CN111303253A - 一种草鱼Fibulin4蛋白结合多肽及其在抗病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种草鱼Fibulin4蛋白结合多肽及其在抗病毒中的应用，特别是其在制备抗草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型(GCRV104)药物中的用途，GCRV104外衣壳蛋白VP55与草鱼蛋白Fibulin4相互作用位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基于该位点合成草鱼Fibulin4蛋白结合多肽的核酸序列如SEQ ID NO：3所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过体外细胞水平进行抗病毒实验验证合成多肽用于防治草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型的可靠性，不仅对于GCRV104与草鱼蛋白互作机制研究提供重要参考，同时对于水产防治GCRV104的应用方面具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种草鱼Fibulin4蛋白结合多肽及其在制备抗草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型药物中的用途。
背景技术
草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型(Grass carp reovirus 104，GCRV104)是引起草鱼出血病的一种高致病性病毒，每年对我国的草鱼养殖业造成巨大的经济损失。目前，对草鱼出血病的防控主要采取接种疫苗、使用广谱抗病毒药物、降低养殖密度以及减少感染几率等方法，但是这些方法要么成本较高，操作难度大，要么防控效果不理想，因此，我国草鱼养殖业中仍缺乏防治草鱼出血病经济、有效的手段。
现有技术中，已知GCRV病毒Ⅱ型外衣壳蛋白VP56和GCRV病毒Ⅲ型外衣壳蛋白VP55均能与草鱼Fibulin4蛋白相互作用，但其相互作用的具体位点尚未可知，鉴定并筛选出GCRV病毒Ⅲ型外衣壳蛋白VP55与草鱼Fibulin4 蛋白互作位点对防控草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型的研究具有重要意义。
发明内容
本发明通过噬菌体展示技术首次筛选得到草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型 (GCRV104)外衣壳蛋白VP55与草鱼蛋白Fibulin4相互作用位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种草鱼Fibulin4蛋白结合多肽，其基于上述GCRV104外衣壳蛋白VP55与草鱼Fibulin4蛋白相互作用位点人工合成得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供上述草鱼Fibulin4蛋白结合多肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型药物中的用途，以该多肽为活性成分，且其一次性给药剂量不低于2.5uM。
进一步地，所述的给药方式为注射。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述任一草鱼Fibulin4蛋白结合多肽作为活性成分，还包括药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述药物组合物的给药方式为注射，且其一次性给药浓度不低于2.5uM。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过噬菌体展示技术首次筛选得到GCRV病毒Ⅲ型外衣壳蛋白 VP55与草鱼Fibulin4蛋白相互作用位点，方便、快捷、可靠。
2.本发明通过体外细胞水平进行抗病毒实验验证合成多肽用于防治草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型(GCRV104)的可靠性，其一次性给药浓度大于2.5uM时即可有效降低病毒感染效率，且随着浓度增加，GCRV104病毒感染效率显著下降，不仅对于GCRV104与草鱼蛋白互作机制研究提供重要参考，同时对于水产防治GCRV104的应用方面具有重要价值。
附图说明
图1是噬菌体展示技术筛选原理示意图。
图2是GST-VP55的原核表达及纯化。
图3是噬菌体展示技术筛选效果，从左至右依次为第一轮、第二轮和第三轮筛选。
图4是本发明中多肽在GCRV104病毒上的体外抗病毒WB检测。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提到的“噬菌体展示技术”(如图1所示)，是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
