CN108395470B

CN108395470B - 具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用

Info

Publication number: CN108395470B
Application number: CN201810022857.1A
Authority: CN
Inventors: 王明连; 张婷; 李劲松; 王群; 杨怡姝; 李劲涛; 王小利
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2038-01-10
Also published as: US20210040153A1; CN108395470A; WO2019137247A1

Abstract

本发明涉及病毒学领域，具体公开了一种具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用。本发明所提供的短肽的氨基酸序列为KHGHHRH，即Lys‑His‑Gly‑His‑His‑Arg‑His。所述短肽具有与NS5高特异性的亲和能力，具有高效抑制登革病毒复制的作用，其抗病毒作用不仅限于DENV‑2，对于1型、3型和4型登革病毒的复制也同样具有显著的抑制作用。在该短肽序列的两端各添加1个半胱氨酸，可通过两端的半胱氨酸将短肽环化，形成环肽。所得到的环肽增强了抑制登革病毒复制的作用，可用于登革病毒感染的特异性治疗。

Description

具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用

技术领域

本发明涉及病毒学领域，具体地说，涉及采用基因工程和噬菌体展示肽库技术获得的具有抑制登革病毒复制作用的短肽。

背景技术

登革病毒(DENV)可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征，广泛流行于热带和亚热带地区，是分布最广、发病最多、危害较大的传染病，在全世界范围内每年约有3.9亿人受感染，近1亿人表现出感染症状，其中大部分为登革热病例，登革出血热病例和登革休克综合症约50多万例，年均因登革病毒感染的死亡数为2万2千多例，以少儿居多(WorldHealth Organization，2009；Bhatt et al.，2013；Guzman and Harris，2015)。登革病毒感染所致的传染病在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲许多国家造成严重危害，在我国也已经从输入性、散发性疾病成为常年均有发生的疾病，在台湾、香港和广东等南部地区常年流行，如2014年仅发生于广州的一次流行就有4万病例。

DENV属黄病毒科黄病毒属，分为四个血清型，分别为DENV 1-4，均可对人类造成致病性，其中DENV 2是传播最广泛的血清型，感染后的重症率及病死率也均高于其他型别。美国德克萨斯大学医学中心的病毒学家Nikos等在近年马来西亚的一次登革热流行后，分离一病毒株，并经全基因组测序发现这是一新型的登革病毒，这种马来登革病毒是否会在人群中持续的传播和流行尚不可知(Normile D.2013.Science.342:415)，是否将其定义为DENV 5尚有待探讨。

DENV以雌蚊为传播媒介，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊。雌蚊叮咬DENV感染者后，病毒在蚊体内增殖，再次叮咬人后引起病毒传播和被叮者感染。人群对任何一型DENV的初次感染均较敏感，感染后获得对同型病毒1-4年的免疫力，而对异型病毒的免疫力则很短暂，只维持2-12个月。因而感染一个型别DENV后还可能发生二次或连续感染，而继发异型病毒感染引起登革出血热和登革休克综合征的发病率和病死率更高。这是由于在继发异型病毒感染中预先存在的交叉抗体能够与病毒结合，通过抗体与靶细胞表面的Fc受体的相互作用促进病毒对包括单核细胞、巨噬细胞以及成熟树突状细胞在内的靶细胞的感染性，进而引起血液浓缩、出血或便血甚至休克等临床症状，登革出血热患者在发热阶段与登革热类似，而在退烧后病人体征出现迅速恶化，并出现出血症状，甚至出现低血容量性休克，病程较短但也较为致命，这种二次感染后的抗体依赖的感染增强作用(Antibody dependentenhancement，ADE)是DENV感染致病性的一个特征，也是病毒疫苗研发的主要障碍。因为如果疫苗不能对所有型别的病毒都产生足够的保护性抗体，将会加重异型病毒的感染。而且，一旦有新的型别病毒出现，疫苗也将可能被废弃。因此，法国药企赛诺菲巴斯德在经过几十年的研发后，推出的全球第一支嵌合的登革热四价疫苗于2016年1月在墨西哥和菲律宾等国获许上市不久，其安全性和保护性就被世界卫生组织和已经使用的几个国家共同警示，特别是在儿童中，接种过该疫苗的儿童患上重症登革热的几率反而高于未曾接种过的儿童(WHO，2017；Aguiar et al.，2016；Flasche et al.，2016；Halstead，2016；Halstead andRussell，2016；Wilder-Smith et al.，2016)，人们刚刚看到的曙光随即黯淡。

