CN113278051B - 一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒学领域，具体涉及一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用。本发明通过优化筛选工艺，获得6条同源寡肽。本发明所提供的6条同源寡肽高亲和病毒RdRp，未来可望用作治疗RNA病毒感染的药物。本发明筛选得到的6条同源寡肽的氨基酸组成中以精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)占据绝对优势，氨基酸侧链为极性亲水氨基酸，所述寡肽极易溶于水或生理溶液中，具有成药性优势。在本发明所提供的同源寡肽的两端各添加一个半胱氨酸，可形成环状，在氨基酸组成和结构上兼有跨膜肽的优势，不需要递送材料即可富集于细胞内，无毒性，成药优势突出。

Description

一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用
技术领域
本发明涉及病毒学领域，具体涉及一组具抗病毒作用的同源环状寡肽序列及其应用。
背景技术
病毒性疾病一直是严重危害人类公共健康的首要原因，而国内外一直存在抗病毒药短缺的状况，抗病毒药的研发落后于抗菌素等药物品种。且RNA病毒容易突变，难以预防，严重威胁人类健康，其中正链RNA病毒(+ssRNA virus)对人类造成的威胁愈来愈烈。正链RNA 病毒的基因组为一条正义RNA单链，病毒RNA链进入宿主细胞后，可以直接作为mRNA链指导蛋白质的合成。
正链RNA病毒涵盖的科属众多，例如黄病毒科的登革病毒 (Dengue virus，DENV)、寨卡病毒(ZIKV)。与DENV一样，冠状病毒也是有包膜的+ssRNA病毒，病毒颗粒直径为80～120nm，基因组总长在26000至32000nt之间，是已知RNA病毒中最大的病毒。
寡肽或称为小分子肽，一般由4-10个氨基酸组成，远小于蛋白质分子。在人体不需消化，即可直接吸收，且不具有免疫原性，不会引起过敏或其他副作用，具有安全性的优势，是一类优质的候选药分子库。CN108395470B(《具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用》) 筛选出抑制登革病毒的寡肽，且获得国际优先权PCT CN2018 124985。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向性好、副作用小、成药性优良的 RNA病毒广谱抑制药物。
抗病毒药物研发的一个巨大障碍是病毒基因的变异，往往投入巨大而以失败告终。因此选择具有保守性的分子靶标是抗病毒药物研发的关键。病毒入侵细胞是发生感染的首要步骤，但靶向病毒表面蛋白的抑制剂在研发初期可能有效，经过一个时期后，病毒表面蛋白在高突变压力下常常发生突变，所以很难开发成广谱抗病毒药物。抗病毒药物的另一个难题是，药物是否能够进入细胞内部。
除逆转录病毒外，RNA病毒都编码RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)，RdRp在RNA病毒的增殖复制中起关键作用，它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因，另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA，担负了复制酶和转录酶双重功能。
基于此，第一方面，本发明提供具抑制RNA病毒复制作用的寡肽，所述寡肽为OP1：KHHWHRH；OP2：KHRWWHP；OP3：KHWWWHP； OP4：KHPWHHR；OP5：KHWYHHR；OP6：NWWHRSD。
本发明以一个登革病毒株的野生序列重构表达体系，并通过优化诱导表达条件等方法，获得野生序列的DENV NS5蛋白的全长可溶性表达体系，通过优化表达条件，获得具有RdRp活性的DENV NS5重组蛋白。以DENV NS5重组蛋白为靶标，从噬菌体展示肽库中，经过多轮筛选，获得一组(6条)与RdRp具有高度亲和力的寡肽。
本发明所述寡肽高亲和病毒的RdRp；且本发明筛选得到寡肽的氨基酸组成以精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)和组氨酸(H) 占据绝对优势，所述寡肽的氨基酸侧链为极性亲水氨基酸，使得所述寡肽极易溶于水或生理溶液中，易于进入细胞，具有成药性优势。图1中绿色荧光标记的是进入细胞并在细胞内富集的寡肽。
