ES2291037T3 - Helicasas de arn que modulan la terminacion de la traduccion. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para identificar una composición de ensayo que modula la eficacia de la terminación de la traducción que comprende: (a) poner en contacto el gen MTT1 o su producto proteico Mtt1p (helicasa B) con una composición o agente de ensayo en condiciones que permitan la unión entre el gen MTT1 o Mtt1p y la composición de ensayo; (b) detectar la unión específica de la composición o agente de ensayo con el gen MTT1 o Mtt1p; y (c) determinar si la composición o agente de ensayo inhibe el gen MTT1 o Mtt1p de modo que se identifique una composición o agente de ensayo que module la eficacia de la terminación de la traducción.
Description
Helicasas de ARN que modulan la terminación de
la traducción.
La presente invención se refiere a una
subfamilia de Helicasas de ARN, una de las cuales es el gen MTT1,
que modula la fidelidad de la terminación de la traducción. La
presente invención se refiere a un complejo de vigilancia
multiproteico que comprende MTT1, Upf1p, Upf3p humanas, factor de
liberación eucariótico 1 y factor de liberación eucariótico 3 que
está implicado en la modulación de la eficacia de la terminación de
la traducción y de la degradación de ARNm aberrante. La
identificación de este complejo proporciona un sistema de ensayo
in vitro para identificar agentes que: afectan a la actividad
funcional de ARNm alterando la frecuencia de desplazamiento del
marco de lectura; permiten controlar un evento de terminación;
promueven la degradación de transcritos aberrantes; proporcionan
moduladores (inhibidores/estimuladores) de la actividad
peptidiltransferasa durante la iniciación, elongación, terminación
y degradación de ARNm de la traducción. Dichos agentes, que pueden
ser antagonistas o agonistas, son útiles con fines de cribado y
diagnóstico y como agentes terapéuticos para enfermedades o
afecciones que son el resultado, o la causa, de traducción
prematura.
El aparato de traducción es responsable de
sintetizar proteínas celulares. Esta maquinaria debe ser capaz de
determinar los sitios precisos en el ARNm donde debería empezar y
donde debería terminar la decodificación. La selección del sitio de
inicio de la traducción se perfila habitualmente por el primer codón
AUG que codifica el aminoácido metionina. Después de la iniciación
de la traducción, el ribosoma fabrica el polipéptido avanzando a lo
largo del ARNm en dirección 5' a 3', decodificando un codón cada
vez. La etapa final del proceso de traducción ocurre cuando uno de
los tres codones de terminación ocupa el sitio A del ribosoma, dando
como resultado la hidrólisis del péptido revisada en Buckingham y
col., (1997).
Aunque la terminación de la traducción aparece
normalmente después de la terminación del polipéptido completo, las
sustituciones de base y mutaciones de desplazamiento del marco de
lectura en el ADN conducen a menudo a la síntesis de un ARNm que
contiene un codón de terminación inapropiado dentro de su región de
codificación de proteína. La aparición de dicho codón de
terminación prematura detiene la traducción en el sitio de
terminación temprana y causa la síntesis de una proteína truncada y
la degradación rápida del ARNm (revisada en
Ruiz-Echevarría y col., 1996; Weng y col., 1997).
De forma interesante, las mutaciones terminadoras y de
desplazamiento del marco de lectura causan aproximadamente un
20-40% de los casos individuales de más de 240
enfermedades hereditarias diferentes (revisado en McKusick, 1994).
Por tanto, puede concebirse el tratamiento de una serie de
trastornos genéticos promoviendo la supresión de mutaciones
terminadoras. La supresión de mutaciones terminadoras es el
resultado de cuando un ARNt análogo cercano compite exitosamente con
los factores de terminación en una mutación terminadora de modo que
aparezca incorporación de aminoácido en la cadena peptídica en lugar
de terminar prematuramente la traducción (Fig. 1). Niveles
suficientes de supresión de mutaciones terminadoras permiten la
producción de proteína polipeptídica completada. Para muchas
enfermedades en las que sólo se produce un 1% de la proteína
funcional, los pacientes sufren síntomas patológicos graves,
mientras que impulsar la expresión a sólo un 5% de los niveles
normales puede reducir en gran medida la gravedad o eliminar la
enfermedad (McKusick, 1994; Cooper, etc.). Informes recientes han
demostrado que concentraciones subinhibidoras de ciertos
aminoglicósidos suprimen el proceso de terminación de la
traducción, dando como resultado la expresión de CFTR completo y
restaurando la actividad del canal de cloruro activado por AMP
ciclico (Bedwell y col., 1997; Howard y col., 1996). Por tanto,
identificar y caracterizar los factores que regulan la eficacia de
la terminación de la traducción será importante para comprender la
biología de este proceso, así como en el desarrollo de agentes
terapéuticos para el tratamiento de un amplio conjunto de trastornos
genéticos que surgen como consecuencia de mutaciones
terminadoras.
La terminación de la traducción se lleva a cabo
por los factores de liberación de peptidilo eucarióticos factor de
liberación 1 (eRF1) y factor de liberación 3 (eRF3). Tanto eRF1 como
eRF3 son proteínas conservadas que interaccionan y promueven la
liberación de peptidilo en células eucarióticas (Frolova y col.,
1994; Stansfield y col., 1995; Zhouravleva y col., 1995). En
levadura, eRF1 y eRF3 están codificados por los genes SUP45
y SUP35, respectivamente (Frolova y col., 1994; Zhouravleva y
col., 1995). Se ha mostrado que Sup45p (eRF1) y Sup35p (eRF3)
interaccionan (Stansfield y col., 1995; Paushkin y col. 1997a,b).
eRF1 contiene actividad de hidrólisis peptídica intrínseca,
mientras que eRF3, que tiene homología con el factor de elongación
de la traducción EF1\alpha (Didichenko y col., 1991), demuestra
actividad GTPasa (Frolova y col., 1996) y potencia la actividad de
terminación de eRF1 de manera dependiente de GTP (Zhouravleva y
col., 1995).
Se han identificado los factores que modulan la
eficacia del proceso de terminación de la traducción (Weng y col.,
1996a,b; Czaplinski y col., 1998; Song y Liebman, 1987;
All-Robyn y col., 1990). Por ejemplo, resultados
recientes indican que la Upf1p es un factor que modula la eficacia
de la terminación de la traducción. La desestabilización del gen
UPF1 da como resultado una drástica estabilización de ARNm
que contienen secuencias terminadoras y promueve la supresión de
ciertos alelos terminadores (Leeds y col., 1991, Cui y col., 1995,
Czaplinski y col., 1995, 1998, Weng y col., 1996a, 1996b).
Resultados recientes sugieren que la Upf1p puede modular el proceso
de terminación de la traducción interaccionando directamente con
eRF1 y eRF3 (Czaplinski y col., 1998). La Upflp contiene una región
rica en cisteína e histidina cerca de su extremo amino terminal y
todos los motivos necesarios para ser un miembro de la superfamilia
de helicasas del grupo I (Czaplinski y col., 1995; Weng y col.,
1996a,b, 1998; Altamura y col., 1992; Cui y col., 1996; Koonin,
1992; Leeds y col., 1992; Atkin y col.; 1995, 1997). Se ha
purificado la Upflp de levadura y demuestra actividad ATPasa y
helicasa dependiente de ARN (Czaplinski y col., 1995, Weng y col.,
1996a,b, 1998). Se ha identificado un homólogo humano del gen
UPF1, llamado RENT1 o HUPF1 (Perlick y col., 1996; Applequist
y col., 1997) y se ha mostrado que es funcional en células de
levadura para potenciar la terminación de la traducción, indicando
que su papel en este proceso está evolutivamente conservado
(Czaplinski y col.,
1998).
1998).
Los resultados presentados en la presente
memoria identifican un conjunto de helicasas de la superfamilia del
grupo I en células de levadura con homología significativa con
Upf1p. En particular, se han caracterizado un gen y su producto
proteico llamado MTT1 (por modulador de la terminación de la
traducción). La Mtt1p codifica una helicasa de la superfamilia del
grupo I y alberga una región rica en
cisteína-histidina en su extremo amino terminal. De
forma similar a Upf1p, la Mtt1p interacciona con el factor de
terminación de la traducción eRF3 y puede modular el proceso de
terminación de la traducción. Significativamente, la inactivación
tanto de Upf1p como de Mtt1p demuestra un fenotipo de supresión
drástica de mutaciones terminadoras que es mayor que el fenotipo de
supresión de mutaciones terminadoras observado para cualquier
deleción. Estos resultados demuestran que hay una familia de
Helicasas de ARN que son moduladores del proceso de terminación de
la traducción.
La invención proporciona procedimientos y un
complejo multiproteico aislado como se expone en las
reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona también el uso
de un complejo multiproteico aislado como se expone en la
reivindicación 9 para la fabricación de un fármaco para el
tratamiento de enfermedad como se expone en la reivindicación
15.
Esta invención proporciona un procedimiento para
identificar una composición o agente de ensayo que module la
eficacia de la terminación de la traducción que comprende: (a) poner
en contacto el MTT1 con una composición de ensayo en condiciones
que permitan la unión entre el MTT1 y la composición de ensayo; (b)
detectar la unión específica de la composición de ensayo al MTT1; y
(c) determinar si la composición de ensayo inhibe el MTT1 de modo
que identifique una composición de ensayo que module la eficacia de
la terminación de la traducción. En una realización, el agente
inhibe la actividad ATPasa/helicasa de MTT1, ATPasa de Upflp; la
actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; la unión a ARN; la unión de los
factores al ribosoma; o la unión de los factores entre sí. En otra
realización, el agente modula la unión del MTT1 al polisoma. En otra
realización, el agente inhibe la unión de MTT1 humano a eRF3. En
otra realización, el agente facilita la unión de MTT1 humano a
eRF3.
Esta invención proporciona un procedimiento de
identificación de una composición o agente de ensayo que modula la
unión a MTT1, comprendiendo el procedimiento: (a) incubar los
componentes que comprenden la composición de ensayo y MTT1, en el
que la incubación se lleva a cabo en condiciones suficientes para
permitir que los componentes interaccionen; y (b) medir el efecto
de la composición de ensayo sobre la unión a MTT1. En una
realización, el procedimiento comprende además identificar un gen
que comprende: (a) introducir en una célula una composición de
ensayo que modula la unión a MTT1; (b) determinar el fenotipo de la
célula después de (a); (c) comparar el fenotipo celular después de
(a) con el fenotipo celular antes de (a); y (d) identificar el gen
de la célula en la que se ha introducido la composición de
ensayo.
Se describe en la presente memoria un vector que
modula la expresión del polinucleótido MTT1 o la función del
polipéptido MTT1. La modulación puede ser inhibidora o
estimulante.
Esta invención proporciona un complejo
multiproteico aislado que comprende un gen MTT1, proteína Upf1p
humana, un factor de liberación eucariótico de peptidilo 1 (eRF1) y
un factor de liberación eucariótico de peptidilo 3 (eRF3), en el
que el complejo es eficaz para modular la actividad
peptidiltransferasa durante la traducción. En una realización, el
complejo comprende además Upf3p y/o Upf2p humanas.
Se describe también en la presente memoria la
provisión de un agente que se une al complejo que modula la
fidelidad de la traducción de un ARNm. La traducción incluye
iniciación, elongación, terminación, así como degradación. En una
realización, el agente inhibe la actividad ATPasa/helicasa de MTT1;
ATPasa de Upf1p; la actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; la unión a
ARN; la unión de los factores al ribosoma; o la unión de los
factores entre sí. El agente puede modular la unión de MTT1 al
polisoma, o inhibir la unión de MTT1 humana a eRF3. Como
alternativa, el agente puede facilitar la unión de MTT1 humana a
eRF3.
Se describe en la presente memoria un
procedimiento de modulación de la actividad peptidiltransferasa
durante la traducción, que comprende poner en contacto una célula
con el agente en una cantidad eficaz para suprimir la terminación
de la traducción por mutaciones terminadoras, modulando así la
actividad peptidiltransferasa. La actividad peptidiltransferasa
durante la traducción aparece durante la iniciación, elongación,
terminación y degradación del ARNm.
Se describe también un procedimiento de
modulación de la eficacia de la terminación de la traducción de ARNm
en un codón terminador y/o de la promoción de la degradación de
transcritos aberrantes, que comprende poner en contacto una célula
con el agente en una cantidad eficaz para inhibir la unión de Mtt1 y
eRF3, modulando así la eficacia de la terminación de la traducción
de ARNm en un codón terminador y/o promoviendo la degradación de
transcritos aberrantes.
Se describe un procedimiento para modular la
eficacia de la terminación de la traducción de ARNm en un codón
terminador y/o para promover la degradación de transcritos
aberrantes, que comprende poner en contacto una célula con un
agente que inhibe la actividad ATPasa/helicasa de MTT1, modulando
así la eficacia de la terminación de la traducción de ARNm en un
codón terminador y/o promoviendo la degradación de transcritos
aberrantes.
Una descripción adicional en la presente memoria
se refiere a un procedimiento de detección de un trastorno asociado
a la expresión de proteína Mtt1, en el que el procedimiento
comprende poner en contacto una muestra de un sujeto que tiene o se
sospeche que tiene un trastorno con un reactivo que detecta la
expresión de la proteína mtt1 o mutante de la misma y detectar la
unión del reactivo en la muestra.
Se da a conocer un procedimiento para tratar una
enfermedad asociada a la actividad peptidiltransferasa. Este
procedimiento comprende administrar a un sujeto una cantidad
terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que
comprende el complejo, proteína mtt1, proteína mtt1 mutante o
agentes de la misma, y un vehículo o diluyente farmacéutico,
tratando así al sujeto.
Existe también un procedimiento de
identificación de genes que están implicados en la modulación de la
fidelidad de la terminación de la traducción, que comprende: a)
aislar un gen de interés; y b) determinar si el gen de interés
comprende los motivos I-IX, en el que si el gen
comprende cualquiera de los nueve motivos, el gen modula la
terminación de la traducción. El motivo I puede comprender la
secuencia: GppGTKTxT-X(n).
El motivo II puede comprender la secuencia
riLxcaSNxAvDx1-X(n). El motivo III puede
comprender la secuencia
vviDExx-QaxxxxxiPi-X(n). El
motivo IV puede comprender la secuencia
xxi1aGDxxQLp-X(n). El motivo V puede
comprende la secuencia lxxSLFerv-X(n). El
motivo VI puede comprender la secuencia
LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n). El motivo VII
puede comprender la secuencia
IgvitPYxxQvxxl-X(n). El motivo VIII puede
comprender la secuencia
vevxtVDxFQGreKdxlilScVR-X(n). El motivo IX
puede comprender la secuencia iGFLxdxRRINValTRak.
Figura 1 5 proteínas de levadura definen una
subclase de la superfamilia de helicasas del grupo I. se alinearon
los dominios de helicasa MTT1, UPF1, DIP1, SEN1 y DNA2 utilizando
PILEUP y los resultados se representaron utilizando BOXSHADE en el
programa GCG. La secuencia consenso se enumera en la línea inferior.
Los residuos idénticos conservados (recuadro gris oscuro) se
indican con letras mayúsculas, mientras que los residuos similares
conservados se indican con letras minúsculas (recuadro gris claro).
Se indica en la figura el número de aminoácidos en la secuencia
primaria de los genes respectivos.
Figura 2 Un mtt/\Delta demuestra
supresión de las mutaciones terminadoras. Se eliminaron MTT1, UPF1
o MTT1 y UPF1 de la cepa KC2 (ura3-52 trp 1D
leu2-2 tyr71) de levadura y se cultivaron esas
células hasta DO_{600}= 1,0. Se sembraron diluciones en serie de
estas células en -ura-leu-tyr para
ensayar la supresión de las mutaciones terminadoras, y en -ura como
control del crecimiento celular. Se controló el crecimiento a 30ºC
y se representa el crecimiento de 10 días en la parte superior.
Figura 3 La Mtt1 no es necesaria para la
descomposición de ARNm mediado por mutaciones terminadoras. Se
eliminaron UPF1 o MTT1 y UPF1 de la cepa KC2
(ura3-52 trp1D leu2-2
tyr7-1) de levadura y se cultivaron esas células
hasta DO_{600}= 0,8. Se preparó el ARN total y se sometió a
análisis de transferencia de ARN utilizando una sonda de ARNm de
CYH2.
Figura 4 La Mtt1 interacciona con eRF3. Se
prepararon extractos citoplasmáticos a partir de una cepa BJ3505 de
levadura transformada con pG-1 (vector) o
pG-1FLAGMTT1 (Flag-Mttlp) en IBTB, y
se incubaron con 30 \mul de GST, complejos de
Sepharose-proteína GST-eRF1,
GST-eRF3, GST-eRF3NM o
GST-eRF3C. Se lavaron los complejos de
Sepharose-proteína 2 veces con IBTB (véanse
materiales y procedimientos), se resuspendieron en tampón de carga
de PAGE-SDS, se separaron en gel de
PAGE-SDS al 8% y se inmunotransfirieron utilizando
anticuerpo anti-FLAG.
Figura 5 La Mtt1 está asociada a polisoma. Se
prepararon extractos citoplasmáticos a partir de una cepa BJ3505 de
levadura transformada con pG-1FLAGMTT1 y se trataron
con ARNasa A o se dejaron sin tratar. Se centrifugaron después los
extractos a través de un gradiente de sacarosa al
7-47%. Se reunieron los gradientes y se recogieron
las fracciones controlando la A_{254}. Se sometieron las
fracciones de gradiente a transferencia Western utilizando
anticuerpo monoclonal del epítopo Flag como sonda. Se muestran los
perfiles de A_{254} en los paneles superiores, mientras que las
transferencias Western de las correspondientes fracciones se
muestran en los paneles inferiores.
La terminación de la traducción en un codón de
terminación es la etapa final que completa la síntesis de un
polipéptido. La terminación prematura de la traducción conduce a la
síntesis de proteínas truncadas y a la rápida degradación de ARNm
aberrantes. Estas mutaciones dan cuenta de un gran porcentaje de los
trastornos genéricos hereditarios, y se ha desarrollado una
estrategia novedosa para reducir la eficacia del proceso de
terminación de la traducción para el tratamiento de estas
enfermedades. Por tanto, la identificación y caracterización de
factores que modulen la eficacia de la terminación serán importantes
tanto para comprender la biología de este proceso como para
identificar nuevos agentes terapéuticos.