目前，对于DENV感染仅限于对症治疗，尚无特异有效的抗病毒药物，根据病毒基因组结构和编码蛋白的功能可望选择有效的抗病毒靶标。DENV是一种有包膜的单正链RNA病毒，呈二十面体结构，病毒体的直径为45-55nm，基因组大小为10.7kb。病毒基因组有感染性，可以直接作为mRNA起始病毒蛋白质的翻译。其基因组编码大约3300个氨基酸，形成一个多聚蛋白前体分子，在病毒和宿主蛋白酶的共同作用下，剪切为3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其基因组5’端1/4的序列编码病毒的结构蛋白，参与病毒与细胞吸附、病毒进入细胞、细胞膜融合以及病毒组装等病毒生命周期的过程，可刺激机体产生保护性抗体，但又是导致ADE效应的主因。3’端3/4的序列编码非结构蛋白(NS)，发挥病毒基因组复制、病毒蛋白翻译后加工和细胞内信号转导等功能。其中NS5是DENV基因组所编码的最大的蛋白(104kD)，也是最具保守性。其主要作用是RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)功能，负责病毒基因组RNA复制。正常的宿主细胞中不存在RdRp的同系物，故其能够用于体外筛选DENV抑制剂；又由于宿主细胞中不存在类似结构的蛋白，所以该蛋白抑制剂将具有较好的病毒特异性。因此，NS5蛋白在近年来已成为抗病毒药物研究的主要靶点。

但由于该蛋白分子较大等原因，其全长表达困难，对其进行功能区片段表达后，则难以形成其特征构象而尚失功能；因此，急需开发一种可表达NS5蛋白全长，形成特征构象的方法，并基于该基础，进一步开发有效的抗病毒药物。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有抑制登革病毒复制作用的短肽。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

鉴于DENV 2是传播最广泛的血清型，感染后的重症率及病死率也均高于其他型别。本发明将DENV-2NS5基因进行密码子优化后，构建了DENV NS5全长表达体系，通过优化诱导条件，获得了DENV NS5全长重组蛋白。然后将重组蛋白纯化后，包被为靶标分子，以噬菌体展示的构象性肽库进行筛选，获得与NS5具有高亲和能力的数个短肽，并对其进行了测序。经细胞染毒实验发现，数个短肽中的1个构象短肽对DENV 2病毒的复制具有明显的抑制，表现出高效的抗病毒作用，且经过对其他血清型的登革病毒进行实验后发现，该短肽的抗病毒作用不仅限于DENV-2，对于1型、3型和4型登革病毒的复制也同样具有显著的抑制作用。

本发明所提供的具有抑制登革病毒复制作用的短肽，其氨基酸序列为KHGHHRH，即Lys-His-Gly-His-His-Arg-His。

所述短肽具有与NS5高特异性的亲和能力，可高效抑制登革病毒的复制，将可用于登革病毒感染的特异性治疗。

进一步地，本发明还提供了所述短肽在制备治疗登革病毒感染药物中的应用，以及所述短肽在制备抑制登革病毒复制药物中的应用。

需要说明的是，含有本发明所述短肽的药物组合物也属于本发明的保护范围。

可选地，所述短肽可经环化处理形成环肽。例如，可在短肽两端合成半胱氨酸用以将该短肽环化，或通过七肽序列中间侧链羧基和N端氨基形成酰胺键环，侧链氨基和C端羧基形成酰胺环，七肽分子首尾酰胺成环等方式将短肽环化。所得到的环肽具有高效抑制登革病毒复制的作用，将可用于登革病毒感染的特异性治疗。

不仅如此，本发明还发现所述短肽中的三肽、四肽、五肽或六肽片段，如KHG、HGH、GHH、HHR、HRH、KHGH、HGHH、GHHR、HHRH、KHGHH、HGHHR、GHHRH、KHGHHR、HGHHRH也与NS5具有高特异性的亲和能力，

进一步地，本发明还提供了上述三肽、四肽、五肽或六肽片段在制备治疗登革病毒感染药物以及抑制登革病毒复制药物中的应用。

不仅如此，含有上述三肽、四肽、五肽或六肽片段的药物组合物也属于本发明的保护范围。

本发明所述的短肽，通过以下步骤筛选获得：

1、DENV NS5基因的密码子优化

DENV NS5基因序列来自NCBI GenBank(Accession number：AF038403.1)，采用MaxCodonTM Optimization Program for expression in E.coli程序对密码子进行优化。