值得注意的是，本发明提供的6条同源寡肽与SARS-CoV-2等病毒 RdRp的结合能力也很强。
登革病毒粒径约40-50nm，基因组10.6kb左右，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白(NS)，登革病毒的RdRp位于其NS5 C端的三分之二，其酶活性功能的正常发挥需要NS5蛋白全长的完整性。新型冠状病毒粒径80-120nm，基因组30kb，编码至少4个结构蛋白和16个非结构蛋白(nsp)。新型冠状病毒是由nsp12在nsp7和nsp8协助下执行RdRp 功能。
本发明通过分子对接实验证实本发明提供的6条同源寡肽与 SARS-CoV-2RdRp的亲和力均高于同样靶向RdRp的对照药瑞德西韦，具有抗病毒应用潜力。
第二方面，本发明提供了具抑制RNA病毒复制作用的特异性片段，所述特异性片段为上述寡肽的四肽、五肽、六肽片段。
第三方面，本发明提供一种寡肽组合，含上述寡肽或上述特异性片段中的两种或多种。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，含有上述寡肽或上述特异性片段或上述寡肽组合。
本发明所提供的药物组合物中的肽片段为经环化处理的环化肽。具体地，可在所述寡肽或特异性片段两端合成半胱氨酸用以寡肽或特异性片段环化，或通过七肽序列中间侧链羧基和N端氨基形成酰胺键环、侧链氨基和C端羧基形成酰胺环、七肽分子首尾酰胺成环等方式将特异性片段环化。所得到的环肽具有高效抑制病毒复制的作用，可用于正链RNA病毒感染的特异性治疗，所述正链RNA病毒为新型冠状病毒、寨卡病毒、丙肝病毒、乙脑病毒、柯萨奇病毒、西尼罗病毒、诺瓦克病毒和/或登革病毒。
本发明筛选得到的寡肽或特异性片段表现出优良的药理活性与稳定性。因此，本发明还要求保护，上述的寡肽或上述特异性片段或上述寡肽组合或上述药物组合物在制备治疗RNA病毒感染药物中的应用或在抑制正链RNA病毒RdRp活性中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
(1)本发明通过优化筛选工艺，得到6条具同源性的特异肽寡肽片段，所述特异性寡肽片段的氨基酸残基为4-7个氨基酸，高亲和RdRp，具广谱抗病毒作用；
(2)本发明通过优化筛选工艺，筛选得到寡肽的氨基酸组成以精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)占据绝对优势，所述寡肽的氨基酸侧链为极性亲水氨基酸，使得所述寡肽极易溶于水或生理溶液中，具有成药性优势，未来可望用作抗正链RNA病毒感染的治疗药物；
(3)由于本发明所述寡肽序列中精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)和色氨酸(W)平均占比近90％，在发挥病毒作用后可提供人体不能合成的必需或半必需氨基酸，具有支持治疗的作用，可用作各种疾病和亚健康状况的辅助治疗。
附图说明
图1是本发明所提供寡肽进入细胞并在细胞中富集的荧光显微镜图。
图2是本发明实施例4中各细胞培养液中病毒拷贝数差异图。
图3是本发明实施例4中光学显微镜下细胞图，空白对照是培养基中无寡肽无病毒感染的细胞，肽保护组是在病毒感染后加入寡肽的细胞，病毒对照是在病毒感染后未加寡肽的细胞。
图4是本发明实施例7中的SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体 (PDBID:7BV2)晶体结构模型图。
图5是本发明实施例7中对照药瑞德西韦与SARS-CoV-2 nsp12-nsp7-nsp8复合体(7BV2)的对接图。
图6是本发明实施例7中寡肽OP4与SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8 复合体(7BV2)的对接图。
图7是本发明实施例7中SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体 (7BV2)与各配体(包括本发明提供的6条同源寡肽和对照药瑞德西韦)对接相互作用的氨基酸位点总览图，其中不同颜色代表分子间不同的作用力。
图8是本发明实施例7中同源寡肽OP4与丙肝病毒NS5b对接图。
图9是本发明实施例7中同源寡肽OP4与乙脑病毒NS5对接图。
图10是本发明实施例7中同源寡肽OP4与柯萨奇病毒RdRp对接图。
图11是本发明实施例7中同源寡肽OP4与寨卡病毒RdRp对接图。
