KR20210111190A - 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법 - Google Patents

단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캐리어를 위치특이적으로 단백질 또는 펩타이드에 결합함으로써 혈중 반감기를 늘리고 면역원성을 감소시키는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체는 인체 내 면역원성이 현저히 저하되어 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체 생성률이 저하되므로, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 임상 효력 감소 현상이 낮고, 면역반응에 대한 안전성이 높은 지속형 제재 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법{Method of decreasing immunogenicity of protein and pepteide}
본 발명은 캐리어를 위치특이적으로 단백질 또는 펩타이드에 결합함으로써 혈중 반감기를 늘리고 면역원성을 감소시키는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
생물학적 치료제에 대한 면역반응은 비인간 및 인간 유래 단백질 모두에 대해 널리 유발될 수 있다. 이러한 반응은 임상 효과를 약화시키고, 효력을 제한시키기도 하며, 때때로 병적 질환을 유발하거나 심지어 환자의 사망을 일으키기도 한다. 특히 재조합 자가 단백질을 대상으로 하는 중화항체의 생성은 환자 본래의 체내 단백질과 교차반응을 유발할 수 있으므로 심각한 결과를 초래할 수 있다.(Lim LC. Acquired red cell aplasia in association with the use of recombinant erythropoietin in chronic renal failure. Hematology 2005 10(3):255-9). 단클론 항체와 같은 바이오 의약품의 문제점은 분자생물학의 발전과 함께 크게 감소하였다. 그러나 많은 재조합 단백질 의약품들은 체내에서 발현되는 단백질 서열과 동일하므로 여전히 중화 면역 반응을 일으킬 가능성이 남아있다 (Namaka M, Pollitt-Smith M, Gupta A, Klowak M, Vasconcelos M, Turcotte D, Gong Y, Melanson M. The clinical importance of neutralizing antibodies in relapsing-remitting multiple sclerosis. Curr Med Res Opin 2006 22(2):223-39). 여전히 명확하지는 않지만, 면역원성을 유발하는 기전은 제품과 환자의 여러가지 요소에 의해 자가 단백질에 대한 저항성이 깨어지는 것이며 (reviewed in Chester, K, Baker, MP and Mayer A. Overcoming the immunologic response to foreign enzymes in cancer therapy. Expert Rev Clin Immunol 2005 1(4): 549-559, Baker MP and Jones TD. Identification and removal of immunogenicity in therapeutic proteins. Curr. Opin. Drug Disc Dev 2007 10(2):219-227). 이것은 용량, 투여의 빈도와 경로, 단백질 의약품의 면역조절 능력과 그 제형 등을 포함한다. 면역반응을 유발하는 가장 중요한 요소는 CD4+ T 세포 반응을 효과적으로 자극할 수 있는 항원인식부위 (epitope)를 지녔느냐 하는 점이다(reviewed Baker MP and Jones TD. Identification and removal of immunogenicity in therapeutic proteins. Curr. Opin. Drug Disc Dev 2007 10(2):219-227).
엑센딘-4(exendin-4)는 길러몬스터 도마뱀(Gila monster lizard)의 침샘에서 발견된 천연 펩타이드로 인간 GLP-1(glucagon-like peptide-1)과는 52%의 서열 유사성을 지니며, 엑센딘-4와 GLP-1은 유사한 인슐린 분비능을 갖고 있다. 그러나 GLP-1은 디펩티딜 펩티다아제-IV(dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV)에 의해 빠르게 비활성화 되어 매우 짧은 반감기를 지닌 반면, 엑센딘-4는 두번째 아미노산 서열의 알라닌 대신 존재하는 글리신에 의하여 DPP-IV에 대한 저항성을 보유함으로써, 2형 당뇨의 치료제로서 보다 효과적일 수 있다. 또한, 인슐린 또는 이의 아날로그, GLP-1/글루카곤 이중 작용제 역시 당뇨병 또는 비만 치료제 등으로 사용된다. 그러나 이러한 비인간 아미노산 서열의 존재는 T 세포에 대한 항원인식부위로 작용할 수 있다. 합성 엑센딘-4로서 2형 당뇨 치료제로 승인받은 exenatide (Byetta®는 임상시험에서 1년간 Exenatide 투여를 받은 환자 중 약 30%이상의 exenatide에 대한 항체가 생성되었으며 최근 승인된 Lixisenatide는 약 60~71%의 항체가 생성되었다(Zinman, B., Hoogwerf, B.J., Garcia, S.D., Milton, D.R., Giaconia, J.M., Kim, D.D., Trautmann, M.E., Brodows, R.G. The Effect of adding Exenatide to a Thiazolidinedione in suboptimally controlled type 2 diabetes. Annals of Internal Medicines. 2007 146(7): 477-486; Schnabel CA, Fineberg ES and Kim DD. Immunogenicity of xenopeptide hormone therapies. Peptides 2006 27:1902-1910; DeFronzo, R.A., Ratner, R.E., Han, J., Kim, D.D., Fineman, M.S., Baron, A.D. Effects of exenatide (exendin-4) on glycaemic control and weight over 30 weeks in metformin-treated patients with type 2 diabetes. Diabetes Care 2005 28:1092-1100; Buse, J.B., Henry, R.R., Han, J., Kim, D.D., Fineman, M.S., Alain, D. et al. Effects of exenatide (exendin-4) on glycaemic control over 30 weeks in sulfonylurea-treated patients with type 2 diabetes. Diabetes Care 2004 27:2628-2635). 즉, 치료 대상 생체 내에서 외래 물질로 인식되어 항체가 생성되어 효과적인 치료 효과를 기대하기 어려운 문제점이 대두되고 있다.
