KR20220016097A - G-csf 단백질 복합체를 사용하는 치료 방법 - Google Patents

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가자난 바트
샨타 차우라
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스펙트럼 파마슈티컬즈 인크
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Abstract

본 개시내용은 병태 (즉, 호중구감소증) 예방, 완화 또는 치료를 필요로 하는 환자에서 병태 (즉, 호중구감소증)를 예방, 완화 또는 치료하는 방법으로서, 상기 병태는 상기 환자에서 손상된 백혈구 생산을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함한다. 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.

Description

G-CSF 단백질 복합체를 사용하는 치료 방법
기술 분야
본 발명은 병태(condition), 예컨대, 호중구감소증(neutropenia)을 치료, 예방 또는 발병 위험을 감소시키기 위한 단백질 복합체, 제약 조성물, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 단백질 복합체는 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 비-펩티딜 중합체(non-peptidyl polymer)를 통해 면역글로불린 Fc 영역을 생리 활성 폴리펩티드에 연결시킴으로써 형성될 수 있다.
본 발명의 배경
호중구감소증은 화학요법 치료, 약물 부작용 또는 자가면역 장애와 가장 흔히 연관된 비교적 흔한 장애이다. 화학요법에 의해 유도된 호중구감소증은 항암제 투여에 의해 발생하는 흔한 독성이다. 이는 생명을 위협하는 감염과 연관이 있으며, 화학 요법 일정을 변경하여 조기 및 장기 임상 결과에 영향을 미칠 수 있다. 열성 호중구감소증은 골수억제 화학요법 양생법, 예컨대, 도세탁셀, 독소루비신, 사이클로포스파미드 (TAC); 후속하여 매주 또는 주 2회의 파클리탁셀의 존재 또는 부재하의 고용량 독소루비신 + 사이클로포스파미드 (AC); 및 도세탁셀 + 사이클로포스파미드 (TC)의 주요 용량 제한 독성이다. 이는 일반적으로 장기간의 입원, 광범위한 항생제의 정맥내 투여로 이어지며, 종종 심각한 이환율 및 사망률과 연관이 있다. 나이브 환자 중 약 25% 내지 40%에서는 G-CSF 지원 부재하에서 일반적인 화학요법 양생법으로 인해 열성 호중구감소증이 발생한다.
현행 치료 방식은 본 병태를 퇴치하기 위해 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 및/또는 항생제를 사용한다. 그러나, G-CSF 또는 그의 다른 폴리펩티드 유도체는 변성되기 쉽거나, 또는 혈액 내 단백질분해효소에 의해 쉽게 분해되어 신장 또는 간을 통해 쉽게 제거된다. 그러므로, G-CSF 함유 약물의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여해야 하고, 이는 환자에게 과도한 고통을 초래한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, G-CSF를 용해도가 높은 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜에 화학적으로 부착시켜 그의 혈액 안정성을 증가시키고, 장기간 동안 적합한 혈중 농도를 유지시켰다.
그러나, G-CSF에의 PEG의 결합이 비록 혈액 안정성을 증가시킬 수는 있지만, 최적의 생리학적 효과에 필요한 역가를 극적으로 감소시킨다. 따라서, 당업계에서 이러한 결점을 해결할 필요가 있다.
따라서, 새로운 G-CSF 함유 단백질 복합체가 안정적으로 유지되고, 환자 결과를 극적으로 개선시킬 수 있는 새로운 제제 및 사용 방법이 강력하게 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 쉽게 제조될 수 있고, 호중구감소증 발병 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있고, 최적의 치료 결과를 달성하는 혈청 농도를 유지할 수 있는, 더욱 안정적인 단백질 복합체를 함유하는 G-CSF를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 부위 특이적으로 연결된 비-펩티딜 중합체를 통해 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 단편을 연결함으로써 제조된 단백질 복합체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 병태 예방, 완화(alleviating) 또는 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 예방, 완화 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.
상기 병태는 환자에서 손상된 백혈구 생산을 특징으로 한다. 예를 들어, 병태는 조혈 기능 감소(reduced hematopoietic function), 면역 기능 감소(reduced immune function), 호중구수 감소(reduced neutrophil count), 호중구 이동 감소(reduced neutrophil mobilization), 말초 혈액 전구 세포 이동(mobilization of peripheral blood progenitor cell), 패혈증(sepsis), 중증 만성 호중구감소증(severe chronic neutropenia), 열성(febrile) 호중구감소증, 골수 이식(bone marrow transplant), 감염성 질환(infectious disease), 백혈구감소증(leucopenia), 혈소판감소증(thrombocytopenia), 빈혈(anemia), 이식 중 골수의 생착 촉진(enhancing engraftment of bone marrow during transplantation), 방사선 치료에서 골수 회복 촉진(enhancing bone marrow recovery in treatment of radiation), 화학물질 또는 화학요법 유도성 골수 무형성 또는 골수억제(chemical or chemotherapeutic induced bone marrow aplasia or myelosuppression), 및 후천성 면역 결핍 증후군(acquired immune deficiency syndrome) 중 하나일 수 있다.
일부 실시양태에서, 병태는 중증 만성 호중구감소증일 수 있다. 일부 실시양태에서, 병태는 열성 호중구감소증일 수 있다. 일부 실시양태에서, 손상된 백혈구 생산은 화학요법, 방사선 요법 또는 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura)의 결과일 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질 복합체는 환자를 애쥬번트(adjuvant) 또는 네오애쥬번트(neoadjuvant) 화학요법으로 치료한 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 복합체는 환자를 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법으로 치료한 후 1일 내지 5일 사이에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법은 도세탁셀 및 사이클로포스파미드의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 용량의 단백질 복합체는 제1 용량의 단백질 복합체를 환자에게 투여한 후 15 내지 25일 사이에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 유효량은 25 ㎍/kg, 50 ㎍/kg, 100 ㎍/kg, 및 200 ㎍/kg으로부터 선택되는 단위 투여량 형태(unit dosage form)이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 0.6 mL 투여 부피 중 13.2 mg의 단백질 복합체이다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 환자에게 치료 유효량의 제2 작용제(second agent) (예컨대, 항암제)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, Cys17에서의 치환은 Cys17Ser일 수 있고, Pro65에서의 치환은 Pro65Ser일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 인간 G-CSF는 서열 번호: 1의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체의 양 말단은 공유 결합에 의해 반응성 기를 통해 변형된 인간 G-CSF 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결된다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 (a) 면역글로불린 Fc 영역이 비글리코실화(aglycosylating)되거나; (b) 면역글로불린 Fc 영역이 CH2 및 CH3 도메인(domain)으로 구성되거나; (c) 면역글로불린 Fc 영역이 CH2, CH3, 및 CH4 도메인 중 하나를 포함하거나; (d) 면역글로불린 Fc 영역이 힌지(hinge) 영역을 추가로 포함하거나; 또는 (e) 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM으로부터 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 추가로 (a) 면역글로불린 Fc 단편의 각 도메인이 도메인의 하이브리드(hybrid)이고, 여기서, 각 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로부터 유래된 상이한 기원(origin)을 갖거나; (b) 면역글로불린 Fc 단편은 기원이 동일한 도메인을 포함하는 단일 쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체이거나; (c) 면역글로불린 Fc 단편은 IgG4 Fc 단편이거나; 또는 (d) 면역글로불린 Fc 단편은 인간 비글리코실화된 IgG4 Fc 단편인 것을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 (a) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 지질 중합체, 키틴(chitin), 히알루론산, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는 (b) 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 3.4 kDa이다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체의 반응성 기는 알데히드 기, 말레이미드 기, 및 숙신이미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 알데히드 기는 프로피온알데히드 기 또는 부티르알데히드 기일 수 있다. 숙신이미드 유도체는 숙신이미딜 카르복시메틸, 숙신이미딜 발레레이트, 숙신이미딜 메틸부타노에이트, 숙신이미딜 메틸프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, N-히드록시숙신이미드, 또는 숙신이미딜 카르보네이트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 양 말단에 반응성 기로서 알데히드 기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 양 말단에 각각 반응성 기로서 알데히드 기 및 말레이미드 기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 양 말단에 각각 반응성 기로서 알데히드 기 및 숙신이미드 기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체의 각 말단은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 및 변형된 인간 G-CSF의 N-말단, C-말단, 또는 리신(lysine) 잔기, 히스티딘 잔기, 또는 시스테인 잔기의 유리(free) 반응성 기에 각각 연결된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 화학요법을 받고 있는 환자에서 호중구감소증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 환자에게, 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 부위 특이적으로 연결된 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 생리 활성 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리 활성 폴리펩티드는 G-CSF이다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체의 양 말단은 공유 결합에 의해 반응성 기를 통해 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결된다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 비글리코실화된 것이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 CH2, CH3, 및 CH4 도메인 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 단편의 각 도메인은 도메인의 하이브리드이고, 여기서, 각 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로부터 유래된 상이한 기원을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단백질 복합체는 화학요법 완료 약 6시간, 약 5시간, 2시간, 또는 1시간 이내에 환자에게 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질 복합체를 활성 성분으로 포함하는 생리활성 생리 활성 폴리펩티드의 생체내 지속 시간 및 안정성을 개선시키기 위한, 제약 조성물 중 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 반응에 의해 제조된 17, 65Ser-G-CSF-PEG-Fc 복합체의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 결과를 보여주는 것이다.
도 1b는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 반응에 의해 제조된 17, 65Ser-G-CSF-PEG-Fc 복합체의 Fc 영역 N-말단 결합을 분석하기 위한 펩티드 맵핑 결과를 나타낸다.
도 2는 17, 65Ser-G-CSF-PEG-Fc (에플라페그라스팀(EFLAPEGRASTIM)) 아암에서의 통계적으로 유의적인 중증 호중구감소증의 발병률 감소를 보여주는 것이다.
도 3은 중증 호중구감소증 및/또는 호중구감소증에 대한 항감염제의 사용으로 인한 입원을 비롯한 호중구감소증 합병증이 에플라페그라스팀 아암에서 유의적으로 더 적다는 것을 보여주는 것이다.
본 발명의 상세한 설명
광범위하게 말하자면, 본 개시내용은 손상된 백혈구 생산을 특징으로 하는 병태를 앓는 환자를 예방, 완화, 예방적 치료, 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 생리 활성 폴리펩티드, 예컨대, 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함한다. 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결될 수 있고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.