Esta invención se refiere a la identificación y
caracterización de una familia de Helicasas de ARN implicadas en la
modulación de la terminación de la traducción, en particular, el gen
MTT1 y su producto proteico. Las cepas mtt1\Delta
no afectan a la descomposición de ARNm, pero demuestran un fenotipo
de supresión de las mutaciones terminadoras. Una cepa
mtt1\Delta upf1\Delta demuestra un fenotipo de supresión
drástica de las mutaciones terminadoras que es mayor que el
observado en cepas que albergan una sola deleción. Los resultados
bioquímicos demuestran que la ATPasa/helicasa Mtt1p está implicada
con, está asociada a polisoma, e interacciona con el factor de
terminación de la traducción eRF3. Tomados conjuntamente, los
resultados presentados en la presente memoria identifican una
familia de Helicasas de ARN que modula la eficacia de la terminación
de la traducción en células.
La presente invención se refiere a una cepa
mttl\Delta mutante. Una cepa mttl\Delta
upfl\Delta mutante demuestra un fenotipo de supresión
drástica de mutaciones terminadoras que es mayor que el observado
en cepas que albergan una sola deleción. La invención se refiere a
ensayos, agentes terapéuticos y procedimientos de cribado que
actúan como antagonistas o agonistas para modular la supresión de
las mutaciones terminadoras. Como se muestra en la presente
memoria, una cepa mttl\Delta upfl\Delta demuestra un
fenotipo de supresión drástica de las mutaciones terminadoras
comparada con una cepa upfl\Delta o
mtt1\Delta.
Esta invención proporciona un complejo aislado
que comprende MTT1, una proteína Upflp humana, un factor de
liberación eucariótico de peptidilo 1 (eRF1) y un factor de
liberación eucariótico de peptidilo 3 (eRF3), en el que el complejo
es eficaz para modular la actividad peptidiltransferasa. Como se
define en la presente memoria, un "complejo de vigilancia"
comprende al menos MTT1, Upflp y el factor de liberación eucariótica
1 y 3. El gen "UPF1" se llama también RENT1 o HUPF1. El
complejo puede comprender también Upf2p y/o Upf3p.
Puede proporcionarse un agente que se une al
complejo que modula la fidelidad de la terminación de la traducción.
La terminación de la traducción incluye iniciación, elongación,
terminación y degradación. El agente puede modular la unión de MTT1
al polisoma o inhibir la unión de MTT1 humana a eRF3. Como
alternativa, el agente puede facilitar la unión de MTT1 a eRF3.
Los resultados presentados en la presente
memoria demuestran que la Mttlp purificada muestra también
actividades ATPasa y helicasa dependientes de ARN (Fig. 7). Varias
series de pruebas sugieren que la Mtt1p está implicada en la
terminación de la traducción. Los resultados presentados en la
presente memoria muestran que: 1) una cepa mtt1\Delta
demuestra un fenotipo de supresión de las mutaciones terminadoras
(Fig. 4); 2) la Mtt1p está asociada a polisoma (Fig. 6); 3) la
Mtt1p interacciona directamente con el factor de liberación de
peptidilo eRF3 (Fig. 5); 4) las cepas mtt1\Delta demuestran
sensibilidad a paromicina. Si se considera que, al contrario que la
cepa upf1\Delta, una cepa mtt1\Delta no estabiliza
los transcritos que contienen mutaciones terminadoras, entonces la
cantidad de supresión de las mutaciones terminadoras por molécula de
ARN es mayor en una cepa mtt1\Delta que en una cepa
upf1\Delta (Fig. 3).
Un gran número de observaciones apuntan a un
papel importante para la síntesis de proteínas en el proceso de
descomposición de ARNm. De hecho, parece que estos dos procesos han
coevolucionado y que los factores esenciales para un proceso
funcionan también en el otro. La evidencia de esta relación incluye
experimentos que demuestran que: a) los fármacos o mutaciones que
interfieren con la elongación de la traducción promueven la
estabilización de ARNm, b) los elementos de secuencia que rigen una
descomposición rápida de ARNm pueden localizarse en regiones de
codificación de ARNm y la actividad de dichos elementos depende de
su traducción, c) los factores de degradación pueden estar
asociados a ribosoma, y d) la terminación prematura de la traducción
puede potenciar las velocidades de descomposición de ARNm.
Puesto que la cantidad de una proteína
particular sintetizada en un tiempo dado depende de la concentración
celular de su ARNm, se sigue que la regulación de las velocidades
de degradación de ARNm proporciona un potente medio de controlar la
expresión génica. En células de mamífero, las velocidades de
descomposición de ARNm (expresadas como semividas) pueden ser tan
cortas como de 15-30 minutos o tan largas como de
500 horas. Obviamente, dichas diferencias en las velocidades de
degradación de ARNm pueden conducir a diferencias de hasta 1.000
veces en el nivel de proteínas específicas. Se proporciona un nivel
adicional de control por la observación de que las velocidades de
descomposición para ARNm individuales no tienen que fijarse, sino
que pueden regularse como consecuencia de mecanismos de
realimentación autogénica, la presencia de hormonas específicas, una
etapa particular de diferenciación o del ciclo celular, o infección
vírica.
Quizás los mejores ejemplos de integración de la
traducción y descomposición de ARNm son estudios que documentan las
consecuencias de la terminación prematura de la traducción. Ésta
aparece cuando la deleción, sustitución de bases o mutaciones de
desplazamiento del marco de lectura en el ADN conducen a la síntesis
de un ARNm que contiene un codón de terminación inapropiado (codón
terminador) dentro de su región de codificación de proteína. La
aparición de dicho codón de terminación prematura detiene la
traducción en el sitio de terminación temprana y causa la síntesis
de una proteína truncada. Independientemente de sus velocidades de
descomposición "normales", los ARNm transcritos a partir de
genes que albergan mutaciones terminadoras (denominados "ARNm que
contienen mutaciones terminadoras") se degradan muy rápidamente.
Dicha "descomposición de ARNm mediada por mutaciones
terminadoras" es ubicua, concretamente, se ha observado en todos
los organismos ensayados y conduce a una reducción de hasta 10 a
100 veces en la abundancia de ARNm específicos. La combinación de
abundancia de ARNm gravemente reducida y traducción terminada
prematuramente causa reducciones en el nivel global de expresión de
genes específicos que son tan drásticas como las consecuencias de la
deleción génica. La importancia de la descomposición de ARNm
mediada por mutaciones terminadoras para la salud humana está
ilustrada por la identificación de un número creciente de
enfermedades hereditarias en las que las mutaciones terminadoras
causan el estado patológico y en las que se ha mostrado que los
ARNm respectivos son sustratos de la ruta de descomposición del
ARNm mediada por mutaciones terminadoras.
Es un punto importante que la inactivación de la
ruta de descomposición del ARNm mediada por mutaciones terminadoras
puede conseguirse sin impedir el crecimiento celular, y conduce a la
restauración de los niveles normales y velocidades de
descomposición normales para ARNm que contienen mutaciones
terminadoras. Más significativamente, los experimentos en levadura
(y otros) demuestran que, aunque un ARNm puede seguir conteniendo un
codón terminador, la inactivación de esta ruta de descomposición
permite sintetizar suficiente proteína funcional para que las
células puedan superar el defecto genético original. Por tanto, es
posible tratar enfermedades causadas por mutaciones terminadoras
mediante la regulación negativa de la ruta de descomposición del
ARNm mediada por mutaciones terminadoras.
Se describe también en la presente memoria un
vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína
MTT1, Upf1p, Upf2p, Upf3p, un factor de liberación eucariótico de
peptidilo 1 (eRF1) y un factor de liberación eucariótico de
peptidilo 3 (eRF3) ligado operativamente a un elemento
regulador.
Al operar la presente invención, pueden
emplearse técnicas de biología molecular, microbiología y ADN
recombinante convencionales dentro de las experiencia de la
técnica. Dichas técnicas se explican totalmente en la bibliografía.
Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la
presente memoria "Sambrook y col., 1989"); "ADN Cloning: A
Practical Approach", volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985);
"Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid
Hybridization [B.D. Hames y S.J. Higgins eds. (1985)];
"Transcription and Translation" [B.D. Hames y S.J. Higgins,
eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney ed. (1986)];
"Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press (1986)]; B. Perbal,
"A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); F.M. Ausubel
y col. (eds.) "Current Protocols in Molecular Biology", John
Wiley & Sons, Inc. (1994).
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN
para ocasionar la replicación del segmento unido. Un "replicón"
es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma,
virus) que funciona como unidad autónoma de replicación de ADN in
vivo, concretamente, capaz de replicación bajo su propio
control. Un "módulo" designa un segmento de ADN que puede
insertarse en un vector en sitios de restricción específicos. El
segmento de ADN codifica un polipéptido de interés, y el módulo y
los sitios de restricción se diseñan para asegurar la inserción del
módulo en el marco de lectura apropiado para la transcripción y
traducción.
"Una molécula de ácido nucleico" designa la
forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos (adenosina,
guanosina, uridina o citidina: "moléculas de ARN") o
desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxitimidina o desoxicitidina: "moléculas de ADN"), o
cualquier análogo de fosfoéster de los mismos tal como
fosforotioatos y tioésteres, en forma monocatenaria o de hélice
bicatenaria. Son posibles hélices bicatenarias de
ADN-ADN, ADN-ARN y
ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico, y en
particular molécula de ADN o ARN, designa sólo la estructura
primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma
terciaria particular. Por tanto, este término incluye ADN
bicatenario encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineales o
circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y
cromosomas. Al discutir la estructura de moléculas de ADN
bicatenarias particulares, las secuencias pueden describirse en la
presente memoria según la convención normal de dar sólo la
secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no
transcrita de ADN (concretamente, la cadena que tiene una secuencia
homóloga con el ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es
una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación biológica
molecular.
Las secuencias de control transcripcional y
traduccional son secuencias de regulación de ADN, tales como
promotores, potenciadores, terminadores y similares, que
proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una
célula huésped. En células eucarióticas, las señales de
poliadenilación son secuencias de control.
Una "secuencia promotora" es una región
reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una célula e
iniciar la transcripción de una secuencia de codificación cadena
abajo (dirección 3'). Con fines de definición en la presente
invención, la secuencia promotora está limitada en su terminación 3'
por el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende cadena
arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o
elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles
detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora,
se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (definido
convenientemente, por ejemplo, cartografiando con nucleasa S1), así
como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables
de la unión de ARN polimerasa. Una secuencia de codificación está
"bajo el control" de secuencias de control transcripcional y
traduccional en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la
secuencia de codificación a ARNm, que entonces se ayusta con
trans-ARN y se traduce a la proteína codificada por
la secuencia de codificación.
Puede utilizarse un gran número de sistemas de
vector-huésped conocidos en la técnica. Los vectores
posibles incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus
modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la
célula huésped utilizada. Los ejemplos de vectores incluyen, pero
sin limitación, bacteriófagos de E. coli tales como
derivados de lambda o plásmidos tales como derivados de pBR322 o
derivados del plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX,
pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de
clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el fragmento de
ADN a un vector de clonación que tiene terminaciones cohesivas
complementarias. Sin embargo, si los sitios de restricción
complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes
en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN
pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede
producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias nucleotídicas
(engarces) en las terminaciones de ADN; estos engarces ligados
pueden comprender oligonucleótidos sintetizados químicamente
específicos que codifican secuencias de reconocimiento de
endonucleasa de restricción. Las moléculas recombinantes pueden
introducirse en células huésped mediante transformación,
transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se
generen muchas copias del gen. Preferiblemente, el gen clonado está
contenido en un plásmido vector lanzadera que proporciona la
expansión en una célula de clonación, por ejemplo, E. coli y
una fácil purificación para la posterior inserción en una línea
celular de expresión apropiada, si se desea eso. Por ejemplo, puede
prepararse un vector lanzadera, que es un vector que puede replicar
en más de un tipo de organismo, para replicación tanto en E.
coli como en Saccharomyces cerevisiae ligando secuencias
de un plásmido de E. coli con secuencias del plásmido 2
\mu de levadura.
Esta invención es capaz de identificar agentes
que se unen al complejo que modula la fidelidad de la traducción.
La traducción incluye iniciación, elongación, terminación, así como
degradación. En una realización, el agente inhibe la actividad
ATPasa/helicasa, la actividad de MTT1, Upf1p; la actividad GTPasa de
eRF1 o eRF3; la unión a ARN; la unión de los factores al ribosoma;
o la unión de los factores entre sí. El agente puede modular la
unión de MTT1 al polisoma, o inhibir la unión de MTT1 humana a eRF3.
Como alternativa, el agente puede facilitar la unión de MTT1 humana
a eRF3.
Se describe en la presente memoria un anticuerpo
que se une al complejo o MTT1. El anticuerpo puede ser un
anticuerpo monoclonal o policlonal. Además, el anticuerpo puede
estar marcado con un marcador detectable que es un marcador
radiactivo, colorimétrico, fluorescente o luminiscente. El
anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal.
El anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo marcado purificado.
Los procedimientos de marcaje de anticuerpos son bien conocidos en
la técnica.
El término "anticuerpo" incluye, a modo de
ejemplo, tanto anticuerpos de origen natural como de origen no
natural. Específicamente, el término "anticuerpo" incluye
anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de los mismos.
Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos
y anticuerpos completamente sintéticos y fragmentos de los mismos.
Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales,
monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y una
biblioteca de expresión de Fab. Además, la proteína o anticuerpo
puede incluir un marcador detectable, en el que el marcador es un
marcaje radiactivo, colorimétrico, fluorescente o luminiscente.
Los anticuerpos pueden marcarse para detección
in vitro, por ejemplo, con marcajes tales como enzimas,
fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, tintes, oro coloidal,
partículas de látex y agentes quimioluminiscentes. Como
alternativa, los anticuerpos pueden marcarse para detección in
vivo, por ejemplo, con radioisótopos (preferiblemente tecnecio
o yodo); reactivos de desplazamiento de resonancia magnética (tales
como gadolinio y manganeso); o reactivos radioopacos. Los marcajes
más habitualmente empleados para estos estudios son elementos
radiactivos, enzimas, productos químicos con fluorescencia cuando se
exponen a luz ultravioleta y otros. Son conocidos una serie de
materiales fluorescentes y pueden utilizarse como marcajes. Estos
incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, rojo
Texas, azul AMCA y amarillo Lucifer. Es un material detector
particular el anticuerpo anti-conejo preparado en
cabras y conjugado con fluoresceína a través de un isotiocianato. La
proteína puede marcarse también con un elemento radiactivo o con
una enzima. El marcaje radiactivo puede detectarse mediante
cualquiera de los procedimientos de recuento actualmente
disponibles. El isótopo preferido puede seleccionarse de ^{3}H,
^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co,
^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y
^{186}Re.
Los marcajes enzimáticos son igualmente útiles,
y pueden detectarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas,
espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o
gasométricas actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la
partícula seleccionada mediante reacción con moléculas puente tales
como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Son
conocidas y pueden utilizarse muchas enzimas que pueden utilizarse
en estos procedimientos. Las preferidas son peroxidasa,
\beta-glucuronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes de
EE.UU. nº 3.654.090, 3.850.752 y 4.016.043 se designan a modo de
ejemplo por su descripción de materiales y procedimientos de marcaje
alternativos.
Pueden utilizarse anticuerpos y ácidos nucleicos
específicos de complejo como sondas en procedimientos para detectar
la presencia de un polipéptido de complejo (utilizando un
anticuerpo) o ácido nucleico (utilizando una sonda de ácido
nucleico) en una muestra o tipo celular específico. En estos
procedimientos, se pone en contacto un anticuerpo o ácido nucleico
específico de complejo con una muestra de un paciente sospechoso de
tener un trastorno asociado a complejo, y se detecta la unión
específica de la sonda de anticuerpo o ácido nucleico a la muestra.
El nivel de complejo o ácido nucleico presente en la muestra
sospechosa puede compararse con el nivel en una muestra de control,
por ejemplo, una muestra equivalente de un individuo no afectado
para determinar si el paciente tiene un trastorno asociado a
complejo. Los polipéptidos de complejo, o fragmentos de los mismos,
pueden utilizarse también como sondas en procedimientos de
diagnóstico, por ejemplo, para detectar la presencia de anticuerpos
específicos de complejo en muestras. Adicionalmente, podrían
utilizarse anticuerpos específicos de complejo para detectar
cofactores novedosos que han formado un complejo con el complejo o
fragmento del mismo.
La presencia, abundancia relativa o ausencia del
complejo se determinan mediante la unión del anticuerpo. Los
posibles procedimientos de detección incluyen cromatografía de
afinidad, transferencia Western u otras técnicas bien conocidas por
los expertos en la técnica. Este enfoque utiliza ácido nucleico
antisentido y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm
específico, enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido
o escindiéndolo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas
de ADN o ARN que son complementarias de al menos una porción de una
molécula de ARNm específica (véase Marcus-Sekura,
1988, Anal. Biochem. 172: 298). En la célula, hibridan con
ese ARNm formando una molécula bicatenaria. La célula no traduce un
ARNm en esta forma bicatenaria. Por lo tanto, los ácidos nucleicos
antisentido interfieren con la expresión de ARNm en proteína. Los
oligómeros de aproximadamente 15 nucleótidos y moléculas que
hibridan con el codón de iniciación AUG serán particularmente
eficaces, puesto que son fáciles de sintetizar y es probable que
presenten menos problemas que moléculas más grandes cuando se
introduzcan en células de órgano. Se han utilizado procedimientos
antisentido para inhibir la expresión de muchos genes in
vitro (Marcus-Sekura, 1988, mencionado
anteriormente; Hambor y col., 1988, J. Exp. Med.
168:
1237).
1237).
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad de escindir específicamente otras moléculas de ARN
monocatenarias de manera análoga a las endonucleasas de restricción
de ADN. Las ribozimas se descubrieron a partir de la observación de
que ciertos ARNm tienen la capacidad de escindir sus propios
intrones. Al modificar la secuencia nucleotídica de estos ARN, los
investigadores han podido crear por ingeniería genética moléculas
que reconocen secuencias nucleotídicas específicas en una molécula
de ARN y las escinden (Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:
3030). Debido a que son específicos de secuencia, sólo se inactivan
los ARNm con secuencias particulares.
Los investigadores han identificado dos tipos de
ribozimas, el tipo Tetrahymena y el tipo "cabeza de
martillo". Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen
secuencias de cuatro bases, mientras que las de tipo "cabeza de
martillo" reconocen secuencias de 11 a 18 bases. Cuanto más larga
es la secuencia de reconocimiento, más probable es que aparezca
exclusivamente en la especie de ARNm diana. Por lo tanto, las
ribozimas de tipo cabeza de martillo son preferibles a las
ribozimas de tipo Tetrahymena para inactivar una especie de
ARNm específica, y son preferible secuencias de reconocimiento de
18 bases a secuencias de reconocimiento más cortas.
