JP2021507680A

JP2021507680A - Ｅｆハンドカルシウム結合モチーフに由来するカルシウムキレート化ペプチド

Info

Publication number: JP2021507680A
Application number: JP2020523998A
Authority: JP
Inventors: ニコル，シャビエル; トーレス，オリオールロス
Original assignee: Sorbonne Universite
Current assignee: Sorbonne Universite
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2021-02-25
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: US20210179682A1; US11643449B2; EP3480210A1; WO2019086617A1; EP3704141A1; JP7286112B2

Abstract

本発明は、インビトロ又はインビボでの使用に適し、好ましくは特定の細胞区画を標的とすることができる、カルシウムと結合できる分子手段、特にカルシウムキレート剤であるペプチドの分野に関する。第１のカルシウム結合ドメイン、ペプチドリンカー及び第２のカルシウム結合ドメインを含むポリペプチドであって、上記第１及び第２の結合ドメインは、上記ペプチドリンカーを介して連結されており、第１のカルシウム結合ドメイン及び第２のカルシウム結合ドメインはそれぞれ、ＥＦハンドモチーフに由来する少なくとも１つのカルシウム結合部位を含み、第１のカルシウム結合ドメイン及び第２のカルシウム結合ドメインは、少なくとも１つのカルシウム結合部位が異なる、ポリペプチド。

Description

本発明は、インビトロ又はインビボでの使用に適し、好ましくは特定の細胞区画を標的とすることができる、カルシウム、特にカルシウムキレート剤であるペプチドを結合できる分子手段の分野に関する。

カルシウム（Ｃａ^２＋）は、代謝、生存から小胞の放出及び運動に至るまで、複数の細胞応答の中心となるセカンドメッセンジャーである。Ｃａ^２＋信号の遮断は、現在、細胞へのＣａ^２＋流入を遮断するか、又は細胞外若しくは細胞内Ｃａ^２＋をキレート化する薬理学的戦略に依存している。Ｃａ^２＋は多くの信号伝達経路、及び細胞外マトリックスの広範な構成要素の機能にとって重要であるため、これらの戦略は、細胞特異性を欠き、患者に適用するとさまざまな副作用を引き起こす。オプトジェネティクスの台頭は、その最初の出現以来、細胞内Ｃａ^２＋を増加させるための多種多様なツールを提供してきた。これは、興奮性細胞の電気的活動を制御するために広く使用されており、神経細胞の相互作用に焦点を当てた膨大な知識を提供し、さらに治療学の新しい有望な分野を切り開いてきた。それにもかかわらず、この戦略は、細胞外培地から追加のＣａ^２＋を流入させることに依存しており、Ｃａ^２＋濃度を下げる、又は内部貯蔵からのＣａ^２＋放出を標的とするなどの、内在性Ｃａ^２＋の変動を操作することはできない。さらに、光刺激が技術的に困難な場合（開発の初期段階など）、インビボでのオプトジェネティクスの使用には障害がある。

したがって、カルシウム信号伝達、特に細胞内カルシウム濃度を操作するための改善された手段が必要である。

ヘリックスループヘリックスカルシウム結合モチーフ（ＥＦハンドモチーフ）は、タンパク質で最も一般的なＣａ^２＋結合部位である。標準的なＥＦハンドモチーフは、長さが約２９アミノ酸で、高度に保存された１２個の残基で構成される柔軟なカルシウム結合ループによって繋がれた２つのアルファヘリックスで構成されている。

本発明者らは、ＥＦハンドモチーフに由来するカルシウム結合ドメインを含むポリペプチドを組み立てた。結果として、本発明のポリペプチドは、カルシウムチャネルの活性を改変するのではなく、カルシウムと直接相互作用する。したがって、それらは、細胞内Ｃａ^２＋のキレート剤として利用できる。

上記ポリペプチドは、Ｃａ^２＋に対する異なる結合親和性を有し、ペプチドリンカーを介して連結されている２つのカルシウム結合ドメインから形成される。本発明者らは、特に、異なるＥＦハンドモチーフに由来する、したがってＣａ^２＋に対して異なる親和性を有するカルシウム結合ドメインを関連付けることによって、影響を受けやすいカルシウム依存性細胞経路の範囲が拡大することを見出した。

本発明のポリペプチドは、インビトロ及びインビボで、例えば、下流エフェクターの活性化及びカルシウム依存性細胞過程を防止するために使用できる。本発明のポリペプチドは、単純な分子ツールを使用して、例えば細胞内の特定の区画を標的とするように蛍光ペプチド又は信号ペプチドを添加することによって容易にさらに機能化でき、したがって、多種多様な用途で使用できる。

本発明は、第１のカルシウム結合ドメイン、ペプチドリンカー及び第２のカルシウム結合ドメインを含むポリペプチドであって、上記第１及び第２の結合ドメインが、上記ペプチドリンカーを介して連結されており、
−第１のカルシウム結合ドメイン及び第２のカルシウム結合ドメインはそれぞれ、ＥＦハンドモチーフに由来する少なくとも１つのカルシウム結合部位を含み、
−第１のカルシウム結合ドメイン及び第２のカルシウム結合ドメインは、少なくとも１つのカルシウム結合部位が異なる、ポリペプチドに関する。

本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された、組換え又は合成のポリペプチドである。

本発明の文脈において、「少なくとも１つのカルシウム結合部位が異なる」という用語は、１つのカルシウム結合ドメインのカルシウム結合部位の少なくとも１つが、他のカルシウム結合ドメインのカルシウム結合部位のいずれかと異なることを示す。

本発明の文脈において、「ＥＦハンドモチーフに由来するカルシウム結合部位」という用語は、その配列がアミノ酸残基の置換、欠失又は付加によって上記ＥＦハンドモチーフの配列に由来し、カルシウムを結合する能力を保持しているペプチドを指す。

カルシウムを結合する能力は、周知の方法を使用して、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＴｉｋｕｎｏｖａ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；１７３：８９−１０２、２００２）によって詳細に説明されているような蛍光法を使用して簡単に測定できる。

好ましくは、本発明によるカルシウム結合部位のそれぞれは、標準的なＥＦハンドモチーフに由来する。

本発明の文脈において、「標準的なＥＦハンドモチーフ」という用語は、当分野で一般的に考慮されるように、すなわち、Ｅと指定される第１のαヘリックス（残基１〜１０）、カルシウム結合ループ（残基１０〜２１）、及びＦと指定される第２のαヘリックス（残基１９〜２９）を含む約２９アミノ酸残基を含むペプチド配列として解釈されるべきである。このモチーフは、多くのカルシウム結合タンパク質に見られる。

好ましくは、本発明のポリペプチドにおいて、カルシウム結合部位は、パルブアルブミン、カルモジュリン、カルレチニン、Ｄ２８Ｋ、カルビンジン、リカバリン、ヒポカルシン、ＮＣＳ−１、ＭＥＬＣ、カルシニューリン（Ｃａｃｉｎｅｕｒｉｎ）Ｂ、ＭＲＬＣ、カルトラクチン、ＴｎＣ、スクイジュリン（Ｓｑｕｉｄｕｌｉｎ）、グランカルシン、ソルシン、ＡＬＧ２、カルパイン、ＣａＰＫ、スペクチン、ｓＣａＢＰ、及びＢＭ−４０からなるリストから選択されるタンパク質からの標準的なＥＦハンドモチーフに由来する。有利には、カルシウム結合部位は、パルブアルブミン及びカルモジュリンからなるリストから選択されるタンパク質からの標準的なＥＦハンドモチーフに由来する。

標準的なＥＦハンドモチーフのカルシウム結合機能は、主に１２アミノ酸のカルシウム結合ループに依存していることが当分野で文書化されている。好ましくは、本発明によるカルシウム結合部位のそれぞれは、標準的なＥＦハンドモチーフのカルシウム結合ループを含むか、又はそれからなる。

