CN114364393A - 使用g-csf蛋白质复合物治疗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种预防、缓解或治疗有需要的患者的状况(即，嗜中性粒细胞减少症)的方法，所述状况的特征在于患者的白细胞生成受损。所述方法包括向患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含经由非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG‑CSF)。所述非肽基聚合物位点特异性地连接至所述免疫球蛋白Fc区的N端，并且，所述经修饰的hG‑CSF在Cys17和Pro65中的至少一个中包含替换。

Description

使用G-CSF蛋白质复合物治疗的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质复合物、药物组合物及其用于治疗、预防或降低发生状况(例如，嗜中性粒细胞减少症)的风险的方法。该蛋白质复合物可通过非肽基聚合物将免疫球蛋白Fc区连接至生理活性多肽而形成，其中，所述非肽基聚合物连接到免疫球蛋白Fc区。
背景技术
嗜中性粒细胞减少症(Neutropenia)是一种相对常见的疾病，最常与化疗治疗、药物不良反应或自身免疫性疾病相关。化疗引起的嗜中性粒细胞减少症是施用抗癌药物引起的常见毒副反应。它与危及生命的感染有关，并可改变化疗安排，从而影响早期和长期的临床结果。发热性嗜中性粒细胞减少症(Febrile Neutropenia)是骨髓抑制性化疗方案的主要剂量限制性毒性，所述骨髓抑制性化疗方案例如是，多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide，TAC)；剂量密集的多柔比星+环磷酰胺(AC)，随后每周或每半周使用或不使用紫杉醇；及多西他赛+环磷酰胺(TC)。它通常会导致住院时间延长、静脉施用广谱抗生素，并且通常与显著的发病率和死亡率相关。在没有G-CSF支持的情况下，约25％至40％的初治患者在常规化疗方案下会出现发热性嗜中性粒细胞减少症。
目前的治疗方法采用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor，G-CSF)和/或抗生素来对抗这种状况。然而，G-CSF或其其他多肽衍生物容易变性或容易被血液中的蛋白水解酶分解，易通过肾脏或肝脏清除。因此，为了维持含G-CSF药物的血药浓度和滴度，有必要经常给患者施用蛋白质药物，这会造成患者过度痛苦。为解决此类问题，将G-CSF通过化学方式附着在聚乙二醇(“PEG”)等溶解度高的聚合物上，从而增加其血液稳定性，并在更长时间内保持适宜的血药浓度。
然而，PEG与G-CSF的结合，尽管可增加血液稳定性，但确实会显著降低达到最佳生理效应所需的滴度。因此，需要解决本领域中的这个缺点。
因此，强烈需要新的制剂和使用方法，其中新的含有G-CSF的蛋白质复合物可以保持稳定并显著改善患者治疗效果。
发明内容
本发明涉及使用含有更稳定的蛋白质复合物的G-CSF的方法，该蛋白质复合物易于制备并施用给有发生嗜中性粒细胞减少症风险的患者，并保持达到最佳治疗结果的血清浓度。本发明的另一方面涉及通过非肽基聚合物连接生理活性多肽和免疫球蛋白Fc片段而制备的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc片段的N端。
一方面，本发明提供了一种预防、缓解或治疗有需要的患者的状况的方法。所述方法包括向患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含通过非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个中包含替换。
所述状况的特征在于患者的白细胞生成受损。例如，所述状况可以是以下之一：造血功能降低、免疫功能降低、嗜中性粒细胞计数减少、嗜中性粒细胞动员(mobilization)减少、外周血祖细胞动员、败血症、严重慢性嗜中性粒细胞减少症、发热性嗜中性粒细胞减少症、骨髓移植、感染性疾病、白细胞减少症、血小板减少症、贫血症、在移植过程中促进骨髓植活、在放射、化学或化疗诱导的骨髓发育不全或骨髓抑制的治疗中促进骨髓恢复、以及获得性免疫缺陷综合征。
在一些实施方案中，所述状况可以是严重慢性嗜中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，所述状况可以是发热性嗜中性粒细胞减少症。在一些实施方案中，白细胞产生受损可能是化学疗法、放射疗法或特发性血小板减少性紫癜的结果。
在一些实施方案中，所述蛋白质复合物可在患者接受辅助或新辅助化疗后施用。在一些实施方案中，所述蛋白质复合物可在患者接受辅助或新辅助化疗后1至5天之间施用。在一些实施方案中，所述辅助或新辅助化疗可以是多西他赛与环磷酰胺的组合。
在一些实施方案中，可在向患者施用第一剂蛋白质复合物后15至25天之间施用第二剂蛋白质复合物。
在一些实施方案中，所述有效治疗量是选自25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg的单位剂型。在一些实施方案中，所述有效治疗量为0.6mL剂量体积中的13.2mg蛋白质复合物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患者施用有效治疗量的第二药剂(例如，抗癌剂)。
在一些实施方案中，Cys17处的替换可以是Cys17Ser，Pro65处的替换可以是Pro65Ser。
在一些实施方案中，经修饰的人G-CSF包含SEQ ID NO：1的多肽序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区包含SEQ ID NO：2的多肽序列。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物的两端通过共价键介由反应基团分别连接至所述经修饰的人G-CSF和所述免疫球蛋白Fc区。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区的特征在于：(a)免疫球蛋白Fc区是无糖基化的(aglycosylated)；(b)所述免疫球蛋白Fc区由CH2和CH3结构域组成；(c)免疫球蛋白Fc区包含CH2、CH3和CH4结构域之一；(d)免疫球蛋白Fc区进一步包含铰链区；或(e)免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc片段。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区的特征还在于：(a)免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合体，其中，每个结构域具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源；(b)免疫球蛋白Fc片段是二聚体或多聚体，由包含具有相同来源的结构域的单链免疫球蛋白组成；(c)免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段；或(d)免疫球蛋白Fc片段是人无糖基化IgG4Fc片段。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物是：(a)选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylatedpolyol)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合；或(b)聚乙二醇。在一些实施方案中，所述聚乙二醇具有3.4kDa的分子量。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物的反应基团选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。例如，所述醛基可以是丙醛基或丁醛基。所述琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基羧甲基(succinimidyl carboxymethyl)、琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物在两端具有醛基作为反应基团。在一些实施方案中，所述非肽基聚合物在两端分别具有醛基和马来酰亚胺基作为反应基团。在一些实施方案中，所述非肽基聚合物在两端分别具有醛基和琥珀酰亚胺基作为反应基团。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物的每端分别连接至免疫球蛋白Fc区的N端和经修饰的人G-CSF的赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基的N端、C端或自由反应基团。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防接受化学疗法的患者的嗜中性粒细胞减少症的方法。该方法包括向所述患者施用包含通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区连接的生理活性多肽的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区的N端位点特异性连接。在一些实施方案中，所述生理活性多肽是G-CSF。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物的两端通过共价键通过反应基团分别与生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区连接。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是免疫球蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区包含CH2、CH3和CH4结构域中的任一个。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区由CH2和CH3结构域组成。所述免疫球蛋白Fc区还可包含铰链区。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合体，其中，每个结构域具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源。
在一些实施方案中，可在化疗完成后约6h、约5h、2h或1h内向患者施用上述蛋白质复合物。
另一方面，本发明提供了一种制备用于改善生理活性多肽的体内持续时间和稳定性的药物组合物中的蛋白质复合物的方法，该组合物包括所述蛋白质复合物作为活性成分。
附图说明
图1A示出了通过免疫球蛋白Fc区的N端反应制备的17 , 65Ser-G-CSF-PEG-Fc复合物的SDS-PAGE和western印迹的结果。
图1B示出了用于分析通过免疫球蛋白Fc区的N端反应制备的17 , 65Ser-G-CSF-PEG-Fc复合物的Fc区N端结合的肽图谱结果。
图2示出了具有统计学意义的17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc(EFLAPEGRASTIM)组(arm)中严重嗜中性粒细胞减少症发生率的降低。
图3示出了EFLAPEGRASTIM组中嗜中性粒细胞减少症的并发症显著减少，这些并发症包括由于严重嗜中性粒细胞减少症和/或使用用于嗜中性粒细胞减少症的抗感染药而住院治疗。
具体实施方式
广义上讲，本发明提供了预防、缓解、预防性治疗和治疗患有以白细胞生成受损为特征的状况的患者的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区以共价键连接的生理活性多肽，例如，经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)。所述非肽基聚合物可以位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个包含替换。
在另一方面，本发明提供了一种用于增加骨髓移植患者的粒细胞数量的方法。所述方法包括向需要此类治疗的患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含经由非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个包含替换。
