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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Subfamilie von RNA-Helicasen,
von denen es sich bei einer um das MTT1-Gen handelt, das die Fidelität der Translationstermination
moduliert. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Multiproteinüberwachungskomplex,
der MTT1, humanes Upf1p, Upf2p, Upf3p, eukaryotischen Release-Faktor
1 und eukaryotischen Release-Faktor 3 umfasst und der an der Modulation
der Effizienz der Translationstermination und dem Abbau von abweichender
mRNA beteiligt ist. Die Identifikation dieses Komplexes liefert
ein In-vitro-Assaysystem zum Identifizieren von Agentien, die: die
funktionelle Aktivität
von mRNAs durch Verändern
der Rasterfrequenz beeinträchtigen;
das Überwachen
eines Terminationsereignisses ermöglichen; den Abbau von abweichenden
Transkripten fördern;
Modulatoren (Inhibitoren/Stimulatoren) der Peptidyltransferaseaktivität während der
Initiation, der Elongation, der Termination und des mRNA-Abbaus
der Translation bereitstellen. Solche Agentien, die Antagonisten
oder Agonisten sein können,
sind zum Screenen und für
Diagnosezwecke und als Therapeutika für Erkrankungen oder Leiden,
die ein Resultat oder eine Ursache einer vorzeitigen Translation
sind, von Nutzen.
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ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Der
Translationsapparat zeichnet für
das Synthetisieren von Zellproteinen verantwortlich. Diese Maschinerie
muss die genauen Stellen an der mRNA bestimmen können, an denen das Dekodieren
beginnen sollte und an denen es enden sollte. Die Auswahl der Translationsstartstelle
wird für
gewöhnlich
von dem ersten AUG-Codon abgegrenzt, das die Aminosäure Methionin
kodiert. Nach der Initiation der Translation stellt das Ribosom
das Polypeptid her, indem es in der 5'- zur 3'-Richtung entlang der mRNA fortschreitet,
wobei es jeweils ein Codon dekodiert. Der letzte Schritt im Translationsvorgang
findet statt, wenn eines der drei Terminationscodons die A-Stelle des
Ribosoms belegt, was in der Hydrolyse des Peptids resultiert (in
Buckingham et al., 1997, besprochen).
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Obwohl
die Translationstermination normalerweise nach dem Abschluss des
vollständigen
Polypeptids erfolgt, führen
Basensubstitutionen und Rasterverschiebungsmutationen in DNA oftmals
zu der Synthese einer mRNA, die ein ungeeignetes Stoppcodon in seiner
Protein kodierenden Region enthält.
Das Vorkommen eines solchen vorzeitigen Stoppcodons hält die Translation
an der Stelle der frühen
Termination an und bewirkt die Synthese eines verkürzten Proteins
und den schnellen Abbau der mRNA (in Ruiz-Echevarria et al., 1996; Weng
et al., 1997, besprochen). Interessanterweise verursachen Nonsense-
und Rasterverschiebungsmutationen ungefähr 20–40 % der einzelnen Fälle von
mehr als 240 verschiedenen Erbkrankheiten (in McKusick, 1994, besprochen).
Folglich kann eine Behandlung einer Reihe genetischer Erkrankungen über das
Fördern der
Nonsense-Suppression vorgesehen werden. Nonsense-Suppression resultiert,
wenn eine nahezu zugehörige
tRNA erfolgreich mit den Terminationsfaktoren an einer Nonsense-Mutation
kompetiert, so dass eine Aminosäureeinbindung
in die Peptidkette anstelle einer vorzeitig terminierenden Translation
stattfindet (1). Ausreichende Niveaus
von Nonsense-Suppression
ermöglichen
die Produktion von abgeschlossenem Polypeptidprotein. Bei vielen
Erkrankungen, in denen nur ein Prozent des funktionellen Proteins
produziert wird, leiden Patienten unter schweren Krankheitssymptomen,
wohingegen das Fördern
der Expression auf nur fünf
Prozent der normalen Niveaus die Schwere beträchtlich reduzieren oder die
Erkrankung ausmerzen kann (McKusick, 1994; Cooper usw.). Jüngere Berichte
haben gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen bestimmter
Aminoglykoside den Translationsterminationsvorgang supprimieren,
was in der Expression des vollständigen
CFTR und dem Wiederherstellen cyclischer AMP-aktivierter Chloridkanalaktivität resultiert (Bedwell
et al., 1997; Howard et al., 1996). Folglich wird das Identifizieren
und Charakterisieren der Faktoren, die die Effizienz der Translationstermination
regulieren, für
das Verständnis
der Biologie dieses Vorgangs sowie beim Entwickeln von Therapeutika
zur Behandlung eines weiten Bereichs von genetischen Erkrankungen, die
als Folge einer Nonsense-Mutation entstehen, von Bedeutung sein.
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Die
Translationstermination wird von den eukaryotischen Release-Faktoren
von Peptidyl, Release-Faktor 1 (eRF1) und Release-Faktor 3 (eRF3),
durchgeuführt.
Sowohl eRF1 und eRF3 sind konservierte Proteine, die interagieren
und die Peptidylfreisetzung in eukaryotischen Zellen fördern (Frolova
et al., 1998, Stansfield et al., 1995, Zhouravleva et al., 1995).
In Hefe werden eRF1 und eRF3 von dem SUP45- bzw. SUP35-Gen kodiert
(Frolova et al., 1994, Zhouravleva et al., 1995). Von Sup45p (eRF1)
und Sup35p (eRF3) wurde gezeigt, dass sie interagieren (Stansfield
et al., 1995, Paushkin et al., 1997a, b). eRF1 enthält intrinsische
Peptidhydrolyseaktivität,
während
eRF3, das Homologie zu dem Translationselongationsfaktor EF1α aufweist
(Didichenko et al., 1991), GTPase-Aktivität zeigt (Frolova et al., 1996)
und die Terminationsaktivität
von eRF1 in einer GTP-abhängigen
Art und Weise verstärkt
(Zhouraleva et al., 1995).
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Faktoren,
die die Effizienz des Translationsterminationsvorgangs modulieren,
wurden identifiziert (Weng et al., 1996a, b; Czaplinski et al.,
1998; Song und Liebman, 1987; All-Robyn et al., 1990). Zum Beispiel deuten
jüngere
Ergebnisse darauf hin, dass das Upf1p ein Faktor ist, der die Effizienz
der Translationstermination moduliert. Eine Unterbrechung des UPF1-Gens
resultiert in einer drastischen Stabilisierung Nonsense enthaltender
mRNAs und fördert
die Suppression bestimmter Nonsense-Allele (Leeds et al., 1991,
Cui et al., 1995, Czaplinski et al., 1995, 1998, Weng et al., 1996a,
1996b). Jüngere
Ergebnisse legen nahe, dass das Upf1p den Translationsterminationsvorgang über direktes
Interagieren mit eRF1 und eRF3 modulieren kann (Czaplinski et al.,
1998). Das Upf1p enthält
eine an Cystein und Histidin reiche Region in der Nähe seines
Aminoterminus und alle Motive, die erforderlich sind, um ein Mitglied
der Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen zu sein (Czaplinski et al.,
1995; Weng et al., 1996a, b, 1998, Altamura et al., 1992, Cui et
al., 1996, Koonin, 1992, Leeds et al., 1992, Atkin et al., 1995,
1997). Das Hefe-Ufp1p wurde gereinigt und zeigt RNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivität (Czaplinski
et al., 1995, Weng et al., 1996a, b, 1998). Ein humanes Homologon
des UPF1-Gens, als RENT1 oder HUPF1 bezeichnet (Perlick et al.,
1996, Applequist et al., 1997), wurde identifiziert und es wurde
davon gezeigt, dass es in Hefezellen beim Verstärken der Translationstermination
funktionell ist, was darauf hinweist, dass seine Rolle in diesem
Vorgang evolutionär
konserviert ist (Czaplinski et al., 1998).
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Die
hier dargestellten Ergebnisse identifizieren einen Satz von Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen in Hefezellen
mit signifikanter Homologie zu Upf1p. Insbesondere wurden ein Gen
und dessen Proteinprodukt namens MTT1 (für Modulator von Translationstermination)
charakterisiert. Mtt1p kodiert eine Superfamilie-Gruppe-I-Helicase und beherbergt
eine an Cystidin/Histidin reiche Region in seinem Aminoterminus.
Analog zu Upf1p interagiert Mtt1p mit dem Translationsterminationsfaktor
eRF3 und kann den Translationsterminationsvorgang modulieren. Bezeichnenderweise
zeigt die Inaktivierung von sowohl Upf1p als auch Mtt1p einen drastischen
Nonsense-Suppressionsphänotyp,
der größer als
der Nonsense-Suppressionsphänotyp ist,
der für
beide Deletionen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass
es eine Familie von RNA-Helicasen gibt, bei denen es sich um Modulatoren
des Translationsterminationsvorgangs handelt.
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Diese
Erfindung stellt Verfahren und einen isolierten Multiproteinkomplex
bereit, wie in den beigefügten
Ansprüchen
ausgeführt.
Die Erfindung stellt außerdem
die Verwendung eines isolierten Multiproteinkomplexes, wie in Anspruch
5 ausgeführt,
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, wie
in Anspruch 15 ausgeführt,
bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung
oder eines Testagens bereit, die bzw. das die Effizienz der Translationstermination
moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkontaktbringen
von MTT1 mit einer Testzusammensetzung unter Bedingungen, die die
Bindung zwischen MTT1 und der Testzusammensetzung ermöglichen;
(b) Nachweisen einer spezifischen Bindung der Testzusammensetzung
an das MTT1 und (c) Ermitteln, ob die Testzusammensetzung das MTT1
inhibiert, um eine Testzusammensetzung zu identifizieren, die die
Effizienz der Translationstermination moduliert. In einer Ausführungsform
inhibiert das Agens ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1, ATPase von Upf1p;
GTPase-Aktivität
von eRF1 oder eRF3; RNA-Bindung; Bindung der Faktoren an das Ribosom
oder Bindung der Faktoren aneinander. In einer anderen Ausführungsform
moduliert das Agens die Bindung von MTT1 an das Polysom. In einer
anderen Ausführungsform
inhibiert das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3. In einer
anderen Ausführungsform
erleichtert das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung
oder eines Testagens bereit, die bzw. das die Bindung an MTT1 moduliert,
wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkubieren von Komponenten,
die die Testzusammensetzung umfassen, und MTT1, wobei das Inkubieren
unter Bedingungen durchgeführt
wird, die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen;
und (b) Messen der Auswirkung der Testzusammensetzung auf die Bindung
an MTT1. In einer Ausführungsform umfasst
das Verfahren weiterhin das Identifizieren eines Gens, wobei das
Verfahren Folgendes umfasst: (a) Einführen einer Testzusammensetzung,
die die Bindung an MTT1 moduliert, in eine Zelle; (b) Bestimmen
des Phänotyps
der Zelle nach (a); (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach (a) mit dem Zellphänotyp vor
(a) und (d) Identifizieren des Gens der Zelle, in die die Testzusammensetzung
eingeführt
wurde.
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Hierin
wird ein Vektor beschrieben, der die Expression von MTT1-Polypeptid
oder die Funktion von MTT1-Polypeptid moduliert. Die Modulation
kann inhibierend oder stimulierend sein.
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Diese
Erfindung stellt einen isolierten Multiproteinkomplex bereit, der
ein MTT1-Gen, humanes Upf1p-Protein, einen eukaryotischen Release-Faktor
1 (eRFI) von Peptidyl und einen eukaryotischen Release-Faktor 3
(eRF3) von Peptidyl umfasst, wobei der Komplex dahingehend wirksam
ist, die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation zu modulieren.
In einer Ausführungsform
umfasst der Komplex weiterhin humanes Upf3p und/oder Upf2p.
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Außerdem wird
hierin die Bereitstellung eines Agens beschrieben, das an den Komplex bindet,
der die Fidelität
der Translation einer mRNA moduliert. Translation beinhaltet Initiation,
Elongation, Termination sowie Abbau. In einer Ausführungsform
inhibiert das Agens ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1, ATPase von Upf1p;
GTPase-Aktivität von eRF1
oder eRF3; RNA-Bindung; Bindung der Faktoren an das Ribosom oder
Bindung der Faktoren aneinander. Das Agens kann die Bindung von
MTT1 an das Polysom modulieren oder die Bindung von humanem MTT1
an eRF3 inhibieren. Alternativ kann das Agens die Bindung von humanem
MTT1 an eRF3 erleichtern.
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Hierin
wird ein Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der
Translation beschrieben, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit
dem Agens in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Nonsense-Translationstermination
zu supprimieren, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert wird,
umfasst. Die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation erfolgt
während
der Initiation, der Elongation, der Termination und des Abbaus von
mRNA.
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Außerdem wird
ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination
von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden
Transkripten beschrieben, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit
dem Agens in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Bindung
von Mtt1 und eRF3 zu inhibieren, wodurch die Effizienz der Translationstermination
von mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von
abweichenden Transkripten gefördert
wird, umfasst.
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Es
wird ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination
von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden
Transkripten beschrieben, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit
einem Agens, das die ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1 inhibiert, wodurch
die Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon
moduliert und/oder der Abbau von abweichenden Transkripten gefördert wird,
umfasst.
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Eine
weitere Beschreibung hierin befasst sich mit einem Verfahren zum
Nachweisen einer Störung, die
mit der Expression von Mtt1-Protein zusammenhängt, wobei das Verfahren das
Inkontaktbringen einer Probe von einem Probanden, der eine Störung aufweist
oder von dem vermutet wird, dass er eine Störung aufweist, mit einem Reagens,
das die Expression des Mtt1-Proteins oder eines Mutanten davon nachweist,
und Nachweisen der Bindung des Reagens in der Probe umfasst.
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Es
wird ein Verfahren zum Behandeln einer Erkrankung, die mit Peptidyltransferaseaktivität zusammenhängt, offenbart.
Dieses Verfahren umfasst das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen
Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Komplex, Mtt1-Protein,
mutiertes Mtt1-Protein oder Agentien dazu umfasst, und einen pharmazeutischen
Trägerstoff
oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel
an einen Probanden, wodurch der Proband behandelt wird.
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Es
liegt außerdem
ein Verfahren zum Identifizieren von Genen, die an der Modulation
der Fidelität
der Translationstermination beteiligt sind, vor, wobei das Verfahren
Folgendes umfasst: a) Isolieren eines Gens von Interesse und b)
Ermitteln, ob das Gen von Interesse die Motive I–IX umfasst, wobei, wenn das
Gen ein beliebiges der neun Motive umfasst, das Gen die Translationstermination
moduliert. Das Motiv I kann die folgende Sequenz umfassen: GppGTKTxT-X(n).
Das Motiv II kann die Sequenz riLxcaSNxAvDx1-X(n) umfassen. Das
Motiv III kann die Sequenz vviDExxQaxxxxxiPi-X(n) umfassen. Das
Motiv IV kann die Sequenz xxil aGDxxQLp-X(n) umfassen. Das Motiv V kann die
Sequenz lxx SLF erv-X(n) umfassen. Das Motiv VI kann die Sequenz
LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n) umfassen. Das Motiv VII kann die Sequenz
IgvitPYxxQvxxl-X(n) umfassen. Das Motiv VIII kann die Sequenz vevxtVDxFQGreKdxlilSc
Vr-X(n) umfassen. Das Motiv IX kann die Sequenz iGFLxdxRRINValTRak
umfassen.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 5 Hefeproteine definieren eine Unterklasse
der Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen.
Die MTT1-, UPF1-, DIP1-, SEN1- und DNA2-Helicase-Domänen
wurden unter Verwendung von PILEUP aligniert und die Ergebnisse
unter Verwendung von BOXSHADE in dem GCG- Programm aufgetragen. Die Consensus-Sequenz
ist in der unteren Zeile aufgeführt.
Konservierte identische Reste (dunkelgraues Kästchen) sind durch Großbuchstaben
angezeigt, während
konservierte ähnliche
Reste durch Kleinbuchstaben angezeigt sind (hellgraues Kästchen).
Die Aminosäurezahl
in der primären
Sequenz der jeweiligen Gene ist in der Figur angezeigt.
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2 Ein
mtt1Δ zeigt
Nonsense-Suppression. MTT1, UPF1 oder MTT1 und UPF1 wurden aus dem Hefestamm
KC2 (ura3-52 trp1D leu2-2 tyr7-1) deletiert und diese Zellen wurden
zu einer OD600 = 1,0 gezüchtet. Reihenverdünnungen
dieser Zellen wurden auf -ura-leu-tyr, um auf Nonsense-Suppression
zu prüfen,
und -ura als einer Kontrolle auf Zellwachstum plattiert. Das Wachstum
wurde bei 30 °C
beobachtet und das Wachstum zu 10 Tagen ist oben abgebildet.
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3 Mtt1
ist für
Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall nicht erforderlich.
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UPF1
oder MTT1 und UPF1 wurden aus dem Hefestamm KC2 (ura3-52 trp1D leu2-2
tyr7-1) deletiert und diese Zellen wurden zu einer OD600 =
0,8 gezüchtet.
Gesamt-RNA wurde hergestellt und RNA-Blot-Analyse unterzogen, wobei
eine Sonde für
CYH2-mRNA verwendet wurde.
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4 Mtt1
interagiert mit eRF3. Zytoplasmatische Extrakte aus einem Hefestamm
BJ3505, der mit entweder pG-1 (Vektor) oder pG-1FLAGMTT1 (Flag-Mtt1p) transformiert
wurde, wurden in IBTB hergestellt und mit 30 μl GST-, GST-eRF1-, GST-eRF3-,
GST-eRF3NM- oder
GST-eRF3C-Sepharose/Protein-Komplexen inkubiert. Die Sepharose/Protein-Komplexe
wurden 2 Mal in IBTB (siehe Materialien und Methoden) gewaschen,
in SDS-PAGE-Ladepuffer resuspendiert, auf einem 8 %-igen SDS-PAGE-Gel
getrennt und unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörper einem
Immunoblot unterzogen.
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5 Mtt1
ist mit Polysom assoziiert. Zytoplasmatische Extrakte aus einem Hefestamm
BJ3505, der mit pG-1FLAGMTT1 transformiert wurde, wurden hergestellt
und entweder mit RNase A behandelt oder unbehandelt belassen. Die
Extrakte wurden dann durch einen Saccharose-Gradienten von 7–47 % zentrifugiert.
Die Gradienten wurden geerntet und Fraktionen wurden gesammelt,
während
A254 beobachtet wurde. Die Gradientfraktionen
wurden Western-Blot unter Verwendung von monoklonalem Antikörper zu
dem Flag-Epitop als einer Sonde unterzogen. Die A254-Profile
sind in den oberen Feldern gezeigt, während die Western-Blots der entsprechenden
Fraktionen sind in den unteren Feldern gezeigt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Translationstermination an einem Terminationscodon ist der letzte
Schritt, der die Synthese eines Polypeptids abschließt. Eine
vorzeitige Translationstermination führt zu der Synthese von verkürzten Proteinen und
einem schnellen Abbau von abweichenden mRNAs. Diese Mutationen machen
einen großen
Prozentanteil genetischer Erbkrankheiten aus und eine neuartige
Strategie zum Verringern der Effizienz des Translationsterminationsvorgangs
wurde zur Behandlung dieser Krankheiten entwickelt. Folglich wird
die Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die die
Terminationseffizienz modulieren, sowohl für das Verständnis der Biologie dieses Vorgangs
als auch beim Identifizieren neuer Therapeutika von Bedeutung sein.
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Diese
Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung einer
Familie von RNA-Helicasen, die am Modulieren der Translationstermination
beteiligt sind, insbesondere das MTT1-Gen und dessen Proteinprodukt.
mtt1Δ-Stämme wirken
sich nicht auf den mRNA-Zerfall aus, zeigen jedoch einen Nonsense-Suppressionsphänotyp. Ein
mtt1Δ-upf1Δ-Stamm zeigt
einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp, der größer ist
als ein in Stämmen,
die eine einzige Deletion beherbergen, beobachteter. Biochemische
Ergebnisse zeigen, dass Mtt1p-ATPase/Helicase beteiligt und mit
Polysom assoziiert ist und mit dem Translationsterminationsfaktor
eRF3 interagiert. Zusammengenommen identifizieren die hierin dargestellten
Ergebnisse eine Familie von RNA-Helicasen, die die Translationsterminationseffizienz
in Zellen modulieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen mutierten mtt1Δ-Stamm. Ein
mutierter mtt1Δ-upf1Δ-Stamm zeigt
einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp, der größer ist
als ein in Stämmen,
die eine einzige Deletion beherbergen, beobachteter. Die Erfindung
betrifft Assays, Therapeutika und Screening-Verfahren, die als Antagonist
oder Agonist fungieren, um die Nonsense-Suppression zu modulieren.
Wie hierin gezeigt, zeigt ein mutierter mtt1Δ-upf1Δ-Stamm einen im Vergleich zu
einem upf1Δ-
oder mtt1Δ-Stamm
drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp.
