JP6041288B2 - ホスホランバン標的修飾rnaアプタマー - Google Patents
ホスホランバン標的修飾rnaアプタマー Download PDFInfo
- Publication number
- JP6041288B2 JP6041288B2 JP2012028555A JP2012028555A JP6041288B2 JP 6041288 B2 JP6041288 B2 JP 6041288B2 JP 2012028555 A JP2012028555 A JP 2012028555A JP 2012028555 A JP2012028555 A JP 2012028555A JP 6041288 B2 JP6041288 B2 JP 6041288B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phospholamban
- modified rna
- target
- rna aptamer
- serca
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
ホスホランバン標的修飾RNAアプタマーの選択は、以下の方法で行った。ホスホランバンの1〜32番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にPDZドメイン、Mycタグ、ヒスチジンタグタンパク質を順次連結したPLN1−32−PDZ−Myc−His6又は、PDZドメイン、Mycタグ、ヒスチジンタグタンパク質が順次連結したPDZ−Myc−His6融合タンパク質の調製は、Kimuraらの方法(Kimura,Y.et al.,Mol.Pharmacol.61:667-673,2002)で行った。PLN1−32−PDZ−Myc−His6又は、PDZ−Myc−His6を結合したNi−NTAビーズの調製は、Ni−NTAビーズをPBS−T(0.05%のTween20を含むリン酸バッファー溶液)で平衡化した後に、5μlのビーズにPLN1−32−PDZ−Myc−His6又は、PDZ−Myc−His6 10μgを含むPBS−T 200μlを加え、4℃で30分間振とうした。反応させたビーズは、PBS−T 1mlで3回洗浄した。1本鎖RNAライブラリーとしては、40塩基の混合配列の5’端と3’にそれぞれT7プロモーターとPCR増幅用配列を含む配列P1(配列番号21)とPCR増幅用のP2(配列番号22)を付加した80塩基の2本鎖DNAを合成し、これを鋳型にT7 RNA polymeraseを用いて1本鎖修飾RNAを合成した。かかるRNAは、硫黄修飾ATP(Adenosin-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer)、CTP、GTP、UTPを使用して合成した。1nmolの1本鎖修飾RNAライブラリーをPBS−T 100μl中98℃で3分間変性させ、直ちに4℃で冷却した。第1回目の選択では、1本鎖RNAライブラリーをPDZ−Myc−His6結合Ni−NTAビーズ 5μlとBSA 1μg/mlを含むPBS−T 10mlへ添加した。室温で30分間振とうした後、混合物を3,000rpmで5分間遠心分離し、その上清をPLN1−32−PDZ−Myc−His6結合Ni−NTAビーズ 5μlと、室温で30分間混合した。ビーズは、PBS−T 1mlで3回洗浄した。タンパク質に結合した修飾RNAアプタマーは、0.5Mのイミダゾール−HCl(pH 7.4)50μlに溶出した。溶出液は、フェノール−クロロホルム混合液で抽出し、1本鎖修飾RNAをエタノールで沈殿させた。70%のエタノールで洗浄した後、1本鎖修飾RNAは、2×RT−PCR反応液 25μl、10pmolのP1プライマー(配列番号21)とP2プライマー(配列番号22)、RT/Platina Taq polymerase(Invitrogen社製)1μlを含むPCR混合液50μlに溶解した。50℃で20分間反応させた後、95℃で2分間変性させた。95℃で30秒間の熱変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長反応を25サイクルのPCR反応を行い、2本鎖DNAを増幅した。PCR産物の一部を4%アガロースゲルで電気泳動し、正しい長さの2本鎖DNAが増幅されていることを確認した。かかる2本鎖DNAを鋳型に、5×反応液 20μl、硫黄修飾ATP(Adenosin-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer)、CTP、GTP、UTP(各5mM)、T7 RNA polymerase(プロメガ社製)を含む反応液(100μl)を調整し、37℃で2時間反応を行った。さらに、5unitsのRNase-free DNaseを加え37℃で15分間反応させ鋳型DNAを除いた。
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞(最終濃度50μg/ml)を、20mMのイミダゾール−HCl(pH6.9)、100mMのKCl、2mMのMgCl2、5mMのNaN3、0.1mMのATP、0.35μM Ca2+(Ca−EGTA buffer:0.5mMのCaCl2と1.3mMのEGTA)を含む反応液50μlに懸濁し、合成した配列番号1〜7及び配列番号9〜20で示される塩基配列からなる19種類のホスホランバン標的修飾RNAアプタマー(1μM)のいずれか1種類の存在下及び非存在下で、37℃で4分間のATPase活性を測定した。活性測定は、佐々木らの方法(Sasaki, T. et al., J. Biol. Chem. 267: 1674-1679 (1992))を用いた。0.35μM Ca2+の代わりに2mMのEGTAを加えたCa2+非存在下でも同様にATPase活性を測定し、両者の量からCa2+依存性ATPase活性(SERCA活性)を求めた。アプタマーのSERCA活性への効果を見るために、アプタマー存在下と非存在下でのSERCA活性の比を求めた。