이에, 치료나 예방 목적으로 오랜 기간 체내에 노출이 이루어지는 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 경우 면역원성을 제어하는 것이 중요하다. 특히 인슐린이나 인슐린 분비 펩타이드, 항비만 단백질 등의 성인병 관련 생리 활성 단백질 또는 펩타이드는 투여 후 체내에 오래 지속할 수 있는 지속형 제제로 개발하는 경우가 많다. 또한, 지속형 제제가 아니더라도 여러 차례 장기간 투여하여야 하는 경우가 많아 면역 반응을 유발하지 않도록 하는 것이 중요한 문제가 되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 면역 반응을 유발하지 않는 단백질 또는 펩타이드 의약 제제의 개발을 위해 예의 노력한 결과, 캐리어를 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합시킴으로써, 면역원성이 캐리어가 결합되지 않은 단백질 또는 펩타이드에 비해 면역원성이 감소하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 체내 면역원성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 캐리어가 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 비말단에 링커 또는 공유결합에 의해 결합된, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체를 포함하는, 생체 내 면역원성 감소용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 비말단인 내부 잔기에 캐리어를 결합시키는 단계를 포함하는, 캐리어가 결합되지 않은 생리 활성 단백질 또는 펩타이드에 비하여 면역원성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명자는 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 말단이 아닌 내부의 위치에 비펩타이드성 링커와 Fc 단편을 결합하여, 목적 펩타이드가 항원으로서 작용하는 기전을 억제함으로써 펩타이드의 면역원성을 낮추는 방법을 개발하였으며, 이와 같이 제조하는 방법을 사용하는 경우, 펩타이드의 N 말단 등 다른 위치에 수식하여 결합체를 제조하는 것과 비교하여 T 세포의 활성화 및 동물에서의 항체 생성 반응을 현저히 억제함을 확인하여, 기존 단백질 의약 제제로 사용되는 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체를 새로운 용도인 면역원성 감소용 조성물, 또는 방법으로 사용할 수 있음을 최초로 제공하고자, 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 한 측면에서는 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 내부 위치에 캐리어가 연결된 결합체를 제조함으로써 캐리어가 연결되지 않은 해당 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 비결합체보다 체내 면역원성을 감소시키는 방법을 제공한다.
이와 같은 체내 면역원성 감소 여부는 공지의 방법에 의해 제한 없이 측정할 수 있다. 예를 들어, N-말단과 C-말단을 포함한 N-말단 이외 부위들에 각각 캐리어를 결합(커플링) 하여 엑스 비보(ex vivo) T 세포의 활성 측정법으로 면역원성의 차이를 확인할 수 있다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와도 공유결합을 형성할 수 있다. 반응 pH를 달리하며 페길화(pegylation) 반응을 진행한 후, 이온교환컬럼을 사용하여 반응 혼합물로부터 위치이성질체를 분리할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 말레이미드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
생체 내 활성에 중요한 부위인 N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 있는 아민 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 알데히드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
N-말단의 보호방법은 디메틸화 외에 메틸화, 탈아미노화(deamination) 또는 아세틸화 방법으로도 가능하며, 이들 예시 방법에만 한정되지 않는다.
본 발명에서, "생리 활성 단백질 또는 펩타이드"는 유전표현 또는 생리 기능을 조절하는 단백질 또는 펩타이드를 의미하며, 본 발명의 방법에 의해 비말단인 내부 잔기에 비펩타이드성 링커 및/또는 캐리어가 연결된 비펩타이드성 링커가 결합되어 체내 면역원성이 감소되는 생리 활성 단백질 또는 펩타이드는 제한 없이 포함된다.
또한, 상기 생리활성 단백질 또는 펩타이드는 천연형 생리활성 단백질 또는 펩타이드 이외에 이의 유도체, 변이체, 또는 이의 단편 등을 모두 포함한다.
그 예로, 항비만 펩타이드, 인슐린 분비 펩타이드 및 그 아날로그, 렙틴, 인슐린, 인슐린 아날로그, 글루카곤, 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘-유사 펩타이드류 (GLP-1등), GLP-1/글루카곤 이중 작용제, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 크롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장인자 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류일 수 있다.
본 발명에서 인슐린이란 인슐린 수용체 자극 활성이 있는 모든 펩타이드 또는 변형 펩타이드를 망라하는데, 예를 들어 천연형 인슐린, 속효성 인슐린, basal 인슐린, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 변형이 일어난 물질인 인슐린 아날로그, 또는 이들의 단편 일 수도 있다. 또한 본 발명에서 인슐린은 짧은 반감기를 극복하기 위한 지속형 기술을 적용한 지속형 인슐린 일 수 있다. 바람직하게는 일주 일회 투여 가능한 지속형 인슐린 혹은 지속형 인슐린 아날로그다. 본 발명에 따른 인슐린의 구체적인 예를 일부만 들자면 대한민국 등록특허 제10-1058290호, 대한민국 특허출원 제10-2014-0022909호 및, 제10-2014-0006938호에 기재된 인슐린 또는 인슐린 아날로그와 그 지속형들을 포함하나 그 범위는 제한되지 않는다
본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 의미한다.
