KR20010082559A

KR20010082559A - 사람 Ｕｐｆ1ｐ, 진핵세포 유리 인자 1 및 진핵세포 유리인자 3을 포함하는 감시 복합체가 연루된, 해독 종결 효율및 이상 ｍＲＮＡ 분해를 조절하는 방법

Info

Publication number: KR20010082559A
Application number: KR1020007013415A
Authority: KR
Inventors: 펠츠스튜어트; 채플린스키케빈; 웽유민
Original assignee: 추후보정; 유니버시티 오브 메디슨 앤드 덴티스트리 오브 뉴저지
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-27
Publication date: 2001-08-30
Also published as: AU4318099A; JP2002516091A; WO1999061600A2; WO1999061600A3; CA2329267C; CA2329267A1; US6486305B1; ATE332365T1; WO1999061600A9; MXPA00011760A; EP1102838A2; EP1102838B1; JP4889150B2; DE69932246D1

Abstract

본 발명은 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 해독 종결을 향상시키는데 연루되는 활성 약물을 스크리닝하는 방법, 및 결함 단백질 복합체가 관련된 질환을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 해독 종결을 조절하는데 효과적인, 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자 3(eRF3)을 포함하는 정제된 복합체를 제공한다. 또한 본 발명은, 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는, 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자 3(eRF3)을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 해독 종결을 조절하는데 효과적인 양의 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자 3(eRF3)을 포함하는 복합체에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합을 억제하거나 조절하는 제제를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합을 억제하거나 향상시키는 제제를 제공한다.

Description

사람 Ｕｐｆ1ｐ, 진핵세포 유리 인자 1 및 진핵세포 유리 인자 3을 포함하는 감시 복합체가 연루된, 해독 종결 효율 및 이상 ｍＲＮＡ 분해를 조절하는 방법{A method of modulating the efficiency of translation termination and degradation of aberrant mRNA involving a surveillance complex comprising human Upf1p, eucaryotic release factor 1 and eucaryotic release factor 3}

정부 권리 조항

본 발명을 주도하는 연구는 부분적으로 미국 국립위생연구소(The National Institutes of Health, GM48631-01)의 승인에 의해 적어도 일부가 지원된다. 따라서 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 가질 수 있다.

최근의 연구로, 세포가 이의 정상적인 기능을 주로 방해할 수 있는 이상 단백질 또는 전사체를 자체적으로 제거하는 진화된 정교한 메카니즘을 갖는다는 것이 입증되었다[참조 문헌: Gottesman et al., 1997; He et al., 1993; Jacobson and Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria et al., 1996; Suzuki et al., 1997; Weng et al., 1997; Maquat, 1995; Pulak and Anderson, 1993]. 이러한 경로는 유전자 발현 조절자 및 부적절한 폴리펩티드 합성용 센서 모두로서 검토될 수 있다. 넌센스-매개된 mRNA 소멸 경로(nonsense-mediated mRNA decay pathway; NMD)는 단백질 암호화 영역내에 넌센스 돌연변이를 포함하는 이상 mRNA를 제거하기 때문에, 해독 종결 감시 경로의 한가지 예가 된다[참조 문헌: Gottesman et al., 1997; He et al., 1993; Jacobson and Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria et al., 1996; Suzuki et al., 1997; Weng et al., 1997; Pulak and Anderson, 1993; Caponigro and Parker, 1996; Maquat, 1995]. NMD 경로는 지금까지 조사된 모든 진핵세포계에서 기능하는 것으로 관찰되었으며, 해독 종결이 전사체내 적절한 코돈에서 일어나는 것을 보장하도록 진화된 것으로 보인다. 미성숙 넌센스 코돈을 함유하는 전사체는 신속하게 분해되고, 따라서 불완전하고 잠재적으로 유해한 단백질의 합성을 방지한다. 미성숙 해독 종결로 200가지가 훨씬 넘는 유전 질환이 발생할 수 있다[참조 문헌: McKusick, 1994].

NMD를 촉진시키는데 수반되는 단백질은 포유동물 세포인 씨. 엘레간스(C. elegans) 및 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisea)에서 조사되었다. NMD에 수반되는 3가지 인자가 효모에서 동정되었다. UPF1, UPF2 및 UPF3 유전자는 대부분의 야생형 mRNA의 소멸률에 영향을 미치지 않으면서 어얼리(early) 넌센스 돌연변이를 함유한 mRNA를 선택적으로 안정화시키는 것으로 나타났다[참조 문헌: He and Jacobson, 1995; Lee and Culbertson, 1995; Leeds, et al., 1992; Leeds et al., 1991; Cui et al., 1995]. 최근 결과로 Upf1p, Upf2p 및 Upf3p가 상호작용하여 복합체를 형성한다는 것이 확인되었다[참조 문헌: He and Jacobson, 1995; He et al., 1997; Weng et al., 1996b]. 씨. 엘레간스에서는, 넌센스 함유 전사체의 양을 증가시키는 7개의 smg 대립유전자가 동정되었다[참조 문헌: Pulak and Anderson, 1993]. RENT1 또는 HUPF1으로 불리는, UPF1 유전자의 사람 동족체가 동정되었는데, 이는 NMD가 진화적으로 보존된 경로임을 나타낸다[참조 문헌: Perlick et al., 1996; Applequist et al., 1997].

포유동물 세포에서 NMD가 일어나는 세포내 구획이 어디인지 논쟁중이더라도[참조 문헌: Weng et al., 1997; Maquat, 1995; Zhang and Maquat, 1997], 효모에서는 전사가 리보솜과 연관된 경우에 NMD가 세포질에서 일어나는 것으로 보인다. 이러한 결론을 지지하는 결과는 다음과 같다: 1) 효모에서 NMD 경로의 기질인 넌센스 함유 및 인트론 함유 RNA는 폴리솜(polysome)과 연관되어 있으며, 이는 해독 진행억제제인 사이클로헥스이미드의 존재하에 안정화된다[참조 문헌: Zhang et al., 1997]. 그러나, RNA와 연관된 폴리솜은, 약제를 성장 배지로부터 제거하는 경우에 정상적인 신속한 소멸 동력을 다시 수득하여 해독을 재개한다[참조 문헌: Zhang et al., 1997]; 2) Upf1p, Upf2p 및 Upf3p는 폴리솜과 연관되어 있는 것으로 나타난다[참조 문헌: Peltz et al., 1993a, 1994; Atkin et al., 1995; Atkin et al., 1997]; 3) 형광성 반응계내 하이브리드화 분석에 의해 나타나는 바와 같이, 5' 스플라이싱 부위(splicing site) 또는 측쇄 지점에 돌연변이를 포함하는, 인트론 함유 LacZ 리포터 RNA의 세포질중 양은 UPF1⁺균주에서는 극적으로 감소되지만 upf1△ 세포에서는 세포질중 이의 양이 증가한다[참조 문헌: Long et al., 1995]; 4) NMD는 넌센스 억제 tRNA에 의해 방해될 수 있다[참조 문헌: Losson and Lacroute, 1979; Gozalbo and Hohmann, 1990; Belgrader et al., 1993]; 5) 하나 이상의 해독 개시/종결 사이클이 완료된 후에만 NMD 경로가 기능한다[참조 문헌: Ruiz-Echevarria and Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria et al., 1998; Zhang and Maquat, 1997]. 또한, 해독 재개 반응은 NMD 경로의 활성화를 방해할 수 있다[참조 문헌: Ruiz-Echevarria and Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria et al., 1998; Zhang and Maquat, 1997]. 상기한 모든 결과는 효모에서의 NMD 경로가 세포질성이고 해독-의존적인 반응임을 나타낸다. rent1/hupf1 단백질도 또한 세포질에 풍부하다[참조 문헌: Applequist et al., 1997]

효모 UPF1 유전자 및 이의 단백질 산물은 추정 감시 복합체의 가장 광범위하게 조사된 인자이다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a,b; Weng et al., 1998; Altamura et al., 1992; Cui et al., 1996; Koonin, 1992; Leeds et al., 1992; Atkin et al., 1995, 1997]. Upf1p는 이의 아미노 말단에 인접한 시스테인- 및 히스티딘-풍부한 영역을 포함하고 슈퍼패밀리(Superfamily) 그룹 I 헬리카제 구성원에 요구되는 모든 모티프를 포함한다. 효모 Upf1p는 정제되었으며, RNA에 결합하고 RNA-의존적인 ATPase 및 RNA 헬리카제 활성을 갖는 것으로 입증되었다[참조 문헌: Czaplinski et al 1995; Weng et al., 1996a,b]. UPF1 유전자 파괴는 넌센스 함유 mRNA를 안정화시키고 특정 넌센스 대립유전자를 억제시킨다[참조 문헌: Leeds et al., 1991; Cui et al., 1995; Czaplinski et al. 1995; Weng et al., 1996a; Weng et al., 1996b].

발명의 요약

해독 종결을 조절하는 능력은 넌센스 돌연변이와 관련된 질환을 치료하는데 특히 중요하다. 어떤 생물학적 시스템에서도, 넌센스 돌연변이 억제가 낮으면, (아미노산 치환 또는 결실을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는) 완전한 길이의 단백질이 발현된다. 천연 상태에서는, 이러한 소량의 완전한 길이의 단백질이 생성되어 병리를 발생시킨다. 그러나, 넌센스 mRNA를 안정화시킴으로써 "완전 판독(read-through)" 전사체 가능성이 극적으로 증가하여, 단백질을 충분히 발현시켜 병리학적인 표현형을 극복할 수 있다.

넌센스-매개된 mRNA 소멸 경로는 넌센스 돌연변이를 함유한 전사체를 세포로부터 제거하는, 진화적으로 보존된 감시 경로의 한가지 예이다. UPF1 유전자 산물은 이상 mRNA를 인지하고 분해시키는 추정 감시 복합체의 필수 성분이다. 본원에서 제시된 결과는 Upf1p의 효모형 및 사람형이 진핵세포 해독 종결 인자 eRF1 및 eRF3 모두와 상호작용한다는 것을 입증한다. Upf1p가 eRF와 상호작용하는 것과 일치하여, Upf1p는 효모[PSI⁺] 균주에서 관찰되는 eRF1 및 eRF3를 함유하는 프리온(prion)-유사 응집체에서 발견된다. 이러한 결과는, Upf1p와 펩티드 유리 인자와의 상호작용이, 종결이 미성숙하게 발생하는지를 감시하는 해독 종결 감시기능을 향상시키고 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 추정 감시 복합체의 어셈블리에 중요한 사건임을 나타낸다.

본 발명은 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자(eRF3)을 포함하고 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는데 효과적인 분리된 복합체를 제공한다. 한가지 양태에서, 본 발명은 추가로 사람 Upf3p 및 Upf2p를 포함한다.

본 발명은 해독 종결을 조절하는데 효과적인, 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자(eRF3)을 포함하는 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 본 발명은 제제가 Upf1p의 ATPase, eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성 또는 리보솜에 대한 RNA 결합을 억제하는, 특허청구범위 제1항의 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf3p의 결합 또는 Upf3p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 억제하거나 조절하는 제제를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 촉진하는 제제를 제공한다. 본 발명은 ePF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf3p의 결합, 또는 Upf3p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 촉진하는 제제를 제공한다. 본 발명은 리보솜에 대한 사람 Upf1p, eRF1 또는 eRF3의 결합을 조절하는 제제를 제공한다.

본 발명은 해독 종결을 촉진시키는데 유효한 양의 복합체를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독되는 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 넌센스 해독 종결을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독되는 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 해독되는 동안의 펩티딜 트랜스퍼라제 활성은 해독 개시, 진행, 종결 및 mRNA 분해 동안에 생성된다.

본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 Upf1p의 ATPase/헬리카제 활성, eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성 또는 리보솜에 대한 RNA의 결합을 억제하는 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 복합체의 조절에 대해 검정함을 포함하여, 해독되는 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 연루되는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이때 복합체를 조절하는 약물은 펩티딜 트랜스퍼라제 활성 또는 해독 종결 향상에 관련된다.

본 발명은 a) 약물과 복합체를 항온처리하고, b) 넌센스 억제에 대한 효과를 측정함으로써 해독 종결을 향상시키는데 연루되는 약물을 스크리닝함을 포함하여, 해독 조절을 향상시키는데 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 검정은 RNA 또는 NTPase(예: ATPase 또는 GTPase) 검정일 수 있다.

본 발명은 a) 복합체의 단백질 또는 복합체를 암호화하는 핵산 또는 이의 안티센스 분자를 함유하는 벡터를 포함하는 세포를 제공하고, b) 이러한 세포에서 상기한 핵산을 과발현시켜 과발현된 복합체를 제조하여 복합체의 기능을 방해함을 포함하여, 세포에서 mRNA의 해독 종결 효율 및/또는 이상 전사체의 분해를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 복합체를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결함 복합체의 비율을 측정하며, (c) 형질감염 전 세포의 결함 복합체 비율을, 형질감염 후 세포의 결함 복합체 비율과 비교함을 포함하여, 복합체의 결함을 수반하는 질환 상태를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명은 복합체 또는 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하여 개체를 치료함을 포함하여, 펩티딜 트랜스퍼라제 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 해독 종결 효율 및 이상 mRNA 분해를 조절하는데 연루되는, 사람 Upf1p, 진핵세포 유리 인자 1 및 진핵세포 유리 인자 3를 포함하는 다단백질 감시 복합체에 관한 것이다. 이러한 복합체를 동정하는 것은, 프레임이동(frameshift) 빈도를 변화시켜 mRNA의 기능적인 활성에 영향을 미치고; 종결 반응을 모니터하고; 이상 전사체의 분해를 촉진시키며; 해독 개시, 진행(elongation), 종결 및 mRNA 분해 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성의 조절자(억제자/자극자)를 제공하는 제제를확인하기 위한 시험관내 검정 시스템을 제공한다. 길항제 또는 효능제일 수 있는 이러한 제제는 스크리닝 및 진단 목적에 유용하고, 미성숙한 해독의 결과이거나 이를 유발시키는 질환 또는 상태에 대한 치료제로서 유용하다.

도 1: 효모 Upf1p 단백질은 펩티드 유리 인자와 특이적으로 상호작용한다. (A) GST-eRF1 또는 GST-eRF3 융합 단백질은 효모 추출물에서 Upf1p에 특이적으로 결합한다. pG-1(벡터) 또는 pG-1FLAGUPF1(Flag-Upf1p)로 형질전환된 효모 균주 BJ3505의 세포질 추출물을 IBTB중에서 제조하고 GST, GST-eRF1 또는 GST-eRF3 세파로스-단백질 복합물 30㎕와 함께 항온처리한다. 세파로스-단백질 복합물은 IBTB에서 2회 세척하고(재료 및 방법 참조) SDS-PAGE 로딩 완충액에 재현탁시키고, 8% SDS-PAGE 겔상에서 분리시키며 항-FLAG 항체를 사용하여 면역블롯팅하다. (B) Upf1p은 eRF1 및 eRf3 모두와 직접 상호작용한다. Upf1p는 문헌에서와 같이 정제한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. 각 레인에 대해 명시한 바와 같이, 최종 농도로 KCl이 보충된 IBTB중 200㎕의 총 반응 용적중 GST, GST-eRF1 또는 GST-eRF3 세파로스-단백질 복합물 10㎕에 Upf1p 200ng을 가한다. 4℃에서 1시간 후, 세파로스-단백질 복합물은 각 레인에 대해 명시한 바와 같이, 최종 농도로 KCl이 보충된 IBTB 1㎖를 사용하여 3분 동안 세척한다. 정제된 세파로스-단백질 복합물은 SDS-PAGE 로딩 완충액에 재현탁시키고 7.5% SDS-PAGE 겔상에서 분리하며 (A)에서와 같이 면역블롯팅한다.

도 2: Upf1p는 eRF3[PSI⁺] 응집체와 연관되어 있다. 동원체 플라스미드내에 삽입된 FLAG-UPF1을 함유한 균주 7G-H66 upf1△의 동종 [PSI⁺] 및 [psi^-] 변이체의 세포질 추출물은 이전에 기술된 바와 같은 슈크로스 쿠션을 통해 원심분리시켜 분획화한다[참조 문헌: Paushkin et al., 1997b]. 상층액(시토졸), 슈크로스 패드(슈크로스) 및 펠렛 분획을 SDS-PAGE에 적용하고, 이들 분획내에서의 eRF1, eRF3 및 Upf1p의 분포는 eRF1 및 eRF3에 대한 폴리클로날 항체 및 FLAG 에피토프에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 면역블롯팅에 의해 측정한다. 95kDa의 단백질은 균주 7G-H66에서 항-FLAG 항체와 교차 반응하고, [PSI⁺] 및 [psi^-] 세포에서 동일하게 분포한다. 이러한 95kDa의 단백질은 균주 BJ3505로부터 제조한 추출물에는 존재하지 않는다(도 1을 참조한다).

도 3: eRF3 및 RNA는 Upf1p에 경쟁적으로 결합한다. 폴리(U) RNA는 eF3에 Upf1p가 결합하는 것을 방해한다. 반응 혼합물은, 결합을 TBSTB(100㎍/㎖의 BSA가 있는 TBST)에서 수행하고 반응 혼합물이 각 레인에 명시한 바와 같이 1mM ATP, 1mM GTP 또는 100㎍/㎖의 폴리(U) RNA를 함유하는 것을 제외하고는 도 1B에서 기술한 바와 같이 제조한다. 반응 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 혼합한다. 혼합 후, 복합물을 도 1B에서와 같이 각 레인에 명시된 1mM ATP, 1mM GTP 또는 100㎍/㎖의 폴리(U) RNA를 함유한 TBSTB로 세척한다. (B) 폴리(U) RNA는 Upf1와 eRF1의 상호작용을 방해하지 않는다. 각 레인에서 상기한 바와 같이, 100㎎/㎖의 폴리(U) RNA의 존재 또는 부재하에 반응 혼합물을 도 1B에서와 같이 제조한다. (C) eRF3은 Upf1pRNA 결합을 억제한다. 균질하게 표지된 32nt RNA는 SstI으로 분해시킨 pGEM5Zf(+)의 SP6 전사에 의해 합성한다. 명시된 양의 GST-eRF3을 Upf1p 200ng과 함께 4℃에서 15분 동안 항온처리한다. RNA 기질 50fmol을 가하고 5분 동안 항온처리한다. 정지 용액을 가하고, 반응물을 4.5%의 천연 PAGE 겔(0.5×TBE, 5% 글리세롤을 함유한 30:0.5의 아크릴아미드:비스아크릴아미드)에서 전기영동한다.

도 4: eRF1 및 eRF3은 Upf1p RNA-의존적인 ATPase 활성을 억제한다. Upf1p RNA-의존적인 ATPase 활성은 1㎍/㎖의 폴리(U) RNA 및 100㎍/㎖의 BSA를 사용하는 목탄 검정에 의해 GST-RF 융합물의 존재하에 측정한다. 결과는 명시된 단백질의 양에 대한 유리된³²P의 pmol로서 도시한다.

도 5: RENT1/HUPF1 키메라 대립유전자가 해독 종결에서 기능한다. (A) RENT1/HUPF1 키메라 대립유전자는 upf1△ 균주에서 넌센스 억제를 방해한다. 균주 PLY146(MATαura3-52 trp1△upf1::URA3 leu2-2 tyr7-1)은 YCplac22(벡터), YCpUPF1(UPF1), YCpRent1CHI4-2 또는 YEpRent1CHI4-2로 형질전환시키고, 세포는 -trp-met 배지에서 OD₆₀₀이 0.5가 될때까지 배양한다. -trp-met 배지에서 1/10, 1/100 및 1/1000으로 희석하고, 이러한 희석액 5㎕를 -trp-met(상위 플레이트) 또는 -trp-met-leu-tyr(하위 플레이트) 배지에 동시에 플레이팅한다. 세포를 30에서 성장시키는 동안 모니터한다. (B) RENT1/HUPF1 키메라 대립유전자는 넌센스 함유 mRNA의 소멸을 촉진시키지 않는다. (A)에서 기술한 균주로부터 OD₆₀₀이 0.8인 세포의 전체 RNA를 분리한다. YCplac22(벡터), YCpUPF1(UPF1) 또는 YEpRent1CHI4-2(YEpRENT1CHI4-2)로 형질전환시킨 균주 PLY146의 RNA 40㎍을 노던 블럿 분석하고 LEU2, TYR7 또는 CYH2 프로브로 프로빙한다.

도 6: Rent1/hupf1은 eRF1 및 eR3과 상호작용한다. NotI으로 선형화시킨 pT7RENT1(레인 1 내지 4) 또는 루시퍼라제 주형(레인 5 내지 8)을 제조자(Promega)의 지시사항에 따라 TNT 커플링된 세망세포 시험관내 전사 해독에 사용한다. 각 레인에서 상기한 바와 같이, 완성된 해독 반응물 2㎕을 레인 1에서 전기영동시키고 완성된 반응물 5.5㎕는 GST, GST-eRF1 또는 GST-eRF3 세파로스-단백질 복합물 10㎕가 있는 IBTB 200㎕중에서 항온처리한다. 4℃에서 1시간 동안 혼합한 다음, 세파로스-단백질 복합물을 도 1A에서와 같이 세척하고, 결합된 단백질은 8% 겔에서 SDS-PAGE에 적용한다. 전기영동 후, 겔을 50% 메탄올 및 10% 아세트산중에서 30분 동안 고정시킨 다음, 1M 살리실산으로 1시간 동안 처리한다. 겔을 건조시키고 방사능사진을 수득한다.

