JP2003510031A - 細胞死調節に関与するｃａｒｄタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（ＮＡＣ）、ＮＡＣをコードする核酸分子および少なくとも１つのＮＡＣに特異的な抗体を提供する。本発明はさらに、キメラＮＡＣタンパク質を提供する。本発明はまた、ＮＡＣ関連タンパク質とのＮＡＣの会合を効果的に変更し得る薬剤の同定のためのスクリーニングアッセイを提供する。本発明はさらに、ＮＡＣをコードする核酸分子またはアンチセンスヌクレオチド配列を細胞に導入することによって、細胞におけるアポトーシスを調節する方法を提供する。本発明はまた、ＵＳ００２４１２５に特異的に結合し得る試薬を使用し、細胞中の増加したかまたは減少したアポトーシスのレベルによって特徴付けられる病理学を診断する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、一般に、分子生物学および分子医学の分野に関し、そしてより詳細
には、プログラム細胞死に関与するタンパク質の同定およびこれらのタンパク質
の関連に関する。

【０００２】 （背景情報） プログラム細胞死は、生理学的なプロセスであり、これは、本質的に全ての自
己複製組織においてホメオスタシスが細胞の産生と細胞の代謝回転との間に維持
されることを確実にする。多くの場合、特徴的な形態学的変化（「アポトーシス
」といわれる）は、死にかけの細胞において起きる。類似の変化が異なる型の死
にかけの細胞において起きるため、細胞死は、異なる細胞型における共通の経路
を介して進行するようである。

【０００３】 組織のホメオスタシスの維持に加えて、アポトーシスはまた、種々の外部刺激
（増殖因子の欠乏、カルシウムレベルの変化、フリーラジカル、細胞傷害性リン
ホカイン、いくつかのウイルスによる感染、放射線および大部分の化学療法剤を
含む）への応答において起きる。従って、アポトーシスは、例えば、代謝経路に
おいて起きる場合、おそらく調節の類似の機構に供される誘導性の事象である。
この点で、アポトーシスの調節不全がまた起き得、そして例えば、対応する正常
な細胞よりも長い時間生存する癌細胞のいくつかの型において、そしてニューロ
ンが早期に死滅する神経変性疾患において観察される。ウイルス感染において、
アポトーシスの誘導は、疾患プロセスの病態生理学において顕著に表れ得る。な
ぜなら、免疫ベースのウイルス感染の根絶は、アポトーシスにおいて生じる免疫
細胞の攻撃による、ウイルスを産生する宿主細胞の除去に依存するからである。

【０００４】 プログラム細胞死に関与するタンパク質のいくつかは同定され、そしてこれら
のタンパク質のいくつかの間の関連が記載されている。しかし、さらなるアポト
ーシス調節タンパク質が、見出されるべく残ったままであり、そしてこれらのタ
ンパク質がその活性を媒介する機構が、解明されるべく残ったままである。細胞
死に関与するタンパク質の同定、およびこれらのタンパク質間の関連の理解は、
細胞におけるアポトーシスのプロセスを操作するための手段を提供し得、そして
従って、細胞の相対的寿命または細胞死刺激に対する相対的な耐性を選択的に調
節するための手段を提供し得る。

【０００５】 アポトーシスの主要なエフェクターは、カスパーゼとして公知の細胞内プロテ
アーゼのファミリーであり、システインアスパルチルプロテアーゼの略語を表す
。カスパーゼは、本質的に全ての動物細胞における不活性の酵素前駆体として見
出される。アポトーシスの間、このカスパーゼは、特定のアスパラギン酸残基で
のタンパク分解性プロセシングによって活性化され、代表的には２つの大きなサ
ブユニットおよび２つの小さなサブユニットからなる活性なプロテアーゼを構築
するサブユニットの産生を生じる（ＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙおよびＬａｚｅｂｎｉ
ｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３１２−１３１６（１９９８））。アポトーシ
スの現象は、細胞内のカスパーゼの活性化によって直接または間接的に生じ、特
定の基質タンパク質のタンパク分解性切断を生じる。さらに、多くの場合におい
て、カスパーゼはそれら自身および互いを切断および活性化し得、プロテアーゼ
活性化のカスケードおよび「自己」活性化の機構を生成する。

【０００６】 カスパーゼの基質の１つは、サイトカインの細胞内プロフォーム（例えば、プ
ロインターロイキン−１β（プロＩＬ−１β）およびプロＩＬ−１８）である。
カスパーゼによって切断される場合、これらのプロタンパク質は、生物学的に活
性なサイトカインに変換され、これは次いで細胞から遊離され、身体内を循環し
、そして炎症性免疫反応を誘発する。従って、カスパーゼは、いくつかの場合、
サイトカイン活性化および感染性因子に対する応答、ならびに炎症性および自己
免疫疾患に関与し得る。カスパーゼはまた、特定のカスパーゼ酵素前駆体を活性
化し得るいくつかのサイトカインレセプター（特にサイトカインの腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）ファミリーのメンバー）によって活性化されるシグナル伝達経路に関
与する。

【０００７】 従って、カスパーゼと相互作用し、そしてカスパーゼを調節するドメインを有
するタンパク質についての知識は、治療的に有用な方法における細胞の生存およ
び死を操作するためのストラテジーを考案するために重要である。従って、カス
パーゼ相互作用ドメインを含むこのようなタンパク質の同定およびこれらが相互
作用するタンパク質の解明は、アポトーシス、サイトカイン産生、サイトカイン
レセプターシグナル伝達、および他の細胞のプロセスを調節するために設計した
ストラテジーの基礎を形成し得る。従って、カスパーゼと相互作用するタンパク
質および他のアポトーシス関連タンパク質の同定の必要性が存在する。本発明は
、この必要性を満たし、そしてその上さらなる利点を提供する。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明に従って、新規な「ＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ」含有タンパク質（Ｎ
ＡＣと示される）、ならびに選択的ｍＲＮＡスプライシングによって産生される
いくつかのＮＡＣのアイソフォームが提供される。本発明はまた、ＮＡＣおよび
そのアイソフォームをコードする核酸分子、これらの核酸分子を含むベクター、
およびこのベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、ＮＡＣタンパク
質（その代替的アイソフォームを含む）に特異的に結合し得る抗体を提供する。

【０００９】 本発明はまた、ＮＡＣのそれ自体との関連性または別のタンパク質との関連性
を効率的に変更し得る因子を同定するために有用なスクリーニングアッセイを提
供する。ＮＡＣの自己関連性を変更すること、またはＮＡＣの他のタンパク質と
の相互作用を変更することによって、効率的な因子は、細胞におけるカスパーゼ
のタンパク分解活性またはアポトーシスのレベルを増加または減少し得るか、あ
るいはこの因子は、ＮＦ−κＢ、サイトカイン産性、または他の事象のレベルを
増加または減少し得る。

【００１０】 本発明はまた、細胞におけるＮＡＣの活性を変更する方法を提供し、ここで、
ＮＡＣの活性のこのような増加または減少は、アポトーシスまたは他の細胞応答
のレベルを調節し得る。例えば、細胞におけるＮＡＣの活性は、細胞中へ導入し
、そしてこれらのタンパク質をコードする核酸配列を発現することによって増加
され得る。さらに、細胞におけるＮＡＣの活性は、細胞中に導入し、そしてＮＡ
Ｃのフラグメント、またはＮＡＣタンパク質をコードする核酸分子の一部に相補
的なアンチセンスヌクレオチド配列を発現することによって、減少され得る。

【００１１】 本発明はまた、細胞中のＮＡＣの増加または減少したレベルに起因するアポト
ーシスの変化したレベルによって特徴付けられる病理を診断するために、ＮＡＣ
に特異的に結合し得る因子、またはＮＡＣをコードする核酸分子に結合し得るヌ
クレオチド配列を使用するための方法を提供する。

【００１２】 本発明によれば、「実質的に純粋な」哺乳動物ＣＡＲＤ含有タンパク質（ＮＡ
ＣおよびＣＡＲＤ−Ｘと呼ばれる）が提供される。本明細書中で使用する場合、
用語「ＮＡＣ」は、ＮＢ−ＡＲＣドメインおよび（ａｎｄ）ＣＡＲＤドメインの
両方（ＮＡＣ）を含むタンパク質をいう。本発明のＮＡＣタンパク質は、「ＣＡ
ＲＤドメイン」ファミリーのタンパク質（このファミリーにはＣＥＤ−４および
Ａｐａｆ−１が含まれる）の新規なメンバーである。本発明のＮＡＣはＮＢ−Ａ
ＲＣドメインおよびＣＡＲＤドメインを含み、そして必要に応じてロイシンリッ
チ反復ドメインおよび／またはＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインをさらに含む。

【００１３】 本発明のＮＡＣの代表例は、ＣＡＲＤ、ＮＢドメイン、およびＬＲＲｓを含む
、大きな、複数ドメインのタンパク質である。ＮＡＣのＣＡＲＤドメインは、Ｃ
ＥＤ−４ファミリーのＣＡＲＤ−４含有メンバー（ＣＥＤ−４、Ａｐａｆ−１、
およびＮｏｄ１を含む）と会合し得るが、ＣＡＲＤ保有カスパーゼとも、試験し
た他のＣＡＲＤ含有タンパク質とも相互作用しないようである。したがって、Ｎ
ＡＣは、以前には記載されていない、ＣＥＤ−４ファミリータンパク質と特異的
に相互作用する新しいタイプのアポトーシス調節因子である。この点に関して、
Ａｐａｆ−１およびＣＥＤ−４タンパク質は、ＣＡＲＤ含有カスパーゼと直接結
合し、最適未満に活性なプロ酵素を直ぐ近くに運び、プロ酵素を互いにトランス
プロセシングさせることによって、オリゴマー形成の際にプロテアーゼ活性化を
促進する。これに対し、ＮＡＣは、プロ−カスパーゼ−９のＣｙｔ−ｃ媒介プロ
セシングを増強するが、プロ−カスパーゼ−９（カスパーゼ−１、２、６、７、
８、１０、１１）には直接結合しないことが見出された。むしろ、ＮＡＣとＡｐ
ａｆ−１との相互作用は、プロ−カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１媒介活性化を容
易にし、したがってＡｐａｆ−１／ＣＥＤ−４ファミリータンパク質の調節の新
たなパラダイムを明らかにする。

【００１４】 興味深いことに、細胞は、Ａｐａｆ−１タンパク質のレベルの差によっては説
明され得ない方法で、カスパーゼのＣｙｔ−ｃ誘導活性化に対する感受性を変化
させることが公知である。したがって、この観察は、Ａｐａｆ−１がプロ−カス
パーゼ−９のプロセシングおよび活性化を誘導し得る効率の変動を示唆する。Ｎ
ＡＣの発見、およびＮＡＣがＡｐａｆ−１と会合し得、そしてＡｐａｆ−１依存
性カスパーゼ活性化を調整し得るという本明細書中で提示される証拠は、Ｃｙｔ
−ｃ／Ａｐａｆ−１アポトーシス経路を介する（すなわち、ＮＡＣタンパク質の
レベルを変化させることによる）微調整信号伝達のためのメカニズムを示す。

【００１５】 ＣＥＤ−４ファミリーメンバーＮｏｄ１は、プロ−カスパーゼ−９を活性化さ
せるための、細胞内の別のＡｐａｆ−１非依存性メカニズムを提供し得ることが
提案される。Ｎｏｄ１は、少なくとも細胞中で過剰発現された場合、プロ−カス
パーゼ−９と会合し、アポトーシスを誘導することが見出された。Ａｐａｆ−１
に関して本明細書中に記載された観察と同様に、ＮＡＣは、Ｎｏｄ１と会合する
こと、およびＮｏｄ１およびプロ−カスパーゼ−９と共に複合体で存在するよう
であることが見出された。これらの知見は、ＮＡＣがまた、Ａｐａｆ−１に対す
る効果と同様に、Ｎｏｄ１によるプロ−カスパーゼ−９の活性化を間接的に調整
することを示す。しかし、Ａｐａｆ−１とは対照的に、これまではインビボにお
けるＮｏｄ１の生理学的役割についてほとんど知られていない。Ｎｏｄ１はＬＲ
Ｒｓを含み、このＬＲＲｓは、（Ａｐａｆ−１のＷＤドメインとＣｙｔ−ｃとの
相互作用と同様に）Ｎｏｄ１活性化を上流の経路に結び付け得る候補のタンパク
質相互作用ドメインであるが、その経路の正体は不明のままである。同様に、Ｎ
ＡＣ中のＬＲＲｓはまた未同定のタンパク質との結合を媒介することが本明細書
中で考えられた。このことによって、特定の細胞死または細胞生存の刺激と、（
ＣＥＤ−４ファミリータンパク質に結合し、その活性を増強する）ＮＡＣとの相
互作用を介するアポトーシス機構のコア成分とを繋ぐためのさらなるメカニズム
が提供される。

【００１６】 ＮＡＣがＡｐａｆ−１およびＮｏｄ１によるカスパーゼ活性化およびアポトー
シス誘導を増強することによる機構は、以下の１つを含み得る。第一に、ＮＡＣ
のＣＡＲＤドメインは、おそらくはＣＡＲＤ−ＣＡＲＤ相互作用を通じてＣＥＤ
−４ファミリータンパク質との相互作用を媒介する。しかし、Ａｐａｆ−１およ
びＮｏｄ１のＣＡＲＤもまた、これらのＮ末端ＣＡＲＤ含有プロドメインを介す
るプロカスパーゼ９との相互作用を媒介する。ＮＡＣがＡｐａｆ−１／プロカス
パーゼ９複合体およびＮｏｄ１／プロカスパーゼ９複合体と相互作用し得ること
を、本明細書中で記載される同時免疫沈降実験が示すので、当業者は、Ａｐａｆ
−１およびＮｏｄ１のＣＡＲＤが、ＣＡＲＤの二量体化に対峙するような異種多
量体化を通じてＮＡＣおよびプロカスパーゼ９のＣＡＲＤに同時に結合し得るこ
とを予期し得る。

【００１７】 第二に、ＮＡＣのＮＢドメインが、ＣＥＤ−４ファミリータンパク質のＮＢド
メインに類似してＡＴＰ依存的様式で自己結合し得ることを、本明細書中に見出
した。また、本明細書中で提示されるように、ＮＡＣのＮＢドメインの細胞への
過剰発現は、Ａｐａｆ−１およびＮｏｄ１によるアポトーシスの誘導を干渉する
。このことは、トランスに潜在的な阻害効果を示し、このドメインを介するＮＡ
Ｃ分子のオリゴマー化がこの機能に重要であることをさらに示す。ＮＡＣのＮＢ
ドメインが、ミトコンドリア（Ｃｙｔ−ｃ／Ａｐａｆ−１）経路を通じてアポト
ーシスを誘導するがＦａｓによって誘導されるアポトーシスを阻害しない薬物で
あるスタウロスポリンによって誘導されるアポトーシスもまた抑制することをま
た、見出した。Ｆａｓは、本明細書において使用される細胞において平行する経
路を介して殺傷する基本的な細胞死レセプターである（「Ｉ型」）。ＮＡＣのＮ
Ｂドメインが、関連性のあるカスパーゼおよびおそらく他の分子とともにＡｐａ
ｆ−１またはＮｏｄ１を含む大きな多様なタンパク質の複合体のアセンブリを容
易にすることが、本明細書において意図される。本発明のＮＡＣの分子ふるいク
ロマトグラフィー分析は、少なくとも細胞に過剰発現される場合、本明細書に記
載される結果と一致して非常に大きなタンパク質複合体が存在することを示す。

【００１８】 第三には、Ａｐａｆ−１とのＮＡＣの相互作用は、Ａｐａｆ−１の活性化状態
によって影響され、Ｃｙｔ−ｃ活性化Ａｐａｆ−１とのＮＡＣの相互作用は、不
活性なＡｐａｆ−１よりもＮＡＣに対して大きな親和性を示す。従って、Ｃｙｔ
−ｃ結合によってＡｐａｆ−１において誘導されるコンフォーメーションの変化
は、ＮＡＣとの結合に必要であるドメインを暴露し得る。同様に、ＮＡＣのＮｏ
ｄ１との相互作用は、細胞における調節に対して同様に供され、そしてＮＡＣは
［不活性なコンフォーメーション］対［活性なコンフォーメーション］において
存在することが本明細書中で意図される。

【００１９】 第四に、精製された成分を使用するインビトロでのＡｐａｆ−１／プロカスパ
ーゼ９のアポソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）の再構築は、ＮＡＣが必須の補因
子ではないことを示したが、それにもかかわらず本発明のＮＡＣは以下に作用す
るインビボでの寄与する役割を担うことが本明細書中で意図される：（ａ）アポ
ソームのアセンブリの増強、（ｂ）アポソームの脱アセンブリ（ｄｅａｓｓｅｍ
ｂｌｙ）の遅延；または（ｃ）Ａｐａｆ−１／カスパーゼ９ホロ酵素複合体の触
媒活性の増強。従って、アポソーム形成のアセンブリまたは脱アセンブリを調節
する方法、またはホロ酵素複合体の触媒活性が、細胞またはＮＡＣをこのような
アセンブリまたは触媒活性を調節する因子と接触させることにより本明細書中で
意図される。

【００２０】 ＮＡＣは、ＣＡＲＤおよびＮＢドメインを含む他のＣＥＤ−４ファミリーメン
バーと類似する。例えば、ＮＡＣは、ＣＥＤ−４およびＡｐａｆ−１のＮＢドメ
インに類似する、自己オリゴマー化を媒介するＮＢドメイン（ＮＢ−ＡＲＣドメ
インとしてもまた本明細書中で言及される）を有する。さらに、カスパーゼのＣ
ＡＲＤと相互作用しないＮＡＣのＣＡＲＤドメインは、他のＣＡＲＤと結合する
。ＮＡＣがＣＥＤ−４ファミリータンパク質の活性を調節し得るという機能的証
拠とともに、これらの類似性は、本発明のＮＡＣが、アポトーシス調節タンパク
質の潜在的な大ファミリーのメンバーを意味することを示唆する。このアポトー
シス調節タンパク質は、カスパーゼ活性化に含まれる多様なタンパク質アセンブ
リを調節する目的で、自己オリゴマー化ＮＢドメインとのアポトーシスタンパク
質相互作用ドメイン（ＣＡＲＤのような）と結合する。従って、タンパク質キナ
ーゼのＡＴＰ結合ポケットとの類似によって、低分子薬物を使用してこのクラス
のアポトーシス調節因子のＮＢドメインを標的化し、これによってアポトーシス
が重要な役割を担う疾患に対する新たな治療学が訪れることが、本明細書で意図
される。従って、本発明のＮＡＣまたはその機能的フラグメント（例えば、ＮＢ
ドメインまたはＣＡＲＤドメイン）は、ＮＡＣのＮＢドメインまたはＣＡＲＤド
メインのいずれかに結合しかつＮＡＣの活性を媒介するアポトーシスを調節する
因子（例えば、低分子）を同定する方法において有用である。

【００２１】 本明細書中で使用される場合、用語「ＣＡＲＤドメイン」とは、カスパーゼ動
員ドメイン（Ｃａｓｐａｓｅ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｄｏｍａｉｎ）（Ｈｏ
ｆｍａｎｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２：１５５−１５６
（１９９７））をいう。ＣＡＲＤドメインは、細胞死プロテアーゼのカスパーゼ
ファミリーのいくつかのメンバーに見出される。カスパーゼ−１、２、４、５、
９および１１は、それらのＮＨ₂末端近辺にＣＡＲＤドメインを含む。これらの
ＣＡＲＤドメインは、カスパーゼのチモーゲン不活性形態の、これらの酵素の活
性化を活性化または阻害し得る他のタンパク質との相互作用を触媒する。例えば
、プロカスパーゼ−９のＣＡＲＤドメインは、Ａｐａｆ−１（アポトーシスプロ
テアーゼ活性化因子−１）と呼ばれるカスパーゼ活性化タンパク質のＣＡＲＤド
メインに結合する。同様に、プロカスパーゼ−１のＣＡＲＤドメインは、カスパ
ーゼ−１プロテアーゼの活性化を生じる、Ｃａｒｄｉａｃ（ＲＩＰ２およびＲＩ
ＣＫとも呼ばれる）として公知の別のＣＡＲＤタンパク質との相互作用を可能に
する（Ｔｈｏｍｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１６：８８５−８８８（１９９８）
）。そして、プロカスパーゼ−２は、ＣＡＲＤタンパク質Ｒａｉｄｄ（Ｃｒａｄ
ｄとしても公知）に結合し、このＲａｉｄｄは、プロカスパーゼ−２の、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）レセプター複合体への動員を可能し、そしてカスパーゼ−２プ
ロテアーゼの活性化を生じる（Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：６
１５−６１９（１９９７））。ＣＡＲＤドメインはまた、それら自体とのホモタ
イプの相互作用に参加し得、これは、これらのタンパク質相互作用ドメインを含
むタンパク質の自己会合を生じ、そしてダイマー複合体またはおそらくオリゴマ
ー複合体でさえも産生する。

【００２２】 ＣＡＲＤドメインは、単一のポリペプチド内にある他の型の機能的ドメイン と関連して見出され、従って、これは、２つのＣＡＲＤ含有タンパク質が関与す
るＣＡＲＤ：ＣＡＲＤ会合を介する、機能的ドメインの標的タンパク質との近接
または標的タンパク質との接触をもたらすための機構を提供する。例えば、Ｃａ
ｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ細胞死遺伝子ｃｅｄ−４は、ＣＡ
ＲＤドメインおよびＡＴＰ結合オリゴマー化ドメイン（ＮＢ−ＡＲＣドメインと
呼ばれる）を含むタンパク質をコードする（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｉｅｚｅｎおよ
びＪｏｎｅｓ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ８：Ｒ２２６−Ｒ２２７）。ＣＥＤ−４タ
ンパク質のＣＡＲＤドメインは、ＣＥＤ−３と呼ばれるプロカスパーゼのＣＡＲ
Ｄドメインと相互作用する。ＮＢ−ＡＲＣドメインは、ＣＥＤ−４に自己会合さ
せるのを可能にし、これによって、会合されたプロＣＥＤ−３分子を互いに近接
にさせるオリゴマー複合体を形成する。ほとんどのプロカスパーゼは、そのプロ
セシングされていない形態においてさえ、少なくとも少量のプロテアーゼ活性を
有するので、カスパーゼのプロ形態を近接させる複合体のアセンブリが、チモー
ゲンのトランスプロセシング（ｔｒａｎｓ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を生じ、こ
れが、タンパク質分解的にプロセシングされた活性なカスパーゼを生じる。従っ
て、ＣＥＤ−４は、プロカスパーゼおよび自己オリゴマー化のためのＮＢ−ＡＲ
Ｃドメインを結合するために、ＣＡＲＤドメインを使用し、この自己オリゴマー
化が、カスパーゼのクラスター化、タンパク質分解性プロセシングおよび活性化
を生じる。

【００２３】 多くのＣＥＤ−４関連タンパク質が、近年同定されている。これらのタンパク
質は、タンパク質のＣＥＤ−４ファミリーに属し、これらとしては、ＣＥＤ−４
（ＹｕａｎおよびＨｏｒｖｉｔｚ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１６：３０９−
３２０（１９９２））、Ａｐａｆ−１（Ｚｏｕら、Ｃｅｌｌ ９０：４０５−４
１３（１９９７））、Ｄａｒｋ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．１：２７２−２７９（１９９９））、およびＣＡＲＤ４／Ｎｏｄ
１（Ｂｅｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７４：１２９５５−１２９５８
（１９９９）およびＩｎｏｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４
５６０−１４５６７（１９９９））が挙げられる。本明細書中で使用される場合
、ＣＥＤ−４ファミリーメンバーは、ＮＢ−ＡＲＣドメインおよびＣＡＲＤドメ
インを含むタンパク質である。

【００２４】 ヒトおよびげっ歯目におけるＣＥＤ−４ホモログ（Ａｐａｆ−１と称される）
は、類似に機能することが見出されている。このＡｐａｆ−１タンパク質は、（
ｉ）ＣＡＲＤドメイン、（ｉｉ）ＮＢ−ＡＲＣドメインおよび（ｉｉｉ）ＷＤリ
ピートドメインの複数のコピーを含む。自発的にオリゴマー化し得るＣＥＤ−４
とは対照的に、哺乳動物Ａｐａｆ−１タンパク質は、補因子タンパク質チトクロ
ムｃの結合によってオリゴマー化が誘導されるまで、不活性なモノマーである（
Ｌｉら、Ｃｅｌｌ ９１：４７９−４８９（１９９７））。Ａｐａｆ−１におい
て、ＷＤリピートドメインは、チトクロムｃと接触するまで、Ａｐａｆ−１タン
パク質のオリゴマー化を妨げる。従って、このＷＤリピートは、損傷されたミト
コンドリアからのチトクロムｃ放出が、オリゴマーＡｐａｆ−１複合体のアセン
ブリを誘発するまで、潜伏状態でＡｐａｆ−１を維持するネガティブ調節ドメイ
ンとして機能する（Ｓａｌｅｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７９４１
−１７９４５（１９９９））。そのＣＡＲＤドメインを介してプロカスパーゼ−
９を結合することによって、Ａｐａｆ−１オリゴマー複合体は、カスパーゼ−９
のチモーゲン形態を近接させ、これらに、互いに切断させそしてタンパク質分解
的にプロセシングされた活性なカスパーゼ−９プロテアーゼの産生を可能にさせ
ると考えられている（Ｚｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１５４９
−１１５５６（１９９９））。

【００２５】 カスパーゼ活性化におけるそれらの役割に加えて、ＣＡＲＤドメインは、他の
細胞プロセスに関係していた。例えば、いくつかのＣＡＲＤ含有タンパク質は、
転写因子ＮＦ−κＢの活性化を誘導する。ＮＦ−κＢ活性化は、多くのサイトカ
インによって誘導され、そしてサイトカインレセプターシグナル伝達機構におい
て重要な役割を果たす（ＤｉＤｏｎａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３８８：５４８−
５５４（１９９７））。さらに、ＣＡＲＤドメインは、カスパーゼを活性化する
よりもむしろ阻害するいくつかのタンパク質（例えば、ＩＡＰ（アポトーシスタ
ンパク質のインヒビター）ファミリーメンバー、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２（
Ｒｏｔｈｅら、Ｃｅｌｌ ８３：１２４３−１２５２（１９９５））およびＢｃ
ｌ−１０タンパク質の腫瘍形成性変異体（Ｗｉｌｌｉｓら、Ｃｅｌｌ ９６：３
５−４５（１９９９）））に見出される。また、ＣＡＲＤドメイン相互作用から
生じるカスパーゼ活性化が、しばしば、アポトーシスの誘導において関与するが
、他のカスパーゼが、炎症性サイトカイン（例えば、プロＩＬ−１βおよびプロ
ＩＬ−１８）のタンパク質分解性プロセシングおよび活性化に主に関与する。従
って、ＣＡＲＤ含有タンパク質はまた、サイトカイン産生に関与し得、従って、
免疫応答および炎症性応答を調節する。

【００２６】 本発明のＮＡＣタンパク質内のＣＡＲＤドメインの機能を考慮すると、本発明
のＮＡＣタンパク質またはそのＣＡＲＤドメイン含有フラグメントは、アポトー
シス、サイトカイン産生、サイトカインレセプターシグナル伝達および他の細胞
プロセスを調節するための方法において、本発明において有用である。本発明の
ＮＡＣタンパク質またはそのＣＡＲＤドメイン含有フラグメントはまた、アポト
ーシス、サイトカイン産生、サイトカインレセプターシグナル伝達および他の細
胞プロセスを調節する、ＣＡＲＤ結合因子を同定するために、本発明において有
用である。

【００２７】 １つの実施形態において、本発明のＮＡＣのＣＡＲＤドメインは、ＮＡＣのＣ
ＡＲＤドメイン（例えば、配列番号２の残基１３７３−１４７３を参照のこと）
に対して少なくとも５０％の同一性を有する配列を含む。より好ましくは、本発
明のＣＡＲＤドメインは、ＮＡＣのＣＡＲＤドメインと少なくとも６０％の同一
性を有する配列を含む。最も好ましくは、本発明のＣＡＲＤドメインは、ＮＡＣ
のＣＡＲＤドメインと少なくとも７５％の同一性を有する配列を含む。代表的に
、本発明のＣＡＲＤドメインは、ＮＡＣのＣＡＲＤドメインと少なくとも９５％
の同一性を有する配列を含む。

【００２８】 本明細書中に記載されるように、本発明のＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘタンパク
質は、他のＣＡＲＤ含有タンパク質と会合し得る。特に、本発明のＮＡＣまたは
ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質のＣＡＲＤドメインの、他のＣＡＲＤ含有タンパク質（
例えば、Ａｐａｆ−１、ＣＥＤ−４、カスパーゼ−１、２、９、１１、ｃＩＡＰ
−１および２、ＣＡＲＤＩＡＫ、Ｒａｉｄｄ、Ｄａｒｋ、ＣＡＲＤ４および他の
ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘなど（本明細書中でＮＡＰまたはＣＡＰとも呼ばれる
））との会合は、その結合複合体が、細胞においてインビボでかまたは適切な条
件下でインビトロで形成し得るように、十分に特異的である。従って、同様に、
本発明のＮＡＣタンパク質は、ＣＡＲＤ：ＣＡＲＤ会合によって別のＮＡＣタン
パク質と会合し得る。

【００２９】 本発明のＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘタンパク質はさらに、プロカスパーゼ、カ
スパーゼ（例えば、カスパーゼ−９）またはカスパーゼ関連タンパク質と、直接
的または間接的に会合し得、これによって、カスパーゼのタンパク質分解活性を
調節する（例えば、本明細書中の実施例１０．０〜１３．０を参照のこと）。カ
スパーゼタンパク質分解活性は、細胞のアポトーシスに関連し、さらにサイトカ
イン産生に関連する。従って、本発明のＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘは、カスパー
ゼタンパク質分解活性を調節することによって、アポトーシスまたはサイトカイ
ン産生を調節し得る。本明細書中で使用される場合、「カスパーゼ」は、本発明
のＮＡＣタンパク質またはＮＡＣ関連タンパク質と会合する、システインアスパ
ルチルプロテアーゼの任意のメンバーである。同様に、「プロカスパーゼ」は、
カスパーゼの不活性形態または活性の低い前駆体形態であり、これは、代表的に
は、タンパク質分解事象によってより活性なカスパーゼに変換される。