本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーの血中安定性を調べるために、以下の実験を行った。ヒトの血清1mlに、配列番号23で示される塩基配列からなるホスホランバン標的DNAアプタマー(Apt−DNA−9)又はApt−RNA−19(11−30)ホスホランバン標的修飾RNAアプタマーを20μg添加し、37℃で0、1、2、3、6、12、又は24時間インキュベートした。各サンプルをエタノール沈殿による濃縮後、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドにより染色した(図4)。Apt−DNA−9(11−30)がインキュベーション3時間から分解しはじめ、12時間後にはほぼ完全に分解したのに対し、Apt−RNA−19は24時間後においても、インキュベーション開始時とほぼ同程度の量が分解されずに残っていることが示された。すなわち、本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーは、ホスホランバンDNAアプタマーよりも血中安定性に優れており、体内に投与した場合に長時間分解されないためより効果が高いと考えられる。
本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーの心筋細胞への効果を調べるために、以下の実験を行った。ラット成獣より心筋細胞を調製し、ホスホランバン標的修飾RNAアプタマーApt−RNA−19(11−30)又はスクランブルの修飾RNAを細胞内導入試薬N-Ter(シグマ社製)と共に心筋細胞に添加した。5%CO2、37℃にて4時間培養した。スクランブルの修飾RNAは、Apt−RNA−19と同じ40塩基の修飾RNAからなり、塩基組成が同じでありながら塩基配列がランダムな塩基の並びからなる、ネガティブコントロールである。
細胞長の変化とFura-2を用いた細胞内Ca2+濃度変化は、Iwanagaらの方法(Iwanaga, Y. et al. J. Clin. Invest. 113: 727-736 (2004))により測定した。顕微鏡を用いた細胞長の測定結果を図5のa−cに示す。Apt−RNA−19(11−30)添加により、細胞長の短縮率(図5のa)と収縮速度(図5のb)が有意に増加した。すなわち、Apt−RNA−19添加により細胞収縮能が向上したことが示された。また、図5のcに示すようにApt−RNA−19(11−30)添加により、細胞弛緩速度が有意に増加し、Apt−RNA−19(11−30)により細胞弛緩能が向上したことが示された。
蛍光顕微鏡による心筋細胞内Ca2+濃度測定の結果を図5のd及びeに示す。Apt−RNA−19(11−30)添加により、細胞内最大Ca2+濃度が有意に増加した(図5のd)。すなわち、Apt−RNA−19による収縮力増大に対応した細胞内Ca2+の増加が認められた。また、心筋細胞内Ca2+濃度低下の時定数を測定した結果、Apt−RNA−19(11−30)添加により、細胞内Ca2+濃度低下の時定数への効果が有意に減少した(図5のe)。すなわち、Apt−RNA−19(11−30)によりSERCAが活性化された結果、細胞内Ca2+低下が速やかに行われ心筋細胞の弛緩能が亢進していることを示す。
これらの結果から、本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーは心筋細胞の収縮、弛緩能を増強し、また速やかかつ効果的な細胞内Ca2+濃度変化に効果を有することが示された。
本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーの心筋細胞への効果に必要な長さを調べるために、以下の実験を行った。Apt−RNA−19(配列番号10)又はApt−RNA−30(配列番号20)について、全長(1−40)、N末端側10塩基欠失体(11−40)、C末端側10塩基欠失体(1−30)及びN末端及びC末端側10塩基欠失体(11−30)を作製した。これらのアプタマーフラグメント0.1μM又は1μMによるSERCA活性化への効果を実施例2と同様の方法で調べた。その結果、Apt−RNA−19はいずれのフラグメントも全長体と同程度のSERCA活性化効果を有することが示された(図6)。また、Apt−RNA−30は11−30フラグメントのSERCA活性化効果が少々低かったものの、11−40フラグメント及び1−30フラグメントは、全長よりも高いSERCA活性化効果を有することが示された(図7)。したがって、本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーはN末端側又はC末端側が欠失したフラグメントの形であっても、40塩基のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーと遜色なく高いSERCA活性化効果を有することが示された。
ビオチンでラベルした本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーとホスホランバン細胞質領域との結合を以下の方法で調べた。実施例1と同様の方法で作製した10μgのPDZ−Myc−His6結合Ni−NTAビーズと各濃度段階のApt−RNA−19(11−30)又はApt−RNA−30(1−30)とを0.1% Triton X-100と0.1mg/mlを含むPBS中で室温、30分間反応させ、結合させた。同液で洗浄後、HRPでラベルしたアビジンを結合させた。HRPの発色によりビオチンでラベルしたホスホランバン標的修飾RNAアプタマーの結合量を測定した。結果を図8及び図9に示す。ホスホランバン細胞質領域とホスホランバン標的修飾RNAアプタマーは、修飾RNAアプタマー濃度依存的に結合量が増加した。ホスホランバン細胞質領域とApt−RNA−30(11−30)解離定数Kdは27nM、ホスホランバン細胞質領域とApt−RNA−30(1−30)の解離定数Kdは11nMであった。
