JPH11504036A - ケモカイン結合タンパク質およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ポックスウイルスによってコードされ、急性又は慢性の調節不全(dysregulated)炎症応答に関連した病徴に対するＴ７インターフェロン受容体相同体と相同のアミノ酸配列を有する新規のＩ型ケモカイン結合性タンパク質の使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ケモカイン結合タンパク質およびその使用 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、一般的には免疫学の分野に関し、特に、種々のポックスウイルスに よってコードされるケモカイン結合タンパク質およびその使用に関する。 ２．関連技術の説明 高等脊椎動物の細胞内に生存するウイルスは特に宿主免疫系を回避すべく進化 したにちがいないことが、次第に明らかになってきている（Gooding，L.，Cell, 91:5-7，1992; Marrack，P．and Kappler，J.，Cell，76:323-332，1994; Smit h，G.，Trends in Micro.，82:80-88，1994）。実際に、ウイルスの生存は、外 来侵入物に対する多彩な宿主反応を回避、抑制、阻止、さもなければ混乱させる ことができる方式に左右される。免疫系のエフェクタアームにより付与される選 択圧は、明らかに進化圧の強力な要素であり、現在生存するすべての真核ウイル スは、コードされたタンパク質として、またはこれらのウイルスの特定の生物学 的生存方式により実証されるように、免疫系との抗争のインプリントまたはレム ナントを含有する。 より大きなＤＮＡウイルス（すなわち、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、 イリドウイルス、およびポックスウイルス）は、特に、感染された宿主の免疫認 識および／またはクリアランスからウイルスを保護すべく機能するタンパク質を コードする。こうして、これらの「破壊性」ウイルスタンパク質は、免疫系の機 能的働きに関する情報を提供しており、この増大するファミリーの新しいメンバ が将来は更に多く発見され、同定される可能性がある。 1980年代に「ウイロカイン」という用語が提案されたが、これはサイトカイン または宿主免疫レパートリにとって重要な他の分泌される調節剤などの細胞外シ グナル分子を模倣することによって機能する感染細胞から分泌されるウイルスコ ード化タンパク質を記述するものである（Kotwal，G．and Moss，B.，Nature，3 35;176-178，1988）。その後、1990年代に「ウイロセプタ」という用語が導入さ れたが、これは次のような観測結果を説明するためであった。すなわち、重要な 細胞の受容体と類似したタンパク質で、しかも宿主のサイトカインをそれらの正 常な受容体から遠ざけることによって機能するこうしたタンパク質をいくつかの ウイルスがコードし、これにより初期の段階で免疫回路を阻害することが観測さ れた（Upton，et al.，Virology，184:370，1991; Schreiber and McFadden，Vi rology，204:692-705，1994）。 特定のポックスウイルスすなわち粘液腫ウイルスに関する最近の研究から、ウ イルスが様々な方式によって免疫系を破壊することが示された（McFadden and G raham，Seminars in Virology，5:421-429，1994）。粘液腫ウイルスは、粘液腫 症と呼ばれる飼いならされたウサギの毒性全身性疾患の病原菌である。粘液腫は もともと18世紀に報告されたもので、実験動物に対して発見された最初のウイル ス病原体であるとともに、ペスト撲滅というはっきりした目的のためにかつて意 図的に環境に導入された最初のウイルス薬剤であった。40年以上前にオーストラ リアおよびヨーロッパの野生ウサギ個体群へ導入されて以来、ウサギおよびウイ ルスの両方の野生種は相互に進化圧および選択圧の影響を受け、その結果、接種 を受けた地域で定常的な地方病が発生した（Fenner，F．and Ratcliffe，F.N.， "Myxomatosis"，Cambridge University Press，London，1965））。 粘液腫は、他のポックスウイルスに関連した生物学的な特徴の多く、すなわち 、複製の細胞質位置および大きな二本鎖ＤＮＡゲノム（160キロベース）、を共 有している。複数の系統から得られた事実によって、すべてのポックスウイルス と同様に、粘液腫は、様々な宿主組織中におけるウイルスの蔓延および増殖を可 能にする働きを有する複数の遺伝子産物をコードすることが示唆される。これら のウイルス性タンパク質のいくつかは、特に、宿主炎症反応および獲得細胞性免 疫の発達を妨害または停止するが、ポックウイルスは、一般に、こうした免疫調 節タンパク質の宝庫であった（Turner，P.C．and Moyer，R.W.，Cur．Top．Micr obiol．Imm．163:125-152，1990; Buller，R.M.L.，and Palumbo，G.J.，Micro ．Dev.，55:80-122，1991; Smith，G.L.，J.，Gen．Virol.，94:1725-1740，199 3; McFadden，G.，(Ed.)，"Viroceptors，virokines and related immune modul ators encoded by DNA viruses"，R.G．Larudes Co.，Austin Texas，1995）。 こうした免疫調節遺伝子産物としては、例えば、細胞表皮成長因子受容体を介 してパラ分泌様式で隣接細胞を刺激する粘液腫成長因子(MGF)（Upton，et al.， J．Virol.，61:1271-1275，1987; Opgenorth，et al.，Virol.，186:185-191，1 992; Opgenorth，et al.，Virol.，192:701-708，1992; Opgenorth，et al.，J ．Virol.，66:4720-4731，1992）；セリンプロテアーゼインヒビタ活性をもつ分 泌糖タンパク質であって、しかも初期炎症反応の発達を抑制するSerpl（Upton， et al.，Virol.，179:628-631，1990; Lormas，et al.，JBC，268:516-521，199 3; Macen，et al.，Virol，195:348-363，1993）；細胞性腫瘍壊死因子(TNF)受 容体の分泌ウイルス性同族体であって、しかもウサギのTNFと結合し、かつそれ を抑制するT2（Smith，et al.，BBRC，176:335-342，1991; Schreiber，M．and McFadden，G.，supra，1994; Upton，et al.，supra，1991）；細胞性インター フェロンγ受容体の分泌ウイルス性同族体であって、しかもウサギのインターフ ェロンγと結合し、かつそれを抑制するT7（Upton et al.，Science，258:1369, 1992; Upton and McFadden，Methods in Molecular Genetics，4:383，1994; M ossman，et al，In: "Viroceptors，virokines and related immune modulator s" p．41-54 Ed．McFadden，R.G．Landers，Co.，1995）；および機構は分かっ ていないが炎症反応内で妨害を示す表面受容体様タンパク質であるM11L（Opgeno rth，et al.，supra; Graham，et al.，Virol，191:112-124，1992）が挙げられ る。 免疫調節タンパク質にはまた、「ケモカイン」と呼ばれる化学走化性サイトカ インも含まれる。ケモカインとは、特に好中球、好塩基球、単球、およびT細胞 などの白血球に対する化学親和性物質である低分子量の免疫リガンドを指す。