在又一方面，本发明提供了一种用于增加患者干细胞产量的方法。所述方法包括向需要此类治疗的患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含经由非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个包含替换。
在再一方面，本发明提供了一种用于增加有需要的患者的造血祖细胞数量的方法，所述患者包括正在接受化疗的患者或为其他患者提供干细胞的患者。所述方法包括向患者施用有效治疗量的蛋白质缀合物(protein conjugate)，该蛋白质缀合物包含经由非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个包含替换。
在一些实施方案中，待治疗的所述状况包括造血功能下降、免疫功能降低、嗜中性粒细胞计数减少、嗜中性粒细胞动员减少、外周血祖细胞动员、败血症、严重慢性嗜中性粒细胞减少症、骨髓移植、感染性疾病、白细胞减少症、血小板减少症、贫血、在移植过程中促进骨髓植入、在放射、化学或化疗诱导的骨髓发育不全或骨髓抑制的治疗中促进骨髓恢复、以及获得性免疫缺陷综合征。在一个实施方案中，所述状况是骨髓抑制、嗜中性粒细胞减少症或优选发热性嗜中性粒细胞减少症。
在另一方面，本发明提供了一种用于预防、缓解、预防性治疗和治疗接受骨髓抑制性抗癌药物的非髓系恶性肿瘤(non-myeloidmalignancies)患者的嗜中性粒细胞减少症(例如，发热性嗜中性粒细胞减少症)所显现的感染的方法。所述方法包括向患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含通过非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个包含替换。
在一些实施方案中，白细胞生成受损是化学疗法(化疗)、放射疗法、辅助或新辅助化疗或特发性血小板减少性紫癜的结果。在某些实施方案中，辅助或新辅助化疗是多西他赛和环磷酰胺的组合。在其他实施方案中，有效治疗量是选自以下的单位剂型：25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg。在某些实施方案中，本方法进一步包括向患者施用有效治疗量的第二药剂，例如，抗癌剂。在某些实施方案中，经修饰的G-CSF通过在Cys17处替换为Cys17Ser。在其他实施方案中，在Pro65处的替换是Pro65Ser。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区包含SEQ ID NO：1的多肽序列。在一些实施方案中，经修饰的G-CSF包含SEQ ID NO：2的多肽序列。
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Figure BDA0003435406110000071
在一些实施方案中，本方法中采用的蛋白质复合物包含：(a)免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合体，其中，每个结构域具有源自选自以下的免疫球蛋白的不同来源：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM；(b)免疫球蛋白Fc片段是二聚体或多聚体，由包含具有相同来源的结构域的单链免疫球蛋白组成；(c)免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段；或(d)免疫球蛋白Fc片段是人无糖基化IgG4 Fc片段。
在某些实施方案中，所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylatedpolyol)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物(lipidpolymer)、几丁质、透明质酸及其组合。在一优选实施方案中，所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防接受化疗的患者嗜中性粒细胞减少症的方法。该方法包括向所述患者施用包含经由非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的G-CSF的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端。在一些实施方案中，所述非肽基聚合物的两端通过共价键通过反应基团分别与生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区连接。在一优选实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的。
在一些实施方案中，所述G-CSF复合组合物在化疗完成后约5h、2h、1h或0.5h内施用于患者。
在一些实施方案中，本发明提供了上述蛋白质复合物，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含CH2、CH3和CH4结构域之一。例如，所述免疫球蛋白Fc区可包括CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区还包括铰链区。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc片段。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合体，并且，每个结构域具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc片段是由包含具有相同来源的结构域的单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物可以是聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合中的任一种，优选非肽基聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，所述非肽基聚合物是3.4kDa聚乙二醇。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物的反应基团可以是醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物中的一种。所述醛基可以是丙醛基或丁醛基。所述琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
在一些实施方案中，所述非肽基聚合物在两端具有醛基作为反应基团。在一些实施方案中，非肽基聚合物在两端分别具有醛基和马来酰亚胺基作为反应基团。在一些实施方案中，所述非肽基聚合物在两端分别具有醛基和琥珀酰亚胺基作为反应基团。
在一些实施方案中，本发明提供了蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物的每一端分别连接至免疫球蛋白Fc区的N端及生理活性多肽的赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基的N端、C端或游离反应基团。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防接受化疗的患者嗜中性粒细胞减少症的方法。该方法包括向所述患者施用包含通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区连接的生理活性多肽的蛋白质复合物，其中，所述所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端。
在一些实施方案中，所述生理活性多肽可以是激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录因子、凝血因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体中的一种。在一些实施方案中，所述生理活性多肽是G-CSF。
另一方面，本发明还提供了一种制备所述蛋白质复合物的方法。所述方法包括：
(a)通过将至少一种在两端具有反应基团的非肽基聚合物、至少一种生理活性多肽和至少一个免疫球蛋白Fc区通过共价键连接来制备蛋白质复合物，及
(b)分离步骤(a)中制备的主要包括以共价键连接的生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的所述蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc片段的N端。
本发明的一个具体实施方案提供了上述制备方法，其中，步骤(a)包括：
(al)通过将所述非肽基聚合物的一端通过共价键连接至所述免疫球蛋白Fc区或所述生理活性多肽来制备缀合物；及
(a2)分离步骤(a1)中制备的缀合物，并将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的另一个。
本发明的另一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，步骤(al)中所述生理活性多肽与非肽基聚合物的反应摩尔比在1:1至1:30的范围内，所述免疫球蛋白Fc片段与非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围内。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(a1)在4.0-9.0的pH条件下进行。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(a1)在4.0℃至25℃的温度下进行。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(al)中免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应浓度为0.1mg/mL～100mg/mL。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(a2)中缀合物与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应摩尔比为1:0.1～1:20。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(a2)在4.0-9.0的pH条件下进行。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(a2)在4.0℃至25℃的温度下进行。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中步骤(a2)中免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的浓度为0.1mg/mL至100mg/mL。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中在还原剂存在下进行步骤(a1)和步骤(a2)。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中所述还原剂选自氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、二甲胺硼酸盐和吡啶硼酸盐。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中，在步骤(a2)中，通过选自阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析和尺寸排阻色谱的单一或组合纯化方法进行分离。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中，所述阴离子交换层析树脂的官能团为选自季铵(Q)、季氨乙基(quaternary aminoethyl，QAE)、二乙氨乙基(dicthylaminocthyl，DEAE)、聚乙烯胺(polyethylene amine，PEI)、二甲基氨甲基(dimethyl-laminomethyl，DMAE)和三甲基氨乙基(trimethylaminoethyl，TMAE)中的任意一种。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中，所述阳离子交换层析树脂的官能团为选自甲基磺酸盐(methylsulfonate，S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)和聚天冬氨酸中的任意一种。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中，所述疏水层析树脂的官能团为选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基和乙基中的任意一种。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中，所述亲和层析树脂的官能团为选自蛋白A、肝素、蓝色(blue)、苯甲脒、金属离子(钴、镍和铜)以及对蛋白质复合物的部分或全部构成成分的抗体中的任意一种，其中，所述非肽基聚合物的两端分别与免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽缀合。