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞(最終濃度50μg/ml)に、各濃度段階のApt−RNA−19(11−30)を加え、0.35μMのCa2+存在下で実施例2と同様の方法でSERCA活性を測定した。同様に各濃度段階のApt−RNA−30(1−30)を加え、0.35μMのCa2+存在下で実施例2と同様の方法でSERCA活性を測定した。結果を図10及び図11に示す。本発明の修飾RNAアプタマー濃度依存的にSERCA活性が増加し、Apt−RNA−19(11−30)のEC50は0.31μM、Apt−RNA−30(1−30)のEC50は18nMであった。また、本発明者らが既に得ているホスホランバンDNAアプタマー(No.9、配列番号23;特開2009−189292号公報参照)のEC50は3.2μMであったことから、本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーは濃度依存的にSERCA活性を増強し、さらにいずれの濃度においても本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーは、ホスホランバンDNAアプタマーよりもSERCA活性を増強する効果が高いことが示された。
カルシウム依存的SERCA活性への本発明のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーの作用メカニズムを調べるために、以下の実験を行った。イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞(最終濃度50μg/ml)に、TBS(10mM Tris−HCl,pH7.4+150mM NaCl)(コントロール)又は合成したApt−RNA−30(1−30)を2μM、又は抗ホスホランバン抗体(mAb−A1、Kimura, Y. et al. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 1223-1230 (1991))を25μg/ml添加したサンプルを調整した。各サンプルについて、種々のCa2+濃度段階におけるSERCA活性を実施例2と同様の方法にて調べた。SERCA活性のCa2+濃度依存性は、最大のSERCA活性を100%としたパーセント表示で示した。結果を図12に示す。
Claims (8)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかの塩基配列からなるホスホランバンに特異的な結合性を有する1本鎖RNAであって、硫黄修飾されていることを特徴とするホスホランバン標的修飾RNAアプタマー。
(a)配列番号10又は20で示される塩基配列;
(b)配列番号10又は20で示される塩基配列のN末端側あるいはC末端側の10塩基を欠失した塩基配列;
(c)前記(a)又は(b)に示される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列;
(d)前記(a)又は(b)に示される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列。 - 配列番号10又は20で示される塩基配列が、配列番号20で示される塩基配列であることを特徴とする請求項1記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマー。
- 1本鎖RNAが、配列番号20で示される塩基配列のC末端側の10塩基を欠失した塩基配列からなる、ホスホランバンに特異的な結合性を有する1本鎖RNAであることを特徴とする請求項1記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマー。
- 血中で少なくとも24時間安定であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマー。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーを有効成分とする、カルシウムイオンポンプATPase(SERCA)の活性増強剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーを有効成分とする心筋の収縮及び弛緩機能増強剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーを有効成分とする心不全治療及び予防薬。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾RNAアプタマーを心不全治療及び予防薬を調製するために使用する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012028555A JP6041288B2 (ja) | 2012-02-13 | 2012-02-13 | ホスホランバン標的修飾rnaアプタマー |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012028555A JP6041288B2 (ja) | 2012-02-13 | 2012-02-13 | ホスホランバン標的修飾rnaアプタマー |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013162771A JP2013162771A (ja) | 2013-08-22 |
JP6041288B2 true JP6041288B2 (ja) | 2016-12-07 |
Family
ID=49174579
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012028555A Expired - Fee Related JP6041288B2 (ja) | 2012-02-13 | 2012-02-13 | ホスホランバン標的修飾rnaアプタマー |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6041288B2 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005220910A1 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Archemix Corp. | Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics |
JP2008512097A (ja) * | 2004-09-07 | 2008-04-24 | アーケミックス コーポレイション | アプタマー医薬品化学 |
JP5344671B2 (ja) * | 2008-02-14 | 2013-11-20 | 国立大学法人山口大学 | 心不全治療薬 |
TWI532842B (zh) * | 2009-06-11 | 2016-05-11 | 力博美科股份有限公司 | 針對凝乳酶之適體及其用途 |
-
2012
- 2012-02-13 JP JP2012028555A patent/JP6041288B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2013162771A (ja) | 2013-08-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | A novel microRNA-124/PTPN1 signal pathway mediates synaptic and memory deficits in Alzheimer’s disease | |
KR102381682B1 (ko) | B형 간염 감염을 치료하기 위한 papd5 및 papd7 억제제 | |
KR102612226B1 (ko) | 유전적으로 암호화가능한 바이오센서용 강력한 저분자 결합 압타머를 생성하기 위한 시험관내 선별법을 이용한 생물학적 rna 스캐폴드의 사용 | |
JP4351896B2 (ja) | p38/JTV−1を有効成分とする癌治療用薬学的組成物及び癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法 | |
KR101317100B1 (ko) | 세포-침투성 펩티드로서 유용한 펩티드 | |
CN105920582B (zh) | 基于细胞渗透性肽的激酶抑制剂 | |
ES2555160A1 (es) | Aptámeros específicos de TLR-4 y usos de los mismos | |
CN113244399A (zh) | 利用酪氨酸激酶抑制剂的组合物和方法 | |
WO2017018641A1 (ko) | 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
CN106794216A (zh) | 阻断异粘蛋白‑snd1相互作用的肽作为癌症治疗的用途 | |
JP2006514104A (ja) | グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3阻害剤 | |
JP2020072716A (ja) | 細胞透過組成物およびそれを用いる方法 | |
CN111542326B (zh) | 转铁蛋白受体(TfR)的RNA适体 | |
US20060216294A1 (en) | Method of modulation | |
US10253069B2 (en) | Compositions and methods for regulating arterial tone | |
JP6041288B2 (ja) | ホスホランバン標的修飾rnaアプタマー | |
US9993522B2 (en) | Treatment of pain by inhibition of USP5 de-ubiquitinase | |
JP5344671B2 (ja) | 心不全治療薬 | |
US10300107B2 (en) | Compositions and methods for CaMKII inhibitors and uses thereof | |
JP2022532335A (ja) | GLY101VAL突然変異を有するBCL-2媒介性ガンの処置に使用するためのBcl-2阻害剤 | |
JP2021507680A (ja) | Efハンドカルシウム結合モチーフに由来するカルシウムキレート化ペプチド | |
US20220288156A1 (en) | Treatment | |
JP2017086027A (ja) | 細胞核輸送受容体kpna2タンパク質に結合するアプタマー、及びそれを用いたkpna2タンパク質の機能阻害 | |
WO2024108216A1 (en) | Compositions comprising octadecaneuropeptides (odn) and synthetic derivatives thereof and methods of use for modulation of food intake, obesity, body weight, nausea, and emesis | |
AU2015233244B2 (en) | STAT5 inhibitors and use of same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150115 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151116 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160107 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160509 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160803 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160810 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161013 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161101 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6041288 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |