KR102612226B1 - 유전적으로 암호화가능한 바이오센서용 강력한 저분자 결합 압타머를 생성하기 위한 시험관내 선별법을 이용한 생물학적 rna 스캐폴드의 사용 - Google Patents

유전적으로 암호화가능한 바이오센서용 강력한 저분자 결합 압타머를 생성하기 위한 시험관내 선별법을 이용한 생물학적 rna 스캐폴드의 사용 Download PDF

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일리 비. 포터
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트
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Abstract

리보스위치 및 작은 리보자임으로부터 유래된 스캐폴드의 라이브러리 및 그것의 사용 방법이 본 명세서에서 제공된다. 본 발명의 스캐폴드는 구조적 스캐폴드의 덕분으로 쉽게 확인되고 특징화 되는 압타머를 생성한다. 본 스캐폴드의 성질은 이들 RNA를 시험관내 및 생체내에서 기능하는 바이오센서를 조작하도록 판독 도메인에 커플링하는 경향이 있다. 바이오센서, 합성 RNA 제제와 합성 DNA 제제, 및 그것의 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

유전적으로 인코딩할 수 있는 바이오센서를 위한 강력한 소형 분자 결합 압타머를 생성하기 위한 생체외 선별을 갖는 생물학적 RNA 스캐폴트의 용도
관련 출원
본원은 다음 미국 특허의 우선권의 이점을 주장한다: 2016년 12월 12일 출원된 특허 가출원 번호 62/432,879로, 그 내용은 전체적으로 모든 목적을 위해 이로써 본 명세서에 참고로 편입된다.
하기에 대한 서술
연방 지원된 연구 또는 개발
본 발명은 국가 과학 재단에 의해 수여된 과제번호 CMMI CHE1150834 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
알로스테릭 RNA 디바이스는 효소 진화를 모니터링할 수 있고, 조작된 대사 경로를 최적화할 수 있고, 신규한 유전자 및 핵산 기반 치료제의 조절인자의 발견을 용이하게 하는 중요한 도구로 점점 더 주목을 받고 있다. 그러나, 이들 플랫폼의 개발에 있어서 하나의 병목현상은 세포 환경에서 견고하게 기능하는 소분자 결합 RNA 압타머의 이용가능성이다. 압타머가 시험관내 선택에 의해 거의 임의의 원하는 표적에 대해 상승될 수 있는 반면, 많은 이들 RNA-기반 압타머는 디바이스 안으로 쉽게 통합될 수가 없거나 또는 세포 상황에서 신뢰할 수 있게 기능하지 않는다.
따라서, 압타머 및 압타머를 개발하는 방법에 대한 요구가 남아있다.
리보스위치 및 작은 리보자임으로부터 유래된 스캐폴드를 사용하는 신규한 접근법이 본 명세서에서 기재된다. 예시적인 양태에서 5-하이드록시트립토판에 대해 여기서 적용된, 이 접근법은 구조적 스캐폴드의 덕분에 쉽게 확인되고 이를 특징으로 하는 압타머를 생성한다. 본 스캐폴드의 특성은 이들 RNA가 시험관내 및 세포 상황에서 기능하는 핵산 디바이스를 조작하도록 판독 도메인에 대해 커플링하기 쉽게 한다.
일 양태에서, 복수의 동일하지 않은 올리고뉴클레오타이드를 포함하여 제공된 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리가 제공된다. 라이브러리의 개별 올리고뉴클레오타이드는 나선 도메인을 포함하는 제1 서열, 제1 헤어핀 도메인을 포함하는 제2 서열, 및 제2 헤어핀 도메인을 포함하는 제3 서열을 포함하고, 상기 나선 도메인, 제1 헤어핀 도메인 및 제2 헤어핀도메인은 리간드-결합 도메인을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성하고, 그리고 상기 라이브러리는 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 나선 도메인은 독립적으로 미스배치된(mismatched) 염기 쌍, GㆍU 워블 염기 쌍 및 벌지(bulge)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 선택적으로 포함하는 완전하게 상보적 나선이다. 일 구현예에서, 각각의 나선 도메인은 완전하게 상보적 나선이다.
일 구현예에서, 각각의 제1 헤어핀 도메인은 독립적으로 미스매치된 염기 쌍, GㆍU 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 포함하고 및/또는 각각의 제2 헤어핀 도메인은 독립적으로 미스매치된 염기 쌍, GㆍU 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 나선 도메인은 길이에서 적어도 4 내지 10 염기 쌍, 또는 길이에서 적어도 10 염기 쌍이다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 올리고리보뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 개별적으로 식 I에 따른 일련의 연결된 서열을 갖는 서열을 포함한다: P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/1-P1' (I), 여기서 "-"는 결합을 나타내고, P1 및 P1'은 나선을 형성하고, P2, L2 및 P2'은 제1 헤어핀을 형성하고, P3, L3 및 P3'은 제2 헤어핀을 형성하고 그리고 J1/2, J2/3 및 J3/1은 함께 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성한다. 일 구현예에서, J2/3은 T-루프 모티프를 포함한다. 일 구현예에서, T-루프 모티프는, 선택적으로 T-루프의 구아노신이 J3/1에서 시티딘과 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 서열 UUGAA를 포함한다.
일 구현예에서, 나선 도메인은 제1 단부 및 제2 단부를 가지고, 상기 제1 단부는 올리고뉴클레오타이드 접합에 근접하고, 상기 제2 단부는 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈에 연결된다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈은 플루오로제닉, 예를 들어, 브로콜리 형광단 결합 압타머, 또는 스위치-기반 판독 모듈, 예를 들어, pbuE 스위치이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈은 올리고리보뉴클레오타이드-기반 판독 모듈이다.
일 구현예에서, 개별 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 약 23개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 바실러스 서브틸리스 xpt-pbuX 구아닌 리보스위치 서열에 대해 서열 관련성을 가지거나, 또는 개별 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 약 21개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 비브리오 콜레라 Vc2 환형 디-GMP 리보스위치 서열에 대해 서열 관련성을 가지거나, 또는 개별 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 약 21개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 쉬스토소마 만소니 헤머헤드 리보자임 서열에 대해 서열 관련성을 가진다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 접합은 N-방향 접합으로, 여기서 N은 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 여기서 N은 2이거나, 또는 여기서 N은 3이거나, 또는 여기서 N은 4이거나, 또는 여기서 N은 5이다.
일 구현예에서, 본 라이브러리는 약 421 내지 약 423의 동일하지 않은 구성원을 포함한다.
또 다른 양태에서, 복수의 동일하지 않은 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리가 제공된다. 본 라이브러리의 개별 올리고뉴클레오타이드는 나선 도메인을 포함하는 제1 서열, 제1 헤어핀 도메인을 포함하는 제2 서열, 및 제2 헤어핀 도메인을 포함하는 제3 서열을 포함하고, 상기 나선 도메인, 상기 제1 헤어핀 도메인 및 상기 제2 헤어핀 도메인은 사전-선택된 리간드-결합 도메인을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성하고, 그리고 상기 라이브러리는 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 각각의 나선 도메인은 독립적으로 미스매치된 염기 쌍, GㆍU 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 선택적으로 포함하는 완전하게 상보적 나선이다. 일 구현예에서, 각각의 나선 도메인은 완전하게 상보적 나선이다.
일 구현예에서, 각각의 제1 헤어핀 도메인은 독립적으로 미스매치된 염기 쌍, GㆍU 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 포함하고 및/또는 각각의 제2 헤어핀 도메인은 독립적으로 미스매치된 염기 쌍, GㆍU 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 나선 도메인은 길이에서 적어도 4 내지 10 염기 쌍이거나 또는 길이에서 적어도 10 염기 쌍이다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 올리고리보뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, 개별 올리고뉴클레오타이드는 식 I에 따른 일련의 연결된 서열을 갖는 서열을 포함한다: P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/1-P1' (I), 여기서 "-"는 결합을 나타내고, P1 및 P1'은 나선을 형성하고, P2, L2 및 P2'은 제1 헤어핀을 형성하고, P3, L3 및 P3'은 제2 헤어핀을 형성하고 그리고 J1/2, J2/3 및 J3/1은 함께 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성한다. 일 구현예에서, J2/3은 T-루프 모티프를 포함한다. 일 구현예에서, T-루프 모티프는, 선택적으로 T-루프의 구아노신이 J3/1에서 시티딘과 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 서열 UUGAA를 포함한다.
일 구현예에서, 나선 도메인은 제1 단부 및 제2 단부를 가지고, 상기 제1 단부는 올리고뉴클레오타이드 접합에 근접하고, 상기 제2 단부는 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈에 연결된다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈은 플루오로제닉, 예를 들어, 브로콜리 형광단 결합 압타머, 또는 스위치-기반 판독 모듈, 예를 들어, pbuE 스위치이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈은 올리고리보뉴클레오타이드-기반 판독 모듈이다.
일 구현예에서, 개별 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 약 23개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 바실러스 서브틸리스 xpt-pbuX 구아닌 리보스위치 서열에 대해 서열 관련성을 갖는 서열을 포함하거나, 또는 개별 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 약 21개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 비브리오 콜레라 Vc2 환형 디-GMP 리보스위치 서열에 대해 서열 관련성을 갖는 서열을 포함하거나, 또는 개별 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 약 21개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 쉬스토소마 만소니 헤머헤드 리보자임 서열에 대해 서열 관련성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 접합은 N-방향 접합으로, 여기서 N은 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 여기서 N은 2이거나, 또는 여기서 N은 3이거나, 또는 여기서 N은 4이거나, 또는 여기서 N은 5이다.
일 구현예에서, 사전선택된 리간드-결합 부위는 아미노산, 펩타이드, 핵염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 금속 이온, 신경전달물질, 호르몬, 활성 약제학적 성분, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 화합물에 대한 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 사전선택된 리간드-결합 부위는 아미노산, 핵염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 신경전달물질, 호르몬, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 대한 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 사전선택된 리간드-결합 부위는 5-하이드록시-L-트립토판, L-트립토판, 세로토닌, 및 5-하이드록시-L-트립토판-메틸아미드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 리간드에 대한 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 리간드는 5-하이드록시-L-트립토판 또는 세로토닌 중 적어도 하나이다.
또 다른 양태에서, 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 리간드 결합을 위한 적합한 조건하에서 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를 리간드와 접촉시키는 단계로, 여기서 개별 올리고뉴클레오타이드는 나선 도메인을 포함하는 제1 서열, 제1 헤어핀 도메인을 포함하는 제2 서열, 및 제2 헤어핀 도메인을 포함하는 제3 서열을 포함하고, 상기 나선 도메인, 제1 헤어핀 도메인 및 제2 헤어핀 도메인은 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성하는, 단계 및 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 올리고뉴클레오타이드가 선택되도록 상기 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를 공간적으로 주소지정 가능한 것에 분할하는 단계를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 접합을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 리간드-결합 도메인을 추가로 포함하고, 그리고 상기 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리의 리간드-결합 도메인은 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하도록 선택된다.
일 구현예에서, 본 방법은 상기 접촉시키는 단계와 상기 분할하는 단계 사이에 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를 유리 리간드의 용액과 경쟁적으로 분할하는 것을 포함하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 전술한 및 다른 특징과 이점은 수반되는 도면들과 연계하여 예시적 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 것이다. 본 특허 또는 출원 파일은 색상으로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색상 도면(들)과 함께 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 및 필요한 요금의 지불에 의해 청에 의해 제공될 것이다.
도 1A는 GR 스캐폴드를 도시한다. GR 스캐폴드는 B. 서브틸리스 xpt - pbuX 구 아닌 리 보스위치의 압타머 도메인으로부터 유래된다. 압타머는 구아닌 (Gua, 심홍색) 결합 부위 (파선은 직접적인 RNA-리간드 상호작용을 나타냄)를 함유하는 3-방향 접합의 연결 (J) 영역에 의해 연결된 세 개의 쌍으로 된 (P) 영역을 포함한다. 윤곽이 그려진 청록색의 뉴클레오타이드는 선택을 위해 무작위 추출된 것들이다. P2 및 P3의 말단 루프 (L2 및 L3, 녹색 박스)는 도메인을 유기체화하는 삼차 상호작용에 참여한다. 아래는 리간드 결합 부위와 무작위화된 뉴클레오타이드 사이의 공간적 관계를 강조하는 동일한 색상 반응식을 갖는 RNA의 3차원 구조 (PDB ID 4FE5)이다.
도 1B는 CDG 스캐폴드를 도시한다. 압타머 도메인 V. 콜레라 Vc2 환 형 디 - G MP 리보스위치 (PDB ID 3IWN)로부터 유래된 CDG 스캐폴드의 이차 (상단부) 및 삼차 구조 (하단부). 라벨링 및 색상 반응식은 도 1A에서 기재된 바와 같다.
도 1C는 HH 스캐폴드를 도시한다. S. 만소니 헤 머 헤 드 리보자임 (PDB ID 3ZP8)으로부터 유래된 HH 스캐폴드의 이차 (상단부) 및 삼차 구조 (하단부). 라벨링 및 색상 반응식은 도 1A에서 기재된 바와 같다.
도 2A는 하기를 도시한다: 5-하이드록시-L-트립토판의 화학 구조.
도 2B는 GR-SSIII 선택의 라운드 7로부터 유래된 서열의 거리 매트릭스의 뿌리가 없는 계통발생적 트리 표현을 도시한다. 서열은 독립적으로 착색된 세 가지 주요 클러스터로 그룹화된다. 거리는 얼마나 많은 치환이 트리의 두 절 사이의 부위 당 발생하였는가 (척도에 대해 도시된 막대)에 관한 최대 가능성 평가 (MLE)로 표현된다.
도 2C는 GR-GsI 선택의 라운드 7로부터 유래된 서열의 거리 매트릭스의 뿌리가 없는 계통발생적 트리 표현을 도시한다. 대표적인 서열이 분석된 4개 클러스터가 독립적인 색상으로 도시되어 있다 (범례는 우측에 도시됨); 흑색 영역은 분석되지 않은 클러스터 및 트리의 영역을 나타낸다.
도 2D는 GR 선택으로부터 유래된 6개 관측된 클러스터의 공변이 모델을 도시하고; 색상은 도 2B 및 2C와 일치한다. 파선은 무작위 추출된 스캐폴드의 영역에 상응하고 L2와 L3을 연결하는 선은 삼차 상호작용을 지지하는 서열이 유지된 클러스터를 나타낸다.
도 3A는 천연 xpt구아닌 리보스위치에 비교하여 3가지 서열 (5HTP-I, -II, 및 -III)의 선택적 2'-하이드록시 아실화로 프라이머 연장에 의해 분석된 ("SHAPE") 화학적 탐침검사의 결과를 도시한다. 명백하게 하기 위해, J2/3 가닥 및 L3에 상응하는 겔의 영역이 도시되어 있다 (보충의 도 4a에 도시된 전체 겔). 비록 모든 세 개 RNA들이 J2/3 내에 또는 여기에 인접한 RNA 백본의 화학적 반응성에서 리간드-의존적 감소를 드러내지만, 단지 5HTP-II만은 xpt 구아닌 리보스위치에서 L2와 그것의 상호작용의 형성을 나타내는 L3에서의 반응성의 특성 핫스팟을 유지한다.
도 3B는 다수의 반응성 변화가 접합에 국소화된다는 것을 밝히는 5HTP의 존재 및 부재에서 5HTP-II의 SHAPE 탐침검사의 리간드-의존적 차별적인 강도의 정량화이다. L3 신호의 향상은 접합에서 리간드 결합과 삼차 구조 형성 사이의 커플링을 시사한다.
도 3C는 5'- 및 3'-증폭 카셋트가 있는 (좌측) 및 없는 (우측) 5HTP-II에 대한 5HTP의 결합의 등온 적정 열량측정 (ITC) 분석을 도시하여, 이들 영역은 리간드 결합에 영향을 주지 않는다는 것을 입증한다.
도 3D는 5-하이드록시트립토판 (심홍색)과 복합체로 5HTP-II 압타머의 결정 구조를 도시한다. 녹색은 모 스캐폴드 (도 1A)의 L2-L3 상호작용을 강조하고 그리고 청록색은 개시 RNA 라이브러리에서 무작위추출된 뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 3E는 하기를 도시한다: 구조와 RNA 백본의 동력학에서의 리간드-의존적 변화 사이의 관계를 강조하는 결정 구조에 대한 패널 (B)에서의 정량화된 SHAPE 반응성 데이터의 오버레이.
도 4A는 하기를 도시한다: 5HTP-II 압타머에서 5HTP의 결합 포켓. 3-방향 접합 내에서 5HTP-결합 포켓은 화합물을 고정하는 아미드가 되는 카복실레이트 기에서 하나의 산소 원자를 제외하고 5-하이드록시트립토판에서 모든 극성 작용기를 계합하는 일 세트의 수소 결합 상호작용을 형성한다. 또한, 복합체는 5HTP의 하이드록시인돌 고리 사이에서 상호작용을 누적함에 의해 그리고 J2/3에서 아데닌 염기 (A48 및 A49)에 대해 안정화된다.
도 4B는 5HTP-II 압타머 내 5HTP의 결합 포켓을 도시한다. 5HTP-II 압타머 내 결합 포켓의 코어 (녹색)는 tRNAPhe (오렌지색) 및 티아민 파이로포스페이트 (TPP) 리보스위치 (청록색)로부터의 T-루프와 거의 완전하게 겹쳐지는 T-루프이다. 각각의 세 가지 예에서, T4 및 T5 위치에도 두 퓨린 사이의 공간 (T1-5 넘버링은 T-루프 모티프 내의 뉴클레오타이드 위치를 나타냄)은 방향족 고리의 삽입을 가능하게 한다.
도 5A는 5HTP 압타머-기반 바이오센서가 E. 콜리에서 작용한다는 것을 도시한다. 야생형 5HTP-II 압타머는 구체적으로 5HTP의 존재에서 브로콜리 리포터의 형광을 활성화시킨다. t=0분에서, 2 mM 5HTP가 하기에 첨가되었다: 배지들.
도 5B는 다음 사항을 도시한다: 야생형 5HTP-II 압타머는 L-트립토판의 존재에서 브로콜리 리포터의 형광을 구체적으로 활성화시키지 않는다. t=0분에서, 5 mM L-트립토판이 하기에 첨가되었다: 배지들.
도 5C는 5HTP-II 압타머 (A48U)의 5HTP-결합 포켓에서 단일 점 돌연변이가 또한 형광단의 존재에서 형광을 제거한다는 것을 도시한다. t=0분에서, 2 mM 5HTP가 하기에 첨가되었다: 배지들.
도 5D는 5HTP의 존재에서 야생형 5HTP-II-브로콜리 센서에 대한 단일 세포 미량의 형광 유도를 도시한다. t=0분에서, 2 mM 5HTP가 하기에 첨가되었다: 배지들.
도 5E는 L-트립토판의 존재에서 야생형 5HTP-II-브로콜리 센서에 대한 단일 세포 미량의 형광 유도를 도시한다. t=0분에서, 5 mM L-트립토판이 하기에 첨가되었다: 배지들.
도 5F는 5HTP의 존재에서 결합하는 능숙하지 않은 5HTP-II A48U 작제물에 대한 단일 세포 미량의 형광 유도를 도시한다. t=0분에서, 2 mM 5HTP가 하기에 첨가되었다: 배지들.
도 6A는 5HTP-IV 압타머에 기반한 인공 5HTP/세로토닌 "ON" 리보스위치의 이차 구조를 도시한다. 5HTP-IV 압타머는 파선으로 박스로 되고, 그리고 연속된 박스로된 뉴클레오타이드는 대안적인 구조 형성에 직접적으로 관여된 뉴클레오타이드에 상응한다.
도 6B는 하기를 도시한다: 5HTP, 세로토닌, 또는 5HTP-NHme의 첨가에 의해 강력한 항종결을 입증하는 리보스위치의 정량화된 단일-턴오버 전사 반응.전사 반응의 겔 이미지는 우측에 도시되어, 종결된 (T) 것부터 초과 번역 (RT) 생성물까지의 리간드-의존적 전이를 나타낸다. L-트립토판으로의 유사한 적정은 초과번역 전사를 생성하지 못했다.
도 7A 는 하기를 도시한다: GsI 역 전사효소를 사용한 CDG 선택의 라운드 7로부터 유래된 서열의 거리 매트릭스의 뿌리가 없는 계통발생적 트리 표현.5HTP 압타머가 유래된 클러스터는 적색으로 강조되어 있다. 거리는 얼마나 많은 치환이 트리의 두 절 사이의 부위 당 발생하였는가 (척도에 대해 도시된 막대)에 관한 최대 가능성 평가 (MLE)로 표현된다.
도 7B는 5HTP-VII 압타머의 공변이 모델을 도시하고; 연속한 적색 선은 무작위 추출된 바이오스캐폴드의 영역에 상응하고 그리고 L2 및 P3을 연결하는 선은 삼차 상호작용을 나타낸다.
도 7C는 GsI 역 전사효소를 사용한 HH 선택의 라운드 7로부터 유래된 서열의 거리 매트릭스의 뿌리가 없는 계통발생적 트리 표현을 도시한다. 5HTP-VIII 압타머가 유래된 클러스터는 자주색으로 강조되어 있고; 흑색 영역은 분석되지 않은 클러스터 및 트리의 영역을 나타낸다.
도 7D는 5HTP-VIII 압타머의 공변이 모델을 도시하고; 연속한 자주색 선은 무작위 추출된 바이오스캐폴드의 영역에 상응하고 그리고 P2 및 L3을 연결하는 선은 삼차 상호작용을 나타낸다.
도 8A는 SuperScript III (Life Technologies)를 사용한 초기 선택에서 90% 초과 돌연변이 빈도를 달성한 3' 말단에서 일부 위치로 선택의 라운드 7에 의한 바이오스캐폴드에서 돌연변이의 상당한 축적을 도시한다. 이차 및 삼차 구조 (P2 및 P3)에 대해 중요한 서열 요소에서의 돌연변이의 축적에 대한 강한 경향이 또한 있다.
도 8B는 전개된 그룹 II 인트론 RT (GsI-IIC)를 사용한 변형된 선택 프로토콜이 GR 바이오스캐폴드, 특히 P2 및 P3 영역에서 축적된 돌연변이의 양에서 완화를 나타낸다는 것을 도시한다. 이것은 서열 안으로 설계된 구조 요소의 보존을 허용한다.
도 8C는 하기 관측된 것을 도시한다: CDG/GsI 선택의 라운드 7에서 뉴클레오타이드 위치의 함수로서 에러 빈도.
도 8D는 하기 관측된 것을 도시한다: HH/GsI 선택의 라운드 7에서 뉴클레오타이드 위치의 함수로서 에러 빈도.
도 9A는 5HTP의 부재 및 존재에서 5HTP-IV, -V 및 -VI 압타머의 SHAPE 분석을 도시한다. 측면에 대한 막대는 3-방향 접합에서 다양한 리간드-의존적 보호 및 L2-L3 상호작용의 L3 진단에서 특성 반응성 핫스팟의 존재를 입증하는 J2/3 및 L3 영역을 강조한다.
도 9B 는 CDG 스캐폴드된 5HTP 결합 압타머의 SHAPE 분석을 도시한다. 원료 겔은 J1/2 및 J2/3에서 명확한 리간드 의존적 변형을 나타낸다. 친계 Vc2 RNA는 테트라-루프 접촉 부위에서 P3에서의 리간드 의존적 보호를 나타내고, 반면에 5HTP-VII 압타머는 나선의 반대측 상에서 리간드 의존적 변형을 나타낸다. 추가로, 어느 RNA도 무관한 리간드의 존재에서 임의의 변형을 나타내지 않는다.
도 9C는 HH 스캐폴드된 5HTP 결합 압타머의 SHAPE 분석을 도시한다. 원료 겔은 J1/2 및 J2/3에서 명확한 리간드 의존적 변형을 나타낸다. J2/3에서의 변화는 예상된 T-루프 모티프의 위치 3 및 4에 주로 위치한다. 추가로, 구조가 유지되는 경우 친계 RNA에서 P2 안으로 도킹하는 P3 (L3)의 말단 루프는 리간드 의존적 보호를 나타낸다. 겔 아래 거리의 함수로 밴드의 통합이 좌측 상에 도시되어 있다.
도 10A 는 2σ로 윤곽화된 모델 주위의 5HTP-II/5HTP 복합체의 2Fo-Fc 전자 밀도 지도를 도시한다. RNA의 모든 영역은 전자 밀도에 의해 명확화되어, 명확한 잔기 및 백본의 배치를 만든다. 청록색 뉴클레오타이드는 최초 RNA 라이브러리에서 무작위 추출되었고 5HTP는 오렌지 색으로 도시되어 있다.
도 10B는 리간드 (5HTP) 및 인접한 이리듐 헥삼민 (IrHex)의 배치를 지지하는 명확한 밀도를 도시하는 1σ로 윤곽화된 5HTP-II/5HTP 복합체의 리간드 결합 포켓의 합성물 누락을 도시한다.
도 10C는 1σ로 윤곽화된 5HTP-II/5HTP 복합체의 5HTP 결합 포켓의 최종 2Fo-Fc 전자 밀도 지도를 도시한다.
도 11A는 HH/GsI 선택의 가장 다수 클러스터의 5HTP-VIII 압타머 중 J2/3의 변이 분석으로부터 유래된 R2R 다이어그램을 도시한다.
도 11B는 생물학적 RNA1에서 발견된 T-루프의 변이 패턴을 비교하는 5HTP-VIII 압타머의 J2/3의 변이 분석 (상단부) 및 5HTP-VIII 압타머를 함유하는 클러스터를 도시한다.
도 12는 5HTP-브로콜리 바이오센서에 대한 구축 반응식을 도시한다. 브로콜리 이차 구조에서 적색 뉴클레오타이드는 DFHBI에 대한 플랫폼을 형성하는 G-사중항을 나타내고 녹색 뉴클레오타이드는 시금치와 브로콜리 사이의 차이를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 신규한 스캐폴드 압타머의 디자인을 도시하는 그래픽 요약이다.
도 14A는 GR-스캐폴드된 압타머 (청록색)가 연계 모듈 (오렌지, CM; 하단 상의 서열)을 통해 플루오로제닉 압타머 (브로콜리, 녹색)에 커플링되고 tRNA 스캐폴드 (황색)로 생체내에서 안정화된 5HTP 및 L-DOPA의 유전자적으로 인코딩할 수 있는 바이오센서의 이차 구조의 개략도이다.
도 14B 및 도 14C는 2 내지 5 염기 쌍의 CM으로 브로콜리에 커플링된 일련의 GR-스캐폴드된 압타머에 대한 관측된 리간드-유도된 형광의 열 지도 (상단부) 및 tRNA/브로콜리 대조군에 대한 리간드-결합된 센서의 휘도 (하단)를 묘사한다.
도 14D 및 도 14E는 E. 콜리에서 동일한 센서의 성능의 열 지도를 묘사한다.
도 15A 및 도 15B 는 야생형 5GR-II 압타머가 구체적으로, L-트립토판의 존재에서가 아닌, 5HTP의 존재에서 브로콜리 리포터의 형광을 활성화시킨다는 것을 도시한다.
도 15 C는 5GR-II 압타머 (A48U)의 5HTP-결합 포켓에서 단일 점 돌연변이가 또한 형광단의 존재에서 형광을 제거한다는 것을 도시한다.
도 15D, 도 15E 및 도 15F는 5HTP, L-트립토판의 존재에서 야생형 5GR-11-브로콜리 센서, 및 5HTP의 존재에서 결합 능력 없는 5GR-II A48U 작제물에 대한 단일-세포 미량의 형광 유도를 묘사한다. t=0분에서, 2 mM 5HTP 또는 5 mM L-트립토판 중 어느 하나가 배지들에 첨가된다.
도 16A는 모든 백본 원자 위에 친계 B. 서브틸리스 xpt 구아닌 리보스위치 및 5GR-11 RNA의 이중인화를 도시한다. 구아닌 리보스위치 (PDB 4FE5)는 적색으로 도시되어 있고 그것의 리간드인, 하이포잔틴은 심홍색으로 도시되어 있다. 5GR-II 압타머는 청색으로 도시되어 있고 그것의 리간드인, 5HTP는 녹색으로 도시되어 있다.
도 16B는 P2 및 P3에서만 백본 원자를 사용한 두 RNA의 이중인화를 도시한다.
도 16C는 이 삼차 상호작용을 확립하는 개별 염기 상호작용의 완전한 보존을 도시하는, L2-L3 상호작용의 코어를 포함하는 두 염기 2배의 이중인화의 도를 묘사한다.
도 17A - 도 17D는 초기 RNA 라이브러리의 서열 및 이차 구조를 묘사한다. 녹색 박스는 프라이밍을 위해 사용된 불변 영역을 강조하고 황색 박스는 각각의 스캐폴드에 대해 특이적인 바코드를 강조한다. 개시 라이브러리에서 무작위 추출된 뉴클레오타이드 위치는 청록색으로 강조되어 있다.
도 17A는 SuperScript III RT를 사용한 선택에 대해 구아닌 리보스위치 압타머 (GR) RNA 라이브러리의 서열을 묘사한다.
도 17B는 GsI-IIC RT를 사용한 선택에 대해 사용된 GR RNA 라이브러리의 서열을 묘사한다.
도 17C는 이-환형 GMP 리보스위치 압타머 (CG) 라이브러리의 서열을 묘사한다. 도 17D는 헤머헤드 리보자임 (HR) 라이브러리의 서열을 묘사한다.
도 18A - 도 18C는 선택적으로 3,4-디하이드록시페닐알라닌 (L-DOPA)을 결합하는 스캐폴드된 압타머의 선택을 묘사한다.
도 18A는 도파민 (1) 및 L-DOPA (2)의 화학 구조를 묘사한다.
도 18B는 L-DOPA에 대한 GR-GsI-IIC 선택의 라운드 7로부터 유래된 서열의 거리 매트릭스의 뿌리가 없는 계통발생적 트리 표현을 묘사한다. 대표적인 서열이 플루오로제닉 바이오센서 안으로 편입된 4개의 클러스터가 독립적인 색상으로 도시되어 있다. 흑색 영역은 분석되지 않은 클러스터 및 트리의 영역을 나타낸다.
도 18C는 패널 (B)의 것과 일치하는 색상으로, 4개 클러스터의 공변이 모델을 묘사한다. DGR-III MFE 구조는 바르게 된다면 삼차 루프-루프 상호작용을 제거하는 대안적인 이차 구조를 갖는다는 것에 주의한다.
도 19는 GR 스캐폴드된 5HTP 결합 압타머의 SHAPE 분석을 묘사한다. 이 도면은 도 4A를 생성하기 위해 사용된 겔의 전체 서열분석 영역을 도시한다.
도 20은 GR-스캐폴드된 5HTP-결합 압타머의 SHAPE 분석을 묘사한다. 도 4A에 도시된 서열 분석 겔의 완전하고 변경되지 않은 이미지 (J2/3 및 L3에 상응하는 영역은 도 4A를 생산하도록 잘려졌다). 5GR-IV, -V 및 -VI 압타머의 SHAPE 분석은 5HTP의 부재 및 존재에서 묘사되어 있다. 측면에 대한 막대는 3WJ에서 다양한 리간드-의존적 보호 및 L2-L3 상호작용의 L3 진단에서 특성 반응성 핫스팟의 존재를 입증하는 J2/3 및 L3 영역을 강조한다.
도 21은 CG-스캐폴드된 5HTP-결합 압타머의 SHAPE 분석을 묘사한다. 원료 겔 (삽입부)은 J1/2 및 J2/3에서 명확한 리간드 의존적 변형을 나타낸다. 친계 Vc2 RNA는 테트라-루프 접촉 부위에서 P3에서의 리간드 의존적 보호를 나타내고, 반면에 5CG-I 압타머는 나선의 반대측 상에서 리간드 의존적 변형을 나타낸다. 추가로,
어느 RNA도 무관한 리간드의 존재에서 변형을 나타내지 않는다. 겔 아래 거리의 함수로 밴드의 통합이 하단에 도시되어 있다. 정규화 및 배정 후, 리간드 의존적 변화는 여전히, 특히 J1/2에서 분명하다 (별표로 착색됨).
도 22는 HR-스캐폴드된 5HTP-결합 압타머의 SHAPE 분석을 묘사한다. 원료 겔 (우측)은 J1/2 및 J2/3에서 명확한 리간드 의존적 변형을 나타낸다. J2/3에서의 변화는 예상된 T-루프 모티프의 위치 3 및 4에 주로 위치한다. 추가로, 만일 구조가 유지되는 경우, 친계 RNA에서 P2 안으로 도킹한 P3 (L3)의 말단 루프는 리간드-의존적 보호를 나타낸다. 겔 아래 거리의 함수로 밴드의 통합이 좌측 상에 도시되어 있다. 정규화 및 배정 후, 리간드 의존적 변화는 여전히 분명하다 (별표로 착색됨). 친계 헤머헤드 RNA (최상부 녹색 별표)에서의 동등한 부위에서 배경 절단은 없다는 것에 주의한다.
도 23은 G-블록으로 합성된 본 발명의 조작된 센서를 묘사한다. "N"은 A, C, G 및 T의 조성이 각각 대략 25%인 위치를 나타낸다. RNA 압타머 및 센서 서열은 그것의 동등한 DNA 서열로 주어진다. 브로콜리 센서의 별개의 도메인은 tRNA 스캐폴드 (회색), DFHBI-1T 결합 브로콜리 압타머 (황색), 연계 모듈 (청록색) 및 GR 스캐폴드된 압타머 (적색)을 나타내도록 코드화된 색상이다.
신규한 조절 및 감지 능력을 갖는 합성 RNA 및/또는 DNA 요소를 생산하는 수단은 시험관내 선택에 의해 강력하게 가능하게 되고 이용 가능한 합성 압타머의 풀은 현재 광범위하다. 그러나, 단지 소수의 소분자 결합 RNA 압타머 만이 그것의 동족 리간드의 효과적이고 널리 사용된 세포내 바이오센서 안으로 전이되거나 또는 다른 RNA 디바이스로 전이된다. 시험관내 결합과 세포내 활성 사이의 이 차이는 문제가 있어, 현행 선택 전략은 세포 환경에서 견고하게 기능할 수 있는 소분자 결합 RNA 압타머에 쉽게 접근할 수 없다는 것을 시사한다. 비록 소분자 결합 RNA에 대한 생체내 선택 전략이 하기에서 보다 성공적일 수 있다: 세포-가능한 압타머를 생성하는 것으로, 이들 접근법은 현재 광범위하게 실제적이지 않다. 따라서, 현행 전략은 향상된 기능을 위해 탠덤하고, 적용-특이적 선택으로 전통적 시험관내 선택을 결합하는 장기 작업흐름에 계속 의존하고 있다.
합성 압타머와 달리, 천연 리보스위치의 소분자 결합 도메인은 세포의 관점에서 진화되었고 그리고 높은 충실도 폴딩을 포함하는 리간드 결합 부위와 검출가능한 출력을 생성하도록 다운스트림 조절 스위치와 연통하는 능력을 넘어 신장하는 추가의 특징을 합체한다. 이들 압타머는 고도로 모듈화되고 강력하고, 광범위 스펙트럼의 박테리아 종에서 관측되고 그리고 전사, 번역, 대안적인 스플라이싱 및 mRNA 안정성에 대해 작용하는 다양한 조절 도메인과 상호작용한다. 따라서, 이들은 산출 (예를 들어, 유전자 조절)을 유도하는 인접한 도메인 또는 서열과 연통의 기전에 관해 고도로 유연하다. 이들 압타머는 합성 적용에서 성공적이었고 그리고 합성 RNA 도구를 입증하기 위해 사용되어 왔다. 비록 천연 압타머를 확인하고 특징화하기 위한 실질적인 노력이 있었지만, 이들은 모듈화하기 어려운 효과기 리간드의 내인성 풀에 기인하여 그것의 다양성 및 적용에서 본질적으로 제한된다.
이들 어려움에 대응하여, 모계의 강력한 폴딩 및 고도로 안정한 구축 특성을 보전하면서 소분자 결합 부위의 광범위 스펙트럼을 부여하는 시험관내 선택을 사용하여 프로그래밍될 수 있는 천연 RNA 압타머 및 작은 핵용융 리보자임에서 발견된 재현성 구축 접힘 및 그것의 사용 방법이 본 명세서에서 제공된다. 소분자 결합 압타머의 선택에서 부분적으로 구조화된 RNA 라이브러리를 사용하는 것이 이전에 이용되었지만, 그러나 이들 단순한 헤어핀 및 나선은 천연 압타머에 유사한 고차 구조를 형성할 가능성을 가지지 않는다. 테트라하이메나 리보자임 P456 도메인에서 말단 루프를 랜덤화함에 의해 아주 보통의 활성의 RNA 리가제 리보자임의 선택은 스캐폴드된 라이브러리에 대한 리보자임을 획득하는 것이 가능하다는 것을 실증했다. 그러나, P456 구조는 그룹 I 자가 스플라이싱 인트론의 IC1 및 IC2 서브클래스에 대해 크고 (160 뉴클레오타이드) 제한된다. 따라서, 이것은 세포 환경의 광범위 스펙트럼에서 활성인 다양한 소분자 결합 압타머를 키우는데 일반적인 플랫폼으로 아주 적합하지 않을 수 있다.
2개의 상이한 리보스위치 압타머 도메인 및 리보자임으로부터 유래된 스캐폴드를 사용하여, 5-하이드록시트립토판 (5HTP) 및/또는 세로토닌 (5HT)을 선택적으로 결합하는 다양한 세트의 압타머가 수득되었다. 각각의 스캐폴드가 인식을 위한 고유의 해결책을 제공하는 반면, 이들 모두는 유사한 결합 친화성으로 수렴되고 화학적으로 관련된 L-트립토판에 대해 식별한다. 이들 압타머는 플루오로제닉 및 스위치-기반 판독 모듈에 대한 커플링을 위한 구조적 스캐폴드로 되기 쉽다. 스크리닝 전략이 가변 정도의 성공을 충족하는 반면, 이 접근법을 사용하여 쉽게 달성된 압타머의 다양성은 실제적인 RNA 디바이스를 실행하는데 요구된 보다 적은 시험관내 특성규명으로 보다 유연한 전략을 가능하게 한다.
RNA-기반 디바이스는 합성 생물학에서 잠재적으로 강력하고 예측가능한 도구로 점점 더 주목 받고 있다. RNA는 시스로, 예측가능한 이차 구조, 및 작은 유전적 풋프린트를 제어하는 능력을 포함하여, 단백질-기반 대안에 비교할 때 제시된 고유의 특징을 갖는다. RNA 디바이스의 능력 후 더욱 모색되고 있는 것 중에는 외부 자극을 감지하고 추가의 단백질 인자의 부재에서 유전적 또는 표현형 반응을 조절하는 수용력이 있다. 합성 리보스위치, 압타자임 및 플루오로제닉 RNA 센서를 만드는데 노력이 집중되었지만, RNA 감지 도메인의 제한된 이용가능성에 부분적으로 기인하여 그것의 가능성은 여전히 완전하게 실현되지 못하고 있다. 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법은 선택을 위한 스캐폴드로 자연적으로 진화된 리보스위치 또는 리보자임을 사용하는 것이 현재까지의 최상의 인공 및 천연 압타머와 동등하게, 시험관내 및 세포 상황 양자에서 작용할 수 있는 강력한 감지 도메인을 생산할 수 있다는 것을 놀랍게도 입증한다.
본 명세서에서 기재된 조성물 및 방법의 핵심 강점은 한 조의 압타머를 얻기 위해 병렬적 선택에서의 다중 스캐폴드의 사용이다. 상이한 스캐폴드로부터 유래된 압타머는 5HTP에 대해 유사한 친화성과 L-트립토판에 대한 선택성을 가지지만, 이들은 분명히 모든 스캐폴드에 공통적 특징인 P1 나선을 통해 판독 도메인과 연통하는 그것의 능력에 관해서 뚜렷한 특성을 갖는다. 이론에 의한 구속됨 없이, 이것은 선택에서 완전하게 제어될 수 없는 특징인, 리간드와 영역간 (P1) 나선 사이의 공간적 관계에서의 변이에 기인한다는 것이 가정된다. 생물학적 리보스위치에서, 리간드는 압타머를 다운스트림 조절 스위치에 연결시키는 P1 나선을 포함하는 RNA에서 구조적 변화를 유도하거나 또는 직접 접촉한다.
한 조의 압타머로, 광범위한 압타머 특성규명 또는 디바이스 최적화 없이 원하는 특성을 갖는 센서에 대해 빠르게 스크린하는 조합 접근법이 이용될 수 있다. 전형적으로, 전통적 시험관내 선택은 단지 단일 소분자 결합 압타머를 생성하고, 그리고 RNA 디바이스의 개발은 감각 압타머를 고정된 노드로 남기면서 많은 연통 모듈 및 어댑터 서열을 스크리닝하는 것을 요한다. 스캐폴드된 선택 접근법으로, 일 세트의 뚜렷한 압타머가 일 세트의 연통 모듈에 조합적으로 커플링될 수 있고 그리고 원하는 활성을 갖는 변이체에 대해 빠르게 선별될 수 있다. 이 방식에서, 이 접근법은 RNA 디바이스 및 센서의 개발에서 주요한 병목 현상을 제거하여야 한다. 현저히, 이 연구에서 단지 가장 다수의 클러스터 만이 특성규명 및 센서 디자인을 위해 각각의 선택에서 초점을 맞추었지만, 각각의 선택 내에서 다운스트림 적용을 개발하기 위한 초기 압타머의 풀을 더욱 풍부하게 할 수 있는 대체 서열을 함유하는 많은 클러스터가 있었다.
