DE69936588T2 - Eine Subfamilie von RNA-Helicasen, die Modulatoren der Fidelität der Translationstermination sind, und Verwendungen dieser - Google Patents

Eine Subfamilie von RNA-Helicasen, die Modulatoren der Fidelität der Translationstermination sind, und Verwendungen dieser Download PDF

Info

Publication number
DE69936588T2
DE69936588T2 DE69936588T DE69936588T DE69936588T2 DE 69936588 T2 DE69936588 T2 DE 69936588T2 DE 69936588 T DE69936588 T DE 69936588T DE 69936588 T DE69936588 T DE 69936588T DE 69936588 T2 DE69936588 T2 DE 69936588T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
complex
mtt1
cell
protein
mtt1p
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69936588T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69936588D1 (de
Inventor
Stuart Piscataway PELTZ
Kevin Somerset CZAPLINSKI
Jonathan D. North Brunswick DINMAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Medicine and Dentistry of New Jersey
Rutgers State University of New Jersey
Original Assignee
University of Medicine and Dentistry of New Jersey
Rutgers State University of New Jersey
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Rutgers State University of New Jersey filed Critical University of Medicine and Dentistry of New Jersey
Application granted granted Critical
Publication of DE69936588D1 publication Critical patent/DE69936588D1/de
Publication of DE69936588T2 publication Critical patent/DE69936588T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Subfamilie von RNA-Helicasen, von denen es sich bei einer um das MTT1-Gen handelt, das die Fidelität der Translationstermination moduliert. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Multiproteinüberwachungskomplex, der MTT1, humanes Upf1p, Upf2p, Upf3p, eukaryotischen Release-Faktor 1 und eukaryotischen Release-Faktor 3 umfasst und der an der Modulation der Effizienz der Translationstermination und dem Abbau von abweichender mRNA beteiligt ist. Die Identifikation dieses Komplexes liefert ein In-vitro-Assaysystem zum Identifizieren von Agentien, die: die funktionelle Aktivität von mRNAs durch Verändern der Rasterfrequenz beeinträchtigen; das Überwachen eines Terminationsereignisses ermöglichen; den Abbau von abweichenden Transkripten fördern; Modulatoren (Inhibitoren/Stimulatoren) der Peptidyltransferaseaktivität während der Initiation, der Elongation, der Termination und des mRNA-Abbaus der Translation bereitstellen. Solche Agentien, die Antagonisten oder Agonisten sein können, sind zum Screenen und für Diagnosezwecke und als Therapeutika für Erkrankungen oder Leiden, die ein Resultat oder eine Ursache einer vorzeitigen Translation sind, von Nutzen.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Der Translationsapparat zeichnet für das Synthetisieren von Zellproteinen verantwortlich. Diese Maschinerie muss die genauen Stellen an der mRNA bestimmen können, an denen das Dekodieren beginnen sollte und an denen es enden sollte. Die Auswahl der Translationsstartstelle wird für gewöhnlich von dem ersten AUG-Codon abgegrenzt, das die Aminosäure Methionin kodiert. Nach der Initiation der Translation stellt das Ribosom das Polypeptid her, indem es in der 5'- zur 3'-Richtung entlang der mRNA fortschreitet, wobei es jeweils ein Codon dekodiert. Der letzte Schritt im Translationsvorgang findet statt, wenn eines der drei Terminationscodons die A-Stelle des Ribosoms belegt, was in der Hydrolyse des Peptids resultiert (in Buckingham et al., 1997, besprochen).
  • Obwohl die Translationstermination normalerweise nach dem Abschluss des vollständigen Polypeptids erfolgt, führen Basensubstitutionen und Rasterverschiebungsmutationen in DNA oftmals zu der Synthese einer mRNA, die ein ungeeignetes Stoppcodon in seiner Protein kodierenden Region enthält. Das Vorkommen eines solchen vorzeitigen Stoppcodons hält die Translation an der Stelle der frühen Termination an und bewirkt die Synthese eines verkürzten Proteins und den schnellen Abbau der mRNA (in Ruiz-Echevarria et al., 1996; Weng et al., 1997, besprochen). Interessanterweise verursachen Nonsense- und Rasterverschiebungsmutationen ungefähr 20–40 % der einzelnen Fälle von mehr als 240 verschiedenen Erbkrankheiten (in McKusick, 1994, besprochen). Folglich kann eine Behandlung einer Reihe genetischer Erkrankungen über das Fördern der Nonsense-Suppression vorgesehen werden. Nonsense-Suppression resultiert, wenn eine nahezu zugehörige tRNA erfolgreich mit den Terminationsfaktoren an einer Nonsense-Mutation kompetiert, so dass eine Aminosäureeinbindung in die Peptidkette anstelle einer vorzeitig terminierenden Translation stattfindet (1). Ausreichende Niveaus von Nonsense-Suppression ermöglichen die Produktion von abgeschlossenem Polypeptidprotein. Bei vielen Erkrankungen, in denen nur ein Prozent des funktionellen Proteins produziert wird, leiden Patienten unter schweren Krankheitssymptomen, wohingegen das Fördern der Expression auf nur fünf Prozent der normalen Niveaus die Schwere beträchtlich reduzieren oder die Erkrankung ausmerzen kann (McKusick, 1994; Cooper usw.). Jüngere Berichte haben gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen bestimmter Aminoglykoside den Translationsterminationsvorgang supprimieren, was in der Expression des vollständigen CFTR und dem Wiederherstellen cyclischer AMP-aktivierter Chloridkanalaktivität resultiert (Bedwell et al., 1997; Howard et al., 1996). Folglich wird das Identifizieren und Charakterisieren der Faktoren, die die Effizienz der Translationstermination regulieren, für das Verständnis der Biologie dieses Vorgangs sowie beim Entwickeln von Therapeutika zur Behandlung eines weiten Bereichs von genetischen Erkrankungen, die als Folge einer Nonsense-Mutation entstehen, von Bedeutung sein.
  • Die Translationstermination wird von den eukaryotischen Release-Faktoren von Peptidyl, Release-Faktor 1 (eRF1) und Release-Faktor 3 (eRF3), durchgeuführt. Sowohl eRF1 und eRF3 sind konservierte Proteine, die interagieren und die Peptidylfreisetzung in eukaryotischen Zellen fördern (Frolova et al., 1998, Stansfield et al., 1995, Zhouravleva et al., 1995). In Hefe werden eRF1 und eRF3 von dem SUP45- bzw. SUP35-Gen kodiert (Frolova et al., 1994, Zhouravleva et al., 1995). Von Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) wurde gezeigt, dass sie interagieren (Stansfield et al., 1995, Paushkin et al., 1997a, b). eRF1 enthält intrinsische Peptidhydrolyseaktivität, während eRF3, das Homologie zu dem Translationselongationsfaktor EF1α aufweist (Didichenko et al., 1991), GTPase-Aktivität zeigt (Frolova et al., 1996) und die Terminationsaktivität von eRF1 in einer GTP-abhängigen Art und Weise verstärkt (Zhouraleva et al., 1995).
  • Faktoren, die die Effizienz des Translationsterminationsvorgangs modulieren, wurden identifiziert (Weng et al., 1996a, b; Czaplinski et al., 1998; Song und Liebman, 1987; All-Robyn et al., 1990). Zum Beispiel deuten jüngere Ergebnisse darauf hin, dass das Upf1p ein Faktor ist, der die Effizienz der Translationstermination moduliert. Eine Unterbrechung des UPF1-Gens resultiert in einer drastischen Stabilisierung Nonsense enthaltender mRNAs und fördert die Suppression bestimmter Nonsense-Allele (Leeds et al., 1991, Cui et al., 1995, Czaplinski et al., 1995, 1998, Weng et al., 1996a, 1996b). Jüngere Ergebnisse legen nahe, dass das Upf1p den Translationsterminationsvorgang über direktes Interagieren mit eRF1 und eRF3 modulieren kann (Czaplinski et al., 1998). Das Upf1p enthält eine an Cystein und Histidin reiche Region in der Nähe seines Aminoterminus und alle Motive, die erforderlich sind, um ein Mitglied der Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen zu sein (Czaplinski et al., 1995; Weng et al., 1996a, b, 1998, Altamura et al., 1992, Cui et al., 1996, Koonin, 1992, Leeds et al., 1992, Atkin et al., 1995, 1997). Das Hefe-Ufp1p wurde gereinigt und zeigt RNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivität (Czaplinski et al., 1995, Weng et al., 1996a, b, 1998). Ein humanes Homologon des UPF1-Gens, als RENT1 oder HUPF1 bezeichnet (Perlick et al., 1996, Applequist et al., 1997), wurde identifiziert und es wurde davon gezeigt, dass es in Hefezellen beim Verstärken der Translationstermination funktionell ist, was darauf hinweist, dass seine Rolle in diesem Vorgang evolutionär konserviert ist (Czaplinski et al., 1998).
  • Die hier dargestellten Ergebnisse identifizieren einen Satz von Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen in Hefezellen mit signifikanter Homologie zu Upf1p. Insbesondere wurden ein Gen und dessen Proteinprodukt namens MTT1 (für Modulator von Translationstermination) charakterisiert. Mtt1p kodiert eine Superfamilie-Gruppe-I-Helicase und beherbergt eine an Cystidin/Histidin reiche Region in seinem Aminoterminus. Analog zu Upf1p interagiert Mtt1p mit dem Translationsterminationsfaktor eRF3 und kann den Translationsterminationsvorgang modulieren. Bezeichnenderweise zeigt die Inaktivierung von sowohl Upf1p als auch Mtt1p einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp, der größer als der Nonsense-Suppressionsphänotyp ist, der für beide Deletionen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass es eine Familie von RNA-Helicasen gibt, bei denen es sich um Modulatoren des Translationsterminationsvorgangs handelt.
  • Diese Erfindung stellt Verfahren und einen isolierten Multiproteinkomplex bereit, wie in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt. Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines isolierten Multiproteinkomplexes, wie in Anspruch 5 ausgeführt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, wie in Anspruch 15 ausgeführt, bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung oder eines Testagens bereit, die bzw. das die Effizienz der Translationstermination moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkontaktbringen von MTT1 mit einer Testzusammensetzung unter Bedingungen, die die Bindung zwischen MTT1 und der Testzusammensetzung ermöglichen; (b) Nachweisen einer spezifischen Bindung der Testzusammensetzung an das MTT1 und (c) Ermitteln, ob die Testzusammensetzung das MTT1 inhibiert, um eine Testzusammensetzung zu identifizieren, die die Effizienz der Translationstermination moduliert. In einer Ausführungsform inhibiert das Agens ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1, ATPase von Upf1p; GTPase-Aktivität von eRF1 oder eRF3; RNA-Bindung; Bindung der Faktoren an das Ribosom oder Bindung der Faktoren aneinander. In einer anderen Ausführungsform moduliert das Agens die Bindung von MTT1 an das Polysom. In einer anderen Ausführungsform inhibiert das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3. In einer anderen Ausführungsform erleichtert das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung oder eines Testagens bereit, die bzw. das die Bindung an MTT1 moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung umfassen, und MTT1, wobei das Inkubieren unter Bedingungen durchgeführt wird, die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen; und (b) Messen der Auswirkung der Testzusammensetzung auf die Bindung an MTT1. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Identifizieren eines Gens, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Einführen einer Testzusammensetzung, die die Bindung an MTT1 moduliert, in eine Zelle; (b) Bestimmen des Phänotyps der Zelle nach (a); (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach (a) mit dem Zellphänotyp vor (a) und (d) Identifizieren des Gens der Zelle, in die die Testzusammensetzung eingeführt wurde.
  • Hierin wird ein Vektor beschrieben, der die Expression von MTT1-Polypeptid oder die Funktion von MTT1-Polypeptid moduliert. Die Modulation kann inhibierend oder stimulierend sein.
  • Diese Erfindung stellt einen isolierten Multiproteinkomplex bereit, der ein MTT1-Gen, humanes Upf1p-Protein, einen eukaryotischen Release-Faktor 1 (eRFI) von Peptidyl und einen eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl umfasst, wobei der Komplex dahingehend wirksam ist, die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation zu modulieren. In einer Ausführungsform umfasst der Komplex weiterhin humanes Upf3p und/oder Upf2p.
  • Außerdem wird hierin die Bereitstellung eines Agens beschrieben, das an den Komplex bindet, der die Fidelität der Translation einer mRNA moduliert. Translation beinhaltet Initiation, Elongation, Termination sowie Abbau. In einer Ausführungsform inhibiert das Agens ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1, ATPase von Upf1p; GTPase-Aktivität von eRF1 oder eRF3; RNA-Bindung; Bindung der Faktoren an das Ribosom oder Bindung der Faktoren aneinander. Das Agens kann die Bindung von MTT1 an das Polysom modulieren oder die Bindung von humanem MTT1 an eRF3 inhibieren. Alternativ kann das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3 erleichtern.
  • Hierin wird ein Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation beschrieben, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Agens in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Nonsense-Translationstermination zu supprimieren, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert wird, umfasst. Die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation erfolgt während der Initiation, der Elongation, der Termination und des Abbaus von mRNA.
  • Außerdem wird ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden Transkripten beschrieben, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Agens in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Bindung von Mtt1 und eRF3 zu inhibieren, wodurch die Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von abweichenden Transkripten gefördert wird, umfasst.
  • Es wird ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden Transkripten beschrieben, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Agens, das die ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1 inhibiert, wodurch die Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von abweichenden Transkripten gefördert wird, umfasst.
  • Eine weitere Beschreibung hierin befasst sich mit einem Verfahren zum Nachweisen einer Störung, die mit der Expression von Mtt1-Protein zusammenhängt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe von einem Probanden, der eine Störung aufweist oder von dem vermutet wird, dass er eine Störung aufweist, mit einem Reagens, das die Expression des Mtt1-Proteins oder eines Mutanten davon nachweist, und Nachweisen der Bindung des Reagens in der Probe umfasst.
  • Es wird ein Verfahren zum Behandeln einer Erkrankung, die mit Peptidyltransferaseaktivität zusammenhängt, offenbart. Dieses Verfahren umfasst das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Komplex, Mtt1-Protein, mutiertes Mtt1-Protein oder Agentien dazu umfasst, und einen pharmazeutischen Trägerstoff oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel an einen Probanden, wodurch der Proband behandelt wird.