도 7: Upf1 모델은 mRNA 감시 기능을 한다. (A) RNA 결합 조절은 Upf1와 펩티드 유리 인자와의 상호작용을 향상시킨다. Upf1p에 대한 ATP의 결합은 RNA에 대한 Upf1의 친화성을 감소시킨다. RNA 및 eRF3이 Upf1에 대해 경쟁적으로 결합하기 때문에, eRF3과의 상호작용은 호의적이다. (B) mRNA 감시 모델. Upf1p와 펩티드 유리 인자와의 상호작용은 종결 반응에서 mRNA 감시 복합체를 어셈블리한다. 이러한 상호작용은, Upf1이 RNA에 결합하고 ATP를 가수분해시키는 것을 것을 방해하여 해독 종결을 향상시킨다. 펩티드 가수분해 후, 유리 인자는 리보솜으로부터 분리되어 Upf1p 헬리카제 활성을 활성화시킨다. 이어서, 감시 복합체는 DSE에 대한 종결 코콘의 3'을 훑어나간다. 감시 복합체와 DSE와의 상호작용은, 미성숙 해독 종결을 일으키고 mRNA로부터 캡을 제거하여, mRNA가 각각 Dcplp 및 Xrnlp 엑소리보뉴클레아제에 의해 mRNA가 분해되도록 신호한다.

도 8: 생체내에서 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동(programmed -1 ribosomal frameshift) 효율을 측정하는데 사용되는 벡터의 개략도. 전사는 PGK1 프로모터로부터 개시되고 PGK1 해독 개시 코돈을 사용한다. pTI25에서, 세균 lacZ 유전자는 개시 부위에 대해 0-프레임이다. 플라스미드 pF8에서, lacZ 유전자는 L-A 바이러스 프레임이동 시그날의 3' 및 해독 개시 부위에 대해 -1 프레임에 위치한다.

도 9: upf3△ 균주는 넌센스 함유 전사체 안정화를 촉진시키는 이의 능력과는 별도로 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동을 증가시킨다. 상이한 upf 결실 균주에서의 PGK1-LacZ -1 리포터 mRNA의 양은 RNase 보호 분석에 의해 측정한다. U3 snRNA의 양은 로딩을 위한 내부 대조로서 사용한다. 야생형 균주에서 리포터 전사체의 양을 임의로 1.0으로 정한다.

도 10: upf3△ 균주는 M₁킬러 바이러스를 유지할 수 있다. (A) upf 돌연변이 균주의 킬러 검정. 상기한 균주의 콜로니를 M₁바이러스에 의해 생성되는, 분비된 킬러 톡신에 민감한 세포 론(lawn)상에서 배양한다. 킬러 활성은 콜로니 주변의 성장 억제 영역으로서 관찰된다. (B) 동일한 균주로부터 전체 RNA를 분리하고 노던 블롯팅에 의해 L-A 및 M₁바이러스 RNA의 존재를 분석한다.

도 11: 파로모마이신 민감성은, 파로모마이신 1mg을 함유한 디스크를 세포 론상에 위치시키고 디스크 주위의 성장 억제 영역을 측정함으로써 동종 야생형 및 upf3△ 균주에서 모니터한다.

미성숙 넌센스 코돈을 갖는 전사체는 신속하게 분해되므로 불완전하고 잠재적으로 유해한 단백질 합성을 방지한다. 감시 경로는 단백질 암호화 영역을 갖는 넌센스 돌연변이를 포함하는 이상 mRNA를 제거한다. 본 발명은 유전 질환 및 암에서 넌센스 돌연변이를 억제하고, 바이러스 감염시 리보솜 프레임이동을 억제하며, RNA:단백질 상호작용을 변화시켜 다수 질환에서 중요한 mRNA 수준을 차례로 조절함을 포함하는, 전사후 조절의 3가지 양상에 관한 것이다.

Upf1p는 펩티드 유리 인자인 진핵세포 유리 인자 1(eucaryoticReleaseFactor 1; eRF1) 및 유리 인자 3(eucaryoticReleaseFactor 3; eRF3)과 상호작용하여 이의 활성을 증대시킴으로써 해독 종결을 향상시킨다. eRF1 및 eRF3 모두는 진핵세포에서 상호작용하여 펩티드 유리를 촉진시키는 보존된 단백질이다. 효모에서, eRF1 및 eRF3은 SUP45 및 SUP35 유전자에 의해 각각 암호화된다[참조 문헌: Frolova et al., 1994; Zhouravleva et al., 1995]. Sup45p 및 Sup35p는 상호작용하는 것으로 나타난다[참조 문헌: Stansfield et al., 1995; Paushkin et al., 1997]. eRF1은 고유한 펩티드 가수분해 활성을 포함하지만, 해독 진행 인자인 EF1α와 동종성을 갖는 eRF3[참조 문헌: Didichenko et al., 1991]은 GTPase 활성을갖는 것으로 입증되었고[참조 문헌: Frolova et al., 1996] eRF1의 종결 활성을 향상시킨다[참조 문헌: Zhouravleva et al., 1995]. 본원에서 제시한 결과는 사람 및 효모 Upf1p와 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3 사이에 생화학적 상호작용이 있음을 입증한다.

다음은, NMD 경로가 어떻게 해독 종결을 향상시키고 후속적으로 넌센스 함유 전사체를 인지하고 분해하는 기능을 하는가에 대한 모델이다. 해독 리보솜의 A 부위에서의 종결 코돈은 리보솜을 정지시킨다(단계 1). 해독 종결 인자 eRF1 및 eRF3은 A 부위에서 상호작용하여, 다른 인자와 가장 용이하게 복합체를 형성하는 Upf1p와 상호작용함으로써 감시 복합체의 어셈블리를 촉진시킨다(단계 2). Upf1p와 유리 인자와의 상호작용은 Upf1p의 ATPase 및 RNA 결합 활성을 억제시킨다. 이러한 억제는, Upf1p가 종결 인자의 활성을 향상시키고 Upf1p 복합체가 유리 인자로부터 미성숙되어 분리되지 않도록하며 DSE를 찾는데 필수적일 수 있다. 펩티드 가수분해는, 유리 인자가 감시 복합체와 연관되어 있는 동안에 발생한다. eRF3에 의한 GTP 가수분해와 종결이 완료된 후, eRF은 리보솜으로부터 분리된다(단계 3). 유리 인자의 분리는 Upf1p의 RNA 결합 및 ATPase 활성을 활성화시키고, Upf1p 복합체가 DSE를 찾는데 있어 종결 코돈의 3'를 훑어가도록 한다(단계 4). 복합체가 DSE 또는 DSE-연관된 인자와 결합하는 경우, RNA가 Dcp1p에 의해 신속하게 캡이 제거되는 기질이 되도록 RNP 복합체를 형성한다(단계 5). 감시 복합체가 DSE와 상호작용한 결과로서 형성된 RNP 복합체는 3' 폴리(A)-PABP 복합체와 5' 캡 구조 사이의 정상적인 상호작용을 방지한다. 이어서, 캡이 제거된 mRNA는 Xrn1p 엑소리보뉴클레아제에 의해 분해된다(단계 6).

본원에서 사용되는 바와 같이, "감시 복합체"는 적어도 Upf1p와 진핵세포 유리 인자 1 및 3을 포함한다. "UPF1" 유전자는 또한 RENT1 또는 HUPF1으로도 불린다. 복합체는 또한 Upf2p 및/또는 Upf3p을 포함할 수 있다.

다수의 관찰 결과는 mRNA 소멸 과정이 단백질 합성에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 지적하고 있다. 사실상, 상기한 2가지 과정은 함께 진화되었고 한가지 과정에 필수적인 인자는 다른 과정에서도 기능하는 것으로 보인다. 이러한 연계에 관한 증거는, a) 해독 진행을 방해하는 약물 또는 돌연변이가 mRNA 안정화를 촉진시키고, b) 신속한 mRNA 소멸을 지시하는 서열 요소가 mRNA 암호화 영역에 국소화될 수 있고 이러한 요소의 활성이 이의 해독에 좌우되고, c) 분해 인자가 리보솜과 연관될 수 있으며, d) 미성숙 해독 종결이 mRNA 소멸률을 향상시킬 수 있음을 입증하는 실험을 포함한다.

소정의 시간내에 합성되는 특정 단백질의 양이 이의 mRNA의 세포내 농도에 의존적이므로, mRNA 소멸률 조절은 유전자 발현을 조절하는 강력한 수단을 제공한다. 포유동물 세포에서, mRNA 소멸률(반감기로서 표현됨)은 짧으면 15 내지 30분이고 길면 500시간일 수 있다. 명백하게, mRNA 소멸률의 이러한 차이는 특정 단백질의 농도를 1000배까지 차이나게 할 수 있다. 개별적인 mRNA에 대한 소멸률이 고정될 필요가 없지만 내인성 피드백 메카니즘, 특정 호르몬의 존재, 분화 또는 세포 주기의 특정 단계, 또는 바이러스 감염 결과로서 조절될 수 있다는 관찰로 추가의 조절 수준이 제시된다.

아마도, 해독 및 mRNA 소멸의 통합 과정의 가장 훌륭한 예는 미성숙 해독 종결의 결과를 나타내는 연구일 것이다. 이는 DNA내의 결실, 염기 치환 또는 프레임이동 돌연변이로 단백질 암호화 영역내에 부적절한 종결 코돈(넌센스 코돈)을 포함하는 mRNA가 합성되는 경우에 발생한다. 이러한 미성숙 종결 코돈의 발생은 어얼리 종결 부위에 해독을 정지시키고 절단된 단백질을 합성하게 된다. 이의 "정상" 소멸률에 관계없이, 넌센스 돌연변이를 지닌 유전자로부터 전사된 mRNA("넌센스 함유 mRNA"로 칭함)는 매우 신속하게 분해된다. 이러한 "넌센스-매개된 mRNA 소멸"은 편재하는데, 즉 이는 모든 시험 유기체에서 관찰되며 특정 mRNA의 양을 10배 내지 100까지 감소시킨다. 매우 감소된 mRNA 양과 미성숙하게 종결된 해독이 결합되어, 아주 극단적인 유전자 결실의 결과로서 특정 유전자의 전체 발현 수준을 감소시킨다. 사람 건강에 대한 넌센스-매개된 mRNA 소멸의 중요성은, 넌센스 돌연변이가 질환 상태를 유발하고 각각의 mRNA가 넌센스-매개된 mRNA 소멸 경로의 기질인 것으로 나타나는 유전 질환의 수가 증가되고 있음이 확인됨으로써 설명된다.

중요한 것은 넌센스-매개된 mRNA 소멸 경로의 불활성화가 세포 성장을 방해하지 않으면서 수행될 수 있고, 넌센스 함유 mRNA에 대한 정상 수준 및 정상 소멸률을 회복시킨다는 점이다. 보다 상세하게, 효모 실험(및 기타)은, mRNA가 여전히 넌센스 코돈을 함유하더라도, 상기한 소멸 경로의 불활성화로, 합성되는 단백질이 충분히 기능하여 세포가 본래의 유전적 결함을 극복할 수 있다는 것을 입증하고 있다. 즉, 넌센스-매개된 mRNA 소멸 경로를 하향조절함으로써 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 질환을 치료할 수 있다.

본 발명은 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자 3(eRF3)을 포함하고 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는데 효과적인, 분리된 복합체를 제공한다.

Upf1p은 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3와 상호작용하고, Upf1p은 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3와의 상호작용에 의해 해독 종결을 조절한다. eRF1 및 eRF3는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질로서 이. 콜라이에서 개별적으로 발현시키고, 글루타티온 세파로즈 비이드를 사용하여 정제한다. 글루타티온 세파로즈 비이드와 결합된, 정제된 GST-RF(유리 인자) 융합 단백질은 FALG 에피토프가 태깅(tagging)된 Upf1p을 함유하는 효모 세포질 추출물에 가한다. 이를 항온처리한 후, GST-RF 및 연관된 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE에 적용한다. 면역블롯팅을 수행하고, FLAG 에피토프에 대한 항체를 사용하여 Upf1p의 존재를 검정한다. 항-FLAG 항체는 FLAG-Upf1p 발현 플라스미드로 형질전환된 세포의 세포질 추출물에서 109kDa의 Upf1p만을 인지한다. 이러한 분석은 또한 Upf1p가 특이적으로 eRF1 또는 eRF3와 함께 정제된다는 것을 입증한다. Upf1p는 다른 단백질과 융합되지 않는 GST 단백질 또는 GST-JIP 단백질과 함께 정제되지는 않는데, 이때 GST에 융합된 Jak2 상호작용 단백질이 반응의 특이성을 모니터하는 데 사용된다.

정제된 Upf1p와 eRF1 또는 eRF3와의 상호작용을 또한 모니터한다. 에피토프가 태깅된 Upf1p(FLAG-Upf1p)를 정제하는 것은 이전에 상세하게 기술하였다. 정제된 FLAG-Upf1p은 증가된 염 농도의 존재하에 GST-RF 융합 단백질과 항온처리하고,이러한 단백질의 상호작용은 상기한 바와 같이 모니터한다. 결과는 정제된 FLAG-Upf1p가 eRF1 또는 eRF3와 상호작용한다는 것을 입증한다. Upf1p-eRF3 복합체는 Upf1p-eRF1 복합체보다 염 농도 증가에 덜 민감하다. 정제된 Upf1p가 GST 단백질 또는 GST-JIP와 상호작용하지 않기 때문에 상호작용은 특이적이다. Upf1p와 eRF1 또는 eRF3의 상호작용은 용량 의존적인 것으로 나타난다.

한가지 양태에서, 복합체는 추가로 사람 Upf3p을 포함한다. 본원에서 제시된 결과는 Upf3p가 해독 판독 프레임이 적절하게 유지되도록 보장하는 기능을 갖는다는 것을 나타낸다. 프로그램된 -1 프레임이동 및 upf3△의 킬러 유지 표현형이 upf1△ 및 upf3△ 균주에서 관찰되기 때문에, 상기한 과정에서 Upf3p의 기능은 Upf1p 및 Upf2p 보다 유전적으로 상위인 것으로 나타난다. 본원에서 제시된 결과는 Upfp가 해독의 상이한 양상 및 mNRA 교체 과정에 영향을 미칠 수 있는 별개의 역할을 갖는다는 것을 입증한다. 임상학적, 수의학적 및 농업적으로 중요한 다수의 바이러스가 프로그램된 프레임이동을 이용하기 때문에 이러한 결과가 실제로도 또한 중요하다. 따라서, 프로그램된 리보솜 프레임이동은 항바이러스제에 대한 독특한 표적으로서 작용하고, 이러한 과정에 수반되는 인자를 확인하고 특성화하는 것은 상기한 화합물을 확인하는 검정을 개발하는데 도움을 줄 것이다. 다른 양태에서, 복합체는 사람 Upf2p를 포함한다.

본 발명은 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자 3(eRF3)을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 따라서, 당해 분야의 숙련가는 통상의 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어 다음 문헌에 예시되어 있다[참조 문헌: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York("Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)); Transcription And Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1984)); Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)].

"벡터"는 다른 DNA 단편이 연결되어 연결된 단편을 복제시킬 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 리플리콘(replicon)이다. "리플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자율 단위로서 작용하는, 즉 자체 조절하에 복제될 수 있는 임의의 유전 단위(예: 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. "카세트"는 특이적인 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 DNA 단편을 의미한다. DNA 단편은 흥미로운 폴리펩티드를 암호화하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 해독용의 적절한 판독 프레임에 카세트가 삽입되도록 디자인한다.

"핵산 분자"는 일본쇄 또는 이본쇄 나선인 리보뉴클레오사이드(예: 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(예: 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체형 또는 이의 임의의 포스포에스테르 유사체를 의미한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하고 임의의 특정한 3차 구조를 한정하지는 않는다. 따라서, 상기 용어에는, 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예: 제한 단편), 플라스미드 및 염색체로 발견되는 이본쇄 DNA가 포함된다. 특정 이본쇄 DNA 분자의 구조를 논의하는데 있어, DNA의 비전사된 쇄(즉, mRNA와 서열 상동성을 갖는 쇄)를 따라 5'에서 3' 방향으로만 서열을 제시하는 일반적인 관례에 따라 본원에서 서열을 기술한다 "재조합 DNA 분자"는 분자생물학적 조작 상태에 있는 DNA 분자이다.

전사 및 해독 조절 서열은 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵세포에서는, 폴리아데닐화 시그날이 조절 서열이다.

"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제가 결합하여 하부스트림(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 명확히 하기 위해, 상기한 배경에서 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소한의 염기수 또는 요소를 포함하는 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 이의 3' 말단이 결합되어 있고 상부스트림(5' 방향)으로 확장되어 있다. 전사 개시 부위(통상, 예를 들어 뉴클레아제 S1을 사용한 지도화에 의해 확인됨)뿐만 아니라 RNA 폴리머라제 결합을 책임지는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)을 프로모터 서열내에서 찾을 수 있다. 암호화 서열은, RNA 폴리머라제가 암호화 서열을 mRNA로 전사시킨 다음, 이것이 트랜스-RNA로 스플라이싱되고 암호화 서열에 의해 암호화되는 단백질로 해독되는 경우, 세포에서 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하"에 있다.

당해 분야에서 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템을 사용할 수 있다. 가능한 벡터에는 이로써 제한되지는 않는 플라스미드 또는 변형된 바이러스 등이 포함되지만, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 상용성이어야만 한다. 벡터의 예로는 이. 콜라이, 박테리오파아지(예: 람다 유도체), 또는 pBR322 유도체 또는 pUC 플라스미드 유도체(예: pGEX 벡터, pmal-c, pFLAG 등)와 같은 플라스미드가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 클로닝 벡터로 삽입시키는 것은, 예를 들어 DNA 단편을 상보적인 접착성(cohesive) 말단을 갖는 클로닝 벡터와 연결시켜 수행할 수 있다. 그러나, DNA를 단편화하는데 사용되는 상보적인 제한 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않는 경우, DNA 분자의 말단을 효소적으로 변형시킬 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드 서열(링커)을 DNA 말단에 연결시켜 목적하는 임의의 부위를 생성시킬 수 있는데, 이렇게 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열을 암호화하는, 특별하게 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 등을 통해 숙주 세포내로 도입하여 유전자의 다수 복사체를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 클로닝된 유전자를 셔틀 벡터 플라스미드상에 포함시켜 클로닝 세포(예: 이. 콜라이)중에서 증식시키고, 경우에 따라 후속적으로 적절한 발현 세포주에 삽입시키기 위해 용이하게 정제한다. 예를들어, 한가지 유형 이상의 유기체에서 복제될 수 있는 벡터인 셔틀 벡터는, 이. 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애 모두에서 복제되는 경우에 이. 콜라이 플라스미드의 서열과 효모의 2μ 플라스미드의 서열을 연결시켜 제조할 수 있다.

복합체의 단백질 Upf1p, Upf2p, Upf3p, 및 유리 인자 1 및 2를 암호화하는 DNA를 발현시키는 것은 당해 분야에 공지된 임의의 프로모터/인핸서 요소에 의해 조절할 수 있지만, 이러한 조절 요소는 발현용으로 선택된 숙주에서 기능할 수 있어야 한다. 사용할 수 있는 프로모터에는 SV40 어얼리 프로모터 영역[참조 문헌: Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310], 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 포함된 프로모터[참조 문헌: Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797], 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터[참조 문헌: Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445], 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열[참조 문헌: Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42], β-락타마제 프로모터와 같은 원핵세포 발현 벡터[참조 문헌: Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731] 또는 tac 프로모터[참조 문헌: DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25]가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.

벡터는 당해 분야에서 공지된 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질유도, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(lipofection)(라이소좀 융합), 유전자 건(gun) 이용 또는 DNA 벡터 운반자[참조 문헌: Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem.263:14621-14624; Hartmut et al., 캐나다 특허원 제2,012,311호(1990. 3. 15.)]에 의해 목적하는 숙주 세포로 도입시킨다.

본 발명은 해독 종결을 조절하는데 효과적인 양으로 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자(eRF3)을 포함하는 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 본 발명은 제제가 Upf1p의 ATPase, eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성, RNA 결합, 리보솜에 대한 인자의 결합 또는 인자들 서로간의 결합을 억제하는, 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 억제하거나 조절하는 제제를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf3p의 결합, Upf3p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 조절하는 제제를 제공한다.

본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 촉진하는 제제를 제공한다. 본 발명은 eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf3p의 결합, Upf3p에 대한 eRF3 또는 eRF1의 결합, RNA 결합, 리보솜에 대한 인자들의 결합 또는 인자들 서로간의 결합을 촉진하는 제제를 제공한다. 본 발명은 리보솜에 대한 사람 Upf1p, eRF1 또는 eRF3의 결합을 조절하는 제제를 제공한다.

본 발명은 복합체에 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한 항체는 방사능, 비색, 형광성 또는 발광성 마커인 검출가능한 마커로 표지할 수 있다. 표지된 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 한가지 양태에서, 표지된 항체는 정제된 표지된 항체이다. 항체를 표지하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.

용어 "항체"에는, 예를 들어 천연 및 비-천연 항체 모두가 포함된다. 상세하게는, 용어 "항체"에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 이의 단편이 포함된다. 또한, 용어 "항체"에는 키메라 항체, 완전하게 합성한 항체 및 이의 단편이 포함된다. 이러한 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 또한 단백질 또는 항체는 방사능, 비색, 형광성 또는 발광성 마커인 검출가능한 마커를 포함할 수 있다.

