TW201514207A - 生理活性多肽複合物高產率製備之改良製程 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於藉由共價鍵連結生理活性多肽、非肽基聚合物連接子及免疫球蛋白恆定區而製備接合物之方法。更特別地，本發明係關於有效地製備生理活性多肽接合物之方法，其中於偶合反應中使用鹽以改良製備生理活性多肽接合物期間之低生產量問題。可經由本發明之製備方法以高純度及高產量製造生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恆定區之複合物。由於製備生理活性多肽接合物所使用之方法，可減低製造成本。因此該方法具有產業利用性及藥物規管順從性，可使用於發展生理活性多肽之長效調配物。

Description

生理活性多肽複合物高產率製備之改良製程
本發明係關於藉由共價鍵連結生理活性多肽、非肽基聚合物連接子及免疫球蛋白恆定區而製備複合物之方法。更特別地，本發明係關於有效地製備生理活性多肽複合物之方法，其中於偶合反應中使用鹽以改良製備生理活性多肽複合物期間之低生產量問題。
通常，生理活性多肽由於彼等之低安定性很容易變性並在血液中經蛋白質水解酵素分解而很快地經由腎臟或肝臟排除。因此，為了維持包含生理活性多肽作為藥理活性成分之蛋白質藥物的血中濃度及效力，需要頻繁地給予患者蛋白質為主的藥物。然而，在主要以注射調配物之形式給予患者蛋白質藥物之情況，頻繁的注射以維持生理活性多肽之血中濃度可能造成患者過多痛苦及高治療費用。為了解決此種問題，一直持續努力於經由增加蛋白質藥物之血液中安定性及維持較長時間之血中藥物濃度而達到最大的藥理功效。此類蛋白質藥物之長效調配物必須增加蛋白質藥物之安定性且同時維持藥物本身效力於足夠高之濃度，以及不造成患者之免疫反應。
先前技術中，為了安定蛋白質及抑制與蛋白質水解酵素之接觸並經腎臟而流失，而使用化學性添加具有高溶解度之聚合物諸如聚乙二醇(下文中，稱為“PEG”)至蛋白質藥物表面之方法。已知PEGs經由非專一性地與目標蛋白質之特定部位或不同部位結合而增加蛋白質之溶解度而有效於安定蛋白質及及防止蛋白質水解，且不會造成任何不良副作用(Sada et al.,J.Fermentation Bioengineering 71：137-139,1991)。
然而，使用PEG之方法中，儘管增加PEG之分子量使PEG有加強肽藥物循環時間之能力，肽藥物之效力還是顯著降低且PEG分子量增加之同時PEG與肽之反應性降低，因而降低產量。
再者，製備免疫球蛋白片段與生理活性多肽之融合蛋白質之方法可克服低聚乙二醇化產量及非專一性之問題，但是與預期相反的，有血液半衰期之增加未顯著提高之問題，且一些實例中，面臨低效價問題。為了使血液半衰期增加達到最大效用，亦可使用不同種類之肽連接子，但可具有導致免疫反應之可能性。此外，有下列問題，於使用具有雙硫鍵之肽(諸如BNP)之情況，由於高錯誤折疊機率而難以應用，而於非天然胺基酸殘基存在之情況，產物不可能為基因重組體之形式。
胰島素為從人類胰臟β-細胞分泌之肽，此肽係作為調控體內血中葡萄糖濃度之重要角色的物質。未適當地分泌胰島素或分泌胰島素但未於體內適當地作用之情況，體內血中葡萄糖無法受調控而增加，因而導致稱為糖尿病之狀況。上述之情況稱為第2型糖尿病，而胰臟未分泌胰島素而增加血中葡萄糖之情況 稱為第1型糖尿病。第2型糖尿病是用包含化學物質作為主要成分之口服降血糖劑治療，亦用胰島素治療某些患者。另一方面，第1型糖尿病之治療則必定需要給藥胰島素。
現在廣泛地使用之胰島素療法係在餐前及餐後經由注射給藥胰島素之方法。然而，此種胰島素療法需要每天3次不斷地給藥，因此造成患者較多痛苦及不便。為了克服此種問題，已做了各種嘗試。其中之一是嘗試通過口腔或鼻腔用吸入的方法經由增加肽藥物之生物膜滲透性而將肽藥物送入體內。然而，與注射比較，此種方法在體內具有顯著較低遞送效率，因此在需要之情況維持生體中之肽藥物活性尚有許多困難。
再者，亦嘗試過皮下給藥過量藥物後延遲吸收之方法。據此，曾報告透過每日只有單次給藥而維持血中藥物濃度之方法。有些已核准為藥用產品(如，Lantus，Sanofi-aventis)且目前已提供給患者。研究已進步到用脂肪酸修飾胰島素而強化胰島素聚合物之結合及透過與存在於給藥部位及血中之白蛋白之結合而延長期間，使用此種方法生產之藥物已核准為藥用產品(Levemir，NovoNordisk)。然而，此種方法造成給藥部位疼痛之副作用，此外，每日單次注射之給藥間隔仍然給患者顯著負擔。
為了解決這些問題，本發明者製備使用非肽基聚合物作為連接子之包括生理活性多肽及免疫球蛋白恆定區之複合物，而作為同時使血液半衰期之增加及包含胰島素之生理活性多肽之體內活性之維持最大化的策略。然而，因為構成該接合物之原料很昂貴，所以仍需要以高產量及高純度製備複合物的方法。在此背景下，本發明者等發現在製備複合物期間將適當類型及濃 度之鹽添加至偶合反應步驟中之反應溶液時，可以高產量及高純度製備生理活性多肽複合物且可減低製造成本，因而完成本發明。
本發明之目的為提供藉由共價鍵連結生理活性多肽、非肽基聚合物連接子及免疫球蛋白恆定區而於製備複合物期間能改良低生產量的有效方法。
為達到上述目的之一方面，本發明提供製備生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恆定區之複合物的方法，包括步驟：(1)使非肽基聚合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之一者反應；及(2)在鹽存在下使步驟(1)之反應混合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之另一者反應。
較佳地，非肽基聚合物可各獨立於其兩端具有選自由醛衍生物、馬來醯亞胺衍生物及琥珀醯亞胺衍生物所組成群組之官能基。
更佳地，非肽基聚合物可經由其兩端之官能基形成共價鍵而連接至生理活性多肽及免疫球蛋白恆定區。
較佳地，該方法可進一步包括於步驟(1)後從反應混合物中分離出生理活性多肽-非肽基聚合物接合物或免疫球蛋白恆定區-非肽基聚合物接合物。