Puede utilizarse cualquier técnica de cribado
conocida en la técnica para cribar agentes que afecten a una
proteína de terminación de la traducción o de descomposición de
ARNm. La presente invención contempla cribados de ligandos de
molécula pequeña.
El conocimiento de la secuencia primaria de una
proteína de terminación de la traducción o de descomposición de
ARNm, y la similitud de esa secuencia con proteínas de función
conocida, puede proporcionar una pista inicial de agentes que es
probable que afecten a la actividad proteica. La identificación y
cribado de dichos agentes se facilita además determinando los
rasgos estructurales de la proteína, por ejemplo, utilizando
cristalografía de rayos X, difracción de neutrones, espectrometría
de resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la
determinación de estructura. Estas técnicas proporcionan el diseño
racional o la identificación de agonistas y antagonistas.
El cribado puede realizarse con células
recombinantes que expresan las proteínas, complejos implicados en
la terminación de la traducción o proteína de descomposición de ARNm
o, como alternativa, con la proteína purificada. Por ejemplo, la
capacidad de la proteína marcada de unirse a una molécula en una
biblioteca combinatoria puede utilizarse como ensayo de cribado,
como se describe en las referencias anteriores.
Puede cribarse en una célula huésped candidata
la cantidad de complejo producido por dicha célula respecto a una
célula de control. Un procedimiento comprende a) proporcionar una
población clonal de dicha célula huésped candidata; b) tratar dicha
población clonal de células de tal modo que las proteínas
intracelulares sean accesibles a un anticuerpo; c) poner en
contacto dichas proteínas intracelulares con un anticuerpo que se
una específicamente al complejo; y d) determinar la cantidad
relativa del complejo producida por dicha célula huésped
candidata.
Pueden realizarse procedimientos de cribado del
gen MTT1 para identificar mutaciones. Dichos procedimientos pueden
comprender además la etapa de amplificar una porción del gen MTT1, y
pueden incluir además una etapa de proporcionar un conjunto de
polinucleótidos que son cebadores de amplificación de dicha porción
del gen MTT1. El procedimiento es útil para identificar mutaciones
para uso en el diagnóstico o la predisposición, y el diagnóstico y
el tratamiento, de anormalidad megacariocítica, trastornos
hematopoyéticos, trastorno mieloproliferativo, trastorno de
plaquetas, leucemia y diagnóstico y tratamiento prenatal de tumores.
Las técnicas de diagnóstico útiles incluyen, pero sin limitación,
hibridación fluorescente in situ (FISH), secuenciación
directa de ADN, análisis PFGE, análisis de transferencia Southern,
análisis de conformación monocatenaria (SSCA), ensayo de protección
de ARNasa, oligonucleótido específico de alelo (ASO), análisis de
transferencia puntual y PCR-SSCP, como se discute
con detalle más adelante.
Esta invención proporciona un procedimiento de
cribado de un fármaco implicado en la actividad peptidiltransferasa
durante la traducción que comprende: a) poner en contacto células
con un candidato a fármaco; y b) ensayar la modulación del
complejo, en el que el fármaco que modula el complejo está implicado
en la actividad peptidiltransferasa. Además, en el complejo puede
ensayarse la actividad NTPasa tal como ATPasa, GTPasa, la actividad
de unión a ARNm, factores que se unen al complejo tales como, pero
sin limitación, eRF1 y eRF3, factores que se disocian del ribosoma;
factores que promueven la agregación y factores que potencian la
terminación de la traducción retardando la hidrólisis
peptídica.
Esta invención proporciona un procedimiento de
cribado de un fármaco activo implicado en la potenciación de la
terminación de la traducción que comprende: a) poner en contacto
células con un candidato a fármaco; y b) ensayar la modulación del
complejo proteico; en el que un fármaco que modula el complejo
proteico está implicado en la potenciación de la terminación de la
traducción.
Esta invención proporciona un procedimiento de
cribado de un fármaco implicado en la potenciación de la terminación
de la traducción que comprende: a) incubar el fármaco y el
complejo; y b) medir el efecto de la supresión de mutaciones
terminadoras, cribando así un fármaco implicado en la potenciación
de la terminación de la traducción. Los ensayos pueden ser ensayos
de unión a ARN o NTPasa tales como ensayos ATPasa o GTPasa, que son
conocidos por los expertos en la técnica.
Se describe en la presente memoria un
procedimiento para inhibir un gen que tiene un alelo mutante que
comprende: (a) transfectar una célula con un vector de expresión
recombinante MTT1; (b) determinar el fenotipo de la célula
después de la transfección; (c) comparar el fenotipo celular después
de la transfección con el fenotipo celular antes de la
transfección; y (d) identificar el gen que contiene el alelo mutante
de la célula transfectada.
Esta invención proporciona un procedimiento de
identificación de una composición de ensayo que modula la unión a
MTT1, comprendiendo el procedimiento: (a) incubar los componentes
que comprenden la composición de ensayo y MTT1, en el que la
incubación se lleva a cabo en condiciones suficientes para permitir
que los componentes interaccionen; y (b) medir el efecto de la
composición de ensayo sobre la unión a MTT1. En una realización, el
procedimiento comprende además identificar un gen que comprende: (a)
introducir en una célula una composición de ensayo que modula la
unión a MTT1; (b) determinar el fenotipo de la célula después de
(a); (c) comparar el fenotipo celular después de (a) con el
fenotipo celular antes de (a); y (d) identificar el gen de la célula
en la que se ha introducido la composición de ensayo.
Una "composición de ensayo", como se
utiliza en la presente memoria, es cualquier composición tal como un
gen, una secuencia de ácido nucleico, un polipéptido, fragmento
peptídico o composición creada mediante el uso de una biblioteca
combinatoria u otro proceso combinatorio, en la que puede ensayarse
su capacidad de funcionar con una capacidad dada o un compuesto que
imita la actividad del complejo. A menudo, dicha composición de
ensayo, secuencia de ácido nucleico o polipéptido es sospechoso,
debido a su secuencia o estructura, de ser capaz de funcionar con
una capacidad dada.
Un "cofactor" es cualquier composición (por
ejemplo, un polipéptido, derivado de polipéptido o peptidomimético)
que sea capaz de modular el complejo e influir en la NMD o en la
eficacia de terminación de la traducción. Se incluyen composiciones
que inducen naturalmente la NMD o la eficacia o fidelidad de la
terminación de la traducción mediante el complejo; se incluyen
también composiciones que no inducen naturalmente la NMD (por
ejemplo, composiciones artificiales y composiciones naturales que
sirven para otros fines).
El término "agonista", como se utiliza en
la presente memoria, significa cualquier composición que sea capaz
de aumentar o estimular la eficacia o fidelidad de la terminación de
la traducción o degradación de ARNm mediante interacción o unión
con el complejo o factores, tales como eRF3 o upf1, del complejo que
interaccionan con MTT1 del complejo. El término "antagonista",
como se utiliza en la presente memoria, significa cualquier
composición que sea capaz de reducir la eficacia o fidelidad de la
terminación de la traducción o degradación de ARNm mediante
interacción o unión con el complejo, MTT1 o factores, tales como
eRf3 o upf1, del complejo que interaccionan con MTT1 del
complejo.
La identificación y el aislamiento de un gen que
codifica MTT1 de la invención proporcionan la expresión de MTT1 en
cantidades mayores que las que pueden aislarse a partir de fuentes
naturales, o en células indicadoras que están especialmente
diseñadas por ingeniería genética para indicar la actividad de MTT1
expresada después de la transfección o transformación de las
células. En consecuencia, además del diseño racional de agonistas y
antagonistas basado en la estructura de MTT1, la presente invención
contempla un procedimiento alternativo para identificar ligandos
específicos de MTT1 utilizando diversos ensayos de cribado conocidos
en la técnica.
Puede utilizarse cualquier técnica de cribado
conocida en la técnica para cribar agonistas o antagonistas de
MTT1. La presente invención contempla cribados de moléculas pequeñas
que se unen a MTT1 y agonizan o antagonizan MTT1 in vitro
y/o in vivo. Por ejemplo, las bibliotecas de productos
naturales pueden cribarse utilizando ensayos de la invención para
moléculas que agonizan o antagonizan la actividad de MTT1.
El conocimiento de la secuencia primaria de
MTT1, y la similitud de esa secuencia con otras proteínas de unión
a ADN, pueden proporcionar una pista inicial respecto a los
inhibidores o antagonistas de MTT1. La identificación y cribado de
antagonistas se facilita además determinando rasgos estructurales de
la proteína, por ejemplo, utilizando cristalografía de rayos X,
difracción de neutrones, espectrometría de resonancia magnética
nuclear y otras técnicas para la determinación estructural. Estas
técnicas proporcionan el diseño racional o la identificación de
agonistas y antagonistas.
Otro enfoque utiliza bacteriófago recombinante
para producir grandes bibliotecas. Utilizando el "procedimiento
del fago" [Scott y Smith, 1990, Science 249:
386-390 (1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. 87: 6378-6382 (1990); Devlin y col.,
Science, 249: 404-406 (1990)], pueden
construirse bibliotecas muy grandes
(10^{6}-10^{8} entidades químicas). Un segundo
enfoque utiliza principalmente procedimientos químicos, de los
cuales son ejemplos el procedimiento de Geysen [Geysen y col.,
Molecular Immunology 23: 709-715 (1986);
Geysen y col., J. Immunologic Method 102:
259-274 (1987)] y el procedimiento de Fodor y col.
[Science 251: 767-773 (1991)]. Furka y col.
["14th International Congress of Biochemistry", volumen 5,
resumen FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res.
37: 487-493 (1991)], Houghton [patente de EE.UU. nº
4.631.211, expedida en diciembre de 1986] y Rutter y col. [patente
de EE.UU. nº 5.010.175, expedida el 23 de abril de 1991] describen
procedimientos para producir una mezcla de péptidos que pueden
ensayarse como agonistas o antagonistas.
En otro aspecto, pueden utilizarse bibliotecas
sintéticas [Needels y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
10700-10704 (1993); Ohlmeyer y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 10922-10926 (1993); Lam y
col., publicación de patente internacional nº WO 92/00252; Kocis y
col., publicación de patente internacional nº WO 9428028 para
cribar ligandos de MTT1 según la presente invención.
El cribado puede realizarse con células
recombinantes que expresan MTT1 o, como alternativa, utilizando
proteína purificada y/o dominios estructurales/funcionales
específicos de MTT1, por ejemplo, producidos recombinantemente como
se describe anteriormente. Por ejemplo, puede utilizarse un dominio
de dimerización de MTT12 marcado para cribar bibliotecas, como se
describe en las referencias anteriores, para moléculas pequeñas que
inhibirán la dimerización de MTT12.
La invención proporciona también un
procedimiento para detectar cofactores o inhibidores novedosos que
se unen a MTT1, que comprende poner en contacto una muestra que
comprende MTT1 con composiciones de ensayo y medir el cambio en la
NMRD después de la administración de la composición de ensayo. La
proteína MTT1 de la presente invención es útil en un procedimiento
de cribado para identificar compuestos de ensayo novedosos o
composiciones de ensayo novedosas que afectan a la NMRD a través de
MTT1. Por tanto, en otra realización, la invención proporciona un
procedimiento para cribar composiciones de ensayo que comprende
incubar los componentes que incluyen la composición de ensayo y
MTT1 en condiciones suficientes para permitir que los componentes
interaccionen, y después medir posteriormente el efecto que tiene la
composición de ensayo sobre la NMRD en una célula de ensayo. El
efecto observado sobre la NMD entre MTT1 y una composición puede ser
agonista o antagonista. Preferiblemente, el polipéptido que
codifica MTT1 es el polipéptido o un péptido sintético que tiene la
actividad biológica de la proteína MTT1.
Debido a que MTT1 está estrechamente relacionada
con la familia UPF1 en levadura, el término "sonda específica de
MTT1", en el contexto de esta invención, designa sondas que se
unen a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos MTT1, o a
secuencias complementarias de las mismas, en una medida
detectablemente mayor que a ácidos nucleicos que codifican
secuencias de UPF1, o a secuencias complementarias de las mismas. El
término "sonda específica de MTT1" incluye por tanto sondas
que pueden unirse a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos MTT1
(o a secuencias complementarias de los mismos) pero no a ácidos
nucleicos que codifican secuencias PF (o a secuencia
complementarias de los mismos) en una medida apreciable.
La invención facilita la producción de sondas de
ácido nucleico específicas de MTT1. Los procedimientos para obtener
dichas sondas pueden diseñarse basándose en los alineamientos de
secuencia de aminoácido mostrados en la Figura 1. Las sondas, que
pueden contener al menos 9, por ejemplo, al menos 12, 15, 25, 35,
50, 100 ó 150 nucleótidos, pueden producirse utilizando cualquiera
de varios procedimientos convencionales (véase, por ejemplo,
Ausubel y col., mencionado anteriormente). Por ejemplo,
preferiblemente las sondas se generan utilizando procedimientos de
amplificación por PCR tales como los descritos a continuación. En
estos procedimientos, se diseñan cebadores que corresponden a
secuencias de MTT1 que pueden incluir aminoácidos específicos de
MTT1, y el producto de PCR resultante se utiliza como sonda para
cribar una biblioteca de ácido nucleico tal como una biblioteca
de
ADNc.
ADNc.
Las sondas de ácido nucleico específicas de MTT1
pueden marcarse con un compuesto que facilita la detección de la
unión al ácido nucleico de MTT1 en la muestra. Por ejemplo, la
muestra puede contener nucleótidos biotinilados a los que pueden
unirse conjugados de avidina marcados detectablemente (por ejemplo,
avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante). Pueden
utilizarse también sondas de ácido nucleico radiomarcado. Estas
sondas pueden utilizarse en ensayos de hibridación de ácidos
nucleicos para detectar niveles alterados de MTT1 en una muestra.
Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos de hibridación in
situ, protección de ARNasa y transferencia Northern. Otros
procedimientos de detección de ácido nucleico convencionales que
pueden utilizarse en la invención son conocidos por los expertos en
la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel y col., mencionado
anteriormente). Además, cuando la molécula de diagnóstico es un
ácido nucleico, puede amplificarse antes de la unión con una sonda
específica de MTT1. Preferiblemente se utiliza PCR, pero pueden
utilizarse otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico
tales como los procedimientos de reacción en cadena con ligasa
(LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en
secuencia de ácido nucleico (NASBA).
Puede realizarse un procedimiento para
determinar si un agente o composición de ensayo modula el complejo
en una célula (i) proporcionando una célula que tiene el complejo;
(ii) poniendo en contacto la célula con un agente o composición de
ensayo que, en ausencia del agente o composición de ensayo, activa
el complejo en la célula; y (iii) detectando un cambio en el
complejo de la célula. Una célula puede ponerse en contacto con el
agente o composición de ensayo simultánea o secuencialmente. Un
aumento del complejo indica que el agente o composición de ensayo
es un agonista del complejo, mientras que una reducción del complejo
indica que el agente o composición de ensayo es un antagonista del
complejo. Si se desea, puede utilizarse el procedimiento
anteriormente descrito para identificar moduladores del complejo
para identificar composiciones, cofactores u otras composiciones
dentro de la ruta del complejo que comprendan el complejo para uso
en este aspecto de la invención. Puede utilizarse cualquier agente
o composición como agente o composición de ensayo en la práctica de
la invención; un agente o composición de ensayo preferido incluye
polipéptidos y agentes orgánicos pequeños o composiciones. Aunque
la homología de secuencia o estructural pueden proporcionar una base
para sospechar que un agente o composición de ensayo puede modular
el complejo en una célula, también son adecuados agentes o
composiciones de ensayo elegidos aleatoriamente para uso en la
invención. Pueden utilizarse procedimientos conocidos en la técnica
para generar aleatoriamente un agente o composición (por ejemplo, la
expresión de polipéptidos a partir de bibliotecas de ácido
nucleico) para producir agentes o composiciones de ensayo adecuados.
Los expertos en la técnica reconocerán que pueden utilizarse
técnicas alternativas en lugar de las técnicas particulares
descritas en la presente memoria.
Un procedimiento para detectar cofactores o
inhibidores novedosos que se unen al complejo comprende poner en
contacto una muestra que comprende el complejo con composiciones de
ensayo y medir el cambio en el complejo después de la
administración de la composición de ensayo. El complejo de la
presente invención es útil en un procedimiento de cribado para
identificar compuestos de ensayo novedosos o composiciones de ensayo
novedosas que afecten al complejo. Por tanto, la invención incluye
un procedimiento para cribar composiciones de ensayo que comprende
incubar los componentes, que incluyen la composición de ensayo y el
complejo, en condiciones suficientes para permitir que los
componentes interaccionen y después medir posteriormente el efecto
que tiene la composición de ensayo sobre el complejo en una célula
de ensayo. El efecto observado sobre el complejo y una composición
puede ser agonista o antagonista.
Esta invención proporciona un procedimiento de
modulación de la actividad peptidiltransferasa durante la
traducción, que comprende poner en contacto una célula con el
complejo en una cantidad eficaz para facilitar la terminación de la
traducción, modulando así la actividad peptidiltransferasa. Un
procedimiento de modulación de la actividad peptidiltransferasa
durante la traducción puede comprender poner en contacto una célula
con el agente en una cantidad suficiente para suprimir la
terminación de la traducción terminadora, modulando así la actividad
peptidiltransferasa. La actividad peptidiltransferasa durante la
traducción aparece durante la iniciación, elongación, terminación y
degradación del ARNm.
Un procedimiento de modulación de la eficacia de
la terminación de la traducción de ARNm en un codón terminador y/o
de la promoción de la degradación de transcritos aberrantes puede
comprender poner en contacto una célula con el agente en una
cantidad eficaz para inhibir la unión de Mtt1 y eRF3, modulando así
la eficacia de la terminación de la traducción de ARNm en un codón
terminador y/o promoviendo la degradación de transcritos
aberrantes.
Un procedimiento de modulación de la eficacia de
la terminación de la traducción de ARNm en un codón terminador y/o
de la promoción de la degradación de transcritos aberrantes puede
comprender poner en contacto una célula con un agente que inhibe la
actividad ATPasa/helicasa de MTT1, modulando así la eficacia de la
terminación de la traducción de ARNm en un codón terminador y/o
promoviendo la degradación de transcritos aberrantes.
Un procedimiento de modulación de la eficacia de
la terminación de la traducción de ARNm en un codón terminador y/o
de la promoción de la degradación de transcritos aberrantes puede
comprender poner en contacto una célula con un agente que inhibe la
actividad ATPasa/helicasa de MTT1 en eRF3, modulando así la eficacia
de la terminación de la traducción de ARNm en un codón terminador
y/o promoviendo la degradación de transcritos aberrantes.
Como se define en la presente memoria,
"modulación" de la fidelidad de la traducción significa alterar
la actividad del aparato traduccional para aumentar o reducir la
fidelidad de la reacción sin inhibir completamente el proceso. Por
ejemplo, modular el proceso de terminación de la traducción en un
codón terminador aparece como consecuencia de alterar la capacidad
de los factores de liberación de la traducción en el codón de
terminación de promover la liberación de peptidilo cuando están en
competencia con ARNt análogos cercanos. El resultado final sería
que el ARNt análogo cercano se incorpora a la cadena polipeptídica y
se suprime la terminación. Puesto que la mayoría de las proteínas
sólo tienen que estar expresadas de 5 a 20% de los niveles de tipo
natural, la terminación de la traducción no tiene que estar
inhibida. Se necesita modular el proceso de terminación de tal modo
que sea menos eficaz en una pequeña cantidad.
Pueden seleccionarse para ensayar agentes que
interfieren con la actividad NTPasa tales como la actividad ATPasa,
GTPasa, helicasa o configuración de motivo de dedo de cinc. Dichos
agentes pueden ser fármacos útiles para tratar infecciones víricas,
puesto que muchos retrovirus, especialmente VIH, coronavirus y otros
virus de ARN están asociados a patologías médicas y veterinarias.
Al proporcionar la identidad de proteínas que modulan los eventos
de desplazamiento del marco de lectura, un cribado inicial de
agentes puede incluir un ensayo de unión a dichas proteínas. Este
ensayo puede emplearse para ensayar la eficacia de agentes sobre la
actividad de proteínas asociadas al desplazamiento del marco de
lectura en seres humanos así como levadura u otra fuente no humana
incluyendo, pero sin limitación, animales.
Por ejemplo, la identificación de agentes que
inhiben la ruta de descomposición, estabilizan los transcritos
terminadores o modulan la eficacia de la terminación de la
traducción es importante para el éxito de la tecnología de ARN
antisentido. Los ARN antisentido son transcritos pequeños,
difusibles, no traducidos y altamente estructurados que se aparean
con ARN diana específicos en regiones de complementariedad,
controlando así la función o expresión de ARN diana. Sin embargo,
los intentos de aplicar tecnología de ARN antisentido han encontrado
un éxito limitado. El factor limitante parece ser conseguir
suficientes concentraciones del ARN antisentido en una célula para
inhibir o reducir la expresión del gen diana. Es probable que sea un
impedimento para conseguir suficiente concentración la ruta de
descomposición por mutaciones terminadoras, puesto que los cortos
transcritos de ARN antisentido, que no se pretende que codifiquen
un producto génico, conducirán probablemente a una rápida
terminación de la traducción si aparece traducción, y en
consecuencia a una rápida degradación y baja abundancia del ARN
antisentido en la célula. Por tanto, los agentes de la invención que
estabilizan transcritos de ARNm aberrante pueden estabilizar
también ARN antisentido.
Esta invención proporciona un procedimiento de
modulación de la eficacia de la terminación de la traducción de
ARNm y/o de la degradación de transcritos aberrantes en una célula,
comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una célula que
contiene un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el
complejo; o un ácido nucleico antisentido del mismo; b)
sobreexpresar dicho vector de ácido nucleico en dicha célula para
producir un complejo sobreexpresado de modo que interfiera con o
inhiba la función del complejo.
Un procedimiento para determinar si un sujeto
porta una mutación en el gen MTT1 puede comprender: a) obtener una
muestra de ácido nucleico apropiada del sujeto; y (b) determinar si
la muestra de ácido nucleico de la etapa (a) es, o deriva de, un
ácido nucleico que codifica MTT1 mutante, de modo que se determine
así si un sujeto porta una mutación en el gen MTT1. La muestra de
ácido nucleico en la etapa (a) puede comprender ARNm
correspondiente al transcrito de ADN que codifica una MTT1 mutante,
y en la que la determinación de la etapa (b) comprende: (i) poner
en contacto el ARNm con el oligonucleótido en condiciones que
permitan la unión del ARNm al oligonucleótido de modo que se forme
un complejo; (ii) aislar el complejo así formado; y (iii)
identificar el ARNm en el complejo aislado de modo que se determine
así si el ARNm es, o deriva de, un ácido nucleico que codifica MTT1
mutante. La determinación de la etapa (b) puede comprender: (i)
poner en contacto la muestra de ácido nucleico de la etapa (a) y el
ácido nucleico aislado con enzimas de restricción en condiciones que
permitan la digestión de la muestra de ácido nucleico, y el ácido
nucleico aislado, en segmentos distintos distinguibles de ácido
nucleico; (ii) aislar los segmentos de ácido nucleico; y (iii)
comparar lo segmentos de ácido nucleico derivados de la muestra de
ácido nucleico con los segmentos de ácido nucleico derivados del
ácido nucleico aislado de modo que se determine así si la muestra de
ácido nucleico es, o deriva de, un ácido nucleico que codifica MTT1
mutante.
Se describe un mamífero no humano transgénico
que comprende al menos una porción de ácido nucleico que codifica
el gen MTT1 y Upflp introducida en el mamífero en una etapa
embrionaria. Los procedimientos de producción de un mamífero no
humano transgénico son conocidos por los expertos en la técnica.
Un procedimiento de detección de un trastorno
asociado a la expresión de mtt1 puede comprender poner en contacto
una muestra de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un
trastorno con un reactivo que detecta la expresión de mtt1 y
detecta la unión del reactivo a la muestra.
Esta invención proporciona un procedimiento para
identificar un estado patológico que implica un defecto en el
complejo de la reivindicación 5 que comprende: (a) transfectar una
célula con un ácido nucleico que codifica el complejo; (b)
determinar la proporción del complejo defectivo de la célula después
de la transfección; (c) comparar la proporción de complejo
defectivo de la célula después de la transfección con la proporción
de complejo defectivo de la célula antes de la transfección.
Como se observa anteriormente, la descomposición
de ARNm mediada por mutaciones terminadoras conduce a deficiencias
celulares de proteínas esenciales y por tanto a la enfermedad. El
control alterado de la estabilidad de ARNm normales puede tener
consecuencias comparativamente extremas.
Esta invención permite el tratamiento de una
enfermedad asociada a la actividad peptidiltransferasa, que
comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente
eficaz de una composición farmacéutica que comprende el complejo de
la reivindicación 5 o los agentes que modulan o estimulan el
complejo, y un portador o diluyente farmacéutico, tratando así al
sujeto.
Las mutaciones terminadoras causan
aproximadamente un 20-40% de las causas individuales
de más de 240 enfermedades hereditarias diferentes (incluyendo
fibrosis quística, hemofilia, hipercolesterolemia familiar,
retinitis pigmentosa, distrofia muscular de Duchenne y síndrome de
Marfan). Para muchas enfermedades en las que sólo se produce un 1%
de la proteína funcional, los pacientes sufren síntomas patológicos
graves, mientras que impulsar la expresión a sólo un 5% de los
niveles normales puede reducir en gran medida la gravedad o eliminar
la enfermedad. Además, un número notablemente grande de las formas
más comunes de cánceres de colon, mama, esofágico, de pulmón,
cabeza y cuello y vejiga son el resultado del desplazamiento del
marco de lectura y mutaciones terminadoras en genes reguladores
(concretamente, p53, BRCA1, BRCA2, etc.). Corregir las mutaciones
terminadoras en los genes reguladores para permitir la síntesis de
las respectivas proteínas debería causar la muerte de las
células
cancerosas.
cancerosas.
Un gran número de observaciones apuntan a un
papel importante de la síntesis de proteína en la fidelidad de la
terminación de la traducción y el proceso de descomposición de ARNm.
De hecho, parece que estos dos procesos han coevolucionado y que
los factores esenciales para un proceso funcionan también en el
otro. La evidencia de esta relación incluye experimentos que
demuestran que: a) los fármacos o mutaciones que interfieren con la
elongación de la traducción promueven la estabilización de ARNm, b)
los elementos de secuencia que rigen una descomposición rápida de
ARNm pueden localizarse en regiones de codificación de ARNm y la
actividad de dichos elementos depende de su traducción, c) los
factores de degradación pueden estar asociados a ribosoma, y d) la
terminación prematura de la traducción puede potenciar las
velocidades de descomposición de ARNm.
Puesto que la cantidad de una proteína
particular sintetizada en un tiempo dado depende de la concentración
celular de su ARNm, se sigue que la regulación de las velocidades
de degradación de ARNm proporciona un potente medio de controlar la
expresión génica. En células de mamífero, las velocidades de
descomposición de ARNm (expresadas como semividas) pueden ser tan
cortas como de 15-30 minutos o tan largas como de
500 horas. Obviamente, dichas diferencias en las velocidades de
degradación de ARNm pueden conducir a diferencias de hasta 1.000
veces en el nivel de proteínas específicas. Se proporciona un nivel
adicional de control por la observación de que las velocidades de
descomposición para ARNm individuales no tienen que fijarse, sino
que pueden regularse como consecuencia de mecanismos de
realimentación autogénica, la presencia de hormonas específicas, una
etapa de particular de diferenciación o del ciclo celular, o
infección vírica.
Quizás los mejores ejemplos de integración de la
traducción y descomposición de ARNm son estudios que documentan las
consecuencias de la terminación prematura de la traducción. Ésta
aparece cuando la deleción, sustitución de bases o mutaciones de
desplazamiento del marco de lectura en el ADN conducen a la síntesis
de un ARNm que contiene un codón de terminación inapropiado (codón
terminador) dentro de su región de codificación de proteína. La
aparición de dicho codón de terminación prematura detiene la
traducción en el sitio de terminación temprana y causa la síntesis
de una proteína truncada. Independientemente de sus velocidades de
descomposición "normales", los ARNm transcritos a partir de
genes que albergan mutaciones terminadoras (denominados "ARNm que
contienen mutaciones terminadoras") se degradan muy rápidamente.
Dicha "descomposición de ARNm mediada por mutaciones
terminadoras" es ubicua, concretamente, se ha observado en todos
los organismos ensayados y conduce a una reducción de hasta 10 a
100 veces en la abundancia de ARNm específicos. La combinación de
abundancia de ARNm gravemente reducida y traducción terminada
prematuramente causa reducciones en el nivel global de expresión de
genes específicos que son tan drásticas como las consecuencias de la
deleción génica. La importancia de la descomposición de ARNm
mediada por mutaciones terminadoras para la salud humana está
ilustrada por la identificación de un número creciente de
enfermedades hereditarias en las que las mutaciones terminadoras
causan el estado patológico y en las que se ha mostrado que los
ARNm respectivos son sustratos de la ruta de descomposición del
ARNm mediada por mutaciones terminadoras.
Es un punto importante que la inactivación de la
ruta de descomposición del ARNm mediada por mutaciones terminadoras
puede conseguirse sin impedir el crecimiento celular, y conduce a la
restauración de los niveles normales y velocidades de
descomposición normales para ARNm que contienen mutaciones
terminadoras. Más significativamente, los experimentos en levadura
(y otros) demuestran que, aunque un ARNm puede seguir conteniendo un
codón terminador, la inactivación de esta ruta de descomposición
permite sintetizar suficiente proteína funcional para que las
células puedan superar el defecto genético original. Por tanto, es
posible tratar enfermedades causadas por mutaciones terminadoras
mediante la regulación negativa de la ruta de descomposición del
ARNm mediada por mutaciones terminadoras.
Las enfermedades, proteínas o genes que son el
resultado de mutaciones terminadoras o de desplazamiento del marco
de lectura incluyen, pero sin limitación, los siguientes: locus de
hemoglobina beta, regulador de la conductancia transmembrana en
fibrosis quística, distrofia muscular pseudohipertrófica progresiva
de tipos Duchenne y Becker, receptor de insulina de fenilcetonuria,
hemofilia A, poliposis adenomatosa del colon, hipercolesterolemia
familiar, neurofibromatosis de tipo I, hemofilia B,
hiperlipoproteinemia de tipo I, enfermedad de
Tay-Sachs, cáncer de mama de tipo 1, hiperplasia
suprarrenal, enfermedad de Von Willebrand, mucopolisacaridosis de
tipo I, albinismo I, enfermedad del riñón poliquístico 1,
deficiencia de ornitina aminotransferasa, angioqueratoma, neoplasia
endocrina múltiple difusa de tipo 1, región Y determinante del sexo,
miembro 1 intercambiador de aniones de la familia de portadores de
soluto 4, cadena alfa-1 de colágeno de tipo I,
hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa 1, glucoquinasa,
proteína p53 tumoral, proteína proteolipídica, mielina, receptor de
hormona de crecimiento, receptor de hormona
luteinizante/coriogonadotropina, apolipoproteína A-I
de lipoproteína de alta densidad,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
hiperamonemia por deficiencia de ornitina transcarbamilasa,
xeroderma pigmentoso I, gen homeótico de secuencia apareada 6,
síndrome de von Hippel-Lindau, inhibidor 2A de
quinasa dependiente de ciclina, esclerosis tuberosa 2, tirosinemia,
enfermedad de Norrie de tipo I, fosfodiesterasa 6B,
palmitoil-proteína tioesterasa, apolipoproteína B,
tirosina quinasa de agammaglobulinemia de Bruton, hipoplasia
suprarrenal, familia 5 de portador de soluto,
5,10-metilentetrahidrofolato reductasa, tumor de
Wilms, riñones poliquísticos, factor de transcripción 14, factor
nuclear hepático, mucopolisacaridosis de tipo II, deficiencia de
proteína C, enfermedad trombótica congénita debida a
neurofibromatosis de tipo II, adrenoleucodistrofia,
alfa-1 de colágeno de tipo VII, alfa 1 de colágeno
de tipo X, locus 2 de alfa-hemoglobina, enfermedad
de almacenamiento de glucógeno VII, intolerancia a la fructosa,
cáncer de mama 2 de inicio temprano, BRCA2, fucosiltransferasa 2,
síndrome de Hermansky-Pudlak, tiroglobulina,
retinoblastoma, síndrome de Wiskott-Aldrich,
rodopsina, colágeno de tipo XVII, receptor colinérgico, canal
accionado por nucleótido cíclico, fotorreceptor, polipéptido épsilon
de receptor nicotínico colinérgico accionado por GMPc, gen
activador de recombinación 1, displasia campomélica,
inmunodeficiencia con IgM aumentada, protooncogén RET,
mucopolisacaridosis RET de tipo IVA, receptor de leptina,
esferocitosis hereditaria, arginina vasopresina, deficiencia de
apolipoproteína C-II de tipo I, hiperlipoproteinemia
debida a fibrosis quística, enfermedad de Wilson, leptina, edema
angioneurótico, canal cloruro 5, disgénesis gonádica, porfiria
aguda intermitente, hemoglobina gamma A, enfermedad de Krabbe,
enfermedad de almacenamiento de glucógeno V, leucodistrofia
metacromática tardía-infantil, síndrome de plaquetas
gigantes, receptor de vitamina D, sarcoglicano delta, TWIST de
Drosophila, enfermedad de Alzheimer, osteopetrosis con acidosis
tubular renal, amelogénesis imperfecta 1, dominio POU de tipo
hipoplásico, factor de transcripción 1 de clase 1, diabetes
mellitus, homólogo de oncogén vírico de sarcoma felino 4 de
Hardy-Zuckerman v-Kit autosómico
dominante, locus delta de hemoglobina, adenina
fosforribosiltransferasa, homólogo de fosfatasa y tensina, hormona
de crecimiento 1, catepsina K, síndrome de Werner, enfermedad de
Niemann-Pick, receptor de hormona liberadora de
hormona de crecimiento, ceruloplasmina, receptor de factor 3
estimulante de colonias, proteína 22 de mielina periférica de
granulocito, fucosidosis, exostosis múltiple de tipo II, anemia de
Fanconi, grupo C de complemento,
ataxia-telangectasia, cadherina 1, miembro 2 de la
familia 2 de portador de soluto, familia A1 de
UDP-glucuronosiltransferasa 1, esclerosis tuberosa
1, gamma 2 de laminina, cistatina B, enfermedad del riñón
poliquístico 2, proteína de transferencia de triglicéridos
microsómicos de 88 kDa, displasia diastrófica, monooxigenasa que
contiene flavina 3, enfermedad de almacenamiento de glucógeno III,
factor de transcripción 4 de clase 3 del dominio POU, subfamilia
IID de citocromo P450, porfiria congénita eritropoyética, ATPasa,
polipéptido alfa de transporte de Cu(2+), cáncer de colon
familiar sin poliposis de tipo 1, fosforilasa quinasa, subunidad
alfa-1 de elastina (muscular), enfermedad de
Canavan, gen de escisión-reparación complementario
defectivo en hámster chino 5, quinasa Janus 3, proteína reguladora
aguda esteroidogénica, fucosiltransferasa 6, glaucoma 1 de ángulo
abierto, exostosis múltiple de tipo I, miocilina, agranulocitosis
genética infantil, receptor de eritropoyetina, supervivencia de
neurona motora 1, homólogo de Drosophila de Hedgehog Sonic
telomérico, lecitina, deficiencia de colesterol aciltransferasa,
segregación postmeiótica aumentada (S. cerevisiae) 1, grupo 6
de deficiencia de reparación en roedor de complemento cruzado de
escisión-reparación, enfermedad de la orina con olor
a jarabe de arce, antígeno de apoptosis 1, factor de transcripción
1, ligasa E3A de proteína ubiquitina hepática, transglutaminasa 1,
miosina VIIIA, proteína de unión comunicante BETA-1
de 32 kDa, factor de transcripción 2, proteína 4.2 hepática
eritrocítica, cadena beta de hormona estimulante de tiroides,
síndrome de
Treacher-Collins-Franceschetti 1,
coroideremia, fibroelastosis endocardiaca 2, enfermedad de Cowden,
hormona anti-mulleriana, secuencia SRY 10,
deficiencia de PTA, proteína 1 relacionada con tirosinasa, subunidad
beta de fosforilasa quinasa, serina/treonina proteína quinasa 11,
fosfolipasa A2 de grupo IIA, gen de
escisión-reparación complementario defectivo en
hámster chino 3, hiperplasia suprarrenal II, cadena
alfa-4 de colágeno de tipo IV, trombastenia de
Glanzmann y Naegeli, proteína de 65 kDa específica de epitelio de
pigmento retinal, A13 de homeosecuencia, polipéptido grande L3 de
calpaína, alfa-2 de laminina de xantinuria,
subfamilia XIX de citocromo P450, mucopolisacaridosis de tipo VI,
lipofuscinosis neuronal ceroidea 3, citrulinemia juvenil, epilepsia
mioclónica de Unverricht y Lundborg, fosforilasa quinasa de
testículos/hígado, gamma 2 del miembro 1 de la familia 3 de
portadores de soluto,
pterina-4-alfa-carbinolamina
deshidratasa, albinismo ocular de tipo 1, epilepsia por
leprechaunismo, enfermedad osteopetrosis de Hirschsprung neonatal
benigna, activador 1 de proteína p21 RAS recesiva autosómica,
mucopolisacaridosis de tipo VII, síndrome de
Chediak-Higashi, miembro 1 de la subfamilia J de
canal de potasio rectificador de entrada, placofilina 1, factor
activador de plaquetas, subunidad alfa de la isoforma 1B de
acetilhidrolasa, plectina 1, transactivador de MHC de clase II de
baja estatura, hipofosfatemia, raquitismo resistente a vitamina D,
factor de transcripción 1 de homeosecuencia relacionado con bicoide
RIEG, distrofia muscular de las cinturas escapohumeral o pélvica de
tipo 2E, retinitis pigmentosa 3, homólogo 3 de MutS en E.