在优化后序列的5’端添加Nde I酶切位点(5’-CATATG-3’)，3’端添加编码6个组氨酸的编码序列(见粗体字母)和Hind III酶切位点序列(5’-AAGCTT-3’)，委托德泰生物(南京)科技公司代为合成如下序列(下划线为酶切位点，前面的数字为后续插入质粒载体后的核苷酸序号)：

该序列所编码的蛋白(分子质量104204.4，pI值为8.75)的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

2、构建DENV-2NS5全长表达载体

将1μg步骤1合成的DNA片段加入到酶切缓冲液中，以Nde I和Hind III内切酶各1U，16度过夜酶切；在另一试管中以Nde I和Hind III酶切PET 30a质粒。分别纯化酶切片段后，将两个酶切反应产物进行连接反应，即构建表达质粒PET 30a/NS5，转化E.coli Top 10感受态中扩增质粒，测序确认基因插入正确后转化表达菌株E.coli BL 21(DE3)。

3、DENV NS5在大肠杆菌中的表达

挑取E.coli BL 21(DE3)/PET 30a/NS5菌落接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，过夜培养后加入IPTG诱导4小时，收集细菌并超声裂解，离心后分别取菌体碎片沉淀(经Tris碱和尿素处理后)、上清液、上清经过Ni-IDA纯化柱后流出液和咪唑洗脱液，进行SDS-PAGE电泳，验证NS5蛋白表达和表达产物的溶解性。图1电泳图表明NS5主要表达于细菌包涵体中。

确定NS5的表达后，挑E.coli BL 21(DE3)/PET 30a/NS5单菌落于5mL含有卡那霉素的LB培养基中过夜培养，次日转入1L含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，置于摇床37℃培养至菌液浊度A600>0.6后，加入IPTG至终浓度0.5mM进行低温诱导，15℃过夜培养后，于10000g、4℃条件下离心15min收集菌体，将菌体沉淀重悬于含1％Triton X-100，1μg/mL抑胃酶肽A，1μg/mL亮抑酶肽，150mM NaCl，pH7.2的溶液中，冰浴。

4、DENV NS5重组蛋白的纯化和复性

将菌体悬液冰浴中超声破碎，之后12，000g、4℃离心1小时，留沉淀。将沉淀用含有1％Triton X-100，5mM EDTA，2mM DTT的50mM Tris(pH 8.0)，150mM NaCl溶液洗涤，去净洗涤液后，将沉淀溶于20mM Tris(pH 8.0)，150mM NaCl，8M尿素，20mM咪唑缓冲液中。Ni-IDA琼脂糖纯化柱以平衡液过柱后，将溶解后的蛋白溶液缓慢上柱，顺次以50mM和100mM咪唑洗脱液过柱洗去非特异蛋白，用500mM咪唑洗脱液将重组目的蛋白洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液。

将所收集的纯化蛋白转入透析袋中，置于成分为PBS(pH 7.4)，2mM EDTA，4mMGSH，0.4mM GSSG，0.4M L-精氨酸，2M尿素的缓冲液中透析，之后在含10％甘油的PBS(pH7.4)中进一步透析6-8小时。将复性后的目的蛋白溶液经0.45μm滤膜过滤除菌后，测定浓度后，-20℃冻存。

5、从噬菌体展示肽库中筛选NS5蛋白的结合肽

筛选所用的构象型肽库为M13噬菌体展示的随机环7肽库，购于美国NEW ENGLANDBioLabs公司。

1)将蛋白液用0.1M NaHCO₃稀释至100μg/mL。每次取0.7mL蛋白液滴加入

聚乙烯培养皿内，平缓摇动将平皿浸透后置于4℃过夜包被。吸弃包被液，加入2mL封闭液，于4℃放置2h；弃封闭液并拍干，用TBST(TBS+0.1％[V/V]Tween-20)洗板6次，每次均拍干。