  • Es liegt außerdem ein Verfahren zum Identifizieren von Genen, die an der Modulation der Fidelität der Translationstermination beteiligt sind, vor, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Isolieren eines Gens von Interesse und b) Ermitteln, ob das Gen von Interesse die Motive I–IX umfasst, wobei, wenn das Gen ein beliebiges der neun Motive umfasst, das Gen die Translationstermination moduliert. Das Motiv I kann die folgende Sequenz umfassen: GppGTKTxT-X(n). Das Motiv II kann die Sequenz riLxcaSNxAvDx1-X(n) umfassen. Das Motiv III kann die Sequenz vviDExxQaxxxxxiPi-X(n) umfassen. Das Motiv IV kann die Sequenz xxil aGDxxQLp-X(n) umfassen. Das Motiv V kann die Sequenz lxx SLF erv-X(n) umfassen. Das Motiv VI kann die Sequenz LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n) umfassen. Das Motiv VII kann die Sequenz IgvitPYxxQvxxl-X(n) umfassen. Das Motiv VIII kann die Sequenz vevxtVDxFQGreKdxlilSc Vr-X(n) umfassen. Das Motiv IX kann die Sequenz iGFLxdxRRINValTRak umfassen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 5 Hefeproteine definieren eine Unterklasse der Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen. Die MTT1-, UPF1-, DIP1-, SEN1- und DNA2-Helicase-Domänen wurden unter Verwendung von PILEUP aligniert und die Ergebnisse unter Verwendung von BOXSHADE in dem GCG- Programm aufgetragen. Die Consensus-Sequenz ist in der unteren Zeile aufgeführt. Konservierte identische Reste (dunkelgraues Kästchen) sind durch Großbuchstaben angezeigt, während konservierte ähnliche Reste durch Kleinbuchstaben angezeigt sind (hellgraues Kästchen). Die Aminosäurezahl in der primären Sequenz der jeweiligen Gene ist in der Figur angezeigt.
  • 2 Ein mtt1Δ zeigt Nonsense-Suppression. MTT1, UPF1 oder MTT1 und UPF1 wurden aus dem Hefestamm KC2 (ura3-52 trp1D leu2-2 tyr7-1) deletiert und diese Zellen wurden zu einer OD600 = 1,0 gezüchtet. Reihenverdünnungen dieser Zellen wurden auf -ura-leu-tyr, um auf Nonsense-Suppression zu prüfen, und -ura als einer Kontrolle auf Zellwachstum plattiert. Das Wachstum wurde bei 30 °C beobachtet und das Wachstum zu 10 Tagen ist oben abgebildet.
  • 3 Mtt1 ist für Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall nicht erforderlich.
  • UPF1 oder MTT1 und UPF1 wurden aus dem Hefestamm KC2 (ura3-52 trp1D leu2-2 tyr7-1) deletiert und diese Zellen wurden zu einer OD600 = 0,8 gezüchtet. Gesamt-RNA wurde hergestellt und RNA-Blot-Analyse unterzogen, wobei eine Sonde für CYH2-mRNA verwendet wurde.
  • 4 Mtt1 interagiert mit eRF3. Zytoplasmatische Extrakte aus einem Hefestamm BJ3505, der mit entweder pG-1 (Vektor) oder pG-1FLAGMTT1 (Flag-Mtt1p) transformiert wurde, wurden in IBTB hergestellt und mit 30 μl GST-, GST-eRF1-, GST-eRF3-, GST-eRF3NM- oder GST-eRF3C-Sepharose/Protein-Komplexen inkubiert. Die Sepharose/Protein-Komplexe wurden 2 Mal in IBTB (siehe Materialien und Methoden) gewaschen, in SDS-PAGE-Ladepuffer resuspendiert, auf einem 8 %-igen SDS-PAGE-Gel getrennt und unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörper einem Immunoblot unterzogen.
  • 5 Mtt1 ist mit Polysom assoziiert. Zytoplasmatische Extrakte aus einem Hefestamm BJ3505, der mit pG-1FLAGMTT1 transformiert wurde, wurden hergestellt und entweder mit RNase A behandelt oder unbehandelt belassen. Die Extrakte wurden dann durch einen Saccharose-Gradienten von 7–47 % zentrifugiert. Die Gradienten wurden geerntet und Fraktionen wurden gesammelt, während A254 beobachtet wurde. Die Gradientfraktionen wurden Western-Blot unter Verwendung von monoklonalem Antikörper zu dem Flag-Epitop als einer Sonde unterzogen. Die A254-Profile sind in den oberen Feldern gezeigt, während die Western-Blots der entsprechenden Fraktionen sind in den unteren Feldern gezeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Translationstermination an einem Terminationscodon ist der letzte Schritt, der die Synthese eines Polypeptids abschließt. Eine vorzeitige Translationstermination führt zu der Synthese von verkürzten Proteinen und einem schnellen Abbau von abweichenden mRNAs. Diese Mutationen machen einen großen Prozentanteil genetischer Erbkrankheiten aus und eine neuartige Strategie zum Verringern der Effizienz des Translationsterminationsvorgangs wurde zur Behandlung dieser Krankheiten entwickelt. Folglich wird die Identifizierung und Charakterisierung von Faktoren, die die Terminationseffizienz modulieren, sowohl für das Verständnis der Biologie dieses Vorgangs als auch beim Identifizieren neuer Therapeutika von Bedeutung sein.
  • Diese Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung einer Familie von RNA-Helicasen, die am Modulieren der Translationstermination beteiligt sind, insbesondere das MTT1-Gen und dessen Proteinprodukt. mtt1Δ-Stämme wirken sich nicht auf den mRNA-Zerfall aus, zeigen jedoch einen Nonsense-Suppressionsphänotyp. Ein mtt1Δ-upf1Δ-Stamm zeigt einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp, der größer ist als ein in Stämmen, die eine einzige Deletion beherbergen, beobachteter. Biochemische Ergebnisse zeigen, dass Mtt1p-ATPase/Helicase beteiligt und mit Polysom assoziiert ist und mit dem Translationsterminationsfaktor eRF3 interagiert. Zusammengenommen identifizieren die hierin dargestellten Ergebnisse eine Familie von RNA-Helicasen, die die Translationsterminationseffizienz in Zellen modulieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen mutierten mtt1Δ-Stamm. Ein mutierter mtt1Δ-upf1Δ-Stamm zeigt einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp, der größer ist als ein in Stämmen, die eine einzige Deletion beherbergen, beobachteter. Die Erfindung betrifft Assays, Therapeutika und Screening-Verfahren, die als Antagonist oder Agonist fungieren, um die Nonsense-Suppression zu modulieren. Wie hierin gezeigt, zeigt ein mutierter mtt1Δ-upf1Δ-Stamm einen im Vergleich zu einem upf1Δ- oder mtt1Δ-Stamm drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp.
  • Diese Erfindung stellt einen isolierten Komplex bereit, der MTT1, ein humanes Upf1p-Protein, einen eukaryotischen Release-Faktor 1 (eRF1) von Peptidyl und einen eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl umfasst, wobei der Komplex dahingehend wirksam ist, die Peptidyltransferaseaktivität zu modulieren. Wie hierin definiert, umfasst ein „Überwachungskomplex" mindestens MTT1, Upf1p und eukaryotischen Release-Faktor 1 und 3. Das „UPF1"-Gen wird auch als RENT1 oder HUPF1 bezeichnet. Der Komplex kann auch Upf2p und/oder Upf3p umfassen.
  • Es kann ein Agens bereitgestellt werden, das an den Komplex bindet, der die Fidelität der Translationstermination moduliert. Translationstermination beinhaltet Initiation, Elongation, Termination und Abbau. Das Agens kann die Bindung von MTT1 an das Polysom modulieren oder die Bindung von humanem MTT1 an eRF3 inhibieren. Alternativ kann das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3 erleichtern.
  • Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das gereinigte Mtt1p ebenfalls RNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivitäten zeigt (7). Mehrere Beweisreihen legen nahe, dass Mtt1p an der Translationstermination beteiligt ist. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass: 1) ein mtt1Δ-Stamm einen Nonsense-Suppressionsphänotyp zeigt (4); 2) das Mtt1p mit Polysom assoziiert ist (6); 3) das Mtt1p direkt mit dem Peptidyl-Release-Faktor eRF3 interagiert (5); 4) mtt1Δ-Stämme Paromomycin-Empfindlichkeit zeigen. Wenn man berücksichtigt, dass ein mtt1Δ-Stamm im Gegensatz zu einem upf1Δ-Stamm Nonsense enthaltende Transkripte nicht stabilisiert, ist der Umfang der Nonsense-Suppression pro RNA-Molekül in einem mtt1Δ-Stamm größer als in einem upf1Δ-Stamm (3).
  • Eine große Anzahl von Beobachtungen deutet auf eine wichtige Rolle für die Proteinsynthese im mRNA-Zerfallsvorgang hin. Tatsächlich scheint es, dass diese zwei Vorgänge sich gemeinsam entwickelt haben und dass für einen Vorgang entscheidende Faktoren auch in dem anderen fungieren. Beweise für diese Verknüpfung beinhalten Versuche, die zeigen, dass: a) Arzneimittel oder Mutationen, die die Translationselongation beeinträchtigen, die mRNA-Stabilisierung fördern, b) Sequenzelemente, die den schnellen mRNA-Zerfall bestimmen, auf mRNA kodierende Regionen lokalisiert werden können und die Aktivität solcher Elemente von deren Translation abhängt, c) Abbaufaktoren mit Ribosom assoziiert sein können und d) vorzeitige Translationstermination mRNA-Zerfallsraten verstärken kann.
  • Da die Quantität eines bestimmten Proteins, das in einer gegebenen Zeit synthetisiert wird, von der zellulären Konzentration von dessen mRNA abhängt, folgt daraus, dass die Regulation von mRNA-Zerfallsraten ein starkes Mittel zum Kontrollieren der Genexpression liefert. In Säugetierzellen können mRNA-Zerfallsraten (als Halbwertzeiten ausgedrückt) lediglich 15–30 Minuten oder bis zu 500 Stunden betragen. Offensichtlich können solche Unterschiede bei den mRNA-Zerfallsraten zu bis zu 1000-fachen Unterschieden beim Spiegel spezifischer Proteine führen. Eine weitere Ebene der Kontrolle wird durch die Beobachtung bereitgestellt, dass Zerfallsraten für individuelle mRNAs nicht festgelegt werden müssen, sondern als Folge autogener Feedback-Mechanismen, des Vorliegens spezifischer Hormone, einer bestimmten Stufe der Differenzierung oder des Zellzyklus oder Virusinfektion reguliert werden können.
  • Die vielleicht besten Beispiele der Integration von Translation und mRNA-Zerfall sind Studien, die die Folgen vorzeitiger Translationstermination dokumentieren. Diese erfolgt, wenn Deletion, Basensubstitution oder Rasterverschiebungsmutationen in DNA zu der Synthese einer mRNA führen, die ein ungeeignetes Stoppcodon (Nonsense-Codon) in seiner Protein kodierenden Region enthält. Das Auftreten eines solchen vorzeitigen Stoppcodons hält die Translation an der Stelle früher Termination an und bewirkt die Synthese eines verkürzten Proteins. Ungeachtet ihrer „normalen" Zerfallsraten werden mRNAs, die aus Genen transkribiert werden, die Nonsense-Mutationen beherbergen (als „Nonsense enthaltende mRNAs" bezeichnet), sehr schnell abgebaut. Ein solcher „Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall" ist ubiquitär, d. h. er wurde in allen getesteten Organismen beobachtet und führt zu einer bis zu zehn- bis einhundertfachen Reduktion der Abundanz spezifischer mRNAs. Die Kombination stark reduzierter mRNA-Abundanz und vorzeitiger terminierter Translation bewirkt Reduktionen des Gesamtniveaus der Expression spezifischer Gene, die so dramatisch wie die Folgen einer Gendeletion sind. Die Bedeutung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls für das menschliche Wohlbefinden wird durch die Identifizierung einer zunehmenden Anzahl von Erbkrankheiten illustriert, in denen Nonsense-Mutationen den Krankheitszustand bewirken und in denen von den jeweiligen mRNAs gezeigt wurde, dass sie Substrate des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs sind.
  • Ein wichtiger Punkt ist, dass die Inaktivierung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs erzielt werden kann, ohne das Zellwachstum zu hemmen, und zu der Wiederherstellung normaler Spiegel und normaler Zerfallsraten für Nonsense enthaltende mRNAs führt. Noch bedeutender, die Hefeversuche (und andere) zeigen, dass, obwohl eine mRNA noch immer ein Nonsense-Codon enthalten kann, die Inaktivierung dieses Zerfallswegs ermöglicht, dass genug funktionelles Protein synthetisiert wird, so dass Zellen den ursprünglichen genetischen Defekt überwinden können. Folglich ist es möglich, Erkrankungen, die von Nonsense-Mutationen verursacht werden, durch Herunterregulieren des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs zu behandeln.
  • Außerdem wird ein Expressionsvektor beschrieben, der eine Nukleinsäure umfasst, die ein MTT1, Upf1p-, Upf2p-, Upf3p-Protein, einen eukaryotischen Release-Faktor 1 (eRF1) von Peptidyl und einen eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl kodiert, der operativ mit einem Regulationselement verknüpft ist.
  • Beim Durchführen der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Molekularbiologie-, Mikrobiologie- und rekombinante DNA-Techniken innerhalb des Fachkönnens eingesetzt werden. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hierin „Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II (D.N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, Hrsg. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
  • Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angelagert werden kann, um die Replikation des angelagerten Segments herbeizuführen. Ein „Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert, d. h. zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle im Stande ist. Eine „Kassette" bezieht sich auf ein DNA-Segment, das an spezifischen Restriktionsstellen in einen Vektor inseriert werden kann. Das DNA-Segment kodiert ein Polypeptid von Interesse und die Kassetten- und Restriktionsstellen sind derart entworfen, dass sie eine Insertion der Kassette in das korrekte Leseraster zur Transkription und Translation sicherstellen.
  • Ein „Nukleinsäuremolekül" bezieht sich auf die Phosphatester-Polymerform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Desoxyribonukleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle") oder beliebige Phosphoester-Analoga davon, wie Phosphorothioate und -thioester, in entweder einzelsträngiger Form oder einer doppelsträngigen Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Ausdruck Nukleinsäuremolekül und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül bezieht sich nur auf die primäre und die sekundäre Struktur des Moleküls und beschränkt es nicht auf etwaige bestimmte tertiäre Formen. Folglich beinhaltet dieser Ausdruck doppelsträngige DNA, die unter anderem in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Plasmiden und Chromosomen zu finden ist. Beim Diskutieren der Struktur bestimmter doppelsträngiger DNA-Moleküle können Sequenzen hierin gemäß des normalen Grundsatzes, nur die Sequenz in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten DNA-Strangs (d. h. der Strang mit einer Sequenz, die zu der mRNA homolog ist) anzugeben, beschrieben werden. Ein „rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, das einer molekularen biologischen Manipulation unterworfen wurde.
  • Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen sind DNA-Regulationssequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, die für die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen. In eukaryotischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
  • Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion, die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer stromabwärts gelegenen (3'-Richtung) kodierenden Sequenz initiieren kann. Zum Zwecke des Definierens der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die Mindestanzahl an Basen oder Elementen einzuschließen, die zum Initiieren der Transkription in Niveaus, die über den Hintergrund erkennbar sind, erforderlich ist. Innerhalb der Promotorsequenz werden sich eine Transkriptionsinitiationsstelle (in geeigneter Weise beispielsweise durch Kartieren mit Nuklease S1 definiert) sowie Proteinbindungsdomänen (Consensus-Sequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich zeichnen, befinden. Eine kodierende Sequenz steht „unter der Kontrolle" von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann trans-RNA-gespleißt und in das Protein, das von der kodierenden Sequenz kodiert wird, translatiert wird.
  • Eine große Anzahl von in der Technik bekannten Vektor/Wirt-Systemen kann verwendet werden. Mögliche Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Plasmide oder modifizierte Viren, das Vektorsystem muss jedoch mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Beispiele von Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, E. coli, Bakteriophagen, wie Lambda-Derivate, oder Plasmide, wie pBR322-Derivate oder pUC-Plasmid-Derivate, z. B. pGEX-Vektoren, pmal-c, pFLAG usw. Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise durch Ligieren des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Termini aufweist, erzielt werden. Wenn die komplementären Restriktionsstellen, die zum Fragmentieren der DNA verwendet wurden, jedoch nicht in dem Klonierungsvektor vorliegt, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann eine beliebige gewünschte Stelle durch Ligieren von Nukleotidsequenzen (Linkern) auf die DNA-Termini produziert werden; diese ligierten Linker können spezifische, chemisch synthetisierte Oligonukleotide kodierende Restriktionsendonukleaseerkennungssequenzen umfassen. Rekombinante Moleküle können mittels Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. in Wirtszellen inseriert werden, so dass viele Kopien des Gens erzeugt werden. Vorzugsweise ist das klonierte Gen auf einem Shuttle-Vektor-Plasmid enthalten, der für die Expansion in einer klonierenden Zelle, z. B. E. coli, und einfache Reinigung zur anschließenden Insertion in eine geeignete Expressionszelllinie, falls eine solche gewünscht wird, sorgt. Zum Beispiel kann ein Shuttle-Vektor, bei dem es sich um einen Vektor handelt, der in mehr als einer Art von Organismus replizieren kann, zur Replikation in sowohl E. coli als auch Saccharomyces cerevisiae durch Verknüpfen von Sequenzen aus einem E. coli-Plasmid mit Sequenzen aus dem Hefe-2μ-Plasmid hergestellt werden.
  • Diese Erfindung kann Agentien identifizieren, die an den Komplex binden, der die Fidelität der Translation moduliert. Translation beinhaltet Initiation, Elongation, Termination sowie Abbau. In einer Ausführungsform inhibiert das Agens ATPase/Helicase-Aktivität, Aktivität von MTT1, Upf1p; GTPase-Aktivität von eRF1 oder eRF3; RNA-Bindung; Bindung der Faktoren an das Ribosom oder Bindung der Faktoren aneinander. Das Agens kann die Bindung von MTT1 an das Polysom modulieren oder die Bindung von humanem MTT1 an eRF3 inhibieren. Alternativ kann das Agens die Bindung von humanem MTT1 an eRF3 erleichtern.
  • Hierin wird ein Antikörper beschrieben, der an den Komplex oder MTT1 bindet. Der Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Des Weiteren kann der Antikörper mit einem nachweisbaren Marker markiert werden, der entweder ein radioaktiver, kolorimetrischer, fluoreszierender oder ein lumineszierender Marker ist. Der markierte Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. Der markierte Antikörper kann ein gereinigter markierter Antikörper sein. Verfahren zum Markieren von Antikörpern sind in der Technik wohl bekannt.
  • Der Ausdruck „Antikörper" beinhaltet beispielhaft sowohl natürlich vorkommende als auch nicht natürlich vorkommende Antikörper. Insbesondere beinhaltet der Ausdruck „Antikörper" polyklonale und monoklonale Antikörper und Fragmente davon. Darüber hinaus beinhaltet der Ausdruck „Antikörper" chimäre Antikörper und vollständig synthetische Antikörper und Fragmente davon. Solche Antikörper beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, polyklonale, monoklonale, chimäre, einkettige, Fab-Fragmente und einen Fab-Expressionsbibliothek. Des Weiteren kann das Protein oder der Antikörper einen nachweisbaren Marker beinhalten, wobei der Marker ein radioaktiver, kolorimetrischer, fluoreszierender oder ein lumineszierender Marker ist.
  • Antikörper können zum Nachweis in vitro markiert werden, z. B. mit Marker wie Enzymen, Fluorophoren, Chromophoren, Radioisotopen, Farbstoffen, kolloidalem Gold, Latexteilchen und chemilumineszierenden Agentien. Alternativ können die Antikörper zum Nachweis in vivo markiert werden, z. B. mit Radioisotopen (vorzugsweise Technetium oder Iod); Magnetresonanzverschiebungsreagenzien (wie Gadolinium und Mangan) oder strahlenundurchlässige Reagenzien. Die am häufigsten für diese Studien eingesetzten Marker sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die bei Exponierung zu ultraviolettem Licht fluoreszieren, und andere. Eine Reihe fluoreszierender Materialien ist bekannt und kann als Marker eingesetzt werden. Diese beinhalten beispielsweise Fluoreszein, Rhodamin, Auramin, Texas Red, AMCA Blue und Lucifer Yellow. Ein bestimmtes Nachweismaterial ist Anti-Kaninchen-Antikörper, der Ziegen hergestellt und durch ein Isothiocyanat mit Fluoreszein konjugiert wird. Das Protein kann auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Der radioaktive Marker kann mittels einer beliebigen der gegenwärtig verfügbaren Zählvorgehensweisen nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re.
  • Enzymmarker sind ebenso geeignet und können mittels einer beliebigen der gegenwärtig eingesetzten Kolorimetrie-, Spektrophotometrie-, Fluorospektrophotometrie-, Amperometrie- oder Gasometrietechniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird mit dem gewählten Teilchen mittels Umsetzung mit Brückenmolekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und dergleichen konjugiert. Viele Enzyme, die in diesen Vorgehensweisen verwendet werden können, sind bekannt und können eingesetzt werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glukuronidase, β-D-Glukosidase, β-D-Galaktosidase, Urease, Glukoseoxidase plus -peroxidase und alkalische Phosphatase. Auf die US-Patentschriften Nr. 3,654,090 ; 3,850,752 und 4,016,043 wird beispielhaft bezüglich ihrer Offenbarungen alternativer Markierungsmaterialien und -verfahren verwiesen.
  • Für einen Komplex spezifische Antikörper und Nukleinsäuren können als Sonden in Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens eines komplexen Polypeptids (unter Verwendung eines Antikörpers) oder einer Nukleinsäure (unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde) in einer Probe oder einer spezifischen Zellart verwendet werden. In diesen Verfahren wird ein für einen Komplex spezifischer Antikörper oder eine Nukleinsäuresonde mit einer Probe von einem Patienten, von dem vermutet wird, dass er eine mit dem Komplex zusammenhängende Erkrankung hat, in Kontakt gebracht und die spezifische Bindung des Antikörpers oder der Nukleinsäuresonde an die Probe nachgewiesen. Der Spiegel des Komplexes oder der Nukleinsäure, der in der suspekten Probe vorliegt, kann mit dem Spiegel in einer Kontrollprobe verglichen werden, z. B. einer äquivalenten Probe von einer nicht betroffenen Einzelperson, um zu ermitteln, ob der Patient eine mit dem Komplex zusammenhängende Erkrankung hat. Komplexe Polypeptide oder Fragmente davon können ebenfalls als Sonden in Diagnoseverfahren verwendet werden, beispielsweise um das Vorliegen von mit einem Komplex spezifischen Antikörpern in Proben nachzuweisen. Darüber hinaus könnten mit einem Komplex spezifische Antikörper zum Nachweisen von neuartigen Kofaktoren verwendet werden, die mit dem Komplex oder dem Fragment davon einen Komplex gebildet haben.
  • Ein Vorliegen, eine relative Abundanz oder ein Fehlen des Komplexes wird über die Bindung der Antikörper ermittelt. Zu möglichen Nachweisverfahren zählen Affinitätschromatographie, Western-Blot oder andere Durchschnittsfachmännern wohl bekannte Techniken. Dieser Ansatz setzt Antisense-Nukleinsäure und Ribozyme ein, um die Translation einer spezifischen mRNA zu blockieren, indem entweder diese mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure maskiert oder sie mit einem Ribozym gespalten wird.
  • Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zu mindestens einem Abschnitt eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (siehe Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:298). In der Zelle hybridisieren sie an diese mRNA, wobei ein doppelsträngiges Molekül gebildet wird. Die Zelle translatiert eine mRNA nicht in diese Doppelstrangform. Folglich beeinträchtigen Antisense-Nukleinsäuren die Expression von mRNA in Protein. Oligomere von etwa fünfzehn Nukleotiden und Molekülen, die an das AUG-Initiationscodon hybridisieren, werden besonders effektiv sein, da sie leicht zu synthetisieren sind und wahrscheinlich weniger Probleme aufwerfen als größere Moleküle, wenn sie in Organzellen eingeführt werden. Antisense-Verfahren wurden zum Inhibieren der Expression vieler Gene in vitro verwendet (Marcus-Sekura, 1988, oben; Hambor et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1237).
  • Ribozyme sind RNA-Moleküle, die über die Fähigkeit verfügen, andere einzelsträngige RNA-Moleküle in einer zu DNA-Restriktionsendonukleasen einigermaßen analogen Art und Weise spezifisch zu spalten. Ribozyme wurden über die Beobachtung entdeckt, dass bestimmte mRNAs die Fähigkeit aufweisen, ihre eigenen Introns zu exzisieren. Durch Modifizieren der Nukleotidsequenz dieser RNAs waren Forscher in der Lage, Moleküle zu konstruieren, die spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und es spalten (Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:3030). Da sie sequenzspezifisch sein, werden nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert.
  • Prüfer haben zwei Arten von Ribozymen identifiziert, die Tetrahymena-Art und die „Hammerkopf"-Art. Ribozyme der Tetrahymena-Art erkennen Sequenzen von vier Basen, während die „Hammerkopf"-Art Sequenzen von elf bis achtzehn Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz ist, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie ausschließlich in der Ziel-mRNA-Spezies auftritt. Folglich sind Ribozyme der Hammerkopf-Art gegenüber Ribozymen der Tetrahymena-Art zum Inaktivieren einer spezifischen mRNA-Spezies bevorzugt und Erkennungssequenzen von achtzehn Basen sind gegenüber kürzeren Erkennungssequenzen bevorzugt.
  • Eine beliebige in der Technik bekannte Screening-Technik kann zum Screenen auf Agentien, die ein Translationsterminations- oder ein mRNA-Zerfallsprotein beeinflussen, angewendet werden. Die vorliegende Erfindung zieht Screenings auf Kleinmolekülliganden in Erwägung.
  • Eine Kenntnis der primären Sequenz eines Translationsterminations- oder mRNA-Zerfallsproteins und der Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen mit bekannter Funktion können einen ersten Hinweis auf Agentien liefern, von denen wahrscheinlich ist, dass sie die Proteinaktivität beeinflussen. Die Identifizierung solcher Agentien und das Screenen auf diese werden durch Ermitteln von Strukturmerkmalen des Proteins, z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie, Neutronenbeugung, NMR-Spektroskopie und anderer Techniken zur Strukturbestimmung, weiter erleichtert. Diese Techniken stellen das rationelle Design oder die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten zur Verfügung.
  • Das Screening kann mit rekombinanten Zellen, die die Proteine exprimieren, Komplexen, die an dem Translationsterminations- oder mRNA-Zerfallsprotein beteiligt sind, oder alternativ mit dem gereinigten Protein durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit von markiertem Protein, an ein Molekül in einer Kombinationsbibliothek zu binden, als ein Screening-Assay angewendet werden, wie in den vorstehenden Referenzen beschrieben.
  • Eine Kandidatenwirtszelle kann auf die Menge des Komplexes gescreent werden, der von der Zelle im Verhältnis zu einer Kontrollzelle produziert wird. Ein Verfahren umfasst a) das Bereitstellen einer klonalen Population der Kandidatenwirtszelle; b) das Behandeln der klonalen Population von Zellen, so dass die intrazellulären Proteine gegenüber einem Antikörper zugänglich sind; c) das Inkontaktbringen der intrazellulären Proteine mit einem Antikörper, der spezifisch an den Komplex bindet; und d) das Ermitteln der relativen Menge des Komplexes, der von der Kandidatenwirtszelle produziert wird.
  • Verfahren zum Screenen des MTT1-Gens zum Identifizieren von Mutationen können durchgeführt werden. Solche Verfahren können weiterhin den Schritt des Amplifizierens eines Abschnitts des MTT1-Gens umfassen und können weiterhin einen Schritt des Bereitstellens eines Satzes von Polynukleotiden beinhalten, bei denen es sich um Primer zur Amplifikation des Abschnitts des MTT1-Gens handelt. Das Verfahren ist zum Identifizieren von Mutationen zur Verwendung in entweder der Diagnose der Veranlagung für und der Diagnose und Behandlung von Megakaryozytenanomalie, hämopoetischer Erkrankungen, myeloproliferativer Erkrankung, Thrombozytenstörung, Leukämie und der pränatalen Diagnose und Behandlung von Tumoren von Nutzen. Geeignete Diagnosetechniken beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrangkonformationsanalyse (single-stranded conformation analysis, SSCA), RNase-Schutz-Assay, allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP, wie im Folgenden weiter ausführlich beschrieben.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel bereit, das an der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkontaktbringen von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel und b) Prüfen auf Modulation des Komplexes, wobei ein Arzneimittel, das den Komplex moduliert, an der Peptidyltransferaseaktivität beteiligt ist. Des Weiteren kann der Komplex auf NTPase-Aktivität, wie ATPase, GTPase, RNA- Bindungsaktivität, Faktoren, die an den Komplex binden, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, eRF1 und eRF3, Faktoren, die von dem Ribosom dissoziieren, Faktoren, die Aggregation fördern; Faktoren, die die Translationstermination durch Verlangsamen der Peptidhydrolyse verstärken, geprüft werden.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel bereit, das aktiv an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkontaktbringen von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel und b) Prüfen auf Modulation des Proteinkomplexes; wobei ein Arzneimittel, das den Proteinkomplex moduliert, an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel bereit, das an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkubieren des Arzneimittels und des Komplexes und b) Messen der Auswirkung auf die Nonsense-Suppression, wodurch auf ein Arzneimittel gescreent wird, das an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist. Bei den Assays kann es sich um einen RNA-Bindungsassay oder NTPase-Assays, wie ATPase- oder GTPase-Assays handeln, die Fachmännern bekannt sind.