特に明記しない限り、「標準的なＥＦハンドモチーフのカルシウム結合ループ」又は「カルシウム結合ループ」という用語は、標準的なＥＦハンドのカルシウム結合ループに対応する１２アミノ酸残基の配列を指す。標準的なＥＦハンド、それらの配列、及び特にそれぞれの「カルシウム結合ループ」に対応する１２アミノ酸配列は、十分に文書化されている。好ましくは、「標準的なＥＦハンドモチーフのカルシウム結合ループ」という用語は、共通配列である配列番号１：
Ｄ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１、式中、
−Ｘ_１はＷを除く任意のアミノ酸残基であり、
−Ｘ_２はＤ、Ｎ、又はＳであり、
−Ｘ_３は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、及びＷを除く、任意のアミノ酸残基であり、
−Ｘ_４はＤ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、又はＧであり、
−Ｘ_５はＤ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、又はＫであり、
−Ｘ_６はＧ及びＰを除く任意のアミノ酸残基であり、
−Ｘ_７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、又はＣであり、
−Ｘ_８はＤ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｇ、又はＣであり、
−Ｘ_９は任意のアミノ酸残基であり、
−Ｘ_１０は任意のアミノ酸残基であり、
−Ｘ_１１はＥ又はＤである、
又はその機能的変異体に対応するペプチド配列を指す。

パルブアルブミンは、２つの異なるＥＦハンドモチーフ、ＰａｒｖＥＦハンド１及び２を含むことが当分野で説明されており、したがって２つの対応するカルシウム結合ループを含み、
−ラットＰａｒｖＥＦハンド１のカルシウム結合ループの配列は、ＤＫＤＫＳＧＦＩＥＥＤＥ（配列番号２）であり、
−ヒトＰａｒｖＥＦハンド２のカルシウム結合ループの配列は、ＤＫＤＧＤＧＫＩＧＶＤＥ（配列番号３）である一方、ラットＰａｒｖＥＦハンド２のカルシウム結合ループの配列は、ＤＫＤＧＤＧＫＩＧＶＥＥ（配列番号４）である。

注目すべきことに、配列がＤＫＤＫＤＧＦＩＤＥＤＥ（配列番号５）であるラットＰａｒｖＥＦハンド１のカルシウム結合ループの高親和性変異体も開示されている。

カルモジュリンは、４つの異なるＥＦハンドモチーフ、ＣａＭＥＦハンド１、２、３、及び４を含むことが当分野で説明されており、したがって４つの対応するカルシウム結合ループを含み、
−ＣａＭＥＦハンド１のカルシウム結合ループの配列は、ヒトとマウスの両方で、ＤＫＤＧＤＧＴＩＴＴＫＥ（配列番号６）であり、
−ＣａＭＥＦハンド２のカルシウム結合ループの配列は、ヒトとマウスの両方で、ＤＡＤＧＮＧＴＩＤＦＰＥ（配列番号７）であり、
−ＣａＭＥＦハンド３のカルシウム結合ループの配列は、ヒトとマウスの両方で、ＤＫＤＧＮＧＹＩＳＡＡＥ（配列番号８）であり、
−ＣａＭＥＦハンド４のカルシウム結合ループの配列は、ヒトとマウスの両方で、ＤＩＤＧＤＧＱＶＮＹＥＥ（配列番号９）である。

さらに好ましくは、本発明のポリペプチドにおいて、カルシウム結合部位のそれぞれは、配列番号２〜９及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるカルシウム結合ループを含むか又はそれからなる。

本発明のポリペプチドがカルシウムイオンを結合する能力を増大させるために、当業者は、標準的なＥＦハンドモチーフ全体に由来する、すなわち、２つのαヘリックス、及び標準的なＥＦハンドモチーフに典型的なカルシウム結合ループを含むカルシウム結合部位の使用を検討してもよい。

有利には、本発明のポリペプチドにおいて、カルシウム結合部位のそれぞれは、標準的なＥＦハンドモチーフを含むか、又はそれからなる。

パルブアルブミンは、２つの異なるＥＦハンドモチーフ、ＰａｒｖＥＦハンド１及び２を含むことが当分野で説明されており、
−ＰａｒｖＥＦハンド１の配列は、ＫＳＡＤＤＶＫＫＶＦＨＩＬＤＫＤＫＤＧＦＩＤＥＤＥＬＧＳＩＬＫＧＦＳＳＤ（配列番号１０）であり、
−ＰａｒｖＥＦハンド２の配列は、ＬＳＡＫＥＴＫＴＬＭＡＡＧＤＫＤＧＤＧＫＩＧＶＥＥＦＳＴＬＶＡＥＳ（配列番号１１）である。

カルモジュリンは、４つの異なるＥＦハンドモチーフ、ＣａＭＥＦハンド１、２、３、及び４を含むことが当分野で説明されており、
−ＣａＭＥＦハンド１の配列は、ＥＱＩＡＥＦＫＥＡＦＳＬＦＤＫＤＧＤＧＴＩＴＴＫＥＬＧＴＶＭＲＳＬＧＱＮ（配列番号１２）であり、
−ＣａＭＥＦハンド２の配列は、ＰＴＥＡＥＬＱＤＭＩＮＥＶＤＡＤＧＮＧＴＩＤＦＰＥＦＬＴＭＭＡＲＫＭＫＤ（配列番号１３）であり、
−ＣａＭＥＦハンド３の配列は、ＤＳＥＥＥＩＲＥＡＦＲＶＦＤＫＤＧＮＧＹＩＳＡＡＥＬＲＨＶＭＴＮＬＧＥＫ（配列番号１４）であり、
−ＣａＭＥＦハンド４の配列は、ＬＴＤＥＥＶＤＥＭＩＲＥＡＤＩＤＧＤＧＱＶＮＹＥＥＦＶＱＭＭＴＡＫ（配列番号１５）である。

さらに好ましくは、本発明のポリペプチドにおいて、カルシウム結合部位のそれぞれは、配列番号１０〜１５及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択される標準的なＥＦハンドモチーフを含むか又はそれからなる。

有利には、第１のカルシウム結合ドメイン及び第２のカルシウム結合ドメインはそれぞれ、ＥＦハンドモチーフに由来する少なくとも２つのカルシウム結合部位を含む。好ましくは、カルシウム結合ドメイン内のカルシウム結合部位は、好ましくは上記に開示されたリストから選択される同じタンパク質からのＥＦハンドモチーフに由来する。

好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドにおいて、第１のカルシウム結合ドメインは、パルブアルブミンからのＥＦハンドモチーフに由来するカルシウム結合部位を含み、第２のカルシウム結合ドメインは、カルモジュリンからのＥＦハンドモチーフに由来するカルシウム結合部位を含む。

好ましくは、上記実施形態では、第１のカルシウム結合ドメインは、パルブアルブミンからのＥＦハンドモチーフに由来する２つのカルシウム結合部位を含み、第２のカルシウム結合ドメインは、カルモジュリンからのＥＦハンドモチーフに由来する２つのカルシウム結合部位を含む。

より好ましくは、上記実施形態では、第１のカルシウム結合ドメインは、配列番号２〜５及びそれらの機能的変異体からなるリスト、さらに好ましくは配列番号４、配列番号５及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるパルブアルブミンからのカルシウム結合ループを含むか又はそれからなる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのカルシウム結合部位を含み、第２のカルシウム結合ドメインは、配列番号６〜９及びそれらの機能的変異体、さらに好ましくは配列番号６又は７及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるカルモジュリンからのカルシウム結合ループを含むか又はそれからなる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのカルシウム結合部位を含む。

さらに好ましくは、上記実施形態では、第１のカルシウム結合ドメインは、配列番号１０及び１１からなるリストから選択されるパルブアルブミンからのＥＦハンドモチーフを含むか又はそれらからなる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのカルシウム結合部位を含むか又はそれらからなり、第２のカルシウム結合ドメインは、配列番号１２〜１５及びそれらの機能的変異体からなるリスト、好ましくは配列番号１２又は１３及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるカルモジュリンからのＥＦハンドモチーフを含むか又はそれらからなる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのカルシウム結合部位を含むか又はそれらからなる。

さらに好ましい実施形態では、第１のカルシウム結合ドメインの配列は、配列番号１６の配列又はその機能的変異体を含むか又はそれからなり、第２のカルシウム結合ドメインの配列は、配列番号１７又はその機能的変異体を含むか又はそれからなる。

本発明の文脈において、配列番号１〜配列番号１７から選択される参照配列の機能的変異体は、その配列が参照配列の１つ又は複数の位置にあるアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって上記参照配列に由来し、それに結合したか又はそれを含むペプチドを脂質ラフトに局在化させる能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、その配列が保存的置換を含む機能的変異体であり、すなわち、その場合、参照配列のアミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の機能的性質を変化させない）。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えることができる。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号１〜配列番号１７から選択される参照配列の機能的変異体は、その配列が１つ又は複数の保存的置換によって参照配列に由来するペプチドである。さらに好ましくは、配列番号１〜配列番号１７から選択される参照配列の機能的変異体の配列は、参照配列と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する。好ましい実施形態において、配列番号１〜配列番号１７から選択される参照配列の機能的変異体は、参照配列と少なくとも８０、８５、９０又は９５％同一の配列を有し、その配列が保存的置換によって参照配列に由来するペプチドである。