ケ モカインには2つの主要なクラスがあり、いずれにもタンパク質の三次構造中に ジスルフィド結合を形成する4個の保存システイン残基が含まれる。αクラスはC -X-C（ただし、Xは任意のアミノ酸である）と記述され、IL-8、CTAP-III、gro/M GSA、およびENA-78が含まれ、βクラスはC-Cと記述され、MCP-1、MIP-1αおよび β、ならびに活性化調節性の正常T発現および分泌タンパク質(RANTES)が含まれ る。これらのクラスの表記は、モチーフ中の最初の2個のシステインを介在残基 が離間させるか否かに対応している。一般に、ほとんどのC-X-Cケモカインは、 好中球に対する化学親和性物質であるが、単球に対しては化学親和性物質とはな らず、一方、C-Cケモカインは、単球に対する親和性を示すが、好中球に対して は親和性を示さない。最近、リンホタクチンと呼ばれる新しいタンパク質が発見 されたことにより、ケモカインの第3のグループすなわち「C」グループが示され た（Kelner，et al.，Science，266:1395-1933，1994）。ケモカイングループは 、リンパ球および単球を炎症部位へ浸潤させるうえで極めて重要であると考えら れている。 更に多くの免疫調節ウイルス遺伝子が今後発見される可能性が強い。これらの および関連する遺伝子産物は、宿主の抗ウイルス防御機構の様々なアームを開裂 させる有用な手段を提供するのみならず、細胞免疫レパートリの新しい要素を同 定するプローブならびに炎症および免疫系の異常調節を抑制する新しいクラスの 薬剤をも提供可能である。 発明の概要 本発明は、一括して「ケモカイン」と呼ばれる白血球化学走化性に関与する1 クラスのサイトカインに対する、予期せずに発見された新規な溶解性ウイスル特 異的抑制剤に関する。本発明のタンパク質はタイプIの「ケモカイン結合タンパ ク質(CBP-I)」であるとともに、粘液腫のT7遺伝子の遺伝子産物でもあるが、こ のT7遺伝子は既にインターフェロンγ(IFN-γ)受容体の同族体をコードすること が分かっている。しかしながら、ウサギのリガンド(IFN-γ)に対してT7遺伝子産 物が極めて特異的であるこことは対照的に、本発明のCBP-Iは、マウスおよびヒ トのc-ヘモカインと非常によく結合する。他のポックスウイルスによりコードさ れるCBP-Iおよび関連同族体は、過剰の白血球の流入が病原性突起と関連する種 々の炎症性疾患の治療に役立つ。 図面の簡単な説明 図1Aは、ポックスウイルス分泌タンパク質と接触させた後のI¹²⁵標識されたIL -8、RANTES、およびMIP-1βのSDS-PAGEを示している。図1Bは、粘液腫またはエ クトロメリアウイルス感染細胞中のI¹²⁵-MIP-1 βのSDS-PAGEを示している。 図2は、粘液腫分泌タンパク質に対するリガンドとしてのI¹²⁵標識されたRANTE SのSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないRANTES、MIP-1β、MIP-1α、IL- 8、およびMCP-1との拮抗を示している。 図3Aおよび3Bは、ポックスウイルス分泌タンパク質に対するリガンドとしての I¹²⁵標識されたMIP-1βのSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないMIP-1β、 IFN-γ、MCAF、MIP-1α、RANTES、およびIL-8との拮抗を示している。図3Aは、 粘液腫、ワクシニア、およびSFVを示している。図3Bは、粘液腫、牛痘、ウサギ 痘、エクトロメリア、およびSFVを示している。 図4は、粘液腫分泌タンパク質に対するリガンドとしてのI¹²⁵標識されたIL-8 のSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないMIP-1β、IFN-γ、MCAF、およびM IP-1αとの拮抗を示している。 図5は、T7タンパク質を表すウェスタンブロットを示すとともに、種々のサイ トカイン（IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IFNα、およびIFN- γ）との相互作用を示している。 図6は、T7タンパク質を表すウェスタンブロットを示すとともに、種々のケモ カイン（RANTES、MCP-1、MCP-3、IL-8、PF4、IP-10、NAP-2、MGSA、およびリン ホタクチン）との相互作用を示している。 図7は、粘液腫感染BGMK細胞由来の全タンパク質、モノQ分画後の半精製タンパ ク質、およびsuperdex75ゲル濾過後の精製CBP-I(T7)タンパク質のSDS-PAGEを示 している。 図8は、ヒトRANTESケモカインの精製CBP-I／部分精製CBP-Iへの結合を示して いる。銀染色分析により、精製CBP-Iまたは部分精製CBP-IのいずれかをRANTESと 共にインキュベートした場合に得られる約47kDの架橋された複合体（CBP-I＋Ran tes）が示され(第2レーンおよび第4レーン)、RANTESが存在しないときはゲル移 動度シフト複合体は観測されなかった(第1レーンおよび第3レーン)。 図9は、ヒトRANTESケモカインの部分精製CBP-Iへの結合を示している。銀染色 分析により、CBP-Iをビオチニル化Rantesと共にインキュベートした場合に得ら れる約47kDの架橋された結合複合体（CBP-I＋Rantes）が明らかにされ(第2レー ン〜第6レーン)、この結合は、標識化されていないケモカインリガンドの量を減 少させることによって滴定することができる。 図10Aは、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中のアテロ ーム性動脈硬化プラークのプラーク厚／深さ(mm)を示している。 図10Bおよび10Cは、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中 のアテローム性動脈硬化プラークのプラーク面積(mm2)を示している。 図11は、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中のアテロー ム性動脈硬化プラークのプラーク厚(mm2)を示している。 発明の詳細な説明 本発明の知見は、損傷、感染、および種々の疾患の状態に対する炎症および免 疫反応における循環系から組織部位へのリンパ球および単球の移行に関連した広 範囲の免疫病理学的状態を治療しうる抗免疫タンパク質の重要で新しい供給源を 提供する。 本発明のタイプＩケモカイン結合タンパク質(CBP-I)の具体例としては、粘液 腫ウイルスが感染した細胞から得られる主要分泌タンパク質があり、M-T7オープ ンリーディングフレームによりコードされている（Upton，et al.，Science，25 8:1369，1992;ならびにGenBank Accession No: M81919; SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2）。このタンパク質は、インターフェロンγ(IFN-γ)に対するヒトおよ びマウス受容体と有意な配列類似性を有する。更に、粘液腫M-T7タンパク質は、 ウサギTFN-γと特異的に結合するが、マウスまたはヒトTFN-γとは特異的な結合 を示さない（Mossman，et al.，J．Biol．Chem.，270:3031-3038，1995）。 「ケモカイン結合タンパク質」という用語は、1つ以上のケモカインと結合し、 かつこれを抑制するタンパク質を意味する。「ケモカイン」は、白血球化学走化 性に寄与するサイトカインの1クラスである。ケモカインのαクラスはC-X-C（た だし、Xは任意のアミノ酸である）と記述され、インターロイキン(Il-8)、結合 組織活性化タンパク質(CTAP-III)、メラニン細胞成長刺激活性(MGSA)gro/MGSA、 IFN-γ誘導性タンパク質(IP-10)、好中球活性化ペプチド2(NAP2)、β-トロンボ グロブリン、および上皮誘導好中球親和性物質(ENA-78)が含まれ；βクラスはC- Cと記述され、T細胞活性化遺伝子3(TCA-3)、単球化学走化性タンパク質(MCP-1、 2、および3)、マクロファージ炎症タンパク質(MIP-1αおよびβ)、ならびに活性 化調節性の正常T発現および分泌タンパク質(RANTES)が含まれる。 