CN102807619A - 含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包括免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段通过化学分子与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子相连，所述化学分子可以为聚乙二醇多聚物。该复合物及其药物组合物可以在保持粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子较高水平生物活性的同时显著延长粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的血清半衰期。与传统PEG化的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子相比，该复合物具有更好的均一性。

Description

含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物

技术领域

本发明涉及一种含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物。 

背景技术

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor，简称GM-CSF)属于细胞因子类重组蛋白，自从1985年Wong等人克隆得到了GM-CSF的cDNA序列以来(Wong GG et al.，Science，1985，228：810-815)，相继有不同种类的GM-CSF类似物得到克隆(US5,391,485、US 5,942,253和US 6,120,807)。而基因工程技术的发展，使大规模表达GM-CSF成为可能。临床上，GM-CSF主要作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒细胞、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能(Nemunaitis J.et al.，Blood，1988，72：834-836；Silver GM et al.，Surgery，1989；106：452-455)。 

重组蛋白长效制剂的开发主要使用的技术包括脂质体包埋技术和聚乙二醇(PEG)化技术，脂质体可以有效的减少蛋白被免疫系统或者蛋白酶的识别和吞噬，延长其体内的作用时间，但是由于包埋技术的限制，该项技术一直没有得到大规模的开发利用。而重组蛋白的聚乙二醇(PEG)化在过去的几年里已经得到了长足的发展，有多个PEG化产品已经上市并取得了惊人的业绩，如Amgen公司开发的PEG化的G-CSF，商品名Neulasta，Roche开发PEG化的重组人干扰素α-2a，商品名Pegasys。 

作为重组蛋白药品，GM-CSF的血清半衰期很短，静脉注射GM-CSF的清除半衰期为1～2小时，皮下注射则为2～3小时，在24小时内有45％药 物经尿液排出。为了维持足够的血药浓度，病人就不得不频繁的接受药品注射，这给病人带来了极大的不变和痛苦。因而，有许多科学家都在致力于长效GM-CSF制剂的开发，例如加拿大的Cangene公司就在GM-CSF的N端连接了不同分子量的PEG分子，这些PEG化的GM-CSF与未PEG化的GM-CSF相比，体外活性没有明显的变化，但是半衰期却延长了27～40倍(Lee DL，et al.，Journal of interferon & cytokine research，2008，28(2)：101-112)。但是一般来说，传统的PEG化产品多数都存在产品不均一和生物活性下降等明显的缺点，这是由PEG分子的特性和重组蛋白大分子量所导致的多个连接位点的特点所决定的。 

因此开发优质长效的GM-CSF制剂就很有必要，这不仅要求该制剂有很长的半衰期，而且重组蛋白原有活性也需要得到较好的保持，另外，制剂还要保持很好的均一性。 

由于大肠杆菌表达系统具有低成本产量高的特点，其是许多非糖基化重组蛋白的首选表达宿主。天然GM-CSF虽然有糖基化，但是，据报道，其非糖基化形式比天然的GM-CSF活性还要高4～6倍(Kaushansky K.，et al.，Biochemistry，1987，26：4861-4867)，因而，许多科学家都致力于在大肠杆菌中表达GM-CSF，如有将GM-CSF在大肠杆菌中表达并分泌到周质腔里面的方法(CN98106057)，这种方法虽然避免了包涵体变性复性的步骤，但是在将重组蛋白从周质腔释放出来时却很容易破坏细胞膜，而细胞膜破坏后，大肠杆菌里面的很多宿主蛋白尤其是核酸将给后续的纯化带来很大的困难，相对而言，包涵体的表达形式更加适合重组蛋白的下游纯化。 

天然的GM-CSF基因N端GC含量很高并非常容易形成二级结构，同时基因内部还有很多大肠杆菌的稀有密码子，这些因素都是GM-CSF无法在大肠杆菌中得到高表达的因素(张智清等，病毒学报，1993，9：136-142)。虽然基因改造的文章和专利时见报道，例如专利CN95101619，但它仅仅对N端基因和终止密码子进行了改造，要得到产品的高表达，这种优化是远远不够的。 

因此，仍然需要对GM-CSF基因进行多方面改造，并在发酵罐上对发酵条件进行优化，使GM-CSF在发酵罐中得到适合大规模生产的高表达，同时 还存在对开发长效重组GM-CSF的技术的需求。 