이 선택 전략의 제2의 강력한 이점은 올리고뉴클레오타이드 접합 구조의 삼차 상호작용에 의해 제공된 세포 상황에서의 강력한 폴딩이다 (예를 들어, 3-방향 접합). 각각의 이들 압타머는 광범위한 생물학적 진화를 경험한 접힘을 가지고, 특히, 3-방향 접합 코어를 구성하는 원위 삼차 상호작용은 고도로 안정하다. 퓨린 리보스위치의 L2-L3 상호작용과 환형 디-GMP 리보스위치 스캐폴드의 테트라루프-테트라루프 수용체 둘 모두는 다른 RNA 구조의 상황의 외측을 안정적으로 형성할 수 있다. 이것은 대다수의 모집단이 규정된 이차 및 삼차 구조를 함유하도록 초기 라이브러리의 모든 구성원의 폴딩을 이들 요소가 잠재적으로 안내할 수 있게 한다. 미스폴딩은 전통적 합성 압타머에 대해 종종 중요한 문제로, 이것은 RNA 요소가 또 다른 RNA에 커플링되거나 더 큰 RNA의 상황에서 배치될 때 크게 악화될 수 있다. 전형적인 선택 프로토콜에서 높은 충실도 폴딩에 대한 상당한 선별 압력은 없기 때문에, 개시 라이브러리에 이 정보를 제공하는 것은 강력한 폴딩 RNA에 대한 경로일 수 있다.
비록 3-방향 접합 스캐폴드가 본 명세서에서 예시되지만, 천연 리보스위치 및 리보자임의 다양성은 이 접근법에 대한 추가의 공급원료를 제공할 수 있다. 3-방향 접합 계열 내에, 3개의 나선의 배향, 연결 영역의 크기 및 특정 리간드 또는 센서에 대해 우수한 스캐폴드를 제공할 수 있는 원위 삼차 상호작용의 성질을 다양하게 하는 광범위한 서열이 존재한다. 게다가, 다른 접힘은 동족 리간드의 성질에 기반하여 표적 소분자를 결합시키는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 5HTP를 결합하는 스캐폴드에 대한 또 다른 선택은 리간드 결합 부위를 수용하고 이것을 P1 나선에 인접하여 위치시키는 5-방향 접합을 함유하는 라이신 리보스위치 압타머 도메인이다. 더 큰 리간드는 스캐폴드로부터 유래된 플라빈 모노뉴클레오타이드 또는 코발라민 리보스위치에 의해 보다 쉽게 수용될 수 있는 반면, 디뉴클레오타이드 예컨대 NADH는 다른 이-환형 뉴클레오타이드 압타머의 하나에 의해 쉽게 수용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 스캐폴드된 선택 접근법은 RNA 디바이스를 사용하는 넓은 범위의 적용에 걸쳐 세포 환경에서 소분자를 모니터링하고 반응하는 강력한 신규한 도구의 개발을 촉진할 가능성을 갖는다.
일반적으로, 본 명세서에서 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 그리고 단백질과 핵산 화학 및 하이브리드화와 연관하여 사용된 명명법은 당 업계에서 잘-알려지고 통상적으로 사용된 것들이다. 본 명세서에서 제공된 방법 및 기술은 달리 나타내지 않는 한 당해 분야에서 잘 알려지고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 및 보다 특정한 참고문헌에서 기재된 것과 같은 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다.
효소적 반응 및 정제 기술은 당 업계에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 제조자의 사양에 따라 수행된다. 본 명세서에서 기재된 분석적 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약학적 화학과 연관하여 사용된 명명법 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당 업계에서 잘-알려지고 통상적으로 사용된 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 전달, 그리고 환자의 치료에 대한 표준 기술이 사용된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 과학적 및 기술 용어들은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적 다의성의 경우에 있어, 본 명세서에서 제공된 정의가 어떤 사전적 또는 외적인 정의보다 우선한다. 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어들은 복수를 포함하여야 하고 복수의 용어들은 단수를 포함하여야 한다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함된"의 사용은 비제한적이다.
그래서 본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어들이 먼저 정의된다.
용어들 "압타머" 및 "압타머 도메인"은 다양한 분자 표적 예컨대 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 및 기타 동종의 것에 높은 특이성 및 친화성으로 특이적으로 결합하는 짧은, 단일-가닥 DNA, RNA 또는 펩타이드 서열을 지칭한다. 압타머는 크기, 및 비-면역원성에서 일반적으로 아주 특이적이고, 비교적 작다. 항체에 유사하게, 압타머는 특이적 3차원 구조를 인식함에 의해 그것의 표적과 상호작용하고 따라서 "화학적 항체"로도 알려져 있다. 단백질 항체에 대조적으로, DNA 또는 RNA 압타머는 그것의 올리고뉴클레오타이드 특성에 기반하여 고유의 화학적 및 생물학적 특성을 제공한다.
용어 "리보스위치"는 소분자 리간드를 직접적으로 결합함에 의해 시스-방식으로 전사체에 대해 그것의 조절적 제어를 발휘하는 mRNA의 5′-미번역된 영역에서 통상적으로 발견된 요소를 지칭한다. 전형적인 리보스위치는 다음 2개의 뚜렷한 기능적 도메인을 함유한다: 리간드 결합 포켓을 스캐폴드하도록 컴팩트한 3차원 접힘을 채용하는 압타머 도메인; 및 전사 또는 번역 기계장치와 상호작용하는 이차 구조적 스위치를 함유하는 발현 플랫폼.조절은 스위칭 서열 알려진, 이들 두 도메인 사이의 중첩 영역에 의해 달성되며, 이 짝짓기는 mRNA의 온 및 오프 상태를 나타내는 발현 플랫폼에서 두 개의 상호 배타적인 구조 중 하나 안으로 RNA의 폴딩을 지시한다. 특정 예시적인 구현예에서, 바람직한 리보스위치는 B. 서브틸리스 xpt -pbuX 구아닌 리보스위치 (본 명세서에서 일명 "GR") 또는 비브리오 콜레라에 Vc2 환형 디-GMP 리보스위치 (본 명세서에서 일명 "CDG")이다.
용어 "리보자임"은 효소 작용하고, 단백질 효소의 작용에 유사한 특이적 생화학적 반응을 촉매 작용할 수 있는 RNA 분자를 지칭한다. 리보자임 부류는 GIR1 분지 리보자임, glmS 리보자임, 그룹 I 자가 스플라이싱 인트론, 그룹 II 자가 스플라이싱 인트론, 헤어핀 리보자임, 헤머헤드 리보자임 및 HDV 리보자임을 포함한다. 특정 예시적인 구현예에서, 바람직한 리보자임은 쉬스토소마 만소니 헤머헤드 리보자임 (본 명세서에서 일명 "HH")이다.
용어들 "합성 RNA 제제", "합성 DNA 제제", "바이오센서" 및 "스캐폴드"는 자연에 존재하는 압타머, 예를 들어, 리보스위치 및 리보자임으로부터 유래된 이차 및 삼차 구조적 스캐폴드를 포함하는 본 명세서에 기재된 핵산 감각 디바이스를 지칭한다. 본 발명의 "합성 RNA 제제", "합성 DNA 제제", "바이오센서" 또는 "구조적 스캐폴드"는 나선 도메인, 제1 및 제2 헤어핀 도메인, 그리고 리간드-결합 도메인을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 접합을 포함한다. 본 발명의 바이오센서는 N-방향 접합을 포함할 수 있고, 여기서 N은 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 바이오센서는 식 I에 따른 일련의 연결된 성분을 갖는 서열을 포함한다: (I) P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/1-, 여기서 "-"는 결합을 나타내고, "P1" 및 "P1'"은 나선을 형성하고, "P2," "L2" 및 "P2'"은 제1 헤어핀을 형성하고, "P3," "L3" 및 "P3'"은 제2 헤어핀을 형성하고 그리고 "J1/2," "J2/3" 및 "J3/1"은 함께 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성한다. (예를 들어, 도 1 참고.)
특정 구현예에서, 본 발명의 바이오센서는 이에 의해 리간드에 대한 모듈의 특이성 및/또는 친화성이 결정될 수 있는 "판독" 모듈을 포함한다. "판독"은 시각적으로 검출가능한 것, 예를 들어, 플루오로제닉 판독, 예컨대, 예를 들어 브로콜리일 수 있거나, 또는 본 명세서에서 추가로 기재된 바와 같이 리보스위치-기반 판독 또는 올리고뉴클레오타이드-기반 판독일 수 있다.
용어 "나선 도메인"은, 예를 들어, 수소, 휴그스틴 또는 역전된 휴그스틴 결합에 의해 함께 유지되고, 따라서 이중 나선 또는 삼중 나선 구조를 형성하는 두 개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
용어 "헤어핀 도메인"은 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 및 3' 말단이 서로 근접하게 되고 루프 구조를 형성하는 폴리뉴클레오타이드의 비-혼성화 부분에 의해 연결되도록 그 자체로 염기 쌍에 대한 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드 접합"은 리간드 결합 부위, 예를 들어, Gua 결합 부위를 형성하는 스캐폴드의 둘, 셋, 넷 또는 다섯 영역을 지칭한다. (예를 들어, 도 1 참고.)
용어 "올리고뉴클레오타이드 라이브러리"는 각각의 서열이 본 발명의 구조적 스캐폴드를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드 서열의 수집을 지칭하고, 여기서 각각의 구조적 스캐폴드는 적어도 나선 도메인, 제1 및 제2 헤어핀 도메인, 그리고 리간드-결합 도메인을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 접합을 포함한다.
특정 예시적인 구현예에서, 본 발명의 바이오센서에 결합하는 스크리닝 리간드 또는 테스트 화합물에 대한 검정이 제공된다. 본 발명의 테스트 화합물은 하기를 포함하여 당해 분야에서 알려진 조합 라이브러리 방법에서의 임의의 수많은 접근법을 사용하여 수득될 수 있다: 생물학적 라이브러리; 공간적으로 주소지정가능 평행한 고상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션을 요하는 합성 라이브러리 방법; "일-비드 일-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용한 합성 라이브러리 방법.생물학적 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리에 제한되는 반면, 다른 4가지 접근법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 대해 적용 가능하다 (Lam, K.S.(1997) Anticancer Drug Des.12:145).
용어 "뉴클레오사이드"는 리보오스 또는 데옥시리보스 당에 공유 결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 갖는 분자를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오사이드는 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘 및 티미딘을 포함한다. 추가의 예시적인 뉴클레오사이드는 이노신, 1-메틸 이노신, 슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 리보티미딘, 2N-메틸구아노신 및 2,2N,N-디메틸구아노신 (또한 일명 "드문" 뉴클레오사이드)을 포함한다. 용어 "뉴클레오타이드"는 당 모이어티에 에스테르 결합으로 연결된 하나 이상의 포스페이트 기를 갖는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트를 포함한다. 용어들 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 5'과 3' 탄소 원자 사이에 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 연결된 뉴클레오타이드의 폴리머를 지칭한다.
용어 "RNA" 또는 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"는 리보뉴클레오타이드의 폴리머 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 그 초과의 리보뉴클레오타이드)를 지칭한다. 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자" 또는 "데옥시리보핵산 분자"는 데옥시리보뉴클레오타이드의 폴리머를 지칭한다. DNA 및 RNA는 (예를 들어, 각각 DNA 복제 또는 DNA의 전사에 의해) 천연적으로 합성될 수 있다. RNA는 후-전사로 변형될 수 있다. DNA 및 RNA는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 및 RNA는 단일-가닥 (즉, 각각 ssRNA 및 ssDNA) 또는 다중-가닥 (예를 들어, 이중 가닥, 즉, 각각 dsRNA 및 dsDNA)일 수 있다. "mRNA" 또는 "메신저 RNA"는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열을 특정하는 단일-가닥 RNA이다. 이 정보는 리보솜이 mRNA에 결합할 때 단백질 합성 동안 번역된다.
용어 "뉴클레오타이드 유사체" 또는 "변경된 뉴클레오타이드" 또는 "변형된 뉴클레오타이드"는 비-자연 발생 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한, 비-표준 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오타이드 유사체는 그것의 의도된 기능을 수행하기 위해 뉴클레오타이드 유사체의 능력을 여전히 보유하면서 뉴클레오타이드의 특정 화학적 특성을 변경하기 위해 임의의 위치에서 변형된다. 유도될 수 있는 뉴클레오타이드의 위치의 예는 5 위치, 예를 들어, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘, 5-프로핀 우리딘, 5-프로페닐 우리딘, 등; 6 위치, 예를 들어, 6-(2-아미노)프로필 우리딘; 아데노신 및/또는 구아노신에 대한 8-위치, 예를 들어, 8-브로모 구아노신, 8-클로로 구아노신, 8-플루오로 구아노신, 등을 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어, 7-데아자-아데노신; O- 및 N-변형된 (예를 들어, 알킬화된, 예를 들어, N6-메틸 아데노신,또는 달리는 당 업계에서 알려진 바와 같은) 뉴클레오타이드; 및 다른 복소환식으로 변형된 뉴클레오타이드 유사체 예컨대 문헌 [Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310]에 기재된 것들을 포함한다.
뉴클레오타이드 유사체는 또한 뉴클레오타이드의 당 부분에 대한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 2' OH-기는 H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR, 또는 OR로부터 선택된 기에 의해 대체될 수 있고, 여기서 R은 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 등이다. 다른 가능한 변형은 하기 특허들에 기재된 것들을 포함한다: 미국특허 번호 5,858,988, 및 6,291,438.
뉴클레오타이드의 포스페이트 기는 또한, 예를 들어, 포스페이트 기의 산소 중 하나 이상을 황 (예를 들어, 포스포로티오에이트)으로 치환함에 의해, 또는, 뉴클레오타이드가 그것의 의도된 기능 예컨대, 예를 들어 하기 문헌과 특허에서 기재된 것과 같은 기능을 수행하도록 허용하는 다른 치환을 함에 의해 변형될 수 있다: Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski 등 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5):317-25, Vorobjev 등 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85, 및 미국특허번호 5,684,143.특정의 상기-언급된 변형 (예를 들어, 포스페이트 기 변형)은 바람직하게는, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내에서 상기 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 가수분해의 속도를 감소시킨다.
특정 예시적인 구현예에서, 검출가능한 표지가 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 검출가능한 마커의 예는 다양한 방사성 모이어티, 효소, 보철 그룹, 형광 마커, 발광성 마커, 생물발광 마커, 금속 입자, 단백질-단백질 결합 쌍, 단백질-항체 결합 쌍 및 기타 동종의 것을 포함한다. 형광 단백질의 예는, 비제한적으로, 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 염화물, 파이코에리트린 및 기타 동종의 것을 포함한다. 생물발광 마커의 예는, 비제한적으로, 루시퍼라아제 (예를 들어, 박테리아, 개똥벌레, 방아벌레 및 기타 동종의 것), 루시페린, 에쿼린 및 기타 동종의 것을 포함한다. 시각적으로 검출가능한 신호를 갖는 효소 시스템의 예는, 비제한적으로, 갈락토시다아제, 글루코리니다제, 포스파타제, 페록시다아제, 콜린에스테라아제 및 기타 동종의 것을 포함한다. 확인가능한 마커는 또한 방사성 화합물 예컨대125I, 35S, 14C 또는 3H를 포함한다. 확인가능한 마커는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
[0045] 형광 라벨 및 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드에 그것의 부착은 하기 문헌을 포함하여 많은 리뷰에 기재되어 있다: Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller and Manak, DNA Probes, 2nd Edition (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); and Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:227-259 (1991). 본 발명에 적용 가능한 특정 방법론은 하기 참조 샘플에서 개시되어 있다: 미국특허 번호 4,757,141, 5,151,507 및 5,091,519.일 양태에서, 하나 이상의 형광 염료는, 예를 들어, 하기에 의해 개시된 바와 같이 라벨링된 표적 서열에 대한 라벨로서 사용된다: 미국 특허번호 5,188,934 (4,7-디클로로플루오레세인 염료); 미국특허번호 5,366,860 (스펙트럼으로 용해성인 로다민 염료); 미국특허번호 5,847,162 (4,7-디클로로로다민 염료); 미국특허번호 4,318,846 (에테르-치환된 플루오레세인 염료); 미국특허번호 5,800,996 (에너지 전달 염료); Lee 등;미국특허번호 5,066,580 (잔틴 염료); 미국특허번호 5,688,648 (에너지 전달 염료); 및 기타 동종의 것.라벨링은 또한 하기 특허 및 특허 공보에서 개시된 바와 같이 양자점으로 수행될 수 있다: 미국특허 번호 6,322,901, 6,576,291, 6,423,551, 6,251,303, 6,319,426, 6,426,513, 6,444,143, 5,990,479, 6,207,392, 2002/0045045 및 2003/0017264.본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형광 표지"는 하나 이상의 분자의 형광 흡수 및/또는 방출 특성을 통해 정보를 전달하는 신호전달 모이어티를 포함한다. 이러한 형광 특성은 형광 강도, 형광 수명, 방출 스펙트럼 특성, 에너지 전달, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드 유사체의 짧은 폴리머를 지칭한다. 용어 "RNA 유사체" 또는 "DNA 유사체"는 상응하는 비변경된 또는 비변형된 DNA 또는 RNA에 비교할 때 적어도 하나의 변경된 또는 변형된 뉴클레오타이드를 가지지만 상응하는 비변경된 또는 비변형된 DNA 또는 RNA와 동일 또는 유사한 특성 또는 기능을 보유하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드)를 지칭한다. 상기에 논의된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 결합을 갖는 RNA 또는 DNA 분자에 비교할 때 RNA 또는 DNA 유사체의 가수분해의 보다 낮은 속도를 초래하는 연결기와 연결될 수 있다. 예를 들어, 유사체의 뉴클레오타이드는 메틸렌디올, 에틸렌디올, 옥시메틸티오, 옥시에틸티오, 옥시카보닐옥시, 포스포로디아미데이트, 포스포로아미데이트, 및/또는 포스포로티오에이트 연결기를 포함할 수 있다. 바람직한 RNA 또는 DNA 유사체는 당- 및/또는 백본-변형된 리보뉴클레오타이드 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변경 또는 변형은 추가로, 예컨대 RNA 또는 DNA의 말단(들)에 또는 내부적으로 (RNA 또는 DNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에) 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 RNA" 또는 "단리된 DNA"는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 RNA 또는 DNA 분자를 지칭한다.
용어 "시험관내"는 예를 들어, 정제된 시약 또는 추출물, 예를 들어, 세포 추출물을 포함하여, 그것의 기술에 인식된 의미를 갖는다. 용어 "생체내"는 또한 예를 들어, 살아있는 세포, 예를 들어, 유기체에서 불멸화된 세포, 일차 세포, 세포주, 및/또는 세포를 포함하여, 그것의 기술에 인식된 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이식유전자"는 인공물에 의해 세포 안으로 삽입되고 세포로부터 발생하는 유기체의 게놈의 일부가 되는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 그와 같은 이식유전자는 형질전환 유기체에 부분적으로 또는 전적으로 이종성 (즉, 외래)인 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 유기체의 내인성 유전자에 상동성인 유전자를 나타낼 수 있다. 용어 "이식유전자"는 또한 형질전환 동물에 부분적으로 또는 전적으로 이종성, 즉, 외래이거나, 또는 형질전환 동물의 내인성 유전자에 상동성이지만, 천연 유전자의 것과 상이한 위치에서 동물의 게놈 안으로 삽입되도록 설계된 형질전환 유기체, 예를 들어, 동물에서 하나 이상의 조작된 RNA 전구체가 발현되도록 인코딩하는 하나 이상의 선택된 핵산 서열, 예를 들어 DNA를 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 이식유전자는 선택된 핵산 서열의 발현을 위해 필요하고, 모두 선택된 서열에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 프로모터 및 임의의 다른 DNA, 예컨대 인트론을 포함하고, 그리고 향상제 서열을 포함할 수 있다.
질환 또는 장애에 "관여된" 유전자는 그의 정상 또는 비정상적인 발현 또는 기능이 질환 또는 장애 또는 상기 질환 또는 장애 중 적어도 하나의 증상을 유발 또는 야기하는 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "샘플 모집단"은 통계적으로 상당한 수의 개체를 포함한 개체의 모집단을 지칭한다. 예를 들어, 샘플 모집단은 50, 75, 100, 200, 500, 1000 또는 그 초과의 개체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플 모집단은 적어도 일반 질환 표현형 (예를 들어, 기능획득 장애) 또는 돌연변이 (예를 들어, 기능획득 돌연변이)에 대해 공유하는 개체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이형접합성"은 특정 유전자좌 (예를 들어, SNP)에서 이종접합성인 (예를 들어, 둘 또는 그 초과의 상이한 대립유전자를 함유하는) 모집단 내의 개체의 분획을 지칭한다. 이형 접합성은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법을 사용하여 샘플 모집단에 대해 계산될 수 있다.
