BR112022000760B1 - Composições, método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e conjugado de fármaco de longa duração - Google Patents

Composições, método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e conjugado de fármaco de longa duração Download PDF

Info

Publication number
BR112022000760B1
BR112022000760B1 BR112022000760-4A BR112022000760A BR112022000760B1 BR 112022000760 B1 BR112022000760 B1 BR 112022000760B1 BR 112022000760 A BR112022000760 A BR 112022000760A BR 112022000760 B1 BR112022000760 B1 BR 112022000760B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
immunoglobulin
region
factor
formula
hormone
Prior art date
Application number
BR112022000760-4A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112022000760A2 (pt
Inventor
Cheongbyeol SHIN
Dooseo JANG
Ji Hye Moon
Dong Hyun Kim
Ji Eun Lee
Original Assignee
Hanmi Pharm. Co., Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanmi Pharm. Co., Ltd filed Critical Hanmi Pharm. Co., Ltd
Publication of BR112022000760A2 publication Critical patent/BR112022000760A2/pt
Publication of BR112022000760B1 publication Critical patent/BR112022000760B1/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/321—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds
    • C08G65/325—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

composições, método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e conjugado de fármaco de longa duração. a presente invenção se refere a um método inédito para preparar um conjugado de fármaco de longa duração e um conjugado de fármaco de longa duração preparado usando o método.