【００３０】 ＣＡＲＤ含有タンパク質はまた、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を誘導すること
が知られている。従って、本発明のＮＡＣはまた、ＮＦ−κＢ活性の調節によっ
て転写を調節し得る。

【００３１】 本発明のＮＡＣタンパク質はまた、ＮＢ−ＡＲＣドメインを含む。本明細書中
で記載される場合、本発明のＮＡＣタンパク質のＮＢ−ＡＲＣドメインは、Ｐ−
ループ（Ｗａｌｋｅｒ Ａ）またはＷａｌｋｅｒ Ｂ領域のいずれかにおける残
基の同一性が、そのＮＡＣの残基（例えば、配列番号２の残基３２９−３４２お
よび４０６−４１４を参照のこと；図１Ｂを参照のこと）に対して少なくとも６
０％である配列を含む。好ましくは、本発明のＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメインは
、Ｐ−ループ（Ｗａｌｋｅｒ Ａ）およびＷａｌｋｅｒ Ｂ領域の全体の同一性
が、そのＮＡＣの残基に対して少なくとも６０％である配列を含む。より好まし
くは、本発明のＮＢ−ＡＲＣドメインは、ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメイン全体（
例えば、配列番号２の残基３２９−５４７を参照のこと）に対して少なくとも６
０％同一性を有する配列を含む。最も好ましくは、本発明のＮＢ−ＡＲＣドメイ
ンは、ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメイン全体に対して少なくとも８０％の同一性を
有する配列を含む。

【００３２】 本発明のＮＡＣタンパク質のＮＢ−ＡＲＣドメインは、他のタンパク質、特に
、ＮＢ−ＡＲＣドメインを含むタンパク質と会合する。従って、機能的ＮＢ−Ａ
ＲＣドメインは、ＮＢ−ＡＲＣ：ＮＢ−ＡＲＣ会合によって、ＮＢ−ＡＲＣドメ
イン含有タンパク質と会合する。本明細書中で使用される場合、用語「会合する
」または「会合」とは、ＮＡＣが、比較的特異的にタンパク質に結合し得、そし
て従って、結合複合体を形成し得ることを意味する。特に、別のＮＢ−ＡＲＣド
メイン含有タンパク質とのＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメインの会合は、この結合複
合体が、細胞においてインビボでかまたは適切な条件下でインビトロで形成し得
るように、十分に特異的である。さらに、ＮＢ−ＡＲＣドメインは、ヌクレオチ
ド結合活性（例えば、ＡＴＰ結合）および加水分解活性の両方を示す。これらの
活性は、代表的に、Ｂ−ＡＲＣドメイン含有タンパク質と会合する能力に必要と
される。従って、本発明のＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメインは、１以上のヌクレオ
チド結合部位を含む。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド結合部位は、
ヌクレオチド（例えば、ＡＴＰなど）を特異的に結合するタンパク質の部分であ
る。代表的に、ＮＢ−ＡＲＣのヌクレオチド結合部位は、本発明のＮＡＣのＰ−
ループ、キナーゼ２モチーフまたはキナーゼ３ａモチーフ（これらのモチーフは
、例えば、ｖａｎ ｄｅｒ ＢｉｅｚｅｎおよびＪｏｎｅｓ、前出に定義される
）を含む。好ましくは、ＮＢ−ＡＲＣのヌクレオチド結合部位は、本発明のＮＡ
ＣのＰ−ループを含む。

【００３３】 従って、本発明のＮＡＣは、ＣＡＲＤ：ＣＡＲＤ会合および／またはＮＢ−Ａ
ＲＣ：ＮＢ−ＡＲＣ会合し得、これが、他のタンパク質との１以上の特異的会合
を可能にする多機能性タンパク質を生じる。本発明のＮＡＣは、アポトーシス、
サイトカイン産生などの細胞プロセスを調節し得る。例えば、本発明のＮＡＣが
、細胞におけるアポトーシスのレベルを増加し得ることが、本明細書中で意図さ
れる。本発明のＡＮＣが、細胞におけるアポトーシスのレベルを減少することも
また、本明細書中で意図される。例えば、アポトーシスを誘導しないＮＡＣは、
アポトーシス性であるＮＡＣとヘテロオリゴマーを形成し得、従って、ＮＡＣの
アポトーシス誘導活性を干渉する。

【００３４】 本発明の別の実施形態において、本発明のＮＡＣタンパク質はまた、システイ
ンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを含み、これは、ＣＡＲＤ４（Ｎｏｄ１と
しても知られる）として知られる別のＣＡＲＤタンパク質において記載されたＬ
ＲＲ（Ｉｎｏｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４５６０−１４
５６７（１９９９））に類似する。しかし、ＣＡＲＤ−４（Ｎｏｄ１）とは異な
り、ＮＡＣのＣＡＲＤドメインは、このタンパク質のカルボキシル末端に位置し
、一方、ＣＡＲＤ−４（Ｎｏｄ１）のＣＡＲＤドメインは、このタンパク質のＮ
Ｈ₂末端に見出される。ＬＲＲドメインの機能は、他のタンパク質との特異的相
互作用を媒介することである。

【００３５】 本明細書中で使用される場合、本発明のＮＡＣのロイシンリッチリピート（Ｌ
ＲＲ）ドメインは、ＮＡＣのＬＲＲドメイン（例えば、配列番号２の残基８０８
−９４７を参照のこと）に対して少なくとも５０％の同一性を有する配列を含む
。好ましくは、本発明のＮＡＣのＬＲＲドメインは、そのＮＡＣのＬＲＲドメイ
ンに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。より好ましくは、本
発明のＮＡＣのＬＲＲドメインは、そのＮＡＣのＬＲＲドメインに対して少なく
とも７５％の同一性を有する配列を含む。最も好ましくは、本発明のＮＡＣのＬ
ＲＲドメインは、ＮＡＣのＬＲＲドメインに対して少なくとも９５％の同一性を
有する配列を含む。

【００３６】 本発明のＮＡＣの短縮型ＬＲＲが使用され得ることが、さらに意図される。本
発明の短縮型ＬＲＲは、ＬＲＲのスプライシング改変体形態（例えば、配列番号
２の残基８０８−９１７を参照のこと）に対して少なくとも９０％の同一性を有
する配列を含み、そしてこのスプライシング領域（例えば、配列番号２の残基９
１８−９４７）における９０％より多い残基を含まない。好ましくは、この短縮
型ＬＲＲは、このスプライシング領域における７０％より多い残基を含まない。
より好ましくは、この短縮型ＬＲＲは、このスプライシング領域における５０％
より多い残基を含まない。この短縮型ＬＲＲは、短縮型ＬＲＲを含むＮＡＣのタ
ンパク質：タンパク質相互作用活性が、全長ＬＲＲを含むＮＡＣについて観察さ
れた活性と異なる場合に、特に有用である。短縮型ＬＲＲを有するＮＡＣの活性
は、本明細書中に開示されるアッセイの１以上によって決定され、そして任意の
タンパク質：タンパク質相互作用が１０％以上変化されるか、またはカスパーゼ
活性またはアポトーシス活性が１０％以上変化される場合に、全長ＬＲＲを含む
ＮＡＣの活性と異なるとみなされる。

【００３７】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のＮＡＣタンパク質は、ＴＩＭ−
ｂａｒｒｅｌタンパク質に対して類似性を有する、ＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメ
インを含む。ＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌドメインは、当該分野で周知であり、代表的
には、樽様構造を形成する、８つの交互のα−へリックスおよびβ−ストランド
からなるが、いくつかの場合は、７つのα−へリックスおよび／またはβ−スト
ランドを含み得る。ＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌは、いくつかの酵素（例えば、アルド
ラーゼ）において見出されているが、いくつかの場合、タンパク質相互作用も媒
介する。

【００３８】 本明細書中で使用される場合、本発明のＮＡＣのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメ
インは、ＮＡＣのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインと少なくとも５０％の同一性
を有する配列（配列番号２の残基１０７９〜１３２０）を含む。好ましくは、本
発明のＮＡＣのＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌ様ドメインは、ＮＡＣのＴＩＭ−Ｂａｒｒ
ｅｌ様ドメインと少なくとも６０％同一性を有する配列を含む。より好ましくは
、本発明のＮＡＣのＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌドメインは、ＮＡＣのＴＩＭ−ｂａｒ
ｒｅｌ様ドメインと少なくとも７０％同一性を有する配列を含む。最も好ましく
は、本発明のＮＡＣのＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌ様ドメインは、ＮＡＣのＴＩＭ−ｂ
ａｒｒｅｌ様ドメインと少なくとも８０％同一性を有する配列を含む。

【００３９】 本発明の現在特に好ましいＮＡＣタンパク質は、配列番号２、４、および６に
示されるタンパク質配列ならびにその生物学的に活性な機能的フラグメントと実
質的に同じアミノ酸配列を含む、タンパク質を含む。

【００４０】 当業者は、上記の配列の多数の残基が、生じるＮＡＣタンパク質種の生物学的
活性を実質的に変化することなく、他の化学的、立体的および／または電子的に
同様の残基で置換され得ることを、認識する。さらに、配列番号２，４、および
６に示されるアミノ酸と実質的に同じ配列をその中に含む、より大きなポリペプ
チド配列が、意図される。

【００４１】 本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じアミノ酸配列」とは、参照
アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一性を有し、かつその参照アミノ酸
配列により規定されるタンパク質の特徴である、匹敵する機能的および生物学的
活性を保持する、アミノ酸配列をいう。好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配
列」を有するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、よ
り好ましくは９０％のアミノ酸同一性を有し；約９５％を超えるアミノ酸配列同
一性が特に好ましい。しかし、種改変体として生じるかまたは保存的アミノ酸置
換により改変されたかもしくは縮重コドンの置換により改変された、記載される
レベルに満たない配列同一性を含むポリペプチド（または本明細書中で以前に言
及された核酸）もまた、本発明の範囲内に包含される。

【００４２】 用語「生物学的に活性」または「機能的」は、本明細書中で本発明のＮＡＣも
しくはそのポリペプチドフラグメントの修飾語句として使用される場合、ＮＡＣ
と同様の機能的特徴を示すポリペプチドをいう。ＮＡＣの生物学的活性は、例え
ば、本明細書中に記載されるような、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ−Ａ
ＲＣ含有タンパク質に（好ましくはインビボで）結合する能力、またはホモオリ
ゴマー化する能力、またはプロテアーゼ活性化（特に、カスパーゼ活性化）を調
節する能力、またはＮＦ−κＢ活性を調節する能力、またはアポトーシスを調節
する能力である。このようなＮＡＣ結合活性は、例えば、本明細書中に記載され
る方法を使用してアッセイされ得る。ＮＡＣの別の生物学的活性は、本発明のＮ
ＡＣに特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生の
ための免疫原として作用する能力である。従って、ＮＡＣをコードする本発明の
核酸は、配列番号２、４、６、１０、または１２に示されるアミノ酸を含むＮＡ
Ｃタンパク質（好ましくはヒト）もまた特異的に認識する抗体により特異的に認
識される、ポリペプチドをコードする。このような免疫学的活性は、当業者に公
知の任意の方法によりアッセイされ得る。例えば、ＮＡＣ ｃＤＮＡによりコー
ドされる試験ポリペプチドは、抗体を産生するために使用され得、次いでこの抗
体は、配列番号２、４、６、１０、または１２に示される配列を含む本発明のＮ
ＡＣタンパク質に結合するその能力についてアッセイされる。その抗体が試験ポ
リペプチドと配列番号２、４、６、１０または１２によりコードされる配列を含
むタンパク質とに、実質的に同じ親和性で結合する場合、そのポリペプチドは、
必要な免疫学的生物学的活性を保有する。

【００４３】 本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」とは、細胞中でそ
のタンパク質と通常は結合している脂質、タンパク質、核酸もしくは他の細胞物
質を比較的混入していない形態である、タンパク質を意味する。実質的に精製さ
れたＮＡＣは、当該分野で周知の種々の方法により得られ得、そのような方法は
、例えば、本明細書中に記載される組換え発現系、沈殿、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびアフィ
ニティークロマトグラフィーなどである。他の周知の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
ｒら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ（１９９０））（本明細書中に参考として援用される）に記載される。あ
るいは、本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前
出）（１９８９）に記載されるような周知の組換え方法を使用して得られ得る。

【００４４】 本発明のＮＡＣタンパク質またはそのフラグメントが、他の異種タンパク質（
すなわち、ＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質およびＣＡＲＤ含有タンパク質）と相互
作用する能力に加えて、本発明のＮＡＣタンパク質およびＣＡＲＤ−Ｘタンパク
質は、自己会合する能力を有する。この自己会合は、ＣＡＲＤドメイン間の相互
作用を介して、そしてまたＮＢ−ＡＲＣドメイン間の相互作用を介して、可能で
ある。さらに、自己会合は、ＬＲＲドメインとＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメイン
との間の相互作用の結果として生じ得る。

【００４５】 本発明に従って、野生型ＮＡＣ活性と異なる活性を有するＮＡＣの変異および
フラグメントもまた、提供される。本明細書中で使用される場合、「変異」は、
野生型タンパク質配列における１つ以上のアミノ酸の任意の欠失、挿入または変
化であり得、そして「フラグメント」は、その野生型タンパク質のカルボキシ末
端、アミノ末端、もしくはその両方のいずれかの任意の短縮形態である。好まし
くは、この変異もしくはフラグメントの異なる活性は、野生型ＮＡＣの活性のす
べてではないがいくらかを維持する、変異体タンパク質もしくはフラグメントの
結果である。例えば、ＮＡＣのフラグメントは、ＣＡＲＤドメインならびにＬＲ
ＲドメインおよびＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインを含み得るが、機能的ＮＲ−
ＡＲＣドメインを欠き得る。このようなフラグメントは、野生型ＮＡＣ活性の一
部（例えば、ＣＡＲＤドメイン機能性）を維持するが、すべての野生型活性は維
持しない（例えば、活性なＮＢ−ＡＲＣドメインを欠く）。従って、生じるフラ
グメントは、野生型ＮＡＣ活性と異なる活性を有する。１つの実施形態において
、そのフラグメントの活性は、「優性ネガティブ」である。優性ネガティブな活
性は、そのフラグメントに、野生型ＮＡＣの１つ以上のアイソフォームの活性を
減少もしくは不活性化させる。

【００４６】 選択的ｍＲＮＡスプライシングから生じるＮＡＣタンパク質のアイソフォーム
もまた、提供され、そしてこれは、他のタンパク質とそのＮＡＣタンパク質の相
互作用を変更もしくは改変し得る。例えば、ＮＡＣの３つの新規なアイソフォー
ムが、本明細書中にて提供され、そして、ＮＡＣβ、ＮＡＣγおよびＮＡＣδ（
それぞれ、配列番号１、３および５として示される）と称される。ＮＡＣβのア
ミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部が、図１Ｂに示され
、そしてＮＡＣβのｃＮＤＡ配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１
および２として列挙される。ＮＡＣβは、両方のスプライス領域が翻訳されたポ
リペプチド中に存在し、それにより図１ＢのＮＡＣ ｃＤＮＡ配列の核酸１〜４
４２２およびＮＡＣタンパク質配列のアミノ酸１〜１４７３を含む、ＮＡＣのス
プライス改変体を示す。ＮＡＣγは、いずれのスプライス領域も翻訳されたポリ
ペプチド中に存在せず、それにより、図１ＢのＮＡＣ ｃＤＮＡ配列の核酸１〜
２８６８、２９６２〜３７８０および３９１６〜４４２２、ならびにＮＡＣタン
パク質配列のアミノ酸１〜９５６、９９８〜１２６０および１３０６〜１４７３
を含む、ＮＡＣのスプライス改変体を示す。ＮＡＣγのｃＤＮＡ配列およびアミ
ノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および４として列挙される。ＮＡＣγは、カ
ルボキシ末端側のスプライス領域のみが翻訳されたポリペプチド中に存在し、そ
れにより、図１ＢのＮＡＣ ｃＤＮＡ配列の核酸１〜２８６８および２９６２〜
４４２２、ならびにＮＡＣタンパク質配列のアミノ酸１〜９５６および９９８〜
１４７３を含む、ＮＡＣのスプライス改変体を示す。ＮＡＣδのｃＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５および６として列挙される。

【００４７】 本発明の別の実施形態において、別のタンパク質もしくはその機能的フラグメ
ントに融合されたＮＡＣまたはその機能的フラグメントを含む、キメラタンパク
質が提供される。ＮＡＣの機能的フラグメントとしては、例えば、本明細書中に
記載されるような、ＮＢ−ＡＲＣドメイン、ＣＡＲＤドメイン、ＬＲＲドメイン
およびＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインが挙げられる。ＮＡＣまたはその機能的
フラグメントが融合されるタンパク質としては、例えば、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ、抗体、またはキメラの回収を容易にする他のタンパク質もし
くはその機能的フラグメントが、挙げられる。ＮＡＣまたはその機能的フラグメ
ントが融合されるさらなるタンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ、グリ
ーン蛍光タンパク質、抗体、キメラの同定を容易にする他のタンパク質もしくは
その機能的フラグメントが挙げられる。ＮＡＣまたはその機能的フラグメントが
融合されるなおさらなるタンパク質としては、例えば、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ド
メイン、リシン、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、抗体、または治療的特性もし
くは他の生物学的活性を有する他のタンパク質が、挙げられる。

【００４８】 本明細書中で意図されるさらなる本発明のキメラタンパク質は、ＮＡＣのドメ
インが、異種タンパク質由来の類似のそのようなドメインにより置換されている
、キメラタンパク質である。例えば、上記のような、ＮＢ−ＡＲＣドメインは、
Ａｐａｆ−１のＮＢ−ＡＲＣドメインなどにより置換され得る。このようなキメ
ラの別の例は、ＮＡＣのＣＡＲＤドメインが、ＣＥＤ−４由来のＣＡＲＤドメイ
ンなどにより置換されている、タンパク質である。

【００４９】 ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質は、ＣＡＲＤドメイン、ならびにＴＩＭ−Ｂａｒｒｅ
ｌ様ドメインに対する類似性を有するが他はＮＡＣと異なる領域を含む。ＣＡＲ
Ｄ−ＸをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号７）は、それがＮＡＣ由来の別の遺
伝子から生じることを明らかにする。特に、推定ＣＡＲＤ−Ｘアミノ酸配列（配
列番号８）は、ＮＢ−ＡＲＣドメインを含まない。

【００５０】 ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質のＣＡＲＤドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメ
イン（配列８の残基３４３〜４３１）の少なくとも５０％同一性を有する配列を
含む。より好ましくは、本発明のＣＡＲＤドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤ
ドメインと少なくとも６０％同一性を有する配列を含む。最も好ましくは、本発
明のＣＡＲＤドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメインと少なくとも７５％
同一性を有する配列を含む。代表的に、本発明のＣＡＲＤドメインは、ＣＡＲＤ
−ＸのＣＡＲＤドメインと少なくとも９５％同一性を有する配列を含む。

【００５１】 ＣＡＲＤ−ＸのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＴＩＭ−
Ｂａｒｒｅｌドメイン（配列番号８の残基５６〜３３１）と少なくとも５０％同
一性を有する配列を含む。好ましくは、本発明のＮＡＣのＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌ
ドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌドメインと少なくとも６０％
同一性を有する配列を含む。より好ましくは、本発明のＣＡＲＤ−ＸのＴＩＭ−
ｂａｒｒｅｌドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌドメインと少な
くとも７０％同一性を有する配列を含む。最も好ましくは、ＣＡＲＤ−ＸのＴＩ
Ｍ−ｂａｒｒｅｌドメインは、ＣＡＲＤ−ＸのＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌドメインと
少なくとも８０％同一性を有する配列を含む。

【００５２】 １つの実施形態において、本明細書中に提供される本発明のキメラＣＡＲＤ含
有タンパク質は、ＮＡＣ−Ｘと称する。ＮＡＣ−Ｘをコードする核酸もまた、本
明細書中に提供される。ＮＡＣ−Ｘタンパク質の代替的アイソフォームおよび代
替的アイソフォームをコードする対応する核酸もまた、提供される。本明細書中
で使用される場合、用語「ＮＡＣ−Ｘ」は、ＮＡＣの一部およびＣＡＲＤ−Ｘの
一部を含む、キメラタンパク質をいう。例えば、ＮＡＣ−Ｘタンパク質の１つの
型は、ＮＡＣδ−Ｘであり、これにおいて、ＮＡＣδの一部（例えば、ＮＡＣδ
のＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメイン）がＣＡＲＤ−Ｘの一部（例えば、ＣＡＲＤ
−ＸのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメイン）により置換されている。ＮＡＣおよび
ＣＡＲＤ−Ｘの両方に共通のドメインの一部（特に、ＣＡＲＤドメインおよびＴ
ＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメイン）を含むタンパク質が、ＮＡＣおよびＣＡＲＤ−
Ｘのキメラを含み得ることは、本発明の範囲内である。例えば、ＮＡＣβ−Ｘタ
ンパク質は、配列番号２からの残基１〜１３９７、そのすぐ後に、配列番号８か
らの残基３６４〜４０２、次いでそのすぐ後に、配列番号２からの残基１４３６
〜１４７３を有し得、そのようにしてキメラＣＡＲＤドメインを形成する。

【００５３】 １つの実施形態において、ＮＡＣ−Ｘタンパク質は、上記のような、ＮＡＣの
ＮＢ−ＡＲＣドメイン、およびＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメインを含む。別の実
施形態において、ＮＡＣ−Ｘタンパク質は、ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメインおよ
びＬＲＲドメイン、ＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメイン、ならびにＮＡＣもしくは
ＣＡＲＤ−ＸのいずれかからのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインまたは両方から
のキメラを含む。なお別の実施形態において、ＮＡＣ−Ｘは、ＮＡＣのＮＢ−Ａ
ＲＣドメインおよびＬＲＲドメイン、ならびにＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメイン
およびＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインを含む。例えば、本発明のキメラタンパ
ク質は、ＮＡＣβ（配列番号２）の１〜９４７と１〜１０７８との間の残基ある
いはＮＡＣγまたはＮＡＣδ（それぞれ、配列番号４および６）の１〜９１８と
１〜１０４８との間の残基を、ＣＡＲＤ−Ｘ（配列番号８）の１〜４３１と５６
〜４３１との間の残基を含むキメラ中に含む。特定の本発明のキメラは、ＮＡＣ
−Ｘ１タンパク質と呼ばれ、そして以下の配列を含む：ＮＡＣβ−Ｘ１（ＮＡＣ
βの残基１〜１０７８およびＣＡＲＤ−Ｘの残基５６〜４３１）（配列番号１０
に列挙される生じたアミノ酸配列を有する）；ＮＡＣγ／δ−Ｘ１（ＮＡＣγま
たはＮＡＣδの残基１〜１０４８およびＣＡＲＤ−Ｘの残基５６〜４３１）（配
列番号１２に列挙される生じたアミノ酸配列を有する）。ＮＡＣβ−Ｘ１をコー
ドするｃＤＮＡは、ＮＡＣβのｃＤＮＡ残基１〜３２３４およびＣＡＲＤ−Ｘの
ｃＤＮＡ残基１６６〜１２９３を含み、配列番号９に列挙される生じた配列を有
し；そしてＮＡＣγ／δ−Ｘ１タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＮＡＣγも
しくはＮＡＣδのｃＤＮＡ残基１〜３１４４ならびにＣＡＲＤ−ＸのｃＤＮＡ残
基１６６〜１２９３を含み。配列番号１１に列挙される生じた配列を有する。

【００５４】 本発明の別の実施形態は、結合体を形成するためのある部分と融合された、Ｎ
ＡＣ、またはその機能的フラグメントを提供する。本明細書中で使用されるよう
に、「部分」は、ＮＡＣまたはその機能的フラグメントに機能的に寄与する物理
的、化学的、生物学的存在であり得る。ある部分により寄与される機能としては
、治療的活性または他の生物学的活性、またはＮＡＣの同定または回復を容易に
する能力が挙げられる。従って、ある部分としては、例えば、蛍光、磁気画像化
による、放射性放出の検出により、結合体化を検出するために有用であることが
、この技術において公知である分子が挙げられる。ある部分がまた、結合体の回
収のために有用であり得る（例えば、タンパク質の単離／精製のために使用され
るＨｉｓタグまたは他の公知のタグ、またはビーズのような物理的物質）。ある
部分は、治療化合物（例えば、結合体が局在する細胞における生物学的変化に影
響するのに有用であり得る細胞傷害性薬物）であり得る。

【００５５】 本発明のポリペプチドを調製するための方法の例は、当該分野で周知の方法を
使用して、適切な宿主細胞（例えば、細菌性細胞、酵母細胞、両生類の細胞（す
なわち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞においてＮＡＣをコードする核酸を発
現させ、そして再び周知の方法を使用して、発現されたポリペプチドを回収する
ものである。本発明のポリペプチドは、本明細書中の以下に記載されるような発
現ベクターを用いて形質転換された細胞から、直接単離され得る。本発明のポリ
ペプチド、生物学的機能的フラグメント、およびその機能的等価物はまた、化学
合成により産生され得る。例えば、合成ポリペプチドは、製造業者により提供さ
れた化学を利用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄ
ｅｌ ４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチド合成装置（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
，ＣＡ）を用いて産生され得る。

【００５６】 その機能的フラグメントまたはポリペプチドアナログもまた、用語ＮＡＣによ
り包含される。用語「機能的フラグメント」は、全長ＮＡＣタンパク質の１部分
であるペプチドフラグメントをいい、ただし、この部分は、上記で規定されるよ
うな対応する全長ＮＡＣの特徴である１つ以上の生物学的活性を有する。例えば
、本発明のＮＡＣタンパク質の機能的フラグメントは、ＮＡＣにおいて一般に行
われる１以上のタンパク質：タンパク質結合活性を有し得る。さらに、免疫応答
を惹起するための本発明のＮＡＣタンパク質の機能的フラグメントの特徴は、抗
ＮＡＣ抗体を得るために有用である。従って、本発明はまた、本発明のＮＡＣタ
ンパク質の機能的フラグメントを提供し、これは、結合および慣例的方法（例え
ば、本明細書中に記載されるバイオアッセイ）を使用して、同定され得る。

【００５７】 用語「ポリペプチドアナログ」は、１つ以上の残基が、機能的に類似した残基
で保存的に置換され、そして本明細書中に記載されるようなＮＡＣを機能的に模
倣する能力を示す、本明細書中に詳細に示される配列と実質的に同じアミノ酸残
基配列を有する任意のポリペプチドを含む。保存的置換の例としては、別の残基
の代わりに、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの
非極性（疎水性）残基の置換、別の残基の代わりに１つの極性（親水性）残基の
置換（例えば、アルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、
グリシンとセリンとの間）、別の残基の代わりにリシン、アルギニンまたはヒス
チジンのような１つの塩基性残基の置換、または別の残基の代わりに、１つの塩
基性残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の置換が挙げられる。

【００５８】 本発明の機能的フラグメントまたはポリペプチドアナログのアミノ酸長は、本
発明のＮＡＣの約５アミノ酸から全長タンパク質配列の範囲であり得る。特定の
実施形態において、アミノ酸長としては、例えば、少なくとも約１０アミノ酸長
、少なくとも約２０アミノ酸長、少なくとも約３０アミノ酸長、少なくとも約４
０アミノ酸長、少なくとも約５０アミノ酸長、少なくとも約７５アミノ酸長、少
なくとも約１００アミノ酸長、少なくとも約１５０アミノ酸長、少なくとも約２
００アミノ酸長、少なくとも約２５０アミノ酸長、またはそれ以上の全長ＮＡＣ
タンパク質配列までが挙げられる。

【００５９】 本明細書中において使用されるような、句「保存的置換」はまた、非誘導残基
の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用を含み、但し、このようなポリペ
プチドは、必要とされる結合活性を示す。句「化学的誘導体」は、機能的側鎖の
反応により化学的に誘導される１つ以上の残基を有する本願ポリペプチドをいう
。このような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が、アミンハイドロ
クロライド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキ
シカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するために誘導体化
されている分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステルおよ
びエチルエステルあるいはエステルまたはヒドラジドの他の型を形成するために
誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキ
ル誘導体を形成するために誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は
、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するために誘導体化され得る。また、２
０個の標準的なアミノ酸のうち１つ以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含むそ
れらのペプチドが、化学的誘導体として含まれる。例えば、：４−ヒドロキシプ
ロリンが、プロリンの代わりに置換され得；５−ヒドロキシリシンは、リシンの
代わりに置換され得；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンの代わりに置換され
得；ホモセリンは、セリンの代わりに置換され得；そしてオルニチンは、リシン
の代わりに置換され得る。本発明のポリペプチドはまた、必要とされる活性が維
持される限り、配列が本明細書中に示されるポリペプチドの配列と比較して、残
基の１つ以上の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドを含む。

【００６０】 本発明はまた、受容可能なキャリア、および単離され、精製されたＮＡＣ成熟
タンパク質またはその機能的ポリペプチドフラグメントを、単独または互いに組
み合わせて含む組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、
ネイティブな供給源から組換え的に誘導体化され得るか、化学的に合成され得る
か、または精製され得る。本明細書中に使用される場合、用語「受容可能なキャ
リア」は、標準的な薬学的キャリアのいずれか（例えば、リン酸緩衝生理食塩溶
液、水およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）、なら
びに湿潤剤の種々の型）を含む。本明細書中に記載されるＮＡＣ組成物は、例え
ば、この後記載される方法において使用され得る。

【００６１】 本発明の別の実施形態に従って、実質的に純粋な核酸分子、およびその機能的
フラグメントが、提供され、これは、本発明のＮＡＣをコードする。例示的な本
発明の核酸分子は、ＮＡＣβ（配列番号１）、ＮＡＣγ（配列番号３）、および
ＮＡＣδ（配列番号５）をコードする実質的に同じヌクレオチドを含む核酸分子
である。