发明概述 

本发明提供了一种含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物。更具体而言，本发明将天然的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(SEQ ID No：1)或者是N端多一个甲硫氨酸的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(SEQ ID No：2)，通过一个化学分子和免疫球蛋白的Fc片段进行共价连接，以延长粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在体内的作用持续时间达到长效的目的，其中所述化学分子可以是聚乙二醇多聚物。 

本发明对天然的GM-CSF的基因(SEQ ID No：3)进行了多方面的改良，并在发酵罐上对发酵条件进行了优化，使GM-CSF在发酵罐中得到了适合大规模生产的高表达。同时，研究了包涵体的预处理和纯化工艺。 

另外，本发明将纯化得到的GM-CSF纯品通过化学分子和免疫球蛋白Fc片段连接，得到了一个含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的复合物及其药物组合物。动物实验表明，该复合物及其药物组合物极大的延长了GM-CSF的体内作用时间。 

具体地，本发明公开了一种复合物，包括免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，其中所述免疫球蛋白Fc片段通过化学分子与所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子相连。 

在本发明公开的复合物中，连接所述免疫球蛋白Fc片段和所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的化学分子可以为聚乙二醇多聚物；所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述聚乙二醇多聚物形成的一个或多个聚乙二醇化产物与单个分子的免疫球蛋白Fc片段以共价键连接；所述聚乙二醇多聚物通过其自身两端的反应性基团与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白Fc片段共价连接。 

在本发明公开的复合物中，所述聚乙二醇多聚物分子两端的反应性基团包括选自以下的一种或两种：醛基(ALD)、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)和羟基琥珀酸亚胺。 所述聚乙二醇多聚物的分子量在500至60000道尔顿之间。 

在本发明公开的复合物中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可以分离于天然产物，或者可以是人工合成的，例如，经由常规重组表达技术制备而得到，优选地其具有SEQ ID No：1或者是SEQ ID No：2的氨基酸序列，或者是源自SEQ ID No：3或4的核苷酸序列，更优选地其具有SEQ ID No：2的氨基酸序列，或者是源自4的核苷酸序列。 

在本发明公开的复合物中，所述免疫球蛋白Fc片段包括选自C_H1，C_H2，C_H3，C_H4结构域中的1个到4个结构域，优选地，还包含铰链区；还优选地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组，还更优选地，选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组，还更优选地，是IgG4Fc片段，还更优选地，是人非糖基化IgG4Fc片段。 

本发明还公开了一种制备本发明所述复合物的方法，包括如下步骤： 

(a)将免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与活化的聚乙二醇多聚物的一端共价连接，形成聚乙二醇化产物； 

(b)从步骤(a)所得反应混合物中分离含有与所述聚乙二醇多聚物共价连接的免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的聚乙二醇化产物； 

(c)将免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与分离的所述聚乙二醇化产物中的聚乙二醇多聚物的另一端共价连接，以得到含有由聚乙二醇多聚物连接的免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物；以及 

(d)分离步骤(c)中所述的复合物。 

在本发明复合物的制备方法中，在步骤(a)中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和聚乙二醇多聚物的反应摩尔比例为1∶0.5至1∶20，优选1∶5；或免疫球蛋白Fc片段和聚乙二醇多聚物的反应摩尔比例为1∶1至1∶8，优选1∶4；在步骤(c)中，获自步骤(b)的聚乙二醇化产物与免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的反应摩尔比例为1∶1至1∶8，优选 1∶4；其中步骤(a)和步骤(c)是在还原剂存在下进行的；所述还原剂选自氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。 

在本发明复合物的制备方法中，其中所述聚乙二醇多聚物两端的反应性基团选自醛基、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯和羟基琥珀酰亚胺；所述醛基是丙醛基或丁醛基。 

本发明还公开了一种药物组合物，所述药物组合物包括前述的复合物和药学上的惰性成分，所述药学上的惰性成分例如本领域所熟知的药典或教科书等相关文献记载的增稠剂、载体、缓冲液、稀释剂、表面活性剂、防腐剂等等，并且是产生生理上可接受的和稳定的制剂所必需的。 