  • Hierin wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Gens mit einem mutierten Allel beschrieben, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle mit einem rekombinanten MTT1-Expressionsvektor; (b) Ermitteln des Phänotyps der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach der Transfektion mit dem Zellphänotyp vor der Transfektion und (d) Identifizieren des Gens, das das mutierte Allel enthält, der transfizierten Zelle.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung bereit, die die Bindung an MTT1 moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung umfassen, und MTT1, wobei das Inkubieren unter Bedingungen durchgeführt wird, die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen; und (b) Messen der Auswirkung der Testzusammensetzung auf die Bindung an MTT1. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Identifizieren eines Gens, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Einführen einer Testzusammensetzung, die die Bindung an MTT1 moduliert, in eine Zelle; (b) Bestimmen des Phänotyps der Zelle nach (a); (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach (a) mit dem Zellphänotyp vor (a) und (d) Identifizieren des Gens der Zelle, in die die Testzusammensetzung eingeführt wurde.
  • Eine „Testzusammensetzung", wie hierin verwendet, ist eine beliebige Zusammensetzung, wie ein Gen, eine Nukleinsäuresequenz, ein Polypeptid, ein Peptidfragment oder eine Zusammensetzung, die durch die Verwendung einer Kombinationsbibliothek oder eines anderen Kombinationsvorgangs erzeugt wurde und auf ihre Fähigkeit zum Fungieren in gegebener Kapazität geprüft werden kann, oder eine Verbindung, die die Aktivität des Komplexes nachahmt. Oftmals wird von einer solchen Testzusammensetzung, einer solchen Nukleinsäuresequenz oder einem solchen Polypeptid aufgrund ihrer bzw. seiner Sequenz oder Struktur vermutet, dass sie bzw. es in einer gegebenen Kapazität fungieren kann.
  • Ein „Kofaktor" ist eine beliebige Zusammensetzung (z. B. ein Polypeptid, ein Polypeptidderivat oder ein Peptidomimetikum), die den Komplex modulieren und NMD oder die Effizienz der Translationstermination beeinflussen kann. Beinhaltet sind Zusammensetzungen, die NMD oder die Effizienz oder Fidelität der Translationstermination über den Komplex natürlich induzieren; ebenfalls beinhaltet sind Zusammensetzungen, die NMD nicht natürlich induzieren (z. B. künstliche Zusammensetzungen und natürliche Zusammensetzungen, die anderen Zwecken dienen).
  • Der Ausdruck „Agonist", wie hierin verwendet, steht für eine beliebige Zusammensetzung, die die Effizienz oder Fidelität der Translationstermination oder den mRNA-Abbau durch Interagieren mit oder Binden an den Komplex oder Faktoren, wie eRF3 oder upf1, des Komplexes, die mit MTT1 des Komplexes interagieren, steigern oder stimulieren kann. Der Ausdruck „Antagonist", wie hierin verwendet, steht für eine beliebige Zusammensetzung, die die Effizienz oder Fidelität der Translationstermination oder den mRNA-Abbau durch Interagieren mit oder Binden an den Komplex, MTT1 oder Faktoren, wie eRF3 oder upf1, des Komplexes, die mit MTT1 des Komplexes interagieren, senken kann.
  • Die Identifizierung und Isolierung eines Gens, das ein MTT1 der Erfindung kodiert, sorgt für die Expression von MTT1 in Mengen, die größer sind, als sie aus natürlichen Quellen isoliert werden können, oder in Indikatorzellen, die speziell darauf konstruiert sind, die Aktivität von MTT1 anzuzeigen, das nach der Transfektion oder Transformation der Zellen exprimiert wird. Dementsprechend zieht die vorliegende Erfindung neben dem rationellen Design von Agonisten und Antagonisten auf Grundlage der Struktur von MTT1 ein alternatives Verfahren zum Identifizieren spezifischer Liganden von MTT1 unter Anwendung verschiedener, in der Technik bekannter Screening-Assays in Erwägung.
  • Eine beliebige, in der Technik bekannte Screening-Technik kann zum Screenen auf MTT1-Agonisten oder -Antagonisten angewendet werden. Die vorliegende Erfindung zieht Screenings auf kleine Moleküle in Erwägung, die an MTT1 binden und MTT1 in vitro und/oder in vivo agonisieren oder antagonisieren. Zum Beispiel können Bibliotheken natürlicher Produkte unter Anwendung von Assays der Erfindung auf Moleküle gescreent werden, die die Aktivität von MTT1 agonisieren oder antagonisieren.
  • Eine Kenntnis der primären Sequenz des MTT1 und der Ähnlichkeit dieser Sequenz mit anderen DNA-Bindeproteinen können einen ersten Hinweis auf die Inhibitoren oder Antagonisten des MTT1 liefern. Die Identifizierung von Antagonisten und das Screenen auf diese werden durch Ermitteln von Strukturmerkmalen des Proteins, z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie, Neutronenbeugung, NMR-Spektroskopie und anderer Techniken zur Strukturbestimmung, weiter erleichtert. Diese Techniken stellen das rationelle Design oder die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten zur Verfügung.
  • Ein anderer Ansatz setzt rekombinanten Bakteriophagen ein, um große Bibliotheken zu produzieren. Unter Anwendung des „Phage"-Verfahrens [Scott und Smith, 1990, Science 249:386–390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378–6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404–406 (1990)] können sehr große Bibliotheken konstruiert werden (106–108 chemische Einheiten). Ein zweiter Ansatz setzt vorwiegend chemische Verfahren ein, von denen das Geysen-Verfahren [Geysen et al., Molecular Immunology 23:709–715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method 102:259–274 (1987)] und das Verfahren von Fodor et al. [Science 251:767–773 (1991)] Beispiele sind. Furka et al. [14th International Congress of Biochemistry, Band 5, Zusammenfassung FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487–493 (1991)], Houghton [ US-Patentschrift Nr. 4,631,211 , erteilt im Dezember 1986] und Rutter et al. [ US-Patentschrift Nr. 5,010,175 , erteilt am 23. April 1991] beschreiben Verfahren zum Produzieren eines Gemischs von Peptiden, die als Agonisten oder Antagonisten getestet werden können.
  • In einem anderen Gesichtspunkt können synthetische Bibliotheken [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700–10704 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922–10926 (1993); Lam et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00252 ; Kocis et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 9428028 ] können zum Screenen auf MTT1-Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Das Screenen kann mit rekombinanten Zellen, die das MTT1 exprimieren, oder alternativ unter Verwendung von gereinigtem Protein und/oder spezifischen strukturellen/funktionellen Domänen von MTT1s, z. B. rekombinant produziert, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine markierte MTT12-Dimerisationsdomäne zum Screenen von Bibliotheken, wie in den vorstehenden Referenzen beschrieben, auf kleine Moleküle, die die Dimerisation des MTT12 inhibieren werden, verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Nachweisen neuartiger Kofaktoren oder Inhibitoren bereit, die MTT1 binden, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe, die MTT1 umfasst, mit Testzusammensetzungen und das Messen der Änderung des NMRD nach Anwendung der Testzusammensetzung umfasst. Das MTT1-Protein der vorliegenden Erfindung ist in einem Screening-Verfahren zum Identifizieren neuartiger Testverbindungen oder neuartiger Testzusammensetzungen, die den NMRD über MTT1 beeinflussen, von Nutzen. Folglich stellt die Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zum Screenen auf Testzusammensetzungen bereit, was das Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung enthalten, und MTT1 unter Bedingungen, die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen; dann anschließend das Messen der Auswirkung, die die Testzusammensetzung auf den NMRD in einer Testzelle hat, umfasst. Die beobachtete Auswirkung auf den NMD zwischen MTT1 und einer Zusammensetzung kann entweder agonistisch oder antagonistisch sein. Vorzugsweise ist das Polypeptid, das das MTT1 kodiert, das Polypeptid oder ein synthetisches Peptid, das die biologische Aktivität des MTT1-Proteins aufweist.
  • Da MTT1 mit der UPF1-Familie in Hefe eng verwandt ist, bezieht sich der Ausdruck „MTT1-spezifische Sonde" im Rahmen dieser Erfindung auf Sonden, die in einem nachweisbar größeren Ausmaß als an Nukleinsäuren, die UPF1-Sequenzen kodieren, oder an komplementäre Sequenzen davon an Nukleinsäuren, die MTT1-Polypeptide kodieren, oder an komplementäre Sequenzen davon, binden. Der Ausdruck „MTT1-spezifische Sonde" beinhaltet folglich Sonden, die in einem nennenswerten Ausmaß an Nukleinsäuren, die MTT1-Polypeptide kodieren, (oder an komplementäre Sequenzen davon), jedoch nicht an Nukleinsäuren, die PF-Sequenzen kodieren, (oder an komplementäre Sequenzen davon) binden.
  • Die Erfindung erleichtert die Produktion von MTT1-spezifischen Nukleinsäuresonden. Verfahren zum Erhalten solcher Sonden können auf Grundlage der Aminosäuresequenz-Alignments, die in 1 gezeigt sind, entwickelt werden. Die Sonden, die mindestens 9, z. B. mindestens 12, 15, 25, 35, 50, 100 oder 150 Nukleotide enthalten können, können unter Anwendung einer beliebigen von mehreren Standardverfahren produziert werden (siehe z. B. Ausubel et al., oben). Zum Beispiel werden die Sonden vorzugsweise unter Anwendung von PCR-Amplifikationsverfahren, wie den im Folgenden beschrieben, erzeugt. In diesen Verfahren werden Primer entworfen, die MTT1-Sequenzen entsprechen, die MTT1-spezifische Aminosäuren beinhalten können, und das resultierende PCR-Produkt wird als eine Sonde zum Screenen einer Nukleinsäurebibliothek, wie einer cDNA-Bibliothek, verwendet.
  • Die MTT1-spezifischen Nukleinsäuresonden können mit einer Verbindung markiert werden, die den Nachweis der Bindung an die MTT1-Nukleinsäure in der Probe erleichtert. Zum Beispiel kann die Sonde biotinylierte Nukleotide enthalten, an die nachweisbar markierte Avidin-Konjugate (z. B. mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Avidin) binden können. Diese Sonden können in Nukleinsäurehybridisierungsassays zum Nachweisen veränderter Spiegel von MTT1 s in einer Probe verwendet werden. Zum Beispiel können In-situ-Hybridisierungs-, RNase-Schutz- und Northern-Blot-Verfahren angewendet werden. Andere Standard-Nukleinsäurenachweisverfahren, die in der Erfindung verwendet werden können, sind Fachmännern bekannt (siehe z. B. Ausubel et al., oben). Darüber hinaus, wenn es sich bei dem diagnostischen Molekül um eine Nukleinsäure handelt, kann sie vor der Bindung mit einer MTT1-spezifischen Sonde amplifiziert werden. Vorzugsweise wird PCR angewendet, es können jedoch andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wie die Ligase-Kettenreaktions-(ligase chain reaction, LCR), ligierte aktivierte Transkriptions-(LAT) und nukleinsäuresequenzgestützte Amplifikationsverfahren (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) angewendet werden.
  • Ein Verfahren zum Ermitteln, ob ein Testagens oder eine Testzusammensetzung den Komplex in einer Zelle moduliert, kann durch (i) Bereitstellen einer Zelle, die den Komplex aufweist; (ii) Inkontaktbringen der Zelle mit einem Testagens oder einer Testzusammensetzung, das bzw. die in Abwesenheit des Testagens oder der Testzusammensetzung den Komplex in der Zelle aktiviert; und (iii) Nachweisen einer Veränderung des Komplexes der Zelle durchgeführt werden. Eine Zelle kann entweder gleichzeitig oder sequentiell mit dem Testagens oder der Testzusammensetzung in Kontakt gebracht werden. Eine Zunahme des Komplexes zeigt an, dass das Testagens oder die Testzusammensetzung ein Agonist des Komplexes ist, während eine Abnahme des Komplexes anzeigt, dass das Testagens oder die Testzusammensetzung ein Antagonist des Komplexes ist. Auf Wunsch kann das oben beschriebene Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren des Komplexes zum Identifizieren von Zusammensetzungen, Kofaktoren oder anderen Zusammensetzungen in dem Komplexweg, die den Komplex umfassen, zur Verwendung in diesem Gesichtspunkt der Erfindung angewendet werden. Ein beliebiges Agens oder eine beliebige Zusammensetzung kann als ein Testagens oder eine Testzusammensetzung beim Ausüben der Erfindung verwendet werden; ein bevorzugtes Testagens oder eine bevorzugte Testzusammensetzung beinhaltet Polypeptide und kleine organische Agentien oder Zusammensetzungen. Obgleich Sequenz- oder Strukturhomologie eine Grundlage für die Vermutung, dass ein Testagens oder eine Testzusammensetzung den Komplex in einer Zelle modulieren kann, bereitstellen kann, sind zufällig gewählte Testagentien oder -zusammensetzungen ebenfalls zur Verwendung in der Erfindung geeignet. In der Technik bekannte Verfahren zum zufälligen Erzeugen eines Agens oder von Zusammensetzungen (z. B. Expression von Polypeptiden aus Nukleinsäurebibliotheken) können zum Produzieren geeigneter Testagentien oder -zusammensetzungen angewendet werden. Fachmänner werden erkennen, dass alternative Techniken anstelle der hierin beschriebenen bestimmten Techniken angewendet werden können.