상기 인슐린 아날로그는 인슐린의 B 쇄 또는 A 쇄의 아미노산이 변이된 인슐린 아날로그일 수 있다. 천연형 인슐린 아미노산 서열은 하기와 같다.
A 쇄 :Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
B 쇄 :
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
본 발명의 인슐린은 역방향 인슐린(inverted insulin), 인슐린 변이체(variants), 인슐린 단편(fragments) 등을 포함하며 제조법으로는 유전자 재조합뿐만 아니라 solid phase 방법으로도 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인슐린 아날로그는 인슐린과 동일한 생체내의 혈당 조절기능을 보유한 펩타이드로서, 이러한 펩타이드는 인슐린 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명의 인슐린 아고니스트는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A쇄, B쇄와 각각 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예;deamination) 또는 수식(예; N-methylation), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택하는 변형이 된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 아미노산 서열이 전형 상동성이 없어도 인슐린 수용체와 결합하여 혈당을 조절할 수 있는 펩타이드 미믹 및 저분자 혹은 고분자 화합물을 의미할 수 있다.
본 발명의 인슐린 단편은 인슐린에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연 상태에서 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산) 도 가능할 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
본 발명의 인슐린 변이체는, 인슐린과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 아미노말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination) 된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 B 쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 3번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 16번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 26번 아미노산, 27번 아미노산, 28번 아미노산, 29번 아미노산, 30번 아미노산, A쇄의 1번, 2번, 5번, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산 14번, 16번 아미노산, 17번 아미노산, 18번 아미노산 19번 및 21번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 이소루신, 발린, 글루타민, 글라이신, 라이신, 히스티딘, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 프로린, 세린, 트레오닌, 아스파틱산으로 치환된 것일 수 있다. 또한 하나 이상의 아미노산이 결실(deleltion)된 인슐린 아날로그도 본 발명의 범주에 속하나 인슐린 아날로그는 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 GLP-1/글루카곤 이중작용제란 천연형 GLP-1/글루카곤 이중작용제인 옥신토모듈린같이 GLP-1/글루카곤 이중작용 활성이 있는 모든 펩타이드 또는 이들의 단편, 전구물질, 변이체나 유도체를 망라한다. 본 발명에서 GLP-1/글루카곤 이중작용제는 짧은 반감기를 극복하기 위한 지속형 기술을 적용한 GLP-1/글루카곤 이중작용제 일 수 있으며 바람직하게는 일주 일회 투여 가능한 지속형 GLP-1/글루카곤 이중작용제이다. 본 발명에 따른 GLP-1/글루카곤 이중작용제의 구체적인 예를 일부만 들자면 대한민국 공개특허 제 10-2012-0137271호, 제 10-2012-0139579호에 기재된 GLP-1/글루카곤 이중작용제 및 그 유도체와 그 지속형들을 포함한다. 상기 특허 명세서는 본 발명의 참조로 모두 포함된다.
아울러, 본 발명의 "인슐린 분비 펩타이드"는 인슐린 분비 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 또는 발현을 자극할 수 있다. 상기 인슐린 분비 펩타이드는 바람직하게는 GLP(Glucagon like 펩타이드)-1, 엑센딘-3(exendin-3) 또는 엑센딘-4(exendin-4)이나 이에 제한되지 않는다. 상기 인슐린 분비 펩타이드에는 천연형 인슐린 분비 펩타이드뿐만 아니라, 그의 전구물질 (precursors), 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 유도체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 아미노(또는 아민) 그룹이 제거된 유도체(Desamino-histidyl 유도체), 아미노 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 유도체(beta-hydroxy imidazopropionyl-유도체), 아미노 그룹에 2개의 메틸(methyl) 잔기로 수식된 유도체(Dimethyl-histidyl-유도체), 아미노 말단의 아미노 그룹을 카복실 그룹으로 치환한 유도체(beta-carboxyimidazopropionyl-유도체) 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 삭제하여 이미다졸아세틸(imidazoacetyl) 그룹만을 남겨두어 아미노 그룹의 양전하(positive charge)를 제거한 유도체(Imidazoacetyl-유도체) 등이 포함될 수 있으며, 또한 기타 다른 형태의 아미노-말단 아미노 그룹 변이 유도체가 본 발명의 범주에 속한다.