coli, deficiencia de tirosina transaminasa, síndrome
oculocerebrorrenal de Lowe, nefronoftisis familiar juvenil 1 con
xantismo, síndrome de lisencefalia de Miller-Dieker
ligado a X visceral heterotáxico, deficiencia de properdina,
3-oxoácido CoA transferasa ligada a X, síndrome de
Waardenburg-Shah, distrofia muscular de las cinturas
escapohumeral o pélvica de tipo 2, síndrome de Alport, enfermedad
de almacenamiento de glucógeno recesiva autosómica IV, diabetes
mellitus autosómica dominante, miembro 1 de la familia 2 de
portadores de soluto de tipo II, síndrome de
mano-pie-útero, cistinosis de inicio temprano o
infantil de tipo nefropático, síndrome de
Crigler-Najjar, factor de crecimiento similar a
insulina 1, lactato deshidrogenasa A, síndrome de Stickler,
amaurosis congénita de Leber de tipo II,
alfa-galactosidasa B, hiperplasia suprarrenal I,
síndrome de Li-Fraumeni, miembro 1 de la familia 12
de portadores de soluto, síndrome de
Klein-Waardenburg, factor 7 de biogénesis de
peroxisoma, gen 8 homeótico de secuencia apareada, retinosquisis,
receptor 2C de 5-hidroxitriptamina, urato oxidasa,
síndrome de Peutz-Jeghers, prolapso de válvula
mitral, melanoma cutáneo maligno familiar 2, fucosiltransferasa 1,
picnodisostosis, mucopolisacaridosis de tipo IIIB,
P-glicoproteína 3, inmunodeficiencia combinada
grave, retinitis pigmentosa negativa de células B, polipéptido 3 de
90 KDa de proteína quinasa S6 ribosómica, deficiencia de factor
ligado a X, homólogo 4 de Drosophila de "Mothers against
decapentaplegic", factor de complemento,
deshidrogenasa/delta-isomerasa de tipo I que
conduce a fijación de estribo, AQP1 1, colestasis progresiva
familiar intrahepática de tipo III, monofosfato desaminasa 1,
factor de transcripción 1 de homeosecuencia.
Esta invención proporciona procedimientos para
cribar fármacos que actúan como productos terapéuticos que tratan
enfermedades causadas por mutaciones terminadoras y de
desplazamiento del marco de lectura mediante ensayos bioquímicos e
in vitro que controlan la actividad de unión de ATP, la
actividad ATPasa, la actividad ARN helicasa, la unión de GTP, la
actividad GTPasa, los factores de liberación o la unión de ARN al
complejo o entre sí (concretamente, MTT1 a eRF3); desarrollando
ensayos capaces de cuantificar la actividad del producto génico
humano en la descomposición de ARNm y la supresión traduccional y
cribando compuestos utilizando los ensayos anteriormente citados.
Los experimentos dados a conocer en la presente memoria han mostrado
que al antagonizar/agonizar la actividad del complejo de factores,
las proteínas del complejo pueden superar los efectos de otro modo
letales de las mutaciones terminadoras en genes esenciales y han
establecido la levadura como un sistema modelo para el desarrollo
de fármacos por el que pueden obtenerse agentes o compuestos
humanos.
Esta invención proporciona un procedimiento para
identificar un estado patológico que implica un complejo proteico
defectivo que comprende: (a) transfectar una célula con un ácido
nucleico que codifica el complejo proteico; (b) determinar la
proporción del complejo proteico defectivo de la célula después de
la transfección; (c) comparar la proporción del complejo proteico
defectivo de la célula después de la transfección con la proporción
del complejo proteico defectivo de la célula antes de la
transfección.
Un procedimiento para identificar un estado
patológico que implica proteínas multiméricas defectivas comprende:
(a) transfectar una célula con el vector como se describe
anteriormente en la presente memoria; (b) determinar la proporción
de proteínas multiméricas defectivas de la célula después de la
transfección; (c) comparar la proporción de proteínas multiméricas
defectivas de la célula después de la transfección con la proporción
de proteínas multiméricas defectivas de la célula antes de la
transfección.
Un procedimiento de identificación de genes que
están implicados en la modulación de la terminación de la
traducción comprende: a) aislar un gen de interés; y b) determinar
si el gen de interés comprende los motivos I-IX, en
el que si el gen comprende alguno de los nueve motivos, el gen
modula la terminación de la traducción. El motivo I puede
comprender la secuencia: GppGTKTxT-X(n).
El motivo II puede comprender la secuencia
riLxcaSNxAvDxl-X(n). El motivo III puede
comprender la secuencia
vviDExx-QaxxxxxiPi-X(n). El
motivo IV puede comprender la secuencia
xxilaGDxxQLp-X(n). El motivo V puede
comprende la secuencia IxxSLFerv-X(n). El
motivo VI puede comprender la secuencia
LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n). El motivo VII
puede comprender la secuencia
IgvitPYxxQvxxl-X(n). El motivo VIII puede
comprender la secuencia
vevxtVDxFQGreKdxlilScVR-X(n). El motivo IX
puede comprender la secuencia iGFLxdxRRINValTRak. Las letras
mayúsculas representan una posición en la secuencia primaria cuyo
residuo de aminoácido específico está muy altamente conservado entre
los miembros de este grupo. Las letras minúsculas representan una
posición en la secuencia primaria cuyas propiedades químicas están
conservadas pero no necesariamente la identidad exacta.
Existen varios procedimientos que pueden
utilizarse para detectar la variación de secuencia de ADN. La
secuenciación directa de ADN, secuenciación manual o secuenciación
fluorescente automatizada pueden detectar la variación de
secuencia. Para un gen tan grande como MTT1, la secuenciación manual
es muy intensiva de mano de obra, pero en condiciones óptimas las
mutaciones en la secuencia de codificación de un gen raramente se
omiten. Otro enfoque es el ensayo de polimorfismo de conformación
monocatenaria (SSCA) (Orita y col., 1989). Este procedimiento no
detecta todos los cambios de secuencia, especialmente si el tamaño
del fragmento de ADN es mayor de 200 pb, pero puede optimizarse
para detectar la mayoría de la variación de secuencia de ADN. La
sensibilidad de detección reducida es una desventaja, pero el
rendimiento aumentado posible con SSCA la hace una alternativa
viable atractiva a la secuenciación directa para la detección de
mutaciones en investigación. Los fragmentos que han cambiado la
movilidad en geles SSCA se secuencian después para determinar la
naturaleza exacta de la variación de secuencia de ADN. Otros
enfoques basados en la detección de desapareamientos entre las dos
cadenas de ADN complementario incluyen electroforesis en gel
desnaturalizante inmovilizado (CDGE) (Sheffiled y col., 1991),
análisis de heterodúplex (HA) (White y col., 1992) y escisión de
desapareamiento químico (CMC) (Grompe y col., 1989). Ninguno de los
procedimientos descritos anteriormente detectará grandes deleciones,
duplicaciones o inserciones, ni detectará una mutación reguladora
que afecte a la transcripción o traducción de la proteína. Otros
procedimientos que podrían detectar estas clases de mutaciones,
tales como un ensayo de truncamiento de proteína o el ensayo
asimétrico, detectan sólo tipos específicos de mutaciones y no
detectarían las mutaciones terminadoras. Puede encontrarse una
revisión de los procedimientos actualmente disponibles de detección
de la variación de secuencia de ADN en una reciente revisión de
Grompe (1993). Una vez es conocida una mutación, puede utilizarse
un enfoque de detección específica de alelo, tal como hibridación de
oligonucleótido específica de alelo (ASO), para cribar rápidamente
en grandes números de otras muestras la misma mutación.
Puede realizarse un análisis preliminar rápido
para detectar polimorfismos en secuencias de ADN observando en una
serie de transferencias Southern de cortes de ADN con una o más
enzimas de restricción, preferiblemente con un gran número de
enzimas de restricción. Cada transferencia contiene una serie de
individuos normales y una serie de tumores. Las transferencias
Southern que exhiben fragmentos de hibridación (que difieren en
longitud del ADN de control cuando se sondean con secuencias
cercanas o que incluyen el gen MTT1) indican una posible mutación.
Si se utilizan enzimas de restricción que producen fragmentos de
restricción muy grandes, entonces se emplea la electroforesis en
gel de campo pulsado (PFGE).
La detección de mutaciones puntuales puede
conseguirse mediante clonación molecular de alelo(s) de MTT1
y secuenciación de(de los) alelo(s) utilizando
técnicas bien conocidas en la técnica. Como alternativa, las
secuencias génicas pueden amplificarse directamente a partir de una
preparación de ADN genómico a partir del tejido tumoral utilizando
técnicas conocidas. Puede determinarse entonces la secuencia de ADN
de las secuencias amplificadas. Hay seis procedimientos bien
conocidos para un ensayo más completo, aunque todavía indirecto,
para conformar la presencia de un alelo de susceptibilidad: 1)
análisis de conformación monocatenaria (SSCA) (Orita y col., 1989);
2) electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE)
(Wartell y col., 1990; Sheffield y col., 1989); 3) ensayos de
protección de ARNasa (Finkelstein y col., 1990; Kinszleret y col.,
1991); 4) oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) (Conner y
col., 1983); 5) el uso de proteínas que reconocen desapareamientos
de nucleótidos tales como la proteína mutS de E. coli
(Modrich, 1991); y 6) PCR específica de alelo (Rano y Kidd, 1989).
Para PCR específica de alelo, se utilizan cebadores que hibridan en
sus extremos 3' con una mutación de MTT1 particular. Si la mutación
de MTT1 particular no está presente, no se observa producto de
amplificación. Puede utilizarse también el sistema de amplificación
de mutación refractaria (ARMS), como se da a conocer en la
solicitud de patente europea publicación nº 0332435 y en Newton y
col., 1989. Pueden detectarse también inserciones y deleciones de
genes mediante clonación, secuenciación y amplificación. Además,
pueden utilizarse sondas de polimorfismo de longitud de fragmento de
restricción (RFLP) para el gen o genes marcadores circundantes para
registrar la alteración de un alelo o una inserción en un fragmento
polimórfico. Dicho procedimiento es particularmente útil para
cribar en parientes de un individuo afectado la presencia de la
mutación MTT1 encontrada en ese individuo. Pueden utilizarse otras
técnicas para detectar inserciones y deleciones como se conocen en
la técnica.
De forma similar, pueden utilizarse sondas de
ADN para detectar desapareamientos mediante escisión enzimática o
química. Véanse, por ejemplo, Cotton y col., 1988; Shenk y col.,
1975; Novack y col., 1986. Como alternativa, pueden detectarse
desapareamientos mediante cambios de la movilidad electroforética de
dúplex desapareados respecto a dúplex apareados. Véase, por
ejemplo, Cariello, 1988. Con ribosondas o sondas de ADN, el ARNm o
ADN celular que puede contener una mutación puede amplificarse
utilizando PCR (véase a continuación) antes de la hibridación. Los
cambios en el ADN del gen MTT1 pueden detectarse también utilizando
hibridación Southern, especialmente si los cambios son grandes
redistribuciones tales como deleciones e inserciones.
Las secuencias de ADN del gen MTT1 que se han
amplificado mediante el uso de PCR pueden cribarse también
utilizando sondas específicas de alelo. Estas sondas son oligómeros
de ácido nucleico, cada una de los cuales contiene una región de la
secuencia del gen MTT1 que alberga una mutación conocida. Por
ejemplo, un oligómero puede ser de aproximadamente 30 nucleótidos
de longitud, correspondiente a una porción de la secuencia del gen
MTT1. Mediante el uso de una batería de dichas sondas específicas
de alelo, pueden cribarse los productos de amplificación de PCR
para identificar la presencia de una mutación previamente
identificada en el gen MTT1. La hibridación de sondas específicas
de alelo con secuencias de MTT1 amplificadas puede realizarse, por
ejemplo, sobre un filtro de nailon. La hibridación con una sonda
particular en condiciones de hibridación rigurosas indica la
presencia de la misma mutación en el tejido tumoral que en la sonda
específica de alelo.
La alteración de la expresión de ARNm de MTT1
puede detectarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica.
Éstas incluyen análisis de transferencia Northern, amplificación por
PCR y protección de ARNasa. La expresión reducida de ARNm indica
una alteración del gen MTT1 de tipo natural. La alteración de genes
MTT1 de tipo natural puede detectarse también mediante cribado de
la alteración de proteína MTT1 de tipo natural. Por ejemplo, pueden
utilizarse anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con MTT1 para
cribar un tejido. La falta de antígeno análogo indicaría una
mutación de MTT1. Los anticuerpos específicos de productos de alelos
mutantes podrían utilizarse también para detectar producto de gen
MTT1 mutante. Dichos ensayos inmunológicos pueden realizarse en
cualquier formato conveniente conocido en la técnica. Estos incluyen
transferencias Western, ensayos inmunohistoquímicos y ensayos
ELISA. Puede utilizarse cualquier medio para detectar una proteína
MTT1 alterada para detectar la alteración de genes MTT1 de tipo
natural. Pueden utilizarse ensayos funcionales tales como
determinaciones de la unión de proteína. Además, pueden utilizarse
ensayos que detectan la función bioquímica de MTT1. Encontrar un
producto del gen MTT1 mutante indica la alteración de un gen MTT1 de
tipo natural. Los genes MTT1 mutantes o productos génicos pueden
detectarse también en otras muestras del cuerpo humano tales como
suero, heces, orina y esputo.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender
polipéptidos MTT1 y fragmentos. Los polipéptidos homólogos pueden
ser fusiones entre dos o más secuencias polipeptídicas de MTT1 o
entre las secuencias de MTT1 y una proteína relacionada.
Igualmente, pueden construirse fusiones heterólogas que exhibirían
una combinación de propiedades o actividades de las proteínas
derivadas. Por ejemplo, la unión a ligando u otros dominios puede
"permutarse" entre diferentes nuevos polipéptidos de fusión o
fragmentos. Dichos polipéptidos de fusión homólogos o heterólogos
pueden presentar, por ejemplo, una resistencia o especificidad de
unión alterada. Los asociados de fusión incluyen inmunoglobulinas,
beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A,
beta-lactamasa, alfa-amilasa,
alcohol deshidrogenasa y el factor de apareamiento alfa de levadura.
Véase, por ejemplo, Godowski y col., 1988. Las proteínas de fusión
se prepararán típicamente mediante procedimientos de ácido nucleico
recombinante, como se describen a continuación, o pueden
sintetizarse químicamente. Las técnicas para la síntesis de
polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield, 1963.
Los ensayos de diagnóstico de la invención
pueden ser ensayos de ácido nucleico tales como ensayos de
hibridación de ácido nucleico y ensayos que detectan la
amplificación de ácido nucleico específico para detectar una
secuencia del ácido nucleico de MTT1 humano descrito en la presente
memoria.
Los medios aceptados para realizar ensayos de
hibridación son conocidos, y pueden obtenerse visiones de conjunto
generales de la tecnología a partir de una revisión de: "Nucleic
Acid Hybridization: A Practical Approach" [72]; "Hybridization
of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports" [41];
"Analytical Biochemistry" [4] e Innis y col., "PCR
Protocols" [74], mencionado anteriormente.
Pueden utilizarse sondas específicas de diana en
el diagnóstico de hibridación de ácido nucleico. Las sondas son
específicas o complementarias de la diana de interés. Para
diferenciaciones alélicas precisas, las sondas deberían ser de
aproximadamente 14 nucleótidos de longitud y preferiblemente de
aproximadamente 20-30 nucleótidos. Para una
detección más general del MTT1 humano de la invención, las sondas de
ácido nucleico son de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000
nucleótidos, lo más preferiblemente de aproximadamente 200 a
aproximadamente 400 nucleótidos.
La sonda de ácido nucleico específica puede ser
un polinucleótido u oligonucleótido de ARN o ADN, o sus análogos.
Las sondas pueden ser nucleótidos mono- o bicatenarios. Las sondas
de la invención pueden sintetizarse enzimáticamente utilizando
procedimientos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, traducción
de muesca, extensión de cebador, transcripción inversa, reacción en
cadena con polimerasa y otros) o químicamente (por ejemplo, mediante
procedimientos tales como el procedimiento de fosforamidita
descrito por Beaucage y Carruthers [19], o mediante el procedimiento
de triéster según Matteuci y col. [62]).
Es un medio alternativo para determinar la
presencia de MTT1 humana la hibridación in situ, o más
recientemente, la reacción en cadena con polimerasa in situ.
La PCR in situ se describe en Neuvo y col. [71]
"Intracellular localization of polymerase chain reaction
(PCR)-amplified Hepatitis C cDNA"; Bagasra y col.
[10], "Detection of Human Immunodeficiency virus type 1 provirus
in mononuclear cells by in situ polymerase chain
reaction"; y Heniford y col. [35], "Variation in cellular EGF
receptor mRNA expression demonstrated by in situ reverse
transcriptase polymerase chain reaction". Los ensayos de
hibridación in situ son bien conocidos y se describen
generalmente en Methods Enzymol. [67]. En una hibridación
in situ, las células se fijan a un soporte sólido,
típicamente un portaobjetos de vidrio. Después, se ponen en contacto
las células con una disolución de hibridación a una temperatura
moderada para permitir la asociación de sondas específicas de diana
que están marcadas. Las sondas están preferiblemente marcadas con
radioisótopos o indicadores fluorescentes.
Las sondas anteriormente descritas son también
útiles para hibridación in situ o para localizar tejidos que
expresen este gen, o en otros ensayos de hibridación para la
presencia de este gen o este ARNm en diversos tejidos biológicos.
La hibridación in situ es un procedimiento de localización
sensible que no depende de la expresión de antígenos o de
condiciones nativas frentes a desnaturalizadas.
