돌연변이 또는 변형될 수 있다. 야생형 GLP-1 서열, 뿐만 아니라 DPP-Ⅳ 저항성 GLP-1 변형체, 즉 GLP-1 (A2S) 또는 GLP-1 (A2G)은 모방체 구조에 도입될 수 있다. 펩티드의 돌연변이는 GLP-1 모방체의 특성을 개선하기 위하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 나선 도메인에서 돌연변이가 나선을 안정화시킬 수 있는 반면, 아미노 말단 잔기에서 돌연변이는 신호를 개선시킬 수 있고, 이에 따라, 수용체에로의 결합 및/또는 모방체의 안정성을 개선시킨다.

링커의 길이 및 조성물은 돌연변이화되어 GLP-1 펩티드 및 Fc 영역 사이의 부착의 안정성 또는 유연성을 다양하게 할 수 있다. 다른 이소타입은 분자의 힌지 영역에 도입될 수 있다. 덧붙여 돌연변이는 모방체의 힌지 영역 내에서 만들어져, 분자를 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG4 힌지는 Ser²²⁸->Pro 변형체를 만들기 위하여 돌연변이화되어, 모방체 내에서 내부 사슬 이황화 결합을 안정화시킨다. 모방체의 Fc 부분 내에서 변형체가 만들어져, FcR 결합과 같은 효과자 기능을 변화시키고, 분자의 안정성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, Ala/ Ala 돌연변이를 갖는 IgG4와 같이, 인간 또는 뮤린 이소타입(또는 이러한 분자들의 변형체들)을 이용할 수 있다.

본 발명의 GLP-1 모방체. 본 발명의 특이적, 비-제한적 예는 화학식 (I) ((P(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t)에 따른 GLP-1 모방체 컨스트럭트(서열 번호 2)이다.

여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드(7-36)의 단일 카피이며, L은 Gly-Ser 또는 Gly-Gly-Gly-Ser 유연성있는 링커의 직렬 반복이고, V는 V_H서열의 C-말단, 예를 들어, 자연적으로 발생한 IgG의 J 영역이며, H는 완전한 IgG1 힌지 영역이고, CH2&CH3는 IgG1 이소타입 하위분류의 것이다. 이러한 컨스트럭트의 반-감기는 GLP-1 펩티드 단독 또는 그것의 변형체 또는 유도체 및 IgG의 그것과 유사한 것의 수배일 것이다.

상기에서 개시된 기초적 구조에 부가하여, 잠재적으로 유리한 생물학적 특성을 갖는 변형체가 개시된다. 이들은 감소된 자기-회합으로의 경향, 감소된 면역 작용자 효과 또는 감소돤 면역원성을 갖을 수 있는 컨스트럭트를 함유한다. 생물학적으로 활성이 있는 펩티드의 개선된 구조와 같은 원하는 특성을 부여하고 혈액뇌장벽을 가로질러 이송하는 다른 변형이 상상된다. 제안된 변형체 및 변형은 임의의 방식으로 결합되어, 원하는 활성을 갖는 컨스트럭트를 산출할 수 있다.

재조합 DNA 방법을 이용하여, GLP-1 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 및 인간 J 서열 사이에 매개의 벡터에 삽입된다. 이는 벡터에서 나타난 제한 위치에 적합한 말단을 갖는 상보적 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 행해진다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 GLP-1 펩티드를 위한 코딩 서열, 및 두 GGGS 반복으로 구성된 유연성 있는 링커를 포함한다. 그 다음, 상기-언급한 기능적 요소를 함유하는 제한 단편은 발현 벡터로 이동된다. 이러한 벡터 항-CD4 면역글로불린 프로모터와 인핸서, 및 IgG1 힌지 서열을 위한 코딩 서열, HC 불변 영역 2(CH2) 및 불변 영역 3(CH3) 뿐만 아니라 플라스미드 복제 및 박테리아에서 선택 및 포유동물 세포에서 안정한 발현자를 위한 선택을 위해 필요한 요소를 포함한다.

이러한 플라스미드는 HEK293E 세포에 도입되고, 일시적으로 형질감염된 세포에서 wt GLP-1 모방체의 발현이 성취된다. 형질감염된 세포의 약 1.5mg/L를 산출하는 GLP-1 모방체의 정제는 표준 단백질 A 및 Superose 12 친화도 크로마토그래피에 의해 성취된다. 이러한 단백질은 아래에 개시된 실험을 위한 시작 재료이다.

GLP-1 모방체의 아미노산 서열은 도 1에 나타내었다. 기능적 도메인은 펩티드 코딩 서열 위에 주석된다. J 서열이 GLP-1 다이머에 더욱 유연성을 제공하고, 면역 글로불린의 구형 구조로부터 튀어나오고, 두 GLP-1 수용체 사이의 갈라진 틈으로 침투할 것이라고 생각된다. IgG1 힌지 영역에는 세 시스테인이 있다. 첫번째는 정상적으로 면역 글로불린 경쇄(LC)와 쌍을 이루며, 다른 두개는 두 HCs CH2 사이의 내부사슬 결합에서 관여하며, CH3 영역은 벌크 단백질을 구성한다. 면역 글로불린이 긴 혈청 반-감기를 갖는다고 믿어지는 이유 중의 하나는 음세포 작용된 면역 글로불린을 세포 외 공간에 다시 보내는 것에 의한 혈청 반김기를 연장하는 FcRn에 결합하는 그들의 능력이다. FcRn의 결합부위는 CH2 및 CH3 영역의 교차를 오버랩한다 (Sheilds et al, 2001, J Biol Chem , vol 276(9), 6591-6604).

두 IgG 중쇄는 호모다이머 형성을 위하여, 힌지 영역에 위치한 시스테인들 사이의 이황화 결합을 통한 세포적 처리 동안, 어셈블된다고 잘 알려져 있다. 이는 변형된 펩티드들 사이에 또한 발생하여 어셈블된 GLP-1 모방체 컨스트럭트를 형성할 것이라 기대된다. 덧붙여, GLP-1 펩티드 내 두 시스테인 사이의 내부사슬 이황화 결합 또한 형성될 것이다. 기대되는 GLP-1 모방체의 구조는 두 GLP-1 펩티드를 형성한다. 완전한 서열의 유연성을 따른 N-말단에서 펩티드의 공간 배열은 펩티드가 생활성 있는 다이머를 형성하는 것을 허용할 것이다.

실시예 3. FACS 결합 분석. GLP-1 모방체의 활성은 실험상 FACS 결합 분석에서 시험된다. GLP-1 모방체가 GLP-1R에 결합하는지 결정하기 위하여, GLP-1R을 과-발현하는 HEK293 세포 (1x1O⁶ 세포)를 GLP-I 모방체 (20 nM)와 함께 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 형광 표지된 두번째 검출 항체(1 μg/mL 염소 항-인간 IgG, Fc 감마 특이적)를 4℃에서 30분 동안 첨가하였다. 세포의 형광 민감성을 흐름 사이토메트리를 통하여 모니터하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, GLP-1 모방체는 GLP-1R(도 2A)을 과-발현시키는 HEK293 세포에 결합하나, 대조군 HEK293 세포(도 2B)에서는 그렇지 않다. GLP-1 펩티드 유사체 (A2S)로써 특이적인 결합은 결합(도 2C)에서 GLP-1 모방체와 경쟁할 수 있다.