Description

CAMPO DA TÉCNICA
[001] A presente invenção se refere a um intermediário inédito para preparar um conjugado de fármaco de longa duração, a uma composição incluindo o mesmo, e a um método para preparar o conjugado de fármaco de longa duração usando o mesmo.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Polipeptídeos fisiologicamente ativos são facilmente desnaturados devido à baixa estabilidade, degradados por proteases no sangue, e facilmente removidos pelos rins ou fígado. Assim, a fim de manter a concentração do sangue e titulação de um fármaco de proteína contendo um polipeptídeo fisiologicamente ativo como um componente farmacológico, o fármaco de proteína precisa ser frequentemente administrado a um paciente. Entretanto, já que a maior parte dos fármacos de proteína é administrada a pacientes na forma de uma injeção, a frequente administração por meio de injeção para manter a concentração do sangue do polipeptídeo fisiologicamente ativo causa dor severa aos pacientes e aumenta os custos para o tratamento. Para resolver estes problemas, esforços foram feitos para maximizar a eficácia de fármacos de proteína pelo aumento da estabilidade do sangue dos fármacos de proteína e manter a concentração do sangue dos mesmos em um alto nível por um longo período de tempo. Entretanto, estas formulações de longa duração de fármacos de proteína não devem induzir respostas imune em pacientes, ao mesmo tempo em que aumentam a estabilidade dos fármacos de proteína e mantêm a titulação do fármaco em um nível suficientemente alto.
[003] Como um método de estabilização de proteínas, inibição do contato com proteases, e supressão de depuração renal, um método de adição química de um polímero altamente solúvel, tal como polietileno glicol (a seguir referido como “PEG”), nas superfícies de fármacos de proteína foi convencionalmente usado. Entretanto, embora o método de uso de PEG possa estender a duração in vivo do fármaco de peptídeo pelo aumento de um peso molecular de PEG, a titulação do fármaco de peptídeo diminui significativamente à medida que o peso molecular aumenta, e um rendimento pode diminuir devido à baixa reatividade com o peptídeo.
[004] Portanto, como um método para aumentar a meia-vida sérica, um conjugado de um fragmento de imunoglobulina e um polipeptídeo fisiologicamente ativo foi usado, e vários estudos foram conduzidos para melhorar os métodos de preparação para tal (Publicação do Pedido de Patente Coreano em Aberto 10-20140109342).
[005] Em particular, há uma necessidade constantemente crescente pelo desenvolvimento de processos eficientes para preparar um conjugado de fármaco de longa duração pela simplificação do processo de preparação existente.
REVELAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[006] Um objetivo da presente invenção é prover um intermediário inédito para preparar um conjugado de fármaco de longa duração.
[007] Um outro objetivo da presente invenção é prover uma composição para preparar um conjugado de fármaco de longa duração incluindo o intermediário.
[008] Um outro objetivo da presente invenção é prover um método de preparação de um conjugado de fármaco de longa duração usando o intermediário.
[009] Um outro objetivo da presente invenção é prover um conjugado de fármaco de longa duração preparado pelo método de preparação.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[010] Um aspecto da presente invenção provê um intermediário inédito.
[011] Em uma modalidade, a presente invenção provê um composto com uma estrutura da Fórmula 1 a seguir ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: [Fórmula 1] X-L1 -(OCH2CH2)nO-L2-R em que, na Fórmula 1 exposta, X é uma região Fc de imunoglobulina; L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos.
[012] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a modalidade anterior, em que, na Fórmula 1, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1- NHCO- ou -a1-NHCO-a2-; a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 200 a 250; e R é maleimida.
[013] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de dobradiça no N-terminal.
[014] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X inclui uma sequência de dobradiça modificada para incluir apenas um resíduo de cisteína pela deleção de uma parte de uma sequência de aminoácido dos aminoácidos a seguir: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 7).
[015] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, a sequência de dobradiça inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (Ser-Cys-Pro) ou uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (Pro-Ser-Cys-Pro).
[016] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o L1 é ligado a uma amina ou grupo reativo tiol localizado em uma extremidade de X.
[017] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o composto tem uma estrutura da Fórmula 2 a seguir: [Fórmula 2] em que, na Fórmula 2, n é de 200 a 250.
[018] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM.
[019] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
[020] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina em uma forma dimérica.
[021] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
[022] No composto ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o composto tem um tamanho de 40 kDa a 250 kDa.
[023] Um outro aspecto da presente invenção provê uma composição para preparar um conjugado de fármaco de longa duração incluindo o composto, ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[024] Em uma modalidade, a composição inclui um composto da Fórmula 1 a seguir ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o fármaco é um polipeptídeo fisiologicamente ativo: [Fórmula 1] X-L1 -(OCH2CH2)nO-L2-R na Fórmula 1 exposta, X é uma região Fc de imunoglobulina; L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos.
[025] Na composição de acordo com a modalidade anterior, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-; a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 200 a 250; e R é maleimida.
[026] Na composição de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o polipeptídeo fisiologicamente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação a interleucina, proteína de ligação a citocina, fator de ativação de macrófago, peptídeo de macrófago, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor do tumor, fator de crescimento da metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX, e XIII, fator de ativação do plasminogênio, peptídeo de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora dos ossos, calcitonina, atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor de via do fator tecidual, hormônio estimulador do folículo, hormônio luteinizante, hormônio de liberação do hormônio luteinizante, fator de crescimento do nervo, hormônio da paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante a insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo de liberação da gastrina, fator de liberação da corticotropina, hormônio estimulador da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista dual GLP-1/GIP, agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos da superfície celular, antígenos de vacina derivados do vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpo.
[027] Na composição de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, R do composto da composição é ligado à cisteína do fármaco.
[028] Na composição de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
[029] Na composição de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o X é uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de dobradiça modificada para incluir apenas um resíduo de cisteína pela deleção de uma parte de uma sequência de aminoácido dos aminoácidos a seguir: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 7).
[030] Ainda um outro aspecto da presente invenção provê um método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo. .
[031] Em uma modalidade, o método de preparação inclui preparar um conjugado pela ligação de uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada, preparada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 a seguir no N-terminal de uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de dobradiça, no polipeptídeo fisiologicamente ativo: [Fórmula 3] CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R em que, na Fórmula 3, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos.
[032] No método de preparação de acordo com a modalidade anterior, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada é preparada pela ligação do ligante da Fórmula 3 exposta no N-terminal da região Fc de imunoglobulina em um pH de 4,0 a 8,0 na presença de um agente de redução.
[033] No método de preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o conjugado é preparado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada no polipeptídeo fisiologicamente ativo em um pH de 5,5 a 8,0.
[034] No método de preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, a preparação do conjugado é realizada pela reação da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada com o polipeptídeo fisiologicamente ativo em uma razão molar de 1:1 a 1:3.
[035] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o método inclui: preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 no N-terminal da região Fc de imunoglobulina; e preparar um conjugado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada preparada na etapa prévia em um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
[036] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada é ligado a uma cisteína do polipeptídeo fisiologicamente ativo.
[037] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o método inclui: preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 no N-terminal de uma região Fc de imunoglobulina; purificar a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada na etapa prévia por cromatografia de troca aniônica em uma solução de tampão com um pH de 6,0 a 8,5; e preparar um conjugado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada purificada na etapa prévia a um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
[038] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o método é realizado sem ultrafiltração/diafiltração depois de preparar a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada.
[039] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o método inclui adicionalmente purificar o conjugado por cromatografia de interação hidrofóbica.
[040] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, na Fórmula 3, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-; a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 200 a 250; e R é maleimida.
[041] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o ligante tem uma estrutura da Fórmula 4 a seguir: [Fórmula 4] em que, na Fórmula 4, n é de 200 a 250.
[042] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o ligante tem um tamanho de 1 kDa a 100 kDa.
[043] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o polipeptídeo fisiologicamente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação a interleucina, proteína de ligação a citocina, fator de ativação de macrófago, peptídeo de macrófago, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor do tumor, fator de crescimento da metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX, e XIII, fator de ativação do plasminogênio, peptídeo de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora dos ossos, calcitonina, atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor de via do fator tecidual, hormônio estimulador do folículo, hormônio luteinizante, hormônio de liberação do hormônio luteinizante, fator de crescimento do nervo, hormônio da paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante a insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo de liberação da gastrina, fator de liberação da corticotropina, hormônio estimulador da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista dual GLP-1/GIP, agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos da superfície celular, antígenos de vacina derivados do vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpo.
[044] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o polipeptídeo fisiologicamente ativo é um agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, glucagon, ou um análogo dos mesmos.
[045] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, o polipeptídeo fisiologicamente ativo inclui uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOS: 1 a 6.
[046] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, a sequência de dobradiça é modificada para incluir apenas um resíduo de cisteína pela deleção de uma parte de uma sequência de dobradiça com uma sequência de aminoácido a seguir: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 7).
[047] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, a sequência de dobradiça inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (Ser- Cys-Pro) ou uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (Pro-Ser-Cys-Pro).
[048] Na preparação de acordo com qualquer uma das modalidades prévias, a região Fc de imunoglobulina é derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
[049] Ainda um outro aspecto da presente invenção provê um conjugado de fármaco de longa duração preparado usando a composição ou o método.
EFEITOS VANTAJOSOS
[050] De acordo com o método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração usando um intermediário inédito de acordo com a presente invenção, um conjugado de fármaco de longa duração pode ser preparado com um alto rendimento, embora alguns dos processos de purificação convencionais sejam omitidos, e, assim, a produtividade do conjugado de fármaco de longa duração pode ser aumentada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[051] A figura 1 mostra os resultados da análise de uma estrutura de uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pelo ensaio MALDI-TOF.
MELHOR MODO
[052] A seguir, as modalidades da presente invenção serão descritas com detalhes.
[053] Neste particular, cada descrição e modalidade revelada na presente invenção podem ser aqui aplicadas para descrever diferentes descrições e modalidades. Em outras palavras, todas as combinações de vários componentes revelados na presente invenção são incluídas no escopo da presente invenção. Além do mais, o escopo da presente invenção não deve ser limitado pela descrição detalhada provida a seguir.
[054] Também, os versados na técnica irão reconhecer ou serão capazes de certificar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da presente invenção. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos no escopo das seguintes reivindicações.
[055] Por toda a especificação, não apenas os convencionais códigos de uma letra e de três letras para aminoácidos de ocorrência natural, mas, também, aqueles códigos de três letras, no geral, permitidos para outros aminoácidos, tais como ácido α-aminoisobutirico (Aib), N -metilglicina (Sar), e ácido a-metil-glutâmico, são usados. Além do mais, os aminoácidos aqui mencionados são abreviados de acordo com as regras de nomenclatura de IUPAC-IUB como segue. alanina Ala, A asparagina Asn, N cisteína Cys, C glutamina Gln, Q histidina His, H leucina Leu, L metionina Met, M prolina Pro, P treonina Thr, T tirosina Tyr, Y arginina Arg, R ácido aspártico Asp, D ácido glutâmico Glu, E glicina Gly, G isoleucina Ile, I lisina Lys, K fenilalanina Phe, F serina Ser, S triptofano Trp, W valina Val, V
[056] Um aspecto da presente invenção provê um composto com uma estrutura da Fórmula 1 a seguir, ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: [Fórmula 1] X-L1 -(OCH2CH2)nO-L2-R Na Fórmula 1 exposta, X é uma região Fc de imunoglobulina; L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos.
[057] Na presente invenção, o composto com uma estrutura da Fórmula 1, ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é uma substância inédita preparada para preparar um conjugado de longa duração e também pode ser referida como “intermediário” ou “material intermediário” no presente pedido.
[058] Em um método de preparação de um conjugado de fármaco de longa duração usando o intermediário da presente invenção, etapas de purificação por ultrafiltração/diafiltração e cromatografia de interação hidrofóbica podem ser omitidas, e efeitos na preparação do conjugado de fármaco de longa duração com um alto rendimento podem ser obtidos, embora as etapas de purificação sejam omitidas.
[059] Especificamente, o intermediário é em uma forma na qual uma região Fc de imunoglobulina é ligada a um ligante. No intermediário da Fórmula 1, X pode ser uma região Fc de imunoglobulina, e L1-(OCH2CH2)nO-L2-R pode ser um ligante. Especificamente, na Fórmula 1 exposta, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-; a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 200 a 250; e R é maleimida, sem ser limitado a isto.
[060] O L1 é um local que se liga à região Fc de imunoglobulina e pode ser um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada, sem ser limitado a isto. O L1 pode ser ligado a um grupo reativo de amina localizado em uma extremidade ou um resíduo de lisina de X ou grupo reativo tiol, sem ser limitado a isto. O R é um local para ligação entre o intermediário e um polipeptídeo fisiologicamente ativo e, especificamente, pode incluir um grupo reativo (por exemplo, tiol, maleimida, aldeído, e succinimida) capaz de se ligar a uma cisteína, ou um grupo amina do N-terminal, ou um resíduo de lisina de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, sem ser limitado a isto.