Los ácidos nucleicos inhibidores pueden
dirigirse a ARNm. En este enfoque, los ácidos nucleicos se diseñan
para bloquear específicamente la traducción de la proteína
codificada. Utilizando este enfoque, el ácido nucleico inhibidor
puede utilizarse para suprimir selectivamente ciertas funciones
celulares mediante la inhibición de la traducción de ARNm que
codifica proteínas críticas. Por ejemplo, un ácido nucleico
inhibidor complementario de regiones de ARNm de
c-myc inhibe la expresión de la proteína
c-myc en una línea celular de leucemia
promielocítica, HL60, que sobreexpresa el protooncogén
c-myc. Veánse Wickstrom E.L. y col. [93] y
Harel-Bellan, A. y col. [31A]. Como se describe en
Helene y Toulme, se ha mostrado que los ácidos nucleicos inhibidores
que se dirigen a ARNm funcionan mediante varios mecanismos
diferentes para inhibir la traducción de la(s)
proteína(s) codificada(s).
En último lugar, pueden utilizarse ácidos
nucleicos inhibidores para inducir la inactivación química o
escisión de los genes diana o de ARNm. La inactivación química
puede aparecer mediante la inducción de reticulaciones entre el
ácido nucleico inhibidor y el ácido nucleico diana dentro de la
célula. Pueden utilizarse también otras modificaciones químicas de
los ácidos nucleicos diana inducidas por ácidos nucleicos
inhibidores apropiadamente derivatizados.
La escisión, y por lo tanto la inactivación, de
los ácidos nucleicos diana puede efectuarse mediante la unión de un
sustituyente al ácido nucleico inhibidor, que puede activarse para
inducir reacciones de escisión. El sustituyente puede ser uno que
efectúe una escisión química o enzimática. Como alternativa, la
escisión puede inducirse mediante el uso de ribozimas o ARN
catalítico. En este enfoque, los ácidos nucleicos inhibidores
comprenderían ARN de origen natural (ribozima) o ácidos nucleicos
sintéticos con actividad catalítica.
Esta invención proporciona también una molécula
antisentido capaz de hibridar específicamente con el ácido nucleico
aislado del gen MTT1. Esta invención proporciona un antagonista
capaz de bloquear la expresión del péptido o polipéptido codificado
por la molécula de ADN aislada. En una realización, el antagonista
es capaz de hibridar con una molécula de ADN bicatenaria. En otra
realización, el antagonista es un oligonucleótido triplex capaz de
hibridar con la molécula de ADN. En otra realización, el
oligonucleótido triplex es capaz de unirse al menos a una porción
de la molécula de ADN aislada con una secuencia nucleotídica.
La molécula antisentido puede ser ADN o ARN o
variantes de los mismos (concretamente, ADN o ARN con una cadena
principal proteica). La presente invención se extiende a la
preparación de nucleótidos antisentido y ribozimas que pueden
utilizarse para interferir con la expresión de proteínas de
reconocimiento de receptor en la traducción de un ARNm específico,
enmascarando el ARNm con un ácido nucleico antisentido o
escindiéndolo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas
de ADN o ARN que son complementarias de al menos una porción de una
molécula de ARNm específica. En la célula, hibridan con ese ARNm,
formando una molécula bicatenaria. La célula no traduce un ARNm en
esta forma bicatenaria. Por lo tanto, los ácidos nucleicos
antisentido interfieren con la expresión de ARNm en proteína.
Las secuencias nucleotídicas o polinucleotídicas
antisentido son útiles para evitar o reducir la expresión del gen
MTT1, como se apreciará por los expertos en la técnica. Por ejemplo,
los vectores polinucleotídicos que contienen todo o una porción del
gen MTT1 u otras secuencias de MTT1 (particularmente las que
flanquean al gen MTT1) pueden disponerse bajo el control de un
promotor en orientación antisentido e introducirse en una célula.
La expresión de dicho constructo antisentido dentro de una célula
interferirá con la transcripción y/o traducción y/o replicación de
MTT1. Los oligómeros de aproximadamente 15 nucleótidos y moléculas
que hibridan con el codón de iniciación AUG son particularmente
eficaces, puesto que son fáciles de sintetizar y es probable que
presenten menos problemas que moléculas más grandes tras la
introducción en células.
Un procedimiento para inhibir sustancialmente la
eficacia de la terminación de la traducción de ARNm y/o de la
degradación de transcritos aberrantes en una célula comprende: a)
proporcionar una célula que contiene el ADN; b) sobreexpresar dicho
ADN en dicha célula para producir un polipéptido sobreexpresado que
se une a MTT1 e interfiere con la función de MTT1.
Un procedimiento para inhibir sustancialmente la
eficacia de la terminación de la traducción de ARNm y/o de la
degradación de transcritos aberrantes en una célula comprende: a)
proporcionar una célula; b) expresar un transcrito antisentido del
complejo en cantidad suficiente para unirse al complejo.
Un procedimiento para inhibir sustancialmente la
terminación de la traducción en una célula comprende: mutar el
complejo que comprende MTT1, Upf1, Upf2p, Upf3p, eRF1 y eRF3 de tal
modo que no se produzca esencialmente complejo funcional en dicha
célula.
Esta descripción posibilita el tratamiento de
una enfermedad asociada a la eficacia de la terminación de la
traducción de ARNm y/o de la degradación de transcritos aberrantes,
que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente
eficaz de una composición farmacéutica que comprende el complejo,
que se introduce en una célula de un sujeto, y un vehículo o
diluyente farmacéutico, tratando así al sujeto.
Un paciente que tiene o que tiene riesgo de
tener una fase temprana como resultado de una deficiencia genética,
enfermedad o tratamiento clínico en el que la afección tiene una
etiología asociada a un defecto, puede tratarse administrando al
paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación o
composición que module la expresión del complejo del tal modo que
mejore el estado del paciente.
"Terapéuticamente eficaz", como se utiliza
en la presente memoria, designa una cantidad de formulación que
está en suficiente cantidad para mejorar el estado del paciente así
tratado. "Mejorar" designa una reducción del efecto
perjudicial del estado patológico o enfermedad en el paciente que
recibe la terapia. El sujeto es preferiblemente un ser humano, sin
embargo, puede concebirse que pueda tratarse cualquier animal.
Esto tiene implicaciones obvias para el
direccionamiento de fármacos en que en el desarrollo de fármacos
pueden dirigirse a uno u otro dominio, por ejemplo, utilizando
técnicas de biblioteca combinatoria o técnicas de diseño racional
de fármacos.
A la vista de lo anterior, resulta evidente que
hay una serie de vías para afectar a la fidelidad de varios
aspectos de la fidelidad de la traducción, a saber, inhibición,
elongación y terminación, que tienen importantes implicaciones para
la terapia antivírica y para la supresión de mutaciones terminadoras
patológicas. Por tanto, pueden identificarse fármacos para uso como
compuesto antivíricos o para alterar la descomposición
ribosómica.
El término "fármacos" se utiliza en la
presente memoria para designar un compuesto o agentes, tales como un
antibiótico o proteína, que pueden afectar a la función del centro
peptidiltransferasa durante la iniciación, elongación, terminación
o degradación de ARNm. Dichos compuestos pueden aumentar o reducir
el ARNm aberrante y la eficacia de la terminación de la
traducción.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, se introducen in vivo
en un vector vírico un ácido nucleico que codifica el complejo o
factores del complejo, un ácido nucleico antisentido o ribozima
específico del complejo o específico de regiones de los factores de
liberación, MTT1 y Upflp. Dichos vectores incluyen un virus de ADN
atenuado o defectivo tal como, pero sin limitación, herpesvirus
simplex (HSV), papilomavirus, virus de Epstein-Barr
(EBV), adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y similares. Se
prefieren virus defectivos que carecen entera o casi enteramente de
genes víricos. El virus defectivo no es infeccioso después de la
introducción en una célula. El uso de vectores víricos defectivos
permite la administración a células en una zona específica
localizada sin preocupación de que el vector pueda infectar otras
células. Por tanto, pueden dirigirse específicamente al tejido
adiposo. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin
limitación, un vector de herpesvirus 1 defectivo (HSV1) [Kaplitt y
col., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-330
(1991)], un vector de adenovirus atenuado tal como el vector
descrito por Stratford-Perricaudet y col. [J.
Clin. Invest. 90: 626-630 (1992)] y un vector
de virus adenoasociado defectivo [Samulski y col., J. Virol.
61: 3096-3101 (1987); Samulski y col., J.
Virol. 63: 3822-3828 (1989)].
En otra realización, el gen puede introducirse
en un vector retrovírico, por ejemplo, como se describe en Anderson
y col., patente de EE.UU. nº 5.399.346; Mann y col., 1983,
Cell 33: 153; Temin y col., patente de EE.UU. nº 4.650.764;
Temin y col., patente de EE.UU. nº 4.980.289; Markowitz y col.,
1988, J. Virol. 62: 1120; Temin y col., patente de EE.UU. nº
5.124.263; publicación internacional de patente nº WO 95/07358,
publicada el 16 de marzo de 1995 por Dougherty y col.; y Kuo y
col., 1993, Blood 82: 845. El suministro génico dirigido se
describe en la publicación de patente internacional WO 95/28494,
publicada en octubre de 1995.
Como alternativa, el vector puede introducirse
in vivo mediante lipofección. Durante la pasada década, ha
habido un uso creciente de liposomas para encapsulación y
transfección de ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos
catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y
peligros encontrados con la transfección mediada por liposomas
pueden utilizarse para preparar liposomas para la transfección in
vivo de un gen que codifica un marcador [Felgner y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417
(1987); véase Mackey y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
8027-8031 (1988)]. El uso de lípidos catiónicos
puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos cargados
negativamente, y promueve también la fusión con membranas celulares
cargadas negativamente [Felgner y Ringold, Science 337:
387-388 (1989)]. El uso de la lipofección para
introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo
tiene ciertas ventajas prácticas. El direccionamiento molecular de
liposomas a células específicas representa un área de beneficio.
Resulta claro que dirigir la transfección a tipos celulares
particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con
heterogeneidad celular, tal como páncreas, hígado, riñón y cerebro.
Los lípidos pueden acoplarse químicamente con otras moléculas con
fines de direccionamiento [véase Mackey y col., mencionado
anteriormente]. Los péptidos dirigidos, por ejemplo hormonas o
neurotransmisores y proteínas tales como anticuerpos o moléculas no
peptídicas, podrían acoplarse químicamente a liposomas.
También es posible introducir el vector in
vivo en forma de un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de
ADN desnudo para terapia génica pueden introducirse en las células
huésped deseadas mediante procedimientos conocidos en la técnica,
por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección,
transducción, fusión celular, DEAE-dextrano,
precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola génica o uso
de un vector transportador de ADN [véanse, por ejemplo, Wu y col.,
J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992); Wu y Wu,
J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988);
Hartmut y col., solicitud de patente canadiense nº 2.012.311,
presentada el 15 de marzo de 1990].
La coexpresión de un producto génico que module
la actividad en el centro peptidiltransferasa y un gen antisentido
o de ribozima heterólogo terapéutico bajo el control de la secuencia
de reconocimiento de ADN específica puede proporcionarse por un
vector de expresión de terapia génica que comprenda tanto un gen que
codifica un modulador de un centro peptidiltransferasa (incluyendo,
pero sin limitación, un gen de una proteína mutante de
desplazamiento de marco de lectura o de descomposición de ARNm, o
un ARN antisentido o ribozima específico de ARNm que codifica dicha
proteína) como un gen de un ácido nucleico antisentido o ribozima no
relacionado bajo un control de expresión coordinado. Estos
elementos pueden proporcionarse en vectores separados, o como
alternativa, estos elementos pueden proporcionarse en un solo
vector de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Los medios para tratar infecciones víricas
pueden incluir agentes que modulan la fidelidad de la traducción, y
por tanto afectan directamente a la replicación vírica o ensamblaje
de partículas víricas.
Se describen en la presente memoria fármacos y
procedimientos para identificar fármacos para uso en terapia
antivírica de virus que utilizan el mecanismo de desplazamiento del
marco de lectura ribosómico basico -1, que incluyen cuatro grandes
familias de virus animales y tres grandes familias de virus de
plantas. Específicamente, ensayos para cribar agentes,
antagonistas/agonistas que efectúan un desplazamiento del marco de
lectura que implica al complejo, y que implica a Upf3p. Además, una
Upf3 mutante.
Por ejemplo, casi todos los retrovirus utilizan
el desplazamiento del marco de lectura ribosómica -1, incluyendo
lentivirus (virus de inmunodeficiencia) tales como
VIH-1 y VIH-2, SIV, FIV, BIV, virus
Visna, virus de atritis-encefalitis y virus de
anemia infecciosa equina; espumavirus (los virus espumosos) tales
como el virus espumoso humano y otros virus espumosos de mamíferos;
los virus linfotróficos de células T tales como
HTLV-1, HTLV-II, STLV y BLV; virus
de leucosis aviar tales como virus de leucemia y sarcoma de muchas
aves, incluyendo aves de corral comerciales; retrovirus de tipo B,
incluyendo virus de tumor mamario de ratón; y retrovirus de tipo D
tales como virus de mono Mason-Pfizer y virus de
adenocarcinoma pulmonar ovino. Además, muchos coronavirus utilizan
el desplazamiento del marco de lectura -1, incluyendo coronavirus
humanos tales como 229-E, OC43; coronavirus
animales tales como coronavirus de ternero, virus de gastroenteritis
transmisible porcina, virus de encefalomielitis hemaglutinante
porcina y virus de la diarrea epidémica porcina; coronavirus
caninos; virus de peritonitis infecciosa felina y coronavirus
entéricos felinos; virus Bluecomb de bronquitis infecciosa de
gallina y pavo; virus de hepatitis de ratón, coronavirus de rata y
coronavirus de conejo. De forma similar, está implicado un
torovirus (un tipo de coronavirus) tal como torovirus humanos
asociados a enfermedades entéricas y respiratorias; virus Breda de
terneros y virus respiratorio bovino; virus Berna equino; torovirus
porcino; torovirus felino. Es otro coronavirus el arterivirus, que
incluye virus de fiebre hemorrágica de simio, virus de arteritis
equina, virus de Lelystad (porcino), virus VR2332 (porcino) y virus
elevador de la lactacto deshidrogenasa (roedores). Son otros virus
animales paramixovirus tales como los de desplazamiento del marco de
lectura ribosómico -1 humano reseñados en sarampión, y astrovirus
tales como astrovirus humanos 1-5 y astrovirus
bovinos, ovinos, porcinos, caninos y de pato.
Los virus de plantas que implican un mecanismo
de desplazamiento del marco de lectura -1 incluyen tetravirus tales
como sobemovirus (por ejemplo, virus del mosaico sureño de la judía,
virus moteado de pata de gallo), leuteovirus (por ejemplo, virus
del enanismo amarillo de la cebada, virus del amarilleo occidental
de la remolacha, virus de enrollado de la hoja de patata),
enamovirus (por ejemplo, virus del mosaico del guisante) y
umbravirus (por ejemplo, virus del moteado de la zanahoria),
tombusvirus tales como tombusvirus (por ejemplo, virus del enanismo
arbustivo del tomate), carmovirus (por ejemplo, virus del moteado
del clavel), necrovirus (por ejemplo, virus de la necrosis del
tabaco), diantovirus (por ejemplo, virus del mosaico necrótico del
trébol rojo) y machiomovirus (virus del moteado clorótico del
maíz).
Además, totivirus tales como L-A
y L-BC (levadura) y otros virus fúngicos, virus de
Giardia lamblia (parásito intestinal), virus de
Trichamonas vaginalis (parásito humano), virus de
Leishmania brasiliensis (parásito humano) y otros virus de
protozoos son virus de desplazamiento del marco de lectura -1.
El componente o componentes de una composición
terapéutica pueden introducirse o administrarse por vía paranteral,
paracanceral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa,
intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular o
intracraneal.
Los modos de suministro incluyen, pero sin
limitación: ADN desnudo, proteína, péptido o dentro de un vector
vírico o dentro de un liposoma. Un vector vírico puede ser un
retrovirus, virus adenoasociado o adenovirus.
Como puede apreciarse fácilmente por un experto
en la técnica, los tratamientos con composiciones descritas en la
presente memoria son particularmente adecuados para el tratamiento
de cualquier animal, particularmente un mamífero, más
específicamente un ser humano. Pero en modo alguno está limitado a
animales domésticos tales como sujetos felinos o caninos, animales
de granja tales como, pero sin limitación, sujetos bovinos, equinos,
caprinos, ovinos y porcinos, animales salvajes (tanto en la
naturaleza como en un jardín zoológico), animales de investigación
tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros,
gatos, etc., concretamente, para uso médico veterinario.
Como se utiliza en la presente memoria,
"composición farmacéutica" podría significar cantidades
terapéuticamente eficaces del complejo con diluyentes,
conservantes, solubilizantes, emulsionantes, coadyuvantes y/o
portadores adecuados útiles en terapia de SCF. Una "cantidad
terapéuticamente eficaz", como se utiliza en la presente
memoria, designa una cantidad que proporciona un efecto terapéutico
para una afección y régimen de administración dados. Dichas
composiciones son formulaciones líquidas o liofilizadas o secadas de
otro modo, e incluyen diluyentes de diverso contenido de tampón
(por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y
fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para evitar
la absorción en superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20,
Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes
solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilenglicerol),
antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de
sodio), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico,
parabenos), sustancias de relleno o modificadores de la tonicidad
(por ejemplo, lactosa, manitol), la unión covalente de polímeros
tales como polietilenglicol a la proteína, la complejación con iones
metálicos o la incorporación del material en o sobre preparaciones
particuladas de compuestos poliméricos tales como poli(ácido
láctico), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc. o sobre liposomas,
microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares,
fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Dichas composiciones
influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad
de liberación in vivo y velocidad de eliminación in
vivo de SCF. La elección de las composiciones dependerá de las
propiedades físicas y químicas de la proteína que tenga actividad
SCF. Por ejemplo, un producto derivado de una forma unida a membrana
de SCF puede requerir una formulación que contenga detergente. Las
composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen la
formulación en depósitos lipófilos (por ejemplo, ácidos grasos,
ceras, aceites). Se incluyen también en la invención composiciones
particuladas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o
poloxaminas) y SCF acoplado a anticuerpos dirigidos contra
receptores, ligandos o antígenos específicos de tejido, o acoplado
a ligandos de receptores específicos de tejido. Otras realizaciones
de las composiciones de la invención incorporan formas particuladas
de recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o
potenciadores de la permeación para diversas vías de
administración, incluyendo parenteral, pulmonar, nasal y oral.
Además, como se utiliza en la presente memoria,
los "portadores farmacéuticamente aceptables" son bien
conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin
limitación, tampón fosfato 0,01-0,1 M y
preferiblemente 0,05 M o solución salina al 0,8%. Adicionalmente,
dichos portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser
disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Son
ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y
ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los
portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o
suspensiones alcóholicas/acuosas, incluyendo disolución salina y
medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de
cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio,
Ringer lactato o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos
incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de
electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y
similares. Pueden estar presentes también conservantes y otros
aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes,
agentes quelantes, gases inertes y similares.
La frase "cantidad terapéuticamente eficaz"
se utiliza en la presente memoria para indicar una cantidad
suficiente para reducir en al menos un 15%, preferiblemente en al
menos un 50%, más preferiblemente en al menos un 90%, y lo más
preferiblemente evitar, un déficit clínicamente significativo en la
actividad, función y respuesta del huésped. Como alternativa, una
cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una
mejora en una afección clínicamente significativa en el huésped.
Como aprecian los expertos en la técnica, la cantidad de compuesto
puede variar dependiendo de la actividad específica y las cantidades
de dosificación adecuadas pueden estar en el intervalo de
aproximadamente 0,1 a 20, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 10, y más preferiblemente de 1 a varios miligramos
de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo
al día, y depende de la vía de administración. En una realización,
la cantidad está en el intervalo de 10 picogramos por kg a 20
miligramos por kg. En otra realización, la cantidad es de 10
picogramos por kg a 2 miligramos por kg. En otra realización, la
cantidad es de 2-80 microgramos por kilogramo. En
otra realización, la cantidad es de 5-20
microgramos por kg.
El término "dosis unitaria", cuando se
utiliza con referencia a una composición farmacéutica de la presente
invención, designa unidades físicamente discretas adecuadas como
dosificación unitaria para seres humanos, conteniendo cada unidad
una cantidad predeterminada de material activo calculado para
producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el
diluyente necesario: concretamente, portador o vehículo.
Un compuesto terapéutico puede suministrarse en
un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el complejo puede
administrarse utilizando infusión intravenosa, una bomba osmótica
implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de
administración. Puede utilizarse una bomba (véase Langer,
mencionado anteriormente; Sefton CRC Crit. Ref. Biomed.
Eng. 14: 201 (1987); Buchwald y col., Surgery 88: 507
(1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)).
Pueden utilizarse materiales poliméricos (véanse "Medical
Applications of Controlled Release", Langer y Wise (eds), CRC
Press, Boca Ratón, Florida (1974); "Controlled Drug
Bioavailability, Drug Product Design and Performance", Smolen y
Ball (eds), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J.
Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); véanse
también Levy y col., Science 228: 190 (1985); During y col.,
Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard y col., J.
Neurosurg. 71: 105 (1989)). Puede disponerse un sistema de
liberación controlada en la proximidad de la diana terapéutica,
concretamente el cerebro, requiriendo así sólo una fracción de la
dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en "Medical
Applications of Controlled Release", mencionado
anteriormente, vol. 2, pág. 115-138 (1984)).
Preferiblemente, se introduce un dispositivo de liberación
controlada en un sujeto en la proximidad del sitio de activación
inmune inapropiada o tumor. Se discuten otros sistemas de
liberación controlada en la revisión de Langer (Science 249:
1527-1533 (1990)).
Como puede apreciarse fácilmente por un experto
en la técnica, los procedimientos y composiciones farmacéuticas
descritos en la presente memoria son particularmente adecuados para
administración a cualquier animal, particularmente un mamífero, e
incluyendo, pero en modo alguno con limitación, animales domésticos
tales como sujetos felinos o caninos, animales de granja tales
como, pero sin limitación, sujetos bovinos, equinos, caprinos,
ovinos y porcinos, animales salvajes (tanto en la naturaleza como
en un jardín zoológico), animales de investigación tales como
ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos,
etc., concretamente, para uso médico veterinario.
Ejemplo
1
Procedimientos de levadura generales:
Medios de levadura, transformaciones, aislamiento de ARN,
transferencia e hibridación fueron como se han descrito (Rose y
col., 1990; Weng y col., 1996a; Hagan y col., 1995; Scheisti y
Geitz, 1989).
Preparación de complejos de fusión de
glutation/Sepharose-RF y de proteínas de fusión RF
purificadas: Se prepararon los complejos de fusión
glutation/Sepharose-RF como se describe
anteriormente (Czaplinski y col., 1998). 1 \mul de complejos
GST-RF contenía típicamente 0,9 \mug de
GST-eRF1 ó 1,5 \mug de GST-eRF3,
mientras que los complejos de GST contenían típicamente 4,5 \mug
de GST por \mul de resina. Se prepararon también
GST-RF a partir de cultivos de células BL21 (DE3)
pLysS transformadas con pGEX2T, pGEX2T-SUP35 o
pGEX2T-SUP45, y se aislaron las proteínas de fusión
como se describe anteriormente (Czaplinski y col., 1998).
Preparación de extractos citoplasmáticos:
Se cultivaron células BJ3505 (MAT\alpha pep4::HIS3
prb-\Delta1.6R HIS3 lys2-208
trp1-\Delta10 ura 3-52 gal2 can1)
hasta una DO_{600}= 1,0 y se lavaron con 5 ml de tampón IB frío
(IBTC que carece de BSA) con PMSF 0,5 mM. Se volvieron a sedimentar
las células y se suspendieron en 1,3 ml de IB frío con PMSF 0,5 mM
e inhibidores de proteasa (PI, 1 \mug/ml de cada una de leptina,
aprotinina y pepstatina A) por g de peso celular. Se añadió un
volumen aproximadamente igual de perlas de vidrio y se consiguió la
lisis agitando con vórtex 6 veces durante 20 segundos, con 1 minuto
de enfriamiento en hielo entre las agitaciones con vórtex. Se
eliminó el lisado y se lavaron las perlas dos veces con un volumen
igual de IB con PMSF 0,5 mM y 1 \mug/ml de cada una de
leupeptina, aprotinina y pepstatina A. Se combinaron los lavados
con el lisado y se eliminó el desecho celular mediante
centrifugación a 30.000 x g durante 20 min.
Ensayos de ATPasa: Se determinó la
actividad ATPasa dependiente de ARN de Mtt1p utilizando 20 ng de
Mtt1p en presencia de proteínas de fusión GST-RF
mediante un ensayo de carbón como se describe anteriormente
(Czaplinski y col., 1995) utilizando
poli(U)-ARN 1 \mug/ml y BSA 100 \mug/ml.
Se representan los resultados como pmol de ^{32}P frente a la
concentración de la proteína indicada.
Identificación de una familia de helicasas de
la superfamilia del grupo I de levadura que son similares al gen
UPF1 : Se emprendió una comparación de secuencia para
identificar otros genes de levadura que son homólogos de
UPF1, y los resultados se muestran en la Figura 1. El gen
SEN1 demostró una homología significativa con UPF1
(Fig. 2, véase Koonin, 1992). SEN2 se identificó en un
cribado de mutaciones que afectan al ayuste de ARNt y alberga todos
los motivos para ser considerado una helicasa de la superfamilia del
grupo I (Winey y Culbertson, 1988; DeMarini y col., 1992). El gen
DNA2 anteriormente identificado demostró también una
homología significativa con UPF1 (Fig. 2). Es probable que
DNA2 tenga un papel en la replicación de ADN, posiblemente en el
procesamiento de fragmentos de Okazaki (Budd y col., 1995; Budd y
Campbell, 1997). Se identificaron también dos genes adicionales que
codifican helicasas de la superfamilia del grupo I con alta
homología con UPF1, y se han denominado en estudios previos
helicasa A (HCSA, Biswas y col., 1997a,b) y helicasa B
(HCSB, Biswas y col., 1995) o scHel1 (Bean y Matson, 1993).
Por razones que se describirán a continuación, el gen que codifica
la helicasa B (HCSB) se denomina MTT1 (por modulador
de la terminación de la traducción). Las proteínas codificadas por
los genes HCSA y MTT1 se han purificado anteriormente
y han demostrado que tienen actividad helicasa dependiente de ADN
(Biswas y col., 1995; Biswas y col., 1997a,b; Bean y Matson, 1993).
Se ha sugerido que HCSA y HCSB están implicados en la replicación de
cromosomas (Biswas y col., 1995, 1997a,b). Esta noción está basada
en las observaciones de que: 1) la proteína de unión a ADN
monocatenario de levadura Rpalp potencia sus actividades ADN
helicasa (Biswas y col., 1995, 1997) y 2) la HcsA se copurificó con
ADN polimerasa \alpha y exhibe las propiedades bioquímicas de las
helicasas replicativas (Biswas y col., 1997a,b). Hasta la fecha, no
hay evidencias in vivo que sugieran la implicación de
HCSA o HCSB en la replicación. Ambas cepas
hcsa\Delta y hcsb\Delta son viables. Las cepas
hcsb\Delta no exhiben defectos en el crecimiento,
sensibilidad al daño de ADN o defectos respiratorios (Bean y Matson,
1997). La inserción de transposón en la región promotora de
MTT1 se ha reseñado que causa hipersensibilidad a blanco de
calcoflúor, un inhibidor de la síntesis de pared celular y a
higromicina B, un fármaco que induce la lectura errónea
traduccional (Lussier y col., 1997). La homología de HcsA y HcsB se
ha reseñado anteriormente (Biswas y col., 1997a).
La homología entre estas cinco helicasas de
levadura parece estar limitada a sus dominios de helicasa (Fig.
2).
Ocho motivos conservados están asociados a todas
las helicasas de la superfamilia del grupo I (Gorbalenya, 1988,
Koonin, 1992). Dentro de estos ocho motivos, está conservado un
número limitado de residuos entre todas las helicasas de la
superfamilia del grupo I. Aunque estos 8 motivos están espaciados
variablemente de proteína a proteína, según la estructura
cristalina de dos helicasas diferentes de la superfamilia del grupo
I, estos residuos conservados están todos en estrecha proximidad en
tres diemnsiones (dos artículos de estructura cristalina). Un
análisis más cuidadoso de los genes con similitud con UPF1
identifica este grupo como una subclase de la superfamilia del
grupo I que es una subclase similar a UPF1. El rasgo distintivo de
esta subclase es una homología más extensa alrededor de los
residuos conservados en los motivos II, IV, V y VI (Fig. 2) que no
se había observado anteriormente (Perlick y col., 1996). Además, dos
motivos adicionales dentro de este dominio están conservados entre
estos cinco genes. El primero está localizado entre los motivos III
y IV (consenso lexSLFervl, fig. 2) y el segundo está localizado
entre los motivos IV y V (consenso IgvitpYxaQ, fig. 2), designados
como motivos IIIa y IVa, respectivamente. Estos motivos adicionales
están presentes en el homólogo humano del gen Upf1 también. De
estos cinco genes de levadura, Dna2p es el de peor ajuste al
consenso, y la omisión de esta secuencia proporciona un consenso
más ajustado. Otras dos helicasas de la superfamilia del grupo I de
levadura, Pif1 y RadH, y dos helicasas bien caracterizadas de grupo
I de E. coli, Rep y uvrD, no pudieron alinearse con estas
cinco secuencias bajo estos parámetros, indicando que la homología
no es general para todas las helicasas de la superfamilia del grupo
I, evidenciando por tanto una subclase distinta.
Como se describe anteriormente, es un rasgo
único de Upflp que contiene una región rica en
cisteína-histidina cerca de su extremo amino
terminal (Fig. 2C). Se ha mostrado que las mutaciones en esta región
reducen las eficacias de terminación de la traducción en codones
terminadores y potencian las eficacias del desplazamiento del marco
de lectura ribosómico -1 programado (Weng y col., 1996b; Cui y col.,
1996). Esta región se ha identificado como el dominio de
interacción de Upf2 (Weng y col., 1996b, He y col., 1996). De forma
interesante, la Mttp1 contiene también una región rica en
cisteína-histidina cerca de su extremo amino
terminal (Bean y Matson, 1997). Dentro de los primeros 127
aminoácidos, están presentes 13 cisteínas y 3 histidinas. Aunque las
regiones ricas en cisteína-histidina de UPF1 y MTT1
no contienen homología aparente, ambas regiones tienen el potencial
de formar dedos de anillo (véase Weng y col., 1996b, Bean y Matson,
1997). Además, estas regiones pueden aparearse con múltiples
motivos de unión a cinc. Sin embargo, debido al número considerable
de residuos de cisteína, cualquier alineamiento de este tipo deja
varios residuos de cisteína sin tener en cuenta dentro de la misma
región.
Una cepa mtt1\Delta demuestra un
fenotipo de supresión de mutaciones terminadoras: La supresión
de mutaciones terminadoras es el resultado de cuando un ARNt
análogo cercano compite exitosamente con los factores de terminación
en una mutación terminadora, de modo que aparece la incorporación
de aminoácido a la cadena peptídica en lugar de la terminación
prematura de la traducción (Fig. 1). Niveles suficientes de
supresión de las mutaciones terminadoras permiten la producción de
proteína polipeptídica completada que puede soportar el crecimiento.
Una cepa upf1\Delta permite la supresión de mutaciones
terminadoras de estos alelos. Basándose en estas observaciones, se
determinó que Mtt1p está implicada en la modulación de la
terminación de la traducción en un codón de terminación. Para
ensayar esta posibilidad, se ensayó en cepas de tipo natural,
mtt1\Delta, upf1\Delta, upf1\Delta mtt1\Delta
que albergan alelos terminadores leu2-2 y
tyr7-1 la supresión de estos alelos. Se
controló el fenotipo de supresión de las cepas que albergan los
alelos terminadores leu2-2 y
tyr7-1 mediante sembrado de células en medios
-trp -leu -tyr. Como control, se sembraron estas células en medios
-trp. Los resultados demostraron que tanto las células que albergan
upf1\Delta como mtt1\Delta crecieron en ambos
tipos de medios (Fig. 3A), indicando que eliminar los genes
UPF1 o MTT1 permitía la supresión de los alelos
terminadores tyr7-1 y
leu2-1 (Fig. 3A). Las células de tipo natural
(UPF1^{+} MTT1^{+}) eran incapaces de crecer en medios
-trp -leu -tyr, demostrando que la presencia de estos genes evitaba
la supresión de estos alelos terminadores (Fig. 3A).
Se controló también el fenotipo de supresión de
mutaciones terminadoras de una cepa upf1\Delta mtt1\Delta
como se describe anteriormente, y se comparó con cepas que albergan
deleciones sencillas. Los resultados de estos experimentos
demostraron que una cepa upf1\Delta mtt1\Delta era mucho
más eficaz para suprimir los alelos terminadores
tyr7-1 y leu2-1 que
las cepas que albergan deleciones sencillas del gen UPF1 o
MTT1 (Fig. 3A). Tomados en conjunto, estos resultados
demuestran que tanto Upf1p como Mtt1p están implicadas en la
modulación de la terminación de la traducción en codones
terminadores.
Los resultados antriores demostraron que una
cepa upf1\Delta era capaz de potenciar la supresión de
desplazamiento del marco de lectura a 37ºC en cepas que albergaban
el alelo his4-38 y un supresor del
desplazamiento del marco de lectura ARNt SUF1, mientras que
las cepas que albergaban el gen UPF1 de tipo natural no
pudieron crecer a esta temperatura (Leeds y col., 1991, 1992). Se
mostró que una cepa mtt1\Delta his4-38 SUF
1 sería capaz también de potenciar la supresión del
desplazamiento del marco de lectura. Los resultados demostraron
que, al contrario que una cepa upf1\Delta, la cepa
mtt1\Delta his4-38 SUF1 era incapaz de
crecer en medios que carecieran de histidina a 37ºC, indicando que
la deleción del gen MTT1 no aumentaba la supresión del
desplazamiento del marco de lectura en este
ensayo.
ensayo.
Una cepa mtt1\Delta no afecta a la
descomposición de ARNm mediada por mutaciones terminadoras: Los
resultados anteriores demostraron que la Upf1p tiene un papel en la
regulación tanto del recambio de ARNm como de la terminación de la
traducción (Weng y col., 1996a,b, 1998; Czaplinski y col., 1998).
Basándose en estos resultados, se determinó si el fenotipo de
supresión de las mutaciones terminadoras observado anteriormente era
una consecuencia de afectar la eficacia de la terminación de la
traducción, inactivar la ruta de descomposición de ARNm mediada por
mutaciones terminadoras (NMD) o una combinación de afectar las dos
rutas. Se construyó una cepa mtt1\Delta que albergaba los
alelos terminadores que contienen tyr7-1 y
leu2-2 para hacerse esta pregunta (véanse
los procedimientos experimentales). Se mostró que una cepa
mtt1\Delta era viable sin defectos de crecimiento
demostrables (véanse los procedimientos experimentales). Se examinó
el efecto de una mtt1\Delta sobre la NMD controlando la
abundancia del precursor CYH2 y el ARNm maduro que codifica una
proteína ribosómica. El precursor CYH2 ayustado ineficazmente, que
contiene un intrón cerca del extremo 5', es un sustrato de origen
natural para la ruta de descomposición de ARNm mediada por
mutaciones terminadoras (NMD) (He y col., 1993). Se determinó
también la abundancia de los transcritos terminadores que contienen
tyr7 y leu2 en estas cepas. Los resultados demostraron que a
niveles de estado estacionario del precursor CYH2 y el ARNm maduro,
los ARNm de tyr7 y leu2 eran equivalentes al encontrado en una cepa
de tipo natural (Fig. 3). Como control, se aumentaron el precursor
CYH2 y los transcritos terminadores que contenían tyr7 y leu2 en una
cepa upf1\Delta. La abundancia del transcrito CYH2 de tipo
natural, que no es un sustrato de la ruta de NMD, era equivalente en
todas las cepas ensayadas (Fig. 3). Además, la abundancia de los
transcritos que son sustratos de la ruta de NMD no estaba más
afectada en una cepa upf1\Delta mtt1\Delta frente a una
cepa sólo upf1\Delta (Fig. 3). Una cepa upf1\Delta
mtt1\Delta era viable sin defectos de crecimiento
discernibles.