2)取噬菌体(第一轮筛选自试剂盒取10μL噬菌体贮存液，约2×10¹¹个噬菌体粒子；以后各轮加入至少含10⁹个噬菌体粒子的扩增纯化液)混于0.4mL TBST中，滴加入平皿，室温缓摇50min；吸弃未结合的噬菌体并于洁净纸巾上拍干，用TBST洗平皿10次；向培养皿中加入0.4mL 0.2mol/L GlycineHCl(pH 2.2，在1mg/mL BSA中)，缓摇5min后吸入一离心管中，迅速加入60μL 1mol/L TrisHCl(pH 9.1)中和，此即洗脱的噬菌体。

3)将洗脱的噬菌体加入10mL宿主菌Tet-LB培养液(OD₆₀₀～0.5)中再扩增，培养5小时后收集培养液将噬菌体纯化，测定滴度后用于下一轮筛选。从第5轮洗脱后用于测定滴度的平板上挑取50个蓝斑分别于1mL新鲜ER2738菌液中扩增。

6、特异结合肽序列的确定

将前述扩增的30个噬菌体克隆纯化、制备单链DNA测序模板，用-96gIII测序引物(5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′)测序，测定PIII蛋白基因中的插入序列。所测得的30个克隆的插入核苷酸片段翻译为氨基酸序列，发现最后一轮洗脱的噬菌体展示肽的氨基酸序列具有共性，其中15个克隆的氨基酸序列完全相同，均为KHGHHRH，即Lys-His-Gly-His-His-Arg-His。

委托德泰生物(南京)公司合成此序列的环化肽，配制成1g/L的母液，按浓度梯度加入新感染登革病毒感染的细胞中，逐日观察细胞变化，发现本合成肽对于病毒感染细胞具有显著的保护作用，该保护作用呈剂量效应关系。

本发明的有益效果在于：

本发明通过采用基因工程和噬菌体展示肽库技术，得到登革病毒NS5全长蛋白，并借此筛选获得一种对多型登革病毒均具有抑制登革病毒复制作用的短肽，为登革病毒的治疗提供了新的途径，有效避免了仅针对一型病毒有效，而易产生或加重异型病毒的感染问题。

附图说明

图1为本发明所述登革病毒NS5蛋白全长表达的SDS-PAGE电泳图，SDS-PAGE电泳图表明NS5主要表达于细菌包涵体；其中，M：蛋白分子量标准；1：细菌裂解离心后沉淀；2：细菌裂解离心后上清；3：上清经过Ni-IDA纯化柱后流出液；4:上清过纯化柱后50mM咪唑洗出液；5-6：上清过纯化柱后100mM咪唑洗出液；7:上清过纯化柱后500mM咪唑洗出液(4-7分别为上清过Ni-IDA纯化柱后经过50mM、100mM、100mM和500mM咪唑梯度洗出液)。

图2为登革病毒NS5蛋白(104kDa)重组表达产物的Westernblotting鉴定；其中，M：蛋白分子量标准；1：表达菌株全菌裂解液上清；2：表达菌株全菌裂解液沉淀；3：包涵体溶液。

图3为实施例中的合成环肽对病毒感染细胞的保护作用；其中，1：未加本合成环肽的细胞；2：加入低浓度本合成肽的细胞；3：加入高浓度本合成肽的染毒细胞；4：未染毒对照细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述合成肽的制备与功能研究。

1、该短肽可以通过构建表达载体通过基因重组表达的方法合成，密码子序列为AAG AAT ACT CTT CAT ACG TTT或AAG CAT GGT CAT CAT CGT CAT，这也是在噬菌体肽库筛选是测序获得的核苷酸序列。或者通过化学方法合成序列为CKHGHHRHC的9肽，两端的半胱氨酸用以将该短肽环化。

2、将合成的肽干粉用DMEM细胞培养基稀释至1g/L浓度。将冻存病毒扩增培养，备好500倍TCID50/mL的登革病毒悬液。

3、在微孔板上28℃培养C6/36细胞，至细胞密度达70％左右时，吸弃微孔板上的原培养液。向培养板第1排每孔加入100μL DMEM细胞生长维持液，为不染毒不加肽的对照细胞；第2排每孔加25μL肽溶液，第3排每孔加入50μL肽溶液，为加肽的未染毒细胞对照；第4～8排每孔均加入25μL病毒液，将细胞培养板置孵箱1h使病毒吸附细胞。第4排不加肽溶液，第5-8排每排分别加肽溶液5μL/孔、10μL/孔、20μL/孔和40μL/孔，将培养体系液体总量不足100μL的孔用培养液补至100μL，将培养板置二氧化碳孵箱培养。

4、观察细胞病变4天，记录各排病变的细胞孔数目和病变程度。细胞病变程度划分为：0，无细胞病变；I，0-25％的细胞发生病变；II，25-50％的细胞发生病变；III，50-75％的细胞发生病变；IV，75-100％的细胞发生病变。

结果显示，第1-3排的36个培养孔细胞生长均良好；未加合成肽的第4排12个孔的细胞全部发生病变，其中9个孔病变程度为IV，3个孔为III；加肽溶液5μL/孔的第5排12个孔细胞均发生了病变，程度为II-III；加肽溶液10μL/孔的第6排细胞有9个孔出现病变，程度为I-II；加肽溶液20μL/孔的第7排细胞有6个孔出现病变，程度为I-II；加肽溶液40μL/孔的第8排细胞只有3个孔出现病变，程度为I，继续培养发现趋于恢复正常。

上述细胞实验表明，本发明所述的合成肽在高浓度下对细胞生长无不良影响；该合成肽对于病毒感染细胞具有显著的保护作用，该保护作用呈剂量效应关系。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京工业大学

<120> 具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用

<141> 2017-12-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys His Gly His His Arg His

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Lys His Gly His His Arg His Cys

1 5

<210> 3

<211> 2767

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatggg taccggtaat attggcgaaa 60

ccctgggcga aaagtggaaa atccgcctga acgcactggg caaaagcgag ttccagatct 120

acaagaagag cggtattcag gaagttgatc gtaccctggc gaaagaaggc attaaacgcg 180

gcgaaaccga tcatcacgca gttagtcgcg gtagcgcaaa actgcgttgg tttgtcgagc 240

gcaacatggt taccccggaa ggcaaagttg ttgatctggg ttgcggtcgc ggcggttggt 300

cttattattg cggtggcctg aaaaacgttc gcgaagttaa aggtctgacc aaaggcggtc 360

cgggtcacga agaaccgatt ccgatgagta cctacggttg gaatctggtt cgtctgcagt 420

ctggcgttga cgttttcttt accccgccgg aaaaatgcga taccctgctg tgcgatattg 480

gcgaaagtag tccgaatccg accgttgaag caggtcgtac cctgcgcgtt ctgaatctgg 540

ttgaaaactg gctgaacaac aacacccagt tctgcatcaa ggttctgaac ccgtatatgc 600

cgagcgttat cgagaagatg gagaccctgc aacgcaaata cggtggtgca ctggttggta 660

atccgctgag tcgtaactcc acccacgaaa tgtactgggt tagcaacgcg agcggcaata 720

ttgtttcctc cgtcaacatg atctcccgca tgctgatcaa ccgctttacc atgcgccata 780

agaaagcgac ctacgaaccg gacgttgatc tgggttctgg tacccgtaac attggcatcg 840

aaagcgaaat cccgaatctg gatatcatcg gcaaacgcat cgagaaatca agcaggagca 900

cgaaaccagt tggcattacg atcaggacca tccgtacaaa acctgggcat atcacggcag 960

ctacgaaacc aaacagaccg gttctgcaag cagtatggtt aacggcgttg ttcgtctgct 1020

gaccaaaccg tgggacgttg ttccgatggt tacccaaatg gcaatgaccg ataccacccc 1080

gtttggtcag cagcgcgttt tcaaagagaa ggtcgatacc cgtacccaag aaccgaaaga 1140

aggcaccaag aagctgatga agatcaccgc tgagtggctg tggaaagaac tgggcaagaa 1200

gaaaaccccg cgtatgtgta cccgcgaaga attcacccgt aaagttcgta gtaacgctgc 1260

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tagtcgtttc tgggagctgg tcgacaaaga acgtaacctg catctggaag gtaagtgcga 1380