[061] Na presente invenção, o intermediário pode ter uma estrutura da Fórmula 2 a seguir, mas não é limitado a isto: [Fórmula 2]
[062] Na Fórmula 2 exposta, n é de 1 a 3.000, de 10 a 2.000, de 50 a 1.000, de 100 a 700, de 150 a 300, ou de 200 a 250.
[063] Especificamente, o intermediário pode ter um tamanho de 40 kDa a 250 kDa, 80 kDa a 200 kDa, ou 100 kDa a 150 kDa, sem ser limitado a isto.
[064] Na presente invenção, o X pode ser uma região Fc de imunoglobulina com uma sequência de dobradiça no N-terminal e, especificamente, a sequência de dobradiça pode ser modificada para incluir apenas um resíduo de cisteína pela deleção de uma parte de uma sequência de aminoácido do aminoácido a seguir, sem ser limitado a isto: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 7).
[065] Da forma aqui usada, o termo “região Fc de imunoglobulina” se refere a uma região incluindo um domínio constante de cadeia pesada 2 (CH2) e/ou um domínio constante de cadeia pesada 3 (CH3) excluindo os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve da imunoglobulina. A região Fc de imunoglobulina pode ser um componente que constitui uma fração do conjugado de fármaco de longa duração da presente invenção.
[066] Especificamente, o X pode ser uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM, mais especificamente, uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, sem ser limitado a isto.
[067] Na presente invenção, a região Fc de imunoglobulina pode incluir uma sequência de dobradiça em particular no N-terminal.
[068] Da forma aqui usada, o termo “sequência de dobradiça” se refere a um local localizado em uma cadeia pesada e que forma um dímero da região Fc de imunoglobulina por meio de uma ligação inter dissulfeto.
[069] Da forma aqui usada, o termo “N-terminal” se refere a terminal amino de uma proteína ou um polipeptídeo e pode incluir um resíduo de aminoácido localizado no final do terminal amino ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos a partir do final do terminal amino. A região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode incluir a sequência de dobradiça no N-terminal, sem ser limitado a isto.
[070] Em vista dos objetivos da presente invenção, a sequência de dobradiça pode incluir apenas um resíduo de cisteína já que um resíduo de cisteína localizado na 8a ou 11a posição da sequência de dobradiça de SEQ ID NO: 7 é deletado. A sequência de dobradiça da presente invenção pode consistir em 3 a 12 aminoácidos incluindo apenas um resíduo de cisteína, sem ser limitado a isto. Mais especificamente, a sequência de dobradiça da presente invenção pode ter uma sequência como segue: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr- Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-P ro-Cys, Glu-Ser- Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys-Pro, Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr- Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser- Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Lys-Tyr-Gly- Pro-Pro-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, ou Glu-Pro-Ser-Cys. Mais especificamente, a sequência de dobradiça pode incluir uma sequência de aminoácido de uma sequência de SEQ ID NO: 8 (Ser-Cys-Pro) ou uma sequência de SEQ ID NO: 9 (Pro-Ser-Cys-Pro), sem ser limitado a isto.
[071] O X pode ser um dímero formado de moléculas de duas cadeias da região Fc de imunoglobulina na presença da sequência de dobradiça, e o intermediário da presente invenção pode ser em uma forma na qual uma extremidade do ligante é ligada a uma cadeia da região Fc de imunoglobulina na forma dimérica, sem ser limitado a isto. Na presente invenção, o X pode ser um dímero da região Fc de imunoglobulina, mas não é limitado a isto.
[072] Além Do Mais, X Da Presente Invenção Pode Ser Uma Região Fc De Imunoglobulina Incluindo Uma Sequência De Aminoácido De Seq Id No: 10, Sem Ser Limitado A Isto.
[073] Neste particular, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região Fc estendida incluindo uma parte de ou a íntegra de um domínio constante de cadeia pesada 1 (CH1) e/ou um domínio constante de cadeia leve 1 (CL1) excluindo os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve da imunoglobulina, desde que a região Fc de imunoglobulina tenha efeitos substancialmente idênticos ou intensificados, se comparado ao tipo nativo. Também, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região a partir da qual uma parte consideravelmente longa da sequência de aminoácido correspondente ao CH2 e/ou CH3 é removida.
[074] Por exemplo, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode incluir 1) domínio CH1, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CH4, 2) domínio CH1 e domínio CH2, 3) domínio CH1 e domínio CH3, 4) domínio CH2 e domínio CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios selecionados a partir do domínio CH1, do domínio CH2, do domínio CH3, e do domínio CH4 e uma região de dobradiça de imunoglobulina (ou uma parte da região de dobradiça), ou 6) um dímero de cada domínio do domínio constante de cadeia pesada e do domínio constante de cadeia leve. Entretanto, a presente invenção não é limitada a isto.
[075] Também, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção inclui não apenas uma sequência de aminoácido de ocorrência natural, mas, também, uma sequência derivada da mesma. A sequência de aminoácido derivada se refere a uma sequência diferente da sequência de aminoácido de ocorrência natural devido a uma deleção, inserção, substituição não conservadora ou conservadora, ou qualquer combinação de um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácido de ocorrência natural.
[076] Por exemplo, no caso de Fc IgG, resíduos de aminoácido conhecidos como importantes na ligação nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, ou 327 a 331 podem ser usados como um alvo adequado para modificação.
[077] Também, outros vários derivados, incluindo aqueles nos quais um local capaz de formar uma ligação de dissulfeto é deletado ou certos resíduos de aminoácido são eliminados do N-terminal de uma forma Fc nativa e um resíduo de metionina é adicionado no N-terminal da forma Fc nativa, podem ser usados. Além do mais, para remover funções efetoras, um local de ligação a complemento, tal como um local de ligação a C1q, pode ser deletado, e um local de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) pode ser deletado. Técnicas de preparo de tais sequências derivadas da região Fc de imunoglobulina são reveladas nas Publicações de Patente Internacional WO 97/34631 e WO 96/32478.
[078] Trocas de aminoácido em proteínas e peptídeos, que, no geral, não alteram a atividade das moléculas, são conhecidas na tecnologia (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As trocas de ocorrência mais comum de resíduos de aminoácido são trocas entre Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/ Val, Ala/Glu, e Asp/Gly. Se exigido, a região Fc pode ser modificada por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, e amidação.
[079] As supradescritas sequências derivadas da região Fc são derivados que têm uma atividade biológica equivalente àquela da região Fc de imunoglobulina da presente invenção ou estabilidade estrutural melhorada como o calor, o pH, ou similares.
[080] Além do mais, estas regiões Fc de imunoglobulina podem ser obtidas a partir de formas nativas isoladas a partir de humanos e outros animais, incluindo vacas, cabras, suínos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos-da-Índia, ou podem ser recombinantes ou derivados dos mesmos, obtidos a partir de células ou micro-organismos animais transformados. Neste particular, os mesmos podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina nativa pelo isolamento de imunoglobulinas completas a partir de humanos ou animais vivos e pelo tratamento dos mesmos com uma protease. Papaína digere a imunoglobulina nativa em regiões Fab e Fc e pepsina digere a imunoglobulina nativa em fragmentos pF‘c e F(ab)2. Estes fragmentos podem ser sujeitos a cromatografia por exclusão de tamanho para isolar Fc ou pF‘c. Em uma modalidade mais específica, uma região Fc derivada de humano é uma região Fc de imunoglobulina recombinante obtida a partir de um micro-organismo.
[081] Além do mais, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ter glicanos naturais ou glicanos aumentado ou diminuídos, se comparados ao tipo natural, ou ser em uma forma deglicosilada. O aumento, a diminuição ou a remoção de glicanos da imunoglobulina Fc podem ser alcançados por quaisquer métodos comumente usados na tecnologia, tais como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética usando um micro-organismo. Neste particular, a região Fc de imunoglobulina obtida pela remoção de glicanos mostra uma significativa diminuição na afinidade da ligação a um complemento c1q e uma diminuição na ou perda da citotoxicidade dependente de anticorpo ou citotoxicidade dependente de complemento, e, assim, desnecessárias respostas imune não são induzidas desse modo em organismos vivos. Com base nisto, uma região Fc de imunoglobulina deglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada como uma carreadora de fármaco em vista dos objetivos da presente invenção.
[082] Da forma aqui usada, o termo “deglicosilação” se refere a uma região Fc a partir da qual glicano é removido usando uma enzima e o termo “aglicosilação” se refere a uma região Fc que não é glicosilada e produzida em procariotas, mais especificamente, E. coli.
[083] Neste particular, a região Fc de imunoglobulina pode ser derivada a partir de humanos ou animais, tais como vacas, cabras, suínos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos, ou porquinhos-da-Índia. Em uma modalidade mais específica, a região Fc de imunoglobulina pode ser derivada a partir de humanos.
[084] Além do mais, a região Fc de imunoglobulina pode ser derivada a partir de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM, ou qualquer combinação ou híbrido dos mesmos. Em uma modalidade mais específica, a região Fc de imunoglobulina é derivada a partir de IgG ou IgM, que são as proteínas mais abundantes no sangue humano, e, em uma modalidade ainda mais específica, a mesma é derivada a partir de IgG conhecido por intensificar as meias-vidas de proteínas que se ligam a ligante. Em uma modalidade ainda mais específica, a região Fc de imunoglobulina é uma região Fc IgG4, e, na modalidade mais específica, a região Fc de imunoglobulina é uma região Fc aglicosilada derivada a partir de IgG4 humano, sem ser limitado a isto.
[085] Neste particular, da forma aqui usada, o termo “combinação” relacionado à região Fc de imunoglobulina se refere à formação de uma ligação entre um polipeptídeo que codifica uma região Fc de imunoglobulina de cadeia única da mesma origem e um polipeptídeo cadeia única de uma diferente origem quando um dímero ou um multímero for formado. Isto é, um dímero ou multímero pode ser preparado usando dois ou mais fragmentos Fc selecionados a partir do grupo que consiste em fragmentos Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD, e Fc IgE.
[086] Da forma aqui usada, o termo “híbrido” significa que sequências correspondentes a duas ou mais regiões Fc de imunoglobulina de diferentes origens estão presentes em uma cadeia única de um domínio constante de imunoglobulina. Na presente invenção, várias formas híbridas são possíveis. Isto é, um domínio híbrido pode ser composto por 1 a 4 domínios selecionados a partir do grupo que consiste em CH1, CH2, CH3, e CH4 de Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE, e Fc IgD e pode incluir adicionalmente uma região de dobradiça.
[087] Neste particular, IgG também pode ser classificado em subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que podem ser combinadas ou hibridizadas na presente invenção. São preferidas as subclasses IgG2 e IgG4, e é mais preferido o fragmento Fc de IgG4 raramente com funções efetoras, tal como citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[088] Da forma aqui usada, o termo “ligante” se refere a uma fração que liga um fármaco (por exemplo, polipeptídeo fisiologicamente ativo) à região Fc de imunoglobulina no conjugado de fármaco de longa duração, e o ligante pode ser um ligante peptidila ou um ligante não peptidila. Especificamente, o ligante pode ser representado pela Fórmula 3 a seguir, sem ser limitado a isto: [Fórmula 3] CHO-L1 -(OCH2CH2)nO-L2-R.
[089] Na Fórmula 3, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 1 a 3.000, de 10 a 2.000, de 50 a 1.000, de 100 a 700, de 150 a 300, ou de 200 a 250; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos.
[090] O ligante pode incluir polietileno glicol e tem estruturas químicas em particular em ambas as extremidades de polietileno glicol, sem ser limitado a isto.
[091] Especificamente, na Fórmula 3 exposta, L1 pode ser um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 pode ser -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-; a1 e a2 podem ser, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n pode ser de 200 a 250; e R pode ser maleimida, e o ligante pode ter um tamanho de 1 kDa a 200 kDa, 1 kDa a 150 kDa, 1 kDa a 100 kDa, 1 kDa a 50 kDa, ou 1 kDa a 10 kDa, mas não é limitado a isto.
[092] Também, o ligante pode ter uma estrutura da Fórmula 4 a seguir, sem ser limitado a isto: [Fórmula 4]
[093] Na Fórmula 4 exposta, n pode ser de 1 a 3.000, de 10 a 2.000, de 50 a 1.000, de 100 a 700, de 150 a 300, ou de 200 a 250.
[094] Uma extremidade do ligante pode ser ligada à região Fc de imunoglobulina, especificamente, o N-terminal da região Fc de imunoglobulina, mais especificamente, a sequência de dobradiça localizada no N-terminal da região Fc de imunoglobulina, ainda mais especificamente, um resíduo de prolina da sequência de dobradiça, para formar o intermediário, mas não é limitado a isto.
[095] Na presente invenção, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a uma substância que pode ser efetivamente usada para o uso pretendido no escopo da decisão farmacomédica sem induzir toxicidade excessiva, irritação, ou respostas alérgicas.
[096] Da forma aqui usada, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a um sal derivado a partir de um ácido inorgânico, ácido orgânico, ou base farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de um ácido adequado podem incluir ácido hidroclórico, ácido brômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido fosfórico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido salicílico, ácido succínico, ácido tolueno-p-sulfônico, ácido tartárico, ácido acético, ácido cítrico, ácido metanossulfônico, ácido fórmico, ácido benzoico, ácido malônico, ácido naftaleno-2-sulfônico e ácido benzenossulfônico. Exemplos do sal derivado a partir de uma base adequada podem incluir metais alcalinos, tais como sódio e potássio, metais alcalino terrosos, tais como magnésio e amônio.
[097] A presente invenção inclui não apenas o composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, mas também um solvato preparado a partir do mesmo.
[098] Além do mais, o composto pode estar presente na forma de um enantiômero (isômero R ou S), racemato, ou diastereômero, ou qualquer mistura dos mesmos no caso de ter um centro de carbono assimétrico (carbono ausente) em um substituinte do mesmo. Além do mais, o composto pode estar presente na forma de um isômero exo ou endo no caso de com um anel ligado em ponte, sem ser limitado a isto.
[099] Um aspecto da presente invenção provê uma composição incluindo um composto com uma estrutura da Fórmula 1 a seguir, ou um estereoisômero, um solvato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o fármaco é um polipeptídeo fisiologicamente ativo: [Fórmula 1] X-L1 -(OCH2CH2)nO-L2-R.
[0100] Na Fórmula 1 exposta, X é uma região Fc de imunoglobulina; L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 1 a 3.000, de 10 a 2.000, de 50 a 1.000, de 100 a 700, de 150 a 300, ou de 200 a 250; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos.
[0101] Especificamente, na Fórmula 1 exposta, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-; a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 200 a 250; e R é maleimida, sem ser limitado a isto.
[0102] A composição da presente invenção inclui o intermediário e tem um uso para preparar um conjugado de fármaco de longa duração.
[0103] Especificamente, já que a composição da presente invenção inclui o intermediário no qual o ligante é ligado à região Fc de imunoglobulina, a composição da presente invenção pode ser reagida com um polipeptídeo fisiologicamente ativo de maneira tal que o ligante do intermediário seja ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo, desse modo, preparando um conjugado de fármaco de longa duração. Mais especificamente, o conjugado de fármaco de longa duração pode ser preparado por meio da ligação entre R da Fórmula 1 correspondente a uma extremidade do ligante e uma cisteína, ou um grupo amina, tal como o N-terminal, ou um resíduo de lisina do polipeptídeo fisiologicamente ativo, sem ser limitado a isto.