실시예 4: cAMP 분석. GLP-1R에 GLP-1의 결합은 신호 분자, 3', 5'-사이클릭 AMP(cAMP)에서 투여량-의존적 증가가 된다. cAMP는 GLP-1R(Applied Biosystems)을 발현하는 세포에서 실험상 분석으로 측정될 수 있다. 간단하게, RINm 세포들(1x10⁵세포)을 GLP-1 펩티드(0-30 nM) 또는 GLP-1 모방체(0-100 nM)의 증가된 농도로 인큐베이션하였다. 세포를 용해하고, 알칸-포스파타제 표지된 cAMP 컨쥬게이트 및 화학 발광 기질(Tropix® CDPD®)을 채용한 경쟁적 분석을 이용하여 cAMP의 양을 결정하였다. wt GLP-1 모방체(도 3A)를 위한 농도 의존적 cAMP 활성은 GLP-1 펩티드(도 3B)와 비교될 수 있다. (각각, EC5O = 0.4nM에 대한 1.1 nM) 유사한 실험에서, IgG4 구조(도 3C)내의 GLP-1(A2G) 모방체 및 IgG4 구조(도 3D) 내의 GLP-1(A2S) 모방체 둘다는 RINm 세포에서 IgG 구조(도 3E)내의 wt GLP-1 모방체보다 유의적으로 더 높은 수치로 cAMP 레벨이 증가된다.

실시예 5: DPP -Ⅳ 절단 분석. GLP-1은 DPP-Ⅳ에 의하여 빠르게 비활성화되기 때문에, 완전한(예를 들어, 절단되지 않은) GLP-1 모방체를 측량하기 위한 실험상 분석이 확립된다. 간단하게, GLP-1 모방체 또는 펩티드(1.2nM)를 실온에서 DPP-Ⅳ(1 μg/mL, R&D Systems)와 함께 인큐베이션시켰다. 다양한 시간(0, 5, 10, 15, 50, 30, 40 분) 후에, DPP-Ⅳ 저해제 (100 μM, Linco)를 부가하여 반응을 억제하였다. 각각의 표준 곡선을 위한 GLP-I Active ELISA (Linco) 및 GLP-1 모방체 또는 펩티드를 이용하여, 완전한 GLP-1 모방체 또는 펩티드의 양을 측정하였다. 도 4는 GLP-1 모방체는 GLP-1 펩티드와 비교하여 DPP-Ⅳ에 의한 절단에 유의적으로 더욱 저항성 있음을 보여준다.

실시예 6: 인간 혈청 안정성 분석. 혈청에서 GLP-1 모방체의 안정성을 또한 측정하여, 다른 혈청 단백질 분해효소가 절단 및 GLP-1 모방체를 비활성화시키기 가능하지 않은 것을 확실하게 하였다. 간단하게, 인간 혈청 내, 37℃에서 GLP1 펩티드 또는 GLP1 모방체(30nM)을 인큐베이션하였다. 다양한 시간 후에, 샘플을 평가하여, 완전한 펩티드 또는 모방체의 양을 결정하였다. 반응을 DPP-Ⅳ 저해제(100 μM, Linco)로 억제하고, 샘플을 Linco로 부터의 GLP-I Active ELISA 를 이용하여 분석하였다. 도 5는 GLP-1 펩티드의 < 5%가 4시간 후에 완전하게 남아있는 반면, 24시간 후에, GLP-1 모방체의 > 90%가 완전하게 남아있는 것으로 보여진다.

실시예 7: RINm 세포에서 인슐린 분비를 유발하는 GLP -1 모방체 . 인슐린 분비에서, GLP-1 모방체의 효과를 시험하기 위하여, RINm 세포를 증가된 농도의 GLP-1(7-36) 펩티드(0-5nM)(도 6A), 엑센딘(exendin)-4 펩티드 (0-5 nM) (도 6A), 또는 다양한 GLP-1 모방체 (5 또는 50 nM)로 처리하고, ELISA를 통하여 분비된 인슐린의 양윽 측정하였다. 시험할 모든 GLP-1 모방체는 RINm 세포에서 인슐린 분비를 자극하는 활성을 갖는다. 50nM에서 모방체는 야생형 GLP-1(7-36) 펩티드의 그것과 비교할 수 있는 활성을 갖는다.(도 6B)

실시예 8: GLP -1 모방체의 약동학. 세 GLP-1 모방체(wt, A2S, 및 A2G)를 결정하기 위하여, C57Blk/6 마우스를 0.062 mg/kg GLP-I 펩티드 또는 1.0 mg/kg A2S GLP-I 모방체로 정맥내 투여하였다. 다른 시간에서 마우스를 희생시킨 다음, 심장의 구멍을 통하여 플라스마를 수득하였다. 동물에서 시간에 걸쳐, 대사됨에 따라, Fc, 전체 모방체, 활성 있는 모방체 및 활성 있는 펩티드를 측정하기 위하여, 다양한 ELISA를 이용하였다. 완전한 GLP-1 펩티드를 Linco로부터의 GLP-I Active ELISA를 이용하여 정량하였다. 완전한 GLP-1 모방체를 GLP-1 펩티드(Linco)의 N-말단에 특이적인 항체와 함께 캡쳐하고, Fc에 특이적인 항체로 검출하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, GLP-1 A2S 모방체 분자를 주입(도 12B)후 72시간 이상 동안 결정한 반면, GLP-1 펩티드의 레벨은 주입(도 12A) 후 감지할 수 있는 15분을 넘지 않는다.

실시예 9: db / db 마우스에서 글루코오스 레벨을 낮추는 GLP -1 모방체 . 6주령 db/db 마우스를 2시간 동안 금식시키고, 그 다음, 운반체, GLP-1 펩티드 또는 GLP-1(A2S) 모방체를 정맥내 투여하였다. 혈당을 투여-후 0.5, 1, 2, 3, 및 4 시간에 모니터하였다. GLP-1 펩티드는 30분, 그러나 60분까지 혈당을 낮추고, GLP-1 펩티드(도 7A)의 짧은 반-감기때문에 혈당은 증가하기 시작한다. 비교하여, GLP-1 펩티드 투여량보다 100-배 더 낮은 GLP-1(A2S) 모방체는 전체 4시간 기간(도 7A)를 통하여 혈중에 감소를 유도한다. 도 7B에 나타낸 결과는 0.019 내지 1.9 nmol 범위의 투여량 에서 GLP-1 모방체가 대조군 동물과 비교하여, 당뇨병 동물의 공복 혈당을 낮추는데 효율적임을 지시한다. 덧붙여, GLP-1을 위한 활성의 기작과 일치하여, 0.19nmol에서 성취된 최대 당 감소 효과는 높은 투여량의 GLP-1 모방체(1.9nmol)에 의하여 향상되지 않는다. 최대 당 감소 효과는 정상 범위 내에 혈당 수치를 유지시킨다.

실시예 10: 랫 섬의 증식에서 GLP-1 모방체의 효과. 약 250 그램 무게의 10 수컷의 Sprague-Dawley 랫을 넴뷰탈(50mg/kg IP)로 마취시켰다. 발끝을 집어 반응 없음의 확인 다음, 정중선 절개를 수행하고, 총담관을 분리하고, 샘창자에로의 그것의 입구를 고정시켰다, 총담관은 간으로의 그것의 분기점에 바로 말단을 절단하였다. Liberase™ RI (0.25 mg/mL)의 10mL을 Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)에 용해하고, 10cc 주사기에 연결된 PE-50를 통하여 총담관에 주입하여, 이자가 Liberase™ 용액과 함께 팽창되도록 하였다. 주입 다음, 이자를 동물로부터 분리해내고, 50mL 시험관에 위치시키고, 이자에 주입하고, 이자를 모든 동물로부터 수집할 때까지 얼음에서 보관하였다.