또 다른 측면에서, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 골수 이식에 적격한 환자에서 과립구의 수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 환자에서 줄기 세포 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 화학요법을 받고 있는 자, 또는 다른 환자에게 줄기 세포를 공여하는 줄기 세포 공여자인 자를 포함하는, 조혈 전구 세포수 증가를 필요로 하는 환자에서 조혈 전구 세포수를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 접합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 병태로는 조혈 기능 감소, 면역 기능 감소, 호중구수 감소, 호중구 이동 감소, 말초 혈액 전구 세포 이동, 패혈증, 중증 만성 호중구감소증, 골수 이식, 감염성 질환, 백혈구감소증, 혈소판감소증, 빈혈, 이식 중 골수의 생착 촉진, 방사선 치료에서 골수 회복 촉진, 화학물질 또는 화학요법 유도성 골수 무형성 또는 골수억제, 및 후천성 면역 결핍 증후군을 포함한다. 한 실시양태에서, 병태는 골수억제, 호중구감소증, 또는 바람직하게, 열성 호중구감소증이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 골수억제 항암제를 받고 있는 비골수성 악성종양 환자에서 호중구감소증 (예컨대, 열성 호중구감소증)으로 나타나는 감염을 예방, 완화, 예방적 치료, 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 손상된 백혈구 생산은 화학요법, 방사선 요법, 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법, 또는 특발성 혈소판감소성 자반증의 결과이다. 특정 실시양태에서, 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법은 도세탁셀 및 사이클로포스파미드의 조합이다. 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 25 ㎍/kg, 50 ㎍/kg, 100 ㎍/kg, 및 200 ㎍/kg으로부터 선택되는 단위 투여량 형태이다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 환자에게 치료 유효량의 제2 작용제, 예컨대, 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 G-CSF는 Cys17에서의 치환에 의한 Cys17Ser이다. 다른 실시양태에서, Pro65에서의 치환은 Pro65Ser이다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열 번호: 1의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 G-CSF는 서열 번호: 2 폴리펩티드 서열을 포함한다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 단백질 복합체는 (a) 면역글로불린 Fc 단편의 각 도메인이 도메인의 하이브리드이고, 여기서, 각 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로부터 유래된 상이한 기원을 갖는 것; (b) 면역글로불린 Fc 단편은 기원이 동일한 도메인을 포함하는 단일 쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것; (c) 면역글로불린 Fc 단편은 IgG4 Fc 단편인 것; 또는 (d) 면역글로불린 Fc 단편은 인간 비글리코실화된 IgG4 Fc 단편인 것을 함유한다.
특정 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 화학요법을 받고 있는 환자에서 호중구감소증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 환자에게 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 변형된 G-CSF를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체의 양 말단은 공유 결합에 의해 반응성 기를 통해 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결된다. 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 비글리코실화된 것이다.
일부 실시양태에서, G-CSF 복합체 조성물은 화학요법 완료 약 5시간, 2시간, 1시간, 또는 30분 이내에 환자에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 면역글로불린 Fc 영역이 CH2, CH3, 및 CH4 도메인 중 하나를 포함하는 단백질 복합체를 제공한다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM으로부터 유래된 면역글로불린 Fc 단편이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 단편의 각 도메인은 도메인의 하이브리드이고, 각 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로부터 유래된 상이한 기원을 갖는다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 단편은 기원이 동일한 도메인을 포함하는 단일 쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체이다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린 Fc 단편은 IgG4 Fc 단편이다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 및 그의 조합 중 하나일 수 있고, 바람직하게, 비-펩티딜 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 3.4 kDa 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체의 반응성 기는 알데히드 기, 말레이미드 기, 및 숙신이미드 유도체 중 하나일 수 있다. 알데히드 기는 프로피온알데히드 기 또는 부티르알데히드 기일 수 있다. 숙신이미드 유도체는 숙신이미딜 카르복시메틸, 숙신이미딜 발레레이트, 숙신이미딜 메틸부타노에이트, 숙신이미딜 메틸프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, N-히드록시숙신이미드, 또는 숙신이미딜 카르보네이트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 양 말단에 반응성 기로서 알데히드 기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 양 말단에 각각 반응성 기로서 알데히드 기 및 말레이미드 기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-펩티딜 중합체는 양 말단에 각각 반응성 기로서 알데히드 기 및 숙신이미드 기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 비-펩티딜 중합체의 각 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단; 및 생리 활성 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 리신 잔기, 히스티딘 잔기, 또는 시스테인 잔기의 유리 반응성 기에 연결된 것인 단백질 복합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 화학요법을 받고 있는 환자에서 호중구감소증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 환자에게, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 생리 활성 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 생리 활성 폴리펩티드는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 응고 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질, 및 수용체 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생리 활성 폴리펩티드는 G-CSF이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 또한 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은
(a) 양 말단에 반응성 기를 갖는 적어도 하나의 비-펩티딜 중합체, 적어도 하나의 생리 활성 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역을 공유 결합에 의해 연결하여 단백질 복합체를 제조하는 단계, 및
(b) 단계 (a)에서 제조된 공유 연결된 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역을 본질적으로 포함하는 단백질 복합체를 단리시키는 단계로서, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 것인 단계를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시양태는 단계 (a)가
(a1) 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드에 연결하여 접합체를 제조하는 단계; 및
(a2) 단계 (a1)에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드 중 나머지 다른 하나에 연결하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a1)에서 생리 활성 폴리펩티드와 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비가 1:1 내지 1:30 범위이고, 면역글로불린 Fc 단편과 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비가 1:1 내지 1:20 범위인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a1)이 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a1)이 4.0℃ 내지 25℃인 온도에서 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a1)에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도가 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a2)에서, 접합체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드 사이의 반응 몰비가 1:0.1 내지 1:20 범위인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a2)가 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a2)가 4.0℃ 내지 25℃인 온도에서 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a2)에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 농도가 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a1) 및 단계 (a2)가 환원제의 존재하에서 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 환원제가 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3), 소듐 보로하이드라이드, 디메틸아민 보레이트, 및 피리딘 보레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (a2)에서, 단리가 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 단일 또는 조합된 정제 방법에 의해 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 4급 암모늄 (Q), 4급 아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌 이민 (PEI), 디메틸-아미노메틸 (DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸술포네이트 (S), 술포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 및 폴리아스파르트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 소수성 크로마토그래피 수지의 작용기가 페닐, 옥틸, (이소)프로필, 부틸, 및 에틸로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 친화성 크로마토그래피 수지의 작용기가 단백질 A, 헤파린, 블루, 벤즈아미딘, 금속 이온 (코발트, 니켈, 및 구리), 및 비-펩티딜 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드에 접합되어 있는 것인 단백질 복합체의 구성 성분의 일부 또는 그 전체에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 크기 배제 크로마토그래피의 수지가 슈퍼덱스(Superdex), 세파크릴(Sephacryl), 슈퍼포스(Superpose), 및 세파덱스(Sephadex)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (b)의 단백질 복합체를 단리시키는 단계가 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 단일 또는 조합된 방법에 의해 수행되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 4급 암모늄 (Q), 4급 아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌 이민 (PEI), 디메틸-아미노메틸 (DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸술포네이트 (S), 술포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 및 폴리아스파르트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 소수성 크로마토그래피 수지의 작용기가 페닐, 옥틸, (이소)프로필, 부틸, 및 에틸로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 친화성 크로마토그래피 수지의 작용기가 단백질 A, 헤파린, 블루, 벤즈아미딘, 금속 이온 (코발트, 니켈, 및 구리), 및 비-펩티딜 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드에 접합되어 있는 것인 단백질 복합체의 구성 성분의 일부 또는 그 전체에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 크기 배제 크로마토그래피의 수지가 슈퍼덱스, 세파크릴, 슈퍼포스, 및 세파덱스로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 단계 (b)가, 단백질 복합체를 구성하는 비-펩티딜 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단을 통해 연결되어 있는 것인 단백질 복합체를 단리시키는 것인 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은
(a') 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드에 연결하여 접합체를 제조하는 단계로서, 이는 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되는 것인 단계;
(b') 단계 (a')에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드 중 나머지 다른 하나에 연결하는 단계로서, 이는 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되는 것인 단계; 및
(c') 단계 (b')에서 제조된 공유 연결된 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역을 본질적으로 포함하는 단백질 복합체를 단리시키는 단계로서, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 것인 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
특히, 비-펩티딜 중합체와 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단이 결합하는 데 있어서 반응 속도에 중요한 조건은 pH이며, 중성 pH 아래인 pH 값, 즉, pH 7.0 미만의 pH 값에서 부위 특이적 결합이 잘 일어날 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에의 비-펩티딜 중합체의 연결은 중성 pH 아래인 pH 값에서 수행되지만, 단백질의 3차 구조 또는 활성을 변성시키지 않는 약산성 내지 산성 pH에서 적절하게 수행되나, 이에 제한되지는 않는다. 비제한적인 예로서, 본 발명에서 사용되는 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고, 약 pH 8.2의 약염기성 조건에서 N-말단 특이성을 갖는 것으로 확인되었다 (실시예 5).
즉, 일반적인 면역글로불린 Fc 영역이 사용되는 경우, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 및 비-펩티딜 중합체의 특이적 결합의 반응 속도는 중성 pH 아래인 pH에서 증가된다. 그러나, 더 낮은 pH 감수성을 갖도록 돌연변이화된 면역글로불린 Fc 영역이 사용되는 경우, 결합의 반응 속도는 상기 조건으로 한정되지 않을 수 있다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은
(a') 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드 중 어느 하나에 연결하여 접합체를 제조하는 단계로서, 여기서, 생리 활성 폴리펩티드와 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:30 범위이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20 범위이고, 환원제는 1 mM 내지 100 mM 범위로 함유되어 있고, 반응은 4.0℃ 내지 25℃인 온도하에 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위인 것인 단계;
(b') 단계 (a')에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드 중 나머지 다른 하나에 연결하는 단계로서, 여기서, 접합체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드 사이의 반응 몰비는 1:0.1 내지 1:20 범위이고, 환원제는 1 mM 내지 100 mM 범위로 함유되어 있고, 반응은 4.0℃ 내지 25℃인 온도하에 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위인 것인 단계; 및
(c') 단계 (b')에서 제조된 공유 연결된 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역을 본질적으로 포함하는 단백질 복합체를 단리시키는 단계로서, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 것인 단계를 포함하는, 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체적인 실시양태는 N-말단 선택성이 90% 이상인 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 활성 성분으로서 단백질 복합체를 포함하는, 생리 활성 폴리펩티드의 생체내 지속 시간 및 안정성을 개선시키기 위한 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시양태는 90% 이상의 양으로 단백질 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 본 조성물의 전달용 제제를 포함하는 제약 용기이다. 예시적인 제약 용기로는 주사기, 시린지, 바이알, 주입 병, 앰플 또는 카풀, 예를 들어, 니들 보호 시스템이 구비된 시린지 또는 주사 펜 내의 카풀을 포함한다. 한 실시양태에 따라, 본 발명은 내부 표면이 있는 벽 및 내부 표면이 있는 실 어셈블리(seal assembly)를 갖는 용기를 포함하는 주사기로서, 벽 및 실 어셈블리의 내부 표면이 약물 제품으로 충전된 폐쇄된 멸균 저장소를 정의하는 것인 주사기를 제공한다.