[0104] Na presente invenção, qualquer polipeptídeo fisiologicamente ativo do conjugado de fármaco de longa duração que pode ser preparado usando a composição pode cair no escopo da presente invenção independente de tipo, tamanho, origem, e similares, desde que o polipeptídeo fisiologicamente ativo tenha efeitos farmacológicos na doença. Exemplos do polipeptídeo fisiologicamente ativo podem incluir peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação a interleucina, proteína de ligação a citocina, fator de ativação de macrófago, peptídeo de macrófago, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor do tumor, fator de crescimento da metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX, e XIII, fator de ativação do plasminogênio, peptídeo de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora dos ossos, calcitonina, atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor de via do fator tecidual, hormônio estimulador do folículo, hormônio luteinizante, hormônio de liberação do hormônio luteinizante, fator de crescimento do nervo, hormônio da paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante a insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo de liberação da gastrina, fator de liberação da corticotropina, hormônio estimulador da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista dual GLP-1/GIP, agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos da superfície celular, antígenos de vacina derivados do vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpo, mas não são limitados aos mesmos.
[0105] Mais especificamente, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), glucagon, insulina, enzima, incretina, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista dual GLP-1/GIP, ou agonista triplo GLP- 1/GIP/Glucagon, mas não é limitado aos mesmos.
[0106] Em virtude de um método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração usando o intermediário ou a composição que inclui o mesmo de acordo com a presente invenção ser realizado pela ligação do intermediário, em que o ligante é ligado à região Fc de imunoglobulina, no polipeptídeo fisiologicamente ativo, qualquer polipeptídeo fisiologicamente ativo incluindo um resíduo de aminoácido ou um grupo reativo capaz de se ligar ao intermediário pode ser usado independentemente dos tipos do mesmo para preparar o conjugado de fármaco de longa duração usando o intermediário ou a composição incluindo o mesmo da presente invenção.
[0107] Na presente invenção, o X pode ser uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, sem ser limitado a isto.
[0108] Além do mais, o X pode ser uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de dobradiça modificada para incluir apenas um resíduo de cisteína pela deleção de uma parte de uma sequência de aminoácido dos aminoácidos a seguir, mas não é limitado a isto: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 7).
[0109] No caso de uso da composição da presente invenção, o conjugado de fármaco de longa duração pode ser preparado sem realizar ultrafiltração/diafiltração e um ciclo de cromatografia de interação hidrofóbica pode ser opcionalmente omitido.
[0110] Especificamente, quando o conjugado de fármaco de longa duração for preparado pela reação do intermediário ou da composição incluindo o mesmo de acordo com a presente invenção com o fármaco, a pureza do conjugado de fármaco de longa duração pode ser 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais, mas não é limitado a isto. A pureza pode ser medida por qualquer método bem conhecido na tecnologia, especificamente, por SE-HPLC, RP- HPLC, e IE-HPLC, além de qualquer método disponível na tecnologia. Mais especificamente, a pureza do conjugado de fármaco de longa duração preparado usando a composição da presente invenção pode ser 90% ou mais em SE-HPLC, 80% ou mais em RP-HPLC, e 85% ou mais em IE-HPLC, mas não é limitado a isto.
[0111] Também, a composição da presente invenção pode incluir adicionalmente um tampão, um estabilizador, um conservante, um sal, e similares exigidos para estabilizar o intermediário e para preparar o conjugado de fármaco de longa duração, mas não é limitado a isto.
[0112] Um outro aspecto da presente invenção provê um kit para preparar um conjugado de fármaco de longa duração incluindo a composição. O kit pode incluir um reagente, manual e similares para preparar o conjugado de fármaco de longa duração, sem ser limitado a isto.
[0113] Um outro aspecto da presente invenção provê um método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração.
[0114] O método de preparação da presente invenção é um método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração em que um fármaco é ligado a uma região Fc de imunoglobulina por meio de um ligante, especificamente, um método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração pela ligação do intermediário no fármaco, sem ser limitado a isto.
[0115] Especificamente, o método de preparação é distinguido pela realização sequencial de i) ligação de um ligante incluindo polietileno glicol (PEG) a uma região Fc de imunoglobulina, e ii) ligação do ligante, que é ligado à região Fc de imunoglobulina, a um fármaco (por exemplo, um polipeptídeo ou proteína fisiologicamente ativa). Isto é, o método de preparação é distinguido pela realização de etapas em uma ordem em particular, isto é, realização de uma primeira etapa de preparar o intermediário pela ligação do ligante incluindo PEG na região Fc de imunoglobulina e, então, realização de uma segunda etapa de ligação do fármaco no intermediário. Alternativamente, o método de preparação da presente invenção também pode ser realizado apenas pela segunda etapa de preparação do conjugado de fármaco de longa duração por meio de uma reação entre o intermediário ou a composição para preparar o conjugado de fármaco de longa duração incluindo o mesmo e o fármaco, sem realizar a primeira etapa, mas não é limitado a isto. Este método de preparação pode ser referido como “método de preparação em ordem reversa” no presente pedido.
[0116] Na presente invenção, no caso do método para preparar o conjugado de fármaco de longa duração realizado pela preparação do intermediário, primeiro, e, então, ligação do intermediário no fármaco, os processos de purificação por ultrafiltração/diafiltração e cromatografia de interação hidrofóbica podem ser omitidos, e foi confirmado que o conjugado de fármaco de longa duração pode ser preparado com um alto rendimento, embora os processos de purificação sejam omitidos.
[0117] De acordo com a convenção, o método de preparação no qual o ligante é primeiro ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e, então, ligado à região Fc de imunoglobulina sem formar o intermediário, quando o ligante ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo (por exemplo, polietileno glicol) for ligado à região Fc de imunoglobulina, ultrafiltração/diafiltração é exigida como um processo de separação depois que o ligante for ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e antes de o produto ligado ser ligado à região Fc de imunoglobulina para reduzir o risco de agregação que pode ocorrer devido a condições de baixo pH (pH de cerca de 3,0) de um tampão de equilíbrio e um tampão de eluição usado para purificação do ligante ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo e para ajustar as condições de pH para reação usando um tampão apropriado. Ao contrário, no método de preparação de acordo com a presente invenção em que o intermediário é preparado pela ligação do ligante à região Fc de imunoglobulina primeiro, um pH de um tampão usado na purificação do ligante ligado à região Fc de imunoglobulina é relativamente alto, e, assim, o processo de ultrafiltração/diafiltração pode ser omitido e, então, um processo de ligação do ligante ligado à região Fc de imunoglobulina ao polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser realizado.
[0118] Portanto, no método de preparação da presente invenção, ultrafiltração/ diafiltração pode não ser realizada depois de preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada, mas a presente invenção não é limitada a isto. No método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração de acordo com a presente invenção, um pH de uma solução usada para purificar a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada não é significativamente diferente de um pH de uma solução usada para uma subsequente reação, de forma que a ligação no fármaco possa ser realizada sem conduzir a ultrafiltração/diafiltração. Pela omissão do processo de ultrafiltração/diafiltração, o risco de formação de impurezas de agregado em uma etapa de concentração pode ser reduzido e o processo de preparação pode ser simplificado de forma que os efeitos de redução de custo possam ser esperados no caso em que a tecnologia for comercializada.
[0119] Também, o método de preparação da presente invenção pode incluir adicionalmente purificar o conjugado por cromatografia de interação hidrofóbica, sem ser limitado a isto.
[0120] Especificamente, a cromatografia de interação hidrofóbica pode ser realizada apenas uma vez ou mais do que uma vez de acordo com as propriedades do fármaco do conjugado de fármaco de longa duração e do tipo e do tamanho do ligante.
[0121] De acordo com o método de preparação da presente invenção, não apenas uma quantidade do fármaco oneroso pode ser reduzida, mas também uma quantidade de regiões Fc de imunoglobulina não reagidas pode ser reduzida, de forma que a íntegra ou uma parte do processo de purificação por cromatografia de interação hidrofóbica possa ser omitida para obter efeitos na redução das matérias-primas exigidas para preparação do conjugado de fármaco de longa duração e dos custos para tal, comparado ao método convencional.
[0122] Neste particular, embora os processos de ultrafiltração/diafiltração e cromatografia de interação hidrofóbica, que foram realizados no método convencional para preparar o conjugado de fármaco de longa duração, sejam omitidos, e apenas o processo de purificação final (por exemplo, um ciclo de cromatografia de interação hidrofóbica) seja realizado no método de preparação da presente invenção, isto é vantajoso em que uma pureza do conjugado final obtido pela presente invenção é mantida, se comparada àquela do método de preparação convencional. Isto é, de acordo com o método de preparação da presente invenção, a pureza final pode ser mantida embora alguns dos processos de purificação sejam omitidos, de forma que a produtividade do conjugado de fármaco de longa duração possa ser melhorada.
[0123] A pureza do conjugado de fármaco de longa duração de acordo com a presente invenção pode ser medida por qualquer método bem conhecido na tecnologia, e exemplos do método podem ser SE-HPLC, RP-HPLC, e IE-HPLC, sem ser limitado a isto.
[0124] De acordo com o método de preparação da presente invenção, a pureza final do conjugado de fármaco de longa duração pode ser 90% ou mais, especificamente, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais, sem ser limitado a isto.
[0125] Neste particular, no método de preparação da presente invenção, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada é preparada primeiro e, então, ligada ao polipeptídeo fisiologicamente ativo, de forma que o conjugado de fármaco de longa duração possa ser preparado com um rendimento mais alto, se comparado ao método convencional em termos de não apenas o polipeptídeo fisiologicamente ativo, mas, também, a região Fc de imunoglobulina.
[0126] Em uma modalidade da presente invenção, foi confirmado que o rendimento do conjugado de fármaco de longa duração obtido pelo método de preparação da presente invenção foi aumentado duas vezes ou mais, se comparado ao rendimento do conjugado de fármaco de longa duração obtido pelo método convencional.
[0127] Especificamente, o método de preparação da presente invenção se refere a um método para preparar um conjugado de fármaco de longa duração incluindo preparar um conjugado pela ligação de uma região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada, que é preparada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 a seguir no N- terminal de uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de dobradiça, a um fármaco (polipeptídeo fisiologicamente ativo): [Fórmula 3] CHO-L1 -(OCH2CH2)nO-L2-R.
[0128] Na Fórmula 3 exposta, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, e a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e R é qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em 2,5- dioxopirrolidinil, 2,5-dioxopirrolil, aldeído, maleimida, aril dissulfeto C6-C20, heteroaril dissulfeto C5-C20, vinil sulfona, tiol, acetamida halogenada, succinimida, p-nitrofenil carbonato, tioéster, e derivados dos mesmos, sem ser limitado a isto.
[0129] Mais especificamente, o método de preparação pode incluir: preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 exposta ao N-terminal de uma região Fc de imunoglobulina; e preparar um conjugado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada na etapa supradescrita a um polipeptídeo fisiologicamente ativo, ou o método de preparação pode incluir: preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 no N- terminal de uma região Fc de imunoglobulina; purificar a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada na etapa supradescrita por cromatografia de troca aniônica em uma solução de tampão com um pH de 6,0 a 8,5, um pH de 6,0 a 8,0, um pH de 6,0 a 7,5, um pH de 6,0 a 7,0, um pH de 6,1 a 6,9, um pH de 6,2 a 6,8, ou um pH de 6,3 a 6,7; e preparar um conjugado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada purificada na etapa supradescrita a um polipeptídeo fisiologicamente ativo, sem ser limitado a isto.
[0130] Além do mais, no método de preparação da presente invenção, (i) a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pode ser preparada pela ligação do ligante da Fórmula 3 ao N-terminal da região Fc de imunoglobulina na presença de um agente de redução em um pH de 4,0 a 8,0, um pH de 4,5 a 7,5, um pH de 5,5 a 7,5, um pH de 5,6 a 7,4, um pH de 5,7 a 7,3 ou um pH de 5,8 a 7,2; e/ou (ii) o conjugado pode ser preparado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada no polipeptídeo fisiologicamente ativo em um pH de 5,5 a 8,0, um pH de 6,0 a 7,5, ou um pH de 6,5 a 7,5, sem ser limitado a isto.
[0131] Além do mais, a etapa de preparar o conjugado de acordo com o método de preparação da presente invenção pode ser realizada pela reação do polipeptídeo fisiologicamente ativo em uma quantidade equivalente a ou mais do que uma quantidade da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada e, especificamente, uma razão molar da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada : polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser de 1:1 a 1:10, de 1:1 a 1:7, de 1:1 a 1:5, ou de 1:1 a 1:3, mas não é limitado a isto.
[0132] Da forma aqui usada, o termo “região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada” se refere a um material intermediário que é produzido no meio do método para preparar o conjugado de fármaco de longa duração de acordo com a presente invenção em que um ligante incluindo um polietileno glicol é ligado à região Fc de imunoglobulina. Isto é, na presente invenção, a “região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada” pode ser usada intercambiavelmente com “intermediário” ou “material intermediário”.
[0133] Na presente invenção, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região Fc de imunoglobulina derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, sem ser limitado a isto.
[0134] Além do mais, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região Fc de imunoglobulina incluindo uma sequência de dobradiça modificada para incluir apenas um resíduo de cisteína pela deleção de uma parte de uma sequência de aminoácido a seguir e, especificamente, a sequência de dobradiça pode incluir uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (Ser-Cys-Pro) ou SEQ ID NO: 9 (Pro-Ser-Cys-Pro), sem ser limitado a isto.
[0135] Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 7).
[0136] O “conjugado de fármaco de longa duração” da presente invenção se refere a um conjugado de fármaco com uma estrutura em que um fármaco (polipeptídeo fisiologicamente ativo) com uma atividade farmacológica no corpo é ligado a uma região Fc de imunoglobulina por meio de um ligante e uma meia-vida aumentada. Em vista dos objetivos da presente invenção, o conjugado de fármaco de longa duração pode ser um em que o intermediário ou a região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada é ligada ao fármaco, mas não é limitado a isto.
[0137] Especificamente, o fármaco não é limitado a substâncias em particular, desde que o fármaco tenha efeitos preventivos, terapêuticos ou de alívio em uma certa doença e pode ser uma proteína, uma enzima, um anticorpo, compostos naturais ou não naturais, ou similares. Mais especificamente, o fármaco pode ser um polipeptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, ainda mais especificamente, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação a interleucina, proteína de ligação a citocina, fator de ativação de macrófago, peptídeo de macrófago, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor do tumor, fator de crescimento da metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX, e XIII, fator de ativação do plasminogênio, peptídeo de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora dos ossos, calcitonina, atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor de via do fator tecidual, hormônio estimulador do folículo, hormônio luteinizante, hormônio de liberação do hormônio luteinizante, fator de crescimento do nervo, hormônio da paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante a insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo de liberação da gastrina, fator de liberação da corticotropina, hormônio estimulador da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista dual GLP-1/GIP, agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos da superfície celular, antígenos de vacina derivados do vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpo, mas não são limitados aos mesmos. Mais especificamente, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode ser agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, glucagon, ou um análogo dos mesmos, mas não é limitado a isto. Ainda mais especificamente, o polipeptídeo fisiologicamente ativo pode incluir, consistir essencialmente em, ou consistir em uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOS: 1 a 6, mas não é limitado a isto.