주입된 이자를 함유하는 50mL 시험관을 37℃ 수조에 위치시키고, 20분 동안 인큐베이트되도록 허용하였다. 인큐베이션 다음, 관을 수조로부터 제거하고, 흔들고, 차가운 10% 새로 태어난 송아지 혈청 (NCS)로 보충된 HBSS (HBSS+), 5 mM 글루코오스, 10 mM HEPES, 100U/ 100㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)로 채웠다. 내용물을 425㎛ 스테인리스강 체를 통하여 필터하고, 2x50mL 튜브에 수집하였다. 필터를 HBSS+로 헹구고, 튜브를 원심분리하였다. 이자 소화를 비연속 폴리수크로오스 밀도 구배에 적용하였다.

1.108gm/mL 폴리수크로오스 용액의 10mL을 펠렛에 첨가하고, 현탁시켰다. 그 다음, 1.096, 1.068 및 1.037gm/mL 폴리수크로오스 용액 각각의 5mL을 순차적으로 첨가하여, 비연속 구배를 종료시켰다. 그 다음 튜브를 2,000rpm, 4℃에서 10분 동안 적용된 브레이크 없이 원심분리하였다. 원심분리한 다음, 섬을 함유한 계면을 수집하고, 세척하였다. 분리된 섬은 10% 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 CMRL- 1066 배지(CMRL+), 2mM 글루타민, 25 mM HEPES, 및 lOOU/lOO㎍ 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)에서 오버나잇 배양하였다. 다음 날 섬을 손수-집고, 세개의 다른 GLP-1 모방체 컨스트럭트의 존재 하에서 8시간 동안 3번 배양시켰다. 음성 대조 섬은 처리하지 않고, 양성 대조군으로써 exendin-4를 이용하였다. 인큐베이션 다음, 삼중 티미딘을 배양에 첨가하고, 24-48시간동안 37℃로 되돌아갔다. 인큐베이션 기간 다음, 섬을 세척하고, 삼중 티미딘 도입을 베타 카운터로 계수하였다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 두 테스트된 농도(5 nM 및 50 nM)에서 exendin-4의 그것과 유사한 레벨에 대조군에 대하여 GLP-1 모방체의 증가된 티미딘 도입을 테스트하였다. 그것은 GLP-1 모방체의 각각이 랫 섬의 증식을 증가시킬 수 있다는 것을 제안한다.

GLP-1 A2S 모방체를 랫 섬 증식에 영향을 시험하는 데 이용하였다. 분리된 및 배양된 섬을 증가된 투여량(0.05 - 500 nM)으로 처리하고, 티미딘 도입을 측정하였다. 도 8B는 A2S 모방체(0.05 - 500 nM)가 대조군에 대하여 티미딘 도입이 증가된 것을 보여주며, 모방체가 시험한 모든 농도에서 랫 섬의 증식을 증가시킬 수 있다는 것을 제안한다.

실시예 11: 비-인간 영장류( NHP ) 섬 및 인간 섬의 증식에서 GLP-1 모방체의 효과 Ranuncoli et al. Cell Transplant (2002) 9, 3, 409-414에 세부적으로 기재된 바와 같이 NHP 섬을 효소적 분해 및 밀도 구배 정제를 이용하여 분리하였다. 섬을 분리하고, Miami 배지 1(University of Miami, Maimi, FL)에서 오버나이트 배양하였다. 삼중 티미딘 도입을 실시예10에 기재된 바와 같이, 평가하였다. GLP-1 A2S 모방체는 NHP 섬의 증식을 exendin-4 (도 9)의 그것과 유사한 레벨로 자극하였다. 유사하게, 인간 섬의 증식을 exendin-4 (도 10A)의 그것과 유사한 레벨로 또한 자극하였다. 도 10B는 A2S 모방체가 0.05nM 내지 500nM 범위의 농도에서 효율적이라는 것을 묘사한다.

실시예 12 : 랫 섬의 인슐린 분비에 GLP-1 모방체의 영향 랫 섬을 실시예 10에 나타낸 프로토콜에 따라 분리하였다. 3.5 또는 15mM 글루코오스를 함유하는 배지에서 섬을 배양하고, ELISA를 이용하여 섬에 의해 분비되는 인슐린을 측정하였다. 결과는 GLP-1 모방체의 다중 컨스트럭트가 글루코오스에 반응하여, 인슐린 분비를 가능하게 한다는 것을 보여준다.

실시예 13: GLP-1 모방체의 안정성은 종 특이적이다. GLP-1 A2S 모방체를 마우스, 랫, 사이노몰거스 원숭이 및 인간으로부터의 전체 혈액에서 인큐베이션하였다. 다양한 시간 점에서, 샘플을 제거하고, ELISA를 이용하여 인접한 모방체의 양을 측정하였다. 모방체의 안정성은 랫 또는 마우스 혈액(도 13)보다 사이노몰거스 원숭이 또는 인간 혈청으로부터의 혈액에서 유의적으로 더 크다. 마우스(도 13A) 또는 랫 혈액(도 13B)에서 18시간 인큐베이션 후, 대부분의 모방체는 더이상 인접하지 않는다. 반대로, 약 100%의 모방체가 사이노몰거스(도 13C) 또는 인간 혈액(도 13D)에서 24-시간 인큐베이션 후, 인접하였다.

실시예 14: 사이노몰거스 원숭이에서 GLP-1 모방체의 개선된 약동학. 사이노몰거스 원숭이를 1.0mg/kg의 네개의 GLP-1 모방체 컨스트럭트로 정맥내 주입하고, 혈청 샘플을 투여 다음, 10 분 내지 5일의 다른 시간 점에서 가져왔다. 혈청 샘플을 ELISA에 의하여 측정하여 인접 모방체를 정량하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 모든 네 모방체는 빠른 분포 상 다음, 더 느린 제거 상을 보유한다. 각각의 컨스트럭트를 위하여 약동학적 상수를 측정하여 유사한 노출에서 약 3일의 T½의 지시를 T=0 내지 T=120 시간의 AUC에 의하여 결정하였다.

실시예15 : 마우스에서 글루코오스 접종 후, 혈당에 GLP-1 모방체 치료의 영향. 8-주령 당뇨병 db/db 마우스를 12시간 동안 공복되게 하였다. 공복 상태로의 6시간에 마우스를 0.02 내지 2mg/kg 범위의 투여량에서 A2S 모방체 컨스트럭트로 피하내 주입하였다. GLP-1 모방체 투여 후, 및 공복의 12시간에, 마우스에 1 g/kg 글루코오스를 경구 투여하고, 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 및 180분에서 그들의 혈당을 측정하였다. 도 15a에서 나타낸 바와 같이, GLP-1 A2S 모방체는 운반자 대조군과 비교하여, 혈당을 낮추는데 효과적인 투여이다. 유사한 실험을 고 지방 식이로 유지된 C57/B16 마우스에 대하여 수행하고, 12시간 공복되도록 하였다. 도 15b에 나타낸 바대로, 운반자 대조군과 비교하여, ALP-1 A2S 모방체는 또한 모든 투여량에서 혈당을 낮추는 데 효과적이다.