本发明提到的“位点”(Locus：Loci as pl)是染色体上一个基因或者标记的位置，有时特指DNA上有表达功能的部分。
本发明提到的“多肽”是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物，通常由10～100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000。多肽普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。
实施例1
GCRV病毒Ⅲ型外衣壳蛋白VP55的原核表达及纯化，其步骤具体如下： (1)从感染GCRV的CIK细胞中获取目的基因，酶切，与PGEX载体重连，转化到DH5α感受态大肠杆菌，提取质粒测序，获得GST-VP55重组质粒；(2) 将上述GST-VP55重组质粒转化到BL21感受态细胞，涂板(Amp抗性培养基)，挑单克隆菌落到1mL培养基摇3h，转到100mL培养基扩增5h(抗性培养基)，制样(未诱导)，加IPTG诱导剂(1：1000)低温诱导过夜，再制样(诱导)，Pbs洗一次，Pbs重悬，加PSFM超声破碎至澄清，离心(8000rpm， 20min)取上清制样；(3)使用GST蛋白纯化试剂盒纯化GST-VP55，跑 SDS-Page胶检测纯化效果，得到纯化GST-VP55蛋白，如图2所示。
实施例2
噬菌体展示技术筛选与VP55相互作用的多肽序列，其步骤具体如下：
(1)准备100ug/mL实施例1中纯化好的GST-VP55蛋白溶液(溶于0.1M pH＝8.6的NaHCO3)作为靶蛋白，每孔加1mL(6孔板)，反复旋转至表面完全湿润，在湿盒中4℃包被过夜。
(2)倒掉孔板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以去除残余包被液，加满封闭液，4℃封闭至少1h；重复上述操作去除封闭液，再用TBST (TBS+0.1％Tween-20)缓冲液快速洗板6次。
(3)用1mLTBST缓冲液稀释10uL噬菌体原始文库，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动1h，再倾倒除去未结合的噬菌体，倒置在干净的纸巾上拍甩除去残余液体；重复步骤(2)中洗板操作，用TBST洗板10次，每次换干净的纸巾避免交叉污染。
(4)加入1mL100ug/mL的GST-vp55蛋白溶液将上述结合的噬菌体竞争性地洗脱下来，室温温和摇动1h，收集噬菌体洗脱液，测定噬菌体滴度。
(5)将第一轮筛选的噬菌体洗脱液按1：100的比例与宿主菌扩增，然后进行纯化和浓缩，再将扩增后浓缩的噬菌体液做第二轮筛选的文库，按步骤(1) 至(4)重复第二轮筛选，其中TBST缓冲液的Tween浓度增加至0.5％，第二轮筛选完成每轮挑20个噬菌斑进行测序，再重复上述操作进行第三轮筛选，挑选20个噬菌斑进行测序，结果如表1和2所示，噬菌斑如图3所示。
表1
| 淘选轮数 | 投入滴度 | 洗脱后滴度 | 回收率 |
| 第一轮 | 1ⅹ10^12 | 2.1ⅹ10^5 | 2.1ⅹ10^-7 |
| 第二轮 | 2.4ⅹ10^10 | 1.6ⅹ10^5 | 6.7ⅹ10^-6 |
| 第三轮 | 1.8ⅹ10^11 | 2.8ⅹ10^7 | 1.6ⅹ10^-4 |
表2
| 第三轮筛选序列 | 氨基酸序列 |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| AATCCTCATTGTATGAAGTGTAATTGGAATGTGAGG | NPHCMKCNWNVR |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| TTTCCTATGACTTAGATGTCTACTTTGAATAGTGGG | FPMTQMSTLNSG |
| GGTAATTGGGGTGTTAAGCATTATGTGAGTAATCTG | GNWGVKHYVSNL |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| GATAGGCAGGGGG...GGTATAGGGTTAGTAGGGAG | DRQGGYRVSRE |
| AAGGTTGTGGGGTCTGGTTATGTGGGTCATAGGACT | KVVGSGYVGHRT |
| AGTAGTGAGACGATGTGGCATTTGGGTTATTATCCG | SSETMWHLGYYP |
| GGGGATGAGCGGATTGTTAGGACGTTGTCTCATAAT | GDERIVRTLSHN |
| AGTAGTGAGACGATGTGGCATTTGGGTTATTATCCG | SSETMWHLGYYP |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
| TCGCATTATCAGGGGAATCATGTTGATAATAAGTTG | SHYQGNHVDNKL |
| GGTAATTGGGGTGTTAAGCATTATGTGAGTAATCTG | GNWGVKHYVSNL |
| TCGCATTATCAGGGGAATCATGTTGATAATAAGTTG | SHYQGNHVDNKL |
| AGTAGTGAGACGATGTGGCATGTGGGTTATTATCCG | SSETMWHLGYYP |
| TCGCATTATCAGGGGAATCATGTTGATAATAAGTTG | SHYQGNHVDNKL |
| TTTAAGCAGGATGCGTGGGAGGCTGTTGATATTCGT | FKQDAWEAVDIR |
(6)将上述每一个噬菌斑测序结果中的随机突变区序列汇总到Excel表格，按照NEB公司的随机12肽库精简遗传密码表将序列翻译成氨基酸多肽，然后与草鱼的蛋白文库进行Blast，结果发现DNKL四个氨基酸位点与草鱼蛋白 Fibulin4完全一致，进一步分析得出GCRVⅢ型病毒外衣壳蛋白VP55与草鱼蛋白Fibulin4相互作用位点，其氨基酸序列为DNKL，同时得到与序列相似度较高的草鱼Fibulin4蛋白结合多肽，其氨基酸序列为SHYQGNHVDNKL。
实施例3
按照核酸序列为TCGCATTATCAGGGGAATCATGTTGATAATAAGTTG (SEQ ID NO:3)、其编码的氨基酸序列为SHYQGNHVDNKL(SEQ ID NO:2) 合成草鱼Fibulin4蛋白结合多肽。
实施例4
通过细胞水平感染阻断实验WB验证抗病毒效果，具体是在CIK细胞上进行体外抗草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型实验，操作步骤如下：
①将状态良好的CIK细胞传到6孔板，长到细胞面积大于孔板面积95％后备用。
②将实施例3合成的多肽用DMSO溶解成1mM的母液，用M199培养基分别稀释到2.5uM、5uM、10uM、20uM备用。
③将6孔板设置成Mock、DMSO、2.5uM、5uM、10uM、20uM 6个组，用GCRV104病毒感染除Mock组以外的剩余5个组(MOI＝1)，孵育1小时后吸出上清，分别加入不同浓度的多肽培养液，Mock组不进行其他处理，只更换相同体积的M199培养液，溶剂对照组加入和2.5uM组相同剂量的 DMSO。置于28度细胞培养箱培养72h，取样，经过SDS-Page胶检测不同浓度的多肽对病毒感染效率的影响，结果如图4所示。
由图4可以看出，合成多肽的一次性给药浓度大于2.5uM时，可以有效降低病毒感染效率，且随着浓度增加，GCRV104病毒感染效率显著下降。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种草鱼Fibulin4蛋白结合多肽及其在抗病毒中的应用
<141> 2020-02-21
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Asp Asn Lys Leu
1
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser His Tyr Gln Gly Asn His Val Asp Asn Lys Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgcattatc aggggaatca tgttgataat aagttg 36
Claims (7)
1.草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型(GCRV104)外衣壳蛋白VP55与草鱼蛋白Fibulin4相互作用位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种草鱼Fibulin4蛋白结合多肽，其特征在于，所述多肽基于权利要求1所述的GCRV104外衣壳蛋白VP55与草鱼蛋白Fibulin4相互作用位点人工合成得到，且其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求2所述的草鱼Fibulin4蛋白结合多肽在制备抗草鱼呼肠孤病毒Ⅲ型药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，以权利要求2所述的草鱼Fibulin4蛋白结合多肽为活性成分，且其一次性给药浓度不低于2.5uM。
5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述的给药方式为注射。
6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求2所述的草鱼Fibulin4蛋白结合多肽作为活性成分，还包括药学上可接受的赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为注射，且其一次性给药浓度不低于2.5uM。
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