  • Ein Verfahren zum Nachweisen neuartiger Kofaktoren oder Inhibitoren, die den Komplex binden, umfasst das Inkontaktbringen einer Probe, die den Komplex umfasst, mit Testzusammensetzungen und das Messen der Veränderung des Komplexes nach der Anwendung der Testzusammensetzung. Der Komplex der vorliegenden Erfindung ist in einem Screening-Verfahren zum Identifizieren neuartiger Testverbindungen oder neuartiger Testzusammensetzungen, die sich auf den Komplex auswirken, von Nutzen. Folglich beinhaltet das Verfahren ein Verfahren zum Screenen auf Testzusammensetzungen, das das Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung beinhalten, und des Komplexes unter Bedingungen, die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen, dann anschließend das Messen der Auswirkung, die die Testzusammensetzung auf den Komplex in einer Testzelle hat, umfasst. Die beobachtete Auswirkung auf den Komplex und eine Zusammensetzung kann entweder agonistisch oder antagonistisch sein.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation bereit, das das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Komplex in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Translationstermination zu erleichtern, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert wird, umfasst. Ein Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation kann das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Agens in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Nonsense-Translationstermination zu supprimieren, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert wird, umfassen. Die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation findet während der Initiation, der Elongation, der Termination und dem Abbau von mRNA statt.
  • Ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden Transkripten kann das Inkontaktbringen einer Zelle mit dem Agens in einer Menge, die dahingehend wirksam ist, die Bindung von Mtt1 und eRF3 zu inhibieren, wodurch die Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von abweichenden Transkripten gefördert wird, umfassen.
  • Ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon und/oder Fördern des Abbaus von abweichenden Transkripten kann das Inkontaktbringen einer Zelle mit einem Agens, das die ATPase/Helicase-Aktivität von MTT1 inhibiert, wodurch die Effizienz der Translationstermination von mRNA an einem Nonsense-Codon moduliert und/oder der Abbau von abweichenden Transkripten gefördert wird, umfassen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „Modulation" der Translationsfidelität, die Aktivität des Translationsapparats zu verändern, um die Fidelität der Reaktion zu erhöhen oder zu verringern, ohne den Vorgang vollständig zu inhibieren. Zum Beispiel findet das Modulieren des Translationsterminationsvorgangs an einem Nonsense-Codon als Folge des Veränderns der Fähigkeit der Translations-Release-Faktoren am Terminationscodon statt, um die Peptidylfreisetzung bei Kompetition nahezu zugehörigen tRNAs zu fördern. Das Endergebnis würde darin bestehen, dass die nahezu zugehörige tRNA in die Polypeptidkette integriert und die Termination supprimiert wird. Da die meisten Proteine nur zu 5 % bis 20 % der Wildtyp-Spiegel exprimiert werden müssen, muss die Translationstermination nicht inhibiert werden. Der Terminationsvorgang muss derart moduliert werden, dass er um einen geringen Grad weniger effizient ist.
  • Agentien, die NTPase-Aktivität, wie ATPase-Aktivität, GTPase-, Helicase-Aktivität, oder die Zinkfingermotiv-Konfiguration beeinträchtigen, können zum Testen ausgewählt werden. Solche Agentien können geeignete Arzneimittel zum Behandeln von Virusinfektionen sein, da viele Retroviren, insbesondere HIV, Coronaviren und andere RNA-Viren mit medizinischen und tiermedizinischen Pathologien zusammenhängen. Durch Bereitstellen der Identität von Proteinen, die Rasterverschiebungsereignisse modulieren, kann ein erster Screen auf Agentien einen Bindungsassay auf solche Proteine beinhalten. Dieser Assay kann zum Testen auf die Wirksamkeit von Agentien gegenüber der Aktivität von mit Rasterverschiebung zusammenhängenden Proteinen vom Menschen sowie von Hefe oder einer anderen nichtmenschlichen Quelle, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Tieren eingesetzt werden.
  • Zum Beispiel ist die Identifizierung von Agentien, die den Zerfallsweg inhibieren, Nonsense-Transkripte stabilisieren oder die Effizienz der Translationstermination modulieren, für den Erfolg von Antisense-RNA-Technologie wichtig. Antisense-RNAs sind kleine, diffusionsfähige, untranslatierte und stark strukturierte Transkripte, die an spezifischen Ziel-RNAs an Komplementaritätsregionen Paare bilden, wodurch die Ziel-RNA-Funktion oder -Expression kontrolliert wird. Versuche, Antisense-RNA-Technologie anzuwenden, haben jedoch begrenzten Erfolg gezeigt. Der begrenzende Faktor scheint darin zu bestehen, ausreichende Konzentrationen der Antisense-RNA in einer Zelle zu erzielen, um die Expression des Zielgens zu inhibieren oder zu verringern. Es ist wahrscheinlich, dass ein Hindernis, eine ausreichende Konzentration zu erzielen, der Nonsense-Zerfallsweg ist, da die kurzen Antisense-RNA-Transkripte, die nicht ein Genprodukt kodieren sollen, wahrscheinlich zu einer schnellen Translationstermination, wenn eine Translation stattfindet, und demzufolge zu einem schnellen Abbau und einer geringen Abundanz der Antisense-RNA in der Zelle führen werden. Folglich können die Agentien der Erfindung, die abweichende mRNA-Transkripte stabilisieren, auch Antisense-RNAs stabilisieren.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination von mRNA und/oder des Abbaus abweichender Transkripte in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Bereitstellen einer Zelle, die einen Vektor enthält, der die Nukleinsäure umfasst, die den Komplex kodiert, oder eine Antisense davon; b) Überexprimieren des Nukleinsäurevektors in der Zelle, um einen überexprimierten Komplex zu produzieren, um die Funktion des Komplexes zu beeinträchtigen oder zu inhibieren.
  • Ein Verfahren zum Ermitteln, ob ein Proband eine Mutation in dem MTT1-Gen trägt, kann Folgendes umfassen: (a) Beziehen einer geeigneten Nukleinsäureprobe von dem Probanden und (b) Ermitteln, ob die Nukleinsäure von Schritt (a) eine Nukleinsäure, die mutiertes MTT1 kodiert, ist oder von einer solchen abgeleitet ist, um dadurch zu ermitteln, ob ein Proband eine Mutation in dem MTT1-Gen trägt. Die Nukleinsäureprobe in Schritt (a) kann mRNA umfassen, die dem Transkript von DNA entspricht, die ein mutiertes MTT1 kodiert, und das Ermitteln von Schritt (b) umfasst Folgendes: (i) Inkontaktbringen der mRNA mit dem Oligonukleotid unter Bedingungen, die das Binden der mRNA an das Oligonukleotid ermöglichen, um einen Komplex zu bilden; (ii) Isolieren des so gebildeten Komplexes und (iii) Identifizieren der mRNA in dem isolierten Komplex, um dadurch zu ermitteln, ob die mRNA eine Nukleinsäure, die mutiertes MTT1 kodiert, ist oder von einer solchen abgeleitet ist. Das Ermitteln von Schritt (b) kann Folgendes umfassen: (i) Inkontaktbringen der Nukleinsäureprobe von Schritt (a) und der isolierten Nukleinsäure mit Restriktionsenzymen unter Bedingungen, die den Verdau der Nukleinsäureprobe und der isolierten Nukleinsäure zu verschiedenen, unterscheidbaren Nukleinsäureteilen ermöglichen; (ii) Isolieren der Nukleinsäureteile und (iii) Vergleichen der Nukleinsäureteile, die von der Nukleinsäureprobe abgeleitet wurden, mit den Nukleinsäureteilen, die von der isolierten Nukleinsäure abgeleitet wurden, um dadurch zu ermitteln, ob die Nukleinsäureprobe eine Nukleinsäure, die mutiertes MTT1 kodiert, ist oder von einer solchen abgeleitet ist.
  • Es wird ein transgenes nichtmenschliches Säugetier beschrieben, das mindestens einen Abschnitt der Nukleinsäure, die MTT1-Gen kodiert und Upf1p, das in einem embryonalen Stadium in das Säugetier eingeführt wurde, umfasst. Verfahren zum Produzieren eines transgenen nichtmenschlichen Säugetiers sind Fachmännern bekannt.
  • Ein Verfahren zum Nachweisen einer Störung, die mit der Expression von mtt1 zusammenhängt, kann das Inkontaktbringen einer Probe von einem Probanden, der eine Störung aufweist oder von dem vermutet wird, dass er eine Störung aufweist, mit einem Reagens, das die Expression des mtt1 nachweist, und das Nachweisen der Bindung des Reagens in der Probe umfassen.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands bereit, der mit einem Defekt in dem Komplex nach Anspruch 5 einhergeht, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle mit einer Nukleinsäure, die den Komplex kodiert; (b) Ermitteln des Anteils des defekten Komplexes der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Anteils des defekten Komplexes der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil des defekten Komplexes der Zelle vor der Transfektion.
  • Wie oben angemerkt, führt Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall zu zellulären Mängeln an lebensnotwendigen Proteinen und somit zu einer Erkrankung. Eine veränderte Kontrolle der Stabilität normaler mRNAs kann vergleichsweise schlimme Folgen haben.
  • Diese Erfindung ermöglicht die Behandlung einer Erkrankung, die mit der Peptidyltransferaseaktivität zusammenhängt, wobei die Behandlung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Komplex von Anspruch 5 oder die Agentien, die den Komplex modulieren oder stimulieren, umfasst, und einen pharmazeutischen Trägerstoff oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel an einen Probanden, wodurch der Proband behandelt wird, umfasst.
  • Nonsense-Mutationen verursachen ungefähr 20–40 % der einzelnen Fälle von mehr als 240 verschiedenen Erbkrankheiten (einschließlich Mukoviszidose, Hämophilie, familiärer Hypercholesterinämie, Retinitis pigmentosa, Duchenne-Muskeldystrophie und Marfan-Syndrom). Bei vielen Erkrankungen, in denen nur ein Prozent des funktionellen Proteins produziert wird, leiden Patienten unter schweren Krankheitssymptomen, wohingegen das Fördern der Expression auf nur fünf Prozent der normalen Niveaus die Schwere beträchtlich reduzieren oder die Erkrankung ausmerzen kann. Darüber hinaus resultiert eine bemerkenswert große Anzahl der meistverbreiteten Formen von Dickdarm-, Brust-, Speiseröhren-, Lungen-, Kopf- und Hals-, Blasenkrebs aus Rasterverschiebung und Nonsense-Mutationen in Regulationsgenen (d. h. p53, BRCA1, BRCA2 usw.). Das Korrigieren von Nonsense-Mutationen in den Regulationsgenen, um die Synthese der jeweiligen Proteine zu ermöglichen, sollte den Tod der Krebszellen bewirken.
  • Eine große Anzahl von Beobachtungen deutet auf eine wichtige Rolle für die Proteinsynthese in der Fidelität der Translationstermination und im mRNA-Zerfallsvorgang hin. Tatsächlich scheint es, dass diese zwei Vorgänge sich gemeinsam entwickelt haben und dass für einen Vorgang entscheidende Faktoren auch in dem anderen fungieren. Beweise für diese Verknüpfung beinhalten Versuche, die zeigen, dass: a) Arzneimittel oder Mutationen, die die Translationselongation beeinträchtigen, die mRNA-Stabilisierung fördern, b) Sequenzelemente, die den schnellen mRNA-Zerfall bestimmen, auf mRNA kodierende Regionen lokalisiert werden können und die Aktivität solcher Elemente von deren Translation abhängt, c) Abbaufaktoren mit Ribosom assoziiert sein können und d) vorzeitige Translationstermination mRNA-Zerfallsraten verstärken kann.
  • Da die Quantität eines bestimmten Proteins, das in einer gegebenen Zeit synthetisiert wird, von der zellulären Konzentration von dessen mRNA abhängt, folgt daraus, dass die Regulation von mRNA-Zerfallsraten ein starkes Mittel zum Kontrollieren der Genexpression liefert. In Säugetierzellen können mRNA-Zerfallsraten (als Halbwertzeiten ausgedrückt) lediglich 15–30 Minuten oder bis zu 500 Stunden betragen. Offensichtlich können solche Unterschiede bei den mRNA-Zerfallsraten zu bis zu 1000-fachen Unterschieden beim Spiegel spezifischer Proteine führen. Eine weitere Ebene der Kontrolle wird durch die Beobachtung bereitgestellt, dass Zerfallsraten für individuelle mRNAs nicht festgelegt werden müssen, sondern als Folge autogener Feedback-Mechanismen, des Vorliegens spezifischer Hormone, einer bestimmten Stufe der Differenzierung oder des Zellzyklus oder Virusinfektion reguliert werden können.
  • Die vielleicht besten Beispiele der Integration von Translation und mRNA-Zerfall sind Studien, die die Folgen vorzeitiger Translationstermination dokumentieren. Diese erfolgt, wenn Deletion, Basensubstitution oder Rasterverschiebungsmutationen in DNA zu der Synthese einer mRNA führen, die ein ungeeignetes Stoppcodon (Nonsense-Codon) in seiner Protein kodierenden Region enthält. Das Auftreten eines solchen vorzeitigen Stoppcodons hält die Translation an der Stelle früher Termination an und bewirkt die Synthese eines verkürzten Proteins. Ungeachtet ihrer „normalen" Zerfallsraten werden mRNAs, die aus Genen transkribiert werden, die Nonsense-Mutationen beherbergen (als „Nonsense enthaltende mRNAs" bezeichnet), sehr schnell abgebaut. Ein solcher „Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall" ist ubiquitär, d. h. er wurde in allen getesteten Organismen beobachtet und führt zu einer bis zu zehn- bis einhundertfachen Reduktion der Abundanz spezifischer mRNAs. Die Kombination stark reduzierter mRNA-Abundanz und vorzeitiger terminierter Translation bewirkt Reduktionen des Gesamtniveaus der Expression spezifischer Gene, die so dramatisch wie die Folgen einer Gendeletion sind. Die Bedeutung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls für das menschliche Wohlbefinden wird durch die Identifizierung einer zunehmenden Anzahl von Erbkrankheiten illustriert, in denen Nonsense-Mutationen den Krankheitszustand bewirken und in denen von den jeweiligen mRNAs gezeigt wurde, dass sie Substrate des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs sind.