【００６２】 本明細書中に記載される核酸分子は、このような核酸が当業者に公知の種々の
タンパク質発現系に援用される場合、本発明のタンパク質を産生するために有用
である。さらに、このような核酸分子またはそのフラグメントは、容易に検出可
能な置換基で標識され得、そして所定のサンプルにおいて本発明のＮＡＣ遺伝子
またはｍＲＮＡ転写物の存在および／または量についてアッセイするためのハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用され得る。本明細書中に記載される核酸
分子およびそのフラグメントはまた、本明細書中に記載される本発明のタンパク
質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよび／
またはテンプレートとして有用である。

【００６３】 用語「核酸」（またポリヌクレオチドといわれる）は、リボ核酸（ＲＮＡ）ま
たはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプラ
イマーを含む。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ（例え
ば、ＮＡＣをコードする遺伝子）のいずれかであり得る。ＮＡＣポリペプチドを
コードする核酸を単離する１つの手段は、当該分野で周知の方法を使用して、天
然のプローブまたは人工的に設計されたＤＮＡプローブを用いて、哺乳動物ゲノ
ムライブラリーをプローブ化することである。ＮＡＣ遺伝子に由来するＤＮＡプ
ローブは、この目的のために特に有用である。ＮＡＣポリペプチドをコードする
ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、
ウサギ、ブタなど）、または他の動物の供給源から、相補的なゲノムＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡまたはＲＮＡを得るため、またはｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのス
クリーニングにより、以下により詳細に記載される方法により関連するｃＤＮＡ
またはゲノムクローンを単離するために使用され得る。このような核酸としては
、配列番号１（ＮＡＣβ）、３（ＮＡＶγ）、および５（ＮＡＣδ）に示される
ような実質的に同じヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられるが、これに限定さ
れない。

【００６４】 ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の変更遺伝子として、本明細
書および請求の範囲における、用語「単離された」および／または「精製された
」および／または「実質的に精製された」の使用は、そのように示されたＤＮＡ
、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が、ヒトの手によりこのような形態で
産生されて、従って、それらのネイティブなインビボ細胞性環境から分離され、
そして核酸またはタンパク質の任意の他の種にはないことを意味する。このヒト
の介入の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタン
パク質は、本明細書中に記載される点では有用であり、それらが天然に存在する
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質は有用ではない。

【００６５】 本発明のＮＡＣタンパク質およびこのようなものをコードする核酸が、生物体
（例えば、原核生物、真核生物、植物、真菌、脊椎動物、無脊椎動物など）の任
意の種から得られ得る。特定の種は、哺乳動物であり得る。本明細書中に使用さ
れる場合、「哺乳動物」は、本発明のＮＡＣが由来する種（例えば、ヒト、ラッ
ト、マウス、ウサギ、サル、ヒヒ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の部
分集合をいう。本明細書中における好ましいＮＡＣは、ヒトＮＡＣである。

【００６６】 本発明の１つの実施形態において、本明細書中に開示される本発明のＮＡＣを
コードするｃＤＮＡは、配列番号１、３および５のいずれかに示されるコード領
域と実質的に同じヌクレオチド配列を含む。本発明のタンパク質をコードする好
ましいｃＤＮＡ分子は、配列番号１、３および５のいずれかにおいて示されるコ
ード領域と同じヌクレオチド配列を含む。

【００６７】 本明細書中に使用されるように、用語「実質的に同じヌクレオチド配列」は、
参照ポリヌクレオチドに十分な同一性を有するＤＮＡをいい、その結果、それは
、穏やかにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチ
ドにハイブリダイズする。１つの実施形態において、参照ヌクレオチド配列と実
質的に同じヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号２、４、６、１０また
は１２のいずれかに示されるのと実質的に同じアミノ酸配列をコードする。別の
実施形態において、参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」
を有するＤＮＡは、参照ヌクレオチド配列に関して少なくとも６０％の同一性を
有する。参照ヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくと
も９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、の同一性を有するＤＮＡが、
好ましい。

【００６８】 本発明はまた、配列番号１、３および５において示される核酸とは異なる核酸
を包含するが、これは、同じ表現型を有する。表現型の類似した核酸もまた、「
機能的に等価な核酸」という。本明細書中で使用される場合、句「機能的に等価
な核酸」は、本明細書中で開示される核酸と同じタンパク質産物を産生するため
に、実質的に同じ様式で機能するだろうわずかに間接的な（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎ
ｔｉａｌ）および非間接的（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）配列バリエ
ーションにより特徴付けられる核酸を包含する。特に、機能的に等価な核酸は、
本明細書中に開示される核酸によりコードされるのと同じかまたは保存的アミノ
酸改変体を有するポリペプチドをコードする。例えば、保存的改変体としては、
非極性残基の、別の非極性残基での置換、または荷電残基の、類似の荷電残基で
の置換が挙げられる。これらの改変体としては、タンパク質の３次構造を実質的
に変更しない、当業者により認識される改変体が挙げられる。

【００６９】 遺伝的コードの縮重により、指定されたハイブリダイゼーション条件下で、本
発明の核酸に必ずしもハイブリダイズしないＮＡＣポリペプチドをコードする核
酸がさらに提供される。本発明のＮＡＣをコードする好ましい核酸は、配列番号
２、４、６、１０または１２に示されるのと実質的に同じアミノ酸配列をコード
するヌクレオチドで構成される。

【００７０】 従って、本発明ＮＡＣをコードする例示的な核酸が、以下から選択され得る： （ａ）配列番号２、４、６、１０または１２に示されるアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ、 （ｂ）穏やかなストリンジェント条件下で、（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズ
するＤＮＡであって、ここで上記ＤＮＡは、生物学的に活性なＮＡＣをコードす
る、ＤＮＡ、または （ｃ）（ｂ）に関して縮重したＤＮＡであって、上記ＤＮＡは、生物学的に活
性なＮＡＣをコードする、ＤＮＡ。

【００７１】 ハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡに天然に存在する結合に類似した水
素結合を介して、核酸の相補鎖（すなわち、センス鎖：アンチセンス鎖またはプ
ローブＤＮＡ：標的ＤＮＡ）の互いの結合をいう。所定のプローブを、標的ＤＮ
Ａとハイブリダイズするために使用されるストリンジェンシーレベルは、当業者
により容易に変更され得る。

【００７２】 句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、その条件下でポリ核酸
（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）のハイブリッドが安定である条件をいう
ために本明細書中で使用される。当業者に周知であるように、ハイブリッドの安
定性は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔ_m）に反映される。一般に、ハイブリ
ッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。代表的に、ハ
イブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件化で行われ、続いて
様々であるが高いストリンジェンシーで洗浄する。ハイブリダイゼーションスト
リンジェンシーに対する参照は、このような洗浄条件に関する。

【００７３】 本明細書中で使用する場合、句「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション」は、標的ＤＮＡが、その標的ＤＮＡに対して約６０％同一性、好まし
くは約７５％同一性、より好ましくは約８５％同一性を有する（標的ＤＮＡに対
して約９０％を超える同一性を有することが特に好ましい）相補核酸を結合する
ことを可能にする条件をいう。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は
、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（
４２℃）中でハイブリダイゼーションし、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％Ｓ
ＤＳ（６５℃）中で洗浄することに等しい条件である。

【００７４】 句「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、０．０１８Ｍ Ｎａ
Ｃｌ（６５℃）中で安定なハイブリッドを形成するこれらの核酸配列のみのハイ
ブリダイゼーションを可能にする（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ Ｎ
ａＣｌ（６５℃）中で安定ではない場合、本明細書中で意図されるように、ハイ
ブリッドは、高ストリンジェンシー条件下では安定ではない）条件をいう。高ス
トリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、
５×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ（４２℃）中でハイブリダイゼーションし、続
いて０．１×ＳＳＰＥ、そして０．１％ＳＤＳ（６５％）中で洗浄することによ
り提供され得る。

【００７５】 句「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、１０％ホルムアミ
ド、５×デンハート溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ（４２℃）中でハイ
ブリダイゼーションし、続いて１×ＳＳＰＥ、そして０．２％ＳＤＳ（５０℃）
中で洗浄することに等価な条件をいう。デンハート溶液およびＳＳＰＥ（例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）が、他の適切なハイブリ
ダイゼーション緩衝液として当業者に周知である。

【００７６】 本明細書中で使用される場合、用語「変性する」とは、参照核酸（例えば、配
列番号１、３および５）からの少なくとも１つのヌクレオチドが異なるが、参照
核酸として同じアミノ酸をコードするコドンをいう。例えば、トリプレット「Ｕ
ＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」により特定されるコドンは、
これらの４つ全てのコドンが、アミノ酸セリンをコードするので、互いに関して
変性される。

【００７７】 本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、中程度のストリンジェン
ト、好ましくは高ストリンジェンシー（配列番号１、３および５に記載される核
酸配列の、実質的に配列全体、または実質的な部分（すなわち、代表的には少な
くとも１５〜３０ヌクレオチド）に対する条件）下でハイブリダイズする。

【００７８】 本発明の核酸は、配列番号１、３および５の種々の領域由来のオリゴヌクレオ
チドプライマーなどを使用するＰＣＲ増幅を使用して、当該分野で周知の種々の
方法（例えば、本明細書中に記載される方法）により生成され得る。

【００７９】 本発明のさらなる実施形態に従って、必要に応じて標識されたＮＡＣコードｃ
ＤＮＡまたはそれらのフラグメントは、新規ＮＡＣをコードするさらなる核酸配
列についてライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー
など）をプロービングするために使用され得る。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリー
を含む適切な哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーの構築物は、当該分野で周知である
。このようなｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、初め、低ストリンジェ
ンシー条件下で行われ、これは、約４２℃未満の温度、約５０％未満のホルムア
ミド濃度、および中程度〜低い塩濃度を含む。

【００８０】 現在好ましい、プローブべーススクリーニング条件は、約３７℃の温度、約２
０％のホルムアミド濃度および約５×標準生理食塩水クエン酸（ＳＳＣ；２０×
ＳＳＣは、３Ｍの塩化ナトリウム、０．３Ｍ クエン酸ナトリウムを含む（ｐＨ
７．０））の塩濃度を含む。このような条件は、完全な相同性無しで、プローブ
配列と実質的な程度の類似性を有する配列の同定を可能にする。句「実質的な類
似性」は、少なくとも５０％相同性を共有する配列をいう。このプローブと低い
程度の相同性を有する配列に対して識別する間、好ましくは、プローブと少なく
とも７０％相同性を有する配列の同定を可能にするハイブリダイゼーション条件
が選択される。結果として、配列番号１、３および５と実質的に同じヌクレオチ
ド配列を有する核酸が得られる。

【００８１】 本明細書中で使用される場合、核酸「プローブ」は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡ、またはそれらのアナログをいい、このアナログは、少なくとも１５、少な
くとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくと
も３００、少なくとも４００または少なくとも５００連続する塩基を含むヌクレ
オチドの配列を有し、これらの塩基は、配列番号１、３および５のいずれかに記
載の任意の連続する塩基と同じ（または相補体）である。プローブを構築するた
めのこれらの配列に由来する好ましい領域は、配列番号１、３および５の３’ま
たは５’コード領域を含む。さらに、本発明ＮＡＣのｃＤＮＡコード領域全体ま
たは配列番号１、３または５に対応する配列全体は、プローブとして使用され得
る。プローブは、本明細書中以下に記載されるように当該分野で周知の方法によ
り標識され得、そして種々の診断キットにおいて使用され得る。

【００８２】 本明細書中で使用される場合、それらの種々の文法的形態の用語「標識」およ
び「表示手段」は、検出可能なシグナルの生成に直接または間接的のいずれかで
関与する単一の原子および分子をいう。任意の標識または表示手段は、本発明の
核酸プローブ、発現されたタンパク質、ポリペプチドフラグメントまたは抗体分
子に連結され得る。これらの原子または分子は、単独またはさらなる試薬と共に
使用され得る。このような標識は、臨床的診断化学においてそれ自体周知である
。

【００８３】 標識手段は、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する変
性を伴わずに、抗体または抗原に化学的に結合する蛍光標識剤であり得る。免疫
蛍光分析技術の記載は、ＤｅＬｕｃａ，「Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ，Ｍａｒｃｈ
ａｌｏｎｉｓら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，１８９〜２３
１頁（１９８２）（これは、本明細書中で参考として援用される）に見出される
。

【００８４】 １つの実施形態では、表示群は、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなど）である。別の実施形態では、放
射活性要素は、使用される標識剤である。基質への標識の連結（すなわち、核酸
、抗体、ポリペプチドおよびタンパク質の標識化）は、当該分野で周知である。
例えば、本発明の抗体は、培養媒地中に提供された放射性標識されたアミノ酸の
代謝的取り込みにより標識され得る。例えば、Ｇｒａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，７３：３〜４６（１９８１）を参照のこと。活性化された官能
基によるタンパク質結合体化またはカップリングの従来手段は、特に、適用可能
である。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第８
巻，補遺，７：７〜２３（１９７８）、Ｒｏｄｗｅｌｌら，Ｂｉｏｔｅｈ．３：
８８９〜８９４（１９８４）および米国特許第４，４９３，７９５号を参照のこ
と。

【００８５】 また、ｍＲＮＡの翻訳を防止するために、ＮＡＣポリペプチドをコードするｍ
ＲＮＡの全長または任意の部分と特異的に結合し得る配列を有するアンチセンス
核酸も提供される。このアンチセンス核酸は、ＮＡＣポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡの配列の任意の部分と特異的に結合し得る配列を有し得る。本明細書中
で使用される場合、句「特異的に結合する」とは、相補核酸配列を認識してそし
て相補塩基対の間の水素結合の形成を介してそれと二重ヘリックスセグメントを
形成する核酸配列の能力を含む。アンチセンス核酸の例は、ヌクレオチドの化学
的アナログを含むアンチセンス核酸である。

【００８６】 上記のように、転写を妨害するために、細胞膜を通過しそしてＮＡＣポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡと特異的に結合することによりＮＡＣポリペプチドの
発現を減少させるに有効な量のアンチセンス核酸と、細胞膜を通過し得る受容可
能な疎水性キャリアとを含む組成物はまた、本明細書中に提供される。例えば、
米国特許第５，３３４，７６１号；同第４，８８９，９５３号；同第４，８９７
，３５５号などにおいて、適切な疎水性キャリアが、記載される。細胞膜を通過
し得る受容可能な疎水性キャリアはまた、選択された細胞型について特異的なレ
セプターに結合し、そしてこれにより選択された細胞型の細胞により取り込まれ
る構造を含み得る。この構造は、細胞型特異的レセプターに結合することが公知
であるタンパク質の部分で有り得る。

【００８７】 アンチセンス核酸は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻
害するために有用である。合成オリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学
構造は、ＮＡＣポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合しそしてｍＲＮＡの翻
訳を阻害するように設計され、そしてこれは、組織サンプルまたは被検体におけ
るＮＡＣ関連遺伝子の発現を阻害するための組成物として有用である。

【００８８】 本発明の別の実施形態に従って、キットは、少なくとも１つの本発明のプロー
ブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むＮＡＣ遺伝子における、変異、重複、
欠失、再配列、および異数性を検出するために提供される。

【００８９】 本発明は、これらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する合成
アンチセンス核酸組成物（本明細書中以後、ＳＡＮＣ）を使用することにより、
ＮＡＣポリペプチドの発現のレベルを調節するための手段を提供する。ｍＲＮＡ
を認識し、そして選択的に結合するように設計された合成オリゴヌクレオチドま
たは他のアンチセンス核酸の化学構造は、配列番号１、３および５に記載される
ヌクレオチド配列を含む、ＮＡＣコード鎖の全長または部分に相補的であるよう
に構成される。ＳＡＮＣは、注射による被検体への投与のために血液流中または
実験室の細胞培養条件で安定であるように設計される。ＳＡＮＣは、細胞の細胞
質に入るために、例えば、小さな疎水性ＳＡＮＣ化学構造を設計することによる
か、またはＳＡＮＣを認識しそして細胞へ輸送する細胞における特異的な輸送系
によって、ＳＡＮＣが細胞膜を通過することを可能にするＳＡＮＣの物理的およ
び化学的特性により細胞膜を通過し得るように設計される。さらに、ＳＡＮＣは
、選択細胞集団内のみにＳＡＮＣを結合させそしてとり込ませる特異的な細胞の
取り込み機構により認識されるようにＳＡＮＣを標的化することにより、特定の
選択された細胞集団のみへの投与のために設計され得る。特定の実施形態では、
ＳＡＮＣは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【００９０】 例えば、ＳＡＮＣは、上で議論したように、特定の細胞型のみにおいて見出さ
れるレセプターに結合するように設計され得る。ＳＡＮＣはまた、標的ｍＲＮＡ
配列を認識しそして選択的に結合するように設計され、これは、配列番号１、３
および５に示される配列内に含まれる配列に対応し得る。ＳＡＮＣは、例えば、
ＲＮａｓｅＩ消化によるか、または転写調節因子もしくはリボソームの結合を阻
害することにより、ｍＲＮＡの標的配列の翻訳を阻害することによるか、または
他の化学酵構造（例えば、リボザイム配列または標的ｍＲＮＡを分解または化学
的に改変のいずれかをする反応性化学基）の包含によって、ｍＲＮＡへ結合する
ことおよびｍＲＮＡの変性を誘導することにより、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化
するように設計される。ＳＡＮＣは、ｍＲＮＡ標的に指向するように設計される
場合、このような特性が可能であることが示された（Ｃｏｈｅｎら、ＴＩＰＳ、
１０：４３５（１９８９）およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒｉａｎ
，Ｊａｎｕａｒｙ（１９９０）４０頁（両方とも本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと）。

【００９１】 本発明のなお別の実施形態に従って、適切な宿主細胞中で上記の核酸配列を発
現させることにより本発明のＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘの組換え産生のための方
法が提供される。本明細書中に記載されるＮＡＣを産生するために適切である組
換えＤＮＡ発現系は、当該分野で周知である。例えば、上記のヌクレオチド配列
は、さらなる操作のためにベクターへ組み込まれ得る。本明細書中で使用される
場合、ベクター（またはプラスミド）は、それらの発現または複製のいずれかの
ために細胞へ異種ＤＮＡを導入するために使用される別個のエレメントをいう。

【００９２】 適切な発現ベクターは、当該分野で周知であり、そして制御配列（例えば、こ
のようなＤＮＡの発現を制御し得るプロモーター領域）に作動可能に連結された
ＤＮＡを発現し得るベクターを含む。従って、発現ベクターは、組換えＤＮＡま
たはＲＮＡ構築物（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または適
切な宿主細胞への導入に際して挿入されたＤＮＡの発現を生じる他のベクター）
をいう。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、そして真核細胞および／
もしくは原核細胞において複製されるベクター、ならびにエピソームのままであ
るベクターまたは宿主細胞ゲノムへ組み込まれたベクターを含む。

【００９３】 原核細胞形質転換ベクターは、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては
、ｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔおよびファージΛＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）などが挙げられる。他の適切なベクターおよび
プロモーターは、米国特許第４，７９８，８８５号（１９８９年１月１７日発行
）（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に詳細に記載
される。

【００９４】 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換に適切な他のベクターとしては、ｐＥＴ発現ベク
ター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国特許４，９５２，４９６号を参照のこと）、例えば
、ｐＥＴ１１ａ（Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ
ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサ遺伝子を含む）；およびｐＥＴ
１２ａ−ｃ（Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびＥ．ｃｏｌｉ
ｏｍｐＴ分泌シグナルを含む）が挙げられる。別の適切なベクターには、ｐＩＮ
−ＩＩＩｏｍｐＡ２（Ｄｕｆｆａｕｄら、Ｍｅｔ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
，１５３：４９２−５０７，１９８７）（ｌｐｐプロモーター、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーターオペレーター、ｏｍｐＡ分泌シグナル、およびｌａｃリプレッサ遺伝
子を含む）がある。

【００９５】 本発明の別の実施形態に従って、本発明の核酸分子（すなわち、ＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む「組換え細胞」が提供される。適切な宿主細胞（好
ましくは、細菌細胞、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換する方法、
ならびに異種タンパク質をコードする遺伝子を含むこの細胞を培養するために適
用可能な方法は、当該分野で一般的に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ、Ｙｏｒｋ、
ＵＳＡ（１９８９）を参照のこと。

【００９６】 形質転換の例示的な方法には、例えば、プラスミド、ウイルス、または細菌フ
ァージベクターを使用する形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレー
ション、リポフェクチンなどが挙げられる。異種ＤＮＡは、必要に応じて、その
染色体外維持を可能にする配列を含むか、またはこの異種ＤＮＡは、宿主のゲノ
ムに一体化され得る（宿主において安定な維持を確実にするための代替の手段と
して）。

【００９７】 本発明の実施における使用に意図される宿主生物には、異種タンパク質の組換
え産生が、実行される生物が挙げられる。このような宿主生物の例としては、細
菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ；例えば、米国特許第
４，８８２，２７９号、同第４，８３７，１４８号、同第４，９２９，５５５号
および同第４，８５５，２３１号を参照のこと）、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥ
Ｋ２９３、ＣＨＯおよびＬｔｋ^-細胞）、昆虫細胞などが挙げられる。現在好ま
しい宿主生物は、細菌である。最も好ましい細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

【００９８】 １つの実施形態において、本発明のＮＡＣをコードする核酸は、当該分野で周
知の適切なウイルスベクターを使用してインビボまたはインビトロのいずれかで
哺乳動物細胞に送達され得る。適切なレトロウイスルベクター（「遺伝子治療」
法のために特異的に設計される）は、例えば、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２０５２６６
およびＷＯ９２１４８２９に記載され、これは、核酸をヒト細胞に効率的に導入
するための方法についての記載を提供する。さらに、本発明のＮＡＣのインビボ
発現を制限または減少させることが望ましい場合、本発明の核酸のアンチセンス
鎖の導入が意図される。

【００９９】 例えば、本発明の１つの実施形態において、アデノウイルス−トランスフェリ
ン／ポリリジン−ＤＮＡ（ＴｆＡｄｐｌ−ＤＮＡ）ベクター複合体（Ｗａｇｎｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：６０９９−６
１０３（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１
４７−１５４（１９９２）；Ｇａｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：１
４−２４（１９９３））を使用して、異種ＮＡＣ核酸を哺乳動物細胞に形質導入
する。本明細書中に記載される任意のプラスミド発現ベクターは、ＴｆＡｄｐｌ
−ＤＮＡ複合体において使用され得る。

【０１００】 本発明のなお別の実施形態に従って、本発明のＮＡＣポリペプチドと特異的な
反応性を有する抗ＮＡＣ抗体が提供される。本発明はまた、抗ＮＡＣβ抗体、抗
ＮＡＣγ抗体、抗ＮＡＣδ抗体、抗ＮＡＣβ−Ｘ１抗体、または抗ＮＡＣγ／δ
−Ｘ１抗体を提供する。本発明の抗体がＮＡＣの特定の型においてのみ提示され
るエピトープに特異的であり得るか、または一つより多い型のＮＡＣに共通する
エピトープに特異的であり得る。例えば、抗ＮＡＣδ抗体は、ＮＡＣδにのみ特
異的であり得るか、またはＮＡＣファミリーの一つより多いメンバーに特異的で
あり得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、その最も広い意味で
使用されてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに少なくとも
約１×１０⁵Ｍ−１の特定の抗原に対して特異的結合活性を保持する抗体のポリ
ペプチドフラグメントを含む。当業者は、例えば、抗ＮＡＣβ抗体フラグメント
または抗ＮＡＣγ抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖお
よびＦｄフラグメント）は、ＮＡＣβまたはＮＡＣγのそれぞれに特異的結合活
性を保持し得、従って、抗体の定義内に含まれる。さらに、本明細書中で使用さ
れる用語「抗体」は、天然の抗体ならびに非天然の抗体および結合活性を保持す
る抗体のフラグメントを含む。このような非天然の抗体は、固相ペプチド合成を
使用して構築され得るか、組換え的に産生され得るか、または例えば、Ｈｕｓｅ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）（これは、本明
細書中で参考として援用される）に記載されるように可変重鎖および可変軽鎖か
らなる組換えライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。

【０１０１】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、タンパク質またはその部分を抗原と
して使用して、当該分野で公知の方法によって産生され得る。例えば、ポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によって産生さ
れ得、これは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）（これは、本明細書中で参考として援
用される）に記載される。本発明のポリペプチドは、このような抗体を生成する
免疫原として使用され得る。あるいは、合成ペプチドが、（市販の合成機を使用
して）調製され得、免疫原として使用され得る。アミノ酸配列は、それらが対応
するポリペプチドの疎水性ドメインまたは親水性ドメインをコードするか否かを
決定するために当該分野で周知の方法によって分析され得る。キメラ抗体、ヒト
化抗体、ＣＤＲ−グラフト化抗体または二官能性抗体のような改変された抗体は
また、当該分野で周知の方法によって産生され得る。このような抗体はまた、ハ
イブリドーマ、化学合成または組換え方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記
、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、に記載される）によって産生さ
れ得る。抗ペプチド抗体と抗融合タンパク質抗体の両方が、使用され得る。（例
えば、Ｂａｈｏｕｔｈら、Ｔｒｅａｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２
：３３８（１９９１）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９８９）（これらは、本明細書中において参考として援用
される）を参照のこと）。

【０１０２】 ＮＡＣに特異的なモノクローナル抗体の場合、本発明が、モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマおよび任意の他の型の細胞株を含むこともまた、本発
明において意図される。ハイブリドーマを調製する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、上記、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記に記載され；そし
てＮＡＣに特異的なモノクローナル抗体を産生する任意の非ハイブリドーマ細胞
株の調製が、当該分野で公知の方法、ならびに本明細書中において細菌細胞、酵
母細胞、両生動物細胞、哺乳動物細胞などのような細胞においてタンパク質発現
について記載される方法で実行され得る。

【０１０３】 このように産生される抗体は、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、身体サン
プル、例えば、組織または脈管流体に存在するＮＡＣのレベルを検出するための
診断方法およびシステムにおいて使用され得る。このような抗体はまた、本発明
のＮＡＣの免疫親和性またはアフィニティークロマトグラフィー精製に使用され
得る。さらに、組織または細胞中の本発明のＮＡＣタンパク質の存在を検出する
ための方法が、本発明で意図され、これは、細胞をＮＡＣポリペプチドに特異的
に結合する抗体と、抗体がＮＡＣポリペプチドに結合することを可能にする条件
下で接触させる工程、ＮＡＣポリペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程
、およびこれによって本発明のポリペプチドの存在を検出する工程を包含する。
このようなポリペプチドの検出に関して、抗体は、インビトロ診断方法またはイ
ンビボイメージング方法について使用され得る。

【０１０４】 サンプル中の標的ＮＡＣポリペプチドのインビトロ検出に有用な免疫学的手順
としては、検出可能な抗体を使用するイムノアッセイが挙げられる。このような
イムノアッセイには、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ、微蛍光アッセイ、凝
集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織学染色手
順（これらは、当該分野において周知である）が挙げられる。抗体は、当該分野
において周知の種々の手段によって検出可能にされ得る。例えば、検出可能なマ
ーカーは、抗体に直接的または間接的に付着され得る。有用なマーカーには、例
えば、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、色素原、お
よび化学発光標識が挙げられる。

【０１０５】 本発明の抗ＮＡＣ抗体は、生きた動物、ヒトまたはそれらから単離される生物
学的組織または流体中のＮＡＣポリペプチドの活性を調節するために本発明で使
用が意図される。用語「調節する」とは、本発明のＮＡＣタンパク質の生物学的
活性（例えば、ＣＡＲＤ含有タンパク質、ＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質を結合す
る能力）を増加（例えば、アゴニストを介して）または阻害（例えば、アンタゴ
ニストを介して）して、カスパーゼのようなプロテアーゼの活性を調節し、ＮＦ
−κＢの活性を調節し、そしてアポトーシスを調節する化合物の能力をいう。従
って、キャリア、および天然に存在するリガンドまたはＮＡＰを本発明のＮＡＣ
ポリペプチドへの結合から阻害するのに有効な量のＮＡＣポリペプチドに特異性
を有する抗体を含む組成物が本発明で意図される。例えば、配列番号２、４、６
、１０、または１２に記載されるアミノ酸配列を含む本発明のＮＡＣポリペプチ
ドのエピトープに指向されたモノクローナル抗体は、この目的のために有用であ
り得る。

【０１０６】 本発明はさらに、ＮＡＣポリペプチドをコードする外来性核酸を発現し得るト
ランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本明細書中で使用されるように、
句「外来性核酸」とは、宿主に対してネイティブでない核酸配列、またはそのネ
イティブな環境以外で宿主に存在する核酸（例えば、遺伝的に操作されたＤＮＡ
構築物の一部として）をいう。ＮＡＣの天然のレベルに加えて、本発明のＮＡＣ
は、トランスジェニック動物において（周知のノックアウトトランスジェニック
生物のように）過剰発現され得るか、または過小発現され得る。

【０１０７】 正常な活性でない（すなわち、ネイティブなＮＡＣを発現しない）ように変異
されたＮＡＣポリペプチドをコードする核酸を発現し得るトランスジェニック非
ヒト動物もまた提供される。本発明はまた、ＮＡＣポリペプチドをコードするｍ
ＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡ（これは、このＮＡＣポリペプチドをコ
ードするｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってその翻訳を減少する）に転
写されるように配置された、ＮＡＣポリペプチドをコードする核酸に相補的なア
ンチセンス核酸を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する
。核酸はさらに、誘導性プロモーターおよび／または組織特異的調節エレメント
を含み得、その結果、発現が誘導され得るか、または特定の細胞型に制限され得
る。核酸の例は、配列番号１、３、または５に示されるコード配列と実質的に同
じコード配列を有するＤＮＡまたはｃＤＮＡである。非ヒトトランスジェニック
哺乳動物の例は、トランスジェニックマウスである。組織特異性決定エレメント
の例は、メタロチオネインプロモーターおよびＬ７プロモーターである。

