CN1314705C

CN1314705C - 高效抑制血管生成多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1314705C
Application number: CNB2005100403785A
Authority: CN
Inventors: 徐寒梅; 奚涛
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2007-05-09
Anticipated expiration: 2025-06-03
Also published as: CN1699408A

Abstract

本发明属于生物工程制药技术领域或蛋白质多肽类药物领域，具体涉及高效血管生成抑制剂及其生产方法与应用。本发明设计了具有整合素亲和性的高效血管生成抑制剂RGD-ED，该抑制剂含有血管生成抑制多肽异亮氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸，在其一端或两端分别连接含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽。本发明的RGD-ED可以合成。本发明还通过基因工程方法在大肠杆菌中表达了其中一种RGD-ED，进行包涵体蛋白分离、溶解和复性、离子交换层析分离纯化得到RGD-ED，产物在体内外实验中都能够显著提高现有血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长、抑制新生血管生成和抗肿瘤效果，能够作为实体瘤、类风湿性关节炎治疗药物。

Description

高效抑制血管生成多肽及其制备方法和应用

一.技术领域：本发明属于生物工程制药技术领域或蛋白质多肽类药物领域。

二.背景技术

肿瘤血管生成抑制剂是近年来在肿瘤治疗中引起重视的一类药物，这方面的研究已经取得一些进展，可望在今后成为一类新的有希望的肿瘤治疗药物。肿瘤新生血管形成的概念是Algureza在1947年提出的，他指出增长的肿瘤的一个重要特征是能够从宿主引发新的毛细血管内皮细胞形成。1971年，Folkman提出假设，认为肿瘤生长和转移依赖于新生血管生成，并认为实体瘤早期可分泌肿瘤血管生成因子，刺激宿主毛细血管增生。新生血管不仅可以提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的途径(Folkman，J.，J.Natl.CancerInst.1990；82：4-6)。因此，阻断新生血管形成可能成为阻止肿瘤生长和转移的手段，从而激发了对促血管生成分子和抗血管生成分子的广泛研究。在这些血管生成抑制剂中，尤其以血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)最引人注目，两者均已在美国进入临床试验，尽管这些血管抑制剂呈现出非常诱人的前景，但其缺陷也非常明显：迄今为止的血管生成药物，如内皮抑素、血管抑素等作用靶点不明确，它们对血管的专一性和选择性还不够好，效果有限，导致实验中用量很高，在小鼠动物模型实验时，血管抑素用量达数百毫克/公斤体重，内皮抑素达到数十毫克/公斤体重，当这些血管生成抑制剂在人体内使用时，使用剂量至少要达到几克/人的剂量。这样大的药物使用剂量势必增加日后该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制难度加大、生产规模和生产成本增大、药物价格居高。

因此，一个好的抗血管生成药物应该有对新生血管的标记分子具有选择性，这样才能达到对新生血管的导向性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用：作到只使用很低剂量的药物，就能达到高效的抑制血管生成效果。

整合素是由α亚基和β亚基组成的跨膜蛋白异二聚体，研究表明，肿瘤细胞表面的整合素是肿瘤转移发生的关键所在，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用控制细胞的迁移、分化和增殖(Schoenwaelder SM等，Curr Opin Cell Biol，1999；274-286)。20多种整合素中大多数都识别含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的细胞外基质配基(Dennis MS等，Proc Natl AcadSci 1990；87：2471-2475)，含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗剂作用，能减少细胞表面黏附分子的表达，调节细胞内信号转导，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。

三.发明内容

目前发现，有的编码血管生成抑制剂的小肽具有抑制血管生成和抗肿瘤效果，本研究是将抑制血管生成的小肽两端加上不同的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，构建了一种对整合素具有结合作用和亲和性的血管生成抑制剂。

本发明的目的是提供一种与整合素有亲和性或结合能力的高效血管生成抑制剂，本发明的高效血管生成抑制剂可以合成。本发明还应用PCR扩增得到目的基因，克隆于原核表达载体，用基因工程手段获得产物，所得产物与同类产品比较，具有高效、特异性抑制内皮细胞增殖和抗肿瘤效果，并且用量小，相应减少了药物治疗的副作用。

本发明的技术方案：

1.本发明所述血管生成抑制多肽为：

(1)在血管生成抑制多肽

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端分别连接含有Arg-Gly-Asp或Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly的序列，即多肽序列

Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，

Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp序列。

(2)在高效抑制血管生成多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端连接含有

Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或

Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys的多肽，即序列

Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，

Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。

2.本发明所述血管生成抑制多肽的制备方法：

(1)本发明的多肽序列及其编码此多肽序列的碱基序列可以直接进行合成。

(2)合成含有Arg-Gly-Asp整合素结合序列肽段的血管生成抑制剂基因序列，以此序列为模板，设计上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上适合克隆的酶切位点，PCR扩增，获得RGD-ED基因。将基因克隆于载体中，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析鉴定。

(3)RGD-ED基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达RGD-ED，表达产物以包涵体形式存在。

(4)进行包涵体蛋白分离、溶解和复性，并进行离子交换层析分离纯化RGD-ED蛋白产物，收集穿过液，冻干。

3.本发明所述血管生成抑制多肽的活性测定方法：

进行内皮细胞增殖实验和鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析、小鼠体内抗肿瘤实验。

4.本发明与现有技术相比其有益效果为：

产物在体内外实验中都能够大幅度改善和提高现有血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长和抗肿瘤效果，副作用小，并且用量小，降低了成本，说明本发明设计的高效血管生成抑制剂科学、合理、可行有效，能够作为肿瘤和风湿性关节炎治疗药物。