  • Ein wichtiger Punkt ist, dass die Inaktivierung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs erzielt werden kann, ohne das Zellwachstum zu hemmen, und zu der Wiederherstellung normaler Spiegel und normaler Zerfallsraten für Nonsense enthaltende mRNAs führt. Noch bedeutender, die Hefeversuche (und andere) zeigen, dass, obwohl eine mRNA noch immer ein Nonsense-Codon enthalten kann, die Inaktivierung dieses Zerfallswegs ermöglicht, dass genug funktionelles Protein synthetisiert wird, so dass Zellen den ursprünglichen genetischen Defekt überwinden können. Folglich ist es möglich, Erkrankungen, die von Nonsense-Mutationen verursacht werden, durch Herunterregulieren des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs zu behandeln.
  • Die Erkrankung, Proteine oder Gene, die aus Nonsense- oder Rasterverschiebungsmutationen resultieren, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: HÄMOGLOBIN-BETA-LOCUS; MUKOVISZIDOSE-TRANSMEMBRAN-LEITFÄHIGKEITSREGULATOR; PSEUDOHYPERTROPHE PROGRESSIVE, DUCHENNE/BECKER-MUSKELDYSTROPHIE-TYPEN; PHENYLKETONURIE, INSULIN-REZEPTOR; HÄMOPHILIE A, ADENOMATOSIS COLI, FAMILIÄRE HYPERCHOLESTERINÄMIE, RECKLINGHAUSEN-KRANKHEIT TYP I, HÄMOPHILIE B, HYPERLIPOPROTEINÄMIE TYP I, TAY-SACHS-ERKRANKUNG, BRUSTKREBS TYP 1, NEBENNIERENHYPERPLASIE, WILLEBRAND-JÜRGENS-SYNDROM, MUKOPOLYSACCHARIDOSE TYP I, ALBINISMUS I, POLYZYSTISCHE NIEREN 1, ORNITHINAMINO-TRANSFERASE-MANGEL-ANGIOKERATOM, DIFFUSE MULTIPLE ENDOKRINE NEOPLASIE TYP 1, GESCHLECHTSBESTIMMENDE REGION Y, ANIONENAUSTAUSCHER-MITGLIED 1 DER FAMILIE 4 GELÖSTER TRÄGER, ALPHA-1-KETTE VON KOLLAGEN TYP I, HYPDXANTHIN-GUANIN-PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE 1, GLUKOKINASE, TUMORPROTEIN p53, PROTEOLIPID-PROTEIN, MYELIN, WACHSTUMSHORMONREZEPTOR, LUTEINISIERUNGSHORMON/CHORIOGONADOTROPIN-REZEPTOR; APOLIPOPROTEIN A-I VON LIPOPROTEIN MIT HOHER DICHTE, GLUKOSE-6-PHOSPHATDEHYDROGENASE, ORNITHINTRANSCARBAMYLASE-MANGEL-HYPERAMMONÄMIE, XERODERMIA PIGMENTOSUM 1, HOMÖOTISCHES GEN 6 MIT GEPAARTER BOX, VON-HIPPEL-LINDAU-SYNDROM, CYCLINABHÄNGIGER KINASEINHIBITOR 2A, BOURNEVILLE-SYNDROM 2, TYROSINÄMIE, NORRIE-WARBURG-SYNDROM, PHOSPHODIESTERASE 6B, PALMITOYL-PROTEIN-THIOESTERASE, APOLIPOPROTEIN B, BRUTON-AGAMMAGLOBULINÄMIE-TYROSINKINASE, FAMILIE 5 GELÖSTER TRÄGER, 5,10,2-METHYLENTETRAHYDROFOLAT-REDUKTASE, WILMS-TUMOR, POLYZYSTISCHE NIEREN, TRANSKRIPTIONSFAKTOR 14, LEBERKERNFAKTOR, MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYP II, PROTEIN-C-MANGEL, KONGENITALE THROMBOSE AUFGRUND VON RECKLING-HAUSEN-KRANKHEIT TYP II, ADRENOLEUKODYSTROPHIE, ALPHA 1 VON KOLLAGEN TYP VII, ALPHA 1 VON KOLLAGEN TYP X, HÄMOGLOBIN- ALPHA-LOCUS 2, TARUI-KRANKHEIT, FRUKTOSEINTOLERANZ, EARLY-ONSET-BRUSTKREBS TYP 2; BRCA2, FUCOSYLTRANSFERASE 2, HERMANSKY-PUDLAK-SYNDROM, THYROGLOBULIN, RETINOBLASTOM, WISKOTT-ALDRICH-SYNDROM, RHODOPSIN, KOLLAGEN TYP XVII, CHOLINOZEPTOR, GATED-CHANNEL FÜR CYCLISCHES NUKLEOTID, PHOTOREZEPTOR, cGMP-GATED, CHOLINOZEPTOR-NIKOTIN-EPSILON-POLYPEPTID, REKOMBINATION-AKTIVIERENDES GEN-1, KAMPOMELE DYSPLASIE, IMMUNDEFEKTSYNDROM MIT IGM-ÜBERPRODUKTION, RET-PROTOONKOGEN; RET-MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYP IVA, LEPTIN-REZEPTOR, MINKOWSKI-CHAUFFARD-SYNDROM, ARGININ-VASOPRESSIN, APOLIPOPROTEIN-C-II-MANGEL-TYP-I-HYPERLIPOPROTEINÄMIE AUFGRUND VON MUKOVISZIDOSE, WILSON-KRANKHEIT, LEPTIN, ANGIONEUROTISCHES ÖDEM, CHLORIDKANAL 5, GONADENDYSGENESIE, AKUTE INTERMITTIERENDE PORPHYRIE, HÄMOGLOBIN, GAMMA A, KRABBE-SYNDROM, MCARDLE-KRANKHEIT, SPÄTINFANTILE METACHROMATISCHE LEUKODYSTROPHIE, BERNARD-SOULIER-SYNDROM, VITAMIN-D-REZEPTOR, DELTA-SARKOGLYKAN, TWIST, DROSOPHILA, ALZHEIMER-KRANKHEIT, MARMORKNOCHENKRANKHEIT MIT RENAL-TUBULÄRER AZIDOSE, AMELOGENESIS IMPERFECTA-1, HYPOPLASIETYP, POU-DOMÄNE KLASSE 1, TRANSKRIPTIONSFAKTOR 1, DIABETES MELLITUS, HOMOLOG ZU VIRALEM ONKOGEN VON AUTOSOMALEM DOMINANTEM FELINEM V-KIT-HARDY-ZUCKERMAN-4-SARKOM, HÄMOGLOBIN-DELTA-LOCUS, ADENIN-PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE, PHOSPHATASE- UND TENSIN-HOMOLOG, WACHSTUMSHORMON 1, CATHEPSIN K, WERNER-SYNDROM, NIEMANN-PICK-KRANKHEIT, SOMATOTROPIN-FREIGABE-HORMONREZEPTOR, CERULOPLASMIN, INTERLEUKIN-3-REZEPTOR, GRANULOZYT, PERIPHERES MYELIN-PROTEIN 22, FUCOSIDOSE, MULTIPLE EXOSTOSE TYP II, FANCONI-ANÄMIE, KOMPLEMENTATIONSGRUPPE C, PROGRESSIVE ZEREBELLÄRE ATAXIE, CADHERIN 1, MITGLIED 2 DER FAMILIE 2 GELÖSTER TRÄGER, UDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASE-1-FAMILIE, A1, BOURNEVILLE-SYNDROM 1, LAMININ, GAMMA 2, CYSTATIN B, POLYZYSTISCHE NIEREN 2, MIKROSOMALES TRIGLYCERID- TRANSFERPROTEIN, 88 KD, DIASTROPHISCHE DYSPLASIE, FLAVIN-ENTHALTENDE MONOOXYGENASE 3, CORI-KRANKHEIT, POU-DOMÄNE KLASSE 3, TRANSKRIPTIONSFAKTOR 4, CYTOCHROM P450-SUBFAMILIE IID, KONGENITALE ERYTHROHEPATISCHE PORPHYRIE, Cu(2+)-TRANSPORTIERENDE ATPase, ALPHA-POLYPEPTID, FAMILIÄRER NON-POLYPOSIS-KOLONKREBS TYP 1, PHOSPHORYLASEKINASE-ALPHA-1-UNTEREINHEIT (MUSKEL), ELASTIN, KOMPLEMENTIERENDE DEFEKTE EXZISIONSREPARATUR BEI CANAVAN-SYNDROM IN CHINESISCHEM HAMSTER, JANUS-KINASE 3, STEROIDOGENES AKUTES REGULATIONS-PROTEIN, FUCOSYLTRANSFERASE 6, GLAUCOMA 1 BEI OFFENEM WINKEL, MULTIPLE EXOSTOSEN TYP I, MYOCILIN, AGRANULOZYTOSE, INFANTILER GENETISCHER ERYTHROPOETINREZEPTOR, ÜBERLEBEN VON TELOMEREM MOTONEURON 1, HOMOLOG ZU DROSOPHILA-SONIC HEDGEHOG, LEZITHIN:CHOLESTERIN-ACYLTRANSFERASE-MANGEL, ERHÖHTE POSTMEIOTISCHE AUFSPALTUNG (S. CEREVISIAE)-1, REPARATUR-DEFIZIENT BEI KREUZKOMPLEMENTIERENDER EXZISIONSREPARATUR IN NAGETIEREN GRUPPE 6, AHORNSIRUP-KRANKHEIT-APOPTOSE-ANTIGEN 1, HEPATISCHER TRANSKRIPTIONSFAKTOR 1, UBIQUITIN-PROTEIN-LIGASE E3A, TRANSGLUTAMINASE 1, MYOSIN VIIA, 32-KD-GAP-JUNCTION-PROTEIN BETA 1, HEPATISCHER TRANSKRIPTIONSFAKTOR 2, ERYTHROZYTÄRES PROTEIN 4.2, THYROTROPIN, BETA-KETTE, TREACHER-COLLINS-SYNDROM 1, CHOROIDEREMIE, ENDOKARDFIBROELASTOSE 2, COWDEN-KRANKHEIT, ANTI-MÜLLER-HORMON, SRY-BOX 10, MIT PTA-MANGEL-TYROSINASE VERWANDTES PROTEIN 1, PHOSPHORYLASEKINASE-BETA-UNTEREINHEIT, SERIN/THREONIN-PROTEIN-KINASE 11, PHOSPHOLIPASE A2 GRUPPE IIA, KOMPLEMENTIERENDE DEFEKTE EXZISIONSREPARATUR IN CHINESISCHEM HAMSTER 3, NEBENNIERENHYPERPLASIE-II-KOLLAGEN TYP IV, ALPHA-4-KETTE, 65-KD-NETZHAUTPIGMENTEPITHEL-SPEZIFISCHES PROTEIN BEI GLANZMANN-NAEGELI-SYNDROM, HOMÖOBOX A13, CALPAIN, GROSSES POLYPEPTID L3, XANTHINURIE-LAMININ, ALPHA 2, CYTOCHROM P450-SUBFAMILIE XIX, MAROTEAUX-LAMY-SYNDROM, JUVENILE NEURONALE CEROID-LIPOFUSZINOSE 3, PHOSPHORYLASEKINASE BEI CITRULLINÄMIE BEI UNVERRICHT-SYNDROM DER TESTES/LEBER GAMMA 2, MITGLIED 1 DER FAMILIE 3 GELÖSTER TRÄGER, PTERIN-4-ALPHA-CARBINOLAMINDEHYDRATASE, OKULARER ALBINISMUS TYP 1, NEONATALES BENIGNES LEPRECHAUNISMUS-SYNDROM, HIRSCHSPRUNG-KRANKHEIT-MARMOR-KNOCHENKRANKHEIT, AUTOSOMALER REZESSIVER RAS-p21-PROTEIN-AKTIVATOR 1, KALIUMKANAL VON NACH INNEN KORRIGIERENDER SLY-SYNDROM-BÉGUEZ-CÉSAR-ANOMALIE, SUBFAMILIE J, MITGLIED 1, PLAKOPHILIN 1, PLÄTTCHEN-AKTIVIERENDER FAKTOR-ACETYL-HYDROLASE-ISOFORM 1B-ALPHA-UNTEREINHEIT, PLEKTIN 1, KURZE STATUR, MHC-KLASSE-II-TRANSAKTIVATOR, HYPOPHOSPHATÄMIE, VITAMIN-D-RESISTENTE RACHITIS, MIT RIEG-BICOID VERWANDTER HOMÖOBOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOR 1, LIMB-GIRDLE-MUSKELDYSTROPHIE TYP 2E, RETINITIS PIGMENTOSA-3, HOMOLOG ZU MutS VON E. COLI 3, TYROSINTRANSAMINASE-MANGEL BEI LOWE-SYNDROM, XANTHISMUS BEI FAMILIÄRER JUVENILER NEPHRONOPHTHISE 1, VISZERALE HETEROTAXIE, X-GEBUNDENES MILLER-DIEKER-LISSENZEPHALIE-SYNDROM, PROPERDIN-MANGEL, X-GEBUNDENE 3,2-OXOSÄURE-CoA-TRANSFERASE, LIMB-GIRDLE-MUSKELDYSTROPHIE TYP 2 BEI WAARDENBURG-SYNDROM, ALPORT-SYNDROM, AUTOSOMALER DOMINANTER DIABETES MELLITUS TYP II BEI AUTOSOMALER REZESSIVER ANDERSEN-KRANKHEIT, MITGLIED 1 DER FAMILIE 2 GELÖSTER TRÄGER, HAND-FUSS-UTERUS-SYNDROM-ZYSTINOSE VOM EARLY-ONSET- ODER INFANTILEN NEPHROPATHISCHEN TYP, INSULINÄHNLICHER WACHSTUMSFAKTOR 1 BEI CRIGLER-NAJJAR-SYNDROM, LAKTATDEHYDROGENASE-A, STICKLER-SYNDROM TYP II, ALPHA-GALAKTOSIDASE B BEI LEBER'-OPTIKUSATROPHIE I, NEBENNIERENHYPERPLASIE I BEI LI-FRAUMENI-SYNDROM, MITGLIED 1 DER FAMILIE 12 GELÖSTER TRÄGER, PEROXISOM-BIOGENESEFAKTOR 7 BEI KLEIN-WAARDENBURG-SYNDROM, HOMÖOTISCHES GEN 8 MIT GEPAARTER BOX, RETINOSCHISIS, 5-HYDROXYTRYPTAMINREZEPTOR 2C, URATOXIDASE, FAMILIÄRES BARLOW-SYNDROM BEI PEUTZ-JEGHERS- SYNDROM, KUTANES MALIGNES MELANOM 2, FUCOSYLTRANSFERASE 1, PYKNODYSOSTOSE, P-GLYKOPROTEIN-3 BEI MUKOPOLYSACCARIDOSE IIIB, SCHWERER KOMBINIERTER IMMUNDEFEKT, B-ZELLEN-NEGATIVE RETINITIS PIGMENTOSA, 90-KD-KINASE VON RIBOSOMALEM PROTEIN S6, POLYPEPTID 3, MIT FAKTOR-X-MANGEL VERBUNDENES SYNDROM GEGEN HOMOLOG ZU DROSOPHILA-DECAPENTAPLEGIC 4, FAKTOR FÜR LEITENDES DEHYDROGENASE/DELTA-ISOMERASE TYP 1-KOMPLEMENT MIT PROGRESSIVER STAPES-FIXIERUNG AQP1 1, PROGRESSIVE FAMILIÄRE INTRAHEPATISCHE TYP-III-MONOPHOSPHAT-DEAMINASE-1, HOMÖOBOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOR 1.