他のケモカインは、当該技術分野で使用される普通の方法によって検出するこ とができる。例えば、化学親和性物質のin vitro研究に対する好ましいマイクロ 化学走化性アッセイ系であるボイデンチャンバを使用して分子を試験してもよい 。一連のウェルをプレキシガラスブロック中に形成するが、このウェルは上下2 つのチャクバから成り、ニトロセルロースおよびポリカーボネートなどのいくつ かのタイプの多孔性フィルタのいずれか1つで分離されている。対象細胞、例え ば末梢血単核細胞、を各ウェルの上側チャンバへ添加し、試験物質、例えば化学 親和性物質、を下側チャンバへ添加する。上側チャンバ中の細胞が下側チャンバ 中の物質に親和性を示す場合、細胞は溶液中に存在する理論濃度勾配に沿って移 行し、フィルタの孔を通ってゆっくりと進み、フィルタの下側に付着する。 こうしてケモカインファミリーのメンバであると思われるポリペプチドが、本 発明のCBP-Iを使用してスクリーニングできる。従って、1実施態様において、本 発明は、新規なケモカインをスクリーニングおよび同定する方法を提供する。該 方法には、遊離のまたはマトリックスに結合した本発明のCBP-Iと1つ以上のケモ カインを含有すると思われる組成物とを接触させる工程と、CBP-Iと組成物との 結合を検出する工程とが含まれる。CBP-Iと組成物（ケモカイン）との結合を検 出する方法は、当業者には分かるであろうが、本明細書中の実施例中に記載の方 法が含まれる。 必要な場合には、CBP-Iとケモカインとの結合を検出する手段として種々の標 識を使用することができる。ケモカインまたはCBP-Iを直接的または間接的に検 出可能なように、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発 光化合物、金属キレート化剤、または酵素を用いて標識することができる。当業 者は他の好適な標識を知るかまたは通常の実験によりこうした標識を確認するこ とができるであろう。 もう1つの実施態様において、本発明は、被検者の免疫病理学的疾患を治療す る方法を提供する。該方法には、グリコシル化の程度にもよるがSDS-PAGEの減少 により測定される分子量が約30〜40kDであること、粘液腫T7インターフェロンγ 受容体の同族体とアミノ酸配列相同性を有すること、および粘液腫T7インターフ ェロンγ受容体の同族体の生物学的機能を有することを特徴とする治療上有効量 の抗炎症タンパク質の被検者への投与が含まれる。「抗炎症」という用語は、炎 症反応の減少または抑制を意味する。 本発明の具体的CBP-Iのグリコシル化および分泌型は、SDS-PAGEの減少条件下 で測定した見かけの分子量が約38kDである。更に、このタンパク質は、粘液腫T7 IFN-γ受容体の同族体との相同性を有する。「相同性」という用語は、CBP-Iと ウイルスIFN-γ受容体とのアミノ酸レベルでの一致度を意味する。好ましくは、 CBP-Iは粘液腫T7 IFN-γ受容体と50%〜95%のアミノ酸配列相同性を有する。相同 性要件は厳しくはないが、CBP-Iは粘液腫T7 IFN-γ受容体の生物学的機能を保持 していなければならない。言い換えると、この相同性は、CBP-Iがケモカインと 結合し、かつこれを抑制するかぎり、それで十分である。 本発明は、官能性ポリペプチドCBP-Iとその官能性断片とを含む。本明細書中 で使用する場合、「官能性ポリペプチド」という用語は、所定の官能性アッセイ を介して同定され、かつ特定の生物学的、形態学的、または表現型の応答と関連 する生物学的機能または活性を有してなるポリペプチドを意味する。CBP-Iペプ チドの官能性断片としては、CBP-I活性が残存するCBP-I断片（例えば、ケモカイ ンと結合する断片）が挙げられる。CBP-Iの生物学的活性を有するより小さいペ プチドは本発明に含まれる。こうしたペプチドのケモカインに対する結合は、本 明細書中に記載の方法を含めて当業者に一般的に知られた方法によって検定する ことができる。生物学的機能は、抗体分子が結合するエピトープ程度に小さいペ プチド断片から細胞内の表現型の特徴的な誘導またはプログラミングに寄与しう る大きなペプチドまで様々である。「官能性ポリヌクレオチド」とは、本明細書 中に記載された官能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。 CBP-I第一級アミノ酸配列に少量の変更を加えても、本明細書中に記載のCBP-I ポリペプチドと比較して実質的に同等な活性を有するタンパク質となる場合があ る。こうした変更は、位置指定突然変異誘発などにより意図的に行ってもよいし 、自発的に行ってもよい。こうした変更を加えて生成したポリペプチドはすべて 、 CBP-I活性が保持されているかぎり本発明に含まれる。更に、1つ以上のアミノ酸 を除去することにより、その活性の有意な変化を伴わずに、得られる分子の構造 の改質を行うこともできる。これによって、更に広範な有用性をもつより小さな 活性分子の開発を行うことができる。例えば、CBP-I活性をもたせるうえで必要 とならないアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸を除去することが可能であ る。 本発明のCBP-Iポリペプチドにはまた、該ポリペプチド配列の保存的変異体も 含まれる。本明細書中で使用される「保存的変異」という用語は、アミノ酸残基 を生物学的に類似した他の残基で置換することを意味する。保存的変異としては 、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの疎水性残 基で他の疎水性残基を置換すること、または極性残基で他の極性残基を置換する こと、例えば、アルギニンでリシンを、グルタミン酸でアスパラギン酸を、もし くはグルタミンでアスパラギンを置換することなどが挙げられる。「保存的変異 」という用語にはまた、無置換の母核アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用す ることも含まれるが、この場合、置換ポリペプチドに対して産生された抗体が無 置換ポリペプチドとも免疫反応を行うものとする。 本発明の方法に使用されるCBP-Iのウイルス供給源としては、粘液腫ウイルス 、牛痘ウイルス、ショープ繊維腫ウイルス、エクトロメリアウイルス、ウサギ痘 ウイルス、および他の哺乳類ポックスウイルスが挙げられるが、この場合、CBP- Iは、グリコシル化の程度にもよるが分子量約30〜40kDを有すること、粘液腫T7 インターフェロンγ受容体の同族体との相同性を有すること、および粘液腫T7イ ンターフェロンγ受容体の同族体の生物学的機能を有することを特徴とする抗炎 症タンパク質の生物学的機能をもつものとする。 本発明の方法により治療される免疫病理学的疾患は、ケモカインの産生および それに続く罹患組織における反応性白血球の蓄積と関連付けることができる。こ の方法には、治療上有効量のCBP-Iの被検者への投与が含まれる。「免疫病理学 的疾患」という用語は、一般に免疫応答または免疫性が関与する任意の疾患を意 味する。本明細書中で使用される「治療上有効」とは、免疫病理学的疾患の原因 を軽減するのに十分なCBP-I量を意味する。「軽減」とは、治療を受ける患者の 疾患の有害な作用を減少させることを意味する。本発明の被検者は好ましくはヒ トであるが、免疫病理学的疾患を患った任意の動物、例えば、ヒトの骨髄が移植 されたSCIDマウス（ヒューマナイズドSCID）、を本発明の方法により治療できる と考えられる。本発明の方法により治療可能な免疫学的疾患としては、例えば、 後天性免疫不全症(AIDS)、毒素ショック症候群、同種異系移植片拒絶、関節硬化 性プラーク成長、紫外線および放射線応答、ならびにT細胞、B細胞、マクロファ ージ、および免疫応答や急性期応答における他の炎症白血球の活性化が関連する 疾患、更に腫瘍壊死因子媒介悪液質などの進行癌が関連する疾患が挙げられる。 