本発明の意味において、核酸又はアミノ酸の２つの配列間の「パーセント同一性」又は「％同一性」は、最適に整列させた後に得られる、比較する２つの配列間の同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセントを意味し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、２つの配列間の差異はその長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸又はアミノ酸配列の比較は、従来、それらを最適に整列させた後に配列を比較することによって行われ、上記比較は、セグメントごとに、又は「整列ウィンドウ」を使用して行うことができる。比較のための配列の最適整列は、手動による比較に加えて、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似検索法（１９８８）、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，ＭａｄｉｓｏｎにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、又は比較ソフトウェアＢＬＡＳＴＮＲ又はＢＬＡＳＴＰ）によって行うことができる。２つの核酸又はアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、この最適配列では、比較する核酸又はアミノ酸配列が２つの配列間の最適整列の参照配列と比較して追加又は欠失を有し得る。パーセント同一性は、アミノ酸、ヌクレオチド、又は残基が２つの配列間、好ましくは２つの完全な配列間で同一である位置の数を決定し、同一の位置の数を整列ウィンドウ内の位置の総数で除算して、結果に１００を掛けて計算し、２つの配列間のパーセント同一性を得る。

本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーをさらに含む。

好ましくは、本発明によるペプチドリンカーの長さは、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、及び最大４０、好ましくは最大３０、さらにより好ましくは最大２０アミノ酸である。好ましくは、ペプチドリンカーは、配列番号１８の配列を有する。

好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１９の配列を有する。

本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特定の細胞内区画に標的化することを可能にする局在化配列である、ペプチド信号などの興味深い特性を有するペプチド配列、又はポリペプチドのインビトロ検出に役立つ蛍光ペプチドを用いてさらに機能化することができる。

ポリペプチドを特定の細胞内区画に標的化できるペプチド信号は、当技術分野で周知である。特に興味深いのは、ペプチドを原形質膜、より具体的には脂質ラフトに標的化できる配列である。脂質ラフトは、スフィンゴ脂質及びコレステロールに富む原形質膜マイクロドメインであり、信号伝達分子が受容体と相互作用するプラットフォームとして機能することが確認及び提案されている。ペプチドを原形質膜に標的化できるペプチド信号は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｒｃファミリーのタンパク質のＮ末端ドメイン、及び特にＬｙｎキナーゼのＮ末端部分のパルミトイル化及びミリストイル化モチーフに対応する配列番号２０の配列のペプチドは、上記タンパク質の脂質ラフトへの局在化を可能にすることが示されている。対照的に、タンパク質Ｋ−Ｒａｓに由来するＣａａＸ−ポリリジンモチーフに対応する配列番号２１の配列のペプチドは、脂質ラフトへの局在化を排除しながら、タンパク質を原形質膜に標的化することが知られている。有利には、本発明のポリペプチドは、ペプチド信号、好ましくは本発明のポリペプチドを原形質膜、さらに好ましくは原形質膜の脂質ラフトに標的化できるペプチド信号をさらに含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２０又は２１の配列、又はその機能的変異体のペプチド信号をさらに含む。

本発明の文脈において、配列番号２０の機能的変異体は、その配列が配列番号２０の配列の１つ又は複数の位置にあるアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって配列番号２０の配列に由来し、それに結合したか又はそれを含むペプチドを脂質ラフトに局在化させる能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、その配列が保存的置換を含む機能的変異体であり、すなわち、その場合、配列番号２０の配列のアミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の機能的性質を変化させない）。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えることができる。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号２０の機能的変異体は、その配列が１つ又は複数の保存的置換によって配列番号２０の配列に由来するペプチドである。さらに好ましくは、配列番号２０の機能的変異体の配列は、配列番号２０の配列と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する。好ましい実施形態では、配列番号２０の機能的変異体は、配列番号２０の配列と少なくとも８０、８５、９０又は９５％同一の配列を有し、その配列が保存的置換によって配列番号２０の配列に由来するペプチドである。

本発明の文脈において、配列番号２１の機能的変異体は、その配列が参照配列の１つ又は複数の位置にあるアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって配列番号２１の配列に由来し、それに結合したか又はそれを含むペプチドを、脂質ラフトを除外して、細胞膜に局在化させる能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、その配列が保存的置換を含む機能的変異体であり、すなわち、その場合、配列番号２１の配列のアミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の機能的性質を変化させない）。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置き換えることができる。互いに置換できる中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンが挙げられる。好ましくは、配列番号２１の機能的変異体は、その配列が１つ又は複数の保存的置換によって配列番号２１の配列に由来するペプチドである。さらに好ましくは、配列番号２１の機能的変異体の配列は、配列番号２１の配列と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する。好ましい実施形態では、配列番号２１の機能的変異体は、配列番号２１の配列と少なくとも８０、８５、９０又は９５％同一の配列を有し、その配列が保存的置換によって配列番号２１の配列に由来するペプチドである。

それに結合したか又はそれを含むペプチドの細胞膜への、特に脂質ラフトへの、又は脂質ラフトを除外して、局在化を可能にするペプチド信号の能力は、特に蛍光顕微鏡及び／又は本出願の実験部分に詳述されているような密度勾配に基づく標準的な方法を使用して容易に決定され得る。

ペプチド信号は、ポリペプチドのＣ末端又はＮ末端部分にあってもよい。

蛍光ペプチドは、当技術分野で周知である。蛍光ペプチドの例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などのＧＦＰ変異体、並びに最適化されたＣＦＰＴｕｒｑｕｏｉｓｅ又はＹＦＰ変異体Ｖｅｎｕｓなどのそれらの変異体である。有利には、本発明のポリペプチドは、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）並びに最適化されたＣＦＰＴｕｒｑｕｏｉｓｅ又はＹＦＰ変異体Ｖｅｎｕｓなどのそれらの変異体からなるリストから選択される蛍光ペプチドをさらに含む。蛍光タンパク質は、ポリペプチドのＣ末端又はＮ末端部分にあってもよい。

好ましくは、本発明はまた、１つ又は複数のアミノ酸残基、ペプチド結合、タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に化学修飾を導入することによって、本発明のポリペプチド又はその機能的変異体に由来する修飾ポリペプチドに関し、この化学修飾は、修飾されたポリペプチドが機能し続ける限り、タンパク質の安定性、生物学的利用能、又は生物活性を高めることを目的とする。

本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び上記ポリヌクレオチドをコードする組換えベクターに関する。

本発明の文脈において、用語「ポリヌクレオチド」という用語は、別個の断片又はより大きな構築体の形態のポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドを指し、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。本明細書で使用される「単離された」という用語には、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、又は天然に関連付けられる他の物質を実質的に含まないポリヌクレオチドが含まれる。

好ましくは、上記組換えベクターは、哺乳動物、細菌又は真菌細胞のような真核細胞又は原核細胞などの宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換されたときに上記ポリヌクレオチドを発現できる発現ベクターである。「発現ベクター」は、クローン化されたＤＮＡの転写と適切な宿主でのｍＲＮＡの翻訳とに必要なＤＮＡ配列である。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択可能なマーカ、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、及びアクティブなプロモータを含み得る。例えば、適切な選択可能なマーカは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンテターゼ、及び真核細胞培養のためのヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；出芽酵母のためのＴＲＰ１をコードする遺伝子の中から選択され得る。一部の発現ベクターには、宿主細胞における自律複製のための複製起点が含まれていないが、統合／維持を選択するためのマーカを使用して（ランダムに又は相同的統合事象ごとに）安定して統合するベクターの能力に依存している。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように指示するＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモータは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモータである。ポリヌクレオチドは、発現のために適切な方向及び正しいリーディングフレームで発現ベクターに挿入される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写調節配列に、場合によって少なくとも１つの翻訳調節配列に制御可能に連結される。そのようなベクターには、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成又は合成ＤＮＡからなり得る直鎖又は環状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。本発明による適切なベクターには、これらに限定されないが、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成又は合成ＤＮＡからなり得る直鎖又は環状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子が含まれる。哺乳動物発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、これらに限定されないが、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、及び≡ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられる。細菌発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、これらに限定されないが、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及びｐＱＥ７Ｏ、ｐＱＥ６Ｏ、ｐＱＥ−９を含むｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。真菌細胞において発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、これらに限定されないが、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。昆虫細胞において発現ベクターとして使用される適切なプラスミドとしては、これらに限定されないが、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＦａｓｔＢａｃｌ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルスなど）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）、ラブドウイルス（狂犬病及び水疱性口内炎ウイルスなど）、パラミクソウイルス（麻疹及びセンダイなど）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びに二本鎖ＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルスなど）、及びポックスウイルス（ワクシニア、鶏痘、及びカナリア痘など）が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。