실시예 16: GLP-1 MMB 는 투여량-의존적으로 사이토카인-유도된 자멸사를 저해한다. RIN-m 세포를 96 웰 플레이트에 50,000 세포/웰로 씨딩하고, 37℃에서 오버나이트 인큐베이션하였다. 다음 날, 사이토카인 TNFα (1Ong/mL) 또는 IL-Iβ (4ng/mL)의 첨가 전, 세포를 GLP-1 MMB(100nM로부터 연속적 희석)의 투여 범위로 30 분 동안 처리하였다. 플레이트를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 자멸사를 분석하기 위하여, Cell Death ELISA-Plus assay kit (Roche Applied Science, Cat No. 11920685001)를 이용하였다. 배지를 웰로부터 빨아들이고, 200㎕의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용해물의 20㎕를 스트렙타비딘 코팅된 96웰 마이크로타이터 플레이트에 옮겼다. 80㎕의 면역시약(제공된 인큐베이션 완충액에서 항-히스톤-비오틴 및 항-DNA-퍼옥시다제의 1.20 희석)을 또한 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 100㎕ 현탁액을 천천히 쉐이킹하면서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 플레이트를 인큐베이션 완충액으로 3번 세척하고, 현상용액을 플레이트에 첨가하였다. 정확히 5분 후에 4.5nm에서 흡광도를 읽었다. 데이터는 GLP-1 MMB가 RIN-m 세포를 TNF-α 또는 IL- lβ에 의해 유도된 자멸사로부터 보호하는 것을 지시한다.(도 16)

제 1형 당뇨병(T1D)에서, 인슐린 분비 이자 베타 세포의 특이적 파괴가 있다. 베타 세포 파괴의 뒤에 숨은 정확한 분자 기작을 알지 못함에도 불구하고, T1D환자로부터의 혈청은 증진된 자멸사를 보이고, 자멸사가 당뇨병의 발병에서 역할을 수행한다는 것을 제시한다. 최근 발병된 환자를 치료하는 것에 의하여, 최초 기간에의 누군가 및 심지어 GLP-1 MMB와 함께 당뇨병이 될 미리 처친된 환자에서 자멸사를 저해할 수 있으며, β-세포 질량이 보존된다.

T1D에서 β-세포 자멸사는 질환의 두가지 다른 상에서 당뇨병 발달에 역할을 수행할 수 있다. 첫째, 섬 자멸사의 발달적 신호는 자기면역 당뇨병의 발병에 궁극적으로 강한 영향을 주는 T-세포 생물학에 영향을 미칠 수 있다. 둘째로, 섬 자멸사는 또한 마지막으로 β-세포의 큰 파괴를 유발할 세포 죽음의 형태이다. β-세포 자멸사를 저해하기 위한 GLP-1 MMB의 이용은 β-세포 질량을 보존하는 것에 의하여 명백한 당뇨병에 당뇨병의 자기면역 발병 또는 진전의 예방에서 유용하다.

T1D는 비가역적 인슐린-분비 베타 세포의 손실로부터 기인한다. 그러나 인슐린 분비는 긴-영구적 T1D를 갖는 몇몇 사람들에게 감지할 수 있으며, 작은 생존 베타 세포 또는 베타 세포 대상의 자기 면역 파괴를 수행하기 위한 연속적 재개를 지시한다. T1D가 복제 다음, 지속적으로 자멸사를 수행하는 β-세포를 갖는다는 것이 보여진다. 베타 세포 자멸사는 대조군 대상에서보다 T1D에서 빈도가 2배이다. 긴-영구적 T1D를 갖는 대부분의 사람들은 계속 파괴되는 베타 세포를 갖는다. 증가된 베타 세포 뒤에 있는 기작은 자기면역 진행 및 글루코오스 독성을 함유할 수 있다. 진행되는 자멸사가 암시됨에도 불구하고, 정의에 의하여, 베타 세포의 존재는 심지어 긴-영구적 T1D 후 일지라도, 새로운 베타 세포 형성이 발생해야하는 것을 수반한다. 본 발명자들은 T1D가 β-세포 파괴의 표적된 GLP-1 MMB 저해에 의하여 예방되거나 상반될 수 있다고 결론지었다.

다-기관 공여자에서, 이자에서 섬은 자멸사와 기관 공여 전 그들의 임상적 과정 중 계속되는 사체 기관 공여를 위한 뇌사를 이끄는 사건 동안의 세포괴사에 영향을 받기 쉽다. 덧붙여, 섬은 이식을 위한 인슐린-생산 세포의 준비에서 섬 분리 과정 중 자멸사에 영향을 받기 쉽다. 더욱이 섬이 당뇨병 수여자의 간에 이식될 때, 특이적으로 TNFα, ILlB, 및 γlNF의 사이토카인 활성화의 캐스케이드가 있다. 분리 과정 중 및 이식 중 그리고, 그 다음, 공여자 섬 이식에서 GLP-1 MMB의 이용은 자멸사를 줄이고, 섬 기능을 증가시킨다. 또한, 의료적 혜택에 필요한 섬의 수를 감소시키고, 섬 이식에서 살아있는 공여자의 이용을 위한 기회를 제공한다.

실시예 17: INS-1E 세포에서 GLP-1 MMB 는 글루코오스-의존적 인슐린 분비를 증가시킨다. RPMI 1640 + 10% FBS + 1% L-글루타민 + 1% 소듐 피루베이트 + 1% ㅂ비-필수 아미노산 + 50 μM β-머캅토에탄올 배지 내에서 INS-IE 세포를 200,000 세포/웰의 세포 농도로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 37℃ 및 5% CO₂ 에서 7일 동안 자라도록 허용하고, 3 또는 4일에 비육하였다. 세포를 0.4 ml의 KRBH 완충액/3 mM 글루코오스로 두번 세척하고, 이러한 완충액에서 30-60 분 동안 인큐베이션하도록 허용하였다. 배지를 세포로부터 제거하고, 적절한 양의 글루코오스를 갖는 KRBH에서 시험품 0.4mL을 각 웰당 첨가하였다. T=0 시간 점에서 상층액의 20 마이크로리터를 각 웰에서 제거하고, 다음 인슐린 측정을 위하여 37℃ 및 5% CO₂ 에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 초민감성 랫 인슐린 ELISA 키트 (Crystal Chem)와 함께 랫 표준 곡선(12.8-0.1ng/mL)를 이용하여 인슐린 농도를 결정하였다. 시간 점 상층액의 1.50 희석의 5마이크로리터를 분석에서 이용하여, 표준 곡선을 시작하는 수치를 수득하였다. ELISA 플레이트는 분자 장치 SpectraMax 340PC 플레이트 리더에서 OD₄₅₀ 빼기 OD₆₃₀을 읽는다. 도 17에 나타낸 바와 같이, GLP-1 MMB는 투여량-의존적 방식으로 그러나 오직 증가된 글루코오스의 존재 하에서 인슐린 분비를 증가시킨다.