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Diese
Erfindung stellt einen isolierten Komplex bereit, der MTT1, ein
humanes Upf1p-Protein,
einen eukaryotischen Release-Faktor 1 (eRF1) von Peptidyl und einen
eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl umfasst, wobei
der Komplex dahingehend wirksam ist, die Peptidyltransferaseaktivität zu modulieren. Wie
hierin definiert, umfasst ein „Überwachungskomplex" mindestens MTT1,
Upf1p und eukaryotischen Release-Faktor 1 und 3. Das „UPF1"-Gen wird auch als
RENT1 oder HUPF1 bezeichnet. Der Komplex kann auch Upf2p und/oder
Upf3p umfassen.
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Es
kann ein Agens bereitgestellt werden, das an den Komplex bindet,
der die Fidelität
der Translationstermination moduliert. Translationstermination beinhaltet
Initiation, Elongation, Termination und Abbau. Das Agens kann die
Bindung von MTT1 an das Polysom modulieren oder die Bindung von
humanem MTT1 an eRF3 inhibieren. Alternativ kann das Agens die Bindung
von humanem MTT1 an eRF3 erleichtern.
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Die
hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das gereinigte Mtt1p
ebenfalls RNA-abhängige ATPase-
und Helicase-Aktivitäten
zeigt (7). Mehrere Beweisreihen legen
nahe, dass Mtt1p an der Translationstermination beteiligt ist. Die
hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass: 1) ein mtt1Δ-Stamm einen
Nonsense-Suppressionsphänotyp zeigt
(4); 2) das Mtt1p mit Polysom assoziiert ist (6); 3) das Mtt1p direkt mit dem Peptidyl-Release-Faktor
eRF3 interagiert (5); 4) mtt1Δ-Stämme
Paromomycin-Empfindlichkeit zeigen. Wenn man berücksichtigt, dass ein mtt1Δ-Stamm im
Gegensatz zu einem upf1Δ-Stamm
Nonsense enthaltende Transkripte nicht stabilisiert, ist der Umfang
der Nonsense-Suppression pro RNA-Molekül in einem mtt1Δ-Stamm größer als
in einem upf1Δ-Stamm
(3).
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Eine
große
Anzahl von Beobachtungen deutet auf eine wichtige Rolle für die Proteinsynthese
im mRNA-Zerfallsvorgang hin. Tatsächlich scheint es, dass diese
zwei Vorgänge
sich gemeinsam entwickelt haben und dass für einen Vorgang entscheidende
Faktoren auch in dem anderen fungieren. Beweise für diese Verknüpfung beinhalten
Versuche, die zeigen, dass: a) Arzneimittel oder Mutationen, die
die Translationselongation beeinträchtigen, die mRNA-Stabilisierung
fördern,
b) Sequenzelemente, die den schnellen mRNA-Zerfall bestimmen, auf
mRNA kodierende Regionen lokalisiert werden können und die Aktivität solcher
Elemente von deren Translation abhängt, c) Abbaufaktoren mit Ribosom
assoziiert sein können
und d) vorzeitige Translationstermination mRNA-Zerfallsraten verstärken kann.
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Da
die Quantität
eines bestimmten Proteins, das in einer gegebenen Zeit synthetisiert
wird, von der zellulären
Konzentration von dessen mRNA abhängt, folgt daraus, dass die
Regulation von mRNA-Zerfallsraten ein starkes Mittel zum Kontrollieren
der Genexpression liefert. In Säugetierzellen
können
mRNA-Zerfallsraten (als Halbwertzeiten ausgedrückt) lediglich 15–30 Minuten
oder bis zu 500 Stunden betragen. Offensichtlich können solche
Unterschiede bei den mRNA-Zerfallsraten zu bis zu 1000-fachen Unterschieden
beim Spiegel spezifischer Proteine führen. Eine weitere Ebene der
Kontrolle wird durch die Beobachtung bereitgestellt, dass Zerfallsraten
für individuelle
mRNAs nicht festgelegt werden müssen,
sondern als Folge autogener Feedback-Mechanismen, des Vorliegens
spezifischer Hormone, einer bestimmten Stufe der Differenzierung
oder des Zellzyklus oder Virusinfektion reguliert werden können.
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Die
vielleicht besten Beispiele der Integration von Translation und
mRNA-Zerfall sind Studien, die die Folgen vorzeitiger Translationstermination
dokumentieren. Diese erfolgt, wenn Deletion, Basensubstitution oder
Rasterverschiebungsmutationen in DNA zu der Synthese einer mRNA
führen,
die ein ungeeignetes Stoppcodon (Nonsense-Codon) in seiner Protein kodierenden
Region enthält.
Das Auftreten eines solchen vorzeitigen Stoppcodons hält die Translation
an der Stelle früher
Termination an und bewirkt die Synthese eines verkürzten Proteins.
Ungeachtet ihrer „normalen" Zerfallsraten werden
mRNAs, die aus Genen transkribiert werden, die Nonsense-Mutationen
beherbergen (als „Nonsense
enthaltende mRNAs" bezeichnet),
sehr schnell abgebaut. Ein solcher „Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall" ist ubiquitär, d. h.
er wurde in allen getesteten Organismen beobachtet und führt zu einer
bis zu zehn- bis
einhundertfachen Reduktion der Abundanz spezifischer mRNAs. Die
Kombination stark reduzierter mRNA-Abundanz und vorzeitiger terminierter
Translation bewirkt Reduktionen des Gesamtniveaus der Expression
spezifischer Gene, die so dramatisch wie die Folgen einer Gendeletion
sind. Die Bedeutung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls für das menschliche Wohlbefinden
wird durch die Identifizierung einer zunehmenden Anzahl von Erbkrankheiten
illustriert, in denen Nonsense-Mutationen den Krankheitszustand
bewirken und in denen von den jeweiligen mRNAs gezeigt wurde, dass
sie Substrate des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs sind.
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Ein
wichtiger Punkt ist, dass die Inaktivierung des Nonsense-vermittelten
mRNA-Zerfallswegs
erzielt werden kann, ohne das Zellwachstum zu hemmen, und zu der
Wiederherstellung normaler Spiegel und normaler Zerfallsraten für Nonsense
enthaltende mRNAs führt.
Noch bedeutender, die Hefeversuche (und andere) zeigen, dass, obwohl
eine mRNA noch immer ein Nonsense-Codon enthalten kann, die Inaktivierung
dieses Zerfallswegs ermöglicht,
dass genug funktionelles Protein synthetisiert wird, so dass Zellen
den ursprünglichen
genetischen Defekt überwinden
können.
Folglich ist es möglich,
Erkrankungen, die von Nonsense-Mutationen verursacht werden, durch
Herunterregulieren des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs zu behandeln.
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Außerdem wird
ein Expressionsvektor beschrieben, der eine Nukleinsäure umfasst,
die ein MTT1, Upf1p-, Upf2p-, Upf3p-Protein, einen eukaryotischen
Release-Faktor 1 (eRF1) von Peptidyl und einen eukaryotischen Release-Faktor
3 (eRF3) von Peptidyl kodiert, der operativ mit einem Regulationselement
verknüpft ist.
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Beim
Durchführen
der vorliegenden Erfindung können
herkömmliche Molekularbiologie-,
Mikrobiologie- und rekombinante DNA-Techniken innerhalb des Fachkönnens eingesetzt
werden. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert. Siehe
z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hierin „Sambrook
et al., 1989");
DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II (D.N. Glover,
Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg., 1984);
Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1985)]; Transcription
And Translation [B.D. Hames & S.J.
Higgins, Hrsg. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, Hrsg.
(1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press (1986)]; B. Perbal,
A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al.
(Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
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Ein „Vektor" ist ein Replikon,
wie Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angelagert
werden kann, um die Replikation des angelagerten Segments herbeizuführen. Ein „Replikon" ist ein beliebiges
genetisches Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine
autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert, d. h. zur
Replikation unter seiner eigenen Kontrolle im Stande ist. Eine „Kassette" bezieht sich auf
ein DNA-Segment, das an spezifischen Restriktionsstellen in einen
Vektor inseriert werden kann. Das DNA-Segment kodiert ein Polypeptid
von Interesse und die Kassetten- und Restriktionsstellen sind derart
entworfen, dass sie eine Insertion der Kassette in das korrekte
Leseraster zur Transkription und Translation sicherstellen.
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Ein „Nukleinsäuremolekül" bezieht sich auf
die Phosphatester-Polymerform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin,
Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Desoxyribonukleosiden
(Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle") oder beliebige
Phosphoester-Analoga davon, wie Phosphorothioate und -thioester,
in entweder einzelsträngiger
Form oder einer doppelsträngigen Helix.
Doppelsträngige
DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices
sind möglich.
Der Ausdruck Nukleinsäuremolekül und insbesondere
DNA- oder RNA-Molekül bezieht
sich nur auf die primäre
und die sekundäre Struktur
des Moleküls
und beschränkt
es nicht auf etwaige bestimmte tertiäre Formen. Folglich beinhaltet
dieser Ausdruck doppelsträngige
DNA, die unter anderem in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z.
B. Restriktionsfragmenten), Plasmiden und Chromosomen zu finden
ist. Beim Diskutieren der Struktur bestimmter doppelsträngiger DNA-Moleküle können Sequenzen
hierin gemäß des normalen
Grundsatzes, nur die Sequenz in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten
DNA-Strangs (d. h. der Strang mit einer Sequenz, die zu der mRNA
homolog ist) anzugeben, beschrieben werden. Ein „rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, das einer
molekularen biologischen Manipulation unterworfen wurde.
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Transkriptions-
und Translationskontrollsequenzen sind DNA-Regulationssequenzen,
wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, die für die Expression
einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen. In eukaryotischen
Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
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Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion,
die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer
stromabwärts
gelegenen (3'-Richtung)
kodierenden Sequenz initiieren kann. Zum Zwecke des Definierens
der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle
gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die Mindestanzahl an
Basen oder Elementen einzuschließen, die zum Initiieren der
Transkription in Niveaus, die über
den Hintergrund erkennbar sind, erforderlich ist. Innerhalb der
Promotorsequenz werden sich eine Transkriptionsinitiationsstelle
(in geeigneter Weise beispielsweise durch Kartieren mit Nuklease
S1 definiert) sowie Proteinbindungsdomänen (Consensus-Sequenzen),
die für
die Bindung von RNA-Polymerase
verantwortlich zeichnen, befinden. Eine kodierende Sequenz steht „unter
der Kontrolle" von
Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle,
wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert,
die dann trans-RNA-gespleißt und in
das Protein, das von der kodierenden Sequenz kodiert wird, translatiert
wird.
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Eine
große
Anzahl von in der Technik bekannten Vektor/Wirt-Systemen kann verwendet
werden. Mögliche
Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Plasmide
oder modifizierte Viren, das Vektorsystem muss jedoch mit der verwendeten
Wirtszelle kompatibel sein. Beispiele von Vektoren beinhalten, sind jedoch
nicht darauf beschränkt,
E. coli, Bakteriophagen, wie Lambda-Derivate, oder Plasmide, wie pBR322-Derivate
oder pUC-Plasmid-Derivate, z. B. pGEX-Vektoren, pmal-c, pFLAG usw.
Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise durch
Ligieren des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Termini
aufweist, erzielt werden. Wenn die komplementären Restriktionsstellen, die
zum Fragmentieren der DNA verwendet wurden, jedoch nicht in dem
Klonierungsvektor vorliegt, können die
Enden der DNA-Moleküle
enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann eine beliebige gewünschte Stelle
durch Ligieren von Nukleotidsequenzen (Linkern) auf die DNA-Termini
produziert werden; diese ligierten Linker können spezifische, chemisch
synthetisierte Oligonukleotide kodierende Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen
umfassen. Rekombinante Moleküle
können
mittels Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation
usw. in Wirtszellen inseriert werden, so dass viele Kopien des Gens
erzeugt werden. Vorzugsweise ist das klonierte Gen auf einem Shuttle-Vektor-Plasmid
enthalten, der für
die Expansion in einer klonierenden Zelle, z. B. E. coli, und einfache
Reinigung zur anschließenden
Insertion in eine geeignete Expressionszelllinie, falls eine solche
gewünscht
wird, sorgt. Zum Beispiel kann ein Shuttle-Vektor, bei dem es sich
um einen Vektor handelt, der in mehr als einer Art von Organismus
replizieren kann, zur Replikation in sowohl E. coli als auch Saccharomyces
cerevisiae durch Verknüpfen
von Sequenzen aus einem E. coli-Plasmid mit Sequenzen aus dem Hefe-2μ-Plasmid
hergestellt werden.
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Diese
Erfindung kann Agentien identifizieren, die an den Komplex binden,
der die Fidelität
der Translation moduliert. Translation beinhaltet Initiation, Elongation,
Termination sowie Abbau. In einer Ausführungsform inhibiert das Agens
ATPase/Helicase-Aktivität,
Aktivität
von MTT1, Upf1p; GTPase-Aktivität
von eRF1 oder eRF3; RNA-Bindung; Bindung der Faktoren an das Ribosom
oder Bindung der Faktoren aneinander. Das Agens kann die Bindung
von MTT1 an das Polysom modulieren oder die Bindung von humanem
MTT1 an eRF3 inhibieren. Alternativ kann das Agens die Bindung von
humanem MTT1 an eRF3 erleichtern.
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Hierin
wird ein Antikörper
beschrieben, der an den Komplex oder MTT1 bindet. Der Antikörper kann ein
monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Des Weiteren kann
der Antikörper
mit einem nachweisbaren Marker markiert werden, der entweder ein
radioaktiver, kolorimetrischer, fluoreszierender oder ein lumineszierender
Marker ist. Der markierte Antikörper
kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. Der markierte Antikörper kann
ein gereinigter markierter Antikörper
sein. Verfahren zum Markieren von Antikörpern sind in der Technik wohl
bekannt.
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Der
Ausdruck „Antikörper" beinhaltet beispielhaft
sowohl natürlich
vorkommende als auch nicht natürlich
vorkommende Antikörper.
Insbesondere beinhaltet der Ausdruck „Antikörper" polyklonale und monoklonale Antikörper und
Fragmente davon. Darüber
hinaus beinhaltet der Ausdruck „Antikörper" chimäre Antikörper und vollständig synthetische
Antikörper
und Fragmente davon. Solche Antikörper beinhalten, sind jedoch
nicht darauf beschränkt,
polyklonale, monoklonale, chimäre,
einkettige, Fab-Fragmente
und einen Fab-Expressionsbibliothek. Des Weiteren kann das Protein
oder der Antikörper
einen nachweisbaren Marker beinhalten, wobei der Marker ein radioaktiver,
kolorimetrischer, fluoreszierender oder ein lumineszierender Marker
ist.
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Antikörper können zum
Nachweis in vitro markiert werden, z. B. mit Marker wie Enzymen,
Fluorophoren, Chromophoren, Radioisotopen, Farbstoffen, kolloidalem
Gold, Latexteilchen und chemilumineszierenden Agentien. Alternativ
können
die Antikörper
zum Nachweis in vivo markiert werden, z. B. mit Radioisotopen (vorzugsweise
Technetium oder Iod); Magnetresonanzverschiebungsreagenzien (wie
Gadolinium und Mangan) oder strahlenundurchlässige Reagenzien. Die am häufigsten
für diese
Studien eingesetzten Marker sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien,
die bei Exponierung zu ultraviolettem Licht fluoreszieren, und andere.
Eine Reihe fluoreszierender Materialien ist bekannt und kann als
Marker eingesetzt werden. Diese beinhalten beispielsweise Fluoreszein,
Rhodamin, Auramin, Texas Red, AMCA Blue und Lucifer Yellow. Ein
bestimmtes Nachweismaterial ist Anti-Kaninchen-Antikörper, der
Ziegen hergestellt und durch ein Isothiocyanat mit Fluoreszein konjugiert
wird. Das Protein kann auch mit einem radioaktiven Element oder
mit einem Enzym markiert werden. Der radioaktive Marker kann mittels
einer beliebigen der gegenwärtig
verfügbaren
Zählvorgehensweisen
nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re.
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Enzymmarker
sind ebenso geeignet und können
mittels einer beliebigen der gegenwärtig eingesetzten Kolorimetrie-,
Spektrophotometrie-, Fluorospektrophotometrie-, Amperometrie- oder
Gasometrietechniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird mit dem
gewählten
Teilchen mittels Umsetzung mit Brückenmolekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten,
Glutaraldehyd und dergleichen konjugiert. Viele Enzyme, die in diesen
Vorgehensweisen verwendet werden können, sind bekannt und können eingesetzt
werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glukuronidase, β-D-Glukosidase, β-D-Galaktosidase,
Urease, Glukoseoxidase plus -peroxidase und alkalische Phosphatase.
Auf die
US-Patentschriften Nr.
3,654,090 ;
3,850,752 und
4,016,043 wird beispielhaft
bezüglich
ihrer Offenbarungen alternativer Markierungsmaterialien und -verfahren
verwiesen.
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Für einen
Komplex spezifische Antikörper
und Nukleinsäuren
können
als Sonden in Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines komplexen
Polypeptids (unter Verwendung eines Antikörpers) oder einer Nukleinsäure (unter
Verwendung einer Nukleinsäuresonde)
in einer Probe oder einer spezifischen Zellart verwendet werden.
In diesen Verfahren wird ein für
einen Komplex spezifischer Antikörper
oder eine Nukleinsäuresonde
mit einer Probe von einem Patienten, von dem vermutet wird, dass
er eine mit dem Komplex zusammenhängende Erkrankung hat, in Kontakt
gebracht und die spezifische Bindung des Antikörpers oder der Nukleinsäuresonde
an die Probe nachgewiesen. Der Spiegel des Komplexes oder der Nukleinsäure, der
in der suspekten Probe vorliegt, kann mit dem Spiegel in einer Kontrollprobe
verglichen werden, z. B. einer äquivalenten
Probe von einer nicht betroffenen Einzelperson, um zu ermitteln,
ob der Patient eine mit dem Komplex zusammenhängende Erkrankung hat. Komplexe
Polypeptide oder Fragmente davon können ebenfalls als Sonden in
Diagnoseverfahren verwendet werden, beispielsweise um das Vorliegen
von mit einem Komplex spezifischen Antikörpern in Proben nachzuweisen.
Darüber
hinaus könnten
mit einem Komplex spezifische Antikörper zum Nachweisen von neuartigen
Kofaktoren verwendet werden, die mit dem Komplex oder dem Fragment
davon einen Komplex gebildet haben.
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Ein
Vorliegen, eine relative Abundanz oder ein Fehlen des Komplexes
wird über
die Bindung der Antikörper
ermittelt. Zu möglichen
Nachweisverfahren zählen
Affinitätschromatographie,
Western-Blot oder andere Durchschnittsfachmännern wohl bekannte Techniken.
Dieser Ansatz setzt Antisense-Nukleinsäure und Ribozyme ein, um die
Translation einer spezifischen mRNA zu blockieren, indem entweder
diese mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure maskiert oder sie mit einem
Ribozym gespalten wird.
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Antisense-Nukleinsäuren sind
DNA- oder RNA-Moleküle,
die zu mindestens einem Abschnitt eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (siehe
Marcus-Sekura, 1988,
Anal. Biochem. 172:298). In der Zelle hybridisieren sie an diese
mRNA, wobei ein doppelsträngiges
Molekül
gebildet wird. Die Zelle translatiert eine mRNA nicht in diese Doppelstrangform.
Folglich beeinträchtigen
Antisense-Nukleinsäuren
die Expression von mRNA in Protein. Oligomere von etwa fünfzehn Nukleotiden
und Molekülen,
die an das AUG-Initiationscodon hybridisieren, werden besonders
effektiv sein, da sie leicht zu synthetisieren sind und wahrscheinlich
weniger Probleme aufwerfen als größere Moleküle, wenn sie in Organzellen
eingeführt
werden. Antisense-Verfahren
wurden zum Inhibieren der Expression vieler Gene in vitro verwendet
(Marcus-Sekura, 1988, oben; Hambor et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1237).
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Ribozyme
sind RNA-Moleküle,
die über
die Fähigkeit
verfügen,
andere einzelsträngige
RNA-Moleküle in
einer zu DNA-Restriktionsendonukleasen einigermaßen analogen Art und Weise
spezifisch zu spalten. Ribozyme wurden über die Beobachtung entdeckt,
dass bestimmte mRNAs die Fähigkeit
aufweisen, ihre eigenen Introns zu exzisieren. Durch Modifizieren
der Nukleotidsequenz dieser RNAs waren Forscher in der Lage, Moleküle zu konstruieren,
die spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen
und es spalten (Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:3030). Da sie sequenzspezifisch
sein, werden nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert.
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Prüfer haben
zwei Arten von Ribozymen identifiziert, die Tetrahymena-Art und
die „Hammerkopf"-Art. Ribozyme der
Tetrahymena-Art erkennen Sequenzen von vier Basen, während die „Hammerkopf"-Art Sequenzen von
elf bis achtzehn Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz
ist, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie ausschließlich in
der Ziel-mRNA-Spezies auftritt. Folglich sind Ribozyme der Hammerkopf-Art
gegenüber
Ribozymen der Tetrahymena-Art zum Inaktivieren einer spezifischen
mRNA-Spezies bevorzugt und Erkennungssequenzen von achtzehn Basen
sind gegenüber
kürzeren
Erkennungssequenzen bevorzugt.