aacctgcgtc tacaacatga tgggcaaacg cgagaagaaa ctgggcgaat ttggcaaagc 1440

gaaaggcagt cgcgctattt ggtatatgtg gctgggcgca cgttttctgg aatttgaagc 1500

actgggcttc ctgaacgaag atcactggtt tagccgcgaa aacagtctgt ctggcgttga 1560

aggcgaaggt ctgtataaac tgggctatat cctgcgcgat gtcagcaaaa aagaaggcgg 1620

cgcaatgtat gcagacgata ccgcaggttg ggatacccgt attaccctgg aagacctgaa 1680

gaacgaagaa atggtcacca accacatgga aggcgaacac aagaaactgg cggaagcgat 1740

cttcaagctg acctaccaga acaaagtcgt tcgcgttcaa cgtccgaccc cgcgcggtac 1800

cgttatggat attattagcc gtcgcgatca acgcggttct ggtcaagttg gtacctacgg 1860

tctgaacacc ttcaccaaca tggaagcgca gctgattcgt cagatggaag gcgaaggcgt 1920

attcaaaagc atccagcatc tgaccgttac cgaagaaatt gcggttcaaa attggctggc 1980

acgcgttcgt cgcgaacgtc tgtctcgtat ggcaatttct ggcgacgatt gcgtagttaa 2040

accgctggat gatcgttttg catctgcact gaccgctctg aacgatatgg gcaaagtccg 2100

caaagacatt caacagtggg aaccgagtcg cggttggaac gattggaccc aagttccgtt 2160

ttgcagccat cacttccacg agctgatcat gaaagacggt cgcgttctgg tagttccgtg 2220

tcgtaatcaa gacgaactga ttggtcgcgc acgtatttct caaggcgcag gttggtcact 2280

gcgcgaaacc gcttgtctgg gtaaatctta cgcacagatg tggagcctga tgtactttca 2340

tcgtcgcgat ctgcgtctgg cagcaaacgc gatttgttct gcagttccga gtcattgggt 2400

tccgaccagt cgtaccacct ggagtattca cgccaaacac gagtggatga ccaccgaaga 2460

tatgctgacc gtatggaacc gcgtttggat ccaagaaaac ccgtggatgg aagacaaaac 2520

cccggttgaa agctgggaag aaatcccgta tctgggtaaa cgcgaagatc agtggtgcgg 2580

tagtctgatt ggtctgacct ctcgcgcaac ctgggcaaaa aacatccaga ccgcgatcaa 2640

ccaggtccgt agcctgattg gcaacgaaga gtataccgac tacatgccga gcatgaaacg 2700

ctttcgtcgc gaagaagaag aagctggcgt actgtggcat catcatcatc atcactaatg 2760

aaagctt 2767

<210> 4

<211> 907

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Thr Gly Asn Ile Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ile

1 5 10 15

Arg Leu Asn Ala Leu Gly Lys Ser Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Lys Ser

20 25 30

Gly Ile Gln Glu Val Asp Arg Thr Leu Ala Lys Glu Gly Ile Lys Arg

35 40 45

Gly Glu Thr Asp His His Ala Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg

50 55 60

Trp Phe Val Glu Arg Asn Met Val Thr Pro Glu Gly Lys Val Val Asp

65 70 75 80

Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Cys Gly Gly Leu Lys

85 90 95

Asn Val Arg Glu Val Lys Gly Leu Thr Lys Gly Gly Pro Gly His Glu

100 105 110

Glu Pro Ile Pro Met Ser Thr Tyr Gly Trp Asn Leu Val Arg Leu Gln

115 120 125

Ser Gly Val Asp Val Phe Phe Thr Pro Pro Glu Lys Cys Asp Thr Leu

130 135 140

Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Pro Asn Pro Thr Val Glu Ala Gly

145 150 155 160

Arg Thr Leu Arg Val Leu Asn Leu Val Glu Asn Trp Leu Asn Asn Asn

165 170 175

Thr Gln Phe Cys Ile Lys Val Leu Asn Pro Tyr Met Pro Ser Val Ile

180 185 190

Glu Lys Met Glu Thr Leu Gln Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Leu Val Gly

195 200 205

Asn Pro Leu Ser Arg Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val Ser Asn

210 215 220

Ala Ser Gly Asn Ile Val Ser Ser Val Asn Met Ile Ser Arg Met Leu

225 230 235 240

Ile Asn Arg Phe Thr Met Arg His Lys Lys Ala Thr Tyr Glu Pro Asp

245 250 255

Val Asp Leu Gly Ser Gly Thr Arg Asn Ile Gly Ile Glu Ser Glu Ile

260 265 270

Pro Asn Leu Asp Ile Ile Gly Lys Arg Ile Glu Lys Ile Lys Gln Glu

275 280 285

His Glu Thr Ser Trp His Tyr Asp Gln Asp His Pro Tyr Lys Thr Trp

290 295 300

Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Thr Lys Gln Thr Gly Ser Ala Ser Ser

