JP2016514110A - 生理活性ポリペプチド結合体の高収率生産のための改善された製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体リンカーおよび免疫グロブリン定常領域が共有結合により連結された結合体を製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、生理活性ポリペプチド結合体の製造時にカップリング反応に塩を使用することにより、製造収率が低いという問題点を改善し、効率的に生理活性ポリペプチド結合体を製造する方法に関する。本発明の製造方法により、高純度及び高収率で生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリン定常領域結合体を製造することができ、これを用いて製造した生理活性ポリペプチド結合体は、製造コストが削減され、産業性を高めて患者の服薬順応度を高める生理活性ポリペプチドの持続型製型の開発に有効に利用することができる。

Description

本発明は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体リンカーと免疫グロブリン定常領域が共有結合により連結された結合体を製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、生理活性ポリペプチド結合体の製造の際、カップリング反応に塩を使用することによって、製造収率が低いという問題点を改善し、効率的に生理活性ポリペプチド結合体を製造する方法に関する。

一般に、生理活性ポリペプチドは、安定性が低いため容易に変性し、血液内のタンパク質加水分解酵素により分解され、腎臓や肝臓を通じて容易に除去されるため、薬理成分として生理活性ポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度および力価を維持するためには、タンパク質の薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、大部分が注射剤の形で患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、生理活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことは、患者に多大な苦痛をもたらし、高額な治療費の原因となる。このような問題を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を高め、血中の薬物濃度を長時間高く持続させることにより薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなタンパク質薬物の持続型製剤は、タンパク質薬物の安定性を高めると共に、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。

タンパク質を安定化させ、タンパク質加水分解酵素との接触および腎臓の消失を抑制するための方法として、従来は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：以下「ＰＥＧ」と略す）のように溶解度の高い高分子をタンパク質薬物の表面に化学的に付加する方法が使用されてきた。ＰＥＧは、目的タンパク質の特定部位または様々な部位に非特異的に結合して溶解度を高めることによりタンパク質を安定化させ、タンパク質の加水分解を防止するのに効果があり、特別な副作用も起こさないことが知られている（非特許文献１）。

しかし、ＰＥＧを利用する方法は、ＰＥＧの分子量を増加させてペプチド薬物の生体内持続時間を延長することができる一方、分子量が増加するほどペプチド薬物の力価が顕著に低くなり、また、ペプチドとの反応性が低くなって収率が減少するという問題がある。

また、免疫グロブリン断片と生理活性ポリペプチドの融合タンパク質を製造する方法は、低いペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）収率の問題と非特異性を克服することができる一方で、血中半減期の延長効果が予想した程画期的なものではなく、場合によっては力価が低いという問題を有している。血中半減期の延長効果を極大化するために、様々な種類のペプチドリンカーが使用されるが、免疫反応を誘発する可能性がある。また、ＢＮＰのようにジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を有しているペプチドを用いる場合ミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）の確率が高く適用が困難であるという問題、および天然に存在しないアミノ酸残基がある場合には、遺伝子組換えの形での生産が不可能であるという問題がある。

インスリンは、ヒトの膵腸のベータ細胞から分泌されるペプチドであり、体内の血糖を調節するのに非常に重要な役割を果たす物質である。このようなインスリンが十分に分泌しなかったり、または分泌したインスリンが体内で十分に作用し得ない場合、体内の血糖が調節されずに上昇するが、このような状態を糖尿病と言う。先に言及した場合を第２型糖尿病と言い、膵腸からインスリンが分泌されず、血糖値が上昇する場合を第１型糖尿病と言う。第２型糖尿病の場合、化学物質を主成分とする経口用血糖降下剤用いて治療を行うが、一部の患者にはインスリンを用いて治療する。一方、第１型糖尿病の場合には、インスリンの投与が必須で要求される。

現在、多く用いられているインスリン治療法は、食前、食後に注射でインスリンを投与する方法である。しかし、このようなインスリン治療法は、一日に３回ずつ持続的に投与しなければならないため、患者に多大な苦痛と不便さをもたらす。このような問題を克服するために様々な試みがなされてきたが、そのうちの一つとしてペプチド薬物の生体膜透過度を増加させ、口腔または鼻腔を通じた吸入によりペプチド薬物を体内に伝達する試みがあった。しかし、このような方法は、注射剤に比べてペプチドの体内伝達効率が顕著に低いため、ペプチド薬物の体内活性を、要求される条件で維持するには依然として多くの困難がある。

また、過量の薬物を皮下に投与した後、吸収を遅延させる方法があり、これにより一日に一回の投与で持続的な血中濃度を維持する方法があった。そのうちの一部は、医薬品（例えば、Ｌａｎｔｕｓ、Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）として許可され、現在患者に投与されている。また、インスリンに脂肪酸を修飾してインスリン重合体の結合を強くし、投与部位および血中のアルブミンと結合して持続時間を増やす研究が進められており、そのうちの一部は、医薬品（例えば、Ｌｅｖｅｍｉｒ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）として許可されている。しかし、このような方法は、投与部位に疼痛が生じるという副作用があり、注射による投与の間隔が一日一回と、依然として患者にとっては大きな負担となっている。

このような問題を解決するために、本発明者らは、インスリンをはじめとした生理活性ポリペプチドの血中半減期の延長および生体内の活性維持を同時に極大化しうる方法として、非ペプチド性重合体をリンカーとして用い、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域を含む結合体が製造されている。しかし、結合体を構成する原料物質の単価が高価であるため、前記結合体を高収率および高純度で製造する方法が依然として切実に求められている。このような背景の下で、本発明者らは、結合体の製造における反応のうち、カップリング工程での反応溶液に適切な種類および濃度の塩を用いると、高収率および高純度で生理活性ポリペプチド結合体の製造が可能となり、製造費用も節減することができることを確認し、本発明を完成した。