本発明の別の態様は、上記ポリヌクレオチド又は組換えベクターで形質転換された宿主細胞又は非ヒト生物を提供する。非ヒトトランスジェニック生物は、単細胞又は多細胞微生物又は高等真核生物から得られる。発現ベクターは、感染、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない多数の技術のいずれか１つを介して宿主細胞に導入できる。発現ベクターを含む修飾された宿主細胞は、クローン的に増殖でき、本発明のポリペプチドを産生するかどうかを判定するために個別に分析され得る。

好ましい実施形態では、上記修飾宿主細胞は、ヒト細胞などの真核細胞である。別の実施形態では、上記非ヒトトランスジェニック生物は、トランスジェニック植物、線虫、ゼブラフィッシュ又は藻類である。

本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び非ヒトトランスジェニック生物は、周知の組換えＤＮＡ技術を使用する本発明のポリペプチド／キメラタンパク質の産生に有用である。本発明の別の態様は、インビトロ又はインビボでの、カルシウムキレート剤としての、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はそれらを含むベクターの非治療的使用に関する。好ましくは、本発明は、カルシウム濃度を安定化及び／又は低下させるための、及び／又はインビボ及び／又はインビトロでカルシウム信号伝達を阻害するための、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はそれらを含むベクターの非治療的使用に関する。さらに好ましくは、非治療的使用は、インビボで行う場合、健康な対象者で行う。

「カルシウム濃度の安定化」という用語は、当技術分野で一般に理解されているように、すなわち、カルシウムを添加したときの組成物中のカルシウム濃度の変動、又は上記組成物中のカルシウム濃度変動の誘発を最小限に抑える作用として解釈されるべきである。カルシウム濃度の変動、特に増加は、実験部分で開示されているように、ＦＲＥＴ／ＣＦＰ比を監視することによって、例えばバイオセンサーであるＴｗｉｔｃｈ２Ｂを使用して簡単に測定できる。本発明の文脈において、バイオセンサーＴｗｉｔｃｈ２ＢのＦＲＥＴ／ＣＦＰ比が、カルシウムの添加又は上記組成物中のカルシウム濃度変動の誘発の際に本発明のポリペプチドなしで検出される変動の１０％未満、好ましくは５％未満で変動、好ましくは増加するとき、カルシウム濃度は組成物中で安定していると見なすことができる。

「カルシウム信号を阻害する」、「カルシウム信号阻害」という用語は、当技術分野で一般に理解されているように、すなわち、カルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーとしてのカルシウムによって活性化されることが知られている下流エフェクターを阻害する作用として解釈されるべきである。カルシニューリン細胞活性を評価するための方法及びキットは、当技術分野で既知であり、例えば、Ｅｎｚｏ社によって製品化されているカルシニューリン細胞活性測定キット（参照名ＢＭＬ−ＡＫ８１６−０００１）が知られている。

多くの病理がカルシウム信号伝達機能不全に関連していることは十分に文書化されている。したがって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞は、そのような病理の予防又は治療に特に有用であり得る。この文脈において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞は、医薬用途に適した組成物に配合され得る。

本発明の別の局面は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は宿主細胞、並びに好ましくは、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本発明の文脈において、「薬学的に許容される」という用語は、一般的に安全で非毒性であり、生物学的にもその他の点でも有害ではない医薬組成物の調製に使用でき、獣医用途及び人間の医薬品用途に許容される担体を指す。適切なビヒクル又は担体としては、緩衝剤、安定化剤、希釈剤、塩、防腐剤、及び乳化剤などの任意の薬学的に許容されるビヒクルが挙げられる。適切な緩衝剤の例としては、リン酸緩衝溶液、塩化物溶液又はリンガー溶液などの緩衝溶質が挙げられる。適切な安定化剤の例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリビニルピロリドン又はヒアルロン酸が挙げられる。

本発明の組成物は、意図された投与経路に従って処方され得る。例えば、経口投与に適した製剤としては、錠剤、丸剤、粉末（硬質又は軟質ゼラチンカプセル）又は顆粒などの液体又は固体製剤が挙げられる。典型的には、そのような製剤において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は宿主細胞は、アルゴン流中で、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース又はシリカなどの１つ以上の不活性希釈剤と混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルクなどの潤滑剤、着色剤、コーティング（コーティング錠）又はワニスを含んでもよい。非経口投与で使用されるような注射に適した製剤は、好ましくは無菌かつ流動性であり、好ましくは水溶液、非水溶液、懸濁液又は乳濁液であってよい。

本発明の別の態様は、好ましくは細胞内カルシウム信号機能不全に関連する病理の予防及び／又は治療に使用する、医薬として使用するための、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物に関する。

本発明の文脈において、「細胞内カルシウム信号伝達機能不全に関連する病理」という用語は、当技術分野におけるそれらの一般的な意味に従って解釈されるべきである。好ましくは、上記病理は、異常に高い細胞内カルシウム濃度に起因する細胞内カルシウム信号伝達機能不全に関連する。本発明の文脈において、「異常に高い細胞内カルシウム濃度」とは、健康なドナーからの細胞よりも著しく高い細胞内カルシウム濃度を指す。さらに好ましくは、上記病理は、網膜色素変性症、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病、てんかん、脳卒中、心不整脈、心不全、高血圧、糖尿病、及び癌からなるリストから選択される。

言い換えれば、本発明は、細胞内カルシウム信号伝達機能不全に関連する病理の予防及び／又は治療方法であって、上記病状は、網膜色素変性症、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病、てんかん、脳卒中、心不整脈、心不全、高血圧、糖尿病、及び癌からなるリストから選択され、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物を、それを必要とする対象者に、好ましくは有効量で投与するステップを含む、方法に関する。

本発明の文脈において、「有効量」という用語は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物の量が、上記の病理の適切な予防及び／又は症状の退行を得るのに十分な量であることを意味する。有効量及び投与計画は、通常の臨床的要因に基づいて主治医によって決定され得る。医学分野で周知のように、患者一人に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、並びに同時に投与されている薬物など、多くの要因に依存する。

本明細書で言及される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物は、本明細書で述べる病理を予防又は治療するために、１回、又は２回以上投与できる。予防及び／又は治療の有効性は、定期的な評価によって監視できる。

本明細書で言及される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物は、既知の投与経路を介して局所的又は全身的に投与できる。好ましくは、本明細書で言及される本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又はそれらを含む組成物は、腸内経路を通じて、特に経口、舌下、又は直腸投与によって、又は非経口経路を通じて、特に脳内、筋肉内、皮内、経皮、腹腔内又は経鼻投与によって投与される。