图12是本发明实施例7中同源寡肽OP4与西尼罗病毒RdRp对接图。
图13是本发明实施例7中同源寡肽OP4与诺瓦克病毒RdRp对接图。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1寡肽的筛选
1、重组DENV NS5可溶性表达蛋白的获得
从NCBI GenBank检索到登革病毒的一个病毒株的NS5基因序列 (Accessionnumber：AF204178)，委托德泰生物(南京)科技公司合成该基因，构建pQE30NS5重组质粒。将该重组质粒转化大肠杆菌 XL1-Blue中。为获得最接近RdRp天然构象的重组NS5蛋白，采用两阶段培养、低温短时间诱导的策略进行重组蛋白的可溶性表达，且采用温和的条件进行细菌裂解和蛋白纯化。方法如下：
(1)配制三种大肠杆菌培养基，A即普通LB培养基，每升含10g 胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，pH 7.2，高压灭菌；B是含1％葡萄糖、200mg/mL氨苄青霉素的LB培养基，为抑表达培养基；C是诱导表达用TB培养基，配制方法是将12g胰化蛋白胨、24g酵母提取物、甘油4ml溶解于900ml dH2O中，高压灭菌，冷却后加入100mL无菌的0.17M KH2PO4/0.72M K2HPO4溶液，并加氨苄青霉素至200mg/mL。
(2)自培养板上挑取单菌落，涮入10mL培养基B中，37℃摇菌过夜。次日将此菌液转入500mL培养基B中，于37℃剧烈震荡培养增菌5～7h后，离心收集菌体。
(3)以500mL培养基C悬浮菌体，加入IPTG至终浓度0.1mM诱导表达，于16℃振荡培养约5h后，4℃离心收集菌体。
(4)以20mL裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM 咪唑，pH 8.0)悬浮菌体，加入溶菌酶至1mg/mL，PMSF至1mM，抑肽酶至10mg/mL，混匀，4℃静置30min待细菌细胞壁破裂内容物溶出。
(5)向菌体裂解液中加入1M CaCl2 30mL、S7核酸酶(20U/mL) 60mL，冰浴中缓摇20min。4℃ 10 000r/min离心15min，收集上清并用Ф0.45μm膜过滤。
(6)取dH2O漂洗后的Ni-NTA树脂4mL，用裂解缓冲液平衡。将裂解液上清与经过平衡的树脂混合，冰浴振荡2h后上柱。依次以50 mM、100mM和150mM咪唑浓度的洗脱液进行柱洗脱，待柱中液体流尽，用4mL高浓度咪唑(250mM)洗脱液将重组蛋白洗脱。定量后冻存备用。
2、利用噬菌体展示肽库筛选登革病毒RdRp高亲和力展示肽
从构型约束的随机肽库中筛选到的结合肽，比线性肽库中筛选得到的结合肽与靶蛋白结合的位点更有空间结构上的特异性，特别适合酶活性抑制剂的筛选。因此我们选定M13噬菌体展示的构型约束的随机环7肽库(Ph.D.-C7CTMPhage Display Peptide LibraryKit，美国NEW ENGLAND BioLabs公司)筛选DENV NS5蛋白高亲和力寡肽。该库的容量为2×1013pfu/mL，1.28×109个可能的7肽残基序列；噬菌体受体菌是E.coli ER2738。
将蛋白液用0.1M NaHCO3稀释至100μg/mL，每次取0.7mL蛋白稀释液滴加入
Figure RE-GDA0003149776950000061
聚乙烯培养皿中并平缓摇晃使覆盖均匀，4℃包被过夜。吸弃包被液后加入2mL封闭液，放置2h后弃封闭液并拍干，用 TBST(TBS+0.1％[V/V]Tween-20)洗板6次。随后取噬菌体(第一轮筛选时自试剂盒取10μL噬菌体贮存液，约2×1011个噬菌体粒子；以后各轮加入至少含1010个噬菌体的扩增纯化液)混于0.4mL TBST中，滴加入平皿，室温缓摇50分钟；吸弃未结合的噬菌体，用TBST洗平皿 10次；向培养皿中加入0.4mL 0.2M GlycineHCl(pH 2.2，1mg/mL BSA)，缓摇5分钟后移液至一离心管中，迅速加入60μL 1M TrisHCl(pH 9.1) 中和，此即洗脱的噬菌体。将洗脱的噬菌体加入10mL宿主菌液中再扩增，培养5小时后收集培养液将噬菌体纯化，测定滴度后用于下一轮筛选。从第4轮洗脱后用于测定滴度的平板上挑取70个蓝斑分别于 1mL新鲜ER2738菌液中扩增。
3、登革病毒RdRp高亲和力展示肽序列测定