本発明は、内毒血症もしくは敗血症性ショック（敗血症）などの免疫病理学的 疾患または敗血症の症状を1つ以上を含む免疫病理学的疾患を治療または軽減す る方法を提供する。該方法には、敗血症の症状を呈するかまたは敗血症が進行す る恐れのある被検者に治療上有効量のCBP-Iを投与することが含まれる。「軽減 」という用語は、治療される疾患の症状を減少または弱めることを意味する。 免疫学的疾患の症状を呈する患者については、CBP-Iを用いた治療に加えて、 抗生物質または抗ウイルス剤を用いた治療を行ってもよい。典型的な抗生物質と しては、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシドまたはペニシリンもしくはセフ ァロスポリンなどのβラクタムが挙げられる。従って、本発明の治療法には、殺 菌量の抗生物質または十分量の抗ウイルス化合物の投与と実質的に同時に治療上 有効量のCBP-Iを投与することが含まれる。 本明細書中で使用される「殺菌量」という用語は、治療を受ける患者中に細菌 死滅血液濃度を得るのに十分な量を意味する。ヒトへの投与に対して安全である として一般に認知されている抗生物質の殺菌量は、当該技術分野で周知であり、 また当該技術分野で知られているように、この殺菌量は特定の抗生物質および治 療される細菌感染のタイプにより変わる。CBP-Iの投与は48時間以内に行うのが 好ましく、好ましくは約2〜8時間以内、最も好ましくは抗生物質の投与と実質的 に同時に行う。 本発明の方法においてCBP-Iの投与を行って再灌流後傷害を軽減することも可 能である。動脈血栓症を治療する場合、組織プラスミノーゲン活性化因子(t-PA) などの血餅溶解剤による再灌流の誘発には、しばしば組織損傷が伴う。こうした 組織損傷の少なくとも一部は、白血球（例えば、多形核白血球(PMN)が挙げられ るが、これに限定されるものではない）が媒介していると考えられる。従って、 CBP-Iの投与により白血球またはPMN‐内皮相互作用が阻害され、これによって再 灌流後傷害が減少または抑制されるのであろう。CBP-Iの投与はまた、動脈傷害 後に新たに生じる再発性アテローム硬化性プラーク成長を抑制するのに有用であ る。再狭窄およびプラークの新たな成長は、動脈壁の内層に対する局所的炎症応 答によって悪化するものと考えられる。 本発明の方法はまた、アレルギー性疾患または自己免疫疾患に起因する炎症の 治療に有用である。アレルギー性疾患としては、例えば、アレルギー性鼻炎、喘 息、アトピー性皮膚炎、および食物性アレルギーが挙げられる。免疫系が宿主自 身の組織を攻撃する自己免疫疾患としては、例えば、インシュリン依存性糖尿病 、炎症性腸疾患、皮膚炎、髄膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症 候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球粘着性欠損症、リウマチ様および他の形態の免 疫性関節炎、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬性関節、進行性全身性硬化症、 原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性脈管炎、重症筋無力症、多発性 硬化症、紅斑点性狼瘡、多発性筋炎、類肉腫症、肉芽腫症、脈管炎、悪性貧血、 CNS炎症性疾患、抗原抗体複合体媒介疾患、自己免疫性溶血性貧血、橋本甲状腺 炎、グレーブス病、習慣性突発性流産、ルナール症候群、糸球体腎炎、皮膚筋炎 、慢性活動性肝炎、セリアック病、AIDSの自己免疫性合併症、萎縮性胃炎、強直 性脊椎炎、およびアジソン病が挙げられるが、これらに限定されるものではない 。 この方法はまた、非悪性または免疫関連細胞増殖疾患の治療に有用である。こ うした疾患としては、例えば、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、急性 呼吸困難症候群(ARDS)、虚血性心疾患、アテローム硬化症、透析後症候群、白血 病、後天性免疫不全症候群、敗血症性ショックおよび他のタイプの急性炎症、脂 質性組織球増殖症などがある。本質的には、ケモカイン産生（例えば、IL-8、MI P-1αまたはβの発現の誘発）に起因する炎症前突起や細胞浸潤と病理論学的に 関連する任意の疾患が治療の対象となりうるものと考えられる。 本発明の方法はまた、微生物感染症の治療にも有用である。細菌、リケッチア 、種々の寄生虫、およびウイルスなどの多くの微生物は、血管内皮および白血球 に 結合し、炎症反応を誘発して、例えば、インターロイキンが産生される。従って 、本発明の方法に使用されるCBP-Iを患者に投与して、こうした感染症と関連し た炎症を防止することができる。 本発明のCBP-Iの投与に対する用量範囲は、免疫応答の症状がある程度抑えら れる所望の効果を得るのに十分な大きさの範囲である。不必要な交叉反応、アナ フィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど用量を多くしてはならな い。一般に、用量は、年齢、症状、性別、および患者の病気の程度により変わる が、当業者により決定することができる。悪い徴候が現れた場合は、個々の医師 によって用量を調節することができる。1日もしくは数日にわたり毎日1回以上の 投与で1回あたり約10pg〜100μgの範囲で用量を変化させることができる。 CBP-Iは、非経口投与、皮下投与、肺内投与、動脈内投与、直腸内投与、筋肉 内投与、鼻腔内投与など、任意の好適な手段で投与される。非経口注入としては 、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、または腹腔内投与が挙げられる。CBP- Iはまた、例えば徐放性皮下埋植の形態で経皮投与するか、またはカプセル、粉 末、もしくは顆粒の形態で経口投与してもよい。また、吸入によりCBP-Iを投与 することもできる。例えば、肺の炎症性疾患の治療に使用する場合、好ましい投 与経路は肺へのエアゾール投与である。 医薬品として許容しうる非経口投与用キャリア製剤としては、無菌または水性 もしくは非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水性溶剤の例は 、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、 およびオレイン酸エチルなどの有機エステルである。水性キャリアとしては、水 、アルコール性／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液、例えば、食塩水および緩 衝媒体、が挙げられる。非経口担体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデ キストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または 固定油が挙げられる。活性治療成分は、医薬品として許容でき、しかも該活性成 分と相溶化しうる賦形剤と共にしばしば混合される。好適な賦形剤としては、水 、食塩水、デキストロース、グリセロール、およびエタノール、またはこれらの 組合せが挙げられる。静脈担体としては、液体および栄養素補液、電解質補液（ 例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。また、保存 料 やその他の添加剤（例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなど ）が存在していてもよい。 本発明はまた、本発明のCBP-Iを含有する薬剤または医薬用組成物の調製方法を 提供する。該薬剤は、有害な免疫応答／炎症反応（本発明のCBP-Iと結合するケ モカインが免疫応答の結果として産生される）の治療に使用されるものである。 