그 예로, 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기를 화학적으로 변이시킨 유도체이며, 구체적으로 엑센딘-4의 아미노 말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본에 존재하는 알파 아미노 그룹 또는 알파 카본을 치환 또는 제거한 엑센딘-4 유도체이며, 더 구체적으로 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(Desaminohistidylexendin-4, DA-엑센딘-4), 하이드록실 그룹 또는 카복실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로 피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, HY-엑센딘-4), 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, CX-엑센딘-4), 2개의 메틸 잔기로 수식한 디메틸-히스티딜-엑센딘-4(Dimethyl-histidyl-exendin-4, DM-엑센딘-4), 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(Imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4) 등일 수 있다. 인슐린 분비 펩타이드에 관한 대한민국 공개 특허 제10-2012-0135123호 역시 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 사용가능한 캐리어 물질의 예를 일부만 들자면 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이나 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 이에 더하여 외래 펩타이드에 PEG를 결합시키면 때로는 외래 펩타이드에 존재하는 항원 부위가 면역세포에 의해 인식되는 것을 저해할 수 있다. 구체적으로는 펩타이드의 항원제시세포(antigen-presenting cell)에 의한 대식작용 및 세포 내 분해작용(proteolysis)을 저해하여 펩타이드가 항원으로 작용할 가능성을 낮출 수 있다. 특히 외래 단백질이 항원으로서 CD4+ T세포의 활성화를 자극하기 위해서는 MHC class II에 14-24개 가량의 짧은 펩타이드로서 결합하여 항원제시세포의 표면에 제시되어야 하는데, 이는 PEG의 결합부위에 따라 적절한 크기로 분해되는 과정에서 억제될 수 있다.
본 발명의 한 실시 형태에서는 상기 캐리어 물질과 상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드가 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된다. 본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 중합체의 예를 일부만 들자면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜이다. 이 기술 분야에 이미 알려진 전술한 예시 비펩타이드 중합체의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 펩타이드 결합을 지니고 있지 않은 물질이기 때문에 기본적으로 단백질 분해효소에 대한 저항성이 있어서 펩타이드의 혈중 반감기를 늘려줄 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위이면 적당하며, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역 글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체 뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
비펩타이드성 중합체에 알데히드 링커를 사용하면 N-말단과 라이신 잔기에 있는 아민 그룹과 반응하며, 선택적으로 반응 수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 인슐린분비 펩타이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, N-말단을 블러킹하는 방법, 라이신 잔기 치환 방법, 카르복시 말단에 아민 그룹을 도입방법 등을 사용하여 반응할 수 있는 아민 그룹을 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 페길화 및 커플링 수율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시 형태에서 상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드는 인슐린분비 펩타이드이다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 이외의 아민 그룹에 특이적으로 면역글로블린 Fc 영역이 결합 된 인슐린 분비 펩타이드 결합체이다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기에 선택적으로 커플링하기 위한 방법으로, 천연형 엑센딘-4에 PEG를 결합시킬 때 pH 9.0로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였으며, 다른 방법으로는 N-말단의 제거 또는 보호된 형태의 엑센딘-4 유도체에 PEG를 결합시킬 때 pH 7.5로 반응시켜 라이신 잔기로의 페길화 반응을 유도하였다.
N-말단 커플링의 경우와는 다르게, 라이신 잔기에 커플링되면 엑스 비보 T 세포 활성이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다 (표 4 내지 8).
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다.
또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하 는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제WO 96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins,
Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val,
Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황산화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화, 파네실화(farnesylation), 아세틸화 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때,동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다. 한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC,Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인 간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 한 구체적인 실시 형태에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 단백질 또는 펩타이드와 결합될 수 있는 반응기를 가진다. 더욱 구체적인 실시 형태에서 이 반응기는 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 자리잡는다. 상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피 온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹,
프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에
히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 제조할 수 있다.
이러한 본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 합성 및 분비 촉 진, 식욕억제, 체중감소, 베타 세포 혈중 글루코스 민감도 증가, 베타 세포 증식(beta cell proliferation) 촉진, gastric emptying 지연, 글루카곤 억제와 같은 기존의 인슐린 분비 펩타이드의 생체 내 활성이 유지될 뿐만 아니라 인슐린 분비 펩타이드의 혈중 반감기 및 이로 인한 상기 펩타이드의 생체 내 효력 지속 효과가 획기적으로 증가하게 하므로, 당뇨, 비만, 급성 관상동맥증후군(Acute coronary syndrome) 또는 다낭성 난소 증후군(Polycystic ovary syndrome) 치료에 유용하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 비말단인 내부 잔기에 캐리어가 비펩타이드성 링커에 의해 연결된, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체를 포함하는, 캐리어 비포함 조성물에 비하여 감소된 면역원성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체의 면역원성 감소용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 조성물은 지속성 제제의 부작용인 면역원성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
생리 활성 단백질 또는 펩타이드, 링커, 결합체는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
(1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 생리활성 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 단백질 또는 펩타이드와 결합된 생리활성 단백질 또는 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 생리활성 단백질 또는 펩타이드 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "연결체"란 비펩타이드성 중합체와 생리활성 단백질 또는 펩타이드만이 공유결합으로 연결된 중간체로서, 이후 이 연결체에 있는 비펩타이드성 중합체의 생리활성 단백질 또는 펩타이드가 연결되지 않은 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키게 된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은
(1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 라이신 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계;
(2) (1)의 반응 혼합물로부터 라이신잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 생리활성 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 단백질 또는 펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다. 더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 단백질 또는 펩타이드인 인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기는 pH 7.5 이상에서 연결된다.