本发明的又一具体实施方案提供了尺寸排阻色谱的树脂选自Superdex、Sephacryl、Superpose和Sephadex的上述制备方法。
本发明的又一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，步骤(b)的蛋白质复合物的分离通过选自阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析和尺寸排阻色谱的单一或组合方法进行。
本发明的又一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，所述阴离子交换层析树脂的官能团为选自季铵(Q)、季氨乙基(QAE)、二乙氨乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨甲基(DMAE)和三甲基氨乙基(TMAE)中的任一种。
本发明的又一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，所述阳离子交换层析树脂的官能团为选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)和聚天冬氨酸中的任一种。
本发明的又一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，所述疏水层析树脂的官能团为选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基和乙基中的任意一种。
本发明的又一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，所述亲和层析树脂的官能团为选自蛋白A、肝素、蓝色(blue)、苯甲脒、金属离子(钴、镍和铜)及对蛋白质复合物的部分或全部构成成分的抗体中的任意一种，其中，所述非肽基聚合物的两端分别与免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽缀合。
本发明的又一具体实施方案提供了所述制备方法，其中所述尺寸排阻色谱的树脂选自Superdex、Sephacryl、Superpose和Sephadex。
本发明的又一具体实施方案提供了上述制备方法，其中，步骤(b)是分离蛋白质复合物，其中，构成蛋白质复合物的非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区通过免疫球蛋白Fc区的N-端连接。
本发明的另一方面提供了一种制备位置特异性蛋白质复合物的方法，该方法包括：
(a')通过将非肽基聚合物的一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽来制备缀合物，其在4.0至9.0的pH条件下进行；
(b')分离步骤(a')中制备的缀合物，并将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的另一个，其在4.0至9.0的pH条件下进行；及
(c')分离步骤(b')中制备的主要包括以共价键连接的生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc片段的N端连接。
特别地，所述非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区的N端结合的反应速率的一个重要条件是pH值，所述位点特异性结合可在低于中性pH值(即，低于pH7.0)的pH值下很好地发生。
所述非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区的N端的连接在低于中性pH的pH值下进行，但适宜在不会使蛋白质的三级结构或活性变性的弱酸性至酸性pH下进行，但不限于此。作为非限制性示例，本发明中使用的免疫球蛋白Fc区具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并证实在约pH 8.2的弱碱性条件下具有N端特异性(实施例5)。
即，当使用通用免疫球蛋白Fc区时，所述免疫球蛋白Fc区的N端与非肽基聚合物的特异性结合的反应速率在低于中性pH的pH下增加。然而，当使用突变为具有较低pH敏感性的免疫球蛋白Fc区时，结合的反应速率可不受该条件限制。
本发明的另一方面提供了一种制备蛋白质复合物的方法，该方法包括：
(a')通过将非肽基聚合物的一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的任一个来制备缀合物，其中，生理活性多肽与非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:30的范围内，免疫球蛋白Fc区与非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1至1:20的范围内，还原剂包含在1mM-100mM的范围内，反应在pH 4.0-9.0、温度为4.0-25℃的条件下进行，免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL至100mg/mL的范围内；
(b')分离步骤(a')中制备的缀合物，并将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的另一个，其中，所述缀合物与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应摩尔比为1:0.1至1:20，还原剂的含量为1mM至100mM，反应在pH为4.0～9.0、温度为4.0～25℃的条件下进行，并且，所述免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应浓度为0.1mg/mL至100mg/mL；及
(c')分离在步骤(b')中制备的主要包含以共价键连接的生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc片段的N端。
本发明的又一具体实施方案提供了一种制备N端选择性为90％或更高的蛋白质复合物的方法。
本发明的另一方面提供了一种用于提高生理活性多肽的体内持续时间和稳定性的药物组合物，所述生理活性多肽包含上述蛋白质复合物作为活性成分。
本发明的一具体实施方案提供包含90％或更高含量的上述蛋白质复合物的组合物。
本发明的另一方面是一种含有所述制剂的用于递送本发明组合物的药物容器。示例性的药物容器包括注射装置(injector)、注射器(syringe)、西林瓶(vial)、输液瓶、安瓿或输送器(carpoule)，例如，配备有针保护系统的注射器或注射笔内的输送器。根据一个实施方案，本发明提供了一种注射装置，其包括具有带内表面的壁和带内表面的密封组件的容器，壁和密封组件的内表面限定了填充有药品的封闭无菌储器。
所述注射装置还可以包括流体递送系统，该系统包括干净的、裸露的、刚性容器针，该针具有在储存状态下仅部分穿过密封组件的尖端，并且在递送状态下穿过密封组件的内表面到无菌储器中。此外，所述注射装置可包括致动器，该致动器适于将容器针从储存状态移动到递送状态。在一个实施方案中，所述容器壁可以是刚性壁或柔性壁，并且，所述密封组件可以是有限定了(define)密封组件内表面的内表面一体式(unitary)柔性壁。所述一体式柔性壁可限定设置为穿过开口并固定地附接至容器壁的隔板。或者，所述容器的壁可限定膛(bore)，并且，所述一体式柔性壁可限定可沿膛移动的塞子。在这种情况下，所述容器壁可限定与塞子相对的封闭端和设置塞子的开口端。作为进一步的替换方案，所述容器的壁可限定膛，所述膛具有与孔的第一端流体连通的开口，并且，所述一体式柔性壁限定设置为跨过所述开口并且固定地附接至容器壁的隔板，所述容器还包括塞子，该塞子设置在所述膛的第二端内并且可沿所述膛移动。
本发明的另一方面涉及用于治疗、改善或预防有需要的患者神经障碍的方法。此类神经系统疾病可与慢性脊髓损伤、帕金森病或脑瘫等神经发育障碍有关。所述方法包括向与神经障碍及其管理相关的有需要患者施用治疗有效剂量。
本发明的另一方面提供了本发明所述组合物在与骨髓移植相关的治疗中的用途。所述方法包括向与骨髓移植和干细胞动员相关的有需要的患者施用治疗有效剂量。
定义
在本文中，术语“蛋白质复合物”或“复合物”是指至少一种生理活性多肽、至少一种在两端具有反应基团的非肽基聚合物和至少一种免疫球蛋白Fc区通过共价键彼此连接的结构。此外，为了区别于“复合物”，其中选自生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的仅两个分子通过共价键相互连接的结构称为“缀合物”。
本发明的蛋白质复合物可以是PEG通过其两端的反应基团通过共价键分别与经修饰的G-CSF和免疫球蛋白Fc区连接的蛋白质复合物。
在本文中，术语“生理活性多肽”、“生理活性蛋白质”、“活性蛋白质”或“蛋白质药物”是指对体内生理事件具有某种拮抗活性的多肽或蛋白质，并且，这些术语可以互换使用。
在本文中，术语“非肽基聚合物”是指包括两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物，所述重复单元通过除肽键之外的任何共价键相互连接，但不限于此。
在本文中，术语“免疫球蛋白Fc区”是指免疫球蛋白分子的除免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)以外的区域。免疫球蛋白Fc区还可包括在重链恒定区的铰链区。具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是包括部分或全部Fc区的片段，并且，在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以与免疫球蛋白片段互换使用。
天然Fc在重链恒定区1的Asn297位置具有糖链，但源自大肠杆菌的重组Fc以无糖基化形式表达。从Fc去除糖链导致Fcγ受体1、2和3以及补体(clq)与重链恒定区1的结合亲和力降低，从而导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的减小或丧失。
在本文中，术语“免疫球蛋白恒定区”可指包括重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)(或含有重链恒定区4(CH4))的Fc片段，但免疫球蛋白的重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CHI)和轻链恒定区(CL)除外，并且，还可包括在重链恒定区的铰链区。此外，本发明所述的免疫球蛋白恒定区可以是包括部分或全部Fc区的延伸免疫球蛋白恒定区，包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区(CL)，但免疫球蛋白的重链和轻链可变区除外，只要其生理功能与天然蛋白基本相似或优于天然蛋白即可。
同时，所述免疫球蛋白恒定区可来源于人或动物，例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等，并且，可优选地来源于人。此外，所述免疫球蛋白恒定区可选自源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体的恒定区，其中，优选源自IgG或IgM，其在人血液中最丰富，并且，最优选地，源自IgG，其已知可改善配体结合蛋白的半衰期。在本发明中，所述免疫球蛋白Fc区可以是由同源结构域的单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体。