주사기는 또한 보관 상태에서 실 어셈블리를 통해 부분적으로만 배치되고, 전달 상태에서 실 어셈블리의 내부 표면을 통해 멸균 저장소로 배치되는 지점을 갖는 깨끗하고 피복되지 않은 강성 용기 니들을 포함하는 유체 전달 시스템을 포함할 수 있다. 추가로, 주사는 용기 니들을 보관 상태에서 전달 상태로 이동하도록 적합화된 액추에이터를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 용기의 벽은 강성 벽 또는 가요성 벽일 수 있고, 실 어셈블리는 실 어셈블리의 내부 표면을 정의하는 내부 표면이 있는 가요성 일체형 벽일 수 있다. 가요성 단일 벽은 개구부를 가로질러 배치되고, 용기의 벽에 고정 부착된 격벽을 정의할 수 있다. 대안적으로, 용기의 벽은 용기의 벽은 보어(bore)를 정의할 수 있고, 일체형 가요성 벽은 보어를 따라 이동가능한 스토퍼(stopper)를 정의할 수 있다. 이러한 경우에, 용기의 벽은 스토퍼의 반대편에 있는 폐쇄된 단부와 스토퍼가 배치되는 개방된 단부를 정의할 수 있다. 추가 대안으로서, 용기의 벽은 보어의 제1 단부와 유체 소통하는 개구가 있는 보어를 정의할 수 있고, 일체형 가요성 벽은 개구를 가로질러 배치되고, 용기의 벽에 고정 부착된 격벽(septum)을 정의하며, 상기 용기는 보어의 제2 단부 내에 배치되고, 보어를 따라 이동가능한 스토퍼를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 신경계 장애의 치료, 개선 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 신경계 장애를 치료, 개선 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 신경계 장애는 만성 척수 손상(chronic spinal cord injury), 파킨슨병 또는 신경 발달 장애, 예컨대, 뇌성 마비와 연관이 있을 수 있다. 본 방법은 신경계 장애 및 그의 관리와 관련하여 필요로 하는 환자에게 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 골수 이식과 관련된 치료에서 상기 기술된 본 조성물의 용도를 제공한다. 본 방법은 골수 이식 및 줄기 세포의 이동과 관련하여 필요로 하는 환자에게 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다.
정의
본원에서 사용되는 바, 용어 "단백질 복합체" 또는 "복합체"는 적어도 하나의 생리 활성 폴리펩티드, 그의 양 말단에 반응성 기를 갖는 적어도 하나의 비-펩티딜 중합체, 및 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역이 공유 결합을 통해 서로 연결되어 있는 구조체를 지칭한다. 추가로, 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역으로부터 선택되는 단 2개의 분자만이 공유 결합을 통해 서로 연결된 구조체는 "복합체"와의 구별을 위해 "접합체"로 명명한다.
본 발명의 단백질 복합체는 PEG가 공유 결합에 의해 그의 양 말단에 반응성 기를 통해 변형된 G-CSF 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결된 단백질 복합체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "생리 활성 폴리펩티드", "생리 활성 단백질", "활성 단백질", 또는 "단백질 약물"은 생체내 생리 이벤트에 대해 일종의 길항 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하고, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "비-펩티딜 중합체"는 펩티드 결합을 제외한 임의의 공유 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 반복 단위를 포함하는 생체적합성 중합체를 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 경쇄 불변 영역 1 (CL1)을 제외한, 면역글로불린 분자의 영역을 지칭한다. 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변 영역에 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 Fc 영역의 일부 또는 그 모두를 포함하는 단편일 수 있고, 본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 단편과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
천연 Fc는 중쇄 불변 영역 1의 Asn297 위치에 당 쇄를 가지고 있지만, E. 콜라이(E. coli) 유래의 재조합 Fc는 비글리코실화된 형태로 발현된다. Fc에서 당 쇄를 제거하면, 중쇄 불변 영역 1에의 Fc 감마 수용체 1, 2, 3 및 보체 (c1q)의 결합 친화도가 감소하여 항체 의존성 세포 매개 세포독성 또는 보체 의존성 세포독성이 감소되거나, 또는 손실된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린 불변 영역"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 제외한, 중쇄 불변 영역 2 (CH2) 및 중쇄 불변 영역 3 (CH3) (또는 중쇄 불변 영역 4 (CH4) 함유), 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 Fc 단편을 지칭할 수 있고, 이는 중쇄 불변 영역에 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 면역글로불린 불변 영역은, 천연 단백질과 실질적으로 유사하거나, 또는 그보다 우수한 생리 기능을 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 제외한, 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및/또는 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 Fc 영역의 일부 또는 그 모두를 포함하는 연장된 면역글로불린 불변 영역일 수 있다.
한편, 면역글로불린 불변 영역은 인간 또는 동물, 예컨대, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 래트, 기니아 피그 등으로부터 기원할 수 있으며, 바람직하게는 인간 기원의 것일 수 있다. 추가로, 면역글로불린 불변 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 그의 조합 또는 하이브리드로부터 유래된, 바람직하게, IgG 또는 IgM (인간 혈액 중 가장 풍부하게 존재)으로부터 유래된, 및 가장 바람직하게, IgG (리간드 결합 단백질의 반감기를 개선시키는 것으로 공지)로부터 유래된 불변 영역으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 기원이 동일한 도메인으로 이루어진 단일 쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "조합"이란, 기원이 동일한 단일 쇄 면역글로불린 불변 영역 (바람직하게, Fc 영역)을 코딩하는 폴리펩티드가 기원이 상이한 단일 쇄 폴리펩티드에 연결되어 이량체 또는 다량체를 형성한다는 것을 의미한다. 즉, 이량체 또는 다량체는 IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, 및 IgE Fc의 Fc 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 단편으로부터 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "하이브리드"란, 기원이 상이한 2개 이상의 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 서열이 면역글로불린 불변 영역 (바람직하게, Fc 영역)의 단일 쇄로 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명에서, 다양한 하이브리드 형태가 가능하다. 예를 들어, 하이브리드 도메인은 IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc, 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3, 및 CH4로 구성된 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 도메인으로 구성될 수 있고, 추가로 힌지 영역을 포함할 수 있다.
IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위부류로 나눌 수 있으며, 본 발명은 그의 조합 또는 하이브리드를 포함할 수 있다. 바람직한 것은 IgG2 및 IgG4 하위부류이고, 가장 바람직한 것은 예컨대, 보체 의존성 세포독성 (CDC)과 같은 이펙터(effector) 기능이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
면역글로불린 불변 영역은 천연 형태와 동일한 정도로, 또는 그보다 더 크거나 더 적은 정도로 글리코실화된 형태를 가질 수 있거나, 또는 탈글리코실화된 형태일 수 있다. 면역글로불린 불변 영역의 글리코실화 또는 탈글리코실화의 증가 또는 감소는 전형적인 방법, 예를 들어, 화학적 방법, 효소적 방법 또는 미생물을 이용한 유전 공학 방법에 의해 달성될 수 있다. 여기서, 탈글리코실화되면, 면역글로불린 불변 영역에의 보체 (C1q) 결합은 유의적으로 감소되고, 항체 의존성 세포독성 또는 보체 의존성 세포독성은 감소 또는 제거되어 생체내에서 불필요한 면역 반응을 유도하지 않는다. 이러한 맥락에서, 탈글리코실화된 또는 비글리코실화된 면역글로불린 불변 영역은 약물 담체의 목적과 더욱 일치한다. 따라서, 면역글로불린 Fc 영역은 더욱 구체적으로 인간 IgG4 유래의 비글리코실화된 Fc 영역, 즉, 인간 IgG4 유래의 비글리코실화된 Fc 영역일 수 있다. 인간 유래의 Fc 영역은, 인체내에서 항원으로 작용하여 항원에 대한 새로운 항체 생성과 같은 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비인간 유래 Fc 영역보다 더욱 바람직하다.
추가로, 본 발명의 면역글로불린 불변 영역은 천연 아미노산 서열 뿐만 아니라, 그의 서열 유도체 (돌연변이체)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 보존적 또는 비보존적 치환, 또는 그의 조합의 결과로서, 야생형 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 결합에 중요한 것으로 알려진 IgG Fc의 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322, 327 내지 331 위치의 아미노산 잔기가 변형에 적합한 부위로 사용될 수 있다. 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위를 제거하거나, 천연 Fc로부터 여러 N-말단 아미노산을 제거하거나, 천연 Fc의 N-말단에 메티오닌을 부가하여 제조된 것과 같은 다양한 유도체가 사용될 수 있다. 추가로, C1q 고정 부위 또는 ADCC 부위와 같은 보체 고정 부위를 제거하여 이펙터 기능을 제거할 수 있다. 면역글로불린 불변 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제 특허 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 96/32478에 개시되어 있다.
분자의 활성을 변경하지 않는 단백질 또는 펩티드 분자의 아미노산 치환은 당업계에 널리 알려져 있다 (문헌 [H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979]). 가장 일반적인 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Nal, Ala/Glu, 및 Asp/Gly 사이에서 양 방향으로 이루어질 수 있다. 임의적으로, 아미노산은 인산화, 황산화, 아크릴화, 글리코실화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화, 아미드화 등에 의해 변형될 수 있다.
상기 기술된 면역글로불린 불변 영역 유도체는 본 발명의 면역글로불린 불변 영역의 것과 등가인 생물학적 활성을 갖지만, 열, pH 등에 대한 면역글로불린 불변 영역의 구조적 안정성이 증가된 유도체일 수 있다. 추가로, 면역글로불린 불변 영역은 인간, 또는 동물, 예컨대, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 래트, 기니아 피그 등으로부터 단리된 천연 형태로부터 수득될 수 있거나, 또는 형질전환된 동물 세포 또는 미생물로부터 수득된 그의 재조합제 또는 유도체일 수 있다. 여기서, 이들은 인간 또는 동물 유기체로부터 전체 면역글로불린을 단리시키고, 단백질 분해 효소로 처리하여 천연 면역글로불린으로부터 수득될 수 있다. 파파인은 천연 면역글로불린을 Fab 및 Fc 영역으로 분해하고, 펩신 처리는 pF'c 및 F (ab)2 단편을 생성한다. 이들 단편에 대해 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피를 수행함으로써 Fc 또는 pF'c를 단리시킬 수 있다.
바람직하게는, 인간 유래의 면역글로불린 불변 영역은 미생물로부터 수득된 재조합 면역글로불린 불변 영역일 수 있다.
본 발명의 단백질 복합체는 모든 성분이 공유 결합에 의해 선형 형태로 연결될 수 있는, [생리 활성 폴리펩티드/비-펩티딜 중합체/면역글로불린 Fc 영역]으로 이루어진 단위 구조체를 하나 이상 포함할 수 있다. 비-펩티딜 중합체는 그의 양 말단에 반응성 기를 가질 수 있으며, 공유 결합에 의해 반응성기를 통해 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결되어 있다. 즉, 생리 활성 폴리펩티드 및 비-펩티딜 중합체의 적어도 하나의 접합체는 공유 결합에 의해 하나의 면역글로불린 Fc 영역에 연결되어, 면역글로불린 Fc 영역에 의해 매개되는 생리 활성 폴리펩티드의 단량체, 이량체 또는 다량체를 형성한다. 따라서, 생체내 활성 및 안정성 증가가 더욱 효과적으로 달성될 수 있다.
비-펩티딜 중합체의 양 말단에 있는 반응성 기는 바람직하게, 반응성 알데히드 기, 프로피온알데히드 기, 부티르알데히드 기, 말레이미드 기, 및 숙신이미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 숙신이미드 유도체는 히드록시 숙신이미딜, 숙신이미딜 카르복시메틸, 숙신이미딜 발레레이트, 숙신이미딜 메틸 부타노에이트, 숙신이미딜 메틸 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, N-히드록시숙신이미드, 또는 숙신이미딜 카르보네이트일 수 있다. 특히, 비-펩티딜 중합체가 양 말단에 반응성 알데히드 기를 가질 경우, 최소한의 비 특이적 반응으로 양 말단 모두 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린과 연결하는 데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화에 의해 생성된 최종 생성물은 아미드 결합에 의해 연결될 때보다 훨씬 더 안정적이다.