較佳地，鹽可選自由下列者所組成群組：氯化鈉、乙酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、碳酸鈉、氰化鈉、檸檬酸鈉、硝酸鈉、氯化鉀、乙酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碳酸鉀、氰化鉀、檸檬酸鉀、硝酸鉀、氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、碳酸鎂、氰化鎂、檸檬酸鎂、硝酸鎂、氯化銨、乙酸銨、硫酸銨、磷酸銨、碳酸銨、 氰化銨、檸檬酸銨、硝酸銨、氯化鈣、乙酸鈣、硫酸鈣、磷酸鈣、碳酸鈣、氰化鈣、檸檬酸鈣及硝酸鈣。
更佳地，鹽可選自由氯化鈉、乙酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉及氯化鉀所組成群組。
較佳地，可以0.1至3.0M之最終濃度添加鹽。
更佳地，可以0.3至2.5M之最終濃度添加鹽。
較佳地，如果鹽為氯化鈉，可以少於3.0M之最終濃度添加鹽，如果鹽為乙酸鈉，可以少於2.5M之最終濃度添加鹽，如果鹽為硫酸鈉，可以少於0.7M之最終濃度添加鹽，如果鹽為磷酸鈉，可以少於0.8M之最終濃度添加鹽，或如果鹽為氯化鉀，可以1.0M或較少之最終濃度添加鹽。
較佳地，步驟(2)之反應時間可為4至18小時。
較佳地，步驟(2)之反應溫度可為0至25℃。
較佳地，如果非肽基聚合物具有一種或多種醛衍生物作為官能基，該反應混合物進一步包括最終濃度為1至100mM之還原劑。
較佳地，可在pH5.0至6.5進行步驟(1)，及可在pH6.0至8.5進行步驟(2)。
較佳地，於步驟(1)中，非肽基聚合物可與生理活性多肽反應，於步驟(2)中，步驟(1)之反應混合物可與免疫球蛋白恆定區反應。
較佳地，於步驟(1)中，生理活性多肽與非肽基聚合物可以1：1至1：20之莫耳比彼此反應，於步驟(2)中，步驟(1)之產物與免疫球蛋白恆定區可以1：0.5至1：10之莫耳比彼此反 應。
更佳地，可在下列者之存在下進行步驟(2)：以最終濃度少於3.0M添加之氯化鈉、以最終濃度少於2.5M添加之乙酸鈉、以最終濃度少於0.7M添加之硫酸鈉、以最終濃度少於0.8M添加之磷酸鈉或以最終濃度為1.0M或更少添加之氯化鉀。
較佳地，非肽基聚合物之官能基可與胺基連接，而此胺基存在於生理活性多肽及免疫球蛋白恆定區之N終端或Lys殘基之側鏈。
較佳地，非肽基聚合物可選自由下列者所組成群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸，及其組合。
更佳地，非肽基聚合物可為聚乙二醇。
較佳地，非肽基聚合物可具有範圍為1至100kDa的分子量。
較佳地，免疫球蛋白恆定區可為非糖基化。
較佳地，免疫球蛋白恆定區可由選自由CH1、CH2、CH3及CH4功能區所組成群組之1至4個功能區組成。
較佳地，免疫球蛋白恆定區可進一步包含鉸鏈區。
較佳地，免疫球蛋白恆定區可選自由IgG、IgA、IgD、IgE、IgM衍生之恆定區，其組合，及其雜合物所組成群組。
較佳地，免疫球蛋白恆定區可選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之恆定區，其組合，及其雜合物所組成群組。
更佳地，免疫球蛋白恆定區可為IgG4 Fc區域。
再更佳地，免疫球蛋白恆定區可為非糖基化人IgG4 Fc區域。
較佳地，生理活性多肽可選自由下列者所組成群組：人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、類昇糖素胜肽(GLP-1等)、調酸素、G蛋白偶聯受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉化生長因子、α 1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、脂蛋白-E、紅血球生成素、糖基化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XIII、胞漿素元活化物、血纖維蛋白結合肽、脲激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、血管收縮素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降血鈣素、胰島素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素、結締組織活化因子、組織因子路徑抑制物、濾泡刺激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒素、乳鐵素、肌骨素、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株 抗體、多株抗體及抗體片段。
更佳地，生理活性多肽可為胰島素。
較佳地，於步驟(1)中，生理活性多肽與非肽基聚合物可在pH為5.0至6.5之條件下以1：1至1：20之莫耳比彼此反應，於步驟(2)中，步驟(1)之反應混合物與免疫球蛋白恆定區可在pH為6.0至8.5之條件下在鹽之存在下以1：0.5至1：10之莫耳比彼此反應，其中如果鹽為氯化鈉，可以少於3.0M之最終濃度添加鹽，如果鹽為乙酸鈉，可以少於2.5M之最終濃度添加鹽，如果鹽為硫酸鈉，可以少於0.7M之最終濃度添加鹽，如果鹽為磷酸鈉，可以少於0.8M之最終濃度添加鹽，或如果鹽為氯化鉀，可以1.0M或較少之最終濃度添加鹽。
可經由本發明之製備方法以高純度及高產量製造生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恆定區複合物。由於製備生理活性多肽複合物所使用之方法，而減低製造成本因而改善工業應用性及服藥順從性。因此，可使用該方法於發展生理活性多肽之長效調配物。
第1圖為顯示經由Source 15Q管柱純化實施例2及實施例3之偶合反應溶液之結果的概圖，其中可比較未反應之免疫球蛋白Fc、長效胰島素複合物(胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc片段複合物)及雜質之含量。
為達到上述目的之一方面，本發明提供製備生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恆定區之複合物的方法，包括步驟：(1)使非肽基聚合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之一者反應；及(2)在鹽存在下使步驟(1)之反應混合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之另一者反應。
步驟(1)為使生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區與非肽基聚合物連接之步驟，可使用連接非肽基聚合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之已知方法。例如，可在0至25℃使彼等反應1至16小時而達成。較佳地，可透過官能基經由反應形成共價鍵而使一個非肽基聚合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區共價結合。此時，根據參與該反應之官能基類型，可進一步包含濃度為1至20mM之還原劑來進行該反應。
非肽基聚合物可經由包含於其中之官能基形成共價鍵而連接至生理活性多肽及免疫球蛋白恆定區。較佳地，非肽基聚合物之官能基可與胺基連接，而此胺基存在於生理活性多肽及免疫球蛋白恆定區之N終端或Lys殘基之側鏈。關於這點，生理活性多肽及免疫球蛋白恆定區上之Lys殘基位置未特別限制於特定部位。Lys殘基未限制為天然Lys，且包含非天然胺基酸及Lys衍生物而無限制，只要彼等含有可與非肽基聚合物之官能基連接的胺基。
反應混合物可包含反應產物，諸如非肽基聚合物與生理活性多肽之接合物或非肽基聚合物與免疫球蛋白恆定區之接合物，及未反應之反應混合物。因此，可進一步於步驟(1)之後包括從反應混合物中分離出生理活性多肽-非肽基聚合物接合物或 免疫球蛋白恆定區-非肽基聚合物接合物的步驟。
術語“非肽基聚合物”，如本文所使用，意指包含兩種或更多種重複單位之生物相容的聚合物，此聚合物係經隨機共價鍵而非經肽鍵而結合在一起。適用於本發明之非肽基聚合物之實例包含聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物諸如聚乳酸(PLA)及聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合，較佳為聚乙二醇(PEG)。所屬領域習知之其衍生物及使用所屬領域習知之方法輕易可製備之衍生物亦在本發明之範疇內。
使用於根據習知之框內融合(inframe fusion)方法而製備之融合蛋白質之肽連接子具有在生體內容易被蛋白質分解酵素裂解之缺點，因此，由於使用相應之載體，任何活性藥物之血液半衰期的增加均無法達到期望。然而，本發明中，由於使用抗蛋白質分解酵素之聚合物，發現肽之血液半衰期與載體相似。因此，本發明中，可使用具有上述功能，即，具有對生體中蛋白質分解酵素之抗性之任合聚合物作為非肽聚合物而沒有任何限制。非肽聚合物具有在1至100kDa範圍之分子量，及較佳在1至20kDa範圍。此外，與生理活性多肽接合之本發明非肽聚合物，不只可為一種聚合物而且可為不同種類聚合物之組合。
本發明所使用的非肽聚合物具有官能基，而此官能基可與免疫球蛋白Fc區及蛋白質藥物接合。
較佳地，非肽基聚合物可與生理活性多肽之胺基酸殘基之側鏈之胺基或硫醇基連接而形成肽、硫代半縮醛、亞胺或 硫代二側氧基吡咯啶基(thiodioxopyrrolidinyl)鍵。
非肽聚合物之終端官能基之非限制實例可包含醛衍生物諸如丙醛基團及丁醛基團、馬來醯亞胺衍生物及琥珀醯亞胺衍生物。琥珀醯亞胺衍生物可包含琥珀醯亞胺基羧甲基、琥珀醯亞胺戊酸酯、琥珀醯亞胺甲基丁酸酯、琥珀醯亞胺甲基丙酸酯、琥珀醯亞胺丁酸酯、琥珀醯亞胺丙酸酯、N-羥基琥珀醯亞胺或琥珀醯亞胺碳酸酯，但未限於此。可使用可選擇性地與免疫球蛋白Fc區及生理活性多肽之胺基酸殘基之胺基或硫醇基連接以便形成共價鍵之官能基而無限制。
在非肽基聚合物兩端之官能基可彼此相同或不同。例如，非肽聚合物可在一端具有琥珀醯亞胺基，及在另一端具有醛衍生物諸如丙醛基或丁醛基。使用具有反應性羥基於其兩端之聚乙二醇作為非肽基聚合物時，該羥基可經已知化學反應活化為各種不同官能基，或可使用市售之具有修飾官能基之聚乙二醇以製備本發明蛋白質複合物。
較佳地，非肽基聚合物可在兩端具有丙醛基作為官能基。
與PEG接合，一般使用於製備長效蛋白質調配物，雖然增加蛋白質之安定性，但是較大分子量之PEG呈現與蛋白質之較低反應度因而降低產量。因為生產量與製造成本及相對應之產業利用性密切相關，所以增加生產量是很重要的。可將有醛官能基之PEG與胺基偶合，此胺基存在於多肽之Lys殘基的N終端或R基團。聚乙二醇化之產量可取決於PEG對蛋白質之莫耳比、反應溶液之濃度、反應時間、pH、溫度等而變化。
然而，使用包含有兩個或更多個官能基之PEG的非肽基聚合物作為兩個不同多肽間之連接子時，需要兩個或更多個反應步驟，因而降低整體產量。特別地，觀察到進行第二反應步驟(其中與具有兩個或更多個官能基之非肽基聚合物接合之生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區分別與免疫球蛋白恆定區或生理活性多肽反應，下文稱為“偶合反應”)與第一反應步驟比有顯著產量降低，此第一反應步驟其中生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區與具有兩個或更多個官能基之非肽基聚合物反應。
本發明者等發現在偶合反應期間添加鹽與反應產量間之相互關係，且彼等證實經由使用鹽而改良偶合反應產量。
本發明中之鹽為具有中性淨電荷之離子性化合物，由相等數目之陰離子及陽離子間形成電子鍵所造成(考量離子價)，並在水溶液中解離成陽離子及陰離子。就本發明之目的而言，可添加鹽至反應溶液以使非肽基聚合物與生理活性多肽之接合物或非肽基聚合物與免疫球蛋白恆定區之接合物與免疫球蛋白恆定區或生理活性多肽連接而形成共價鍵。常見形成鹽之陽離子包含銨(NH4 +)、鈣(Ca2+)、鐵(Fe2+或Fe3+)、鎂(Mg2+)、鉀(K+)、吡啶鎓(C5H5NH+)、四級銨(NR4 +)或鈉(Na+)，及陰離子可包含乙酸根(CH3COO-)、碳酸根(CO3 2-)、氯離子(Cl-)、檸檬酸根(HOC(COO-)(CH2COO-)2)、氰離子(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亞硝酸根(NO2 -)、磷酸根(PO4 3-)或硫酸根(SO4 2-)。可由上述陽離子與陰離子組合而形成鹽。鹽可為一般所屬領域使用之鹽，但不限於此，較佳為氯化鈉、乙酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、碳酸鈉、氰化鈉、檸檬酸鈉、硝酸鈉、氯化鉀、乙酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碳酸鉀、氰 化鉀、檸檬酸鉀、硝酸鉀、氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、碳酸鎂、氰化鎂、檸檬酸鎂、硝酸鎂、氯化銨、乙酸銨、硫酸銨、磷酸銨、碳酸銨、氰化銨、檸檬酸銨、硝酸銨、氯化鈣、乙酸鈣、硫酸鈣、磷酸鈣、碳酸鈣、氰化鈣、檸檬酸鈣或硝酸鈣。更佳地，鹽可為氯化鈉、乙酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉或氯化鉀。可取決於生理活性多肽及反應溶劑之類型而自由地選擇適當的鹽作為鹽。
反應溶液中可包含鹽以使經由一個官能基與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區連接之非肽基聚合物有效地經由另一個官能基而與免疫球蛋白恆定區或生理活性多肽連接。為增加非肽基聚合物之偶合反應產量起見，鹽之最終濃度可相對地高，例如，少於3.0M。可經由重複實驗決定鹽之較低濃度限制，以及作為鹽濃度之適當範圍，例如，可建議於偶合反應中以0.1至3M之最終濃度包含鹽，及更明確地，0.3至2.5M之最終濃度。
較佳地，如果鹽為氯化鈉，可以少於3.0M之最終濃度添加鹽，如果鹽為乙酸鈉，可以少於2.5M之最終濃度添加鹽，如果鹽為硫酸鈉，可以少於0.7M之最終濃度添加鹽，如果鹽為磷酸鈉，可以少於0.8M之最終濃度添加鹽，或如果鹽為氯化鉀，可以1.0M或較少之最終濃度添加鹽。如果鹽濃度超過根據鹽類型之上述範圍，則產量增加，但是可能不合意地發生黏聚。雖然發生黏聚，仍然可能製備複合物，但是會產生製程上之困難。就製程之便利性而言，因此，較佳以不造成過度黏聚之濃度添加鹽，即，不產生黏聚或產生極微量黏聚。例如，儘管會黏聚，在偶合反應期間添加鹽時仍然比添加鹽前增加整體產量，只要不造成分離上及/或純化上之嚴重問題此種黏聚是可接受的。
本發明之具體實例中，經由連接胰島素、含有兩個醛基作為官能基之PEG連接子及免疫球蛋白恆定區而製備複合物時，為了增加產量在各種不同條件下使用鹽而使反應得以進行。發現在偶合反應中使用鹽而改良產量(表1)。再者，本發明者等發現可經由防止由於副反應所致雜質產生而達到添加鹽之偶合反應產量之改良，例如，防止可經由兩個不同胰島素-PEG接合物與一個免疫球蛋白恆定區之兩個N終端結合而形成之多聚體之產生(第1圖)。
本發明中，偶合反應，即，步驟(2)之反應較佳可進行4至18小時。此外，可在0至25℃進行偶合反應。然而，反應條件未限制於此。
本發明中，如果非肽基聚合物具有一種或多種醛衍生物作為官能基，反應混合物可進一步包括最終濃度為1至100mM之還原劑。
本發明中，還原劑意為作用於減少可逆性亞胺雙鍵之化合物，該亞胺雙鍵係從非肽基聚合物之醛基與多肽(生理活性多肽、免疫球蛋白恆定區)之胺基之反應而形成，因而形成共價鍵，且意指包含所有所屬領域已知之還原劑。就本發明之目的而言，可將還原劑加至反應溶液其中非肽基聚合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區形成共價鍵。只要是所屬領域一般使用之任何還原劑，本發明均可採用。較佳地，還原劑之實例可包含，但未限制於，氰基硼氫化鈉、硼烷吡啶複合物、硼氫化鈉、硼烷二甲胺複合物、硼烷三甲胺複合物或三乙醯氧基硼氫化鈉。可取決於生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區及反應溶劑之類型而自由地 選擇適當之還原劑。
反應溶液中包含的還原劑用於生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區與非肽基聚合物之接合。可包含濃度1至20mM之還原劑用於生理活性多肽與非肽基聚合物或免疫球蛋白恆定區與非肽基聚合物間之反應(步驟(1)之反應)，濃度1至100mM之還原劑用於偶合反應(步驟(2)之反應)。
較佳地，可在pH 5.0至6.5進行步驟(1)及可在pH 6.0至8.5進行步驟(2)。再者，可在其中使用檸檬酸鈉及磷酸鉀或HEPES將離子強度調控於20至500mM內的條件下進行反應，但未限制於此。
本發明之具體實例中，使用於其兩端具有丙醛作為官能基之PEG作為非肽基聚合物而與作為生理活性多肽之胰島素反應而製備PEG-胰島素接合物，然後在鹽存在下進行與免疫球蛋白恆定區之偶合反應而製備胰島素-PEG-免疫球蛋白恆定區複合物。
如上述，與非肽基聚合物之連接發生於非肽基聚合物之官能基與存在於生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區N終端之胺基之間或與構成彼等之胺基酸殘基之側鏈之胺基或硫醇基之間。其間，因為免疫球蛋白恆定區具有兩個N終端，一個免疫球蛋白恆定區藉由相同非肽基聚合物分子上之兩個官能基，或藉由兩個不同非肽基聚合物分子上之官能基而連接。然而，根據本發明製備方法而形成之複合物較佳為其中各一分子之生理活性多肽、非肽基聚合物及免疫球蛋白恆定區彼此連接之形式，即，一個生理活性多肽分子及一個免疫球蛋白恆定區分子連接至一個非 肽基聚合物之兩端。反之，一個免疫球蛋白恆定區與相同非肽基聚合物分子之兩個官能基連接時，所有非肽基聚合物端點之官能基均與免疫球蛋白恆定區連接，因而不能經偶合反應而與生理活性多肽連接。免疫球蛋白恆定區與兩個不同非肽基聚合物分子之各官能基連接時，可能形成偽二聚體形式之多聚體。
因此，本發明之具體例中，於步驟(1)中，非肽基聚合物與生理活性多肽反應，於步驟(2)中，步驟(1)之反應混合物與免疫球蛋白恆定區反應。如果非肽基聚合物首先與生理活性多肽反應而形成生理活性多肽-非肽基聚合物接合物，然後該接合物藉由偶合反應與免疫球蛋白恆定區反應，則可防止一個免疫球蛋白恆定區與非肽基聚合物之兩端連接之接合物形成，其可發生於免疫球蛋白恆定區首先與非肽基聚合物反應時。
上述具體例之具體實施例中，較佳為在步驟(1)中，生理活性多肽及非肽基聚合物以1：1至1：20之莫耳比反應，及在步驟(2)中，作為步驟(1)產物之生理活性多肽與非肽基聚合物之接合物與免疫球蛋白恆定區以1：0.5至1：10之莫耳比反應，但未限制於此。