选择药学上的惰性成分，例如药用添加剂、载体、稀释剂、赋形剂等等，部分地由组合物的具体施用途径所决定。施用途径包括但不限于口服、喷雾、胃肠外、局部、眼部、透皮、皮下、静脉、肌肉内、腹膜内、鞘内、直肠和阴道。 

药物组合物可以是液体、气溶胶或固体剂量形式，并且可配置成任何适宜的制剂，包括但不限于溶液、悬浮液、胶束、乳剂、微乳剂、气溶胶、粉末、颗粒、囊剂、软凝胶、胶囊、片剂、丸剂、囊片、栓剂、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂等等，如具体的施用途径所要求的。 

施用药物组合物的量可由本领域普通技术人员确定，以每天一次或几次施用来达到期望结果，而且剂量也可由独立医师调整来达到期望治疗效果或在发生任何并发症时调整。大体上，施用药物组合物的量可根据下述而改变：使用的特定药物组合物的活性、该组合物的代谢稳定性和作用时长；受试者的物种、年龄、体重、一般健康、饮食情况、性别和饮食；施用的方式和时间；排泄速率；以及要治疗的特定病症的表现程度和/或严重程度。 

本发明还公开了本发明所要求保护的复合物及其组合物在制备治疗白细胞和中性粒细胞减少病症的药物中的用途，所述白细胞和中性粒细胞减少病症例如肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、以及白细胞减少可能潜在的感染并发症。 

本发明所要求保护的复合物及其组合物不仅可以极大延长产品的半衰 期，而且产品的均一性也有显著的提高。传统的长效生物制品由于使用了大分子聚乙二醇，生物活性会有明显的下降，本发明使用的是小分子聚乙二醇，因而较好的保持了GM-CSF原有的生物活性。本发明提供的含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的长效复合物半衰期从天然GM-CSF的1～3小时增加到了60小时左右，从而成功得到了含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的长效复合物。 

附图说明

图1.GM-CSF的改良基因和天然基因的序列对比图。 

图2.BL21/pET22b-GMCSF(BHM00101)诱导表达的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。泳道1为诱导前菌体总蛋白；泳道2-4为诱导1-3小时的菌体总蛋白；泳道5为标准GM-CSF蛋白；泳道6为蛋白质分子量标准。 

图3.pET22b(+)-GMCSF-51质粒构建流程图。 

图4.纯化后的GM-CSF的HPLC纯度检测(97.30％峰面积归一)。 

图5.从包涵体复性得到的GM-CSF、与所述GM-CSF相连的PEG化产物(PEG-GM-CSF)、免疫球蛋白的Fc片段、以及与所述PEG化产物相连的免疫球蛋白的Fc片段(LAPS-GM-CSF)的SDS-PAGE图。其中泳道1为GM-CSF；泳道2为PEG-GM-CSF；泳道3为免疫球蛋白Fc段；泳道4为LAPS-GM-CSF。 

图6.纯化后的LAPS-GM-CSF的HPLC纯度检测(98.26％峰面积归一)。 

图7.对照品rhGM-CSF、PEG-GM-CSF以及LAPS-GM-CSF的药代动力学实验结果分析图。 

发明详述 

一方面，本发明重新设计合成了GM-CSF基因(SEQ ID No：4)，降低了上游基因的GC含量，减少了在该部位形成二级结构的可能；并对整个GM-CSF的基因进行了优化，把所有的稀有密码子均更换为大肠杆菌的偏爱密码子，终止密码子也设计为大肠杆菌偏爱的TAA。通过改造，重新设计的GM-CSF基因(SEQ ID No：4)与天然基因序列(SEQ ID No：3)相比，二者的基因序列只有78.3％的同源性，前50个上游核苷酸GC含量从74％降低到 56％的合理范围。同时，通过修改核苷酸序列，去除了天然序列中的颈环结构。这种修改增加mRNA的稳定性，并有利于核糖体与mRNA的结合，提高翻译效率。GM-CSF改良基因(SEQ ID No：4)和天然基因(SEQ ID No：3)的序列对比参见图1。 