四.附图说明：

图1HPLC纯化RGD-ED分析结果

图2鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析RGD-ED抑制新生血管生成：A，空白对照B，C，D分别为0.05μg，0.1μg和0.2μg给药组

图3RGD-ED体内抑制肿瘤效果

五.具体实施方式：

1.RGD-ED基因的克隆及其原核表达载体的构建

合成编码RGD-ED多肽序列的碱基，作为模板；合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了NdeI酶切位点；下游引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位点。进行PCR扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，进行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表达载体pw，PCR筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实序列发生了设计的突变。

合成的引物1：5’GGAATTCCATATGATCGTGCGCCGTGCCGACCGC3’

合成的引物2：5’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCA3’

其中，引物1编码了NdeI位点和Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的部分序列，引物2编码XhoI位点和含有Arg-Gly-Asp序列的基因。

2.为了比较本发明所设计的血管生成抑制剂RGD-ED的实际效果，本实例中我们同时委托公司合成了不含Arg-Gly-Asp序列的多肽

Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ED)。

3.重组菌的诱导表达

将表达质粒转化大肠杆菌，重组菌经过1mMIPTG诱导表达3小时后，收获细胞并超声破菌，离心分离上清和沉淀，15％SDS-PAGE电泳分析，将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE扫描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析表达结果。

4.包涵体的分离、溶解与复性

超声破菌，离心分离，将包涵体沉淀用0.1Mtris和脱氧胆酸钠洗涤，沉淀溶解于月桂基肌氨酸钠(SLS)中，4℃，10000rpm离心5min，上清液4℃透析，透析液为buffer A(10mM Tris-HCl，0.1mM氧化型谷胱甘肽和1mM还原型谷胱甘肽，pH7.4)，6-8h换液一次，共换液3次，最后透析一次，透析液为buffer B(10mM Tris-HCl，pH7.4)，样品直接进行SP-Sepharose Fast Flow(AmershamPharmacia Biotech)层析。柱床平衡洗涤均用buffer B，用0.6M NaCl，Tris-HCl，pH7.4和1M NaCl，Tris-HCl，pH7.4分步洗脱，将洗脱液混合，buffer B透析后冻干浓缩。层析结果如图1所示。

5.内皮细胞增殖分析

培养BCE细胞和NIH 3T3细胞，方法：培养液DMEM含10％灭活小牛血清(BCS)，1％抗生素及3ng/ml bFGF。细胞增殖分析方法如下：PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，加入培养液悬浮细胞并离心收集细胞，调整细胞浓度至25,000cells/ml。将细胞移入6孔板(0.5ml/well)，培养24h.，更换培养基为1mlDMEM，5％BCS，1％抗生素，1ng/ml bFGF，每孔加入不同剂量的样品，进一步培养48h，胰蛋白酶消化细胞，重悬于PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式细胞仪进行分析。

结果显示：重组RGD-ED能够特异性抑制内皮细胞-BCE细胞的增殖，而对非内皮细胞-NIH 3T3则没有抑制作用。抑制BCE增殖的ED₅₀大约为0.1μg/ml，而没有Arg-Gly-Asp序列的多肽ED₅₀大约为0.8μg/ml，内皮抑素的ED₅₀大约为0.5μg/ml。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂确实显著提高了现有的血管生成的生物活性。

6.鸡胚尿囊绒膜(CAM)分析

为了检测体内抗血管生成活性，进行CAM分析。所有实验在超净台中进行无菌操作，将消毒的6天的鸡胚在37℃、90％湿度下进行培养。两天后，每个鸡蛋顶端打孔，将试剂滴到灭菌的Whatman滤纸，放入CAMs上血管密集区，培养48小时后，观察鸡胚和CAMs并拍照。

如图2所示，为了评价RGD-ED体内抗新生血管生成活性，采用了不同剂量的RGD-ED来进行CAM实验，其中0.05μg，0.1μg和0.2μg的RGD-ED都能够显著抑制新生血管和血管生成，0.5μgRGD-ED能够完全抑制血管生成并导致鸡胚死亡。RGD-ED具有潜在的抑制血管生成的作用。

7.动物体内抗肿瘤实验

将培养的B16F10黑色素瘤细胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×10⁵细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到200mm³-300mm³，随机将小鼠分组，每组7只，其中一组接受RGD-ED治疗，一组用不含Arg-Gly-Asp的ED治疗，以上两组剂量均为5mg/kg/d，对照注射PBS。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式：肿瘤体积＝长×宽²×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。

如图3所示，结果表明，在第9天时，RGD-ED的肿瘤抑制率为58％，而没有Arg-Gly-Asp序列的多肽ED的肿瘤抑制率为28％。以上实验说明本发明所设计的高效血管生成抑制剂能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。

Claims

1.一种具有整合素、肝素亲和性和结合能力的高效抑制血管生成的多肽，其特征在于在血管生成抑制多肽Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的一端或另外一端连接对整合素家族具有亲和性和结合能力的多肽。

2.根据权利要求1所描述的多肽，其特征在于所述对整合素家族具有亲和性和结合能力的多肽为Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。

3.根据权利要求2所描述高效抑制血管生成多肽的生成方法，其特征在于：构建编码含有Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys序列的Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro多肽的基因序列，进行基因工程表达，分离纯化重组蛋白质。

4.根据权利要求2所述的高效抑制血管生成多肽的生成方法，其特征在于：采用多肽合成方法合成含有Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys序列的Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro多肽。

5.根据权利要求1或2所述高效抑制血管生成多肽在制备治疗人类新生血管生成有关疾病-实体瘤的药物中的应用。