실시예 18: 랫 및 인간 섬에서 GLP-1 MMB 는 글루코오스-의존적 인슐린 분비를 증가시킨다. 랫 섬을 콜라지나제 분해, 다음, Ficoll 구배 정제에 의하여 수득하였다. 인간 섬은 효소 분해와, Ricordi et al Diabetes (1998) 37, 4, 413-420에 세부적으로 개시된 농도 구배 정제를 이용하여 분리하였다. CMRL-1066 (Gibco), pen/strep (5,OOOunits/5,OOOμg), 10%FBS, 1% L-글루타민 25 mM HEPES, pH 7.2-7.4 배지, 20 x 100 mm 페트리 디쉬에서 섬을 오버나이트 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 18 내지 24 시간 동안 배양하였다. 다음 날, 섬을 디쉬의 중앙으로 소용돌이치게 하고, 50mL 코니컬 튜브에 수집하였다. 약 10-15분 동안 섬이 중력에 의하여 튜브의 바닥으로 정착하도록 허용하였다. 상층액을 제거하고, Functionality/Viability 배지 (MediaTech, cat#99-786-CV)를 첨가하고, 섬이 중력에 의하여 튜브의 바닥으로 정착하도록 허용하였다. 섬을 전체 세번 동안 세척하였다. 상층액을 제거하고, 섬을 1%BSA, 1% L-글루타민, 1% pen/strep 및 0.5 mM 글루코오스 용액을 함유하는 Functionality/Viability 배지에서 mL 당 20 섬의 밀도에서 재현탁시켰다. 세포 현탁액(-20 섬)의 1mL를 24웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂ 에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후에, 1% BSA, 1% L-글루타민, 1% pen/strep, GLP-I MMB (50 nM 최종 농도, 100 nM 개시 농도) 및 3.5 mM (n=12) 또는 15 mM (n=12)의 최종 농도에서 글루코오스를 함유하는 1mL의 Functionality/Viability 배지를 첨가하였다. 24㎕의 상층액을 시간=0(인슐린의 베이스라인) 및 처리의 첨가후 4시간으로써 수집하였다. 인슐린 ELISA를 수행할 때까지 상층액을 -20℃에 보관하였다. Crystal Chem (Downers Grove, IL) 초민감성 ELISA 분석 키트 (cat # 90060)를 이용하여 랫 인슐린을 정량화하였다. Linco Research (St Charles, ML cat#EZHI-14K)로부터의 인간 인슐린 ELISA 키트를 이용하여 인간 인슐린을 정량화하였다. 도 18은 GLP-1 MMB가 랫(도 18A) 및 인간 섬(도 18B)으로부터의 인슐린 분비를 유의적으로 증가시키는 것을 보여준다.

당뇨병, 제 1형 및 제 2형 둘다는 궁극적으로, 개개의 β-세포로부터 분비되는 인슐린의 충분하지 않은 양에 기인한다. 당뇨병을 갖는 개개의 인슐린 분비를 증가시키기 위한 능력은 그들을 GLP-1 MMB로 처리함으로써 개선시키거나, 그들의 당뇨병 증상을 제거할 것이다. 중요하게, 인슐린 분비의 증가는 글루코오스 의존적이며, 증가된 글루코오스 레벨의 존재 하에서만 증가한다. 이에 따라, 위험한 고혈당증 에피소드 환자의 위험은 GLP-1 MMB의 이용으로 최소화한다.

마찬가지로, 인슐린 분비에서의 증가는 또한, 섬 이식 과정에 혜택을 준다. 이식된 섬의 인슐린 분비 능력의 증가에 의하여, 치료적 혜택을 제공하기 위하여 필요한 섬의 수가 효율적으로 감소할 수 있다. 섬 이식을 지지하는 데 유용한 사체 이자의 제한된 양으로, GLP-1 MMB의 이용은 섬 이식 과정으로부터 혜택 받을 수 있는 환자의 수를 유의적으로 증가시킬 것이다. 더욱이, 인슐린 분비를 증가시키기 위한 능력은 GLP-1 MMB와의 중재 없이, 분충분한 인슐린 분비 능력에 기인하여 공여자에서 당뇨병의 발병을 이끄는 그들의 인슐린 분비 능력이 고갈될 위험 없이, 공여자 집단에서 살아있는 공여자로 확대할 수 있다.

실시예 19. 정상 마우스의 혈당에서 GLP-1 MMB 의 효과. 정상 C57BLK/6 마우스는 13 동물을 갖는 각 그룹인 두 그룹으로 랜덤하게 하였다. 그룹 1은 PBS 운반자 또는 GLP-1 MMB(0.5mg/kg)를 매일 복막내 투여시켰다. 두 그룹은 10일동안 치료하였다. 체중을 위하여 마우스를 매일 모니터하고, 혈당을 연구가 종결된 점인 32일 동안 모니터(LifeScan, CA)하였다.

GLP-1 MMB를 받은 마우스는 PBS 처리된 마우스와 비교한 바, 10-일 치료의 경로 동안 낮은 혈당을 보였다.(도 19) PBS 그룹의 레벨로 되돌아간 혈당 처리는 종결하였다. 두 그룹은 연구 과정을 통하여 동일한 체중 증가를 보였다.(데이터는 나타내지 않음)

고혈당증은 제 1형 및 제 2형 당뇨병 둘 다에서 나타나며, 파괴적인 질환의 2차 합병증 진전에 책임이 있다. 수여자(상기 비-처리 대조와 동일한 진행 무게 증가에 의하여 묘사된 바와 같이)의 전체 건강에 반대적으로 영향을 미침 없이 혈당을 감소시키기 위한 GLP-1 MMB의 능력은 제 1형 및 제 2형 환자에게 혜택이 있을 것이다.

실시예 20: GLP-1 MMB 는 당뇨병 마우스 β-세포의 몰락을 보호한다. 마우스(12주령 db/db)를 오버나이트 금식시켰다. 연구의 1일째, 마우스(4그룹, n=5/그룹)를 GLP-I MMB (1.5 mg/kg) 또는 음성 대조 모방체로 피하내 투여하였다. 연구 4일째, 굶긴 혈당을 측정하고, OGTT(경구 글루코오스 독성 시험)를 수행하였다. 혈당 레벨을 꼬리 상처 혈액을 이용하여 15, 30, 60, 90, 120, 150 및 180 분에 측정하였다. 마우스를 안락사시키고, 이자를 제거하고 10% 중성 완충된 포르말린에서 담금에 의하여 고정하였다. 각 마우스로부터의 이자를 파라핀에 임베딩하고, 섹션하여, H&E 및 면역히스토케미스트리에 의하여 염색하였다. 인슐린 염색의 형태 계측 분석은 대조군과 비교하여 GLP-1 MMB 처리된 마우스에서 인슐린 염색의 유의적으로 더 높은 민감성을 보였다. 투여 14일 후, 안락사된 마우스로 실험을 반복하여, GLP-1 MMB의 단일 투여량의 지속성을 평가하였다. 다시, 인슐린 염색의 형태 계측 분석은 단일 투여 후 2주된 GLP-1 MMB 처리된 마우스에서 더 높은 인슐린 염색의 민감성을 보였다. 인슐린 염색의 민감성은 직접적으로 섬내에 저장된 인슐린의 양과 연관되며, GLP-1 MMB 처리가 당뇨병 동물 모델의 섬에서 인슐린 분비 및 저장을 증가시킨다는 것을 제안한다.

제 2형 당뇨병에서 불충분한 인슐린 합성 및 저장은 질환의 2차적 합병증의 발병과 진전에 책임이 있는 고혈당증을 이끈다. 인슐린 합성 및 저장을 증가시키기 위한 GLP-1 MMB의 능력은 제 2형 환자에서 고혈당증을 감소시키고, 2차 합병증의 발병 및 진전을 제한할것이다.

실시예 21: 당뇨병 면역손상된 마우스에서 인간 섬의 한계 질량 이식의 효능에서 GLP- MMB 의 영향. 무흉선 nu/nu (nude)마우스를 Harlan Laboratories로부터 구매하였다. 동물들을 마이크로-분리된 케이지 내의 바이러스 항체 없는 방에서 가두고 멸균된 음식물 및 물에 자유롭게 접근되게 하였다. 모든 실험을 실험 동물의 관리 및 이용 지침에 설명된 표준에 따라 수행하였다.