将GM-CSF改良基因转化进大肠杆菌中，筛选高表达克隆。对阳性BL21/pET22b-GMCSF菌株的诱导表达条件进行了优化，选取了5个IPTG诱导终浓度进行诱导表达，分别为0.05、0.25、0.4、1.25、2.5和5mM。并于开始诱导后的第4、5、6、7和19小时，取1ml菌液用于检测不同诱导时间目标蛋白的表达水平。还在5L的发酵罐中进行了扩大培养，研究了不同的诱导条件，包括：不同的诱导起始浓度OD₆₀₀＝30-50，不同的IPTG终浓度0.4-1mM，以及不同的诱导时间5-19h。优选诱导条件为：诱导起始浓度为OD₆₀₀＝30，IPTG终浓度为0.4mM，诱导时间为5小时。在优选诱导条件下，在大肠杆菌中得到了30～40％的高表达(图2)。 

因为大肠杆菌表达效率高，大部分的重组蛋白均是以包涵体的形式在细胞中得到表达。包涵体是一些致密的颗粒，里面除了重组蛋白以外，还包括核酸和其它杂蛋白。因而，为了得到有活性的可溶重组蛋白，需要对包涵体进行一系列的处理和纯化，主要包括：包涵体的洗涤、变性、复性以及纯化等步骤。 

为了高效地得到高活性GM-CSF纯品，对包涵体的预处理和纯化工艺进行了研究。研究了不同的菌体裂解液成分对包涵体预处理工艺的影响，包括3种EDTA浓度：1mM、5mM、10mM，和2种Triton X-100浓度：0.5％、1％(V/V)，优选1mM EDTA和0.5％Triton X-100(V/V)。离心收集细胞沉淀，加入细胞裂解缓冲液(20mM pH 9.0Tris缓冲液，1mM EDTA，0.2M NaCl，0.5％Triton X-100)，然后进行高压破碎。离心收集包涵体，加入洗涤缓冲液后并在室温下重悬细胞沉淀，重复洗涤2次后，离心收集沉淀包涵体，供下一步的变性和复性使用。 

包涵体中的重组蛋白一般是没有生物活性的，因为包涵体是一个致密的颗粒，蛋白没有正确的构象。为了得到有活性的重组蛋白，一般需要将包涵体溶解变性，然后在一定的缓冲液中折叠成正确的构象，即复性。常用的变 性剂有盐酸胍和尿素。经研究，优选8M的尿素作为含有GM-CSF的包涵体的变性剂。在复性条件的研究中，发现加入一定量的半胱氨酸(L-半胱氨酸)可以提高GM-CSF复性收率。进而研究了0.06g/L、0.12g/L、0.18g/L三种L-半胱氨酸浓度对GM-CSF复性收率的影响，优选浓度是0.12g/L。 

利用柱层析法对上述蛋白复性缓冲液进行了纯化，得到的GM-CSF的纯品，经反相高压色谱分析，纯度可达97％以上(图4)；进行活性分析，比活性可达1.4×10⁷IU/mg。 

另一方面，本发明开发了制造含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物的方法。 

将上面得到的GM-CSF产品与分子量约为3400道尔顿的由ID Biochem公司制备的聚乙二醇二丙醛(PEG-(ALD)₂，在PEG的两个末端具有两个丙醛)分子进行共价连接，即可得到GM-CSF和PEG分子相连的聚乙二醇(PEG)化产物。本发明研究了GM-CSF同3400道尔顿的聚乙二醇二丙醛连接反应所需要的不同摩尔比例：1∶0.5；1∶1；1∶2.5；1∶5；1∶10和1∶20，不同反应缓冲液pH值：pH 4.0、pH 5.0和pH 6.0，不同反应时间：1h和2h。优选反应条件是：1∶5的摩尔比，在pH 6.0的条件下反应1小时。在优选反应条件下可以得到最大产量的N-末端连接的PEG化产物。反应液中的PEG化产物可以通过选用不同的填料经层析法而得到纯化。 

将纯化后的该PEG化产物和免疫球蛋白的Fc相连，可得到含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的复合物。 

本发明还研究了PEG化产物和免疫球蛋白的Fc连接反应的不同的摩尔比例：1∶1；1∶2；1∶4和1∶8，优选1∶4。然后分别用分子筛，阴离子和疏水层析法顺序纯化，即可得到一定纯度的含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的复合物。 