前述の特徴に加えて、本発明は、本発明を例示する実施例及び添付の図面を参照する以下の説明から明らかになる他の特徴をさらに含む。

本発明のポリペプチドはＣａ^２＋捕捉剤であり、インビボで皮質神経細胞の遊走を変化させる。（Ａ、Ｂ）２０秒間のタプシガルギン（Ｔｈａｐｓ．）曝露によって、ＦＲＥＴバイオセンサーＴｗｉｔｃｈ２ＢからのＦＲＥＴ／ＣＦＰ比によって監視される、対照Ｈ２９３細胞のカルシウム濃度の増加が誘発される。対照的に、細胞が^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅを発現すると、この上昇は劇的に減少する。ＦＲＥＴ比は、青（低Ｃａ^２＋）から赤（高Ｃａ^２＋）にコードされる。（Ｃ）Ｅ１４．５のｅＧＦＰ及びｍＲＦＰ共エレクトロポレーション皮質神経細胞は、Ｅ１８．５で辺縁帯に近い緻密層に詰め込まれる（上列）。対照的に、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの発現は、この層の発達を妨げ、発達中の皮質の深さ全体に神経細胞が散在し、皮質の表面にヘテロトピアが形成される（下列）。本発明のポリペプチドを使用したＣａ^２＋操作の細胞内制限。Ａ：^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、Ｂ：Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、Ｃ：^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓ。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、いずれの細胞区画も標的としない場合にＣａ^２＋信号伝達を全体的に変更するために、又は特定の区画を標的とするために使用した。Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓが原形質膜の非ラフト画分に制限されることを意図しているかどうかにかかわらず、脂質ラフトを標的にすることを目的としている。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓの両方が原形質膜で見つかったかどうかにかかわらず、細胞質で検出された。原形質膜分画は、Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓの明らかな細胞内局在を強調した。異なる密度勾配画分における目的タンパク質の存在。Ａ：カベオリン、Ｂ：Ｌｙｎ−Ｔｗｉｃｈ２Ｂ、Ｃ：Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、Ｄ：アダプチン、Ｅ：Ｔｗｉｃｈ２Ｂ−Ｋｒａｓ、Ｆ：^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓ。Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、より高密度の画分（４〜９）に^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓの局在が移動したかどうかにかかわらず、画分３で非常に濃縮された。（Ａ、Ｂ）Ｅ１４．５でエレクトロポレーションされた対照皮質神経細胞は、Ｅ１８．５で辺縁帯の近くに緻密層を形成する。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの発現は、この層の発達を妨げ、（Ａ）発達中の皮質の深さ全体に神経細胞が散在し（矢じり）、（Ｂ）皮質の表面にヘテロトピアが形成される（矢じり）。（Ｃ）Ｐ１０の仔では、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅエレクトロポレーション神経細胞は、対照よりも皮質に広い広がりを持ち、（Ｄ）^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅによって誘発されたヘテロトピアは維持され（矢じり）、Ｃａ^２＋信号伝達の変更が皮質神経細胞の遊走に干渉することを示す。箱ひげ図の要素：中央線、平均；箱の境界、四分位数の上限と下限；ひげ、ｓ．ｄ．。スケールバー、（Ａ）２５０μｍ、（Ｂ）１００μｍ、（Ｃ）２００μｍ、（Ｄ）５００μｍ。＊ＰΠ０．０５；＊＊＊ＰΠ０．００１；（Ａ、Ｃ）二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定。 ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの生化学的特性評価。（ａ）^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}は、ＥＧＴＡ（Ｋｄ＝０．３±０．１ｎＭ）との競合により、挿入されたトリプトファン（残基１０３）に隣接するＥＦハンドからのＣａ^２＋の解離定数の決定を可能にしたが、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}を用いた直接Ｃａ^２＋滴定を使用し、変異の近くにあるカルモジュリン由来のＣａ^２＋結合部位のＫｄを測定した（Ｋｄ＝２．８±０．９μΜ）。代表的な滴定フィットを示す。（ｂ）^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}（それぞれ、ｋ_ｏｆｆ＝５２９±２８ｓ^−１及びｋ_ｏｆｆ＝０，２４±０．０１ｓ^−１）の速度論的解離定数を決定するためにストップトフロー実験を行った。 ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、細胞生存に影響を及ぼさない。ＨＥＫ２９３細胞に^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ又はＲＦＰのいずれかをトランスフェクトした。活性化Ｃａｓｐａｓｅ３陽性細胞を免疫標識して、アポトーシスを起こした細胞の数を評価した。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ発現細胞は、ＲＦＰ発現対照よりもアポトーシスプログラムに入りにくい。（ａ）スケールバー、５０μｍ（ｂ）データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．、マンホイットニー検定である。 ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅトランスフェクト細胞は、対照と同様にＣａ^２＋の静止濃度を維持するように適応する。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ又ＲＦＰトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞にレシオメトリックカルシウムセンサーＦｕｒａ−２をロードし、細胞内カルシウム濃度を評価できるようにした。（ａ）Ｆｕｒａ−２は３４０ｎｍ（Ｃａ^２＋結合）及び３８０ｎｍ（Ｃａ^２＋なし）で順次励起し、細胞内Ｃａ^２＋濃度は、較正したＣａ^２＋溶液の蛍光に基づいて計算した。（ａ）０．２ｍＭ又は（ｂ）２ｍＭのいずれかのＣａ^２＋を含む培養液中の^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及びＲＦＰトランスフェクト細胞間で、静止Ｃａ^２＋濃度に違いは検出されなかった。（ｃ）静止Ｃａ^２＋濃度は、２ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋で成長した^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及びＲＦＰトランスフェクト細胞の両方で、０．２ｍＭのＣａ^２＋で維持された細胞と比較して高く、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅはこのイオンの細胞内静止濃度の調節を妨げないことを示唆している。（ａ、ｂ）スケールバー、２０μｍ。（ｂ）のスケールバーは（ａ）に適用される。（ｃ）箱ひげ図の要素：中央線、平均；箱の境界、四分位数の上限と下限；ひげ、ｓ．ｄ．；＊＊＊ＰΠ０．００１、クラスカルウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定。 ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、タプシガルギンの短い又はより長いパルスによって誘発されるＣａ^２＋濃度の上昇を低減する。ＨＥＫ２９３細胞を低Ｃａ^２＋培地に浸し、タプシガルギンの１分間（ａ−ｃ）、２分間（ｄ−ｆ）及び５分間（ｇ−ｉ）のパルスに曝露した。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ発現細胞は、対照と比較してＦＲＥＴ／ＣＦＰ比の上昇が減少し、最大応答が遅延する。ＳｐｉＣｅｅ発現細胞では、応答の減衰も遅延し、応答の鋭さが低下する。スケールバー、２０μｍ。（ｂ、ｅ、ｈ）データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。（ｃ、ｆ、ｉ）箱ひげ図の要素：中央線、平均、箱の境界、四分位数の上限と下限；ひげ、ｓ．ｄ．；＊＊＊ＰΠ０．００１、マンホイットニー検定。細胞内Ｃａ^２＋濃度の強力で持続的な上昇は、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅによって遅延する。細胞外Ｃａ^２＋濃度の変化（０．２ｍＭから２ｍＭ）は、ＨＥＫ２９３細胞内のＴｗｉｔｃｈ２ＢのＦＲＥＴ／ＣＦＰ比に大きな変化をもたらす。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ発現細胞は、同様の大きさのＦＲＥＴ／ＣＦＰ比の変化を示すが、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅのない細胞と比較して遅延する。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。（ｃ）箱ひげ図の要素：中央線、平均；箱の境界、四分位数の上限と下限；ひげ、ｓ．ｄ．；＊＊＊ＰΠ０．００１、マンホイットニー検定。 ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ標的化の生化学的特性評価、（ａ、ｂ）膜分画アッセイの画分３のＬｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅピーク。（ａ）コレラ毒素のφサブユニット（ＣｔＢ、画分３及び４に濃縮、画分３にピーク）の発現プロファイルと一致し、（ｂ）カベオリン（画分４に濃縮）の発現とは異なる。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓは、主に画分４に濃縮され、（ｄ）カベオリンに似たプロファイルを有し、（ｃ）ＣｔＢとは異なるプロファイルを有する。データは平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である。＊ＰΠ０．０５、＊＊＊ＰΠ０．０１、＊＊＊ＰΠ０．００１、二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定。 ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓは、成長する軸索の形態に影響を及ぼさない。非エレクトロポレーションＲＧＣ軸索は、ｍＲＦＰ、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、又は^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓの発現に影響されない先端に扇形の成長円錐を示す。箱ひげ図の要素：中央線、平均；箱の境界、四分位数の上限と下限；ひげ、ｓ．ｄ．。スケールバー、１０μｍ。有意差は検出されない；クラスカルウォリス検定。サイトゾル^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及びＬｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、ｅｐｈｒｉｎＡ５及びＳｌｉｔ１誘発成長円錐の崩壊を妨げるが、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓは妨げない。（ａ）ｅｐｈｒｉｎＡ５又は（ｅ）ｓｌｉｔ１に曝露されると、ｍＲＦＰ発現成長円錐は、同じカバーガラスの非エレクトロポレーションされた隣接物と同じ崩壊応答を示し、（ｂ、ｆ）^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ、及び（ｃ、ｇ）Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ発現軸索は、ｅｐｈｒｉｎＡ５及びｓｌｉｔ１の忌避活性に耐性があり、これは、同じカバーガラスからの非エレクトロポレーション軸索で観察され、（ｄ、ｈ）対照的に、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓ発現軸索は、それらの対照に類似した成長円錐の再構築を示す。箱ひげ図の要素：中央線、平均；箱の境界、四分位数の上限と下限；ひげ、ｓ．ｄ．。スケールバー、１０μｍ。＊ＰΠ０．０５；＊＊＊ＰΠ０．００１；ウィルコクソン対検定