本発明は、グリコシル化の程度にもよるが約30〜40kDの分子量を有し、粘液腫 T7インターフェロンγ受容体の同族体とのアミノ酸配列相同性を有し、更に医薬 用キャリア中で、粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体の生物学的機能を 有する抗炎症性タンパク質の免疫治療上有効量の少なくとも1回の投与量を含む 医薬用組成物を提供する。 本発明は、本発明の方法に使用される本発明のCBP-Iを含有する医薬用製剤お よび組成物を提供する。その形態は投与経路に依存する。例えば、注入用組成物 は、それぞれ単位用量が含まれるアンプルの形態で、または複数回の投与量を含 有する容器の形態で提供できる。 CBP-Iを処方して、医薬品として許容される中性塩の形態で治療用組成物を調 製してもよい。こうした塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸など）また は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸など）と共に形成される酸付加塩が 挙げられる。塩としてはまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カ リウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリシウム、水酸化第二鉄など）および有 機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカ インなど）から形成される塩も含まれる。 適切な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリド ン、エチレン‐酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、 硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリド共重合体）を選ぶことによって、 送達制御を行うことが可能である。CBP-Iの放出速度は、巨大分子の濃度を変化 させることによって制御可能である。 作用持続時間を制御するもう1つの方法は、CBP-Iをポリマー材料（例えば、ポ リエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコリド共重合体、 またはエチレン酢酸ビニル共重合体）の粒子中に包含させるものである。この他 、例 えば、コアセルベーション技術または界面重合技術によって調製されたマイクロ カプセル中に（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン のマイクロカプセル、またはポリ(メチルメタクロレート)マイクロカプセルを使 用して）、あるいはコロイド薬物送達システム中にCBP-Iを封入することが可能 である。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフ ェア、ビーズ、脂質に基づく系（例えば、水中油エマルション、ミセル、混合ミ セル、およびリポソーム）が挙げられる。 以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するもの ではない。これらは利用可能な典型的な例であるが、当業者にとって公知の他の 手順を代わりに使用してもよい。 実施例１ 材料及び方法 損傷誘発性アテローム硬化症のラットモデル ： ９匹のＳＤ(Sprague Dawley)ラットにバルーン血管形成術を施すことによって その左腸骨大腿骨の動脈に損傷を与えた。全身性ペントバルビタール麻酔下で（ 体重 100ｇ当たり 6.5mgを筋肉内注射、Somnotrol、MTC Pharmaceuticals、ケン ブリッジ、オンタリオ）、1.5mmのＵＳＣＩ血管形成用バルーンを静脈切開及び 動脈切開によって動脈内に逆方向に進ませた。500pgのCBP-I （６匹のラット） 又は生理食塩水（５匹のラット）を、後のバルーンによる損傷部位から上流に向 かう血管形成用バルーンカテーテルの末端管腔内にCBP-I 又は対照溶液を動脈内 注射することによって与えた。次いで、バルーンを８バールの圧力に１分間膨ら ませた。血管形成術後、バルーンをすぼませて取り出し、動脈切開部位をn-ブチ ルシアノアクリレートモノマー(Nexaband、Veterinary Products Laboratories 、フェニックス、アリゾナ)の局所塗布によって閉じた。各ラットを正常ラット の食餌で養って、手術後４週間追跡検査を行った。追跡検査では、ラットをユー タニル(euthanyl)2.0ml/kg で殺し、大動脈を組織学的検査のために採収した。損傷誘発性アテローム硬化症のウサギモデル ： ７匹のコレステロール補給ニュージーランド白ウサギに末端(distal)腹大動脈 のバルーン血管形成術を施した。全てのウサギ（ニュージーランド白系統）に２ ％コレステロールを含む10％落花生油食を４日／週与えた。これはバルーン損傷 の２週前から始めた。麻酔（40mg/kg ケタリーン(ketalean)、８mg/kg キシラゼ ン(xylazene)及び 0.5mg/kg アセプロマジン(acepromazine)を筋肉内注射）後、 ３〜3.5mm の血管形成用バルーンカテーテル（バルーンと大動脈の直径の比は≧ １：１）を、大腿動脈の静脈切開(femoral arterial cut down)によって導入し た。バルーンを末端腹大動脈内で８バールの圧力に膨らませて、その末端胸大動 脈に逆方向に進ませた。各ウサギにおいてＸ線透視による監視下でのバルーンの 前進及び引き出しを３回行って確実に内皮を裸出させた。バルーン血管形成術に よる損傷の前後と、４週間の追跡調査において対比血管造影図を記録した。大腿 アクセスの達成後すぐにヘパリン(400単位)を投与してカテーテル関連血栓症を 低減させた。 ４匹のウサギの末端腹大動脈内におけるバルーンによる損傷後、すぐに精製CB P-I(T7)タンパク質 500 pg/サンプルを注入した。３匹のウサギにおいて、生理 食塩水の平行注入液を末端腹大動脈内に局所的に注入した。バルーンによる損傷 後、すぐに各注入物を無菌 0.9％生理食塩水で総容量10mlに希釈してWolinskyカ テーテルによって投与した。全ての注入は腸骨分岐の近位の腹大動脈内で3.25mm Wolinskyバルーンによって行われた（最終圧力６±１バールに２分間膨らませた ）。Ｘ線透視による監視下で、Wolinskyバルーンを腸骨分岐のすぐ上方に置いて その灌流バルーンがごく普通に腸骨分岐の 0.5〜2.5cm 上方に位置するようにし 、第１の注入部位と呼んだ。上流の第２の部位は腸骨分岐に近位の 2.5cmよりも 上方の領域に規定した。全ての検査において、バルーンによる損傷後、注入物を すぐに無菌 0.9％生理食塩水で総容量10mlに希釈してWolinskyカテーテルによっ て投与した。全ての注入は腸骨分岐の近位の腹大動脈内で3.25mm Wolinsky バル ーンによって行われた（最終圧力６±１バールに２分間膨らませた）。CBP-I タンパク質の単離及び精製 ： 粘液腫T-7 タンパク質(CBP-I)は本明細書の実施例４に記載したようにして単 離、精製した。組織学的分析及び形態計測学的(morphometric)分析 ： 末端腹大動脈（ウサギ）の第１のWolinsky注入部位、又は灌流バルーンの最初 の位置決めによって規定された第１の注入部位を示す上流の腸骨大腿骨動脈枝（ ラット）にて組織学的分析を行った。ウサギにおいて、腸骨分岐近傍の下流の非 注入部位（分岐の 0.5cm上方から分岐のか0.5cm 下方まで）、及び上流の非注入 部位（腸骨分岐の 2.5cm〜3.5cm 上方の上流腹大動脈）から内部対照切片を取り 出した。腸骨分岐の 1.5〜2.5cm 上方の領域は、バルーン配置による潜在的に可 変の注入量を有する境界ゾーンであると考えられ、したがってこの分析には含ま れなかった。ラットにおいては、T-7 処置ラット及び生理食塩水注入ラット両方 の第１のバルーン部位を組織学的評価に用いた。ホルマリン固定標本のヘマトキ シリン及びエオシン染色を以前に記載されたようにして行った。簡単に言うと、 以前に記載されたように各標本を10％(v/v)リン酸ナトリウム緩衝ホルマリンに 固定し、処理し、含浸し、パラフィンに包埋してミクロトームによって５μm の 切片に切断した。