어구 "세포 또는 유기체에서 유전자의 기능을 시험하는 것"은 그로부터 발생하는 발현, 활성, 기능 또는 표현형을 시험하거나 연구하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "드문 뉴클레오타이드"는 드물게 발생하는 자연 발생 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 구아노신, 아데노신, 시토신, 또는 우리딘이 아닌 자연 발생 리보뉴클레오타이드를 포함하여, 드물게 발생하는 자연 발생 뉴클레오타이드를 지칭한다. 드문 뉴클레오타이드의 예는, 비제한적으로, 이노신, 1-메틸 이노신, 슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 리보티미딘, 2N-메틸구아노신 및 2,2N,N-디메틸구아노신을 포함한다.
조작된 RNA 전구체, 또는 조작된 핵산 분자에서와 같이, 용어 "조작된"은 전구체 또는 분자의 핵산 서열의 전부 또는 일부가 인간에 의해 생성되거나 또는 선택될 수 있다는 점에서, 전구체 또는 분자가 자연에서 발견되지 않는다는 것을 나타낸다. 일단 생성되거나 또는 선택되면, 본 서열은 세포 내의 기전에 의해, 복제, 번역, 전사, 또는 달리는 가공될 수 있다. 따라서, 조작된 핵산 분자를 유도하는 이식유전자로부터 세포 내에서 생산된 RNA 전구체는 조작된 RNA 전구체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "접착 강도" 또는 "염기 쌍 강도"는 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스의 대향하는 가닥 상의 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체)의 쌍 사이에서, 상기 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체) 간의 H-결합, 반데르발스 상호작용, 및 기타 동종의 것에 주로 기인한, 상호작용의 강도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "불안정한 뉴클레오타이드"는 염기 쌍이 통상적인 염기 쌍 (즉, 왓슨-크릭 염기 쌍)보다 낮은 접착강도의 것이 되도록 제2 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체와 염기 쌍을 형성할 수 있는 제1 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 불안정한 뉴클레오타이드는 제2 뉴클레오타이드와 미스매치 염기 쌍을 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 불안정한 뉴클레오타이드는 2 뉴클레오타이드와 워블 염기 쌍을 형성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 불안정한 뉴클레오타이드는 2 뉴클레오타이드와 모호한 염기 쌍을 형성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 불안정한 뉴클레오타이드는 벌지를 형성할 수 있고, 상기 불안정한 뉴클레오타이드는 제2 뉴클레오타이드와 쌍을 이루지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "염기 쌍"은 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스의 대향하는 가닥 상의 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체)의 쌍 사이에서, 상기 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체) 간의 H-결합, 반데르발스 상호작용, 및 기타 동종의 것에 주로 기인한, 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "접착 강도" 또는 "염기 쌍 강도"는 염기 쌍의 강도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "미스매치된 염기 쌍"은 비-상보적 또는 비-왓슨-크릭 염기 쌍으로 구성된 염기 쌍을 지칭하고, 예를 들어, 정상 상보적 G:C, A:T 또는 A:U 염기 쌍이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "모호한 염기쌍" (비-차별적 염기 쌍으로도 알려짐)은 보편적인 뉴클레오타이드에 의해 형성된 염기 쌍을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "보편적인 뉴클레오타이드" ("중성 뉴클레오타이드"로도 알려짐)는 염기 쌍을 형성할 때 상보적 폴리뉴클레오타이드 상에 염기들 사이에서 상당히 차별하지 않는 염기 ("보편적인 염기" 또는 "중성 염기")를 갖는 이들 뉴클레오타이드 (예를 들어 특정 불안정한 뉴클레오타이드)를 포함한다. 보편적인 뉴클레오타이드는 우세하게 축적하는 상호작용에 기인하여 역평행 듀플렉스 핵산 (예를 들어, 이중-가닥 DNA 또는 RNA)으로 효율적으로 팩킹할 수 있는 소수성 분자이다. 보편적인 뉴클레오타이드의 염기 부는 전형적으로 질소-함유 방향족 복소환형 모이어티를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "충분한 상보성" 또는 "충분한 상보성의 정도"는 올리고뉴클레오타이드 서열이 원하는 표적 올리고뉴클레오타이드에 결합하기에 충분히 상보적이다는 것을 의미한다.
본 발명의 다양한 방법론은 값, 수준, 특징, 특징적인 것, 특성, 등을, 본 명세서에서 "적절한 대조군"로 교환가능하게 언급된 "적합한 대조군"에 비교하는 것을 포함하는 단계를 포함한다. "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 비교 목적에 대해 유용한 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 임의의 대조군 또는 표준이다. 일 구현예에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 방법론을 수행하기 이전에 결정된 값, 수준, 특징, 특징적인 것, 특성, 등이다. 예를 들어, 전사 속도, mRNA 수준, 번역 속도, 단백질 수준, 생물학적 활성, 세포 특징 또는 특성, 유전자형, 표현형, 등은 세포 또는 유기체 안으로 본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제를 도입하기 이전에 결정될 수 있다. 또 다른 구현예에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은, 예를 들어, 정상 특성을 나타내는, 세포 또는 유기체, 예를 들어, 대조군 또는 정상 세포 또는 유기체에서 결정된 값, 수준, 특징, 특징적인 것, 특성, 등이다. 또 다른 구현예에서, "적합한 대조군" 또는 "적절한 대조군"은 사전 규정된 값, 수준, 특징, 특징적인 것, 특성, 등이다.
본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제는 세포 안으로 (즉, 세포내로) 직접적으로 도입될 수 있거나, 또는 공동으로, 틈새 공간, 유기체의 순환으로 세포외로 도입될 수 있거나, 경구로 도입될 수 있거나, 또는 세포 또는 유기체를 핵산을 함유하는 용액에서 함침시킴에 의해 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프 시스템, 및 뇌척수액은 합성 RNA 또는 DNA 제제가 도입될 수 있는 부위이다.
본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제는, 핵산을 함유하는 용액의 주입, RNA 제제에 의해 덮인 입자에 의한 폭격, 세포 또는 유기체를 RNA 제제의 용액에 침지시키는 것, 또는 RNA 제제의 존재에서 세포막의 전기천공을 포함하여 당해 분야에서 알려진 핵산 전달 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 지질-매개된 담체 수송, 화학적-매개된 수송, 및 양이온성 리포좀 형질감염 예컨대 인산 칼슘, 및 기타 동종의 것과 같은 세포에 핵산을 도입하기 위한 당해 분야에서 알려진 다른 방법이 사용될 수 있다. 합성 RNA 또는 DNA 제제는 하기 활성 중 하나 이상을 수행하는 다른 성분과 함께 도입될 수 있다: 세포에 의한 핵산 흡수를 고양하거나 또는 달리 표적 유전자의 억제를 증가시키는 것.
핵산을 도입하는 물리적 방법은 바이오센서를 함유하는 용액의 주입, 바이오센서에 의해 덮인 입자에 의한 폭격, 세포 또는 유기체를 바이오센서의 용액에 침지시키는 것, 또는 바이오센서의 존재에서 세포막의 전기천공을 포함한다. 바이러스 입자 안으로 포장된 바이러스 작제물은 세포 안으로 발현 작제물의 효율적인 도입 및 발현 작제물에 의해 인코딩된 RNA의 전사 둘 모두를 달성할 것이다. 지질-매개된 담체 수송, 화학적-매개된 수송, 예컨대 인산 칼슘, 및 기타 동종의 것과 같은 세포로 핵산을 도입하는 당해 분야에서 알려진 다른 방법이 사용될 수 있다. 따라서 RNA는 하기 활성 중 하나 이상을 수행하는 성분과 함께 도입될 수 있다: 세포에 의한 RNA 흡수를 고양하거나, 단일 가닥의 어닐링을 억제하거나, 단일 가닥을 안전화시키거나, 또는 다른 방식으로 표적 유전자의 억제를 증가시키는 것.
합성 RNA 또는 DNA 제제는 세포 안으로 (즉, 세포내로) 직접적으로 도입될 수 있거나, 또는 공동으로, 틈새 공간, 유기체의 순환으로 세포외로 도입될 수 있거나, 경구로 도입될 수 있거나, 또는 세포 또는 유기체를 RNA 또는 DNA를 함유하는 용액에서 함침시킴에 의해 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프 시스템, 및 뇌척수액은 RNA 또는 DNA가 도입될 수 있는 부위이다.
표적 세포는 생식 계열 또는 체세포, 분화전능성 또는 만능, 분열하는 또는 비-분열하는, 실질 또는 상피, 불멸화된 또는 전환된 세포, 등으로부터의 것일 수 있다. 세포는 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있다. 분화된 세포 유형은 지방세포, 섬유모세포, 근세포, 심근세포, 내피, 뉴런, 신경교,혈구, 거핵구, 림프구, 대식세포, 중성구, 호산구, 호염기구, 비만세포, 백혈구, 과립구, 각질형성세포, 연골세포, 골아세포, 파골세포, 간세포, 및 내분비 또는 외분비 샘의 세포를 포함한다.
합성 RNA 또는 DNA 제제는 세포당 적어도 하나의의 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 물질의 더 높은 용량 (예를 들어, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000 카피) 더 효과적인 억제를 생성할 수 있고; 보다 낮은 용량은 또한 특이적 적용에 대해 유용할 수 있다.
예시적인 양태에서, 본 발명의 바이오센서의 효능은 세포에서 표적의 전사, 번역, 대안적인 스플라이싱 및/또는 mRNA 안정성을 구체적으로 조절하는 그것의 능력에 대해 시험된다. 세포는 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 바이오센서로 형질감염될 수 있다. 표적 DNA, 표적 RNA (예를 들어, mRNA) 및/또는 표적 단백질에서 선택적 감소가 측정된다. 표적 DNA, RNA 또는 단백질의 감소는 바이오센서의 부재 또는 DNA, RNA 또는 단백질을 표적화하지 않는 바이오센서의 존재에서의 표적 DNA, RNA 또는 단백질의 수준에 비교될 수 있다. 외인성으로-도입된 DNA, RNA 또는 단백질은 비교하기 위해 분석될 수 있다. 표준 형질감염 기술에 대해 어느 정도 저항성인 것으로 알려진 신경 세포를 이용할 때, 수동적인 흡수에 의해 바이오센서를 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선 또는 영향을 주기 위한 목적으로, 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 증상 또는 질환 또는 장애에 대한 소인이 있는, 환자에게 치료제 (예를 들어, 합성 RNA 또는 DNA 제제)의 적용 또는 투여, 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포 주에 치료제의 적용 또는 투여로 정의된다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에게 치료제 (예를 들어, 합성 RNA 또는 DNA 제제 또는 이를 인코딩하는 벡터 또는 이식유전자)를 투여함에 의해 대상체에서 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 질환에 대한 위험이 있는 대상체는, 예를 들어, 임의의 진단 또는 예후 또는 그 조합에 의해 확인될 수 있다. 예방적 제제의 투여는 질환 또는 장애가 예방되거나, 대안적으로, 그것의 진행이 지연되도록, 질환 또는 장애에 특징적인 증상의 징후 이전에 발생할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료적으로 대상체를 치료하는 방법에 속하고, 즉 질환 또는 장애의 증상의 개시를 변경한다. 예시적인 구현예에서, 본 발명의 조절 방법은, 표적 서열과 서열 특이적 상호작용이 달성되도록, 장애를 발현하는 세포를 하나 이상의 표적 서열에 대해 특이적인 치료제 (예를 들어, 합성 RNA 또는 DNA 제제 또는 이를 인코딩하는 벡터 또는 이식유전자)와 접촉시키는 것을 포함한다. 이들 방법은 시험관내 (예를 들어, 세포를 제제와 함께 배양함에 의해) 또는, 대안적으로, 생체내 (예를 들어, 대상체에게 제제를 투여함에 의해)에서 수행될 수 있다.
예방적 및 치료적 치료 방법 둘 모두에 관하여, 이러한 치료는 약물유전체학의 분야로부터 수득된 지식에 기반하여 구체적으로 맞추어질 수 있거나 또는 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "약물유전체학"은 임상 개발에서 및 시장에서 약물에 대한 게놈 기술 예컨대 유전자 서열분석, 통계적인 유전학, 및 유전자 발현 분석의 적용을 지칭한다. 더 구체적으로, 본 용어는 환자의 유전자가 약물에 대한 그의 반응 (예를 들어, 환자의 "약물 반응 표현형" 또는 "약물 반응 유전자형")을 결정하는 방법에 대한 연구를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 그 개별의 약물 반응 유전자형에 따라 본 발명의 표적 유전자 분자 또는 표적 유전자 조절 물질로 개체의 예방적 또는 치료적 처치를 조절하는 방법을 제공한다. 약물유전체학은 임상의 또는 의사가 치료로부터 가장 이점이 있을 환자에게 예방적 또는 치료적 처치를 목표로 하고 독성 약물-관련된 부작용을 경험할 환자의 치료를 피할 수 있게 한다.
치료제는 적절한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 합성 RNA 또는 DNA 제제 (또는 이들을 인코딩하는 발현 벡터 또는 이식유전자)가 상기 제제로 치료의 효능, 독성, 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 치료제는 그와 같은 제제의 작용기전을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제제는 그와 같은 제제로 치료의 효능, 독성, 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 제제는 그와 같은 제제의 작용기전을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다.
본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제를 함유하는 약제학적 조성물은 장애가 있거나 또는 전개할 위험이 있는 것으로 진단된 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 환자는 장애가 있는 것으로 진단되고, 그리고 환자는 달리는 일반적으로 양호한 건강상태이다. 예를 들어, 환자는 치명적으로 병들지 않고, 환자 진단 후 적어도 2, 3, 5 또는 그 초과의 년 동안 생존하기 쉽다. 환자는 진단 후 즉시 치료될 수 있거나, 또는 치료는 환자가 더 쇠약하게 되는 증상을 겪을 때까지 지연될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 환자는 질환의 진전 단계에 도달하지 않았다.
합성 RNA 또는 DNA 제제는 약 1.4 mg 미만 / 체중 kg, 또는 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 또는 0.00001 mg 미만 / 체중 kg, 및 200 nmole 미만의 RNA 제제 (예를 들어, 약 4.4 x 1016 카피) / 체중 kg, 또는 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015 nmole 미만의 합성 RNA 또는 DNA 제제/ 체중 kg의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 단위 용량은 주입 (예를 들어, 정맥내 또는 근육내, 척추강내로, 또는 직접적으로 뇌 안으로), 흡입된 용량, 또는 국소 도포에 의해 투여될 수 있다. 특히 바람직한 투약량은 2, 1, 또는 0.1 mg 미만/체중 kg이다.
장기로 직접적으로 합성 RNA 또는 DNA 제제의 전달은 장기당 약 0.00001 mg 내지 약 3 mg, 또는 바람직하게는 장기당 약 0.0001-0.001 mg, 장기당 약 0.03-3.0 mg, 눈 당 약 0.1-3.0 mg 또는 장기당 약 0.3-3.0 mg의 정도인 투약량으로 될 수 있다. 투약량은 장애를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양일 수 있다. 일 구현예에서, 단위 용량은 1일 1회보다 덜 빈번하게, 예를 들어, 매 2, 4, 8 또는 30일보다 덜 빈번하게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 단위 용량은 빈도로 투여되지 않는다 (예를 들어, 규칙적 빈도로 되지 않는다). 예를 들어, 단위 용량은 단일 회 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 효과적인 용량은 다른 전통적 치료적 양식으로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체에는 합성 RNA 또는 DNA 제제의 초기 용량, 및 하나 이상의 유지 용량이 투여된다. 유지 용량 또는 용량들은 일반적으로 초기 용량보다 낮고, 예를 들어, 초기 용량의 2분의 1보다 낮다. 유지 요법은 0.01 ㎍ 내지 1.4 mg/체중 kg/일, 예를 들어, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 0.00001 mg/체중 kg/일의 범위인 용량 또는 용량들로 대상체를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 유지 용량은 바람직하게는 매 5, 10, 또는 30일마다 한번 이하로 투여된다. 또한, 치료 요법은 특정한 질환, 그것의 중증도 및 환자의 전체적인 상태의 특성에 의존하여 다양하게 되는 기간 동안 지속할 수 있다. 바람직한 구현예에서 투약량은 1일 1회 이하, 예를 들어, 24, 36, 48, 또는 그 초과의 시간당 1회 이하, 예를 들어, 매 5 또는 8일에 1회 이하로 전달될 수 있다. 치료에 이어서, 환자는 그의 상태에서의 변화, 및 질환 상태의 증상의 완화에 대해 모니터링될 수 있다. 화합물의 투약량은 환자가 현행 투약량 수준에 대해 상당히 반응하지 않는 경우에 증가될 수 있거나, 또는 질환 상태의 증상의 완화가 관측되거나, 질환 상태가 제거되거나, 또는 원하지 않는 부작용이 관측되는 경우, 용량은 줄어들 수 있다.
효과적인 용량은 특이적 상황 하에서 원하는 대로 또는 적절히 고려된 대로, 단일 용량 또는 2회 이상 용량으로 투여될 수 있다. 반복된 또는 빈번한 주입을 용이하게 하기 위해 요망하는 경우, 전달 장치, 예를 들어, 펌프, 반-영구적 스텐트 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 낭내 또는 관절내), 또는 저장소의 이식이 권장될 수 있다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 복수의 합성 RNA 또는 DNA 제제 종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 합성 RNA 또는 DNA 제제 종은 자연 발생 표적 서열에 관해 또 다른 종에 비-중첩 및 비-인접한 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 복수의 합성 RNA 또는 DNA 제제 종은 상이한 자연 발생 표적에 대해 특이적이다. 또 다른 구현예에서, 복수의 합성 RNA 또는 DNA 제제 종은 둘 또는 그 초과의 표적 서열 (예를 들어, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 초과의 표적 서열)을 표적으로 한다.
성공적인 치료에 이어서, 질환 상태의 재발을 예방하기 위해 환자가 유지 요법을 겪게 하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 본 발명의 화합물은 0.01㎍ 내지 100 g / 체중 kg의 범위로 되는 유지 용량으로 투여된다 (하기 참고: 미국특허 번호 6,107,094).
합성 RNA 또는 DNA 제제 조성물의 농도는 장애를 치료 또는 예방하는데 효과적이거나 또는 인간에서의 생리적 병태를 조절하는데 충분한 양이다. 투여된 합성 RNA 또는 DNA 제제의 농도 또는 양은 제제에 대해 결정된 파라미터 및 투여의 방법, 예를 들어 비강, 볼, 또는 폐에 의존할 것이다. 예를 들어, 비강 제형은 콧구멍의 자극 또는 연소를 피하기 위해 일부 성분의 농도를 훨씬 더 낮게 요구하는 경향이 있다. 적합한 비강 제형을 제공하기 위해 경구 제형을 10-100배 희석하는 것이 때로 바람직하다.
특정 인자는 비제한적으로 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하여, 환자를 효과적으로 치료하는데 요구된 투약량에 영향을 미칠 수 있다. 나아가, 치료적 유효량의 합성 RNA 또는 DNA 제제로 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 치료를 위한 합성 RNA 또는 DNA 제제의 효과적인 투약량은 특정 치료 과정 동안 증가 또는 감소할 수 있음이 또한 인정될 것이다. 투약량의 변화는 본 명세서에 기재된 바와 같은 진단 검정의 결과로 나타나고 이로부터 분명해질 수 있다. 예를 들어, 대상체는 합성 RNA 또는 DNA 제제 조성물을 투여한 후 모니터링될 수 있다. 모니터링으로부터의 정보에 기반하여, 합성 RNA 또는 DNA 제제 조성물의 추가의 양이 투여될 수 있다.
투약은 수일에서 수개월까지, 또는 치료가 유효하게 되거나 질병 상태의 축소가 달성될 때까지 지속하는 치료의 과정으로, 치료되는 질환 상태의 중증도 및 반응성에 의존한다. 최적의 투약 계획은 환자 몸에서의 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 통상적인 기술자는 최적의 투약량, 투약 방법론 및 반복 비율을 쉽게 결정할 수 있다. 최적의 투약량은 개별 화합물의 상대적 효력에 의존하여 다양할 수 있고, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50을 기반으로 추정될 수 있다.