시트레이트 완충액에서 새로이 용해된 스트렙토조토신(200mg/kg)의 정맥내 투여에 의하여 당뇨병을 유도하였다. 당뇨병의 유도는 유도후 비-공복 혈당의 수치를 모니터함으로써 수행하고, >350mg/dL 수치를 갖는 동물만을 수여자로써 이용하였다. 즉시 수여자에게 정상 혈당을 허용하기에 충분하지 않은 질량을 의미하는 한계 섬 질량(

50 IEQ/g 체중)의 이식 후, 이식 후- 첫주에, 그 다음 3배 주까지 이식 기능을 위하여 비-공복 혈당 수치를 매일 측정함으로써 동물을 모니터하였다.

섬 접종, 생종 능력 및 기능을 향상시키기 위한 중재는 한계 섬 질량으로 이식된 동물에서 정상 혈당을 성취하는 시간을 감소시킬 것이다. 한계섬 질량의 수여자의 두개의 그룹이 함유되며, 한 그룹은 매일 GLP-I MMB (0.5 mg/kg)를 IP 주입 시켰고, 대조 그룹은 운반자를 IP 주입 시켰다. 적어도 2 연속된 리딩에서 비-공복 혈당 수치가 <200mg/dL일 때, 동물은 혈당 정상이라고 고려된다. 덧붙여, 접종 기능은 처리된 및 대조군의 이식 >30일 후 동물에서, 오버나이트 금식 후 글루코오스 내성 시험(1.5g/kg)의 수단에 의하여 평가하여, 글루코오스 접종 후 글루코오스 제거를 연구한다. 정상 혈당을 받은 동물은 접종 제거를 수행하여 본래 이자 섬의 남아있는 기능을 배제하였다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 섬의 한계 질량의 이식 후, GLP-1 MMB 처리된 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 정상 혈당을 더욱 빨리 획득한다. 덧붙여, GLP-1 MMB 처리된 마우스는 더욱 효율적인 글루코오스 접종의 제거를 나타낸다. 이러한 데이터는 GLP-1 MMB 처리가 이식된 인간 섬의 접종, 생존 및 기능을 개선시키고, 공여자(살아있는 및 뇌사 둘다 포함) 및 수여자 둘다에서 GLP-1 MMB의 이용이 섬 이식 과정을 수행하는 것을 지지한다고 강하게 제안한다. 이러한 결과는 당뇨병 수여자에 이식된 인간 섬에서 GLP-1 MMB의 혜택적 영향을 나타낸다. 더욱이, 데이터는 GLP-1 MMB로의 처리가 섬 접종, 생존 및 기능을 개선시키고, 섬 이식 세팅에서 귀중한 부가적 치료법일 것이다.

실시예 22: 비인간 영장류 섬에서 글루코오스에 반응한 인슐린 분비에서 GLP-1 MMB 의 효과. 비인간 영장류 섬은 효소 분해 및 농도 구배 정제를 이용하여 분리하고, 두개의 그룹으로 나누어 175㎠플라스크의

20,000 IE의 농도에서 처리된 비-조직 배양에서 습윤한 혼합된 95% 공기/5% CO₂의 37℃에서 배양하였다. 섬의 한 그룹은 단독으로 배양하고 다른 그룹은 50 nM GLP-I MMB로 보충된 MM1으로 배양하였다.

배양의 2일 후, 섬을 수집하고, 섬의 샘플(대조군으로부터의 2, GLP-1 MMB 그룹으로부터의 1)을 동적 자극 분석에 주제화하여, 섬의 인슐린 분비에서 글루코오스 농도의 영향을 평가하였다. 37℃에서 20분 동안 섬을 125-mM NaCl, 5.9-mM KCl, 1.28-mM CaCl₂, 1.2mM MgCl₂, 25-mM HEPES, 0.1% 소혈청알부민 및 3-mM 글루코오스를 함유한 완충액과 함께 크로마토그래피 컬럼Bio-gel Fine 45-90 nm, Bio-Rad)에 미리 주입하였다. 동일한 완충액에 10분 동안 섬을 주입하고, 그 다음 순차적으로 11-mM 및 3-mM 글루코오스 구획에 노출시켰다. 관류액의 구획을 3-mM 글루코오스로 관류하는 동안 매 2분에, 자극 동안에는 매 분 수집하였다. 각 구획에서 인슐린의 농도는 ELISA를 이용하여 분석하였다.

GLP-1 MMB의 존재 하에서 인큐베이션되는 섬은 비-처리된 대조군과 비교하여 반대로써, 글루코오스 자극된 인슐린 분비의 유의적 증가를 나타낸다(도 21). 이러한 데이터는 시험관 내에서 인슐린 합성 및 분비에 GLP-MMB가 긍정적 영향을 가지며, 더욱이 섬 이식 전 그것의 용도를 지지한다는 것을 강하게 제안한다. GLP-1 MMB로의 이식 전 섬의 증가된 효능은 섬 이식 과정을 수행하는 제 1형 당뇨병을 갖는 개체내에서 동일한 치료적 효과를 성취하는 데 필요한 감소된 섬 수가 된다. 더욱이, 이러한 결과로부터 GLP-1 MMB로 개체의 치료가 생체내에서 섬 효능을 증가시킬 것이라는 것을 예측할 수 있다. 이는 그들의 한계 질량 섬으로부터 기능을 증가시키기 위한 섬 이식의 두 공여자(살아있는 및 뇌사 포함) 및 수여자의 치료를 지지한다.

실시예 23: 시노몰거스 원숭이 한계 질량 모델에서 동종이형의 섬 접종 및 장-기간 생존에서 GLP-1 MMB 의 영향. 비-인간 영장류 한계 질량 모델의 이용은 감소된 수의 섬으로 당뇨병의 반전을 위하여 허용하기 위한 가능성을 갖는 이식 접근을 연구하기 위한 것을 가능하게 한다. 한계 질량 모델에서, 정상 혈당을 취득하는 데 필요한 약 5,000 IEQ/kg, 또는 반수(보통 10,000 IEQ/kg)가 이식된다. 동일한 동종이형 공여자로부터수득한 섬을 이용하여, 공여자와 분리 변수를 제거한다. 유사한 미리-이식된 인슐린 요구를 갖는 원숭이 쌍을 이식함으로써, 섬 기능을 증가시키고 초기 섬 손실을 제한하도록 디자인된 약제로 처리된 원숭이에서 약제를 투여하지 않은 원숭이에 비하여, 증강된 섬 접종을 관찰하는 것이 가능하다.

수여자는 Mauritian 기원의 2-3년된 시노몰거스 원숭이이며, 같은 주의 공여자는 >4년이다. 당뇨병은 1250 mg/㎡ 스트렙토조토신으로 유도하였다. 혈당 레벨을 150-300 mg/dl로 유지시키기 위한 시도로, 아침 식사 전에 당뇨병 동물을 NPH 인슐린으로, 점심 식사 전에 NPH/Lantus로 처리하였다. 당뇨병 유도 4주 후, 원숭이에 글루카곤 접종을 수행하여, 자극된 c-펩티드가 생산되지 않은 것을 입증하였다.

