BR112015021764B1 - Método de preparação melhorado para a produção com alto rendimento de conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo - Google Patents

Método de preparação melhorado para a produção com alto rendimento de conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo Download PDF

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Abstract

MÉTODO DE PREPARAÇÃO MELHORADO PARA A PRODUÇÃO COM ALTO RENDIMENTO DE CONJUGADO DE POLIPEPTÍDEO FISIOLOGICAMENTE ATIVO. A presente invenção refere-se a um método para a preparação de um conjugado através da ligação de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, um ligante de polímero não peptídico e uma região constante de imunoglobulina via uma ligação covalente. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método para preparar eficientemente o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo, em que um sal é usado em uma reação de acoplamento para melhorar o problema de baixo rendimento de produção observado durante a preparação do conjugado do polipeptídeo fisiologicamente ativo. O complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo?polímero não peptídico?região constante de imunoglobulina pode ser produzido com um elevado grau de pureza e rendimento pelo método de preparação da presente invenção. Em virtude do método de preparação do conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo, os custos de produção podem ser reduzidos. Como tal, o método pode ser utilizado para desenvolver formulações de ação prolongada de polipeptídeos fisiologicamente ativos, que apresentam melhor aplicabilidade industrial e maior conformidade com a regulamentação dos fármacos.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a um método para a preparação de um conjugado através da ligação de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, um ligante de polímero não peptídico e uma região constante de imunoglobulina por uma ligação covalente. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método para preparar eficientemente o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo, em que um sal é usado em uma reação de acoplamento para melhorar o problema de baixo rendimento de produção observado durante a preparação do conjugado do polipeptídeo fisiologicamente ativo.
2. Descrição da Arte Relacionada
[002] Em geral, os polipeptídeos fisiologicamente ativos são facilmente desnaturados devido à sua baixa estabilidade e são decompostos no sangue pela proteína hidrolase para serem prontamente removidos através dos rins ou fígado. Como tal, a fim de manter a concentração no sangue e a potência dos medicamentos proteicos constituídos por um polipeptídeo fisiologicamente ativo como princípio ativo farmacológico, é necessário administrar frequentemente aos doentes o fármaco à base de proteínas. No entanto, no caso de medicamentos proteicos administrados aos doentes principalmente sob a forma de formulação injetável, as frequentes injeções necessárias para manter a concentração no sangue dos polipeptídeos fisiologicamente ativos podem causar dor excessiva aos doentes e resultar em custos de tratamento elevados. Para resolver estes problemas, tem sido envidado um esforço constante para maximizar a eficácia farmacológica aumentando a estabilidade no sangue dos fármacos proteicos e mantendo a concentração de fármaco no sangue por um tempo prolongado. Estas formulações de ação prolongada de fármacos proteicos são necessárias tanto para aumentar a estabilidade dos fármacos proteicos e manter a potência dos medicamentos em si a um nível suficientemente elevado, como para não causar nenhuma reação imunitária nos doentes.
[003] No estado da técnica anterior, a fim de estabilizar proteínas e inibir o seu contato com a proteína hidrolase e subsequente perda através dos rins, tem- se utilizado um método para adicionar quimicamente, à superfície da proteína, polímeros de solubilidade elevada como, por exemplo, polietilenoglicol (doravante referido como "PEG"). Sabe-se que os PEGs são eficazes para estabilizar proteínas e evitar a sua hidrólise através da ligação não específica do PEG a um ou vários locais específicos da proteína alvo a fim de aumentar a solubilidade da proteína, e que, além disso, não têm quaisquer efeitos secundários adversos (Sada et al, J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991).
[004] No entanto, no método que utiliza PEG, embora o tempo de circulação dos fármacos peptídicos aumente pelo aumento do peso molecular do PEG, a potência do fármaco peptídico é significativamente reduzida e a reatividade do PEG com peptídeos diminui com o aumento do peso molecular, reduzindo assim o rendimento.
[005] Além disso, se bem que um método de preparação de uma proteína de fusão de um fragmento de imunoglobulina e um polipeptídeo fisiologicamente ativo possa superar os problemas de baixo rendimento e falta de especificidade da peguilação, por outro lado apresenta problemas, pois o aumento da semivida no sangue não é tão elevado quanto o esperado e em alguns casos o título é baixo. Além disso, a fim de maximizar o efeito de aumento de semivida no sangue, vários tipos de ligantes de peptídeo podem ser usados, mas estes poderão induzir uma reação imunitária. Ademais, quando se utilizam peptídeos que possuem pontes de dissulfureto, tais como o BNP, a aplicação é difícil devido à elevada probabilidade de uma dobragem deficiente, e nos casos em que estão presentes resíduos de aminoácidos não nativos, a produção na forma de um recombinante genético é impossível.
[006] A insulina é um peptídeo segregado pelas células beta do pâncreas humano como um material que desempenha um papel muito importante no controle do nível de glicose no sangue do organismo. Quando a insulina não é segregada corretamente ou a insulina tal como segregada não atua corretamente no organismo, a glicose no sangue do organismo não pode ser controlada e aumenta, induzindo desse modo o estado referido como diabetes. O caso descrito atrás é referido como diabetes mellitus tipo 2, e o caso em que a insulina não é segregada pelo pâncreas para reduzir a glicose no sangue é conhecido como diabetes mellitus tipo 1. A diabetes mellitus tipo 2 é tratada com um agente hipoglicemiante oral, que inclui uma substância química como componente principal, e em certos doentes é também tratada com insulina. Por outro lado, o tratamento de diabetes mellitus tipo 1 requer necessariamente a administração de insulina.
[007] A terapia de insulina tão amplamente utilizada na atualidade é um método em que insulina é administrada por injeção, antes e após as refeições. Tal terapia de insulina requer que a insulina seja constantemente administrada, isto é, três vezes ao dia, e como tal causa muito sofrimento e transtorno aos doentes. Para superar esses problemas, procuraram-se várias alternativas. Uma delas foi a entrega de fármacos peptídicos ao organismo por inalação através das cavidades orais ou nasais, aumentando a permeabilidade da membrana biológica a fármacos peptídicos. No entanto, este método tem uma eficiência de entrega ao organismo significativamente inferior à da injeção, e por isso é muito difícil manter a atividade IN VIVO de fármacos peptídicos nas condições exigidas.
[008] Por outro lado, tentaram-se métodos para retardar a absorção após a administração subcutânea de um excesso de medicamento. Nesse sentido, foram descritos métodos para manter a concentração de fármaco no sangue através de apenas uma única administração diária. Alguns foram aprovados como medicamentos (por exemplo, Lantus, Sanofi-aventis) e são atualmente administrados a doentes. A investigação progrediu no sentido de modificar a insulina com ácidos gordos para reforçar a ligação do polímero de insulina e aumentar a sua duração por ligação à albumina presente no local de administração e no sangue, e fármacos produzidos por esse método foram aprovados como medicamentos (Levemir, NovoNordisk). No entanto, esses métodos têm o efeito colateral de causar dor no local de administração, e, além disso, o intervalo de administração para uma única injeção diária ainda representa uma responsabilidade importante para os doentes.
[009] A fim de resolver estes problemas, os presentes inventores prepararam um complexo composto por um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma região constante de imunoglobulina usando um polímero não peptídico como ligante, como estratégia para simultaneamente maximizar um aumento na semivida e manter a atividade IN VIVO de polipeptídeos fisiologicamente ativos incluindo insulina. No entanto, é ainda necessário um método para preparar o complexo com um elevado grau de pureza e rendimento, pois as matérias- primas constituintes do conjugado são caras. Assim sendo, os presentes inventores constataram que quando se adiciona um tipo adequado de sal em uma concentração adequada a uma solução reacional em uma etapa de reação de acoplamento durante a preparação do complexo, um complexo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser preparado com um elevado grau de pureza e rendimento e custos de produção reduzidos, dando assim por concluída a presente invenção.
[010] RESUMO DA INVENÇÃO
[011] Um objeto da presente invenção é proporcionar um método eficiente capaz de melhorar o baixo rendimento de produção observado durante a preparação de um complexo, ligando um polipeptídeo fisiologicamente ativo, um ligante de polímero não peptídico e uma região constante de imunoglobulina através de uma ligação covalente.
[012] Para alcançar o objetivo anterior, em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de um complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo - polímero não peptídico - região constante de imunoglobulina, que compreende as etapas de: (1) fazer reagir um polímero não peptídico com um entre um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma região constante de imunoglobulina; e (2) fazer reagir a mistura reacional da etapa (1) com o outro entre o polipeptídeo fisiologicamente ativo e a região constante de imunoglobulina, na presença de um sal.
[013] De preferência, o polímero não peptídico pode ter independentemente um grupo funcional em ambas as suas extremidades selecionado do grupo constituído por um derivado de aldeído, um derivado de maleimida e um derivado de succinimida
[014] Mais de preferência, o polímero não peptídico pode estar ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e à região constante de imunoglobulina através de grupos funcionais em ambas as suas extremidades para formar uma ligação covalente.
[015] De preferência, o método pode ainda incluir o passo de separar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo - polímero não peptídico, ou um conjugado de região constante de imunoglobulina - polímero não peptídico, da mistura reacional após a etapa (1).
[016] De preferência, o sal pode ser selecionado do grupo formado por cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, carbonato de sódio, cianeto de sódio, citrato de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio, acetato de potássio, sulfato de potássio, fosfato de potássio, carbonato de potássio, cianeto de potássio, citrato de potássio, nitrato de potássio, cloreto de magnésio, acetato de magnésio, sulfato de magnésio, fosfato de magnésio, carbonato de magnésio, cianeto de magnésio, citrato de magnésio, nitrato de magnésio, cloreto de amônio, acetato de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, cianeto de amônio, citrato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de cálcio, acetato de cálcio, sulfato de cálcio, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, cianeto de cálcio, citrato de cálcio e nitrato de cálcio.
[017] Mais de preferência, o sal pode ser selecionado do grupo constituído por cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio e cloreto de potássio.
[018] De preferência, o sal pode ser adicionado em uma concentração final de 0,1 a 3,0 M.
[019] Mais de preferência, o sal pode ser adicionado em uma concentração final de 0,3 a 2,5 M.
[020] De preferência, se o sal for cloreto de sódio, pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, se o sal for acetato de sódio, pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, se o sal for sulfato de sódio, pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, se o sal for fosfato de sódio, pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou se o sal for cloreto de potássio, pode ser adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
[021] De preferência, o tempo de reação da etapa (2) será de 4 a 18 horas.
[022] De preferência, a temperatura de reação do passo (2) será de 0 a 25 °C.
[023] De preferência, se o polímero não peptídico possuir um ou mais derivados de aldeído como grupos funcionais, a mistura reacional compreenderá ainda um agente redutor em uma concentração final de 1 a 100 mM.
[024] De preferência, o passo (1) pode ser realizado a um pH de 5,0 a 6,5, e o passo (2) pode ser realizado a um pH de 6,0 a 8,5.
[025] De preferência, no passo (1), o polímero não peptídico pode reagir com o polipeptídeo fisiologicamente ativo, e no passo (2), a mistura reacional do passo (1) pode reagir com a região constante de imunoglobulina.
[026] De preferência, no passo (1), o polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não peptídico podem reagir um com o outro em uma razão molar de 1:1 a 1:20, e no passo (2), o produto do passo (1) e a região constante de imunoglobulina podem reagir um com o outro em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10.
[027] Mais de preferência, o passo (2) pode ser realizado na presença de cloreto de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, de acetato de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, de sulfato de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, de fosfato de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou de cloreto de potássio adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
[028] De preferência, os grupos funcionais do polímero não peptídico podem ser ligados a um grupo amina presente no terminal N, ou em uma cadeia lateral do resíduo de Lys do polipeptídeo fisiologicamente ativo e da região constante de imunoglobulina.
[029] De preferência, o polímero não peptídico pode ser selecionado do grupo constituído por polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol, polióis polioxietilados, álcoois polivinílicos, polissacarídeos, dextranos, éteres poliviniletílicos, ácido polilático (PLA), ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), polímeros de lipídios, quitinas, ácido hialurónico e suas combinações.
[030] Mais, de preferência, o polímero não peptídico pode ser polietilenoglicol.
[031] De preferência, o polímero não peptídico pode ter um peso molecular de 1 a 100 kDa.
[032] De preferência, a região constante de imunoglobulina pode ser aglicosilada.
[033] De preferência, a região constante de imunoglobulina pode consistir de uma a quatro domínios selecionados do grupo constituído pelos domínios CH1, CH2, CH3 e CH4.
[034] De preferência, a região constante de imunoglobulina pode ainda incluir uma região da dobra.
[035] De preferência, a região constante de imunoglobulina pode ser selecionada do grupo constituído por regiões constantes derivadas de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, suas combinações e seus híbridos.
[036] De preferência, a região constante de imunoglobulina pode ser selecionada do grupo constituído por regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, suas combinações e seus híbridos.
[037] Mais de preferência, a região constante de imunoglobulina pode ser uma região Fc da IgG4.
[038] Muito mais de preferência, a região constante de imunoglobulina pode ser uma região Fc de IgG4 humana aglicosilada.
[039] De preferência, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser selecionado do grupo constituído pelo hormônio do crescimento humano, hormônios libertadores do hormônio do crescimento, peptídeos libertadores do hormônio do crescimento, Interferon, receptores de Interferon, fatores estimulantes de colônias, peptídeos semelhantes ao glucagon (GLP-1, etc.), oxintomodulina, receptores acoplados à proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteínas de ligação a interleucinas, proteínas de ligação a citoquinas, fatores de ativação de macrófagos, peptídeos de macrófagos, fatores de células B, fatores de células T, proteína A, inibidores de alergia, glicoproteínas de necrose celular, imunotoxinas, linfotoxinas, fator de necrose tumoral, supressores de tumor, fator de crescimento transformador, 1- antitripsina, albumina, α-lactoalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina, eritropoietina glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeos de ativação do receptor da trombina, trombomodulina, fatores de coagulação VII, VIIa, VIII, IX e XIII, ativadores do plasminogênio, peptídeos de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína C reativa, inibidor da renina, inibidor da colagenase, superóxido-dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína de estimulação óssea, calcitonina, insulina, atriopeptina, fator de indução de cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor da via do fator tecidular, hormônio foliculostimulante, hormônio luteinizante, hormônio libertadora da hormônio luteinizante, fatores do crescimento nervoso, hormônio paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante à insulina, hormônio adrenocortical, glucagon, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo libertador de gastrina, fator de libertação da corticotropina, hormônio estimulante da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, Antígenos da superfície celular, Antígenos de vacinas derivados de vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos.
[040] Mais de preferência, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser a insulina.
[041] De preferência, no passo (1), o polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não peptídico podem ser feitos reagir um com o outro em uma razão molar de 1:1 a 1:20 sob condições de pH 5,0 a 6,5, e no passo (2), a mistura reacional do passo (1) e a região constante de imunoglobulina podem ser feitas reagir uma com a outra em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10, sob condições de pH 6,0 a 8,5, na presença de sal, em que se o sal for cloreto de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, se o sal for acetato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, se o sal for sulfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, se o sal for fosfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou se o sal for cloreto de potássio, este pode ser adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
[042] EFEITO DA INVENÇÃO
[043] Um complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico-região constante de imunoglobulina pode ser produzido com um elevado grau de pureza e rendimento pelo método de preparação da presente invenção. Em virtude do método usado para preparar o complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo, os custos de produção podem ser reduzidos e deste modo podem ser melhoradas a aplicabilidade industrial e a adesão ao fármaco. Por conseguinte, o método pode ser usado para desenvolver formulações de ação prolongada de polipeptídeos fisiologicamente ativos.
[044] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[045] A Fig. 1 é um perfil ilustrativo dos resultados da purificação das soluções da reação do acoplamento dos Exemplos 2 e 3 pela coluna Source 15Q, em que se podem comparar os teores da Fc de imunoglobulina não reagida, de um complexo de insulina de ação prolongada (complexo de insulina- PEG-fragmento Fc de imunoglobulina) e de impurezas.
[046] DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS
[047] Para alcançar os objetivos anteriores, em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de um complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico-região constante de imunoglobulina, que compreende as etapas de: (1) reagir um polímero não peptídico com um entre um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma região constante de imunoglobulina; e (2) fazer reagir à mistura reacional do passo (1) com o outro entre o polipeptídeo fisiologicamente ativo e a região constante de imunoglobulina na presença de um sal.
[048] A etapa (1) é o passo de ligação do polipeptídeo fisiologicamente ativo ou da região constante de imunoglobulina ao polímero não peptídico e para isso pode-se recorrer a um método conhecido utilizado para ligar o polímero não peptídico com o polipeptídeo fisiologicamente ativo ou com a região constante de imunoglobulina. Isto pode ser alcançado, por exemplo, através da sua reação entre 0 e 25 °C durante 1 a 16 horas. De preferência, um polímero não peptídico pode ser covalentemente ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo ou à região constante de imunoglobulina através do seu grupo funcional pela reação de formação de uma ligação covalente. Aqui, de acordo com o tipo de grupo funcional que participa na reação, um agente redutor pode ser ainda incluído em uma concentração de 1 a 20 mM para realizar a reação.
[049] O polímero não peptídico pode ser ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e à região constante de imunoglobulina através de grupos funcionais nele incluídos, formando ligações covalentes. De preferência, os grupos funcionais do polímero não peptídico podem estar ligados a um grupo amina presente em um terminal N ou em uma cadeia lateral do resíduo de Lys do polipeptídeo fisiologicamente ativo e da região constante de imunoglobulina. Neste contexto, a posição do resíduo de Lys no polipeptídeo fisiologicamente ativo e na região constante de imunoglobulina não está particularmente limitada ao local específico. O resíduo de Lys não está limitado a Lys natural, e aminoácidos não naturais e derivados de Lys estão incluídos, sem limitação, desde que contenham grupos amina para serem ligados aos grupos funcionais do polímero não peptídico.
[050] A mistura reacional pode incluir os produtos de reação, tais como o conjugado do polímero não peptídico e do polipeptídeo fisiologicamente ativo, ou o conjugado do polímero não peptídico e da região constante de imunoglobulina, e mistura reacional que não tenha reagido. Portanto, um passo para separar da mistura reacional o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico, ou o conjugado de região constante de imunoglobulina-polímero não peptídico, pode ser ainda incluído depois da etapa (1).
[051] O termo "polímero não peptídico", como aqui utilizado, refere-se a um polímero biocompatível composto por duas ou mais unidades de repetição que são mantidas unidas por qualquer ligação covalente diferente de uma ligação peptídica. Entre os exemplos de polímeros não peptídicos úteis na presente invenção constam polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol, polióis polioxietilados, álcoois polivinílicos, polissacarídeos, dextranos, éteres poliviniletílicos, polímeros biodegradáveis tais como ácido polilático (PLA) e ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), polímeros de lipídios, quitinas, ácido hialurônico e suas combinações, com uma preferência por polietilenoglicol (PEG). Os seus derivados conhecidos na arte e os derivados que podem ser facilmente preparados por métodos conhecidos na arte também estão dentro do âmbito da presente invenção.
[052] Os ligantes de peptídeos utilizados na proteína de fusão preparada de acordo com o anterior método de fusão em fase têm a desvantagem de ser facilmente clivados IN VIVO por enzimas proteolíticas e, portanto, qualquer aumento da semivida no sangue de fármacos ativos causado pelo uso de um correspondente transportador fica aquém das expetativas. No entanto, na presente invenção, a semivida no sangue do peptídeo é semelhante à do transportador devido ao uso de polímeros resistentes a enzimas proteolíticas. Como tal, na presente invenção, qualquer polímero com a característica anterior, ou seja, resistência a enzimas proteolíticas IN VIVO, pode ser usado como o polímero não peptídico, sem qualquer limitação. Os polímeros não peptídicos têm um peso molecular na faixa de 1 a 100 kDa, e de preferência na faixa de 1 a 20 kDa. Além disso, o polímero não peptídico da presente invenção, para ser conjugado com o polipeptídeo fisiologicamente ativo, pode ser não só um tipo de polímero, mas também uma combinação de diferentes tipos de polímeros.
[053] Os polímeros não peptídicos utilizados na presente invenção possuem grupos funcionais que podem ser conjugados com a região Fc da imunoglobulina e com o fármaco de proteína.
[054] De preferência, o polímero não peptídico pode estar ligado a um grupo amina ou a um grupo tiol em uma cadeia lateral do resíduo de aminoácido do polipeptídeo fisiologicamente ativo para formar uma ligação peptídeo, hemitioacetal, imina, ou tiodioxopirrolidinilo.
[055] Exemplos não limitativos de grupos funcionais terminais dos polímeros não peptídicos podem incluir derivados de aldeídos, tais como um grupo propionaldeído e um grupo butiraldeído, derivados de maleimida e derivados de succinimida. Os derivados de succinimida podem incluir succinimidil carboximetilo, valerato de succinimidilo, metilbutanoato de succinimidilo, metilpropionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, N-hidroxisuccinimida, ou carbonato de succinimidilo, mas não lhes estando limitados. Podem ser utilizados sem qualquer limitação os grupos funcionais seletivamente ligados ao grupo amina ou grupo tiol do resíduo de aminoácido da região Fc da imunoglobulina e ao polipeptídeo fisiologicamente ativo a fim de formar uma ligação covalente.
[056] Os grupos funcionais em ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes entre si. Por exemplo, o polímero não- peptídico pode possuir um grupo succinimida em uma extremidade e um derivado de aldeído, tal como um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído, na outra extremidade. Quando polietilenoglicol com um grupo hidroxilo reativo em ambas as extremidades é utilizado como polímero não peptídico, o grupo hidroxi pode ser ativado para vários grupos funcionais por reações químicas conhecidas, ou então pode-se utilizar polietilenoglicol comercialmente disponível com um grupo funcional modificado a fim de preparar o complexo proteico da presente invenção.
[057] De preferência, o polímero não peptídico poderá ter grupos propionaldeído como grupos funcionais em ambas as extremidades.
[058] A conjugação com PEG, que é normalmente utilizada para preparar formulações de proteína de ação prolongada, aumenta a estabilidade das proteínas, mas PEGs de pesos moleculares elevados exibem baixa reatividade com as proteínas e, como tal, diminuem o rendimento da produção. Uma vez que o rendimento de produção está estreitamente correlacionado com os custos de produção e a correspondente aplicabilidade industrial, é muito importante aumentar o rendimento de produção. PEG com grupos funcionais de aldeído pode ser acoplado a um grupo amina presente em um terminal N ou no grupo R do resíduo de Lys do polipeptídeo. O rendimento da PEGguilação pode variar com a razão molar de PEG para proteínas, a concentração das soluções de reação, o tempo de reação, pH, temperatura, etc.
[059] No entanto, quando um polímero não peptídico incluindo PEG com dois ou mais grupos funcionais é usado como ligante entre dois polipeptídeos diferentes, duas ou mais etapas de reação são necessárias, diminuindo assim o rendimento total. Particularmente, o passo da segunda reação (no qual o polipeptídeo fisiologicamente ativo ou a região constante de imunoglobulina conjugada com um polímero não peptídico tendo dois ou mais grupos funcionais reage com a região constante de imunoglobulina ou com o polipeptídeo fisiologicamente ativo, respetivamente, doravante denominada "reação de acoplamento") ocorre com um rendimento significativamente mais baixo do que o passo da primeira reação, em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo ou a região constante de imunoglobulina reage com um polímero não peptídico tendo dois ou mais grupos funcionais.
[060] Os presentes inventores encontraram uma correlação entre a adição de sal durante a reação de acoplamento e o rendimento da reação, e confirmaram que o rendimento da reação de acoplamento é melhorado pelo uso de um sal.
[061] O sal na presente invenção é um composto iônico com uma carga líquida neutra, resultante da formação de ligações elétricas entre números iguais de ânions e cátions (considerando a valência iônica) e, em solução aquosa, dissocia-se em cátions e ânions. Em relação aos objetivos da presente invenção, o sal pode ser adicionado à solução de reação para que o conjugado de polímero não peptídico e polipeptídeo fisiologicamente ativo, ou o conjugado de polímero não peptídico e região constante de imunoglobulina se ligue à região constante de imunoglobulina ou ao polipeptídeo fisiologicamente ativo formando uma ligação covalente. Os cátions de formação de sais comuns incluem amônio (NH4+), cálcio (Ca2+), ferro (Fe2+ ou Fe3+), magnésio (Mg2+), potássio (K+), piridínio (C5H5NH+), amônio quaternário (NR4+) ou sódio (Na+), e os ânions podem incluir acetato (CH3COO-), carbonato (CO3-2), cloreto (Cl-), citrato HOC(COO-) (CH2COO-)2, cianeto (CN-), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), fosfato (PO4-3) ou sulfato (SO4-2). O sal pode ser formado em combinações dos cátions e ânions atrás referidos. O sal pode ser um sal de uso comum na técnica, de preferência, mas sem lhes estar limitado, cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, carbonato de sódio, cianeto de sódio, citrato de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio, acetato de potássio, sulfato de potássio, fosfato de potássio, carbonato de potássio, cianeto de potássio, citrato de potássio, nitrato de potássio, cloreto de magnésio, acetato de magnésio, sulfato de magnésio, fosfato de magnésio, carbonato de magnésio, cianeto de magnésio, citrato de magnésio, nitrato de magnésio, cloreto de amônio, acetato de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, cianeto de amônio, citrato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de cálcio, acetato de cálcio, sulfato de cálcio, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, cianeto de cálcio, citrato de cálcio, ou nitrato de cálcio. Mais, de preferência, o sal pode ser cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, ou cloreto de potássio. Como sal, um sal adequado pode ser livremente selecionado dependendo do tipo do polipeptídeo fisiologicamente ativo e do solvente de reação.
[062] O sal pode ser incluído na solução reacional para que o polímero não peptídico ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo ou à região constante de imunoglobulina através de um grupo funcional se ligue efetivamente à região constante de imunoglobulina ou ao polipeptídeo fisiologicamente ativo através do grupo funcional. A fim de aumentar o rendimento da reação de acoplamento do polímero não peptídico, a concentração final de sal pode ser relativamente alta, por exemplo, inferior a 3,0 M. O limite inferior da concentração de sal pode ser determinado por testes repetidos, e como intervalo adequado para a concentração de sal pode ser sugerido, por exemplo, que o sal esteja incluído em uma concentração final de 0,1 a 3 M, e mais especificamente em uma concentração final de 0,3 a 2,5 M durante a reação de acoplamento.
[063] De preferência, se o sal for cloreto de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, se o sal for acetato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, se o sal for sulfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, se o sal for fosfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou se o sal for cloreto de potássio, este pode ser adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos. Se a concentração de sal exceder o intervalo anterior de acordo com o tipo de sal, o rendimento aumenta, mas indesejavelmente poderá ocorrer aglomeração. Apesar da ocorrência de aglomeração, é ainda possível preparar complexos, mas são criadas dificuldades ao processo. Em termos de conveniência do processo, portanto, é preferível que o sal seja adicionado em uma concentração que não cause excessiva aglomeração, ou seja, que não cause nenhuma aglomeração ou apenas uma quantidade vestigial de aglomerados. Por exemplo, quando, apesar da aglomeração, a adição de sal durante a reação de acoplamento aumenta o rendimento total comparado com antes da adição do sal, tal aglomeração é aceitável desde que não cause grandes problemas durante a separação e/ou purificação.
[064] Em uma forma de realização específica da presente invenção, quando um complexo foi preparado pela ligação de insulina, um ligante de PEG contendo dois grupos aldeído como grupos funcionais, e a região constante de imunoglobulina, a reação foi deixada prosseguir utilizando um sal sob diferentes condições a fim de aumentar o rendimento. Verificou-se que o uso de sal durante a reação de acoplamento melhora o rendimento (Tabela 1). Além disso, os presentes inventores constataram o aumento no rendimento da reação de acoplamento por adição de sal pode ser conseguido pela prevenção da geração de impurezas por uma reação secundária, por exemplo, impedindo a geração de multímeros que podem ser formados pela ligação de dois conjugados diferentes de insulina-PEG aos dois terminais N de uma região constante de imunoglobulina (Fig. 1).
[065] Na presente invenção, a reação de acoplamento, ou seja, a reação da etapa (2) pode ser preferencialmente realizada em 4 a 18 horas. Além disso, a reação de acoplamento pode ser realizada entre 0 e 25 °C. No entanto, as condições de reação não lhes estão limitadas.
[066] Na presente invenção, se o polímero não peptídico tiver um ou mais derivados de aldeído como grupos funcionais, a mistura reacional pode ainda incluir um agente redutor em uma concentração final de 1 a 100 mM.
[067] Na presente invenção, “agente redutor” significa um composto que serve para reduzir a ligação dupla imina reversível formada a partir de uma reação entre o grupo aldeído do polímero não peptídico e o grupo amina dos polipeptídeos (polipeptídeo fisiologicamente ativo, região constante de imunoglobulina), desse modo estabelecendo uma ligação covalente, e pretende englobar todos os agentes redutores conhecidos na arte. No que diz respeito aos objetivos da presente invenção, o agente redutor pode ser adicionado à solução reacional na qual o polímero não peptídico forma uma ligação covalente com o polipeptídeo fisiologicamente ativo ou com a região constante de imunoglobulina. Desde que seja normalmente usado na técnica, qualquer agente redutor pode ser utilizado na presente invenção. De preferência, como exemplos do agente redutor podem referir-se, sem lhes estar limitados, cianoboro-hidreto de sódio, complexo borano--piridina, boro-hidreto de sódio, complexo borano-- dimetilamina, complexo borano--trimetilamina ou triacetoxiboro-hidreto de sódio. Um agente redutor adequado pode ser livremente selecionado consoante os tipos de polipeptídeo fisiologicamente ativo ou da região constante de imunoglobulina e o solvente de reação.
[068] O agente redutor está incluído na solução da reação de conjugação do polipeptídeo fisiologicamente ativo ou região constante de imunoglobulina com o polímero não peptídico. O agente redutor pode estar presente em uma concentração de 1~20 mM para a reação entre o polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não peptídico, ou entre a região constante de imunoglobulina e o polímero não peptídico (reação da etapa (1)), e em uma concentração de 1~100 mM para a reação de acoplamento (reação da etapa (2)).
[069] De preferência, o passo (1) pode ser realizado a pH 5,0-6.5, e o passo (2) pode ser realizado a pH 6,0-8,5. Além disso, a reação pode ser realizada em condições em que a força iônica é controlada entre 20 e 500 mM com citrato de sódio e fosfato de potássio ou HEPES, mas sem lhes estar limitado.
[070] Em uma forma de realização específica da presente invenção, PEG com propionaldeídos como grupos funcionais em ambas as extremidades foi usado como polímero não peptídico e foi reagido com insulina como o polipeptídeo fisiologicamente ativo para preparar um conjugado de PEG- insulina. A seguir, realizou-se a reação de acoplamento com a região constante de imunoglobulina na presença do sal para preparar um complexo de insulina- PEG-região constante de imunoglobulina.
[071] Conforme descrito atrás, a ligação com o polímero não peptídico ocorre entre os grupos funcionais do polímero não peptídico e um grupo amina que está presente ou em um terminal N do polipeptídeo fisiologicamente ativo, ou na região constante de imunoglobulina, ou em um grupo amina, ou em um grupo tiol em uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido que os constitui. Por outro lado, uma vez que a região constante de imunoglobulina tem dois terminais N, uma região constante de imunoglobulina é ligada através de dois grupos funcionais na mesma molécula de polímero não peptídico, ou através de grupos funcionais em duas moléculas diferentes de polímero não peptídico. No entanto, o complexo formado pelo método de preparação de acordo com a presente invenção está de preferência em uma forma em que as moléculas de polipeptídeo fisiologicamente ativo, de polímero não peptídico e de região constante de imunoglobulina estão ligadas umas às outras, ou seja, uma molécula do polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma molécula da região constante de imunoglobulina estão ligadas a ambas as extremidades do polímero não peptídico. Em contraste, quando uma região constante de imunoglobulina está ligada a dois grupos funcionais da mesma molécula de polímero não peptídico, todos os grupos funcionais em ambas as extremidades do polímero não peptídico estão ligados às regiões constantes de imunoglobulina e, portanto, não se podem ligar ao polipeptídeo fisiologicamente ativo por acoplamento. Quando uma região constante de imunoglobulina está ligada a cada um dos grupos funcionais de duas moléculas de polímero não peptídico diferentes, multímeros podem ser formadas sob a forma de pseudodímeros.
[072] Portanto, em uma forma de realização da presente invenção, na etapa (1) o polímero não peptídico reage com o polipeptídeo fisiologicamente ativo, e na etapa (2) a mistura reacional da etapa (1) reage com a região constante de imunoglobulina. Se o polímero não peptídico reagir primeiro com o polipeptídeo fisiologicamente ativo para formar um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico, e o conjugado reagir então com a região constante de imunoglobulina pela reação de acoplamento, poderá ser impedida a formação de um conjugado pela ligação de uma região constante de imunoglobulina a ambas extremidades de um polímero não peptídico, a qual poderá ocorrer quando a região constante de imunoglobulina e o polímero não peptídico são primeiro reagidos.