본 발명은 아래에 기재된 바와 같은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 상기-기재된 제제의 사용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 조절제 (예를 들어, 합성 RNA 또는 DNA 제제)는 투여를 위해 적합한 약제학적 조성물 안으로 편입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 핵산 분자, 단백질, 항체, 또는 조절 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 언어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 동종의 것을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적으로 활성 서브스턴스에 대한 이러한 배지 및 제제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 활성 화합물과 양립불가능한 경우를 제외하고, 조성물에 이들의 사용이 고려된다. 보충의 활성 화합물이 또한 조성물 안으로 편입될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 양립 가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내 (IV), 진피내, 피하 (SC 또는 SQ), 복강내, 근육내, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 및 경점막 투여를 포함한다. 비경구, 진피내, 또는 피하 적용을 위해 사용된 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용 물, 염수 용액, 고정 유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸파라벤; 산화 방지제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성의 조정용 제제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스.pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어 진 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사가능 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사가능 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위해 멸균 수용액 (여기서 수용성) 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 캐리어는 생리적 염수, 정균물, 크레모포어 ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 반드시 멸균되어야 하고 용이한 주사성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 그것은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정하여야 하고, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균류의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타 동종의 것), 및 적합한 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유체성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살, 및 기타 동종의 것에 의해 달성될 수 있다. 많은 사례에서, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴에 의해 초래될 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 요구되는 바와 같이 활성 화합물을 적절한 용매에서 상기에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 요구된 양으로 합체하고, 이어서 여과된 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을, 염기성 분산매 및 상기 열거된 것으로부터 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴에 의해 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 그것의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 청결제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 유체 담체 내의 화합물은 경구로 도포되고 씻기거나 뱉거나 삼키게 된다. 약제학적으로 양립가능한 결합제, 및/또는 아쥬반트 물질은 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 및 기타 동종의 것은 임의의 하기 성분, 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정성 셀룰로스, 트라가칸쓰 검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 스테아르산 마그네슘 또는 스테로테스; 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제 예컨대 박하, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미제.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 가스 예컨대 이산화탄소, 또는 분무기를 함유하는 가압된 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투되는 장벽에 대해 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당 업계에서 알려져 있고, 예를 들어, 경점막 투여에 대해, 세제, 담즙산 염, 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 일반적으로 당 업계에서 알려진 바와 같은 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 직장 전달을 위한 (예를 들어, 통상적인 좌약 기재 예컨대 코코아버터 및 다른 글리세라이드와 함께) 좌약 또는 체류 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
합성 RNA 또는 DNA 제제는 또한, 비제한적으로 하기 문헌에서 기재된 방법을 포함하여 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 형질감염 또는 감염에 의해 투여될 수 있다: McCaffrey 등 (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (유체역학적 형질감염); Xia 등 (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (바이러스-매개된 전달); 또는 Putnam (1996), Am. J. Health Syst.Pharm.53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst.Pharm.53(3), 325 (1996).
합성 RNA 또는 DNA 제제는 또한 DNA 백신과 같은, 핵산 제제의 투여를 위해 적합한 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 이들 방법은 하기를 포함한다: 유전자 건, 생체 주사기, 및 피부 패치뿐만 아니라바늘-없는 방법 예컨대 마이크로-입자 DNA 백신 기술로 하기에 개시된 것: 미국특허 번호 6,194,389, 및 하기에 개시된 바와 같은 분말-형태 백신으로 포유동물 경피 바늘-없는 백신접종: 미국특허 번호 6,168,587.추가로, 비강내 전달이 특히 하기 문헌에 기재된 바와 같이 가능하다: Hamajima 등 (1998), Clin.Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10.리포좀 (예를 들어, 하기에 기재된 것: 미국특허 번호 6,472,375) 및 미세캡슐화가 또한 사용될 수 있다. 생분해성 표적화가능 극미립자 전달 시스템이 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 하기에 기재된 것: 미국특허 번호 6,471,996).
일 구현예에서, 활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절 방출 제형과 같이 신체로부터 신속 제거에 대해 화합물을 보호할 캐리어와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 단클론성 항체로 감염된 세포에 대해 표적화된 리포좀을 포함함)은 또한 약제학적으로 허용가능한 캐리어로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이 당해 분야의 숙련가에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다: 미국특허 번호 4,522,811.
투여의 용이와 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 투약량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대해 일원화된 투약량으로 적합화된 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구된 약제학적 담체와 회합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 사전 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투약량 단위 형태에 대한 명세는 활성 화합물의 고유의 특성과 달성되는 특정한 치료 효과 및 개체의 치료를 위한 그와 같은 활성 화합물을 배합하는 당 업계에 내재된 제한에 의해 지시되고 그리고 직접적으로 의존한다.
그러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, LD50 (50%의 모집단에 치명적인 용량) 및 ED50 (50%의 모집단에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는, 세포 배양 또는 실험적 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고 이것은 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료적 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 비록 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고 그것에 의해 부작용을 감소시키기 위해 감염된 조직의 부위에 이러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 치료가 취해져야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 투약량의 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투약량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내로 된다. 투약량은 이용된 투약형태 및 이용된 투여경로에 의존하여 이 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 임의의 화합물에 대해, 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정될 때 EC50 (즉, 절반-최대 반응을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
약제학적 조성물은 투여에 대한 선택적인 지침과 함께 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 합성 RNA 또는 DNA 제제의 치료적 유효량 (즉, 효과적인 투약량)은 선택된 합성 RNA 또는 DNA 제제에 좌우된다. 예를 들어, 대략 1 ㎍ 내지 1000 mg의 범위인 단일 용량이 투여될 수 있다; 일부 구현예에서, 10, 30, 100 또는 1000 ㎍이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 1-5 g의 조성물이 투여될 수 있다. 조성물은 격일로 1회를 포함하여, 1일당 1회 이상 내지 주당 1회 이상까지 투여될 수 있다. 숙련가는 비제한적으로 질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함한 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구된 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 인정할 것이다. 나아가, 치료적 유효량의 합성 RNA 또는 DNA 제제로 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나 또는, 바람직하게는, 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는, 예를 들어, 비제한적으로 Xia 등, (2002), 상동에 기재된 것들을 포함하여, 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여, 발현 작제물, 예를 들어, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 발현 카세트, 또는 플라스미드 바이러스 벡터 안으로 삽입될 수 있다. 발현 작제물은 하기에 의해 대상체에게 전달될 수 있다: 예를 들어, 흡입, 경구로, 정맥내 주사, 국소 투여 (하기 참고: 미국특허 번호 5,328,470) 또는 뇌정위적 주사 (하기 참고: 예를 들어, Chen 등 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057). 전달 벡터의 약제학적 제제는 허용가능한 희석제 내 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 전달 비히클이 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터로부터 온전히 생산될 수 있고, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
전달 경로는 환자의 장애에 의존적일 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 대상체에 IV 또는 SC 투여에 의해 본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제가 투여될 수 있다. 본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제에 부가하여, 환자에 제2 요법, 예를 들어, 일시적 처방 요법 및/또는 질환-특이적 요법이 투여될 수 있다. 이차 요법은, 예를 들어, 증상적 (예를 들어, 증상을 경감하기 위함), 보호성 (예를 들어, 질환 진행을 늦추거나 중단하기 위함), 또는 회복적 (예를 들어, 질환 과정을 역전하기 위함) 요법일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제는 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 국소 전달은 눈, 점막, 체강의 표면을 포함한 신체의 임의의 표면, 또는 임의의 내부 표면에 합성 RNA 또는 DNA 제제의 직접적인 적용을 지칭할 수 있다. 국소 투여를 위한 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭스, 스프레이, 및 액체를 포함할 수 있다. 종래의 약제학적 캐리어, 수성, 분말 또는 오일성 베이스, 증점제 및 기타 동종의 것이 필요하거나 또는 바람직할 수 있다. 국소 투여는 또한 선택적으로 대상체의 표피 또는 진피에, 또는 이들의 특정한 지층에 또는 하부 조직에 합성 RNA 또는 DNA 제제를 전달하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다.
척추강내 또는 심실내 투여를 위한 조성물은, 또한 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있는, 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 척추강내 또는 심실내 투여를 위한 조성물은 바람직하게는, 예를 들어, 합성 RNA 또는 DNA 제제에 부착된 친유성 모이어티 외에도 형질감염 시약 또는 추가의 친유성 모이어티를 포함하지 않는다.
비경구 투여를 위한 제형은, 또한 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 심실내 주사는, 예를 들어 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 정맥내 사용을 위해, 용질의 총 농도는 제제에 등장성을 부여하기 위해 조절되어야한다.
본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제는 폐 전달에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 폐 전달 조성물은 분산물의 흡입에 의해 전달될 수 있어 분산물 내의 조성물은 이것이 혈액 순환으로 직접적으로 폐포 영역을 통해 쉽게 흡수될 수 있는 폐에 도달할 수 있다. 폐 전달은 폐의 질환을 치료하기 위해 전신 전달 및 국소화된 전달 둘 모두에 효과적일 수 있다.
폐 전달은 분무, 에어로졸화, 미셀 및 건조 분말-기반 제형의 사용을 포함한, 상이한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 전달은 액체 분무기, 에어로졸-기반 흡입기, 및 건조 분말 분산물 디바이스로 달성될 수 있다. 정량 디바이스가 바람직하다. 아토마이저 또는 흡입기를 사용하는 이점 중 하나는 디바이스가 자기-함유되기 때문에 오염 가능성이 최소화된다는 것이다. 건조 분말 분산물 디바이스는, 예를 들어, 건조 분말로 쉽게 제형화될 수 있는 약물을 전달한다. 합성 RNA 또는 DNA 제제 조성물은 동결건조된 또는 분무건조된 분말 그것만으로 또는 적합한 분말 캐리어와 조합하여 안정적으로 저장될 수 있다. 흡입을 위한 조성물의 전달은 타이머, 용량 계수기, 시간 측정기, 또는 장치에 통합될 때 용량 추적, 순응도 모니터링 및/또는 에어로졸 약제의 투여 동안 환자에게 유발된 용량을 가능하게 하는 시간 지표를 포함할 수 있는 투약 타이밍 요소에 의해 조정될 수 있다.
캐리어로서 유용한 약제학적 부형제의 유형은 안정화제 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 증량제 예컨대 탄수화물, 아미노산 및 폴리펩타이드; pH 조정제 또는 완충액; 염 예컨대 염화나트륨; 및 기타 동종의 것을 포함한다. 이들 캐리어는 결정성 또는 비정질 형태일 수 있거나 또는 두 가지의 혼합물일 수 있다.
특히 귀중한 증량제는 양립가능한 탄수화물, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 이들의 조합을 포함한다. 적합한 탄수화물은 단당류 예컨대 갈락토스, D-만노스, 소르보스, 및 기타 동종의 것; 이당류, 예컨대 락토스, 트레할로스, 및 기타 동종의 것; 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린; 및 다당류, 예컨대 라피노오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 및 기타 동종의 것; 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 탄수화물의 바람직한 그룹은 락토스, 트레할로스, 라피노오스 말토덱스트린, 및 만니톨을 포함한다. 적합한 폴리펩타이드는 아스파르탐을 포함한다. 아미노산은 알라닌 및 글리신을 포함하고, 글리신이 바람직하다.
적합한 pH 조정제 또는 완충액은 유기산 및 염기로부터 제조된 유기염, 예컨대 나트륨 시트레이트, 나트륨 아스코르베이트, 및 기타 동종의 것을 포함하고; 나트륨 시트레이트가 바람직하다.
본 발명의 합성 RNA 또는 DNA 제제는 경구 및 비강 전달에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들 막을 통해 투여된 약물은 작용의 신속 개시를 가지고, 치료적 혈장 수준을 제공하고, 간 대사의 초회 통과 효과를 피하고, 그리고 비우호적인 위장 (GI) 환경에 대한 약물의 노출을 피한다. 추가의 이점은 막 부위에 대한 용이한 접근을 포함하여, 약물이 쉽게 적용될 수 있고, 국소화될 수 있고 그리고 제거될 수 있다. 일 구현예에서, 경구 또는 비강 전달에 의해 투여된 합성 RNA 또는 DNA 제제는 혈액-뇌 장벽을 지날 수 있도록 변형된다.
일 구현예에서, 합성 RNA 또는 DNA 제제를 포함하는 조성물의 단위 용량 또는 측정된 용량은 이식된 디바이스에 의해 분배된다. 본 디바이스는 대상체 내에서 파라미터를 모니터링하는 센서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 디바이스는 펌프, 예컨대 삼투 펌프 및, 선택적으로, 연관된 전자기기를 포함할 수 있다.
합성 RNA 또는 DNA 제제는 바이러스 천연 캡시드 또는 화학적으로 또는 효소적으로 생산된 인공 캡시드 또는 이로부터 유래된 구조에 포장될 수 있다.
특정 다른 양태에서, 본 발명은 합성 RNA 또는 DNA 제제의 약제학적 제형을 함유하는 적합한 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구현예에서 약제학적제형의 개별 구성요소는 하나의 용기에 제공될 수 있다. 대안적으로, 2개 또는 그 초과의 용기에 별도로 약제학적 제형의 성분, 예를 들어, 합성 RNA 또는 DNA 제제 제형을 위한 하나의 용기 및 담체 화합물을 위한 적어도 또 다른 용기를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 본 키트는 수 많은 상이한 배치형태 예컨대 단일 박스에 하나 이상의 용기로 포장될 수 있다. 상이한 성분은, 예를 들어, 키트와 함께 제공된 지침에 따라 조합될 수 있다. 성분은 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 조합될 수 있어, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제조하고 투여할 수 있다. 본 키트는 또한 전달 장치를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 방법의 다른 적합한 변형 및 적응이 본 명세서에 개시된 구현예의 범위를 벗어나지 않으면서 적합한 등가물을 사용하여 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 아주 분명할 것이다. 이제 기재된 특정 구현예를 상세히 기술하였지만, 이것은 하기 실시예를 참고로 하여 보다 분명히 이해될 것이며, 이는 단지 예시의 목적으로 포함되며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재된 것에 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 아래에 기재되어 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고 문헌은 전체적으로 참고로 편입된다. 충돌할 경우에, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 설명적이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1:생물학적 RNA로부터 정보를 갖는 선택 라이브러리 스캐폴딩
다중-나선 팩킹 (즉, 삼차 폴딩)을 갖는 작은 생물학적 RNA의 시험은 특이적 스캐폴드로 간주될 수 있는 2개의 반복적인 구조를 나타냈다. 제1의 것은 H-유형 가성매듭으로, 바이러스 mRNA 내 작은 리보자임 리보솜 프레임이동 요소를 포함하는 생물학적 RNA, 및 천연 및 합성 압타머에서 광범위하게 발견된다. 그러나, 디자인 관점에서 이 접힘은 조작하기 어려울 수 있다. 다른 것은 접합 주변의 나선 배열을 구성하는 원격 삼차 상호작용에 의해 지지되는 3-방향 접합 (3WJ)이다. 이 접힘은 전형적으로 접합에 하우징된 리간드-결합 부위의 근위에 디자인가능한 나선 요소 (P1 나선으로 지칭됨)를 위치시킴에 따라 압타머를 합체하는 RNA 디바이스의 디자인에 더 적합하다.
3-방향 접합 폴드 그룹 내에는, 시험관내 선택을 위한 서열의 초기 라이브러리를 스캐폴딩하는데 사용될 수 있는 잠재적인 후보의 많은 선택이 있다. 본 명세서에서는 다음 세 가지가 예시되어 있다: B. 서브틸리스 xpt - pbuX 구아닌 리보스위치의 압타머 도메인 (본 명세서에서 일명 "GR"), 비브리오 콜레라에 Vc2 환형 디-GMP 리보스위치의 압타머 도메인 (본 명세서에서 일명 "CDG"), 및 쉬스토소마 만소니 헤머헤드 리보자임 (본 명세서에서 일명 "HH") (도 1). 각각의 이들 친계 RNA 스캐폴드에서, 접합은 판독 도메인에 대한 이차 구조적 브릿지로 역할을 할 수 있는 P1 나선 근위에 주요 생물학적 활성을 호스트한다.
개시 라이브러리는 스캐폴드의 전체적인 이차 및 삼차 구조를 보존하는 반면 접합에서 충분한 수의 뉴클레오타이드를 랜덤화하여 승자가 나타나도록 적절한 풀 다양성을 보장하도록 설계되었다. 접합의 연결 가닥에서 모든 뉴클레오타이드는 접합 근위의 각각의 나선에서 적어도 하나의 염기 쌍뿐만 아니라, 무작위추출 (각각의 위치에서 4개의 뉴클레오타이드의 동일한 모집단)되었다 (도 1). GR 스캐폴드에 대해, 이것은 약 7x1013 서열 (423 서열)의 라이브러리 크기에 동등한 23개 무작위화된 뉴클레오타이드 위치의 초기 라이브러리를 생성하였고; CDG 및 HH는 유사한 다양성의 수준을 함유한다 (약 4x1012 서열; 421 서열의 라이브러리 크기에 동등한 21개 무작위화된 뉴클레오타이드 위치). 이 서열의 수는 이론적으로 RNA의 초기 풀에서 적어도 5-배 중복으로 완전하게 표시된다. 이것은 전형적인 선택에 대해 권장되는 것보다 실질적으로 더 낮은 다양성이지만, 서열 공간의 더욱 더 제한된 샘플링으로 신규한 압타머가 개시 풀로부터 획득되었다.
3개의 스캐폴드는 특이적 디자인 특징을 갖는 라이브러리 카셋트로 통합되었다. 스캐폴드 서열의 초기 및 말단 염기를 함유하는 각각의 스캐폴드의 P1 나선은 모든 라이브러리에서 RNA 구조의 선택적 2'-하이드록시 아실화 분석된 것으로 프라이머 연장에 의해 분석된 ("SHAPE") 화학적 탐침검사에 대해 개발된 것에 기반한 설계된 나선-함유 구조화된 증폭 카셋트로 대체되었다 (도 17).이것은 복제를 위해 필요한 불변 영역이 구조화되고 선택된 압타머 안으로 거의 편입되지 않을 것이다는 것을 보장한다. 불변 영역이 리간드-결합 부위의 형성에 참여할 가능성을 더욱 최소화하기 위해, P1 나선이 적어도 10개의 염기 쌍으로 연장되었다. 초기 개시 라이브러리를 인코딩하는 DNA 템플레이트의 전체 서열은 표 1 및 도 23에 주어진다.
스캐폴드 선택에 대해 추가의 복잡한 사안은 바이러스 역전사효소 (RT)의 낮은 충실도이다. 이 효소의 가장 통상적으로 사용되는 버전을 만들기 위해 열 안정성 및 가공성을 개선시키기위한 MMLV RT의 엔지니어링은 이미 낮은 충실도를 줄였다. 스캐폴드의 보존 서열에 뉴클레오타이드의 오편입 또는 결실은 전반적인 접힘을 안정화시키는 삼차 상호작용을 쉽게 방해한다. RNA 결여 구조는 RT에 의해 보다 효율적으로 증폭되어, 선택에서 관측되는 "작은 모티프의 폭정" 현상을 부분적으로 유발시킬 가능성이 있는, 각각의 선택 라운드의 복제 단계 동안 상당한 편향을 유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해, (SSIII에 대한 55 ℃에 대비하여) 70 ℃까지 활성을 보유하고 그리고 MMLV-유래된 RT보다 본질적으로 더 높은 충실도를 갖는 써모필 지오바실러스 스테아로써모필루스 (GsI-IIC-MRF 또는 "GsI")로부터의 모바일 그룹 II 인트론으로부터 유래된 최근에 특성규명된 RT가 채택되었다. 비교하기 위해, GR 스캐폴드 선택은 GsI과 함께 MMLV로부터 유래된 RT (SuperScript III 또는 "SSIII")로 수행되었다.
실시예 2: 5HTP에 대한 스캐폴드된 선택은 많은 포텐셜 압타머를 생성한다
선택을 위한 표적은 5-하이드록시-L-트립토판이고 (5HTP; 도 2A), 세로토닌의 즉각적인 생합성 전구체로, 이것은 그것의 카복실레이트 기를 통헤 고체 매트릭스 상에 고정된다. 각각의 라이브러리로 7 라운드의 선택이, L-트립토판에 대한 반대선택과 이후의 라운드에서 점점 더 엄격해지는 세정 절차로 수행되었다. SSIII 선택에서, 결합하지 않은 RNA를 제거하기 위한 경쟁적 용출 이전에 친화성 칼럼을 초기 라운드에서 광범위하게 세정하는 종래의 SELEX 프로토콜이 채택되었다. 경쟁적 용출은 라운드 4에서 초기에 관찰되었고 라운드 6에서 총 입력 RNA의 > 50%로 정점에 이르렀다. GsI 선택은 일반적으로 권고되는 것보다 덜 엄격한 프로토콜을 사용했는데 경쟁적 용출 하에서 칼럼 상에 남아 있는 총 RNA의 거의 최종 10%가 초기 4 라운드에서의 증폭을 위해 수집되어 풀에서세정 엄격성을 증가시키기 전에 서열 다양성을 보존했다. 선택의 세부사항은 실시예 6-8 및 표 2에 주어진다.
서열 다양성을 보존하고 초기 확률적 사건을 최소화함에 있어서, 차세대 서열분석 (NGS) 및 다운스트림 생물정보학 분석의 조합은 포텐셜 압타머를 밝혀내고 선택의 주요 특징을 설명하는데 의존되었다. 각각의 선택을 위해, >200,000 판독이 최종 라운드로부터의 RNA에 대해 수득되었고, 수득한 서열은 클러스터링되고 최대-유사한 트리가 생성되었다. 하기를 사용한 SSIII 및 GsI 선택의 비교: GR스캐폴드로, 이는 몇개의 중요한 특징을 드러냈다.