본 발명의 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체는 인체 내 면역원성이 현저히 저하되어 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체 생성률이 저하되므로, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 임상 효력 감소 현상이 낮고, 면역반응에 대한 안전성이 높은 지속형 제재 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 엑스 비보 (ex vivo) T 세포 활성 시험에 사용된 공여자와 전세계 및 유럽, 북미 인구의 HLA-DR 유전자형 빈도 비교를 나타낸 도이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:엑센딘-4의 페길화(Pegylation)와 위치이성질체 분리
3.4K PropionALD(2) PEG(프로피온알데히드기를 2개 가지고 있는 분자량 3.4 kDa의 PEG, IDB Inc., 한국)를 천연형 엑센딘-4(미국 American Peptides)의 N-말단에 페길화시키기 위하여 펩타이드와 PEG의 몰비를 1 : 15, 펩타이드의 농도를 3mg/ml로 하여 4℃에서 90분간 반응하였다. 이 때 반응은 pH 4.0인 100mM 농도의 NaOAc 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 3.4K PropionALD(2) PEG를 엑센딘-4의 라이신(Lys) 잔기에 페길화시키기 위하여 펩타이드와 PEG의 몰비 1 : 30, 펩타이드 농도 3mg/ml로 4℃에서 3시간 동안 반응하였다. 이때 반응은 pH 9.0인 100mM 농도의 Na-Phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며 환원제인 20mM SCB를 첨가하여 반응하였다. 각 반응액은 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 통하여 일차적으로 모노-페길화된(Mono-pegylated) 펩타이드를 정제하였으며, SOURCES(XK 16ml,아머샴 바이오사이언스)를 통하여 이성질체를 분리하였다. N-말단이 페길화된 피크(N-term pegylated 피크)가 가장 앞쪽에 나오고 그 뒤쪽으로 차례로 2개의 라이신이 페길화된 피크(Lys Pegylated 피크)가 나옴을 알 수 있었다. 용출된 피크는 펩타이드 매핑(mapping) 방법으로 페길화된 위치를 확인할 수 있었다.
Lys12 페길화된 결합체가 먼저 용출되고, Lys27 페길화된 결합체는 가장 뒤쪽에서 용출되며 N-말단 위치이성체 및 Lys12 위치이성체와 완벽한 피크분리가 가능하였다.
Column : SOURCE Q (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스) 58-27
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →40% 80분 B (A: 20mM 트리스 pH8.5, B: A + 0.5M NaCl )
Column : SOURCE S (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →100% 50분 B (A : 20mM 구연산 pH3.0,B : A + 0.5M KCl)
실시예 2: CA 엑센딘-4 라이신 잔기 페길화(Pegylation)와 위치이성질체 분리
3.4K PropionALD(2) PEG를 CA 엑센딘-4(미국 American Peptides)의 라이신(Lys) 잔기에 페길화시키기 위하여 CA 엑센딘-4와 PEG의 몰 비를 1 : 30으로 하고, CA 엑센딘-4 농도를 3mg/ml로 하여 4℃에서 3시간 동안 반응하였다. CA 엑센딘-4는 천연형 엑센딘의 N-말단 히스티딘 잔기에서 알파 탄소가 삭제되고 측쇄의 β-탄소가 직접 카르복시 탄소에 이어진 N-말단 변형 엑센딘-4이다. 이때 반응은 pH 9.0인100mM 농도의 Na-Phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며 환원제인 20mM SCB를 첨가하여 반응하였다. 각 반응액은 SOURCE Q(XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)를 통하여 일차적으로 모노-페길화된(Mono-pegylated) 펩타이드를 정제하였으며, SOURCES(XK 16ml,아머샴 바이오사이언스)를 통하여 이성질체를 분리하였다. N-말단이 페길화된 피크(N-term pegylated 피크)가 가장 앞쪽에 나오고 그 뒤쪽으로 차례로 2개의 라이신이 페길화된 피크(Lys Pegylated 피크)가 나옴을 알 수 있었다. 용출된 피크는 펩타이드 매핑(mapping) 방법으로 페길화된 위치를 확인할 수 있었다.
Lys12 페길화된 결합체가 먼저 용출되고, Lys27 페길화된 결합체는 가장 뒤쪽에서용출되며 N-말단 위치이성체 및 Lys12 위치이성체와 완벽한 피크분리가 가능하였다.
Column : SOURCE Q (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →40% 80분 B (A: 20mM 트리스 pH8.5, B: A + 0.5M NaCl )
Column : SOURCE S (XK 16ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →100% 50분 B (A : 20mM 구연산 pH3.0,B : A + 0.5M KCl)
실시예 3: 이미다조-아세틸 (Imidazo-acetyl) 엑센딘-4(Lys27)-면역글로불린 Fc 결합체 제조
이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 3.4K PropionALD(2) PEG를 CA 엑센딘-4의 Lys과 반응시킨 후, 두개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크(Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다. 펩타이드와 면역글로블린 Fc 몰비를 1 : 8, 전체단백질농도를 60mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응 후 SOURCE Q 16ml과 SOURCE ISO 16ml을 이용한 2단계 정제방법은 실시예 2와 동일하다. HPLC 역상분석결과 순도 95.8%를 나타내었다.