実施例１：
構築：
本発明によるポリヌクレオチドをコードする配列番号２２の配列
５ＡＴＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＴＧＧＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＡＡＧＣＡＴＣＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＡＴＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＴＧＣＧＧＴＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＣＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＴＴＡＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴ−３のポリヌクレオチドは、配列番号２３の配列：
５ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧ３のＬｙｎキナーゼＮ末端ドメインをコードするヌクレオチド配列の縦列反復を用いてインフレームでインシリコで設計し、
所望の配列はそれぞれ、Ｓｉｇｍａ社及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のオリゴヌクレオチドとして得られる。オリゴをアニーリングし、レポーター配列を用いてインフレームでｐｃＤＮＡ３−ｍＲＦＰにクローニングした。脂質ラフト除外型及びサイトゾル型はそれぞれ、配列番号２４の配列：
５ＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧ３のＫｒａｓのＣａａＸ−ポリリジンモチーフをコードする配列の有無にかかわらず、上記のポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３にサブクローニングすることにより得た。

網膜神経節細胞（ＲＧＣ）での発現のために、構築体をｐｃＸにサブクローニングした。Ｔｗｉｔｃｈ２Ｂは、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して膜マイクロドメインを標的とし、ｐｃＤＮＡ３又はｐｃＸにサブクローニングした。

細胞培養：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに保存し、製造元のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトし、トランスフェクションの翌日にイメージングするか、固定して免疫細胞蛍光処理した。

精製^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}の産生：完全長ＣａＳｐｏｎｇｅｃＤＮＡを、Ｎ末端グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグが付いたフレーム内で、ｐＧＳＴ−Ｐａｒａｌｌｅｌ２ベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ−１；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）にサブクローニングした。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}クローンは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的変異誘発キット（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅから調製した。タンパク質は、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳＥ．ｃｏｌｉ細胞で産生した。ＧＳＴタグ付きタンパク質は、グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムを使用して精製した。ＧＳＴタグは、組換えタバコエッチウイルスＮＩａプロテイナーゼを使用して切断した。組換えタンパク質は、３０ｍＭのＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、ｐＨ７．２及び１００ｍＭのＫＣｌを含むバッファーで溶出した。タンパク質濃度は、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}の両方で５５００Ｍ^−１ｃｍ^−１の計算された吸光係数を使用して、Ａ２８０測定から推定した。

^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}（パルブアルブミン由来）の標識部位のＣａ^２＋親和性の測定：^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}の標識部位へのＣａ^２＋の結合は、４ｍｍｘ１０ｍｍの石英キュベット（ＪａｓｃｏＦＰ−８３００分光蛍光光度計）で２０℃でトリプトファン蛍光（２８５ｎｍ励起、３３０ｎｍ発光、５ｎｍ帯域通過）を測定することによって監視した。タンパク質を標準バッファー（３０ｍＭのＭＯＰＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．２；０．１ＭのＫＣｌ）で２．２５μＭに希釈し、２５４μＬのサンプルをキュベットにロードした。ＣａＣｌ_２の添加は蛍光を増加させなかったが、ミリモル量のＥＧＴＡの添加は大幅な減少（７．５ｍＭの最終ＥＧＴＡ濃度で最大２７％）をもたらすことが最初に観察された。これによって、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}の標識部位がＣａ^２＋で飽和していることが示された。Ｃａ^２＋の解離定数は、タンパク質溶液をＥＧＴＡで滴定した競合実験から推定した。漸増濃度のＥＧＴＡ（１．９５〜５００ｍＭ）を含む溶液のサンプル２μｌをキュベットに添加した。各添加後に蛍光を測定した。蛍光値を希釈について補正し、ＥＧＴＡの濃度の関数としてプロットした。Ｗｅｅｋｓ，Ｋ．Ｍ．＆Ｃｒｏｔｈｅｒｓ（Ｄ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１，１０２８１−１０２８７（１９９２））によって以前に記載されたように、パルブアルブミン由来の２つの部位がＣａ^２＋結合と同等であると仮定して、データを二次方程式１にフィッティングした。

^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}（カルモジュリン由来）の標識部位のＣａ^２＋親和性の測定：^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}の最初のカルモジュリン部位へのＣａ^２＋の結合は、２０℃でトリプトファン蛍光（２８５ｎｍ励起、３４０ｎｍ発光、５ｎｍ帯域通過）を測定することによって監視した。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}を標準バッファーで１．６μＭに希釈し、２５８μＬのサンプルをキュベットにロードした。ＣａＣｌ_２の添加は蛍光を増加させたが、ミリモル量のＥＧＴＡの添加は蛍光の減少をもたらし、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅのカルモジュリン由来の部位はサンプル中のＣａ^２＋で部分的に満たされていることが示された。Ｃａ^２＋がないカルモジュリン部位を有するタンパク質の蛍光値は、飽和していることが判明した濃度である２ｍＭのＥＧＴＡの存在下で測定した。サンプル中のＣａ^２＋の合計濃度（^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅのパルブアルブミン由来部位に結合したＣａ^２＋を除く）は、Ｑｕｉｎ−２を使用して上記のように測定し、２．５μＭであることがわかった。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}の標識部位からのＣａ^２＋の解離定数は、タンパク質溶液を漸増量のＣａＣｌ_２（０．０５〜６．２５ｍＭの溶液２μＬを添加）で滴定した実験から推定した。蛍光値を希釈について補正し、全Ｃａ^２＋濃度（追加したＣａ^２＋プラス２．５μΜ）の関数としてプロットした。２つのカルモジュリン部位がＣａ^２＋結合と同等であると仮定して、データを結合曲線にフィッティングした。

速度論的解離定数の測定：^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ（^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}）のトリプトファン標識Ｃａ結合部位の速度論的解離定数（ｋ_ｏｆｆ）の値は、タンパク質を２０℃で、ＡｐｐｌｉｅｄＰｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ社製ストップトフロー装置で適切な量のＥＧＴＡと混合して測定した。反応溶液を２８５ｎｍで励起し、３２０ｎｍカットオフフィルターを備えた光電子増倍管を使用して蛍光を測定した。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}の場合、タンパク質（標準バッファーで２．３μＭ）を同じバッファーで１５ｍＭのＥＧＴＡと１：１で混合した。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}の場合、タンパク質（標準バッファーで１．７μＬプラス５０μＭのＣａＣｌ_２）を、標準バッファープラス５０μＭのＣａＣｌ_２を含む４ｍＭのＥＤＴＡと１：１で混合した。蛍光は時間の関数として記録し、データは、そこから速度定数を導き出した単一の指数曲線でフィッティングした。報告された値は、３つの測定の平均±標準偏差である。

細胞死アッセイ：ＨＥＫ２９３細胞を、ポリリジンでコーティングされたカバーガラスにプレーティングし、翌日、製造元の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｐＣＸ−ｍＲＦＰ又はｐＣＸ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅベクターでトランスフェクトした。プレーティングの３日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ３（Ａｓｐｌ７５、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、＃００４３）抗体及び抗−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）抗体で免疫細胞化学のために処理するか、又はＣｅｌｌＥｖｅｎｔＣａｓｐａｓｅ３／７ＧｒｅｅｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で３０分間処理し、固定して、−チューブリン抗体で標識した。

界面活性剤を使用しない方法による膜分画：エレクトロポレーションされた網膜をペレット状にし（１９５ｇで４℃で５分間）、プロテアーゼ阻害剤カクテルとホスファターゼ阻害剤カクテル１、２、３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１．３４ｍＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．５に再懸濁した。ホモジネートを２６ゲージの針でせん断し、２０秒間のバーストで３回超音波処理した。ホモジネートは、ＭＢＳ（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２５０ｍＭの炭酸ナトリウム）中に２．０６ｍＬの６０％スクロースを添加して４０％スクロースに調整し、５〜３０％不連続スクロースグラジエント下に置き、３４，０００ｒｐｍ、４℃で１５〜１８時間、Ｂｅｃｋｍａｎ社製ＳＷ４１Ｔｉロータで遠心分離した。９つの画分（各１．２４ｍＬ）を９容量のＭＢＳと混合したチューブの上部から採取し、４０，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ社製ＳＷ−４１Ｔｉロータ）。上清を捨て、膜ペレットを１００μｌの１％ＳＤＳに再懸濁した。