본 발명의 비-펩티딜 중합체의 양 말단에 있는 반응성 기는 서로 동일하거나, 상이할 수 있다. 비-펩티드 중합체는 양 말단에 알데히드 반응기를 가질 수 있거나, 또는 한쪽 말단에 알데히드 기 및 나머지 다른 한쪽 말단에 말레이미드 반응성 기, 또는 한쪽 말단에 알데히드 기 및 나머지 다른 한쪽 말단에 숙신이미드 반응성 기를 가질 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 비-펩티드 중합체는 한쪽 말단에 말레이미드 기를 갖고, 나머지 다른 한쪽 말단에 알데히드 기, 프로피온알데히드 기, 또는 부티르알데히드 기를 가질 수 있다. 또한, 비-펩티드 중합체는 한쪽 말단에 숙신이미딜 기 및 나머지 다른 한쪽 말단에 프로피온알데히드 기, 또는 부티르알데히드 기를 가질 수 있다. 양 말단에 반응성 히드록시 기를 갖는 폴리에틸렌글리콜이 비-펩티딜 중합체로서 사용되는 경우, 히드록시 기는 공지된 화학 반응에 의해 다양한 반응성 기로 활성화될 수 있거나, 또는 변형된 반응성 기를 갖는, 상업적으로 이용가능한 폴리에틸렌글리콜이 본 발명의 단백질 복합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비-펩티딜 중합체를 통해 연결될 때, 비-펩티딜 중합체의 양 말단은 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 및 생리 활성 폴리펩티드의 N-말단 (아미노 말단), C-말단 (카르복시 말단), 또는 리신 잔기, 히스티딘 잔기, 또는 시스테인 잔기의 유리 반응성 기에 결합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "N-말단"은 본 발명의 목적을 위해 비-펩티딜 중합체를 포함하는 링커(linker)가 접합될 수 있는 부위인 펩티드의 N-말단을 지칭한다. N-말단의 예는 N-말단의 원위 단부에 있는 아미노산 잔기 뿐만 아니라, N-말단에 가까운 아미노산 잔기도 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 원위 단부로부터 1번째 내지 20번째 아미노산 잔기가 포함될 수 있다.
본 발명의 비-펩티딜 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 예컨대, PLA (폴리락트산) 및 PLGA (폴리락트산-글리콜산), 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 구체적으로, 폴리에틸렌 글리콜일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 당업계에 널리 알려져 있고, 당업계의 기술 범위에서 용이하게 제조될 수 있는 그의 유도체는 본 발명의 비-펩티딜 중합체에 포함된다. 비-펩티딜 중합체의 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa, 구체적으로 1 kDa 내지 20 kDa 범위일 수 있다.
본 발명의 생리 활성 폴리펩티드는 다양한 생리 활성 폴리펩티드, 예컨대, 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포 표면 항원, 수용체 길항제 및 그의 유도체 또는 유사체로 예시될 수 있다.
구체적으로, 생리 활성 폴리펩티드는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 성장 호르몬-방출 펩티드, 인터페론 및 인터페론 수용체 (예컨대, 인터페론-알파, -베타, 및 -감마, 가용성 타입 I 인터페론 수용체), 콜로니-자극 인자, 인터루킨 (예컨대, 인터루킨-1, -2, -3, -4, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19,. -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28., -29. -30 등), 및 인터루킨 수용체 (예컨대, IL-1 수용체. IL-4 수용체 등), 효소 (예컨대, 글루코세레브로시다제, 이두로네이트-2-술파제, 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파,베타, 알파-L-이두로니다제, 부티릴콜리네스테라제, 키티나제, 글루타메이트 데카르복실라제, 이미글루세라제, 리파제, 우리카제, 혈소판-활성화 인자 아세틸히드롤라제, 중성 엔도펩티다제, 미엘로퍼옥시다제 등), 인터루킨- 및 사이토카인 결합 단백질 (예컨대, IL-18bp, TNF 결합 단백질 등), 대식세포-활성화 인자, 대식세포 펩티드, B 세포 인자, T 세포 인자, 단백질 A, 알레르기 억제제, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림프독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제제, 전환 성장 인자, 알파-1 항트립신, 알부민, 알파-락트알부민, 아포지단백-E, 에리트로포이에틴, 글리코실화된 에리트로포이에틴, 안지오포이에틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성화 펩티드, 트롬보모듈린, 혈액 인자 VII, VIIa, VIII, IX, 및 XIII, 플라스미노겐 활성인자, 피브린 결합 펩티드, 우로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C 반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자, 표피 성장 인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 성장 인자, 골 자극 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 글루카곤 유도체, 글루카곤 유사 펩티드, 엑센딘 (엑센딘4), 아트리오펩틴, 연골 유도 인자, 엘카토닌, 결합 조직 활성화 인자, 조직 인자 경로 억제제, 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장 인자 (예컨대, 신경 성장 인자, 섬모 신경 영양 인자, 축색 생성 인자-1, 뇌 나트륨 이뇨 펩티드, 신경교 유래 신경 영양 인자, 네트린, 호중구 억제 인자, 신경 영양 인자, 뉴투린 등), 부갑상선호르몬, 릴랙신, 세크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장 인자, 부신 피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코르티코트로핀 방출 인자, 갑상선 자극 호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체 (예컨대, TNFR (P75), TNFR (P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포-활성화 인자 수용체 등), 수용체 길항제 (예컨대, IL1-Ra 등), 세포 표면 항원 (예컨대, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예컨대, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fd), 및 바이러스 유래 백신 항원을 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 생리 활성 폴리펩티드는 과립구 콜로니-자극 인자, 에리트로포이에틴, 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 G-CSF이다.
본 발명에서, 항체 단편은 특정 항원에 결합하는 능력을 갖는 Fab, Fab', F(ab'), Fd, 또는 scFv일 수 있으며, 바람직하게, Fab'일 수 있다. Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 CH1 도메인의 카르복실 말단에 있는 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 여러 아미노산 잔기의 부가 측면에서 Fab 단편과 상이하다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인만으로 구성된 단편이고, F(ab')2 단편은 이황화 결합 또는 화학 반응에 의해 Fab' 단편의 두 분자가 결합하여 생성된다. scFv 단편은 VL 및 VH 도메인만이 펩티드 링커에 의해 서로 연결된 단일 폴리펩티드 쇄이다.
추가로, 본 발명의 단백질 복합체는 동물 성장 호르몬, 예컨대, 소 성장 호르몬 또는 돼지 성장 호르몬의 장기 지속형 단백질 제제 및 예컨대, 인터페론과 같이, 동물 질환의 치료 또는 예방을 위한 장기 지속형 단백질 제제의 개발에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 (a) 양 말단에 반응성 기를 갖는 적어도 하나의 비-펩티딜 중합체, 적어도 하나의 생리 활성 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 면역글로불린 Fc 영역을 공유 결합에 의해 연결시켜 단백질 복합체를 제조하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 제조된 공유 연결된 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역을 본질적으로 포함하는 단백질 복합체를 단리시키는 단계로서, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 것인 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 이량체의 형태일 수 있거나, 또는 동종이량체 또는 이종이량체의 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 복합체를 구성하는 면역글로불린 Fc 영역은 N 말단을 1개 또는 2개 이상 포함할 수 있다. 따라서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단을 통해 적어도 하나의 비-펩티딜 중합체에 연결될 수 있다. 특히, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 동종이량체 형태일 수 있으며, 이에 따라, 면역글로불린 Fc 영역의 동종이량체에 포함된 2개의 N-말단을 통해 1 또는 2개의 비-펩티딜 중합체에 연결된다. 이와 관련하여, 비-펩티딜 중합체는 각각 생리 활성 폴리펩티드에 결합하여 단백질 복합체를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 단백질 복합체는 1 또는 2개 이상의 비-펩티딜 중합체, 1 또는 2개 이상의 생리 활성 폴리펩티드, 및 1 또는 2개 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 공유 결합에 의해 연결함으로써 제조될 수 있다.
단계 (a)에서, 3가지 성분 사이의 공유 결합은 순차적으로 또는 동시에 발생할 수 있다. 예를 들어, 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비-펩티딜 중합체의 양 말단에 각각 연결될 때, 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역 중 어느 하나가 먼저 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단에 연결될 수 있고, 나머지 다른 하나는 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단에 연결될 수 있다. 본 방법은 원하는 단백질 복합체 이외의 다른 부산물의 생산이 최소화되고, 단백질 복합체가 고순도로 제조된다는 점에서 이롭다.
그러므로, 단계 (a)는
(i) 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 특정 부위를 공유 결합을 통해 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단에 연결시키는 단계;
(ii) 접합체를 반응 혼합물로부터 균질하게 단리시키는 단계로서, 여기서, 접합체는 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 특정 부위를 비-펩티딜 중합체에 연결시킴으로써 제조되는 것인 단계; 및
(iii) 생리 활성 폴리펩티드 또는 면역글로불린 Fc 영역의 특정 부위를 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단에 연결시켜 단백질 복합체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서, 단계 (a)는 (a1) 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드의 어느 하나에 연결하여 접합체를 제조하는 단계; 및 (a2) 단계 (a1)에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역 중 나머지 다른 하나에 연결하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 단계 (a)는 (a1') 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역에 연결하여 접합체를 제조하는 단계; 및 (a2') 단계 (a1')에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 생리 활성 폴리펩티드에 연결하는 단계를 포함할 수 있다.
대안적으로, 단계 (a)는 (a1") 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 생리 활성 폴리펩티드에 연결하여 접합체를 제조하는 단계; 및 (a2") 단계 (a1")에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역에 연결하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 단계 (a1), (a1'), 또는 (a1")에서, 생리 활성 폴리펩티드와 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:30 범위일 수 있고, 면역글로불린 Fc 영역과 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20 범위일 수 있다.
구체적으로, 단계 (a1')에서, 면역글로불린 Fc 영역과 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20 범위, 및 특히, 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10, 또는 1:1 내지 1:4 범위일 수 있다. 단계 (a1")에서, 생리 활성 폴리펩티드와 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:30 범위, 및 특히, 1:1 내지 1:15 또는 1:1 내지 1:10 범위일 수 있다. 제조 수율 및 비용은 반응 몰비에 따라 최적화될 수 있다.
본 발명에서, 단계 (a1), (a1'), 또는 (a1")은 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행될 수 있고; 단계 (a1), (a1'), 또는 (a1")은 4.0℃ 내지 25℃인 온도에서 수행될 수 있고; 단계 (a1), (a1'), 또는 (a1")에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL일 수 있다.
본 발명의 단계 (a2), (a2'), 또는 (a2")에서, 접합체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드 사이의 반응 몰비는 1:0.1 내지 1:20 범위, 및 특히, 1:0.2 내지 1:10 범위일 수 있다. 구체적으로, 단계 (a2')에서, 접합체와 생리 활성 폴리펩티드 사이의 반응 몰비는 1:0.1 내지 1:20 범위일 수 있고, 단계 (a2")에서, 접합체와 면역글로불린 Fc 영역 사이의 반응 몰비는 1:0.1 내지 1:20 범위일 수 있다. 제조 수율 및 비용은 반응 몰비에 따라 최적화될 수 있다.
본 발명에서, 단계 (a2), (a2'), 또는 (a2")는 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행될 수 있고; 단계 (a2), (a2'), 또는 (a2")는 4.0℃ 내지 25℃인 온도에서 수행될 수 있고; 단계 (a2), (a2'), 또는 (a2")에서, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL일 수 있다.