将上述从包涵体复性得到的GM-CSF、与所述GM-CSF相连的PEG化产物(PEG-GM-CSF)、免疫球蛋白的Fc片段、以及与所述PEG化产物相连的免疫球蛋白的Fc片段(LAPS-GM-CSF)进行SDS-PAGE分析，如图5所示。对与所述PEG化产物相连的免疫球蛋白的Fc片段(LAPS-GM-CSF)进 行HPLC分析，纯度可达95％以上(图6)；进行活性分析，比活性可达1.2×10⁷IU/mg。 

本发明对含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的长效复合物进行了体内和体外检测。药代动力学结果表明(图7)，该复合物的半衰期从天然GM-CSF的1～3小时增加到了60小时左右，从而成功得到了含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的长效复合物。 

实例 

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明，但它们不是对本发明的限定。 

实例1表达载体的构建及高表达菌种筛选 

为了使GM-CSF在大肠杆菌中高表达，重新设计合成了GM-CSF基因(SEQ ID No：4)，包括：降低了上游基因的GC含量，减少了二级结构形成的可能；并对整个GM-CSF的基因进行了优化，把稀有密码子更换为大肠杆菌的偏爱密码子，终止密码子也设计为大肠杆菌偏爱的TAA；同时在基因的起始密码子前面带上Nde I酶切位点，终止密码子后面加上BamH I酶切位点。 

然后把合成好的并经测序为SEQ ID No：4的基因用Nde I(New England Biolabs，Cat.R0111S)和BamH I(New England Biolabs，Cat.R0136S)限制性内切酶进行双酶切消化，并回收。同时，对载体pET22b(+)(Novagen，Cat：69744-3)也用Nde I和BamH I进行双酶切消化，并回收。将消化后的载体和基因片段按照1∶3的摩尔比，在连接酶的作用下16℃连接16小时。然后将连接产物转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen，Cat：C4040-10)，用PCR筛选阳性克隆，并扩大培养阳性克隆，提取质粒进行PCR，酶切和测序鉴定。 

鉴定正确的质粒命名为pET22b(+)-GMCSF-51，质粒构建流程见图3。将该质粒大量提取后，转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，Cat：69450-3)，涂布LB/Amp+(100μg/ml)固体平板，37℃培养过夜。挑取BL21/pET22b-GMCSF阳性克隆进行小量的试诱导表达。培养及诱导过程为：接种阳性单克隆菌落至10ml LB/Amp+液体培养基中，37℃200rpm条件下 培养过夜；按1∶100的比例接种过夜培养物至1L新鲜LB/Amp+液体培养基中，继续培养2.5h；往培养液中加入IPTG至终浓度为0.4mM开始诱导，IPTG加入前及开始诱导后每1小时取1ml菌液用于检测目标蛋白表达水平的变化。诱导5h后菌液OD值为2.9，用8000rpm离心10min收集菌沉淀，称量菌体湿重为2.3g/L。 

对阳性BL21/pET22b-GMCSF菌株的诱导表达条件进行优化。选取IPTG诱导终浓度分别为0.05、0.25、0.4、1.25、2.5和5mM，并于开始诱导后的第4、5、6、7和19小时取1ml菌液用于检测不同诱导时间目标蛋白的表达水平。选取其中高表达的菌株命名为大肠杆菌BHM00101，并制成甘油菌菌种于-80℃保藏。 

实例2发酵罐生产 

将实例1获得的甘油菌取一支接种至50ml LB/Amp+基础培养基中，在37℃200rpm条件下培养12h后，取1.8ml培养液接种于180ml LB/Amp+基础培养基中，37℃200rpm条件下培养16h。将180ml种子菌全部接种到5L发酵罐中，发酵罐内含经过灭菌的1.7L基础培养基LB。发酵过程培养温度为37℃，pH6.8，初始通气量2L/min，初始搅拌速度为200rpm。根据溶氧调整搅拌速度，当溶氧降为0时升高搅拌速度，每次提升幅度为50rpm。培养3小时转速升至800rpm后不再改变搅拌速度。继续培养1小时当pH开始上升时流加补料，通过维持发酵液恒定的pH值来调整补料速度。每小时取样测定OD₆₀₀，在菌生长至合适的浓度进行IPTG诱导表达，加入IPTG至终浓度为0.4mM并增加通气量至3L/min。继续培养5h后停止发酵，测定最终OD₆₀₀为103，离心收集菌体，菌体湿重可以达到160g/L。诱导过程中每小时取1ml菌液用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 