실시예 4: 엑스 비보(ex vivo) 시험을 위한 인간 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 분리 및 공여자의 선별
인간 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 건강체 공여자로부터 채취한 혈액으로부터 24시간 이내에 분리하였다. 공여혈액은 UK National Blood Transfusion Service(Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK)로부터 제공되었다. 말초혈액 단핵세포는 림포프렙(LymphoprepTM, Axis-shield, Dundee, Scotland)을 이용한 밀도 구배 원심분리법을 이용하여 분리한 백혈구층 (buffy coat)로부터 분리하였으며, 이 중, CD8+ T 세포는 CD8+ 로제트셉 (CD8+ RosetteSepTM, StemCell Technologies Inc, London, UK)을 이용하여 제거되었다. 각 공여자의 말초혈액 단핵세포는 사용 전까지 액체질소 내에 보관되었다. 공여자의 세포는 HLA SSP-PCR based tissue-typing kit (Biotest, Solihull, UK)를 이용하여 HLA-DR 반수체 유전자형(haplotype)을 감별하고, T 세포의 반응성은 인플루엔자 A와 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr virus) 유래의 항원 펩타이드인 KLH(Keyhole Limpet Haemocyanin, Pierce (Perbio), Northumberland, UK)를 이용하여 시험하였다. 전세계 인구의 HLA-DR 타입의 빈도를 대표하는 50명의 공여자를 선별하여 하나의 코호트로 구성하였다. 코호트를 구성하는 각 공여자의 MHC class II 반수체 유전자형과 T 세포의 반응성을 표 1 내지 3에 나타내었으며, 공여자 유전자형의 빈도를 세계 인구의 빈도와의 비교 결과를 도 1에 나타내었다. 하기 표 1 내지 3은 공여자 별 HLA-DR 유전자형 및 항원 펩타이드 KLH에 대한 T 세포의 반응성을 나타낸 것이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
상기, 표 1 내지 3의 회색란은 공여 세포의 해동 전후의 KLH에 대한 반응성이 유의적으로 차이가 있었던 경우를 나타낸 것이다.
실시예 5: EpiScreen TM 엑스 비보 (ex vivo) T 세포 증식 시험
대표적인 생리활성 단백질 또는 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드의 페길레이션 위치에 따른 면역원성 억제 기전을 확인하기 위하여, 비결합 천연형 엑센딘-4와 비결합 CA 엑센딘-4, CA 엑센딘-4의 라이신 잔기에 페길레이션 된 연결체 펩타이드와 (CA Exendin-4-PEG(inter)), 천연형 엑센딘-4의 N-말단에 페길레이션 된 연결체 펩타이드(Exendin-4-PEG(N-term))의 T 세포 증식능을 비교하였다. 이 때 CA 엑센딘-4는 페길레이션 될 수 있는 N-말단 잔기를 갖고 있지 않으므로 CA 엑센딘-4에 대해서는 N-말단 페그화 연결체를 제조하지 않았다.
T 세포 증식 시험을 위하여 상기 공여자의 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 해동하여 세포수와 생존률을 측정하였다. 세포는 AIM-V ® 배양배지로 4-6x106세포/ml 되도록 희석하였다. 각 공여자 세포를 24구 배양 플레이트에 분주한 후, 시험 시료를 최종농도 50 ㎍/ml이 되도록 첨가하였다 (n=3). 각 공여자 세포에 대한 재현성 확인을 위하여 항원 펩타이드 KLH 처리군을 두었다. 모든 시험군과 대조군은 37°C, 5% CO2 조건의 배양기에서 8일 간 배양되었으며, 5, 6, 7, 8일째에 각각 세포 일부를 취하여 96구 배양 플레이트로 옮겨 세포증식률을 측정하였다. 세포증식률 측정을 위하여 구 당 0.75μi [3H]-Thymidine (Perkin Elmer® Buckinghamshire, UK)을 첨가하고 18시간 동안 배양한 후, TomTec Mach III 세포회수기를 이용하여 96구 필터 플레이트로 세포들을 회수하였다. 1450 Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter (Perkin Elmer® Buckinghamshire, UK)를 이용하여 각 구의 방사선 활성도 (cpm, count per minute)를 측정하였다. 결과는 자극 지표 (SI, stimulation index)의 실험적 역치에 기준하여 2 이상(SI≥2, p<0.05)의 경우를 양성(P)으로 판정하였다. SI≥1.9에 해당하는 경계값을 포함한 경우에는 별도로 표시(P*)하였다. 그 결과, CA 엑센딘-4와 엑센딘-4에 대해서 각각 12%와 10%의 공여자에서 양성반응을 확인하였으나, 펩타이드 내부에 페길레이션 된 CA 엑센딘-4는 모든 공여자에서 음성으로 확인되었다. 반면, N-말단에 페길레이션 된 엑센딘-4는 6%의 공여자에서 양성을 나타냄으로써, N-말단보다는 펩타이드 내부 라이신에 페길레이션된 경우, 펩타이드의 면역원성을 보다 현저히 저해함을 알 수 있었다 (표 4 내지 7). 표 4 내지 6은 T 세포 증식 및 인터류킨-2 (IL-2) 분비를 나타낸다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
표 7은 T 세포 증식 반응 강도 및 빈도 (SI≥1.9 경계값 포함)를 나타낸다.
Figure pat00007
상기와 같은 결과들은 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 말단이 아닌 내부 잔기에 비펩타이드성 중합체, 특히 PEG를 연결한 연결체의 면역원성이 저해됨을 시사하는 것이다.
실시예 6: EpiScreen TM 엑스 비보 (ex vivo) 인터루킨-2(IL-2) 분비 시험
대표적인 생리활성 단백질 또는 펩타이드인 인슐린분비 펩타이드의 페길레이션 위치에 따른 면역원성 억제 기전을 확인하기 위하여, EpiScreenTM T 세포 증식 시험과 동일한 시료와 공여자 세포를 이용하여 실시예 5의 연결체들과 비결합 엑센딘-4에 대하여 인터루킨-2 분비능을 비교 측정하였다. ELISpot 플레이트 (Millipore, Herts, UK)에 항인터루킨-2 항체 (R&D Systems, Abingdon, UK)를 결합시켰다. 플레이트를 PBS (phosphate-buffered saline)로 3회 수세한 후 블로킹 용액, 1% 우혈청 알부민을 첨가한 PBS,을 첨가하여 반응시켰다. AIM-V® 배양배지로 수세한 후, AIM-V® 배양배지에 4-6x106세포/ml로 희석한 공여자 세포를 100㎕/구씩 분주하였다. 최종농도 50 ㎍/ml이 되도록 시험 시료를 50㎕씩 첨가하였다 (n=6). 8일간 배양한 후 ELISpot 플레이트는 비오틴 표지된 인터루킨-2 검출 항체와 스트렙타비딘-AP (R&D Systems, Abingdon, UK) 를 순차적으로 결합시킨 후, BCIP/NBT ((R&D Systems, Abingdon, UK)를 첨가하여 스폿(spot)이 발현되도록 하였다. 증류수로 수세하여 반응을 종료시킨 후 플레이트를 건조시킨 후, Immunoscan® Analyser를 이용하여 구 당 생성된 스폿 (spw, spots per well)을 스캔하고 분석하였다. 상기 엑스 비보 (ex vivo) T 세포 활성도 측정 시험 결과는 자극 지표 (SI, stimulation index)의 실험적 역치에 기준하여 2 이상(SI≥2, p<0.05)의 경우를 양성(E)으로 판정하였다. SI≥1.9에 해당하는 경계값을 포함한 경우에는 별도로 표시(E*)하였다. 그 결과, CA 엑센딘-4와 엑센딘-4에 대해서 각각 10%와 16%의 공여자에서 양성반응이 확인되었고, 펩타이드 내부에 페길레이션 된 CA 엑센딘-4는 모든 공여자에서 단 2%에서만, N-말단에 페길레이션 된 엑센딘-4는 6%의 공여자에서 양성을 나타냄으로써, T 세포 증식 시험 결과와 유사한 결과를 나타내었다. 즉, N-말단보다는 펩타이드 내부 라이신에 페길레이션된 경우, 펩타이드의 면역원성을 보다 현저히 저해함을 확인할 수 있었다 (표 4 내지 6 및 8). 표 8은 T 세포의 인터루킨-2 분비 반응의 강도 및 빈도 (SI≥1.9 경계값 포함)을 나타낸다.
Figure pat00008
상기와 같은 결과들은 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 말단이 아닌 내부 잔기에 비펩타이드성 중합체, 특히 PEG를 연결한 연결체의 면역원성이 저해됨을 시사하는 것이다.
실시예 7: 정상 랫트에서의 지속성 인슐린분비 펩타이드에 대한 항체 생성 시험
실시예 3에서 제조한 CA 엑센딘-4를 PEG와 면역글로불린 Fc 단편에 연결시킨 결합체를 세 가지 용량으로 정상 Sprague Dawley 랫트에 주 1회, 26주 간 피하투여하고 이후 4주 간 회복기간을 두었다 (n=40-60/군). 투여 전과, 투여 중 13, 19, 26째 주, 회복기간 종료 시점에 각각 채혈하여 혈청을 분리하고, 이로부터 인슐린분비 펩타이드에 대한 항체 생성 여부를 측정하였다.
그 결과, 약물을 투여받은 160 개체 중 단 두 마리에서만 13주, 회복기간 후에 각각 항체가 검출되었다. 그러나 이 항체들은 약물에 대한 중화 항체는 아닌 것으로 확인되었다 (표 9). 표 9는 랫트(SD Rat)에서의 26주 투여에 따른 항체 생성을 나타낸다.
Figure pat00009
실시예 8: 게잡이 원숭이에서의 지속성 인슐린분비 펩타이드에 대한 항체 생성 시험
실시예 3에서 제조한 CA 엑센딘-4를 PEG와 면역글로불린 Fc 단편에 연결시킨 결합체를 세 가지 용량으로 게잡이 원숭이(Cynomolgus monkey)에 주 1회, 26주 간 피하투여하고, 이후 4주 간 회복기간을 두었다 (n=8-12/군). 투여 전과, 투여 중 12, 19, 26째 주, 회복기간 종료 시점에 각각 채혈하여 혈청을 분리하고, 이로부터 인슐린분비 펩타이드에 대한 항체 생성 여부를 측정하였다. 그 결과, 모든 개체에서 항체 생성은 관찰되지 않았다 (표 10). 표 10은 게잡이 원숭이 (Cynomolgus monkey)에서의 26주 투여에 따른 항체 생성을 나타낸다.
Figure pat00010
실시예 9: 혈중 항 약물 항체 검출 및 중화능 평가 시험
실시예 3의 결합체가 랫트나 게잡이 원숭이의 체내에서 항 약물 항체(anti-drug antibody, ADA)를 생성하였는지 검출하기 위하여 bridging ELISA 법으로 조사하였다. 스트렙타비딘(streptavidin)이 바닥에 결합된 96구 마이크로플레이트에 비오틴화한 실시예 3의 결합체를 결합시킨 후 수세하였다. 측정하고자 하는 랫트 또는 원숭이의 혈청 시료와 함께 디곡시게닌(digoxigenin, dig)-표지된 HM11260C를 첨가하여 반응시킨 후 수세하였다. 이후, 홀스래디쉬 퍼록시다아제가 결합된 항 dig 항체 (anti-DIG-POD antibody)를 첨가하여 TMB 기질 (3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine substrate)에 의해 발색되도록 하였다. 랫트 혈청에서의 측정 감도는 3.1 ng/ml, 원숭이 혈청에서의 측정 감도는 12.5 ng/ml이었다. 검출된 항 HM11260C 항체의 HM11260C에 대한 중화능을 평가하기 위하여, 인간 GLP-1 수용체를 과발현시킨 세포주 (GLP-1R/CHO)에 혈청시료와 HM11260C를 함께 첨가하였을 때의 cAMP 유도능에 대한 억제율을 측정하였다. 상기 160 마리 중 두마리에서 생성된 항체는 모두 중화능이 없는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과들은 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 말단이 아닌 내부의 위치에 비펩타이드성 링커와 Fc 단편을 결합시키는 경우, 목적 펩타이드가 항원으로서 작용하는 기전을 억제함으로써 펩타이드의 면역원성을 낮추는 것을 시사하는 것으로, 이와 같이 제조하는 방법을 사용하는 경우, 펩타이드의 N 말단 등 다른 위치에 수식하여 결합체를 제조하는 것과 비교하여 T 세포의 활성화 및 동물에서의 항체 생성 반응을 현저히 억제함을 뒷받침하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 비말단 내부 잔기인 27번 라이신 잔기에 캐리어인 면역글로불린 Fc 영역을 1 내지 100kDa 분자량의 폴리에틸렌글리콜 링커에 의해 결합시키는 단계를 포함하는, 캐리어가 결합되지 않은 생리 활성 단백질 또는 펩타이드에 비하여 면역원성을 감소시키는 방법으로서,
    상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드가 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 엑센딘-4 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
    상기 폴리에틸렌글리콜 링커가 상기 내부 잔기에 연결되는 반응이 pH 7.0 내지 9.0에서 수행되고,
    상기 면역원성 감소가 하기 특징 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 방법:
    T 세포 증식 억제;
    인터루킨-2(IL-2) 분비 억제; 및
    항체 생성 억제.
  2. 제1항에 있어서, 캐리어가 내부 잔기에 결합된 생리 활성 단백질 또는 펩타이드가 캐리어가 말단 잔기에 결합된 생리 활성 단백질 또는 펩타이드에 비하여 면역원성이 감소된 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드가 엑센딘-4 또는 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 엑센딘-4 유도체인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 내부 잔기에 캐리어를 1 내지 100kDa 분자량의 폴리에틸렌글리콜 링커에 의해 연결하여 면역원성을 감소시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 내부 잔기에 캐리어를 1 내지 100kDa 분자량의 폴리에틸렌글리콜 링커에 의해 연결하는 것은, 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 엑센딘-4 유도체의 27번 라이신 잔기에 캐리어를 1 내지 100kDa 분자량의 폴리에틸렌글리콜 링커에 의해 연결하는 것인, 방법.
  6. 생리 활성 단백질 또는 펩타이드의 비말단 내부 잔기인 27번 라이신 잔기에 캐리어인 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 링커인 1 내지 100kDa 분자량의 폴리에틸렌글리콜에 의해 연결된, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체를 포함하는, 캐리어 비포함 조성물에 비하여 감소된 면역원성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체의 면역원성 감소용 조성물로서,
    상기 생리 활성 단백질 또는 펩타이드가 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 엑센딘-4 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
    상기 폴리에틸렌글리콜이 상기 내부 잔기에 pH 7.0 내지 9.0에서 연결되고,
    상기 면역원성 감소가 하기 특징 중 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 조성물:
    T 세포 증식 억제;
    인터루킨-2(IL-2) 분비 억제; 및
    항체 생성 억제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 지속성 제제의 부작용인 면역원성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 캐리어가 내부 잔기에 연결된 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체가 캐리어가 말단 잔기에 연결된 생리 활성 단백질 또는 펩타이드 결합체에 비하여 면역원성이 감소된 것을 특징으로 하는, 조성물.
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