  • Diese Erfindung stellt Verfahren zum Screenen auf Arzneimittel bereit, die als Therapeutika fungieren, die Erkrankungen behandeln, die von Nonsense- und Rasterverschiebungsmutationen verursacht werden. Durch biochemische und In-vitro-Assays, die die Aktivität von ATP-Bindung, ATPase-Aktivität, RNA-Helicase-Aktivität, GTP-Bindung, GTPase-Aktivität, Release-Faktoren oder RNA-Bindung an den Komplex oder aneinander (d. h. MTT1 an eRF3); Entwickeln von Assays, die die Aktivität des humanen Genprodukts beim mRNA-Zerfall und der Translationssuppression quantifizieren können; Screenen von Verbindungen unter Verwendung der oben erwähnten Assays. Die hierin offenbarten Versuche haben gezeigt, dass ein Antagonisieren/Agonisieren der Aktivität des Komplexes von Faktoren, Proteinen des Komplexes die ansonsten letalen Auswirkungen von Nonsense-Mutationen in entscheidenden Genen überwinden kann, und haben Hefe als ein Modellsystem zur Arzneimittelentwicklung bestimmt, für die Agentien oder Verbindungen für den Menschen erhalten werden können.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands, der mit einem defekten Proteinkomplex einhergeht, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle mit einer Nukleinsäure, die den Proteinkomplex kodiert; (b) Ermitteln des Anteils des defekten Proteinkomplexes der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Anteils des defekten Proteinkomplexes der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil des defekten Proteinkomplexes der Zelle vor der Transfektion.
  • Ein Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands geht mit defekten multimeren Proteinen einher, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle mit dem wie hierin zuvor beschriebenen Vektor; (b) Ermitteln des Anteils defekter multimerer Proteine der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Anteils defekter multimerer Proteine der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil defekter multimerer Proteine der Zelle vor der Transfektion.
  • Ein Verfahren zum Identifizieren von Genen, die an der Modulation der Translationstermination beteiligt sind, umfasst Folgendes: a) Isolieren eines Gens von Interesse und b) Ermitteln, ob das Gen von Interesse die Motive I–IX umfasst, wobei, wenn das Gen ein beliebiges der neun Motive umfasst, das Gen die Translationstermination moduliert. Das Motiv I kann die folgende Sequenz umfassen: GppGTKTxT-X(n). Das Motiv II kann die Sequenz riLxcaSNxAvDxl-X(n) umfassen. Das Motiv III kann die Sequenz vviDExxQaxxxxxiPi-X(n) umfassen. Das Motiv IV kann die Sequenz xxil aGDxxQLp-X(n) umfassen. Das Motiv V kann die Sequenz lxx SLF erv-X(n) umfassen. Das Motiv VI kann die Sequenz LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n) umfassen. Das Motiv VII kann die Sequenz IgvitPYxxQvxxl-X(n) umfassen. Das Motiv VIII kann die Sequenz vevxtVDxFQGreKdxlilSc Vr-X(n) umfassen. Das Motiv IX kann die Sequenz iGFLxdxRRINValTRak umfassen. Großbuchstaben stellen eine Position in der primären Sequenz dar, deren spezifischer Aminosäurerest unter Mitgliedern dieser Gruppe sehr stark konserviert ist. Kleinbuchstaben stellen eine Position in der primären Sequenz dar, deren chemische Eigenschaften konserviert, jedoch nicht unbedingt die exakte Identität sind.
  • Es gibt mehrere Verfahren, die zum Erkennen einer DNA-Sequenzveränderung verwendet werden können. Direkte DNA-Sequenzierung, entweder manuelle Sequenzierung oder automatisierte Fluoreszenzsequenzierung, können eine Sequenzveränderung erkennen. Für ein so großes Gen wie MTT1 ist eine manuelle Sequenzierung sehr arbeitsintensiv, unter optimalen Bedingungen werden Mutationen in der kodierenden Sequenz eines Gens selten verfehlt. Ein weiterer Ansatz ist die Einzelstrangkonformationspolymorphismusanalyse (single-stranded conformation polymorphism analysis, SSCA) (Orita et al., 1989). Dieses Verfahren erkennt nicht alle Sequenzveränderungen, insbesondere wenn die DNA-Fragmentgröße mehr als 200 bp beträgt, kann jedoch optimiert werden, um die meisten DNA-Sequenzveränderungen zu erkennen. Die verminderte Erkennungsempfindlichkeit ist ein Nachteil, der gesteigerte Umsatz, der mit SSCA möglich ist, macht es jedoch zu einer reizvollen, durchführbaren Alternative zur direkten Sequenzierung bei Mutationserkennung auf einer Forschungsbasis. Die Fragmente, die auf SSCA-Gelen eine verschobene Mobilität aufweisen, werden dann sequenziert, um die genaue Beschaffenheit der DNA-Sequenzveränderung zu ermitteln. Zu anderen Ansätzen, die auf der Erkennung von Fehlpaarungen zwischen den zwei komplementären DNA-Strängen basieren, zählen „clamped" denaturierende Gelelektrophorese (CDGE) (Sheffield et al., 1991), Heteroduplex-Analyse (HA) (White et al., 1992) und chemische Fehlpaarungsspaltung (chemical mismatch cleavage, CMC) (Grompe et al., 1989). Keines der oben beschriebenen Verfahren wird große Deletionen, Duplikationen oder Insertionen erkennen, noch werden sie eine Regulationsmutation erkennen, die sich auf die Transkription oder Translation des Proteins auswirken. Andere Verfahren, die diese Klassen von Mutationen erkennen könnten, wie ein Proteinverkürzungsassay oder der asymmetrische Assay, erkennen nur spezifische Arten von Mutationen und würden Missense-Mutationen nicht erkennen. Ein Überblick über die gegenwärtig verfügbaren Verfahren zum Erkennen einer DNA-Sequenzveränderung lässt sich in einem neueren Überblick von Grompe (1993) finden. Sobald eine Mutation bekannt ist, kann ein allelspezifischer Erkennungsansatz, wie allelspezifische Oligonukleotidhybridisierung (ASO-Hybridisierung), eingesetzt werden, um schnell große Anzahlen von anderen Proben auf dieselbe Mutation zu screenen.
  • Eine schnelle vorläufige Analyse zum Nachweisen von Polymorphismen in DNA-Sequenzen kann durchgeführt werden, indem eine Reihe von Southern-Blots von DNA, die mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, vorzugsweise mit einer großen Anzahl von Restriktionsenzymen, geschnitten wurde, betrachtet wird. Jeder Blot enthält eine Reihe normaler Einzelpersonen und eine Reihe Tumore. Southern-Blots, die hybridisierende Fragmente aufzeigen (die sich in Bezug auf die Länge von Kontroll- DNA unterscheiden, wenn sie mit Sequenzen sondiert werden, die dem MTT1-Gen ähneln oder dieses enthalten), deuten auf eine mögliche Mutation hin. Wenn Restriktionsenzyme, die sehr große Restriktionsfragmente produzieren, verwendet werden, wird Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) eingesetzt.
  • Der Nachweis von Punktmutationen kann durch molekulare Klonierung des MTT1-Allels bzw. der MTT1-Allele und Sequenzieren des Allels bzw. der Allele unter Anwendung von im Fachgebiet wohl bekannten Techniken durchgeführt werden. Alternativ können die Gensequenzen direkt aus einem Präparat von genomischer DNA aus dem Tumorgewebe unter Anwendung bekannter Techniken amplifiziert werden. Dann kann die DNA-Sequenz der amplifizierten Sequenzen bestimmt werden. Es gibt sechs wohl bekannte Verfahren für einen vollständigeren, dennoch immer noch indirekten Test zum Bestätigen des Vorliegens eines Empfänglichkeitsallels: 1) Einzelstrangkonformationsanalyse (single-stranded conformation analysis, SSCA) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase-Schutz-Assays (Finkelstein et al., 1990; Kinszleret et al., 1991); 4) allelspezifische Oligonukleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nukleotidfehlpaarungen erkennen, wie das E. coli-mutS-Protein (Modrich, 1991) und 6) allelspezifische PCR (Rann & Kidd, 1989). Für allelspezifische PCR werden Primer verwendet, die an ihren 3'-Enden an eine bestimmte MTT1-Mutation hybridisieren. Wenn die bestimmte MTT1-Mutation nicht vorliegt, wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Ein „Amplification Refractory Mutation System" (ARMS) kann ebenfalls verwendet werden, wie in der europäischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 0332435 und in Newton et al., 1989, offenbart. Insertionen und Deletionen von Genen können ebenfalls mittels Klonierung, Sequenzierung und Amplifikation nachgewiesen werden. Darüber hinaus können RFLP-Sonden (RFLP = Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) für das Gen oder umgebende Markergene verwendet werden, um eine Veränderung eines Allels oder eine Insertion in einem polymorphen Fragment zu bewerten. Ein solches Verfahren ist insbesondere zum Screenen von Verwandten einer betroffenen Einzelperson auf das Vorliegen der MTT1-Mutation, die in dieser Einzelperson vorgefunden wurde, von Nutzen. Andere Techniken zum Nachweisen von Insertionen und Deletionen, wie sie in der Technik bekannt sind, können verwendet werden.
  • In ähnlicher Weise können DNA-Sonden verwendet werden, um Fehlpaarungen durch enzymatische oder chemische Spaltung nachzuweisen. Siehe z. B. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ können Fehlpaarungen durch Verschiebungen der elektrophoretischen Beweglichkeit fehlgepaarter Duplexe im Vergleich zu korrekt gepaarten Duplexen nachgewiesen werden. Siehe z. B. Cariello, 1988. Die zelluläre mRNA oder DNA, die eine Mutation enthalten könnte, kann mit entweder Ribosonden oder DNA-Sonden unter Anwendung von PCR (siehe im Folgenden) vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Veränderungen der DNA des MTT1-Gens können auch unter Anwendung von Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden, insbesondere wenn die Veränderungen grobe Umordnungen sind, wie Deletionen und Insertionen.
  • DNA-Sequenzen des MTT1-Gens, die unter Anwendung von PCR amplifiziert wurden, können ebenfalls unter Verwendung allelspezifischer Sonden gescreent werden. Diese Sonden sind Nukleinsäureoligomere, von denen jedes eine Region der MTT1-Gensequenz enthält, die eine bekannte Mutation beherbergt. Zum Beispiel kann ein Oligomer etwa 30 Nukleotiden lang sein, was einem Abschnitt der MTT1-Gensequenz entspricht. Durch Verwendung einer Batterie solcher allelspezifischen Sonden können PCR-Amplifikationsprodukte gescreent werden, um das Vorliegen einer zuvor identifizierten Mutation in dem MTT1-Gen zu identifizieren. Die Hybridisierung allelspezifischer Sonden mit amplifizierten MTT1-Sequenzen kann beispielsweise auf einem Nylonfilter durchgeführt werden. Die Hybridisierung an eine bestimmte Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen deutet auf das Vorliegen derselben Mutation in dem Tumorgewebe wie in der allelspezifischen Sonde hin.
  • Eine Veränderung der MTT1-mRNA-Expression kann mittels einer beliebigen der im Fachgebiet bekannten Techniken nachgewiesen werden. Zu diesen zählen Northern-Blot-Analyse, PCR-Amplifikation und RNase-Schutz. Eine verminderte mRNA-Expression deutet auf eine Veränderung des Wildtyp-MTT1-Gens hin. Eine Veränderung von Wildtyp-MTT1-Genen kann auch durch Screenen auf eine Veränderung von Wildtyp-MTT1-Protein nachgewiesen werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die mit MTT1 eine Immunreaktion zeigen, zum Screenen eines Gewebes verwendet werden. Ein Fehlen von zugehörigem Antigen würde auf eine MTT1-Mutation hinweisen. Antikörper, die für Produkte mutierter Allele spezifisch sind, könnten ebenfalls dazu verwendet werden, ein mutiertes MTT1-Genprodukt nachzuweisen. Solche immunologischen Assays können in beliebigen zweckmäßigen Formaten, die in der Technik bekannt sind, vorgenommen werden. Zu diesen zählen Western-Blots, immunhistochemische Assays und ELISA-Assays. Ein beliebiges Mittel zum Nachweisen eines veränderten MTT1-Proteins kann zum Nachweisen einer Veränderung von Wildtyp-MTT1-Genen verwendet werden. Funktionelle Assays, wie Proteinbindungsbestimmungen, können angewendet werden. Darüber hinaus können Assays angewendet werden, die die biochemische Funktion von MTT1 nachweisen. Das Finden eines mutierten MTT1-Genprodukts deutet auf eine Veränderung eines Wildtyp-MTT1-Gens hin. Mutierte MTT1-Gene oder -Genprodukte können ebenfalls in anderen menschlichen Körperproben, wie Serum, Stuhl, Urin und Sputum, nachgewiesen werden.