实例3GM-CSF的纯化 

步骤1包涵体的洗涤 

离心发酵液，收集大肠杆菌细胞。加入细胞裂解缓冲液(20mM pH 9.0Tris缓冲液，1mM EDTA，0.2M NaCl，0.5％Triton X-100)，室温下重悬细胞沉淀。用细胞均质机对细胞悬液在15,000psi的压力下进行高压破碎。然后将 破碎液5,000rpm离心35分钟，弃去上清，加入缓冲液1(10mM Tris，pH 9.0，0.5％Triton X-100)对沉淀(包涵体)进行洗涤并重悬沉淀。5,000rpm离心重悬的沉淀35分钟，弃去上清，加入缓冲液2(10mM Tris，pH 9.0)进行第二次洗涤并重悬沉淀。5,000rpm离心第二次洗涤并重悬的沉淀35分钟，弃去上清，得到洗涤后的包涵体。 

步骤2包涵体的变性与复性 

在上述步骤1得到的包涵体中加入溶解缓冲液(20mM pH 9.0Tris缓冲液，8M尿素)，室温重悬沉淀，静置4小时后于7,000rpm下离心30min，收集上清。在收集的裂解液上清中加入L-半胱氨酸(0.024g/200ml)，4℃条件下轻柔的混合1小时。然后加入复性缓冲液(4M尿素，0.25M精氨酸，50mM pH 8.5的Tris缓冲液，0.5mM半胱氨酸，4mM的还原型谷胱甘肽，0.8mM的氧化型谷胱甘肽)，4℃静置36小时。然后22,000g离心30分钟，收集上清并用0.45微米滤膜过滤。用5K膜包将滤液浓缩并将缓冲液更换为10mMTris，pH 8.5，22,000g离心30min，收集上清即为GM-CSF复性液。 

步骤3柱层析纯化 

将上述步骤2中得到的GM-CSF复性液用0.45微米滤膜进行过滤，用SepharoseQ柱(GE公司)进行纯化，缓冲液为pH7.5的Tris缓冲液。采用梯度洗脱的方法，收集目标蛋白峰即得到GM-CSF的纯品(对其的SDS-PAGE如图5泳道1所示)，得到的蛋白纯度可达97％以上(图4)，蛋白回收率在50％左右，该蛋白的N-端氨基酸测序结果和SEQ ID No：2的N-端序列完全一致，采用TF-1细胞/MTT法(见2010版中国药典三部附录XF)进行活性检测，比活性可达1.4×10⁷IU/mg。 

实例4含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的复合物的生产 

步骤1PEG-GM-CSF的制备 

用G25凝胶层析柱(GE公司)将GM-CSF纯品缓冲液更换为pH 6.0的100mM的磷酸钾缓冲液(PBS)，然后用3K的膜包将蛋白样品进行浓缩，直至蛋白样品浓度达到5mg/ml以上。在上述GM-CSF样品中，按照1∶0.5、1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10和1∶20的摩尔比例加入3,400道尔顿的由ID Biochem 公司制备的聚乙二醇二丙醛(PEG-(ALD)₂，在PEG的两个末端具有两个丙醛)，然后加入氰基硼氢化钠(SCB)(溶于pH 6.0的100mM的磷酸钾缓冲液中)，以pH 6.0100mM的磷酸钾缓冲液调整蛋白和SCB的浓度分别为5mg/ml和20mM。4℃轻柔搅拌1小时。然后用凝胶层析柱将反应液的缓冲液更换为pH7.5的20mM Tris-HCl。然后用SepharoseQ柱(GE公司)进行纯化，收集PEG-GM-CSF组分峰(对该组分的SDS-PAGE如图5泳道2所示)，并用阴离子层析柱将缓冲液更换为pH 6.0的100mM的磷酸钾缓冲液。通过此实验，发现收率最高且副产物最少的GM-CSF：PEG的最佳反应摩尔比为1∶5。 