La Mtt1p interacciona con el factor de
liberación de peptidilo eRF3: Los resultados anteriores sugerían
que Upf1p afecta a la terminación de la traducción al interaccionar
directamente con los factores de terminación de la traducción eRF1
y eRF3 y, por lo tanto, puede afectar a su eficacia de terminación
de la traducción (Czaplinski y col., 1998). Puesto que eliminar el
gen MTT1 promueve tambien la supresión de las mutaciones
terminadoras de los alelos tyr7-1 y
leu2-2, Mtt1p interacciona también con los
factores de liberación de peptidilo. Para ensayar esto, se
expresaron individualmente eRF1 y eRF3 en E. coli en forma de
proteínas de fusión con
glutation-S-transferasa (GST) y se
purificaron utilizando perlas de
glutation-Sepharose. Se añadieron proteínas de
fusión GST-RF (factor de liberación) purificadas
asociadas con las perlas de glutation-Sepharose a
un extracto citoplasmático de levadura que contenía una Mtt1p
marcada con epítopo FLAG (véanse los procedimientos
experimentales). Después de la incubación, se purificaron las
GST-RF y proteínas asociadas mediante cromatografía
de afinidad y se sometieron a PAGE-SDS. Se realizó
una inmunotransferencia y se ensayó la presencia de
Flag-Mtt1p utilizando un anticuerpo contra el
epítopo FLAG. El anticuerpo anti-FLAG reconoció sólo
la Mtt1p de 127 kDa en extractos citoplasmáticos de células
transformadas con plásmido que expresa FLAG-Upf1p.
Este análisis demostró también que la Mtt1p se copurificaba
específicamente con eRF3 (Fig. 5). La Mtt1p no se copurificaba con
GST-RF1 ni proteína GST que no estaba fusionada con
otra proteína (Fig. 5) o proteína GST-JIP, en la que
se utilizó una proteína de interacción con Jak2 fusionada con GST
para controlar la especificidad de la reacción.
La Mtt1p está asociada a polisoma:
Basándose en los fenotipos de supresión de las mutaciones
terminadoras de una cepa mtt1\Delta, se investigó si la
Mtt1p está asociada a ribosomas. Para determinar si la Mttp1 está
asociada a ribosoma, se prepararon extractos postmitocondriales a
partir de células que albergan el gen Flag-Mtt1 y se
separaron las fracciones de polisoma mediante centrifugación a
través de gradientes de sacarosa. Se recogieron las diversas
fracciones y se determinó la presencia de la proteína
FLAG-Mtt1p en las fracciones de gradiente mediante
transferencia Western, sondeando las transferencias con un
anticuerpo dirigido contra el epítopo FLAG. Los resultados de estos
experimentos indicaron que la FLAG-Mtt1p está
asociada a polisoma y monosoma, mientras que las fracciones
superiores no contenían Mtt1p detectable (Fig. 6, carriles 2 y 3).
La Mtt1p asociada a la fracción de polisoma consiste
predominantemente en una proteína de 127 kDa. El tratamiento de los
extractos de polisoma con ARNasa desplazó la Mtt1p a fracciones que
contienen las subunidades de 40 S.
La Mtt1p demuestra actividades ATPasa y
helicasa dependientes de ARN: Los resultados anteriores han
mostrado que la Mtt1p tiene actividades ATPasa y helicasa
dependientes de ADN (Biswas y col., 1995). Basándose en los
resultados descritos anteriormente, se mostró que la Mtt1p será
también una ATPasa y helicasa dependiente de ARN. Se preguntó
primero si la Mtt1p purificada exhibía actividad ATPasa. Se
realizaron ensayos de ATPAsa incubando la proteína purificada en
mezclas de reacción que contenían
[\gamma-^{32}P]-ATP radiomarcado
en presencia o ausencia de poliuridina (poli(rU)) y
ensayando la liberación de ^{32}PO_{4}. Los resultados
demostraron que en ausencia de poli(rU) no era detectable
actividad ATPasa (Fig. 7). Las mezclas de reacción que contenían
poli(rU), sin embargo, estimularon en gran medida la
liberación de ^{32}PO_{4}, indicando que la Mtt1p albergaba
también una actividad ATPasa dependiente de ARN (Fig. 7). Las
concentraciones de poli(rU) de o superiores a 330 nM
estimulaban al máximo la actividad ATPasa de la Upf1p.
Los resultados presentados en la presente
memoria describen la identificación de Mtt1p, una helicasa
dependiente de ácido nucleico con homología significativa con
Upf1p, un factor identificado anteriormente en la regulación tanto
de la terminación de la traducción como de NMD (Czaplinski y col.,
1995, 1998; Weng y col., 1996a,b, 1998). Varias series de pruebas
indican que la Mtt1p tiene también un papel en la modulación del
proceso de terminación de la traducción. De forma interesante, la
comparación del gen MTT1 con otras helicasas de la
superfamilia del grupo I identificó motivos de firma única que
marcan esta subfamilia de la superfamilia de helicasas del grupo I
como posiblemente implicada en procesos dependientes de ARN o
dependientes de ARN-ADN (Fig. 2). Como se discutirá
a continuación, estos resultados sugieren que un subconjunto de las
Helicasas de ARN de la familia de Upflp está implicado en la
modulación de la eficacia del proceso de terminación de la
traducción.
El gen MTT1 y su producto proteico
demuestran similitud con Upf1p: Una comparación de los genes
MTT1 y UPF1 identificó varias regiones de similitud.
Ambas proteínas contienen una región rica en
cisteína-histidina cerca del extremo aminoterminal
de la proteína y albergan todos los motivos para ser una helicasa de
la superfamilia del grupo I (Fig. 2). Las regiones ricas en
cisteína-histidina de UPF1 y MTT1 no
son muy homólogas. También es concebible que estas regiones ricas
en cisteína-histidina formen un nuevo tipo de motivo
rico en cisteína-histidina. De forma interesante,
las mutaciones en la región rica en
cisteína-histidina de UPF1 han mostrado
anteriormente que aumentaban las eficacias del desplazamiento del
marco de lectura -1 programado y promovían la supresión de
mutaciones terminadoras (Cui y col., 1996; Weng y col., 1996b).
Las comparaciones de secuencia de helicasas de
la superfamilia del grupo I identificaron inicialmente los genes
SEN1 y MOV-10 por tener regiones de
alta homología con la región helicasa del gen UPF1 (Koonin,
1992). El gen MTT1 demuestra también una extensa homología
con UPF1 y con otros miembros de la subfamilia similar a
UPF1 (Fig. 2). Estos genes incluyen DNA2, HCSA,
HCSB/MTT1 y SEN1. En particular, es otro miembro de la
familia UPF1 de helicasas el gen HelB recientemente
aislado (Biswas y col., 1997a,b). Esta helicasa se aisló
inicialmente como parte del complejo multienzimático polimerasa
\alpha (Biswas y col., 1993, 1993a, 1995). La deleción de
HCSA no causa la supresión de mutaciones terminadoras,
demostrando que los fenotipos de supresión de mutaciones
terminadoras observados en cepas upf1\Delta y
mtt1\Delta no son simplemente debidos a la deleción de una
helicasa del grupo I.
La Mttp1p es una helicasa de ARN implicada en
la terminación de la traducción: Los resultados anteriores
demostraron que Hel1p/Mtt1p demostró actividad ADN helicasa que
estaba estimulada por la proteína de unión a ADN monocatenario de
levadura Rpalp (Biswas y col., 1995; Bean y Matson, 1997). Los
resultados presentados en la presente memoria demostraron que la
Mtt1p purificada muestra también actividades ATPasa y helicasa
dependientes de ARN (Fig. 7). Por tanto, de forma similar a la
Upflp (Czaplinski y col., 1995), la Mtt1p demuestra también la
capacidad de desenrrollar tanto dúplex de ADN como de ARN.
Varias series de pruebas sugieren que la Mtt1p
está implicada en la terminación de la traducción. Los resultados
presentados en la presente memoria muestran que: 1) una cepa
mtt1\Delta demuestra un fenotipo de supresión de
mutaciones terminadoras (Fig. 4); 2) la Mtt1p está asociada a
polisoma (Fig. 6); 3) la Mtt1p interacciona directamente con el
factor de liberación de peptidilo eRF3 (Fig. 5); 4) las cepas
mtt1\Delta demuestran sensibilidad a paromicina. Si se
considera que, al contrario que la cepa upf1\Delta, una
cepa mtt1\Delta no estabiliza transcritos que contienen
mutaciones terminadoras, entonces la cantidad de supresión de
mutaciones terminadoras por molécula de ARN es mayor en una cepa
mtt1\Delta que en una cepa upf1\Delta (Fig.
3).
Una cepa mtt1\Delta upf1\Delta
demuestra un fenotipo de supresión drástica de mutaciones
terminadores comparada con una cepa upf1\Delta o
mtt1\Delta. Una posibilidad para explicar esta observación
es que estas proteínas funcionan en la misma etapa de la terminación
de la traducción y que Mtt1p o Upflp pueden compensar parcialmente
la pérdida del otro factor. La inactivación de ambos factores, sin
embargo, conduce a un nivel mayor de supresión de las mutaciones
terminadoras. Una explicación alternativa es que estos dos factores
trabajan en diferentes etapas del proceso de terminación. Tanto
Mtt1p como Upf1p funcionan modulando la eficacia de la terminación
de la traducción y Upf1p actúa posteriormente en la promoción de la
descomposición del ARNm. El aumento sinérgico de la supresión de
mutaciones terminadoras puede ser una consecuencia tanto del
aumento del transcrito que contiene mutaciones terminadoras como de
la reducción de la eficacia de la terminación de la traducción en
una cepa mtt1\Delta upf1\Delta.
Al menos dos Helicasas de ARN están
implicadas en la modulación de la eficacia de la terminación de la
traducción: Es interesante que parece haber al menos dos
helicasas implicadas en la modulación de la eficacia de la
terminación de la traducción. Las helicasas son enzimas que
desenrrollan dúplex de ácido nucleico. Se ha aclarado ahora que la
capacidad de manipular dúplex de ácido nucleico mediante helicasas
es crítica para cada proceso biológico en el que estén implicados
ADN y ARN. Se ha mostrado que un gran número de Helicasas de ARN
están implicadas en mecanismos de control
post-transcripcional. Los ejemplos incluyen
procesamiento de ARNt, biogénesis ribosómica, ayuste, transporte,
traducción y recambio de ARNm. Estas Helicasas de ARN entran dentro
de al menos dos familias, la más destacada superfamilia de
helicasas de "secuencia DEAD" o la superfamilia del grupo II.
Las helicasas de la superfamilia del grupo I, como las mostradas en
la Fig. 2, se ha mostrado que desenrrolan tanto dúplex de ADN como
de ARN.
Actualmente, no es conocido ni entendido cómo
Upf1p y Mtt1p modulan el proceso de terminación de la traducción.
La eficacia de la terminación de la traducción puede afectarse al
alterar 1) las velocidades de asociación de los eRF con el
ribosoma, 2) la eficacia de los eRF de promover la hidrólisis de
peptidilo, o 3) la velocidad de disociación de los eRF del ribosoma
después de completar la terminación de la traducción. Hay ensayos
para controlar estas etapas en el proceso de terminación de la
traducción para empezar a comprender en qué etapa funcionan estas
proteínas.
Los resultados presentados en la presente
memoria indican que, aunque la maquinaria de traducción es altamente
precisa, las velocidades de crecimiento de células no cambian en
condiciones que reducen la exactitud de este proceso. Por ejemplo,
una cepa mtt1\Delta upf1\Delta no demostró ningún efecto
sobre el crecimiento celular aunque la terminación de la traducción
es menos eficaz en estas células. Además, las cepas que albergan el
alelo mof4-1 de UPF1 o
upf3\Delta, que demuestran una eficacia del desplazamiento
del marco de lectura programado cuatro veces mayor e indican una
reducción de la fidelidad del proceso de elongación de la
traducción, tampoco muestran defectos de crecimiento (Cui col.,
1996; Ruiz-Echevarría y col., 1998).
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly Val Ile Thr Pro Tyr Xaa Xaa Gln Val
Xaa Xaa Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ile Gln Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Leu Val Cys Ala Pro Ser Asn Ile Ala
Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Lys Ile Leu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Arg Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asp Thr Val Ile Ile Asp Glu Ala Thr
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Glu Val Xaa Thr Val Asp Xaa Phe Gln Gly
Arg Glu Lys Asp Xaa}
\sac{Ile Ile Leu Ser Cys Val Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly Phe Leu Xaa Asp Xaa Arg Arg Ile Asn
Val Ala Leu Thr Arg}
\sac{Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Xaa Ser Leu Phe Glu Arg Val
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly Val Ile Thr Pro Tyr Xaa Ala
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ile Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Val Gly Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Phe Glu Arg Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Ile Thr Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Asp Ala Phe Gln Gly Arg Glu Lys
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Ile Leu Ser Cys Val Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly Phe Leu Lys Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Leu Asn Val Ala Leu Thr Arg Ala
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> levadura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 472
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> levadura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> levadura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> levadura
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 380
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> levadura
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
Claims (16)
1. Un procedimiento para identificar una
composición de ensayo que modula la eficacia de la terminación de
la traducción que comprende:
(a) poner en contacto el gen MTT1 o su producto
proteico Mtt1p (helicasa B) con una composición o agente de ensayo
en condiciones que permitan la unión entre el gen MTT1 o Mtt1p y la
composición de ensayo;
(b) detectar la unión específica de la
composición o agente de ensayo con el gen MTT1 o Mtt1p; y
(c) determinar si la composición o agente de
ensayo inhibe el gen MTT1 o Mtt1p de modo que se identifique una
composición o agente de ensayo que module la eficacia de la
terminación de la traducción.
2. Un procedimiento de identificación de una
composición o agente de ensayo que modula la unión del producto
Mtt1p del gen MTT1 (helicasa B) a ARN, polisomas o un factor de
liberación eucariótico de peptidilo 3 (eRF3), comprendiendo el
procedimiento:
(a) incubar los componentes que comprenden la
composición de ensayo y el producto génico de MTT1 (Mtt1p), en el
que la incubación se lleva a cabo en condiciones suficientes para
permitir que los componentes interaccionen; y
(b) medir el efecto de la composición de ensayo
sobre la unión del producto del gen MTT1 (Mtt1p) a ARN, polisomas o
un factor eucariótico peptidilo 3 (eRF3).
3. El procedimiento de la reivindicación 2, que
comprende además identificar un gen que comprende:
(a) introducir en una célula in vitro una
composición de ensayo que module dicha unión del producto del gen
MTT1 (Mtt1p);
(b) determinar el fenotipo de la célula después
de (a);
(c) comparar el fenotipo celular después de (a)
con el fenotipo celular antes de (a); y
(d) identificar el gen de la célula en la que se
ha introducido la composición de ensayo.
4. Un procedimiento de detección de un trastorno
de supresión de las mutaciones terminadoras asociado a la expresión
de la proteína Mtt1p de MTT1 (helicasa B), en el que el
procedimiento comprende poner en contacto una muestra de un sujeto
que tiene o se sospecha que tiene un trastorno con un reactivo que
detecta la expresión de Mtt1p y detectar la unión del reactivo a la
muestra.
5. Un complejo multiproteico aislado que
comprende la proteína Mtt1p de MTT1 (helicasa B), la proteína Upf1p
humana, un factor de liberación eucariótico de peptidilo 1 (eRF1) y
un factor de liberación eucariótico de peptidilo 3 (eRF3), en el
que el complejo es eficaz para modular la actividad
peptidiltransferasa durante la traducción.
6. El complejo de la reivindicación 5, que
comprende además Upf3p y/o Upf2p humanas
7. Un procedimiento de modulación de la
actividad peptidiltransferasa durante la traducción, que comprende
poner en contacto una célula in vitro con el complejo de la
reivindicación 5 en una cantidad eficaz para facilitar la
terminación de la traducción, modulando así la actividad
peptidiltransferasa.
8. Un procedimiento de cribado de un fármaco
implicado en la actividad peptidiltransferasa durante la traducción
que comprende: a) poner en contacto células con un candidato a
fármaco; y b) ensayar la modulación del complejo de la
reivindicación 5, en el que un fármaco que modula el complejo está
implicado en la actividad peptidiltransfe-
rasa.
rasa.
9. Un procedimiento de cribado de un fármaco
activo implicado en la potenciación de la terminación de la
traducción que comprende: a) poner en contacto células con un
candidato a fármaco; y b) ensayar la modulación del complejo
proteico de la reivindicación 5; en el que un fármaco que modula el
complejo proteico está implicado en la potenciación de la
terminación de la traducción.
10. Un procedimiento de cribado de un fármaco
implicado en la potenciación de la terminación de la traducción que
comprende: a) incubar el fármaco y el complejo de la reivindicación
5; y b) medir el efecto de la supresión de mutaciones terminadoras,
cribando así un fármaco implicado en la potenciación de la
terminación de la traducción.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el ensayo es un ensayo de ARN o un ensayo de ATPasa.
12. Un procedimiento de cribado de un fármaco
que inhibe la interacción entre la proteína Mtt1p de MTT1 (helicasa
B) y eRF3, que comprende: a) poner en contacto células con un
candidato a fármaco; y b) ensayar la modulación del complejo de la
reivindicación 5, en el que un fármaco que modula la unión de Mtt1p
a eRF3 está implicado en la potenciación de la terminación de la
traducción.
13. Un procedimiento de modulación de la
eficacia de la terminación de la traducción de ARNm y/o de la
degradación de transcritos aberrantes en una célula, comprendiendo
dicho procedimiento: a) proporcionar una célula aislada que
contiene un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el
complejo de la reivindicación 5; o un ácido nucleico antisentido
del mismo; b) sobreexpresar dicho vector en dicha célula produciendo
un complejo sobreexpresado de modo que interfiera con la función
del complejo.
14. Un procedimiento para identificar un estado
patológico que implica un defecto en el complejo de la
reivindicación 5, que comprende: (a) transfectar una célula in
vitro con un ácido nucleico que codifica el complejo de la
reivindicación 5; (b) determinar la proporción del complejo
defectivo de la célula después de la transfección; (c) comparar la
proporción de complejo defectivo de la célula después de la
transfección con la proporción de complejo defectivo de la célula
antes de la transfección.
15. El uso del complejo de la reivindicación 5
para la fabricación de un fármaco para el tratamiento de
\beta-talasemia, \beta-globina,
distrofia muscular de Duchenne/Becker, hemofilia A, hemofilia B,
enfermedad de Von Willebrand, osteogénesis imperfecta (OI), cáncer
de mama, cáncer de ovario, tumor de Wilms, enfermedad de
Hirschprung, fibrosis quística, piedras en el riñón,
hipercolesterolemia familiar (FH), retinitis pigmentosa o
neurofibromatosis, retinoblastoma, ATM, enfermedad de Costmann.
16. Un procedimiento para identificar un estado
patológico que implica proteínas multiméricas defectivas que
comprende:
(a) transfectar una célula in vitro con
un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el complejo
de la reivindicación 5;
(b) determinar la proporción de proteínas
multiméricas defectivas de la célula después de la transfección;
y
(c) comparar la proporción de proteínas
multiméricas defectivas de la célula después de la transfección con
la proporción de proteínas multiméricas defectivas de la célula
antes de la transfección.
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