【０１０８】 ＮＡＣポリペプチドの生理学的および行動性の役割を解明する動物モデル系も
また提供され、ＮＡＣポリペプチドの発現が種々の技術を使用して改変されるト
ランスジェニック動物を作製することによって産生される。このような技術の例
としては、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染または当業者に周知
の他の手段によって、ＮＡＣポリペプチドをコードする正常なまたは改変型の核
酸を、適切に受精された胚に挿入してトランスジェニック動物を作製することが
挙げられる。（例えば、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ
ｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）を参照のこと
）。

【０１０９】 変異したまたは正常な型のＮＡＣ遺伝子の、トランスジェニック動物のネイテ
ィブな遺伝子座を用いる相同組換えを使用して、発現の調節またはＮＡＣポリペ
プチドの構造を変更することもまた、本発明において意図される。（Ｃａｐｅｃ
ｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５０（１９８９）；これらは本明細書中において参考
として援用される）を参照のこと。相同組換え技術は、当該分野で周知である。
相同組換えは、ネイティブ（内因性）遺伝子を組換えまたは変異遺伝子で置き換
えて、ネイティブ（内因性）タンパク質を発現し得ないが、例えば、ＮＡＣポリ
ペプチドの改変された発現を生じる変異されたタンパク質を発現し得る動物を作
製する。

【０１１０】 相同組換えとは対照的に、マイクロインジェクションは、宿主遺伝子を除去す
ることなく、遺伝子を宿主ゲノムに追加する。マイクロインジェクションは、内
因性ＮＡＣと外因性ＮＡＣとの両方を発現し得るトランスジェニック動物を作製
し得る。誘導性プロモーターは、核酸のコード領域に連結されてトランスジーン
の発現を調節するための手段を提供し得る。組織特異的調節エレメントは、トラ
ンスジーンの組織特異的発現を可能にするコード領域に連結され得る。トランス
ジェニック動物モデル系は、特定のリガンド（すなわち、ＮＡＣタンパク質応答
を活性化または阻害するアゴニストおよびアンタゴニスト）の同定について化合
物をインビボスクリーニングするのに有用である。

【０１１１】 本発明のさらなる実施形態は、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘ活性（例えば、ＮＡ
ＣまたはＣＡＲＤ−Ｘが一つ以上の異種タンパク質と会合する能力）を効果的に
変更し得る薬剤を同定するための方法を提供する。従って、本発明は、効果的な
薬剤（ＮＡＣのＮＡＣ会合タンパク質との会合、またはＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤ
−Ｘ会合タンパク質との会合（例えば、ＣＡＲＤ含有タンパク質および／または
ＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質との会合）を変更し得る）を同定するために有用な
スクリーニングアッセイを提供する。本発明のＮＡＣおよびＣＡＲＤ−Ｘタンパ
ク質は、アポトーシスに関係するタンパク質を調節する（例えば、実施例７．０
〜１３．０を参照のこと）ので、このような効果的な薬剤の同定は、アポトーシ
スのレベルの増加または減少によって特徴付けられる病理学的状態（例えば、癌
など）を有する被験体における細胞中のＮＡＣ結合タンパク質またはＣＡＲＤ−
Ｘ結合タンパク質によって媒介されるアポトーシスのレベルを調節するのに有用
であり得る。

【０１１２】 従って、本発明によれば、以下の方法：Ａｐａｆ−１媒介アポトーシスを調節
する方法、Ａｐａｆ−１誘導カスパーゼ活性化を調節する方法、およびＮｏｄ−
１誘導アポトーシスを調節する方法が提供され、これらの方法は、Ａｐａｆ−１
を、ＮＡＣ、またはそのＣＡＲＤドメインもしくはＮＢドメインを含むフラグメ
ントと接触させる工程を包含する。Ｂａｘ媒介アポトーシスを調節する方法、カ
スパーゼ媒介アポトーシスを調節する方法、およびＡｐａｆ−１のカスパーゼ−
９への結合を阻害する方法がまた提供され、これらの方法は、細胞を、ＣＡＲＤ
−ＸまたはＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメインに接触させる工程を包含する。

【０１１３】 さらに、本発明のＮＡＣタンパク質およびＣＡＲＤ−Ｘタンパク質は、ＣＡＲ
Ｄドメインを含むので、効果的な薬剤は、任意の他のＣＡＲＤドメイン活性に加
えて、これらのそれぞれのＣＡＲＤドメイン活性を調節するために有用であり得
る（例えば、実施例２．０および５．０−１３．０に記載の活性を参照のこと）
。これらのさらなるＣＡＲＤドメイン活性としては、影響を受けるカスパーゼが
アポトーシスに関与するのか、何らかの代替の細胞プロセス（例えば、タンパク
分解プロセシングおよび炎症性サイトカインの活性化）に関与するのかにかかわ
らず、例えば、ＮＦ−κＢ活性調節、サイトカインレセプターシグナル伝達、お
よびカスパーゼ活性化／阻害が挙げられる。

【０１１４】 本明細書中において使用される場合に、用語「薬剤」とは、ＮＡＣと異種タン
パク質との会合を変化させるか、あるいはＮＡＣが自己会合する能力を変化させ
るか、あるいはＮＡＣのヌクレオチド結合活性および／または加水分解活性を変
化させる可能性を有する、単純であるかまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプ
チド模倣物、タンパク質またはオリゴヌクレオチドのような、化学的分子あるい
は生物学的分子を意味する。さらに、用語「効果的な薬剤」とは、本明細書中に
おいて、実際に、ＮＡＣと異種タンパク質との会合を変化させ得るか、またはＮ
ＡＣが自己会合する能力を変化させ得るか、またはＮＡＣのヌクレオチド結合活
性および／もしくは加水分解活性を変化させ得る薬剤を意味するために使用され
る。例えば、効果的な薬剤は、抗ＮＡＣ抗体またはＮＡＣ関連タンパク質であり
得る。

【０１１５】 本明細書中において使用される場合に、用語「会合を変化させる」とは、特異
的に相互作用する２つのタンパク質間の会合が、効果的な薬剤の存在に起因して
、増加するかまたは減少するかのいずれかであることを意味する。ＮＡＣの、細
胞内の別のタンパク質との変化した会合の結果として、ＮＡＣまたはＮＡＣ関連
タンパク質の活性は、増加または減少され得、それによって、生物学的プロセス
（例えば、細胞におけるアポトーシスのレベル）を調節する。本明細書中におい
て使用される場合に、用語「活性を変化させる」とは、その薬剤が、細胞中のＮ
ＡＣの活性を増加または減少させ得、それによって、その細胞の生物学的プロセ
ス（例えば、細胞におけるアポトーシスのレベル）を調節することを意味する。
例えば、効果的な薬剤は、ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣ：ＮＢ−ＡＲＣ会合活性を、Ｎ
ＡＣとＣＡＲＤ含有タンパク質との会合に影響を与えることなく、増加または減
少させ得る。ＡＴＰ加水分解活性の調節は、ＮＡＣタンパク質が他のＮＢ−ＡＲ
Ｃ含有タンパク質（例えば、Ａｐａｆ−１）と会合する能力を調節し得、これに
よって、ＮＡＣとＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質との間のこのような会合によって
生じる任意のプロセスを調節する。同様に、用語ＮＡＣと別のタンパク質との「
会合を変化させる」とは、ＮＡＣに特異的に結合するタンパク質（すなわち、Ｎ
ＡＣ関連タンパク質）とＮＡＣとの間の会合を増加させることまたは減少させる
こと、あるいは他の様式で変化させることをいう。

【０１１６】 効果的な薬剤は、ＮＡＣが別のタンパク質と会合する能力を妨害することによ
って作用し得るか、またはＮＡＣ関連タンパク質との複合体からＮＡＣを解離さ
せることによって作用し得、ここで、結合したＮＡＣの遊離ＮＡＣに対する比は
、細胞における生物学的プロセス（例えば、アポトーシス）のレベルに関連する
。例えば、リガンドの、ＮＡＣ関連タンパク質への結合は、ＮＡＣ関連タンパク
質が、次に、ＮＡＣに結合することを可能にし得る。例えば、ＣＡＲＤ含有タン
パク質とＮＡＣとの会合は、ＮＡＣの、ＮＢ−ＡＲＣ：ＮＢ−ＡＲＣ会合活性の
活性化または阻害を生じ得る。効果的な薬剤の存在下では、ＮＡＣとＣＡＲＤ含
有タンパク質との会合は変化され得、これによって、細胞におけるカスパーゼの
活性化を変化させ得る。変化したカスパーゼ活性化の結果として、細胞における
アポトーシスのレベルは、増加または減少し得る。従って、ＮＡＣの別のタンパ
ク質との会合を変化させる効果的な薬剤の同定は、細胞におけるアポトーシスの
レベルを増加または減少させるための、効果的な薬剤の使用を可能にし得る。

【０１１７】 効果的な薬剤は、例えば、癌細胞のような細胞におけるアポトーシスのレベル
を増加させるために、有用であり得る。癌細胞は、その正常細胞の対と比較した
場合に、減少したレベルのアポトーシスを有することによって、特徴付けられる
。効果的な薬剤はまた、例えば、後天性免疫不全症候群のようなウイルス性疾患
を有する被験体において、Ｔリンパ球のような細胞におけるアポトーシスのレベ
ルを減少させるために、有用であり得る。この疾患は、正常なＴ細胞と比較した
場合に、感染したＴ細胞における増加したレベルのアポトーシスによって、特徴
付けられる。従って、効果的な薬剤は、増加または減少したアポトーシスによっ
て特徴付けられる病理を有する被験体において、アポトーシスのレベルを変化さ
せるための医薬として、有用であり得る。さらに、効果的な薬剤は、例えば、ア
ポトーシスのレベルを減少させるために使用され得、従って、培養物中のハイブ
リドーマ細胞のような細胞の生存時間を増加させ得る。インビトロで細胞の生存
を延長するための、効果的な薬剤の使用は、産業的な組織培養の適用において、
生物生成物の収率を有意に改善し得る。

【０１１８】 別のタンパク質のＮＢ−ＡＲＣドメインを結合する能力を欠くが、そのＣＡＲ
Ｄドメインを介して自己会合する能力または他のＣＡＲＤ含有タンパク質に結合
する能力を保持するＮＡＣは、効果的な薬剤の一例である。なぜなら、細胞にお
ける非ＮＢ−ＡＲＣ関連ＮＡＣの発現は、内因性ＮＡＣタンパク質の、それ自体
またはＮＡＣ関連タンパク質との会合を変化させ得るからである。

【０１１９】 従って、ＮＡＣの変異は、例えば、特定の細胞型において起こるＮＡＣ／ＮＡ
Ｃ関連タンパク質の正常レベルに依存して、効果的な薬剤であり得ることが理解
されるべきである。さらに、ＮＡＣの活性フラグメントは、その活性フラグメン
トが細胞におけるＮＡＣと別のタンパク質との会合を変化させ得ると仮定すれば
、効果的な薬剤であり得る。このような活性フラグメント（これは、約５アミノ
酸程度に小さなペプチドであり得る）は、例えば、ペプチドライブラリーをスク
リーニング（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号を参照
のこと、これは、本明細書中に参考として援用される）し、そしてＮＡＣ関連タ
ンパク質を結合し得るペプチドを同定することによって、同定され得る。

【０１２０】 同様に、ＮＡＣ関連タンパク質のペプチドまたはポリペプチド部分もまた、効
果的な薬剤であり得る。ＮＡＣ関連タンパク質のＣ末端ペプチドのようなペプチ
ドが、例えば、ＮＡＣへの結合に関して競合することによって、細胞におけるＮ
ＡＣとＣＡＲＤ含有タンパク質またはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質との会合を減
少させるために、有用であり得る。天然には存在しないペプチド模倣物もまた、
効果的な薬剤として有用であり得る。このようなペプチド模倣物としては、例え
ば、ペプトイド（これは、Ｎ置換グリシンを含むペプチド様配列である）または
オリゴカルバメートが挙げられ得る。ペプチド模倣物は、例えば、インビボにお
ける酵素的分解に対して増加した安定性を有することに起因して、効果的な薬剤
として特に有用であり得る。

【０１２１】 効果的な薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを、インビボで、２つ
のハイブリッド系を使用して実施し得るか、またはインビトロで、本明細書中に
開示されるように実施し得る。例えば、酵母２ハイブリッド系を使用して、薬剤
のパネルをスクリーニングし、ＮＳＣまたはＣＡＲＤ−Ｘと別のタンパク質との
会合を変化させる、効果的な薬剤を同定し得る。効果的な薬剤は、レポーター遺
伝子の変化したレベルの転写を検出することによって、同定され得る。例えば、
ＮＡＰおよびＮＡＣのハイブリッドによる、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス
作用性ドメインの結合に起因する、レポーター遺伝子の転写のレベルは、薬剤の
非存在下および存在下で、決定され得る。ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘと別のタン
パク質との間の会合を変化させる、効果的な薬剤は、この薬剤の非存在下での転
写のコントロールレベルと比較した場合に、レポーター遺伝子の比例的に変化し
たレベルの転写によって、同定され得る。

【０１２２】 当業者によって理解されるように、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘの活性を調節す
る薬剤を同定するためのアッセイ方法は、一般に、コントロールとの比較を必要
とする。例えば、ある型の「コントロール」は、薬剤に曝露された試験細胞また
は試験培養物と実質的に同じに処理された細胞または培養物であり、「コントロ
ール」の細胞または培養物は、その薬剤に曝露されていないことで区別する。別
の型の「コントロール」の細胞または培養物は、「コントロール」の細胞または
培養物はネイティブタンパク質を発現しないことを除いて、トランスフェクトさ
れた細胞と同一の細胞または培養物であり得る。従って、薬剤に対するトランス
フェクトされた細胞の応答が、同じ反応条件下での同じ薬剤に対する「コントロ
ール」の細胞または培養物の応答（またはそれがないこと）と、比較される。同
様に、「コントロール」は、薬剤に曝露されていないか、または特定のネイティ
ブタンパク質を発現しない細胞の、抽出物（部分的に精製されたかまたは精製さ
れていないもの）であり得る。「コントロール」はまた、ＮＡＣタンパク質と特
異的には会合しないことが公知である、単離された化合物（例えば、タンパク質
（例えば、実施例において使用されるようなＳｋｐ−１））であり得る。

【０１２３】 従って、本発明の別の実施形態によれば、ＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤを含有
するタンパク質（ＮＡＣ）と、ＮＡＣ関連タンパク質（ＮＡＰ）との会合を変化
させる、効果的な薬剤を同定する方法が提供され、この方法は、以下： ａ）このＮＡＣタンパク質およびＮＡＰタンパク質を、これらのＮＡＣタンパ
ク質とＮＡＰタンパク質とが会合し得る条件下で、ＮＡＣタンパク質とＮＡＰタ
ンパク質との会合を変化させ得ると疑われる薬剤と接触させる工程；ならびに ｂ）このＮＡＣタンパク質とＮＡＰタンパク質との変化した会合を検出する工
程であって、ここで、この変化した会合が、効果的な薬剤を同定する、工程、 を包含する。

【０１２４】 本明細書中において使用される場合に、句「ＮＡＣ関連タンパク質」（ＮＡＰ
）とは、本発明のＮＡＣと直接的にかまたは間接的に結合するタンパク質をいい
、例えば、実施例２．０−９．０に記載されるＮＡＣ相互作用タンパク質および
／またはＮＡＣ結合タンパク質である。

【０１２５】 ＮＡＣタンパク質とＮＡＰタンパク質との変化した会合を検出するための、当
該分野において周知の方法（例えば、タンパク質：タンパク質結合、タンパク質
分解またはアポトーシス活性を測定すること）を、本明細書中に記載されるバイ
オアッセイにおいて使用して、ＮＡＣタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニ
ストとして、薬剤を同定し得る。本明細書中に記載されるように、ＮＡＣタンパ
ク質は、自己会合する能力を有する。従って、ＮＡＣタンパク質ＮＡＰの会合を
変化させる効果的な薬剤を同定するための方法はまた、ＮＡＣが自己会合する能
力を変化させる効果的な薬剤を同定するために、有用である。

【０１２６】 同様に、ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質は、他のＣＡＲＤ含有タンパク質と相互作用
する能力、および自己会合する能力を有する。従って、ＮＡＣと別のタンパク質
との会合を変化させる効果的な薬剤を同定するための方法はまた、ＣＡＲＤ−Ｘ
が自己会合するか、または異種ＣＡＲＤ含有タンパク質と会合する能力を変化さ
せる効果的な薬剤を同定するために、有用である。本発明の別の実施形態によれ
ば、ＣＡＲＤ含有ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質と、ＣＡＲＤ−Ｘ関連タンパク質（Ｃ
ＡＰ）との会合を変化させる効果的な薬剤を同定する方法が提供され、この方法
は、以下： ａ）このＣＡＲＤ−Ｘタンパク質およびＣＡＰタンパク質を、これらのＣＡＲ
Ｄ−Ｘタンパク質とＣＡＰタンパク質とが会合し得る条件下で、ＣＡＲＤ−Ｘタ
ンパク質とＣＡＰタンパク質との会合を変化させ得ると疑われる薬剤と接触させ
る工程；ならびに ｂ）このＣＡＲＤ−ＸとＣＡＰタンパク質との変化した会合を検出する工程で
あって、ここで、この変化した会合が、効果的な薬剤を同定する、工程、 を包含する。

【０１２７】 本明細書中において使用される場合に、句「ＣＡＲＤ−Ｘ関連タンパク質」（
ＣＡＰ）とは、本発明のＣＡＲＤ−Ｘに直接的にかまたは間接的に結合するタン
パク質をいい、例えば、実施例３．０および１０．０−１３．０に記載される、
ＣＡＲＤ−Ｘ相互作用タンパク質および／またはＣＡＲＤ−Ｘ結合タンパク質で
ある。

【０１２８】 本明細書中において使用される場合に、「ＮＡＣタンパク質とＮＡＰタンパク
質とが会合し得る条件」または「ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質とＣＡＰタンパク質と
が会合し得る条件」とは、ＮＡＣ：ＮＡＰまたはＣＡＲＤ−Ｘ：ＣＡＰが特異的
に会合する環境条件をいう。このような条件は、代表的に、水性条件であり、３
．０と１１．０との間のｐＨおよび１００℃未満の温度を有する。好ましくは、
これらの条件は、１Ｍ ＮａＣｌに等価未満の塩濃度、５．０と９．０との間の
ｐＨ、および０℃と５０℃との間の温度を有する、水性条件である。最も好まし
くは、この条件は、正常な酵母または哺乳動物細胞の生理学的条件、または免疫
沈降およびＧＳＴ−ＮＡＣ：ＮＡＰ会合アッセイなどのようなインビトロアッセ
イを実施するために好ましい条件の範囲である。

【０１２９】 本発明のなお別の実施形態においては、ＮＡＣタンパク質またはＣＡＲＤ−Ｘ
タンパク質によって媒介される、カスパーゼ調節活性を調節するための方法が提
供され、この方法は、以下： ＮＡＣタンパク質またはＣＡＲＤ−Ｘタンパク質を、上記バイオアッセイによ
り同定されたアゴニストまたはアンタゴニストの、効果的な調節する量と接触さ
せる工程、 を包含する。

【０１３０】 本発明はまた、インビトロスクリーニングアッセイを提供する。このようなス
クリーニングアッセイは、これらが自動化され得る点で特に有用であり、これは
、ＮＡＣおよびＮＡＰタンパク質、またはＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＰの結合、あ
るいはＮＡＣもしくはＣＡＲＤ−Ｘの活性を効果的に変化して、それによってア
ポトーシスを調節する薬剤を同定するための、例えば、無作為もしくは理論的に
設計された薬剤（例えば、薬物、ペプチド模倣物、またはペプチド）の高スルー
プットスクリーニングを可能にする。インビトロスクリーニングアッセイは、例
えば、ＮＡＣまたはＮＡＣ融合タンパク質（例えば、ＮＡＣ−グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＳＴ／ＮＡＣ；実施例を参照のこと）
を使用し得る。インビトロスクリーニングアッセイにおける使用のために、ＮＡ
ＣまたはＮＡＣ融合タンパク質は、固体基板に対する親和性ならびにＮＡＣ関連
タンパク質と結合する能力を有するべきである。例えば、ＮＡＣがこのアッセイ
に使用される場合、固体基板は、共有結合した抗ＮＡＣ抗体を含み得る。あるい
は、ＧＳＴ／ＮＡＣ融合タンパク質は、このアッセイで使用され得、そして固体
基板は、共有結合されたグルタチオンを含み得、これは、ＧＳＴ／ＮＡＣ融合タ
ンパク質のＧＳＴ成分によって結合される。同様に、ＮＡＣ関連タンパク質、ま
たはＧＳＴ／ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＧＳＴ／ＮＢ−ＡＲＣ含有タンパ
ク質の融合タンパク質は、本明細書中に記載されるようなインビトロアッセイに
おいて使用され得る。

【０１３１】 当業者は、ＣＡＲＤ−Ｘおよび／またはＣＡＲＤ−Ｘ関連タンパク質（ＣＡＰ
）が、本明細書中に記載されるスクリーニング方法、診断方法および治療方法に
おいてＮＡＣおよびＮＡＰに対するアナログを使用し得ることを認識する。

【０１３２】 インビトロスクリーニングアッセイは、ＮＡＣまたはＮＡＣ融合タンパク質を
、例えば、固体支持体に結合させ、次いでＮＡＣ関連タンパク質および試験され
る試薬を添加することによって、実施され得る。試薬を含まないコントロール反
応は、並行に実施され得る。適切な条件（これは、例えば、特定のＮＡＣおよび
ＮＡＣ関連タンパク質の結合を可能にする、適切な緩衝液濃度およびｐＨならび
に時間および温度を含む）下でのインキュベーション後、試薬の非存在下および
試薬の存在下で結合されたタンパク質の量が、決定され得る。ＮＡＣ関連タンパ
ク質のＮＡＣタンパク質との結合は、例えば、放射性核種または蛍光標識のよう
な検出可能な部分をＮＡＣ関連タンパク質に結合させ、固体支持体と結合した標
識の量を測定することによって検出され得、ここで、検出された標識の量は、Ｎ
ＡＣ関連タンパク質とＮＡＣタンパク質との結合の量を示す。有効な試薬は、コ
ントロールレベルの結合と比較した場合の、試薬の存在下における特定の結合量
を比較することによって決定され、ここで、有効な試薬は、ＮＡＣとＮＡＣ関連
タンパク質との結合を変化させる。このようなアッセイは、有効な試薬を検出す
るために、ペプチドライブラリーのような試薬のパネルをスクリーニングする際
に特に有用である。

【０１３３】 本発明はさらに、例えば遺伝子治療のために、ＮＡＣをコードする核酸を被験
体の細胞中に導入するための方法を提供する。ウイルスは、宿主防御機構をかわ
し、そして特定の細胞型を感染および伝播し得る、特殊化された感染試薬である
。ウイルスベースのシステムは、比較的高いレベルの異種核酸を種々の細胞へ導
入し得る利点を提供する。ＮＡＣタンパク質をコードする本発明の核酸を哺乳動
物細胞（例えば、脈管組織セグメント）へ導入するための適切なウイルスベクタ
ーは、当該分野で周知である。これらのウイルスベクターとしては、例えば、単
純疱疹ウイルスベクター（例えば、Ｇｅｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：
１６６７−１６６９（１９８８））、ワクシニアウイルスベクター（例えば、Ｐ
ｉｃｃｉｎｉら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５４５−５
６３（１９８７）；サイトメガロウイルベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｖｉｒ
ａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｙ．ＧｌｕｚｍａｎおよびＳ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ編、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．，１９８８、７８−８４頁）、モロニーマウ
ス白血病ウイルスベクター（Ｄａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ、８５：６４６９（１９８０））、アデノウイルスベクター（例
えば、Ｌｏｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８１
：３６５５−３６５９（１９８４）；Ｊｏｎｅｓら、Ｃｅｌｌ、１７：６８３−
６８９（１９７９）；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１
６−６２６（１９８８）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，ＵＳＡ、８９：６０９４−６０９８（１９９２）；Ｇｒａｈａｍら、Ｍ
ｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１０９−１２７（１９９１））、アデノ随伴ウ
イルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第４，４０５，７
１２号および同第４，６５０，７６４号を参照のこと）などが挙げられる。特に
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベ
クターである。

【０１３４】 本明細書中における使用に適したレトロウイルスベクターは、例えば、米国特
許第５，２５２，４７９号、およびＷＩＰＯ刊行物のＷＯ ９２／０７５７３、
ＷＯ ９０／０６９９７、ＷＯ ８９／０５３４５、ＷＯ ９２／０５２６６お
よびＷＯ ９２／１４８２９（本明細書中に参考として援用される）に記載され
、これらは、このようなレトロウイルスベクターを用いて核酸をヒト細胞へ効果
的に導入するための方法の説明を提供する。他のレトロウイルスベクターとして
は、例えば、マウス乳房腫瘍ウイルスベクター（例えば、Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒ
ｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６５５−９６
５９ （１９８８））などが挙げられる。

【０１３５】 詳細には、特定の細胞型に対するウイルスベクターの特異性を使用して、予め
決定された細胞型を標的化し得る。従って、ウイルスベクターの選択は、ある部
分、標的化される細胞型に依存する。例えば、神経変性疾患が、この疾患に冒さ
れた神経細胞におけるＮＡＣのレベルを増加させることによって処置される場合
、神経細胞を標的化するウイルスベクターが、使用され得る。単純疱疹ウイルス
由来のベクターは、神経細胞を標的化するウイルスベクターの１つの例である（
Ｂａｔｔｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：９４１−９５１（１９９
３）（これは、本明細書中に参考として援用される））。同様に、造血系の疾患
状態または病的状態が処置される場合、特定の血球またはその前駆体細胞に対し
て特異的であるウイルスベクターが、使用され得る。ヒト免疫欠損ウイルスに基
づくベクターは、このようなウイルスベクターの１つの例である（Ｃａｒｒｏｌ
ｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７Ｅ：２４１（１９９３）（これは、
本明細書中に参考として援用される））。さらに、ウイルスベクターまたは他の
ベクターが構築されて、組織特異的なプロモーターまたはエンハンサーをこのベ
クターへ組み込むことによって組織特異的様式でＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘをコ
ードする核酸を発現し得る（Ｄａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５（１９９２）（これは、本明細書中に
参考として援用される））。

【０１３６】 遺伝子治療に関して、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘをコードする核酸あるいはア
ンチセンスヌクレオチド配列を含むベクターは、種々の方法によって被験体へ投
与され得る。例えば、ウイルスベクターが使用される場合、投与はこのベクター
の標的特異性をうまく利用し得る。このような場合、ベクターを疾患部位に局所
的に投与する必要はない。しかし、局所投与は、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘをコ
ードする核酸を投与する特に効果的な方法であり得る。さらに、投与は、被験体
へ静脈内注射もしくは皮下注射を介し得る。注射の後、ウイルスベクターは、こ
れらが感染に対する適切な標的特異性を伴って宿主細胞を認識するまで、循環さ
れる。ウイルスベクターの髄液への注射はまた、例えば、神経変性疾患の処置に
おいて、効果的な投与形式であり得る。

【０１３７】 レセプター媒介ＤＮＡ送達手段はまた、組織特異的リガンドまたは抗体（これ
は、架橋分子を介して核酸分子と非共有結合的に複合体化する）を用いて、組織
特異的な様式でＮＡＣをコードする核酸分子を細胞へ送達するために使用され得
る（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９
９２）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される））。裸
の核酸分子、または例えばカチオン性リポソームにカプセル化された核酸分子の
直接注射はまた、インビボでの非分裂細胞または分裂細胞への安定な遺伝子移入
のために使用され得る（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１
７４８（１９９３）（これは、本明細書中に参考として援用される））。さらに
、ＮＡＣをコードする核酸分子は、粒子ボンバードメント方法を用いて種々の組
織に移入され得る（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０（１９９１）（これは、本明細書中に参
考として援用される））。このような核酸分子は、転写および翻訳に必要とされ
る適切なヌクレオチド配列に結合され得る。

【０１３８】 ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘをコードする核酸の特に有用な投与様式は、疾患状
態または病的状態の部位における局所的な直接接種によるものである。局所投与
は、有利であり得る。なぜなら、希釈効果がなく、従って、大多数の標的細胞が
核酸分子と接触する可能性が、増加する。従って、局所接種は、他の投与形態で
必然的な標的化の必要条件を軽減し得、そして、所望する場合、接種された領域
において全ての細胞型を感染するベクターが使用され得る。接種された領域内の
特定の細胞サブセットのみにおける発現が所望される場合、プロモーター、エン
ハンサーまたは所望される細胞サブセットに特異的な他の発現エレメントが、こ
のような核酸分子に連結され得る。この核酸分子および調節エレメントを含むベ
クターは、ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミドなど
であり得る。リポソームのようなトランスフェクションビヒクルがまた使用され
て、非ウイルスベクターをレシピエント細胞へ導入し得る。このようなビヒクル
は、当該分野で周知である。

【０１３９】 本発明はまた、本明細書中に記載される治療方法を実施するために有用な治療
組成物を提供する。本発明の治療組成物（例えば、薬学的組成物）は、生理学的
に適合性なキャリアを、本発明のＮＡＣもしくはＣＡＲＤ−Ｘ（またはその機能
的フラグメント）、ＮＡＣもしくはＣＡＲＤ−Ｘ調節剤（例えば、本明細書中に
記載される方法によって同定された化合物（アゴニストまたはアンタゴニスト）
）、または活性成分としてこの治療組成物中で溶解するかまたは分散する（本明
細書中に記載されるような）抗ＮＡＣ抗体もしくは抗ＣＡＲＤ−Ｘ抗体と一緒に
含む。好ましい実施形態において、治療組成物は、治療目的のために哺乳動物ま
たはヒトの患者に投与される場合、免疫原性ではない。

【０１４０】 本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」、「生理学的に受
容可能な」およびこれらの文法的なバリエーションは、これらが組成物、キャリ
ア、希釈剤および試薬に関する場合、交換可能に使用され、そして吐気、眩暈感
、胃の不調などのような所望されない生理学的影響の生成を伴わずに哺乳動物へ
投与し得る材料を示す。