イムノブロッティングでは、サンプルを４〜１５％のＭｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＴＧＸＴｒｉｓ−ＧｌｙｃｉｎｅバッファーＳＤＳＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ）で分離し、０．２μｍのＴｒａｎｓ−ＢｌｏｔＴｕｒｂｏニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。５％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂粉乳を補充した１ｘＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で、膜を室温で１時間ブロックした。一次抗体のインキュベーションを４℃で一晩実施し、それには、以下の抗体：ウサギ抗ＧＦＰ（１／２００、Ａ１１１２２、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウサギ抗ＤｓＲｅｄ（１／２００、６３２４７６、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ウサギ抗φアダプチン（１／２００、ｓｃ−１０７６２、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）及びウサギ抗カベオリン（１／５００、６１００６０、ＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ヤギ抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体を検出に使用した（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルベニア州）。抗体のインキュベーション後、膜をＴＢＳＴ（２．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で徹底的に洗浄した。強化された化学発光法（ＥＣＬプライムウエスタンブロッティング検出試薬、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、ウエスタンブロットを可視化した。

崩壊アッセイ：Ｅ１５マウスの網膜に、ｍＲＦＰ、Ｌｙｎ−ＣａｌｃｉｕｍＳｐｏｎｇｅ、ＣａｌｃｉｕｍＳｐｏｎｇｅ、又はＣａｌｃｉｕｍＳｐｏｎｇｅ−Ｋｒａｓを、２つのポーリングパルス（方形波、１７５Ｖ、持続時間５ｍｓ、５０ｍｓ間隔）に続いて４つの転送パルス（４０Ｖ、５０ｍｓ及び９５０ｍｓ中間パルス）でエレクトロポレーションした。網膜を切開し、培養液（グルタミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、ＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）及びグルコースを補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２）で２４時間、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータで保存した。翌日、それらをＴｉｓｓｕｅ−Ｃｈｏｐｐｅｒ（Ｍｃｌｌｗａｎ）で２００μｍの正方形に切断し、外植片をｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ及びＬａｍｉｎｉｎ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）でコーティングしたカバーガラスにプレーティングした。細胞は、０．４％メチルセルロースを補充した培養液で２４時間培養し、ｒｍＳｌｉｔ−１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で１時間処理した。

免疫検出：網膜外植片、又はＣａｌｃｉｕｍＳｐｏｎｇｅ及びＧＦＰの標的バージョン又はＴｗｉｔｃｈ２Ｂ及びｍＲＦＰの標的バージョンを共発現しているＨｅｋ細胞を、ＰＢ中４％ＰＦＡで３０分間固定し、透過ブロックし、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ及び３％ＢＳＡで固定した。次に、ＤｓＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＧＦＰ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合された二次抗体に対して免疫化するか、又は−Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合された二次抗体に対して免疫化した。
イメージング：画像は、４０倍の油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．３）とソフトウェアＭｅｔａｍｏｒｐｈ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）とを組み合わせた倒立ＤＭＩ６０００Ｂ落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で取得した。ライブイメージング実験では、０．２又は２ｍＭのＣａＣｌを含むＨＢＳバッファーで細胞を灌流した。タプシガルギンは１ｍＭで使用した）。ＣＦＰ（４８３／３２ｎｍ）及びＹＦＰ（５４２／２７）チャネルの画像は、２０秒ごとに同時に取得した。画像はＩｍａｇｅＪで処理し、背景及び裏写りを修正した後、ＣＦＰ／ＹＦＰの比率を計算した。共焦点画像は６３倍の油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４５）で取得し、試験片全体を含むＺスタックをナイキスト周波数でサンプリングした。画像は、ＩｍａｇｅＪ及びＰｈｏｔｏｓｈｏｐでレンダリングした。

統計：
二元配置分散分析及びボンフェローニ事後検定は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．）を用いて計算した。＊＊＝ｐ＜０．００１

結果：
本発明によるポリペプチドの例は、以後^Ｃａ２＋Ｓｐ、ＣａｌｃｉｕｍＳｐｏｎｇｅ、ＳｐｉＣｅｅ、又は^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅと呼ばれ、正確に同じペプチドを指すこれらの３つの用語は、パルブアルブミン及びカルモジュリンの両方のＣａ^２＋結合ドメインを含む融合タンパク質として設計した。

固定又は生細胞実験でスポンジ発現細胞を簡単に特定できるように、蛍光タンパク質ｍＲＦＰをこの構築体に融合した。

^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅのＣａ^２＋結合特性を特性評価するために、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの２つの変異体（^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}）のトリプトファン蛍光を使用した。これらの変異体のそれぞれは、カルモジュリン又はパルブアルブミン部分（それぞれ^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}）のＣａ^２＋結合特性の評価を可能にする。Ｃａ^２＋滴定を使用して、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１３４Ｗ}のＣａ^２＋のＫｄが２．８±０．９μΜであることが確認され、ストップトフロー実験を行って、２０℃での解離速度ｋｏｆｆ＝５２９±２８ｓ^−１を評価した（図５）。標識されたパルブアルブミン部位（^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}）の高い親和性により、Ｃａ^２＋滴定の使用が妨げられ、ＥＧＴＡとの競合によりＫｄを測定した。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ^{Ｆ１０３Ｗ}の解離定数は、Ｋｄ＝０．３±０．１ｎＭ及びｋｏｆｆ＝０．２４±０．０１ｓ^−１である（図５）。これらの特徴は、完全長のパルブアルブミン及びカルモジュリンタンパク質のＣａ^２＋結合特性と一致し、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅがＣａ^２＋に対する低親和性及び高親和性を備えたバイモーダルＣａ^２＋キレート剤結合部位であることが確認され、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、インセルロ（ｉｎｃｅｌｌｕｌｏ）での挙動を評価するためにＨＥＫ２９３細胞で発現させた。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの発現は細胞生存率（図６）にも静止Ｃａ^２＋濃度（図７）にも影響を及ぼさなかったため、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ発現細胞は、以前に報告された範囲内で、その生存率に対応する静止Ｃａ^２＋濃度を維持できることが示唆された。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅトランスフェクト細胞は、静止Ｃａ^２＋濃度を培養液中のＣａ^２＋量に適合させることもできた（図７）。これらの観察は、薬理学的Ｃａ^２＋バッファーの報告された特性に類似している。

^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの緩衝特性は、最適化されたＣａ^２＋ＦＲＥＴセンサーであるＴｗｉｔｃｈ２Ｂを使用して調査した。細胞内Ｃａ^２＋濃度を反映するＣＦＰに対するＦＲＥＴ比は、Ｔｗｉｔｃｈ２Ｂ発現ＨＥＫ２９３細胞で監視した。タプシガルギンの２０秒間のパルスによって誘発された細胞内Ｃａ^２＋貯蔵の放出は、ＦＲＥＴ／ＣＦＰ比の増加を誘発し、これは、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅを共発現する細胞では劇的に減少した（図１）。タプシガルギンの存在下でのＦＲＥＴ／ＣＦＰ比の上昇の欠如は、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅがＴｗｉｔｃｈ２Ｂを含む他のＣａ^２＋結合タンパク質と競合し、それらのＣａ^２＋への効率的な結合を妨げていることを示している。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅによるＣａ^２＋緩衝の限界を調査するために、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及びＴｗｉｔｃｈ２Ｂを共発現する細胞をより長いタプシガルギン刺激（１、２、又は５分）に曝露した。すべての場合において、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、バイオセンサーによって検出されるＣａ^２＋の上昇を低減及び遅延させた（図８）。極端な細胞内Ｃａ^２＋の上昇は、長期のタプシガルギン曝露後に、細胞外Ｃａ^２＋濃度（０．２ｍＭから２ｍＭに）を増加させることによって誘発された。^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、Ｔｗｉｔｃｈ２Ｂによって検出されるＣａ^２＋の上昇の遅延を誘発した（図９）。これは、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅが、薬理学的に誘発されたＣａ^２＋信号伝達を、このセカンドメッセンジャーの広範囲の濃度で変更できることを示している。