[0138] Além do mais, quaisquer variantes, derivados e fragmentos do polipeptídeo fisiologicamente ativo também caem no escopo da presente invenção.
[0139] Da forma aqui usada, o termo “variante” se refere a um peptídeo com uma sequência de aminoácido em que um ou mais aminoácidos são diferentes daqueles de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo, ao mesmo tempo em que retêm as mesmas funções do polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo, e a variante pode ser preparada por substituição, adição, deleção, modificação, ou qualquer combinação de alguns aminoácidos da sequência de aminoácido do polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo.
[0140] Da forma aqui usada, o termo “derivado” se refere a um peptídeo, um análogo a peptídeo, ou um peptidomimético obtido pela modificação de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo pela adição, deleção, ou substituição para ter atividade similar àquela do polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo.
[0141] Da forma aqui usada, o termo “fragmento” se refere a uma forma obtida pela adição/deleção de um ou mais aminoácidos para/a partir do N-terminal ou do C- terminal, e o aminoácido adicionado pode ser qualquer aminoácido que não existe na natureza (por exemplo; D-aminoácido).
[0142] Os métodos para preparar a variante, o derivado e o fragmento do polipeptídeo fisiologicamente ativo podem ser usados independentemente ou em combinação. Por exemplo, qualquer polipeptídeo fisiologicamente ativo com um ou mais aminoácidos diferentes na sequência de aminoácido e a desaminação de um resíduo de aminoácido no N-terminal pode ser incluído no mesmo.
[0143] O derivado do polipeptídeo fisiologicamente ativo inclui formas biossimilares e biomelhor. Por exemplo, em relação a biossimilares, o biossimilar pode ser qualquer enzima biossimilar disponível no conjugado de fármaco de longa duração da presente invenção, embora haja uma diferença entre uma enzima conhecida e um hospedeiro para sua expressão, uma diferença na característica da glicosilação e no grau da mesma, e uma diferença no grau de substituição em um resíduo de aminoácido em particular da correspondente enzima à luz da sequência padrão em que o grau de substituição não é 100% de substituição. O polipeptídeo fisiologicamente ativo e a variante, o derivado e o fragmento do mesmo podem ser produzidos a partir de células animais, E. coli, levedura, células de inseto, células vegetais, animais vivos e similares por meio de recombinação genética, os métodos de produção não são limitados aos mesmos, e quaisquer polipeptídeos fisiologicamente ativos comercialmente disponíveis, e variantes, derivados e fragmentos dos mesmos também podem ser usados.
[0144] Além do mais, o polipeptídeo fisiologicamente ativo, e a variante, o derivado e o fragmento do mesmo podem incluir uma sequência de aminoácido com uma homologia de pelo menos 80%, especificamente, pelo menos 90%, mais especificamente, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, e o polipeptídeo fisiologicamente ativo, e a variante, o derivado, e o fragmento do mesmo podem ser obtidos a partir de micro-organismos por tecnologias de recombinação genética ou comercialmente disponíveis, sem ser limitado a isto.
[0145] Da forma aqui usada, o termo “homologia” se refere ao grau de similaridade entre as sequências de aminoácido de uma proteína tipo selvagem ou sequências de nucleotídeo que codificam a mesma e incluem uma sequência idêntica à sequência de aminoácido ou sequência de nucleotídeo da presente invenção pelo supradescrito percentual ou maior. A homologia pode ser determinada pela comparação das sequências por meio de observação visual, mas também pode ser determinada usando um algoritmo bioinformático, que provê resultados de análise de um grau de homologia pelo alinhamento das sequências a serem comparadas. A homologia entre as duas sequências de aminoácido pode ser indicada em percentual. Algoritmos automatizados usados podem ser usados em módulos do software de computador GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA de Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group Madison, WI, EUA). Os algoritmos de alinhamento automatizados nos módulos incluem o algoritmo Needleman & Wunsch, o algoritmo Pearson & Lipman e o algoritmo de sequência Smith & Waterman. Outros algoritmos e determinações de homologia usados no alinhamento são automatizados em software, tais como FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST, e CLUSTAL W.
[0146] Informação sobre sequências do polipeptídeo fisiologicamente ativo, e a variante, o derivado, e o fragmento dos mesmos, e as sequências de nucleotídeo que codificam os mesmos podem ser obtidos a partir da conhecida base de dados de NCBI GenBank, ou similares.
[0147] Os aminoácidos substituídos ou adicionados podem ser não apenas 20 aminoácidos comumente encontrados em proteínas humanas, mas também aminoácidos atípicos ou de ocorrência não natural. Fontes comerciais de aminoácidos atípicos podem incluir Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. e Genzyme pharmaceuticals. Os peptídeos incluindo estes aminoácidos e típicas sequências de peptídeo podem ser sintetizados e comprados a partir de fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company, Bachem (EUA) ou Anygen (Coreia).
[0148] Além do mais, o polipeptídeo fisiologicamente ativo, e a variante, o derivado, e o fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção podem ser em uma forma variada em que o N-terminal e/ou o C-terminal é quimicamente modificado ou protegido por grupos orgânicos, ou aminoácidos podem ser adicionados nos terminais do peptídeo, para proteção de proteases in vivo, ao mesmo tempo em que aumentam a estabilidade das mesmas.
[0149] Particularmente, já que os N- e C-terminais de peptídeos quimicamente sintetizados são eletricamente carregados, o N-terminal pode ser acetilado e/ou o C- terminal pode ser amidado para remover as cargas, mas a modalidade não é limitada a isto.
[0150] Além do mais, o peptídeo de acordo com a presente invenção inclui todos os mesmos na forma do próprio peptídeo, um sal do mesmo (por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável do peptídeo), ou um solvato do mesmo. Também, o peptídeo pode ser em qualquer forma farmaceuticamente aceitável.
[0151] O tipo do sal não é particularmente limitado. Entretanto, o sal é preferivelmente em uma forma segura e efetiva para um indivíduo, por exemplo, um mamífero, sem ser limitado a isto.
[0152] Da forma aqui usada, o termo “solvato” se refere a um complexo do peptídeo ou um sal do mesmo de acordo com a presente invenção e uma molécula de solvente.
[0153] Embora descrito como um “peptídeo que consiste em um SEQ ID NO em particular” na presente invenção, isto não exclui uma mutação que pode ocorrer naturalmente ou pela adição de uma sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácido do SEQ ID NO, ou uma mutação silente da mesma, desde que o peptídeo tenha atividade idêntica ou equivalente àquela do peptídeo que consiste na sequência de aminoácido, e mesmo quando tal adição ou mutação de sequência estiver presente, a mesma obviamente pertence ao escopo da presente invenção.
[0154] O método para preparar o conjugado de fármaco de longa duração de acordo com a presente invenção pode ser um método para preparar um conjugado em que um polipeptídeo fisiologicamente ativo é ligado a uma região Fc de imunoglobulina por meio de um ligante, sem ser limitado a isto.
[0155] Na presente invenção, a ligação entre o ligante e a região Fc de imunoglobulina pode ser formada por uma ligação covalente ou uma ligação não covalente entre uma extremidade do ligante e o N-terminal da região Fc de imunoglobulina, mas locais ou métodos de ligação para a ligação não são particularmente limitados. Especificamente, a região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada pode ser preparada pela ligação de uma prolina no N-terminal da região Fc de imunoglobulina a um grupo -CHO do ligante, sem ser limitado a isto.
[0156] Na presente invenção, o ligante pode ter uma estrutura da Fórmula 4 a seguir, mas não é limitado a isto: [Fórmula 4]
[0157] Na Fórmula 4 exposta, n é de 200 a 250.
[0158] Além do mais, o ligante pode ter um tamanho de 1 kDa a 200 kDa, 1 kDa a 150 kDa, 1 kDa a 100 kDa, 1 kDa a 50 kDa, ou 1 kDa a 10 kDa, sem ser limitado a isto.
[0159] A região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pode ter uma estrutura da Fórmula 2 a seguir, sem ser limitado a isto.
[0160] [Fórmula 2]
[0161] O método de preparação da presente invenção pode ser realizado pela ligação do polipeptídeo fisiologicamente ativo a uma extremidade da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada com a estrutura da Fórmula 2, sem ser limitado a isto.
[0162] Além do mais, a outra extremidade do ligante que não é ligada à região Fc de imunoglobulina pode ser ligada ao polipeptídeo fisiologicamente ativo, especificamente, um grupo -SH ou um aminoácido contendo um grupo -SH, ou uma cisteína do polipeptídeo fisiologicamente ativo, sem ser limitado a isto.
[0163] Na presente invenção, o conjugado de fármaco de longa duração pode ter uma estrutura da Fórmula 5 a seguir, sem ser limitado a isto.
[0164] [Fórmula 5]
[0165] A Fórmula 5 mostra uma estrutura em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo, o ligante, e a região Fc de imunoglobulina são sequencialmente ligados a partir da esquerda, sem ser limitado a isto.
[0166] Quando o conjugado de fármaco de longa duração for preparado de acordo com o método de preparação da presente invenção em que a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada é preparada primeiro e ligada ao polipeptídeo fisiologicamente ativo, foi confirmado que a pureza do conjugado final pode ser mantida com um aumentado rendimento, comparado ao método de preparação convencional, embora os processos de ultrafiltração/diafiltração e cromatografia de interação hidrofóbica sejam omitidos e apenas o processo de purificação final (por exemplo, um ciclo de cromatografia de interação hidrofóbica) seja realizado no método de preparação de acordo com a presente invenção.
[0167] Um outro aspecto da presente invenção provê um conjugado de fármaco de longa duração preparado pelo método supradescrito.
[0168] Em virtude de o conjugado de fármaco de longa duração preparado pela preparação da presente invenção ter uma meia-vida aumentada, se comparada ao polipeptídeo fisiologicamente ativo que não é ligado ao ligante ou à região Fc de imunoglobulina, efeitos vantajosos na preparação de fármacos podem ser obtidos.
[0169] O conjugado de fármaco de longa duração preparado pelo método de preparação da presente invenção pode ser usado na preparação de fármacos ou composições com os propósitos de prevenção, tratamento, e alívio de doenças.
[0170] A seguir, a presente invenção será descrita com mais detalhes em relação aos seguintes exemplos. Entretanto, os seguintes exemplos são meramente apresentados para exemplificar a presente invenção, e o escopo da presente invenção não é limitado a isto.
EXEMPLO COMPARATIVO: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO PELA LIGAÇÃO DE POLIPEPTÍDEO FISIOLOGICAMENTE ATIVO PEGUILADO NA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA
[0171] Um polipeptídeo fisiologicamente ativo PEGuilado foi ligado a uma região Fc de imunoglobulina para preparar um conjugado de longa duração.
EXEMPLO COMPARATIVO 1: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO PELA LIGAÇÃO DO ANÁLOGO 1 DO AGONISTA TRIGONAL GLP-1/GIP/GLUCAGON PEGUILADO NA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA
[0172] A fim de PEGuilar um polipeptídeo fisiologicamente ativo (análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, SEQ ID NO: 1) em um resíduo de cisteína (grupo -SH), o análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon foi reagido com um ligante contendo PEG (maleimida-10 kDa-PEG-aldeído) (Fórmula 4) por cerca de 1 hora em uma razão molar de 1:1,0 a 1:1,3 com uma concentração de análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon de cerca de 3 g/L. Especificamente, a reação foi realizada em um tampão 50 mM Tris contendo isopropanol (pH de 7,5, 6°C ± 4°C). A fim de obter um análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon mono- PEGuilado, a solução da reação foi diluída com um tampão de equilíbrio incluindo citrato de sódio e etanol até um volume total de 20 vezes e purificada. Neste particular, o análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon mono-PEGuilado foi purificado usando uma coluna SP de Alto Desempenho (GE Healthcare, cromatografia de troca catiônica) usando uma solução que inclui citrato de sódio e etanol e um gradiente de concentração de cloreto de potássio. Depois que a solução purificada do análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon PEGuilado foi diluída com água, a solução de tampão foi substituída com uma solução de fosfato de potássio 0,1 M através de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF), seguido pela concentração para recuperar um resultante com uma concentração final de cerca de 3 g/L ou mais.
[0173] O análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon mono-PEGuilado preparado da forma supradescrita foi ligado a uma região Fc de imunoglobulina para preparar um conjugado de longa duração como segue.
[0174] A fim de ligar um grupo aldeído de PEG do análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon mono-PEGuilado no terminal amino de uma região Fc de imunoglobulina, o análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon mono- PEGuilado foi reagido com a região Fc de imunoglobulina em uma razão molar de 1:2 em uma temperatura de 6°C ± 4°C por cerca de 12 horas com uma concentração de proteína total (análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon e região Fc de imunoglobulina) de 30 g/L.
[0175] A fim de isolar e remover regiões Fc de imunoglobulina não reagidas depois da reação para ligação, a solução da reação foi purificada usando uma coluna Butyl 4 Fast Flow (GE Healthcare, cromatografia de interação hidrofóbica). Neste caso, um tampão Tris e cloreto de sódio foram adicionados na solução da reação, e a solução da reação foi purificada usando uma solução que inclui um Bis-Tris e um gradiente de concentração de cloreto de sódio.
[0176] Posteriormente, usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare), cromatografia de interação hidrofóbica foi realizada. Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 1 de agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio.
EXEMPLO COMPARATIVO 2: PREPARAÇÃO DO CONJUGADO PELA LIGAÇÃO DE ANÁLOGO 1 DE GLUCAGON PEGUILADO NA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA
[0177] A fim de PEGuilar um polipeptídeo fisiologicamente ativo (Análogo 1 de Glucagon, SEQ ID NO: 4) em um resíduo de cisteína (grupo -SH), o análogo 1 de Glucagon foi reagido com um ligante contendo PEG (maleimida-10 kDa-PEG- aldeído) (Fórmula 1) por cerca de 1 hora em uma razão molar de 1:1,3 com uma concentração do análogo 1 de Glucagon de 3 g/L. Especificamente, a reação foi realizada em um tampão 50 mM Tris contendo isopropanol (pH de 7,3). A fim de obter um análogo 1 de Glucagon mono-PEGuilado, a solução da reação foi diluída com um tampão de equilíbrio incluindo citrato de sódio e etanol até um volume total de 20 vezes e purificada. Neste particular, o análogo 1 de Glucagon mono-PEGuilado foi purificado usando uma coluna SP de Alto Desempenho (GE Healthcare, cromatografia de troca catiônica) usando uma solução que inclui citrato de sódio e etanol e um gradiente de concentração de cloreto de potássio. Depois que a solução purificada do análogo 1 de Glucagon PEGuilado foi diluída com água, a solução de tampão foi substituída com uma solução de fosfato de potássio 0,1 M através de ultrafiltração/ diafiltração (UF/DF), seguido pela concentração para recuperar um resultante com uma concentração final de 3 g/L ou mais.
[0178] O análogo 1 de Glucagon mono-PEGuilado preparado da forma supradescrita foi ligado a uma região Fc de imunoglobulina para preparar um conjugado de longa duração como segue.
[0179] A fim de ligar um grupo aldeído de PEG do análogo 1 de Glucagon mono- PEGuilado no terminal amino da região Fc de imunoglobulina, o análogo 1 de Glucagon mono-PEGuilado foi reagido com a região Fc de imunoglobulina em uma razão molar de 1:5 em uma temperatura de 6°C ± 4°C por cerca de 12 horas com uma concentração de proteína total (análogo 1 de Glucagon e região Fc de imunoglobulina) de 20 g/L.
[0180] A fim de isolar e remover regiões Fc de imunoglobulina não reagidas depois da reação para ligação, a solução da reação foi purificada usando uma coluna Butyl 4 Fast Flow (GE Healthcare, cromatografia de interação hidrofóbica). Neste caso, um tampão Tris e cloreto de sódio foram adicionados na solução da reação, e a solução da reação foi purificada usando uma solução que inclui Bis-Tris e um gradiente de concentração de cloreto de sódio.
[0181] Posteriormente, usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare), cromatografia de interação hidrofóbica foi realizada. Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 1 de Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio.
[0182] Os presentes inventores desenvolveram um processo capaz de produzir eficientemente o conjugado com uma alta pureza pela omissão do processo de filtração por membrana e do processo de purificação (cromatografia de interação hidrofóbica, Butyl 4 Fast Flow) do processo de preparação do conjugado de acordo com os supradescritos Exemplos Comparativos 1 e 2, como segue.
EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA MONO-PEGUILADA EXEMPLO 1-1. PREPARAÇÃO DA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA MONO-PEGUILADA
[0183] A fim de PEGuilar o N-terminal de uma região Fc de imunoglobulina (49,8 kDa) com uma região de dobradiça com uma sequência Pro-Ser-Cys-Pro no N-terminal, a região Fc de imunoglobulina foi reagida com um ligante contendo PEG (estrutura da Fórmula 4, 10 kDa) em uma razão molar (região Fc de imunoglobulina : ligante contendo PEG) de 1:1 com uma concentração da região Fc de imunoglobulina de 50 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 4 horas.
[0184] [Fórmula 4]
[0185] Especificamente, a reação foi realizada em uma composição incluindo um tampão 5 mM Bis-Tris (pH 6,5) e fosfato de potássio, e 10 mM NaCNBH3 (cianoboro- hidreto de sódio) foi adicionado na mesma como um agente de redução. A fim de obter uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada, a solução da reação foi diluída com o tampão Bis-Tris e purificada.
[0186] Diferente do método de preparação dos supradescritos Exemplos Comparativos em que o análogo de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon e análogo de glucagon mono-PEGuilados foram purificados por cromatografia de troca catiônica, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi purificada usando uma coluna CaptoQ ImpRes (GE Healthcare, cromatografia de troca aniônica) usando um tampão Bis-Tris e um gradiente de concentração de cloreto de sódio.
EXEMPLO 1-2. ANÁLISE DA ESTRUTURA DA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA MONO-PEGUILADA
[0187] A região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada no Exemplo 11 foi estruturalmente analisada por MALDI-TOF e mapeamento de peptídeo. Em decorrência de MALDI-TOF, o resultante foi idêntico a um peso molecular esperado da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada (figura 1) e, em decorrência do mapeamento de peptídeo, foi confirmado que mais de 90% de PEG foi PEGuilado no N-terminal da região Fc de imunoglobulina.
[0188] Neste particular, em decorrência da análise da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada (Fórmula 2) preparada no Exemplo 1-1 exposto usando ensaios SE- HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, a pureza foi confirmada como 90% ou mais em SE- HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 80% ou mais em IE-HPLC.
[0189] [Fórmula 2]
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DO CONJUGADO PELA LIGAÇÃO DA REGIÃO Fc DE IMUNOGLOBULINA PEGUILADA NO POLIPEPTÍDEO FISIOLOGICAMENTE ATIVO
[0190] Conjugados de longa duração foram preparados como segue pela ligação da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada no Exemplo 1-1 a vários peptídeos fisiologicamente ativos.
[0191] Diferente do método de preparação dos Exemplos Comparativos em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo PEGuilado foi purificado por cromatografia de troca catiônica e, então, sujeito a troca de tampão e concentração por ultrafiltração/ diafiltração (UF/DF), a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi reagida com o polipeptídeo fisiologicamente ativo por meio da conjugação de peptídeo sem realizar ultrafiltração/diafiltração. Os conjugados de longa duração preparados da forma supradescrita tinham alta pureza e, assim, um dos dois ciclos de cromatografia de interação hidrofóbica pode ser omitido, diferente do método de preparação de acordo com os Exemplos Comparativos.
EXEMPLO 2-1. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DO ANÁLOGO 1 DO AGONISTA TRIGONAL GLP-1/GIP/GLUCAGON
[0192] Um conjugado de longa duração (ligante-análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG) foi preparado por meio da conjugação de peptídeo do análogo 1 de agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon (SEQ ID NO: 1), depois da cromatografia de troca aniônica do Exemplo 1-1, sem realizar ultrafiltração/diafiltração.
[0193] [SEQ ID NO: 1] Glu16 (em vermelho) e Lys20 (em vermelho) ligados por anel de Lactama
[0194] Neste particular, a fim de ligar um grupo reativo a maleimida em um terminal de PEG da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada ao análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi reagida com o análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon em uma razão molar de 1:1 com uma concentração do análogo 1 de agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon de 0,2 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 2 horas. A reação foi realizada em um tampão Tris-Cl (6°C ± 4°C) incluindo isopropanol. Em decorrência da análise do resultante depois da reação usando ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, a pureza foi confirmada como 90% ou mais em SE-HPLC, 80% ou mais em RP-HPLC, e 70% ou mais em IE-HPLC.
[0195] Posteriormente, o resultante da reação foi sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica uma vez usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare). Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina- PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio. Foi confirmado que um rendimento aqui obtido foi aumentado em cerca de duas vezes ou mais, se comparado a um rendimento do Exemplo Comparativo 1 com a mesma quantidade do análogo 1 de agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon.
[0196] O conjugado de ligante-análogo 1 de agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG eluído foi analisado por ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, e alta pureza foi confirmada já que a pureza foi 90% ou mais em SE-HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 90% ou mais em IE- HPLC.
EXEMPLO 2-2. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DO ANÁLOGO 2 DO AGONISTA TRIGONAL GLP-1/GIP/GLUCAGON
[0197] Um conjugado de longa duração (ligante-análogo 2 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG) foi preparado por meio da conjugação de peptídeo do análogo 2 do agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon (SEQ ID NO: 2), depois da cromatografia de troca aniônica do Exemplo 1-1, sem realizar ultrafiltração/diafiltração.
[0198] [SEQ ID NO: 2] Glu 16 (em vermelho) e Lys20 (em vermelho) ligados por anel de Lactama
[0199] Neste particular, a fim de ligar um grupo reativo a maleimida em um terminal de PEG da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada ao análogo 2 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi reagida com o análogo 2 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon em uma razão molar de 1:1 com uma concentração do análogo 2 do agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon de 0,2 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 2 horas. A reação foi realizada em um tampão Tris-Cl (6°C ± 4°C) incluindo isopropanol. Em decorrência da análise do resultante depois da reação usando ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, a pureza do conjugado de longa duração incluindo o análogo 2 do agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon foi confirmada como 90% ou mais em SE-HPLC, 80% ou mais em RP-HPLC, e 70% ou mais em IE-HPLC.
[0200] Posteriormente, o resultante da reação foi sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica uma vez usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare). Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 2 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina- PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio. Foi confirmado que um rendimento aqui obtido foi aumentado em cerca de duas vezes ou mais, se comparado a um rendimento do Exemplo Comparativo 1 com a mesma quantidade do análogo 2 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon.
[0201] O conjugado de ligante-análogo 2 do agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG eluído foi analisado por ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, e alta pureza foi confirmada, já que a pureza foi 90% ou mais em SE-HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 80% ou mais em IE- HPLC.
EXEMPLO 2-3. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DO ANÁLOGO 3 DO AGONISTA TRIGONAL GLP-1/GIP/GLUCAGON
[0202] Um conjugado de longa duração (ligante-análogo 3 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG) foi preparado por meio da conjugação de peptídeo do análogo 3 do agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon (SEQ ID NO: 3), depois da cromatografia de troca aniônica do Exemplo 1-1, sem realizar ultrafiltração/diafiltração.
[0203] [SEQ ID NO: 3] Glu 16 (em vermelho) e Lys20 (em vermelho) ligados por anel de Lactama
[0204] Neste particular, a fim de ligar um grupo reativo a maleimida em um terminal de PEG da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada à cisteína do análogo 3 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, a região Fc de imunoglobulina mono- PEGuilada foi reagida com o análogo 3 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon em uma razão molar de 1:1 com uma concentração do análogo 3 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon de 0,2 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 2 horas. A reação foi realizada em um tampão Tris-Cl (6°C ± 4°C) incluindo isopropanol. Em decorrência da análise do resultante depois da reação usando ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE- HPLC, a pureza foi confirmada como 90% ou mais em SE-HPLC, 80% ou mais em RP-HPLC, e 70% ou mais em IE-HPLC.
[0205] Posteriormente, o resultante da reação foi sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica uma vez usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare). Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado do ligante-análogo 3 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina- PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio. Foi confirmado que um rendimento aqui obtido foi aumentado em cerca de duas vezes ou mais, se comparado a um rendimento do Exemplo Comparativo 1 com a mesma quantidade do análogo 3 do agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon.
[0206] O conjugado do ligante-análogo 3 do agonista trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG eluído foi analisado por ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, e alta pureza foi confirmada, já que a pureza foi 90% ou mais em SE-HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 90% ou mais em IE- HPLC.
EXEMPLO 2-4. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DO ANÁLOGO 1 DE GLUCAGON
[0207] Um conjugado de longa duração (ligante-análogo 1 de Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG) foi preparado por meio da conjugação do peptídeo do análogo 1 de Glucagon (SEQ ID NO: 4), depois da cromatografia de troca aniônica do Exemplo 1-1, sem realizar ultrafiltração/diafiltração.
[0208] [SEQ ID NO: 4] Aib = ácido 2-aminoisobutírico Glu16 (em vermelho) e Lys20 (em vermelho) ligados por anel de Lactama
[0209] Neste particular, a fim de ligar um grupo reativo a maleimida em um terminal de PEG da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada ao análogo 1 de Glucagon, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi reagida com o análogo 1 de Glucagon em uma razão molar de 1:1 com uma concentração do análogo 1 de Glucagon de 0,2 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 2 horas. A reação foi realizada em um tampão Tris-Cl (6°C ± 4°C) incluindo isopropanol. Em decorrência da análise do resultante depois da reação usando ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, a pureza do ligante-análogo 1 de Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi confirmada como 90% ou mais em SE-HPLC, 70% ou mais em RP-HPLC, e 70% ou mais em IE-HPLC.
[0210] Posteriormente, o resultante da reação foi sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica uma vez usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare). Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 1 de Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio. Foi confirmado que um rendimento aqui obtido foi aumentado em cerca de 1,5 vezes ou mais, se comparado a um rendimento do Exemplo Comparativo 2 com a mesma quantidade do análogo 1 de Glucagon.
[0211] O conjugado de ligante-análogo 1 de Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG eluído foi analisado por ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, e alta pureza foi confirmada, já que a pureza foi 90% ou mais em SE-HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 90% ou mais em IE-HPLC.
EXEMPLO 2-5. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DO ANÁLOGO 2 DO GLUCAGON
[0212] Um conjugado de longa duração (ligante-análogo 2 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG) foi preparado por meio da conjugação do peptídeo do análogo 2 do Glucagon (SEQ ID NO: 5), depois da cromatografia de troca aniônica do Exemplo 1-1, sem realizar ultrafiltração/diafiltração.
[0213] [SEQ ID NO: 5] Glu16 (em vermelho) e Lys20 (em vermelho) ligados por anel de Lactama
[0214] Neste particular, a fim de ligar um grupo reativo a maleimida em um terminal de PEG da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada ao análogo 2 do Glucagon, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi reagida com o análogo 2 do Glucagon em uma razão molar de 1:1 com uma concentração do análogo 2 do Glucagon de 0,2 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 2 horas. A reação foi realizada em um tampão Tris-Cl (6°C ± 4°C) incluindo isopropanol. Em decorrência da análise do resultante depois da reação usando ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, a pureza do ligante-análogo 2 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi confirmada como 90% ou mais em SE-HPLC, 70% ou mais em RP-HPLC, e 70% ou mais em IE-HPLC.
[0215] Posteriormente, o resultante da reação foi sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica uma vez usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare). Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 2 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio. Foi confirmado que um rendimento aqui obtido foi aumentado em cerca de 1,5 vezes ou mais, se comparado a um rendimento do Exemplo Comparativo 2 com a mesma quantidade de análogo 2 do Glucagon.
[0216] O conjugado de ligante-análogo 2 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG eluído foi analisado por ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, e alta pureza foi confirmada, já que a pureza foi 90% ou mais em SE-HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 90% ou mais em IE-HPLC.
EXEMPLO 2-6. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DO ANÁLOGO 3 DO GLUCAGON
[0217] Um conjugado de longa duração (ligante-análogo 3 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG) foi preparado por meio da conjugação do peptídeo do análogo 3 do Glucagon (SEQ ID NO: 6), depois da cromatografia de troca aniônica do Exemplo 1-1, sem realizar ultrafiltração/diafiltração.
[0218] [SEQ ID NO: 6]
[0219] Neste particular, a fim de ligar um grupo reativo a maleimida em um terminal de PEG da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada à cisteína do análogo 3 do Glucagon, a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada foi reagida com o análogo 3 do Glucagon em uma razão molar de 1:1 com uma concentração do análogo 3 do Glucagon de 0,2 g/L em 6°C ± 4°C por cerca de 2 horas. A reação foi realizada em um tampão Tris-Cl (6°C ± 4°C) incluindo isopropanol. Em decorrência da análise do resultante depois da reação usando ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, a pureza do ligante-análogo 3 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi confirmada como 90% ou mais em SE-HPLC, 70% ou mais em RP-HPLC, e 70% ou mais em IE-HPLC.
[0220] Posteriormente, o resultante da reação foi sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica uma vez usando uma coluna Source 15ISO (GE Healthcare). Subprodutos foram eliminados por este processo, e um conjugado de ligante-análogo 3 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG foi obtido. Neste caso, a purificação foi realizada usando um tampão que inclui citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio. Foi confirmado que um rendimento aqui obtido foi aumentado em cerca de 1,5 vezes ou mais, se comparado ao rendimento existente com a mesma quantidade de análogo 3 do Glucagon.
[0221] O conjugado de ligante-análogo 3 do Glucagon contendo região Fc de imunoglobulina-PEG eluído foi analisado por ensaios SE-HPLC, RP-HPLC e IE-HPLC, e alta pureza foi confirmada já que a pureza foi 90% ou mais em SE-HPLC, 90% ou mais em RP-HPLC, e 90% ou mais em IE-HPLC.
[0222] As Tabelas 1 e 2 mostram os resultados da comparação entre os métodos dos exemplos comparativos e dos exemplos. Tabela 1 Comparação Entre Métodos de Preparação de Análogo do Agonista Trigonal GLP- 1/GIP/Glucagon Tabela 2 Comparação Entre Métodos de Preparação de Análogos do Glucagon
[0223] A descrição exposta da presente invenção é provida com o propósito de ilustração, e será entendido pelos versados na técnica que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem mudar a concepção técnica e as características essenciais da presente invenção. Assim, fica claro que as supradescritas modalidades são ilustrativas em todos os aspectos, e não limitam a presente invenção. Portanto, o escopo da revelação é definido não pela descrição detalhada, mas pelas reivindicações e seus equivalentes, e todas as variações no escopo das reivindicações e seus equivalentes devem ser interpretadas como sendo incluídas na revelação.