[073] Em um exemplo específico da forma de realização anterior, de preferência, na etapa (1), o polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não peptídico reagem em uma razão molar de 1:1 a 1:20, e na etapa (2), o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo e polímero não peptídico produzido na etapa (1) e a região constante de imunoglobulina são feitas reagir em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10, mas não lhes estando limitado.
[074] Mais especificamente, o passo (2) pode ser efetuado pela adição de cloreto de sódio em uma concentração final inferior a 3,0 M, acetato de sódio em uma concentração final inferior a 2,5 M, sulfato de sódio em uma concentração final inferior a 0,7 M, fosfato de sódio em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou cloreto de potássio em uma concentração final de 1,0 M ou menos, mas não se estando limitado ao tipo e concentração de sal. Desde que não seja gerada aglomeração excessiva o suficiente para interferir com o processo na mistura reacional, vários tipos de sal podem ser adicionados em diferentes concentrações. O sal pode ser usado em uma concentração que causa uma aglomeração correspondente ao nível de aglomeração considerado aceitável quando não é adicionado nenhum sal.
[075] Mais especificamente, o passo (1) é um passo em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é feito reagir com o polímero não peptídico em uma razão molar de 1:1 a 1:20 sob condições de pH 5,0-6,5 e o passo (2) é um passo em que a mistura reacional da etapa (1) é feita reagir com a região constante de imunoglobulina em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10 sob condições de pH 6,08.5 na presença de sal, e se o sal for cloreto de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, se o sal for acetato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, se o sal for sulfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, se o sal for fosfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou se o sal for cloreto de potássio, este pode ser adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
[076] O passo (1) é uma reação de preparação do conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico e, subsequentemente, poderá ser levado a cabo um passo de purificação do produto. O passo (2) é uma reação para a preparação do complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico-região constante de imunoglobulina pela reação do conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo- polímero não peptídico como produto do passo (1) com a região constante de imunoglobulina. O complexo pode ser preparado com um rendimento melhorado, controlando as condições de reação e a razão molar dos reagentes conforme descrito atrás.
[077] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo fisiologicamente ativo" refere-se de forma geral a um polipeptídeo que apresenta uma determinada função fisiológica IN VIVO. Tem uma estrutura de polipeptidilo em comum e apresenta várias atividades biológicas. Quando o organismo se torna biologicamente anormal como resultado de secreção insuficiente ou excessiva de um determinado material envolvido em uma função específica, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode regular a expressão genética ou função fisiológica e desse modo corrigir a anomalia. Fármacos típicos à base de proteínas podem ser incluídos.
[078] O polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser selecionado do grupo formado por hormônio do crescimento humano, hormônios libertadoras do hormônio do crescimento, peptídeos libertadores do hormônio do crescimento, Interferon, receptores de Interferon, fatores estimulantes de colônias, peptídeos semelhantes ao glucagon (GLP-1, etc.), oxintomodulina, receptores acoplados à proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteínas de ligação a interleucina, proteínas de ligação a citoquinas, fatores de ativação de macrófagos, peptídeos de macrófagos, fatores de células B, fatores de células T, proteína A, inibidores de alergia, glicoproteínas de necrose celular, imunotoxinas, linfotoxinas, fator de necrose tumoral, supressores de tumor, fator de crescimento transformador, α1-antitripsina, albumina, α-lactoalbumina, apolipoproteína E, eritropoietina, eritropoietina glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeos de ativação do receptor da trombina, trombomodulina, fatores de coagulação VII, VIIa, VIII, IX e XIII, ativadores do plasminogênio, peptídeos de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína C reativa, inibidor da renina, inibidor da colagenase, superóxido-dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína de estimulação óssea, calcitonina, insulina, atriopeptina, fator de indução de cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor da via do fator tecidular, hormônio foliculostimulante, hormônio luteinizante, hormônio libertadora da hormônio luteinizante, fatores do crescimento nervoso, hormônio paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante à insulina, hormônio adrenocortical, glucagon, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo libertador da gastrina, fator de libertação da corticotropina, hormônio estimulante da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, Antígenos da superfície celular, Antígenos de vacinas derivados de vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos. De preferência, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser insulina, mas não lhe estando limitado.
[079] A insulina utilizada na forma de realização da presente invenção é uma espécie de peptídeo fisiologicamente ativo segregado pelo pâncreas quando o nível de glicose no sangue aumenta que serve para controlar o nível de glicose no sangue, obrigando o fígado, os músculos esqueléticos e o tecido adiposo a assimilar a glicose do sangue e a armazená-la como glicogênio, e também suprimindo a lipólise, um metabolismo que utiliza gordura como fonte de energia. Em termos de estrutura, a insulina é composta por uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Os termos cadeia alfa da insulina e cadeia beta da insulina podem ser usados alternativamente a cadeia A da insulina e cadeia B da insulina, respetivamente. Estes peptídeos incluem agonistas, precursores, derivados, fragmentos e variantes de insulina. São preferenciais a insulina nativa, a insulina de ação rápida e a insulina de ação prolongada.
[080] A insulina nativa é um hormônio segregado pelo pâncreas e desempenha um papel fundamental no controle do nível de glicose no sangue, promovendo a captação celular da glicose e inibindo a lipólise. A insulina que regula o nível de glicose no sangue é produzida a partir do precursor proinsulina, o qual é destituído da função de regulação do nível de glicose no sangue, através de uma série dos processos. A sequência de aminoácidos da insulina é a seguinte:
[081] - Cadeia alfa:
[082] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln- Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID n.° 1)
[083] -- Cadeia Beta:
[084] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala- Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID n.° 2)
[085] Os agonistas da insulina são substâncias que se ligam IN VIVO ao receptor da insulina e apresentam as mesmas atividades biológicas que a insulina, independentemente da estrutura da insulina.
[086] Derivados de insulina denotam um peptídeo que apresenta uma homologia de sequências de pelo menos 80% em uma sequência de aminoácidos em relação à insulina nativa, possui alguns grupos de resíduos de aminoácidos alterados por substituição química (por exemplo, alfa-metilação, alfa-hidroxilação), remoção (por exemplo, desaminação) ou modificação (por exemplo, N-metilação glicosilação, ácidos gordos), e tem a função de controlar o nível de glicose no sangue no organismo.
[087] Fragmentos de insulina denotam o tipo de insulina em que um ou mais aminoácidos são adicionados ou eliminados, terminais amino ou carboxi da insulina, e os aminoácidos tal como adicionados também podem ser aminoácidos não nativos (por exemplo, aminoácidos do tipo D). Estes fragmentos de insulina retêm a função de controle do nível de glicose no sangue no organismo.
[088] Variantes de insulina denotam um peptídeo que difere da insulina em uma ou mais sequências de aminoácidos e que mantém a função de controlar o nível de glicose no sangue no organismo.
[089] Os respectivos métodos utilizados para a preparação de agonistas, derivados, fragmentos e variantes da insulina podem ser empregados independentemente ou em combinação. Por exemplo, o peptídeo de insulina pode incluir peptídeos entre os quais um ou mais diferem, na sequência de aminoácidos, da insulina nativa e apresentam desaminação no resíduo de aminoácido N-terminal, tendo a função de controlar o nível de glicose no sangue do organismo.
[090] Como aqui utilizado, o termo "região constante de imunoglobulina" refere-se a um fragmento de imunoglobulina que é desprovido das regiões variáveis das cadeias leve e pesada, da região constante 1 da cadeia pesada (CH1), e da região constante da cadeia leve (CL), ou seja, uma região Fc formada pelas regiões constantes 2 e 3 da cadeia pesada (CH2 e CH3) (ou incluindo a região constante da cadeia pesada (CH4)). Opcionalmente, a região Fc da imunoglobulina pode ainda incluir uma região da dobra. Além disso, a região constante de imunoglobulina da presente invenção pode ter uma região Fc de imunoglobulina prolongada, que compreende uma parte ou a totalidade da região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e/ou da região constante da cadeia leve (CL), exceto apenas as regiões variáveis das cadeias leve e pesada da imunoglobulina, desde que apresente efeitos substancialmente idênticos ou superiores aos da região constante da imunoglobulina nativa. Além disso, a região constante de imunoglobulina da presente invenção pode carecer de uma parte significativa da sequência de aminoácidos correspondente a CH2 e/ou CH3. Consequentemente, a região constante de imunoglobulina da presente invenção pode incluir (1) domínio CH1, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CH4, (2) domínio CH1 e domínio CH2, (3) domínio CH1 e domínio CH3, (4) domínio CH2 e domínio CH3, (5) uma combinação de um ou mais domínios constantes e uma região da dobra da imunoglobulina (ou uma região parcial da dobra) ou (6) um dímero de cada domínio constante da cadeia pesada e a região constante da cadeia leve.