^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅがインビボの生理学的プロセスを妨げる能力を評価するために、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅを、１４．５日齢（Ｅ１４．５）マウス胚の側脳室の子宮内エレクトロポレーションを使用して新しく生成された皮質神経細胞で発現させた。初期に生まれた皮質神経細胞の遊走は、Ｃａ^２＋依存プロセスである。エレクトロポレーションされた神経細胞の移動の位置は、Ｅ１８．５で評価した。ＧＦＰ及びｍＲＦＰで共エレクトロポレーションされた神経細胞の大部分は皮質板に達し、辺縁帯の近くに神経細胞の緻密層を形成する（図４）。対照的に、ＧＦＰ及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅを共発現する多くの神経細胞は、遊走の減少を示し、脳室下帯を含む新皮質全体で見つかった。さらに、いくつかのエレクトロポレーションされた細胞は、皮質板で失速せず、辺縁帯に向かってオーバーシュートし、ヘテロトピアを引き起こした。（図１）。いくつかのエレクトロポレーションされた神経細胞も皮質板で失速せず、辺縁帯に向かってオーバーシュートし、９匹中７匹の動物でヘテロトピアを引き起こし、誤って配置された神経細胞は１０個のｍＲＦＰでエレクトロポレーションされた胚のうち２つのみで見つかった（図４）。生後１０日目に、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅを発現する神経細胞は、ｍＲＦＰでエレクトロポレーションされた対照よりも皮質の厚い層を覆っていた（図４）。さらに、胚発生中に検出されたヘテロトピアは、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ発現動物（１２匹中１０匹）で出生後の段階で維持されたが、１匹のｍＲＦＰをエレクトロポレーションされた仔（５匹のエレクトロポレーションされた動物、図４）でのみ見つかった。これは、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅによるＣａ^２＋緩衝が、インビボでの正しい神経細胞の遊走に必要な生理学的Ｃａ^２＋変調を変更するのに十分であることを示している。

細胞内のカルシウム信号は、細胞内区画に限定されることがよくある。遺伝的コード化は、特定の細胞小器官に構築体の発現を制限する能力を与えるため、このシナリオにおける^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの機能を評価した。Ｌｙｎキナーゼからのパルミトイル化−ミリストイル化モチーフのタンデムを、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅのｎ末端に融合して、脂質ラフト、原形質膜の区画（Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ）を標的にした。あるいは、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは、脂質ラフトは除外したが、Ｋ−Ｒａｓ（^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓ）に由来するＣａａＸ−ポリリジンモチーフのｃ末端融合により、依然として原形質膜を標的としていた。これらの標的化配列は、以前に使用及び検証されている。界面活性剤を含まない原形質膜分画法を使用すると、Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅは脂質ラフト画分に濃縮されていることがわかったが、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの局在は、非ラフト画分に移動しており（図２）、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅのこれらの変異体が別個の膜区画を標的としていることを示している。それらの特定の分布は、さまざまな膜マーカ、それぞれコレラ毒素（ＣｔＢ）及びカベオリンのφサブユニットのプロファイルと一致する（図１０）。

Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ及び^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓを使用して、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅがその細胞内局在に応じて特定の生理的Ｃａ^２＋依存性細胞過程を操作する可能性を調査した。この目的のために、網膜軸索の忌避ガイダンス分子ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５への応答を分析し、カルシウム信号伝達を必要とするプロセスである。トランスフェクトされていない軸索とｍＲＦＰでエレクトロポレーションされた軸索とを含む対照条件では、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５は、エレクトロポレーションされていない又はｍＲＦＰを発現する成長円錐の崩壊を引き起こし、葉状仮足アクチンの脱重合と成長円錐領域の大幅な減少を特徴とした（図１１及び図１２）。サイトゾルにおける^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの発現は、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５が誘発する成長円錐の崩壊を完全に廃止し、カルシウム信号の要件が確認された（図１２）。同様に、Ｌｙｎ−^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅを発現する軸索は、Ｓｌｉｔ−１処理で崩壊の増加を示さなかった（図１２）。対照的に、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅ−Ｋｒａｓを発現する軸索は、対照と区別がつかず（図１２）、ｓｌｉｔ１及びｅｐｈｒｉｎＡ５によって生成される崩壊を誘発する信号伝達カスケードは、脂質ラフト内で区分化されたカルシウム信号伝達を必要とし、^Ｃａ２＋Ｓｐ／ＳｐｉＣｅｅの標的バージョンは、異なる細胞内及びＣａ^２＋依存性信号伝達カスケードの特定の操作を実現することを示した。

結論として、本発明のポリペプチドは、Ｃａ^２＋依存性生理学的機能を妨害する能力を有するＣａ^２＋捕捉剤として機能する。本発明のポリペプチドは、細胞特異的な方法で、細胞内分解能を用いてカルシウム応答を変化させる可能性を有し、信号伝達カスケードの精密な研究のための新しい分野を開き、治療実施への道を開く。

Claims

第１のカルシウム結合ドメイン、ペプチドリンカー及び第２のカルシウム結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記第１及び第２の結合ドメインは、前記ペプチドリンカーを介して連結されており、
−前記第１のカルシウム結合ドメイン及び前記第２のカルシウム結合ドメインはそれぞれ、ＥＦハンドモチーフに由来する少なくとも１つのカルシウム結合部位を含み、
−前記第１のカルシウム結合ドメイン及び前記第２のカルシウム結合ドメインは、少なくとも１つのカルシウム結合部位が異なる、ポリペプチド。
前記カルシウム結合部位が、パルブアルブミン、カルモジュリン、カルレチニン、Ｄ２８Ｋ、カルビンジン、リカバリン、ヒポカルシン、ＮＣＳ−１、ＭＥＬＣ、カルシニューリン（Ｃａｃｉｎｅｕｒｉｎ）Ｂ、ＭＲＬＣ、カルトラクチン、ＴｎＣ、スクイジュリン（Ｓｑｕｉｄｕｌｉｎ）、グランカルシン、ソルシン、ＡＬＧ２、カルパイン、ＣａＰＫ、スペクチン、ｓＣａＢＰ、及びＢＭ−４０からなるリストから選択されるタンパク質からの標準的なＥＦハンドモチーフに由来することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
前記カルシウム結合部位のそれぞれが、配列番号１の配列又はその機能的変異体を有する標準的なＥＦハンドモチーフのカルシウム結合ループを含むか又はそれからなることを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
前記カルシウム結合部位のそれぞれが、配列番号２〜９又はそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるカルシウム結合ループを含むか又はそれからなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記カルシウム結合部位のそれぞれが、配列番号１０〜１５又はそれらの機能的変異体からなるリストから選択される標準的なＥＦハンドモチーフを含むか又はそれからなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記第１のカルシウム結合ドメインが、パルブアルブミンからのＥＦハンドモチーフに由来する少なくとも１つのカルシウム結合部位を含み、前記第２のカルシウム結合ドメインが、カルモジュリンからのＥＦハンドモチーフに由来する少なくとも１つのカルシウム結合部位を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記第１のカルシウム結合ドメインが、配列番号２〜５及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるパルブアルブミンからのカルシウム結合ループを含むか又はそれからなる少なくとも１つのカルシウム結合部位を含み、前記第２のカルシウム結合ドメインが、配列番号６〜９及びそれらの機能的変異体からなるリストから選択されるカルモジュリンからのカルシウム結合ループを含むか又はそれからなる少なくとも１つのカルシウム結合部位を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
ペプチド信号、好ましくは本発明のポリペプチドを原形質膜、さらに好ましくは原形質膜の脂質ラフトに標的化できるペプチド信号、有利には配列番号２０又は２１の配列又はそれらの機能的変異体のペプチド信号を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）からなるリストから選択される蛍光ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
請求項１０のポリヌクレオチド又は請求項１１の組換えベクターで形質転換された宿主細胞又は非ヒト生物。
請求項１〜９のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載のベクター、及び/又は請求項１２に記載の宿主細胞、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
カルシウムキレート剤としての、好ましくはカルシウム濃度の安定化のための、及び/又はインビボ及び/又はインビトロでのカルシウム信号伝達の阻害のための、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１１に記載のベクターの非治療的使用。
医薬として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１１に記載の組換えベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の組成物。
細胞内カルシウム信号伝達機能不全、好ましくは網膜色素変性症、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病、てんかん、脳卒中、心不整脈、心不全、高血圧、糖尿病、及び癌に関連する病理の予防及び/又は治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１１に記載の組換えベクター、請求項１２に記載の宿主細胞又は請求項１３に記載の組成物。