Claims (33)

1. Composto com uma estrutura da Fórmula 1 a seguir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: [Fórmula 1] X-L1-O(CH2CH2θ)n-L2-R caracterizado por, na Fórmula 1 exposta, X ser uma região Fc de imunoglobulina e compreender, no N-terminal, uma sequência de dobradiça que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (Pro-Ser-Cys-Pro); L1 ser um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada e ligado a um grupo reativo amina localizado em uma extremidade de X; L2 ser -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, em que a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n ser de 10 a 2.400; e R ser maleimida.
2. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na Fórmula 1, L1 ser um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 ser -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-, em que a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n ser de 200 a 250; e R ser maleimida.
3. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o L1 ser ligado a um resíduo de prolina (Pro) de SEQ ID NO: 9.
4. Composto com uma estrutura da Fórmula 2 a seguir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: [Fórmula 2] caracterizado por, na Fórmula 2 exposta, n ser de 200 a 250.
5. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser derivada a partir de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM.
6. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
7. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser em uma forma dimérica.
8. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina compreender uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
9. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto ter um tamanho de 40 kDa a 250 kDa.
10. Composição para preparar um conjugado de fármaco de longa duração, caracterizada por compreender um composto com uma estrutura da Fórmula 1 a seguir, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o fármaco é um polipeptídeo fisiologicamente ativo: [Fórmula 1] X-L1-O(CH2CH2θ)n-L2-R na Fórmula 1 exposta, X é uma região Fc de imunoglobulina e compreende, no N-terminal, uma sequência de dobradiça que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (Pro-Ser-Cys-Pro); L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada e ligado a um grupo reativo amina localizado em uma extremidade de X; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, em que a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e R é maleimida.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por, na Fórmula 1 exposta, L1 ser um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 ser -a1-NHCO- ou -a1-NHCO-a2-, em que a1 e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n ser de 200 a 250; e R ser maleimida.
12. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o polipeptídeo fisiologicamente ativo ser selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação a interleucina, proteína de ligação a citocina, fator de ativação de macrófago, peptídeo de macrófago, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor do tumor, fator de crescimento da metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX, e XIII, fator de ativação do plasminogênio, peptídeo de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora dos ossos, calcitonina, atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor de via do fator tecidual, hormônio estimulador do folículo, hormônio luteinizante, hormônio de liberação do hormônio luteinizante, fator de crescimento do nervo, hormônio da paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante a insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo de liberação da gastrina, fator de liberação da corticotropina, hormônio estimulador da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista dual GLP-1/GIP, agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos da superfície celular, antígenos de vacina derivados do vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpo.
13. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por R do composto da composição ser ligado à cisteína do fármaco.
14. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por a região Fc de imunoglobulina ser derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
15. Método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, o método caracterizado por compreender: preparar um conjugado pela ligação de uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada, preparada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 a seguir no N- terminal de uma região Fc de imunoglobulina compreendendo uma sequência de dobradiça que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (Pro- Ser-Cys-Pro) em um polipeptídeo fisiologicamente ativo: [Fórmula 3] CHO-L1-O(CH2CH2O)n-L2-R em que, na Fórmula 3 exposta, L1 é um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 é -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, - COO-b2-, ou -b1-COO-b2-, em que a1, a2, b1, e b2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n é de 10 a 2.400; e; R é maleimida.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada ser preparada pela ligação do ligante da Fórmula 3 exposta no N-terminal da região Fc de imunoglobulina em um pH de 4,0 a 8,0 na presença de um agente de redução.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o conjugado ser preparado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada no polipeptídeo fisiologicamente ativo em um pH de 5,5 a 8,0.
18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a preparação do conjugado ser realizada pela reação da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada com o polipeptídeo fisiologicamente ativo em uma razão molar de 1:1 a 1:3.
19. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o método compreender: preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 no N-terminal da região Fc de imunoglobulina; e preparar um conjugado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada na etapa prévia em um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada ser ligado a um resíduo de cisteína do polipeptídeo fisiologicamente ativo.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o método compreender: preparar uma região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada pela ligação de um ligante da Fórmula 3 no N-terminal de uma região Fc de imunoglobulina; purificar a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada preparada na etapa prévia por cromatografia de troca aniônica em uma solução de tampão com um pH de 6,0 a 8,5; e preparar um conjugado pela ligação do ligante da região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada purificada na etapa prévia a um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o método ser realizado sem ultrafiltração/diafiltração depois de preparar a região Fc de imunoglobulina mono-PEGuilada.
23. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender adicionalmente purificar o conjugado por cromatografia de interação hidrofóbica.
24. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por, na Fórmula 3, L1 ser um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; L2 ser -a1- NHCO- ou -a1-NHCO-a2-, em que al e a2 são, cada qual, independentemente, um alquileno C1-C6 de cadeia reta ou ramificada; n ser de 200 a 250; e R ser maleimida.
25. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o ligante ter uma estrutura da Fórmula 4 a seguir: [Fórmula 4] em que, na Fórmula 4 exposta, n é de 200 a 250.
26. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o ligante ter um tamanho de 1 kDa a 100 kDa.
27. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o polipeptídeo fisiologicamente ativo ser selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação a interleucina, proteína de ligação a citocina, fator de ativação de macrófago, peptídeo de macrófago, fator de célula B, fator de célula T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor do tumor, fator de crescimento da metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX, e XIII, fator de ativação do plasminogênio, peptídeo de ligação a fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora dos ossos, calcitonina, atriopeptina, fator de indução da cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, inibidor de via do fator tecidual, hormônio estimulador do folículo, hormônio luteinizante, hormônio de liberação do hormônio luteinizante, fator de crescimento do nervo, hormônio da paratireoide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante a insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo de liberação da gastrina, fator de liberação da corticotropina, hormônio estimulador da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, agonista dual GLP-1/GIP, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos da superfície celular, antígenos de vacina derivados do vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpo.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o polipeptídeo fisiologicamente ativo ser um agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, glucagon, ou um análogo dos mesmos.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o polipeptídeo fisiologicamente ativo incluir qualquer uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 1 a 6.
30. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a região Fc de imunoglobulina ser derivada a partir de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
31. Composição caracterizada por compreender um composto com uma estrutura da Fórmula 2 a seguir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: [Fórmula 2] em que, na Fórmula 2 exposta, n é de 200 a 250, e em que o fármaco é um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
32. Método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo, o método caracterizado por compreender: preparar um conjugado pela ligação de um composto com uma estrutura da Fórmula 2 a seguir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo em um polipeptídeo fisiologicamente ativo: [Fórmula 2] em que, na Fórmula 2 exposta, n é de 200 a 250.
33. Conjugado de fármaco de longa duração, caracterizado por um composto com uma estrutura de Fórmula 2 a seguir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ser conjugado a um polipeptídeo fisiologicamente ativo: Fórmula 2 em que na Fórmula 2 acima, n é de 200 a 250, e em que o polipeptídeo fisiologicamente ativo é selecionado do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), hormônio de crescimento humano (hGH), eritropoietina (EPO), glucagon, insulina, hormônio liberador do hormônio do crescimento, peptídeo liberador de hormônio de crescimento, interferonas, receptores de interferona, receptores acoplados em proteína G, interleucinas, receptores de interleucina, enzimas, proteína de ligação à interleucina, proteína de ligação à citocina, fator de ativação de macrófagos, peptídeo de macrófagos, fator de células B, fator de células T, proteína A, inibidor de alergia, glicoproteína de necrose da célula, imunotoxina, linfotoxina, fator de necrose tumoral, supressor de tumor, fator de crescimento de metástase, α-1 antitripsina, albumina, α-lactalbumina, apolipoproteína-E, eritropoietina altamente glicosilada, angiopoietinas, hemoglobina, trombina, peptídeo de ativação do receptor de trombina, trombomodulina, fatores sanguíneos VII, VIIa, VIII, IX e XIII, fator ativador do plasminogênio, peptídeo de ligação à fibrina, uroquinase, estreptoquinase, hirudina, proteína C, proteína reativa C, inibidor de lenina, inibidor de colagenase, superóxido dismutase, leptina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epitelial, fator de crescimento epidérmico, angiostatina, angiotensina, fator de crescimento ósseo, proteína estimuladora óssea, calcitonina, atriopeptina, fator indutor de cartilagem, elcatonina, fator de ativação do tecido conjuntivo, tecido inibidor da via do fator, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio liberador do hormônio luteinizante, fator de crescimento nervoso, hormônio da paratireóide, relaxina, secretina, somatomedina, fator de crescimento semelhante à insulina, hormônio adrenocortical, colecistocinina, polipeptídeo pancreático, peptídeo liberador de gastrina, fator liberador de corticotropina , hormônio estimulante da tireoide, autotaxina, lactoferrina, miostatina, incretinas, polipeptídeo inibitório gástrico (GIP), agonista duplo GLP- 1/GIP, agonista trigonal GLP-1/GIP/Glucagon, antígenos de superfície celular, antígenos de vacina derivados de vírus, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e fragmentos de anticorpos.
BR112022000760-4A 2019-07-18 2019-07-18 Composições, método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e conjugado de fármaco de longa duração BR112022000760B1 (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2019/008912 WO2021010532A1 (ko) 2019-07-18 2019-07-18 신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112022000760A2 BR112022000760A2 (pt) 2022-03-15
BR112022000760B1 true BR112022000760B1 (pt) 2024-01-02