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Eine
beliebige in der Technik bekannte Screening-Technik kann zum Screenen
auf Agentien, die ein Translationsterminations- oder ein mRNA-Zerfallsprotein
beeinflussen, angewendet werden. Die vorliegende Erfindung zieht
Screenings auf Kleinmolekülliganden
in Erwägung.
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Eine
Kenntnis der primären
Sequenz eines Translationsterminations- oder mRNA-Zerfallsproteins
und der Ähnlichkeit
dieser Sequenz mit Proteinen mit bekannter Funktion können einen
ersten Hinweis auf Agentien liefern, von denen wahrscheinlich ist,
dass sie die Proteinaktivität
beeinflussen. Die Identifizierung solcher Agentien und das Screenen
auf diese werden durch Ermitteln von Strukturmerkmalen des Proteins,
z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie,
Neutronenbeugung, NMR-Spektroskopie
und anderer Techniken zur Strukturbestimmung, weiter erleichtert.
Diese Techniken stellen das rationelle Design oder die Identifizierung
von Agonisten und Antagonisten zur Verfügung.
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Das
Screening kann mit rekombinanten Zellen, die die Proteine exprimieren,
Komplexen, die an dem Translationsterminations- oder mRNA-Zerfallsprotein
beteiligt sind, oder alternativ mit dem gereinigten Protein durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann die Fähigkeit
von markiertem Protein, an ein Molekül in einer Kombinationsbibliothek
zu binden, als ein Screening-Assay angewendet werden, wie in den
vorstehenden Referenzen beschrieben.
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Eine
Kandidatenwirtszelle kann auf die Menge des Komplexes gescreent
werden, der von der Zelle im Verhältnis zu einer Kontrollzelle
produziert wird. Ein Verfahren umfasst a) das Bereitstellen einer
klonalen Population der Kandidatenwirtszelle; b) das Behandeln der
klonalen Population von Zellen, so dass die intrazellulären Proteine
gegenüber
einem Antikörper
zugänglich
sind; c) das Inkontaktbringen der intrazellulären Proteine mit einem Antikörper, der
spezifisch an den Komplex bindet; und d) das Ermitteln der relativen
Menge des Komplexes, der von der Kandidatenwirtszelle produziert
wird.
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Verfahren
zum Screenen des MTT1-Gens zum Identifizieren von Mutationen können durchgeführt werden.
Solche Verfahren können
weiterhin den Schritt des Amplifizierens eines Abschnitts des MTT1-Gens umfassen
und können
weiterhin einen Schritt des Bereitstellens eines Satzes von Polynukleotiden
beinhalten, bei denen es sich um Primer zur Amplifikation des Abschnitts
des MTT1-Gens handelt. Das Verfahren ist zum Identifizieren von
Mutationen zur Verwendung in entweder der Diagnose der Veranlagung
für und
der Diagnose und Behandlung von Megakaryozytenanomalie, hämopoetischer
Erkrankungen, myeloproliferativer Erkrankung, Thrombozytenstörung, Leukämie und
der pränatalen
Diagnose und Behandlung von Tumoren von Nutzen. Geeignete Diagnosetechniken
beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
(FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrangkonformationsanalyse
(single-stranded conformation analysis, SSCA), RNase-Schutz-Assay,
allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP,
wie im Folgenden weiter ausführlich
beschrieben.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel
bereit, das an der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation beteiligt
ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkontaktbringen
von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel und b) Prüfen auf
Modulation des Komplexes, wobei ein Arzneimittel, das den Komplex
moduliert, an der Peptidyltransferaseaktivität beteiligt ist. Des Weiteren
kann der Komplex auf NTPase-Aktivität, wie ATPase, GTPase, RNA- Bindungsaktivität, Faktoren,
die an den Komplex binden, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, eRF1
und eRF3, Faktoren, die von dem Ribosom dissoziieren, Faktoren,
die Aggregation fördern;
Faktoren, die die Translationstermination durch Verlangsamen der Peptidhydrolyse
verstärken,
geprüft
werden.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel
bereit, das aktiv an der Verstärkung
der Translationstermination beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes
umfasst: a) Inkontaktbringen von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel
und b) Prüfen
auf Modulation des Proteinkomplexes; wobei ein Arzneimittel, das
den Proteinkomplex moduliert, an der Verstärkung der Translationstermination
beteiligt ist.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel
bereit, das an der Verstärkung der
Translationstermination beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes
umfasst: a) Inkubieren des Arzneimittels und des Komplexes und b)
Messen der Auswirkung auf die Nonsense-Suppression, wodurch auf
ein Arzneimittel gescreent wird, das an der Verstärkung der
Translationstermination beteiligt ist. Bei den Assays kann es sich
um einen RNA-Bindungsassay oder NTPase-Assays, wie ATPase- oder
GTPase-Assays handeln, die Fachmännern
bekannt sind.
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Hierin
wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Gens mit einem mutierten
Allel beschrieben, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren
einer Zelle mit einem rekombinanten MTT1-Expressionsvektor; (b)
Ermitteln des Phänotyps
der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach der
Transfektion mit dem Zellphänotyp
vor der Transfektion und (d) Identifizieren des Gens, das das mutierte Allel
enthält,
der transfizierten Zelle.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung
bereit, die die Bindung an MTT1 moduliert, wobei das Verfahren Folgendes
umfasst: (a) Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung
umfassen, und MTT1, wobei das Inkubieren unter Bedingungen durchgeführt wird,
die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen;
und (b) Messen der Auswirkung der Testzusammensetzung auf die Bindung
an MTT1. In einer Ausführungsform
umfasst das Verfahren weiterhin das Identifizieren eines Gens, wobei
das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Einführen einer Testzusammensetzung,
die die Bindung an MTT1 moduliert, in eine Zelle; (b) Bestimmen
des Phänotyps
der Zelle nach (a); (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach (a) mit dem Zellphänotyp vor
(a) und (d) Identifizieren des Gens der Zelle, in die die Testzusammensetzung
eingeführt
wurde.
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Eine „Testzusammensetzung", wie hierin verwendet,
ist eine beliebige Zusammensetzung, wie ein Gen, eine Nukleinsäuresequenz,
ein Polypeptid, ein Peptidfragment oder eine Zusammensetzung, die
durch die Verwendung einer Kombinationsbibliothek oder eines anderen
Kombinationsvorgangs erzeugt wurde und auf ihre Fähigkeit
zum Fungieren in gegebener Kapazität geprüft werden kann, oder eine Verbindung,
die die Aktivität
des Komplexes nachahmt. Oftmals wird von einer solchen Testzusammensetzung,
einer solchen Nukleinsäuresequenz
oder einem solchen Polypeptid aufgrund ihrer bzw. seiner Sequenz
oder Struktur vermutet, dass sie bzw. es in einer gegebenen Kapazität fungieren
kann.
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Ein „Kofaktor" ist eine beliebige
Zusammensetzung (z. B. ein Polypeptid, ein Polypeptidderivat oder ein
Peptidomimetikum), die den Komplex modulieren und NMD oder die Effizienz
der Translationstermination beeinflussen kann. Beinhaltet sind Zusammensetzungen,
die NMD oder die Effizienz oder Fidelität der Translationstermination über den
Komplex natürlich
induzieren; ebenfalls beinhaltet sind Zusammensetzungen, die NMD
nicht natürlich
induzieren (z. B. künstliche
Zusammensetzungen und natürliche
Zusammensetzungen, die anderen Zwecken dienen).
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Der
Ausdruck „Agonist", wie hierin verwendet,
steht für
eine beliebige Zusammensetzung, die die Effizienz oder Fidelität der Translationstermination
oder den mRNA-Abbau durch Interagieren mit oder Binden an den Komplex
oder Faktoren, wie eRF3 oder upf1, des Komplexes, die mit MTT1 des
Komplexes interagieren, steigern oder stimulieren kann. Der Ausdruck „Antagonist", wie hierin verwendet,
steht für
eine beliebige Zusammensetzung, die die Effizienz oder Fidelität der Translationstermination
oder den mRNA-Abbau durch Interagieren mit oder Binden an den Komplex,
MTT1 oder Faktoren, wie eRF3 oder upf1, des Komplexes, die mit MTT1
des Komplexes interagieren, senken kann.
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Die
Identifizierung und Isolierung eines Gens, das ein MTT1 der Erfindung
kodiert, sorgt für
die Expression von MTT1 in Mengen, die größer sind, als sie aus natürlichen
Quellen isoliert werden können,
oder in Indikatorzellen, die speziell darauf konstruiert sind, die
Aktivität
von MTT1 anzuzeigen, das nach der Transfektion oder Transformation
der Zellen exprimiert wird. Dementsprechend zieht die vorliegende
Erfindung neben dem rationellen Design von Agonisten und Antagonisten
auf Grundlage der Struktur von MTT1 ein alternatives Verfahren zum
Identifizieren spezifischer Liganden von MTT1 unter Anwendung verschiedener,
in der Technik bekannter Screening-Assays in Erwägung.
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Eine
beliebige, in der Technik bekannte Screening-Technik kann zum Screenen
auf MTT1-Agonisten oder -Antagonisten angewendet werden. Die vorliegende
Erfindung zieht Screenings auf kleine Moleküle in Erwägung, die an MTT1 binden und
MTT1 in vitro und/oder in vivo agonisieren oder antagonisieren.
Zum Beispiel können
Bibliotheken natürlicher
Produkte unter Anwendung von Assays der Erfindung auf Moleküle gescreent werden,
die die Aktivität
von MTT1 agonisieren oder antagonisieren.
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Eine
Kenntnis der primären
Sequenz des MTT1 und der Ähnlichkeit
dieser Sequenz mit anderen DNA-Bindeproteinen können einen ersten Hinweis auf
die Inhibitoren oder Antagonisten des MTT1 liefern. Die Identifizierung
von Antagonisten und das Screenen auf diese werden durch Ermitteln
von Strukturmerkmalen des Proteins, z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie,
Neutronenbeugung, NMR-Spektroskopie und anderer Techniken zur Strukturbestimmung,
weiter erleichtert. Diese Techniken stellen das rationelle Design
oder die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten zur Verfügung.
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Ein
anderer Ansatz setzt rekombinanten Bakteriophagen ein, um große Bibliotheken
zu produzieren. Unter Anwendung des „Phage"-Verfahrens [Scott und Smith, 1990,
Science 249:386–390
(1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378–6382 (1990); Devlin
et al., Science, 249:404–406
(1990)] können
sehr große Bibliotheken
konstruiert werden (10
6–10
8 chemische
Einheiten). Ein zweiter Ansatz setzt vorwiegend chemische Verfahren
ein, von denen das Geysen-Verfahren [Geysen et al., Molecular Immunology
23:709–715 (1986);
Geysen et al., J. Immunologic Method 102:259–274 (1987)] und das Verfahren
von Fodor et al. [Science 251:767–773 (1991)] Beispiele sind.
Furka et al. [14th International Congress of Biochemistry, Band
5, Zusammenfassung FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein
Res. 37:487–493
(1991)], Houghton [
US-Patentschrift Nr.
4,631,211 , erteilt im Dezember 1986] und Rutter et al.
[
US-Patentschrift Nr. 5,010,175 ,
erteilt am 23. April 1991] beschreiben Verfahren zum Produzieren
eines Gemischs von Peptiden, die als Agonisten oder Antagonisten
getestet werden können.
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In
einem anderen Gesichtspunkt können
synthetische Bibliotheken [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:10700–10704
(1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922–10926 (1993);
Lam et al., internationale Patentveröffentlichung Nr.
WO 92/00252 ; Kocis et al., internationale
Patentveröffentlichung
Nr.
WO 9428028 ] können zum
Screenen auf MTT1-Liganden gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Das
Screenen kann mit rekombinanten Zellen, die das MTT1 exprimieren,
oder alternativ unter Verwendung von gereinigtem Protein und/oder
spezifischen strukturellen/funktionellen Domänen von MTT1s, z. B. rekombinant
produziert, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann
eine markierte MTT12-Dimerisationsdomäne zum Screenen
von Bibliotheken, wie in den vorstehenden Referenzen beschrieben,
auf kleine Moleküle,
die die Dimerisation des MTT12 inhibieren werden, verwendet werden.
-
Die
Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren zum Nachweisen neuartiger Kofaktoren oder Inhibitoren bereit,
die MTT1 binden, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer
Probe, die MTT1 umfasst, mit Testzusammensetzungen und das Messen
der Änderung
des NMRD nach Anwendung der Testzusammensetzung umfasst. Das MTT1-Protein
der vorliegenden Erfindung ist in einem Screening-Verfahren zum Identifizieren neuartiger
Testverbindungen oder neuartiger Testzusammensetzungen, die den
NMRD über
MTT1 beeinflussen, von Nutzen. Folglich stellt die Erfindung in
einer anderen Ausführungsform
ein Verfahren zum Screenen auf Testzusammensetzungen bereit, was
das Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung enthalten,
und MTT1 unter Bedingungen, die dazu ausreichen, das Interagieren
der Komponenten zu ermöglichen;
dann anschließend
das Messen der Auswirkung, die die Testzusammensetzung auf den NMRD
in einer Testzelle hat, umfasst. Die beobachtete Auswirkung auf
den NMD zwischen MTT1 und einer Zusammensetzung kann entweder agonistisch
oder antagonistisch sein. Vorzugsweise ist das Polypeptid, das das
MTT1 kodiert, das Polypeptid oder ein synthetisches Peptid, das
die biologische Aktivität
des MTT1-Proteins aufweist.
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Da
MTT1 mit der UPF1-Familie in Hefe eng verwandt ist, bezieht sich
der Ausdruck „MTT1-spezifische Sonde" im Rahmen dieser
Erfindung auf Sonden, die in einem nachweisbar größeren Ausmaß als an
Nukleinsäuren,
die UPF1-Sequenzen kodieren, oder an komplementäre Sequenzen davon an Nukleinsäuren, die MTT1-Polypeptide
kodieren, oder an komplementäre
Sequenzen davon, binden. Der Ausdruck „MTT1-spezifische Sonde" beinhaltet folglich Sonden, die in
einem nennenswerten Ausmaß an
Nukleinsäuren,
die MTT1-Polypeptide kodieren, (oder an komplementäre Sequenzen
davon), jedoch nicht an Nukleinsäuren,
die PF-Sequenzen kodieren, (oder an komplementäre Sequenzen davon) binden.
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Die
Erfindung erleichtert die Produktion von MTT1-spezifischen Nukleinsäuresonden.
Verfahren zum Erhalten solcher Sonden können auf Grundlage der Aminosäuresequenz-Alignments,
die in 1 gezeigt sind, entwickelt
werden. Die Sonden, die mindestens 9, z. B. mindestens 12, 15, 25,
35, 50, 100 oder 150 Nukleotide enthalten können, können unter Anwendung einer
beliebigen von mehreren Standardverfahren produziert werden (siehe
z. B. Ausubel et al., oben). Zum Beispiel werden die Sonden vorzugsweise
unter Anwendung von PCR-Amplifikationsverfahren, wie den im Folgenden
beschrieben, erzeugt. In diesen Verfahren werden Primer entworfen,
die MTT1-Sequenzen entsprechen, die MTT1-spezifische Aminosäuren beinhalten
können,
und das resultierende PCR-Produkt wird als eine Sonde zum Screenen
einer Nukleinsäurebibliothek,
wie einer cDNA-Bibliothek, verwendet.
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Die
MTT1-spezifischen Nukleinsäuresonden
können
mit einer Verbindung markiert werden, die den Nachweis der Bindung
an die MTT1-Nukleinsäure
in der Probe erleichtert. Zum Beispiel kann die Sonde biotinylierte
Nukleotide enthalten, an die nachweisbar markierte Avidin-Konjugate
(z. B. mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Avidin) binden können. Diese
Sonden können
in Nukleinsäurehybridisierungsassays
zum Nachweisen veränderter
Spiegel von MTT1 s in einer Probe verwendet werden. Zum Beispiel
können
In-situ-Hybridisierungs-, RNase-Schutz- und Northern-Blot-Verfahren angewendet
werden. Andere Standard-Nukleinsäurenachweisverfahren,
die in der Erfindung verwendet werden können, sind Fachmännern bekannt
(siehe z. B. Ausubel et al., oben). Darüber hinaus, wenn es sich bei
dem diagnostischen Molekül
um eine Nukleinsäure handelt,
kann sie vor der Bindung mit einer MTT1-spezifischen Sonde amplifiziert
werden. Vorzugsweise wird PCR angewendet, es können jedoch andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren,
wie die Ligase-Kettenreaktions-(ligase chain reaction, LCR), ligierte
aktivierte Transkriptions-(LAT) und nukleinsäuresequenzgestützte Amplifikationsverfahren
(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) angewendet werden.
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Ein
Verfahren zum Ermitteln, ob ein Testagens oder eine Testzusammensetzung
den Komplex in einer Zelle moduliert, kann durch (i) Bereitstellen
einer Zelle, die den Komplex aufweist; (ii) Inkontaktbringen der
Zelle mit einem Testagens oder einer Testzusammensetzung, das bzw.
die in Abwesenheit des Testagens oder der Testzusammensetzung den
Komplex in der Zelle aktiviert; und (iii) Nachweisen einer Veränderung
des Komplexes der Zelle durchgeführt
werden. Eine Zelle kann entweder gleichzeitig oder sequentiell mit
dem Testagens oder der Testzusammensetzung in Kontakt gebracht werden.
Eine Zunahme des Komplexes zeigt an, dass das Testagens oder die
Testzusammensetzung ein Agonist des Komplexes ist, während eine
Abnahme des Komplexes anzeigt, dass das Testagens oder die Testzusammensetzung
ein Antagonist des Komplexes ist. Auf Wunsch kann das oben beschriebene
Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren des Komplexes zum Identifizieren
von Zusammensetzungen, Kofaktoren oder anderen Zusammensetzungen
in dem Komplexweg, die den Komplex umfassen, zur Verwendung in diesem
Gesichtspunkt der Erfindung angewendet werden. Ein beliebiges Agens
oder eine beliebige Zusammensetzung kann als ein Testagens oder
eine Testzusammensetzung beim Ausüben der Erfindung verwendet
werden; ein bevorzugtes Testagens oder eine bevorzugte Testzusammensetzung
beinhaltet Polypeptide und kleine organische Agentien oder Zusammensetzungen.
Obgleich Sequenz- oder Strukturhomologie eine Grundlage für die Vermutung,
dass ein Testagens oder eine Testzusammensetzung den Komplex in
einer Zelle modulieren kann, bereitstellen kann, sind zufällig gewählte Testagentien
oder -zusammensetzungen ebenfalls zur Verwendung in der Erfindung
geeignet. In der Technik bekannte Verfahren zum zufälligen Erzeugen
eines Agens oder von Zusammensetzungen (z. B. Expression von Polypeptiden
aus Nukleinsäurebibliotheken)
können
zum Produzieren geeigneter Testagentien oder -zusammensetzungen
angewendet werden. Fachmänner
werden erkennen, dass alternative Techniken anstelle der hierin
beschriebenen bestimmten Techniken angewendet werden können.
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Ein
Verfahren zum Nachweisen neuartiger Kofaktoren oder Inhibitoren,
die den Komplex binden, umfasst das Inkontaktbringen einer Probe,
die den Komplex umfasst, mit Testzusammensetzungen und das Messen
der Veränderung
des Komplexes nach der Anwendung der Testzusammensetzung. Der Komplex
der vorliegenden Erfindung ist in einem Screening-Verfahren zum
Identifizieren neuartiger Testverbindungen oder neuartiger Testzusammensetzungen,
die sich auf den Komplex auswirken, von Nutzen. Folglich beinhaltet
das Verfahren ein Verfahren zum Screenen auf Testzusammensetzungen,
das das Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung
beinhalten, und des Komplexes unter Bedingungen, die dazu ausreichen,
das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen, dann anschließend das
Messen der Auswirkung, die die Testzusammensetzung auf den Komplex
in einer Testzelle hat, umfasst. Die beobachtete Auswirkung auf
den Komplex und eine Zusammensetzung kann entweder agonistisch oder
antagonistisch sein.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation
bereit, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Komplex in
einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Translationstermination
zu erleichtern, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert
wird, umfasst. Ein Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der
Translation kann das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Agens
in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Nonsense-Translationstermination
zu supprimieren, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert
wird, umfassen. Die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation findet
während
der Initiation, der Elongation, der Termination und dem Abbau von
mRNA statt.
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Ein
Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination
von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden
Transkripten kann das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Agens
in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Bindung von Mtt1
und eRF3 zu inhibieren, wodurch die Effizienz der Translationstermination
von mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von
abweichenden Transkripten gefördert
wird, umfassen.
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Ein
Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination
von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden
Transkripten kann das Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Agens,
das die ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1
inhibiert, wodurch die Effizienz der Translationstermination von
mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von abweichenden Transkripten
gefördert
wird, umfassen.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet „Modulation" der Translationsfidelität, die Aktivität des Translationsapparats
zu verändern,
um die Fidelität
der Reaktion zu erhöhen
oder zu verringern, ohne den Vorgang vollständig zu inhibieren. Zum Beispiel
findet das Modulieren des Translationsterminationsvorgangs an einem
Nonsense-Codon als Folge des Veränderns
der Fähigkeit
der Translations-Release-Faktoren am Terminationscodon statt, um
die Peptidylfreisetzung bei Kompetition nahezu zugehörigen tRNAs
zu fördern.