하기의 거리 매트릭스: GR/SSIII 선택으로, 이는 단지 소수의 하기를 분명히 나타냈고: 단리된 클러스터, 그리고 각각의 클러스터 내에서 서열은 고도의 내부 관련성을 가진다 (도 2B). 다수 (>80%)의 서열은 5HTP-I, -II, 및 -III (도 2D) 으로 지칭되는, 3개의 뚜렷한 서열-관련된 계열로 덩어리되고, 나머지는 해석하기 어려운 작은 모집단으로 클러스터링된다. 이것은 단일 분리가 종종 확인되고 추가 돌연변이 유발 및 선택이 공변이 정보를 얻기 위해 필요한 전통적 SELEX의 전형이다. 그에 반해서, GR/GsI선택은 하기 서열의 더 높은 샘플링으로 보다 다양한 클러스터를 생성했다: 주요 클러스터 사이의 영역에 거주하는 서열 (도 2C 및 2D). CDG 및 HH 선택은 GsI과 함께 많은 포텐셜 압타머로 그것의 서열 공간에서 유사하게 다양하다 (도 7). 전통적 선택 접근법은 종종 제한된 서열 정보로 압타머를 찾는 것을 용이하게 하기 위해 과-선택에 의존하지만, NGS에 의한 서열분석 및 승자의 다양성의 보존은 보존 및 공변이 패턴의 보다 철저한 분석을 허용하여, 공통 압타머 서열을 결정하는데 도움을 주었다. 유사한 결과가 GR-스캐폴드된 L-DOPA 선택에서 관측되었다 (도 18). 입증된 5HTP 압타머를 생성한 각각의 클러스터로부터 250개 서열의 서브셋이 본 명세서에 추가로 기재된다.
예상외로, SSIII 선택의 제한된 서열 다양성에 부가하여, 결실 및 점 돌연변이의 무거운 축적이 관측되어 스캐폴드의 불변 영역의 전체 동일성을 보유하는 서열은 최종 라운드에서 전혀 회수되지 않도록 되었다. 클러스터 중 2개인, 5HTP-I 및 5HTP-III (도 2D)은 퓨린 리보스위치의 루프-루프 상호작용의 형성에 필수적인 스캐폴드의 L2 또는 L3에서 결실을 갖는다. 또한, 5HTP-III 구성원은 급격하게 대안적인 이차 구조에 대한 잠재력을 생성하는 선택 동안 획득된 몇개의 점 결실을 함유한다. 이 서열의 최소 자유 에너지 (MFE) 및 공변이 분석은 L-트립토판 압타머의 공통 서열과 일치하는 이차 구조를 시사하고 (2-방향 접합을 포함하는 압타머; Majerfeld & Yarus, Nucleic Acids Research, 2005, 33, 5482-5493), 추가로 본 스캐폴드는 하기에서 유지되지 않았다는 것을 시사한다: 5HTP-III 계열. 5HTP-II는 라이브러리로 설계된 삼차 구조에 필요한 서열 요건을 유지하는 유일한 주요 클러스터이고 SSIII과 GsI 선택 사이에 공유된 유일한 풍부한 서열이다. SSIII를 사용한 선택에 대조적으로, GsI 선택은 스캐폴드의 불변 영역에서 발생하는 낮은 양의 돌연변이를 나타내어, 스캐폴드의 강력한 유지를 나타낸다 (도 8).
높은 압타머 포텐셜을 갖는 서열을 확인하기 위해, 각각의 풀로부터 10개의 가장 많은 클러스터를 개별적으로 정렬하고, MFE 구조를 예상하고, 그리고 공변이 모델을 생성하였다. 이것은 선택에 의해 제시된 주요 공통 서열의 정보-풍부 관찰을 허용했다. GR/SSIII 실험은 매우 과하게 선택되었기 때문에, 세 가지 주요 클러스터 각각으로부터의 가장 풍부한 서열이 추가 검증을 위해 선택되었다. GsI 선택을 위해, 공통 MFE 구조가 모 스캐폴드와 일치하는 하나 이상의 클러스터로부터 우세한 서열이 선택되었다.
실시예 3: 가장 많은 클러스터는 스캐폴드 구조를 보전하고 높은 선택성 5HTP를 결합한다
구조적 스캐폴드는 수득한 압타머의 구조적 및 상호작용 특징의 검증을 아주 용이하게 한다. "SHAPE"로 지칭된 기술인, N-메틸isatoic 무수물 ("NMIA")을 사용한 RNA 구조의 화학적 탐침검사는 친계 스캐폴드의 이차 및 삼차 구조가 보존되었는지뿐만 아니라 압타머에서 리간드-의존적 구조적 변화가 있었는지를 밝힌다. GR/SSIII 선택에서, 5HTP-I 및 5HTP-II 압타머는 3-방향 접합 요소 내에 리간드의 존재에서 NMIA 반응성 패턴에서 국소화된 변화를 가지고, 이는 리간드-결합 부위와 일치한다 (도 3A, 도 19). 그러나, 5HTP-III은 불변 영역에서 J2/3의 외측에 변화를 나타내어, 예상된 구조 및 이전에 기재된 트립토판 압타머의 L-Trp 결합 부위와 일치한다 (Majerfeld & Yarus). GR 스캐폴드의 보존은 L2와 상호작용할 때만 존재하는 L3에서의 고유의, 리간드-독립적인 NMIA 반응성 특성을 사용하여 평가되었다 (Stoddard 등, RNA, 2008, 14, 675-684).5HTP-II는 이 특징을 나타내는 SSIII 선택의 세 가지 클러스터로부터의 유일한 서열이다. 반대로, GR/GsI 선택으로부터의 모든 시험된 서열은 이 삼차 구조 특성을 갖는다 (도 9A 및 20). 이들 데이터는 GR/SSIII 선택이 구조적 스캐폴드를 보전하는 유일한 5HTP-II를 갖는 세 가지 뚜렷한 압타머를 생성하는 반면 GR/GsI 선택은 스캐폴드를 유지하는 다중 용액을 생산했다는 것을 강하게 나타낸다. GR/GsI 분리를 위한 5HTP-의존적 특성은 5HTP-II 및 친계 압타머의 것보다는 약하지만, 정량화는 이들이 유사한 방식으로 접합을 국소화시킨다는 것을 밝힌다 (도 3B). CDG/GsI 및 HH/GsI 선택의 SHAPE 특성규명은 압타머의 신규한 부류에 대한 리간드-의존적 변화와 친계 스캐폴드를 닮은 전체적인 반응성 패턴을 나타낸다 (도 9B, 9C, 21 및 22).
5HTP 및 화학적으로 유사한 화합물 세트에 대한 이들 압타머의 친화성 및 선택성은 등온 적정 열량측정 (ITC)에 의해 평가되었다. 중요하게는, 모든 시험된 압타머에 대해, 5'- 및 3'-카셋트 서열은 5HTP 결합에 대해 필요하지 않아, 중성 서열의 성공적인 디자인을 나타낸다 (도 3C). 몇 개의 경향이 이 분석으로부터 부각되었다. 첫째로, 모 스캐폴드를 보전하지 않은 양 압타머 (5HTP-I, -III)는 세포 기반 적용에 결정적인 요건인, 5HTP와 L-트립토판 사이를 구별하지 못한다 (표 3). 둘째로, 3-방향 접합 스캐폴드를 보전하는 다수의 압타머는 파괴된 스캐폴드를 갖는 압타머보다 5HTP에 대해 더 높은 친화성을 가지고 전부는 L-트립토판에 대해 강하게 구별한다. 이것은 스캐폴드의 구조가 아미노산에 결합하는 다른 합성 및 천연 압타머에 비교할만한 친화성을 유지하면서 선택적 결합 포켓을 생성하는데 중요하다는 것을 나타낸다.5HTP-I 및 5HTP-III은 5HTP와 세로토닌 사이에 강한 식별력을 나타내어, 주쇄 원자가 직접적으로 인식된다는 것을 암시한다. 그에 반해서, 스캐폴드를 보전하는 많은 압타머는 5HTP보다 2- 내지 4-배 더 높은 친화성으로 N-메틸-5-하이드록시-L-트립토파노미드를 결합한다. 또한, 이들은 5HTP의 탈카복실화 생성물인, 세로토닌을 결합하여, 결합에서 주쇄 원자에 대한 보다 낮은 요건을 시사한다 (표 3). 따라서, 이들 압타머 중 소수는 뛰어난 세로토닌 센서일 수 있다. GsI 선택으로부터 가장 현저한 것은 상이한 스캐폴드 구조를 가짐에도 불구하고, 각각의 선택으로부터의 우세한 압타머는 아주 유사한 결합 친화성 및 선택성 프로파일로 수렴하여, 3-방향 접합이 5HTP 결합 포켓을 호스팅하기 위한 강력한 접힘임을 밝힌다는 것이다. 이와 함께, 이들 데이터는 뚜렷한 올리고뉴클레오타이드 접합, 예컨대 3-방향 접합 구축 변이체가 5HTP 인식에 대한 강력한 용액을 발견할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 구조적 분석으로 5GR -II 압타머의 분석은 5HTP 결합에 대해 재발성 RNA 모티프가 사용된다는 것을 밝힌다
본 명세서에서 기재된 스캐폴드된 선택 전략이 친계 RNA의 접힘을 보존하였다는 것을 추가로 입증하고 RNA가 어떻게 5HTP를 인식할 수 있는지를 설명하기 위해, 5HTP와 복합체화된 5HTP-II의 구조가 2.0 Å 해상도로 결정되었다 (도 3D, 대표적인 전자 밀도 지도는 도 10에 도시되어 있고 결정학 통계는 표 4에 주어진다). 이 구조는 결합 포켓 및 다양한 접합 영역에 관하여 P1에 대해 상이한 각에 의해 생성된 편차의 주요 공급원을 가지면서, 잔기 19-77에서 모든 백본 원자에 걸쳐 6.5 Å의 r.m.s.d.를 갖는 친계 xpt 구아닌 리보스위치 압타머와 전반적으로 겹쳐진다 (도 16A-C). L2-L3 삼차 상호작용 내에서 염기-염기 상호작용의 패턴 및 백본 기하학은 두 RNA들 사이에서 거의 동일하다 (r.m.s.d.0.96 Å으로 잔기 31-39, 61-67 내 모든 원자에 걸침). 따라서, GR 스캐폴드는 선택 과정 동안, 전반적으로 그리고 국소적으로 양자에서 온전히 남았다.
5HTP-II의 리간드 결합 포켓은 모 RNA로부터 근본적으로 상이한 국소 구조를 갖는 3-방향 접합 내에 있다. 직접적인 리간드 접촉은 T-루프인 일반적인 RNA 구조적 모듈을 사용하여 J2/3 내 뉴클레오타이드에 의해 주로 매개된다 (도 4A). J2/3의 처음 5개 뉴클레오타이드는 tRNAPhe T-루프와 거의 완벽하게 겹쳐지는 표준적 T-루프 구조를 형성한다 (r.m.s.d.0.49 Å으로 백본 잔기 경우). D-루프와 긴 범위의 왓슨-크릭 짝짓기에 의한 tRNA T-루프에서 위치 3의 안정화는 활성에 중요하다. 5HTP-II는 T-루프의 G47과 J3/1의 C75 사이에 유사한 상호작용을 보유한다. 5HTP-II T-루프는 tRNA T-루프가 D-루프로부터의 삽입작용하는 퓨린을 호스팅하는 방법이고 또한 그것의 리보스위치에 의한 티아민 파이로포스페이트 (TPP) 인식에 유사한 이종상동성인 방식으로 위치 4와 5 사이에 적층된 5HTP를 호스팅한다 (도 4B). T-루프가 리간드의 인식을 직접적으로 담당하는 반면, 세 개의 무작위화된 영역 모두로부터의 뉴클레오타이드는 T-루프를 안정화시키는 조밀한 접합의 형성을 돕는 국소 구조에 관여한다. 만일 그와 같은 복합 세트의 상호작용이 T-루프를 지지하는 경우, 단리된 T-루프가 5HTP를 결합하는 것은 거의 불가능하다.
결정 구조로5HTP-II의 구조는 다른 스캐폴드된 압타머에 의한 5HTP 인식으로 추가의 통찰력을 형성한다. GR/GsI 선택에서 가장 풍부한 클러스터인, 5HTP-IV는 또한 T-루프의 UUGAA 특성을 함유한다. 그러나, 모티프는 단일 뉴클레오타이드에 의해 3'-이동되어, 하기의 것들 사이 J1/2 및 J3/1에서의 상당한 서열 차이에 의해 제안된 바와 같이 3-방향 접합 내에 대안적인 배향을 유도할 가능성이 있다: 5HTP-II 및 5HTP-IV. HH 선택에서, 가장 흔한 클러스터 (5HTP-VIII) 중 가장 풍부한 서열은 또한 J2/3에서 T-루프의 보존된 UUGAA 서열을 함유한다. 5HTP-VIII 압타머의 이 영역의 서열 변이 분석은 단지 약간의 편차만으로 생물학적 T-루프의 패턴과 일치하는 보존 패턴을 밝힌다 (도 11). 이것은 T-루프 모티프가 RNA에 의한 작은 평면 화합물의 인식을 위한 강력한 모듈일 수 있다는 것을 시사한다. CDG 선택으로부터의 RNA에는 분명히 확인가능한 T-루프가 없지만, 결합 파라미터는 다른 두 선택의 것과 거의 완벽하게 일치하여, 유사한 인식 방식을 시사한다.
실시예 5: 스캐폴드된 압타머는 강력한 소분자 감각 디바이스 안으로 쉽게 편입될 수 있다
잘 접혀지고, 고도로 구조화되고 특이적인 RNA 압타머를 만드는데 있어 스캐폴드된 선택 기술을 입증하기 위해, 기능적 합성 RNA 바이오센서를 생산하는 그것의 능력을 시험하였다. 이들 디바이스를 만들기 위해, 짧은 나선 요소를 통해 형광단-결합 모듈에 소분자 결합 압타머를 연결하는 전략이 사용되었다. 각각의 라이브러리로부터 수위 후보 압타머는 두 개의 압타머를 연결하는 두 개의 나선 변이체로 (연통 모듈은 하기로 지칭됨: "A" 및 "U", 도 12) 브로콜리 형광단 결합 압타머에 커플링되었다. 이것은 5HTP를 감지할 수 있는 RNA의 세트 및/또는 하기에 걸친 세로토닌을 초래했다: 몇 개의자릿 수로 시험관내에서 다양한 출력 형광 동적 범위를 가짐 (표 5 및 표 6). 많은 이들 센서는 리간드의 존재에 있을 때 동일한 조건 하에서 비접합된 브로콜리 압타머 단독의 것 이상으로 형광 수준을 생성할 수 있다. 이 시스템에 고유한 것은 브로콜리 형광에 의해 모니터링될 때 단리된 압타머의 KD에 비하여 감소된 겉보기 F50 (절반의 최대 형광 반응을 유도하는데 요구된 리간드 농도로 정의됨)이다. 그러나, 몇개의 스캐폴드된 압타머는 그것의 KD와 F50 사이에 단지 ~10-배 차이를 나타낸다. 전반적으로, 이것은 KD 및 F50에서의 차이가 1000-배에 접근할 수 있는, 문헌에서의 천연 리보스위치 압타머 도메인의 예에 유리하게 비교되어, 감수성 또는 리간드 독성이 리보스위치 적용에서 제한 인자일 때 고려되는 중요한 특성이다.
상기 디바이스 중, 5HTP-II(A)는 E. 콜리에서 5HTP를 구체적으로 감지할 수 있다. 이 유전자적으로 인코딩된 센서는 풍부한 화학적 한정 배지에서 성장하는 E. 콜리에 2 mM 5HTP의 첨가로 형광의 신속 유도 (10분)를 생성하여, 대략 80%의 박테리아가 20분 이내에 관측가능한 반응을 나타냈다 (도 5). 형광 신호는 RNA 디바이스 결합 5HTP에 완전하게 의존적이었다. L-트립토판이 배지에 포함되었거나 센서가 단리된 압타머에 리간드 결합을 제거한 T-루프 모듈에서 점 돌연변이 (A48U)를 함유했을 때 신호 이득은 관측되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 게다가, 5HTP의 존재에서 상대 형광에서의 증가는 생존 세포의 천연 리보스위치 압타머 도메인에 기반한 강력한 환형 디뉴클레오타이드 센서에 비교할만했다. 중요하게는, 이들 관찰은 비-천연 압타머가 형광 센서의 맥락에서 천연 압타머에 비교해 세포 내 성능을 감소시켰다는 주장과는 대조적이다 (You, PNAS (2015) 112:21, E2756-2765).
선택 스캐폴드된 5HTP 압타머는 유전자 조절 인자를 생성하도록 천연 리보스위치 발현 플랫폼으로부터 유래된 조작된 모듈러 이차 스위치에 또한 커플링되었다. 압타머 및 발현 플랫폼의 P1 나선이 직접적으로 커플링된 커플링 전략을 사용하여, 전사의 능동적인 리간드-의존적 조절 인자가 5HTP-IV 센서와 pbuE "ON" 스위치 플랫폼을 융합함에 의해 조작되었다 (도 6A). 얻어진 RNA 인자는 단리에서 압타머 도메인에 동일한 특이성 프로파일로 시험관내에서 전사 초과번역을 활성화할 수 있고 천연 리보스위치와 일치하는 동적 범위를 갖는다 (도 6B); 놀랍게도, L-Trp는 초과번역 전사를 전혀 가능하게 할 수 없었다. 다시, KD와 T50 사이의 차이는 무의미하지 않았으나 (세로토닌에 대해 6-배, 5HTP에 대해 22-배), 압타머의 열역학적 특성이 어댑터 서열과의 연통하는 그것의 능력을 항상 지시하지는 않는 천연 리보스위치에 대해 관측된 경향을 반영했다.
실시예 6: 예시적인 구현예에 따른 스캐폴드된 압타머
브로콜리 압타머가 tRNA 스캐폴드에 커플링되어 세포 기반 적용에 대해 바이오센서를 안정화시켰다. 네 개의 상이한 GR-스캐폴드된 5HTP 압타머가 상이한 길이 (2 내지 5개의 A-U 및 U-A 염기쌍; 도 14A)의 네 개의 연통 모듈 및 리간드-의존 방식에서 형광을 발하는 능력에 대해 시험된 각각의 수득한 바이오센서에 커플링되었다. 각각의 센서는 시험관내 (도 14B; 표 7 및 8) 및 E. 콜리 (도 14D; 표 9 및 10) 둘 모두에서 단리된 브로콜리 압타머에 대한 형광 및 최대 휘도에서 그것의 리간드-의존적 접힘 변화에 대해 평가되었다. 시험관내에서 후보의 신속 스크리닝을 가능하게 하기 위해, 바이오센서는 전사되고 추가 정제 없이 형광 검정에 직접적으로 사용되었다. 이들 데이터는 세 가지 압타머 (5GR-II, -IV, 및 -V)가 시험관내 및 세포 상황 둘 모두에서 5HTP 및/또는 세로토닌을 검출할 수 있는 센서를 생성하며, 형광 및 최대 휘도에서 조합된 접힘 증가에 관해 5GR-II가 최상의 성능을 입증했다는 것을 밝힌다.
스캐폴드된 압타머의 잠재성을 추가로 입증하기 위해, 5GR-II/CM-4 바이오센서를 사용하여 E. 콜리에 의한 5HTP의 흡수를 시각화하기 위해 생존 세포 이미지형성이 사용되었다. 단일 세포의 형광 이미지형성은 풍부한 화학적 한정 배지에서 성장하는 E. 콜리에 2 mM 5HTP의 첨가로 형광의 신속 유도를 드러냈으며, 대략 80%의 박테리아가 20분 이내에 관측가능한 반응을 나타냈다 (도 15A, D). 형광 신호는 RNA 디바이스 결합 5HTP에 완전하게 의존적이었다; L-트립토판이 배지에 포함되었거나 (도 15B, E) 또는 센서가 단리된 압타머에 리간드 결합을 제거한 T-루프 모듈에서 점 돌연변이 (A48U)를 함유했을 때(도 15C, F) 검출가능한 신호 이득은 관측되지 않았다. 5HTP의 존재에서 상대적 형광에서의 관측된 증가는 생존 세포에서 천연 리보스위치 압타머 도메인에 기반한 강력한 환형 디뉴클레오타이드 센서에 비교할만했다. 이들 결과는 합성 압타머가 천연 압타머에 비교해 세포 내 성능을 감소시켰다는 이전의 주장과 대조적이고, 그리고 다중 합성 압타머가 알로스테릭 플루오로제닉 RNA의 맥락에서 E. 콜리 내에서 작용할 수 있다는 것이 여기에 나타나 있다.