Family

ID=74210441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112022000760-4A BR112022000760B1 (pt) 2019-07-18 2019-07-18 Composições, método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e conjugado de fármaco de longa duração

Country Status (12)

Country Link
US (2) US11717577B2 (pt)
EP (1) EP4001303A4 (pt)
JP (2) JP7394207B2 (pt)
KR (2) KR102478588B1 (pt)
CN (1) CN114945587A (pt)
AU (1) AU2019457235C1 (pt)
BR (1) BR112022000760B1 (pt)
CA (1) CA3147883C (pt)
MX (1) MX2022000758A (pt)
NZ (1) NZ784956A (pt)
PE (1) PE20220393A1 (pt)
WO (1) WO2021010532A1 (pt)

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
MY149128A (en) 2005-08-16 2013-07-15 Hanmi Science Co Ltd A method for the mass production of immunoglobulin fc region deleted initial methionine residues
BRPI0710011A2 (pt) 2006-04-14 2011-08-02 Trubion Pharmaceuticals Inc proteìnas de ligação compreendendo articulação de imunoglobulina e regiões fc dotadas de funções efetoras fc alteradas
CA2688275A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
US9950564B2 (en) * 2010-04-05 2018-04-24 Douglas G. Willis Articulating carriage
CA2792942A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
KR101382593B1 (ko) * 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
GB201203071D0 (en) * 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
KR102073748B1 (ko) * 2013-01-31 2020-02-05 한미약품 주식회사 재조합 효모 형질전환체 및 이를 이용하여 면역글로불린 단편을 생산하는 방법
RU2677796C9 (ru) 2013-03-05 2019-03-15 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом
JP6602746B2 (ja) * 2013-03-15 2019-11-06 カポン、ダニエル・ジェイ． 非ペプチジル結合を含むハイブリッド免疫グロブリン
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
EP3341025A4 (en) 2015-09-24 2019-05-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PROTEIN COMPLEX BY USING A SPECIFIC ROLE OF AN IMMUNOMOBILIN FRAGMENT FOR LINKING
KR102247701B1 (ko) * 2016-02-26 2021-05-03 한미정밀화학주식회사 폴리에틸렌글리콜 디알데히드 유도체의 제조방법
JP6937773B2 (ja) * 2016-03-07 2021-09-22 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド ポリエチレングリコール誘導体及びその用途
JP7121024B2 (ja) * 2017-02-07 2022-08-17 ハンミ ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド 非ペプチド性重合体リンカー化合物、そのリンカー化合物を含む結合体、及びそれらの製造方法
CN111164128A (zh) * 2017-09-29 2020-05-15 韩美药品株式会社 包含作为接头的非肽基聚合物偶联的脂肪酸衍生物化合物的蛋白复合物及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022000760A2 (pt) 2022-03-15
EP4001303A4 (en) 2023-05-31
US20230248843A1 (en) 2023-08-10
JP7394207B2 (ja) 2023-12-07
AU2019457235B2 (en) 2022-06-16
JP2022532445A (ja) 2022-07-14
CN114945587A (zh) 2022-08-26
PE20220393A1 (es) 2022-03-18
US20230103271A2 (en) 2023-03-30
AU2019457235C1 (en) 2022-12-22
KR20210010428A (ko) 2021-01-27
AU2019457235A1 (en) 2022-03-03
US11717577B2 (en) 2023-08-08
KR102478588B1 (ko) 2022-12-16
WO2021010532A1 (ko) 2021-01-21
JP2023182575A (ja) 2023-12-26
KR20220022899A (ko) 2022-02-28
NZ784956A (en) 2023-01-27
US20220257788A1 (en) 2022-08-18
MX2022000758A (es) 2022-02-11
CA3147883C (en) 2024-01-02
CA3147883A1 (en) 2021-01-21
KR102334315B1 (ko) 2021-12-06
EP4001303A1 (en) 2022-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7322105B2 (ja) 免疫グロブリンＦｃフラグメント結合を用いたタンパク質及びペプチドの溶解度を改善する方法
TWI708782B (zh) 新穎胰島素類似物及其用途
US20190248858A1 (en) Novel feline erythropoietin receptor agonists
KR20210111190A (ko) 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
ES2799326T3 (es) Un conjugado de fc de inmunoglobulina que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de inmunoglobulina a fcrn
CN112839681A (zh) 寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物及其医学用途
US20230310631A1 (en) Therapeutic use of glucagon derivative or conjugate thereof for liver disease
BR112022000760B1 (pt) Composições, método para preparar um conjugado de longa duração de um polipeptídeo fisiologicamente ativo e conjugado de fármaco de longa duração
RU2805873C2 (ru) Новый способ получения длительно действующего конъюгата лекарственного средства посредством получения промежуточного соединения
TW201321404A (zh) 加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物
US20220273808A1 (en) Novel method of preparing protein conjugate
EP4321170A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating chronic kidney disease containing glucagon derivative
KR20210009980A (ko) 단백질 결합체의 신규 제조 방법
KR20210144609A (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 삼중 활성체의 지속형 결합체의 액상 제제
CA3179707A1 (en) Liquid formulation
KR20230095666A (ko) 간 표적 물질 및 이의 용도
BR112016022844B1 (pt) Método e composição para aperfeiçoar a solubilidade de proteína e peptídeo em solução aquosa que compreende um fragmento fc de imunoglobulina
EA040489B1 (ru) Способ улучшения растворимости белка и пептида за счет использования связывания с фрагментом fc иммуноглобулина

Legal Events

Date Code Title Description
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 18/07/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS