CN116130025A

CN116130025A - 一种致病弧菌Pir B毒力蛋白结合肽P2及其应用

Info

Publication number: CN116130025A
Application number: CN202211599098.8A
Authority: CN
Inventors: 张鑫; 陈廷; 任春华; 罗鹏; 张吕平; 王艳红; 江晓; 胡超群
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-05-16

Abstract

本发明公开了一种致病弧菌Pir B毒力蛋白结合肽P2及其应用。与Pir B毒力蛋白有高亲和力的小分子结合肽P2，氨基酸序列为LGSPLLTYGRPQ。本发明通过噬菌体展示技术从随机肽库中筛选到与致病弧菌Pir B毒力蛋白具有高亲和力的结合肽，化学合成该结合肽，该结合肽注射后可有效提高对虾感染弧菌后的存活率，对对虾养殖有显著的保护效果。该结合肽能够高效结合致病弧菌PirB毒力蛋白，有效降低Pir B蛋白的毒力；此外该方法可有效降低对虾健康养殖中抗生素的使用，减少耐药菌株的产生，在对虾AHPND的防治中具有很好的应用前景。

Description

一种致病弧菌Pir B毒力蛋白结合肽P2及其应用

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体的说是一种致病弧菌Pir B毒力蛋白结合肽P2及其在制备对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)防治药物中的应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，俗称南美白对虾，又叫太平洋白虾，原产于热带东太平洋沿岸海域，是世界和我国养殖产量第一的养殖对虾种类。根据《2021年中国渔业年鉴》统计，2020年我国凡纳滨对虾养殖年产量186万多吨，在满足人民优质蛋白食品需求方面具有重大作用。

随着凡纳滨对虾养殖产业规模的不断扩大，养殖环境和养殖模式日益多样化，凡纳滨对虾养殖病害的暴发也愈加频繁。弧菌病是对虾养殖过程中最为常见、危害最大的细菌性疾病。凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病，早期也被称为“早死综合征”(EMS)。根据全球水产养殖联盟估计，每年由AHPND导致的经济损失达10亿美元，然而目前仍然没有有效的防控手段去遏制AHPND的暴发。

凡纳滨对虾AHPND致病副溶血弧菌分泌的毒力蛋白Pir AB会与凡纳滨对虾肝胰腺细胞上的受体蛋白进行特异性的结合，造成细胞的脱落，继而引发肝胰腺组织的急性坏死，最终导致对虾的死亡。通过对毒力蛋白Pir AB的蛋白结构进行分析发现，Pir B蛋白包含孔结构域Ⅰ和受体结合结构域Ⅱ。针对弧菌毒力蛋白Pir B设计Pir B蛋白结合肽用于阻断其与机体受体蛋白的结合，可缓解Pir AB对肝胰腺靶细胞的毒性，进而降低致病感弧菌染后的死亡率。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种致病弧菌Pir B毒力蛋白结合肽P2，该蛋白结合肽P2能够特异性的结合致病弧菌Pir B毒力蛋白，降低对虾感染弧菌后的死亡率，可应用于对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的防治。

本发明人根据已经报道的致病弧菌毒力蛋白Pir B的基因序列，原核外源表达PirB毒力蛋白；然后将原核表达的蛋白进行纯化、变性、复性等过程，获得具有活性的Pir B毒力蛋白；以纯化后的Pir B毒力蛋白为靶标，利用噬菌体展示技术从随机12肽库中筛选能与Pir B毒力蛋白有高亲和力的小分子结合肽P2，其氨基酸序列为：LGSPLLTYGRPQ。本发明的P2结合肽结构上是全新的，未见任何文献报道。

因此，本发明的第一个目的是提供一种与Pir B毒力蛋白有高亲和力的小分子结合肽P2，其特征在于，氨基酸序列为LGSPLLTYGRPQ。

本发明的第二个目的是提供一种编码小分子结合肽P2的编码基因。

本发明的第三个目的是提供上述小分子结合肽P2或其编码基因在制备抑制弧菌药物中的应用。

优选，所述的弧菌是指不包括但不限于携带能够编码Pir B毒力蛋白基因的弧菌，例如包括哈氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌。

本发明的结合肽P2能够通过化学合成或基因工程重组表达的方法获得。

优选，所述的小分子结合肽可以是表达小分子结合肽P2的载体、含有该载体的工程菌株或细胞系。

优选，小分子结合肽P2或其编码基因在制备对虾急性肝胰腺坏死病防治药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种抑制弧菌或对虾急性肝胰腺坏死病防治药物，其含有小分子结合肽P2、表达小分子结合肽P2的载体、含有该载体的工程菌株或细胞系作为活性成分。

本发明通过噬菌体展示技术从随机肽库中筛选到与致病弧菌Pir B毒力蛋白具有高亲和力的结合肽，化学合成该结合肽，该结合肽注射后可有效提高对虾感染弧菌后的存活率，对对虾养殖有显著的保护效果。该结合肽能够高效结合致病弧菌PirB毒力蛋白，有效降低Pir B蛋白的毒力；此外该方法可有效降低对虾健康养殖中抗生素的使用，减少耐药菌株的产生，在对虾AHPND的防治中具有很好的应用前景。

附图说明：

图1是纯化后的Pir B毒力蛋白SDS-PAGE电泳图；

图2是与Pir B毒力蛋白高亲和力随机结合肽的筛选；

图3是结合肽P2对凡纳滨对虾感染致病弧菌后死亡率的影响。

具体实施方式：

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1

致病弧菌Pir B毒力蛋白的原核表达和纯化

Pir B毒力蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

将测序正确的Pir B毒力蛋白的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)克隆到pet28a质粒上，转化到大肠杆菌BL21菌株进行外源原核表达，超声破碎后经SDS-PAGE检测发现，目的蛋白主要是以包涵体状态存在。然后对包涵体进行纯化、复性以及亲和纯化，最终获得具有活性的Pir B毒力蛋白进行SDS-PAGE检测，复性后的Pir B毒力蛋白分子量大约为64kDa，纯度大于80％。(见附图1)

实施例2

致病弧菌Pir B毒力蛋白结合肽P2的筛选

根据制备的Pir B毒力蛋白，采用ELISA板法从噬菌体12肽随机肽库中淘选Pir B毒力蛋白结合肽。实验步骤如下：将Pir B毒力蛋白包被于ELISA酶标板，4℃包被过夜，包被浓度为2μg/mL；在37℃条件下使用4％ PBSM孵育1小时，将Pir B蛋白封闭；将噬菌体1：1稀释于4％ PBSM，每孔加入100μL，37℃孵育1小时；分别用TBST，PBS洗3遍；将Anti-M13-HRPantibody 1：2000稀释于4％ PBSM，37℃孵育40分钟；然后分别用TBST，PBS洗3遍；每孔加入100uL TMB显色液，显色15分钟；最后使用酶标仪读取每孔在450nm下的吸光值。按照上述过程进行3轮淘选，进行第2轮和3筛选时，每次增加6次洗涤。经过3轮的淘选富集后，感染菌液并挑斑收集单克隆噬菌体上清进行ELISA效价检测，共挑选190个噬菌体单克隆感染菌液；降低Pir B毒力蛋白包板浓度(1μg/mL)，提高筛选标准挑，对筛选到的阳性克隆进行进一步的筛选，共筛选到与目标蛋白有高亲和力，且不识别无关蛋白阳性克隆的11株。(附图2)

选取与Pir B毒力蛋白高亲和力的结合肽P2，并对其进行测序，其氨基酸序列为：LGSPLLTYGRPQ。

实施例3

Pir B毒力蛋白结合肽P2对对虾感染致病弧菌感染后的存活率的影响

为了验证筛选得到的Pir B毒力蛋白结合肽P2在致病弧菌感染过程中的功能，挑选健康状态良好的凡纳滨对虾(约5g/只)于养殖桶内暂养，用于结合肽的功能验证。

人工合成筛选到的结合肽P2(LGSPLLTYGRPQ)，并体外进行肌肉注射；通过观察注射结合肽对凡纳滨对虾感染致病弧菌后的死亡率的影响来验证其功能。试验分为两个组(n＝30)，实验组注射筛选到的结合肽，对照组注射等量的PBS。将合成的结合肽P2溶解到PBS中，调整好浓度，按照10μg/g bwt剂量对凡纳滨对虾进行肌肉注射，注射体积为20μL。注射24小时后，再次肌肉注射致病弧菌(携带编码Pir B毒力蛋白基因的副溶血弧菌致病菌株)，注射剂量为2×10⁶CFU/g bwt，注射体积为20μL。为了排除由两次注射造成死亡的个体，弧菌注射6小时后开始记录每组试验对虾的死亡情况，共记录168小时。相对于阴性对照组(注射PBS，存活率为3.45％)，注射与Pir B毒力蛋白有高亲和力的短肽P2能够大幅提高对虾感染弧菌后的存活率(存活率为40％)，(见附图3)。

SEQ ID No.1-Pir B毒力蛋白的氨基酸序列

MTNEYVVTMSSLTEFNPNNARKSYLFDNYEVDPNYAFKAMVSFGLSNIPYAGGFLSTLWNIFWPNTPNEPDIENIWEQLRDRIQDLVDESIIDAINGILDSKIKETRDKIQDINETIENFGYAAAKDDYIGLVTHYLIGLEENFKRELDGDEWLGYAILPLLATTVSLQITYMACGLDYKDEFGFTDSDVHKLTRNIDKLYDDVSSYITELAAWADNDSYNNANQDNVYDEVMGARSWCTVHGFEHMLIWQKIKELKKVDVFVHSNLISYSPAVGFPSGNFNYIATGTEDEIPQPLKPNMFGERRNRIVKIESWNSIEIHYYNRVGRLKLTYENGEVVELGKAHKYDEHYQSIELNGAYIKYVD VIANGPEAIDRIVFHFSDDRTFVVGENSGKPSVRLQLEGHFICGMLADQEGSDKVAAFSVAYELFHPDEFGTEK

SEQ ID No.2-Pir B毒力蛋白的编码基因的核苷酸序列

ATGACTAACGAATACGTTGTAACAATGTCATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAATGCTCGTAAAAGTTATTTATTTGATAACTATGAAGTTGATCCTAACTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCATTTGGTCTTTCAAATATTCCTTACGCGGGTGGTTTTTTATCAACGTTATGGAATATCTTTTGGCCAAATACGCCAAATGAGCCAGATATTGAAAACATTTGGGAACAATTACGTGACAGAATCCAAGATTTAGTAGATGAATCGATTATAGATGCCATCAATGGAATATTGGATAGCAAAATCAAAGAGACACGCGATAAAATTCAAGACATTAATGAGACTATCGAAAACTTCGGTTATGCTGCGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAATGGCTTGGTTATGCGATATTGCCTCTATTAGCAACAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGCTTGTGGTCTGGATTATAAGGATGAATTCGGTTTCACCGATTCTGATGTGCATAAGCTAACACGTAATATTGATAAGCTTTATGATGATGTATCGTCTTACATTACAGAACTCGCTGCGTGGGCTGATAACGACTCTTACAATAATGCAAACCAAGATAACGTGTATGATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTGTACGGTTCACGGCTTTGAACATATGCTTATTTGGCAAAAAATCAAAGAGTTGAAAAAAGTTGATGTGTTTGTTCACAGTAATTTAATTTCATATTCACCTGCTGTTGGTTTTCCTAGTGGTAATTTCAACTATATTGCTACAGGTACGGAAGATGAAATACCTCAACCATTAAAACCAAATATGTTTGGGGAACGTCGAAATCGTATTGTAAAAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAATACATTATTACAATCGCGTAGGTCGACTTAAACTAACTTA TGAAAATGGGGAAGTGGTAGAACTAGGCAAGGCTCATAAATATGACGAGCATTACCAATCTATTGAGTTAAACGGCGCTTACATTAAATATGTTGATGTTATTGCCAATGGACCTGAAGCAATTGATCGAATCGTATTTCATTTTTCAGATGATCGAACATTTGTTGTTGGTGAAAACTCAGGCAAGCCAAGTGTGCGTTTGCAACTGGAAGGTCATTTTATTTGTGGCATGCTTGCGGATCAAGAAGGTTCTGACAAAGTTGCCGCGTTTAGCGTGGCTTATGAATTGTTTCATCCCGATGAATTTGGTACAGAAAAGTAG

Claims

1.一种与Pir B毒力蛋白有高亲和力的小分子结合肽P2，其特征在于，氨基酸序列为LGSPLLTYGRPQ。

2.一种编码权利要求1所述的小分子结合肽P2的编码基因。

3.权利要求1所述的小分子结合肽P2或其编码基因在制备抑制弧菌药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的弧菌是能够编码毒力蛋白Pir B的致病弧菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的弧菌包括哈氏弧菌、副溶血弧菌。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的结合肽P2能够通过化学合成或基因工程重组表达的方法获得。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的小分子结合肽是表达小分子结合肽P2的载体、含有该载体的工程菌株或细胞系。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，小分子结合肽P2或其编码基因在制备对虾急性肝胰腺坏死病防治药物中的应用。

9.一种抑制弧菌或对虾急性肝胰腺坏死病防治药物，其特征在于，含有权利要求1所述的小分子结合肽P2、表达小分子结合肽P2的载体、含有该载体的工程菌株或细胞系作为活性成分。