国際公開第９７／３４６３１号 国際公開第９６／３２４７８号

Ｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７１：１３７−１３９，１９９１ Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、ＲＬＨｉｌｌ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７９

本発明の目的は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体リンカーおよび免疫グロブリン定常領域が共有結合により連結された結合体の製造時、製造収率が低いという問題点を改善する効率的な製造方法を提供することにある。

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、（１）非ペプチド性重合体を、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のいずれか一方と反応させる工程と、（２）塩の存在下で、前記工程（１）の反応混合物を、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のいずれか他方と反応させる工程を含む、生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリン定常領域結合体の製造方法を提供する。

好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれ独立してアルデヒド誘導体、マレイミド誘導体およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される官能基を有することができる。

より好ましくは、非ペプチド性重合体は、前記両末端の官能基を介して生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域とそれぞれ共有結合で連結することができる。
好ましくは、前記工程（１）の後に、反応混合物から生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体または免疫グロブリン定常領域−非ペプチド性重合体の連結体を分離する工程をさらに含むことができる。

好ましくは、前記塩は、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）または硝酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）からなる群から選択されるものであってもよい。

より好ましくは、前記塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および塩化カリウムからなる群から選択されるものであってもよい。
好ましくは、前記塩は、０．１〜３．０Ｍの最終濃度で添加することができる。

より好ましくは、前記塩は、０．３〜２．５Ｍの最終濃度で添加することができる。
好ましくは、前記塩が塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムである場合０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加することができる。

好ましくは、前記工程（２）の反応時間は４〜１８時間であってもよい。
好ましくは、前記工程（２）の反応温度は、０〜２５℃であってもよい。
好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、一つ以上のアルデヒド誘導体を官能基として有する場合、反応混合物に、さらに還元剤を１〜１００ｍＭの最終濃度で含むことができる。

好ましくは、前記工程（１）は、ｐＨ５．０〜６．５で工程（２）はｐＨ６．０〜８．５の条件で行うことができる。
好ましくは、前記工程（１）で非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドと反応させ、工程（２）で工程（１）の反応混合物を免疫グロブリン定常領域と反応させることができる。

好ましくは、前記工程（１）は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体を１：１〜１：２０のモル比で反応させ、工程（２）は、工程（１）の生成物と免疫グロブリン定常領域を１：０．５〜１：１０のモル比で反応させるものであってもよい。

より好ましくは、前記工程（２）は、塩が塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合は０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加して行うことができる。

好ましくは、前記非ペプチド性重合体の官能基は、それぞれ生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域のＮ末端アミン基またはＬｙｓ残基側鎖のアミン基に結合してもよい。

好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＧＡ）、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。

より好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであってもよい。
好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、分子量が１〜１００ｋＤａの範囲のものであってもよい。

好ましくは、前記免疫グロブリン定常領域は、非グリコシル化したものであってもよい。
好ましくは、前記免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインからなる群から選択される１個〜４個のドメインからなるものであってもよい。

好ましくは、前記免疫グロブリン定常領域は、ヒンジ領域をさらに含んでもよい。
好ましくは、免疫グロブリン定常領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）およびこれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）による定常領域からなる群から選択されるものであってもよい。

好ましくは、前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせおよびこれらのハイブリッドによる定常領域からなる群から選択されるものであってもよい。

より好ましくは、前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であってもよい。
より好ましくは、前記免疫グロブリン定常領域は、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であってもよい。

好ましくは、前記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン−様ペプチド（ＧＬＰ−１など）、オキシントモジュリン、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液凝固第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片からなる群から選択されるものであってもよい。

より好ましくは、前記生理活性ポリペプチドは、インスリンであってもよい。
好ましくは、工程（１）は、ｐＨ５．０〜６．５の条件で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体を１：１〜１：２０のモル比で反応させる工程であり、工程（２）は、塩の存在下で、ｐＨ６．０〜８．５の条件で前記工程（１）の反応混合物を免疫グロブリン定常領域と１：０．５〜１：１０のモル比で反応させる工程であり、前記塩は、塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合は０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加したものであってもよい。

本発明の製造方法により、高純度および収率で生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリン定常領域結合体を製造することができ、これを用いて製造した生理活性ポリペプチド結合体は、製造コストが削減され、産業性を高めて患者の服薬順応度を高める生理活性ポリペプチドの持続型剤型の開発に有効に利用することができる。

実施例２と３のカップリング反応溶液をＳｏｕｒｃｅ １５Ｑカラムで精製したプロファイルを示した図である。反応していない免疫グロブリンＦｃ、持続型インスリン結合体（インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体）および不純物の含有量を比較することができる。

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、（１）非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のいずれか一方と反応させる工程と（２）塩の存在下で、前記工程（１）の反応混合物を生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のいずれか他方と反応させる工程を含む生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリン定常領域結合体の製造方法を提供する。

前記工程（１）は、非ペプチド性重合体の生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域を結合させる工程であって、非ペプチド性重合体に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域を結合させるために用いられる公知の方法を利用することができ、例えば、０〜２５℃で１〜１６時間反応させることによって達成することができる。好ましくは、前記反応により生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域に１つの非ペプチド性重合体が官能基を介して共有結合することができる。このとき、前記反応に参与する官能基の種類に応じて、１〜２０ ｍＭの還元剤をさらに含んで行うことができる。