在本文中，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白恒定区(优选Fc区)的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自IgG Fc、IgAFc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc的Fc片段中的两个或更多个片段制备而成。
在本文中，术语“杂合体”是指编码两个或多个不同来源的免疫球蛋白恒定区的序列存在于免疫球蛋白恒定区(优选Fc区)的单链中。在本发明中，各种杂合体形式都是可能的。例如，所述杂合体结构域(hybrid domain)可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgAFc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4中的一到四个结构域组成，并且，可进一步包括铰链区。
IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且，本发明可包括它们的组合或杂合体。优选的是IgG2和IgG4亚类，最优选的是很少具有效应子功能(例如，补体依赖性细胞毒性(CDC))的IgG4的Fc区。
所述免疫球蛋白恒定区可具有与天然形式相同程度或比其更大或更小程度的糖基化形式，或者可以是去糖基化形式。所述免疫球蛋白恒定区的糖基化或去糖基化的增加或减少可通过典型的方法来实现，例如，通过使用化学方法、酶促方法或使用微生物的基因工程方法。在本文中，当去糖基化时，与免疫球蛋白恒定区结合的补体(Clq)显著减少，并且，抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性被降低或去除，从而不会在体内诱导不必要的免疫反应。在这种情况下，去糖基化或无糖基化的免疫球蛋白恒定区更符合药物载体的目的。因此，所述免疫球蛋白Fc区可以更具体地是源自人IgG4的无糖基化Fc区，即，源自人IgG4的无糖基化Fc区。人源性Fc区比非人源性Fc区更优选，非人源性Fc区可在人体内充当抗原并引起不希望的免疫反应，例如，产生针对该抗原的新抗体。
此外，本发明所述的免疫球蛋白恒定区不仅包括天然氨基酸序列，还包括其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物是指由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、保守型或非保守型替换、或其组合而具有不同于野生型氨基酸序列的氨基酸序列。例如，已知对连接很重要的IgG Fc中的214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸残基可用作适合修饰的位点。可使用各种衍生物，例如，通过去除能够形成二硫键的位点、从天然Fc去除若干N-端氨基酸或将甲硫氨酸添加到天然Fc的N-端而制备的那些衍生物。此外，可去除补体固定位点，例如，Clq固定位点或ADCC位点，以去除效应子功能。制备免疫球蛋白恒定区的序列衍生物的技术公开于编号WO 97/34631和WO 96/32478的国际专利公开中。
不改变分子活性的蛋白质或肽分子中的氨基酸替换是本领域众所周知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的双向的替换发生在氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、AlaJGly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、LeuNal、Ala/Glu和Asp/Gly之间。任选地，氨基酸可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
上述免疫球蛋白恒定区衍生物可以是与本发明所述的免疫球蛋白恒定区生物活性相当、但随热、pH等免疫球蛋白恒定区结构稳定性增加的衍生物。此外，所述免疫球蛋白恒定区可从从人或动物(如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠、豚鼠等)分离的天然类型获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物中获得的其重组体或衍生物。在本文中，它们可通过从人类或动物生物体中分离完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理它们而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab和Fc区域，胃蛋白酶处理导致pF'c和F(ab)2片段的产生。例如，可对这些片段进行尺寸排阻色谱以分离Fc或pF'c。
优选地，人源免疫球蛋白恒定区可以是从微生物获得的重组免疫球蛋白恒定区。
本发明的蛋白质复合物可包括一个或多个[生理活性多肽/非肽基聚合物/免疫球蛋白Fc区]单元结构，其中，所有组分可通过共价键以线性形式连接。非肽基聚合物可在其两端具有反应基团，并且，通过共价键通过反应基团分别连接至生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区。即，生理活性多肽与非肽基聚合物的至少一种缀合物通过共价键连接至一个免疫球蛋白Fc区，从而形成生理活性多肽的单体、二聚体或多聚体，其由免疫球蛋白Fc区介导。因此，可以更有效地实现体内活性和稳定性的增加。
非肽聚合物两端的反应基团优选选自反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是羟基琥珀酰亚胺基(hydroxysuccinimidyl)、琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。特别地，当所述非肽基聚合物在两端具有反应性醛基时，可以有效地以最少的非特异性反应将这两端与生理活性多肽和免疫球蛋白连接。通过醛键还原烷基化生成的最终产物比通过酰胺键连接时稳定得多。
本发明所述的非肽聚合物两端的反应基团可以相同也可以不同。所述非肽聚合物可在两端具有醛基反应基团，也可在一端具有醛基而在另一端具有马来酰亚胺反应基团，或者在一端具有醛基而在另一端具有琥珀酰亚胺反应基团，但不限于此。
例如，所述非肽聚合物可在一端具有马来酰亚胺基团，并且在另一端具有醛基基团、丙醛基团或丁醛基团。此外，所述非肽聚合物可在一端具有琥珀酰亚胺基团，并且在另一端具有丙醛基团或丁醛基团。当使用在其两端具有反应性羟基的聚乙二醇作为非肽基聚合物时，可通过已知的化学反应将羟基活化成各种反应基团，或者可使用市售的具有改性反应基团的聚乙二醇来制备本发明的蛋白质复合物。
当生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区通过非肽基聚合物连接时，所述非肽基聚合物的两个末端中的每一个都可结合至免疫球蛋白Fc区的N端和生理活性多肽的赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基的N端(氨基端)、C端(羧基端)或游离反应基团。
在本文中，术语“N端”是指肽的N端，其是为了本发明的目的包括非肽基聚合物的接头可缀合的位点。N端的示例不仅可包括N端远端的氨基酸残基，而且还可包括N端附近的氨基酸残基，但不限于此。具体地，可包括从远端开始的第1至第20个氨基酸残基。
本发明所述的非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylatedpolyol)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物(例如，PLA(聚乳酸)和PLGA(polylactic-glycolic acid，聚乳酸-乙醇酸))、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及它们的组合，特别是聚乙二醇，但不限于此。此外，本领域公知的并且在本领域技术范围内容易制备的其衍生物也包括在本发明的非肽基聚合物中。所述非肽基聚合物的分子量可以在1kDa至100kDa的范围内，特别是1kDa至20kDa。
本发明的生理活性多肽可以是各种生理活性多肽，例如，激素、细胞因子、白细胞介素、白细胞介素结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂及其衍生物或类似物。
具体而言，所述生理活性多肽包括人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素和干扰素受体(例如，干扰素-α、-β和-γ，可溶性I型干扰素受体)、集落刺激因子、白细胞介素(例如，白细胞介素-1、-2、-3、-4、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白细胞介素受体(例如，IL-1受体、IL-4受体等)、酶(例如，葡糖脑苷脂酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶A、阿加糖苷酶-α、-β(agalsidase alpha,beta)、α-L-艾杜糖酶(alpha-L-iduronidase)、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、髓过氧化物酶等)、白细胞介素结合蛋白和细胞因子结合蛋白(例如，IL-18bp、TNF结合蛋白等)、巨噬细胞激活因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、糖基化促红细胞生成素、血管生成素(an-giopoietin)、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体活化肽、血栓调节蛋白、血液因子VII、VIIa、VIII、IX和XIII、纤溶酶原激活剂、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶(streptokinase)、水蛭素、蛋白C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板源性生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白(bone-stimulating protein)、降钙素、胰岛素、胃泌酸调节素、胰高血糖素、胰高血糖素衍生物、胰高血糖素样肽、促胰岛素分泌肽(exendins(Exendin4))、心房肽(atriopeptin)、成软骨诱导因子、依降钙素(elcatonin)、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子(例如，神经生长因子、睫状神经营养因子、轴突生成因子-1、脑钠肽、胶质细胞源性神经营养因子、纺锤蛋白(netrin)、嗜中性粒细胞抑制因子、神经营养因子、neurturin等)、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长素介质、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子(autotaxin)、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白(myostatin)、受体(例如，TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、B细胞活化因子受体等)、受体拮抗剂(例如，ILl-Ra等)、细胞表面抗原(例如，CD 2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和Fd)、以及病毒源疫苗抗原(virus-derived vaccine antigen)。
具体地，本发明所述的生理活性多肽可以是粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素或其修饰形式。在优选实施方案中，所述多肽是G-CSF。
在本发明中，所述抗体片段可以是具有结合特定抗原能力的Fab、Fab'、F(ab')、Fd或scFv，优选为Fab'。所述Fab片段包括轻链的可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)以及重链的可变结构域(VH)和第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于添加了若干个氨基酸残基，包括来自CH1结构域羧基末端铰链区的一个或多个半胱氨酸残基。Fd片段是仅由VH和CH1结构域组成的片段，而F(ab')2片段是通过二硫键或化学反应结合两分子Fab'片段而产生的。scFv片段是一条多肽链，其中，只有VL和VH结构域通过肽接头相互连接。