将前述扩增的噬菌体克隆纯化、制备单链DNA测序模板，用-96 gIII测序引物反向测序，测定PIII蛋白基因中的核苷酸插入序列。将上述片段的核苷酸序列翻译为氨基酸，与噬菌体PIII蛋白编码序列融合的核苷酸序列和所对应的氨基酸序列集中为以下6个：
OP1：AAG CAT CAT TGG CAT CGG CAT，氨基酸序列为 KHHWHRH；
OP2：AAG CAT CAC TGG TGG CAT CCT，氨基酸序列为 KHRWWHP；
OP3:AAG CAT TGG TGG TGG CAT CCT，氨基酸序列为 KHWWWHP；
OP4:AAG CAT CCG TGG CAT CAT CGG，氨基酸序列为 KHPWHHR；
OP5:AAG CAT TGG TAT CAT CAT CGG，氨基酸序列为 KHWYHHR；
OP6：AAT TGG TGG CAT CGG TCG GAT，氨基酸序列为NWWHRSD。
可见，1.28×109个可能的7肽残基序列经过筛选后，集中为氨基酸序列完全相同或者具有明显共性的一组寡肽，且它们含有保守基序 WH、WHR或WHP。
实施例2寡肽的合成
本实施例采用固相合成的方法合成实施例1得到的同源寡肽中的 OP4，OP4序列为AAG CAT CCG TGG CAT CAT CGG，即KHPWHHR。在同源寡肽OP4两端各添加一个半胱氨酸Cys，形成环状。即通过固相化学方法合成序列为CKHPWHHRC的9肽，两端的半胱氨酸C用以形成二硫键而将该寡肽环化。
实施例3寡肽的细胞毒性实验(安全性评价)
1)准备OP4寡肽溶液：用细胞培养基将实施例2制备得到的寡肽干粉溶解，配制成2mM的寡肽溶液，顺次对倍稀释为1mM、0.5mM、 0.25mM、0.125mM。
2)寡肽的细胞毒性检测：在96孔板中培养C6/36细胞，在覆盖率 80％左右时，将其中的培养基吸弃，加入以上各浓度(0.125～2mM) 的含肽培养液，200μL/孔，每个肽浓度3个复孔。空白对照孔加入不含肽的新鲜培养基。放入孵箱继续培养24h后，从各孔吸出100μL培养液，即每孔剩余100μL培养液，向每孔加入10μL CCK8溶液 (Engreen)，将培养板在培养箱内孵育约3小时，用酶标仪测定450nm 处的吸光度。
3)细胞活力检测：显微镜下观察发现，加入寡肽的各组细胞生长状态好于对照细胞。以对照组细胞活力为100％计，肽含量1mM、 0.5mM、0.25mM、0.125mM的各组细胞的活力水平分别为120％、 106％、98％和98％。说明本发明所提供的寡肽对细胞生长不仅无不良影响，且可能提供了营养支持而更利于细胞生长。
实施例4寡肽体外抗登革病毒实验
1)准备细胞和病毒液：将C6/36细胞接种于96孔板的A-E行，共 60孔，每孔4×104个细胞，置于孵箱28℃培养2天。顺次对倍稀释实施例2制备得到的OP4寡肽溶液，配制25μM、12.5μM、6.3μM和3.1μM 肽含量的细胞维持液；将病毒液稀释至100TCID50/50μL。
2)病毒感染细胞：吸弃各细胞孔内的原培养基，用Hanks液轻柔冲洗细胞一次，吸弃洗液，用所配病毒液(50μL/孔)感染细胞(空白对照组除外)，1小时后将各孔中的病毒残液吸弃入消毒缸中。感染后的各组细胞分别用25μM、12.5μM、6.3μM和3.1μM肽含量的细胞维持液(200μL/孔)继续28℃培养，未染毒的对照组和阳性染毒对照组细胞均用不含测试肽的维持液同步培养。
3)检测培养基中病毒量：病毒感染3天后，从培养板上每孔取 100μL培养基转入无RNA酶EP管中用于提取RNA，每孔补加100μL新鲜培养基继续培养以观察细胞病变。将提取的RNA逆转录，并进行实时荧光定量PCR检测，使用登革病毒检测通用引物对各组细胞的Ct 值进行统计分析，比较细胞感染病毒后，在不同肽含量培养基中病毒粒子拷贝数的差异即病毒复制能力的差异。就OP4而言，各组细胞培养基中病毒拷贝数差异如图2，寡肽浓度为25μM、12.5μM、6.3μM、 3.1μM时，病毒相对载量分别为0.0019、0.0039、0.0501和0.3307。由图2结果可见，感染病毒后，25-3.1μM各肽含量细胞培养基中的病毒拷贝数均较不含寡肽的细胞培养基中明显降低，病毒量分别为对照组病毒量的0.002～0.33倍。
4)观察细胞病变：每日镜下观察细胞病变，染毒一周后细胞出现病变，比较各组细胞病变程度差异。如图3所示，有寡肽保护的病毒感染细胞病变程度较对照明显较轻。
图3结果说明，细胞受到病毒感染后，应用本发明所提供的寡肽可阻止病毒进一步复制，不致产生细胞病变，对受感染细胞具有保护作用。