공여자 기관을 수집하고, 실시예 A 및 실시예 B에 참조된 반-자동화된 방법을 통하여 섬을 분리하고, 처음 37℃와 그 다음 22℃에서 2 오버나이트 배양 기관을 수행하였다. 대조군 원숭이를 위한 섬은 표준 MM1 배지에서 배양하고, 실험 원숭이를 위한 섬은 50 nM GLP-1 MMB로 보충된 MM1에서 배양하였다. 원숭이를 미니-개복술을 수행하고, 간으로의 문맥을 통하여 섬이식을 수행하였다. 원숭이 쌍은 같은 공여자(상기에 개시된 대로 배양된)로부터

5,000 IEQ/kg 를 받고, 한 원숭이는 주 당 2회 피하에 GLP-I MMB (0.2 mg/kg)를 주입하고, 대조군 원숭이는 그러지 않았다. 대조군 및 GLP-1 MMB 처리된 원숭이 둘다를 위하여, 임상적으로 채용되는 바와 같이, 스테로이드 없는 면역 억제(SFIS로써 간략화, 낮은 투여량 FK506의 지속, 높은 투여량 라파마이신, 항-DL2R 유도 치료법)로 거부 반응을 예방하였다. 동물을 하루에 두번 모니터하여 공복 및 식사-후 혈당 레벨(heel stick, glucometer)을 결정하고, 이식 후 100-200 mg/dl의 범위로 혈당을 유지하기 위하여 필요한 대로 인슐린을 처리하였다. 공복의 c-펩티드를 매 다른 주에 결정하고, 정맥의 글루코오스 내성 시험(IVGTT)를매 8주에 수행하여 접종 기능을 평가하였다.

GLP-1 MMB 처리된 동물은 외인성 인슐린 요구에서 유의적 감소를 갖는 뛰어난 글루코오스 조절을 갖는다.(도 22A) 개선된 글루코오스 조절은 비-처리된 대조군(도 22B)와 비교하여 GLP-1 MMB 처리된 동물에서 HgbAlc에서 빠른 감소에 의하여 더욱 설명된다. 이러한 연구는 섬 이식 과정을 겪는 제 1형 당뇨병에서 GLP-1 MMB의 용도를 지지한다.

장점: 이러한 신규한 분자의 제 2형 당뇨병을 치료하기 위한 치료적으로서의 이용은 다른 GLP-1 유사체에 걸쳐 몇몇 장점을 제공한다. 예를 들어, GLP-1 펩티드의 반-감기를 연장시킬 것이다. 또한, 모방체 구조에서 야생형 GLP-1 펩티드는 단백질 분해 효소 분해, 특히 DPP-Ⅳ에 저항성이 있다. 이는 돌연변이 펩티드보다 야생형 GLP-1 펩티드의 치료를 위하여 허용할 수 있다. GLP-1은 본래 펩티드이므로, 돌연변이된 GLP-1 유사체로 처리된 환자에서보다 GLP-1 모방체로 처리된 환자에서 덜 면역 반응이 있을 수 있다. 덧붙여, GLP-1 모방체의 큰 크기는 그것이 혈액뇌장벽을 가로지르는 것으로부터 방해할 수 있다. 구역 및 걱정이 뇌에서 GLP-1R을 채우는 GLP-1과 연관되기 때문에, 장점을 제공할 수 있다. 더욱이, 모방체 플랫폼은 각 모방체 분자에서 두 펩티드의 발현이 된다. 이는 세포 표면 GLP-1 수용체에 친화도록 높일 수 있는 다이머 리간드를 형성하여, GLP- 펩티드가 서로 상호작용하도록 허용할 수 있다. 상기에서 제공된 실시예는 섬의 증식에서 MMB의 다중 컨스트럭트가 갖는 긍정적 영향, 증가된 글루코오스 레벨에 반응하여 섬에 의하여 분비되는 인슐린의 양 및 GLP-1 MMB로 처리된 당뇨병 동물의 증가된 혈당을 나타낸다. 또한, GLP-1 MMB가 본래의 GLP-1 펩티드 또는 그것의 더 긴 영구적 유사체와 비교했을 때, 뛰어난 약동학적 특성을 갖는 것으로 보인다. 덧붙여, 설치류 대 영장류에서 개선된 약동학은 당뇨병의 설치류 모델에서 보이는 GLP-1 MMB 처리의 혜택이 환자에서 이용될 때, GLP-1 MMB가 가질 임상적 혜택을 실제로 과소평가할 수 있다는 것을 보여준다.

당뇨병이 있는 모든 환자들에 의해 경험된 고혈당증 및 다른 대사 장애는 인슐린의 상대적 결함에 직접적으로 연관된다. 인슐린 생산 세포의 수 및 그들의 인슐린 분비 가능성을 증가시킴으로써 생산되는 인슐린의 양은 유의적으로 증가된다. 이에 따라, GLP-1 MMB 치료법은 인슐린 생산에서 증가가 질환의 임상적 증상 또는 예후를 개선시키는 임의의 위치에서 유용하다. GLP-1 MMB의 개선된 약동학적 특성은 치료를 더욱 임상적으로 적합하고 편리하게 만들 것이며, 이에 따라, 존재하는 GLP-1 유사 치료법을 넘어 유의적 개선이 있다. GLP-1 MMB 치료법은 그것이 당뇨병 에 기인하는 것이든 또는 다른 대사 장애에 기인하는 것이든, 고혈당증을 경험하는 모든 환자에 혜택이 있다. 그것은 또한 전-당뇨병 단계의 질환에 걸리기 쉽게 결정된 그러한 환자에서 섬의 질량을 증가시키고 당뇨병의 임상적 발병을 지연시키는 데 유용하다. 마찬가지로, 그것은 이식 세팅에서 전체 기관 및 섬 둘다, 공여자 및 수여자 둘다에 혜택이 있다. 그것은 또한, 그들의 이식 전 인슐린 생산 세포의 증식을 증가시키고, 인슐린 제조 전구 세포의 분화를 자극하기 위한 실험관 내 세팅에서 유용하다. 상기 개시된 실시예는 본 발명의 GLP-1 MMB가 고혈당증이 되는 당뇨병 및 다른 대사 장애의 치료에서 많은 용도를 갖는다는 것을 증명한다. 본 분야의 숙련자에게 본 발명의 GLP-1 MMB는 실시예에서 설명한 것을 넘어서 지시를 위하여, 그것을 이상적 항당뇨병 약제로 만드는 특성을 갖는다는 것이 자명할 것으로써, 실시예는 GLP-1 MMB의 잠재적 치료 용도에서 제한을 둘 의도가 아니다.

본 발명이 앞선 설명 및 실시예에서 특이 기재된 바와 달리 실행될 수 있음은 자명할 것이다. 많은 변형 및 본 발명의 다양함이 상기 지시의 관점 내에서 가능하며, 이에 따라 본 발명의 관점 내에 있는 것이다.

Claims (28)

1. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-1 당뇨병 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 핵산은 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
2. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-1 당뇨병 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 핵산은 서열 번호 7-14로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
3. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-1 당뇨병 관련 증상을 진 단하거나 치료하는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 핵산은 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.

   화학식 (I)

   ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

   여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

   L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

   V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

   H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

   CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

   CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

   n은 1 내지 10의 정수이며,

   o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.