前記非ペプチド性重合体は、これに含まれる官能基を介して、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域とそれぞれ共有結合で連結することができる。好ましくは、前記非ペプチド性重合体の官能基は、それぞれ生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域のＮ末端アミン基またはＬｙｓ残基側鎖のアミン基に結合することができる。この時、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域上でＬｙｓ残基の位置は、特定の位置に限定されない。前記Ｌｙｓ残基は、天然型Ｌｙｓに限定されるものではなく、非ペプチド性重合体の官能基と連結しうるアミン基を含むものであれば、非天然型アミノ酸およびＬｙｓ誘導体を非限定的に含む。

前記反応混合物は、反応生成物である非ペプチド性重合体と生理活性ポリペプチドとの連結体または非ペプチド性重合体と免疫グロブリン定常領域との連結体および／または反応しない反応混合物を含むことができる。従って、工程（１）の後に、反応混合物から生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体または免疫グロブリン定常領域−非ペプチド性重合体の連結体を分離する工程をさらに含むことができる。

本発明において、「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合により相互に連結される。本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＧＡ）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができ、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。当該分野において知られているこれらの誘導体および当該分野の技術レベルで容易に製造することができる誘導体も本発明の範囲に含まれる。

従来のインフレーム融合（ｉｎｆｒａｍｅ ｆｕｓｉｏｎ）の方法で製造された融合タンパク質で使用されたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の延長効果は期待した程得ることができないことである。しかし、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を使用してキャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。従って、本発明で使用することのできる非ペプチド性重合体は、前記のような役割を果たすことができるもの、すなわち、生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば限定されることなく使用できる。非ペプチド性重合体は、分子量が１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲であることが好ましい。また、生理活性ポリペプチドと結合される本発明の非ペプチド性重合体は、一種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせを使用してもよい。

本発明で使用される非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域および蛋白質薬物と結合する官能基を有する。
好ましくは、前記非ペプチド性重合体は、生理活性ポリペプチドのアミノ酸残基側鎖のアミン基またはチオール基とペプチド、ヘミチオアセタール（ｈｅｍｉｔｈｉｏａｃｅｔａｌ）、イミン（ｉｍｉｎｅ）またはチオジオキソピロリジニル（ｔｈｉｏｄｉｏｘｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）結合を形成することができる。

前記非ペプチド性重合体の末端官能基の例としては、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などのアルデヒド誘導体、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）誘導体およびスクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）誘導体などがある。前記スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルカルボキシメチル、吉草酸スクシンイミジル、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドリン、またはスクシンイミジルカーボネートが用いられるが、これらに限定されるものではなく、免疫グロブリンＦｃ領域と生理活性ポリペプチドのアミノ酸残基のアミン基またはチオール基と選択的に共有結合を形成する官能基を制限なく使用することができる。

前記非ペプチド性重合体の末端官能基は、互いに同一であっても、または異なっていてもよい。たとえば、一方の末端にはスクシンイミド基を、他方の末端には、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基などのアルデヒド誘導体を有することができる。両末端に官能基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として利用する場合には、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前記多様な官能基で活性化したり、商業的に入手可能な改変された官能基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明のタンパク質結合体を製造することができる。

好ましくは、非ペプチド性重合体は、官能基として両末端にプロピオンアルデヒド基を有することができる。
従来、タンパク質持続型製剤を製造するためにＰＥＧを結合させることは、タンパク質の安定性は高めることができるという長所があるが、ＰＥＧの分子量が増加するほど、タンパク質との反応性が低くなり、収率が減少するという問題がある。製造の収率は、製造コストとそれに伴う産業性と密接な関係があるので、収率を向上させることは非常に重要である。アルデヒド官能基を含むＰＥＧは、ポリペプチドのＮ末端アミン基またはＬｙｓ残基Ｒ基のアミン基に結合することができ、ＰＥＧとタンパク質のモル比、反応溶液の濃度、時間、ｐＨ、温度などを調節することにより、ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）反応収率が変化しうる。

しかし、ＰＥＧをはじめとする２つ以上の官能基を有する非ペプチド性重合体を、互いに異なるポリペプチド間のリンカーとして使用する場合は、２回以上の反応工程を経ており、全体的に低い収率を示す。特に、２次反応工程（二つ以上の官能基を有する非ペプチド性重合体が連結された生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域をそれぞれ免疫グロブリン定常領域または生理活性ポリペプチドと反応させる工程、以下「カップリング反応」）では、二つ以上の官能基を有する非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域と反応させる１次反応工程より顕著に低い収率を示すころが観察された。

本発明者は、カップリング反応の工程で、塩の添加と反応収率との相関性を見出し、塩を使用することによりカップリング反応の収率が向上することを確認した。
本発明における塩とは、同数（電子価を考慮）の陰イオンと陽イオンが電気的に結合して中性の有効荷電を有するイオン性物質であって、水溶液上でそれぞれ陽イオンと陰イオンに解離する化合物を意味し、本発明の目的上、非ペプチド性重合体と生理活性ポリペプチドの連結体または、非ペプチド性重合体と免疫グロブリン定常領域の連結体が、れぞれ免疫グロブリン定常領域または生理活性ポリペプチドと共有結合されるようにするために、反応溶液に含ませることができる。一般に、塩を形成する陽イオンは、アンモニウム（ＮＨ_４ ^＋）、カルシウム（Ｃａ_２ ^＋）、鉄（Ｆｅ_２ ^＋またはＦｅ_３ ^＋）、マグネシウム（Ｍｇ_２ ^＋）、カリウム（Ｋ^＋）、ピリジニウム（Ｃ_５Ｈ_５ＮＨ^＋）、第４級アンモニウム（ＮＲ_４ ^＋）またはナトリウム（Ｎａ^＋）であってもよく、陰イオンは、 アセテート（ＣＨ_３ＣＯＯ⁻）、カーボネート（ＣＯ_３ ^２−）、クロリド（Ｃｌ⁻）、クエン酸塩（ＨＯＣ（ＣＯＯ⁻）（ＣＨ_２ＣＯＯ⁻）_２）、シアン化物（ＣＮ⁻）、硝酸塩（ＮＯ_３ ⁻）、亜硝酸塩（ＮＯ_２ ⁻）、リン酸塩（ＰＯ_４ ^３−）または硫酸塩（ＳＯ_４ ^２−）であってもよい。前記塩は、前述の陽イオン種と陰イオンの組み合わせで形成されるものであってもよい。前記塩は、当業界において通常に使用される塩をいずれも使用することができ、これに限定されるものではないが、好ましくは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シアン化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、炭酸カリウム、シアン化カリウム、クエン酸カリウム、硝酸カリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、シアン化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、シアン化アンモニウム、クエン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、シアン化カルシウム、クエン酸カルシウムまたは硝酸カルシウムであってもよい。より好ましくは、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、または塩化カリウムであってもよい。前記塩は、生理活性ポリペプチドの種類と反応溶媒に応じて適合した塩を自由に選択することができる。

前記塩は、一つの官能基を介して、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域が結合された非ペプチド性重合体が、他の一つの官能基を介してそれぞれ免疫グロブリン定常領域または生理活性ポリペプチドと効率的に結合することができるように、反応溶液に含ませることができる。非ペプチド性重合体の連結反応収率を高めるために添加される塩の最終濃度は、比較的高い濃度で、例えば、３．０Ｍ未満で付加することができる。塩の濃度の下限値は、当業者が反復実験によって決定することができ、例示の目的で、適切な塩の濃度範囲を提示すると、カップリング反応の際に０．１〜３Ｍの最終濃度で含むことができ、より具体的には、０．３〜２．５Ｍの最終濃度で含むことができる。

好ましくは、前記塩が塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満の最終濃度で、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満の最終濃度で、硫酸ナトリウムの場合０．７Ｍ未満の最終濃度で、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満の最終濃度で、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加することができる。塩の種類によっては前記濃度を超えると収率は上昇するが、凝集が生じることがあり好ましくない。凝集が生じても結合体の製造は可能であるが、工程上の困難をきたすことがあり、工程を容易にするために、過度の凝集を誘発しない、つまり、凝集が生じないかまたは生じても、ごくわずかに形成される程度の濃度で塩を添加することが好ましい。例えば、塩の付加により連結反応の際に凝集が生じても、製造工程全体の収率が塩付加以前よりも上昇するならば、その程度の凝集は、分離および／または精製上に深刻な問題をきたさない限り、許容される。

本発明の具体的な実施例では、インスリン、２つのアルデヒド基を官能基として含むＰＥＧリンカーおよび免疫グロブリン定常領域が連結された結合体の製造時、収率を向上させるために塩を様々な条件で使用して反応を行ったが、カップリング反応を行うなかで、塩を使用することにより収率が向上することを確認した（表１）。また、本発明者は、このような塩の添加によるカップリング反応の収率向上が、副反応として生成される不純物、例えば、一つの免疫グロブリン定常領域上の２つのＮ末端が互いに異なる２つのインスリン−ＰＥＧ連結体に結合して形成される多量体の生成を抑制することにより達成されることを確認した（図１）。

本発明において、カップリング反応、すなわち、前記工程（２）の反応は、好ましくは、４〜１８時間行うことができる。また、前記カップリング反応は、０〜２５℃で行うことができるが、前記反応条件に限定されるものではない。

本発明において、非ペプチド性重合体が官能基としてアルデヒド誘導体を一つ以上含む場合、反応混合物は、最終濃度１〜１００ｍＭの還元剤をさらに含むことができる。
本発明における還元剤とは、非ペプチド性重合体の官能基であるアルデヒドとポリペプチド（生理活性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域）のアミン基が結合して生成される可逆的イミンの二重結合を還元させることによって共有結合を生成させうる、当該分野において公知の全ての還元剤を意味し、本発明の目的上、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域と共有結合することができるように、反応溶液に含むことができる。前記還元剤は、当業界において通常に用いられる還元剤を全て使用することができ、これに限定されないが、好ましくは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）、ボラン−ピリジンコンプレックス（Ｂｏｒａｎｅ ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）、ボラン−ジメチルアミンコンプレックス（Ｂｏｒａｎｅ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、ボラン−トリメチルアミンコンプレックス（Ｂｏｒａｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）またはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｒｉａｃｅｔｏｘｙｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）であってもよい。前記還元剤は、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域の種類と反応溶媒に応じて適合した還元剤を自由に選択することができる。

前記還元剤は、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域と非ペプチド性重合体間の連結のため反応溶液に含まれるものであり、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体または免疫グロブリン定常領域と非ペプチド性重合体間の連結反応（工程（１）の反応）時、１〜２０ｍＭ、カップリング反応（工程（２）の反応）：１〜１００ｍＭで含むことができる。

好ましくは、工程（１）は、ｐＨ５．０〜６．５で、工程（２）はｐＨ６．０〜８．５の条件で行うことができる。また、それぞれクエン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムまたはＨＥＰＥＳを用いてイオン強度を２０〜５００ｍＭに調節した条件で行うことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の具体的な実施例では、両末端にそれぞれプロピオンアルデヒドを官能基として含むＰＥＧを非ペプチド性重合体として用い、生理活性ポリペプチドとしてインスリンと反応させることによってＰＥＧ−インスリン連結体を製造した後、塩の存在下において免疫グロブリン定常領域とのカップリング反応を行い、インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリン定常領域結合体を製造した。

前述したように、前記非ペプチド性重合体との結合は、非ペプチド性重合体の官能基と生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のＮ末端アミン基またはこれらを構成するアミノ酸残基の側鎖に含まれたアミン基またはチオール基を介して行われる。一方、免疫グロブリン定常領域は２つのＮ末端を有するため、一つの免疫グロブリン定常領域が同じ非ペプチド性重合体分子上の２つの官能基を介して結合するか、または互いに異なる２つの非ペプチド性重合体の分子上の官能基に、それぞれ結合することができる。しかし、本発明に係る製造方法によって生成された結合体は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体および免疫グロブリン定常領域の各１分子が互いに結合された、すなわち、１つの非ペプチド性重合体の両末端にそれぞれ生理活性ポリペプチド１分子および免疫グロブリン定常領域１分子が結合された形態であることが望ましい。一方、１つの免疫グロブリン定常領域が同じ非ペプチド性重合体分子上の２つの官能基を介して結合した場合、非ペプチド性重合体の両末端の官能基がいずれも免疫グロブリン定常領域と結合して生理活性ポリペプチドとのカップリング反応がなされないことがあり、互いに異なる２つの非ペプチド性重合体の分子上の官能基に、それぞれ結合された場合には、類似した二量形態の多量体が形成されることもある。

従って、本発明の一実施形態では、工程（１）で非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドと反応させ、工程（２）で工程（１）の反応混合物を、免疫グロブリン定常領域と反応させることができる。非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドと先に反応させて生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体を形成した後、免疫グロブリン定常領域とカップリング反応を行うと、免疫グロブリン定常領域と非ペプチド性重合体を先に反応させたときに示される現象である１つの免疫グロブリン定常領域が１つの非ペプチド性重合体の両末端の官能基と全て結合した形態の連結体が形成されることを防ぐことができる。

前記実施形態の具体的な事例において、工程（１）は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体を１：１〜１：２０のモル比で反応させ、工程（２）は、工程（１）生成物である生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の連結体と免疫グロブリン定常領域を１：０．５〜１：１０のモル比で反応させることが好ましいが、これに限定されるものではない。

より具体的には、前記工程（２）は、塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加して行うことができる。しかし、前記塩の種類および濃度に限定されるものではなく、反応混合物において工程を阻害する程度に過度な凝集を誘発しない限り、様々な種類の塩を様々な濃度で添加して行うことができ、塩が付加されない場合に許容可能なものとして認められる程度の凝集レベルに相当する凝集を誘発する濃度の塩を用いることができる。

より具体的には、工程（１）は、ｐＨ５．０〜６．５の条件で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体を１：１〜１：２０のモル比で反応させる工程であり、工程（２）は、塩の存在下で、ｐＨ６．０〜８．５の条件で、前記工程（１）の反応混合物を、免疫グロブリン定常領域と１：０．５〜１：１０のモル比で反応させる 工程であり、前記塩は、塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合、１．０Ｍ以下の最終濃度で添加されるものであってもよい。

前記工程（１）は、生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体を製造するための反応であり、その後に前記生成物を精製する工程をさらに行うことができる。前記工程（２）は、工程（１）の生成物である生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体を免疫グロブリン定常領域と反応させて生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリン定常領域の結合体を製造するための反応であり、前記のように反応条件および反応物のモル比を調整し、改善された収率で結合体を製造することができる。

本発明における「生理活性ポリペプチド」とは、生体内において何らかの生理作用を有するポリペプチドを総称する概念であり、ポリペプチドの構造を有するという共通点を有し、多様な生理活性を有する。前記生理活性ポリペプチドは、遺伝表現と生理機能を調整し、生体内において機能の調節に関与する物質の欠乏や過度な分泌により異常病態を示すとき、これを正す役割を果たすものであり、一般的なタンパク質治療剤を含むことができる。

生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン−様ペプチド（ＧＬＰ−１など）、オキシントモジュリン、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、 α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液凝固第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体と抗体断片からなる群から選択されるものであってもよい。好ましくは、前記生理活性ポリペプチドは、インスリンであるが、これに限定されるものではない。

本発明の実施例で使用されたインスリンは、体内の血糖値が高いときに膵臓から分泌され、肝臓、筋肉、脂肪組織から糖を吸収してグリコーゲンとして貯蔵するようにさせ、脂肪を分解してエネルギー源として使用されることを抑制し、血糖を調節する機能を有する生理活性ペプチドの一種である。構造的な面においてインスリンは、アルファチェーンおよびベータチェーンを含む。前記インスリンアルファチェーンおよびインスリンのベータチェーンという用語は、それぞれインスリンＡチェーンおよびインスリンＢチェーンと混用して使用することができる。このようなペプチドは、インスリンアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）、前駆物質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、 誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）などを含み、好ましくは、天然型インスリン、速効性インスリン、持続型インスリンなどであってもよい。

天然型インスリンは、膵臓から分泌されるホルモンであり、一般に細胞内グルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制して体内の血糖を調節する役割を果たす。インスリンは血糖の調節機能のないプロインスリン（Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ）前駆体の形態からプロセシングを経て、血糖調節の機能を有するインスリンとなる。インスリンのアミノ酸配列は、下記の通りである。

−アルファチェーン：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号１）
−ベータチェーン：
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）
インスリンアゴニストは、インスリンの構造に関係なく、インスリンの生体内受容体に結合し、インスリンと同一の生物学的活性を示す物質を意味する。