Das Endergebnis würde
darin bestehen, dass die nahezu zugehörige tRNA in die Polypeptidkette
integriert und die Termination supprimiert wird. Da die meisten
Proteine nur zu 5 % bis 20 % der Wildtyp-Spiegel exprimiert werden
müssen, muss
die Translationstermination nicht inhibiert werden. Der Terminationsvorgang
muss derart moduliert werden, dass er um einen geringen Grad weniger
effizient ist.
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Agentien,
die NTPase-Aktivität,
wie ATPase-Aktivität,
GTPase-, Helicase-Aktivität,
oder die Zinkfingermotiv-Konfiguration beeinträchtigen, können zum Testen ausgewählt werden.
Solche Agentien können
geeignete Arzneimittel zum Behandeln von Virusinfektionen sein,
da viele Retroviren, insbesondere HIV, Coronaviren und andere RNA-Viren
mit medizinischen und tiermedizinischen Pathologien zusammenhängen. Durch Bereitstellen
der Identität
von Proteinen, die Rasterverschiebungsereignisse modulieren, kann
ein erster Screen auf Agentien einen Bindungsassay auf solche Proteine
beinhalten. Dieser Assay kann zum Testen auf die Wirksamkeit von
Agentien gegenüber
der Aktivität
von mit Rasterverschiebung zusammenhängenden Proteinen vom Menschen
sowie von Hefe oder einer anderen nichtmenschlichen Quelle, einschließlich, jedoch nicht
darauf beschränkt,
Tieren eingesetzt werden.
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Zum
Beispiel ist die Identifizierung von Agentien, die den Zerfallsweg
inhibieren, Nonsense-Transkripte stabilisieren oder die Effizienz
der Translationstermination modulieren, für den Erfolg von Antisense-RNA-Technologie
wichtig. Antisense-RNAs sind kleine, diffusionsfähige, untranslatierte und stark
strukturierte Transkripte, die an spezifischen Ziel-RNAs an Komplementaritätsregionen
Paare bilden, wodurch die Ziel-RNA-Funktion
oder -Expression kontrolliert wird. Versuche, Antisense-RNA-Technologie anzuwenden, haben
jedoch begrenzten Erfolg gezeigt. Der begrenzende Faktor scheint
darin zu bestehen, ausreichende Konzentrationen der Antisense-RNA
in einer Zelle zu erzielen, um die Expression des Zielgens zu inhibieren oder
zu verringern. Es ist wahrscheinlich, dass ein Hindernis, eine ausreichende
Konzentration zu erzielen, der Nonsense-Zerfallsweg ist, da die
kurzen Antisense-RNA-Transkripte, die nicht ein Genprodukt kodieren
sollen, wahrscheinlich zu einer schnellen Translationstermination,
wenn eine Translation stattfindet, und demzufolge zu einem schnellen
Abbau und einer geringen Abundanz der Antisense-RNA in der Zelle
führen
werden. Folglich können
die Agentien der Erfindung, die abweichende mRNA-Transkripte stabilisieren,
auch Antisense-RNAs stabilisieren.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination
von mRNA und/oder des Abbaus abweichender Transkripte in einer Zelle
bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Bereitstellen
einer Zelle, die einen Vektor enthält, der die Nukleinsäure umfasst,
die den Komplex kodiert, oder eine Antisense davon; b) Überexprimieren
des Nukleinsäurevektors
in der Zelle, um einen überexprimierten
Komplex zu produzieren, um die Funktion des Komplexes zu beeinträchtigen
oder zu inhibieren.
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Ein
Verfahren zum Ermitteln, ob ein Proband eine Mutation in dem MTT1-Gen
trägt,
kann Folgendes umfassen: (a) Beziehen einer geeigneten Nukleinsäureprobe
von dem Probanden und (b) Ermitteln, ob die Nukleinsäure von
Schritt (a) eine Nukleinsäure,
die mutiertes MTT1 kodiert, ist oder von einer solchen abgeleitet ist,
um dadurch zu ermitteln, ob ein Proband eine Mutation in dem MTT1-Gen
trägt.
Die Nukleinsäureprobe
in Schritt (a) kann mRNA umfassen, die dem Transkript von DNA entspricht,
die ein mutiertes MTT1 kodiert, und das Ermitteln von Schritt (b)
umfasst Folgendes: (i) Inkontaktbringen der mRNA mit dem Oligonukleotid
unter Bedingungen, die das Binden der mRNA an das Oligonukleotid
ermöglichen,
um einen Komplex zu bilden; (ii) Isolieren des so gebildeten Komplexes
und (iii) Identifizieren der mRNA in dem isolierten Komplex, um
dadurch zu ermitteln, ob die mRNA eine Nukleinsäure, die mutiertes MTT1 kodiert,
ist oder von einer solchen abgeleitet ist. Das Ermitteln von Schritt
(b) kann Folgendes umfassen: (i) Inkontaktbringen der Nukleinsäureprobe
von Schritt (a) und der isolierten Nukleinsäure mit Restriktionsenzymen
unter Bedingungen, die den Verdau der Nukleinsäureprobe und der isolierten
Nukleinsäure
zu verschiedenen, unterscheidbaren Nukleinsäureteilen ermöglichen;
(ii) Isolieren der Nukleinsäureteile
und (iii) Vergleichen der Nukleinsäureteile, die von der Nukleinsäureprobe
abgeleitet wurden, mit den Nukleinsäureteilen, die von der isolierten
Nukleinsäure
abgeleitet wurden, um dadurch zu ermitteln, ob die Nukleinsäureprobe
eine Nukleinsäure,
die mutiertes MTT1 kodiert, ist oder von einer solchen abgeleitet
ist.
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Es
wird ein transgenes nichtmenschliches Säugetier beschrieben, das mindestens
einen Abschnitt der Nukleinsäure,
die MTT1-Gen kodiert und Upf1p, das in einem embryonalen Stadium
in das Säugetier
eingeführt
wurde, umfasst. Verfahren zum Produzieren eines transgenen nichtmenschlichen
Säugetiers
sind Fachmännern
bekannt.
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Ein
Verfahren zum Nachweisen einer Störung, die mit der Expression
von mtt1 zusammenhängt,
kann das Inkontaktbringen einer Probe von einem Probanden, der eine
Störung
aufweist oder von dem vermutet wird, dass er eine Störung aufweist,
mit einem Reagens, das die Expression des mtt1 nachweist, und das Nachweisen
der Bindung des Reagens in der Probe umfassen.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands
bereit, der mit einem Defekt in dem Komplex nach Anspruch 5 einhergeht,
wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle
mit einer Nukleinsäure,
die den Komplex kodiert; (b) Ermitteln des Anteils des defekten
Komplexes der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Anteils
des defekten Komplexes der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil
des defekten Komplexes der Zelle vor der Transfektion.
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Wie
oben angemerkt, führt
Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall zu zellulären Mängeln an lebensnotwendigen
Proteinen und somit zu einer Erkrankung. Eine veränderte Kontrolle
der Stabilität
normaler mRNAs kann vergleichsweise schlimme Folgen haben.
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Diese
Erfindung ermöglicht
die Behandlung einer Erkrankung, die mit der Peptidyltransferaseaktivität zusammenhängt, wobei
die Behandlung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Komplex von Anspruch
5 oder die Agentien, die den Komplex modulieren oder stimulieren,
umfasst, und einen pharmazeutischen Trägerstoff oder ein pharmazeutisches
Verdünnungsmittel
an einen Probanden, wodurch der Proband behandelt wird, umfasst.
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Nonsense-Mutationen
verursachen ungefähr
20–40
% der einzelnen Fälle
von mehr als 240 verschiedenen Erbkrankheiten (einschließlich Mukoviszidose,
Hämophilie,
familiärer
Hypercholesterinämie,
Retinitis pigmentosa, Duchenne-Muskeldystrophie und Marfan-Syndrom).
Bei vielen Erkrankungen, in denen nur ein Prozent des funktionellen
Proteins produziert wird, leiden Patienten unter schweren Krankheitssymptomen, wohingegen
das Fördern
der Expression auf nur fünf
Prozent der normalen Niveaus die Schwere beträchtlich reduzieren oder die
Erkrankung ausmerzen kann. Darüber
hinaus resultiert eine bemerkenswert große Anzahl der meistverbreiteten
Formen von Dickdarm-, Brust-, Speiseröhren-, Lungen-, Kopf- und Hals-,
Blasenkrebs aus Rasterverschiebung und Nonsense-Mutationen in Regulationsgenen
(d. h. p53, BRCA1, BRCA2 usw.). Das Korrigieren von Nonsense-Mutationen in den
Regulationsgenen, um die Synthese der jeweiligen Proteine zu ermöglichen,
sollte den Tod der Krebszellen bewirken.
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Eine
große
Anzahl von Beobachtungen deutet auf eine wichtige Rolle für die Proteinsynthese
in der Fidelität
der Translationstermination und im mRNA-Zerfallsvorgang hin. Tatsächlich scheint
es, dass diese zwei Vorgänge
sich gemeinsam entwickelt haben und dass für einen Vorgang entscheidende
Faktoren auch in dem anderen fungieren. Beweise für diese
Verknüpfung
beinhalten Versuche, die zeigen, dass: a) Arzneimittel oder Mutationen,
die die Translationselongation beeinträchtigen, die mRNA-Stabilisierung
fördern,
b) Sequenzelemente, die den schnellen mRNA-Zerfall bestimmen, auf mRNA kodierende
Regionen lokalisiert werden können
und die Aktivität
solcher Elemente von deren Translation abhängt, c) Abbaufaktoren mit Ribosom
assoziiert sein können
und d) vorzeitige Translationstermination mRNA-Zerfallsraten verstärken kann.
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Da
die Quantität
eines bestimmten Proteins, das in einer gegebenen Zeit synthetisiert
wird, von der zellulären
Konzentration von dessen mRNA abhängt, folgt daraus, dass die
Regulation von mRNA-Zerfallsraten ein starkes Mittel zum Kontrollieren
der Genexpression liefert. In Säugetierzellen
können
mRNA-Zerfallsraten (als Halbwertzeiten ausgedrückt) lediglich 15–30 Minuten
oder bis zu 500 Stunden betragen. Offensichtlich können solche
Unterschiede bei den mRNA-Zerfallsraten zu bis zu 1000-fachen Unterschieden
beim Spiegel spezifischer Proteine führen. Eine weitere Ebene der
Kontrolle wird durch die Beobachtung bereitgestellt, dass Zerfallsraten
für individuelle
mRNAs nicht festgelegt werden müssen,
sondern als Folge autogener Feedback-Mechanismen, des Vorliegens
spezifischer Hormone, einer bestimmten Stufe der Differenzierung
oder des Zellzyklus oder Virusinfektion reguliert werden können.
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Die
vielleicht besten Beispiele der Integration von Translation und
mRNA-Zerfall sind Studien, die die Folgen vorzeitiger Translationstermination
dokumentieren. Diese erfolgt, wenn Deletion, Basensubstitution oder
Rasterverschiebungsmutationen in DNA zu der Synthese einer mRNA
führen,
die ein ungeeignetes Stoppcodon (Nonsense-Codon) in seiner Protein kodierenden
Region enthält.
Das Auftreten eines solchen vorzeitigen Stoppcodons hält die Translation
an der Stelle früher
Termination an und bewirkt die Synthese eines verkürzten Proteins.
Ungeachtet ihrer „normalen" Zerfallsraten werden
mRNAs, die aus Genen transkribiert werden, die Nonsense-Mutationen
beherbergen (als „Nonsense
enthaltende mRNAs" bezeichnet),
sehr schnell abgebaut. Ein solcher „Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall" ist ubiquitär, d. h.
er wurde in allen getesteten Organismen beobachtet und führt zu einer
bis zu zehn- bis
einhundertfachen Reduktion der Abundanz spezifischer mRNAs. Die
Kombination stark reduzierter mRNA-Abundanz und vorzeitiger terminierter
Translation bewirkt Reduktionen des Gesamtniveaus der Expression
spezifischer Gene, die so dramatisch wie die Folgen einer Gendeletion
sind. Die Bedeutung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls für das menschliche Wohlbefinden
wird durch die Identifizierung einer zunehmenden Anzahl von Erbkrankheiten
illustriert, in denen Nonsense-Mutationen den Krankheitszustand
bewirken und in denen von den jeweiligen mRNAs gezeigt wurde, dass
sie Substrate des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs sind.
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Ein
wichtiger Punkt ist, dass die Inaktivierung des Nonsense-vermittelten
mRNA-Zerfallswegs
erzielt werden kann, ohne das Zellwachstum zu hemmen, und zu der
Wiederherstellung normaler Spiegel und normaler Zerfallsraten für Nonsense
enthaltende mRNAs führt.
Noch bedeutender, die Hefeversuche (und andere) zeigen, dass, obwohl
eine mRNA noch immer ein Nonsense-Codon enthalten kann, die Inaktivierung
dieses Zerfallswegs ermöglicht,
dass genug funktionelles Protein synthetisiert wird, so dass Zellen
den ursprünglichen
genetischen Defekt überwinden
können.
Folglich ist es möglich,
Erkrankungen, die von Nonsense-Mutationen verursacht werden, durch
Herunterregulieren des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs zu behandeln.
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Die
Erkrankung, Proteine oder Gene, die aus Nonsense- oder Rasterverschiebungsmutationen
resultieren, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: HÄMOGLOBIN-BETA-LOCUS;
MUKOVISZIDOSE-TRANSMEMBRAN-LEITFÄHIGKEITSREGULATOR;
PSEUDOHYPERTROPHE PROGRESSIVE, DUCHENNE/BECKER-MUSKELDYSTROPHIE-TYPEN;
PHENYLKETONURIE, INSULIN-REZEPTOR; HÄMOPHILIE A, ADENOMATOSIS COLI,
FAMILIÄRE
HYPERCHOLESTERINÄMIE,
RECKLINGHAUSEN-KRANKHEIT TYP I, HÄMOPHILIE B, HYPERLIPOPROTEINÄMIE TYP
I, TAY-SACHS-ERKRANKUNG,
BRUSTKREBS TYP 1, NEBENNIERENHYPERPLASIE, WILLEBRAND-JÜRGENS-SYNDROM,
MUKOPOLYSACCHARIDOSE TYP I, ALBINISMUS I, POLYZYSTISCHE NIEREN 1,
ORNITHINAMINO-TRANSFERASE-MANGEL-ANGIOKERATOM,
DIFFUSE MULTIPLE ENDOKRINE NEOPLASIE TYP 1, GESCHLECHTSBESTIMMENDE
REGION Y, ANIONENAUSTAUSCHER-MITGLIED 1 DER FAMILIE 4 GELÖSTER TRÄGER, ALPHA-1-KETTE
VON KOLLAGEN TYP I, HYPDXANTHIN-GUANIN-PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE 1, GLUKOKINASE,
TUMORPROTEIN p53, PROTEOLIPID-PROTEIN, MYELIN, WACHSTUMSHORMONREZEPTOR,
LUTEINISIERUNGSHORMON/CHORIOGONADOTROPIN-REZEPTOR; APOLIPOPROTEIN
A-I VON LIPOPROTEIN MIT HOHER DICHTE, GLUKOSE-6-PHOSPHATDEHYDROGENASE, ORNITHINTRANSCARBAMYLASE-MANGEL-HYPERAMMONÄMIE, XERODERMIA
PIGMENTOSUM 1, HOMÖOTISCHES
GEN 6 MIT GEPAARTER BOX, VON-HIPPEL-LINDAU-SYNDROM, CYCLINABHÄNGIGER KINASEINHIBITOR
2A, BOURNEVILLE-SYNDROM 2, TYROSINÄMIE, NORRIE-WARBURG-SYNDROM,
PHOSPHODIESTERASE 6B, PALMITOYL-PROTEIN-THIOESTERASE, APOLIPOPROTEIN
B, BRUTON-AGAMMAGLOBULINÄMIE-TYROSINKINASE,
FAMILIE 5 GELÖSTER
TRÄGER,
5,10,2-METHYLENTETRAHYDROFOLAT-REDUKTASE, WILMS-TUMOR, POLYZYSTISCHE NIEREN, TRANSKRIPTIONSFAKTOR
14, LEBERKERNFAKTOR, MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYP II, PROTEIN-C-MANGEL, KONGENITALE THROMBOSE
AUFGRUND VON RECKLING-HAUSEN-KRANKHEIT
TYP II, ADRENOLEUKODYSTROPHIE, ALPHA 1 VON KOLLAGEN TYP VII, ALPHA
1 VON KOLLAGEN TYP X, HÄMOGLOBIN- ALPHA-LOCUS 2, TARUI-KRANKHEIT,
FRUKTOSEINTOLERANZ, EARLY-ONSET-BRUSTKREBS
TYP 2; BRCA2, FUCOSYLTRANSFERASE 2, HERMANSKY-PUDLAK-SYNDROM, THYROGLOBULIN,
RETINOBLASTOM, WISKOTT-ALDRICH-SYNDROM, RHODOPSIN, KOLLAGEN TYP
XVII, CHOLINOZEPTOR, GATED-CHANNEL FÜR CYCLISCHES NUKLEOTID, PHOTOREZEPTOR,
cGMP-GATED, CHOLINOZEPTOR-NIKOTIN-EPSILON-POLYPEPTID, REKOMBINATION-AKTIVIERENDES
GEN-1, KAMPOMELE DYSPLASIE, IMMUNDEFEKTSYNDROM MIT IGM-ÜBERPRODUKTION,
RET-PROTOONKOGEN;
RET-MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYP IVA, LEPTIN-REZEPTOR, MINKOWSKI-CHAUFFARD-SYNDROM,
ARGININ-VASOPRESSIN, APOLIPOPROTEIN-C-II-MANGEL-TYP-I-HYPERLIPOPROTEINÄMIE AUFGRUND
VON MUKOVISZIDOSE, WILSON-KRANKHEIT, LEPTIN, ANGIONEUROTISCHES ÖDEM, CHLORIDKANAL
5, GONADENDYSGENESIE, AKUTE INTERMITTIERENDE PORPHYRIE, HÄMOGLOBIN,
GAMMA A, KRABBE-SYNDROM, MCARDLE-KRANKHEIT, SPÄTINFANTILE METACHROMATISCHE
LEUKODYSTROPHIE, BERNARD-SOULIER-SYNDROM, VITAMIN-D-REZEPTOR, DELTA-SARKOGLYKAN,
TWIST, DROSOPHILA, ALZHEIMER-KRANKHEIT,
MARMORKNOCHENKRANKHEIT MIT RENAL-TUBULÄRER AZIDOSE, AMELOGENESIS IMPERFECTA-1,
HYPOPLASIETYP, POU-DOMÄNE KLASSE
1, TRANSKRIPTIONSFAKTOR 1, DIABETES MELLITUS, HOMOLOG ZU VIRALEM
ONKOGEN VON AUTOSOMALEM DOMINANTEM FELINEM V-KIT-HARDY-ZUCKERMAN-4-SARKOM,
HÄMOGLOBIN-DELTA-LOCUS, ADENIN-PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE,
PHOSPHATASE- UND TENSIN-HOMOLOG, WACHSTUMSHORMON 1, CATHEPSIN K,
WERNER-SYNDROM,
NIEMANN-PICK-KRANKHEIT, SOMATOTROPIN-FREIGABE-HORMONREZEPTOR, CERULOPLASMIN, INTERLEUKIN-3-REZEPTOR,
GRANULOZYT, PERIPHERES MYELIN-PROTEIN 22, FUCOSIDOSE, MULTIPLE EXOSTOSE
TYP II, FANCONI-ANÄMIE,
KOMPLEMENTATIONSGRUPPE C, PROGRESSIVE ZEREBELLÄRE ATAXIE, CADHERIN 1, MITGLIED
2 DER FAMILIE 2 GELÖSTER
TRÄGER,
UDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASE-1-FAMILIE,
A1, BOURNEVILLE-SYNDROM 1, LAMININ, GAMMA 2, CYSTATIN B, POLYZYSTISCHE
NIEREN 2, MIKROSOMALES TRIGLYCERID- TRANSFERPROTEIN, 88 KD, DIASTROPHISCHE
DYSPLASIE, FLAVIN-ENTHALTENDE
MONOOXYGENASE 3, CORI-KRANKHEIT, POU-DOMÄNE KLASSE 3, TRANSKRIPTIONSFAKTOR
4, CYTOCHROM P450-SUBFAMILIE IID, KONGENITALE ERYTHROHEPATISCHE
PORPHYRIE, Cu(2+)-TRANSPORTIERENDE
ATPase, ALPHA-POLYPEPTID, FAMILIÄRER
NON-POLYPOSIS-KOLONKREBS
TYP 1, PHOSPHORYLASEKINASE-ALPHA-1-UNTEREINHEIT (MUSKEL), ELASTIN, KOMPLEMENTIERENDE
DEFEKTE EXZISIONSREPARATUR BEI CANAVAN-SYNDROM IN CHINESISCHEM HAMSTER,
JANUS-KINASE 3, STEROIDOGENES AKUTES REGULATIONS-PROTEIN, FUCOSYLTRANSFERASE 6, GLAUCOMA
1 BEI OFFENEM WINKEL, MULTIPLE EXOSTOSEN TYP I, MYOCILIN, AGRANULOZYTOSE,
INFANTILER GENETISCHER ERYTHROPOETINREZEPTOR, ÜBERLEBEN VON TELOMEREM MOTONEURON
1, HOMOLOG ZU DROSOPHILA-SONIC HEDGEHOG, LEZITHIN:CHOLESTERIN-ACYLTRANSFERASE-MANGEL,
ERHÖHTE
POSTMEIOTISCHE AUFSPALTUNG (S. CEREVISIAE)-1, REPARATUR-DEFIZIENT BEI KREUZKOMPLEMENTIERENDER
EXZISIONSREPARATUR IN NAGETIEREN GRUPPE 6, AHORNSIRUP-KRANKHEIT-APOPTOSE-ANTIGEN
1, HEPATISCHER TRANSKRIPTIONSFAKTOR 1, UBIQUITIN-PROTEIN-LIGASE
E3A, TRANSGLUTAMINASE 1, MYOSIN VIIA, 32-KD-GAP-JUNCTION-PROTEIN BETA 1, HEPATISCHER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR 2, ERYTHROZYTÄRES PROTEIN 4.2, THYROTROPIN,
BETA-KETTE, TREACHER-COLLINS-SYNDROM
1, CHOROIDEREMIE, ENDOKARDFIBROELASTOSE 2, COWDEN-KRANKHEIT, ANTI-MÜLLER-HORMON,
SRY-BOX 10, MIT PTA-MANGEL-TYROSINASE
VERWANDTES PROTEIN 1, PHOSPHORYLASEKINASE-BETA-UNTEREINHEIT, SERIN/THREONIN-PROTEIN-KINASE
11, PHOSPHOLIPASE A2 GRUPPE IIA, KOMPLEMENTIERENDE DEFEKTE EXZISIONSREPARATUR
IN CHINESISCHEM HAMSTER 3, NEBENNIERENHYPERPLASIE-II-KOLLAGEN TYP
IV, ALPHA-4-KETTE, 65-KD-NETZHAUTPIGMENTEPITHEL-SPEZIFISCHES PROTEIN BEI GLANZMANN-NAEGELI-SYNDROM, HOMÖOBOX A13,
CALPAIN, GROSSES POLYPEPTID L3, XANTHINURIE-LAMININ, ALPHA 2, CYTOCHROM P450-SUBFAMILIE
XIX, MAROTEAUX-LAMY-SYNDROM,
JUVENILE NEURONALE CEROID-LIPOFUSZINOSE 3, PHOSPHORYLASEKINASE BEI
CITRULLINÄMIE
BEI UNVERRICHT-SYNDROM
DER TESTES/LEBER GAMMA 2, MITGLIED 1 DER FAMILIE 3 GELÖSTER TRÄGER, PTERIN-4-ALPHA-CARBINOLAMINDEHYDRATASE,
OKULARER ALBINISMUS TYP 1, NEONATALES BENIGNES LEPRECHAUNISMUS-SYNDROM,
HIRSCHSPRUNG-KRANKHEIT-MARMOR-KNOCHENKRANKHEIT,
AUTOSOMALER REZESSIVER RAS-p21-PROTEIN-AKTIVATOR 1, KALIUMKANAL VON NACH INNEN
KORRIGIERENDER SLY-SYNDROM-BÉGUEZ-CÉSAR-ANOMALIE,
SUBFAMILIE J, MITGLIED 1, PLAKOPHILIN 1, PLÄTTCHEN-AKTIVIERENDER FAKTOR-ACETYL-HYDROLASE-ISOFORM
1B-ALPHA-UNTEREINHEIT, PLEKTIN 1, KURZE STATUR, MHC-KLASSE-II-TRANSAKTIVATOR,
HYPOPHOSPHATÄMIE,
VITAMIN-D-RESISTENTE RACHITIS, MIT RIEG-BICOID VERWANDTER HOMÖOBOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOR
1, LIMB-GIRDLE-MUSKELDYSTROPHIE TYP 2E, RETINITIS PIGMENTOSA-3,
HOMOLOG ZU MutS VON E. COLI 3, TYROSINTRANSAMINASE-MANGEL BEI LOWE-SYNDROM,
XANTHISMUS BEI FAMILIÄRER
JUVENILER NEPHRONOPHTHISE 1, VISZERALE HETEROTAXIE, X-GEBUNDENES
MILLER-DIEKER-LISSENZEPHALIE-SYNDROM,
PROPERDIN-MANGEL, X-GEBUNDENE 3,2-OXOSÄURE-CoA-TRANSFERASE, LIMB-GIRDLE-MUSKELDYSTROPHIE
TYP 2 BEI WAARDENBURG-SYNDROM, ALPORT-SYNDROM, AUTOSOMALER DOMINANTER
DIABETES MELLITUS TYP II BEI AUTOSOMALER REZESSIVER ANDERSEN-KRANKHEIT,
MITGLIED 1 DER FAMILIE 2 GELÖSTER
TRÄGER,
HAND-FUSS-UTERUS-SYNDROM-ZYSTINOSE VOM EARLY-ONSET- ODER INFANTILEN
NEPHROPATHISCHEN TYP, INSULINÄHNLICHER
WACHSTUMSFAKTOR 1 BEI CRIGLER-NAJJAR-SYNDROM, LAKTATDEHYDROGENASE-A, STICKLER-SYNDROM
TYP II, ALPHA-GALAKTOSIDASE B BEI LEBER'-OPTIKUSATROPHIE I, NEBENNIERENHYPERPLASIE
I BEI LI-FRAUMENI-SYNDROM, MITGLIED 1 DER FAMILIE 12 GELÖSTER TRÄGER, PEROXISOM-BIOGENESEFAKTOR
7 BEI KLEIN-WAARDENBURG-SYNDROM, HOMÖOTISCHES GEN 8 MIT GEPAARTER
BOX, RETINOSCHISIS, 5-HYDROXYTRYPTAMINREZEPTOR 2C, URATOXIDASE,
FAMILIÄRES
BARLOW-SYNDROM BEI PEUTZ-JEGHERS- SYNDROM,
KUTANES MALIGNES MELANOM 2, FUCOSYLTRANSFERASE 1, PYKNODYSOSTOSE,
P-GLYKOPROTEIN-3 BEI MUKOPOLYSACCARIDOSE IIIB, SCHWERER KOMBINIERTER
IMMUNDEFEKT, B-ZELLEN-NEGATIVE RETINITIS PIGMENTOSA, 90-KD-KINASE
VON RIBOSOMALEM PROTEIN S6, POLYPEPTID 3, MIT FAKTOR-X-MANGEL VERBUNDENES
SYNDROM GEGEN HOMOLOG ZU DROSOPHILA-DECAPENTAPLEGIC 4, FAKTOR FÜR LEITENDES
DEHYDROGENASE/DELTA-ISOMERASE TYP 1-KOMPLEMENT MIT PROGRESSIVER STAPES-FIXIERUNG
AQP1 1, PROGRESSIVE FAMILIÄRE
INTRAHEPATISCHE TYP-III-MONOPHOSPHAT-DEAMINASE-1, HOMÖOBOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOR
1.
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Diese
Erfindung stellt Verfahren zum Screenen auf Arzneimittel bereit,
die als Therapeutika fungieren, die Erkrankungen behandeln, die
von Nonsense- und Rasterverschiebungsmutationen verursacht werden. Durch
biochemische und In-vitro-Assays,
die die Aktivität
von ATP-Bindung, ATPase-Aktivität,
RNA-Helicase-Aktivität,
GTP-Bindung, GTPase-Aktivität,
Release-Faktoren oder RNA-Bindung an den Komplex oder aneinander
(d. h. MTT1 an eRF3); Entwickeln von Assays, die die Aktivität des humanen
Genprodukts beim mRNA-Zerfall und der Translationssuppression quantifizieren
können;
Screenen von Verbindungen unter Verwendung der oben erwähnten Assays.
Die hierin offenbarten Versuche haben gezeigt, dass ein Antagonisieren/Agonisieren
der Aktivität
des Komplexes von Faktoren, Proteinen des Komplexes die ansonsten
letalen Auswirkungen von Nonsense-Mutationen in entscheidenden Genen überwinden
kann, und haben Hefe als ein Modellsystem zur Arzneimittelentwicklung
bestimmt, für
die Agentien oder Verbindungen für
den Menschen erhalten werden können.
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands,
der mit einem defekten Proteinkomplex einhergeht, bereit, wobei
das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle mit
einer Nukleinsäure,
die den Proteinkomplex kodiert; (b) Ermitteln des Anteils des defekten
Proteinkomplexes der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen
des Anteils des defekten Proteinkomplexes der Zelle nach der Transfektion
mit dem Anteil des defekten Proteinkomplexes der Zelle vor der Transfektion.
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Ein
Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands geht mit defekten
multimeren Proteinen einher, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
(a) Transfizieren einer Zelle mit dem wie hierin zuvor beschriebenen
Vektor; (b) Ermitteln des Anteils defekter multimerer Proteine der
Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Anteils defekter
multimerer Proteine der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil
defekter multimerer Proteine der Zelle vor der Transfektion.
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Ein
Verfahren zum Identifizieren von Genen, die an der Modulation der
Translationstermination beteiligt sind, umfasst Folgendes: a) Isolieren
eines Gens von Interesse und b) Ermitteln, ob das Gen von Interesse die
Motive I–IX
umfasst, wobei, wenn das Gen ein beliebiges der neun Motive umfasst,
das Gen die Translationstermination moduliert. Das Motiv I kann
die folgende Sequenz umfassen: GppGTKTxT-X(n). Das Motiv II kann
die Sequenz riLxcaSNxAvDxl-X(n) umfassen. Das Motiv III kann die
Sequenz vviDExxQaxxxxxiPi-X(n) umfassen. Das Motiv IV kann die Sequenz
xxil aGDxxQLp-X(n) umfassen. Das Motiv V kann die Sequenz lxx SLF
erv-X(n) umfassen. Das Motiv VI kann die Sequenz LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n) umfassen. Das
Motiv VII kann die Sequenz IgvitPYxxQvxxl-X(n) umfassen. Das Motiv
VIII kann die Sequenz vevxtVDxFQGreKdxlilSc Vr-X(n) umfassen. Das
Motiv IX kann die Sequenz iGFLxdxRRINValTRak umfassen. Großbuchstaben stellen
eine Position in der primären
Sequenz dar, deren spezifischer Aminosäurerest unter Mitgliedern dieser Gruppe
sehr stark konserviert ist. Kleinbuchstaben stellen eine Position
in der primären
Sequenz dar, deren chemische Eigenschaften konserviert, jedoch nicht
unbedingt die exakte Identität
sind.
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Es
gibt mehrere Verfahren, die zum Erkennen einer DNA-Sequenzveränderung
verwendet werden können.
Direkte DNA-Sequenzierung, entweder manuelle Sequenzierung oder
automatisierte Fluoreszenzsequenzierung, können eine Sequenzveränderung
erkennen. Für
ein so großes
Gen wie MTT1 ist eine manuelle Sequenzierung sehr arbeitsintensiv,
unter optimalen Bedingungen werden Mutationen in der kodierenden
Sequenz eines Gens selten verfehlt. Ein weiterer Ansatz ist die Einzelstrangkonformationspolymorphismusanalyse
(single-stranded conformation polymorphism analysis, SSCA) (Orita
et al., 1989). Dieses Verfahren erkennt nicht alle Sequenzveränderungen,
insbesondere wenn die DNA-Fragmentgröße mehr als 200 bp beträgt, kann
jedoch optimiert werden, um die meisten DNA-Sequenzveränderungen
zu erkennen. Die verminderte Erkennungsempfindlichkeit ist ein Nachteil,
der gesteigerte Umsatz, der mit SSCA möglich ist, macht es jedoch
zu einer reizvollen, durchführbaren
Alternative zur direkten Sequenzierung bei Mutationserkennung auf einer
Forschungsbasis. Die Fragmente, die auf SSCA-Gelen eine verschobene
Mobilität
aufweisen, werden dann sequenziert, um die genaue Beschaffenheit
der DNA-Sequenzveränderung
zu ermitteln. Zu anderen Ansätzen,
die auf der Erkennung von Fehlpaarungen zwischen den zwei komplementären DNA-Strängen basieren,
zählen „clamped" denaturierende Gelelektrophorese
(CDGE) (Sheffield et al., 1991), Heteroduplex-Analyse (HA) (White
et al., 1992) und chemische Fehlpaarungsspaltung (chemical mismatch
cleavage, CMC) (Grompe et al., 1989). Keines der oben beschriebenen
Verfahren wird große
Deletionen, Duplikationen oder Insertionen erkennen, noch werden
sie eine Regulationsmutation erkennen, die sich auf die Transkription
oder Translation des Proteins auswirken. Andere Verfahren, die diese
Klassen von Mutationen erkennen könnten, wie ein Proteinverkürzungsassay
oder der asymmetrische Assay, erkennen nur spezifische Arten von
Mutationen und würden
Missense-Mutationen nicht erkennen. Ein Überblick über die gegenwärtig verfügbaren Verfahren
zum Erkennen einer DNA-Sequenzveränderung lässt sich in einem neueren Überblick
von Grompe (1993) finden. Sobald eine Mutation bekannt ist, kann
ein allelspezifischer Erkennungsansatz, wie allelspezifische Oligonukleotidhybridisierung
(ASO-Hybridisierung), eingesetzt werden, um schnell große Anzahlen
von anderen Proben auf dieselbe Mutation zu screenen.
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Eine
schnelle vorläufige
Analyse zum Nachweisen von Polymorphismen in DNA-Sequenzen kann durchgeführt werden,
indem eine Reihe von Southern-Blots von DNA, die mit einem oder
mehreren Restriktionsenzymen, vorzugsweise mit einer großen Anzahl
von Restriktionsenzymen, geschnitten wurde, betrachtet wird. Jeder
Blot enthält
eine Reihe normaler Einzelpersonen und eine Reihe Tumore. Southern-Blots,
die hybridisierende Fragmente aufzeigen (die sich in Bezug auf die
Länge von
Kontroll- DNA unterscheiden,
wenn sie mit Sequenzen sondiert werden, die dem MTT1-Gen ähneln oder
dieses enthalten), deuten auf eine mögliche Mutation hin. Wenn Restriktionsenzyme,
die sehr große
Restriktionsfragmente produzieren, verwendet werden, wird Puls-Feld-Gelelektrophorese
(PFGE) eingesetzt.
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Der
Nachweis von Punktmutationen kann durch molekulare Klonierung des
MTT1-Allels bzw.
der MTT1-Allele und Sequenzieren des Allels bzw. der Allele unter
Anwendung von im Fachgebiet wohl bekannten Techniken durchgeführt werden.
Alternativ können
die Gensequenzen direkt aus einem Präparat von genomischer DNA aus
dem Tumorgewebe unter Anwendung bekannter Techniken amplifiziert
werden. Dann kann die DNA-Sequenz der amplifizierten Sequenzen bestimmt
werden. Es gibt sechs wohl bekannte Verfahren für einen vollständigeren,
dennoch immer noch indirekten Test zum Bestätigen des Vorliegens eines
Empfänglichkeitsallels:
1) Einzelstrangkonformationsanalyse (single-stranded conformation
analysis, SSCA) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese
(DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase-Schutz-Assays
(Finkelstein et al., 1990; Kinszleret et al., 1991); 4) allelspezifische
Oligonukleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung
von Proteinen, die Nukleotidfehlpaarungen erkennen, wie das E. coli-mutS-Protein
(Modrich, 1991) und 6) allelspezifische PCR (Rann & Kidd, 1989).
Für allelspezifische PCR
werden Primer verwendet, die an ihren 3'-Enden an eine bestimmte MTT1-Mutation
hybridisieren. Wenn die bestimmte MTT1-Mutation nicht vorliegt,
wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Ein „Amplification Refractory
Mutation System" (ARMS)
kann ebenfalls verwendet werden, wie in der
europäischen
Patentanmeldungsveröffentlichung
Nr. 0332435 und in Newton et al., 1989, offenbart. Insertionen
und Deletionen von Genen können
ebenfalls mittels Klonierung, Sequenzierung und Amplifikation nachgewiesen
werden. Darüber
hinaus können
RFLP-Sonden (RFLP = Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) für das Gen
oder umgebende Markergene verwendet werden, um eine Veränderung
eines Allels oder eine Insertion in einem polymorphen Fragment zu
bewerten. Ein solches Verfahren ist insbesondere zum Screenen von
Verwandten einer betroffenen Einzelperson auf das Vorliegen der
MTT1-Mutation, die in dieser Einzelperson vorgefunden wurde, von
Nutzen. Andere Techniken zum Nachweisen von Insertionen und Deletionen,
wie sie in der Technik bekannt sind, können verwendet werden.
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In ähnlicher
Weise können
DNA-Sonden verwendet werden, um Fehlpaarungen durch enzymatische oder
chemische Spaltung nachzuweisen. Siehe z. B. Cotton et al., 1988;
Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ können Fehlpaarungen
durch Verschiebungen der elektrophoretischen Beweglichkeit fehlgepaarter
Duplexe im Vergleich zu korrekt gepaarten Duplexen nachgewiesen
werden. Siehe z. B. Cariello, 1988. Die zelluläre mRNA oder DNA, die eine
Mutation enthalten könnte,
kann mit entweder Ribosonden oder DNA-Sonden unter Anwendung von
PCR (siehe im Folgenden) vor der Hybridisierung amplifiziert werden.
Veränderungen
der DNA des MTT1-Gens können
auch unter Anwendung von Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden,
insbesondere wenn die Veränderungen
grobe Umordnungen sind, wie Deletionen und Insertionen.
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DNA-Sequenzen
des MTT1-Gens, die unter Anwendung von PCR amplifiziert wurden,
können
ebenfalls unter Verwendung allelspezifischer Sonden gescreent werden.
Diese Sonden sind Nukleinsäureoligomere,
von denen jedes eine Region der MTT1-Gensequenz enthält, die eine bekannte Mutation
beherbergt. Zum Beispiel kann ein Oligomer etwa 30 Nukleotiden lang
sein, was einem Abschnitt der MTT1-Gensequenz entspricht. Durch
Verwendung einer Batterie solcher allelspezifischen Sonden können PCR-Amplifikationsprodukte
gescreent werden, um das Vorliegen einer zuvor identifizierten Mutation
in dem MTT1-Gen zu identifizieren. Die Hybridisierung allelspezifischer
Sonden mit amplifizierten MTT1-Sequenzen kann beispielsweise auf
einem Nylonfilter durchgeführt
werden. Die Hybridisierung an eine bestimmte Sonde unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen deutet auf das Vorliegen derselben Mutation
in dem Tumorgewebe wie in der allelspezifischen Sonde hin.
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Eine
Veränderung
der MTT1-mRNA-Expression kann mittels einer beliebigen der im Fachgebiet
bekannten Techniken nachgewiesen werden. Zu diesen zählen Northern-Blot-Analyse, PCR-Amplifikation
und RNase-Schutz. Eine verminderte mRNA-Expression deutet auf eine Veränderung
des Wildtyp-MTT1-Gens hin. Eine Veränderung von Wildtyp-MTT1-Genen
kann auch durch Screenen auf eine Veränderung von Wildtyp-MTT1-Protein
nachgewiesen werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die
mit MTT1 eine Immunreaktion zeigen, zum Screenen eines Gewebes verwendet
werden. Ein Fehlen von zugehörigem
Antigen würde
auf eine MTT1-Mutation hinweisen. Antikörper, die für Produkte mutierter Allele
spezifisch sind, könnten ebenfalls
dazu verwendet werden, ein mutiertes MTT1-Genprodukt nachzuweisen.
Solche immunologischen Assays können
in beliebigen zweckmäßigen Formaten,
die in der Technik bekannt sind, vorgenommen werden. Zu diesen zählen Western-Blots,
immunhistochemische Assays und ELISA-Assays. Ein beliebiges Mittel zum
Nachweisen eines veränderten
MTT1-Proteins kann zum Nachweisen einer Veränderung von Wildtyp-MTT1-Genen
verwendet werden. Funktionelle Assays, wie Proteinbindungsbestimmungen,
können
angewendet werden. Darüber
hinaus können
Assays angewendet werden, die die biochemische Funktion von MTT1
nachweisen. Das Finden eines mutierten MTT1-Genprodukts deutet auf
eine Veränderung
eines Wildtyp-MTT1-Gens hin. Mutierte MTT1-Gene oder -Genprodukte
können
ebenfalls in anderen menschlichen Körperproben, wie Serum, Stuhl,
Urin und Sputum, nachgewiesen werden.