次いで、各標本由来の切片（最小で２切片／部位）をヘマトキ シリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡検査法によって検査した。シュワルツマン反応 ： 体重３kgの雌性ニュージーランド白ウサギに、E.coli血清型 0111:B4(Sigma) 由来のリポ多糖(LPS)、及びカラムクロマトグラフィーを用いて均質に精製され たCBP-I(T7)タンパク質を注射した。0.1〜1.0 μg のCBP-I が存在する50〜100 μg のLPS 及びCBP-I が存在しない50〜100 μg のLPS の８つの皮内注射液(各 0.1m)をウサギの背に注入した；片側に約 2.5cm毎に離された４つの注射部位が ある。24時間後、ウサギの耳辺縁静脈に LPS 100μg を静脈内投与する。静脈内 注射の約４〜６時間後、内皮注射部位に壊死性炎症が発生した。その炎症が有意 になるとすぐに、ユータノール(euthanol)の致死性注射によってウサギを殺した 。損傷の大きさ及び赤みを評価して組織サンプルを集めた。 実施例２ 新規ウイルスタンパク質へのサイトカインの結合 簡単に言うと、種々のヒトサイトカインを¹²⁵Ｉで放射性同位元素標識し、対 照又はポックスウイルス感染BGMK細胞から採取した分泌タンパク質に曝露し、架 橋させ、次いでSDS-PAGEによって新規サイトカイン／タンパク質複合体を分析し た。驚くべきことに、架橋アッセイは、何が明らかに試験される３つのヒトケモ カイン（Il-8、RANTES、及び MIP-1βのそれぞれに結合した新規ウイルス特異的 タンパク質）であるかをカバーしていない（図１）。図１Ａにヨウ素化リガンド 及び組織培養上清を用いるゲル移動度変位アッセイを示す。組織培養上清(Sups) は以下のようにして調製した：BGMK（ベビーミドリザル腎細胞(Baby Green Monk ey Kidney Cells)）に粘液腫(MYX)、ワクシニアウイルス(VV)、又はショープ繊 維腫ウイルス(SFV)を感染多重度(MOI)３で感染させた。初期のSupsを採集するた めに、感染単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で３回洗浄し、次いで感染の４時 間後に採集した血清フリー培地を補給した（Ｅ）。後期のSupsを、その単層をPB S で３回洗浄し、感染の４時間後に血清フリー培地を補給することによって調製 し、次いで、これらのSupsを感染の18時間後に採集した（Ｌ）。偽(mock)Supsを ウイルスの不存在下で同様の方法で調製した。SupsをAmicon濃縮器を用いて約15 倍に濃縮した。製造業者のプロトコルに従って、ヨードビーズ(iodobeads)(Pier ce)を用いてヒトケモカインIL-8、RANTES、及び MIP- βを¹²⁵Ｉで標識した。 ゲル移動度変位アッセイは以下のようにして行った：ヨウ素化リガンド５μl をSUP 10μl と混合し、室温で２時間静置した。次いで化学架橋試薬1-エチル-3 -(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)(100mM リン酸カリウム溶液 に200mM で溶かしたもの、pH7.5)2μl を15分間かけて添加し、さらに２μl を1 5分間かけて添加した。次いで、トリス-HCl(1.0M、pH7.5)2μl を添加すること によって反応を止めた。得られた混合物をSDS-PAGE及びオートラジオグラフィー を用いて分析した。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。 図１Ｂには、ヨウ素化 MIP-1βを偽、MYX 又はエクトロメリア(ECT)Sups と反 応させたこと以外は図１Ａに記載したのと同様の実験を示す。このデータは、シ ョープ繊維腫ウイルス(SFV)又は粘液腫(MYX)が感染した細胞が、約50kDの架橋化 学種（矢印で指したもの）を作り出す新規タンパク質を分泌するということを示 しており、そして12kDのリガンドに結合した未知の化学種は約38kDであるという ことを示すものである。重要なことに、その新規複合体は、偽感染対照細胞、又 はワクシニアウイルス(VV)、SFV のものとは異なる属（オルトポックスウイル ス属）のポックスウイルス又は粘液腫（レポリポックスウイルス属）に感染した 細胞由来の上清中には検出されない。 図２には¹²⁵Ｉ-RANTES を競合相手とともに用いるゲル移動度変位アッセイを 示す。ヨウ素化RANTESを０、１、10及び 100倍モル過剰の非標識ヒトRANTES、MI P-1β、MIP-1α、IL-8又はMCAFと混合した。次いで、この混合物を図１Ａに記載 したようにして偽又は粘液腫初期Supsと反応させて、SDS-PAGE及びオートラジオ グラフィーを用いて分析した。この図は、RANTESとの自己競合(self competitio n)並びに MIP-1β、MIP-1α、IL-8及びMCAFとの交差競合(cross competition)を 示している。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。 図３Ａにおいては、ヨウ素化 MIP-1βを０、１、10及び 100倍モル過剰の非標 識ヒト MIP-1β、IFNγ、MCAF、MIP-1α、RANTES、又はIL-8と混合した。次いで 、この混合物を図１Ａに記載したようにして偽又は粘液腫初期Supsと反応させて 、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。この図は、MIP-1β との自己競合、並びに IFNγ、MCAF、MIP-1α、RANTES、及びIL-8との交差競合 を示している。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。 図３Ｂにおいては、ヨウ素化 MIP-1βを、偽、MYX、雌ウシポックスウイルス( CPV)、ウサギポックスウイルス(RPV)、ECT、SFV、又はVV由来のSupsto混合して 、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。矢印はシフトした複 合体及び遊離のリガンドを指し示すものである。 図４においては、ヨウ素化IL-8を０、１、10及び 100倍モル過剰の非標識ヒト MIP-1β、MIP-1α、MCAF、又は IFNγと混合した。次いで、この混合物を図１ Ａに記載したようにして偽又は粘液腫初期Supsと反応させて、SDS-PAGE及びオー トラジオグラフィーを用いて分析した。この図は、IL-8との自己競合、並びに M IP-1α、MCAF、及び IFNγとの交差競合を示している。矢印はシフトした複合体 を指し示すものである。 図２に示したように、リガンドとして¹²⁵Ｉ標識RANTESを用いた場合、結合はR ANTEd、MIP-1β、MIP-1α及びMCP-1 を含むが、IL-8を含まない種々のコールド( cold)ケモカイン競合相手と競合することができた。同様に、¹²⁵Ｉ-MIP-1βを標 識リガンドとして用いた場合、非標識 MIP-1β、MCAF、MIP-1α及びRANTES との競合が観察されたが、IL-8又はヒト IFNγとの競合は観察されなかった（図 ３）。しかしながら、標識IL-8をリガンドとして用いた場合、コールドIL-8並び に MIP-1α、MIP-1β、MCAFとの競合が観察されたが IFNγとの競合は観察され なかった（図４）。 C-X-C 及びC-C ケモカインがこのような珍しいパターンの交差競合を有すると いうことは興味深いが、それはウイルスタンパク質を有するこれらの種々のヒト ケモカインの様々な親和力定数に関係しているものと考えられる。ウイルス38kD a 分泌タンパク質種に結合しているケモカインの明白な広いスペクトルは、この タンパク質が多くのヒトケモカインの一般化された阻害剤であるということを示 唆するものであり、したがって広範な白血球の化学走性を妨げる。 