此外，本发明的蛋白质复合物可用于开发动物生长激素(例如，牛生长激素或猪生长激素)的长效蛋白制剂、以及用于治疗或预防动物疾病的长效蛋白制剂(例如，干扰素)。
本发明的另一方面提供了制备本发明的蛋白质复合物的方法。特别地，本发明提供了一种制备位置特异性蛋白质复合物的方法，该方法包括：(a)通过共价键连接至少一种在两端具有反应基团的非肽基聚合物、至少一种生理活性多肽及至少一个免疫球蛋白Fc区来制备蛋白质复合物；及(b)分离步骤(a)制备的主要包括以共价键连接的生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc片段的N端。
本发明所述的免疫球蛋白Fc区可以是二聚体的形式，也可以是同源二聚体或异源二聚体的形式。因此，构成本发明的蛋白质复合物的免疫球蛋白Fc区可包括一个或两个或更多个N端。因此，所述免疫球蛋白Fc区可通过N端与至少一种非肽基聚合物连接。特别地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是同源二聚体的形式，因此通过免疫球蛋白Fc区的同源二聚体中包含的两个N端连接至一个或两个非肽基聚合物。在这方面，所述非肽基聚合物可分别与生理活性多肽结合，从而形成蛋白质复合物。
因此，本发明的蛋白质复合物可通过将一种或两种或更多种非肽基聚合物、一种或两种或更多种生理活性多肽和一种或两种或更多种免疫球蛋白Fc区经由共价键连接来制备。
在步骤(a)中，三个组分之间的共价键可依次或同时发生。例如，当所述生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区分别连接到非肽基聚合物的两端时，所述生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区中的任何一个可首先连接到非肽基聚合物的一端，然后另一个可连接到非肽基聚合物的另一端。该方法的优点在于，除了所需蛋白质复合物之外的副产物的产生被最小化，并且蛋白质复合物以高纯度制备。
因此，步骤(a)可包括：
(i)经由共价键将免疫球蛋白Fc区的特异性位点或生理活性多肽连接至非肽基聚合物的一端；
(ii)从反应混合物中均匀分离缀合物，其中，该缀合物是通过将免疫球蛋白Fc区的特异性位点或生理活性多肽与非肽基聚合物连接来制备的；及
(iii)通过将生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区的特异性位点与分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接来产生蛋白质复合物。
同时，在本发明中，步骤(a)包括：(a1)通过将非肽基聚合物的一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的任一个来制备缀合物；(a2)分离步骤(a1)中制备的缀合物，并将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端通过共价键连接至生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区中的另一个。
具体地，步骤(a)可包括：(a1')通过将非肽基聚合物的一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区来制备缀合物；(a2')分离步骤(a1')中制备的缀合物，并将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端通过共价键连接至生理活性多肽。
或者，步骤(a)可包括：(a1”)通过将非肽基聚合物的一端通过共价键连接至生理活性多肽来制备缀合物；及(a2”)分离在步骤(a1”)中制备的缀合物并通过共价键将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端连接至免疫球蛋白Fc区。
在本发明的步骤(al)、(al')或(al”)中，所述生理活性多肽与非肽基聚合物之间的反应摩尔比可在1:1至1:30的范围内，所述免疫球蛋白Fc区与非肽基聚合物之间的反应摩尔比可在1:1至1:20的范围内。
具体地，在步骤(al')中，所述免疫球蛋白Fc区与非肽基聚合物之间的反应摩尔比可在1:1～1:20的范围内，尤其是可在1:1～1:15、1:1～1:10或1:1～1:4的范围内。在步骤(al”)中，所述生理活性多肽与非肽基聚合物之间的反应摩尔比可在1:1～1:30的范围内，尤其是在1:1～1:15或1:1～1:10的范围内。可根据反应摩尔比优化制备收率和成本。
在本发明中，步骤(al)、(al')或(al”)可在4.0至9.0的pH条件下进行；步骤(al)、(al')或(al”)可在4.0℃至25℃的温度下进行；在步骤(al)、(al')或(al”)中，所述免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应浓度可在0.1mg/mL～100mg/mL的范围内。
在本发明的步骤(a2)、(a2')或(a2”)中，所述缀合物与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽之间的反应摩尔比可在1:0.1～1:20的范围内，尤其是在1:0.2～1:10的范围内。具体地，在步骤(a2')中，所述缀合物与生理活性多肽之间的反应摩尔比可在1:0.1～1:20的范围内，在步骤(a2”)中，所述缀合物与免疫球蛋白Fc区之间的反应摩尔比可在1:0.1～1:20的范围内。可根据反应摩尔比优化制备收率和成本。
在本发明中，步骤(a2)、(a2')或(a2”)可在4.0至9.0的pH条件下进行；步骤(a2)、(a2')或(a2”)可在4.0℃至25℃的温度下进行；在步骤(a2)、(a2')或(a2”)中，所述免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应浓度可在0.1mg/mL～100mg/mL的范围内。
同时，本发明所述的制备方法可以是制备位置特异性蛋白质复合物的方法，包括：(a')通过将非肽基聚合物的一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的任一个来制备缀合物，其中，所述生理活性多肽与非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1～1:30的范围内，所述免疫球蛋白Fc区与非肽基聚合物之间的反应摩尔比在1:1～1:20的范围内，还原剂的含量范围为1mM～100mM，反应在pH 4.0～9.0的条件下、在4.0℃～25℃的温度下进行，并且，免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的反应浓度在0.1mg/mL～100mg/mL的范围内；
(b')分离步骤(a')中制备的缀合物，并将分离的缀合物的非肽基聚合物的另一端通过共价键连接至免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽中的另一个，其中，所述缀合物与免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽之间的反应摩尔比在1:0.1～1:20的范围内，还原剂的含量范围为1mM～100mM，反应在pH为4.0～9.0、温度为0℃～25℃的条件下进行，并且，所述免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的浓度在0.1mg/mL～100mg/mL的范围内；及
(c')分离步骤(b')中制备的主要包括以共价键连接的生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物，其中，所述非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fc片段的N端，但不限于此。
必要时考虑参与反应的非肽基聚合物两端的反应基团的类型，本发明的步骤(al)、步骤(al')、步骤(al”)、步骤(a2)、步骤(a2')和步骤(a2”)中的反应可在还原剂存在下进行。本发明的还原剂可以是氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、二甲胺硼酸盐或吡啶硼酸盐。在这点上，所述还原剂(例如，氰基硼氢化钠)的浓度、反应溶液的温度和pH值以及参与反应的生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区的总浓度在生产收率和纯度方面是重要的。为了使高纯度均质复合物的产量最大化，需要条件的各种组合。根据要制备的生理活性多肽的特点，可以有多种条件，但不限于：所述还原剂(例如，氰基硼氢化钠)的含量范围可为1mM～100mM；所述反应溶液的温度可为0℃～25℃、pH为4.0至9.0；所述反应蛋白的浓度(反应中包含的免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽的浓度)可在5mg/mL～100mg/ml的范围内。
同时，如果需要，可通过选自用于蛋白质分离的一般方法的方法(考虑分离的缀合物所需的诸如纯度、疏水性、分子量和电荷等特性)进行步骤(a2)、步骤(a2')和步骤(a2”)中缀合物的分离。例如，可通过应用各种已知的方法进行分离，包括尺寸排阻色谱、亲和层析、疏水层析或离子交换层析，并且，如果需要，可组合使用多种不同的方法来以更高的纯度纯化缀合物。
根据要制备的生理活性多肽的特性，可以有多种条件。然而，为了分离与非肽基聚合物连接的免疫球蛋白Fc区或生理活性多肽缀合物，通常进行尺寸排阻色谱。为了进一步放大和分离非肽基聚合物在所需位置以外的位置结合产生的异构体或制备过程中产生的少量变性形式，也可使用亲和层析、疏水层析或离子交换层析。
在本发明中，如果需要，考虑到疏水性、分子量和电荷等性质，步骤(b)可通过选自蛋白质分离中使用的一般方法的方法进行，以最终纯化高纯度复合物。例如，可通过应用各种已知的方法进行分离，包括尺寸排阻色谱、亲和层析、疏水层析或离子交换层析，并且，如果需要，可组合使用多种不同的方法来以更高的纯度纯化复合物。根据所需的由生理活性多肽、非肽基聚合物和Fc恒定区组成的复合物的特征，各种分离条件是可能的。然而，为了分离其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区分别连接至非肽基聚合物两端的复合物，通常进行尺寸排阻色谱。为了进一步放大和有效分离由生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区与非肽基聚合物在所需位置以外的位置结合产生的异构体或副反应产物、或制备过程中产生的少量变性形式、未反应的生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区，可组合使用疏水层析、离子交换层析或亲和层析。特别地，可组合使用疏水层析和离子交换层析，也可使用多个疏水层析或多个离子交换层析。根据要制备的复合物，可单独使用离子交换层析或疏水层析。
在本发明中，所述离子交换层析是将特定pH值的带电蛋白质通过带电离子树脂固定化层析柱，通过蛋白质迁移速率的差异来分离蛋白质，可以是阴离子交换层析或阳离子交换层析。
所述阴离子交换层析是使用阳离子树脂，构成相应阴离子交换层析的树脂的官能团可以是选自季铵(Q)、季氨乙基(QAE)、二乙氨乙基(DEAE)、聚乙烯胺(PEI)、二甲基氨甲基(DMAE)和三甲基氨乙基(TMAE)中的任意一种，但不限于此。
进一步地，所述阳离子交换层析是使用阴离子树脂，构成相应阳离子交换层析的树脂的官能团可以是选自甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)和聚天冬氨酸中的任意一种，但不限于此。
在本发明中，构成疏水层析的树脂的官能团可以是选自苯基、辛基、(异)丙基、丁基和乙基中的任意一种，但不限于此。
在本发明中，构成尺寸排阻色谱的树脂的官能团可以是选自Superdex、Sephacryl、Superpose和Sephadex中的任意一种，但不限于此。
此外，本发明中的亲和层析是通过蛋白质迁移速率的差异来分离蛋白质，这是由蛋白质与树脂中能够与该蛋白质相互作用的配体(其固定在该树脂上)之间的相互作用引起的。构成亲和层析的树脂的官能团可以是选自蛋白A、肝素、蓝色(blue)、苯甲脒、金属离子(钴、镍和铜)和对部分或全部蛋白质复合物组成成分(其中，非肽基聚合物的两端分别与免疫球蛋白Fc区和生理活性多肽缀合)的抗体中的任意一种，但不限于此。