インスリン誘導体は、天然型インスリンと比較した時、少なくとも８０％以上のアミノ酸配列で相同性を示し、アミノ酸残基の一部の基が、化学的に置換（例えば、α−メチル化、α−ヒドロキシル化）、除去（例えば、脱アミノ化）または修飾（例えば、Ｎ−メチル化、グリコシル化、脂肪酸）された形態であってもよく、体内での血糖を調節する機能を有するペプチドを意味する。

インスリン断片は、インスリンのＮ末端またはＣ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が付加または削除された形態を意味し、付加されたアミノ酸は、天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよく、このようなインスリン断片は、体内で血糖調節の機能を有する。

インスリン変異体は、インスリンとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであり、体内で血糖調節の機能を有するペプチドを意味する。
また、インスリンアゴニスト、誘導体、断片、および変異体においてそれぞれ使用された製造方法は、独立して使用することができ、組み合わせも可能である。たとえば、本発明のインスリンペプチドは、天然型インスリンとアミノ酸配列が一つ以上異なり、Ｎ末端アミノ酸残基が脱アミノ化され、体内で血糖調節の機能を有するペプチドも含まれる。

本発明における「免疫グロブリン定常領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）と軽鎖定常領域（ＣＬ）を除いた、重鎖定常領域２（ＣＨ２）と重鎖定常領域３（ＣＨ３）（または重鎖定常領域４（ＣＨ４）を含む）の部分を含むＦｃ断片を意味し、重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリン定常領域は、天然型と実質的に同等または向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域のみを除き、一部または全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む拡張された免疫グロブリン定常領域であってもよい。また、ＣＨ２および／またはＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン定常領域は、（１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメイン、（２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、（３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、（４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、（５）１つまたは２つ以上の定常領域ドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、（６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。

免疫グロブリンＦｃ断片をはじめとした定常領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ断片は、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製、および収率の面で有利なだけでなく、アミノ酸配列が抗体毎に異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるので、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性も低くなるという効果も期待できる。

一方、免疫グロブリン定常領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、好ましくは、ヒト起源である。また、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）もしくはそれらの混成（ｈｙｂｒｉｄ）による定常領域からなる群から選択されてもよい。好ましくは、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させるものとして公知のＩｇＧ由来であってもよい。

本発明における「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成する際に、同一起源の短鎖免疫グロブリン定常領域（好ましくは、Ｆｃ領域）をコードするポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドとの結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ ＦｃおよびＩｇＥ Ｆｃ断片からなる群から選択される２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。

本発明において、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、短鎖の免疫グロブリン定常領域（好ましくは、Ｆｃ領域）内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリン定常領域に相当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、種々の形態のハイブリッドが可能である。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ ＦｃおよびＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる群から選択される１個〜４個のドメインからなるハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。

ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせ、またはこれらの混成化も可能である。好ましくは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスであり、最も好ましくは、補体依存毒性（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のようなエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよい。

また、免疫グロブリン定常領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリン定常領域糖鎖の増減または除去には化学的方法、酵素学的方法および微生物を利用した遺伝子工学的方法などの通常の方法を用いることができる。ここで、免疫グロブリン定常領域から糖鎖が除去された免疫グロブリン定常領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が顕著に低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または除去されるため、生体内での不必要な免疫反応を誘発しない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より符合する形は、糖鎖が除去または非グリコシル化された免疫グロブリン定常領域であると言える。従って、さらに好ましくは、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域を使用することができる。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体で抗原として作用し、これに対する新しい抗体を生成するなどの望ましくない免疫反応を引き起こす非−ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましいことができる。

また、本発明の免疫グロブリン定常領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列誘導体（ｍｕｔａｎｔ）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより相違する配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られた２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が改変のために適当な部位として利用することができる。また、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されるか、または天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ部位が除去されることもできる。このような免疫グロブリン定常領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献１、特許文献２などに開示されている。

分子の活性を全体的に変化させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知である（非特許文献２）。最も通常に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミル化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などにより修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。

上述の免疫グロブリン定常領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン定常領域と同様の生物学的活性を示すが、免疫グロブリン定常領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体であってもよい。また、このような免疫グロブリン定常領域は、ヒトおよび牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内で分離した天然型からも得られ、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、免疫グロブリン全体をヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合には、ＦａｂおよびＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃおよびＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。

好ましくは、ヒト由来の免疫グロブリン定常領域を微生物から得た組換え型免疫グロブリン定常領域であってもよい。

以下、下記の実施例により本発明をより詳しく説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるわけではない。
実施例１：インスリンのペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）反応およびモノペグ化したインスリンの精製
インスリン粉末を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解した後、３．４Ｋ ｐｒｏｐｉｏｎ−ＡＬＤ２ ＰＥＧ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を１つずつ有しているＰＥＧ、韓国ＩＤＢ社）を、インスリンベータチェーンのＮ末端にペグ化させるために、インスリン：ＰＥＧのモル比を１：４で、インスリン濃度を５ｍｇ／ｍｌで４℃にて約２時間反応させた。この時、反応は５０ｍＭのクエン酸ナトリウム ｐＨ６．０、４５％のイソプロパノールで行われ、３．０ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤を添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％のＥｔＯＨが含まれたバッファーとＫＣｌの濃度勾配を利用したＳＰ−ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して精製した。

実施例２：塩を添加ないカップリング反応による結合体の製造
インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体を製造するために、実施例１の方法を用いて得たモノペグ化した（ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）インスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２となるようにし、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１３時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭのリン酸カリウム、１０％のエタノール、ｐＨ ８．２であり、還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