図５においては、Ｔ７タンパク質(CBP-I)を精製し（実施例３参照）、指示さ れたサイトカインと混合し、架橋し、SDS-PAGEによって分析し、抗Ｔ７抗体との ウェスタンブロッティングによって分析した。試験したサイトカインの中で、ヒ トIL-8及びウサギ IFNγのみがＴ７と高分子複合体を形成し、結合特異性を示し た。 図６においては、全ての３つの主要クラス（ＣＸＣ、ＣＣ及びＣ）由来の代表 的なケモカインのスペクトルを図５に記載されたようにしてＴ７タンパク質(CBP -I)に対する結合について試験した。試験された全てのケモカインが比較できる 結合活性を有するＴ７タンパク質を結合した。 実施例３ ＣＢＰ−Ｉの精製 CBP-I を精製するために、粘液腫感染細胞の分泌タンパク質を濃縮し、MonoQ クロマトグラフィーによって分画し、次いでサイズ濾過クロマトグラフィーによ って分画した。図７には粘液腫ウイルス感染細胞の上清からのCBP-I の均質にな るまでの精製を示す。簡単に言うと、一晩置いた粘液腫ウイルス感染ベビーミド リザル腎(BGMK)細胞から上清を採収し、10,000RPM で１時間遠心分離し、攪拌限 外濾過セル(Amicon)を用いて10倍濃縮した。ウイルスフリーの濃縮粘液腫上清(S ups)を20mMビス- トリスpH6.0(Sigma)中で透析し、精製前に４℃で保存した（レ ーン１）。CBP-I を速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を用いる２ステ ップ精製法によって粘液腫上清から均質になるまで精製した。簡単に言うと、粘 液腫上清５mlを、低イオン強度出発緩衝液(20mMビス-トリスpH6.0)で予備平衡化 したMonoQ HR5/5(Pharmacia)陰イオン交換カラム上に装填した。段階グラジエン ト法において溶離緩衝液(1M NaCl 20mMビス- トリスpH6.0)を500mM NaClまで増 大させることによってタンパク質をカラムから溶離させた。タンパク質画分を集 めてSDS-PAGEによって分離し、銀染色によって分析した。150〜200mM NaClで溶 離されたタンパク質（画分21〜27）の分析によって、約37,000MW（CBP-I）及び ウシ血清アルブミンのサイズに相当する未知の混入タンパク質の顕著なバンドが 現れた（レーン２）。続いて、プールしたMonoQ 画分♯21〜27をHiLoad 16/60 S uperdex 75ゲル濾過カラム(Pharmacia)上に装填し、20mMビス- トリスpH6.0を用 いて流量 0.5ml／分にて溶離した。２カラム床容量と等しい容量に画分を集めて 、SDS-PAGEによって分離し、銀染色によって分析した。Superdex 75 の通過流量 (flow-through volume)から集めた画分♯26〜31には、精製CBP-I に相当する約3 7kDの単一のタンパク質種が現れた（レーン３）。 最終CBP-I 産物（図７）は、CBP-I のグリコシル化不足の(under-glycosylate d)変異体であると思われるより小さい成分(35kDa)と共精製された38kDa のグリ コシル化タンパク質であった。 精製又は部分精製CBP-I １μg を、１μの組換え体ヒトRANTESとともに、又は 組換え体ヒトRANTESなしに室温(RT)で２時間インキュベートした。インキュベー ト後、そのタンパク質にEDC(Sigma)を40mM（最終濃度）になるまで添加すること によって室温で30分間架橋させ、1/10容量の１Ｍトリス(pH7.5)を添加すること によって停止させた。この混合物にSDS 装填緩衝液を添加し、そのサンプルを３ 分間煮沸し、SDS-PAGEにかけ、銀染色によって検出した。精製又は部分精製CBP- I をRANTESとともにインキュベートした場合、銀染色分析によって約47kDの架橋 複合体（CBP-I ＋RANTES）が現れたが（レーン２及び４）、ゲル移動度が変位し た複合体はRANTESが存在しない場合には観察されなかった（レーン１及び３）。 部分精製（すなわちMonoQ 単独）又は完全精製CBP-I をヒトRANTESとともに標 準架橋アッセイで試験した場合、その結合活性がCBP-I 単独によって与えられた 特性であるかどうかを予測したように、CBP-I ／ケモカインの特有の変位した １：１複合体が検出された（図８及び９）。図９には部分精製CBP-I へのヒトRA NTESケモカインの結合を示す。部分精製CBP-I １μg を、組換え体ヒトRANTESな しで（レーン１）、又は組換え体ヒトRANTESの量を増加させながら（レーン２〜 ６）室温で２時間インキュベートした。インキュベート後、そのタンパク質にED C(Sigma)を40mM（最終濃度）になるまで添加することによってRTで30分間架橋さ せ、1/10容量の１Ｍトリス(pH7.5)を添加することによって停止させた。この混 合物にSDS 装填緩衝液を添加し、そのサンプルを３分間煮沸し、SDS-PAGEにかけ 、銀染色によって検出した。CBP-I をRANTESとともにインキュベートした場合、 銀染色によって約47kDの架橋結合複合体（CBP-I ＋RANTES）が現れ（レーン２〜 ６）、この結合は、ケモカインリガンドの量を減少させることによって滴定する ことができる。現れた約66kDの単一の混入バンドは、MonoQ クロマトグラフィー 中にCBP-I とともに共分画されたが、Superdex 75 クロマトグラフィーによって 除去されなかった未知のタンパク質である。 実施例４ ラット大腿動脈内の血管形成用バルーンによる損傷に見られるような抗再狭窄タ ンパク質としてのCBP-I(T-1)の効率の分析 炎症は、動脈壁内の促進されたアテローム硬化プラークと関連している。閉塞 した動脈を開くために設計されたバルーン血管形成術及びその他の関連の血管形 成術用装置の使用後、高い割合でプラーク再発、すなわち再狭窄が存在する。ま た、動脈損傷、ウイルス感染、脈管炎、ホモシスチン尿症、真性糖尿病、高血圧 症、高脂血症、喫煙及び免疫複合体が引き起こした疾患に至る状況下でも促進さ れたアテローム硬化プラークの成長が報告されている。より大きなＤＮＡウイル スは、宿主免疫及び炎症防御機構による減退した阻害を有する宿主中でそのウイ ルスを増殖させる進化した機構、すなわち抗炎症タンパク質を有する。これらの 例は、免疫を基礎とする疾患を治療又は予防する可能性がある抗炎症薬としての ウイルスタンパク質の使用を証明するものである。CBP-I(T-7)を、血管形成術後 のプラーク成長を予防する可能性がある治療薬として試験した。CBP-I はインタ ーフェロンγ受容体相同体及びケモカイン阻害剤として作用するということが報 告されている。CBP-I を損傷誘発性アテローム硬化症の２つの動物モデル（ラッ ト及びウサギ）において試験した。その結果は、注入の４週後にプラーク形成の 有意な減少を示している。 CBP-I 注入後では生理食塩水注入との比較においてプラーク成長における有意 な減少が存在する（図10Ａ〜Ｃ）。ラットモデルにおいては、CBP-I 注入の４週 間後の追跡検査ではプラークの平均面積は 0.005±0.002mm²であり（図10Ｂ、Ｃ ）、プラークの平均厚さは8.33±4.01μm である（図10Ａ）（ｐ＜0.0003）。生 理食塩水注入の場合、４週間後の追跡検査ではプラークの面積は 0.036±0.006m m²であり、プラークの厚さは62±7.35μm である（ｐ＜0.0003）。これはCBP-I 注入の場合、プラークの面積及びプラークの厚さが７倍減少しているということ を示している。プラークの発達の減退は、バルーンによる損傷直前のCBP-I 単独 注入の４週間後の追跡検査で観察された。目に見える損傷は、主に、ラット動脈 損傷モデルに特有の平滑筋細胞増殖性変化からなる（図10）。 ウサギモデルでも、生理食塩水で処理した対照との比較において、プラークの 面積及び厚さが有意に減少していた。４週間後の追跡検査では、CBP-I 注入後の プラークの平均厚さは30±21.6μm であり、生理食塩水注入後は 600±200 μm であった（ｐ＜0.02）。