   여기서, L은 다.
4. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-1 당뇨병 관련 증상을 진 단하거나 치료하는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체는 서열 번호 2 또는 4의 모든 인접 아미노산을 포함하는 것인 방법.
5. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하는 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-1 당뇨병 관련 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 또는 작용제가 서열 번호 7-14 중 적어도 하나의 모든 인접 아미노산을 포함하는 것인 방법.
6. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

   화학식 (I)

   ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

   여기서, P는 서열 번호 1 및 6으로부터 선택된 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드이며,

   L은

   

   으로부터 선택되며,

   V는

   

   로부터 선택되며,

   H는

   

   (서열 번호 26)이고,

   CH2는

   

   (서열 번호 43)이며,

   CH3는

   

   (서열 번호 44)이고,

   n은 1 내지 10의 정수이며,

   o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
7. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

   화학식 (I)

   ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

   여기서, P는 서열 번호 6의 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드이며,

   L은

   

   으로부터 선택되며,

   V는

   

   로부터 선택되며,

   H는

   

   (서열 번호 27)이고,

   CH2는

   

   (서열 번호 45)이며,

   CH3는

   

   (서열 번호 46)이고,

   n은 1 내지 10의 정수이며,

   o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
8. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

   화학식 (I)

   ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

   여기서, P는 서열 번호 6의 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드이며,

   L은

   

   으로부터 선택되며,

   V는

   

   로부터 선택되며,

   H는

   

   (서열 번호 28)이고,

   CH2는

   

   (서열 번호 45)이며,

   CH3는

   

   (서열 번호 46)이고,

   n은 1 내지 10의 정수이며,

   o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
9. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

   화학식 (I)

   ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

   여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

   L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

   V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

   H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

   CH2는

   

   (서열 번호 43)이며,

   CH3는

   

   (서열 번호 44)이고,

   n은 1 내지 10의 정수이며,

   o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
10. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

    화학식 (I)

    ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

    L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

    V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

    H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

    CH2는

    

    (서열 번호 45)이며,

    CH3는

    

    (서열 번호 46)이고,

    면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
11. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

    화학식 (I)

    ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

    L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

    V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

    H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

    CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

    CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
12. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

    화학식 (I)

    ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

    L은 GS, GGS, GGGS (서열 번호 16), GSGGGS (서열 번호 17), GGSGGGS (서열 번호 18), GGSGGGSGG (서열 번호 19) 및 GGGSGGGSGG (서열 번호 20)으로부터 선택되고,

    V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

    H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

    CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

    CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
13. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

    화학식 (I)

    ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

    L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유 연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

    V는 GTLVTVSS (서열 번호 21), GTLVAVSS (서열 번호 22), GTAVTVSS (서열 번호 23), TVSS (서열 번호 24), 및 AVSS (서열 번호 25)이며,

    H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

    CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

    CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
14. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

    화학식 (I) ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

    L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

    V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

    H는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP (서열 번호 26), ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP (서열 번호 27), 및 ESKYGPPCPPCPAPEAAGGP (서열 번호 28)로부터 선택되고,

    CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

    CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
15. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나, 이에 투여하는 것을 포함하며, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서, GLP-1 당뇨병 관련된 증상을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체가 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.

    화학식 (I)

    ((Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도체이며,

    L은 모방체가 선택적인 배향 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

    V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

    H는 EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP (서열 번호 29), EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP (서 열 번호 30), EPKSADKTHTCPPCPAPEALGGP (서열 번호 31), EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP (서열 번호 32), EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP (서열 번호 33), EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP (서열 번호 34), EPKSADKAHTCPPCPAPELLGGP (서열 번호 35), 및 EPKSADKTHTCPPCPAPELLGGP (서열 번호 36), ADKTHTCPPCPAPELLGGP (서열 번호 37), THTCPPCPAPELLGGP (서열 번호 38), ESKYGPPCPSCPAPEAAGGP (서열 번호 39), ESKYGPPCPPCPAPELLGGP (서열 번호 40), CPPCPAPELLGGP (서열 번호 41), 및 CPPCPAPEAAGGP (서열 번호 42)로부터 선택되고,

    CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

    CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
16. 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 작용제 또는 모방체 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 조성물을 세포, 조직, 기관 또는 동물과 접촉시키거나 이에 투여하는 것을 포함하며, 상기 적어도 하나의 GLP-1 CH1 결실된 모방체는 화학식 (I)에 따른 P 또는 폴리펩티드를 포함하여, 세포, 조직, 기관 또는 동물에서 GLP-2 당뇨병 관련 질환을 진단하거나 치료하는 방법.

    화학식 (I)

    (Pep(n)-L(o)-V(p)-H(q)-CH2(r)-CH3(s))(t),

    여기서, P는 적어도 하나의 생활성이 있는 GLP-1 펩티드, 변형체 또는 유도 체이며,

    L은 모방체가 대신하는 기원 및 결합 특성을 갖도록 허용함으로써, 구조적 유연성을 제공하는 폴리펩티드일 수 있는 적어도 하나의 링커 서열이고,

    V는 면역 글로불린 가변 영역의 C-말단 중 적어도 한 부분이며,

    H는 면역 글로불린 가변 힌지 영역의 적어도 한 부분이고,

    CH2는 면역 글로불린 CH2 불변 영역의 적어도 한 부분이며,

    CH3는 면역 글로불린 CH3 불변 영역의 적어도 한 부분이고,

    n은 1 내지 10의 정수이며,

    o, p, q, r, s 및 t는 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
17. 폴리펩티드가 화학식 I에 따른 적어도 하나의 P 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 갖는 제 1항에 따른 GLP-1 CH1 결실된 모방체 핵산 또는 GLP-1 CH1 결실된 모방체 폴리펩티드.
18. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 당뇨병 약물, 인슐린 대사 관련 약물, 탐지할 수 있는 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항-감염성 약물, 심혈관(CV)계 약물, 중추신경계(CNS) 약물, 자율신경계(ANS) 약물, 기도 약물, 위장(GI)관 약물, 호르몬 약물, 체액 또는 전해질 균형을 위한 약물, 혈액 약물, 항신생물제, 면역조절 약물, 눈, 귀 또는 코 약물, 국소 약물, 영양제, 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택된 치료적 유효량의 적어도 하나의 화합물, 조성물 또는 폴리펩티드 를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
19. 제 1항에 있어서, 유효량은 세포, 조직, 기관 또는 동물의 킬로그램 또는 상당하는 농도 당 0.001-50㎎의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 또는 작용제, 0.000001-500㎎의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 또는 작용제, 또는 0.0001-100㎍의 GLP-1 CH1 결실된 모방체 또는 작용제 핵산인 방법.
20. 제 1항에 있어서, 접촉 또는 투여는 비경구, 피하내, 근육내, 정맥내, 관절강내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 뇌내, 공내, 뇌강내, 대장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 결장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 결장, 협측, 설하, 비내, 또는 경피로부터 선택된 적어도 하나의 형태에 의한 것인 방법.
21. 제 1항에 있어서, GLP-1 관련 증상은 대사 장애인 방법.
22. 제 21항에 있어서, 대사 장애가 고혈당증인 방법.
23. 제 21항에 있어서, 대사 장애는 당뇨병인 방법.
24. 제 21항에 있어서, 유효량이 이를 필요로 하는 동물에서 혈당 레벨을 낮춤으로써 대사 장애를 치료하는 방법.
25. 제 21항에 있어서, 유효량이 인슐린 생산 세포로부터 인슐린 분비를 증가시킴으로써 대사 장애를 치료하는 방법.
26. 제 21항에 있어서, 유효량이 인슐린 생산 세포의 자멸사를 예방함으로써 대사 장애를 치료하는 방법.
27. 제 21항에 있어서, 유효량이 인슐린 생산 세포의 증식을 증가시키는 대사 장애를 치료하는 방법.
28. 제 1항에 있어서, GLP-1 관련 증상은 당뇨병에 관련된 것인 방법.

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