상기 5HTP 바이오센서는 선택 압타머의 생화학적 및 생체물리학적 분석으로부터의 지식으로 설계되었다. 그러나, 바이오센서의 신속 개발을 위한 최적의 작업흐름은 후보 RNA를 디자인하기 위해 선택의 전산 분석에서 유래된 정보 만 사용할 수 있다. 스캐폴드된 압타머가 실험적 특성규명의 부재에서 바이오센서 엔지니어링을 가능하게하는 디자인 원리를 포함한다는 것을 입증하기 위해, 상기 바이오센서 전략은 L-DOPA 선택으로부터 유래된 네 가지 압타머에 대해 이용되었다. 이들 압타머 중 어느 것도 알로스테릭 플루오로제닉 센서에 그것의 편입 이전에 어떤 방식으로도 입증되지 않았다. 시험관내 (도 14C; 표 7 및 8) 및 E. 콜리 (도 14E; 표 9 및 10)에서 L-DOPA 및 도파민으로 수득한 바이오센서의 스크리닝은 양 상황에서 기능하는 두 가지 압타머 (DG-I 및 DG-II)를 드러냈다.
표 7. 플루오로제닉 GR - 스캐폴드된 압타머의 시험관내 -접힘 유도
Figure 112019079943141-pct00009
a 리간드 농도는 2 mM이다.
b접힘 유도 (FI)는 (총형광, +리간드) / (총형광, -리간드)로 계산된다.
오류는 세 번의 독립적인 실험에 대한 평균의 표준 오차로 보고된다.
표 8. 친계 브로콜리에 대비한 플루오로제닉 GR - 스캐폴드된 압타머의 시험관내 휘도
Figure 112019079943141-pct00010
a 압타머 리간드 농도는 2 mM이다.
b 퍼센트 휘도는 (총 형광 센서, +리간드) / (총 형광 브로콜리, + 리간드)로 계산된다. 오류는 세 번의 독립적인 실험에 대한 평균의 표준 오차로 보고된다.
표 9. 플루오로제닉 GR - 스캐폴드된 압타머의 생체내 -접힘 유도
Figure 112019079943141-pct00011
a 리간드 농도는 2 mM이다.
b 접힘 유도 (FI)는 (총 형광, +리간드) / (총 형광, -리간드)로 계산된다. 오류는 세 번의 독립적인 실험에 대한 평균의 표준 오차로 보고된다.
표 10. 친계 브로콜리 압타머에 대비한 플루오로제닉 GR - 스캐폴드된 압타머의 생체내 휘도
Figure 112019079943141-pct00012
a 리간드 농도는 2 mM이다.
b 퍼센트 휘도는 (총 형광 센서, + 리간드) / (총 형광 브로콜리, +리간드)로 계산된다. 오류는 세 번의 독립적인 실험에 대한 평균의 표준 오차로 보고된다.
실시예 7: 논의
RNA-기반 디바이스는 시스, 예측가능한 이차 구조 및 작은 유전적 풋프린트에서 조절하는 능력을 포함하여, 단백질-기반 대안과 비교했을 때 고유의 특징 세트에 의해 유도된 합성 생물학에서 강력한 도구로 되는 방향으로 진행하고 있다. 노력은 합성 리보스위치, 압타자임 및 플루오로제닉 RNA 센서를 만드는데 집중되어 왔지만, 그러한 디바이스의 맥락에서 기능을 하는 소분자 수용체의 제한된 이용가용성으로 인해 그것의 가능성은 여전히 완전하게 실현되지 못하고 있다. 본 명세서에서 제시된 연구에서, 시험관내 선택을 통해 상승된 소분자 결합 포켓을 스캐폴드하기 위해 자연적으로 진화된 리보스위치와 리보 자임의 이차 및 삼차 구조적 구조를 이용하는 전략이 설계되었다. 중요하게는, 최종 선택 라운드의 높은 처리량 서열분석에서 수득된 것을 넘지 않는 정보를 사용하여, 이 접근법을 사용하여 L-DOPA에 대해 선택된 압타머는 세포 상황에서 기능하는 유전적으로 인코딩가능한 바이오센서를 생성하기 위해 플루오로제닉 압타머 모듈에 커플링되었다.
본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물 중 하나의 주요 강도는 한 조의 압타머를 얻기 위해 병렬적 선택에서 다중 스캐폴드의 사용이다. 이것은 센서 다양성 및 개발을 상당히 제한하는 단순한 무작위화된 풀로부터 동일한 서브 셋의 해법이 재생가능하게 생성되는 당 업계에서 알려진 전통적 선택과는 상당히 상이하다. 상이한 스캐폴드로부터 유래된 압타머는 5HTP에 대해 유사한 친화성과 L-트립토판에 대한 선택성을 가지지만, 이들은 분명히 모든 스캐폴드에 공통적 특징인 P1 나선을 통해 판독 도메인과 연통하는 그것의 능력에 관해서 뚜렷한 특성을 갖는다. 생물학적 리보스위치에서, 리간드는 압타머를 다운스트림 조절 스위치에 연결시키는 P1 나선을 포함하는 RNA에서 구조적 변화를 유도하거나 또는 직접 접촉한다. 과학적 이론에 구속되지 않고, 상이한 압타머에 걸친 센서 성능에서의 차이는 부분적으로, 선택에서 완전하게 제어될 수 없는 특징인, 리간드와 영역간 (P1) 나선 사이의 공간적 관계에서의 변화에 기인한다고 가정된다. 그러나, 깊은 선택과는 달리, 여기서 제시된 스캐폴드된 선택 접근법은 가능한 리간드 위치를 제한함으로써 양호한 리간드/P1 배향으로 선택을 강하게 편향시킨다.
한 조의 압타머로, 조합 접근법은 본 명세서에서 도파민 센서 개발로 대표되는 바와 같은 광범위한 압타머 특성규명 또는 디바이스 최적화없이 센서를 빠르게 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다 (도 19). 깊은 선택으로부터 유래된 압타머로부터 RNA 디바이스의 개발은 다양성의 부족으로 인해 고정된, 변경불가능한 노드로 감각 압타머를 이탈하는 동안 연통 모듈의 넓은 스크리닝과 함께 철저한 특성규명을 필요로 한다. 본 명세서에서 기재된 스캐폴드된 선택 방법 및 조성물로, 뚜렷한 압타머의 세트는 연통 모듈의 세트에 조합하여 커플링될 수 있고, L-DOPA 선택으로 실증된 바와 같이 원하는 활성을 갖는 변이체를 빠르게 선별할 수 있다. 이 방식에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및 조성물은 그것의 개발에서 주요 병목현상을 용이하게 함으로써 RNA 디바이스 및 센서의 적절한 개발을 용이하게 해야 한다. 현저히, 이 연구에서 특성규명 및/또는 센서 디자인을 위해 가장 많은 클러스터 만이 각각의 선택에서 집중되었지만, 각각의 선택 내에서 다운스트림 적용을 개발하기 위한 압타머의 초기 풀을 더욱 풍부하게 할 수 있는 대체 서열을 포함하는 많은 클러스터가 있다.
본 명세서에서 기재된 선택 방법 및 조성물의 제2의 강력한 이점은 3-방향 접합 구조의 삼차 상호작용에 의해 제공된 세포 상황에서의 강력한 폴딩에 대한 잠재력이다. 각각의 이들 압타머는 광범위한 생물학적 진화를 거친 접힘을 갖는다. 또한, 3-방향 접합 코어를 구성하는 원위 삼차 상호작용은 매우 안정적일 수 있다. 퓨린 리보스위치의 L2-L3 상호작용 및 환형 디-GMP 리보스위치 스캐폴드의 테트라루프-테트라루프 수용체 둘 모두는 다른 RNA 구조의 상황을 외측으로 안정적으로 형성할 수 있다. 그에 반해서, S. 만소니 헤머헤드 리보자임을 구성하는 긴 범위 상호작용은 동적으로, 이는 선택된 스캐폴드에 대한 다양성의 또 다른 양태이다. 스캐폴드에 강력한 이차 및 삼차 구조의 존재는 이들 요소가 초기 라이브러리의 모든 구성원의 폴딩을 잠재적으로 유도할 수 있게 한다. 그에 반해서, 선택 동안 RNA 미스폴딩 및 또는 최종 압타머에서 다중 MFE 구조의 존재는 종종 전통적 깊은 선택에 중요한 문제이다. 전형적인 선택 프로토콜에서 고-충실도 폴딩에 대한 상당한 선택 압력이 없으므로, 개시 라이브러리에 이 정보를 제공하는 것은 강력한 폴딩 RNA를 향한 경로가 될 수 있다.
3-방향 접합 스캐폴드가 이 연구의 초점으로 선택되었지만, 천연 리보스위치와 리보자임의 다양성은 이 접근법에 대한 추가의 공급원료를 제공할 수 있다. 3-방향 접합 계열 내에, 3개의 나선의 배향, 연결 영역의 크기 및 특정 리간드 또는 센서에 대해 우수한 스캐폴드를 제공할 수 있는 원위 삼차 상호작용의 성질을 다양하게 하는 광범위한 서열이 존재한다. 게다가, 다른 접힘은 동족 리간드의 성질에 기반하여 표적 소분자를 결합시키는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 5HTP를 결합시키기 위한 스캐폴드에 대한 또 다른 논리적 선택은 라이신 리보스위치 압타머 도메인이다. 더큰 리간드는 플라빈 모노뉴클레오타이드 또는 코발라민 리보스위치-유래된 스캐폴드에 의해 보다 쉽게 인식될 수 있는 반면, 디뉴클레오타이드 예컨대 NADH는 이-환형 뉴클레오타이드 압타머 중 하나에 의해 용이하게 수용될 수 있다. 천연 RNA 압타머가 화학적으로 다양한 소분자를 인식하는 것으로 발견되었으므로, 신규한 압타머의 선택에 대한 그것의 구조를 활용하는 것은 넓은 범위의 적용에 걸쳐 세포 환경에서 소분자를 모니터링하고 이에 반응하는 강력한 새로운 도구의 개발을 촉진시키는 가능성을 갖는다.
실시예 8: 라이브러리 구축
각각의 스캐폴드에 대해, 모 RNA의 리간드 결합 부위 또는 활성 부위를 둘러싸는 8 Å 쉘 내에 뉴클레오타이드가 그것의 결정 구조로부터 확인되었다 (GR, PDB ID 4FE5; CDG, PDB ID 3IWN; HH, PDB ID 3ZD5). 상응하는 위치는 역전사 및 증폭을 위한 보존된 측접 서열을 갖는 전체 압타머 도메인에 이르는 DNA 울트라머에서 무작위추출되었다 (통합된 DNA 기술; 이 연구에서 사용된 모든 핵산의 서열은 표 1에 제공되어 있다). ssDNA는 ~2x10- 12 mol DNA (~1012 개별 서열에 상응함)가 각각 100 μL PCR 반응에 사용되고 T7 부위 계류 및 RT-PCR 프라이머로 15 사이클 동안 증폭되는 표준 Taq PCR 조건을 사용하여 전사를 위한 dsDNA 템플레이트로 전환되었다. 대략 1x1014 서열이 40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 25 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 0.01% 트리톤 X-100, 4 mM 각 rNTP pH 8.0, 0.08 단위 무기 포스파타제 (Sigma-Aldrich, 동결건조된 분말), 및 0.25 mg/mL T7 RNA 중합효소를 함유하는 12.5 mL 전사 반응에서 전사되고 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션되었다. 전사 샘플은 그런 다음 -20 ℃에서 75% 에탄올에 침전되고, 펠릿화되고, 그리고 300 μL 포름아미드, 3 mL 8 M 우레아, 및 300 μL 0.5 M EDTA pH 8.0의 용액에서 재구성되었다. 전장 RNA는 변성 8%, 29:1 아크릴아미드:비스아크릴아미드 겔로 정제되었다. 생성물 RNA는 UV 음영화에 의해 가시화된 후 겔로부터 절제되고 0.5x TE에서 교환 및 저장 전에 0.3 M NaOAc pH 5.0에서 용출되었다.
실시예 9: 5HTP 친화성 칼럼 매트릭스의 합성
유도된 칼럼에 대해, 3 mL 층 용적의 EAH 세파로스 4B (GE Healthcare)가 디메틸포름아미드 (DMF)로 탈수되었다. 10 μ몰의 Fmoc-5-하이드록시-L-트립토판 및 10 μ몰의 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)를 1 mL의 DMF에 용해시키고 20 μmole N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 갖는 탈수된 칼럼에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 진탕으로 인큐베이션하였다. 칼럼 매트릭스를 그런 다음 빼내고 DMF로 광범위하게 세정하였다. 미반응된 세파로스 아민은 대략 1 mL DMF 내 1 mmole의 아세트산 무수물 및 1 mmole DIPEA를 부가함에 의해 아세틸화되고 실온에서 1시간 동안 혼합되었다. 칼럼을 아세틸화 혼합물에서 빼내고 그리고 20% v/v 피페리딘/DMF를 사용한 Fmoc 탈보호 이전에 DMF로 세정하였다. 칼럼 상의 아미노산 농도는 탈보호 분획에서 Fmoc의 농도를 측정함에 의해 결정되었다 (A301 nm = 8000 M- 1 cm-1). 이 방법은 대략 0.5-1 mM 탈보호된 아미노산/ mL 수지를 생성했다. 계수기 선택을 위해, 아세틸화된 세파로스를 초래하는 리간드 커플링 단계를 생략하는 것을 제외하고 정확히 동일한 EAH 세파로스를 제조하였다.
실시예 10: 시험관내 선택
SuperScript III 역전사 효소 (GR/SSIII)를 사용하는 GR 스캐폴드 선택을 위해, 350 μL 아세틸화된 세파로스를 선택 완충액 (10 mM Na-HEPES, pH 7.0, 250 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1 mg/mL tRNA)에서 평형화시키고 350 μL의 선택 완충액 내 1 nmol의 라이브러리 RNA를 실온에서 30분 동안 진탕으로 인큐베이션시켰다. 적용된 용액을 제거하고 칼럼 매트릭스를 350 μL의 선택 완충액으로 1회 세정하였다. 풀링된 통과 유체 및 세정물 (총 750 μL)을 사전-평형화된 5HTP-유도된 세파로스 4B 칼럼에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션시켰다. 칼럼을 그런 다음 빼내고 선택 완충액에서 10 mM 5HTP로 용출 전에 선택 완충액으로 3회 세정하였다 (350 μL에서 두 번의 1 시간 인큐베이션; 총 700 μL 용출된 용적). 용출된 분획을 그런 다음 0.5 mL Ultracel 10kD MWCO 필터 (Millipore)에서 50 μL로 농축시키고 0.3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.0), 5 μg 글리코겐에서 에탄올을 침전시키고, 그리고 -70 ℃에서 30분 동안 저장 전에 75% 에탄올의 최종 농도로 하였다. 각각의 사이클 조건의 세부사항은 표 2에 제공되어 있다.
경쟁적으로 용출된 RNA를 RNA의 신규한 모집단으로 전환시키기 위해, 용출 분획을 에탄올에 침전시키고, 13000 x g에서 4 ℃에서 펠릿화하고, 경사분리하고, 그리고 진공하에서 건조시켰다. 건조된 펠릿은 0.7 mM 각 dNTP, 7 μM RT-PCR 프라이머로 재구성하고, 그리고 5분 동안 65 ℃로 가열하기 전에 총 용적을 14 μL로 하고, 그리고 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 용액을 그런 다음 하기로 옮겼다: 최대 1x SuperScript III 제1-가닥 완충액 (5x:250 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 375 mM KCL, 15 mM MgCl2)으로, 20 μL의 총 용적 내 5 mM DTT 및 200 단위 SuperScript III (Life Technologies)를 가지는 것, 그 후 54 ℃에서 15분 연장함. 전체 20 μL 역전사 용액을 표준 Taq DNA 중합효소 조건을 사용하여 500 μL의 총 용적에서 PCR 증폭시켰다. 증폭된 풀은 그런 다음 40 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 25 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 0.01% 트리톤 X-100, 4 mM 각 rNTP pH 8.0, 0.08 단위 무기 포스파타제, 및 0.25 mg/mL T7 RNA 중합효소를 함유하는 1 mL 전사 반응물에 100 μL의 PCR 반응물을 부가함에 의해 전사되고 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. rNTP가 UTP, CTP, 및 GTP에 대해 2 mM로 낮아지고 반면 ATP는 200 μM 및 ~100 μCi 32P-ATP로 감소되는 것을 제외하고, 32P 라벨링된 RNA에 대한 100 μL 전사 반응이 유사한 조건 하에서 수행되었다. 전사 샘플은 따라서 확장된 겔 장입 조건으로 상기에 기재된 바와 같이 겔 정제되었다.
GsI 역전사효소를 사용한 선택은 하기 변화로 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다. 선택을 위한 완충액은 감소된 마그네슘 농도 및 보다 생리적으로 관련된 1가 양이온을 함유했다: 25 mM Na-HEPES, pH 7.0, 150 mM KCl, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2). GsI-IIC-MRF 역전사효소가 SuperScript III 대신에 사용되었다. GsI-IIC MRF 역전사효소는 문헌에 기재된 바와 같이 E. 콜리에서 발현되고 정제되었다 (Mohr 등, RNA, 2013, 19, 958-970). 침전된 RNA 펠릿은 1.25 mM dNTP 및 20 μM RT-PCR 프라이머로 옮겨지고 그 후 65 ℃에서 변성, 4 ℃에서 어닐링, 및 60 ℃에서 평형이 수행되었다. 용액을 그런 다음 20 μL 총 용적 내에 1x GsI-IIC-MRF 완충액 조건 (10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 20 mM TrisCl, pH 7.5, 1 mM DTT)으로 옮기고 충분한 효소를 연장을 위해 60 ℃에서 첨가하였다. PCR은 상기에 기재된 바와 같이 수행되었다.
실시예 11: 고-처리량 서열분석 및 생체정보 분석
표준 PCR은 어닐링에 필요한 일루미나 하이브리드화 서열을 유동 셀에 첨부하기 위해 수행되었다. 각각의 라이브러리는 구별되는 12개 뉴클레오타이드 바코드를 함유하는 순방향 서열분석 프라이머 및 고유의 역방향 프라이머로 증폭되었다 (서열은 표 1에 주어져 있다). 샘플은 구입 판독 및 색인 프라이머를 갖는 MiSeq (Illumina) 상에서 150 사이클 동안 v3 시약 키트를 사용하여 서열분석되었다.
얻어진 서열은 QIIME로부터의 스크립트를 사용하여 탈다중화되고, 트리밍되고, 그리고 품질 여과되었다 (Caporaso 등, Nat. Methods, 2010, 7, 335-336). P1 줄기 외측의 모든 서열정보는 트리밍되고 단지 각각의 뉴클레오타이드에 대해 Phred 점수 ≥ 20을 함유하는 서열만 분석에 사용되었다. 각각의 라이브러리에 대해 얻어진 파스타 형식 파일은 그런 다음 USEARCH (Edgar, Bioinformatics, 26, 2460-2461)에 의해 클러스터링되었으며, 이는 90% 동일성으로 클러스터링된 종자 서열을 생성했다; 단일 서열을 함유하는 임의의 클러스터는 버려졌다. 최상부 10개의 흔한 클러스터는 그런 다음 그것의 최초 서열 파일로 다시 맵핑되었고, 250개의 개별 서열은 추가 분석을 위해 각각의 클러스터의 대표적인 샘플로 무작위로 채택되었다. 각각의 클러스터에서의 서열은 MUSCLE (Edgar, NAR, 2004, 32, 1792-1797)을 사용하여 정렬되었고 수득한 정렬은 CMfinder (Yao 등, Bioinformatics, 2006, 22, 445-452)를 사용하여 분석되었다. R2R (Weinberg & Breaker, BMC Bioinformatics, 2011, 12, 3)은 그것의 디폴트 설정에서 실행되어 최소 자유 에너지 (MFE) 이차 구조 상에 맵핑된 서열 보존의 수치를 생성했다.
실시예 12: NMIA 화학적 탐침검사
RNA는 이전에 기재된 바와 같이 제조되었다 (Edwards 등, Methods Mol. Biol., 2009, 535, 135-163). RNA의 5' 및 3' 말단에 측접하는 카셋트 구조가 역전사를 용이하게 하기 위해 첨가되었고 NMIA 변형은 확립된 프로토콜 (Wilkinson 등, Nat. Protoc., 2006, 1, 1610-1616)을 사용하여 25 ℃에서 수행되었다. RNA는 100 mM Na-HEPES, pH 8.0, 100 mM NaCl, 및 6 mM MgCl2에서 100 nM로 탐색되었다. 리간드 농도는 표시된 곳에서 500 μM이였다. 겔 이미지는 SAFA (Das 등, RNA, 2005, 11, 344-354) 및 ImageJ (NIH)에 의해 분석되었다.
실시예 13: 등온 적정 열량측정 (ITC)
시험된 모든 RNA는 SSIII 선택 완충액 (10 mM Na-HEPES, pH 7.0, 250 mM NaCl; 50 mM KCl; 10 mM MgCl2)으로 교환되었고 10 kD MWCO 필터 (EMD Millipore)에서 3회 세정되었다. 리간드는 건조 고체로부터 직접적으로 5-하이드록시인돌 모이어티에 대해 8000 mol- 1 cm-1의 275 nm에서 소광 계수를 사용하여 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 상에 확립된 결합 완충액 및 농도로 옮겨졌다. RNA 50-100 μM 사이로 희석되고 리간드는 RNA의 거의 10배 농도에서 적정되었다. 적정은 확립된 프로토콜 (Gilbert and Batey, Methods Mol. Biol., 2009, 540, 97-114)을 사용하여 MicroCal iTC200 마이크로열량계 (GE Healthcare)를 사용하여 25 ℃에서 수행되었다. 데이터가 분석되고 적합화는 Origin 5.0 소프트웨어 제품군 (Origin Laboratories)으로 수행되었다.
실시예 14: 5HTP-II/5HTP 착물의 구조 결정
결정화를 위한 RNA는 이전에 기재된 바와 같이 제조되었다 (Edwards 등, Methods Mol. Biol., 2009, 535, 135-163). RNA는 Amicon Ultra 15 10k MWCO 필터 (EMD Millipore, Inc.)에서 농축되고 0.5x T.E. 완충액으로 교환되었다. 회절 품질 결정은 2 μL RNA:리간드 착물 (1:1) 및 3.5 μL 모액 (8-14% 2-메틸-2,4-펜탄디올, 40 mM 나트륨 카코딜레이트 pH 5.5, 4 mM MgCl2, 12 mM NaCl, 80 mM KCl, 및 4-9 mM 코발트 헥사민)을 혼합하고, 마이크로-씨딩하고, 그리고 22 ℃에서 1-3일 동안 인큐베이션함에 의해 수득되었다. 결정은 추가의 저온보호가 필요하지 않았고 데이터 수집 전에 액체 질소에서 플래시 냉동되었다. 데이터는 CuKα 방사선 (1.5418 Å)을 사용하여 100 K에서 Rigaku R- Axis IV 이미지 플레이트 시스템으로 수집되었고, 하기를 사용하여 색인이 만들어지고 확장되었다: D*TREK (Pflugrath, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 1999, 55, 1718-1725). 코발트 헥사민을 1-11 mM 이리듐 헥사민으로 대체함에 의해 제작된 중원자 유도체에 대한 데이터는 홈 x-선 공급원 상에 또한 수집되었다. 상들은 변칙적인 산란 (SIRAS) 방법으로 단일 동형 대체를 사용하여 결정되었다. AutoSol (Adams 등, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) 방법을 사용하여 그런 다음 상을 계산하기 위해 사용한 12개 이리듐 원자를 발견하였다. 얻어진 실험적 밀도 지도는 RNA 백본과 나선의 모호하지 않은 특징을 나타내었고 모델을 구축하는 데 사용되었다.
초기 모델은 하기에서 리간드 없이 반복적으로 구축되었다: Coot (Emsley & Cowtan, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 2004, 60, 2126-2132)로 PHENIX에서 개량의 라운드 사이 (Adams 등, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221). RNA 모델은 모델에 5HTP가 내장되기 전에 개량 및 모의실험된 어닐링의 몇 차례 라운드를 거쳤다. 이 구축의 시점에서, 리간드의 확실한 배치 및 배향을 허용하는 결합 포켓 내의 명확한 리간드 밀도가 존재한다. 리간드 및 염기의 배치는 복합체 생략 지도에 의해 입증되었다 (도 10B). 물 배치는 Fo-Fc 차이 지도에서의 피크 크기를 기반으로 한 리간드 배치 후 최종 개량 라운드에서 자동화되었다. 수득한 모델은 하기를 사용하여 판단된 바와 같이 양호한 기하학을 가졌다: MolProbity (Chen 등, 2010, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) 및 최종 모델 통계 (Rwork 및 Rfree는 각각 21.9% 및 26.2%임). 모든 결정학 데이터 및 모델 통계는 표 4에 주어져 있다.
실시예 15: 시험관내 브로콜리 센서 검정
RNA는 금속 이온의 이행을 최소화하기 위해 10k MWCO Amicon Ultra (Millipore)에서 추가의 0.5x T.E. 버퍼 세정으로 상기에 기재된 바와 같이 제조되었다. 모든 RNA 센서는 80 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM KCl, 및 50 mM NaCl을 함유하는 완충액에서 0.5 μM RNA 및 10 μM (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI)의 농도에서 분석되었다. 완충액, 리간드, 마그네슘 (표 6에서 제공된 농도), 및 DFHBI는 RNA의 첨가 전에 혼합되었고 모든 반응은 30분 동안 실온에서 인큐베이션되도록 하였다. DFHBI 형광은 Greiner 96-웰 편평한 바닥 흑색 형광 플레이트 (Thermo Scientific)에 200 μL 반응 용적을 놓고 Tecan Infinite M200 PRO 플레이트 리더에서 판독함으로써 측정되었다. 샘플은 460 nm에서 여기되었고 형광 방출은 506 내지 510 nm 사이의 평균 신호로 측정되었다. 절반의 최대 형광 반응을 유도하기 위한 리간드의 농도는 리간드 농도의 함수로서 관측된 형광을 2개의 상태 모델에 적합화함으로써 결정되었다.
조작된 센서는 G-블록 (도 23에 주어진 센서의 서열; 통합된 DNA Technologies) 합성되고 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 pET30b에서 XbaI과 BlpI 부위 사이에서 클로닝되었다. 모든 수득한 플라스미드가 서열 확인되었다. T7 RNA 중합효소 전사 반응에 대해, DNA 템플레이트는 표준 PCR 반응을 사용하여 1 μM 외부 프라이머 (5': GGCCGTAATACGACTCACTATAGGAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAG, 3': TGGCGCCCGAACAGGGACTTGAACCCTGGA)를 사용한 PCR에 의해 생성되었다. 템플레이트를 시험관내 전사 반응(상기 참고)에 직접적으로 첨가하고 RNA 합성이 2시간 동안 37 ℃에서 진행되도록 하였다. 상기 전사 반응으로부터의 RNA를 추가 정제 없이 검정에서 직접적으로 사용하였다.
각각의 센서의 활성은 하기를 함유하는 100 μL 반응물에서 모니터링되었다: 50 μl의시험관내 전사 반응물, 10 μl의 10x 조사 완충액 (1x:50 mM K-HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 150 mM KCl, 50 mM NaCl), 30 μM DFHBI-1T 및 2 mM 리간드 (플러스 리간드 반응용). 반응물은 30분 동안 실온에서 인큐베이션되고 DFHBI 형광은 Greiner 96-웰 편평한 바닥 흑색 형광 플레이트 (Thermo Scientific)에 90 μL 반응 용적을 놓고 Tecan Infinite M200 PRO 플레이트 리더에서 판독함으로써 측정되었다. 샘플은 460 nm에서 여기되었고 형광 방출은 506 내지 510 nm 사이의 평균 신호로 측정되었다. 모든 실험에 대해, tRNA-스캐폴드된 브로콜리 압타머의 양성 대조군은 리간드의 존재 및 부재에서 수행되었고, 이것은 또한 상대 휘도에 대한 참조로서 사용되었다. 접힘-유도는 DFHBI-1T 조건 단독에 대한 형광 값으로 DFHBI-1T 플러스 리간드 반응에 대한 형광 값을 나눔에 의해 계산되었다. 모든 실험을 3중으로 수행되었고 정량화된 데이터는 평균의 표준 오차 (s.e.m.)로 보고되었다
실시예 16: 시험관내 브로콜리 센서 검정
E. 콜리 One Shot® BL21 Star (DE3) 세포 (Thermo Fisher)가 50 μg/mL 카나마이신으로 보충된 LB 한천 상으로 도말된 유도성 대조군 하에서 센서를 함유하는 pET30b-유래된 플라스미드로 전환되고 37 ℃에서 대략 16시간 동안 인큐베이션되었다. 개별 콜로니가 선정되고 50 μg/mL 카나마이신 보충된 5 mL의 LB에서 밤새 (대략 16시간) 성장되어 배양물이 포화에 도달하도록 하였다. 스크리닝 실험을 위해, 5 μl의 포화된 밤샘 배양물을 50 μg/mL 카나마이신으로 보충된 5 mL의 LB에 첨가하고 37 ℃에서 중간-대수증식 (대략 0.4-0.6의 OD600)으로 성장시켰다. 브로콜리 압타머 단독 또는 브로콜리/리보스위치 압타머 융합 작제물의 발현을 유도하기 위해, IPTG를 각각의 배양물에 1 mM의 최종 농도로 첨가하여, 그 다음 추가의 2시간 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 세포는 그런 다음 원심분리에 의해 펠릿화되고 5 mM의 최종 농도로 MgSO4 및 50 μg/mL의 최종 농도로 카나마이신으로 보충된 5 mL의 1X M9 염으로 1회 세정되었다. 세정 후, 세포는 원심분리에 의해 펠릿화되고, 250 μl의 상기 M9 배지에서 재현탁되고 그리고 두 개의 100 μl 분취액으로 분할되었다. 분취액의 절반에, DFHBI-1T가 110 μL의 최종 용적에서 50 μM의 최종 농도로 첨가되었다. 분취액의 다른 절반에는, DFHBI-1T가 50 μM의 최종 농도로 첨가되었고 그리고 리간드 (5HTP, 5HP 또는 도파민)이 110 μL의 최종 용적에서 1 mM의 최종 농도로 첨가되었다. 세포는 그런 다음 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션되어 각각의 화합물이 흡수되도록 하였다. 30분 인큐베이션에 이어, 100 μl의 각각의 분취액을 Greiner 96-웰 흑색 마이크로플레이트로 피펫팅하고 얼음 상에서 30분 동안 냉각시켰다. 형광 측정을 위해, DFHBI-1T가 472 nm의 여기 파장 및 520 nm 방출 파장에서 모니터링되었다. 정량화된 데이터는 pET30b 빈 벡터 대조군을 사용하여 배경 보정된 세 가지 생물학적 복제물로부터 평균 형광 값 ± 평균의 표준 오차 (s.e.m.)를 나타낸다. 접힘-유도는 리간드에 노출된 세포의 평균 형광 값을 리간드 없는 세포의 평균 형광으로 나눔에 의해 계산되었다.
실시예 17: 5HTP의 세포내 형광 이미지형성
DNA 및 배양물을 기재된 바와 같이 제조하였다 (Paige 등, Science, 2012, 335, 1194). 간단히, tRNA/브로콜리 융합 서열을 유도성 T7 프로모터의 XbaI과 BlpI 부위 다운스트림 사이의 pET30b 안으로 클로닝하였다. 서열-확인된 플라스미드는 BL21 (DE3) STAR 세포 (Invitrogen) 안으로 전환되었고 단일 콜로니가 50 μg/mL 카나마이신으로 보충된 Luria 액체배지 (LB)에서 밤새 성장되었다. 밤새 배양물을 사용하여 1:1000 희석으로 신선한 LB/카나마이신 배지를 접종하고 배양물을 37 ℃에서 OD600 = 0.4-0.6 성장시키고 그 후 1 mM IPTG로 유도하고 그리고 37 ℃에서 2-4시간 동안 성장시켰다. 200 μl의 수득한 배양물을 원심분리하고, 경사분리하고, 그리고 50 μg/mL 카나마이신, 5 mM MgSO4, 및 1 mM IPTG로 보충된 2 mL의 M9 최소 염 배지에서 재현탁시켰다. 200 μl의 재현탁된 배양물을 96-웰 폴리-D-라이신 코팅된 유리 바닥 플레이트 (MatTek)로 이전시키고 그리고 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 그런 다음 제거하고, 그리고 200 μl의 M9 배지, 1 mM IPTG, 및 400 μM DFHBI-1T (Lucerna)를 첨가하기 전에 웰들을 M9/카나마이신/1 mM IPTG 배지로 세정하였다. 생생한 형광 이미지를 Nikon Ti-E 현미경 상에서 60x 오일 대물렌즈, 여기 필터 472/30, 이색성 거울 490 (장경) 및 방출 필터 520/40를 사용하여 Andor iXon3 897 EMCCD로 취하고, FIJI로 분석했다 (Schindelin 등, Nat. Methods, 2012, 9, 676-682).
실시예 18: 단일 턴오버 시험관내 전사 검정
dsDNA 템플레이트를 이전에 기재된 바와 같이 전사하였다 (Trausch 등, Structure, 2011, 19, 1413-1423). 간단히 말해서, 50 ng의 DNA 템플레이트를 23 μL로 한 반응 당 12.5 μL의 2x 전사 완충액 (140 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 140 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 28 mM β-머캅토에탄올 및 70 mg/mL BSA), 2.5 μL 50 mM MgCl2, 100-200 μCi의 32P-ATP, 및 0.25 단위의 E. 콜리 RNA 중합효소 σ70 홀로엔자임 (Epicentre Biotechnologies)에서 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 평형화된 반응은 그런 다음 7.5 μL 반응 완충액 (165 μM 각 rNTP, 0.2 mg/mL 헤파린, 및 원하는 리간드 농도)의 첨가로 개시되었고, 8M 우레아로 켄칭하기 전에 15분 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었다. 반응물을 그런 다음 8% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 건조시키고, 포스포르 이미지형성기 스크린 상에 노출시켰다. 겔의 정량화는 ImageJ (NIH)에서 수행하였고 데이터는 2-상태 모델에 적합화하였다.
수탁 코드
좌표와 구조 인자는 수탁 코드 4ZAQ 하에서 RSCB 단백질 데이터 은행에 기탁되었다.
참고에 의한 편입
본원의 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조 (참고 문헌, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계속 특허 출원을 포함함)의 내용은 이로써 그것의 전체로 본 명세서에 참고로 명시적으로 편입된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당 업계에서 통상적인 기술자에세 통상적으로 알려진 의미와 일치한다.
등가물
당해 분야의 숙련가는 일상적인 실험과정 이하를 사용하여 본 명세서에 제공된 특이적 구현예의 많은 균등물을 인식할 것이거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (58)

  1. 복수의 동일하지 않은 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리로서, 각각의 올리고뉴클레오타이드가,
    a) 나선 도메인을 포함하는 제1 서열;
    b) 제1 헤어핀 도메인을 포함하는 제2 서열;
    c) 제2 헤어핀 도메인을 포함하는 제3 서열; 및
    d) 올리고뉴클레오타이드 접합
    을 포함하는 구조적 스캐폴드를 포함하고,
    올리고뉴클레오타이드 접합이 (i) 나선 도메인, 제1 헤어핀 도메인 및 제2 헤어핀 도메인을 연결하는 서열 및 (ii) 리간드-결합 도메인을 포함하고,
    라이브러리가 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 도메인을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  2. 복수의 동일하지 않은 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리로서, 각각의 올리고뉴클레오타이드가,
    a) 나선 도메인을 포함하는 제1 서열;
    b) 제1 헤어핀 도메인을 포함하는 제2 서열;
    c) 제2 헤어핀 도메인을 포함하는 제3 서열; 및
    d) 올리고뉴클레오타이드 접합
    을 포함하는 구조적 스캐폴드를 포함하고,
    올리고뉴클레오타이드 접합이 (i) 나선 도메인, 제1 헤어핀 도메인 및 제2 헤어핀 도메인을 연결하는 서열 및 (ii) 사전-선택된 리간드-결합 도메인을 포함하고,
    라이브러리가 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 도메인을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 나선 도메인은 독립적으로, 미스매치된(mismatched) 염기 쌍, G·U 워블 염기 쌍 및 벌지(bulge)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 선택적으로 포함하는 완전하게 상보적 나선인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 나선 도메인은 완전하게 상보적 나선인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 제1 헤어핀 도메인은 독립적으로, 미스매치된 염기 쌍, G·U 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 제2 헤어핀 도메인은 독립적으로, 미스매치된 염기 쌍, G·U 워블 염기 쌍 및 벌지로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 불안정한 뉴클레오타이드를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 나선 도메인은 길이가 적어도 4 내지 10 염기 쌍인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  8. 제7항에 있어서, 나선 도메인은 길이가 적어도 10 염기 쌍인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 식 I에 따른 일련의 연결된 서열을 갖는 서열을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리:
    (I) P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/1-P1'
    여기서
    -는 결합을 나타내고;
    P1 및 P1'는 나선을 형성하고;
    P2, L2 및 P2'은 제1 헤어핀을 형성하고;
    P3, L3 및 P3'은 제2 헤어핀을 형성하고;
    J1/2, J2/3 및 J3/1은 함께 올리고뉴클레오타이드 접합을 형성한다.
  10. 제9항에 있어서, J2/3은 T-루프 모티프를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  11. 제10항에 있어서, T-루프 모티프는 서열 UUGAA를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  12. 제11항에 있어서, T-루프의 구아노신은 J3/1에서 시티딘과 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 형성하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 나선 도메인은 제1 단부 및 제2 단부를 갖고, 제1 단부는 올리고뉴클레오타이드 접합의 근위에 있고, 제2 단부는 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈에 연결되는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  14. 제13항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈은 플루오로제닉 또는 스위치-기반 판독 모듈인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  15. 제14항에 있어서, 플루오로제닉 모듈은 브로콜리 형광단 결합 압타머인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  16. 제14항에 있어서, 스위치-기반 모듈은 pbuE 스위치인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  17. 제13항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드-기반 판독 모듈은 올리고리보뉴클레오타이드-기반 판독 모듈인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 23개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 xpt-pbuX 구아닌 리보스위치 서열에 서열 관련성(sequence correspondence)을 갖는 서열을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 21개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는, 비브리오 콜레라 Vc2 환형 디-GMP 리보스위치 서열에 서열 관련성을 갖는 서열을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 접합 내에 21개 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는, 쉬스토소마 만소니 헤머헤드 리보자임 서열에 서열 관련성을 갖는 서열을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 접합은 N-방향 접합이고, 여기서 N은 3, 4 또는 5인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 접합은 N-방향 접합이고, 여기서 N은 3인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 접합은 N-방향 접합이고, 여기서 N은 4인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 접합은 N-방향 접합이고, 여기서 N은 5인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 라이브러리는 421 내지 423의 동일하지 않은 구성원을 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  26. 제1항에 있어서, 리간드-결합 도메인은 아미노산, 펩타이드, 핵염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 금속 이온, 신경전달물질, 호르몬, 활성 약제학적 성분, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 화합물에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  27. 제2항에 있어서, 사전선택된 리간드-결합 도메인은 아미노산, 펩타이드, 핵염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 금속 이온, 신경전달물질, 호르몬, 활성 약제학적 성분, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 화합물에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  28. 제26항에 있어서, 리간드-결합 도메인은 아미노산, 핵염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 신경전달물질, 호르몬, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  29. 제27항에 있어서, 사전선택된 리간드-결합 도메인은 아미노산, 핵염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 신경전달물질, 호르몬, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  30. 제28항에 있어서, 리간드-결합 도메인은 뉴클레오타이드, 신경전달물질, 호르몬, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  31. 제29항에 있어서, 사전선택된 리간드-결합 도메인은 뉴클레오타이드, 신경전달물질, 호르몬, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  32. 제1항에 있어서, 리간드-결합 도메인은 5-하이드록시-L-트립토판, L-트립토판, 세로토닌 및 5-하이드록시-L-트립토판-메틸아미드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  33. 제2항에 있어서, 사전선택된 리간드-결합 도메인은 5-하이드록시-L-트립토판, L-트립토판, 세로토닌 및 5-하이드록시-L-트립토판-메틸아미드로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 리간드에 대한 결합 부위를 포함하는, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 리간드는 5-하이드록시-L-트립토판 또는 세로토닌 중 적어도 하나인, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리.
  35. 1) 리간드 결합을 위한 적합한 조건하에서 복수의 RNA 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를 리간드와 접촉시키되, 각각의 RNA 올리고뉴클레오타이드가,
    a) 나선 도메인을 포함하는 제1 서열;
    b) 제1 헤어핀 도메인을 포함하는 제2 서열;
    c) 제2 헤어핀 도메인을 포함하는 제3 서열; 및
    d) 올리고뉴클레오타이드 접합을 포함하는 구조적 스캐폴드를 포함하고,
    올리고뉴클레오타이드 접합이 나선 도메인, 제1 헤어핀 도메인 및 제2 헤어핀 도메인을 연결하는 서열을 포함하는 것인, 단계; 및
    2) 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 RNA 올리고뉴클레오타이드가 선택되도록 RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를 공간적으로 주소지정 가능한 것에 분할하되, 올리고뉴클레오타이드 접합이 리간드-결합 도메인을 추가로 포함하고, RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리의 리간드-결합 도메인이 가변성 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 것인, 단계
    를 포함하는, 복수의 동일하지 않은 리간드-결합 RNA 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 방법은 단계 1)과 단계 2) 사이에 단계 1a)를 추가로 포함하고, 단계 1a)는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를 유리 리간드의 용액과 경쟁적으로 분할하는 것을 포함하는, 방법.
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