[091] Uma região constante de imunoglobulina que inclui a região Fc é um polipeptídeo biodegradável metabolizável IN VIVO para poder ser usado com segurança como transportador de fármacos. Além disso, devido ao seu peso molecular relativamente baixo, a região Fc da imunoglobulina é mais vantajosa em termos de produção, purificação e rendimento de produção de um complexo do que uma molécula de imunoglobulina inteira. Além disso, uma vez que é desprovida da região Fab, a qual apresenta alta não-homogeneidade devido à diferença na sequência de aminoácidos de um anticorpo para outro, a Fc de imunoglobulina por si só proporciona ao complexo uma homogeneidade significativamente melhorada e reduz a possibilidade de induzir antigenicidade no sangue.
[092] Por outro lado, a região constante de imunoglobulina pode originar de seres humanos ou animais, como vacas, cabras, porcos, ratinhos, coelhos, hamsters, ratos, cobaias, etc., e pode, de preferência, ser de origem humana. Além disso, a região constante de imunoglobulina pode ser selecionada entre fragmentos Fc derivados de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, ou de combinações ou híbridos respectivos. De preferência, a região constante é derivada de IgG ou IgM, que são as mais abundantes no sangue, e mais de preferência da IgG, a qual se sabe melhorar a semivida no soro de proteínas de ligação a ligandos.
[093] Como aqui utilizado, o termo "combinação" significa que polipeptídeos de codificação de regiões constantes de imunoglobulina de cadeia simples (de preferência regiões Fc) da mesma origem estão ligados a um polipeptídeo de cadeia simples de origem diferente para formar um dímero ou multímero. Ou seja, um dímero ou um multímero pode ser preparado pela combinação de dois ou mais fragmentos selecionados do grupo formado pelos fragmentos Fc da IgG, Fc da IgA, Fc da IgM, Fc da IgD, e Fc da IgE.
[094] Como aqui utilizado, o termo "híbrido" significa que sequências de codificação de duas ou mais regiões constantes de imunoglobulina de diversas origens estão presentes em uma região constante de imunoglobulina de cadeia simples (de preferência, uma região Fc). Na presente invenção, várias formas híbridas são possíveis. Por exemplo, o domínio híbrido pode ser composto por um a quatro domínios selecionados do grupo constituído por CH1, CH2, CH3 e CH4 da Fc da IgG, Fc da IgM, Fc da IgA, Fc da IgE e Fc da IgD, e podem incluir uma região da dobra.
[095] A IgG está dividida nas subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e a presente invenção pode incluir combinações ou híbridos respectivos. As subclasses IgG2 e IgG4 são preferenciais e a mais preferencial é a região Fc da IgG4 que raramente apresenta funções efetoras, tais como a Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC).
[096] A região constante da imunoglobulina pode ter cadeias de açúcar nativas, mais cadeias de açúcar, ou menos cadeias de açúcar do que a forma nativa, ou pode estar na forma desglicosilada. O aumento, redução ou remoção de cadeias de açúcar da região constante de imunoglobulina pode ser realizado por métodos típicos da técnica, tal como um método químico, um método enzimático ou um método de engenharia genética que emprega um microrganismo. Aqui, a região constante de imunoglobulina desglicosilada apresenta uma diminuição acentuada na afinidade de ligação ao complemento (c1q), bem como uma diminuição ou perda de citotoxicidade dependente de anticorpos ou citotoxicidade dependente do complemento, e por isso não induz desnecessariamente respostas imunitárias IN VIVO. A este respeito, uma região constante de imunoglobulina em uma forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais apropriada para o objeto da presente invenção como transportador do fármaco. Como tal, uma região Fc aglicosilada derivada de IgG4 humana será muito mais preferencialmente utilizada. A região Fc de origem humana é preferível a uma região de Fc de origem não-humana, a qual pode atuar como um antígeno no corpo humano e causar respostas imunitárias indesejáveis, tais como a produção de um novo anticorpo contra o Antígeno.
[097] Além disso, não só a região constante da imunoglobulina com a sequência de aminoácidos nativa, mas também a sua sequência de aminoácidos mutante é abrangida pela designação de região constante de imunoglobulina da presente invenção. Uma sequência de aminoácidos derivada tem uma sequência que difere em um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa devido a uma deleção, inserção, substituição conservadora ou não conservador, ou suas combinações. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos nas posições de 214 a 238, de 297 a 299, de 318 a 322 ou de 327 a 331 na Fc da IgG, que se sabe serem importantes para a ligação, podem ser usados como locais adequados para a modificação. Vários derivados, tais como aqueles preparados pela remoção dos locais capazes de formar pontes de dissulfureto, remoção de vários aminoácidos N-terminais da Fc nativa, ou adição de metionina ao terminal N da Fc nativa, podem ser usados na presente invenção. Além disso, os locais de fixação do complemento, por exemplo, locais de fixação do C1q ou locais ADCC, podem ser eliminados da região Fc nativa a fim de eliminar a função efetora. As técnicas de preparação de sequências de aminoácidos mutantes da região constante de imunoglobulina estão divulgadas nas publicações de patentes internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478.
[098] Substituições de aminoácidos em proteínas e peptídeos, que de uma forma geral não alteram a atividade das moléculas, são bem conhecidas na arte (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As substituições mais comuns ocorrem entre os resíduos de aminoácidos Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly. Opcionalmente, os aminoácidos podem ser modificados por fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação e amidação.
[099] Os atrás referidos derivados da região constante de imunoglobulina podem ser derivados com a mesma atividade biológica da região constante da imunoglobulina da presente invenção, que apresenta uma estabilidade estrutural melhorada em relação ao calor, pH ou afins. Além disso, estas regiões Fc podem ser obtidas de formas nativas isoladas de seres humanos e outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, ratinhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias, ou podem ser recombinantes ou seus derivados obtidos a partir de células animais ou microrganismos transformados. Neste caso, podem ser obtidas de uma imunoglobulina nativa isolando imunoglobulinas inteiras de organismos humanos ou animais e tratando-as com uma enzima proteolítica. As imunoglobulinas são clivadas em regiões Fab e Fc por tratamento com papaína e em pF'c e F(ab)2 por tratamento com pepsina. Estes fragmentos podem ser sujeitos a cromatografia de exclusão molecular para isolar Fc ou pF'c.
[100] De preferência, uma região constante de imunoglobulina de origem humana é uma região constante de imunoglobulina recombinante obtida a partir de um microrganismo.
[101] A presente invenção é seguidamente descrita em pormenor usando como referência os exemplos a seguir. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e a invenção não se destina a ser limitada por esses exemplos.
[102] Exemplo 1: Reação de PEGuilação da insulina e purificação da insulina mono-peguilada
[103] Insulina em pó foi dissolvida em HCl 10 mM e a seguir fez-se reagir com PEG 3.4K propino-ALD2 (PEG com dois grupos propionaldeído em ambas as extremidades, IDB, Coreia) a 4 °C, durante cerca de 2 horas, em uma razão molar 1:4 de insulina:PEG e a uma concentração de insulina de 5 mg/ml para peguilar o terminal N da cadeia beta da insulina. Esta reação foi conduzida sob citrato de sódio 50 mM, pH 6,0, em 45% de isopropanol, com adição de cianoborohidreto de sódio 3,0 mM , um agente redutor. A solução reacional foi purificada com uma coluna SP-HP (GE Healthcare), utilizando um tampão contendo citrato de sódio (pH 3.0) e 45% de EtOH, e um gradiente de concentração de KCl.
[104] Exemplo 2: Preparação de complexo por reação de acoplamento sem adição de sal
[105] Para preparar um complexo de insulina-PEG-fragmento Fc de imunoglobulina, insulina mono-PEGuilada preparada pelo método do Exemplo 1 e um fragmento Fc de imunoglobulina foram reagidos em uma razão molar 1:1,2, com um nível de proteína total de 20 mg/ml, a 25 °C, durante 13 horas. A solução reacional continha HEPES 100 mM, fosfato de potássio 22 mM e 10% de etanol a pH 8,2, e continha ainda cianoboro-hidreto de sódio 20 mM como agente redutor.
[106] No fim da reação, a solução reacional foi passada através de uma coluna Source 15Q (GE Healthcare) para separar e purificar a insulina que não reagiu, o fragmento Fc de imunoglobulina que não reagiu, o complexo insulina- PEG- fragmento Fc de imunoglobulina e o complexo de fragmento Fc de imunoglobulina acoplado a duas ou mais insulinas mono-PEGuiladas (insulina- PEG), usando tampão Tris-HCl (pH 7,5) e um gradiente de concentração de NaCl. Neste sentido, o teor de impurezas foi identificado em um perfil (Fig. 1).
[107] A seguir, Source 15ISO (GE Healthcare) foi usada como segunda coluna para remover quaisquer resíduos de Fc de imunoglobulina e de complexo de insulina multiacoplado, obtendo-se assim o complexo de insulina-PEG-Fc de imunoglobulina. Neste caso, a eluição foi realizada com um gradiente de concentração de sulfato de amônio contendo Tris-HCl (pH 7,5). O complexo eluído de insulina-PEG-Fc de imunoglobulina foi analisado por RP-HPLC e IE- HPLC.
[108] Exemplo 3: Melhoria no rendimento da reação de acoplamento por adição de cloreto de sódio
[109] A fim de avaliar o efeito de cloreto de sódio no rendimento da reação de acoplamento, insulina mono-PEGuilada preparada pelo método do Exemplo 1 e fragmento Fc de imunoglobulina foram reagidos em uma razão molar 1:1,2 com um nível de proteína total de 20 mg/ml, a 25 °C, durante 13 horas. A solução reacional continha HEPES 100 mM, fosfato de potássio 22 mM e 10% de etanol a pH 8,2, com adição de cloreto de sódio a uma concentração final de 0,5 a 3,0 M, e continha ainda cianoboro-hidreto de sódio 20 mM como agente redutor.
[110] A solução reacional foi purificada e analisada da mesma forma que no Exemplo 2. A adição de cloreto de sódio à solução de acoplamento melhorou o rendimento da reação de acoplamento, em comparação com nenhuma adição. Este efeito foi maximizado pela adição de cloreto de sódio a uma concentração final de 2,0 M (Tabela 1). Os resultados do perfil de Source 15Q mostram que as impurezas geradas por uma reação secundária diminuíram enquanto o rendimento aumentou (Fig. 1). Foi também confirmado que quando a reação de acoplamento era conduzida com adição de cloreto de sódio 2,0 M, complexo de insulina-PEG- Fc de imunoglobulina com um elevado grau de pureza de 95% ou mais podia ser preparado (Tabela 2). Em contraste, quando cloreto de sódio era adicionado a uma concentração final de 3,0 M, aglomeração começava a ser observada.
[111] Exemplo 4: Melhoria no rendimento da reação de acoplamento por adição de acetato de sódio
[112] A fim de avaliar o efeito de acetato de sódio no rendimento da reação de acoplamento, insulina mono-PEGuilada preparada pelo método do Exemplo 1 e fragmento Fc de imunoglobulina foram reagidos em uma razão molar 1:1,2 com um nível de proteína total de 20 mg/ml, a 25 °C, durante 13 horas. A solução reacional continha HEPES 100 mM, fosfato de potássio 22 mM e 10% de etanol a pH 8,2, com adição de acetato de sódio a uma concentração final de 1,5 a 3,0 M, e continha ainda cianoboro-hidreto de sódio 20 mM como agente redutor.
[113] A solução reacional foi purificada e analisada da mesma forma que no Exemplo 2. A adição de acetato de sódio à solução de acoplamento melhorou o rendimento da reação de acoplamento, em comparação com nenhuma adição. Este efeito foi maximizado pela adição de acetato de sódio a uma concentração final de 1,5 M (Tabela 1). Foi também confirmado que quando a reação de acoplamento era conduzida com adição de acetato de sódio 1,5 M, complexo de insulina-PEG- Fc de imunoglobulina com um elevado grau de pureza de 95% ou mais podia ser preparado (Tabela 2). Em contraste, quando acetato de sódio era adicionado a uma concentração final de 2,5 M ou mais, era difícil calcular o rendimento devido à aglomeração.
[114] Exemplo 5: Melhoria no rendimento da reação de acoplamento por adição de sulfato de sódio
[115] A fim de avaliar o efeito de sulfato de sódio no rendimento da reação de acoplamento, insulina mono-PEGuilada preparada pelo método do Exemplo 1 e fragmento Fc de imunoglobulina foram reagidos em uma razão molar 1:1,2, com um nível de proteína total de 20 mg/ml, a 25 °C, durante 13 horas. A solução reacional continha HEPES 100 mM, fosfato de potássio 22 mM e 10% de etanol a pH 8,2, com adição de sulfato de sódio a uma concentração final de 0,4 a 0,7 M, e continha ainda cianoboro-hidreto de sódio 20 mM como agente redutor.
[116] A solução reacional foi purificada e analisada da mesma forma que no Exemplo 2. A adição de sulfato de sódio à solução de acoplamento melhorou o rendimento da reação de acoplamento, em comparação com nenhuma adição. Este efeito foi maximizado pela adição de sulfato de sódio a uma concentração final de 0,4 M (Tabela 1). Quando sulfato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 0,5 M, começou a observar-se aglomeração. Quando sulfato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 0,7 M ou mais, foi difícil calcular o rendimento devido à aglomeração.
[117] Exemplo 6: Melhoria no rendimento da reação de acoplamento por adição de fosfato de sódio
[118] A fim de avaliar o efeito de fosfato de sódio no rendimento da reação de acoplamento, insulina mono-PEGuilada preparada pelo método do Exemplo 1 e fragmento Fc de imunoglobulina foram reagidos em uma razão molar 1:1,2, com um nível de proteína total de 20 mg/ml, a 25 °C, durante 13 horas. A solução reacional continha HEPES 100 mM, fosfato de potássio 22 mM e 10% de etanol a pH 8,2, com adição de fosfato de sódio a uma concentração final de 0,4 a 0,8 M, e continha ainda cianoboro-hidreto de sódio 20 mM como agente redutor.
[119] A solução reacional foi purificada e analisada da mesma forma que no Exemplo 2. A adição de fosfato de sódio à solução de acoplamento melhorou o rendimento da reação de acoplamento, em comparação com nenhuma adição. Este efeito foi maximizado pela adição de fosfato de sódio a uma concentração final de 0,4 M (Tabela 1). Em contraste, quando fosfato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 0,6 M, começou a observar-se aglomeração. Quando fosfato de sódio foi adicionado a uma concentração final de 0,8 M, foi difícil calcular o rendimento devido à aglomeração.
[120] Exemplo 7: Melhoria no rendimento da reação de acoplamento por adição de cloreto de potássio
[121] A fim de avaliar o efeito de cloreto de potássio no rendimento da reação de acoplamento, insulina mono-PEGuilada preparada pelo método do Exemplo 1 e fragmento Fc de imunoglobulina foram reagidos em uma razão molar 1:1,2, com um nível de proteína total de 20 mg/ml, a 25 °C, durante 13 horas. A solução reacional continha HEPES 100 mM, fosfato de potássio 22 mM e 10% de etanol a pH 8,2, com adição de cloreto de potássio a uma concentração final de 0,5 a 1,0 M, e continha ainda cianoboro-hidreto de sódio 20 mM como agente redutor.
[122] A solução reacional foi purificada e analisada da mesma forma que no Exemplo 2. A adição de cloreto de potássio à solução de acoplamento melhorou o rendimento da reação de acoplamento, em comparação com nenhuma adição. Este efeito foi maximizado pela adição de cloreto de potássio a uma concentração final de 1,0 M (Tabela 1).