在本发明中，步骤(b)是为了分离非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区通过免疫球蛋白Fc区的N端彼此连接的蛋白质复合物。
本发明的另一方面提供了一种用于制备N端选择性为90％或更高的蛋白质复合物的方法。具体地，通过本发明的方法制备的蛋白质复合物可以是一种非肽基聚合物的一端与免疫球蛋白Fc区的N端连接使N端选择性为90％或更高的蛋白质复合物，其中，该N端选择性更具体地为95％或更高，甚至更具体地为98％或更高，再更具体地为99％或更高，但不限于此。
在本文中，术语“以90％或更高的N端选择性连接”是指，在90％或更多的通过蛋白质复合物级分(通过本发明的一系列反应获得)纯化制备的蛋白质复合物中，所述非肽基聚合物以位置特异性的方式连接至Fc区的N端。在本文中，术语“90％或更多(高)”可指v/v、w/w和峰/峰，但不限于一特定单位。包含以位置特异性方式连接至Fc区N端的非肽基聚合物的蛋白质复合物的收率可因反应条件、非肽基聚合物的反应器等而有所不同。
在本发明的实例中，证实了通过各种生理活性多肽、非肽基聚合物和Fc复合物的制备可通过本发明的方法制备N端选择性为90％或更高的蛋白质复合物。
所述药物组合物可包含蛋白质复合物，其包含量为90％或更高、更具体为95％或更高、甚至更具体为98％或更高、甚至更具体为99％或更高(但不限于此)的生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白Fc区N端。在本文中，术语“90％或更高”可指v/v、w/w和峰/峰，但不限于特定单位。
所述药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。
本发明的药物组合物可通过多种途径施用，包括口服、经皮、皮下、静脉内和肌肉内途径，优选以可注射制剂的形式施用。此外，本发明的药物组合物可通过本领域已知的方法配制以在将其施用给哺乳动物后提供活性成分的快速、持久或延迟释放。所述制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、袋药剂(sachet)、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软或硬明胶胶囊、无菌可注射溶液或无菌粉剂。合适的载体、赋形剂和稀释剂的示例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶(acaciarubber)、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。所述药物组合物还可包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明的蛋白质复合物的实际给药剂量可由若干相关因素决定，这些因素包括所治疗的疾病的类型；给药途径；患者的年龄、性别、体重和疾病的严重程度；以及作为活性成分的生理活性多肽的类型。由于本发明的蛋白质复合物具有优异的血持续时间(bloodduration)和体内效价，因此可以显著降低包括本发明蛋白质复合物的肽类药物的给药剂量和频率。
本发明的另一方面提供了蛋白质复合物的群体，其包括90％或更高量的根据上述方法制备的蛋白质复合物。在本文中，术语“复合物的群体”和“群体”可互换使用，它们是指一组蛋白质复合物，包括非肽基聚合物连接至Fc区N端的蛋白质复合物和/或非肽基聚合物与Fc区N端以外的区域相连的蛋白质复合物。
群体可仅包括非肽基聚合物连接至Fc区N端的蛋白质复合物、或非肽基聚合物连接至Fc区N端以外的区域的蛋白质复合物。具体地，非肽基聚合物连接至Fc区N端以外的区域的蛋白质复合物在群体中的百分比可以是90％或更高，更具体为95％或更高，甚至更具体为98％或更高，甚至更具体为99％或更高，但不限于此。在本文中，术语“90％或更高”可指v/v、w/w和峰/峰，但不限于特定单位。
出于本发明的目的，所述群体可以指通过去除制备的蛋白质复合物中的杂质、未反应的物质等，非肽基聚合物连接至Fc区N端以外的区域的蛋白质复合物的百分比增加了的群体。此外，所述群体可以指通过用于制备具有90％或更高N端选择性的蛋白质复合物的方法制备的群体，但不限于此。可通过本发明的方法有效地纯化该群体。
本发明特别涉及上述蛋白质复合物在预防、缓解或治疗有需要的患者中的用途，所述患者需要增加其白细胞产生、计数或需要增加干细胞产生，具体做法是向所述患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含经由非肽基聚合物以共价键连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至免疫球蛋白Fc区的N端，并且，经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个包含替换。此类方法可与或不与化疗药物或方案联合使用，其中，这些化疗药物或方案包括：多西他赛、多柔比星、环磷酰胺(TAC)；剂量密集的多柔比星+环磷酰胺(AC)，随后每周或每半周使用或不使用紫杉醇(paclitaxel)；及多西他赛+环磷酰胺(TC)。无论如何，本发明中描述的方法为接受这种方案的患者提供了优异的临床和副反应结果。在优选实施方案中，EFLAPEGRASTIM以13.2mg/0.6mL(含有3.6mg G-CSF)的固定剂量给药。在一个实施方案中，在每个周期的第1天静脉内(IV)施用TC。因此，多西他赛以75mg/m2 IV输注给药，及(ii)环磷酰胺以600mg/m2IV输注给药。每个治疗周期为21天，最多4个化疗周期。为了在任何周期的第1天(前一个周期的第22天)开始全剂量化疗，患者必须显示ANC≥1.5×109/L和血小板计数≥100×109/L。在其他实施方案中，EFLAPEGRASTIM可在每个周期的第2天，即TC化疗后约24h(±2h)给药。
此处提供的实施例仅用于说明目的，本发明不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：干扰素α(IFNu)-PEG-免疫球蛋白Fc N端区复合物的制备
1-1.IFNa-PEG缀合物的制备
将ALD-PEG-ALD(IDB,韩国)(一种分子量为3.4kDa的聚乙二醇(PEG)，其两端有醛反应基团)添加到溶解在100mM磷酸盐缓冲液中的5mg/mL人干扰素α-2b(hIFNa-2b，分子量：19kDa)中，其中，hIFNa:PEG的摩尔比为1:5至1:10)。将还原剂氰基硼氢化钠(NaBH3CN，Sigma)以20mM的最终浓度加入其中，并在4℃至8℃下缓慢搅拌反应约1h。为了获得PEG选择性地连接至干扰素α的氨基末端且PEG和干扰素α以1:1的比例相互连接的缀合物，将反应混合物进行SP HP(GE Healthcare,美国)阴离子交换层析以以高纯度纯化IFNot-PEG缀合物。
1-2.IFNα-PEG-Fc复合物的制备
为了将实施例1-1中纯化的IFNa-PEG缀合物与免疫球蛋白Fc的N端脯氨酸残基连接，加入免疫球蛋白Fc片段并以1:1至1:4的IFNa-PEG缀合物:免疫球蛋白Fc的摩尔比反应。将反应溶液制备为100mM磷酸盐缓冲液(pH为5.5至6.5)，并以20mM至50mM的最终浓度添加氰基硼氢化钠(NaBH3CN，Sigma)作为还原剂。在缓慢搅拌下，使反应在4℃至8℃下进行约12h至16h。
1-3.IFNa-PEG-Fc复合物的分离和纯化
为了去除实施例1-2的结合反应后未反应的物质和副产物并纯化由此产生的IFNa-PEG-Fc蛋白质复合物，将反应混合物经缓冲液交换为10mM Tris(pH7.5)，然后通过Source Q(GE Healthcare，美国)阴离子交换层析柱以去除未反应的Fc并获得IFNa-PEG-Fc蛋白复合物级分。具体而言，将反应溶液加到用10mM Tris(pH 7.5)平衡的Source Q柱上，然后使用含有50mM氯化钠(NaCl)的20mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液对该柱进行等度溶剂洗涤去除杂质。然后，用含有150mM氯化钠(NaCl)的缓冲溶液的浓度梯度洗脱IFNa-PEG-Fc蛋白质复合物。少量未反应的Fc和干扰素α二聚体作为杂质存在于获得的1FNa-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Source iso(GE Healthcare，美国)疏水层析。详细地，Source iso(GE Healthcare，美国)用含有约1.3M硫酸铵的20mM磷酸钾(pH 6.0)缓冲溶液平衡，然后将纯化的IFNa-PEG-Fc蛋白质复合物级分施加到其上。最后，用20mM磷酸钾(pH6.0)缓冲溶液的线性浓度梯度纯化高纯度IFNa-PEG-Fc蛋白质复合物。所制备的IFNa-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N端选择性通过肽图谱检测，发现选择性为90％或更高。
实施例2：人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)-PEG-Fc复合物的制备
17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物是使用衍生物(17,65-G-CSF)制备的，该衍生物通过用丝氨酸替换天然G-CSF的17和65位氨基酸而制备，然后进行纯化。
2-1.17,65SG-CSF-PEG缀合物的制备
将ALD-PEG-ALD(IDB，韩国)(分子量为3.4kDa的聚乙二醇(PEG)，其两端具有醛反应基团)添加到溶解在100mM磷酸盐缓冲液中的5mg/mL17 , 65S-G-CSF中(分子量：18kDa)，其中，G-CSF:PEG的摩尔比为1:5至1:10。将还原剂氰基硼氢化钠(NaBH3CN，Sigma)以20mM的最终浓度加入其中，并在4℃至8℃下缓慢搅拌反应约1h。为了获得PEG选择性地连接至人粒细胞集落刺激因子的氨基末端且PEG和G-CSF以1:1的比例相互连接的缀合物，将反应混合物进行SP HP(GE Healthcare，美国)阳离子交换层析以以高纯度纯化17 , 65SG-CSF-PEG缀合物。
2-2.17,65G-CSF-PEG-Fc复合物的制备
为了将实施例3-1中纯化的17,65G-CSF-PEG缀合物连接至免疫球蛋白Fc的N端，加入免疫球蛋白Fc片段并以1:1至1:4的17,65Ser-G-CSF-PEG缀合物：免疫球蛋白Fc摩尔比反应。将反应溶液制备为100mM磷酸盐缓冲液(pH为5.5至6.5)，并以20mM的最终浓度添加氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)作为还原剂。在4℃至8℃下缓慢搅拌进行反应。
2-3.17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc(或17,65SG-CSF-PEG-Fc)复合物的分离与纯化为了去除实施例3-2结合反应后未反应的物质和副产物并纯化由此产生的17 , 65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物，将反应混合物经缓冲液交换至含有2M NaCl的10mM Tris(pH 8.0)，然后通过Source Phenyl柱。为了去除杂质，用20mM Tris(pH 8.0)缓冲溶液的浓度梯度纯化17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。少量未反应的免疫球蛋白Fc和17,65G-CSF二聚体作为杂质存在于获得的17 , 65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Q HP(GEHealthcare，美国)阴离子色谱。Q HP(GE Healthcare，美国)用20mM Tris(pH8.0)缓冲溶液平衡，然后将纯化的17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分应用于其上。最后，使用含有1M氯化钠的20mM Tris(pH 8.0)缓冲溶液的线性浓度梯度纯化高纯度17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。制备的17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N端选择性通过肽图谱检测，发现选择性为90％或更高。