更具體地，可以少於3.0M之最終濃度添加氯化鈉，以少於2.5M之最終濃度添加乙酸鈉，以少於0.7M之最終濃度添加硫酸鈉，以少於0.8M之最終濃度添加磷酸鈉，或以1.0M或較少之最終濃度添加氯化鉀，而進行步驟(2)，但未限制鹽之類型及濃度。只要不產生足夠干擾反應混合物中之製程的過度黏聚，可以不同濃度添加各種不同類型之鹽。可使用造成相當於未添加鹽時被視為可接受之黏聚程度之黏聚之鹽濃度。
更具體地，步驟(1)為使生理活性多肽與非肽基聚合物以1：1至1：20之莫耳比在pH條件5.0至6.5下反應之步驟，及步驟(2)為使步驟(1)之反應混合物與免疫球蛋白恆定區以1：0.5至1：10之莫耳比在pH條件6.0至8.5及鹽存在下反應之步驟，且如果鹽為氯化鈉，可以少於3.0M之最終濃度添加鹽，如果鹽為乙酸鈉，可以少於2.5M之最終濃度添加鹽，如果鹽為硫酸鈉，可以少於0.7M之最終濃度添加鹽，如果鹽為磷酸鈉，可以少於0.8M之最終濃度添加鹽，或如果鹽為氯化鉀，可以1.0M或較少之最終濃度添加鹽。
步驟(1)為製備生理活性多肽-非肽基聚合物接合物之反應，之後，可進一步進行純化產物之步驟。步驟(2)為經由使步驟(1)產物之生理活性多肽-非肽基聚合物接合物與免疫球蛋白恆定區反應而製備生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恆定區複合物之反應。可如上述經由調控反應條件及反應物之莫耳比而以改良產量製備複合物。
如本文所使用，術語“生理活性多肽”如一般概念意指在生體中具有某些生理功能之多肽。其共同具有多肽基結構且顯示不同之生物活性。當身體由於缺乏或過度分泌涉及某功能之物質結果而變得生物性上之不正常時，生理活性多肽可調節基因表現或生理功能，因而改正不正常。可包含一般蛋白質藥物。
生理活性多肽可選自由下列者所組成群組：人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、類昇糖素胜肽(GLP-1等)、調酸素、G蛋白偶聯受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞 介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉化生長因子、α 1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、脂蛋白-E、紅血球生成素、糖基化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、VIIa、VIII、IX及XIII、胞漿素元活化物、血纖維蛋白結合肽、脲激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、血管收縮素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降血鈣素、胰島素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素、結締組織活化因子、組織因子路徑抑制物、濾泡刺激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒素、乳鐵素、肌骨素、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株抗體、多株抗體及抗體片段。較佳地，生理活性多肽可為胰島素，但未限制於此。
本發明之具體例中使用之胰島素為當血糖濃度變高時從胰臟分泌之一種生理活性肽，胰島素作用為藉由引起使肝臟、骨骼肌及脂肪組織從血液攝入葡萄糖並儲存為肝醣，以及藉由抑制脂肪分解(脂肪分解為使用脂肪作為能源之代謝作用)而調控血糖濃度。就結構而言，胰島素包括α鏈及β鏈。術語胰島素α鏈及胰島素β鏈可分別與胰島素A鏈及胰島素B鏈交換使用。 這些肽包含胰島素促效劑、前驅物、衍生物、片段及變體。較佳為天然胰島素、速效胰島素及長效胰島素。
天然胰島素為分泌自胰臟之激素及在經由促進細胞攝取葡萄糖及抑制脂肪分解而調控血糖濃度上扮演關鍵角色。具有調節血糖濃度功能之胰島素係透過一系列之製程而從無調節血糖濃度功能之胰島素元前驅物製造。胰島素之胺基酸序列如下：
-α鏈：Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO.1)
-β鏈：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO.2)
胰島素促效劑意指與體內胰島素受體結合而呈現與胰島素相同生物活性之物質而無關於胰島素之結構。
胰島素衍生物意指與天然胰島素相比在胺基酸序列中顯示至少有80%序列同源性之肽，具有一些在化學取代(如，α-甲基化、α-羥基化)、移除(如，去胺化)或修飾(如，N-甲基化、糖基化、脂肪酸)之形式上改變之胺基酸殘基基團，並在體內具有調控血糖濃度之功能。
胰島素片段意指胰島素之類型其中在胺基或羧基末端添加或刪除一個或多個胺基酸，及添加的胺基酸亦可為非天然胺基酸(如，D型胺基酸)。此種胰島素片段保有在體內調控血糖濃度之功能。
胰島素變體意指胺基酸序列中有一個或多個與胰島素不同之肽，及保有在體內調控血糖濃度之功能。
可獨立或組合地採用使用於製備胰島素促效劑、衍生物、片段及變體之各別方法。例如，胰島素肽可包含胺基酸序列中有一個或多個與天然胰島素不同及在N終端胺基酸殘基有去胺化，具有在體內調控血糖濃度之功能之肽。
如本文所使用，術語“免疫球蛋白恆定區”意指缺少輕及重鏈之可變區、重鏈之恆定區1(CH1)及輕鏈之恆定區(CL)之免疫球蛋白片段，即，包括重鏈之恆定區2及3(CH2及CH3)(或包含重鏈之恆定區(CH4))之Fc區。視需要地，免疫球蛋白Fc區可進一步包括鉸鏈區。而且，本發明免疫球蛋白恆定區可為延伸的免疫球蛋白Fc區其包括只有除免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之可變區以外之部分或全部重鏈之恆定區1(CH1)及/或輕鏈之恆定區(CL)，只要其顯示實質上等於或優於天然免疫球蛋白恆定區之效用。再者，本發明免疫球蛋白恆定區可缺少相當於CH2及/或CH3之胺基酸序列之重要部分。因此，本發明免疫球蛋白恆定區可包括(1)CH1功能區、CH2功能區、CH3功能區及CH4功能區、(2)CH1功能區及CH2功能區、(3)CH1功能區及CH3功能區、(4)CH2功能區及CH3功能區、(5)一個或多個恆定區域及免疫球蛋白鉸鏈區(或部分鉸鏈區)之組合或(6)各重鏈之恆定區域及輕鏈之恆定區之二聚體。