[123] A seguinte Tabela 1 mostra o rendimento da reação de acoplamento e o rendimento total de acordo com o tipo e concentração de sal na reação de acoplamento durante a preparação do complexo de insulina e fragmento Fc de imunoglobulina. Tabela 1
Figure img0001
-: sem aglomeração, +: quantidade vestigial, ++; quantidade pequena, +++; quantidade excessiva, ++++; aglomeração total
[124] Conforme se pode ver na Tabela 1, os grupos com sal adicionado apresentaram rendimentos de reação de acoplamento aumentados de 32,3% para 35,2% a 43,5%, e rendimentos totais aumentados de 16,2% para 17,6% a 21,8% em relação ao grupo de controle sem adição, embora difiram com o tipo e concentração de sal. As suas taxas de variação em relação ao rendimento do grupo de controle sem adição foram convertidas, e as taxas de variação do rendimento da reação de acoplamento e do rendimento total obtidas eram tão elevadas quanto de 9 a 35%.
[125] A seguir, a Tabela 2 mostra a pureza do complexo final que foi preparado pela adição de cloreto de sódio 2,0 M ou acetato de sódio 1,5 M à solução de reação de acoplamento durante a preparação do complexo de insulina e fragmento Fc de imunoglobulina. A pureza foi confirmada por análise de HPLC, nomeadamente cromatografia de exclusão molecular (doravante referida como SE) e cromatografia de permuta iônica (doravante referida como IE). Tabela 2
Figure img0002

Claims (19)

1. Método para a preparação de um conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico-região constante de imunoglobulina, caracterizado por compreender as etapas de: (1) fazer reagir um polímero não peptídico com um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região constante de imunoglobulina para preparar um complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo - polímero não peptídico ou um complexo de região constante de imunoglobulina - polímero não peptídico; e (2) fazer reagir o complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo - polímero não peptídico ou um complexo de região constante de imunoglobulina - polímero não peptídico preparado na etapa (1) com o outro dentre o polipeptídeo fisiologicamente ativo e a região constante de imunoglobulina na presença de um sal para preparar o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico-região constante de imunoglobulina, em que o polímero não peptídico é selecionado a partir do grupo constituído por polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol, polióis polioxietilados, álcoois polivinílicos, polissacarídeos, dextranos, éteres poliviniletílicos, ácido polilático (PLA), ácido poli(láctico-co- glicólico) (PLGA), polímeros de lipídios, quitinas, ácido hialurónico e suas combinações, o sal é selecionado a partir do grupo formado por cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, carbonato de sódio, cianeto de sódio, citrato de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio, acetato de potássio, sulfato de potássio, fosfato de potássio, carbonato de potássio, cianeto de potássio, citrato de potássio, nitrato de potássio, cloreto de magnésio, acetato de magnésio, sulfato de magnésio, fosfato de magnésio, carbonato de magnésio, cianeto de magnésio, citrato de magnésio, nitrato de magnésio, cloreto de amônio, acetato de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, cianeto de amônio, citrato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de cálcio, acetato de cálcio, sulfato de cálcio, fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, cianeto de cálcio, citrato de cálcio e nitrato de cálcio, o sal é adicionado a uma concentração final de 0,3 a 3,0 M.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero não peptídico ter independentemente um grupo funcional em ambas as suas extremidades selecionado do grupo formado por um derivado de aldeído, um derivado de maleimida e um derivado de succinimida, opcionalmente em que o polímero não peptídico está ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e à região constante de imunoglobulina através de grupos funcionais em ambas as suas extremidades formando uma ligação covalente.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente o passo de separar um complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero não peptídico, ou um complexo de região constante de imunoglobulina-polímero não peptídico da mistura reacional após o passo (1).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o sal ser selecionado do grupo constituído por cloreto de sódio, acetato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio e cloreto de potássio, opcionalmente em que se o sal for cloreto de sódio, este ser adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, se o sal for acetato de sódio, este ser adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, se o sal for sulfato de sódio, este ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, se o sal for fosfato de sódio, este ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou se o sal for cloreto de potássio, este ser adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o sal ser adicionado em um concentração final de 0,3 a 2,5 M.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tempo de reação do passo (2) ser de 4 a 18 horas, opcionalmente em que a temperatura de reação do passo (2) é de 0 a 25 °C.
7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se o polímero não peptídico tiver um ou mais derivados de aldeído como grupos funcionais, a mistura reacional compreender adicionalmente um agente redutor em uma concentração final de 1 a 100 mM.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo (1) ser realizado a pH de 5,0 a 6,5 e o passo (2) ser realizado a pH de 6,0 a 8,5.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero não peptídico reagir com o polipeptídeo fisiologicamente ativo no passo (1) e o complexo de polipeptídeo fisiologicamente ativo - polímero não peptídico do passo (1) reagir com a região constante de imunoglobulina no passo (2).
10. Método, de acordo com reivindicação 9, caracterizado por o polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não peptídico reagirem entre si em uma razão molar de 1:1 a 1:20 no passo (1) e o produto do passo (1) e a região constante de imunoglobulina reagirem entre si em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10 no passo (2), opcionalmente em que o passo (2) é realizado na presença de cloreto de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, acetato de sódio adicionado em uma concentração final inferior a de 2,5 M, sulfato de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, fosfato de sódio adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou cloreto de potássio adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os grupos funcionais do polímero não peptídico estarem ligados a um grupo amina presente em um terminal N, ou em uma cadeia lateral de um resíduo de Lys do polipeptídeo fisiologicamente ativo e da região constante de imunoglobulina.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero não peptídico ser polietilenoglicóis, opcionalmente em que o polímero não peptídico tem um peso molecular de 1 a 100 kDa.
13. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado por a região constante de imunoglobulina ser aglicosilada.
14. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado por a região constante de imunoglobulina compreender um a quatro domínios selecionados do grupo constituído pelos domínios CH1, CH2, CH3 e CH4 opcionalmente em que a região constante de imunoglobulina compreende adicionalmente uma região da dobra.
15. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado por a região constante da imunoglobulina ser selecionada do grupo constituído por regiões constantes derivadas de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, suas combinações e seus híbridos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região constante de imunoglobulina ser selecionada do grupo constituído pelas regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, suas combinações e seus híbridos, opcionalmente em que a região constante de imunoglobulina é uma região Fc da IgG4 e opcionalmente em que a região constante de imunoglobulina é uma região Fc da IgG4 humana aglicosilada.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo fisiologicamente ativo ser selecionado do grupo constituído pela hormônio do crescimento humano, hormônios libertadoras da hormônio do crescimento, peptídeos libertadores da hormônio do crescimento, Interferon, receptores de Interferon, fatores estimulantes de colônias, peptídeos semelhantes ao glucagon (GLP-1, etc.), oxintomodulina, receptores acoplados à proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteínas de ligação a interleucinas, proteínas de ligação a citoquinas, fatores de ativação de macrófagos, peptídeos de macrófagos, fatores de células B, fatores de células T, proteína A, inibidores de alergia, glicoproteínas de necrose celular, imunotoxinas, linfotoxinas, fator de necrose tumoral, supressores de tumor, fator de crescimento transformador, α1-antitripsina, albumina, α-lactoalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina, eritropoietina glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeos de ativação do receptor da trombina, trombomodulina, fatores de coagulação VII, VIIa, VIII, IX e XIII, ativadores do plasminogênio, peptídeos de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína C reativa, inibidor da renina, inibidor da colagenase, superóxido-dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína de estimulação óssea, calcitonina, insulina, atriopeptina, fator de indução de cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor da via do fator tecidular, hormônio foliculostimulante, hormônio luteinizante, hormônio libertadora da hormônio luteinizante, fatores do crescimento nervoso, hormônio paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante à insulina, hormônio adrenocortical, glucagon, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo libertador de gastrina, fator de libertação da corticotropina, hormônio estimulante da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, Antígenos da superfície celular, Antígenos de vacinas derivados de vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos opcionalmente em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é insulina.
18. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado por no passo (1), o polipeptídeo fisiologicamente ativo e o polímero não peptídico serem feitos reagir um com o outro em uma razão molar de 1:1 a 1:20 sob condições de pH 5,0 a 6,5, e no passo (2), a mistura reacional do passo (1) e a região constante de imunoglobulina serem feitas reagir uma com a outra em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10, sob condições de pH 6,0 a 8,5, na presença do sal, em que se o sal for cloreto de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 3,0 M, se o sal for acetato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 2,5 M, se o sal for sulfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,7 M, se o sal for fosfato de sódio, este pode ser adicionado em uma concentração final inferior a 0,8 M, ou se o sal for cloreto de potássio, este pode ser adicionado em uma concentração final de 1,0 M ou menos.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo fisiologicamente ativo ser a insulina e o polímero não peptídico ser o polietilenoglicol.
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