【０１４１】 薬理学的組成物の調製物中で溶解または分散する活性な成分を含む薬理学的組
成物の調製物は、当該分野で周知である。代表的なこのような組成物は、液体溶
液または懸濁液として注射可能ないずれかで調製されるが；使用の前に液体中の
溶液または懸濁液に適切な固体形態がまた、好ましくあり得る。この調製物はま
た、乳化され得る。

【０１４２】 活性成分は、賦形剤と一緒に混合され得、この賦形剤は、薬学的に受容可能で
ありそして本明細書中に記載される治療方法における使用に適した量において活
性成分と適合性である。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロ
ース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み
合わせである。さらに、所望される場合、この組成物は、活性成分の効果を増強
する微量の補助材料（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）を含み得
る。

【０１４３】 本発明の治療組成物は、この中の成分の薬学的に受容可能な塩を含み得る。薬
学的に受容可能な非毒性塩としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩
素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸
、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、
アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸など）を用い
て形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）が挙
げられる。

【０１４４】 遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸
化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）；および有機塩基（
例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−、アルキルアミンおよびアリールアミン（
例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルア
ミなど）および必要に応じて置換エタノールアミン（例えば、エタノールアミン
、ジエタノールアミンなど））から誘導され得る。

【０１４５】 生理学的に耐容性があるキャリアは、当該分野で周知である。例示的な液体キ
ャリアは、活性成分および水に加えた材料を含まないか、あるいは生理学的ｐＨ
のリン酸ナトリウム、生理学的生理食塩水もしくは両方（例えば、リン酸緩衝化
生理食塩水）のような緩衝液を含む、滅菌水溶液である。さらになお、水性キャ
リアは、１つより多くの緩衝化塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム
のような塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含み得
る。

【０１４６】 液体組成物はまた、水に加えてかつ水を排除した、液相を含み得る。さらなる
液相の例としては、グリセリン、綿実油のような植物油、および水−油乳濁液が
挙げられる。

【０１４７】 本明細書中に記載される場合「有効量」は、所望の治療効果を達成するため、
例えば、本発明のＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘタンパク質のタンパク質分解活性を
調節するために算出された、予め決定された量である。必要とされる投薬量は、
特定の処置および所望される処置期間によって変化する；しかし、１日当たり、
１ｋｇ体重当たり約１０μｇと約１ｍｇとの間の投薬量が、治療的処置のために
使用されることが、予測される。このような化合物を、本明細書中以後に議論さ
れるようにデポー形態または長期持続（ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ）形態で投与
することが特に有利であり得る。治療的有効量は、代表的には、生理学的に受容
可能な組成物中に投与される場合、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、
好ましくは約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも
約２μｇ／ｍｌ、そして通常は５〜１０μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十
分である、ＮＡＣ調節剤もしくはＣＡＲＤ−Ｘ調節剤、または本明細書中に同定
される化合物の量である。治療的な本発明の抗ＮＡＣ抗体は、当該分野における
既知の経験に従って比例的に適切な量で投与され得る。

【０１４８】 病理を処置する方法もまた本明細書において提供され、この方法は、有効量の
本発明の治療組成物を投与する工程を包含する。このような組成物は、代表的に
は、生理学的に適合性の組成物において投与される。

【０１４９】 本明細書において本発明に従う処置を意図される異常細胞増殖に関連する例示
的な疾患は、癌病理、ケラチノサイト過形成、新生物形成、ケロイド、良性前立
腺肥大、炎症性過形成、線維症、バルーン血管形成術後の動脈における平滑筋細
胞増殖（再狭窄）などが含まれる。本明細書において処置を意図される例示的な
癌病理には、神経膠腫、癌腫、腺癌、肉腫、黒色腫、過誤腫、白血病、リンパ腫
などが含まれる。

【０１５０】 異常細胞増殖の病理を処置する方法には、発癌タンパク質の1つ以上の活性を
調節する方法が含まれ、ここで、その発癌タンパク質は、特異的に、ＮＡＣまた
はＣＡＲＤ−Ｘと直接または間接的に相互作用する。このような発癌タンパク質
の活性を調節する方法には、発癌タンパク質を実質的に純粋なＮＡＣ、ＣＡＲＤ
−Ｘ、またはその活性フラグメント（すなわち、発癌タンパク質結合フラグメン
ト）と接触させる工程を包含する。この接触は、発癌タンパク質の活性を調節し
、それにより、その発癌タンパク質によって引き起こされる病理を処置する方法
を提供する。発癌タンパク質の活性を調節するさらなる方法には、発癌タンパク
質を薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、その薬剤は、ＮＡＣとその発癌タ
ンパク質との間の相互作用を調節する。

【０１５１】 また本明細書において意図されるのは、例えば、骨髄形成不全、およびリンパ
球の数の減少に起因する免疫不全など、細胞分裂が少なすぎる場合の病理学的障
害の処置のための本発明の薬学的組成物を使用する治療法である。種々の炎症疾
患を、本発明の治療組成物で処置する方法（例えば、敗血症、線維症（例えば、
傷）、関節炎、対宿主性移植片病など）もまた、本明細書において意図される。

【０１５２】 本発明はまた、アポトーシスの増大したかまたは減少したレベルが、例えば、
細胞におけるＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘの増大したかまたは減少した発現に起因
するのか、または改変体ＮＡＣもしくはＣＡＲＤ−Ｘの発現に起因するのか否か
を決定するために、細胞におけるアポトーシスの増大したかまたは減少したレベ
ルによって特徴付けられる病理学を診断のための方法を提供する。このような病
理学（細胞におけるＮＡＣのＮＡＣ結合タンパク質との、またはＣＡＲＤ−Ｘの
ＣＡＰとの結合の変化に起因し得る）の同定は、上記のような、効果的な薬剤ま
たは核酸分子またはアンチセンスヌクレオシド配列を使用する介入的治療を可能
にし得る。一般に、試験サンプルは、増大したかまたは減少したアポトーシスを
有するかまたは有することが疑われることによって特徴付けられる病理学を有す
る被験体から得られ、そして正常被験体からのコントロールサンプルと、試験サ
ンプル中の細胞が、例えば、増大したかもしくは減少したＮＡＣの発現を有する
か否かを決定するために比較され得る。細胞中のＮＡＣのレベルは、サンプルを
、抗ＮＡＣ抗体もしくはＮＡＣ関連タンパク質（これらのいずれもＮＡＣに特異
的に結合し得る）のような試薬と接触させることによって決定され得る。例えば
、細胞中のＮＡＣのレベルは、抗ＮＡＣ抗体を使用する周知の免疫アッセイまた
は免疫組織化学的方法（例えば、Ｒｅｅｄら、前出、１９９２；Ｈａｒｌｏｗお
よびＬａｎｅ、前出、（１９８８）もまた参照のこと）によって決定され得る。
本明細書において使用される場合、用語「試薬」は、ＮＡＣに、もしくは、結合
したＮＡＣ／ＮＡＣ結合タンパク質複合体に、特異的に結合し得る化学的もしく
は生物学的分子を意味する。例えば、抗ＮＡＣ抗体もしくはＮＡＣ結合タンパク
質のいずれかは、ＮＡＣのための試薬であり得、一方、抗ＮＡＣ抗体もしくは抗
ＮＡＣ結合タンパク質抗体のいずれかは、ＮＡＣ／ＮＡＣ結合タンパク質複合体
であり得る。

【０１５３】 本明細書において使用される場合、用語「試験サンプル」は、被験体から得ら
れ、そしてそのサンプル中の細胞中でのＮＡＣの発現について試験された細胞も
しくは組織の標本を意味する。試験サンプルは、例えば、外科手術の間またはニ
ードル生検により得ることができ、そして本明細書に記載される方法を使用して
、アポトーシスの増大もしくは減少によって特徴付けられる病理学を診断するた
めに試験され得る。試験サンプル中の細胞におけるＮＡＣの増大したかまたは減
少した発現は、特定の細胞型におけるＮＡＣについて予想される正常レベルと比
較することによって決定され得る。種々の細胞型における正常範囲のＮＡＣレベ
ルは、統計学的に有意な数の正常被験体をサンプリングすることによって決定さ
れ得る。さらに、コントロールサンプルは、増大したかまたは減少したアポトー
シスによって特徴付けられる病理学が、増大したかまたは減少したＮＡＣの発現
に起因するか否かを決定するために、試験サンプルと平行に評価され得る。試験
サンプルは、例えば、上記の免疫組織化学的方法を使用して試験され得るか、ま
たはそのサンプルはさらに処理され、そして試験され得る。例えば、試験サンプ
ルの抽出は、サンプルの細胞中に発現されるＮＡＣが、コントロール細胞に由来
するＮＡＣと同じ様式でＮＡＣ結合タンパク質と結合し得るか否か、またはその
かわりに改変体ＮＡＣが細胞中で発現されるか否かを決定するために調製および
試験され得る。

【０１５４】 本発明の別の実施形態において、診断システム（好ましくは、キットの形態で
）が提供され、これは本明細書に記載されるＮＡＣ、ＮＡＣタンパク質、および
／または抗ＮＡＣ抗体をコードする少なくとも１つの本発明の核酸を、適切なパ
ッケージング材料中に含む。１つの実施形態において、例えば、診断核酸は、配
列番号１、３、および５のいずれかに由来する。本発明の診断システムは、ゲノ
ムＤＮＡかまたはＮＡＣをコードする転写核酸（例えば、ｍＲＮＡもしくはｃＤ
ＮＡ）のいずれかにおいて、ＮＡＣをコードする核酸の存在もしくは非存在につ
いてアッセイするために有用である。

【０１５５】 適切な診断システムには、少なくとも１つの本発明のＮＡＣ核酸、ＮＡＣタン
パク質、および／または抗ＮＡＣ抗体が含まれ、好ましくは、少なくとも１つの
アッセイのために十分な量の別々のパッケージされた化学試薬として、２つ以上
の本発明の核酸、タンパク質、および／または抗体が含まれる。パッケージング
された試薬の使用についての説明書もまた、代表的には、含まれる。当業者は、
容易に本発明の核酸プローブおよび／またはプライマーを、本明細書に記載され
るように、本発明の実施のための適切な緩衝液および溶液と組み合わせてキット
形態に組み込むことができる。

【０１５６】 本明細書において使用される場合、句「パッケージング材料」とは、キットの
内容物（例えば、本発明の核酸プローブまたはプライマーなど）を収納するため
に使用される１つ以上の物理的構造をいう。パッケージング材料は、好ましくは
、滅菌した汚染のない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。
そのパッケージング材料は、本発明の核酸が、配列番号１、３、および５に示さ
れるヌクレオチド配列またはその中の変異または欠失を含むＮＡＣをコードする
特定の配列を検出するために使用され得ることを示す標識を有し、それにより、
癌の存在または素因を診断する。さらに、そのパッケージング材料は、いかにそ
のキットの中のその材料が、特定の配列を検出し、そして癌の存在もしくは素因
を診断するために利用されるかを示す説明書を含む。

【０１５７】 診断システムと関連して本明細書において使用されるパッケージング材料は、
核酸ベースの診断システムにおいて通例利用されるものである。本明細書におい
て使用される場合、用語「パッケージ」とは、ガラス、プラスチック、紙、ホイ
ルなどのような固体マトリックスまたは材料をいい、本発明の単離された核酸、
オリゴヌクレオチド、またはプライマーを固定された限界内に保持することが可
能なものをいう。したがって、例えば、パッケージは、ミリグラム量の意図され
た核酸、オリゴヌクレオチド、またはプライマーを含有するために使用されるガ
ラスバイアルであり得、あるいはそれはマイクログラム量の意図された核酸プロ
ーブが作動可能に固定されているマイクロタイタープレートであり得る。

【０１５８】 「使用説明書」は、代表的には、試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ方
法パラメーター（例えば、混合される試薬およびサンプルの相対量、試薬／サン
プル混合物の維持期間、温度、緩衝液条件など）を記載する明確な表現を含む。

【０１５９】 診断アッセイは、試薬に結合しているサンプル中のＮＡＣの量を検出するため
の単純な方法を含むべきである。検出は、試薬を標識化し、そして周知の方法を
使用してこのラベルの存在を検出することにより実施され得る（例えば、抗体の
標識化についてはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出１９８８；９章を参照のこ
と）。試薬は、種々の検出可能な部分（放射標識、酵素、ビオチンまたは蛍光色
素を含む）で標識され得る。試薬を標識するための材料は、診断キット中に含ま
れ得るか、または別々に販売元から購入され得る。標識化試薬と試験サンプル（
所望される場合、コントロールサンプル）との接触に続いて、特異的に結合した
試薬は、特定の部分を検出することにより同定され得る。

【０１６０】 特異的に試薬に結合し得る標識化抗体はまた、非標識試薬の特異的結合を同定
するために使用され得る。例えば、試薬が抗ＮＡＣ抗体である場合、第２の抗体
を使用して、抗ＮＡＣ抗体の特異的結合を検出し得る。第２の抗体は、一般的に
は特定のクラスの第１の抗体に特異的である。例えば、抗ＮＡＣ抗体がＩｇＧク
ラスの抗体である場合、第２の抗体は、抗ＩｇＧ抗体である。このような第２の
抗体は、容易に市販の供給源から入手可能である。第２の抗体は、上記のような
検出可能な部分を用いて標識され得る。サンプルが第２の抗体を使用して標識さ
れる場合、このサンプルは最初に第１の抗体と接触され、次いでこのサンプルは
、標識された第２の抗体と接触され、これは、第１の抗体に特異的に結合し、そ
して標識化サンプルを生じる。

【０１６１】 本発明の別の実施形態に従って、ＮＡＣ関連タンパク質を同定する方法が提供
される。本明細書中で使用される場合、用語「ＮＡＣ会合タンパク質」すなわち
「ＮＡＰ」は、ＮＡＣまたはその代替のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）に、
直接または間接に特異的に結合し得、好ましくは直接結合し得るタンパク質を意
味する。ＮＡＣタンパク質は自己会合することが公知であるので、ＮＡＣタンパ
ク質は、用語ＮＡＣに含まれる。例示的なＮＡＰは、ＮＢ−ＡＲＣ、ＣＡＲＤ、
ＬＲＲ、またはＮＡＣのＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインに結合し得るタンパク
質またはタンパク質のポリペプチド部分である。同様に、用語「ＣＡＲＤ−Ｘ会
合タンパク質」すなわち「ＣＡＰ」は、ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質に、直接または
間接に、好ましくは直接に特異的に結合し得るタンパク質をいう。同様に、ＣＡ
ＲＤ−Ｘタンパク質は、自己会合することが公知であるので、ＣＡＲＤ−Ｘタン
パク質は、用語ＣＡＰに含まれる。ＮＡＰまたはＣＡＰは、例えば、実施例記載
されるアッセイと同様のインビトロタンパク質結合アッセイ、実施例に記載され
るアッセイと同様の酵母ツーブリッドアッセイ、または他の型のタンパク質相互
作用アッセイおよび方法により、同定され得る。

【０１６２】 ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘを使用して、ＮＡＰまたはＣＡＰは、本明細書中に
開示される方法を使用して同定され得ることが、タンパク質精製、タンパク質相
互作用クローニング、またはタンパク質質量分析の当業者に明らかである。

【０１６３】 用語「ＮＡＰ」または「ＣＡＰ」は、一般的に使用されるが、本明細書中に記
載されるアッセイを使用して同定されるＮＡＰまたはＣＡＰが、タンパク質の部
分（ＮＡＰまたはＣＡＰの候補とみなされる）であり得るということが認識され
るべきである。本明細書中で使用される場合、用語ＮＡＰまたはＣＡＰの「活性
フラグメント」とは、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘにそれぞれ結合し得るが、全長
タンパク質の一部のみからなるポリペプチド配列に対応するタンパク質をいう。
このようなポリペプチドは、ＮＡＰまたはＣＡＰとみなされるが、ｃＤＮＡライ
ブラリーから得られたｃＤＮＡ配列が、全長タンパク質をコードしなくても良い
ということは周知である。従って、ｃＤＮＡは、全長タンパク質の一部のみであ
るが、それにもかかわらず適切なコンホメーションをとりかつＮＡＣまたはＣＡ
ＲＤ−Ｘに結合するのに十分な領域を含むポリペプチドをコードし得る。しかし
、全長タンパク質において、ポリペプチドは、例えば、ＮＡＰまたはＣＡＰの結
合部位の立体的ブロッキングに起因して、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘに結合しな
いコンホメーションをとり得る。このような全長タンパク質はまた、ＮＡＰまた
はＣＡＰの例であり、ここでＮＡＣ結合活性またはＣＡＲＤ−Ｘ結合活性は、適
切な条件下で活性化され得る（すなわち、リン酸化、蛋白分解、タンパク質結合
、ｐＨ変化など）。議論の簡便さのために、本明細書中で使用される場合、用語
「ＮＡＰ」および「ＣＡＰ」は、ＮＡＰまたはＣＡＰおよびそれらの活性フラグ
メントをそれぞれ含むことが意図される。

【０１６４】 ＣＡＲＤ−含有タンパク質は、一般的にアポトーシスに関与するので、ＮＡＰ
またはＣＡＰのＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘとの会合は、細胞におけるアポトーシ
スのレベルに影響し得る。本明細書中に記載される方法の使用による、種々のＮ
ＡＰまたはＣＡＰの同定は、ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘにより制御される細胞死
またはシグナル伝達経路に必要な洞察を提供し得、ＮＡＰのＮＡＣとの会合また
はＣＡＰのＣＡＲＤ−Ｘとの会合を有効に変更する因子を同定するために有用な
アッセイの開発を可能にする。このような因子は、例えば、被験体における癌の
有効な治療を提供するためまたは自己免疫疾患を処置するために有用であり得る
。これらと同じアッセイは、ＮＡＣのそのＣＡＲＤドメイン、ＮＢ−ＡＲＣドメ
イン、または他のこのタンパク質内のドメインを介する自己会合を調節する因子
の同定に使用され得；そしてＣＡＲＤ−Ｘの、そのＣＡＲＤドメインまたはこの
タンパク質内に見出される他のドメインを介するそれ自体との自己会合を調節す
る因子の同定のために使用され得る。

【０１６５】 正常な細胞において、ＮＡＰおよびＮＡＣタンパク質の定常状態レベルの会合
が起こるようである。特定の細胞型におけるこのＮＡＰおよびＮＡＣタンパク質
の定常状態レベルの会合は、その細胞型における通常レベルのアポトーシスを決
定し得る。細胞中でのＮＡＰおよびＮＡＣタンパク質の定常状態レベルの会合に
おける増加または減少は、細胞における増加したレベルまたは減少したレベルの
アポトーシスを生じ得、これは、被験体における病状を生じ得る。細胞中でのＮ
ＡＰおよびＮＡＣタンパク質の正常な会合は、例えば、細胞中での、それぞれ、
変異体ＮＡＰまたはＮＡＣタンパク質の発現に起因して変更され得、これらのい
ずれかは、ＮＡＣの正常な結合機能と競合し得、そしてそれによって、細胞内で
のＮＡＰおよびＮＡタンパク質の会合を減少し得る。用語「変異体」は、特定の
細胞型において通常見出されるＮＡＰまたはＮＡＣタンパク質とは異なるタンパ
ク質を意味するために、本明細書中で一般的に使用される。さらに、細胞中での
ＮＡＰおよびＮＡＣタンパク質の正常な会合は、細胞中のＮＡＰおよびＮＡＣタ
ンパク質の会合を有効的に変更する因子（例えば、薬物）と細胞との接触に起因
して、増加または減少され得る。

【０１６６】 本発明のＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤドメインタンパク質（ＮＡＣβ、ＮＡＣ
γおよびＮＡＣδは、例えば、インビトロ結合アッセイを使用して特徴付けられ
、そしてＣＡＲＤ含有タンパク質が、酵母２ハイブリッド系を使用して、さらに
特徴付けられる。インビボ転写活性アッセイ（例えば、酵母２ハイブリッド系）
は、タンパク質の会合を同定および操作するための特に有用である。さらに、こ
のようなアッセイにおいて観測される結果は、細胞において天然に起こる事象を
映すようである。従って、このようなインビボアッセイにおいて得られる結果は
、ヒト被験体のような被験体において細胞内で起こり得る結果の予測となり得る
。

【０１６７】 酵母２ハイブリッド系のような転写活性アッセイは、転写因子の調節特性に基
づき、この転写因子は、機能的に分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよびトランス
活性化ドメインからなる。個別のタンパク質として発現される場合、これらの２
つのドメインは、遺伝子転写を媒介しそこなう。しかし、転写活性化活性は、Ｄ
ＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが、例えば、２つのタンパク質
の会合に起因して一緒に架橋される場合、回復され得る。ＤＮＡ結合ドメインお
よびトランス活性化ドメインは、例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活
性化ドメインを融合タンパク質（ハイブリッド）として発現することによって、
架橋され得る。但し、これらのドメインに融合されるタンパク質は、互いに会合
し得る。２つのハイブリッドの非共有結合架橋は、ＤＮＡ結合ドメインおよびト
ランス活性化ドメインを一緒にもたらし、そして転写的にコンピテントな複合体
を生成する。タンパク質の会合は、レポーター遺伝子の転写活性化を観測するこ
とによって決定される（実施例Ｉを参照のこと）。

【０１６８】 本明細書に例示される酵母２ハイブリッド系は、ハイブリッドタンパク質を発
現するベクターについて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種々の株を宿主細胞とし
て使用する。転写活性化アッセイはまた、例えば、哺乳動物細胞を使用して実施
され得る。しかし、酵母２ハイブリッド系は、酵母を用いる作業の容易さおよび
アッセイが実施され得る速度のために、特に有用である。例えば、ＬｅｘＡオペ
レーター配列に連結されるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母宿主細胞は、Ｎ
ＡＣのＣＡＲＤ_Lドメイン（配列番号２のアミノ酸残基１１２８〜１４７３）は
、いくつかのＣＡＲＤ含有タンパク質と相互作用し得る（実施例を参照のこと）
。例えば、１つの場合において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合
ドメインからなり、このドメインは、ＬｅｘＡプロモーターを結合し、ＮＡＣの
ＣＡＲＤｌ_Lドメインに融合され、そしてトランス活性化ドメインは、ＣＡＲＤ
含有タンパク質をコードするいくつかのｃＤＮＡ配列に個別に融合されるＢ４２
酸性領域からなった。ＬｅｘＡドメインが、ＣＡＲＤ含有タンパク質に融合され
るトランス活性化ドメインに非共有結合的に架橋された場合、この会合は、レポ
ーター遺伝子の転写を活性化する。

【０１６９】 ＮＡＰ、例えば、ＣＡＲＤ含有タンパク質またはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質
もまた、例えば、実施例に記載されるようなグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を利用するアッセイのようなインビトロアッセイ
を使用して、同定され得る。このようなインビトロアッセイは、ＮＡＰを同定お
よび単離する単純、迅速かつ安価な方法を提供する。このようなインビトロアッ
セイはインビボで得られる結果を確認する際に特に有用であり、そしてＮＡＰの
特定の結合ドメインを特徴付けるために、使用され得る。例えば、ＧＳＴ／ＣＡ
ＲＤ_L融合タンパク質が発現され得、そして固定化グルタチオンを含む親和性マ
トリックスへの結合によって、精製され得る。所望ならば、ＣＡＲＤ含有タンパ
ク質またはＣＡＲＤ含有タンパク質の活性フラグメントを含み得るサンプルは、
結合したＧＳＴ／ＣＡＲＤ_Lを含むアフィニティカラムを通過させられ得、そし
てＣＡＲＤ_Lに結合するＣＡＲＤ含有タンパク質が得られ得る。さらに、ＧＳＴ
／ＣＡＲＤ_Lは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用さ
れ得、ここで、ＧＳＴ／ＣＡＲＤ_L融合タンパク質のクローンへの結合は、この
クローンが、ＣＡＲＤ含有タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むことを示す。

【０１７０】 本発明の別の実施形態において、細胞におけるアポトーシスの増加または減少
したレベルで特徴付けられる病状についての処置の進行をモニタリングするため
の方法が提供され、この方法は、このような処置の可能性を確認するために有用
である。このような治療（例えば、有効な薬剤を使用して、細胞中のＮＡＣ会合
タンパク質とＮＳＣとの会合を変更する治療）は、なされる治療における改変を
可能にし得、この改変は、治療において使用される有効薬剤の量を減少させるこ
と、有効薬剤の量を増加させること、または異なる有効薬剤を使用することを含
む。一般に、試験サンプルは、増加または減少したアポトーシスによって特徴付
けられる病状を有する被験体から得られ得、このサンプルは、正常な被験体から
のコントロールサンプルと比較されて、試験サンプル中の細胞が、例えば、ＮＡ
Ｃの増加した発現または減少した発現を有するか否かを決定し得る。好ましくは
、このコントロールサンプルは、同じ被験体からの以前のサンプルであり、それ
によって、治療の結果としての、病状に対する変化の直接的な比較を提供する。
細胞におけるＮＡＣのレベルは、サンプルを、試薬（例えば、抗ＮＡＣ抗体また
はＮＡＣ会合タンパク質）と接触させることによって決定され得、これらのいず
れかは、ＮＡＣに特異的に結合する。例えば、細胞におけるＮＡＣのレベルは、
抗ＮＡＣ抗体を使用する、周知の免疫アッセイまたは免疫組織化学的な方法によ
って、決定され得る（例えば、Ｒｅｅｄら、前出、１９９２；また、Ｈａｒｌｏ
ｗおよびＬａｎｅ、前出、（１９８８）を参照のこと）。

【０１７１】 本発明の別の実施形態に従って、癌を罹患する患者における疾患のないまたは
生存の予後を決定するための方法が提供される。例えば、１次腫瘍組織における
ＮＡＣタンパク質の異常なレベル（より高いか、またはより低いかのいずれか）
が、増加または減少した腫瘍の再発または拡大のいずれかとの高い相関を示し、
それによって、疾患のないまたは全生存の可能性を示すことが、本明細書中で意
図される。従って、本発明は、癌対応における有意な進歩を有利に提供し得る。
なぜなら、腫瘍再発または拡大についての危険における患者の早期同定は、早期
の積極的な治療を可能にし、生存の可能性を有意に増大させる。癌腫瘍を有する
個体における腫瘍の再発または拡大の危険性を予測する方法；腫瘍転移の危険性
を決定するために癌患者をスクリーニングする方法；および癌を罹患する患者に
対する処置の適切な過程を決定するための方法もまた提供される。これらの方法
は、患者からサンプルを収集し、そしてコントロールにおける発現のレベルと、
あるいは患者集団サンプリング、組織培養分析、または疾患予後の決定のための
参照レベルを決定するための公知の任意の他の方法によって規定されるＮＡＣ発
現の参照レベルと、患者におけるＮＡＣ発現のレベルとを比較することによって
、実施される。次いで、患者におけるＮＡＣ発現のレベルは、参照レベルより高
いか、または参照レベルより低いかとして分類され、ここで、高いレベルの患者
についての生存または腫瘍再発の予後は、低レベルの患者についての予後とは異
なる。

【０１７２】 明細書中で言及される全ての米国特許および全ての刊行物は、その全体が、本
明細書中で参考として援用される。ここで、本発明を以下の非限定的な実施例を
参照してより詳細に記載する。

【０１７３】 （実施例） （１．０ 本発明のＮＡＣタンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング） Ｊｕｒｋａｔ全ＲＮＡを、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およ
びランダムヘキサヌクレオチドプライマーを使用して、相補的ＤＮＡに逆転写し
た。ＮＡＣの３つの重複ｃＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドプ
ライマーセットを使用して、Ｔｕｒｂｏ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを有する
Ｊｕｒｋａｔ相補的ＤＮＡから増幅した：プライマーセット１；

【０１７４】

【化１】 プライマーセット２；

【０１７５】

【化２】 およびプライマーセット３；

【０１７６】

【化３】 得られたｃＤＮＡフラグメントは、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｍｙｃ（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ，Ｒｏｙら，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６９１４−６９２５（１
９９７）に記載されるように改変した）に連結され、そしてＥｃｏＲＩ部位でフ
ラグメント２および３を連結してフラグメント４を作製し、フラグメント１およ
び４をＢｓｔ Ｘ１部位で連結することによって、全長ｃＤＮＡにアセンブルし
た。アセンブルした全長ｃＤＮＡの配列決定分析を実施し、そして配列番号２に
記載する。

【０１７７】 代替的なｍＲＮＡスプライシング産物を表すさらなるＮＡＣｃＤＮＡを得、こ
の代替的なｍＲＮＡスプライシング産物は、３１個のアミノ酸セグメント（配列
番号５および６）、４５個のアミノ酸セグメント、または３１個および４５個の
アミノ酸セグメント（配列番号３および４）、ＬＲＲとＣＡＲＤとの間に位置す
る両方（図１Ａに、斜線のボックスとして、そしてそれぞれ、図１Ｂおよび配列
番号２にイタリック体のアミノ酸９５７−９８７および１２６１−１３０５とし
て示される）を欠損するより短いタンパク質をコードする。下線を引いた領域（
それぞれ、配列番号２のアミノ酸９５７−９８７または１２６１−１３０５、ま
たは両方を欠損する）を欠損する３つの代替的にスプライスされたアイソフォー
ムを含む、全長ＮＡＣタンパク質の模式図が、図２に示される。これらのアイソ
フォームの３つの全長ヌクレオチド配列は、配列番号１、３および５に記載され
、それぞれ、ＮＡＣβ（全長）、ＮＡＣγ（両方のスプライス領域を欠損する）
、およびＮＡＣδ（３１個のスプライス領域を欠損する）に対応する。

【０１７８】 Ｃｌｕｓｔａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２
：４６７３−４６８０（１９９４））を使用する、公知のタンパク質配列に対す
るＮＡＣの比較は、Ｃ末端付近のＮＡＣのＣＡＲＤドメイン（例えば、配列番号
２の残基１３７３−１４７３を参照のこと）が、多数のＣＡＲＤドメインタンパ
ク質と類似することを明らかにした。従って、以前に同定されたＣＥＤ−４タフ
ァミリータンパク質とは異なり、ＮＡＣのＣＡＲＤドメインは、アミノ末端より
もむしろそのカルボキシ末端に配置される。さらなる配列分析は、ＮＡＣにおけ
るアルドラーゼおよびＲｕＢｉｓＣｏに観察されるドメインに類似するα₈β₈（
ＴＩＭ）−Ｂａｒｒａｌ様ドメインを予測し、このドメインは、予測されたＣＡ
ＲＤドメインのアミノ末端側のすぐ隣に配置される（例えば、配列番号２の残基
１０７９−１３６４を参照のこと）。さらに、ＮＡＣの一部分は、ＮＢ−ＡＲＣ
ドメインに相同的な配列部分（例えば、配列番号２の残基３２９−５４７を参照
のこと）およびロイシン富化繰返し領域（例えば、配列番号２の残基８０８−９
４７を参照のこと）を有することが見出された。上のタンパク質に対する相同性
に基づいて、本発明のタンパク質は、ＮＡＣタンパク質と呼ばれる。なぜなら、
それは、ＮＢ−ＡＲＣ ａｎｄ ＣＡＲＤドメイン含有タンパク質であるからで
ある。他のＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤドメイン含有タンパク質を用いるＣｌｕ
ｓｔａｌＷ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔは、両
方のＮＢ−ＡＲＣ領域（特に、Ｐループ、またはＷａｌｋｅｒ Ａ、およびＷａ
ｌｋｅｒ Ｂ部分）およびＣＡＲＤ領域（それぞれ、図１Ｃおよび図１Ｄ）にお
いて、他のタンパク質へのＮＡＣの相同性を確認した。この配列分析は、最初に
、ＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌドメインに似たドメインが、ＣＡＲＤドメインをも含む
タンパク質において同定され、そしてまた、最初に、ＴＩＭ−ｂａｒｒｅｌドメ
インに似たドメインが、ＮＢ−ＡＲＣドメインをも含むタンパク質において同定
されていることを示す。

【０１７９】 ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメイン（ＮＢドメインとしても参照される）は、ＡＴ
Ｐ結合タンパク質を示す古典的なＷａｌｋｅｒ ＡおよびＢボックスを含み、そ
そしてＮｏｄ１のＮＢ−ドメインに対するアミノ酸配列において、最も類似すし
（２９％）（Ｉｎｏｈａｒａら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、
１４５６０−７；およびＢｅｒｔｉｎら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７４（１９）、１２９５５−１２９５８）、続いて、ヒトＡｐａｆ−１（１７
％）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｐａｆ−１ホモログ（１２％）、およびＣ．ｅ
ｌｅｇａｎｓ ＣＥＤ−４タンパク質（１２％）である（図１Ｃ）。ＮＡＣのＣ
ＡＲＤドメインは、それぞれ、Ｎｏｄ１、ヒトＡｐａｆ−１、およびＣＥＤ−４
のＣＡＲＤドメインと２１％、１９％、および８％のアミノ酸同一性を共有する
（図１Ｄ）。ＮＡＣ ＣＡＲＤ配列は、他のＣＡＲＤの構造（Ａｐａｆ−１、ｐ
ｒｏ−ｃａｓｐａｓｅ−９、およびＲａｉｄｄ（図１Ｅ）に対して以前に報告さ
れたものを含む）上で容易に進み、これらのドメインで典型的な６α−へリック
ス折り畳みの保存を示唆する。

【０１８０】 ＮＡＣ ｍＲＮＡは、成人のヒト組織において広く発現され、抹消血白血球、
胸腺、脾臓および心臓において最も高いレベルにあることが見出された。２つ以
上の接近して転位するｍＲＮＡ種が、ノーザンブロットにおいて観測され、有病
性（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）ｍＲＮＡは、約５ｋｂの長さを有した。

【０１８１】 （２．０ インビトロタンパク質結合アッセイ） 本発明のＮＡＣタンパク質のＣＡＲＤドメインは、これら同士または他のＣＡ
ＲＤとの結合を介する同型のタンパク質相互作用ドメインを示す。ここで、タン
パク質相互作用パートナーに対する特異性は、これらのドメインの表面上に示さ
れる親水性および疎水性のアミノ酸残基のパターンにおける相補性によって規定
される。ＮＡＣのどのＣＡＲＤドメインが結合し得るかを調査するために、イン
ビトロタンパク質結合アッセイを実施した。これらの実験について、ＮＡＣのＣ
ＡＲＤを、ＧＳＴ融合タンパク質として細菌に産生させ、精製し、そしてインビ
トロ翻訳によって産生した種々の放射標識されたＣＡＲＤファミリータンパク質
との相互作用を試験するためにグルタチオン−セファロース上に固定化した。

【０１８２】 ＮＡＣのＣＡＲＤドメインをコードする相補的ＤＮＡを、Ｔｕｒｂｏ Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および上記のプライマーセット
３でＪｕｒｋａｔのＤＮＡから増幅した。生じたＰＣＲフラグメントを、Ｅｃｏ
ＲＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そしてｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクタ
ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐｃＤＮＡ−ｍｙｃベクターに連結した。ＮＡ
Ｃのこの領域は、ＣＡＲＤ_L（配列番号２のアミノ酸残基１１２８〜１４７３）
およびＣＡＲＤ_S（配列番号２のアミノ酸残基１１２８〜１２６１および１３０
６〜１４７３）と名付けられた２つの選択的スプライシングアイソフォームを含
む。ＮＢ−ＡＲＣドメインをコードするｃＤＮＡの領域を、配列番号１５（正方
向（ｆｏｒｗａｒｄ））および配列番号１４（逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ））のプ
ライマーを使用してＰＣＲ増幅した。生じたＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩ
制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素で消化し（配列番号２のアミノ酸残基３２６〜
５５１をコードするフラグメントを得る）、そしてｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターお
よびｐｃＤＮＡ−ｍｙｃベクターに連結した。

【０１８３】 ｐＧＥＸ−４Ｔ１中のＮＢ−ＡＲＣ、ＣＡＲＤ_L、およびＣＡＲＤ_SをＸＬ−１
ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に発現し、公知の技術
（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（
１９９９）に記載される技術）に従ってグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロース
を使用してアフィニティ精製した。ＧＳＴプルダウンアッセイについて、精製し
たＣＡＲＤ_LおよびＣＡＲＤ_SのＧＳＴ融合タンパク質およびＧＳＴ単独（１０〜
１５μｌのＧＳＨ−セファロースビーズに０．１〜０．５μｇ固定化した）を、
１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１００μｌのＣｏ−ＩＰ緩衝液中［１４２．４ｍＭ
ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、０．
５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ］と、室温で３０分間インキュベートした。次いで、³⁵Ｓ標識され、インビ
トロで翻訳されたＣＡＲＤ_L、ＣＡＲＤ_Sまたはコントロールタンパク質Ｓｋｐ−
１を含むラット網状赤血球ライセート（ＴｎＴ−ライセート；Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｉｎｃ．）１μｌと、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補填された１００μｌのＣｏ
−ＩＰ緩衝液中で、ビーズを４℃で一晩インキュベートした。ビーズを５００μ
ｌのＣｏ−ＩＰ緩衝液で４回洗浄した後、２０μｌのＬａｅｍｍｌｉ−ＳＤＳサ
ンプル緩衝液中で煮沸した。抽出したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンドを、蛍光間接撮影法で検出した。

【０１８４】 生じた同種二量体化パターンは、ＣＡＲＤ_L−ＣＡＲＤ_L、ＣＡＲＤ_S−ＣＡＲ
Ｄ_S、およびＣＡＲＤ_L−ＣＡＲＤ_Sの両方を含むレーンは、非常に強いシグナル
を有し、一方、コントロールＧＳＴ単独およびコントロールＳｋｐ−１を含むレ
ーンは、無視し得るシグナルを有することを示す。従って、本発明のＮＡＣのＣ
ＡＲＤドメインは、インビトロでの非常に強い自己結合能を示す。

【０１８５】 さらに、ＮＡＣのＣＡＲＤは、ＧＳＴプルダウンアッセイにおいて、Ａｐａｆ
−１、ＣＥＤ−４およびそれ自身のＣＡＲＤ含有領域と特異的相互作用を示した
が、プロ−カスパーゼ１、２、９、１１、Ｒａｉｄｄ（Ｃｒａｄｄ）、Ｃａｒｄ
ｉａｋ（ＲＩＰ２；Ｒｉｃｋ）、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはＢｃｌ−１０
（ＣＩＰＥＲ；ｈＥ１０）を含む他の種々のＣＡＲＤ含有タンパク質との相互作
用は示さなかった（図４Ａ）。以下に記載のような酵母２ハイブリッド法によっ
て、同様の結果を得た。従って、ＮＡＣのＣＡＲＤドメインは、ＣＥＤ−４ファ
ミリーのメンバーと選択的に結合するが、ＣＡＲＤを保有するカスパーゼまたは
種々のＣＡＲＤ含有アダプタータンパク質とはほとんど相互作用しない。

【０１８６】 （３．０ 酵母におけるタンパク質相互作用の研究） ＥＧＹ４８酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：
ＭＡＴα、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、ｈｉｓ、ｌｅｕ２：：ｐｌｅｘＡｐｏ６−ｌｅ
ｕ２）を，以下と融合されたＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインをコードするｐＧｉ
ｌｄａ−ＣＡＲＤＬプラスミド（ｈｉｓマーカー）で形質転換した：ＮＡＣのＣ
ＡＲＤドメイン（ＣＡＲＤ_L）およびカスパーゼ−９；そのＷＤドメインのない
Ａｐａｆ−１；膜貫通ドメインのないＢｃｌ−ＸＬ、ＢａｘおよびＢｃｌ−２。
ＥＧＹ４８をまた、Ｂ４２トランス活性化ドメインに融合された上記の列挙され
た群のタンパク質およびさらなるｖＲａｓおよびＦＡＤＤを標的タンパク質とし
てコードするベクターｐＪＧ４−５（ｔｒｐｌマーカー）で形質転換し、そして
これらの細胞を、以前に記載された（Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３；Ｓａｔｏら、
１９９５）ようにＬｅｘＡ−ＬａｃＺレポータープラスミドｐＳＨ１８４０（ｕ
ｒａ３マーカー）で形質転換した。細胞およびプラスミドの供給源を、以前に記
載した（米国特許第５，６３２，９９４号およびＺｅｒｖｏｕｓら、Ｃｅｌｌ
７２：２２３−２３２（１９９３）；Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１
−８０３（１９９３）；Ｇｏｌｅｍｉｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編；Ｇｒｅ
ｅｎ Ｐｕｂｌ．；ＮＹ １９９４）（これらの各々が本明細書中に参考として
援用される））。形質転換体を、以前（Ｓａｔｏら、Ｇｅｎｅ １４０：２９１
−２９２（１９９４））に記載したようにロイシンおよび２％グルコースで補填
したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒの最小培地（ＢＭＭ）プレート上でレプリカプレート
した。タンパク質−タンパク質相互作用を、２％ガラクトースおよび１％ラフィ
ノースを含むロイシン欠失ＢＭＭプレート上での形質転換体の増殖によってスコ
アした。

【０１８７】 タンパク質−タンパク質相互作用をまた、βガラクトシダーゼ活性アッセイを
使用して評価した。ＢＭＭ／Ｌｅｕ／グルコースのプレート上で増殖したコロニ
ーを、ニトロセルロース膜上にフィルターリフトし、ＢＭＭ／Ｌｅｕ／グルコー
スのプレート上で一晩インキュベートした。酵母細胞を、液体窒素中に膜を浸す
ことおよび室温で融解することによって溶解した。３．２ｍｌの（５０μｌのＸ
−ｇａｌ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）で補填した）Ｚ緩衝液中（６０ｍＭ Ｎａ₂Ｈ
ＰＯ₄、４０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄）で膜
をインキュベートすることによって、βガラクトシダーゼ活性を測定した。βガ
ラクトシダーゼ活性のレベルを、各々の形質転換体の産生した青色の強度に従っ
て評価した。

【０１８８】 上記のように、ＮａｃのＣＡＲＤは、ＣＥＤ−４ファミリーのメンバー（例え
ば、Ａｐａｆ−１）に選択的に結合するが、ＣＡＲＤを保有するカスパーゼまた
は種々のＣＡＲＤ含有アダプタータンパク質とはほとんど相互作用しない。

【０１８９】 同様の２ハイブリッド相互作用実験を、ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質のＣＡＲＤド
メインを使用して実施した。表１は、２ハイブリッド実験の結果を要約する。こ
こで、ｐＧｉｌｄａプラスミドから発現されたＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合
ドメインおよびＣＡＲＤ−Ｘまたはいくつかの他のＣＡＲＤ含有タンパク質（Ｃ
ＡＲＤＩＡＫ、ＮＡＣ（ＣＡＲＤ_L）、Ａｐａｆ−１、カスパーゼ２、９および
１１を含む）由来のＣＡＲＤドメインを含む融合タンパク質を、同一の細胞内に
ＣＡＲＤ−Ｘ、ＣＡＲＤＩＡＫ、ＮＡＣ（ＣＡＲＤ_L）、カスパーゼ９およびｃ
ＩＡＰ−２由来のＣＡＲＤドメインとして発現し、上記のようにｐＪＧ４−５プ
ラスミド由来のＢ４２タンパク質からのトランス活性化ドメインとの融合タンパ
ク質として発現した。示されるように、ＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメインは、そ
れ自身と相互作用したが、他のタンパク質のＣＡＲＤドメインとは相互作用しな
かった。

【０１９０】 （表１） ＣＡＲＤ−Ｘ：ＣＡＲＤ相互作用の酵母２ハイブリッド分析

【０１９１】

【表１】 （４．０ ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメインの自己結合） ＮＡＣのＮＢドメインの特性を調べるために、ＮＡＣの推定のＮＢドメインを
含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を使用し
て、インビトロ結合実験を実施した。インビトロ翻訳された、ＮＢ−ＡＲＣまた
はプロ−カスパーゼ９（コントロールとして使用される）を含む³⁵Ｓ標識のラッ
ト網状赤血球ライセート（１μｌ）を、ＧＳＴプルダウンアッセイのために、精
製したＧＳＴ−ＮＢ−ＡＲＣまたはＧＳＴ単独と結合したＧＳＨ−セファロース
ビーズとインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして上記のように蛍
光間接撮影法によって可視化した。インプットの１０分の１をＮＢ−ＡＲＣまた
はコントロールとしてのプロ−カスパーゼ９についてロードした。ＮＡＣのＮＢ
ドメインは、³⁵Ｓ標識のインビトロ翻訳された（ＩＶＴ）ＮＡＣ ＮＢドメイン
へのＧＳＴ−ＮＢの結合をアッセイした実験において自己結合した（図３Ａ）。
従って、このアッセイにおいて、ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣ含有フラグメントは、ホ
モ二量体化する強力な能力を示す（図３Ａ）。

【０１９２】 対照的に、ＮＡＣのＮＢドメインは、プロ−カスパーゼ９、Ａｐａｆ−１およ
びＣｅｄ−４を含む種々の他のタンパク質に結合しない（図３Ａ）。ＡＴＰを除
去するためのアピラーゼでのサンプルの処理またはハイブリダイズし得ないＹ−
Ｓ−ＡＴＰの添加は、Ａｐａｆ−１およびＣＥＤ−４について以前に報告された
ようなＡＴＰ依存性オリゴマー化と一致して、ＮＡＣのＮＢドメインの自己結合
を防いだ（図３Ｂ、３Ｃ）。他のＮＢドメインによるヌクレオチド３リン酸の結
合に必須であることが公知のＷａｌｋｅｒ Ａ ｂｏｘモチーフ（Ｐ−ｌｏｏｐ
モチーフ）（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８，７
２８−７２９）におけるリジン残基の変異は、ＮＡＣのＮＢドメインの自己結合
する能力が顕著に減少した（図３Ｄ）。従って、これらの結果は、ＮＡＣのＮＢ
ドメインがＡＴＰ依存性自己結合ドメインとしてＣＥＤ−４ファミリータンパク
質に類似して機能することを示す。

【０１９３】 自己結合の能力および他の公知のＣＡＲＤドメインに結合する能力は、他の公
知のＣＡＲＤドメインに観察される同一のタンパク質−タンパク質相互作用の能
力同様に、ＮＡＣのＣＡＲＤドメイン、ＣＡＲＤ_S、およびＣＡＲＤ_Lを確立する
。ＣＡＲＤ−Ｘの自己結合する能力はまた、このタンパク質が公知のＣＡＲＤタ
ンパク質と同一のタンパク質−タンパク質相互作用特性を有するとして確立する
。従って、新たなヒトＣＡＲＤドメインの２つのアイソフォームは特徴付けられ
、そして他のヒトタンパク質ＣＡＲＤ−Ｘの高度に関連した配列はまた、特徴付
けられた。さらに、ＮＡＣの推定のＮＢ−ＡＲＣドメインの能力は、両方の自己
結合が示され、他の公知のＮＢ−ＡＲＣドメインにおいて観察される同一のタン
パク質−タンパク質相互作用の能力としてこのドメインを確立する。従って、Ｎ
ＡＣタンパク質は、機能的ＣＡＲＤドメインおよび機能的ＮＢ−ＡＲＣドメイン
の両方を含むことが示された。

【０１９４】 （５．０ ＮＡＣのタンパク質−タンパク質相互作用） 細胞内のＮＡＣ自身、Ａｐａｆ−１、Ｎｏｄ１、およびＣＥＤ−４と相互作用
するＮＡＣの能力を、同時免疫沈降によって確認した（図４Ｂ、４Ｃ）。これら
の実験について、ｍｙｃエピトープタグを含むＮＡＣを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に
一過性のトランスフェクションによって、ＨＡタグ化ＮＡＣ、Ｆｌａｇ−Ａｐａ
ｆ−１、ＷＤドメインを欠失するＨＡ−Ａｐａｆ−１（ΔＷＤ）、ＨＡ−ＣＥＤ
−４、Ｆｌａｇ−Ｎｏｄ１または種々のコントロールタンパク質と同時発現した
（図４Ｂ、４Ｃ）。次いで、ｍｙｃ−ＮＡＣタンパク質を、免疫沈降によって回
収し、生じた免疫複合体を結合したＨＡタグ化またはＦｌａｇタグ化タンパク質
の存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロットによって分析した。

【０１９５】 結果は、これらの同時免疫沈降実験においてＮＡＣ、Ａｐａｆ−１、Ｎｏｄ１
およびＣＥＤ−４は全てＮＡＣと結合し、ここで、プロ−カスパーゼ９、ｃＩＡ
Ｐ１、ｃＩＡＰ２、Ｂｃｌ−１０、およびＡｋｔは結合しなかったことを示す（
例えば、図４ＢおよびＣを参照のこと）。興味深いことに、全長Ａｐａｆ−１と
比較して、ＮＡＣは、自己抑圧された状態でこのタンパク質を正常に維持するＷ
Ｄ反復ドメインを欠失するＡｐａｆ−１の短縮型変異体とより効果的に同時免疫
沈降した。このことは、「活性化」Ａｐａｆ−１はＮＡＣと選択的に相互作用す
ることを示唆する。

【０１９６】 （６．０ ＮＡＣ：Ａｐａｆ−１結合のゲル−ふるい（ｓｉｅｖｅ）クロマト
グラフィー分析） ＮＡＣのＡｐａｆ−１との結合をまた、Ａｐａｆ−１活性化およびアポトソー
ム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）アセンブリを誘導するように、Ｃｙｔ−ｃおよびｄ
ＡＴＰで刺激された細胞性抽出物を使用するゲル−ふるいクロマトグラフィーに
よって確認した。ＮＡＣ／Ａｐａｆ−１タンパク質複合体のサイズを評価するた
めに、２９３Ｔ細胞を、Ｆｌａｇエピトープタグ化Ａｐａｆ−１およびｍｙｃタ
グ化ＮＡＣで一過性に同時トランスフェクトした。Ｄｅｖｅｒａｕｘら（１９９
７）Ｎａｔｕｒｅ ３８８，３００−３０４に記載されたように、低張で界面活
性剤を含まない緩衝液を使用して、トランスフェクトされた細胞から細胞性抽出
物を調製し、そしてｃｙｔ−ｃ（１０μＭ）およびｄＡＴＰ（１ｍＭ）と３０℃
で５分間インキュベート（１．５ｇ）した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６ ＨＲ １０
／３０ゲルろ過カラムを使用することによって、処理したタンパク質溶解物を、
溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＤＴＴを含む）中で直ち
に分画した。カラム画分（０．５ｍｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、
引き続き抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ａｐａｆ−１について）および抗ｍｙｃ抗体（
ＮＡＣについて）を使用してイムノブロットした。

【０１９７】 分子ふるいカラムからの画分の分析は、ほとんど全てのＡｐａｆ−１およびＮ
ＡＣが、２ＭＤａを超える評価された分子量を有する巨大な複合体でともに移動
したことを示した（図４Ｄ）。これらのカラム画分を同時免疫沈降分析に使用し
て、ＮＡＣおよびＡｐａｆ−１は、共通のタンパク質複合体にさらに結合し、そ
して非結合様式ではほとんど同時移動しないことが示された。いくつかのＮＡＣ
およびＡｐａｆ−１が非刺激抽出物中でともに同時免疫沈降し得るが、Ｃｙｔ−
ｃおよびｄＡＴＰの添加によってこれらのタンパク質の結合が５倍以上に増加し
た（図４Ｅ）。さらに、ＮＡＣのＣｙｔ−ｃ活性化Ａｐａｆ−１への結合は迅速
であり、１分以内に最大になり、そして一過性であり、３０分以内に基準線レベ
ル以下に回復する。広範なスペクトルのカスパーゼ阻害剤（１００μＭのベンゾ
イル（ｂｅｎｏｚｙｌ）−バリニル−アラニニル−アスパラチル−フルオロメチ
ルケトン（ｚＶＡＤ−ｆｍｋ））の添加は、ＮＡＣ／Ａｐａｆ−１複合体の安定
性を延長した。このことは、アポトーシス後の活性化フィードバック機構の存在
を示唆した。

【０１９８】 （７．０ ＮＡＣはＡｐａｆ−１アポトーシス活性を調節する） 内在性Ａｐａｆ−１を含む細胞質ゾル抽出物は、Ｃｙｔ−ｃ誘導カスパーゼ活
性化の機構を研究するための都合の良い系を提供する。従って、Ａｐａｆ−１媒
介性カスパーゼ活性化に対するＮＡＣの効果を、ミトコンドリアの破裂および内
在性Ｃｙｔ−ｃの放出を回避するために等張性の界面活性剤を含まない条件下（
Ｄｅｖｅｒａｕｘら、前出）で調製した細胞抽出物を使用して調査した。

【０１９９】 細胞質ゾル抽出物を、（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、前出）に記載されるように２９
３Ｔ細胞から調製し、そしてカスパーゼ緩衝液中で３０分間３０℃にて種々の濃
度のｃｙｔ−ｃおよび１ｍＭ ｄＡＴＰと共にインキュベートした（１０μｇ）
。いくつかの場合、抽出物を、ｃｙｔ−ｃまたは１０ｎｇ グランザイム−Ｂ（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の添加の前に、一晩４℃にてグルタチオン−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ上に固定したＧＳＴ融合タンパク質と吸着させた。次いで、カスパーゼ
基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（１００μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加し
、そしてプロテアーゼ活性を、３７℃にて蛍光発生（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）
ＡＦＣの放出をモニターすることにより連続的に測定した。あるいは、トランス
フェクトした細胞を、タンパク質含有量について正規化したカスパーゼ溶解緩衝
液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に直接溶解し、そして
上記のようにＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの切断についてモニターした。細胞抽出物
中でのＩＶＴ［³⁵Ｓ］プロ−カスパーゼ−９のプロセシングを、（Ｃａｒｄｏｎ
ｅら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，１３１８〜１３２１）に記載される
ようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。

【０２００】 細胞質ゾル抽出物をＮＡＣタンパク質（図５Ａ）またはアンチセンスＮＡＣ転
写物（図５Ｂ）を産生する、プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細
胞から調製した。ＮＡＣについてのアンチセンスＲＮＡ発現プラスミドを、ＮＡ
Ｃ（配列番号２）のアミノ酸１〜１１２７に対応するｃＤＮＡフラグメントを、
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ中にＥｃｏＲＩ部位において逆配向で挿入することにより
構築した。

【０２０１】 内在性Ｃｙｔ−ｃの抽出物への添加は、プロ−カスパーゼ−９（Ａｐａｆ−１
の直接的な標的）のタンパク質分解性プロセシング、およびテトラペプチド基質
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ）を切断する下流カスパーゼの活性
化を生じた。ＮＡＣの過剰発現は、プロ−カスパーゼ−９のＣｙｔ−ｃ誘導プロ
セシングおよびＤＥＶＤ切断カスパーゼの活性化を増強した（図５Ａ）。対照的
に、ＮＡＣのアンチセンス媒介性減少は、Ｃｙｔ−ｃによるカスパーゼ活性化の
減少を生じた（図５Ｂ）。ＮＡＣがカスパーゼのＡｐａｆ−１依存性活性化を調
節するというさらなる証拠は、ＮＡＣの精製された組換えフラグメントとの抽出
物のプレ吸着（これは、カスパーゼのＣｙｔ−ｃ誘導活性化の抑制を生じた）（
図５Ｃ）により得られ、従ってこのことは、抽出物からのＡｐａｆ−１／ｃｙｔ
−ｃアポトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）に対するＮＡＣ親和性枯渇タンパク
質のＣＡＲＤおよびＮＢ−ドメインの関連性を示唆する。対照的に、セリン−プ
ロテアーゼ（グランザイムＢ（ＢｒａＢ））によるカスパーゼの活性化は、ＮＡ
Ｃフラグメントとの抽出物のプレ吸着によりわずかだけ影響され（図５Ｄ）、こ
のことは、これらの結果の特異性を示す。

【０２０２】 （８．０ ＮＡＣは、Ａｐａｆ−１誘導カスパーゼ活性化およびインタクトな
細胞におけるアポトーシスを増強する） 上記の実施例８．０において、ＮＡＣが細胞抽出物においてＡｐａｆ−１の機
能を調節し得ることを観察したので、一過性トランスフェクションアッセイを使
用して、ＮＡＣおよびＡｐａｆ−１がインタクトな細胞においてカスパーゼ活性
化およびアポトーシスを誘導する際に共同し得るか否かをアッセイした。２９３
Ｔ細胞を、ｐＥＧＦＰ（０．１μｇ）およびプロ−カスパーゼ−９をコードする
プラスミド（０．０５μｇ）、Ａｐａｆ−１をコードするプラスミド（０．０５
または２．０μｇ）またはＮＡＣをコードするプラスミド（０．５、１または２
μｇ）でトランスフェクトした。総ＤＮＡインプットを、空のベクターで正規化
した。減少させた血清（０．１％ウシ胎仔血清）を含む培地中で１．５日間培養
した後、浮遊細胞および接着細胞（トリプシン処理により回収した）をプールし
、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、１μｇ／ｍｌ ４’，６−ジ
アミジノ−２−フェニリンドール（ＤＡＰＩ）で染色し、そしてアポトーシス形
態（核フラグメント化、クロマチン凝縮）を有するＧＦＰ−陽性細胞の割合を、
Ｄｅｖｅｒａｕｘら（前出）およびＣａｒｄｏｎｅら（前出）に記載されるよう
に蛍光顕微鏡（平均±標準誤差、ｎ＝３）により決定した。

【０２０３】 これらの実験について、ＨＥＫ２９３Ｔ（図６）またはＨＴ１０８０細胞への
、プロ−カスパーゼ−９およびＡｐａｆ−１をコードする最適以下量のプラスミ
ドのトランスフェクションが、わずかなアポトーシスの増加のみを生じる条件を
考え出した。次いで、ＮＡＣをコードするプラスミドを、これらの細胞へ種々の
量で同時トランスフェクトした。それ自身によるかまたはプロ−カスパーゼ−９
と組み合わせられたＮＡＣの過剰発現は、アポトーシスに対してわずかな効果し
か有さなかった（図６Ａ）。対照的に、ＮＡＣは、Ａｐａｆ−１と組み合わせた
アポトーシスの容量依存性の相乗的な誘導を生じた（図６Ａ）。ＮＡＣおよびＡ
ｐａｆ−１による相乗的なカスパーゼ活性化もまた示された（図６Ｂ）。さらに
、細胞におけるＮＡＣが誘導したＡｐａｆ−１機能の増強は、プロ−カスパーゼ
−９とのＡｐａｆ−１と関連するＮＡＣが誘導した増加と相関した。これは、Ｎ
ＡＣが細胞において過剰発現される場合に（図６Ｃ）、より多いＡｐａｆ−１が
抗−カスパーゼ−９免疫沈降において回収され得ることを示す、同時免疫沈降実
験に基づいた。

【０２０４】 全長ＮＡＣは、Ａｐａｆ−１とプロ−カスパーゼ−９との組み合わせを過剰発
現することにより誘導されるアポトーシスおよびカスパーゼ活性化を増強したが
、ＣＡＲＤまたはＮＢ−ドメインのみを含むＮＡＣのフラグメントは、反対の効
果を有し、Ａｐａｆ−１とプロ−カスパーゼ−９トランスフェクションとの組み
合わせにより誘導されるアポトーシスを妨害した（図６Ｄ）。ミトコンドリア／
Ｃｙｔ−ｃ依存性細胞死刺激（スタウロスポリン）により誘導されたアポトーシ
スはまた、優性阻害（ＮＡＣのＣＡＲＤおよびＮＢフラグメント）により抑制さ
れ、一方、Ａｐａｆ−１依存性刺激（Ｆａｓ）により誘導されるアポトーシスは
、影響されなかった（図６Ｄ）。従って、これらの結果は、ＮＡＣがＡｐａｆ−
１により支配されるアポトーシス経路を特異的に調節することを示す。