综上所述，本发明所提供的合成肽，在高浓度下对细胞生长无不良影响；且对病毒感染细胞有显著的保护作用。
实施例5 SARS-CoV-2nsp12蛋白同源建模
(1)从NCBI GenBank获得SARS-CoV-2nsp12蛋白完整序列 (Accession number：YP_009725307.1)，以SARS-CoV nsp12蛋白 (PDBID:6NUR)为模板，通过SWISS模型同源建模构建了三维结构模型。由于nsp12的RdRp功能还依赖于nsp7和nsp8，故将nsp7和nsp8 序列和结构引入模型构建，所构建模型实质是nsp12-nsp7-nsp8复合体中SARS-CoV-2RdRp所呈现的功能性构象。结果显示，SARS-CoV nsp12与SARS-CoV-2nsp12蛋白序列一致性较高，达96.35％，同时模型构建GMQE值为0.83，QMEAN值为-0.72，均显示模型构建成功。
(2)在Discovery Studio中对模型进行Prepare Protein处理(加氢，去除水分子等)，并通过Define and Edit Binding Site功能中的From Receptor Cavities进行基于蛋白结构空腔的对接位点预测，获得37个潜在的作用靶点，依次标记为Site 1～Site 37。
实施例6寡肽与同源建模SARS-CoV-2nsp12蛋白的结合能力计算
瑞德西韦是靶向病毒RdRp的核苷类似物，在无其他同靶点特异有效药物的情况下，瑞德西韦是评价实施例1得到的6条寡肽与 SARS-CoV-2nsp12结合能力的最优对照药。
(1)同靶点对照药瑞德西韦与SARS-CoV-2nsp12的结合能力计算。首先将瑞德西韦分别与实施例5计算得到的SARS-CoV-2nsp12蛋白37个位点(Site 1-37)逐一进行Libdock分子对接，其中Number of Hotspots设置为100，Docking Tolerance设置为0.25，其余为默认参数。瑞德西韦与SARS-CoV-2nsp12的结合能力计算结果显示，37个位点中有7个位点能成功对接上，其中Site 1的对接模型得分最高，为180.49。
(2)寡肽OP1-OP6与SARS-CoV-2nsp12蛋白结合能力计算。绘制OP1-OP6配体寡肽的结构模型，并分别与SARS-COV-2nsp12 Site 1 进行半柔性对接。所有设置均与本实施例的步骤(1)相同，即Number of Hotspots设置为100，Docking Tolerance设置为0.25，其余为默认参数。该6条寡肽的结合能力得分结果如下：
OP1环化为CKHHWHRHC，得到155个构象，最高得分为215.564；
OP2环化为CKHRWWHPC，得到44个构象，最高得分为205.618；
OP3环化为CKHWWWHPC，得到84个构象，最高得分为208.786；
OP4环化为CKHPWHHRC，得到390个构象，最高得分为245.908；
OP5环化为CKHWYHHRC，得到18个构象，最高得分为188.755；
OP6环化为CNWWHRSDC，得到17个构象，最高得分为194.890。
该结果表明，这6个具有共性的寡肽与SARS-CoV-2nsp12蛋白的结合力均高于对照药瑞德西韦，证明本发明提供的6条同源寡肽与 SARS-CoV-2nsp12在RNA聚合酶活性位点有更强的结合能力，意味着本发明提供的6条同源寡肽对于新冠病毒基因组RNA复制的抑制作用更强，可认为具有较瑞德西韦更有效的抗病毒作用。
实施例7寡肽OP1-OP6与SARS-CoV-2RdRp复合体晶体结构 (PDBID：7BV2)的结合能力计算
从蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)中获取 SARS-CoV-2RdRp复合体的晶体结构，见图4，图4中白色代表病毒 RNA模板。该结构包含SARS-CoV-2nsp12以及辅助因子nsp7、nsp8，同时包含有一条短的dsRNA以及核苷类似药物瑞德西韦。在DiscoveryStudio中首先删除dsRNA以及瑞德西韦，随后再对剩余的RdRp复合体 (nsp12-nsp7-nsp8)进行Prepare Protein处理同上。随后同样基于空腔搜索潜在的作用位点，并选择原先dsRNA所结合的空腔分别与寡肽 OP1-OP6以及瑞德西韦进行半柔性对接，参数同上。其中瑞德西韦最高对接得分为114.565，而六条寡肽的得分结果如下：
OP1环化为CKHHWHRHC，得到195个构象，最高得分为164.909；
OP2环化为CKHRWWHPC，得到57个构象，最高得分为160.830；
OP3环化为CKHWWWHPC，得到58个构象，最高得分为166.597；
OP4环化为CKHPWHHRC，得到161个构象，最高得分为175.525；
OP5环化为CKHWYHHRC，得到21个构象，最高得分为153.866；
OP6环化为CNWWHRSDC，得到10个构象，最高得分为152.787。
本实施例中对照组的对接结果见图5，寡肽OP4的对接结果见图6，与实施例6中使用同源建模所构建模型的对接结果趋势基本一致，并且可以看到，对于dsRNA结合的空腔，寡肽的对接分数均远高于瑞德西韦，即寡肽相较于瑞德西韦能与SARS-CoV-2RdRp的活性空腔更紧密地结合，并可能阻遏dsRNA与RdRp的结合，发挥重要的酶活性抑制作用，SARS-CoV-2nsp12-nsp7-nsp8复合体(7BV2)与各配体对接相互作用氨基酸位点总览见图7。
采用本实施例方法，从蛋白质结构数据库查找已有晶体结构的病毒RdRp，对各病毒的RdRp基于空腔搜索潜在的作用位点，选择其中包含RdRp活性空腔的位点与寡肽OP4进行半柔性对接，结果显示同源寡肽OP4与丙肝病毒NS5b(图8)、乙脑病毒NS5(图9)、柯萨奇病毒 RdRp(图10)、寨卡病毒RdRp(图11)、西尼罗病毒RdRp(图12)以及诺瓦克病毒RdRp(图13)等对接成功，表明本发明所提供寡肽能够高亲和力地结合于+ssRNA病毒的RdRp活性位点，即本发明所提供寡肽具广谱抗病毒作用。
对比例1寡肽KHGHHRH体外抗登革病毒
本对比例提供寡肽KHGHHRH的体外抗病毒实验。本对比例与实施例4相同，区别仅在于，本对比例中的细胞维持液为含有寡肽 KHGHHRH的细胞维持液。
就本对比例提供的寡肽(KHGHHRH)而言，抗病毒实验时现将其配制为1g/L的肽溶液，在微孔板上的刚染毒后的细胞培养孔内分别加入5μL、10μL、20μL和40μL肽溶液，即各组细胞培养液中寡肽浓度分别为45μM、90μM、180μM和360μM，根据细胞病变情况判定最低有效浓度为90μM。
在本发明提供的同源寡肽中具抗病毒作用的最低有效肽浓度为 3.1μM，较对比例1的最低有效浓度明显降低，即本发明提供的6条同源寡肽提高了有效性。
对比例2寡肽KHGHHRH与SARS-CoV-2RdRp复合体晶体结构 (PDBID：7BV2)的结合能力计算
本对比例采用与实施例7相同的方法计算寡肽KHGHHRH与 SARS-CoV-2RdRp复合体晶体结构(PDBID：7BV2)的结合能力。结果表明，寡肽KHGHHRH同样能结合于SARS-CoV-2RdRp空腔，但其最高得分仅为149.495。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.具抑制RNA病毒复制作用的寡肽，其特征在于，所述寡肽的氨基酸序列为KHPWHHR。
2.根据权利要求1所述的寡肽，其特征在于，在寡肽KHPWHHR两端各添加一个半胱氨酸Cys，形成环状肽，所述环化肽为CKHPWHHRC。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的寡肽。
4.权利要求1-2任一项所述寡肽或权利要求3所述药物组合物在制备病毒RdRp活性抑制剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108395470A (zh) * 2018-01-10 2018-08-14 北京工业大学 具有抑制登革病毒复制作用的短肽及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification and molecular characterization of human antibody fragments specific for dengue NS5 protein;Zhao Yongqian等;《Virus Res》;20140122(第179期);全文 *
用噬菌体随机肽库分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白单克隆抗体识别的表位;王玉娥等;《农业生物技术学报》;20040526(第02期);全文 *
登革病毒抑制剂的研究进展;何利娜等;《国际药学研究杂志》;20130228(第01期);全文 *

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