实施例3：使用具有不同反应基团的PEG制备蛋白质复合物
3-1.17,65SG-CSF-PEG缀合物的制备
将SMB-PEG-SMB(Nektar，美国)(其为分子量为3.4kDa的聚乙二醇(PEG)，两端具有琥珀酰亚胺α-丁酸甲酯(SMB)反应基团)加入到溶解在20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中的10mg/mL 17,65SG-CSF(分子量为18kDa)中，其中，G-CSF:PEG的摩尔比为1:3，并在室温下缓慢搅拌约30min。为了获得缀合物，其中所述缀合物中PEG选择性地连接至17,65SG-CSF的氨基末端且PEG和17,65SG-CSF以1:1的比例相互连接，将反应混合物进行SPHP(GE Healthcare，美国)阳离子交换层析。
3-2.17,65SG-CSF-PEG-Fc复合物的制备
为了将实施例7-1中纯化的17,65SG-CSF-PEG缀合物与免疫球蛋白Fc的N端以外的区域连接，加入免疫球蛋白Fc片段并以1:4至1:8的17,65SG-CSF-PEG缀合物：免疫球蛋白Fc摩尔比反应。使反应在室温下于20mM磷酸盐缓冲液(pH为5.5至6.5)中缓慢搅拌约2h。
3-3.17,65SG-CSF-PEG-Fc复合物的分离与纯化
为了去除实施例7-2的结合反应后未反应的物质和副产物并纯化由此产生的17, 65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物，将反应混合物通过Q HP(GE Healthcare，美国)阴离子交换色谱柱，因此去除未结合的Fc，得到17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分。将反应溶液加到用20mM Tris(pH 8.0)缓冲液平衡的Q HP柱上，用含有1M氯化钠(NaCl)的缓冲溶液的浓度梯度纯化17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。少量未反应的免疫球蛋白Fc和17,65SG-CSF二聚体作为杂质存在于获得的17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物级分中。为了去除杂质，进一步进行Source iso(GE Healthcare，美国)疏水层析。最后，使用Source iso(GE Healthcare，美国)，用含有1.2M硫酸铵的50mM Tris(pH 7.5)缓冲溶液的线性浓度梯度纯化高纯度17, 65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物。制备的17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N端选择性通过肽图谱检测，发现选择性为90％或更高。
实施例4：使用具有不同反应基团的PEG制备蛋白质复合物
使用FacVII-ATKAVC制备FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物，FacVII-ATKAVC是本申请发明人先前提交的韩国专利申请No.10-2012-0111537的FacVII衍生物。
4-1.PEG-Fc复合物的分离与纯化
首先，为了将马来酰亚胺-10kDa-PEG-醛(NOF，日本)的醛反应基团连接至免疫球蛋白Fc片段的N端，将免疫球蛋白Fc区和马来酰亚胺-10kDa PEG-醛以1:1的摩尔比在100mM磷酸盐缓冲溶液(pH为5.5至6.5)中混合，并在10mg/mL的蛋白质浓度下加入还原剂，即20mM氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)。使反应在低温(4℃至8℃)下进行约2h。为了获得单聚乙二醇化的免疫球蛋白Fc片段(马来酰亚胺-10kDa PEG-Fc)，进行Source Q(GE Healthcare，美国)阴离子色谱，并用pH 7.5的20mM Tris缓冲液中的氯化钠浓度梯度进行洗脱。
4-2.FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物的制备
通过加入0.5mM至2mM三苯基膦-3,3',3”-三磺酸三钠盐水合物(triphenylphosphine-3,3',3”-trisulfonic trisodium salt hydrate)作为还原剂以还原C端使FacVII-ATKAVC在pH 5.5的10mM双甘氨肽缓冲液(glycylglycine buffer)中于室温下反应约2h。C端还原的FacVII-ATKAVC和单PEG化免疫球蛋白Fc片段(马来酰亚胺-10kDaPEG-Fc)以1:4至1:20的摩尔比混合，并在pH 7.5的50mM Tris缓冲液中以1mg/mL至2mg/mL的总蛋白浓度于室温下反应2h。
4-3.FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物的分离与纯化
将实施例8-2的反应溶液进行Source Q阴离子色谱，并用pH 7.5的20mM Tris缓冲溶液中的氯化钠的浓度梯度洗脱FacVII-ATKAVC-10kDa PEG-Fc复合物。为了活化FacVII-ATKAVC-PEG-Fc复合物的FacVII，在约4mg/mL FacVII的条件下在pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲溶液中于低温(4℃至8℃)下反应约18h。最后，使用Superdex 200在pH 5.5的10mM双甘氨肽缓冲溶液中通过尺寸排阻层析(GE Healthcare，美国)纯化高纯度FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc。制备的FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc蛋白质复合物的Fc区的N端选择性通过肽图谱检测，发现选择性为90％或更高。
实施例5：使用不同分子量的PEG制备蛋白质复合物
ALD-PEG-ALD(Nektar,USA)(一种分子量为10kDa的聚乙二醇，其两端有醛反应基团)用于以与实施例5-2相同的方式制备和纯化胰岛素-10kDa PEG缀合物。将纯化的胰岛素-10kDa PEG缀合物浓缩至约5mg/mL的浓度，然后用于以与实施例2-3相同的方式制备和纯化胰岛素-10kDa PEG-Fc蛋白质复合物。
实施例6-蛋白质复合物纯度的评估
6-1.蛋白质复合物的鉴定
使用4％～20％梯度凝胶和12％凝胶通过非还原SDS-PAGE分析上述实施例中制备的蛋白质复合物。使用对免疫球蛋白Fc和生理活性多肽的抗体对各个蛋白质复合物进行SDS-PAGE分析和Western印迹分析。如图1所示，偶联反应导致成功生成IFNa-PEG-Fc(A)、hGH-PEG-Fc(B)、17,65SG-CSF-PEG-Fc(C)、Insulin-PEG-Fc(D)、EPO-PEG-Fc(E)、CA-Exendin4-PEG-Fc(F)和FacVII-PEG-Fc(G)。
6-2.蛋白质复合物纯度的评估
上述实施例中制备的蛋白质复合物IFNa-PEG-Fc(A)、hGH-PEG-Fc(B)、17,65SG-CSF-PEG-Fc(C)、Insulin-PEG-Fc(D)、EPO-PEG-Fc(E)和CA-Exendin4-PEG-Fc(F)分别使用HPLC进行尺寸排阻色谱、反相色谱或离子交换色谱。在每次分析中，它们都显示了一个对应于95％或更高纯度的单峰。
6-3.检查蛋白质复合物的位点选择性
实施例中制备的蛋白质复合物IFNa-PEG-Fc(A)、hGH-PEG-Fc(B)、17,65SG-CSF-PEG-Fc(C)、Insulin-PEG-Fc(D)和EPO-PEG-Fc(E)分别使用蛋白酶进行肽图谱分析(反相色谱)。经确认，以90％以上的高选择性制备了通过免疫球蛋白Fc区的N端连接的蛋白质复合物。
实施例7：根据Fc结合位置比较复合物的功效
将实施例中制备的蛋白质复合物CA-Exendin4-PEG-Fc、17,65SG-CSF-PEG-Fc和EPO-PEG-Fc分别进行体外和体内功效测试。如下表所示，与Fc的N端(脯氨酸)结合显示出比与其他区域(例如，赖氨酸)结合更好的功效。
[表1]体外活性-CAExendin-PEG-Fc位置异构体的CHO/GLP-1R生物测定
Figure BDA0003435406110000301
如表1所示，CA Exendin-PEG-Fc位置异构体之间的体外活性比较表明：本发明的通过特异性结合免疫球蛋白Fc片段的N端制备的CA Exendin-PEG-Fc复合物具有比通过与免疫球蛋白Fc区的另一个位置结合制备的CA Exendin-PEG-Fc复合物高6倍的效力。
[表2]体外活性-使用17,65SG-CSF-PEG-Fc位置异构体的骨髓细胞增殖试验
Figure BDA0003435406110000302
如表2所示，17,65SG-CSF-(N端)-PEG-(N端)Fc-实验组S-G-CSF-PEG-Fc位置异构体之间的体外活性比较表明：与通过结合免疫球蛋白Fc区的另一位置制备的17,65SG-CSF-(N端)-PEG-(N端)Fc-实验组S-G-CSF-PEG-Fc复合物相比，本发明的通过特异性结合免疫球蛋白Fc片段的N端制备的17,65SG-CSF-(N端)-PEG-(N端)Fc-实验组S-G-CSF-PEG-Fc复合物的效价提高了约67％。
同时，为了检查本发明的蛋白质复合物(特别是EPO-PEG-Fc位置异构体)的体内活性，进行红细胞正常小鼠试验(normocythemic mice assay)，以测定将EPO-PEG-Fc经皮下注射到红细胞正常小鼠后的网状细胞(reticulocyte)水平。
[表3]EPO-PEG-Fc位置异构体的体内生物效价网状细胞水平的测定(在经皮下注射到红细胞正常小鼠后)
Figure BDA0003435406110000303
如表3所示，EPO-PEG-Fc位置异构体之间的体内活性比较表明：与通过结合至免疫球蛋白Fc区的另一位置制备的EPO-PEG-Fc复合物相比，本发明的通过特异性结合免疫球蛋白Fc片段的N端制备的EPO-PEG-Fc复合物的效价提高了40％。
这些结果表明：当通过使用免疫球蛋白Fc片段的特定位点作为结合位点来制备包含生理活性多肽、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区的蛋白质复合物时，该蛋白质复合物表现出提高的生理活性多肽的体内活性。
实施例8：在接受多西他赛和环磷酰胺(TC)的乳腺癌患者的化疗诱导的嗜中性粒 细胞减少症的管理中随机人体试验17,65SG-CSF-PEG-Fc蛋白质复合物(EFLAPEGRASTIM) vs.PEGFILGRASTIM
为了评估固定剂量的EFLAPEGRASTIM(13.2mg/0.6mL；3.6mg GCSF等效物)在乳腺癌患者(这些患者是用多西他赛和环磷酰胺(TC)辅助或新辅助化疗的候选者)中的疗效和安全性，在406名患者中进行了开放标记、活性对照人体研究。
符合条件的患者按1:1随机分配至以下两个治疗组：(a)EFLAPEGRASTIM组：EFLAPEGRASTIM 13.2mg/0.6mL(含3.6mg G-CSF)固定剂量和(b)PEGFILGRASTIM组：PEGFILGRASTIM 6mg/0.6mL(含6.0mg G-CSF)固定剂量。因此，在每个周期的第1天静脉(IV)注射TC：(i)根据机构的护理标准以75mg/m2静脉输注多西他赛(ii)根据机构的护理标准以600mg/m2静脉输注环磷酰胺。每个治疗周期为21天，最多4个化疗周期。要在任何周期的第1天(前一个周期的第22天)开始全剂量化疗，患者必须具有ANC≥1.5×109/L和血小板计数≥100×109/L。
在每个周期的第2天，即TC化疗后约24h(±2h)给予EFLAPEGRASTIM或PEGFILGRASTIM。PEGFILGRASTIM将根据制造商的处方信息(每个化疗周期皮下注射6mg)给药。
符合所有纳入和排除标准的患者被随机分配到EFLAPEGRASTIM组或PEGFILGRASTIM组并接受研究治疗(TC)，随后24(±2)h接受EFLAPEGRASTIM或PEGFILGRASTIM 4个周期。在最后一剂研究治疗后35(±5)天进行治疗结束(EOT)访视。在第1周期期间，在化疗前的第1天抽取CBC样本，然后，从第4天到第15天每天抽取CBC样本直到从嗜中性粒细胞减少症中恢复。在第2至第4周期中，在给药前第1天和第4、7、10和15天(每次收集±1天)抽取CBC样本。在治疗结束访视时也收集CBC。在第1周期的第2天、第4天和第5天以及第三周期的第2天、第4天和第7天收集用于群体PK的稀疏PK样本。在化疗给药前、治疗结束时以及6个月和12个月(长期安全性)时在每个周期抽取免疫原性样本。