包含Fc區之免疫球蛋白恆定區為生物可降解多肽，此多肽可在生體中經代謝，而可安全地使用作為藥物載體。此外，就複合物之生產、純化及生產量而言，因為免疫球蛋白Fc區之相 對較小分子量而比整個免疫球蛋白分子更有利。再者，因為缺少Fab，此Fab呈現由於從一個抗體到另一個抗體之胺基酸序列差異之高度非同質性，所以單獨之免疫球蛋白Fc提供複合物顯著加強之同質性，而降低誘導血液抗原性之可能性。
另一方面，免疫球蛋白恆定區可來自人或動物，諸如牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等，較佳可為來自人。此外，免疫球蛋白恆定區可選自衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM之Fc片段，或其組合或雜合物。較佳地，恆定區衍生自IgG或IgM，彼等為血液中最大量者，而最佳來自IgG，已知IgG改善配體結合蛋白質之血清半衰期。
如本文所使用，術語“組合”意指編碼同源單鏈免疫球蛋白恆定區(較佳地，Fc區)之多肽與不同源之單鏈多肽連接而形成二聚體或多聚體。即，可經由組合選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE之片段所組成之群組之兩種或更多種片段而製備二聚體或多聚體。
如本文所使用，術語“雜合物”意指編碼兩種或更多種不同來源之免疫球蛋白恆定區之序列存在於免疫球蛋白恆定區(較佳地，Fc區)之單鏈中。本發明中，各種不同雜合形式均可能。例如，雜合區域可由選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc之CH1、CH2、CH3及CH4所組成群組之1至4個功能區所組成，且可包含鉸鏈區。
IgG分成IgG1、IgG2、IgG3及IgG4子類，而本發明可包含其組合或雜合物。較佳為IgG2及IgG4子類，最佳為很少具有效應功能諸如補體依賴型細胞毒性(CDC)之IgG4之Fc區。
免疫球蛋白恆定區可為具有天然糖鏈、與天然形式比較為增加之糖鏈或減少之糖鏈之形式，或可為去糖基化之形式。可經由所屬領域之一般方法而達到免疫球蛋白恆定區糖鏈之增加、減少或移除，諸如化學方法、酵素方法及使用微生物之遺傳工程方法。此處，去糖基化免疫球蛋白恆定區顯示與補體(c1q)之結合親合力的急遽下降及減少或喪失抗體依賴型細胞毒性或補體依賴型細胞毒性，因而不會在生體內誘發不必要之免疫反應。關於這點，非糖基化或去糖基化形式之免疫球蛋白恆定區可較適合本發明之目的而作為藥物載體。據此，可再更佳地使用人IgG4衍生之非糖基化Fc區。人衍生之Fc區比非人衍生之Fc區更佳，非人衍生之Fc區可充作人體中之抗原而引起不想要之免疫反應諸如產生新抗體對抗抗原。
再者，不僅是有天然胺基酸序列之免疫球蛋白恆定區還有其胺基酸序列突變體均可包含於本發明免疫球蛋白恆定區之範圍內。胺基酸序列衍生物具有由於刪除、插入、非保留性或保留性取代或其組合而與天然胺基酸序列有一個或多個不同胺基酸殘基之序列。例如，已知IgG Fc中位置214至238、297至299、318至322或327至331之胺基酸殘基在連接上是重要的，可使用作為適合修飾用之位置。本發明可使用各種不同衍生物，諸如經由移除能形成雙硫鍵之部位、自天然Fc移除一些N終端胺基酸或添加甲硫胺酸至天然Fc之N終端而製備者。此外，可從天然Fc區消除補體固定部位，如，C1q固定部位，或ADCC部位而移除起效子(ettector)功能。製備免疫球蛋白恆定區之胺基酸序列突變體之技術揭露於固際專利案公開WO 97/34631及WO 96/32478。
蛋白質及肽中之胺基酸取代，通常不會改變分子活性，此為所屬領域所熟知(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見之取代發生於胺基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之間。視需要地，可經由磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙醯化及醯胺化而修飾胺基酸。
上述免疫球蛋白恆定區衍生物可為呈現與本發明免疫球蛋白恆定區相同生物活性之衍生物而同時具有對抗熱、pH等之改良結構安定性。此外，可從自人及其他動物包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠及天竺鼠單離之天然形式得到這些Fc區，或可得自轉殖動物細胞或微生物之重組體或其衍生物。此處，彼等可得自藉由單離來自人或動物生物體之完整免疫球蛋白並用蛋白質分解酵素處理而得到之天然免疫球蛋白。免疫球蛋白經木瓜酵素處理而裂解為Fab及Fc區，及經胃蛋白酶處理而裂解為pF'c及F(ab)2。可使這些片段進行粒徑排除層析法而分離Fc或pF'c。
較佳地，人衍生免疫球蛋白恆定區可為得自微生物之重組免疫球蛋白恆定區。
在下文，將參考下列實施例而更詳細說明本發明。然而，這些實施例僅用於說明之目的，而非意圖限制本發明。
[實施例]
實施例1：胰島素之聚乙二醇化反應及單聚乙二醇化胰 島素之純化
將胰島素粉末溶於10mM HCl，然後於4℃與3.4K二乙基酮-ALD2 PEG(propion-ALD2 PEG)(具有2個於兩端之丙醛基之PEG，IDB，韓國)以胰島素：PEG之莫耳比1：4及胰島素濃度5mg/ml反應約2小時而聚乙二醇化胰島素β鏈之N終端。在50mM檸檬酸鈉pH 6.0下，45%異丙醇中添加還原劑3.0mM氰基硼氫化鈉而進行此反應。用SP-HP(GE Healthcare)管柱，使用含有檸檬酸鈉(pH 3.0)及45% EtOH之緩衝液，及KCl濃度梯度而純化反應溶液。
實施例2：經由不添加鹽之偶合反應之複合物製備
使經由實施例1之方法製備之單聚乙二醇化胰島素與免疫球蛋白Fc片段以莫耳比1：1.2及總蛋白質濃度20mg/ml於25℃反應13小時而製備胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc片段之複合物。這次，反應溶液含有100mM HEPES、22mM磷酸鉀及10%乙醇，pH8.2，及另外含有20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。
反應完成後，將反應溶液通過Source 15Q(GE Healthcare)管柱使用Tris-HCl(pH 7.5)緩衝液及NaCl濃度梯度分離及純化未反應胰島素，未反應免疫球蛋白Fc片段、胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc片段之複合物及與兩個或更多個單聚乙二醇化胰島素(胰島素-PEG)偶合之免疫球蛋白Fc片段複合物。關於這點，概圖上(第1圖)鑑定雜質之含量。
然後，使用Source 15ISO(GE Healthcare)作為第二管柱而移除任何殘留之免疫球蛋白Fc及多偶合胰島素複合物，因而得到胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物。在此情況下，使用含Tris-HCl(pH 7.5)之硫酸銨濃度梯度進行沖提。用RP-HPLC及IE-HPLC分析沖 提出之胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物。
實施例3：經由添加氯化鈉而改良偶合反應產量
使經由實施例1之方法製備之單聚乙二醇化胰島素與免疫球蛋白Fc片段以莫耳比1：1.2及總蛋白質濃度20mg/ml於25℃反應13小時，來檢查氯化鈉對偶合反應產量之影響。這次，反應溶液含有100mM HEPES、22mM磷酸鉀及10%乙醇，pH8.2，並添加有最終濃度為0.5至3.0M之氯化鈉，及另外含有20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。
如實施例2之相同方式純化及分析反應溶液。與不添加比較，添加氯化鈉至偶合溶液改良偶合反應產量。添加最終濃度為2.0M之氯化鈉達到最大效果(表1)。Source 15Q概圖之結果顯示由於副反應所致，雜質減少，使得產量改良(第1圖)。亦證實在添加2.0M氯化鈉下進行偶合反應時，可製備純度95%或更高之高純度胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物(表2)。相反的，以最終濃度3.0M添加氯化鈉時，開始觀察到黏聚。
實施例4：經由添加乙酸鈉而改良偶合反應產量
使經由實施例1之方法製備之單聚乙二醇化胰島素與免疫球蛋白Fc片段以莫耳比1：1.2及總蛋白質濃度20mg/ml於25℃反應13小時，而檢查乙酸鈉對偶合反應產量之影響。這次，反應溶液含有100mM HEPES、22mM磷酸鉀及10%乙醇，pH8.2，並添加有最終濃度為1.5至3.0M之乙酸鈉，及另外含有20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。
如實施例2之相同方式純化及分析反應溶液。與不添加比較，添加乙酸鈉至偶合溶液改良偶合反應產量。添加最終濃度為 1.5M之乙酸鈉達到最大效果(表1)。亦證實在添加1.5M乙酸鈉下進行偶合反應時，可製備純度95%或更高之高純度胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc複合物(表2)。相反的，以最終濃度2.5M或更高添加氯化鈉時，由於黏聚而難以計算產量。
實施例5：經由添加硫酸鈉而改良偶合反應產量
使經由實施例1之方法製備之單聚乙二醇化胰島素與免疫球蛋白Fc片段以莫耳比1：1.2及總蛋白質濃度20mg/ml於25℃反應13小時，而檢查硫酸鈉對偶合反應產量之影響。這次，反應溶液含有100mM HEPES、22mM磷酸鉀及10%乙醇，pH8.2，添加最終濃度為0.4至0.7M之硫酸鈉，及另外含有20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。
如實施例2之相同方式純化及分析反應溶液。與不添加比較，添加硫酸鈉至偶合溶液改良偶合反應產量。添加最終濃度為0.4M之硫酸鈉達到最大效果(表1)。以最終濃度0.5M添加硫酸鈉時，開始觀察到黏聚。以最終濃度0.7M或更高添加硫酸鈉時，由於黏聚而難以計算產量。
實施例6：經由添加磷酸鈉而改良偶合反應產量
使經由實施例1之方法製備之單聚乙二醇化胰島素與免疫球蛋白Fc片段以莫耳比1：1.2及總蛋白質濃度20mg/ml於25℃反應13小時，而檢查磷酸鈉對偶合反應產量之影響。這次，反應溶液含有100mM HEPES、22mM磷酸鉀及10%乙醇，pH8.2，添加最終濃度為0.4至0.8M之磷酸鈉，及另外含有20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。
如實施例2之相同方式純化及分析反應溶液。與不添加比 較，添加磷酸鈉至偶合溶液改良偶合反應產量。添加最終濃度為0.4M之磷酸鈉達到最大效果(表1)。相反的，以最終濃度0.6M添加磷酸鈉時，開始觀察到黏聚。以最終濃度0.8M添加磷酸鈉時，由於黏聚而難以計算產量。
實施例7：經由添加氯化鉀而改良偶合反應產量
使經由實施例1之方法製備之單聚乙二醇化胰島素與免疫球蛋白Fc片段以莫耳比1：1.2及總蛋白質濃度20mg/ml於25℃反應13小時，而檢查氯化鉀對偶合反應產量之影響。這次，反應溶液含有100mM HEPES、22mM磷酸鉀及10%乙醇，pH8.2，添加最終濃度為0.5至1.0M之氯化鉀，及另外含有20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。
如實施例2之相同方式純化及分析反應溶液。與不添加比較，添加氯化鉀至偶合溶液改良偶合反應產量。添加最終濃度為1.0M之氯化鉀達到最大效果(表1)。
下列表1顯示製備包含胰島素及免疫球蛋白Fc片段之複合物期間根據偶合反應中鹽之類型及濃度之偶合反應產量及總產量。
如表1所示，雖然取決於鹽之類型及濃度而有不同，與不添加之對照組比較，添加鹽之群組顯示偶合反應產量從32.3%增加到35.2%至43.5%及總產量從16.2%增加到17.6%至21.8%。關於未添加對照組之產量變化率是變換的，而偶合反應產量及總產量變化率高達9至35%。
下列表2顯示製備包含胰島素及免疫球蛋白Fc片段之複合物期間經由添加2.0M氯化鈉或1.5M乙酸鈉至偶合反應溶液而製備之最終複合物的純度。純度係經使用粒徑排除層析法(在下文稱為SE)及離子交換層析法(在下文稱為IE)之HPLC分析雙重 檢查。
<110> 韓美藥品股份有限公司(HANMI PHARM.CO.,LTD.)
<120> 生理活性多肽複合物高產率製備之改良製程
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由於本案的圖為結果數據，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。

Claims (30)

  1. 一種製備生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恆定區複合物之方法，包括步驟：(1)使非肽基聚合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之一者反應；及(2)在鹽存在下使步驟(1)之反應混合物與生理活性多肽或免疫球蛋白恆定區之另一者反應。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非肽基聚合物各獨立於其兩端具有選自由醛衍生物、馬來醯亞胺衍生物及琥珀醯亞胺衍生物所組成群組之官能基。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該非肽基聚合物經由其兩端之官能基形成共價鍵而連接該生理活性多肽及該免疫球蛋白恆定區。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，另外包括從步驟(1)之反應混合物中分離出生理活性多肽-非肽基聚合物接合物或免疫球蛋白恆定區-非肽基聚合物接合物之步驟。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該鹽係選自由下列者所組成群組：氯化鈉、乙酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、碳酸鈉、氰化鈉、檸檬酸鈉、硝酸鈉、氯化鉀、乙酸鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、碳酸鉀、氰化鉀、檸檬酸鉀、硝酸鉀、氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、碳酸鎂、氰化鎂、檸檬酸鎂、硝酸鎂、氯化銨、乙酸銨、硫酸銨、磷酸銨、碳酸銨、氰化銨、檸檬酸銨、硝酸銨、氯化鈣、乙酸鈣、硫酸鈣、磷酸鈣、碳酸鈣、氰化鈣、檸檬酸鈣及硝酸鈣。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該鹽係選自由下列者所組成群組：氯化鈉、乙酸鈉、硫酸鈉、磷酸鈉及氯化鉀。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該鹽以最終濃度0.1至3.0M添加。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該鹽以最終濃度0.3至2.5M添加。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中若該鹽為氯化鈉，則以少於3.0M之最終濃度添加之，若該鹽為乙酸鈉，則以少於2.5M之最終濃度添加之，若該鹽為硫酸鈉，則以少於0.7M之最終濃度添加之，若該鹽為磷酸鈉，則以少於0.8M之最終濃度添加之，或若該鹽為氯化鉀，則以1.0M或更少之最終濃度添加之。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(2)之反應時間為4至18小時。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(2)之反應溫度為0至25℃。
  12. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中若該非肽基聚合物具有一種或多種醛衍生物作為官能基，則該反應混合物另外包括最終濃度為1至100mM之還原劑。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在pH 5.0至6.5進行步驟(1)及在pH 6.0至8.5進行步驟(2)。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在步驟(1)中該非肽基聚合物與該生理活性多肽反應，及在步驟(2)中該步驟(1)之反應混合物與該免疫球蛋白恆定區反應。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中在步驟(1)中，該生理活性多肽與該非肽基聚合物以1：1至1：20之莫耳比彼此反應，及在步驟(2)中，該步驟(1)之產物與該免疫球蛋白恆定區以1：0.5至1：10之莫耳比彼此反應。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中在下列者之存在下進行步驟(2)：以最終濃度少於0.3M添加之氯化鈉、以最終濃度少於2.5M添加之乙酸鈉、以最終濃度少於0.7M添加之硫酸鈉、以最終濃度少於0.8M添加之磷酸鈉或以最終濃度為1.0M或更少添加之氯化鉀。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非肽基聚合物之官能基與胺基連接，該胺基存在於該生理活性多肽及該免疫球蛋白恆定區之N終端或Lys殘基之側鏈。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非肽基聚合物選自由下列者所組成群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸，及其組合。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非肽基聚合物為聚乙二醇。
  20. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該非肽基聚合物具有範圍為1至100kDa之分子量。
  21. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區為非糖基化。
  22. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區 由選自由CH1、CH2、CH3及CH4功能區所組成群組之1至4個功能區組成。
  23. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區另外包含鉸鏈區。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區選自由IgG、IgA、IgD、IgE、IgM衍生之恆定區，其組合，及其雜合物所組成群組。
  25. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之恆定區，其組合，及其雜合物所組成群組。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區為IgG4 Fc區域。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該免疫球蛋白恆定區為非糖基化人IgG4 Fc區域。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生理活性多肽選自由下列者所組成群組：人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、類昇糖素胜肽(GLP-1等)、調酸素、G蛋白偶聯受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉化生長因子、α 1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、脂蛋白-E、紅血球生成素、糖基化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、 凝血酶調節素、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX及凝血因子XIII、胞漿素元活化物、血纖維蛋白結合肽、脲激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、血管收縮素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降血鈣素、胰島素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素、結締組織活化因子、組織因子路徑抑制物、濾泡刺激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒素、乳鐵素、肌骨素、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株抗體、多株抗體及抗體片段。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中該生理活性多肽為胰島素。
  30. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在步驟(1)中，該生理活性多肽與該非肽基聚合物以1：1至1：20之莫耳比在pH條件5.0至6.5下反應，及在步驟(2)中，在該鹽存在下，該步驟(1)之反應混合物與該免疫球蛋白恆定區以1：0.5至1：10之莫耳比在pH條件6.0至8.5下反應，若該鹽為氯化鈉，可以少於3.0M之最終濃度添加之，若該鹽為乙酸鈉，可以少於2.5M之最終濃度添加之，若該鹽為硫酸鈉，可以少於0.7M之最終濃度添加之，若該鹽為磷酸鈉，可以少於0.8M之最終濃度添加之，或若該鹽為氯化鉀，可以1.0M或更少之最終濃度添加之。
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