305 310 315 320

Met Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Thr Lys Pro Trp Asp Val Val

325 330 335

Pro Met Val Thr Gln Met Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln

340 345 350

Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg Thr Gln Glu Pro Lys

355 360 365

Glu Gly Thr Lys Lys Leu Met Lys Ile Thr Ala Glu Trp Leu Trp Lys

370 375 380

Glu Leu Gly Lys Lys Lys Thr Pro Arg Met Cys Thr Arg Glu Glu Phe

385 390 395 400

Thr Arg Lys Val Arg Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile Phe Thr Asp

405 410 415

Glu Asn Lys Trp Lys Ser Ala Arg Glu Ala Val Glu Asp Ser Arg Phe

420 425 430

Trp Glu Leu Val Asp Lys Glu Arg Asn Leu His Leu Glu Gly Lys Cys

435 440 445

Glu Thr Cys Val Tyr Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Leu Gly

450 455 460

Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu

465 470 475 480

Gly Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp

485 490 495

His Trp Phe Ser Arg Glu Asn Ser Leu Ser Gly Val Glu Gly Glu Gly

500 505 510

Leu Tyr Lys Leu Gly Tyr Ile Leu Arg Asp Val Ser Lys Lys Glu Gly

515 520 525

Gly Ala Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile Thr

530 535 540

Leu Glu Asp Leu Lys Asn Glu Glu Met Val Thr Asn His Met Glu Gly

545 550 555 560

Glu His Lys Lys Leu Ala Glu Ala Ile Phe Lys Leu Thr Tyr Gln Asn

565 570 575

Lys Val Val Arg Val Gln Arg Pro Thr Pro Arg Gly Thr Val Met Asp

580 585 590

Ile Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser Gly Gln Val Gly Thr Tyr

595 600 605

Gly Leu Asn Thr Phe Thr Asn Met Glu Ala Gln Leu Ile Arg Gln Met

610 615 620

Glu Gly Glu Gly Val Phe Lys Ser Ile Gln His Leu Thr Val Thr Glu

625 630 635 640

Glu Ile Ala Val Gln Asn Trp Leu Ala Arg Val Arg Arg Glu Arg Leu

645 650 655

Ser Arg Met Ala Ile Ser Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Leu Asp

660 665 670

Asp Arg Phe Ala Ser Ala Leu Thr Ala Leu Asn Asp Met Gly Lys Val

675 680 685

Arg Lys Asp Ile Gln Gln Trp Glu Pro Ser Arg Gly Trp Asn Asp Trp

690 695 700

Thr Gln Val Pro Phe Cys Ser His His Phe His Glu Leu Ile Met Lys

705 710 715 720

Asp Gly Arg Val Leu Val Val Pro Cys Arg Asn Gln Asp Glu Leu Ile

725 730 735

Gly Arg Ala Arg Ile Ser Gln Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Glu Thr

740 745 750

Ala Cys Leu Gly Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Ser Leu Met Tyr Phe

755 760 765

His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Ala Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val

770 775 780

Pro Ser His Trp Val Pro Thr Ser Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Ala

785 790 795 800

Lys His Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Thr Val Trp Asn Arg

805 810 815

Val Trp Ile Gln Glu Asn Pro Trp Met Glu Asp Lys Thr Pro Val Glu

820 825 830

Ser Trp Glu Glu Ile Pro Tyr Leu Gly Lys Arg Glu Asp Gln Trp Cys

835 840 845

Gly Ser Leu Ile Gly Leu Thr Ser Arg Ala Thr Trp Ala Lys Asn Ile

850 855 860

Gln Thr Ala Ile Asn Gln Val Arg Ser Leu Ile Gly Asn Glu Glu Tyr

865 870 875 880

Thr Asp Tyr Met Pro Ser Met Lys Arg Phe Arg Arg Glu Glu Glu Glu

885 890 895

Ala Gly Val Leu Trp His His His His His His

900 905

Claims

1.一种具有抑制登革病毒复制作用的短肽，其特征在于，其氨基酸序列为KHGHHRH。

2.权利要求1所述的短肽在制备治疗登革病毒感染药物中的应用。

3.权利要求1所述的短肽在制备抑制登革病毒复制药物中的应用。

4.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的短肽。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述短肽可经环化处理形成环肽。