接受至少一剂研究药物且未停止研究的患者在最后一剂研究治疗后接受长期安全性随访。长期安全性包括在3个月和9个月时通过电话进行的不良事件(AE)评估以及在6个月和12个月时进行的AE评估和免疫原性抽血的临床访问。第1周期中的DSN被定义为严重嗜中性粒细胞减少症的给药后天数。
对第1周期中严重嗜中性粒细胞减少症持续时间(DSN)的主要终点进行了功效分析，该持续时间被定义为严重嗜中性粒细胞减少症(ANC<0.5×109/L)的给药后天数，从低于阈值的ANC首次发生开始。结果表明：EFLAPEGRASTIM组的平均DSN为0.20(±0.50)天，而PEGFILGRASTIM组的平均DSN为0.35(±0.68)天。EFLAPEGRASTIM组与PEGFILGRASTIM组之间的平均DSN的差异为-0.15天，相应的95％CI为(-0.264,-0.032)(使用统计分析计划中指定的百分位数法)。使用预先指定的主要终点标准，EFLAPEGRASTIM组到PEGFILGRASTIM组被证明提供了非劣于PEGFILGRASTIM的DSN(更好或同样有效)(95％CI上限<0.62天；p<0.0001)。结果还证明了EFLAPEGRASTIM在第1周期中比PEGFILGRASTIM具有统计学优势(95％CI上限<0；p＝0.038)，这表明EFLAPEGRASTIM组中严重嗜中性粒细胞减少症的发生率显著降低(图2和图3)。同时，治疗组(其中大部分被认为与化疗(TC)给药有关)之间的不良事件发生率总体上具有可比性。
本文提供的实施例支持通过PEG部分连接免疫球蛋白Fc区的G-CSF蛋白质复合物在增加生理活性多肽的体内持续时间和同时增加或维持体内活性(效力)方面的优越性。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以以不同的具体形式实施本发明。因此，应当理解，上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是示例性的。本发明的范围由所附权利要求而不是由上述描述限定，因此落入权利要求的范围内的所有变化和修改、或这些范围的等价物都被包括在权利要求中。
序列表
<110> 光谱制药有限公司
<120> 使用G-CSF蛋白质复合物治疗的方法
<130> 178923.00178
<150> 16/428,351
<151> 2019-05-31
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 174
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
115 120 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220

Claims (41)

1.一种预防、缓解或治疗有需要的患者的状况的方法，所述状况的特征在于患者的白细胞生成受损，所述方法包括向所述患者施用有效治疗量的蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含通过非肽基聚合物共价连接至免疫球蛋白Fc区的经修饰的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至所述免疫球蛋白Fc区的N端，并且，所述经修饰的hG-CSF在Cys17和Pro65中的至少一个中包含替换。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述状况选自：造血功能降低、免疫功能降低、嗜中性粒细胞计数减少、嗜中性粒细胞动员减少、外周血祖细胞动员、败血症、严重慢性嗜中性粒细胞减少症、发热性嗜中性粒细胞减少症、骨髓移植、感染性疾病、白细胞减少症、血小板减少症、贫血症、在移植过程中促进骨髓植活、在放射、化学或化学疗法诱导的骨髓发育不全或骨髓抑制的治疗中促进骨髓恢复、以及获得性免疫缺陷综合征。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述状况是严重慢性嗜中性粒细胞减少症。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述状况是发热性嗜中性粒细胞减少症。
5.根据权利要求1中任一项所述的方法，其中，所述白细胞生成受损是化学疗法、放射疗法或特发性血小板减少性紫癜的结果。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质复合物在所述患者接受辅助或新辅助化疗后给药。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述蛋白质复合物在所述患者接受辅助或新辅助化疗后1至5天之间给药。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述辅助或新辅助化疗是多西他赛与环磷酰胺的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在向所述患者施用第一剂蛋白质复合物后15至25天之间施用第二剂所述蛋白质复合物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效治疗量是选自25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg的单位剂型。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效治疗量为0.6mL剂量体积中的13.2mg所述蛋白质复合物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用有效治疗量的第二药剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第二药剂是抗癌剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，Cys17处的替换是Cys17Ser。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，Pro65处的替换是Pro65Ser。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述经修饰的人G-CSF包含SEQ ID NO：1的多肽序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含SEQ ID NO：2的多肽序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述非肽基聚合物的两端介由反应基团通过共价键分别连接至所述经修饰的人G-CSF和所述免疫球蛋白Fc区。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，
(a)所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的；
(b)所述免疫球蛋白Fc区由CH2和CH3结构域组成；
(c)所述免疫球蛋白Fc区包含CH2、CH3和CH4结构域之一；
(d)所述免疫球蛋白Fc区进一步包含铰链区；或者
(e)所述免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的免疫球蛋白Fc片段。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，
(a)所述免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合体，其中，每个结构域具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源；
(b)所述免疫球蛋白Fc片段是二聚体或多聚体，由包含具有相同来源的结构域的单链免疫球蛋白组成；
(c)所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段；或者
(d)所述免疫球蛋白Fc片段是人无糖基化IgG4 Fc片段。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，
(a)所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合；或者
(b)所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量为3.4kDa。
23.根据权利要求18所述的方法，其中，所述非肽基聚合物的反应基团选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，
(a)所述醛基为丙醛基或丁醛基；或者
(b)所述琥珀酰亚胺衍生物为琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺丁酸甲酯、琥珀酰亚胺丙酸甲酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，
(a)所述非肽基聚合物在两端具有醛基作为反应基团；
(b)所述非肽基聚合物在两端分别具有醛基和马来酰亚胺基作为反应基团；或者
(c)所述非肽基聚合物在两端分别具有醛基和琥珀酰亚胺基作为反应基团。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非肽基聚合物的每端分别连接至所述免疫球蛋白Fc区的N端和所述经修饰的人G-CSF的赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基的N端、C端或自由反应基团。
27.一种用于治疗或预防接受化疗的患者的嗜中性粒细胞减少症的方法，其中，所述方法包括向所述患者施用蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含通过非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区连接的生理活性多肽，其中，所述非肽基聚合物位点特异性地连接至所述免疫球蛋白Fc区的N端。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非肽基聚合物的两端介由反应基团通过共价键分别连接至所述生理活性多肽和所述免疫球蛋白Fc区。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc区是免疫球蛋白。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc区是无糖基化的。
31.根据权利要求27所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含CH2、CH3和CH4结构域中的任一个。
32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc区由CH2和CH3结构域组成。
33.根据权利要求27所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc区还包含铰链区。
34.根据权利要求27所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc片段的每个结构域是结构域的杂合体，其中，每个结构域具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源。
35.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。
36.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
37.根据权利要求27所述的方法，其中，所述生理活性多肽是G-CSF。
38.根据权利要求27所述的方法，其中，所述蛋白质复合物在化疗完成后约6h内施用于所述患者。
39.根据权利要求27所述的方法，其中，所述蛋白质复合物在化疗完成后约5h内施用于所述患者。
40.根据权利要求27所述的方法，其中，所述蛋白质复合物在化疗完成后约2h内施用于所述患者。
41.根据权利要求27所述的方法，其中，所述蛋白质复合物在化疗完成后约1h内施用于所述患者。
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