한편, 본 발명의 제조 방법은 (a') 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드의 어느 하나에 연결하여 접합체를 제조하는 단계로서, 여기서, 생리 활성 폴리펩티드와 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:30 범위이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비-펩티딜 중합체 사이의 반응 몰비는 1:1 내지 1:20 범위이고, 환원제는 1 mM 내지 100 mM 범위로 함유되어 있고, 반응은 4.0℃ 내지 25℃인 온도하에 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위인 것인 단계;
(b') 단계 (a')에서 제조된 접합체를 단리시키고, 단리된 접합체의 비-펩티딜 중합체의 나머지 다른 한쪽 말단을 공유 결합에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드 중 나머지 다른 하나에 연결하는 단계로서, 여기서, 접합체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드 사이의 반응 몰비는 1:0.1 내지 1:20 범위이고, 환원제는 1 mM 내지 100 mM 범위로 함유되어 있고, 반응은 4.0℃ 내지 25℃인 온도하에 pH 4.0 내지 9.0인 조건에서 수행되고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 반응 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위인 것인 단계; 및
(c') 단계 (b')에서 제조된 공유 연결된 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역을 본질적으로 포함하는 단백질 복합체를 단리시키는 단계로서, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결되지만, 이에 제한되지 않는 것인 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법일 수 있다.
본 발명의 단계 (a1), 단계 (a1'), 단계 (a1"), 단계 (a2), 단계 (a2'), 및 단계 (a2")에서 반응은 필요할 경우, 반응에 참여하는 비-펩티딜 중합체의 양 말단의 반응성 기의 유형을 고려하여, 환원제의 존재하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 환원제는 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3), 소듐 보로하이드라이드, 디메틸아민 보레이트, 또는 피리딘 보레이트일 수 있다. 이와 관련하여, 환원제 (예컨대, 소듐 시아노보로하이드라이드)의 농도, 반응액의 온도 및 pH, 반응에 참여하는 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역의 총 농도는 생산 수율 및 순도 면에서 중요하다. 고순도 균질 복합체의 생산을 극대화하기 위해, 조건의 다양한 조합이 요구된다. 제조하고자 하는 생리 활성 폴리펩티드의 특성에 따라, 다양한 조건이 가능하고, 제한하는 것은 아니지만, 환원제 (예컨대, 소듐 시아노보로하이드라이드)는 1 mM 내지 100 mM 범위로 함유될 수 있고, 반응액은 0℃ 내지 25℃인 온도에서 및 pH 4.0 내지 9.0인 조건하에 있을 수 있고, 반응 단백질의 농도 (반응시 포함된 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드의 농도)는 5 mg/mL 내지 100 mg/mL 범위일 수 있다.
한편, 단계 (a2), 단계 (a2'), 및 단계 (a2")에서 접합체의 분리는 필요할 경우, 예컨대, 분리된 접합체에 필요한 순도, 소수성, 분자량 및 전하와 같은 특성을 고려하여, 단백질 분리에서 사용되는 일반 방법으로부터 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 분리는 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 비롯한, 공지된 다양한 방법을 적용함으로써 수행될 수 있고, 필요할 경우, 더 높은 순도로 접합체를 정제하기 위해 복수의 상이한 방법이 조합하여 사용된다.
제조하고자 하는 생리 활성 폴리펩티드의 특성에 따라, 다양한 조건이 가능하다. 그러나, 비-펩티딜 중합체에 연결된 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리 활성 폴리펩티드 접합체를 분리하기 위해, 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피가 수행된다. 원하는 위치 이외의 다른 위치에서 비-펩티딜 중합체의 결합에 의해 생성된 이성질체 또는 제조 중에 생성된 소량의 변성된 형태의 추가의 규모 확장 및 분리를 위해, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피 또한 사용될 수 있다.
본 발명에서, 단계 (b)는 필요할 경우, 고순도 복합체를 최종적으로 정제하기 위해, 예컨대, 소수성, 분자량 및 전하와 같은 특성을 고려하여, 단백질 분리에서 사용되는 일반 방법으로부터 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 분리는 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 비롯한, 공지된 다양한 방법을 적용함으로써 수행될 수 있고, 필요할 경우, 더 높은 순도로 복합체를 정제하기 위해 복수의 상이한 방법이 조합하여 사용된다. 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 Fc 불변 영역으로 구성된 원하는 복합체의 특성에 따라, 다양한 분리 조건이 가능하다. 그러나, 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역이 각각 비-펩티딜 중합체의 양 말단에 연결된 복합체를 분리하기 위해, 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피가 수행된다. 원하는 위치 이외의 다른 위치에서의 생리 활성 폴리펩티드 또는 면역글로불린 Fc 영역, 및 비-펩티딜 중합체의 결합에 의해 생성된 이성질체 또는 부반응 생성물, 또는 제조 중에 생성된 소량의 변성된 형태의 추가의 규모 확장 및 효과적인 분리를 위해, 미반응 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역, 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피 또한 조합하여 사용될 수 있다. 특히, 소수성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피가 조합하여 사용될 수 있고, 복수의 소수성 크로마토그래피 또는 복수의 음이온 교환 크로마토그래피 또한 가능하다. 제조하고자 하는 복합체에 따라, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피는 단독으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 특정 pH에서 하전된 단백질을 하전된 이온 수지 고정 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시키고, 단백질을 단백질의 이동 속도의 차이에 의해 분리함으로써 단백질을 분리하는 것으로서, 이는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피는 양이온 수지를 사용하는 것이고, 상응하는 음이온 교환 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 4급 암모늄 (Q), 4급 아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌 이민 (PEI), 디메틸-아미노메틸 (DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
추가로, 양이온 교환 크로마토그래피는 음이온 수지를 사용하는 것이고, 상응하는 양이온 교환 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 메틸술포네이트 (S), 술포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 및 폴리아스파르트산으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 소수성 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 페닐, 옥틸, (이소)프로필, 부틸, 및 에틸로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 크기 배제 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 슈퍼덱스, 세파크릴, 슈퍼포스, 및 세파덱스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
추가로, 본 발명에서 친화성 크로마토그래피는 그 위에 리간드가 고정화되어 있는 수지 중 단백질과 상호작용할 수 있는 리간드와 단백질 사이의 상호작용에 의해 일어나는 단백질의 이동 속도의 차이에 의해 단백질을 분리하는 것이다. 친화성 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 단백질 A, 헤파린, 블루, 벤즈아미딘, 금속 이온 (코발트, 니켈, 및 구리), 및 비-펩티딜 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 폴리펩티드에 접합되어 있는 것인 단백질 복합체의 구성 성분의 일부 또는 그 전체에 대한 항체로부터 선택되는 어느 하나일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 (b) 단계는 비-펩티딜 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단을 통해 서로 연결된 단백질 복합체를 단리시키는 것이다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 N-말단 선택성이 90% 이상인 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 복합체는 비-펩티딜 중합체의 한쪽 말단이 90% 이상, 더욱 구체적으로, 95% 이상, 더욱더 구체적으로, 98% 이상, 및 추가로 더욱더 구체적으로, 99% 이상의 N-말단 선택성으로 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결될 수 있는 것인 단백질 복합체일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "90% 이상의 N-말단 선택성으로 연결하는"이란, 본 발명에 따른 일련의 반응에 의해 수득된 단백질 복합체 분획을 정제하여 제조된 단백질 복합체 중 90% 이상에서 비-펩티딜 중합체가 위치 특이적 방식으로 Fc 영역의 N-말단에 연결되는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "90% 이상"은 v/v, w/w 및 피크/피크 단위를 지칭할 수 있지만, 특정 단위에 제한되지 않는다. 위치 특이적 방식으로 Fc 영역의 N-말단에 연결된 비-펩티딜 중합체를 포함하는 단백질 복합체의 수율은 반응 조건, 비-펩티딜 중합체의 반응기 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명이 실시예에서, N-말단 선택성이 90% 이상인 단백질 복합체는 다양한 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 Fc 복합체의 제조를 통해 본 발명에 따른 방법에 의해 제조될 수 있다는 것이 확인되었다.
제약 조성물은 생리 활성 폴리펩티드-비-펩티딜 중합체-면역글로불린 Fc 영역의 N-말단을 포함하는 단백질 복합체를 90% 이상, 더욱 구체적으로, 95% 이상, 더욱더 구체적으로, 98% 이상, 및 추가로 더욱더 구체적으로, 99% 이상의 양으로 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "90% 이상"은 v/v, w/w 및 피크/피크 단위를 지칭할 수 있지만, 특정 단위에 제한되지 않는다.
제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥내, 근육내를 비롯한 다양한 경로를 통해, 바람직하게, 주사용 제제 형태로 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물은 포유동물에게로의 그의 투여 후 활성 성분의 신속, 장기 지속 또는 지연 방출을 제공하기 위해 당업계에 공지된 방법에 의해 제제화될 수 있다. 제제는 정제, 환제, 산제, 사쉐, 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사액 또는 멸균 산제일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만닛톨, 크실리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 광유를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 충전제, 항응고제, 활택제, 습윤화제, 향미제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 복합체의 실제 투여 용량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 투여 경로, 환자 연령, 성별, 체중, 질환의 중증도를 포함하는 여러 관련 인자에 의해서 뿐만 아니라, 활성 성분으로서 생리학적 활성 폴리펩티드의 유형에 의해서도 결정될 수 있다. 본 발명의 단백질 복합체는 우수한 혈액 지속 시간 및 생체내 효력를 가지므로, 본 발명의 단백질 복합체를 포함하는 펩티드 약물의 투여 용량 및 빈도를 현저히 감소시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 또 다른 측면은 상기 방법에 따라 제조된 단백질 복합체를 90% 이상의 양으로 포함하는 단백질 복합체 집단을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "복합체 집단," 및 "집단"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 비-펩티딜 중합체가 Fc 영역의 N-말단에 연결되어 있는 단백질 복합체, 및/또는 비-펩티딜 중합체가 Fc 영역의 N-말단 이외의 다른 영역에 연결된 단백질 복합체를 포함하는 단백질 복합체 군을 지칭한다.
집단은 비-펩티딜 중합체가 Fc 영역의 N-말단에 연결된 단백질 복합체, 또는 비-펩티딜 중합체가 Fc 영역의 N-말단 이외의 다른 영역에 연결된 단백질 복합체만을 포함할 수 있다. 집단에 포함된, 비-펩티딜 중합체가 Fc 영역의 N-말단 이외의 다른 영역에 연결된 단백질 복합체의 비율(%)은 90% 이상, 더욱 구체적으로, 95% 이상, 더욱더 구체적으로, 98% 이상, 및 추가로 더욱더 구체적으로, 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "90% 이상"은 v/v, w/w 및 피크/피크 단위를 지칭할 수 있지만, 특정 단위에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 집단은 그의 제조된 단백질 복합체로부터 불순물, 미반응 물질 등을 제거함으로써 비-펩티딜 중합체가 Fc 영역의 N-말단 이외의 다른 영역에 연결된 단백질 복합체의 비율(%)이 증가된 집단을 지칭할 수 있다. 추가로, 상기 집단은 N-말단 선택성이 90% 이상인 단백질 복합체를 제조하는 방법에 의해 제조된 것을 지칭할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 집단은 본 발명의 방법에 의해 효율적으로 정제될 수 있다.