항체를 시험관내에서 검출하기 위해, 예를 들어 효소, 형광단, 발색단, 방사능동위원소, 염료, 콜로이드성 금, 라텍스 입자 및 화학발광제와 같은 표지를 사용하여 표지할 수 있다. 또한, 항체를 생체내에서 검출하기 위해, 예를 들어 방사능동위원소(바람직하게는 테크네튬 또는 요오드), 자기 공명 이동 제제(예: 가돌리늄 및 망간) 또는 방사능 불투과성 제제를 사용하여 표지할 수 있다. 이러한 연구에 가장 널리 사용되는 표지는 방사능 원소, 효소, 자외선에 노출시 형광을 나타내는 화합물 등이다. 다수의 형광성 물질이 공지되어 있으며 표지로서 사용될 수 있다. 여기에는, 예를 들어 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드(Texas Red), AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow)가 포함된다. 특별한 검출 물질은 염소에서 제조하였으며 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인을 접합시킨 항-토끼 항체이다. 단백질을 또한 방사능 원소 또는 효소로 표지할 수 있다. 방사능 표지는 현재 이용할 수 있는 계수 공정에 의해 검출할 수 있다. 바람직한 이소형은³H,¹⁴C,³²P,³⁵S,³⁶Cl,⁵¹Cr,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁹⁰Y,¹²⁵I,¹³¹I 및¹⁸⁶Re로부터 선택할 수 있다.

효소 표지도 또한 유용하며, 이는 현재 이용가능한 임의의 비색계, 분광광도계, 형광 분광광도계, 전류계 도는 기체계 기술로 검출할 수 있다. 효소는 브릿지 분자(예: 카보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드 등)와의 반응시킴으로써 선택된 입자와 접합시킨다. 상기 공정에 사용할 수 있는 다수의 효소가 공지되어 있으며 이용가능하다. 바람직한 것은 퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스 옥시다제+퍼옥시다제 및 알칼리 포스파타제이다. 또다른 표지 물질 및 방법을 기술하고 있는 문헌, 예를 들어 미국 특허 제3,654,090호, 제3,850,752호 및 제4,016,043호를 참조한다.

복합체-특이적 항체 및 핵산을 본 방법에 프로브로서 사용하여 샘플 또는 특이적인 세포 유형에서 복합체 폴리펩티드(항체 사용) 또는 핵산(핵산 프로브 사용)의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 방법에서는, 복합체와 연관된 질환이 의심되는 환자의 샘플을 복합체-특이적 항체 또는 핵산 프로브와 접촉시키고 샘플에 대한 항체 또는 핵산 프로브의 특이적 결합을 검출한다. 의심되는 샘플에 존재하는 복합체 또는 핵산 수준을 대조 샘플(예: 질환이 없는 개체의 동등한 샘플) 수준과 비교하여 환자가 복합체와 연관된 질환을 갖는지를 결정할 수 있다. 복합체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 또한 진단법에서 프로브로서 사용하여, 예를 들어 샘플에 복합체-특이적 항체가 존재하는지를 검출할 수 있다. 또한, 복합체-특이적 항체를 사용하여 복합체 또는 이의 단편과 함께 복합체를 형성하는 신규한 보조인자를 검출할 있다.

본 발명은 해독 종결을 촉진시키는데 유효한 양의 복합체를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 넌센스 해독 종결을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 해독 동안의 펩티딜 트랜스퍼라제 활성은 해독 개시, 진행, 종결 및 mRNA 분해 동안에 생성된다.

본 발명은 Upf1p의 ATPase/헬리카제 활성, eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성, RNA 결합 또는 리보솜에 대한 RNA의 결합을 억제시키는 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.

특정 양태에서, NTPase 활성(예: ATPase 활성, GTPase, 헬리카제 활성) 또는 아연 핑거 모티프 배위를 방해하는 제제를 시험용으로 선택할 수 있다. 다수의 레트로바이러스, 특히 HIV, 코로나바이러스 및 기타 RNA 바이러스가 의학적 및 수의학적 병인과 관련되어 있기 때문에, 상기한 제제는 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 약제일 수 있다. 프레임이동 반응을 조절하는 단백질을 확인함으로써, 제제를 위한 초기 스크리닝에 상기한 단백질에 대한 결합 검정을 포함시킬 수 있다. 이러한 검정은 사람뿐만 아니라 효모, 또는 동물을 포함하지만 이로써 제한되지 않는 사람이 아닌 공급원으로부터 단백질과 연관된 프레임이동 활성에 대한 제제의 유효성을 시험하는데 사용될 수 있다

예를 들어, 소멸 경로를 억제하고 넌센스 전사체를 안정화시키거나 해독 종결 효율을 조절하는 제제를 확인하는 것이 안티센스 RNA 기술 성공에 있어 중요하다. 안티센스 RNA는 상보성 영역에서 특정 표적 RNA와 쌍을 이루어 표적 RNA 기능 또는 발현을 조절하는, 작고 확산가능하고 해독되지 않았으며 고도로 구조화된 전사체이다. 그러나, 안티센스 RNA 기술을 적용하려는 시도를 성공하는데는 한계가 있다. 표적 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키기 위해 세포에서 안티센스 RNA의 충분한 농도를 제공해야하는 것이 제한 인자로 나타난다. 또한, 충분한 농도를 수득하는데 있어 넌센스 소멸 경로가 방해가 되는데, 왜냐하면 유전자 산물을 암호화하는 의도가 아닌 짧은 넌센스 RNA 전사체에서 해독이 일어나는 경우에 해독이 신속하게 종결되고 결과적으로는 신속하게 분해되어 세포에서 안티센스 RNA의 양이 적어지기 때문이다. 따라서, 이상 mRNA 전사체를 안정화시키는 본 발명의 제제는 또한 안티센스 RNA도 안정화시킬 수 있다.

복합체의 존재, 상대적인 양 또는 부재는 항체 결합으로 측정한다. 친화성 크로마토그래피, 웨스턴 블롯팅 또는 다른 기술을 포함하는 가능한 검출 방법이 당해 분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.

이러한 방법은 안티센스 핵산을 사용하여 mRNA를 차단하거나 라이보자임으로 mRNA를 절단함으로써, 특정 mRNA의 해독을 차단하는 안티센스 핵산 및 라이보자임을 이용한다.

안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자의 적어도 일부와 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다[참조 문헌: Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:298]. 세포에서, 이들은 mRNA와 하이브리드화하여 이본쇄 분자를 형성한다. 세포는 이러한 이본쇄 형태의 mRNA를 해독하지 않는다. 따라서, 안티센스 핵산은 mRNA가 단백질로 발현되는 것을 방해한다. AUG 개시 코돈과 하이브리드화하는 대략 15개의 뉴클레오타이드의 올리고머 및 분자가 특히 효율적인데, 왜냐하면 이들은 합성이 용이하며, 이들을 기관 세포내로 도입하는 경우에 보다 큰 분자보다 문제가 적게 발생하기 때문이다. 안티센스 방법은 시험관내에서 다수의 유전자 발현을 억제시키는데 사용되어왔다[참조 문헌: 상기한 Marcus-Sekura, 1988; Hambor et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1237].

라이보자임은 DNA 제한 엔도뉴클레아제와 다소 유사한 방식으로 다른 일본쇄 RNA 분자를 특이적으로 절단하는 능력을 지닌 RNA 분자이다. 라이보자임은 특정 mRNA가 자체의 인트론을 절단하는 능력을 지니고 있다는 것이 관찰되어 발견되었다. 이러한 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써, 연구자들은 RNA 분자내에서 특정 뉴클레오타이드 서열을 인지하여 이를 절단하는 분자를 조작할 수 있었다[참조 문헌: Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:3030]. 이들은 서열 특이적이므로, 특정 서열을 갖는 mRNA만이 불활성화된다.

조사자들에 의해 2가지 유형의 라이보자임, 테트라하이메나(Tetrahymena) 유형 및 "햄머헤드(hammerhead)" 유형이 동정되었다. 테트라하이메나 유형 라이보자임은 4개의 염기 서열을 인지하지만, "햄머헤드" 유형은 11개 내지 18개의 염기 서열을 인지한다. 표적 mRNA 종에서는 보다 긴 인지 서열만이 생성되기 쉽다. 따라서, 특정 mRNA 종을 불활성화시키는데 햄머헤드 유형의 라이보자임이 테트라하이메나 유형의 라이보자임보다 바람직하고, 18개의 염기 인지 서열이 보다 짧은 인지 서열보다 바람직하다.

본 발명은 a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 복합체 조절에 대해 검정함을 포함하여 해독되는 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이때 복합체를 조절하는 약물은 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 연루된다. 또한 복합체는 NTPase 활성(ATPase, GTPase), RNA 결합 활성, 복합체에 결합하는 인자(예: eRF1 및 eRF3), 리보솜으로부터 분리된 인자, 응집을 촉진하는 인자, 펩티드 가수분해를 지연시킴으로써 해독 종결을 향상시키는 인자에 대해 검정할 수 있다.

본 발명은 a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 단백질 복합체 조절에 대해 검정함을 포함하여, 해독 종결을 향상시키는데 관련되는 활성 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이때 단백질을 조절하는 약물은 해독 종결을 향상시키는데 연루된다.

본 발명은 a) 약물과 복합체를 항온처리하고, b) 넌센스 억제에 대한 효과를 측정함으로써 해독 종결을 향상시키는데 관련되는 약물을 스크리닝함을 포함하여, 해독 종결을 향상시키는데 연루되는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 검정은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 RNA 또는 NTPase(예: ATPase 또는 GTPase) 검정일 수 있다.

예를 들어, 복합체의 존재, 상대적인 양 및 부재는 항체에 결합시켜 검출할 수 있다. Up1f1은 이전에 기술한 바와 같이 FLAG 에피토프에 대한 M2 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 검출할 수 있다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a,b]. eRF3은 문헌에 기술한 바와 같이 검출한다[참조 문헌: Didchenko et al., 1991]. eRF1은 문헌에 기술한 바와 같이 검출한다[참조 문헌: Stansfield et al., 1992]. Up1fp RNA-의존적인 ATPase 활성은 이전에 기술한 바와 같이 1㎍/㎖의 폴리(U) RNA 및 100㎍/㎖의 BSA를 사용하는 목탄 검정에 의해, GST-RF 융합 단백질의 존재하에 Upf1p 20ng을 사용하여 측정할 수 있다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. 결과는 명시된 단백질의 농도에 대한 유리된³²P pmol로서 도시하였다. RNA 결합은 다음과 같이 측정할 수 있다: 균질하게 표지된 32nt RNA는, 이전에 기술한 바와 같이 SstI으로 분해시킨 pGEM5Zf(+)의 SP6 전사에 의해 합성한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. RNA 결합 완충액은, 모든 반응물에 100㎍/㎖의 BSA가 포함되는 것을 제외하고는 이전에 기술한 바와 같다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. 명시된 양의 GST-eRF3(28)을 Upf1p 200ng과 함께 4℃에서 15분 동안 배양한다. RNA 기질 50fmol을 가하고 5분 동안 항온처리한다. 정지 용액을 가하고, 반응물을 4.5%의 천연 PAGE 겔(0.5×TBE, 5% 글리세롤을 함유한 30:0.5의 아크릴아미드:비스아크릴아미드)에서 전기영동한다.

본 발명은 a) 복합체를 암호화하는 핵산 또는 이의 안티센스를 함유하는 벡터를 포함하는 세포를 제공하고, b) 상기 세포에서 상기한 핵산 벡터를 과발현시켜 과발현된 복합체를 제조하여 복합체의 기능을 방해하거나 억제함을 포함하여, 세포에서 mRNA의 해독 종결 효율 및/또는 이상 전사체의 분해를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 복합체를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결함 복합체의 비율을 측정하며, (c) 형질감염 전 세포의 결함 복합체 비율을 형질감염 후 세포의 결함 복합체 비율과 비교함을 포함하여, 특허청구범위 제1항의 복합체의 결함과 관련된 질환 상태를 확인하는 방법을 제공한다.

상기한 바와 같이, 넌센스-매개된 mRNA 소멸은 필수적인 단백질의 세포내 결핍을 유발시켜 질환을 유발시킨다. 정상 mRNA의 안정성 조절이 변화되면 비교적 끔찍한 결과를 낳을 수 있다.

본 발명은 특허청구범위 제1항의 복합체 또는 복합체를 조절하고 자극하는 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하여 개체를 치료함을 포함하여, 펩티딜 트랜스퍼라제 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

넌센스 돌연변이는 240개 이상의 상이한 유전 질환(예: 낭포성 섬유증, 혈우병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 색소성망막염, 뒤시엔느 근위축증 및 마르판 증후군)의 개별적인 원인중 대략 20 내지 40%를 차지한다. 1%의 기능성 단백질만이 생성되는 다수 질환의 경우에, 환자는 심각한 질환 증상으로 고통받지만, 정상 수준의 5%만이라도 발현을 증가시키면 질환의 증상을 크게 감소시키거나 질환을 제거할 수 있다. 또한,결장암, 유방암, 식도암, 폐암, 머리 및 목의 암, 방광암의 가장 흔한 형태의 대다수가 조절 유전자(예: p53, BRCA1, BRCA2 등)에서의 프레임이동 및 넌센스 돌연변이로부터 발생된다. 각각의 단백질을 합성하도록 조절 유전자에서의 넌센스 돌연변이를 교정하면 암세포를 죽일 수 있다.

넌센스 또는 프레임이동 돌연변이의 결과인 질환, 단백질 또는 유전자는 다음을 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다: 헤모글로빈--베타 위치; 낭포성 섬유증 막통과 전위 조절자; 뒤시엔드 및 베커 유형의 진행성 가성비대 근이양증; 페닐케톤뇨증; 인슐린 수용체; 혈우병 A, 선종성 결장폴립증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 신경섬유종증 유형 I, 혈우병 B, 과지단백혈증 유형 I, 테이-삭스병, 유방암 유형 1, 부신과형성, 폰 빌레브란트병, 뮤코다당질축적증 유형 I, 백색증 I, 다낭신질환 1, 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍 각화혈관증, 다발성 내분비 신생물 유형 1, 성별 결정 영역 Y, 용질 운반체 패밀리 4 음이온 교환기 1, 콜라겐 유형 I 알파-1 쇄, 하이포크산틴 구아닌 포스포라이보실트랜스퍼라제 1, 글루코키나제, 종양 단백질 p53, 지단백질성 단백질, 마이엘린, 성장 호르몬 수용체, 황체 호르몬/코리오고나도트로핀 수용체; 고밀도지단백질의 아포지단백질 A-I, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍 과암모니아혈증, 색소성 건피증 I, 페어드 박스 호메오틱(paired box homeotic) 유전자 6, 폰힙펠-린도우 증후군, 사이클린-의존적인 키나제 억제제 2A, 결정성 경화증 2, 티로신혈증 유형 I, 노리에병, 포스포디에스테라제 6B, 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 아포지단백질 B, 브루톤 무감마글로불린혈증 타이로신 키나제, 부신 형성부전, 용질 운반체 패밀리 5, 5,10-@메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 윌름스 종양, 다낭신 질환, 전사 인자 14, 간 핵 인자, 뮤코다당질축정증 유형 II, 단백질 C 결핍증, 신경섬유종증 유형 II로 인한 선천성 혈전증, 부신백질이영양증, 콜라겐 유형 VII 알파-1, 콜라겐 유형 X 알파 1, 헤모글로빈--알파 위치-2, 당원 축적 질환 VII, 프럭토스 불내성, 유방암 2 초기 발병; BRCA2, 푸코실트랜스퍼라제 2, 헤르만스키-푸들라크 증후군, 티로글로불린, 망막모세포종, 비스코트-알드리치 증후군, 로돕신, 콜라겐 유형 XVII, 콜린 수용체, 사이클릭 뉴클레오타이드 게이트화된 채널, 광수용체, cGMP 게이트화된 콜린 수용체 니코틴 엡실론 폴리펩타이드, 재조합 활성화 유전자-1, 굴곡 이형성증, IgM이 증가된 면역부전증, 레트(RET) 원종양유전자; 레트 뮤코다당질축적증 유형 IVA, 렙틴 수용체, 유전성 구성적혈구증, 아르기닌, 바소프레신, 낭포성 섬유증으로 인한 아포지단백질 C-II 결핍증 유형 I 지단백혈증, 윌슨병, 렙틴, 혈관신경성 부종, 클로라이드 채널 5, 성선이발생증, 급성 간헐성 포르피린증, 헤모글로빈, 감마 A, 크라베병, 당원 축적 질환 V, 유아기 후 이염성 백질이양증, 거대 혈소판 증후군, 비타민 D 수용체, 사코글라이칸 델타 트위스트 드로소필라, 알츠하이머병, 세뇨관 산성혈증을 동반한 골화석증, 법랑질형성부전증, 포우 도메인 부류 1, 전사 인자 1, 당뇨병, 상염색체성 우성 V-KIT 하디-주커만 4-고양이 육종 바이러스 원종양유전자 상동체, 헤모글로빈--델타 위치, 아데닌 포스포라이보실트랜스퍼라제, 포스파타제 및 텐신 상동체, 성장 호르몬 1, 카텝신 K, 베너 증후군, 니만-피크병, 성장 호르몬-방출 호르몬 수용체, 세룰로플라스민, 콜로니 자극 인자 3 수용체, 과립구, 말초 마이엘린 단백질 22, 푸코사이드축적증, 다발성 외골증 유형 II, 판코니 빈혈, 상보성 그룹 C, 모세혈관확장성 운동실조증, 카드헤린 1, 용질 운반체 패밀리 2 멤버 2, UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 패밀리 A1, 결정성 경화증 1, 라미닌 감마 2, 시스타닌 B, 다낭신 질환 2, 미소체성 트리글리세라이드 운반 단백질 88KD, 변형이형성증, 플라빈-함유 모노옥시게나제 3, 당원 축적 질환 III, 포우 도메인 부류 3, 전사 인자 4, 시토크롬 P450 서브패밀리 IID, 포르피린증, 선천성 적혈구생성증, ATPase, Cu(2+)-운반 알파 폴리펩티드, 결장암, 가족성 비폴립증 유형 1, 포스포릴라제 키나제 알파 1 소단위(근육), 엘라스틴, 카나반병, 차이니즈 햄스터(Chinese hamster)에서의 절단-복구 상보성 결핍증, 야누스 키나제 3, 스테로이드생성 급성 조절 단백질, 푸코실트랜스퍼라제 6, 녹내장 1, 개방각, 다발성 외골증 유형 1, 마이오시클린, 무과립백혈구증, 유아성 유전 적혈구생성 수용체, 운동 뉴런 1 생존, 종말체 소닉 헤지호그(telomeric sonic hedgehog), 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제의 드로소필라 상동체 결핍, 감수분열후 분리 증가(씨. 세레비지애)-1, 절단-복구 교차 상보성 설치류의 복구 결핍증 그룹 6, 단풍당밀 뇨질환, 세포소멸 항원 1, 전사 인자 1, 간 유비퀴틴-단백질리가제 E3A, 트랜스글루타미나제 1, 마이오신 VIIA, 세극결합 단백질 베타-1 32-KD, 전사 인자 2, 간 단백질 4.2, 적혈구, 갑상선 자극 호르몬 베타 쇄, 트리처 콜린스-프란세스첼티 증후군 1, 맥락막결함증, 심내막 섬유탄성증-2, 코우덴병, 항-뮐러 호르몬, SRY-박스 10, PTA 결핍 타이로시나제-관련 단백질 1, 포스포릴라제 키나제 베타 소단위, 세린/트레오닌 단백질 키나제 11, 포스포리파제 A2 그룹 IIA, 차이니즈 햄스터 3에서의 절단-복구 상보성 결핍, 부신과형성 II 콜라겐 유형 IV 알파-4 쇄, 글라즈만 및 네겔리 신색소 표피-특이적 단백질 65-KD의 혈소판무력증, 호메오 박스 A13, 칼파인, 거대 폴리펩티드 L3, 크산틴우리아 라민 알파 2, 시토크롬 P450 서브패밀리 XIX, 뮤코다당질축적증 유형 VI, 세로이드-리포푸신증, 뉴런 3, 청소년 시트룰린증, 운베리히드 및 룬드보르그 포스포릴라제 키나제의 간대성 근경련, 고환/간 감마 2, 용질 운반체 패밀리 3 멤버 1, 프테린-4-알파-카비놀아민 데하이드라타제, 백색증 안 유형 1, 양성 신생아 요정증, 히르쉬스프룽병 골화석증, 상염색체성 열성 RAS p21 단백질 활성자 1, 뮤코다당질축적증 유형 VII 체디악-히가시 증후군, 칼륨 채널 내부 교정 서브패밀리 I 멤버 1, 플라코필린 1, 혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제 이소형 1B 알파 소단위, 플렉틴 1, 짧은 신장, MHC 부류 II 트랜스활성자, 저인산혈증, 비타민 D-내성 구루병, 릭 바이코이드(RIEG BIOCOID)-관련 호메오박스 전사 인자 1, 근이양증, 각막윤부연대 유형 2E, 색소성망막염-3, MutS, 이. 콜라이 동족체 3, 타이로신 트랜스아미나제 결핍 로우 안뇌신증 증후군, 크산틴성 신결핵증, 가족성 청소년 1 내장역위증, X-연결된 뮐러-디커 뇌회결함 증후군, 프로페르딘 결핍, X-연결된 3-@옥소산 CoA 트랜스퍼라제, 워르덴버그-샨 증후군 근이양증, 각막윤부연대 유형 2, 알포트 증후군, 상염색체성 열성 당원 축적 질환 IV 당뇨병, 상염색체 우성 유형 II 용질 운반체 패밀리 2 멤버 1, 손-발-자궁 시스틴축적증 증후군, 초기 발병 또는 유아 신장병증 유형, 그리글러-나자르 증후군, 인슐린유사 성장 인자 1, 락테이트 데하이드로게나제-A, 스티클러 증후군 유형 II, 레버 I 알파-갈락토시다제 B의 선천성 흑내장, 부신과형성 I 리-프라우메니 증후군, 용질 운반체 12 패밀리 12 멤버 1, 클라인-워덴부르그 증후군 퍼옥시좀 생물발생 인자 7, 페어드 박스호메오틱 유전자 8, 망막분리, 5-하이드록시트립타민 수용체 2C, 우레이트 옥사다제, 페우츠-제처르스 증후군 승모판 탈출증, 가족성 흑색종, 악성 피부 2, 푸코실트랜스퍼라제 1, 다발이공증, 뮤코다당질축적증 유형 IIIB, P-당단백질-3, 중증 합병형 면역부전증, B-세포 음성 색소성 망막염, 리보솜 단백질 S6 키나제 90KD, 폴리펩티드 3 증후군, X-연결된 인자 결핍, 상보성 인자의 드로소필라 동족체 4, 데하이드로게나제/델타-이소머라제 유형 I, 진행성 전도성 등골 고정 AQP1 1, 가족성 진행성 간, 유형 III 모노포스페이트 데아미나제-1 및 호메오박스 전사 인자 1.

본 발명은 넌센스 및 프레임이동 돌연변이에 의해 유발되는 질환을 치료하는 치료제로서 작용하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. ATP 결합 활성, ATPase 활성, RNA 헬리카제 활성, GTP 결합, GTPase 활성, 복합체에 대한 유리 인자 또는 RNA 결합, 또는 이들 서로간의 결합(즉, eRF1 및 eRF3에 대한 Upf1p의 결합, 또는 Upf3p에 대한 Upf2p의 결합)을 모니터하는 생화학적 및 시험관내 검정에 의해, mRNA 소멸 및 해독 억제에서의 사람 유전자 산물의 활성을 정량화할 수 있는검정을 개발하고 상기한 검정을 사용하여 화합물을 스크리닝한다. 본원에서 기술한 실험은 인자들의 복합체 및 복합체의 단백질의 활성을 길항하거나 상승시키는 것이 필수 유전자에서의 넌센스 돌연변이의 치명적인 영향을 극복할 수 있음을 나타내며, 사람 제제 또는 화합물을 수득할 수 있도록 약물을 개발하기 위한 모델 시스템으로서 효모를 설정하였다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "시험 조성물"은 유전자, 핵산 서열, 폴리펩티드, 펩티드 단편과 같은 임의의 조성물, 정해진 용량내에서 기능하는 능력을 검정할 수 있는 순열조합적 라이브러리 또는 다른 순열조합 과정을 사용하여 제조한 조성물, 또는 복합체의 활성을 모방한 화합물이다. 핵산 서열 또는 폴리펩티드와 같은 이러한 시험 조성물은 이의 서열 또는 구조 때문에 정해진 용량내에서 기능할 수 있는 것으로 추정된다.

"보조인자"는 복합체를 조절할 수 있고 NMRD 또는 해독 종결 효율에 영향을 미칠 수 있는 임의의 조성물(예: 폴리펩티드, 폴리펩티드 유도체 또는 펩티드 의태체)이다. 조성물에는 복합체를 통해 NMRD 또는 해독 종결 효율을 자연적으로 유도하는 조성물이 포함되지만, 자연적으로 NMRD를 유도하지 않는 조성물(예: 인공 조성물 및 다른 목적으로 작용하는 천연 조성물)도 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능제"는 복합체, 또는 복합체의 Upf1p와 상호작용하는 복합체의 인자(예: eRF1 또는 eRF3)와 상호작용하거나 결합함으로써 해독 종결 효율 또는 mRNA 분해를 증가시키거나 자극시킬 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 복합체, 또는 복합체의 Upf1p와 상호작용하는 복합체의 인자(예: eRF1 또는 eRF3)와 상호작용하거나 결합함으로써 해독 종결 효율 또는 mRNA 분해를 감소시키거나 억제시킬 수 있는 임의의 조성물을 의미한다.

본 발명은 또한 세포에서 시험 제제 또는 조성물이 복합체를 조절하는지를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 복합체를 갖는 세포를 제공하고, (ii) 세포를, 시험 제제 또는 조성물의 부재하에 세포에서 복합체를 활성화시키는 시험 제제 또는 조성물과 접촉시키며, (iii) 세포의 복합체에서의 변화를 검출함으로써 수행할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 있어, 세포는 시험 제제 또는 조성물과 동시에 또는 순자차적으로 접촉시킬 수 있다. 복합체가 증가하는 것은, 시험 제제 또는 조성물이 복합체의 효능제임을 나타내고, 복합체가 감소되는 것은, 시험 제제 또는 조성물이 복합체의 길항제임을 나타낸다. 경우에 따라, 복합체 조절자를 확인하는 상기한 방법을 사용하여, 본 발명의 이러한 양태에 사용하기 위한 복합체를 포함하는 복합체 경로내에 있는 조성물, 보조인자 또는 다른 조성물을 확인할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 임의의 제제 또는 조성물을 시험 제제 또는 조성물로서 사용할 수 있으며, 바람직한 시험 제제 또는 조성물에는 폴리펩티드 및 작은 유기 화합물 제제 또는 조성물이 포함된다. 서열 또는 구조적 상동성이, 세포에서 시험 제제 또는 조성물이 복합체를 조절할 수 있는지를 추측하는데 있어 기초를 제공하더라도, 무작위적으로 선택된 시험 제제 또는 조성물도 본 발명에 사용하기에 적합하다. 제제 또는 조성물을 무작위적으로 제조하는 공지된 방법(예: 핵산 라이브러리로부터 폴리펩티드 발현)을 사용하여 적합한 시험 제제 또는 조성물을 제조할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본원에서 기술한 특정 기술 대신에 대체 기술을 사용할 수 있음을 알 수 있을 것이다.

본 발명은 또한, 복합체를 함유하는 샘플을 시험 조성물과 접촉시키고 시험 조성물을 적용한 후 복합체의 변화를 측정함을 포함하여, 복합체에 결합하는 신규한 보조인자 또는 억제자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 복합체는 복합체에 영향을 미치는 신규한 시험 화합물 또는 신규한 시험 조성물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에 유용하다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 시험 조성물을 함유하는 성분과 이와 상호작용하기에 충분한 조건하에 복합체를 함께 항온처리한 다음, 시험 세포에서 복합체상에서의 시험 조성물의 효과를 측정함을 포함하여, 시험 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 복합체 및 조성물에 대해 관찰된 효과는 길항성일 수도 있고 효능성일 수 있다.

본 발명은 (a) 단백질 복합체를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결함 단백질 복합체의 비율을 측정하며, (c) 형질감염 전 세포의 결함 단백질 복합체 비율과 형질감염 후 세포의 결함 단백질 복합체 비율을 비교함을 포함하여, 결함 단백질 복합체가 관련된 질환을 확인하는 방법을 제공한다.

당해 분야에서 공지된 임의의 스크리닝 기술을, 해독 종결 또는 mRNA 소멸 단백질에 영향을 미치는 제제를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 작은 분자 리간드를 스크리닝하는 것을 포함한다.

해독 종결 또는 mRNA 소멸 단백질의 1차적인 서열에 대한 정보와 기능이 공지된 단백질과의 서열 유사성에 대한 정보는 단백질 활성에 영향을 미칠 수 있는제제에 대한 초기 실마리를 제공한다. 이러한 제제를 확인하고 스크리닝하는 방법은, 예를 들어 X-선 결정법, 중성자 회절법, 핵자기 공명 분광법, 및 구조를 결정하기 위한 다른 기술을 사용하여 단백질의 구조적인 특성을 측정함으로써 용이해진다. 이러한 기술로 효능제 및 길항제를 합리적으로 디자인하거나 확인할 수 있다.

해독 종결에 수반되는 복합체의 단백질 또는 mRNA 소멸 단백질을 발현시키는 재조합 세포, 또는 정제된 단백질을 사용하여 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 표지된 단백질이 순열조합적인 라이브러리중의 분자에 결합하는 능력을, 상기 참조 문헌에서 기술한 바와 같이 스크리닝 검정으로서 사용할 수 있다.

본 발명은 a) 상기 후보 숙주 세포의 클론 집단을 제공하고, b) 세포내 단백질이 항체와 근접할 수 있도록 세포의 클론 집단을 처리하고, c) 세포내 단백질을, 복합체와 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키며, d) 후보 숙주 세포에 의해 생성된 복합체의 상대적인 양을 측정함을 포함하여, 대조 세포와 후보 숙주 세포에 의해 생성된 복합체의 양을 비교하여 후보 숙주 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 a) DNA를 함유하는 세포를 제공하고, b) 세포에서 상기 DNA를 과발현시켜 Upf1p와 결합하여 Upf1p의 기능을 방해하는 과발현된 폴리펩티드를 생성함을 포함하여, 세포에서 mRNA 해독 종결 효율 및/또는 이상 전사체의 분해를 실질적으로 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 a) 세포를 제공하고, b) 복합체에 결합하기에 충분한 양으로 복합체의 안티센스 전사체를 발현시킴을 포함하여, 세포에서 mRNA 해독 종결 효율 및/또는 이상 전사체의 분해를 실질적으로 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포에서 본질적으로 기능하지 않는 복합체가 생성되도록, Upf1p, Upf2p, Upf3p, eRF1 및 eRF3를 포함하는 복합체를 돌연변이시킴을 포함하여, 세포에서 해독 종결을 실질적으로 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포에 도입되는 복합체 및 약제학적 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하여 개체를 치료함을 포함하여, mRNA 해독 종결 효율 및/또는 이상 전사체의 분해와 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

한가지 양태에서, 본 발명은 환자의 상태를 완화시키는 치료학적 유효량으로, 복합체의 발현을 조절하는 제형 또는 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 유전적 결함의 결과로서 결함과 연관된 병인을 갖는 초기 상태의 질환 또는 임상적인 상태를 갖거나 이의 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, "치료학적으로 유효한"은 치료되는 환자의 상태를 완화시키기에 충분한 양인 제형의 양을 의미한다. "완화"는 치료를 받는 환자의 질환 상태 또는 장애의 유해한 효과를 감소시킴을 의미한다. 본 발명의 개체는 바람직하게는 사람이지만, 본 발명의 방법으로 다른 동물을 치료할 수 있다는 것도 고려된다. 용어 "조절"은 복합체, mRNA, 핵산, 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 향상시키거나 억제하거나 변화시키거나 또는 변형시킴을 의미한다.

약물 표적화의 경우, 약물 개발을 위해, 예를 들어 순열조합적인 라이브러리 기술 또는 합리적인 약물 디자인 기술을 사용하여 한 도메인 또는 다른 도메인을표적화시킬 수 있음이 명백하게 나타난다.

상기한 관점에서, 본 발명이 항바이러스 치료 및 병리학적인 넌센스 돌연변이 억제와 중요한 관련성이 있는 해독 종결에 영향을 미치는 다수의 경로를 제공함이 명백하다. 따라서, 본 발명은 항바이러스성 화합물로서 사용하기 위한 약물 또는 리보솜 소멸을 변화시키는 약물을 제공한다.

용어 "약물"은 본원에서 해독 개시, 진행, 종결, mRNA 분해 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 중심의 기능에 영향을 미칠 수 있는 화합물 또는 제제(예: 항생제 또는 단백질)을 의미한다. 이러한 화합물은 이상 mRNA 및 해독 종결 효율을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

유전자 치료법 및 형질전환 벡터

한가지 양태에서, 복합체 또는 복합체의 인자를 암호화하는 핵산, 복합체에 특이적인 안티센스 또는 라이보자임, 또는 유리 인자 및 Upf1p 영역에 특이적인 안티센스 또는 라이보자임을 생체내에서 바이러스 벡터내로 도입한다. 이러한 벡터에는, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV), 파필로마바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus; EBR), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV) 등을 포함하지만 이로써 제한되지는 않는 감쇠 또는 결함 DNA 바이러스가 포함된다. 바이러스 유전자가 완전히 또는 거의 완전히 결핍된 결함 바이러스가 바람직하다. 결함 바이러스는 세포내로 도입된 후에 세포를 감염시키지 않는다. 결함 바이러스 벡터를 사용하면 벡터가다른 세포를 감염시킬 수 있다는 염려없이도 특이적으로 국소화된 영역중 세포로 벡터를 도입할 수 있다. 따라서, 지방 조직이 특이적으로 표적화될 수 있다. 구체적인 벡터의 예로는 결함 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터[참조 문헌: Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330(1991)], 문헌에 기술되어 있는 벡터와 같은 감쇠된 아데노바이러스 벡터[참조 문헌: Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90: 626-630(1992)] 및 결함 아데노-관련된 바이러스 벡터[참조 문헌: Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3103(1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828(1989)]가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.

다른 양태에서 유전자는, 예를 들어 다음 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 레트로바이러스 벡터에 도입시킬 수 있다[참조 문헌: Anderson et al., 미국 특허 제5,399,346호; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., 미국 특허 제4,650,764호; Temin et al., 미국 특허 제4,980,289호; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., 미국 특허 제5,124,263호; 국제 특허 공보 제WO 95/07358호(1995.3.16.), Dougherty et al.; and Kuo et al., 1993, Blood 82:845]. 표적화된 유전자 전달은 국제 특허 공보 제WO95/28494호(1995.10.)에 기술되어 있다.

선택적으로, 벡터를 리포펙션에 의해 생체내에서 도입시킬 수 있다. 과거 십년 동안, 생체내에서 핵산을 포집시키고 형질감염시키는데 있어 리포좀의 사용이 증가되었다. 마커를 암호화하는 유전자의 생체내 형질감염용 리포좀을 제조하는데는, 리포좀 매개된 형질감염이 직면하는 어려움 및 위험성을 제한하기 위해 디자인된 합성 양이온성 지질을 사용할 수 있다[참조 문헌: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417(1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031(1988)]. 양이온성 지질을 사용함으로써 음전하로 하전된 핵산 포집을 촉진시킬 수 있고, 또한 음전하로 하전된 세포 막을 사용한 융합을 촉진시킬 수 있다[참조 문헌: Felgner and Ringold, Science 337:387-388(1989)]. 외인성 유전자를 생체내 특정 기관으로 도입시키는데 리포펙션을 사용하는 것은 특별한 실질적인 잇점이 있다. 한가지 잇점은 특이적인 세포에 대해 리포좀이 분자적으로 표적화된다는 것이다. 특정 세포 유형으로의 형질감염을 지시하는 것이 세포적 이종성을 갖는 조직(예: 췌장, 간, 신장 및 뇌)에서 특히 유리하다는 것이 명백하다. 표적화 목적을 위해, 지질을 다른 분자와 화학적으로 커플링시킬 수 있다[참조 문헌: 상기한 Mackey et al.]. 표적화된 펩티드(예: 호르몬, 신경전달물질, 및 항체와 같은 단백질) 또는 비-펩티드 분자를 리포좀에 화학적으로 커플링시킬 수 있다.

생체내에서 벡터를 나상 DNA 플라스미드로서 도입하는 것도 또한 가능하다. 유전자 치료용 나상 DNA 벡터는 당해 분야에서 공지된 방법(예: 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질유도, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 유전자 건 사용 또는 DNA 벡터 전달자 사용)에 의해 목적하는 숙주 세포로 도입시킬 수 있다[참조 문헌: Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967(1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624(1988); Hartmut et al., 캐나다 특허원 제2,012,311호(1990. 3. 15.)].

추가 양태에서, 본 발명은 동등한 발현 조절하에 있는 관련없는 안티센스 핵산 또는 라이보자임에 대한 유전자와 함께, 펩티딜 트랜스퍼라제 중심의 조절자(예: 돌연변이 프레임이동 또는 mRNA 소멸 단백질용 유전자, 또는 이러한 단백질을 암호화하는 mRNA에 특이적인 안티센스 RNA 또는 라이보자임)를 암호화하는 유전자 모두를 포함하는 유전자 치료 발현 벡터를 제공함으로써, 특이적인 DNA 인지 서열의 조절하에 있는 펩티딜 트랜스퍼라제 중심의 활성을 조절하는 유전자 산물과 치료적인 이종성 안티센스 또는 라이보자임 유전자 산물을 공동 발현시키는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 이러한 요소는 개별적으로 벡터로 제공되거나, 단일 발현 벡터로 제공될 수 있다.

항바이러스 치료법

여전히 추가 양태에서, 본 발명은 해독 종결을 조절하여 바이러스 복제 또는 바이러스 입자의 어셈블리에 직접 영향을 미치는 제제를 제공함으로써 바이러스 감염을 치료하는 수단을 제공한다.

본 발명은 유리하게는, 4개의 동물 바이러스 군 및 3개의 식물 바이러스 군을 포함하여, 기본적인 -1 리보솜 프레임이동 메카니즘을 이용하는 바이러스의 항바이러스(또는 넌센스 억제) 치료에 사용하기 위한 약물 및 이를 확인하는 방법을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 복합체를 수반하는 프레임이동에 영향을 미치고 Upf3p를 포함하는 제제, 길항체/효능제를 스크리닝하는 검정을 제공한다. 또한 본 발명은 돌연변이 Upf3를 제공한다.

예를 들어, 거의 모든 레트로바이러스는 -1 리보솜 프레임이동을 이용하며, 이의 예에는 렌티바이러스류(면역결핍 바이러스), 예를 들어 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, 비스나 바이러스, 관절염-뇌염 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스; 스푸마바이러스류(포아미 바이러스류), 예를 들어 사람 포아미 바이러스 및 기타 포유동물 포아미 바이러스; T 세포 림프향성 바이러스류, 예를 들어 HTLV-I, HTLV-II, STLV 및 BLV; 조류 백혈증 바이러스류, 예를 들어 통상의 가금류를 포함한 다수의 조류의 백혈병 및 육종 바이러스; 유형 B 레트로바이러스류, 예를 들어 마우스 유방암 바이러스; 및 유형 D 레트로바이러스류, 예를 들어 만손-화이자 원숭이 바이러스 및 양 폐선암 바이러스가 포함된다. 또한, 다수의 코로나바이러스류가 -1 프레임이동을 이용하는데, 이의 예에는 사람 코로나바이러스, 예를 들어 229-E, OC43; 동물 코로나바이러스, 예를 들어 송아지 코로나바이러스, 돼지 전달성 위장염 바이러스, 돼지의 헤마글루틴화 뇌척수염 바이러스, 돼지 표피 설사 바이러스; 개 코로나바이러스; 고양이 감염성 복막염 바이러스 및 고양이 장 코로나바이러스; 닭 감염성 기관지염 바이러스 및 칠면조 블루콤(bluecomb) 바이러스; 마우스 간염 바이러스, 랫트 코로나바이러스 및 토끼 코로나바이러스가 포함된다. 유사하게, 토로 바이러스(코로나바이러스의 한 유형), 예를 들어 장 및 호흡기 질환과 관련된 사람 토로바이러스; 송아지 브레다 바이러스 및 소 호흡기 바이러스; 말 베른 바이러스; 돼지 토로바이러스; 닭 토로바이러스가 있다. 다른 코로바이러스에는, 원숭이 출혈열 바이러스, 말 동맥염 아테리바이러스, 레일스태드 바이러스(돼지), VR2332 바이러스(돼지) 및 락테이트 데하이드로게나제-상승 바이러스(설치류)를 포함한 아테리바이러스가 있다. 다른 동물 바이러스에는 파라믹소바이러스(예: 홍역에서 언급된 사람 -1 리보솜 프레임이동) 및 아스트로바이러스(사람 아스트로바이러스 1 내지 5, 및 소, 양, 돼지, 개 및 오리 아스트로바이러스)가 있다.

-1 프레임이동 메카니즘을 포함하는 식물 바이러스에는 테트라바이러스류, 예를 들어 소베모바이러스[예: 써던 빈 모자이크 바이러스(southern bean mosaic virus), 콕스풋 미틀 바이러스(cocksfoot mettle virus)], 레우테오바이러스[예: 배얼리 옐로우스와프 바이러스(barley yellowswarf virus), 비트 웨스턴 옐로우즈 바이러스(beet western yellows virus) 및 포테이토 립 롤 바이러스(potato leaf roll virus), 에나모바이러스[예: 콩 모자이크 바이러스], 움브라바이러스[예: 캐롯 모틀 바이러스(carrot mottle viruse)]; 톰부스바이러스류, 예를 들어 톰부스바이러스[예: 토마토 부쉬 스턴트 바이러스(tomato bushy stunt virus), 카르모바이러스[예: 카네이션 모틀 바이러스(carnation mottle virus)], 네크로바이러스(예: 담배 괴사 바이러스); 디안토바이러스[예: 레드 클로버 괴사 모자이크 바이러스] 및 마키오모바이러스[예: 메이즈 클로로틱 모틀 바이러스(maize chlorotic mottle virus)]가 포함된다.

또한, L-A 및 L-BC(효모)와 같은 토티바이러스류 및 기타 진균 바이러스류, 지라디아 람다 바이러스(장 기생충), 트리코넬라 배지넬 바이러스(사람 기생충), 레이쉬마니아 브라실리엔시스 바이러스(사람 기생충) 및 다른 원생동물 바이러스가 -1 프레임이동 바이러스이다.

본 발명에 따라서, 본 발명의 치료학적 조성물 성분 또는 성분들은 비경구,암가까이, 점막내, 경피적, 근육내, 정맥내, 표피내, 피하, 복강내, 심실내 또는 두골내로 도입하거나 투여할 수 있다.

전달 형태에는 나상 DNA, 단백질, 펩티드, 또는 바이러스 벡터 또는 리포좀중의 형태가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 한가지 양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 아데노바이러스이다.

당해 분야의 숙련가에게 쉽게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 동물, 특별하게는 포유동물, 보다 상세하게는 사람을 치료하는데 특히 적합하다. 수의학적 용도의 경우, 이로써 제한되지는 않지만 애완 동물(예: 고양이 및 개), 가축(예: 소, 말, 염소, 양 및 돼지), 야생 동물(야생 또는 동물원에 있는 동물), 연구용 동물(예: 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등) 등이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적 조성물"은 SCF 치료에 유용한, 적합한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 갖는, 치료학적으로 유효한 양의 복합체를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료학적으로 유효한 양"은 소정의 조건 및 투여 방식에 대해 치료학적 효과를 제공하는 양을 의미한다. 이러한 조성물은 액체 제형, 냉동건조 제형 또는 다르게 건조된 제형이고, 다양한 완충 내용물(예: 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 농도의 희석제, 표면에 흡수되는 것을 방지하는 부가제(예: 알부민 젤라틴), 세제(예: 트윈(Tween) 20, 트윈 80, 플루로닉(Pluronic) F68, 담즙산염), 가용화제(예: 글리세룰, 폴리에틸렌 글리세롤), 산화방지제(예: 아스코르브산, 메타아황산나트륨), 방부제(예: 티메로살, 벤질 알콜, 파라벤), 용적 증가 물질 또는 등장성 개질제(예: 락토스, 만니톨), 단백질에 대한 중합체 공유결합 제제(예: 폴리에틸렌 글리콜), 금속이온과의 착화제, 또는 물질을 중합체성 화합물(예: 폴리락트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등)의 특정 제제내 또는 제제상에, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 단층 베시클, 다층 베시클, 적혈구 고스트 또는 스페로플라스트상에 혼입시키는 제제를 포함한다. 이러한 조성물은 SCF의 생리학적 상태, 가용성, 안정성, 생체내 유리율 및 생체내 제거율에 영향을 미친다. 조성물의 선택은 SCF 활성을 지닌 단백질의 물리적 및 화학적 특성에 좌우된다. 예를 들어, SCF의 막-결합된 형태로부터 유도된 생성물은 세제를 함유하는 제형을 요구할 수 있다. 조절 또는 지연성 방출 조성물은 친지성 저장부(예: 지방산, 왁스, 오일)중에 제형을 포함한다. 또한, 본 발명에는 중합체(예: 폴록사머 또는 폴록스아민)로 피복된 특정 조성물이 포함되며, 조직 특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대해 지시된 항체와 커플링되거나 조직 특이적 수용체 리간드와 커플링된 SCF가 포함된다. 본 발명의 조성물의 다른 양태에서는 특정 형태의 보호 피막, 프로테아제 억제제 또는 다양한 투여 경로(예: 비경구, 폐, 비강 및 경구)에 대한 투과성 향상제를 혼입시킨다.

또한 본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며, 이로써 제한되지는 않지만 0.01 내지 0.1M, 바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액 및 0.8% 염수가 이에 포함된다. 또한, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼일 수 있다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유(예: 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르(예: 에틸 올레에이트)이다. 염수 및 완충된 매질을 포함하는 수성 담체에는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 수용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 또는 경화유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 유동성 및 영양성 보충제, 전해질 보충제(예: 링거 덱스트로스 기본의 전해질 보충제) 등이 포함된다. 방부제 및 다른 부가제로, 예를 들어 항균제, 산화방지제, 킬레이트제, 불활성 가스 등이 존재할 수도 있다.

본원에서 "치료학적으로 유효한 양"은 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상학적으로 중요한 결함을 약 15% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 감소시키고, 가장 바람직하게는 이를 억제시키는데 충분한 양을 의미한다. 또한, 치료학적으로 유효한 양은 숙주에서 임상학적으로 중요한 상태를 개선시키는데 충분하다. 당해 분야의 숙련가에게 이해되는 바와 같이, 화합물의 양은 이의 비활성도에 따라 다양할 수 있으며, 적합한 용량은 1일 개체의 체중 ㎏당 활성 성분이 약 0.1 내지 20㎎, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10㎎, 보다 바람직하게는 1 내지 수십㎎의 범위일 수 있으며 이는 투여 경로에 좌우된다. 한가지 양태에서, 성분의 양은 ㎏당 10pg 내지 20㎎의 범위이다. 다른 양태에서, 성분의 양은 ㎏당 2 내지 80㎍이다. 또다른 양태에서, 성분의 양은 ㎏당 5 내지 20㎍이다.

본 발명의 치료 조성물과 함께 사용되는 경우, 용어 "단위 용량"은 사람의 경우 단일 투여량으로서 적합한, 물리적으로 구별된 단위를 의미하는데, 이때 각 단위는 요구되는 희석제(예: 담체 또는 비히클)과 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리측정된 양을 포함한다.

여전히 다른 양태에서, 치료 화합물은 조절된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 복합체는 정맥내 주입, 이식가능한 삼투성 펌프, 경피성 패취, 리포좀 또는 다른 투여 형태를 사용하여 투여할 수 있다. 한가지 양태에서, 펌프를 사용할 수 있다[참조 문헌: 상기한 Langer; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:210(1987); Buchwald et al., Surgery 88:507(1980); Saudek et al., N. Emgl. J. Med. 321:574(1989)]. 다른 양태에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다[참조 문헌: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Press., Boca Raton, Florida(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley, New York(1984); Ranger and Peppas, J. Macromol, Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61(1983); Levy et all., Science 228:190(1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351(1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105(1989)]. 여전히 다른 양태에서는, 치료 표적(예: 뇌)에 근접하도록 조절된 방출 시스템을 위치시켜 전신 용량의 일부만을 수용하도록 한다[참조 문헌: Goodson, 상기한 Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138(1984)]. 바람직하게는, 조절된 방출 장치를 부적절한 면역 활성 또는 종양 부위에 근접하도록 개체에 도입시킨다. 다른 조절된 방출 시스템은 문헌에 논의되어 있다[참조 문헌: Science 249:1527-1533(1990)]

당해 분야의 숙련가에게 용이하게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 방법 및 약제학적 조성물은 임의의 동물, 특별하게는 포유동물에게 투여하는데 특히 적합하며, 포유동물의 예에는 수의학적 용도의 경우, 이로써 제한되지는 않지만 애완 동물(예: 고양이 및 개), 가축(예: 소, 말, 염소, 양 및 돼지), 야생 동물(야생 또는 동물원에 있는 동물), 연구용 동물(예: 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등) 등이 포함된다.

본 발명은 본 발명의 예로서 제공되는, 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 보다 용이하게 이해될 것이다.

실시예 1

해독 종결 및 이상 mRNA 분해 향상

넌센스-매개된 mRNA 소멸 경로는 넌센스 돌연변이를 함유하는 전사체를 세포로부터 제거하는, 진화적으로 보존된 감시 경로의 한가지 예이다. UPF1 유전자 산물은 이상 mRNA를 인지하고 분해하는 추정 감시 복합체의 필수 성분이다. 본원에서 제시된 결과는 Upf1p의 효모형 및 사람 형이 진핵세포 해독 종결 인자 eRF1 및 eRF3 모두와 상호작용한다는 것을 입증한다. Upf1p가 eRF와 상호작용한다는 것과 일치하여, Upf1p는 효모[PSI⁺] 균주에서 관찰되는 eRF1 및 eRF3를 함유하는 프리온-유사 응집체에서 발견된다. 이러한 결과는, Upf1p와 펩티드 유리 인자와의 상호작용이, 종결이 미성숙하게 발생하는지를 감시하는 해독 종결 감시기능을 향상시켜 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 추정 감시 복합체의 어셈블리에서 중요한 반응임을 나타낸다.

재료 및 방법

일반적인 효모 방법: 효모 배지는 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 제조한다[참조 문헌: Rose et al., 1990]. 효모 형질전환은 리튬 아세테이트 방법으로 수행한다[참조 문헌: Scheistl and Geitz, 1989]. RNA 분리, 블롯팅 및 하이브리드화는 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Weng et al., 1996a; Hagan et al., 1995].

플라스미드: 플라스미드 YCp 및 YEp RENTCHI4-2는 MET25 프로모터하에 있는 키메라 유전자를 지닌 pMET25CHIMERA[참조 문헌: Perlick et al., 1996]의 4.5kb SstI-Asp718 단편을 YCplac22 및 YEplac112에 각각 연결시켜 제조한다[참조 문헌: Ferguson et al., 1981]. YCpFLAGUPF1 및 YEpFLAGUPF1는 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Weng et al., 1996a]. GST-RF 융합 플라스미드 pGEX2T, pGEX2T-SUP35 및 pGEX2T-SUP45는 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Paushkin et al., 1997b].

글루타티온 세파로즈-RF 융합 복합체의 제조: pGEX2T, pGEX2T-SUP35 및 pGEX2T-SUP45로 형질전환된 균주 BL21(DE3) pLysS[참조 문헌: Paushkin et al., 1997b]는 50㎍/㎖의 암피실린 및 30㎍/㎖의 클로람페닐콜이 있는 LB상에서 24℃에서 배양시켜 OD₆₀₀이 0.6이 되게 한다. 0.3mM IPTG를 가하고 세포를 밤새 배양시킨다. 세포를 수집하고, 0.5mM PMSF가 있는 차가운 TBST(50mM 트리스, pH 7.4,150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100)로 1회 세척한다. 세포는 배양물 ㎖당 0.5mM PMSF를 갖는 TBST 50㎕에 재현탁시키고 초음파로 용해시킨다. 트리톤 X-100을 가하여 최종 농도가 1%가 되게하고, 용해물을 4℃에서 20분 동안 혼합한다. 세포 부스러기는 30,000xg에서 30분 동안 원심분리하여 제거한다. TBST중에 평형화시킨 50% 글루타티온-세파로즈(Pharmacia) 슬러리 80㎕를 추출물 1㎖당 가하고, 30분 동안 혼합하면서 4℃에서 항온처리한다. 세파로즈 비이드를 500xg에서 3분 동안 수집하고, 500mM로 NaCl이 보충된 TBST로 3분 동안 세척하고 총 2시간 동안 상기한 바와 같이 수집한다. 세파로즈-단백질 복합체를 세척한 다음, IBTB(25mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50mM KCl, 10mM MgCl₂, 2% 글리세롤, 0.1% 트리톤 X-100, 100㎍/㎖ BSA)를 사용하여 총 2시간 동안 이전과 같이 수집하고, 충전된 비이드 용적에 대한 완충액의 비가 2:1이 되도록 IBTB에 재현탁시킨다. GST-RF 복합체 1㎕는 통상 GST-eRF1 0.9㎍ 또는 GST-eRF 3 1.5㎍을 함유하지만, GST 복합체는 통상 수지 ㎕당 GST 4.5㎍을 함유한다.

세포질성 추출물의 제조: BJ3505(MATα pep4::HIS3 prb-△1.6R HIS3 lys2-208 trp1-△10 ura3-52 gal2 can1) 세포는 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 배양하고 0.5mM PMSF가 있는 차가운 완충액 IB(BSA가 결핍된 IBTB) 5㎖로 세척한다. 세포를 재펠렛화하고, 세포 중량 g당 0.5mM PMSF 및 프로테아제 억제제(PI, 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴 A가 각각 1㎍/㎖)가 있는 차가운 IB 1.3㎖에 재현탁시킨다. 대략 동일 용적의 유리 비이드를 가하고, 볼텍싱(vortexing) 사이에는 얼음에서 1분 동안 냉각시키면서 20초로 6회 볼텍싱하여 용해시킨다. 용해물을 제거하고, 비이드는 0.5mM PMSF 및 각각 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴 A 1㎍/㎖가 있는 동일 용적의 IB로 2회 세척한다. 세척액을 용해물과 합하고, 세포 부스러기는 30,000xg에서 20분 동안 원심분리하여 제거한다.

[PSI⁺] upf1△ 균주의 제조: UPF1은 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 [PSI⁺] 균주 7G-H66(MATa ade2-1 SUQ5 trp1-289 leu2-3,112 ura3-52[PSI⁺])으로부터 결실시킨다[참조 문헌: Cui et al., 1995]. 써던 블롯 분석에 의해 결실을 확인한다. [PSI⁺] 결정기를 복구하기 위해, 7G-H66 upf1△은 3mM GuHCl[참조 문헌: Ter-Avanesyan et al., 1994]을 함유한 배지에서 배양한다. UPF1의 파괴로 ade2-1가 억제되는데, 이는 [PSI⁺]의 억제자 표현형을 모니터하는데 사용되며, 따라서 GuHCl 배지에서 배양한 후에 수득되는 클론의 [psi^-] 상태는 1A-H19 [psi^-] 시험 균주(MATα ade2-1 lys2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 SUQ5[psi^-])와 교차하는 것으로 확인된다[참조 문헌: Ter-Avanesyan et al., 1994]. upf1△ 대립유전자의 억제자 표현형은 열성이지만, [PSI⁺] 결정기는 우성이다. 따라서, 이배체의 비-억제자 표현형은 클론의 [psi^-] 상태를 나타낸다. 균주 7G-H66 upf1△의 [PSI⁺] 및 [psi^-] 분리체는 동원체 기본 플라스미드 YCplac22FLAGUPF1로 형질전환시킨다[참조 문헌: Weng et al., 1996a; Weng et al., 1996b].

[PSI⁺] 응집체 공동 원심분리용 용해물의 제조: YCplac22 또는 YCpFLAGUPF1로 형질전환된 7G-H66 upf1△ 세포는 트립토판이 결핍된 배지에서 배양하여 OD₆₀₀이 1.5가 되게 하고 물에서 세척하고, 1mM PMSF 및 PI(2㎍/㎖의 아프로티닌, 1㎍/㎖의 펩스타틴 A, 0.5㎍/㎖의 류펩틴, 2.5㎍/㎖의 안티파인, 0.5㎍/㎖의 TLCK, 0.5㎍/㎖의 TPCK, 0.1mM의 벤즈아미딘 및 1mM의 메타아황산나트륨)를 함유한 완충액 A(25mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50mM KCl, 10mM MgCl₂, 1mM EDTA, 2% 글리세롤)중에서 유리 비이드와 함께 혼합하여 용해시킨다. 용해물을 15,000xg에서 20분 동안 원심분리한 다음, RNase A(400㎍/㎖)로 처리하여 폴리리보솜을 파괴한다. 추출물은 문헌에서 기술한 바와 같이 슈크로스 쿠션을 통해 원심분리시킨다[참조 문헌: Paushkin et al., 1997b]. 리보솜이 일차적으로 슈크로스 분획으로 이동하는데, eRF1, eRF3 및 Upf1p가 모두 리보솜과 연관되어 있기 때문에 이들은 [psi^-]추출물중에서 상기 분획에 존재한다.

정제된 GST-RF 융합 단백질의 제조: GST-RF 융합 복합체를 제조하기 위한 pGEX2T, pGEX2T-SUP35 또는 pGEX2T-SUP45로 형질전환된 균주 BL21(DE3) pLysS의 배양물 400㎖로부터 추출물을 상기한 바와 같이 제조한다. 50% 글루타티온-세파로즈 슬러리 800㎕을 가하고 30분 동안 혼합하면서 항온처리한다. 세파로즈 비이드를 수집하고 NaCl이 500mM로 보충된 TBST를 사용하여 3분 동안 2회 세척하고 500xg에서 3분 동안 원심분리하여 이를 수집한다. 세파로즈 비이드를 RBST로 세척하고 총2시간 동안 수집한다. GST 융합 단백질은 글루타티온 용출 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM 글루타티온) 400㎕중에 세척된 세파로즈 비이드를 재현탁시킴으로써 용출시키고, 혼합하면서 실온에서 10분 동안 항온처리한다. 세파로즈 비이드를 수집하고 상층액을 제거한다. 총 3시간 동안 이전과 같이 용출을 반복하고 용출 분획을 합한다. 단백질의 농도는 브래드포드 검정으로 측정한다.

Upf1p, eRF1 및 eRF3의 면역검출: Upf1p은 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 FLAG 에피토프에 대한 M2 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 검출한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a,b]. eRF3은 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 검출한다[참조 문헌: Didichenko et al., 1991]. eRF1도 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 검출한다[참조 문헌: Stansfield et al., 1992].

ATPase 검정: Upf1p RNA-의존적인 ATPase 활성은, 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 1㎍/㎖의 폴리(U) RNA 및 100㎍/㎖ BSA를 사용하는 목탄 검정에 의해 GST-RF 융합 단백질의 존재하에 Upf1p 20ng을 사용하여 측정한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. 결과는 명시된 단백질의 농도에 대한 유리된³²P의 pmol로서 도시한다.

RNA 결합 검정: 균질하게 표지된 32nt RNA는, 이전에 기술한 바와 같이 SstI으로 분해시킨 pGEM5Zf(+)의 SP6 전사에 의해 합성한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. RNA 결합 완충액은, 모든 반응물에 100㎍/㎖의 BSA가 포함되는 것을 제외하고는 이전에 기술한 바와 같다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995].명시된 양의 GST-eRF3(28)을 Upf1p 200ng과 4℃에서 15분 동안 항온처리한다. RNA 기질 50fmol을 가하고 5분 동안 항온처리한다. 정지 용액을 가하고, 반응물을 4.5%의 천연 PAGE 겔(0.5×TBE, 5% 글리세롤을 함유한 30:0.5의 아크릴아미드:비스아크릴아미드)에서 전기영동한다.

결과

Upf1p는 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3과 상호작용한다: Upf1p은 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3과 상호작용함으로써 해독 종결을 조절한다. eRF1 및 eRF3은 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질로서 이. 콜라이에서 개별적으로 발현시키고, 글루타티온 세파로즈 비이드를 사용하여 정제한다. 글루타티온 세파로즈 비이드와 연관되어 있는 정제된 GST-RF(유리 인자) 융합 단백질을 FLAG 에피토프 태깅된 Upf1p를 함유하는 효모 세포질 추출물에 가한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a,b]. 항온처리 후, GST-RF 및 연관된 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제하고 SDS-PAGE에 적용한다. 면역블롯팅을 수행하고, FLAG 에피토프에 대한 항체를 사용하여 Upf1p의 존재를 검정한다. 항-FLAG 항체는 FLAG-Upf1p을 발현시키는 플라스미드로 형질전환된 세포의 세포질 추출물중에서 109kDa의 Upf1p만을 인지한다(도 1A의 레인 1과 레인 2 비교). 이러한 분석은 또한 Upf1p가 특이적으로 eRF1(도 1A의 레인 5) 또는 eRF3(도 1A의 레인 4)와 함께 정제된다는 것을 입증한다. Upf1p은, 다른 단백질과 융합되지 않은 GST 단백질, 또는 GST에 융합된 단백질과 상호작용하는 Jak2가 반응의 특이성을 모니터하는데사용되는 GST-JIP 단백질과는 함께 정제되지 않는다.

정제된 Upf1p과 eRF1 또는 eRF3와의 상호작용을 또한 모니터한다. 에피토프 태깅된 Upf1p 정제는 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995]. 정제된 FLAG-Upf1p는 증가된 염 농도의 존재하에 GST-RF 융합 단백질과 항온처리하고, 이러한 단백질들의 상호작용은 상기한 바와 같이 모니터한다. 결과는 정제된 FLAG-Upf1p가 eRF1 또는 eRF3(도 1B의 레인 8 내지 12(eRF1) 및 레인 3 내지 7(eRF3)와 상호작용한다는 것을 입증한다. Upf1p-eRF3 복합체는 Upf1p-eRF1 복합체보다 염 농도 증가에 덜 민감하다(도 1B). 정제된 Upf1p가 GST 단백질(도 1B의 레인 2) 또는 GST-JIP와 상호작용하지 않기 때문에 상호작용은 특이적이다. Upf1p와 eRF1 또는 eRF3의 상호작용은 용량-의존적인 것으로 나타난다.

Upf1p는 [PSI⁺] 균주에서 eRF3의 응집체와 연관된다: 생화학적 결과는, Upf1p가 펩티드 유리 인자와 상호작용하여 이의 활성을 향상시킴으로써 넌센스 코돈에서 해독 종결을 향상시킬 수 있음을 입증하고 있다. 최근 결과는 세포질로 유전되는 결정기 [PSI⁺]를 운반하는 균주에서 관찰된 넌센스 억제자 표현형이 효모 eRF3(Sup35p)의 특이적인 또다른 단백질 배위 상태의 결과라는 것을 나타낸다. [PSI⁺] 상태에서, eRF3은, 고분자량의 응집체 또는 아밀로이드 유사 섬유를 형성하여 eRF3 활성을 억제시켜, 리보솜에 의한 해독 종결 코돈의 판독을 증가시킨다[참조 문헌: Wickner, 1994; Paushkin et al., 1997a; Patino et al., 1996; Glover et al., 1997]. 또한 상기한 eRF3의 특이적인 또다른 배위는, 포유동물 프리온과유사한 자체 촉매 메카니즘에 의해 자체적으로 증식할 수 있는 것으로 제안되었다[참조 문헌: Paushkin et al., 1997a; Glover et al., 1997; Wickner, 1994]. 따라서, eRF3의 또다른 단백질 배위 상태와 SUP35 유전자에 돌연변이가 없는 것이 [PSI⁺] 표현형의 자체 증식을 가능하게 한다. 효모 eRF1(Sup45p)는 eRF3과 상호작용하며, 또한 [PSI⁺] 세포에 존재하는 응집체중에서 발견된다[참조 문헌: Paushkin e tal., 1997b]

Upf1p와 eRF1 및 eRF3의 상호작용으로 인해 Upf1p가 [PSI⁺] 세포에서 eRF3 응집체와 연관될 수 있다는 것이 타당하다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, [PSI⁺] 세포에서 발견되는 eRF1 및 eRF3 응집체중에서의 Upf1p의 존재를 모니터한다. 이전의 결과는 [PSI⁺] 세포로부터 제조한 추출물에서 eRF1/eRF3 응집체가 슈크로스 패드를 통해 침전된다는 것을 입증하였다. 동종 유전자형 [psi^-] 및 [PSI⁺] 세포의 세포질 추출물을 제조하고 슈크로스 쿠션을 통해 원심분리하며, 웨스턴 블롯 분석에 의해 상이한 분획중에서 Upf1p, eRF1 및 eRF3의 존재를 모니터한다. 결과는 Upf1p, eRF1 및 eRF3가 [PSI⁺] 세포의 추출물중 펠렛 분획에 존재하지만 [psi^-] 추출물중 펠렛 분획에서는 발견되지 않는 것으로 나타난다(도 2의 레인 3과 6 비교). 이러한 결과는 효모 세포에서 Upf1p이 해독 종결 인자와 상호작용한다는 증거를 제공한다.

eRF3 및 RNA는 Upf1p와의 상호작용에서 경쟁한다: 정제된 FLAG-Upf1p 및 정제된 GST-eRF1 또는 GST-eRF3를 포함하고, GTP 또는 폴리(U) RNA를 포함하는 반응 혼합물을 제조한다. 이를 항온처리한 후, 세파로즈-GST-RF 융합 복합체를 GTP 또는 폴리(U) RNA를 함유하는 동일한 완충액으로 세척한다. 잔류하는 결합된 단백질은 SDS-PAGE에 적용한 다음, FLAG-에피토프에 대한 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행한다. 결과는, Upf1p와 eRF3 사이의 상호작용이 GTP에 의해 영향을 받지않는 다는 것을 입증한다(도 3A, 레인 3과 레인 4 비교). 유사한 실험은, ATP가 Upf1p와 eRF3 사이의 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다(도 3A, 레인 3과 5 비교). 폴리(U) RNA가 Upf1p-eRF1 상호작용에 영향을 미치지 않더라도(도 3B), Upf1p-eRF3 상호작용은 폴리(U) RNA를 포함하는 반응물에서 극적으로 감소된다(도 3A, 레인 3과 6 비교).

상기한 결과는 Upf1p에 대한 RNA 및 eRF3 결합이 경쟁적임을 나타낸다. RNA를 갖는 복합체에 대한 Upf1p의 결합 능력에 미치는 eRF3의 효과를 모니터한다. Upf1p 및 RNA를 함유하고 eRF3가 결여되어 있거나 이를 증가된 농도로 함유하는 반응 혼합물을 제조하고, Upf1p:RNA 복합체의 형성을 RNA 겔 이동 검정에 의해 모니터한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a; Weng et al., 1998]. Upf1p-RNA 복합체가 eRF3의 부재하에 형성되더라도(도 3C의 레인 2), 반응 혼합물중에서 eRF3의 농도가 증가되면 형성되는 Upf1p-RNA의 양이 감소된다(도 3C의 레인 4 내지 8). GST 단백질이 Upf1-RNA 복합체 형성에 영향을 미치지 않기 때문에(도 3C의 레인 9), 억제는 eRF3에 대해 특이적이다. eRF3-RNA 복합체는 형성되지 않는데(도 3C의 레인 3), 이는 관찰된 복합체가 Upf1p에 대한 결합에 기인한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과 모두는 RNA 및 eRF3이 Upf1p에 경쟁적으로 결합한다는 것을 제시한다.

또한, 폴리(U) RNA와 함께 정제된 Flag-Upf1p를 ATP의 존재 또는 부재하에 항온처리한다. 항온처리 후, GST-eRF3을 반응 혼합물에 가하고, Upf1-eRF3 상호작용을 이전과 같이 면역블롯팅 분석으로 모니터한다. 결과는 폴리(U) 및 ATP 모두가 반응 혼합물에 존재하는 경우, Upf1p는 폴리(U) RNA가 결핍된 반응물에서와 동일한 친화성으로 eRF3와 상호작용한다는 것을 입증한다(도 4A의 레인 6, 8 및 10). 대조 실험은 ATP가 Upf1p와 eRF3의 결합을 방해하지 않으며(도 4A의 레인 4), 폴리(U) RNA가 상호작용을 완전하게 억제한다는 것을 입증한다(도 4A의 레인 5, 7 및 9). 이러한 결과는 Upf1p에 대한 ATP 결합이 경쟁 RNA의 결합을 방해함으로써 Upf1p와 eRF3와의 상호작용을 기능적으로 향상시킨다는 개념과 일치한다.

Upf1p의 K436A형은 해독 종결 유리 인자와의 변화된 상호작용을 나타낸다: 다음으로, mRNA 교체 및 해독 종결 활성을 불활성화시키는 UPF1 유전자의 돌연변이가 해독 종결 유리 인자와 상호작용하는 Upf1p의 능력에 영향을 미치는지를 측정하였다. 이전 결과에서는 Upf1p의 436위치에서 보존된 라이신 잔기(K436)에 돌연변이를 갖는 균주는 넌센스 함유 mRNA 및 넌센스 억제 표현형을 안정화시키는 것으로 나타났다[참조 문헌: Weng et al., 1996a]. Upf1p의 정제된 K436A형을 사용하면[참조 문헌: Weng et al., 1996a, 1998], 이러한 돌연변이가 eRF1과 상호작용하는 Upf1p의 능력에 영향을 미치는지가 의심되었다. Upf1p의 K436A형, GST-eRF1 및 다양한 농도의 KCl을 함유하는 반응 혼합물을 제조하고 이들의 상호작용을 상기한 바와 같이 모니터한다. 결과는 K436A 돌연변이로 인해 Upf1_K436A와 eRF1과의 상호작용이 야생형 Upf1과 eRF1과의 상호작용보다 4 내지 6배 이상 극적으로 감소된다는 것을 입증한다(도 4B의 레인 3 및 4와 레인 7 및 8 비교).

eRF3과 상호작용하는 K436A Upf1p의 능력을 모니터한다. K436A Upf1p 및 GST-eRF3을 함유하는 반응 혼합물을 제조하고, Upf1p-eRF3의 상호작용을 상기한 바와 같이 모니터한다. 결과는, Upf1p의 돌연변이형이 야생형 Upf1p와 동등한 친화성으로 eRF3과 상호작용할 수 있음을 입증한다(도 4C의 레인 3).

K436A 돌연변이는, ATP가 반응 혼합물에 존재하는 경우에 RNA보다 eRF3와 우선적으로 상호작용하도록 Upf1p의 능력에 영향을 미친다. K436A 돌연변이는 ATP의 경우에 Upf1p의 친화성을 감소시키는 것으로 나타난다[참조 문헌: Weng et al., 1996a, 1998). 그러나, Upf1p의 K436A형이 여전히 RNA에 결합할 수 있더라도, 야생형 Upf1p와 달리, ATP가 RNA:Upf1p_K436A복합체를 분리시킬 수 없다[참조 문헌: Weng et al., 1996a,1998]. 따라서, ATP 및 RNA의 존재하에 eRF3와 상호작용하는 Upf1p_K436A의 능력을 모니터한다. 돌연변이 Upf1p와 ATP 또는 폴리(U) RNA, 또는 ATP 및 폴리(U) RNA를 포함하는 반응 혼합물을 제조하고, eRF3와 Upf1p의 상호작용을 상기한 바와 같이 모니터한다. 결과는, 야생형 Upf1p와 유사하게, 폴리(U) RNA가 Upf1p_K436과 eRF3와의 상호작용을 방해한다는 것을 입증한다(도 4C의 레인 4).그러나, 야생형 Upf1p와 달리, ATP는 폴리(U) RNA의 존재하에 Upf1p_K436A와 eRF3와의 상호작용을 회복시킬 수 없다(도 4C의 레인 5). 이러한 결과는 ATP가 반응물에 존재하는 경우, Upf1p_K436A가 Upf1p-RNA 복합체보다 Upf1p-eRF3 복합체에 호의적이지 못하다는 것을 나타낸다. 이러한 모든 결과는, 이상 mRNA를 더이상 분해시키지 않고 넌센스 억제 표형형을 나타내는 K436A upf1 대립유전자를 갖는 균주가 해독 종결 유리 인자와 변화된 상호작용을 나타낸다는 것을 제시한다. 시험관내 반응에서 관찰되는 변화된 Upf1p_K436A:eRF 상호작용은 상기한 돌연변이 upf1 대립유전자의 생체내 mRNA 소멸 및 넌센스 억제 표현형과 상호 관련되어 있다.

eRF1 및 eRF3은 Upf1p ATPase 활성을 억제한다: 유전학적 및 생화학적 데이타는, ATPase/헬리카제 활성이 해독 종결을 향상시키는데는 필요하지 않지만 넌센스 함유 전사체를 분해시키는데는 필요하다는 것을 나타낸다[참조 문헌: Weng et al., 1996a,b; Weng et al., 1997]. 이러한 결과를 근거로 하여, Upf1p와 eRF와의 상호작용이 Upf1p의 ATPase/헬리카제 활성을 억제시켜 Upf1p가 해독 종결을 향샹시키는 것으로 추측된다. 따라서, Upf1p와 eRF1 또는 eR3와의 상호작용은, 이들이 Upf1p의 RNA-의존적인 ATPase 활성에 영향을 미치는지에 대해 조사한다. 방사능 표지된 γ³²P-ATP 및 1) Upf1p, 2) Upf1p 및 RNA, 3) Upf1p, RNA 및 GST, 4) Upf1p, RNA 및 GST-eRF1 또는 5) Upf1p, RNA 및 GST-eRF3을 포함하는 반응 혼합물을 제조한다. 상기한 반응물에서 ATPase의 활성을 상기한 바와 같은 목탄 검정을 사용하여 모니터한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a; Weng etal., 1996b]. 결과는, Upf1p만을 함유한 반응물은 검출가능한 ATPase 활성을 갖지 않지만 Upf1p 및 폴리(U) RNA를 함유한 반응물은 최대의 ATPase 활성을 나타낸다는 것을 입증한다. eRF1 또는 eRF3를 가하면, 용량 의존적인 방식으로 Upf1p의 RNA 의존적인 ATPase 활성이 억제된다(도 5, GST-eRF1 및 GST-eRF3). 반응 혼합물에 GST 단백질을 가하는 것은 Upf1p의 RNA-의존적인 ATPase 활성에 아무런 영향을 미치지 못한다(도 5, GST). eRF1 또는 eRF3은 어느쪽도 고유의 ATPase 활성을 갖고 있지 않거나 RNA가 결핍된 반응물에서 Upf1p의 ATPase 활성을 자극하지 못한다. eRF1에 의한 Upf1p의 ATPase 활성 억제는 단순히 이의 RNA 결합 활성을 억제한 결과는 아닌데, 왜냐하면 eRF1이 Upf1p의 상기한 기능을 억제하지 못하기 때문이다. 이러한 모든 결과는 Upf1p의 ATPase 활성이 해독 종결 인자와 이의 상호작용에 의해 조절될 수 있다는 것을 입증한다.

효모/사람 UPF1 대립유전자는 해독 종결을 조절하는 작용을 한다: rent1 또는 hupf1이라고 불리는 효모 Upf1p의 사람 상동체가 또한 해독 종결 및 mRNA 교체를 조절하는지를 측정하여, 진화를 통해 상기한 단백질의 역할이 보존된다는 것을 제시하였다. 효모 세포에서 rent1/hupf1[참조 문헌: Perlick et al., 1996]이 모니터되었다. 따라서, 효모/사람 UPF1 하이브리드 유전자 발현이 upf1△ 균주의 넌센스 억제를 방해하고 이상 전사체의 소멸을 촉진하는지에 대한 의문이 생겼다. 사람 및 효모 Upf1p의 아미노 및 카복시 말단은 서로 상이하지만, rent1/hupf1은 둘다 시스테인/히스티딘이 풍부한 영역과 효모 UPF1 유전자에서 발견되는 헬리카제 모티프를 포함하며, 상기한 영역에 대해 서로 60%의 동일성 및 90%의 유사성을 나타낸다[참조 문헌: Perlick et al., 1996; Applequist et al., 1997]. 이러한 실험에 사용되는 하이브리드 작제물은 효모 UPF1 유전자의 N 및 C 말단 사이에 개재시킨 사람 단백질의 보존된 도메인으로 구성된다[참조 문헌: Perlick et al., 1996]. 이러한 하이브리드 유전자는 프레임이동 알로억제(allosuppression) 검정에서 upf1△ 균주를 보충하는 것으로 이전에 밝혀졌다[참조 문헌: Perlick et al., 1996]. 하이브리드 유전자의 발현이 넌센스 돌연변이 억제를 방해하는 기능을 하는지에 대해 먼저 의심을 품었다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, leu2-2 및 tyr7-1 넌센스 대립유전자를 갖는 upf1△ 균주를, 1) 벡터만, 2) 야생형 효모 UPF1 유전자 또는 3) 동원체내에 삽입된 MET25 프로모터로부터 발현되는 효모/사람 하이브리드 유전자(YCpRENT1CHI4-2)를 갖는 플리스미드 또는 복제수가 많은 플라스미드(YEpRENT1CHI4-2)로 형질전환시킨다. 배지로부터 메티오닌을 제거하여 하이브리드 유전자의 발현이 증가시킨다[참조 문헌: Perlick et al., 1996]. leu2-2 및 tyr7-1 넌센스 대립유전자의 억제는, 세포를 -trp-met-leu-tyr 배지에 플레이팅하여 모니터한다. 대조로서, 상기한 세포를 -trp-met 배지에 플레이팅한다. 결과는 벡터를 갖는 upf1△ 세포가 양쪽 유형의 배지에서 성장한다는 것을 입증하는데(도 6A), 이는 상기한 넌센스 대립유전자가 억제됨을 나타낸다. 효모 UPF1 유전자를 갖는 세포는 -trp-met-leu-tyr 배지에서 성장할 수 없으며, 이는 효모 UPF1 유전자의 존재가 상기한 넌센스 대립유전자의 억제를 방해한다는 것을 입증한다(도 6A). 유사하게, 하이브리드 효모/사람 UPF1 유전자의 발현은 -trp-met-leu-tyr 배지상에서 상기한 세포가 성장하는 것을 방해하며, 이로써 효모 Upf1p를대체하는 상기한 단백질의 leu2-2 및 tyr7-1 대립유전자의 억제 방해 능력이 입증된다(도 6A). 하이브리드 유전자는 다수복사체의 플라스미드로부터 발현되는 경우, 보다 우수하게 기능한다(도 6A). 키메라 단백질의 발현은 정상 세포 성장에는 영향을 미치지 못하는데, 왜냐하면 이러한 플라스미드를 갖는 세포뿐만 아니라 야생형 세포도 -trp-met 배지상에서 성장하기 때문이다(도 6A).

효모/사람 UPF1 유전자는 효모 세포에서 넌센스 함유 전사체의 소멸을 촉진시킨다. 이를 시험하기 위해, tyr7-1 및 leu2-2 넌센스 함유 전사체 양을 벡터 플라스미드, 효모 UPF1 유전자, 또는 다수복사체의 플라스미드내에 사람/효모 UPF1 대립유전자를 갖는 upf1△ 균주에서 측정한다. 상기한 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, tyr7 및 leu2 전사체의 양은 TYR7 및 LEU2 유전자를 암호화하는 방사능표지된 DNA 프로브로 블롯을 프로빙하는 RNA 블롯팅 분석으로 분석한다[참조 문헌: Weng et al., 1996a; Weng et al., 1996b]. 결과는, leu2-2 및 tyr7-1 mRNA가 UPF1⁺세포에서는 소량이지만 upf1△ 균주 및 효모/사람 하이브리드 대립유전자를 포함하는 upf1△에서는 풍부하다는 것을 입증한다(도 6B). 유사하게, NMD에 대한 내인성 기질인 CYH2 전구체[참조 문헌: He et al., 1993]는 효모/사람 하이브리드 대립유전자를 발현시키는 세포에서는 풍부하지만, CYH2 mRNA 농도는 3개의 균주 모두에서 유사하다(도 6B). 이러한 모든 결과는 효모/사람 UPF1 하이브리드 유전자 산물이 효모 세포에서 해독 종결에 대해서는 기능하지만 NMD 경로를 활성화시키지는 않는다는 겻을 나타낸다.

사람 Upf1p는 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3와 상호작용한다: 상기한 결과는 UPF1 유전자의 사람 상동체가 또한 펩티드 유리 인자의 해독 종결 활성을 조절하는 기능을 한다는 것을 입증한다. 따라서, 완전한 길이의 rent1/hupf1이 eRF1 및 eRF3과 상호작용하는지에 의심을 품었다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, 방사능표지된 rent1/hupf1 단백질을 시험관내 전사/해독 시스템과 커플링시켜 합성하한다. rent1/hupf1의 시험관내 합성으로 대략 130kDa의 밴드가 생성되었고(도 7의 레인 1), 이는 rent1/hupf1의 보고된 크기와 일치한다[참조 문헌:Applequist et al., 1997]. 또한 이전에 기술된 바와 같이 루시퍼라제 단백질을 합성하고 이를 상호작용 특이성에 대한 대조 단백질로서 사용한다. 루시퍼라제 단백질 합성으로 68kD의 단백질이 생성되었다(도 7의 레인 5). rent1/hupf1 또는 루시퍼라제 단백질은 상기한 바와 같이 GST, GST-eRF1 또는 GST-eRF3와 함께 항온처리하고, 이러한 단백질과 rent1/hupf1 또는 루시퍼라제의 상호작용은 SDS-PAGE를 실시한 다음, 방사능사진으로 모니터한다. 결과는 rent1/hupf1이 GST-eRF1 또는 GST-eRF3와 상호작용한다는 것을 입증한다(도 7의 레인 3 및 4). rent1/hupf1이 GST 단백질과 복합체를 형성하지 않기 때문에 상호작용은 특이적이다(도 7의 레인 2). 또한, 시험관내 합성된 루시퍼라제 단백질은 GST, GST-eRF1 또는 GST-eRF3와 상호작용하지 않는다(도 7의 레인 6 내지 8). 또한, 폴리(U) RNA는 hupf1/rent1과 eRF3과의 상호작용을 방해한다. 이러한 모든 결과는 rent1/hupf1이 또한 감시 복합체중 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3, 및 Upf1p와 상호작용하여 해독 종결을 조절한다는 것을 나타낸다.

논의

상기한 결과들은, Upf1p가 넌센스 코돈에서 해독 종결을 향상시키고 넌센스 함유 전사체의 소멸을 촉진시키는데 수반되는 다기능성 단백질이라는 것을 나타낸다[참조 문헌: Weng et al., 1996a,b; Weng et al., 1998]. 본원에서 제시한 결과로, 해독 종결을 향상시키는데 Upf1p가 기능하는 방법을 해명하는데 착수하였다. Upf1p의 효모 및 사람형은 펩티드 유리 인자 eRF1 및 eRF3과 상호작용하여 이의 활성을 조절함으로써 해독 종결에 영향을 미치는 것으로 입증되었다(도 1). 상기한 결과는 Upf1p가 또한 펩티드 유리 인자 응집체의 일부 또는 [PSI⁺] 효모 세포에서 관찰되는 섬유로서 관찰된다는 것을 증명하고 Upf1p의 돌연변이형이 유리 인자와 변화된 상호작용을 갖는다는 것을 증명함으로써 구체화되었다.

Upf1p와 펩티드 유리 인자와의 상호작용은, Upf1p가 상기한 인자들의 활성을 향상시킨다는 것을 제안한다: Upf1p가 [PSI⁺] 세포에서 발견되는 eRF3 응집체와 또한 연관되어 있다는 발견은, 상기한 단백질이 생체내에서 해독 종결 유리 인자와 상호작용한다는 것과 일치한다(도 2). 이러한 결과는, 해독 종결을 향상시키기 위해 세포에 의해 정상적으로 이용되는 Upf1p의 일부가 효모 [PSI⁺] 세포중에서 세포성 풀로부터 고갈되어 있다는 것을 제시한다. 현재, NMD상에서 Upf1p의 상기한 부분을 제거한 효과는 공지되어 있지 않다. 본원에서 제시한 결과로, [PSI⁺] 복합체의 성분으로서 Upf1p가 응집체 형성 및 유지에 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었다.

리보솜의 A 부위가 종결 코돈에 의해 점유되는 경우, 종결을 촉진시키는 eRF1 및 eRF3의 정확한 메카니즘 방법은 완전하게 해명되지 않았다[참조 문헌; Buckingham et al., 1997]. 한가지 제안은 eRF1이 tRNA와 구조적인 모사체일 수 있지만 eRF3는 EF-1α의 기능적인 모사체일 수 있다는 것이다[참조 문헌: Didichenko et al., 1991]. 리보솜 A 부위에서 이러한 두가지 단백질의 상호작용은 P 부위에서 tRNA와 연관된 펩티드의 절단을 촉진시킨다[참조 문헌: Zhouravleva et al., 1995]. 유리 인자와 Upf1p의 상호작용이 해독 종결 효율을 향상시키는 것으로 예측되는 해독 과정에서의 몇개의 단계가 있다. 여기에는, 1) eRF가 인접한 동종 tRNA와 경쟁하고 리보솜과 생산적으로 상호작용하여 해독 종결 효율을 증가시키고, 2) eRF의 펩티드 가수분해 효율을 증가시키거나, 또는 3) eRF의 재활용을 증가시켜 해독 종결을 촉진할 수 있는 인자들의 거대한 자유 풀을 형성시킴을 포함한다.

해독 종결을 향상시키는데 있어 Upf1p의 역할은 진화를 통해 보존될 수 있다: 효모 UPF1 유전자의 사람 상동체가 최근에 분리되었다[참조 문헌: Perlick et al., 1996; Applequist et al., 1996]. 사람 유전자가 효모 UPF1 유전자에는 존재하지 않는 아미노 및 카복시 말단 도메인을 포함하더라도, 사람 유전자는 효모 상동체에서 발견되는 시스테인-히스티딘이 풍부한 영역과 헬리카제 모티프를 포함한다[참조 문헌: Perlick et al., 1996; Applequist et al., 1997]. 또한 UPF1 유전자의 효모/사람 하이브리드 발현은, upf1△ 균주에서 발현되는 경우 프레임이동 억제 검정에서 기능한다[참조 문헌: Perlick et al., 1996]. 본원에서 제시된 결과는, Upf1p와 유사하게, 효모/사람 UPF1 대립유전자의 발현이 넌센스 함유 leu2-2 및 tyr7-1 대립유전자를 갖는 upf1△ 균주에서 관찰되는 넌센스 억제 표현형을 방해한다는 것을 입증한다(도 6). 효모/사람 하이브리드가 효모 Upf1p의 해독 종결 표현형을 보충할 수 있더라도, 넌센스 함유 mRNA의 신속한 소멸을 촉진시키지는 못한다(도 6). 또한, 해독 종결에서의 이의 역할과 일치하여, 사람 rent1/hupf1 단백질은 또한 해독 종결 인자 eRF1 및 eRF3와 상호작용한다(도 6). 이러한 결과뿐만 아니라 효모 Upf1p 및 rent1/hupf1 둘다가 세포질에 주로 국소화[참조 문헌: Jacobson and Peltz, 1996; Applequist et al., 1996]된다는 것은, 해독 종결을 조절하는 이러한 단백질의 역할과 일치한다. 이러한 모든 결과는 해독 종결에서의 Upf1p의 역할이 진화를 통해 거의 보존되어 있다는 것을 제시한다.

유리 인자와의 상호작용은 Upf1p의 생화학적 활성을 조절한다: 결과는 유리 인자와 Upf1p의 상호작용이 이의 ATPase 활성을 억제하고 Upf1p가 RNA에 결합하는 것을 방해한다는 것을 입증한다(도 3 및 5). 이러한 결과는, Upf1p ATPase/헬리카제 및 RNA 결합 활성이 NMD를 촉진시키는데는 요구되지만 이의 해독 종결 활성에는 불필요한 것임을 입증하는 이전의 생화학적 및 유전학적 결과와 일치한다[참조 문헌: Weng et al., 1996a,b; Weng et al., 1998]. RNA 및 eRF3은 Upf1p에 경쟁적으로 결합하는 것으로 나타난다(도 3). 이러한 결과는, RNA에 대한 Upf1p의 친화성을 감소시키는 인자가 결과적으로는 유리 인자에 대한 결합에는 호의적이라는 것을 제시한다. Upf1p에 대한 ATP의 결합이 RNA에 대한 Upf1p의 친화성을 감소시킨다는것은 이전에 입증되었다[참조 문헌: Weng et al., 1996a, 1998]. 결과는, ATP에 의해 Upf1p가 RNA보다 eRF3와 상호작용하도록 유발된다는 것을 입증한다(도 4C 및 도 8A). 이러한 결과를 기초로하면, ATP는 Upf1p의 NMD 활성과 해독 종결을 전환시킬 수 있는 Upf1p의 보조인자이다. Upf1p의 유전학적 및 생화학적 분석 결과는 이러한 가설과 일치한다[참조 문헌: Weng et al., 1996a, b, 1998]. 예를 들어 ATPase 활성이 결핍되어 있으나 여전히 ATP와 결합하는 Upf1p의 돌연변이형은 여전히 해독 종결을 방해하는 기능을 한다[참조 문헌: Weng et al., 1996a, 1998]. 중요한 것은, Upf1p의 이러한 돌연변이형에 ATP가 결합하여 이의 RNA 결합 친화성을 여전히 조절한다는 것이다[참조 문헌: Weng et al., 1998]. 또한, RNA 결합 활성이 ATP에 의해 조절되지 않는 돌연변이 Upf1p_K436A는 넌센스 코돈에서 해독 종결을 향상시키는 기능을 하지 않는다[참조 문헌: Weng et al., 1996a; Weng et al., 1998]. 이러한 Upf1p_K436A는 또한 eRF1과의 상호작용은 극적으로 감소되지만(도 4B), RNA 및 ATP의 존재하에서 eRF3와 상호작용하지는 않는다(도 4C).

상기한 모델을 기초로하면, 종결 반응은 감시 복합체 어셈블리에 있어 중요하며 해독 종결 및 넌센스 함유 전사체의 분해를 향상시킨다. 해독 종결은 또한 야생형 전사체의 안정성 또는 전사 효율을 조절하는데 있어 중요한 반응일 수 있다. 다수 전사체의 3' 비해독 영역은 해독 효율 및/또는 각 mRNA의 안정성을 조절하는 조절 요소를 암호화한다[참조 문헌: Ross, 1995; Jacobson and Peltz, 1996; Jacobson, 1996; Caponigro et al., 1995; Wickens et al., 1997]. 종결 반응이또한, 3'-UTR에 있는 요소와 후속적으로 상호작용하여 이의 안정성 및/또는 해독 효율을 조절하는 복합체의 어셈블리에 있어 신호인 것으로 인지된다. 흥미롭게도, 단백질 포스파타제 2A(PP2A)의 한 소단위가 해독 종결 인자 eRF1이다[참조 문헌: Andjelkovic et al., 1996]. eRF1의 한가지 역할이 종결 반응에서 PP2A 포스파타제를 리보솜으로 이동시키는 것이라는 가능성이 있다. PP2A는 적절한 위치로 이동되어 해독 효율 또는 소정의 전사체의 안정성을 조절하는 인자의 활성을 조절할 수 있다. 흥미롭게도, 이러한 시나리오는 파악되는 NMD 경로 기능 방법과 매우 유사하다. 야생형 및 NMD 모두에 대한 기본 전제는, 종결이 리보솜을 정지시키는 속도 제한 반응이고 복합체의 어셈블리에 신호를 보내어 소정의 전사체의 수명에 대한 후속적인 반응을 조절한다는 것이다. 흥미롭게도, 해독에서 PP2A의 역할이 조사되지 않았더라도, 포스파타제를 암호화하는 SAL6 유전자의 돌연변이로 넌센스 돌연변이 억제가 촉진되는 것으로 나타난다[참조 문헌: Vincent et al., 1994]. 명백하게, 이러한 가정을 시험하는데는 추가 시험이 필요하다.

실시예 2

Upf3 단백질은 해독 및 mRNA 교체를 모니터하고 바이러스 유지에 영향을 미치는 감시 복합체의 성분이다

넌센스-매개된 mRNA 소멸(NMD) 경로는 미성숙 해독 종결 코돈을 포함하는 이상 mRNA를 분해하는 기능을 한다. 사카로마이세스 세레비지애에서, Upf1, Upf2 및 Upf3 단백질은 상기한 경로에 수반되는 트랜스-작용 인자인 것으로 확인되었다.최근 결과는, Upf 단백질이 해독 과정의 몇몇 양상의 충실도를 유지시키는데 또한 수반될 수 있다는 것을 입증한다. UPF1 유전자에서 특정 돌연변이는 넌센스 코돈에서의 해독 종결 효율 및/또는 유전자 발현을 조절하기 위해 바이러스에 의해 사용되는, 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 과정에 영향을 미치는 것으로 나타난다. 프로그램된 프레임이동 효율을 변화시키면 바이러스 어셈블리에 영향을 끼쳐서 바이러스 역가가 감소되거나 바이러스가 제거된다. 여기서, Upf3 단백질이 프로그램된 -1 프레임이동 효율을 조절하는 기능을 하는 것으로 입증되었다. upf3△ 균주는 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율을 증가시켜 M₁바이러스를 유지하기 위한 능력이 손실되는 것으로 입증되었다. 또한, upf3△ 균주는 야생형 세포보다 항생제 파로모마이신에 더욱 민감하고, 이러한 약물의 존재하에 upf3△ 균주에서 프레임이동 효율이 증가된다. 또한, Upf3p는 Upf1p 및 Upf1p에 대해 상위이다. 상기한 관찰과 UPF1 유전자의 mof4-1 대립유전자가 또한 NMD 및 프로그램된 -1 프레임이동 효율에 영향을 미친다는 요인을 기초로 하여, Upfp 단백질이 해독 충실도 및 mRNA 교체를 모니터하는 기능을 하는 감시 복합체의 일부라는 것이 입증된다.

재료 및 방법

재료, 균주, 플라스미드, 배지 및 일반적인 방법: 제한효소는 베링거 만하임(Boehringer Mannheim), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 및 BRL로부터 입수한다. 방사능 뉴클레오타이드는 NEN 또는 애머샴(Amersham)으로부터 입수한다. 본 연구에 사용되는 동종 효모 균주는 표 1에 열거하였다. 이. 콜라이 DH5α를 사용하여 플라스미드 DNA를 증폭시킨다. 플라스미드 pF8 및 pT125는 이전에 기술되었고[참조 문헌: Dinman, J.D. Icho, T., and Wickner, R.B.(1991)], 도 7에 나타내었다. YCplac33중에 mof4-1 대립유전자를 포함하는 플라스미드 pmof4BE는 이전에 기술되었다[참조 문헌: Cui, Y, K.W. Hagan, S. Zhang, and Peltz S.W. (1995)]. 효모 배지는 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 제조한다[참조 문헌: Rose, M.D., Winston, F. and Hieter, P. (1990)]. 효모는 리튬 아세테이트 방법을 사용하여 형질전환시킨다[참조 문헌: Schiestl, R.H., and Gietz, R.D.(1989)]. L-A 및 M₁을 rho-o 균주로 세포유도(cytoduction)시키는 것은 세포유도 공여체로서 균주 3164 및 3165[참조 문헌: Dinman, J.D.., and Wickner, R.B. (1994); Dinman, J.D.., and Wickner, R.B. (1992)]를 사용하여 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다[참조 문헌: Dinman, J.D.., and Wickner, R.B. (1992)]. β-갈락토시다제(β-gal) 검정은 표준 프로토콜에 따라 수행한다[참조 문헌: Guarente, L. (1983)].

UPF3 클로닝: UPF3 유전자를 클로닝하는데 사용되는 전략은 UPF2를 클로닝하는데 사용되는 것과 동일하다[참조 문헌: Cui, Y, K.W. Hagan, S. Zhang, and Peltz, S.W. (1995). 후속적인 서브클로닝은, 2.1kb Asp718-BglII 단편이 upf3 돌연변이를 보충하는데 충분하며, 이러한 클론의 후속적인 분석으로 이전에 보고된 UPF3 서열과 이것이 일치한다는 것을 나타낸다[참조 문헌: Lee, B.S., andCulbertson, M.R. (1995)].

킬러 검정, 프레임이동 검정, 및 전체 핵산 추출 및 분석: 킬러 검정은 5x47 킬러 지시자 세포의 론(플레이트 당 ㎖당 550nm에서의 광학 밀도가 1단위인 현탁액 0.5㎖)으로 새로이 씨딩된 4.7MB 플레이트상에 콜로니를 리플리카 플레이팅시킴으로써 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다[참조 문헌: Dinman, J.D., and Wickner, R.B.(1992)]. 20℃에서 2일 후, 킬러 활성은 킬러 콜로니 주변의 성장 억제 영역으로서 관찰된다. 킬러 활성 소실을 정량화하기 위해, 킬러⁺로 확인된 콜로니를 단일 콜로니를 수득하기 위해 재도말하고 킬러 콜로니의 %를 측정한다. -1 프레임이동 효율은 문헌에서와 같이 0-프레임 대조(pTI25) 및 -1 리포터(pF8) 플라스미드를 사용하여 측정한다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996); Dinman, J.D., Ruiz-Echevarria, M.J., Czaplinski, K. and Peltz, S.W.(1996b)].

전체 핵산(TNA)을 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 세포로부터 추출한다[참조 문헌: Dinman, J.D. and Wickner, R.B (1994); Dinman, J.D. and Wickner, R.B (1992)]. TNA의 동일한 양을 0.1% 아가로스 겔을 통해 분리시키고, 에티듐 브로마이드를 사용하여 가시화한다. TNA를 50% 포름아미드, 9.25% 포름알데히드, 1xTAE에서 45℃에서 30분 동안 겔중에서 변성시키고, 겔을 물로 세척하고, 핵산을 니트로셀룰로스로 이전시킨다. mRNA 추출은 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996)]. L-A 및M₁(+) 쇄 RNA의 양은 상기한 바와 같이 모니터한다(28). lacZ -1 프레임이동 리포터 mRNA 및 U3 snRNA의 RNA 양은 본질적으로 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 리보뉴클레아제 보호 검정에 의해 측정한다[참조 문헌: Sambrook].

방사능 프로브 제조: 리보뉴클레아제 보호 검정을 위해, RNA 프로브는 [α-³²P]UTP로 표지한다. lacZ mRNA 양을 모니터하기 위해, LacZ 유전자를 포함하는 플라스미드로부터 유도된 pGEM을 HincII로 분해하고 RNA 폴리머라제 T7을 사용하여 시험관내에서 전사시키다. U3 전사체의 양을 모니터하기 위해, pGEM-유도된 플라스미드인 pGEM-U3을 SspI으로 절단하고 RNA 폴리머라제 T3을 사용하여 시험관내에서 전사시킨다. L-A 및 M₁(+) 쇄 RNA 프로브는 [α-³²P]CTP 표지된 T3 RNA 폴리머라제 런오프(runoff) 전사체(28)를 사용하여 상기한 바와 같이 제조한다.

결과

upf3△ 균주는 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율을 증가시키는 것으로 입증된다: mof4-1은, 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율을 특이적으로 증가시키고 M₁새틀라이트(Satellite) 바이러스 손실을 촉진시키는 UPF1 유전자의 독특한 대립유전자이다. 그러나, upf1△ 균주는 이러한 표현형을 나타내지는 않는다. Upf2 또는 Upf3 단백질을 포함한 추정 감시 시스템의 다른 인자가 또한 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동에 영향을 미친다. 따라서, UPF 유전자가 결실된 동종 균주를 조사하면 리보솜 프레임이동 효율이 증가되었음이 입증된다.

생체내에서 프로그램된 리보솜 프레임이동 효율을 측정하는 방법은 문헌에 기술되어 있다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996); Dinman, J.D., Icho, T., and Wickner, R.B.(1991); Dinman, J.D., Ruiz-Echevarria, M.J., Czaplinski, K. and Peltz, S.W.(1996b)]. 전사가 효모 PGK1 프로모터로부터 개시되고 PGK1 폴리아데닐화 부위에서 종결되는 lacZ 리포터 플라스미드 시리즈를 사용한다. 해독 개시 코돈 다음에는 다수 클로닝 부위가 있고, 그 다음에는 이. 콜라이 lacZ 유전자가 있다. lacZ가 해독 개시 부위에 대해서 0-프레임이기 때문에 플라스미드 pTI25는 0-프레임 대조로서 작용한다(도 8). 플라스미드 pF8에서, L-A 유도된, 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 시그날은 폴리링커중에 클로닝되어 있고 lacZ 유전자는 해독 개시 부위에 대해 -1 프레임에 위치한다(도 8). 따라서, 상기한 작제물에서, lacZ 유전자는 리보솜이 -1 방향으로 프레임을 이동하는 경우에만 해독될 것이다. +1 프레임이동 리포터 플라스미드인 pJD104(도 8)는 효모의 Ty1 역이동가능한(retrotransposable) 요소로부터 유도된, 프로그램된 +1 리보솜 프레임이동 시그날의 3'에 삽입된 lacZ 유전자를 포함한다. 상기한 작제물에서, lacZ 유전자는 리보솜이 +1 방향으로 프레임을 이동하는 경우에만 해독될 것이다. -1 리보솜 프레임이동 효율은 0-프레임 대조 플라스미드 pTI25를 갖는 세포에서 측정되는 β-gal 활성에 대한, -1 프레임이동 리포터 플라스미드 pF8를 갖는 세포에서 측정되는 β-gal 활성의 비를 측정하고 이에 100%을 곱하여 계산한다. 유사하게, +1 리보솜 프레임이동 효율은 pTI25 β-gal에 대한pJD104의 비를 기초로하여 계산한다. 상기한 시험은 균주의 종이 상이하지 않도록, 상이한 UPF 유전자가 결실된 동종 효모 균준에서 수행한다(표 1).

상기 실험 결과는, β-gal 활성 수준과 이에 따른 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동의 겉보기 효율이 야생형 균주에서 보다 upf1△ 및 upf2△ 균주에서 각각 1.8 및 1.5배로 약간 더 크다는 것을 입증한다(표 2). 하기에서 논의되는 바와 같이, -1 프로그램된 리보솜 프레임이동이 약간 증가하는 것은 M₁바이러스 손실을 촉진시키는데는 충분하지 않다. 반대로, upf3△ 세포에서의 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율은 야생형 세포보다 3.4배가 높은데(표 2), 이는 M₁바이러스 손실을 촉진시키기에 충분하다(하기 참조). 이러한 결과는, mof4-1 균주와 유사하게, upf3△ 균주에서도 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 수준이 증가됨을 입증한다.

^a: -1 리보솜 프레임이동 효율(%)은 0 프레임 대조 플라스미드를 갖는 균주의 β-갈락토시다제 활성에 대해 -1 리보솜 프레임이동 리포터 플라스미드를 갖는동일 균주의 β-갈락토시다제 활성의 비로서 측정한다.

^b: L-AHN 및 M₁은 세포유도에 의해 균주내로 도입하고, M₁dsRNA의 유지(+) 또는 손실(-)은 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같은 킬러 플레이트 검정 및 노던 블롯 분석으로 분석한다.

흥미롭게도, 돌연변이 균주중 어떤것도, β-갈락토시다제 활성 수준에 의해 측정되는 바와 같이, 프로그램된 +1 리보솜 프레임이동의 겉보기 효율이 극적으로 증가되지 않는다. 이러한 모든 결과는, upf3△ 균주가 -1 리보솜 프레임이동을 특이적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다.

프레임이동 리포터 전사체의 양은 upf△ 균주에서 동일하다: 상기한 검정에 사용되는 -1 프레임이동 리포터 전사체는 프레임이동 부위의 짧은 단백질 암호화 영역 5' 다음에, 리포터 단백질을 암호화하며 5' 개방 판독 프레임의 해독 개시 부위를 갖는 프레임외에 있는 서열을 갖는다. 리보솜 프레임이동 효율의 명백한 변화는, 해독 장치가 넌센스 함유 mRNA로서 인지할 수 있는 LacZ -1 프레임이동 리포터 mRNA 양의 변화로 발생될 수 있다. UPF 유전자가 결실되면 -1 프레임이동 리포터 전사체가 안정화될 수 있고, 이에 의해 β-gal 리포터 단백질의 합성이 증가된다. upf3△ 균주가 upf1△ 균주 및 upf2△ 균주보다 상당히 많은 리포터 전사체를 축적하는지를 확인하기 위해, lacZ -1 프레임이동 리포터 mRNA의 양을 RNase 보호 분석으로 측정한다. 로딩 대조로서, U3 snRNA의 양을 측정한다. 하이브리드화 밴드 정량화로, U3 sNRNA를 표준으로 하여 lacZ 프레임이동 리포터 mRNA의 양은 동종 야생형 upf1△, upf2△ 및 upf3△ 균주의 것과 동일한 것으로 나타난다(도 9). 따라서, 이러한 결과는, upf1△ 또는 upf2△ 균주와 비교하는 경우, upf3△에서 관찰되는 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율 증가는 다른 upf△ 균주에서보다 상당히 크게 리포터 전사체를 안정화시킨 결과가 아니라는 것을 나타낸다. -1 LacZ mRNA의 양이 약간 증가한 것으로 upf3△ 균주에서 관찰되는 β-gal 리포터 단백질의 생성이 4배 증가된 것을 설명하지는 못한다. 따라서, upf3△는, mof 표현형이 넌센스 mRNA를 안정화시키는 이의 능력과 상관없이 -1 리보솜 프레임이동 효율을 증가시킨다는 것을 입증한다.

M₁킬러 바이러스는 upf3△ 균주에서 유지되지 않는다: -1 리보솜 프레임이동 효율을 변화시키면 바이러스 입자 어셈블리에 유용한 Gag-pol 단백질에 대한 Gag 단백질의 비를 변화시켜 결과적으로 바이러스 증식을 억제한다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996); Dinman, J.D. and Wickner, R.B. (1994); Dinman, J.D., and Wickner, R.B.(1992); Dinman, J.D., Ruiz-Echevarria, M.J., Czaplinski, K. and Peltz, S.W.(1997b)]. L-A 및 M₁바이러스는 세포유도에 의해 동종 야생형 UPF⁺, upf1△, upf2△ 및 upf3△ 균주에 도입시키고, 이들 세포를 배양하고 킬러 톡신에 민감한 세포 론상에 리플리카 플레이팅시킨다. M₁바이러스를 유지하는 세포는 킬러 톡신을 분비하여 성장 억제 환을 형서하지만, M₁이 손실된세포는 이러한 성장 억제를 나타내지 않는다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996); Dinman, J.D., and Wickner, R.B.(1992); Dinman, J.D., Ruiz-Echevarria, M.J., Czaplinski, K. and Peltz, S.W.(1996b)]. 이러한 검정 결과는, 야생형, upf1△ 및 upf2△ 균주는 킬러 표현형을 유지하지만 upf3△ 균주 균주는 킬러 표현형을 유지하는 능력이 상실되었음을 입증한다(도 10A, 표 2). 이전 결과와 일치하게, mof4-1 대립유전자를 갖는 세포는 또한 킬러 표현형을 유지할 수 없다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996)].

킬러 표현형 결핍이 킬러 톡신 생성을 방해한 것이라기 보다는 바이러스 유지 결핍의 결과인지를 측정하기 위해, UPF⁺, upf1△, upf2△ 및 upf3△ 균주의 각각 1개의 콜로니로부터 전체 핵산을 추출하고, 동일한 양의 핵산을 비변성 아가로스 겔에서 분리시킨다. RNA를 니트로셀룰로스로 이전시키고 [α-³²P]CTP 표지된 L-A 및 M₁(+) 쇄 RNA 특이적 프로브와 하이브리드화한다. 결과는 도 10B에 나타내었다. 킬러 표현형 손실과 일치하여, 18kb M₁dsRNA가 mof4-1 및 upf3△ 세포에서는 존재하지 않지만, upf1 및 upf2 돌연변이 및 야생형 균주에서는 존재한다. 이러한 결과는, UPF3 유전자 결실로 M₁-1 리보솜 프레이이동 효율이 변화되어 새틀라이트 바이러스의 증식을 방해한다는 가설을 지지한다.

upf3△ 균주는 파로모마이신에 대해 증가된 민감성을 나타낸다: 해독 충실도가 감소된 돌연변이를 포함하는 균주는, 효모에서 판독오류 빈도를 증가시키는 것으로 여겨지는 약물인 아미노글리코시드 항생제 파로모마이신에 대해 과민성이다. 이전 결과는, -1 리보솜 프레임이동 효율을 증가시키는 UPF1 유전자의 mof4-1 대립유전자를 갖는 세포가 또한 동종의 야생형 균주보다 파로모마이신에 대해 증가된 민감성을 나타낸다는 것을 입증하였다. upf3△ 균주가 또한 상기한 항생체에 대해 증가된 민감성을 나타내는 지를 조사한다. 파로모마이신 민감성은, 세포 론상에 파로모마이신 1㎎을 함유한 디스크를 두고 디스크 주변의 성장 억제 영역을 측정함으로써 동종 야생형 및 upf3△ 균주에서 모니터한다(도 11). 결과는, mof4-1 균주와 유사하게, upf3△ 균주가 동종성 야생형 균주보다 파로모마이신에 대해 보다 민감하다는 것을 입증한다. upf1△ 및 upf2△ 균주 어느것도 파로모마이신에 대해 과민성을 나타내지 않는다.

-1 리보솜 프레임이동에 대한 파로모마이신의 효과는, 동종성 야생형 및 upf3△ 균주에서 플라스미드 pF8(-1 프레임 리포터 작제물) 또는 pTI25(0 프레임 대조)를 이용하는 β-갈락토시다제 검정에 의해 추가로 검정한다. 세포는 상이한 농도의 약물의 존재하에 액체 배지에서 성장시키고, 본 검정에서 사용되는 다수의 세포에 대해 표준화시켜 β-갈락토시다제 활성을 측정한다. pF8(-1 프레임이동 리포터 작제물)을 포함하는 upf3△ 세포의 β-갈락토시다제 활성은 파로모마이신의 농도가 증가됨에 따라 연속적으로 증가된다. 그러나, pF8을 함유하는 야생형 세포 또는 pTI25(0 프레임 대조 작제물)를 함유하는 어떤 균주에서도 β-갈락토시다제 활성은 영향을 받지 않는다. 이러한 모든 결과는 파로모마이신이, -1 리보솜 프레임이동 효율에 미치는 UPF3 유전자 결실 효과를 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

upf3△ 및 upf3△ mof4-1 균주의 증가된 -1 프로그램된 프레임이동 및 킬러 바이러스 유지 결핍 표현형은 동등하다: 상기한 결과는, upf3△ 균주가 mof4-1 세포에서와 유사한 표현형을 갖는다는 것을 나타낸다. UPF1 유전자 결실이 아니라 UPF1 유전자의 mof4-1 대립유전자가 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 및 M₁유지에 여향을 미치기 때문에, mof4-1p가 Upf3p의 기능을 변화시킬 수 있다고 가정하였다. 따라서, mof4-1 upf3△ 균주는 upf3△ 균주에서와 동일한 프로그램된 -1 프레임이동 및 킬러 표현형을 가져야만 한다. 동종 mof4-1, upf3△ 및 mof4-1 upf3△ 균주에서의 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율 및 바이러스 유지 표현형은 상기한 바와 같이 모니터한다. 이 실험의 결과는 표 3에 요약하였다. mof4-1, upf3△ 및 mof4-1 upf3△ 균주에서 관찰되는 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율은 동등하다. 또한, 상기한 모든 균주는 킬러 표현형이 결핍되어 있다(표 3). 이러한 결과는, UPF1 유전자의 mof4-1 대립유전자가 UpF3P의 활성을 조절함으로써 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동을 변화시킨다는 것을 제시한다.

upf3△ 대립유전자의 프로그램된 프레임이동 및 킬러 표현형은 다른 upf△ 대립유전자로부터 독립적이다: upf1△, upf2△ 및 upf3△ 사이의 상위 관계는, -1 리보솜 프레임이동 효율 및 킬러 유지와 관련하여 측정한다. 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 및 킬러 표현형 모두는 동종 UPF⁺, upf1△upf2△, upf1△upf3△, upf2△upf3△ 및 upf1△upf2△upf3△ 균주에서 상기한 바와 같이 모니터한다. 이들 실험 결과는 표 3에 나타내었다. upf3△을 갖는 모든 균주는 -1 리보솜 프레임이동 효율을 증가시키고, 이는 UFP3 유전자만이 결실된 균주와 동등하며 UPF2 유전자의 UPF1 상태와는 독립적이다(표 3). 역으로, upf1△UPF3⁺, upf2△UPF3⁺및 upf1△upf2△UPF3⁺균주는 킬러 표현형 손실을 촉진시키기에 충분하게 프로그램된 -1 프레임이동 효율이 증가되지 않은 것으로 나타난다(표 2). 이러한 모든 결과는, Upf3p가 Upf1p 및 Upf2p 모두의 상부스트림에서 작용한다는 것을 나타낸다.

논의

Upf 단백질은 mRNA 교체 및 해독 모두를 모니터하는 감시 복합체의 일부이다. NMD 경로는, 해독되는 경우에 정상 세포 기능을 크게 방해할 수 있는 비정상적인 펩티드를 생성할 수 있는 이상 넌센스 함유 전사체를 세포가 자체적으로 제거하도록 진화된 메카니즘의 한 예이다[참조 문헌: Jacobson, A. and Peltz. S.W. 1996); Ruiz-Echevarria, M.J., K. Czaplinski and Peltz, S.W. (1996); Weng, Y., M.J. Ruiz-Echevarria, S. Zhang Y. Cui, K. Czaplinski, J. Dinman, and S.W. Peltz. (1997); He, F., Peltz, S.W., Donahue, J.L., Rosbasch, M. and Jacobson, A. (1993); Pulak, R. and Anderson, P. (1993)]. 흥미롭게도, 넌센스 돌연변이 결과인 몇몇 사람 유전질환의 임상학적 출현 및 중증도는 넌센스 함유 전사체가 안정화되는 조건하에 증가될 수 있다[참조 문헌: Hall, G.W., and Thein, S. (1994); Dietz, H.C., I. McIntosh, L.Y. Sakai, G.G. Corson, S.C. Chalberg, R.E. Pyeritz, and Francomano, C.A. (1993); Dietz, H.C., U. Franke, H. Furthmayr,C.A. Francomano, A. De Paepe, R. Devereux, F. Ramirez, and Pyeritz, R.E.(1995)]. 지금까지 연구된 모든 진핵세포 유기체에 NMD 경로가 유지되고 있으며 상기 과정에 수반되는 인자 하나 이상이 사람 세포에서 보존된다는 사실은[참조 문헌: Perlick, H.A., Medghalchi, S.M., Spencer, F.A., Kendzior, R.J.Jr., and Dietz, H.C.(1996); Applequist, S.E., Selg, M., Roman, C., and Jack, H. (1997)], 비정상적인 mRNA를 제거하는 압력이 진화를 통해 상기한 과정을 유지시키기에 충분하다는 것을 제시한다.

최근 연구 결과는, NMD 경로에 수반되는 인자가 해독 과정의 몇몇 양상을 조절하는데 있어 추가로 작용한다는 것을 나타낸다. Upf1p의 유전학적 연구는, 이것이 NMD와 해독 종결 과정 조절 모두에 작용하는 다기능성 단백질이라는 것을 제시한다[참조 문헌: Weng, Y., K. Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996a); Weng, Y., K. Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996b)]. 보다 최근의 생화학적 증거는, Upf1p가 해독 종결 유리 인자 eRF1 및 eRF3과 상호작용한다는 것을 나타낸다. 해독 종결이 이상하게 발생하는지를 모니터하여 생성되는 비정상적인 mRNA를 분해시키는 NMD 경로의 기능 때문에, 해독 종결을 조절하는데 있어 Upf1p의 기능은 놀랍지는 않다.

UPF1 유전자의 mof4-1 대립유전자는, 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율을 증가시키고, M₁킬러 바이러스를 유지시킬 수 없는 것으로 나타난다[참조 문헌: Cui, Y., Dinman,J.D., and Peltz, S.W. (1996)]. 또한, mof2-1 돌연변이는 프로그램된 -1 리보솜의 증가된 효율을 명백하게 나타낸다[참조 문헌: Cui, Y.,Dinman,J.D.D., Goss Kinzy, T. and Peltz, S.W. (1997)]. mof2-1 돌연변이는, 해독 개시 부위 선택에 있어 중요한 역할을 하는 것이로 이미 기술되어 있는 SUI 유전자[참조 문헌: Cui, Y., Dinman,J.D.D., Goss Kinzy, T. and Peltz, S.W. (1997)]에 대한 대립유전자이다. 흥미롭게도, mof2-1 돌연변이 균주는 또한 넌센스 함유 전사체가 축적되는 것으로 나타난다. 이러한 결과는, NMD에 수반된 인자들을 포함한 감시 복합체가 해독 과정에서 다른 단계를 모니터하는데 또한 수반될 수 있음을 제시한다. 본원에서 제시된 결과는, UpFf3p가 NMD에서의 역할 이외에도, 적절한 해독 판독 프레임을 유지시키는데 수반되는 추정 감시 복합체의 일부이라는 것을 나타낸다. 결과는 또한 -1 리보솜 프레임이동에서 Upf1p의 mof4-1 대립유전자의 효과가, 해독 장치와 Upf3p의 상호작용 조절을 통해 대부분 발생된다는 것을 제시한다.

Upf3p는 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동에 Upfp 복합체를 연결시키는 중요한 인자이다. UPF1, UPF2 또는 UPF3 유전자가 결실된 세포의 프로그램된 리보솜 프레임이동 및 M₁바이러스 유지 측면을 모니터함으로써, upf3△ 균주가 프로그램된 -1 프레임이동 효율 및 바이러스 유지에 영향을 미친다는 것이 입증된다(표 2 및 3). upf3△ 균주에서 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동이 증가된 것은, upf1△ 또는 upf2△ 균주에서 관찰되는 것 보다 상당히 크게 리포터 전사체를 안정화시킨 결과는 아니다(도 9). 이와 일치하여, upf3△ 세포에서 -1 리보솜 프레임이동 효율은, 해독 충실도에 영향을 미치는 것으로 공지된 약물인 파로모마이신의 용량 증가에 상응하여 상승된다. upf1△ 대립유전자가 아니라, UPF1 유전자의 mof4-1 대립유전자가 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 및 킬러 유지에 영향을 미친다는 관찰은, Upf1p가 해독 판독 프레임 유지에 직접 영향을 미치지는 않는다는 것을 제시한다. Upf3p가 프로그램된 프레임이동을 조절하는 Upfp 복합체의 중심 성분이라는 개념은 mof4-1 upf3△ 균주가 mof4-1 균주와 동일한 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 및 킬러 표현형을 갖는다는 관찰로 지지된다(표 2).

본원에서 제시된 결과는, Upf3p가 해독 판독 프레임을 적절하게 유지시키는 기능을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 과정에서 Upf3p의 기능은, upf3△의 프로그램된 -1 프레임이동 및 킬러 유지 표현형이 upf1△ 및 upf2△ 균주에서 관찰되기 때문에, Upf1p 및 Upf2p에 대해 유전적으로 상위인 것으로 나타난다(표 3). 이러한 과정에서의 Upf3p의 정확한 생화학적 기능은 공지되지 않았지만, 본원에서 제시된 결과는, Upfp가 해독 및 mRNA 교체 과정의 상이한 양상에 영향을 미칠 수 있는 별개의 역할을 지닐 수 있다는 것을 입증한다. 중요한 것은, 임상학적, 수의학적 및 농업적으로 중요한 바이러스가 프로그램 프레임이동을 이용하기 때문에, 상기한 결과가 또한 실질적으로 유용할 수 있다는 점이다[참조 문헌: Brierley, I. (1995); Dinman, J.D.D., Ruiz-Echevarria, M.J. and Peltz, S.W.(1997)]. 따라서, 프로그램된 리보솜 프레임이동은 항바이러스제제에 대한 독특한 표적으로 작용하고, 이러한 과정에 수반되는 인자를 확인하고 특성화하는 것은 본 발명의 화합물을 확인하기 위한 검정을 개발하는데 도움을 줄 것이다[참조 문헌: Dinman, J.D.D., Ruiz-Echevarria, M.J. and Peltz, S.W.(1997)].

a: 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동 효율 및 M₁바이러스 유지는 표 2의 기호 설명에 기술되어 있는 바와 같이 측정한다.

상기한 바와 같이, UPF1 유전자에서의 돌연변이는 해독 종결 표현형을 변화시키고 프로그램된 프레임이동을 증가시키며 넌센스 함유 전사체를 안정화시킬 수 있다[참조 문헌: Weng, Y., K. Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996a); Weng, Y., K.Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996b); Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996); Ruiz-Echevarria, M.J., K. Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996); Weng, Y.,M.J. Ruiz-Echevarria, S. Zhang, Y. Cui, K. Czaplinski, J. Dinman, and S.W. Peltz.(1997)]. 따라서, 초기에 상기한 유전자들의 산물이 이상 mRNA를 분해하는데 전적으로 수반된다고 여겨졌더라도, 새로운 양상은 상기한 경로에 수반되는 인자들이 해독(해독 진행 및 종결 포함) 및 mRNA 교체의 몇몇 측면에서 다수의 역할을 한다는 것을 나타낸다[참조 문헌: Weng, Y., K. Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996a); Weng, Y., K. Czaplinski, and Peltz, S.W.(1996b); Cui, Y., Dinman, J.D., and Peltz, S.W. (1996)]. 이는, Upfp 복합체가 "해독 검사점(translational checkpoint)"으로 작용하는 감시 복합체의 일부라는 것을 입증한다. 세포 주기 조절 검사점과 유사하게, UPF 유전자는 필수적이지는 않지만 이들이 수반되는 과정의 높은 충실도를 확보해준다. 이러한 인자들의 부재하에, 해독 및 mRNA 서브셋은 보다 덜 정확하게 진행될 수 있다.

정지된 리보솜은, UpfP 복합체의 어셈블리를 촉진하여 이러한 과정을 후속적으로 감시할 수 있는 중요한 반응이다. 프로그램된 프레임이동 및 해독 종결은 리보솜 정지를 수반한다[참조 문헌: Wolin, S.L. and Walter, P.(1988); Tu, C.,Tzeng, T.-H. and Bruenn, J.A.(1992); Tate, W.P. and Brown, C.M. (1992)]. 결과는, 해독 종결 유리 인자 eRF1 및 eRF3과, A 부위에 종결 코돈을 함유하는 정지된 리보솜과의 상호작용이 Upfp 복합체의 어셈블리를 촉진시키는 것을 돕는다는 것을 보여준다. 결과는 Upfp 복합체와 유리 인자와의 상호작용이 해독 종결을 향상시킨 다음, 넌센스 함유 전사체를 분해시킨다는 것을 나타낸다. 프로그램된 -1 리보솜 프레임이동의 경우, 활주 부위 다음의 RNA 가매듭이 리보솜 정지를 촉진시킨다[참조 문헌: Tu, C.,Tzeng, T.-H. and Bruenn, J.A.(1992); Somogyi, P.,Jenner, A.J., Brierley, I.A and Inglis, S.C.(1993)]. 정지된 리보솜은 또한 감시 복합체의 어셈블리를 개시시킨다. 상기한 복합체, 또는 Upf 단백질의 서브셋은 리보솜이 적절한 해독 판독 프레임을 유지하도록 도울 수 있다. 상기한 인자들의 부재하에, 리보솜은 보다 쉽게 미끄러져 판독 프레임을 변화시키게 된다.

Claims

해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는데 효과적인, 사람 Upf1p 단백질, 펩티드 진핵세포 유리 인자 1(eRF1) 및 펩티드 진핵세포 유리 인자 3(eRF3)을 포함하는 분리된 다단백질 복합체.
제1항에 있어서, 사람 Upf3p 및/또는 Upf2p를 추가로 포함하는 복합체.
제1항의 복합체에 결합하는 항체.
제4항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날인 항체.
제4항에 있어서, 표지를 갖는 항체.
Upf1p의 ATPase, eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성, RNA 결합, eRF1 결합, eRF3 결합, 또는 리보솜에 대한 복합체 또는 이의 인자들의 결합을 억제하는, 제1항 또는 제2항의 복합체에 결합하는 제제.
eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 억제하거나 조절하는 제제.
eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf3p의 결합, 또는 Upf3p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 억제하거나 조절하는 제제.
eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 촉진시키는 제제.
eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf3p의 결합, 또는 Upf3p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 촉진시키는 제제.
리보솜에 대한 사람 Upf1p, eRF1 또는 eRF3의 결합을 조절하는 제제.
제7항에 있어서, 표지 또는 마커를 갖는 제제.
제6항에 있어서, 안티센스 분자 또는 라이보자임인 제제.
해독 종결을 촉진시키는데 유효한 양의 제1항의 복합체를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성을 조절하는 방법.
넌센스 해독 종결을 억제하는데 유효한 양의 제6항의 제제를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성을 조절하는 방법.
제15항에 있어서, 해독 동안의 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성이 해독 개시, 진행, 종결 및 mRNA 분해를 포함하는 방법.
eRF1 또는 eRF3에 대한 사람 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 억제하는데 유효한 양의 제6항의 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 방법.
Upf1p의 ATPase/헬리카제 활성, eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성, 또는리보솜에 대한 RNA의 결합을 억제하는 제6항의 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 이상 전사체의 분해를 촉진시키는 방법.
a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 제1항 또는 제2항의 복합체 조절에대해 검정(이때 제1항의 복합체를 조절하는 약물이 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성에 연루되는 것이다)함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성에 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법.
a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 제1항 또는 제2항의 단백질 복합체 조절에 대해 검정(이때 제1항의 단백질 복합체를 조절하는 약물이 해독 종결을 향상시키는데 연루되는 것이다)함을 포함하여, 해독 종결의 향상에 활성적으로 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법.
a) 약물과 복합체를 항온처리하고, b) 넌센스 억제에 대한 효과를 측정함으로써 해독 종결을 향상시키는데 관여하는 약물을 스크리닝함을 포함하여, 해독 종결을 향상시키는데 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법.
제21항에 있어서, 검정이 RNA 검정 또는 ATPase 검정인 방법.
a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 제1항의 복합체 조절에 대해 검정(이때 eRF1 또는 eRF3에 대한 Upf1p의 결합, 또는 Upf1p에 대한 eRF1 또는 eRF3의 결합을 조절하는 약물이 해독 종결을 향상시키는데 연루되는 것이다)함을 포함하여, Upf1p 및 eRF1 또는 eRF3 사이의 상호작용을 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.
a) 제1항 또는 제2항의 복합체를 암호화하는 핵산 또는 이의 안티센스를 함유하는 벡터를 포함하는 세포를 제공하고, b) 복합체의 기능을 방해하도록 상기 세포에서 벡터를 과발현시켜 과발현된 복합체를 생성시킴을 포함하여, 세포에서 mRNA의 해독 종결 효율 및/또는 이상 전사체의 분해를 조절하는 방법.
(a) 제1항의 복합체를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결함 복합체의 비율을 측정하며, (c) 형질감염 전 세포의 결함 복합체 비율을 형질감염 후 세포의 결함 복합체 비율과 비교함을 포함하여, 제1항에 따른 복합체의 결함과 관련되는 질환 상태를 확인하는 방법.
제1항의 복합체 또는 제6항의 제제, 및 약제학적 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하여 개체를 치료함을 포함하여, 펩티딜 트랜스퍼라제 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법.
제26항에 있어서, 질환이 넌센스 또는 프레임이동 돌연변이로부터 발생되는 방법.
제27항에 있어서, 질환이 β-지중해빈혈, β-글로빈, 뒤시엔느/베커 근이양증, 혈우병 A, 혈우병 B, 폰 빌레브란트병, 불완전골형성증(OI), 유방암, 난소암, 윌름스 종양, 히르쉬버그병, 낭포성 섬유증, 신결석, 가족성고콜레스테롤혈증(FH), 색소성 망막염, 신경섬유종증, 망막아종, ATM 또는 코스트만병인 방법.