【０２０５】 （９．０ ＮＡＣは、Ｎｏｄ１誘導アポトーシスを増強する） ＮＡＣは、ＣＥＤ−４ファミリーメンバー（Ｎｏｄ１）と結合するので（図４
Ｃ）、Ｎｏｄ１の過剰発現により誘導されるアポトーシスに対する、ＮＡＣのＣ
ＡＲＤのみを示すＮＡＣ全長タンパク質またはフラグメントを同時発現すること
の効果をアッセイした。全長ＮＡＣを用いる実験について、プロ−カスパーゼ−
９と組み合わせたＮｏｄ１の最適以下量のトランスフェクションが、ＨＥＫ２９
３Ｔ細胞（図７Ａ）またはＨＴ１０８０細胞のいずれかにおけるアポトーシスの
わずかな増加しか誘導しない条件を同定した。次いで、全長ＮＡＣをコードする
種々の量のプラスミドＤＮＡを同時トランスフェクトした。それ自身またはプロ
−カスパーゼ−９と組み合わせることにより、全長ＮＡＣは、アポトーシスに対
してわずかな効果しが有さなかった。しかし、最適以下量のＮｏｄ１との組み合
わせにおいて、ＮＡＣは、アポトーシスにおける容量依存性増加を誘導した（図
７Ａ）。

【０２０６】 Ｎｏｄ１誘導アポトーシスを増強する全長ＮＡＣと対照的に、配列番号２の１
１２９〜１４７３のアミノ酸に対応するＣＡＲＤドメインのみを含むＮＡＣのフ
ラグメントは、Ｎｏｄ１誘導アポトーシスを抑制した。ＮＡＣのＣＡＲＤドメイ
ンの効果を試験するために、Ｎｏｄ１プラスミドのより高い量を使用する条件を
同定し、これは、プロ−カスパーゼ−９と組み合わせて７５％を超えるアポトー
シスを含んだ。次いで、ＣＡＲＤおよびＮＡＣをコードする種々の量のプラスミ
ドＤＮＡを同時トランスフェクションし、これは、Ｎｏｄ１誘導アポトーシスに
おける容量依存性減少を示した（図７Ａ）。イムノブロッティング実験は、全長
ＮＡＣ（図７Ｂ）もＣＡＲＤドメインフラグメントもどちらもＮｏｄ１またはプ
ロ−カスパーゼ−９のレベルを変更せず、このことは、ＮＡＣがこれらのタンパ
ク質のレベルよりもむしろ活性を調節することを示した。

【０２０７】 さらに、同時免疫沈降実験は、ＮＡＣ、Ｎｏｄ１およびプロ−カスパーゼ−９
が多重タンパク質複合体を形成するという間接的な証拠を提供した。図７Ｂに示
されるように、Ｎｏｄ１は、これらのタンパク質が結合し得るという報告と一致
して、プロカスパーゼ−９（レーン４）と容易に同時免疫沈降した。対照的に、
非常に小さなＮＡＣが、ＮＡＣがプロ−カスパーゼ−９を直接結合しないことを
示す本発明者らの結果を一致して、Ｎｏｄ１が過剰発現されない細胞溶解産物か
ら調製された抗カスパーゼ−９免疫複合体において存在した（レーン５）。しか
し、Ｎｏｄ１およびＮＡＣが細胞中で同時発現される場合、プロカスパーゼ−９
の免疫沈降は、免疫複合体とのＮｏｄ１およびＮＡＣの両方の結合を明らかにし
（レーン６）、このことは、Ｎｏｄ１がＮＡＣをプロ−カスパーゼ−９に結合さ
せることを示した。これらの結果は、ＮＡＣがＮｏｄ１と結合しそしてＮｏｄ１
のプロアポトーシス機能を調節し得ることを示した。

【０２０８】 （１０．０ ＣＡＲＤ−Ｘは、このＣＡＲＤドメインを介してカスパーゼ９と
相互作用する） 全長ＣＡＲＤ−Ｘを、ＥＳＴクローン（ＫＩＡ０９９５）から、そのＮ末端に
おいてＭｙｃタグを含むｐＣＤＮＡ３ベクターのＥｃｏＲ１／Ｘｈｏ１部位へ、
ＰＣＲを使用して構築した。同じベクターを使用して、そのＣＡＲＤドメインを
欠くＣＡＲＤ−Ｘにおいてクローン化し、そして配列番号８のアミノ酸３４５〜
４３１に対応するＣＡＲＤドメイン単独においてクローン化した。

【０２０９】 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＣＤＮＡ３ Ｆｌａｇタグ化カスパーゼ９のＣ／Ａ
変異体の存在下または非存在下で、ｐＣＤＮＡ３ Ｍｙｃタグ化全長ＣＡＲＤ−
Ｘ、ＣＡＲＤ−Ｘ ΔＣＡＲＤのいずれかで、またはＣＡＲＤドメイン単独でト
ランスフェクトした。４８時間後、細胞をＨＫＭＥＮ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩
衝液、１４２．５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび
０．２％ＮＰ−４０）緩衝液中で溶解し、そして抗ｍｙｃタグ化タンパク質セフ
ァロースビーズと共に免疫沈降に供した。サンプルを４℃にて１時間インキュベ
ートし、ＨＫＭＥＮ中で２回洗浄し、そしてＳＤＳ−サンプル緩衝液中で５分間
煮沸した。次いで、サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そして
ＰＶＤＦ膜上へ移し、これを１時間５％ミルク／ＢＳＡ中でブロッキングし、続
いて抗カスパーゼ９または抗ＣＡＲＤ−Ｘ抗ペプチド抗体とインキュベートした
。膜をＥＣＬ検出システムにより現像した。

【０２１０】 これらの結果は、全長ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＲＤドメインが単独で、ＣＡＲ
Ｄドメインを介してカスパーゼ−９と相互作用することを示す。

【０２１１】 （１１．０ Ｂａｘ媒介性アポトーシスに対するＣＡＲＤ−Ｘの効果） 全長ＣＡＲＤ−Ｘ、ＣＡＲＤ−Ｘ ΔＣＡＲＤ、およびＣＡＲＤ−Ｘ ＣＡＲ
ＤドメインをｐｃＤＮＡ３ Ｂａｘの存在下（５〜８）または非存在下（１〜４
）でＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションによりＭｙｃタグ化
タンパク質として発現し、そしてＢａｘ単独（レーン５）と比較した。細胞を２
４時間後に回収し、３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてＤＡＰＩで
染色した。アポトーシスの割合を、顕微鏡観察後に定量化した。結果を図８に示
し、そしてこれは、全長ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメインが
、Ｂａｘ媒介性アポトーシスを約７０％阻害することを示す。

【０２１２】 （１２．０ カスパーゼ９媒介性アポトーシスに対するＣＡＲＤ−Ｘの効果） ＨＥＫ２９３細胞を、全長ＣＡＲＤ−Ｘ、ＣＡＲＤ−Ｘ ΔＣＡＲＤ、および
ＣＡＲＤ−Ｘ ＣＡＲＤタンパク質の存在下または非存在下で、野生型ｆｌａｇ
タグ化カスパーゼ９およびＡｐａｆ−１で一過性にトランスフェクトした。２４
時間後に細胞を回収し、３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてＤＡＰ
Ｉで染色した。アポトーシスの割合を、顕微鏡観察後に定量化した。結果を図９
に示し、そしてこれは、全長ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＲＤ−ＸのＣＡＲＤドメイ
ンが、カスパーゼ−９媒介性アポトーシスを約５０％阻害することを示す。

【０２１３】 （１３．０ ＣＡＲＤ−Ｘは、カスパーゼ９を結合することについてＡｐａｆ
−１と競合する） Ｆｌａｇタグ化カスパーゼ９およびＭｙｃタグ化Ａｐａｆ−１（１〜５６０’
）を、２９３Ｔ細胞へ４８時間一過性同時トランスフェクトした。細胞を０．２
％ＨＫＭＥＮ中で溶解し、そして抗ｍｙｃセファロースビーズと共に免疫沈降に
供した。ビーズをＨＫＭＥＮ中で洗浄し、続いて時前に全長ＣＡＲＤ−Ｘでトラ
ンスフェクトした２９３Ｔ細胞からの増加した量の溶解産物の非存在下（レーン
１）または存在下（レーン２〜５）でインキュベーションした。サンプルを洗浄
し、そしてタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ
膜へブロッティングし、そして抗カスパーゼ９抗体でイムノブロットした。結果
は、ＣＡＲＤ−Ｘがカスパーゼ９へのＡｐａｆ−１の結合を競合的に阻害するこ
とを示す。

【０２１４】 本発明を、上記の実施例を参照して記載してきたが、本発明の精神から逸脱す
ることなく種々の改変がなされ得ることは理解されるべきである。従って、本発
明は、上記の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、ＮＡＣβといわれるヒトＮＡＣの最も長いアイソフォームのドメイ
ン構造を示す略図を示す。ＮＢ（ヌクレオチド結合）ドメイン（アミノ酸３２９
−５４７、塗りつぶしたボックス）、ロイシンリッチの反復（ＬＲＲ、アミノ酸
８０８−９４７、塗りつぶした棒）、およびＣＡＲＤ（カスパーゼ関連漸増ドメ
イン（Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｄｏｍａｉｎ））（アミノ酸１３７３−１４７
３、点付きのボックス）を示す。斜線付きのボックスは、２つの選択的にスプラ
イシングされたエキソン由来の配列を示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、最も長いヒトＮＡＣアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号２に
もまた記載される）を示す。ＮＢドメインのＰ−ループ（ＷａｌｋｅｒＡ）およ
びＷａｌｋｅｒＢの位置が示されている。ＬＲＲ反復およびＣＡＲＤのアミノ酸
配列はそれぞれ、下線が引かれ、そして太字である。斜体の文字は、選択的スプ
ライシングされたエキソンの配列を示す。

【図１Ｃ】 図１Ｃは、ＮＡＣ：ＮＢ−ＡＲＣ相同性の配列分析を示す。Ｎｏｄ１／ＣＡＲ
Ｄ４のＮＢドメイン（アミノ酸１９７−４０８）、およびＡｐａｆ−１のＮＢ−
ＡＲＣドメイン（アミノ酸１３８−３５５）ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ＣＥ
Ｄ−４（アミノ酸１５４−３７４）とのＮＡＣのＮＢドメイン（アミノ酸３２９
−５４７）の整列。整列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ．法を用いて行った（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９
４））。同一および類似の残基を、黒および灰色の陰影でそれぞれ示す。Ｐ−ル
ープおよびＷａｌｋｅｒＢ配列の位置を示す。

【図１Ｄ】 図１Ｄは、ＮＡＣのＣＡＲＤドメイン（アミノ酸１３７３−１４６５）、Ｎｏ
ｄ１／ＣＡＲＤ４（アミノ酸１５−１０４）、Ａｐａｆ−１（アミノ酸１−８９
）、およびＣＥＤ−４（アミノ酸２−８９）の整列を示す。同一および類似の残
基を、それぞれ黒および灰色の陰影で示す。

【図１Ｅ】 図１Ｅは、ＮＡＣ ＣＡＲＤドメインの３Ｄ構造予想を示す。ＮＡＣのＣＡＲ
Ｄドメインの構造を、Ｒａｉｄｄ、Ａｐａｆ−１、およびプロ−カスパーゼ−９
の構造に基づいてモデリングした。６つのα−へリックスを標識する（Ｈ１〜Ｈ
６）。ＮＡＣのＣＡＲＤドメインの予想された構造のモデルを、Ａｐａｆ−１、
プロ−カスパーゼ−９、およびＲａｉｄｄのＣＡＲＤの構造に基づいて、本質的
には記載されるように（Ｓｃｈｅｎｄｅｌら（１９９９）ＪＢＣ ２７４，２１
９３２−２１９３６）、ＭＯＤＰＥＬＬＥＲプログラムを用いて作製した（Ｃｈ
ｏｕら（１９９８）Ｃｅｌｌ ９４，１７１−１８０；およびＱｉｎら（１９９
９）Ｎａｔｕｒｅ ３９９（６７３６），５４９−５５７）。

【図２】 図２は、ＮＡＣの複数のアイソフォームを示す。ＮＡＣのアイソフォームを、
選択的ｍＲＮＡスプライシングによって、ｃＤＮＡクローニングの結果に基づい
て作製する。図１Ａと同じ記号を使用する。２つの選択的スプライシングされた
エキソンは、点付きのボックスおよび斜線付きのボックスとしてそれぞれ示され
る。得られた４つのアイソフォームを、ＮＡＣα、ＮＡＣβ、ＮＡＣγおよびＮ
ＡＣδと記載する。

【図３】 図３は、実施例４．０からの結果を示し、これはＮＢ−ドメインのＡＴＰ依存
性自己会合を実証する。（Ａ）精製されたＧＳＴコントロールタンパク質または
ＮＡＣのＮＢ−ドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＢ）（ＧＳＨ
−セファロースビーズ上に固定化された、０．５μｇ）を、³⁵Ｓ−標識した、イ
ンビトロ翻訳された（ＩＶＴ）ＮＡＣのＮＢ−ドメイン（ＮＡＣ−ＮＢ）（上）
またはプロ−カスパーゼ−９（下）と共にインキュベートした。結合したタンパ
ク質を溶出し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。インプットＩＶＴタ
ンパク質（レーン１）の１０分の１を、比較のために直接ロードした。（Ｂ）示
されるようにＧＳＴまたはＧＳＴ−ＮＢの吸収の前にＡＴＰを枯渇するために、
網状赤血球溶解物におけるＩＶＴ［³⁵Ｓ］−ＮＡＣ−ＮＢを、３０℃で３０分間
、種々の濃度（０〜１０単位）のアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて（＋）、ま
たは用いずに（−）インキュベートした。（Ｃ）固定化したＧＳＴ−ＮＢへのＩ
ＶＴ［³⁵Ｓ］−ＮＡＣ−ＮＢの結合を、種々の濃度のγ−Ｓ−ＡＴＰの存在下で
行った。（Ｄ）ＮＡＣ ＮＢ−ドメインのＰ−ループにおける変異は、自己会合
を妨げる。ＮＡＣの野生型（ＷＴ）（レーン１〜３）およびＫ３４０Ｍ変異体（
レーン４〜６）ＮＢ−ドメインを、ＧＳＴ融合物として作製し、そして細菌から
精製するか、またはこれらをインビトロ翻訳（ＩＶＴ）によって³⁵Ｓ−標識化タ
ンパク質として作製した。グルタチオン−セファロース（０．５μｇ）上に固定
化されたＷＴまたはＫ３４０ＭのいずれかのＮＢ−ドメインを含むＧＳＴコント
ロールまたはＧＳＴ融合物を、上記のように１ｍｌのＩＶＴタンパク質を用いて
インキュベートし、次いで洗浄し、そして吸着されたタンパク質を溶出し、そし
てＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。インプットＩＶＴタンパク質（レーン１および
４）の１０分の１を、比較として含めた。

【図４】 図４は、実施例５．０からの結果を示し、これは、ＮＡＣが、それ自身および
Ｃｅｄ−４ファミリータンパク質と複合体を形成することを実証する。（Ａ）Ｃ
ＡＲＤ−ＣＡＲＤ相互作用。ＮＡＣのＩＶＴ［³⁵Ｓ］−標識化ＣＡＲＤドメイン
、Ａｐａｆ−１のＣＡＲＤ、ＣＥＤ−４、またはプロカスパーゼ−９およびＢｃ
ｌ−１０を、固定化されたＧＳＴ（レーン２）またはＮＡＣのＣＡＲＤ（ＮＡＣ
ＣＡＲＤ）を含むＧＳＴ融合物（レーン３）を用いてインキュベートした。イ
ンプットＩＶＴ［³⁵Ｓ］タンパク質の１０分の１をまた、ゲルに直接ロードした
（レーン１）。（Ｂ）全長ＮＡＣは、Ａｐａｆ−１、ＣＥＤ−４、およびそれ自
体と複合体を形成する。ヒト２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートで培養し、そして
ｍｙｃタグ化全長ＮＡＣ（ｍｙｃ−ＮＡＣ）をコードするｐｃＤＮＡ３（１μｇ
）の存在下（＋）、または非存在下（−）で、エピトープタグ化（ＨＡまたはＦ
ｌａｇタグ）全長ＨＡ−ＮＡＣ、全長Ｆｌａｇ−Ａｐａｆ−１、ＷＤ反復を欠く
ＨＡ−Ａｐａｆ−１［ＨＡ−Ａｐａｆ−１（ΔＷＤ）］、ＨＡ−ＣＥＤ−４、ま
たは触媒的部位変異（Ｃ２８７Ａ）を有するプロ−カスパーゼ−９の不活性形態
（ＨＡ−カスパーゼ−９）をコードする発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３、各１μ
ｇ）を用いて過渡的にトランスフェクトした。免疫沈降（ＩＰ）を、１日後に、
ｍｙｃに対するマウスモノクローナル抗体（レーン４および６）またはコントロ
ールマウスＩｇＧ（Ｃｎｔｌ）（レーン５）のいずれかを使用して、行った。免
疫複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、そして抗ＨＡまたは抗Ｆｌａｇ
抗体を使用するイムノブロッティングによって分析した。各々のトランスフェク
ション由来の溶解物（ＩＰインプットの１０％）を、コントロールとしてゲルに
直接ロードした（レーン１〜３）。あるいは、これらの相互作用の結果を、示さ
れた標的タンパク質由来の免疫複合体におけるｍｙｃ−ＮＡＣをプローブするこ
とによってさらに確認した。（Ｃ）ＮＡＣは、Ｎｏｄ１と関連する。Ｍｙｃタグ
化全長ＮＡＣを、Ｆｌａｇタグ化Ｎｏｄ１を用いて、または用いずに、同時トラ
ンスフェクトした。同時免疫沈降を、抗Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナル抗体を用
いて行い、そして得られた免疫複合体を、抗ｍｙｃ抗体を使用してＮＡＣについ
てプローブした（レーン３および４）。各々のトランスフェクション由来の溶解
物（ＩＰインプットの１０％）を、コントロールとしてゲルに直接ロードした（
レーン１および２）。あるいは、ＮＡＣ／Ｎｏｄ１相互作用を、ＮＡＣ免疫複合
体においてＮｏｄ１をプローブすることによってさらに確認した。（Ｄ）Ａｐａ
ｆ−１／ＮＡＣタンパク質複合体のゲル篩クロマトグラフィー分析。Ｆｌａｇタ
グ化Ａｐａｆ−１およびｍｙｃタグ化ＮＡＣを同時発現する細胞から調製した溶
解物を、ｃｙｔ−ｃ（１０μＭ）／ｄＡＴＰ（１μＭ）で５分間、３０℃で処理
し、次いで１００ｍｍ ｚＶＡＤ−ｆｍｋを添加し、そしてこのサンプルを、セ
ファロース−６ゲル濾過カラム上での分画の前に、氷上に置いた。カラム画分を
、それぞれ抗Ｆｌａｇおよび抗−ｍｙｃエピトープ抗体を使用して、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ／イムノブロッティングによって、Ａｐａｆ−１およびＮＡＣについてア
ッセイした。分子量マーカーの位置および空隙容積画分を示した。Ａｐａｆ−１
およびＮＡＣを含む画分をプールし、Ａｐａｆ−１を回収するために抗Ｆｌａｇ
抗体を用いるか、またはＩｇＧコントロール抗体（Ｃｎｔｌ）を用いて免疫沈降
し、そして得られた免疫複合体を、抗ｍｙｃエピトープ抗体を使用してＮＡＣに
ついてイムノブロッティングした。（Ｅ）ｃｙｔ−ｃによって誘導されるＮＡＣ
／Ａｐａｆ−１会合の時間経過。Ｆｌａｇ−Ａｐａｆ−１およびＨＡ−ＮＡＣを
発現する細胞溶解物を、ｃｙｔ−ｃ（１０μＭ）／ｄＡＴＰ（１ｍＭ）で種々の
時間処理し、そして抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降に供した。得られたＡｐａ
ｆ−１免疫複合体を、ＮＡＣの存在についてイムノブロッティングによって分析
した。レーン６（アスタリスク）は、このアッセイが、カスパーゼインヒビター
、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）の存在下で行われた場合の結果を示す。カスパ
ーゼインヒビターは、Ａｐａｆ−１／ＮＡＣ複合体を安定化すると思われること
に注意のこと。

【図５】 図５は、実施例７．０からの結果を示し、ＮＡＣがｃｙｔ−ｃ誘導カスパーゼ
活性化を調節することを実証する。（Ａ）ＮＡＣは、ｃｙｔ−ｃ誘導プロ−カス
パーゼ−９プロセシングおよびＤＥＶＤ切断活性を増強する。１０ｃｍプレート
において、ヒト２９３Ｔ細胞を、全長ＮＡＣをコードするｐｃＤＮＡ３プラスミ
ド（１０μｇ）または空の（ｅｍｐｔｙ）ベクター（ＣＮＴＬ）を用いてトラン
スフェクトした。２４時間後、細胞質抽出物を、低張性の界面活性剤を含まない
条件を使用して、トランスフェクトされた細胞から調製した。細胞溶解物（１０
μｇ）を、［³⁵Ｓ］プロ−カスパーゼ−９と共に、ｃｙｔ−ｃ（１０μＭ）およ
びｄＡＴＰ（１μＭ）（ｃｙｔ−ｃ）の存在下または非存在下で３０℃にて６０
分間インキュベートした。プロ−カスパーゼ−９プロセシングをモニターするた
めに、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして蛍光写真により視覚化し
た（上部パネル）。あるいは、抽出物におけるＤＥＶＤａｓｅ活性を測定した。
種々の濃度のｃｙｔ−ｃを添加し（下部パネル）、そしてカスパーゼ基質Ａｃ−
ＤＥＶＤ−ＡＦＣからのＡＦＣの放出をモニターした［１ｍｇのタンパク質あた
り１分間についての相対的蛍光単位（ＲＦＵ）として表す］。（Ｂ）１０ｃｍプ
レートにおいて、ヒト２９３Ｔ細胞を、逆方向でＮＡＣ ｃＤＮＡを含むｐｃＤ
ＮＡ３（１０μｇ）（ＮＡＣ ＡＳ）または空のベクター（ＣＮＴＬ）を用いて
トランスフェクトした。３６時間培養後、細胞質抽出物を調製し、タンパク質濃
度について正規化し、そしてカスパーゼ（ＤＥＶＤａｓｅ）のｃｙｔ−ｃ活性化
についてアッセイした。結果をコントロールのパーセント（平均±ＳＥ、ｎ＝３
）として表す）。上部パネルは、ＡＳ−ＮＡＣを含むかまたは含まない、エピト
ープタグ化ＮＡＣまたはＡｐａｆ−１の同時発現による並行実験から誘導される
細胞溶解物におけるＮＡＣおよびＡｐａｆ−１の免疫ブロットを示し、ＮＡＣに
おいてアンチセンス媒介減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を示すがＡｐａｆ−１では
示さない。（ｃ）ＧＳＴコントロール、またはＮＡＣのＣＡＲＤもしくはＮＢ−
ドメイン（ＮＢ）を含むＧＳＴ融合タンパク質を使用して行われたＧＳＴアフィ
ニティー吸着後の細胞溶解物において、ＤＥＶＤａｓｅ活性を測定した。ｃｙｔ
−ｃ（１μＭ）およびｄＡＴＰ（１ｍＭ）により誘導されたＤＥＶＤａｓｅ活性
を連続して測定し、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣからのＡＦＣ放出（ＲＦＵ／１μｇ
のタンパク質）をモニターした。挿入図は、吸着に使用されたＧＳＴ融合タンパ
ク質のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を表す。（Ｄ）細胞抽出物を「Ｃ
」におけるように、ＧＳＴ−アフィニティー吸収に供し、次いでカスパーゼを１
０ｎｇのＧｒａＢまたは１μＭのｃｙｔ−ｃのいずれかを使用して活性化した（
平均％ＧＳＴコントロール±ＳＥ、ｎ＝３）。

【図６】 図６は、ＮＡＣがアポトーシスのＡｐａｆ−１誘導およびカスパーゼ活性化を増
強することを示す実施例８．０からの結果を示す。（Ａ）２９３Ｔ細胞を、示さ
れるように、ｐＥＧＦＰ（０．１μｇ）、およびプロカスパーゼ−９（０．０５
μｇ）、Ａｐａｆ−１（０．０５または２．０μｇ）またはＮＡＣ（０．５、１
、または２μｇ）をコードするプラスミドで、トランスフェクトした。総ＤＮＡ
投入量を、空のベクターで正規化した。トランスフェクトした細胞を、０．１％
のウシ胎仔血清を含有する培地において１．５日間培養し、次いで、ＤＡＰＩで
固定および染色した。％ＧＦＰポジティブアポトーシス細胞（核断片化およびク
ロマチン凝縮を示す）を、蛍光顕微鏡によって決定した（平均±ＳＥ、ｎ＝３）
。（Ｂ）プロカスパーゼ−９（０．０５μｇ ＤＮＡ）、Ａｐａｆ−１（０．０
５μｇ）、ＮＡＣ（２μｇ）、または示されるような種々の組み合わせをコード
するプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞質抽出物を、ＡＣ−
ＤＥＶＤ−ＡＦＣの細胞溶解物への添加およびＡＦＣ放出（ＲＦＵ／μｇ溶解物
）の経時的な連続的モニタリングにより、カスパーゼ活性についてアッセイした
。示されていないが、無視できるカスパーゼ活性を、Ａｐａｆ−１、ＮＡＣ、ま
たはＮＡＣとＡｐａｆ−１との組み合わせで（プロカスパーゼ−９の非存在下で
）トランスフェクトした細胞の溶解物において検出した。（Ｃ）ＮＡＣ、Ａｐａ
ｆ−１、およびカスパーゼ−９を含む三重複合体形成。２９３Ｔ細胞を、Ｆｌａ
ｇタグ化プロカスパーゼ−９との組み合わせにおいて（レーン２および３）およ
びｍｙｃタグ化ＮＡＣとの組み合わせにおいて（レーン３）、Ｆｌａｇタグ化Ａ
ｐａｆ−１でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ｚＶＡＤ−
ｆｍｋ（１００μＭ）の存在下で２４時間培養し、次いで、低浸透圧性の、界面
活性剤を含まない条件下で、５０μＭのｚＶＡＤ−ｆｍｋの存在下で溶解した。
細胞溶解物を、ウサギポリクローナル抗ヒトカスパーゼ−９抗体を使用して、免
疫沈降に供した。得られた免疫複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分画し、ニ
トロセルロース膜に移し、そして引き続いてトランスフェクトしたＡｐａｆ−１
およびプロカスパーゼ−９の存在について抗Ｆｌａｇ抗体を使用して（上部パネ
ル）、そしてＮＡＣについては抗ｍｙｃ抗体を使用した（下部パネル）プローブ
した。（Ｄ）２９３Ｔ細胞を、０．１μｇのｐＥＧＦＰ ＤＮＡおよびＮＡＣの
ＣＡＲＤまたはＮＢドメインをコードするプラスミドの０．５もしくは２μｇの
いずれかで、プロカスパーゼ−９（０．０５μｇ）およびＡｐａｆ−１（１μｇ
）、Ｆａｓ（０．３μｇ）をコードする発現プラスミドとともにトランスフェク
トした。あるいは、細胞を、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅで処理した（ＳＴＳ、
１μＭで５時間）。細胞を固定し、そしてＤＡＰＩで染色し、そしてアポトーシ
スについてスコアした（平均±ＳＥ、ｎ＝３）。

【図７】 図７は、実施例９．０の結果が、ＮＡＣがアポトーシスのＮｏｄ１誘導を増強
すること実証することを示す。（Ａ）２９３Ｔ細胞を、ｐＥＧＦＰ（０．１μｇ
）ならびに、示されるようなプロ−カスパーゼ−９（０．０５μｇ）、Ｎｏｄ１
、ＮＡＣ、およびＮＡＣ−ＣＡＲＤをコードする種々の量の発現プラスミドを用
いてトランスフェクトした（各トランスフェクションのための総ＤＮＡインプッ
トを、空のベクターを用いて規格化した）。トランスフェクトした細胞を、０．
１％のウシ胎児血清を含む培地中で１．５日かけて培養し、次いで、固定し、そ
してＤＡＰＩを用いて染色した。この％ＧＦＰ−ポジティブアポトーシス細胞（
核の切断およびクロマチンの縮合を示す）を、蛍光顕微鏡によって決定した（平
均±ＳＥ、ｎ＝３）。（Ｂ）ＮＡＣは、Ｎｏｄ１を介してカスパーゼ−９と間接
的に結合し得る。２９３Ｔ細胞を、プロ−カスパーゼ−９の不活性形態をコード
する発現プラスミドを用いて過渡的にトランスフェクトした。このプロ−カスパ
ーゼ−９の不活性形態は、示されるように、Ｆｌａｇ標識Ｎｏｄ１（１μｇ）お
よびｍｙｃ標識ＮＡＣ（１μｇ）と共に、触媒残基Ｃ２８７Ａ［プロ−カスパー
ゼ−９（Ｃ２８７Ａ）］（１μｇ）の置換変異体を含む。各トランスフェクショ
ンのための総ＤＮＡインプットを、空のベクターを用いて規格化した。細胞質抽
出物を、緩衝液Ａを使用して調製し、そしてウサギポリクローナル抗−カスパー
ゼ−９抗体（レーン４〜６）を用いて免疫沈降（ＩＰ）に供した。得られた免疫
−複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移し、そし
て特定の抗体を使用するＮＡＣ、Ｎｏｄ１、およびカスパーゼ−９に対して連続
してプローブした。各トランスフェクトのＩＰのために使用した溶解産物の１／
１０を、コントロール（溶解産物；レーン１〜３）としてゲル上に直接的に充填
した。