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Fusionspolypeptide
können
MTT1-Polypeptide und -Fragmente umfassen. Homologe Polypeptide können Fusionen
zwischen zwei oder mehr MTT1-Polypeptidsequenzen oder zwischen den
Sequenzen von MTT1 und einem verwandten Protein sein. Ebenso können heterologe
Fusionen konstruiert werden, die eine Kombination von Eigenschaften
oder Aktivitäten
der abgeleiteten Proteine zeigen würden. Zum Beispiel können Ligandenbinde-
oder andere Domänen
zwischen unterschiedlichen neuen Fusionspolypeptiden oder Fragmenten „getauscht" werden. Solche homologen
oder heterologen Fusionspolypeptide können beispielsweise eine veränderte Bindungsstärke oder
-spezifität
zeigen. Zu Fusionspartnern zählen
Immunglobuline, bakterielle beta-Galactosidase,
trpE, Protein A, beta-Lactamase, alpha-Amylase, Alkoholdehydrogenase
und Hefe-alpha-Paarungsfaktor. Siehe z. B. Godowski et al., 1988.
Fusionsproteine werden in der Regel mittels entweder rekombinanter
Nukleinsäureverfahren,
wie im Folgenden beschrieben, hergestellt werden oder können chemisch
synthetisiert werden. Techniken zur Synthese von Polypeptiden sind
beispielsweise in Merrifield, 1963, beschrieben.
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Die
diagnostischen Assays der Erfindung können Nukleinsäureassays
sein, wie Nukleinsäurehybridisierungsassays
und Assays, die die Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäure nachweisen,
um eine Nukleinsäuresequenz
des hierin beschriebenen humanen MTT1 nachzuweisen.
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Anerkannte
Mittel zum Durchführen
von Hybridisierungsassays sind bekannt und allgemeine Überblicke
zur Technologie können
dem Überblick:
Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach [72]; Hybridization
of Nucleic Acids Immobilized an Solid Supports [41]; Analytical
Biochemistry [4] und Innis et al., PCR Protocols [74], oben, entnommen
werden.
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Für das Ziel
spezifische Sonden können
in der Nukleinsäurehybridisierungsdiagnostik
verwendet werden. Die Sonden sind für das Ziel von Interesse spezifisch
oder zu diesem komplementär.
Für präzise Alleldifferenzierungen
sollten die Sonden etwa 14 Nukleotide lang und vorzugsweise etwa
20–30
Nukleotide sein. Für einen
mehr allgemeinen Nachweis des humanen MTT1 der Erfindung machen
Nukleinsäuresonden
etwa 50 bis etwa 1000 Nukleotide, am meisten bevorzugt etwa 200
bis etwa 400 Nukleotide aus.
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Die
spezifische Nukleinsäuresonde
kann RNA- oder DNA-Polynukleotid oder -Oligonukleotid oder deren
Analoge sein. Die Sonden können
einzel- oder doppelsträngige
Nukleotide sein. Die Sonden der Erfindung können enzymatisch unter Verwendung
in der Technik wohl bekannter Verfahren (z. B. Nick-Translation,
Primerverlängerung,
Umkehrtranskription, die Polymerase-Kettenreaktion und andere) oder
chemisch (z. B. mittels Verfahren wie dem Phosphoramidit-Verfahren,
von Beaucage und Carruthers [19] beschrieben, oder mittels dem Triester-Verfahren
nach Matteucci et al. [62]) synthetisiert werden.
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Ein
alternatives Mittel zum Ermitteln des Vorliegens des humanen MTT1
ist In-situ-Hybridisierung oder,
in jüngster
Zeit, In-situ-Polymerase-Kettenreaktion. In-situ-PCR ist in Neuvo
et al. [71], Intracellular localization of polymerase chain reaction
(PCR)- amplified
Hepatitis C cDNA; Bagasra et al. [10], Detection of Human Immunodeficiency
virus type 1 provirus in mononuclear cells by in situ polymerase
chain reaction; und Heniford et al. [35], Variation in cellular
EGF receptor mRNA expression demonstrated by in reverse transcriptase
polymerase chain reaction, beschrieben. In-situ-Hybridisierungsassays
sind wohl bekannt und allgemein in Methods Enzymol. [67] beschrieben.
In einer In-situ-Hybridisierung werden Zellen an einem festen Träger, in
der Regel einen Glasobjektträger,
fixiert. Die Zellen werden dann mit einer Hybridisierungslösung bei
einer mäßigen Temperatur
in Kontakt gebracht, um ein Anbinden zielspezifischer Sonden, die
markiert sind, zu ermöglichen.
Die Sonden werden vorzugsweise mit Radioisotopen oder fluoreszierenden
Reporter markiert.
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Die
oben beschriebenen Sonden sind ebenfalls zur In-situ-Hybridisierung
von Nutzen oder um Gewebe zu lokalisieren, die dieses Gen exprimieren,
oder für
andere Hybridisierungsassays auf das Vorliegen dieses Gens oder
dessen mRNA in verschiedenen biologischen Geweben. In-situ-Hybridisierung
ist ein empfindliches Lokalisierungsverfahren, das nicht von der
Expression von Antigenen oder nativen im Vergleich zu denaturierten
Bedingungen abhängt.
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Mit
den inhibitorischen Nukleinsäuren
kann mRNA targetiert werden. In diesem Ansatz sind die inhibitorischen
Nukleinsäuren
dazu entworfen, die Translation des kodierten Proteins spezifisch
zu blockieren. Unter Anwendung dieses Ansatzes kann die inhibitorische
Nukleinsäure
dazu verwendet werden, bestimmte Zellfunktionen durch Inhibition
der Translation von mRNA kodierenden wichtigen Proteinen selektiv
zu supprimieren. Zum Beispiel inhibiert eine inhibitorische Nukleinsäure, die
zu Regionen von c-myc-mRNA komplementär ist, die c-myc-Protein-Expression
in einer Promyelozytenleukämiezelllinie
des Menschen, HL60, die das c-myc-Protoonkogen überexprimiert. Siehe E.L. Wickstrom
et al. [93] und A. Harel-Bellan et al. [31A]. Wie in Helene und
Toulme beschrieben, wurde von inhibitorischen Nukleinsäuren, die
mRNA targetieren, gezeigt, dass sie durch mehrere unterschiedliche
Mechanismen dahingehend arbeiten, die Translation des kodierten Proteins
bzw. der kodierten Proteine zu inhibieren.
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Schließlich können die
inhibitorischen Nukleinsäuren
zum Induzieren einer chemischen Inaktivierung oder Spaltung der
Zielgene oder -mRNA verwendet werden. Eine chemische Inaktivierung
kann über
die Induktion von Vernetzungen zwischen der inhibitorischen Nukleinsäure und
der Zielnukleinsäure
innerhalb der Zelle erfolgen. Andere chemische Modifikationen der
Zielnukleinsäuren,
die von entsprechend derivatisierten inhibitorischen Nukleinsäuren induziert
werden, können
ebenfalls angewendet werden.
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Eine
Spaltung und folglich eine Inaktivierung der Zielnukleinsäuren kann
bewirkt werden, indem ein Substituent an die inhibitorische Nukleinsäure angelagert
wird, der aktiviert werden kann, um Spaltungsreaktion zu induzieren.
Der Substituent kann ein Substituent sein, der entweder eine chemische
oder eine enzymatische Spaltung bewirkt. Alternativ kann eine Spaltung
durch Verwendung von Ribozymen oder katalytischer RNA induziert
werden. In diesem Ansatz würden
die inhibitorischen Nukleinsäuren
entweder natürlich vorkommende
RNA (Ribozyme) oder synthetische Nukleinsäuren mit katalytischer Aktivität umfassen.
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Des
Weiteren stellt diese Erfindung ein Antisense-Molekül bereit,
das spezifisch mit der isolierten Nukleinsäure des MTT1-Gens hybridisieren
kann. Diese Erfindung stellt einen Antagonisten bereit, der die
Expression des Peptids oder Polypeptids, das von dem isolierten
DNA-Molekül
kodiert wird, blockieren kann. In einer Ausführungsform kann der Antagonist
mit einem doppelsträngigen
DNA-Molekül
hybridisieren. In einer anderen Ausführungsform ist der Antagonist
ein Triplex-Oligonukleotid, das an das DNA-Molekül hybridisieren kann. In einer
anderen Ausführungsform
kann das Triplex-Oligonukleotid
an mindestens einen Abschnitt des isolierten DNA-Moleküls mit einer
Nukleotidsequenz binden.
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Das
Antisense-Molekül
kann DNA oder RNA oder Varianten davon (d. h. DNA oder RNA mit einer Proteinhauptkette)
sein. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Herstellung
von Antisense-Nukleotiden und Ribozymen, die zum Beeinträchtigen
der Expression der Rezeptorerkennungsproteine bei der Translation
einer spezifischen mRNA verwendet werden können, entweder durch Maskieren
dieser mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder Spalten dieser mit
einem Ribozym.
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Antisense-Nukleinsäuren sind
DNA- oder RNA-Moleküle,
die zu mindestens einem Abschnitt eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind.
Sie hybridisieren in der Zelle an diese mRNA, wodurch ein doppelsträngiges Molekül gebildet
wird. Die Zelle translatiert eine mRNA in dieser doppelsträngigen Form nicht.
Folglich beeinträchtigen
Antisense-Nukleinsäuren
die Expression von mRNA in Protein.
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Antisense-Nukleotid-
oder -Polynukleotidsequenzen sind beim Verhindern oder Vermindern
der Expression des MTT1-Gens von Nutzen, wie Fachmänner zu
schätzen
wissen werden. Zum Beispiel können
Polynukleotidvektoren, die das gesamte oder einen Abschnitt des
MTT1-Gens oder andere Sequenzen aus dem MTT1 (insbesondere jene,
die das MTT1-Gen flankieren) enthalten, unter die Kontrolle eines
Promotors in einer Antisense-Ausrichtung gestellt und in eine Zelle
eingeführt
werden. Die Expression eines solchen Antisense-Konstrukts in einer
Zelle wird die MTT1-Transkription
und/oder -Translation und/oder -Replikation beeinträchtigen.
Oligomere von etwa fünfzehn
Nukleotiden und Molekülen,
die an das AUG-Initiationscodon hybridisieren, sind besonders effizient,
da sie leicht zu synthetisieren sind und bei ihnen wahrscheinlich
ist, dass sie bei Einführung
in Zellen weniger Probleme aufwerfen als größere Moleküle.
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Ein
Verfahren zum substantiellen Inhibieren der Translationsterminationseffizienz
von mRNA und/oder des Zerfalls abweichender Transkripte in einer
Zelle umfasst Folgendes: a) Bereitstellen einer Zelle, die die DNA
enthält;
b) Überexprimieren
der DNA in der Zelle, um ein überexprimiertes
Polypeptid zu produzieren, das an MTT1 bindet und die MTT1-Funktion
beeinträchtigt.
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Ein
Verfahren zum substantiellen Inhibieren der Translationsterminationseffizienz
von mRNA und/oder des Zerfalls abweichender Transkripte in einer
Zelle umfasst Folgendes: a) Bereitstellen einer Zelle; b) Exprimieren
eines Antisense-Transkripts des Komplexes in ausreichender Menge,
um den Komplex zu binden.
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Ein
Verfahren zum substantiellen Inhibieren der Translationstermination
in einer Zelle umfasst Folgendes: Mutieren des Komplexes, der MTT1,
Upf1p, Upf2p, Upf3p, eRF1 und eRF3 umfasst, so dass im Wesentlichen
kein funktioneller Komplex in der Zelle produziert wird.
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Die
Offenbarung ermöglicht
die Behandlung einer Erkrankung, die mit Translationsterminationseffizienz
von mRNA und/oder Zerfall abweichender Transkripte zusammenhängt, wobei
die Behandlung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Komplex, der in
eine Zelle eines Probanden eingeführt wird, umfasst, und einen
pharmazeutischen Trägerstoff
oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel
an einen Probanden, wodurch der Proband behandelt wird, umfasst.
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Ein
Patient, der ein Leiden in einem Frühstadium in Folge eines genetischen
Mangels, einer Erkrankung oder einer klinischen Behandlung aufweist
oder ein Risiko aufweist, ein solches aufzuweisen, wobei das Leiden
eine Ätiologie
aufweist, die mit einem Defekt zusammenhängt, kann durch Verabreichen
einer therapeutisch wirksamen Menge einer Formulierung oder Zusammensetzung,
die die Expression des Komplexes moduliert, an den Patienten, so
dass der Zustand des Patienten verbessert wird, behandelt werden.
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„Therapeutisch
wirksam", wie hierin
verwendet, bezieht sich auf eine Menge einer Formulierung, die von
ausreichender Quantität
ist, um den Zustand des so behandelten Patienten zu bessern. „Bessern" bezieht sich auf
eine Verminderung der nachteiligen Auswirkung des Krankheitszustands
oder der Störung
in dem Patienten, der die Therapie empfängt. Der Proband ist vorzugsweise
ein Mensch, es kann jedoch vorgesehen werden, dass ein beliebiges
Tier behandelt werden kann.
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Dies
hat insofern offensichtliche Auswirkungen auf die Arzneimittelausrichtung,
dass eine oder die andere Domäne
zur Arzneimittelentwicklung targetiert werden kann, z. B. unter
Anwendung der Kombinationsbibliothektechniken oder rationeller Arzneimitteldesigntechniken.
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Angesichts
des Vorstehenden wird offensichtlich, dass es eine Reihe von Wegen
zur Beeinflussung der Fidelität
mehrerer Gesichtspunkte der Translationsfidelität gibt, und zwar Inhibition,
Elongation und Termination, was bedeutende Auswirkungen auf die
antivirale Therapie und auf die Suppression pathologischer Nonsense-Mutationen
hat. Folglich können
Arzneimittel zur Verwendung als antivirale Verbindungen oder zum Verändern des
ribosomalen Zerfalls identifiziert werden.
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Der
Ausdruck „Arzneimittel" wird hierin dazu
verwendet, sich auf eine Verbindung oder Agentien, wie ein Antibiotikum
oder Protein, zu beziehen, die sich auf die Funktion des Peptidyltransferasezentrums
während der
Initiation, der Elongation, der Termination, des mRNA-Abbaus auswirken
kann bzw. können.
Solche Verbindungen können
abweichende mRNA und die Effizienz der Translationstermination steigern
oder vermindern.
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Gentherapie und transgene
Vektoren
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In
einer Ausführungsform
werden eine Nukleinsäure,
die den Komplex oder Faktoren des Komplexes kodiert; ein Antisense
oder Ribozym, das für
den Komplex spezifisch ist oder für Regionen der Release-Faktoren
spezifisch ist, MTT1 und Upf1p in vivo in einen viralen Vektor eingeführt. Zu
solchen Vektoren zählen
ein attenuiertes oder defektes DNA-Virus, wie, jedoch nicht darauf
beschränkt,
Herpes-simplex-Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus (EBV),
Adenovirus, adenoassoziiertes Virus (AAV) und dergleichen. Defekte Viren,
denen virale Gene vollständig
oder nahezu vollständig
fehlen, sind bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach der Einführung in
eine Zelle nicht infektiös.
Die Verwendung defekter viraler Vektoren ermöglicht die Verabreichung an
Zellen in einem spezifischen, lokalisierten Bereich, ohne Bedenken,
dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Folglich kann spezifisch
Fettgewebe targetiert werden. Beispiele bestimmter Vektoren beinhalten,
sind jedoch nicht darauf beschränkt,
einen defekten Herpesvirus-1-Vektor (HSV-Vektor) [Kaplitt et al., Molec.
Cell Neurosci. 2:320–330
(1991)], einen attenuierten Adenovirusvektor, wie der von Stratford- Perricaudet et al.
[J. Clin. Invest. 90:626–630
(1992)] beschriebene Vektor, und einen defekten adenoassoziierten
Virusvektor [Samulski et al., J. Virol. 61:3096–3101 (1987); Samulski et al.,
J. Virol. 63:3822–3828
(1989)].
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In
einer anderen Ausführungsform
kann das Gen in einen retroviralen Vektor eingeführt werden, z. B. wie in Anderson
et al.,
US-Patentschrift Nr.
5,399,346 ; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al.,
US-Patentschrift Nr. 4,650,764 ;
Temin et al.,
US-Patentschrift Nr.
4,980,289 ; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin
et al.,
US-Patentschrift Nr. 5,124,263 ;
der internationalen Patentveröffentlichung
Nr.
WO 95/07358 , am
16. März
1995 von Dougherty et al. veröffentlicht;
und Kuo et al., 1993, Blond 82:845, beschrieben. Die targetierte Genabgabe
ist in der internationalen Patentveröffentlichung Nr.
WO 95/28494 , im Oktober 1995 veröffentlicht, beschrieben.
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Alternativ
kann der Vektor mittels Lipofektion in vivo eingeführt werden.
Im letzten Jahrzehnt sind Liposome vermehrt zur Verkapselung und
Transfektion von Nukleinsäuren
in vitro verwendet worden. Synthetische kationische Lipide, die
dazu entworfen sind, die Schwierigkeiten und Gefahren zu begrenzen,
die bei liposomvermittelter Transfektion angetroffen werden, können zum
Herstellen von Liposomen zur In-vivo-Transfektion eines Gens, das
einen Marker kodiert, verwendet werden [Felgner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 84:7413–7417
(1987); siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027–8031 (1988)].
Die Verwendung kationischer Lipide können die Verkapselung negativ
geladener Nukleinsäuren
fördern
und auch die Fusion mit negativ geladenen Zellmembranen fördern [Felgner
und Ringold, Science 337:387–388
(1989)]. Die Anwendung von Lipofektion zum Einführen exogener Gene in die spezifischen
Organe in vivo hat bestimmte praktische Vorteile. Die molekulare
Targetierung von Liposomen auf spezifische Zellen stellt einen Vorteilsbereich
dar. Es ist offensichtlich, dass das Richten der Transfektion auf
bestimmte Zellarten wäre
besonders in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität, wie Pankreas,
Leber, Niere und das Gehirn, von Nutzen. Lipide können zum
Zwecke der Targetierung chemisch an andere Moleküle gekoppelt werden [siehe
Mackey et al., oben]. Targetierte Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter,
und Proteine wie Antikörper
oder Moleküle, bei
denen es sich nicht um Peptide handelt, könnten chemisch an Liposome
gekoppelt werden.
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Es
ist auch möglich,
den Vektor als ein Nackt-DNA-Plasmid in vivo einzuführen. Nackt-DNA-Vektoren zur
Gentherapie können
mittels in der Technik bekannter Verfahren, z. B. Transfektion,
Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran,
Kalziumphosphatpräzipitation,
Verwendung einer Genkanone oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters,
in die gewünschten
Wirtszellen eingeführt
werden [siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963–967 (1992);
Wu und Wu, J. Biol. Chem. 263:14621–14624 (1988); Harmut et al.,
kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311 ,
am 15. März
1990 eingereicht).
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Die
Koexpression eines Genprodukts, das die Aktivität am Peptidyltransferasezentrum
moduliert, und eines therapeutischen heterologen Antisense- oder
Ribozym-Gens unter der Kontrolle der spezifischen DNA-Erkennungssequenz
kann bereitgestellt werden, indem ein Gentherapie-Expressionsvektor
bereitgestellt wird, der sowohl ein Gen, das für einen Modulator eines Peptidyltransferasezentrums
kodiert (einschließlich, jedoch
nicht darauf beschränkt,
eines Gens für
ein mutiertes Rasterverschiebungs- oder mRNA-Zerfallsprotein oder
einer Antisense-RNA oder eines Ribozyms, die bzw. das für eine mRNA
spezifisch ist, die ein solches Protein kodiert), als auch ein Gen
für eine
nicht verwandte Antisense-Nukleinsäure oder ein Ribozym unter
koordinierter Expressionskontrolle umfasst. Diese Elemente können auf
separaten Vektoren bereitgestellt werden; oder diese Elemente können alternativ
in einem einzigen Expressionsvektor bereitgestellt werden.
-
Antivirale Therapie
-
Mittel
zum Behandeln von Virusinfektionen können Agentien beinhalten, die
die Translationsfidelität modulieren
und somit sich direkt auf die Virusreplikation oder die Assembly
viraler Teilchen auswirken.
-
Arzneimittel
und Verfahren zum Identifizieren von Arzneimitteln sind hierin zur
Verwendung in der antiviralen Therapie von Viren, die den grundlegenden
ribosomalen -1-Rasterverschiebungsmechanismus einsetzen, was vier
große
Familien von Tierviren und drei große Familien von Pflanzenviren
beinhaltet, beschrieben. Insbesondere Assays zum Screenen auf Agentien,
Antagonisten/Agonisten, die eine Rasterverschiebung bewirken, die
den Komplex einschließt,
und die Upf3p einschließen.
Außerdem
ein mutiertes Upf3p.
-
Zum
Beispiel setzen nahezu alle Retroviren ribosomale -1-Rasterverschiebung
ein, einschließlich
Lentiviren (Immundefizienzviren), wie HIV-1 und HIV-2, SIV, FIV,
BIV, Visnavirus, Arthritis-Enzephalitis-Virus und equines infektibses
Anämievirus;
Spumaviren (die Foamyviren), wie Foamyvirus des Menschen und Foamyviren
anderer Säugetiere;
die T-Zell-Leukämieviren,
wie HTLV-I, HTLV-II, STLVs und BLV; Leukoseviren von Vögeln, wie
Leukämie-
und Sarkomaviren vieler Vögel,
einschließlich
Geflügel
für den
gewerblichen Gebrauch; Typ-B-Retroviren, einschließlich Maus-Mammatumorvirus;
und Typ-D-Retroviren, wie Masen-Pfizer-Affenvirus und Lungenadenokarzinomvirus
des Schafs. Darüber
hinaus setzen viele Coronaviren die -1-Rasterverschiebung ein, einschließlich Coronaviren
des Menschen, wie 229-E, OC43; Coronaviren von Tieren, wie Coronavirus
des Kalbs, übertragbares
Gastroenteritisvirus des Schweins, hämagglutinierendes Enzephalomyelitisvirus
des Schweins und infektiöses
Enteritisvirus des Schweins; Coronavirus des Hunds; infektiöses Peritonitisvirus
der Katze und enterisches Coronavirus der Katze; infektiöses Bronchitisvirus
von Geflügel
und Bluecomb-Virus des Truthahns; Hepatitisvirus der Maus, Coronavirus
der Ratte und Coronavirus des Kaninchens. In ähnlicher Weise wird Torovirus
(eine Coronavirusart) eingeschlossen, wie Toroviren des Menschen,
die mit Darm- und Atemwegserkrankungen zusammenhängen; Bredavirus von Kälbern und
Atemwegsvirus des Rinds; Berne-Virus von Pferden; Torovirus des
Schweins; Torovirus der Katze. Ein anderes Coronavirus ist das Arterivirus,
hämorrhagische
Fiebervirus des Affen, Arteritisvirus des Pferdes, Lelystad-Virus
(Schwein), VR2332-Virus
(Schwein) und die Laktatdehydrogenase erhöhendes Virus (Nagetiere) beinhaltet.
Andere Tierviren sind Paramyxoviren, wie die ribosomale -1-Rasterverschiebung
des Menschen, von der bei Masern berichtet wird, und Astroviren,
wie die Astroviren 1–5
des Menschen, und Astroviren des Rinds, des Schafs, des Schweins,
des Hunds und der Ente.
-
Die
Pflanzenviren, die einen -1-Rasterverschiebungsmechanismus einschließen, beinhalten
Tetraviren, wie Sobemoviren (z. B. Southern-Bean-Mosaikvirus, Knaulgrasscheckungsvirus),
Leuteoviren (z. B. Gelbverzwergungsvirus der Gerste, westliches
Vergilbungsvirus der Rübe
und Blattrolivirus der Kartoffel), Enamoviren (z. B. Erbsenmosaikvirus)
und Umbraviren (z. B. Karottenscheckungsvirus); Tombusviren, wie
Tombusvirus (z. B. Tomatenzwergbuschkrankheit), Carmovirus (z. B.
Nelkenscheckungsvirus), Nekrosevirus (z. B. Tabaknekrosevirus);
Dianthoviren (z. B. Rotklee-Nekrosemosaikvirus) und Machiomovirus
(z. B. Mais-Chlorose-Scheckungsvirus).
-
Darüber hinaus
sind Totiviren, wie L-A- und L-BC- (Hefe) und andere Pilzviren,
Girardia-lamblia-Virus (Darmparasit), Triconella-vaginell-Virus
(Parasit im Menschen), Leishmania-brasiliensis-Virus (Parasit im
Menschen) und andere protozoale Viren -1-Rasterverschiebungsviren.
-
Der
Bestandteil oder die Bestandteile einer therapeutischen Zusammensetzung
kann bzw. können
parenteral, paracanceral, transmukosal, transdermal, intramuskulär, intravenös, intradermal,
subkutan, intraperitoneal, intraventrikulär oder intrakranial eingeführt oder
verabreicht werden.
-
Abgabemodi
beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Nackt-DNA, Protein, Peptid
oder in einem viralen Vektor oder in einem Liposom. Ein viraler
Vektor kann ein Retrovirus, adenoassoziiertes Virus oder Adenovirus
sein.
-
Wie
ein Durchschnittsfachmann leicht zu schätzen wissen wird, sind hierin
beschriebene Zusammensetzungen und Behandlungen besonders zur Behandlung
eines beliebigen Tiers, insbesondere eines Säugetiers, genauer gesagt eines
Menschen, geeignet. Jedoch keineswegs auf Haustiere, wie Katzen-
oder Hundesubjekte, Nutztiere, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Rinder-,
Pferde-, Ziegen-, Schaf- und Schweinesubjekte, wilde Tiere (ob in
der Wildnis oder in einem zoologischen Garten), Versuchstiere, wie
Mäuse,
Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen usw.,
d. h. zur Verwendung in der Tiermedizin, beschränkt.
-
Wie
hierin verwendet, könnte „pharmazeutische
Zusammensetzung" für therapeutisch
wirksame Mengen des Komplexes mit geeigneten Verdünnungsmitteln,
Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern,
Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen stehen, die in der
SZF-Therapie von Nutzen sind. Eine „therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf diejenige Menge, die eine therapeutische Wirkung
für ein
gegebenes Leiden und einen gegebenen Verabreichungsplan liefert.
Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten
oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierungen
und beinhalten Verdünnungsmittel
mit unterschiedlichen Puffergehalten (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat),
pH-Werten und Ionenstärken,
Additive, wie Albumin oder Gelatine, um eine Absorption in Oberflächen zu
verhindern, Detergentien (z. B. Tween-20, Tween-80, Pluronic F68,
Gallensäuresalze),
Solubilisierungsmittel (z. B. Glycerin, Polyethylenglykol), Antioxidationsmittel
(z. B. Ascorbinsäure,
Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol,
Parabene), Massenaufbaumittel oder Tonusmodifikatoren (z. B. Laktose,
Mannit), kovalente Anlagerung von Polymeren wie Polyethylenglykol
an das Protein, Komplexbildung mit Metallionen oder Integration
des Materials in oder auf bestimmten Präparaten polymerer Verbindungen,
wie Polymilchsäure,
Polyglykolsäure,
Hydrogele usw., oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellaren
oder multilamellaren Vesikeln, Blutkörperchenschatten oder Sphäroplasten.
Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die
Löslichkeit,
die Stabilität,
die Geschwindigkeit der In-vivo-Freisetzung
und die Geschwindigkeit der In-vivo-Clearance des SZF. Die Wahl
der Zusammensetzungen wird von den physikalischen und chemischen
Eigenschaften des Proteins mit SZF-Aktivität abhängen. Zum Beispiel erfordert
ein Produkt, das von einer membrangebundenen Form des SZF abgeleitet
ist, eine Formulierung, die Detergens enthält. Zusammensetzungen mit kontrollierter
oder anhaltender Freisetzung beinhalten eine Formulierung in lipophilen
Depots (z. B. Fettsäuren,
Wachse, Öle).
Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind teilchenförmige Zusammensetzungen,
die mit Polymeren beschichtet sind (z. B. Poloxamere oder Poloxamine)
und SZF, der an Antikörper
gekoppelt ist, die gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden
oder Antigene gerichtet sind, oder an Liganden von gewebespezifischen
Rezeptoren gekoppelt ist. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzungen
der Erfindung schließen
teilchenförmige
Schutzbeschichtungen, Proteaseinhibitoren oder Permeationsverbesserer
für verschiedene
Verabreichungswege ein, einschließlich parenteral, pulmonal,
nasal und oral.
-
Des
Weiteren, wie hierin verwendet, sind „pharmazeutisch unbedenkliche
Trägerstoffe" Fachmännern wohl
bekannt und beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphatpuffer
von 0,01–0,1
M und vorzugsweise 0,05 oder 0,8 %-ige Kochsalzlösung. Darüber hinaus können solche
pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoffe
wässrige
oder nichtwässrige
Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen sein. Beispiele von nichtwässrigen
Lösemitteln
sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare organische
Ester wie Ölsäureethylester.
Zu wässrigen
Trägerstoffen
zählen
Wasser, alkoholische/wässrige
Lösungen,
Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und
gepufferte Medien. Zu parenteralen Vehikeln zählen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose,
Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktatlösung oder nichtflüssige Öle. Zu intravenösen Vehikeln
zählen
Flüssigkeiten
und Nährstoffe
wiederauffüllende Mittel,
Elektrolyten wiederauffüllende
Mittel, wie die auf Ringer-Dextrose basierenden, und dergleichen.
Konservierungsmittel und andere Additive können ebenfalls vorhanden sein,
wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel,
Chelatbildner, Inertgase und dergleichen.
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Der
Ausdruck „therapeutisch
wirksame Menge" wird
hierin so verwendet, für
eine Menge zu stehen, die dazu ausreicht, ein klinisch signifikantes
Defizit bei der Aktivität,
Funktion und Reaktion des Wirts um mindestens etwa 15 Prozent, vorzugsweise
um mindestens 50 Prozent, mehr bevorzugt um mindestens 90 Prozent
zu reduzieren und am meisten bevorzugt zu verhindern. Alternativ
reicht eine therapeutisch wirksame Menge dazu aus, eine Verbesserung
eines klinisch signifikanten Leidens in dem Wirt zu bewirken. Wie
Fachmänner
zu schätzen
werden wissen, kann die Menge der Verbindung in Abhängigkeit
von ihrer spezifischen Aktivität
variieren, und geeignete Dosierungsmengen können von etwa 0,1 bis 20, vorzugsweise
etwa 0,5 bis etwa 10 und mehr bevorzugt einem oder mehreren Milligramm
Wirkstoff pro Kilogramm Körpergewicht
einer Einzelperson pro Tag reichen und von dem Verabreichungsweg
abhängen.
In einer Ausführungsform
liegt die Menge im Bereich von 10 Picogramm pro kg bis 20 Milligramm
pro kg. In einer anderen Ausführungsform
beträgt
die Menge 10 Picogramm pro kg bis 2 Milligramm pro kg. In einer
anderen Ausführungsform
beträgt
die Menge 2–80
Mikrogramm pro Kilogramm. In einer anderen Ausführungsform beträgt die Menge
5–20 Mikrogramm
pro kg.
-
Der
Ausdruck „Einheitsdosis", wenn er in Bezug
auf eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten,
die als einheitliche Dosierung für
Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorherbestimmte
Menge Wirkmaterial enthält,
die darauf berechnet wurde, die gewünschte therapeutische Wirkung
in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Trägerstoff
oder Vehikel, zu produzieren.
-
Eine
therapeutische Verbindung kann in einem System mit kontrollierter
Freisetzung abgegeben werden. Zum Beispiel kann der Komplex unter
Anwendung von intravenöser
Infusion, einer implantierbaren Osmosepumpe, eines transdermalen
Pflasters, Liposomen oder anderen Verabreichungsmodi verabreicht
werden. Eine Pumpe kann verwendet werden (siehe Langer, oben; Sefton,
CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery
88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)).
Polymere Materialien können
verwendet werden (siehe Medical Applications of Controlled Release,
Langer und Wise (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, Florida (1974);
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,
Smolen und Ball (Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger und Peppas,
J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); siehe auch
Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol.
25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Ein
System mit kontrollierter Freisetzung kann in der Nähe des Therapieziels,
d. h. dem Gehirn, angeordnet werden, wodurch nur ein Bruchteil der
systemischen Dosis erforderlich ist (siehe z. B. Goodson in Medical
Applications of Controlled Release, oben, Bd. 2, S. 115–138 (1984)).
Vorzugsweise wird eine Vorrichtung zur kontrollierten Freisetzung
in einen Probanden in der Nähe
der Stelle der unangemessenen Immunaktivierung oder des Tumors eingebracht.
Weitere Systeme mit kontrollierter Freisetzung sind im Überblick
von Langer (Science 249:1527–1533
(1990)) erörtert.
-
Wie
ein Durchschnittsfachmann leicht zu schätzen wissen wird, sind die
hierin beschriebenen Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen
besonders zur Behandlung eines beliebigen Tiers, insbesondere eines
Säugetiers,
geeignet und einschließlich,
jedoch keineswegs darauf beschränkt,
Haustieren, wie Katzen- oder Hundesubjekte, Nutztieren, wie, jedoch
nicht darauf beschränkt,
Rinder-, Pferde-, Ziegen-, Schaf- und Schweinesubjekte, wilden Tieren
(ob in der Wildnis oder in einem zoologischen Garten), Versuchstieren,
wie Mäuse,
Ratten, Kaninchen, Ziegen; Schafe, Schweine, Hunde, Katzen usw.,
d. h. zur Verwendung in der Tiermedizin.
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VERSUCHSDETAILSABSCHNITT
-
BEISPIEL 1: Eine Familie von RNA-Helicasen
sind Modulatoren der Translationstermination
-
Materialien und Verfahren
-
Allgemeine
Hefe-Verfahren: Hefemedien, Transformationen, RNA-Isolierung, Blotting
und Hybridisierung waren wie beschrieben (Rose et al., 1990, Weng
et al., 1996a, Hagan et al., 1995, Scheistl und Geitz, 1989).
-
Herstellung
von Glutathion-Sepharose-RF-Fusionskomplexen und gereinigten RF-Fusionsproteinen: Die
Glutathion-Speharose-RF-Fusionskomplexe wurden wie zuvor beschrieben
(Czaplinski et al., 1998) hergestellt. 1 μl GST-RF-Komplexe enthielten
in der Regel 0,9 μg
GST-eRF1 oder 1,5 μg
GST-eRF3, während GST-Komplexe
in der Regel 4,5 μg
GST pro μl
Harz enthielten. Gereinigte GST-RF wurden ebenfalls aus Kulturen
von BL21(DE3)-pLysS-Zellen hergestellt, die mit pGEX2T, pGEX2T-SUP35
oder pGEX2T-SUP45 transformiert worden waren, und die Fusionsproteine
wurden wie zuvor beschrieben (Czaplinski et al., 1998) isoliert.
-
Herstellung
zytoplasmatischer Extrakte: BJ305-Zellen (MATα pep4::HIS3 prb-Δ1,6R HIS3
lys2-208 trp1-Δ10
ura-52 gal2 can1) wurden zu einer OD600 =
1,0 gezüchtet
und in 5 ml kaltem Puffer IB (IBTB, dem RSA fehlte) mit 0,5 mM PMSF
gewaschen. Die Zellen wurden erneut pelletiert und in 1,3 ml kaltem
IB mit 0,5 mM PMSF und Proteaseinhibitoren (PI, jeweils 1 μg/ml Leupeptin,
Aprotinin und Pepstatin A) pro g Zellgewicht suspendiert. Ein ungefähr gleiches
Volumen Glasperlen wurde zugegeben und eine Lyse wurde durch 6-maliges
Vortexen für
20 Sekunden mit 1 Minute Kühlen
auf Eis zwischen dem Vortexen erzielt. Das Lysat wurde entfernt
und die Perlen 2-mal mit einem gleichen Volumen von IB mit 0,5 mM
PMSF und jeweils 1 μg/ml
Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin A gewaschen. Die Waschvorgänge wurden
mit dem Lysat vereint und die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugierung
bei 30.000 × g
für 20
min entfernt.
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ATPase
Assays: Mtt1p-RNA-abhängige
ATPase-Aktivität
wurde unter Verwendung von 20 ng Mtt1p in Anwesenheit von GST-RF-Fusionsproteinen
mittels eines Aktivkohle-Assays, wie zuvor beschrieben (Czaplinski
et al., 1995), unter Verwendung von 1 μg/ml Poly-(U)-RNA mit 100 μg/ml RSA
ermittelt. Die Ergebnisse werden als pmol freigesetztes 32P im Vergleich zur Konzentration des angegebenen
Proteins aufgetragen.
-
Ergebnisse
-
Identifizierung
einer Familie von Hefe-Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen, die dem
UPF1-Gen ähneln: Ein
Sequenzvergleich zum Identifizieren anderer Hefegene, die zu dem
UPF1 homolog sind, wurde vorgenommen und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Das SEN1-Gen zeigte signifikante
Homologie mit UPF1 (2; siehe Koonin, 1992). SEN1
wurde in einem Screen auf Mutationen, die sich auf die tRNA-Spleißung auswirken und
alle Motive beherbergen, um als eine Superfamilie-Gruppe-I-Helicase
erachtet zu werden, identifiziert (Winey und Culbertson, 1988, DeMarini
et al., 1992). Das zuvor identifizierte DNA2-Gen zeigte ebenfalls
signifikante Homologie zu UPF1 (2). Von
DNA2 ist wahrscheinlich, dass es eine Rolle in der DNA-Replikation, möglicherweise
im Verarbeiten von Okazaki-Fragmenten spielt (Budd et al., 1995,
Budd und Campbell, 1997). Zwei weitere Gene, die Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen
kodieren, mit hoher Homologie zu UPF1 wurden ebenfalls identifiziert
und wurden in früheren
Studien als Helicase A (HCSA, Biswas et al., 1997a, b) und Helicase
B (HCSB, Biswas et al., 1997a, b) oder scHel1 (Bean und Matson,
1993) bezeichnet. Aus Gründen,
die im Folgenden beschrieben werden, wird das Gen, das Helicase
B (HCSB) kodiert, als MTT1 (für
Modulator von Translationstermination) bezeichnet. Die Proteine,
die von den HCSA- und MTT1-Genen kodiert werden, wurden zuvor gereinigt
und von ihnen wurde gezeigt, dass sie DNA-abhängige Helicase-Aktivität aufweisen
(Biswas et al., 1995; Biswas et al., 1997a, b; Bean und Matson,
1993). Von HCSA und HCSB wurde behauptet, dass sie an der Chromosomreplikation
beteiligt sind (Biswas et al., 1995, 1997a, b). Diese Auffassung
basiert auf den Beobachtungen, dass: 1) das einzelsträngige Hefe-DNA-Bindeprotein
Rpa1p deren DNA-Helicase-Aktivitäten
verstärkt
(Biswas et al., 1995, 1997) und 2) HcsA gemeinsam mit DNA-Polymerase α gereinigt
wird, und zeigt die biochemischen Eigenschaften replikativer Helicasen
(Biswas et al., 1997a, b). Bis heute gibt es keine In-vivo-Beweise,
die die Beteiligung von HCSA oder HCSB an der Replikation nahe legen.
Beide hcsaΔ- und
hcsbΔ-Stämme sind
lebensfähig.
hcsbΔ-Stämme zeigen
keine Wachstumsdefekte, Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schädigung oder Atemwegsdefekte
(Bean und Matson, 1997). Von Transposon-Insertion in die Promotorregion
von MTT1 wurde berichtet, dass sie Überempfindlichkeit gegenüber Calcofluor
White, einem Zellwandsyntheseinhibitor, und Hygromycin B, einem
Arzneimittel, das einen Translationslesefehler induziert, verursacht
(Lussier et al., 1997). Homologie von HcsA und HcsB wurde zuvor
bemerkt (Biswas et al., 1997a). Die Homologie zwischen diesen fünf Hefe-Helicasen
scheint auf ihre Helicase-Domänen
beschränkt
zu sein (2).
-
Acht
konservierte Motive sind mit allen Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen
assoziiert (Gorbalenya, 1988, Koonin, 1992). In diesen acht Motiven
ist eine begrenzte Anzahl Reste unter allen Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen
konserviert. Obwohl diese 8 Motive entsprechend der Kristallstruktur
von 2 unterschiedlichen Superfamile-Gruppe-I-Helicasen variabel von Protein zu Protein
beabstandet sind, befinden sich diese konservierten Reste alle in
unmittelbarer Nähe
in 3 Dimensionen (2 Kristallstrukturpapiere).
-
Eine
sorgfältigere
Analyse der Gene mit Ähnlichkeit
zu UPF1 identifiziert diese Gruppe als eine Subklasse der Superfamilie-Gruppe
I, die UPF1-ähnliche
Subklasse. Das charakteristische Merkmal dieser Subklasse ist eine
umfassendere Homologie, die die konservierten Reste in den Motiven
II, IV, V und VI umgibt (2), die
zuvor bemerkt wurde (Perlick et al., 1996). Darüber hinaus werden zwei zusätzliche
Motive in dieser Domäne
unter diesen fünf
Genen konserviert. Das erste befindet sich zwischen den Motiven
III und IV (Consensus lexSLFervl; 2) und
das zweite befindet sich zwischen den Motiven IV und V (Consensus
IgvitpYxaQ; 2), die als Motiv IIIa bzw.
IVa bezeichnet werden. Diese zusätzlichen
Motive liegen auch im humanen Homolog des Upf1-Gens vor. Von diesen
fünf Hefegenen
weist Dna2p die schlechteste Übereinstimmung
mit dem Consensus auf und ein Weglassen dieser Sequenz ergibt einen
engeren Consensus. Zwei andere Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen aus
Hefe, Pif1 und RadH, und zwei gut charakterisierte Gruppe-I-Helicasen
aus E. coli, Rep und uvrD, konnten nicht unter diesen Parametern
mit diesen fünf
Sequenzen aligniert werden, was darauf hindeutet, dass die Homologie
nicht für
alle Superfamile-Gruppe-I-Helicasen allgemeingültig ist, was einen Beweis
für eine
andere Subklasse darstellt.
-
Wie
oben beschrieben, besteht ein einzigartiges Merkmal des Upf1p darin,
dass es eine an Cystein/Histidin reiche Region in der Nähe seines
Aminoterminus aufweist (2C). Von Mutationen
in dieser Region wurde gezeigt, dass sie Translationsterminationseffizienzen
an Nonsense-Codons vermindern und programmierte ribosomale -1-Rasterverschiebungseffizienzen
verstärken
(Weng et al., 1996b; Cui et al., 1996). Diese Region wurde als die
Upf2-Interaktionsdomäne
identifiziert (Weng et al., 1996b, He et al., 1996). Interessanterweise
enthält
das Mtt1p auch eine an Cystidin/Histidin reiche Region in der Nähe seines
Aminoterminus (Bean und Matson, 1997). Innerhalb der ersten 127
Aminosäuren
liegen 13 Cysteine und 3 Histidine vor. Obwohl die an Cystidin/Histidin
reichen Regionen von UPF1 und MTT1 keine offensichtliche Homologie
enthalten, weisen beide Regionen das Potential auf, Ringfinger zu
bilden (siehe Weng et al., 1996b, Bean und Mason, 1997). Darüber hinaus
können
diese Regionen an mehrere Zinkbindemotive angepasst werden. Aufgrund
der beträchtlichen
Anzahl von Cysteinresten hinterlässt
jedoch jedes Alignment dieser Art mehrere Cysteinreste, die innerhalb
derselben Region nicht berücksichtigt
sind.
-
Ein
mtt1Δ-Stamm
zeigt einen Nonsense-Suppressionsphänotyp: Nonsense-Suppression resultiert, wenn
eine nahezu zugehörige
tRNA erfolgreich mit den Terminationsfaktoren an einer Nonsense-Mutation kompetiert,
so dass eine Aminosäureeinbindung
in die Peptidkette anstelle einer vorzeitig terminierenden Translation
stattfindet (1). Ausreichende Niveaus
von Nonsense-Suppression ermöglichen
die Produktion von abgeschlossenem Polypeptidprotein, was das Wachstum
unterstützen
kann. Ein upf1Δ-Stamm
ermöglicht die
Nonsense-Suppression dieser Allele. Auf Grundlage dieser Beobachtungen
wurde bestimmt, dass Mtt1p am Modulieren der Translationstermination
an einem Stoppcodon beteiligt ist. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden
Wildtyp-, mtt1Δ-,
upf1Δ-,
upf1Δ-mtt1Δ-Stämme, die
leu2-2- und tyr7-1-Nonsense-Allele beherbergen, auf Suppression
dieser Allele geprüft.
Der Suppressionsphänotyp
von Stämmen,
die die leu2-2- und tyr7-1-Nonsense-Allele beherbergen, wurde durch
Plattieren von Zellen auf -trp-leu-tyr-Medien beobachtet. Als eine
Kontrolle wurden diese Zellen auf -trp-Medien plattiert. Die Ergebnisse
zeigten, dass die beiden upf1Δ- und
mtt1Δ-Zellen
beherbergenden auf beiden Medienarten wuchsen (3A),
was darauf hindeutet, dass ein Deletieren entweder des UPF1- oder
des MTT1-Gens eine Suppression der tyr7-1- und leu2-2-Nonsense-Allele
ermöglicht
(3A). Wildtyp-Zellen (UPF1+-MTT1+) waren nicht
dazu im Stande, auf -trp-leu-tyr-Medien zu
wachsen, was zeigte, dass das Vorliegen dieser Gene eine Suppression
dieser Nonsense-Allele verhinderte (3A).
-
Der
Nonsense-Suppressionsphänotyp
eines upf1Δ-mtt1Δ-Stamms wurde
ebenfalls wie oben beschrieben beobachtet und mit Stämmen verglichen,
die einzelne Deletionen beherbergten. Die Ergebnisse aus diesen
Versuchen zeigten, dass ein upf1Δ-mtt1Δ-Stamm dahingehend
viel wirksamer war, die tyr7-1- und leu2-2-Nonsense-Allele zu supprimieren,
als Stämme,
die einzelne Deletionen entweder des UPF1- oder des MTT1-Gens beherbergten
(3A). Zusammengenommen zeigen diese
Ergebnisse, dass sowohl das Upf1p als auch das Mtt1p am Modulieren
der Translationstermination an Nonsense-Codons beteiligt sind.
-
Frühere Ergebnisse
zeigten, dass ein upf1Δ-Stamm
ebenfalls die Rasterverschiebungs suppression bei 37 °C in Stämmen, die
das his4-38-Allel und einen SUF1-tRNA-Rasterverschiebungssuppressor beherbergen,
verstärken
konnte, während
Stämme,
die das Wildtyp-UPF1-Gen beherbergten, nicht bei dieser Temperatur
wachsen konnten (Leeds et al., 1991, 1992). Es wurde gezeigt, dass
ein mtt1Δ-his4-38-SUF1-Stamm ebenfalls
die Rasterverschiebungssuppression verstärken können würde. Die Ergebnisse zeigten,
dass ein mtt1Δ-his4-38-SUF1-Stamm
im Gegensatz zu einem upf1Δ-Stamm
nicht bei 37 °C
auf Medien, denen es an Histidin mangelte, wachsen konnte, was darauf
hinweist, dass ein Deletieren des MIT1-Gens die Rasterverschiebungssuppression
in diesem Assay nicht steigern konnte.
-
Ein
mtt1Δ-Stamm
wirkt sich nicht auf den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall aus:
Frühere
Ergebnisse zeigten, dass das Upf1p eine Rolle beim Regulieren sowohl
des mRNA-Umsatzes als auch der Translationstermination innehat (Weng
et al., 1996a, b, 1998; Czaplinski et al., 1998). Auf Grundlage
dieser Ergebnisse wurde ermittelt, ob der oben beobachtete Nonsense-Suppressionsphänotyp eine
Folge des Beeinflussens der Effizienz der Translationstermination,
wodurch der Nonsense-vermittelte mRNA-Zerfallsweg (nonsense-mediated mRNA
decay pathway, NMD-Weg) inaktiviert wird, oder einer Kombination
des Beeinflussen der zwei Wege war. Ein mtt1Δ-Stamm, der die tyr7-1- und
leu2-2-Nonsense enthaltenden Allele beherbergte, wurde konstruiert,
um diese Frage zu stellen (siehe Versuchsverfahren). Von einem mtt1Δ-Stamm wurde
gezeigt, dass er ohne demonstrierbaren Wachstumsdefekte lebensfähig ist
(siehe Versuchsverfahren). Die Auswirkung eines mtt1Δ auf NMD
wurde durch Beobachten der Abundanz des CYH2-Präkursors und reifer mRNA, die
ein ribosomales Protein kodiert, untersucht. Der ineffizient gespleißte CYH2-Präkursor,
der in der Nähe
des 5'-Endes ein Intron
enthält,
ist ein natürlich
vorkommendes Substrat für
den Nonsensevermittelten mRNA-Zerfallsweg (nonsense-mediated mRNA
decay pathway, NMD-Weg)
(He et al., 1993). Die Abundanz der Nonsense enthaltenden tyr7-
und leu2-Transkripte
wurde ebenfalls in diesen Stämmen
bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Steady-State-Spiegel
von CYH2-Präkursor
und reifer mRNA, der tyr7- und leu2-mRNAs zu den in einem Wildtyp-Stamm
gefundenen gleichwertig waren (3). Als
eine Kontrolle wurden die CYH2-Präkursor und Nonsense enthaltenden
tyr7- und leu2-Transkripte
in einem upf1Δ-Stamm
erhöht.
Die Abundanz des Wildtyp-CYH2- Transkripts,
bei dem es sich nicht um ein Substrat des NMD-Wegs handelt, war
in allen getesteten Stämmen
gleichwertig (3). Darüber hinaus ist die Abundanz
der Transkripte, bei denen es sich um Substrate für den NMD-Weg
handelt, in einem upf1Δ-mtt1Δ-Stamm im
Vergleich zu nur einem upf1Δ-Stamm
nicht mehr beeinflusst wurde (3). Ein
upf1Δ-mtt1Δ-Stamm war
ohne erkennbare Wachstumsdefekte lebensfähig.
-
Das
Mtt1p interagiert mit dem Peptidyl-Release-Faktor eRF3: Frühere Ergebnisse
legten nahe, dass das Upf1p sich durch direktes Interagieren mit
den Translationsterminationsfaktoren eRF1 und eRF3 auf die Translationstermination
auswirkt und folglich sich auf deren Effizienz der Translationstermination
auswirken kann (Czaplinski et al., 1998). Da ein Deletieren des
MTT1-Gens auch die Nonsense-Suppression
der tyr7-1- und leu2-2-Allele fördert,
interagiert Mtt1p auch mit den Peptidyl-Release-Faktoren. Um dies
zu testen, wurden eRF1 und eR3 individuell in E. coli als Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine
(GST-Fusionsproteine) exprimiert und unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-Perlen
gereinigt. Die gereinigten GST-RF-Fusionsproteine (RF = Release-Faktor),
die mit den Glutathion-Sepharose-Perlen
assoziiert sind, wurden einem zytoplasmatischen Hefeextrakt zugesetzt,
der ein mit FLAG-Epitop markiertes Mtt1p enthielt (siehe Versuchsverfahren).
Nach der Inkubation wurden die GST-RFs und assoziierten Proteine
mittels Affinitätschromatographie gereinigt
und SDS-PAGE unterzogen. Immunoblotting wurde durchgeführt und
es wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen das FLAG-Epitop
auf das Vorliegen von Flag-Mtt1p geprüft. Der Anti-FLAG-Antikörper erkannte
nur das 127 kD lange Mtt1p in zytoplasmatischen Extrakten aus Zellen,
die mit Plasmid transformiert worden waren, das das FLAG-Upf1p exprimierte.
Diese Analyse zeigte außerdem,
dass das Mtt1p spezifisch gemeinsam mit eRF3 gereinigt wurde (5).
Mtt1p wurde nicht gemeinsam mit entweder GST-RF1 oder GST-Protein,
das nicht an ein anderes Protein fusioniert war (5),
oder einem GST-JIP-Protein gereinigt, wobei ein Jak2-Interaktisonsprotein,
das an GST fusioniert war, zum Überwachen
der Spezifität
der Reaktion verwendet wurde.
-
Das
Mtt1p ist mit Polysom assoziiert: Auf Grundlage von Nonsense-Suppressionsphänotypen
eines mtt1Δ-Stamms
wurde untersucht, ob das Mtt1p mit Ribosomen assoziiert ist. Um
zu bestimmen, ob das Mtt1p mit Ribosom assoziiert ist, wurden postmitochondriale
Extrakte aus Zellen, die das Flag-Mtt1-Gen beherbergen, hergestellt
und die Polysomfraktionen wurden mittels Zentrifugierung durch Saccharose-Gradienten getrennt.
Die verschiedenen Fraktionen wurden gesammelt und das Vorliegen
des Flag-Mtt1p-Proteins in den Gradientenfraktionen wurde mittels
Western-Blotting
ermittelt, wobei die Blots mit einem Antikörper sondiert wurden, der gegen
das Flag-Epitop gerichtet ist. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen
zeigten an, dass das Flag-Mtt1p mit Polysom und Monosom assoziiert,
während
die oberen Fraktionen kein nachweisbares Mtt1p enthielten (6, Bahnen 2 und 3). Das Mtt1p, das mit
der Polysomfraktion assoziiert war, besteht vorwiegend aus einem
127 kD langen Protein. Die Behandlung der Polysomextrakte mit RNase
A verschob das Mtt1p auf Fraktionen, die die 40S-Subeinheiten enthalten.
-
Das
Mtt1p zeigt RNA-abhängige
ATPase- und Helicase-Aktivitäten:
Frühere
Ergebnisse haben gezeigt, dass Mtt1p DNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivitäten aufweist
(Biswas et al., 1995). Auf Grundlage der oben beschriebenen Ergebnisse
wurde gezeigt, dass Mtt1p ebenfalls eine RNA-abhängige ATPase und Helicase sein
wird. Es wurde zunächst
gefragt, ob gereinigtes Mtt1p ATPase-Aktivität zeigte. ATPase-Assays wurden
durchgeführt,
indem das gereinigte Protein in Reaktionsgemischen, die radiomarkiertes [γ-32P]-ATP enthielten, in Anwesenheit oder
Abwesenheit eines Polyuridins (Poly(rU)) inkubiert und auf die Freisetzung
von 32PO4 geprüft wurde.
Die Ergebnisse zeigten, dass in Abwesenheit von Poly(rU) keine ATPase-Aktivität nachweisbar
war (7). Reaktionsgemische, die Poly(rU)
enthielten, stimulierten jedoch die Freisetzung von 32PO4 erheblich, was darauf hinweist, dass Mtt1p
ebenfalls eine RNA-abhängige
ATPase-Aktivität beherbergte
(7). Konzentrationen von Poly(rU)
bei 330 nM oder mehr als 330 nM stimulierten die ATPase-Aktivität des Upf1p
maximal.
-
Diskussion
-
Die
hier dargestellten Ergebnisse beschreiben die Identifizierung von
Mtt1p, einer nukleinsäureabhängigen Helicase
mit signifikanter Homologie zu dem Upf1p, einem zuvor beim Regulieren
von sowohl der Translationstermination als auch des NMD identifizierten
Faktor (Czaplinski et al., 1995, 1998; Weng et al., 1996a, b, 1998).
Mehrere Beweisreihen deuten darauf hin, dass Mtt1p auch eine Rolle
beim Modulieren des Translationsterminationsvorgangs innehat. Interessanterweise
identifizierte ein Vergleich des MTT1-Gens mit anderen Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen,
dass einzigartige Signaturmotive, die diese Subfamilie von Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen
markieren, möglicherweise
an entweder RNA-abhängigen
oder RNA-DNA-abhängigen Vorgängen beteiligt
sind (2). Wie im Folgenden erörtert werden
wird, legen diese Ergebnisse nahe, dass eine Untergruppe der Upf1p-Familie
von RNA-Helicasen am Modulieren der Effizienz des Translationsterminationsvorgangs
beteiligt ist.
-
Das
MTT1-Gen und sein Proteinprodukt zeigen Ähnlichkeit zu dem Upf1p: Ein
Vergleich der MTT1- und UPF1-Gene identifizierte mehrere Regionen
von Ähnlichkeit.
Beide Proteine enthalten eine an Cystidin/Histidin reiche Regionen
in der Nähe
des aminoterminalen Endes des Proteins und beherbergen alle Motive,
um eine Superfamilie-Gruppe-I-Helicase zu sein (2).
Die an Cystidin/Histidin reichen Regionen von UPF1 und MTT1 sind
nicht sehr homolog. Es ist auch denkbar, dass diese an Cystidin/Histidin
reichen Regionen eine neue Art von an Cystidin/Histidin reichem
Motiv bilden. Interessanterweise wurde von Mutationen in der an Cystidin/Histidin
reichen Region von UPF1 zuvor gezeigt, dass sie die Effizienzen
von programmierter -1-Rasterverschiebung steigern und die Nonsense-Suppression
fördern
(Cui et al., 1996; Weng et al., 1996b).
-
Sequenzvergleiche
von Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen identifizierten zunächst, dass
SEN1- und MOV-10-Gene starke Regionen von Homologie zu der UPF1-Gen-Helicase-Region aufweisen
(Koonin, 1992). Das MTT1-Gen zeigte ebenfalls erhebliche Homologie
zu UPF1 und zu anderen Mitgliedern der UPF1-ähnlichen Subfamilie (2).
Zu diesen Genen zählen
DNA2, HCSA, HCSB/MTT1 und SEN1. Insbesondere ist ein anderes Mitglied
der UPF1-Familie von Helicasen das jüngst isolierte HelB-Gen (Biswas
et al., 1997a, b). Diese Helicase wurde zunächst als Teil des Multienzym/Polymerase-α-Komplexes
isoliert (Biswas et al., 1993, 1993a, 1995). Eine Deletion von HCSA
verursachte keine Nonsense-Suppression, was zeigte, dass die in upf1Δ- und mtt1Δ-Stämmen beobachteten
Nonsense-Suppressionsphänotypen
nicht einfach aufgrund des Deletierens einer Gruppe-I-Helicase vorliegen.
-
Das
Mtt1p ist eine RNA-Helicase, die an der Translationstermination
beteiligt ist: Frühere
Ergebnisse zeigten, dass das Hel1p/Mtt1p DNA-Helicase-Aktivität zeigte,
die von dem einzelsträngigen
Hefe-DNA-Bindeprotein Rpa1p stimuliert wurde (Biswas et al., 1995;
Bean und Matson, 1997). Die hier dargestellten Ergebnisse zeigten,
dass das gereinigte Mtt1p ebenfalls RNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivitäten zeigt (7). Folglich zeigte auch Mtt1p, ähnlich zu
Upf1p (Czaplinski et al., 1995) die Fähigkeit, sowohl DNA- als auch
RNA-Duplexe zu entwinden.
-
Mehrere
Beweisreihen legen nahe, dass Mtt1p an der Translationstermination
beteiligt ist. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass: 1)
ein mtt1Δ-Stamm
einen Nonsense-Suppressionsphänotyp zeigt (4);
2) das Mtt1p mit Polysom assoziiert ist (6);
3) das Mtt1p direkt mit dem Peptidyl-Release-Faktor eRF3 interagiert
(5); 4) mtt1Δ-Stämme Paromomycin-Empfindlichkeit
zeigen. Wenn man berücksichtigt, dass
ein mtt1Δ-Stamm
im Gegensatz zu einem upf1Δ-Stamm
Nonsense enthaltende Transkripte nicht stabilisiert, ist der Umfang
der Nonsense-Suppression pro RNA-Molekül in einem mtt1Δ-Stamm größer als
in einem upf1Δ-Stamm
(3).
-
Ein
mtt1Δ-upf1Δ-Stamm zeigt
im Vergleich mit einem upf1Δ-
oder mtt1Δ-Stamm
einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp. Eine Möglichkeit,
diese Beobachtung zu erklären,
besteht darin, dass diese Proteine im selben Schritt in der Translationstermination
fungieren und dass entweder Mtt1p oder Upf1p den Verlust des anderen
Faktors zum Teil kompensieren kann. Die Inaktivierung beider Faktoren
führt jedoch
zu einem viel höheren
Niveau der Nonsense-Suppression. Eine alternative Erklärung besteht
darin, dass diese zwei Faktoren in unterschiedlichen Schritten im
Terminationsvorgang arbeiten. Sowohl Mtt1p als auch Upf1p fungieren
zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination und Upf1p
agiert anschließend
zum Fördern
des Zerfalls der mRNA. Der synergistische Anstieg der Nonsense-Suppression kann
eine Folge sowohl des Erhöhens
der Menge des Nonsense enthaltenden Transkripts als auch des Verminderns
der Effizienz der Translationstermination in einem mtt1Δ-upf1Δ-Stamm sein.
-
Mindestens
zwei RNA-Helicasen sind am Modulieren der Effizienz der Translationstermination
beteiligt: Es ist interessant, dass es scheinbar mindestens zwei
Helicasen gibt, die am Modulieren der Effizienz der Translationstermination
beteiligt sind. Es wurde nun klar, dass die Fähigkeit zum Manipulieren von
Nukleinsäureduplexen
durch Helicasen für
jeden biologischen Vorgang, an dem DNA und RNA beteiligt sind, entscheidend
ist. Von einer großen
Anzahl von RNA-Helicasen wurde gezeigt, dass sie an posttranskriptionalen
Steuermechanismen beteiligt sind. Zu Beispielen zählen tRNA-Verarbeitung,
ribosomale Biogenese, Spleißen, Transport,
Translation und mRNA-Umsatz. Diese RNA-Helicasen gliedern sich in
mindestens zwei Familien, wobei die bedeutendste Superfamilie die „DEAD-Box"-Helicasen oder die
Superfamilie-Gruppe II ist. Von den Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen,
wie die in 2 gezeigten, wurde gezeigt,
dass sie sowohl DNA- als auch RNA-Duplexe entwinden.
-
Zurzeit
ist nicht bekannt oder es wird nicht verstanden, wie Upf1p und Mtt1p
den Translationsterminationsvorgang modulieren. Die Effizienz der
Translationstermination kann durch Verändern 1) der Assoziationsraten
der eRFs mit dem Ribosom, 2) der Effizienz der eRFs beim Fördern der
Peptidylhydrolyse oder 3) der Rate der Dissoziation der eRFs von
dem Ribosom, nachdem die Translationstermination abgeschlossen wurde,
beeinflusst werden. Assays zum Überwachen
dieser Schritte im Translationsterminationsvorgang, um zu beginnen,
zu verstehen, bei welchem Schritt diese Proteine fungieren.
-
Die
hier dargestellten Ergebnisse zeigen an, dass sich die Wachstumsraten
von Zellen, obwohl der Translationsapparat sehr präzise ist,
unter Bedingungen, die die Genauigkeit dieses Vorgangs reduzieren, nicht ändern. Zum
Beispiel zeigte ein mtt1Δ-upf1Δ-Stamm keine
Auswirkungen auf das Zellwachstum, wenn auch die Translationstermination
in diesen Zellen weniger effizient ist. Darüber hinaus zeigen Stämme, die
das mof4-1-Allel von UPF1 oder ein upf3Δ beherbergen und eine vierfach
erhöhte
programmierte Rasterverschiebungseffizienz zeigen und eine Verringerung
der Fidelität
im Vorgang der Translationselongation anzeigen, ebenfalls keine
Wachstumsdefekte (Cui et al., 1996; Ruiz-Echevarria et al., 1998).
-
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