この場合、観察されたプラークはコレステロール補給ウ サギモデルで通常見られた線維及び脂肪泡沫細胞プラークであった（図11）。 損傷誘発性アテローム硬化症の２モデルにおけるウイルス抗炎症タンパク質の 使用の検査（ウサギ及びラット）。両モデルで、組織学的分析においてその後の プラーク形成における有意な減少が検出可能であった。各場合において、タンパ ク質の単独注入がバルーン損傷直後に行われた。 実施例５ シュワルツマン反応 壊死性炎症の典型的な例の一つはシュワルツマン反応であり、この反応は、ま ずリポ多糖(LPS)をウサギの皮膚に導入し、次いで24時間後同じLPS を静脈内投 与するものである。第二のLPS 注射後短時間のうちに、浸潤マクロファージが第 一の注射部位に再現性のある壊死性応答（これは高度に再現性があり、容易に定 量化される）を誘発する。マクロファージ流入及び第一の注入部位での活性化を 阻害するCBP-I の能力が検査された。 LPS を精製T7タンパク質の存在下又は不存在下でウサギの背に皮内注射し、24 時間後、LPS を静脈注射により投与した。皮内注射部位に炎症がすぐに現れ、そ の動物は安楽死した。そのデータを集めた。 損傷は以下のように等級付けられる：直径１〜10mm、わずかに赤色、膨らみ無 し（＋）；直径１〜10mm、赤色、膨らみ１〜２mm（＋＋）；直径10〜15mm、強烈 な赤色、膨らみ２〜３mm（＋＋＋）；直径15mmより大、暗出血性中心を有する強 烈な赤色、膨らみ２〜３mm（＋＋＋＋）。 LPS（100μg）損傷は出血性で膨らみがあるが、LPS(100μg)＋CBP-I(T7)タン パク質(１μg)を注射した皮膚はわずかに赤色で膨らみがあった。LPS 50μgを用 いた場合、CBP-I １μg によりシュワルツマン反応の全ての目に見える徴候が抑 制された。CBP-I を単独で皮内注射し、その後LPS を静脈注射した場合、炎症は 誘発されなかった。ウシ血清アルブミン(1.0μg)をLPS 100 μg とともに注射し 、その後LPS を静脈注射した場合、炎症を抑制することはできなかった。これら の実験（ｎ＝２）は、精製CBP-I タンパク質が局在化したシュワルツマン反応か らウサギを保護することができるということを示している。 T7が IFNγ及びIL-8及びRANTES等のケモカインを結合することが示されたので 、シュワルツマン反応におけるこれらのサイトカインのかかわり合いは興味深い 。 サイトカインIL-12、IFNγ、TNFα(Ozmenら，J．Exp．Med.，180:907-915，1994 )及びIL-8(Harada ら，Int．Immunol.，5:681-690，1993)が関与するシュワルツ マン反応は複雑である。例えば、IFNγ(Billiauら，Euro．J．Immunol.，17:185 1-1854，1987; Heremans，J．Immunol.，138:4175-4179，1987)又はIL-8（上記 のHaradaら）のいずれかに対する中和抗体はシュワルツマン反応を遮断し又は抑 制することは示されている。したがって、ウサギでのシュワルツマン反応におけ るCBP-I の抑制効果は、CBP-I の IFNγもしくはケモカイン又はその両方に結合 する能力によるものであり得る。CBP-I は IFNγに対する化学種特異性を示すが 、ケモカインには結合しないので、これらの実験はこの炎症モデルにおけるT7の IFNγとケモカインとの結合活性を識別するための試みにおいてラットで繰り返 されるであろう。概要： クローニングされ配列決定された粘液腫CBP-I 遺伝子は、公知のケモカイン受 容体の分泌相同体ではなく、全てが７つの膜伸縮進行性(membrane-spanning)ド メイン（「ヘビ状物(serpentine)」と呼ばれる）を保有し、非常に多くの最近の レビューに記載されている(kelvin,D.J.ら，J．Leukocyte Biol.，54:604-612， 1993; Murphy,P.M.，Ann．Rev．Imm.，12:593-633，1994; Horuk，R.，Imm．Tod ay.，15:169-174，1994;及びHoruk,R.，Trends inPharm．Sci.，15:159-165，19 94)。いくつかのＤＮＡウイルスは、ポックスウイルスにおける少なくとも１つ の遺伝子候補(Massung,R.F．ら，Virology，197:511-528，1994)を含む、そのよ うなヘビ状物受容体の相同体をコードする(Ahuja,S.K．ら，Imm．Today，15:281 -287，1994)が、本発明のCBP-I はかかる特定の受容体ファミリーのメンバーで はない。したがって、CBP-I は、恐らく処理された組織におけるケモカインのス ペクトルをモジュレートすることによって作用する新しいクラスの抗炎症タンパ ク質を示すものである。 本発明は目下好ましい態様に関して記載したが、本発明の精神から逸脱するこ となく種々の修飾がなされ得ることは理解されるであろう。したがって、本発明 は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＢＸ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ ＡＣＳ ＡＢＲ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルーカス，アレクサンドラ カナダ国 ティ６エイチ ０エイチ６ ア ルバータ エドモントン，13904−49 ア ベニュー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．被験者の免疫病理学的疾患を治療する方法であって、 約30〜40kDの分子量を有し； 粘液腫Ｔ７インターフェロンγ受容体相同体と相同のアミノ酸配列を有し；か つ、 粘液腫Ｔ７インターフェロンγ受容体相同体の生物学的機能を有する ことを特徴とする抗炎症タンパク質の治療学的に有効な量を被験者に投与するこ とを含む方法。 ２．抗炎症タンパク質がケモカイン結合性タンパク質である、請求項１に記載の 方法。 ３．ケモカインがクラスα又はクラスβケモカインである、請求項２に記載の方 法。 ４．ケモカインがＣＴＡＰ−III、gro/ＭＧＳＡ、ＥＮＡ-78、ＭＣＰ-1、インタ ーロイキン-8、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ-1α、及びＭＩＰ-1βからなる群から選ば れる、請求項３に記載の方法。 ５．免疫病理学的疾患が微生物感染、悪性疾患及び転移、喘息、冠状動脈再狭窄 、自己免疫疾患、肝硬変、内毒素血症、アテローム硬化症、並びに再灌流障害か らなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ６．請求項１に記載の方法であって、さらに被験者に抗生物質又は抗ウイルス薬 を投与することを含む方法。 ７．抗炎症タンパク質の投与が１投与当たり約10pg〜 100μg の用量である、請 求項１に記載の方法。 ８．抗炎症タンパク質の投与が皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与 、直腸内投与及び経皮投与からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ９．約30〜40kDの分子量を有し；粘液腫Ｔ７インターフェロンγ受容体相同体と 相同のアミノ酸を有し；かつ粘液腫Ｔ７インターフェロンγ受容体相同体の生物 学的機能を有する、免疫治療学的に有効な量の抗炎症タンパク質の少なくとも１ つを薬理学的担体中に含む医薬組成物。 10．抗炎症タンパク質がＩ型ケモカイン結合性タンパク質である、請求項９に記 載の組成物。 11．ケモカインがクラスα又はクラスβケモカインである、請求項10に記載の組 成物。 12．ケモカインがＣＴＡＰ−III、gro/ＭＧＳＡ、ＥＮＡ-78、ＭＣＰ-1、インタ ーロイキン-8、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ-1α、及びＭＩＰ-1βからなる群から選ば れる、請求項11に記載の組成物。