본 발명은 특히 환자에게 치료 유효량의, 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체를 투여함으로써 수행되고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되어 있고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함하는 것인, 그의 백혈구 세포 생산 증가를 필요로 하거나, 또는 줄기 세포 생산 증가를 필요로 하는 환자를 예방, 완화 또는 치료하는 데에서 상기 기술된 단백질 복합체의 용도에 관한 것이다. 상기 방법은 도세탁셀, 독소루비신, 사이클로포스파미드 (TAC); 후속하여 매주 또는 주 2회의 파클리탁셀의 존재 또는 부재하의 고용량 독소루비신 + 사이클로포스파미드 (AC); 및 도세탁셀 + 사이클로포스파미드 (TC)를 비롯한 화학요법제 또는 양생법과 함께 조합될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 기술된 방법은 상기 양생법을 받고 있는 환자에게 우수한 임상 및 부작용 결과를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 에플라페그라스팀은 13.2 mg/0.6 mL (3.6 mg G-CSF 함유) 고정 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, TC는 각 사이클 1일째 정맥내로 (IV) 투여된다. 따라서, 도세탁셀은 75 mg/㎡ IV 주입으로 투여되고, (ii) 사이클로포스파미드는 600 mg/㎡ IV 주입으로 투여된다. 각 치료 사이클은 최대로는 최대 4 사이클의 화학요법을 포함하여 21일이다. 임의 사이클의 1일째 (이전 사이클의 22일째)에 전체 용량 화학요법을 시작하기 위해서는, 환자는 ANC ≥ 1.5x109/L 및 혈소판수 ≥ 100x109/L를 보여야 한다. 다른 실시양태에서, 에플라페그라스팀은 TC 화학요법 후 대략 24시간 (±2시간)인 각 사이클의 2일째에 투여될 수 있다.
본원에 제공된 실시예는 단지 예시 목적인 것이며, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 인터페론 알파 ( IFNa )-PEG-면역글로불린 Fc의 N-말단 영역으로 이루어진 복합체 제조
1-1. IFNa -PEG 접합체 제조
분자량이 3.4 kDa이고, 그의 양 말단에 알데히드 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 ALD-PEG-ALD (IDB, 한국)를 100 mM 포스페이트 완충제에 용해된 5 mg/mL의 인간 인터페론 알파-2b (hIFNa-2b, 분자량: 19 kDa)에 1:5 내지 1:10의 hIFNa:PEG 몰비로 첨가하였다. 여기에 환원제인 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN, 시그마(Sigma))를 최종 농도 20 mM으로 첨가하고, 약 1시간 동안 천천히 교반하면서, 4℃ 내지 8℃에서 반응시켰다. PEG는 인터페론 알파의 아미노 말단에 선택적으로 연결되고, PEG 및 인터페론 알파는 서로 1:1 비율로 연결된 접합체를 수득하기 위해, 반응 혼합물에 대해 SP HP (GE 헬쓰케어(GE healthcare: 미국)) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 IFNa-PEG 접합체를 고순도로 정제하였다.
1-2. IFNa -PEG- Fc 복합체 제조
실시예 1-1에서 정제된 IFNa-PEG 접합체를 면역글로불린 Fc의 N-말단 프롤린 잔기에 연결하기 위해, 면역글로불린 Fc 단편을 첨가하고, 1:1 내지 1:4의 IFNa-PEG 접합체: 면역글로불린 Fc의 몰비로 반응시켰다. 반응액을 100 mM 포스페이트 완충제 (pH 5.5 내지 6.5)로서 제조하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN, 시그마)를 최종 농도 20 mM 내지 50 mM로 환원제로서 첨가하였다. 천천히 교반하면서, 4℃ 내지 8℃에서 약 12시간 내지 16시간 동안 반응시켰다.
1-3. IFNa -PEG- Fc 복합체의 단리 및 정제
실시예 1-2의 결합 반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 그렇게 제조된 IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하기 위해, 반응 혼합물을 10 mM 트리스 (pH 7.5)로 완충 용액 교환한 후, 소스 Q(Source Q) (GE 헬쓰케어: 미국) 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시켜 미반응 Fc를 제거하고, IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체 분획을 수득하였다. 상세하게, 반응액을 10 mM 트리스 (pH 7.5)로 평형화된 소스 Q 칼럼에 적용하고, 칼럼을 50 mM 염화나트륨 (NaCl)을 함유하는 20 mM 트리스 (pH 7.5) 완충 용액으로 등용매 세척하여 불순물을 제거하였다. 이어서, 150 mM 염화나트륨 (NaCl)을 함유하는 완충 용액의 농도 구배로 IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체를 용출시켰다. 소량의 미반응 Fc 및 인터페론 알파 이량체가 수득된 IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체 분획 중 불순물로서 존재하였다. 불순물을 제거하기 위해, 소스 이소(Source iso) (GE 헬쓰케어: 미국) 소수성 크로마토그래피를 추가로 수행하였다. 상세하게, 소스 이소 (GE 헬쓰케어: 미국)를, 약 1.3 M 황산암모늄을 함유하는 20 mM 인산칼륨 (pH 6.0) 완충 용액으로 평형화시킨 후, 이어서, 여기에 정제된 IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체 분획을 적용하였다. 마지막으로, 20 mM 인산칼륨 (pH 6.0) 완충 용액의 선형 농도 구배를 사용하여 고순도 IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하였다. 제조된 IFNa-PEG-Fc 단백질 복합체의 Fc 영역의 N-말단 선택성을 펩티드 맵핑으로 조사하였고, 선택성은 90% 이상인 것으로 나타났다.
실시예 2: 인간 과립구 콜로니 자극 인자 (G- CSF )-PEG- Fc 복합체 제조
천연 G-CSF의 위치 17 및 65의 아미노산을 세린으로 치환하여 제조된 유도체 (17,65-G-CSF)를 사용하여 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 제조한 후, 이어서, 정제하였다.
2-1. 17, 65S G - CSF -PEG 접합체 제조
분자량이 3.4 kDa이고, 그의 양 말단에 알데히드 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 ALD-PEG-ALD (IDB, 한국)를 100 mM 포스페이트 완충제에 용해된 5 mg/mL의 17,65S-G-CSF (분자량: 18 kDa)에 1:5 내지 1:10의 G-CSF:PEG 몰비로 첨가하였다. 여기에 환원제인 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN, 시그마)를 최종 농도 20 mM으로 첨가하고, 약 1시간 동안 천천히 교반하면서, 4℃ 내지 8℃에서 반응시켰다. PEG는 인간 과립구 콜로니 자극 인자의 아미노 말단에 선택적으로 연결되고, PEG 및 G-CSF는 서로 1:1 비율로 연결된 접합체를 수득하기 위해, 반응 혼합물에 대해 SP HP (GE 헬쓰케어: 미국) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 17,65SG-CSF-PEG 접합체를 고순도로 정제하였다.
2-2. 17,65 G- CSF -PEG- Fc 복합체 제조
실시예 3-1에서 정제된 17,65G-CSF-PEG 접합체를 면역글로불린 Fc의 N-말단에 연결하기 위해, 면역글로불린 Fc 단편을 첨가하고, 1:1 내지 1:4의 17,65Ser-G-CSF-PEG 접합체:면역글로불린 Fc의 몰비로 반응시켰다. 반응액을 100 mM 포스페이트 완충제 (pH 5.5 내지 6.5)로서 제조하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, 시그마)를 최종 농도 20 mM로 환원제로서 첨가하였다. 천천히 교반하면서, 4℃ 내지 8℃에서 반응시켰다.
2-3. 17, 65 Ser -G- CSF -PEG- Fc (또는 17, 65S G - CSF -PEG- Fc ) 복합체의 단리 및 정제
실시예 3-2의 결합 반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 그렇게 제조된 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하기 위해, 반응 혼합물을 2 M NaCl을 함유하는 10 mM 트리스 (pH 8.0)로 완충제 교환한 후, 소스 페닐(Source Phenyl) 칼럼을 통해 통과시켰다. 불순물을 제거하기 위해, 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 20 mM 트리스 (pH 8.0) 완충 용액의 농도 구배로 정제하였다. 소량의 미반응 면역글로불린 Fc 및 17,65G-CSF 이량체가 불순물로서 수득된 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체 분획 중에 존재하였다. 불순물을 제거하기 위해, Q HP (GE 헬쓰케어: 미국) 음이온 크로마토그래피를 추가로 수행하였다. Q HP (GE 헬쓰케어: 미국)를 20 mM 트리스 (pH 8.0) 완충 용액으로 평형화시킨 후, 이어서, 여기에 정제된 17,65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체 분획을 적용하였다. 마지막으로, 1 M 염화나트륨을 함유하는 20 mM 트리스 (pH 8.0) 완충 용액의 선형 농도 구배를 사용하여 고순도 17,65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하였다. 제조된 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체의 Fc 영역의 N-말단 선택성을 펩티드 맵핑으로 조사하였고, 선택성은 90% 이상인 것으로 나타났다.
실시예 3: 상이한 반응성 기를 갖는 PEG를 이용한 단백질 복합체 제조.
3-1. 17, 65S G - CSF -PEG 접합체 제조
분자량이 3.4 kDa이고, 그의 양 말단에 숙신이미딜 알파-메틸 부타노에이트 (SMB) 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 SMB-PEG-SMB (넥타(Nektar: 미국))를 20 mM 포스페이트 완충제 (pH 8.0)에 용해된 10 mg/mL의 17,65SG-CSF (분자량 18 kDa)에 1:3의 G-CSF:PEG 몰비로 첨가하고, 30분 동안 천천히 스티플링(stifling)하면서 실온에서 반응시켰다. PEG는 17, 65SG-CSF의 아미노 말단에 선택적으로 연결되고, PEG 및 17, 65SG-CSF는 서로 1:1 비율로 연결된 접합체를 수득하기 위해, 반응 혼합물에 대해 SP HP (GE 헬쓰케어: 미국) 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다.
3-2. 17, 65S G - CSF -PEG- Fc 복합체 제조
실시예 7-1에서 정제된 17, 65SG-CSF-PEG 접합체를 면역글로불린 Fc의 N-말단 이외의 다른 영역에 연결하기 위해, 면역글로불린 Fc 단편을 첨가하고, 1:4 내지 1:8의 17, 65SG-CSF-PEG 접합체: 면역글로불린 Fc의 몰비로 반응시켰다. 20 mM 포스페이트 완충제 (pH 5.5 내지 6.5) 중에서 천천히 스티플링하면서 실온에서 약 2시간 동안 반응시켰다.
3-3. 17, 65S G - CSF -PEG- Fc 복합체의 단리 및 정제
실시예 7-2의 결합 반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고, 그렇게 제조된 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하기 위해, 반응 혼합물을 Q HP (GE 헬쓰케어: 미국) 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시키고, 이로써, 비결합 Fc를 제거하고, 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체 분획을 수득하였다. 반응액을 20 mM 트리스 (pH 8.0) 완충제로 평형화된 Q HP 칼럼에 적용하고, 1 M 염화나트륨 (NaCl)을 함유하는 완충 용액의 농도 구배로 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하였다. 소량의 미반응 면역글로불린 Fc 및 17, 65SG-CSF 이량체가 수득된 17,65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체 분획 중 불순물로서 존재하였다. 불순물을 제거하기 위해, 소스 이소 (GE 헬쓰케어: 미국) 소수성 크로마토그래피를 추가로 수행하였다. 마지막으로, 소스 이소 (GE Healthcare: 미국)를 사용하여 1.2 M 황산암모늄을 함유하는 50 mM 트리스 (pH 7.5) 완충 용액의 선형 농도 구배를 사용하여 고순도 17,65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체를 정제하였다. 제조된 17, 65SG-CSF-PEG-Fc 단백질 복합체의 Fc 영역의 N-말단 선택성을 펩티드 맵핑으로 조사하였고, 선택성은 90% 이상인 것으로 나타났다.