步骤2含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的复合物的制备 

含有免疫球蛋白Fc片段和GM-CSF的复合物的制备就是通过化学反应，将PEG-GM-CSF和免疫球蛋白Fc片段进行连接。 

首先，人非糖基化IgG4Fc片段的制备方法如下：将溶于10mM磷酸盐缓冲液中的200mg 150-kDa免疫球蛋白G(IgG)(韩国绿十字公司)用2mg木瓜蛋白酶(Sigma)在37℃温度搅拌处理2小时，酶反应后，对由此再生的免疫球蛋白Fc片段依次用Superdex柱、蛋白A柱和SepharoseSP柱(GE公司)进行层析纯化。具体的说，就是将反应液加到用10mM磷酸钠缓冲液(PBS，pH 7.3)平衡过的Superdex 200柱(GE)上，将柱子用同一缓冲液以流速1ml/分钟洗脱。与免疫球蛋白Fc片段相比具有相对较高分子量的未反应免疫球蛋白分子(IgG)和F(ab′)²由于其洗脱早于IgG Fc片段的特性而被除去。分子量近似于IgG Fc片段的Fab片段通过蛋白A柱层析除去。将洗脱自Superdex 200柱的含IgG Fc片段的所得组分以5ml/分钟的流速加到用20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)平衡的蛋白A柱(GE)上，用同一缓冲液洗柱，以去除未结合在柱上的蛋白质。然后，用100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱蛋白A柱，以获得高纯度的免疫球蛋白Fc片段。最后用polyCATp阳离子交换柱(PolyLC Company)纯化从蛋白A柱收集的Fc组分，其中上样了Fc组分的该柱子用10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中的0.15-0.4M NaCl线性梯度洗脱，从而提供了高纯度的Fc组分。将该Fc组分以浓度2mg/ml溶于100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，并与300U/mg去糖基化酶PNGase F(NEB)混合。使反应混合 物在温和搅拌下于37℃反应24小时。然后，为了纯化非糖基化的免疫球蛋白Fc，将反应混合物加到SP Sepharose FF柱(GE)上，然后用含1M NaCl的10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)，以0.1-0.6M线性NaCl梯度洗脱柱子。天然免疫球蛋白IgG4Fc较早地洗脱下来，而非糖基化免疫球蛋白IgG4Fc则稍后被洗脱下来，收集后面的非糖基化免疫球蛋白IgG4Fc(对其的SDS-PAGE如图5泳道3所示)供下一步连接反应使用。 

然后用凝胶层析柱将上述制备的人非糖基化IgG4Fc片段的缓冲液更换为pH 6.0的100mM的磷酸钾缓冲液，并调整Fc的终浓度达到70-100mg/ml。将上述步骤1中得到的PEG-GM-CSF和Fc按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8的摩尔比例混合，总蛋白浓度控制为50mg/ml，同时加入20mM SCB并轻柔的搅拌，4℃条件下反应16小时。然后用G25凝胶层析柱(GE公司)将上述反应液的缓冲液体系更换为pH 7.520mM的Tris缓冲液，再将样品顺序用SepharoseQ柱(GE公司)，Phenyl Sepharose(GE公司)顺序进行纯化，收集目标峰LAPS-GM-CSF(对其的SDS-PAGE如图5泳道4所示)，G25凝胶层析柱(GE公司)将缓冲液更换为pH 7.0的PBS，然后进行纯度分析(图6)和体外活性检测(TF-1细胞/MTT法，见2010版中国药典三部附录XF)。结果表明，得到的LAPS-GM-CSF不仅纯度很高，而且体外活性没有明显的下降，比活性可达1.2×10⁷IU/mg。同时，通过此实验，也发现收率最高且副产物最少的PEG-GM-CSF:Fc的最佳反应摩尔比为1∶4。用截留分子量为10K的膜包(Sartorious公司)将目标峰缓冲液更换为pH7.0的制剂缓冲液(含1.1％的苯甲醇，40mg/ml的甘露醇，8.7mg/ml的氯化钠和1.2mg/ml的三乙醇胺)，并将蛋白终浓度调整为1mg/ml，即得到了LAPS-GM-CSF的药物组合物。 