反応が終結した後、反応液は、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーとＮａＣｌ濃度勾配を利用し、反応していないインスリン、反応していない免疫グロブリンＦｃ断片、インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ断片結合体、モノペグ化したインスリン（インスリン−ＰＥＧ）が２つ以上結合した免疫グロブリンＦｃ断片結合体を分離精製した。この時、プロファイル上で不純物の含有量を確認した（図１）。

その後、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２次カラムとして使用し、残留した免疫グロブリンＦｃおよびマルチカップリングされたインスリン結合体を除去し、インスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を得た。このとき、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）が含まれた硫酸アンモニウムの濃度勾配を利用して溶出した。溶出されたインスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＩＥ−ＨＰＬＣを使用して分析した。

実施例３：塩化ナトリウム化添加によるカップリング反応収率の向上
塩化ナトリウムの添加がカップリング反応の収率に及ぼす影響を観察するために、実施例１の方法を用いて得たモノペグ化したインスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２となるようにし、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１３時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭのリン酸カリウム、１０％のエタノール、ｐＨ８．２であり、最終濃度０．５〜３．０Ｍになるように塩化ナトリウムを添加した。また、還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

実施例２に記載されたものと同様に反応液を精製して分析した。カップリング溶液に塩化ナトリウムを添加した場合、添加していない場合よりもカップリング収率が向上され、このような効果は、塩化ナトリウムを最終濃度２．０Ｍで添加した場合、最も顕著に示されることを確認した（表１）。このとき、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑプロファイルを観察した結果、収率が向上した分だけ、副反応による不純物が減少したことを確認することができた（図１）。また、２．０Ｍの塩化ナトリウムを添加してカップリングを進めた場合、純度９５％以上の高純度でインスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造することができることを確認した（表２）。一方、塩化ナトリウムを最終濃度３．０Ｍで添加した場合、凝集が観察され始めた。

実施例４：酢酸ナトリウムの添加によるカップリング反応収率の向上
酢酸ナトリウムの添加がカップリング反応収率に及ぼす影響を観察するために、実施例１の方法を用いて得たモノペグ化したインスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２となるようにし、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１３時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭのリン酸カリウム、１０％のエタノール、ｐＨ８．２であり、最終濃度１．５〜３．０Ｍになるようにナトリウム酢酸を添加した。また、還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

実施例２に記載されたものと同様に反応液を精製して分析した。カップリング溶液に酢酸ナトリウムを添加した場合、添加していない場合よりカップリング収率が向上し、このような効果は、酢酸ナトリウムを最終濃度１．５Ｍで添加した場合、最も顕著に示されることを確認した（表１）。また、１．５Ｍの酢酸ナトリウムを添加してカップリングを進めた場合、純度９５％以上の高純度でインスリン−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を製造することができることを確認した（表２）。一方、酢酸ナトリウムを２．５Ｍ以上の最終濃度で添加した場合、凝集のため収率算出が困難であった。

実施例５：硫酸ナトリウムの添加によるカップリング反応収率の向上
硫酸ナトリウムの添加がカップリング反応収率に及ぼす影響を観察するために、実施例１の方法を用いて得たモノペグ化したインスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２となるようにし、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１３時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭのリン酸カリウム、１０％のエタノール、ｐＨ８．２であり、最終濃度０．４〜０．７Ｍになるように硫酸ナトリウムを添加した。また、還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

実施例２に記載されたものと同様に反応液を精製して分析した。カップリング溶液に酢酸ナトリウムを添加した場合、添加しない場合よりカップリングの収率が向上したが、このような効果は、硫酸ナトリウムを最終濃度０．４Ｍで添加した場合、最も顕著に示されることを確認した（表１）。一方、硫酸ナトリウムを最終濃度０．５Ｍで添加した場合、凝集が観察され始め、０．７Ｍ以上添加した場合には、凝集のため収率を算出するのが困難であった。

実施例６：リン酸ナトリウムの添加によるカップリング反応収率の向上
リン酸ナトリウムの添加が、カップリング反応収率に及ぼす影響を観察するために、実施例１の方法を用いて得たモノペグ化したインスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２となるようにし、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１３時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭのリン酸カリウム、１０％のエタノール、ｐＨ８．２であり、最終濃度０．４〜０．８Ｍになるようにリン酸ナトリウムを添加した。また、還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

実施例２に記載されたものと同様に反応液を精製して分析した。カップリング溶液に酢酸ナトリウムを添加した場合、添加しない場合よりカップリング収率が向上し、このような効果は、リン酸ナトリウムを最終濃度０．４Ｍで添加した場合、最も顕著に示されることを確認した（表１）。一方、リン酸ナトリウムを最終濃度０．６Ｍで添加した場合、凝集が観察され始め、０．８Ｍ添加した場合、凝集のため収率を算出するのが困難であった。

実施例７：塩化カリウムの添加によるカップリング反応収率の向上
塩化カリウムの添加がカップリング反応収率に及ぼす影響を観察するために、実施例１の方法を用いて得たモノペグ化したインスリンと免疫グロブリンＦｃ断片のモル比が１：１．２となるようにし、全体のタンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１３時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２２ｍＭのカリウムリン酸、１０％のエタノール、ｐＨ８．２であり、最終濃度０．５〜１．０Ｍになるように塩化カリウムを添加した。また、還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。

実施例２に記載されたものと同様に反応液を精製して分析した。カップリング溶液に酢酸ナトリウムを添加した場合、添加していない場合よりカップリング収率が向上し、このような効果は、塩化カリウム化を最終濃度１．０Ｍで添加した場合、最も顕著に示されることを確認した（表１）。