실시예 4: 상이한 반응성 기를 갖는 PEG를 이용한 단백질 복합체 제조.
본 발명자들에 의해 앞서 제출된 한국 특허 출원 번호 10-2012-0111537의 FacVII 유도체인 FacVII-ATKAVC를 이용하여 FacVII-ATKAVC-PEG-Fc 복합체를 제조하였다.
4-1. PEG- Fc 복합체의 단리 및 정제
먼저, 말레이미드-10 kDa-PEG-알데히드 (NOF: 일본)의 알데히드 반응성 기를 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 연결하기 위해, 면역글로불린 Fc 영역 및 말레이미드-10 kDa PEG-알데히드를 100 mM 포스페이트 완충 용액 (pH 5.5 내지 6.5) 중에 1:1의 몰비로 혼합하고, 여기서 환원제인 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, 시그마)를 단백질 농도 10 mg/mL하에 첨가하였다. 저온 (4℃ 내지 8℃)에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 모노PEG화된 면역글로불린 Fc 단편 (말레이미드-10 kDa PEG-Fc)을 수득하기 위해, 소스 Q (GE 헬쓰케어: 미국) 음이온 크로마토그래피를 수행하고, 20 mM 트리스 완충제 (pH 7.5) 중 염화나트륨의 농도 구배로 용출을 수행하였다.
4-2. FacVII - ATKAVC -PEG- Fc 복합체 제조
C-말단을 환원시키기 위해 환원제로서 0.5 mM 내지 2 mM 트리페닐포스핀-3,3',3"-트리술폰 트리소듐 염 수화물을 첨가함으로써 FacVII-ATKAVC를 10 mM 글리실글리신 완충제 중 pH 5.5에서 실온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. C-말단-환원된 FacVII-ATKAVC 및 모노PEG화된 면역글로불린 Fc 단편 (말레이미드-10 kDa PEG-Fc)을 1:4 내지 1:20의 몰비로 혼합하고, 실온에서 약 2시간 동안 50 mM 트리스 완충제 (pH 7.5) 중 1 mg/mL 내지 2 mg/mL의 총 단백질 농도로 반응시켰다.
4-3. FacVII - ATKAVC -PEG- Fc 복합체의 단리 및 정제
실시예 8-2의 반응 용액에 대해 소스 Q 음이온 크로마토그래피를 수행하고, FacVII-ATKAVC-10 kDa PEG-Fc 복합체를 20 mM 트리스 완충 용액 (pH 7.5) 중 염화나트륨 농도 구배로 용출시켰다. FacVII-ATKAVC-PEG-Fc 복합체의 FacVII을 활성화시키기 위해, 저온 (4℃ 내지 8℃)에서 약 18시간 동안 약 4 mg/mL의 FacVII의 조건하에 0.1 M Tris-HCl 완충 용액 (pH 8.0) 중에서 반응시켰다. 마지막으로, 고순도 FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc를 10 mM 글리실글리신 완충 용액 (pH 5.5) 중 슈퍼덱스 200을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피 (GE 헬쓰케어: 미국)에 의해 정제하였다. 제조된 FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc 단백질 복합체의 Fc 영역의 N-말단 선택성을 펩티드 맵핑으로 조사하였고, 선택성은 90% 이상인 것으로 나타났다.
실시예 5: 분자량이 상이한 PEG를 이용한 단백질 복합체 제조.
분자량이 10 kDa이고, 그의 양 말단에 알데히드 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD (넥타: 미국)를 사용하여 실시예 5-2와 동일한 방식으로 인슐린-10 kDa PEG 접합체를 제조하고 정제하였다. 정제된 인슐린-10 kDa PEG 접합체를 약 5 mg/mL 농도로 농축시킨 후, 이를 사용하여 실시예 2-3과 동일한 방식으로 인슐린-10 kDa PEG-Fc 단백질 복합체를 제조하고 정제하였다.
실시예 6 - 단백질 복합체의 순도 평가
6-1. 단백질 복합체 확인
상기 실시예에서 제조된 단백질 복합체를 4% 내지 20% 구배 겔 및 12% 겔을 이용하여 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 면역글로불린 Fc 및 생리 활성 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 개별 단백질 복합체의 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, 커플링 반응 결과, IFNa-PEG-Fc (A), hGH-PEG-Fc (B), 17, 65SG-CSF-PEG-Fc (C), 인슐린-PEG-Fc (D), EPO-PEG-Fc (E), CA-엑센딘4-PEG-Fc (F), 및 FacVII-PEG-Fc (G)가 성공적으로 제조된다.
6-2. 단백질 복합체 순도 평가
상기 실시예에서 제조된 단백질 복합체인 IFNa-PEG-Fc (A), hGH-PEG-Fc (B), 17,65S G-CSF-PEG-Fc (C), 인슐린-PEG-Fc (D), EPO-PEG-Fc (E), 및 CA-엑센딘4-PEG-Fc (F)에 대해 각각 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 또는 HPLC를 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 이들은 각 분석에서 95% 이상의 고순도에 상응하는 단일 피크를 나타내었다.
6-3. 단백질 복합체의 부위 특이성 조사
상기 실시예에서 제조된 단백질 복합체인 IFNa-PEG-Fc (A), hGH-PEG-Fc (B), 17,65S G-CSF-PEG-Fc (C), 인슐린-PEG-Fc (D), 및 EPO-PEG-Fc (E)에 대해 각각 프로테아제를 이용하여 펩티드 맵핑 분석 (역상 크로마토그래피)을 수행하였다. 90% 이상의 높은 선택성을 갖는, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단을 통해 연결된 단백질 복합체가 제조되었다는 것이 확인되었다.
실시예 7: Fc 결합 위치에 따른 복합체의 효능 비교
상기 실시예에서 제조된 단백질 복합체인 CA-엑센딘4-PEG-Fc, 17, 65SG-CSF-PEG-Fc, 및 EPO-PEG-Fc에 대해 각각 시험관내 및 생체내 효능 시험을 수행하였다. 하기 표에 제시된 바와 같이, Fc의 N-말단 (프롤린)에의 결합은 다른 영역 (예컨대, 리신)에의 결합보다 효능이 우수한 것으로 나타났다.
Figure pct00002
표 1에 제시된 바와 같이, CA 엑센딘-PEG-Fc 위치 이성질체 사이의 시험관내 활성 비교 결과, 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에의 특이적 결합에 의해 제조된 본 발명의 CA 엑센딘-PEG-Fc 복합체가, 면역글로불린 Fc 영역의 또 다른 위치에의 결합에 의해 제조된 CA 엑센딘-PEG-Fc 복합체보다 6배 더 높은 효력을 갖는 것으로 나타났다.
Figure pct00003
표 2에 제시된 바와 같이, 17, 65SG-CSF-(N-말단)-PEG-(N-말단) Fc-실험군 S-G-CSF-PEG-Fc 위치 이성질체 사이의 시험관내 활성 비교 결과, 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에의 특이적 결합에 의해 제조된 본 발명의 17,65SG-CSF-(N-말단)-PEG-(N-말단) Fc-실험군 S-G-CSF-PEG-Fc 복합체가, 면역글로불린 Fc 영역의 또 다른 위치에의 결합에 의해 제조된 17, 65SG-CSF- (N-말단)-PEG-(N-Terminus) Fc-실험군 S-G-CSF-PEG-Fc 복합체와 비교하여 약 67% 증가된 역가를 갖는 것으로 나타났다.
한편, 본 발명의 단백질 복합체, 특히, EPO-PEG-Fc 위치 이성질체의 활성을 조사하기 위해, 정상적혈구 마우스 검정법을 수행하여 정상적혈구 마우스에 EPO-PEG-Fc를 피하 주사한 후 망상적혈구 수준을 측정하였다.
Figure pct00004
표 2에 제시된 바와 같이, EPO-PEG-Fc 위치 이성질체 사이의 시험관내 활성 비교 결과, 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에의 특이적 결합에 의해 제조된 본 발명의 EPO-PEG-Fc 복합체가, 면역글로불린 Fc 영역의 또 다른 위치에의 결합에 의해 제조된 EPO-PEG-Fc 복합체와 비교하여 약 40% 증가된 역가를 갖는 것으로 나타났다.
본 결과는 생리 활성 폴리펩티드, 비-펩티딜 중합체, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 단백질 복합체이 면역글로불린 Fc 단편의 특정 부위를 결합 부위로서 사용함으로써 제조될 경우, 단백질 복합체는 생리 활성 폴리펩티드의 생체내 활성을 개선시킨다는 것을 제안한다.
실시예 8: 도세탁셀 및 사이클로포스파미드 ( TC )를 받고 있는 유방암 환자에서 화학요법 유도성 호중구감소증 관리에서의 무작위화된 인간 시험 17, 65S G - CSF -PEG-Fc 단백질 복합체 (에플라페그라스팀) 대 페그필그라스팀(PEGFILGRASTIM).
도세탁셀 및 사이클로포스파미드 (TC)와 함께 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법에 대한 후보자인 유방암 환자에서 고정 용량의 에플라페그라스팀 (13.2 mg/0.6 mL; 3.6 mg GCSF 등가량)의 효능 및 안전성을 평가하기 위해, 개방 표지, 활성 대조군, 인간 연구를 406명의 환자에서 수행하였다.
적격한 환자를 1:1로 하기 두 처리 아암으로 무작위화하였다: (a) 에플라페그라스팀 아암:에플라페그라스팀 13.2 mg/0.6 mL (3.6 mg G-CSF 함유) (고정 용량) 및 (b) 페그필그라스팀 아암:페그필그라스팀 6 mg/0.6 mL (6.0 mg G-CSF 함유) (고정 용량). 따라서, TC를 하기와 같이 각 사이클 1일째 정맥내로 (IV) 투여하였다: (i) 도세탁셀은 기관의 치료 표준에 따라 75 mg/㎡ IV 주입, (ii) 사이클로포스파미드는 기관의 치료 표준에 따라 600 mg/㎡ IV 주입. 각 치료 사이클은 최대로는 최대 4 사이클의 화학요법을 포함하여 21일이었다. 임의 사이클의 1일째 (이전 사이클의 22일째)에 전체 용량 화학요법을 시작하기 위해서는, 환자는 ANC ≥ 1.5x109/L 및 혈소판수 ≥ 100x109/L를 가져야 한다.
에플라페그라스팀 또는 페그필그라스팀을 TC 화학요법 후 대략 24시간 (±2시간)인 각 사이클의 2일째에 투여하였다. 페그필그라스팀은 제조사의 처방 정보에 따라 투여하고자 하였다 (화학요법 사이클당 1회 6 mg씩 피하로).