【図８】 図８は、実施例１１．０に記載されるように、Ｂａｘ媒介アポトーシスにおけ
るＣＡＲＤ−Ｘの効果を示す。

【図９】 図９は、実施例１２．０に記載されるように、カスパーゼ９媒介アポトーシス
におけるＣＡＲＤ−Ｘの効果を示す。

【図１０】 図１０は、実施例１３．０の結果は、ＣＡＲＤ−ＸがＡｐａｆ−１と競合して
カスパーゼ−９と結合することを実証することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８５ 48/00 13/08 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 9/00 17/02 ４Ｈ０４５ 13/08 19/02 17/02 29/00 19/02 31/00 29/00 35/00 31/00 35/02 35/00 37/06 35/02 43/00 １０５ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｍ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA01 CA04 CA07 CA09 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 HA12 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ01 QQ13 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR82 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 AG27 CA01 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 AA16 BA08 BA10 BA17 BA22 CA53 DC50 MA17 NA14 ZA362 ZA812 ZA892 ZA962 ZB082 ZB112 ZB272 ZB322 ZB352 ZC412 ZC542 4C085 AA13 AA14 BB11 CC22 CC23 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA17 NA14 ZA36 ZA81 ZA89 ZA96 ZB08 ZB11 ZB27 ZB32 ZB35 ZC41 ZC54 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA00 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (103)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（ＮＡＣ）をコ
   ードする単離された核酸であって、この核酸は、以下： （ａ）配列番号２に開示されたアミノ酸配列をコードする核酸、または （ｂ）配列番号２に開示されたアミノ酸配列の機能的フラグメントをコードする
   核酸であって、該機能的フラグメントが、配列番号２のアミノ酸１２６１−１３
   ０５を含み、該機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ−
   ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する核酸、または、 （ｃ）配列番号２に開示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一のアミノ酸
   配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが、配列
   番号２のアミノ酸１２６１−１３０５を含み、該ポリペプチドが、ＣＡＲＤ含有
   タンパク質もしくはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する核酸、
   から選択される、単離された核酸。
2. 【請求項２】 配列番号２に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチ
   ドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
3. 【請求項３】 前記核酸のヌクレオチド配列が配列番号１に開示された配列
   と同一である、請求項１に記載の核酸。
4. 【請求項４】 ＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（ＮＡＣ）をコ
   ードする単離された核酸であって、この核酸は、以下： （ａ）配列番号４に開示されたアミノ酸配列をコードする核酸、または （ｂ）配列番号４に開示されたアミノ酸配列の機能的フラグメントをコードする
   核酸であって、該機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ
   −ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する核酸、または、 （ｃ）配列番号４に開示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一のアミノ酸
   配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが、配列
   番号２のアミノ酸９５７−９８７をコードせず、該ポリペプチドが、ＣＡＲＤ含
   有タンパク質またはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する核酸、
   から選択される、単離された核酸。
5. 【請求項５】 前記核酸のヌクレオチド配列が、配列番号３に開示された配
   列と同一である、請求項４に記載の核酸。
6. 【請求項６】 配列番号４に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチ
   ドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の核酸。
7. 【請求項７】 ＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（ＮＡＣ）をコ
   ードする単離された核酸であって、この核酸は、以下： （ａ）配列番号６に開示されたアミノ酸配列をコードする核酸、または、 （ｂ）配列番号６に開示されたアミノ酸配列の機能的フラグメントをコードする
   核酸であって、該機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ
   −ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する核酸、または、 （ｃ）配列番号６に開示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一のアミノ酸
   配列を有するポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが、配列
   番号２のアミノ酸９５７−９８７をコードせず、該ポリペプチドが、ＣＡＲＤ含
   有タンパク質またはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する、核酸
   、 から選択される、単離された核酸。
8. 【請求項８】 前記核酸のヌクレオチド配列が、配列番号５に開示された配
   列と同一である、請求項７に記載の核酸。
9. 【請求項９】 配列番号６に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチ
   ドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の核酸。
10. 【請求項１０】 前記核酸がｃＤＮＡである、請求項１、４または７に記載
    の核酸。
11. 【請求項１１】 請求項１、４または７に記載の核酸を含む、ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１、４または７に記載の核酸を含む、組換え細胞。
13. 【請求項１３】 配列番号２のアミノ酸１３７３−１４７３をコードするヌ
    クレオチド配列を含む、請求項１、４または７に記載の核酸。
14. 【請求項１４】 配列番号２のアミノ酸３２９−５４７をコードするヌクレ
    オチド配列を含む、請求項１、４または７に記載の核酸。
15. 【請求項１５】 配列番号２のアミノ酸８０８−９４７をコードするヌクレ
    オチド配列を含む、請求項１、４または７に記載の核酸。
16. 【請求項１６】 配列番号２のアミノ酸３２９−３４２をコードするヌクレ
    オチド配列を含む、請求項１、４または７に記載の核酸。
17. 【請求項１７】 配列番号２のアミノ酸４０６−４１４をコードするヌクレ
    オチド配列を含む、請求項１、４または７に記載の核酸。
18. 【請求項１８】 配列番号２のアミノ酸１０７９−１３２０をコードするヌ
    クレオチド配列を含む、請求項１、４または７に記載の核酸。
19. 【請求項１９】 配列番号２のアミノ酸１２６１−１３０５をコードする配
    列番号１に開示されたヌクレオチド配列と同じであるかもしくは相補体であるか
    、またはその一部である、少なくとも２０個連続した塩基を含む、オリゴヌクレ
    オチド。
20. 【請求項２０】 配列番号１のヌクレオチド９８５−１６４１として開示さ
    れるヌクレオチド配列もしくはその相補体からなるか、または、そこからの少な
    くとも２０個連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
21. 【請求項２１】 配列番号１のヌクレオチド２４２２−２８４４として開示
    されるヌクレオチド配列もしくはその相補体からなるか、または、そこからの少
    なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
22. 【請求項２２】 配列番号１のヌクレオチド３２３５−３９６０として開示
    されるヌクレオチド配列もしくはその相補体からなるか、または、そこからの少
    なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
23. 【請求項２３】 配列番号１のヌクレオチド２８７０−２９５９として開示
    されるヌクレオチド配列もしくはその相補体からなるか、または、そこからの少
    なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
24. 【請求項２４】 配列番号１のヌクレオチド４１１７−４４１９として開示
    されるヌクレオチド配列もしくはその相補体からなるか、または、そこからの少
    なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 前記オリゴヌクレオチドが、検出可能なマーカーで標識さ
    れた、請求項１９、２０、２１、２２、２３または２４に記載のオリゴヌクレオ
    チド。
26. 【請求項２６】 請求項１９、２０、２１、２２、２３または２４に記載の
    ヒトＮＡＣの発現を阻害するために有効な量のアンチセンス核酸および細胞膜を
    通過可能な受容可能な疎水性キャリアを含む、組成物。
27. 【請求項２７】 請求項２５に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ
    含む、ＮＡＣ ｃＤＮＡ配列の存在を検出するための、キット。
28. 【請求項２８】 請求項１、４または７に記載の核酸を発現するトランスジ
    ェニック非ヒト哺乳動物であって、該核酸が該トランスジェニック非ヒト動物に
    外因性である、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
29. 【請求項２９】 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、
    請求項２８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
30. 【請求項３０】 配列番号２のアミノ酸１２６１−１３０５、配列番号２の
    アミノ酸３２９−３４２およびアミノ酸４０６−４１４に少なくとも６０％の同
    一性を有するアミノ酸配列ならびにＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力
    を有するＮＢ−ＡＲＣドメイン、配列番号２のアミノ酸１３７３−１４７３に少
    なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列ならびにＣＡＲＤ含有タンパク質
    に結合する能力を有するＣＡＲＤドメイン、そして、配列番号８のアミノ酸５６
    −３３１に少なくとも５０％の同一性ならびにタンパク質相互作用を媒介する能
    力を有するＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメインを含む、単離されたＮＡＣタンパク
    質。
31. 【請求項３１】 配列番号２のアミノ酸８０８−９４７に少なくとも５０％
    の同一性およびタンパク質相互作用を媒介する能力を有するＬＲＲドメインをさ
    らに含む、請求項３０に記載のタンパク質。
32. 【請求項３２】 前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２、４または
    ６のいずれかと実質的に同一の配列を含む、請求項３０に記載のタンパク質。
33. 【請求項３３】 配列番号２、４または６のいずれかに開示された配列と同
    一のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のＮＡＣ。
34. 【請求項３４】 配列番号２のアミノ酸１２６１−１３０５、配列番号８の
    アミノ酸５６−３３１に少なくとも５０％の同一性およびタンパク質相互作用を
    媒介する能力を有するＴＩＭ−Ｂａｒｒｅｌ様ドメイン、ならびに、配列番号２
    のアミノ酸１３７３−１４７３に少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配
    列およびＣＡＲＤ含有タンパク質に結合する能力を有するＣＡＲＤドメイン、配
    列番号２のアミノ酸３２９−３４２およびアミノ酸４０６−４１４に少なくとも
    ６０％の同一性を有するアミノ酸配列およびＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合
    する能力を有するＣＡＲＤドメイン、そして、配列番号２のアミノ酸８０８−９
    ４７に少なくとも５０％の同一性およびタンパク質相互作用を媒介する能力を有
    するＬＲＲドメインからなる群から選択される第２のドメイン、を含む単離され
    たタンパク質。
35. 【請求項３５】 単離されたＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（
    ＮＡＣ）であって、このタンパク質は、以下： （ａ）配列番号２に開示されたアミノ酸配列、または （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列の機能的フラグメントであって、該機能的フラグメ
    ントが、配列番号２のアミノ酸１２６１−１３０５を含み、該機能的フラグメン
    トが、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する
    能力を有する、機能的フラグメント、または、 （ｃ）配列番号２に開示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一のアミノ酸
    配列を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸
    １２６１−１３０５を含み、該ポリペプチドが、ＣＡＲＤ含有タンパク質または
    ＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有するポリペプチド、 から選択される、単離されたタンパク質。
36. 【請求項３６】 配列番号２に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸
    配列を含む、請求項３５に記載の単離されたＮＡＣ。
37. 【請求項３７】 単離されたＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（
    ＮＡＣ）であって、このタンパク質は、以下： （ａ）配列番号４に開示されたアミノ酸配列、または （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列の機能的フラグメントであって、該機能的フラグメ
    ントが、配列番号２のアミノ酸９５７−９８７をコードせず、該機能的フラグメ
    ントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合す
    る能力を有する、機能的フラグメント、または、 （ｃ）配列番号４に開示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一のアミノ酸
    配列を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸
    ９５７−９８７をコードせず、該ポリペプチドが、ＣＡＲＤ含有タンパク質また
    はＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する、ポリペプチド、 から選択される、単離されたＮＡＣ。
38. 【請求項３８】 配列番号４に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸
    配列を含む、請求項３７に記載の単離されたＮＡＣ。
39. 【請求項３９】 単離されたＮＢ−ＡＲＣおよびＣＡＲＤ含有タンパク質（
    ＮＡＣ）であって、このタンパク質は、以下： （ａ）配列番号６に開示されたアミノ酸配列、または （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列の機能的フラグメントであって、該機能的フラグメ
    ントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質もしくはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合す
    る能力を有する、機能的フラグメント、または、 （ｃ）配列番号６に開示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％同一のアミノ酸
    配列を有するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸
    ９５７−９８７をコードせず、該ポリペプチドが、ＣＡＲＤ含有タンパク質また
    はＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する、ポリペプチド、 から選択される、ＮＡＣ。
40. 【請求項４０】 配列番号６に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸
    配列を含む、請求項３９に記載の単離されたＮＡＣ。
41. 【請求項４１】 配列番号２のアミノ酸１３７３−１４７３を含むアミノ酸
    配列を含む、請求項３５、３７または３９に記載の単離されたＮＡＣ。
42. 【請求項４２】 配列番号２のアミノ酸３２９−５４７を含むアミノ酸配列
    を含む、請求項３５、３７または３９に記載の単離されたＮＡＣ。
43. 【請求項４３】 配列番号２のアミノ酸８０８−９４７を含むアミノ酸配列
    を含む、請求項３５、３７または３９に記載の単離されたＮＡＣ。
44. 【請求項４４】 配列番号２のアミノ酸３２９−３４２を含むアミノ酸配列
    を含む、請求項３５、３７または３９に記載の単離されたＮＡＣ。
45. 【請求項４５】 配列番号２のアミノ酸４０６−４１４を含むアミノ酸配列
    を含む、請求項３５、３７または３９に記載の単離されたＮＡＣ。
46. 【請求項４６】 配列番号２のアミノ酸１０７９−１３２０を含むアミノ酸
    配列を含む、請求項３５、３７または３９に記載の単離されたＮＡＣ。
47. 【請求項４７】 キメラタンパク質であって、このタンパク質は、以下： （ａ）ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメインであって、該ＮＢ−ＡＲＣドメインが、配
    列番号２のアミノ酸３２９−３４２およびアミノ酸４０６−４１４に少なくとも
    ６０％同一性およびＮＢ−ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有するアミノ
    酸配列を含む、ＮＡＣのＮＢ−ＡＲＣドメイン、ならびに、 （ｂ）ＮＡＣのＣＡＲＤドメインであって、該ＣＡＲＤドメインが、配列番号２
    のアミノ酸１３７３−１４７３に少なくとも５０％の同一性およびＣＡＲＤ含有
    タンパク質に結合する能力を有するアミノ酸配列を含む、ＮＡＣのＣＡＲＤドメ
    イン、 を含み、該ＮＢ−ＡＲＣドメインおよび該ＣＡＲＤドメインが異種タンパク質に
    由来する、キメラタンパク質。
48. 【請求項４８】 薬学的に受容可能なキャリアおよび以下： （ａ）ＮＡＣ、またはその機能的なフラグメントであって、該ＮＡＣ、またはそ
    の機能的フラグメントがＣＡＲＤ含有タンパク質またはＮＢ−ＡＲＣ含有タンパ
    ク質に結合する能力を有するＮＡＣ、またはその機能的なフラグメント； （ｂ）ＮＡＣ、またはその機能的フラグメントをコードする核酸であって、該Ｎ
    ＡＣ、またはその機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質またはＮＢ−
    ＡＲＣ含有タンパク質に結合する能力を有する、核酸； （ｃ）（ｂ）の核酸に相補的なアンチセンス核酸；あるいは、 （ｄ）抗ＮＡＣ抗体、 から選択される化合物を含む、治療組成物。
49. 【請求項４９】 前記ＮＡＣが、請求項３５、３７または３９に記載の単離
    されたＮＡＣを含む、請求項４８に記載の治療組成物。
50. 【請求項５０】 前記ＮＡＣをコードする核酸が、請求項１、４または７に
    記載の単離された核酸を含む、請求項４８に記載の治療組成物。
51. 【請求項５１】 薬学的に受容可能なキャリアおよび以下： （ａ）配列番号８に開示されるアミノ酸配列に関して少なくとも７０％の同一性
    を有するＣＡＲＤ−Ｘタンパク質、もしくはそのフラグメントであって、該ＣＡ
    ＲＤ−Ｘタンパク質、もしくはそのフラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質に
    結合する能力を有するＣＡＲＤ−Ｘタンパク質、または、 （ｂ）配列番号８に開示されるアミノ酸配列に関して少なくとも７０％の同一性
    を有するＣＡＲＤ−Ｘタンパク質をコードする核酸であって、該ＣＡＲＤ−Ｘタ
    ンパク質またはその機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質に結合する
    能力を有する、核酸； （ｃ）（ｂ）の核酸に相補的なアンチセンス核酸；または、 （ｄ）抗ＣＡＲＤ抗体、 から選択される化合物を含む、治療組成物。
52. 【請求項５２】 配列番号２のアミノ酸１２６１−１３０５を含むＮＡＣの
    一部と特異的な反応性を有する、単離された抗ＮＡＣ抗体。
53. 【請求項５３】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５２に記載
    の抗体。
54. 【請求項５４】 請求項５３に記載のモノクローナル抗体を産生する、細胞
    株。
55. 【請求項５５】 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項５２に記載
    の抗体。
56. 【請求項５６】 ＮＡＣタンパク質を発現するための方法であって、該方法
    が、該ＮＡＣの発現に適切な条件下で、請求項１２に記載の細胞を培養する工程
    を包含する、方法。
57. 【請求項５７】 哺乳動物ＮＡＣまたはＣＡＲＤ−Ｘをコードする核酸を同
    定するための方法であって、該方法は、以下の工程： 核酸を含むサンプルを、請求項１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４また
    は配列番号７に記載のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該接触が
    、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で行なわれる工程、なら
    びに、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする化合物を同定する工程、 を包含する、方法。
58. 【請求項５８】 サンプル中のヒトＮＡＣの存在を検出するための方法であ
    って、該方法は、試験サンプルを請求項５２に記載の抗体と接触させる工程、抗
    体：ＮＡＣ複合体の存在を検出する工程、およびそのために、該試験サンプルに
    おけるヒトＮＡＣの存在を検出する工程を包含する、方法。
59. 【請求項５９】 発癌性タンパク質の活性を調節するための方法であって、
    該方法は、該発癌性タンパク質を実質的に純粋なＮＡＣ、またはその機能的フラ
    グメントと接触させる工程であって、該ＮＡＣ、またはその機能的フラグメント
    が、該発癌性タンパク質と相互作用する工程を包含する、方法。
60. 【請求項６０】 発癌性タンパク質の活性を調節するための方法であって、
    該方法は、該発癌性タンパク質を、配列番号８に開示されたアミノ酸配列に関し
    て、少なくとも７０％同一性を有する実質的に純粋なＣＡＲＤ−Ｘタンパク質、
    またはその機能的フラグメントと接触させる工程であって、該ＣＡＲＤ−Ｘタン
    パク質、またはその機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質に結合する
    能力を有し、該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質、またはその機能的フラグメントが、該
    発癌性タンパク質と相互作用する工程を包含する、方法。
61. 【請求項６１】 前記機能的フラグメントが、配列番号８のアミノ酸３４５
    −４３１に対応するＣＡＲＤドメインに関して少なくとも約７０％の同一性を含
    む、請求項６０に記載の方法。
62. 【請求項６２】 ＮＡＣ関連タンパク質（ＮＡＰ）とのＮＡＣの会合を変更
    する効果的な薬剤を同定するための方法であって、この方法は、以下の工程： （ａ）該ＮＡＣおよびＮＡＰタンパク質を該ＮＡＣおよびＮＡＰタンパク質が会
    合するのを可能にする条件下で、該ＮＡＣおよびＮＡＰタンパク質の会合を変更
    し得ることが疑われる薬剤と接触させる工程；ならびに、 （ｂ）該ＮＡＣおよびＮＡＰタンパク質の変更された会合を検出する工程であっ
    て、該変更された会合が効果的な薬剤を同定する、工程、 を包含する、方法。
63. 【請求項６３】 前記ＮＡＣがヌクレオチド結合活性を有する、請求項６２
    に記載の方法。
64. 【請求項６４】 ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質と、ＣＡＲＤ−Ｘ関連タンパク質
    （ＣＡＰ）との会合を変更する効果的な薬剤を同定するための方法であって、こ
    の方法は、以下の工程： （ａ）該ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＰタンパク質を、該ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＰ
    タンパク質が会合するのを可能にする条件下で、該ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＰタ
    ンパク質の会合を変更し得ることが疑われる薬剤と接触させる工程であって、Ｃ
    ＡＲＤ−Ｘタンパク質は、配列番号８に開示されるアミノ酸配列に関して少なく
    とも７０％の同一性を有し、該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質は、ＣＡＲＤ−Ｘ含有タ
    ンパク質に結合する能力を有する、工程；ならびに、 （ｂ）該ＣＡＲＤ−ＸおよびＣＡＰタンパク質の変更された会合を検出する工程
    であって、該変更された会合が有効な薬剤を同定する、工程、 を包含する、方法。
65. 【請求項６５】 前記変更された会合が、レポーター遺伝子の該転写活性を
    測定することによって検出される、請求項６２または６４に記載の方法。
66. 【請求項６６】 前記有効な薬剤が薬物である、請求項６２または６４に記
    載の方法。
67. 【請求項６７】 前記有効な薬剤がタンパク質である、請求項６２または６
    ４に記載の方法。
68. 【請求項６８】 細胞におけるアポトーシスのレベルを調節する方法であっ
    て、この方法は、以下の工程： （ａ）ＮＡＣをコードする核酸分子を該細胞に導入する工程；および （ｂ）該細胞において該ＮＡＣを発現する工程であって、該ＮＡＣの発現が、該
    細胞におけるアポトーシスを調節する工程、 を包含する、方法。
69. 【請求項６９】 ＮＡＣをコードする前記核酸分子が、請求項１、４または
    ７の核酸である、請求項６８に記載の方法。
70. 【請求項７０】 細胞におけるアポトーシスのレベルを調節する方法であっ
    て、この方法は、以下の工程： （ａ）ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質をコードする核酸分子を該細胞に導入する工程で
    あって、該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質が、配列番号８に開示されるアミノ酸配列に
    関して少なくとも７０％の同一性およびＣＡＲＤ含有タンパク質に結合する能力
    を有する工程；ならびに （ｂ）該細胞において該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質を発現する工程であって、該Ｃ
    ＡＲＤ−Ｘタンパク質の発現が、該細胞におけるアポトーシスを調節する工程、
    を包含する、方法。
71. 【請求項７１】 細胞におけるアポトーシスのレベルを調節する方法であっ
    て、この方法は、アンチセンスヌクレオチド配列を該細胞に導入する工程であっ
    て、該アンチセンスヌクレオチド配列が、ＮＡＣをコードする核酸分子に特異的
    にハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーションが、該細胞における該ＮＡＣの
    発現を減少または阻害する工程を包含する、方法。
72. 【請求項７２】 細胞におけるアポトーシスのレベルを調節する方法であっ
    て、この方法は、アンチセンスヌクレオチド配列を該細胞に導入する工程であっ
    て、該アンチセンスヌクレオチド配列が、配列番号８に開示されたアミノ酸配列
    に関して、少なくとも７０％の同一性を有するＣＡＲＤ−Ｘタンパク質をコード
    する核酸分子に特異的にハイブリダイズし、該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質が、ＣＡ
    ＲＤ含有タンパク質に結合する能力を有し、該ハイブリダイゼーションが、該細
    胞における該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質の発現を減少または阻害する工程を包含す
    る、方法。
73. 【請求項７３】 異常な細胞増殖または異常な炎症によって特徴付けられる
    病理学を処置するための方法であって、該方法は、請求項４８または５１に記載
    の有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
74. 【請求項７４】 被験体におけるＮＡＣの増加したかまたは減少したレベル
    によって特徴付けられる病理学を診断する方法であって、この方法は、以下の工
    程： （ａ）該被験体から試験サンプルを獲得する工程； （ｂ）該試験サンプルを、適切な条件下で、該ＮＡＣに結合し得る薬剤と接触さ
    せる工程であって、該薬剤の該ＮＡＣへの特異的な結合を可能にする工程；およ
    び （ｃ）該試験サンプルにおける該特異的結合の量を、コントロールサンプルにお
    ける特異的な結合の量と比較する工程であって、該コントロールサンプルと比較
    した該試験サンプルにおける該特異的な結合の増加したかまたは減少した量が、
    病理学の診断となる工程、 を包含する、方法。
75. 【請求項７５】 被験体におけるＣＡＲＤ−Ｘタンパク質の増加したかまた
    は減少したレベルによって特徴付けられる病理学を診断する方法であって、この
    方法は、以下の工程： （ａ）該被験体から試験サンプルを獲得する工程； （ｂ）該試験サンプルを、適切な条件下で、該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質に結合し
    得る薬剤と接触させる工程であって、該条件は、該薬剤の該ＣＡＲＤタンパク質
    への特異的結合を可能にし、該ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質が、配列番号８に開示さ
    れたアミノ酸配列に関して少なくとも７０％の同一性およびＣＡＲＤ含有タンパ
    ク質に結合する能力を有する工程；および （ｃ）該試験サンプルにおける該特異的結合の量を、コントロールサンプルにお
    ける特異的な結合の量と比較する工程であって、該コントロールサンプルと比較
    した該試験サンプルにおける該特異的な結合の増加したかまたは減少した量が、
    病理学の診断となる工程、 を包含する、方法。
76. 【請求項７６】 前記薬剤が、抗ＮＡＣ抗体かまたはＮＡＣ関連タンパク質
    （ＮＡＰ）である、請求項７４に記載の方法。
77. 【請求項７７】 前記薬剤が、抗ＣＡＲＤ−Ｘ抗体かまたはＣＡＲＤ−Ｘ関
    連タンパク質である、請求項７５に記載の方法。
78. 【請求項７８】 細胞におけるアポトーシスのレベルを調節する方法であっ
    て、この方法は、該細胞におけるＮＡＣとＮＡＣ関連タンパク質との会合を効果
    的に変更するかまたは該細胞におけるＮＡＣの活性を効果的に変更する薬剤と、
    該細胞を接触させる工程を包含する、方法。
79. 【請求項７９】 細胞におけるアポトーシスのレベルを調節する方法であっ
    て、この方法は、該細胞におけるＣＡＲＤ−Ｘ関連タンパク質と、配列番号８に
    開示されたアミノ酸配列に関して少なくとも７０％の同一性を有するＣＡＲＤ−
    Ｘタンパク質の会合を効果的に変更するかまたは該細胞におけるＣＡＲＤ−Ｘタ
    ンパク質の活性を効果的に変更する薬剤と、該細胞を接触させる工程を包含する
    、方法。
80. 【請求項８０】 前記ＮＡＣおよびＮＡＰの会合がＣＡＲＤ：ＣＡＲＤ会合
    またはＮＢ−ＡＲＣ：ＮＢ−ＡＲＣ会合を含む、請求項６２に記載の方法。
81. 【請求項８１】 前記ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質およびＣＡＰの会合がＣＡＲ
    Ｄ：ＣＡＲＤ会合を含む、請求項６４に記載の方法。
82. 【請求項８２】 前記変更された会合が転写を調節する、請求項６２または
    ６４に記載の方法。
83. 【請求項８３】 前記変更された会合がＮＦ−κＢ活性を調節する、請求項
    ８２に記載の方法。
84. 【請求項８４】 以下の群： （ａ）ＮＡＣタンパク質またはその機能的フラグメントであって、該ＮＡＣ、ま
    たはその機能的フラグメントが、ＣＡＲＤ含有タンパク質またはＮＢ−ＡＲＣ含
    有タンパク質に結合する能力を有する、ＮＡＣタンパク質； （ｂ）（ａ）のＮＡＣ、またはそのフラグメントをコードする核酸； （ｃ）（ｂ）の核酸に対して相補的なアンチセンス核酸；および （ｄ）抗ＮＡＣ抗体 から選択される化合物と細胞を接触させる工程を包含する、転写を調節する方法
    。
85. 【請求項８５】 癌を診断するかまたは癌治療をモニターする方法であって
    、請求項５２に記載の抗体と、患者からの試験サンプルを接触させる工程を包含
    する、方法。
86. 【請求項８６】 癌を有する患者の予後を評価する方法であって、請求項５
    ２に記載の抗体と、患者からの試験サンプルを接触させる工程を包含する、方法
    。
87. 【請求項８７】 ＮＡＣのヌクレオチド結合部位に結合する、効果的な薬剤
    。
88. 【請求項８８】 プロカスパーゼまたはカスパーゼと、ＮＡＣとの会合を調
    節する、効果的な薬剤。
89. 【請求項８９】 前記効果的な薬剤が、前記プロカスパーゼまたは前記カス
    パーゼと、前記ＮＡＣとの会合を阻害する、請求項８８に記載の薬剤。
90. 【請求項９０】 前記効果的な薬剤が、前記プロカスパーゼまたは前記カス
    パーゼと、前記ＮＡＣとの会合を増加する、請求項８８に記載の薬剤。
91. 【請求項９１】 配列番号８に開示されるアミノ酸配列に関して少なくとも
    ７０％の同一性を有するＣＡＲＤ−Ｘタンパク質の、プロカスパーゼまたはカス
    パーゼとの会合を調節する、効果的な薬剤。
92. 【請求項９２】 前記効果的な薬剤が、前記プロカスパーゼまたは前記カス
    パーゼと、前記ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質との会合を阻害する、請求項９１に記載
    の薬剤。
93. 【請求項９３】 前記効果的な薬剤が、前記プロカスパーゼまたは前記カス
    パーゼと前記ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質との会合を増加する、請求項９１に記載の
    薬剤。
94. 【請求項９４】 前記プロカスパーゼがプロカスパーゼ８であり、そして、
    前記カスパーゼがカスパーゼ８である、請求項８８または９１に記載の薬剤。
95. 【請求項９５】 前記プロカスパーゼがプロカスパーゼ９であり、そして、
    前記カスパーゼがカスパーゼ９である、請求項８８または９１に記載の薬剤。
96. 【請求項９６】 ＣＥＤ−４ファミリータンパク質を使用して、ＮＡＣの会
    合を調節する、効果的な薬剤。
97. 【請求項９７】 前記効果的な薬剤が、前記ＣＥＤ−４ファミリータンパク
    質と前記ＮＡＣとの会合を阻害する、請求項９６に記載の薬剤。
98. 【請求項９８】 前記効果的な薬剤が、前記ＣＥＤ−４ファミリータンパク
    質と前記ＮＡＣとの会合を増加する、請求項９６に記載の薬剤。
99. 【請求項９９】 ＣＥＤ−４ファミリータンパク質と、配列番号８に開示さ
    れたアミノ酸配列に関して少なくとも７０％の同一性を有するＣＡＲＤ−Ｘタン
    パク質との会合を調節する、効果的な薬剤。
100. 【請求項１００】 前記効果的な薬剤が、ＣＥＤ−４ファミリータンパク質
     と前記ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質との会合を阻害する、請求項９９に記載の薬剤。
101. 【請求項１０１】 前記効果的な薬剤が、ＣＥＤ−４ファミリータンパク質
     と前記ＣＡＲＤ−Ｘタンパク質との会合を増加する、請求項９９に記載の薬剤。
102. 【請求項１０２】 前記ＣＥＤ−４ファミリータンパク質が、ＣＥＤ−４、
     Ａｐａｆ−１、Ｄａｒｋ、およびＣＡＲＤ４／ｎｏｄ１からなる群から選択され
     る、請求項９６または９９に記載の薬剤。
103. 【請求項１０３】 前記ＣＥＤ−４ファミリータンパク質がＡｐａｆ−１で
     ある、請求項９６または９９に記載の薬剤。