下記の表１は、インスリンと免疫グロブリンＦｃ断片を含む結合体の製造時にカップリング反応中の塩の種類と濃度によるカップリング反応収率および総収率を示す。

前記表１で示されるように、塩の種類および濃度に応じて相異するものの、非添加対照群に比べて塩の添加群でカップリング収率は３２．３％から３５．２％〜４３．５％に増加し、総収率は１６．２％から１７．６％〜２１．８％に増加した。これを非添加対照群の収率に対する変化率に換算し、それぞれ９〜３５％の高い数値でカップリング収率および総収率の増加率を示すことを確認した。

下記表２は、インスリンと免疫グロブリンＦｃ断片を含む結合体の製造時にカップリング反応液に２．０Ｍの塩化ナトリウムまたは１．５Ｍの酢酸ナトリウムを添加して製造された場合の最終的な結合体の純度を示す。サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下ＳＥ）およびイオン交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下ＩＥ）を用いたＨＰＬＣ分析法を行って純度を二重に確認した。

Claims (30)

1. （１）非ペプチド性重合体を、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のいずれか一方と反応させる工程と、
   （２）塩の存在下で、前記工程（１）の反応混合物を、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域のいずれか他方と反応させる工程を含む、生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体−免疫グロブリン定常領域結合体の製造方法。
2. 前記非ペプチド性重合体が、両末端にそれぞれ独立してアルデヒド誘導体、マレイミド誘導体およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される官能基を有するものである、請求項１に記載の製造方法。
3. 非ペプチド性重合体が、前記両末端の官能基を介して、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域とそれぞれ共有結合で連結されるものである、請求項２に記載の製造方法。
4. 前記工程（１）の後、反応混合物から生理活性ポリペプチド−非ペプチド性重合体の連結体または免疫グロブリン定常領域−非ペプチド性重合体の連結体を分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
5. 前記塩は、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、硝酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）、塩化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、酢酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、硫酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、シアン化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｙａｎｉｄｅ）、クエン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）または硝酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ）からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の製造方法。
6. 前記塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および塩化カリウムからなる群から選択されるものである、請求項５に記載の製造方法。
7. 前記塩が、０．１〜３．０Ｍの最終濃度で添加されるものである、請求項１に記載の製造方法。
8. 前記塩が、０．３〜２．５Ｍの最終濃度で添加されるものである、請求項７に記載の製造方法。
9. 前記塩が、塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加されるものである、請求項６に記載の製造方法。
10. 前記工程（２）の反応時間が４〜１８時間である、請求項１に記載の製造方法。
11. 前記工程（２）の反応温度が、０〜２５℃である請求項１に記載の製造方法。
12. 前記非ペプチド性重合体が、１つ以上のアルデヒド誘導体を官能基として有する場合、反応混合物に、さらに還元剤を１〜１００ｍＭの最終濃度で含むものである、請求項２に記載の製造方法。
13. 工程（１）はｐＨ５．０〜６．５で、工程（２）はｐＨ６．０〜８．５の条件で行われるものである、請求項１に記載の製造方法。
14. 工程（１）において、非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドと反応させ、
    工程（２）において、工程（１）の反応混合物を免疫グロブリン定常領域と反応させるものである、請求項１に記載の製造方法。
15. 工程（１）が、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体を１：１〜１：２０のモル比で反応させ、
    工程（２）が、工程（１）の生成物と免疫グロブリン定常領域を１：０．５〜１：１０のモル比で反応させるものである、請求項１４に記載の製造方法。
16. 工程（２）が、塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加して行われるものである、請求項１５に記載の製造方法。
17. 前記非ペプチド性重合体の反応が、それぞれ生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリン定常領域のＮ末端アミン基またはＬｙｓ残基側鎖のアミン基と結合されるものである、請求項１に記載の製造方法。
18. 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＡ）、ポリ乳酸−グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ＰＬＧＡ）、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の製造方法。
19. 前記非ペプチド性重合体がポリエチレングリコールである、請求項１に記載の製造方法。
20. 前記非ペプチド性重合体が、分子量１〜１００ｋＤａの範囲のものである、請求項１に記載の製造方法。
21. 前記免疫グロブリン定常領域が、非グリコシル化されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
22. 前記免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインからなる群から選択される１個〜４個のドメインからなるものである、請求項１に記載の製造方法。
23. 前記免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ領域をさらに含むものである、請求項１に記載の製造方法。
24. 免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）およびこれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）による定常領域からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の製造方法。
25. 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせおよびこれらのハイブリッドの定常領域からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の製造方法。
26. 前記免疫グロブリン定常領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項２５に記載の製造方法。
27. 前記免疫グロブリン定常領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項２６に記載の製造方法。
28. 前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン−様ペプチド（ＧＬＰ−１など）、オキシントモジュリン、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液凝固第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、プロテインＣ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン類似成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体と抗体断片からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の製造方法。
29. 前記生理活性ポリペプチドがインスリンである、請求項２８に記載の製造方法。
30. 工程（１）が、ｐＨ５．０〜６．５の条件にて、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体とを１：１〜１：２０のモル比で反応させる工程であり、工程（２）が、塩の存在下で、ｐＨ６．０〜８．５の条件にて、前記工程（１）の反応混合物と免疫グロブリン定常領域とを１：０．５〜１：１０のモル比で反応させる工程であり、前記塩が、塩化ナトリウムである場合３．０Ｍ未満、酢酸ナトリウムである場合２．５Ｍ未満、硫酸ナトリウムの場合０．７Ｍ未満、リン酸ナトリウムである場合０．８Ｍ未満、または塩化カリウムである場合１．０Ｍ以下の最終濃度で添加されるものである、請求項１に記載の製造方法。