모든 포함 및 제외 기준을 충족하는 환자를 에플라페그라스팀 아암 또는 페그필그라스팀 아암으로 무작위화하였고, 이들은 4 사이클 동안 연구 처리 (TC)를 받은 후 이어서, 24 (±2)시간내 에플라페그라스팀 또는 페그필그라스팀을 받았다. 처리 종료 (EOT) 방문은 연구 처리의 마지막 투약 후 35 (±5)일에 수행하였다. 사이클 1 동안 CBC 샘플을 화학요법 요법 전 1일째에, 및 이어서, 4일째부터 15일째까지, 또는 호중구감소증에서 회복될 때까지 매일 채취하였다. 사이클 2 내지 4에서, CBC 샘플을 투약 전 1일째, 및 이어서, 4, 7, 10 및 15일째 (각 수집된 동안 상기 시점±1일) 채취하였다. 또한, CBC를 처리 종료 방문시에 수집하였다. 집단 PK를 위한 스파스(sparse) PK 샘플은 사이클 1에서 2일째, 4일째, 및 5일째, 및 이어서, 사이클 3에서, 2일째, 4일째, 및 7일째 수집하였다. 면역원성 샘플은 각 사이클에서 화학요법 투여 전, 처리 종료시, 및 6 및 12개월째 (장기간 안전성) 채취하였다.
적어도 1회 용량의 연구 약물을 받고, 연구를 중단하지 않은 환자는 연구 처리의 마지막 투약 후 장기간 안전성을 추적하고 있다. 장기 안전성에는 3개월 및 9개월째에 유선상으로 유해 사례 (AE) 평가 및 6개월 및 12개월째에 AE 평가 및 면역원성 채혈을 위한 클리닉 방문을 포함한다. 사이클 1에서 DSN은 투약 후 중증 호중구감소증의 발현 기간 (일수)으로 정의된다.
임계치 미만의 ANC가 처음 발생한 후 그로부터 투약 후 중증 호중구감소증 (ANC <0.5x109/L)의 발현 기간 (일수)으로 정의된 사이클 1에서의 중증 호중구감소증의 발현 지속 기간 (DSN)의 1차 종점을 위해 효능 분석을 수행하였다. 본 결과, 페그필그라스팀 아암에서 평균 DSN이 0.35 (±0.68)일인 것과 비교하여 에플라페그라스팀 아암에 대한 평균 DSN은 0.20 (±0.50)일인 것으로 나타났다. 에플라페그라스팀 아암과 페그필그라스팀 아암 사이의 평균 DSN의 차이는 -0.15일이었고, 상응하는 95% CI는 통계 분석 계획에 명시된 백분위수 방법을 사용하여 (-0.264, -0.032)였다. 1차 종점에 대한 미리 명시된 기준을 사용하여, 페그필그라스팀 아암 대비 에플라페그라스팀 아암은 페그필그라스팀만큼 비열등한 DSN (더 우수하거나 또는 효과적)을 제공하는 것으로 입증되었다 (95% CI의 상한 <0.62일; p<0.0001). 본 결과는 또한 사이클 1에서 페그필그라스팀에 비해 에플라페그라스팀이 통계학상 우월한 것으로 입증되었으며 (95% CI의 상한 <0; p0.038), 이는 중증 호중구감소증의 발병률이 에플라페그라스팀 아암에서 유의적으로 더 낮다는 것을 시사한다 (도 2 및 도 3). 한편, 유해 사례의 발생률은 일반적으로 처리군 사이에 유사하였고, 이들 대부분은 화학요법 (TC) 투여와 관련된 것으로 간주되었다.
본원에서 제공된 실시예는 생리 활성 폴리펩티드의 생체내 지속 시간을 증가시키고, 동시에 생체내 활성 (효력)을 증가 또는 유지시키기 위해서는 PEG 모이어티를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 부착된 G-CSF 단백질 복합체가 우수하다는 것을 뒷받침한다.
상기 설명에 기초하여, 본 발명은 그의 기술적 정신 또는 본질적인 특징을 변경하지 않으면서, 다른 구체적인 형태로 실행될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 제한적인 것이 아니라, 예시적인 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위 앞의 설명보다는 청구범위에 의해 정의되며, 따라서, 청구범위의 경계 및 바운드, 또는 상기 경계 및 바운드의 등가물 내에 포함되는 모든 변경 및 변형은 이에 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Spectrum Pharmaceuticals <120> METHODS OF TREATMENT USING G-CSF PROTEIN COMPLEX <130> 178923.00178 <150> 16/428,351 <151> 2019-05-31 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 1 5 10 15 Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 20 25 30 Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45 Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60 Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 65 70 75 80 Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110 Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125 Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140 Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 145 150 155 160 Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220

Claims (41)

  1. 병태(condition)의 예방, 완화(alleviating) 또는 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 예방, 완화 또는 치료하는 방법으로서, 병태는 환자에서 손상된 백혈구 생산을 특징으로 하는 것이고, 방법은 환자에게, 비-펩티딜 중합체(non-peptidyl polymer)를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 공유 연결된 변형된 인간 과립구-콜로니 자극 인자 (hG-CSF)를 포함하는 단백질 복합체의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결되고, 변형된 hG-CSF는 Cys17 및 Pro65 중 적어도 하나에 치환을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 병태가 조혈 기능 감소(reduced hematopoietic function), 면역 기능 감소(reduced immune function), 호중구수 감소(reduced neutrophil count), 호중구 이동 감소(reduced neutrophil mobilization), 말초 혈액 전구 세포 이동(mobilization of peripheral blood progenitor cell), 패혈증(sepsis), 중증 만성 호중구감소증(severe chronic neutropenia), 열성 호중구감소증(febrile neutropenia), 골수 이식(bone marrow transplant), 감염성 질환(infectious disease), 백혈구감소증(leucopenia), 혈소판감소증(thrombocytopenia), 빈혈(anemia), 이식 중 골수의 생착 촉진(enhancing engraftment of bone marrow during transplantation), 방사선 치료에서 골수 회복 촉진(enhancing bone marrow recovery in treatment of radiation), 화학적 또는 화학요법 유도성 골수 무형성 또는 골수억제(chemical or chemotherapeutic induced bone marrow aplasia or myelosuppression), 및 후천성 면역 결핍 증후군(acquired immune deficiency syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 병태가 중증 만성 호중구감소증인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 병태가 열성 호중구감소증인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 손상된 백혈구 생산이 화학요법, 방사선 요법, 또는 특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura)의 결과인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단백질 복합체를, 환자가 애쥬번트(adjuvant) 또는 네오애쥬번트(neoadjuvant) 화학요법으로 치료받은 후에 투여하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단백질 복합체를, 환자가 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법으로 치료받은 후 1 내지 5일 사이에 투여하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 애쥬번트 또는 네오애쥬번트 화학요법이 도세탁셀 및 사이클로포스파미드의 조합인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제2 용량의 단백질 복합체를, 제1 용량의 단백질 복합체를 환자에게 투여한 후 15 내지 25일 사이에 투여하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 치료 유효량이 25 ㎍/kg, 50 ㎍/kg, 100 ㎍/kg, 및 200 ㎍/kg으로부터 선택되는 단위 투여량 형태(unit dosage form)인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 치료 유효량이 0.6 mL 투여 부피 중 13.2 mg의 단백질 복합체인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 환자에게 치료 유효량의 제2 작용제(second agent)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제2 작용제가 항암제인 방법.
  14. 제1항에 있어서, Cys17에서의 치환이 Cys17Ser인 방법.
  15. 제1항에 있어서, Pro65에서의 치환이 Pro65Ser인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 변형된 인간 G-CSF가 서열 번호: 1의 폴리펩티드 서열을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 비-펩티딜 중합체의 양 말단이 공유 결합에 의해 반응성 기를 통해 변형된 인간 G-CSF 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결된 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    (a) 면역글로불린 Fc 영역이 비글리코실화(aglycosylating)되거나;
    (b) 면역글로불린 Fc 영역이 CH2 및 CH3 도메인(domain)으로 구성되거나;
    (c) 면역글로불린 Fc 영역이 CH2, CH3, 및 CH4 도메인 중 하나를 포함하거나;
    (d) 면역글로불린 Fc 영역이 힌지(hinge) 영역을 추가로 포함하거나; 또는
    (e) 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM으로부터 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 면역글로불린 Fc 단편의 각 도메인이 도메인의 하이브리드(hybrid)이고, 여기서, 각 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로부터 유래된 상이한 기원(origin)을 갖거나;
    (b) 면역글로불린 Fc 단편은 기원이 동일한 도메인을 포함하는 단일 쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체이거나;
    (c) 면역글로불린 Fc 단편이 IgG4 Fc 단편이거나; 또는
    (d) 면역글로불린 Fc 단편이 인간 비글리코실화된 IgG4 Fc 단편인 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    (a) 비-펩티딜 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 지질 중합체, 키틴(chitin), 히알루론산, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는
    (b) 비-펩티딜 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 3.4 kDa인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 비-펩티딜 중합체의 반응성 기가 알데히드 기, 말레이미드 기, 및 숙신이미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    (a) 알데히드 기가 프로피온알데히드 기 또는 부티르알데히드 기이거나; 또는
    (b) 숙신이미드 유도체가 숙신이미딜 카르복시메틸, 숙신이미딜 발레레이트, 숙신이미딜 메틸부타노에이트, 숙신이미딜 메틸프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, N-히드록시숙신이미드, 또는 숙신이미딜 카르보네이트인 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    (a) 비-펩티딜 중합체가 양 말단에 반응성 기로서 알데히드 기를 갖거나;
    (b) 비-펩티딜 중합체가 양 말단에 반응성 기로서 각각 알데히드 기 및 말레이미드 기를 갖거나; 또는
    (c) 비-펩티딜 중합체가 양 말단에 반응성 기로서 각각 알데히드 기 및 숙신이미드 기를 갖는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 비-펩티딜 중합체의 각 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 및 변형된 인간 G-CSF의 N-말단, C-말단, 또는 리신(lysine) 잔기, 히스티딘 잔기, 또는 시스테인 잔기의 유리 반응성 기에 연결된 방법.
  27. 화학요법을 받고 있는 환자에게 비-펩티딜 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 생리 활성 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 비-펩티딜 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 부위 특이적으로 연결된 것인, 화학요법을 받고 있는 환자에서 호중구감소증을 치료 또는 예방하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 비-펩티딜 중합체의 양 말단이 공유 결합에 의해 반응성 기를 통해 생리 활성 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역에 각각 연결된 방법.
  29. 제27항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비글리코실화된 방법.
  31. 제27항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH2, CH3, 및 CH4 도메인 중 어느 하나를 포함하는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 방법.
  33. 제27항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지 영역을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제27항에 있어서, 면역글로불린 Fc 단편의 각 도메인이 도메인의 하이브리드이고, 여기서, 각 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로부터 유래된 상이한 기원을 갖는 방법.
  35. 제27항에 있어서, 비-펩티딜 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 중합체, 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  36. 제27항에 있어서, 비-펩티딜 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  37. 제27항에 있어서, 생리 활성 폴리펩티드가 G-CSF인 방법.
  38. 제27항에 있어서, 단백질 복합체가 화학요법의 완료 후 약 6시간 이내에 환자에게 투여되는 방법.
  39. 제27항에 있어서, 단백질 복합체가 화학요법의 완료 후 약 5시간 이내에 환자에게 투여되는 방법.
  40. 제27항에 있어서, 단백질 복합체가 화학요법의 완료 후 약 2시간 이내에 환자에게 투여되는 방법.
  41. 제27항에 있어서, 단백질 복합체가 화학요법의 완료 후 약 1시간 이내에 환자에게 투여되는 방법.
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