实例5药代动力学检测 

取SPF级SD雄性大鼠20只，随机分成5组，每组4只，皮下注射检测样品，包括对照品(厦门特宝生产的特尔立rhGM-CSF)。样品GM-CSF，PEG-GM-CSF和含有免疫球蛋白Fc片段的GM-CSF(LAPS-GM-CSF)的注射剂量见表2。分别在注射后的0.25，0.5，1，2，3，6，10，12，24，48，72，96，120，144，192，240，288，336，384，432和480小时眼眶取血样， 用ELISA试剂盒检测血清中的样品含量并分析，结果如表2和图7所示。 

表2.药代动力学实验结果分析 

*：与GM-CSF、PEG-GM-CSF、rhGM-CSF(特宝)相比，半衰期均显著延长(p＜0.001)。 

Claims (17)

1.一种复合物，包括免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

2.如权利要求1所述的复合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段通过化学分子与所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子相连。

3.如权利要求2所述的复合物，其中所述化学分子为聚乙二醇多聚物，所述聚乙二醇多聚物的分子量在500至60000道尔顿之间。

4.如权利要求3所述的复合物，其中所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述聚乙二醇多聚物形成的一个或多个聚乙二醇化产物与单个分子的免疫球蛋白Fc片段以共价键连接。

5.如权利要求4所述的复合物，其中所述聚乙二醇多聚物通过其自身两端的反应性基团与所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述免疫球蛋白Fc片段共价连接。

6.如权利要求5所述的复合物，其中所述聚乙二醇多聚物分子两端的反应性基团包括选自以下的一种或两种：醛基、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯和羟基琥珀酸亚胺，其中所述醛基优选是丙醛基或丁醛基。

7.如权利要求1至6任一项所述的复合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。

8.如权利要求1至7任一项所述的复合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段包括选自C_H1，C_H2，C_H3，C_H4结构域中的1个到4个结构域，优选地，所述免疫球蛋白Fc片段还包括铰链区。

9.如权利要求1至8任一项所述的复合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组，优选地，选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段以及它们的组合和杂合体组成的组，更优选地，所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4 Fc片段，最优选地，所述免疫球蛋白Fc片段是人IgG4Fc片段。

10.如前述任一项权利要求所述的复合物，其中所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子分离于天然产物，或者是人工合成的，优选地其具有SEQ ID No：1或者是SEQ ID No：2的氨基酸序列，或者是源自SEQ ID No：3或4的核苷酸序列。

11.一种制备复合物的方法，所述复合物包括免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，所述方法包括如下步骤：

(a)将所述免疫球蛋白Fc片段或所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与活化的聚乙二醇多聚物的一端共价连接，形成聚乙二醇化产物；

(b)从步骤(a)所得反应混合物中分离含有与所述聚乙二醇多聚物共价连接的免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的聚乙二醇化产物；

(c)将免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与分离的所述聚乙二醇化产物中的聚乙二醇多聚物的另一端共价连接，以得到含有由聚乙二醇多聚物连接的免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物；以及

(d)分离步骤(c)中的所述复合物。

12.如权利要求11所述的方法，其中在步骤(a)中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和所述聚乙二醇多聚物的反应摩尔比例为1∶0.5至1∶20，优选为1∶5；或所述聚乙二醇多聚物和所述免疫球蛋白Fc片段的反应摩尔比例为1∶1至1∶8，优选为1∶4。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中在步骤(c)中，获自步骤(b)的聚乙二醇化产物与免疫球蛋白Fc片段或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的反应摩尔比例为1∶1至1∶8，优选为1∶4。

14.如权利要求11-13任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇多聚物两端的反应性基团选自以下的一种或两种：醛基、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯和羟基琥珀酰亚胺，其中所述醛基优选是丙醛基或丁醛基。

15.如权利要求11-14任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(c)是在还原剂存在下进行的，优选地，所述还原剂选自氰基硼氢化钠、硼氢化钠、硼酸二甲胺和硼酸吡啶。

16.一种药物组合物，包括权利要求1-10任一项所述的复合物或通过权利要求9-13任一项所述的方法制备的复合物、和药学上可接受的载体。

17.权利要求1-10任一项所述的复合物、或通过权利要求9-13任一项所述方法制备的复合物、或权利要求16所述的药物组合物在制备治疗白细胞和中性粒细胞减少病症的药物中的用途。

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