  • Fusionspolypeptide können MTT1-Polypeptide und -Fragmente umfassen. Homologe Polypeptide können Fusionen zwischen zwei oder mehr MTT1-Polypeptidsequenzen oder zwischen den Sequenzen von MTT1 und einem verwandten Protein sein. Ebenso können heterologe Fusionen konstruiert werden, die eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der abgeleiteten Proteine zeigen würden. Zum Beispiel können Ligandenbinde- oder andere Domänen zwischen unterschiedlichen neuen Fusionspolypeptiden oder Fragmenten „getauscht" werden. Solche homologen oder heterologen Fusionspolypeptide können beispielsweise eine veränderte Bindungsstärke oder -spezifität zeigen. Zu Fusionspartnern zählen Immunglobuline, bakterielle beta-Galactosidase, trpE, Protein A, beta-Lactamase, alpha-Amylase, Alkoholdehydrogenase und Hefe-alpha-Paarungsfaktor. Siehe z. B. Godowski et al., 1988. Fusionsproteine werden in der Regel mittels entweder rekombinanter Nukleinsäureverfahren, wie im Folgenden beschrieben, hergestellt werden oder können chemisch synthetisiert werden. Techniken zur Synthese von Polypeptiden sind beispielsweise in Merrifield, 1963, beschrieben.
  • Die diagnostischen Assays der Erfindung können Nukleinsäureassays sein, wie Nukleinsäurehybridisierungsassays und Assays, die die Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäure nachweisen, um eine Nukleinsäuresequenz des hierin beschriebenen humanen MTT1 nachzuweisen.
  • Anerkannte Mittel zum Durchführen von Hybridisierungsassays sind bekannt und allgemeine Überblicke zur Technologie können dem Überblick: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach [72]; Hybridization of Nucleic Acids Immobilized an Solid Supports [41]; Analytical Biochemistry [4] und Innis et al., PCR Protocols [74], oben, entnommen werden.
  • Für das Ziel spezifische Sonden können in der Nukleinsäurehybridisierungsdiagnostik verwendet werden. Die Sonden sind für das Ziel von Interesse spezifisch oder zu diesem komplementär. Für präzise Alleldifferenzierungen sollten die Sonden etwa 14 Nukleotide lang und vorzugsweise etwa 20–30 Nukleotide sein. Für einen mehr allgemeinen Nachweis des humanen MTT1 der Erfindung machen Nukleinsäuresonden etwa 50 bis etwa 1000 Nukleotide, am meisten bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotide aus.
  • Die spezifische Nukleinsäuresonde kann RNA- oder DNA-Polynukleotid oder -Oligonukleotid oder deren Analoge sein. Die Sonden können einzel- oder doppelsträngige Nukleotide sein. Die Sonden der Erfindung können enzymatisch unter Verwendung in der Technik wohl bekannter Verfahren (z. B. Nick-Translation, Primerverlängerung, Umkehrtranskription, die Polymerase-Kettenreaktion und andere) oder chemisch (z. B. mittels Verfahren wie dem Phosphoramidit-Verfahren, von Beaucage und Carruthers [19] beschrieben, oder mittels dem Triester-Verfahren nach Matteucci et al. [62]) synthetisiert werden.
  • Ein alternatives Mittel zum Ermitteln des Vorliegens des humanen MTT1 ist In-situ-Hybridisierung oder, in jüngster Zeit, In-situ-Polymerase-Kettenreaktion. In-situ-PCR ist in Neuvo et al. [71], Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)- amplified Hepatitis C cDNA; Bagasra et al. [10], Detection of Human Immunodeficiency virus type 1 provirus in mononuclear cells by in situ polymerase chain reaction; und Heniford et al. [35], Variation in cellular EGF receptor mRNA expression demonstrated by in reverse transcriptase polymerase chain reaction, beschrieben. In-situ-Hybridisierungsassays sind wohl bekannt und allgemein in Methods Enzymol. [67] beschrieben. In einer In-situ-Hybridisierung werden Zellen an einem festen Träger, in der Regel einen Glasobjektträger, fixiert. Die Zellen werden dann mit einer Hybridisierungslösung bei einer mäßigen Temperatur in Kontakt gebracht, um ein Anbinden zielspezifischer Sonden, die markiert sind, zu ermöglichen. Die Sonden werden vorzugsweise mit Radioisotopen oder fluoreszierenden Reporter markiert.
  • Die oben beschriebenen Sonden sind ebenfalls zur In-situ-Hybridisierung von Nutzen oder um Gewebe zu lokalisieren, die dieses Gen exprimieren, oder für andere Hybridisierungsassays auf das Vorliegen dieses Gens oder dessen mRNA in verschiedenen biologischen Geweben. In-situ-Hybridisierung ist ein empfindliches Lokalisierungsverfahren, das nicht von der Expression von Antigenen oder nativen im Vergleich zu denaturierten Bedingungen abhängt.
  • Mit den inhibitorischen Nukleinsäuren kann mRNA targetiert werden. In diesem Ansatz sind die inhibitorischen Nukleinsäuren dazu entworfen, die Translation des kodierten Proteins spezifisch zu blockieren. Unter Anwendung dieses Ansatzes kann die inhibitorische Nukleinsäure dazu verwendet werden, bestimmte Zellfunktionen durch Inhibition der Translation von mRNA kodierenden wichtigen Proteinen selektiv zu supprimieren. Zum Beispiel inhibiert eine inhibitorische Nukleinsäure, die zu Regionen von c-myc-mRNA komplementär ist, die c-myc-Protein-Expression in einer Promyelozytenleukämiezelllinie des Menschen, HL60, die das c-myc-Protoonkogen überexprimiert. Siehe E.L. Wickstrom et al. [93] und A. Harel-Bellan et al. [31A]. Wie in Helene und Toulme beschrieben, wurde von inhibitorischen Nukleinsäuren, die mRNA targetieren, gezeigt, dass sie durch mehrere unterschiedliche Mechanismen dahingehend arbeiten, die Translation des kodierten Proteins bzw. der kodierten Proteine zu inhibieren.
  • Schließlich können die inhibitorischen Nukleinsäuren zum Induzieren einer chemischen Inaktivierung oder Spaltung der Zielgene oder -mRNA verwendet werden. Eine chemische Inaktivierung kann über die Induktion von Vernetzungen zwischen der inhibitorischen Nukleinsäure und der Zielnukleinsäure innerhalb der Zelle erfolgen. Andere chemische Modifikationen der Zielnukleinsäuren, die von entsprechend derivatisierten inhibitorischen Nukleinsäuren induziert werden, können ebenfalls angewendet werden.
  • Eine Spaltung und folglich eine Inaktivierung der Zielnukleinsäuren kann bewirkt werden, indem ein Substituent an die inhibitorische Nukleinsäure angelagert wird, der aktiviert werden kann, um Spaltungsreaktion zu induzieren. Der Substituent kann ein Substituent sein, der entweder eine chemische oder eine enzymatische Spaltung bewirkt. Alternativ kann eine Spaltung durch Verwendung von Ribozymen oder katalytischer RNA induziert werden. In diesem Ansatz würden die inhibitorischen Nukleinsäuren entweder natürlich vorkommende RNA (Ribozyme) oder synthetische Nukleinsäuren mit katalytischer Aktivität umfassen.
  • Des Weiteren stellt diese Erfindung ein Antisense-Molekül bereit, das spezifisch mit der isolierten Nukleinsäure des MTT1-Gens hybridisieren kann. Diese Erfindung stellt einen Antagonisten bereit, der die Expression des Peptids oder Polypeptids, das von dem isolierten DNA-Molekül kodiert wird, blockieren kann. In einer Ausführungsform kann der Antagonist mit einem doppelsträngigen DNA-Molekül hybridisieren. In einer anderen Ausführungsform ist der Antagonist ein Triplex-Oligonukleotid, das an das DNA-Molekül hybridisieren kann. In einer anderen Ausführungsform kann das Triplex-Oligonukleotid an mindestens einen Abschnitt des isolierten DNA-Moleküls mit einer Nukleotidsequenz binden.
  • Das Antisense-Molekül kann DNA oder RNA oder Varianten davon (d. h. DNA oder RNA mit einer Proteinhauptkette) sein. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Herstellung von Antisense-Nukleotiden und Ribozymen, die zum Beeinträchtigen der Expression der Rezeptorerkennungsproteine bei der Translation einer spezifischen mRNA verwendet werden können, entweder durch Maskieren dieser mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder Spalten dieser mit einem Ribozym.
  • Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zu mindestens einem Abschnitt eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind. Sie hybridisieren in der Zelle an diese mRNA, wodurch ein doppelsträngiges Molekül gebildet wird. Die Zelle translatiert eine mRNA in dieser doppelsträngigen Form nicht. Folglich beeinträchtigen Antisense-Nukleinsäuren die Expression von mRNA in Protein.
  • Antisense-Nukleotid- oder -Polynukleotidsequenzen sind beim Verhindern oder Vermindern der Expression des MTT1-Gens von Nutzen, wie Fachmänner zu schätzen wissen werden. Zum Beispiel können Polynukleotidvektoren, die das gesamte oder einen Abschnitt des MTT1-Gens oder andere Sequenzen aus dem MTT1 (insbesondere jene, die das MTT1-Gen flankieren) enthalten, unter die Kontrolle eines Promotors in einer Antisense-Ausrichtung gestellt und in eine Zelle eingeführt werden. Die Expression eines solchen Antisense-Konstrukts in einer Zelle wird die MTT1-Transkription und/oder -Translation und/oder -Replikation beeinträchtigen. Oligomere von etwa fünfzehn Nukleotiden und Molekülen, die an das AUG-Initiationscodon hybridisieren, sind besonders effizient, da sie leicht zu synthetisieren sind und bei ihnen wahrscheinlich ist, dass sie bei Einführung in Zellen weniger Probleme aufwerfen als größere Moleküle.
  • Ein Verfahren zum substantiellen Inhibieren der Translationsterminationseffizienz von mRNA und/oder des Zerfalls abweichender Transkripte in einer Zelle umfasst Folgendes: a) Bereitstellen einer Zelle, die die DNA enthält; b) Überexprimieren der DNA in der Zelle, um ein überexprimiertes Polypeptid zu produzieren, das an MTT1 bindet und die MTT1-Funktion beeinträchtigt.
  • Ein Verfahren zum substantiellen Inhibieren der Translationsterminationseffizienz von mRNA und/oder des Zerfalls abweichender Transkripte in einer Zelle umfasst Folgendes: a) Bereitstellen einer Zelle; b) Exprimieren eines Antisense-Transkripts des Komplexes in ausreichender Menge, um den Komplex zu binden.
  • Ein Verfahren zum substantiellen Inhibieren der Translationstermination in einer Zelle umfasst Folgendes: Mutieren des Komplexes, der MTT1, Upf1p, Upf2p, Upf3p, eRF1 und eRF3 umfasst, so dass im Wesentlichen kein funktioneller Komplex in der Zelle produziert wird.
  • Die Offenbarung ermöglicht die Behandlung einer Erkrankung, die mit Translationsterminationseffizienz von mRNA und/oder Zerfall abweichender Transkripte zusammenhängt, wobei die Behandlung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Komplex, der in eine Zelle eines Probanden eingeführt wird, umfasst, und einen pharmazeutischen Trägerstoff oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel an einen Probanden, wodurch der Proband behandelt wird, umfasst.
  • Ein Patient, der ein Leiden in einem Frühstadium in Folge eines genetischen Mangels, einer Erkrankung oder einer klinischen Behandlung aufweist oder ein Risiko aufweist, ein solches aufzuweisen, wobei das Leiden eine Ätiologie aufweist, die mit einem Defekt zusammenhängt, kann durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Formulierung oder Zusammensetzung, die die Expression des Komplexes moduliert, an den Patienten, so dass der Zustand des Patienten verbessert wird, behandelt werden.
  • „Therapeutisch wirksam", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Menge einer Formulierung, die von ausreichender Quantität ist, um den Zustand des so behandelten Patienten zu bessern. „Bessern" bezieht sich auf eine Verminderung der nachteiligen Auswirkung des Krankheitszustands oder der Störung in dem Patienten, der die Therapie empfängt. Der Proband ist vorzugsweise ein Mensch, es kann jedoch vorgesehen werden, dass ein beliebiges Tier behandelt werden kann.
  • Dies hat insofern offensichtliche Auswirkungen auf die Arzneimittelausrichtung, dass eine oder die andere Domäne zur Arzneimittelentwicklung targetiert werden kann, z. B. unter Anwendung der Kombinationsbibliothektechniken oder rationeller Arzneimitteldesigntechniken.
  • Angesichts des Vorstehenden wird offensichtlich, dass es eine Reihe von Wegen zur Beeinflussung der Fidelität mehrerer Gesichtspunkte der Translationsfidelität gibt, und zwar Inhibition, Elongation und Termination, was bedeutende Auswirkungen auf die antivirale Therapie und auf die Suppression pathologischer Nonsense-Mutationen hat. Folglich können Arzneimittel zur Verwendung als antivirale Verbindungen oder zum Verändern des ribosomalen Zerfalls identifiziert werden.
  • Der Ausdruck „Arzneimittel" wird hierin dazu verwendet, sich auf eine Verbindung oder Agentien, wie ein Antibiotikum oder Protein, zu beziehen, die sich auf die Funktion des Peptidyltransferasezentrums während der Initiation, der Elongation, der Termination, des mRNA-Abbaus auswirken kann bzw. können. Solche Verbindungen können abweichende mRNA und die Effizienz der Translationstermination steigern oder vermindern.
  • Gentherapie und transgene Vektoren
  • In einer Ausführungsform werden eine Nukleinsäure, die den Komplex oder Faktoren des Komplexes kodiert; ein Antisense oder Ribozym, das für den Komplex spezifisch ist oder für Regionen der Release-Faktoren spezifisch ist, MTT1 und Upf1p in vivo in einen viralen Vektor eingeführt. Zu solchen Vektoren zählen ein attenuiertes oder defektes DNA-Virus, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Herpes-simplex-Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Adenovirus, adenoassoziiertes Virus (AAV) und dergleichen. Defekte Viren, denen virale Gene vollständig oder nahezu vollständig fehlen, sind bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach der Einführung in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwendung defekter viraler Vektoren ermöglicht die Verabreichung an Zellen in einem spezifischen, lokalisierten Bereich, ohne Bedenken, dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Folglich kann spezifisch Fettgewebe targetiert werden. Beispiele bestimmter Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, einen defekten Herpesvirus-1-Vektor (HSV-Vektor) [Kaplitt et al., Molec. Cell Neurosci. 2:320–330 (1991)], einen attenuierten Adenovirusvektor, wie der von Stratford- Perricaudet et al. [J. Clin. Invest. 90:626–630 (1992)] beschriebene Vektor, und einen defekten adenoassoziierten Virusvektor [Samulski et al., J. Virol. 61:3096–3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822–3828 (1989)].
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Gen in einen retroviralen Vektor eingeführt werden, z. B. wie in Anderson et al., US-Patentschrift Nr. 5,399,346 ; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., US-Patentschrift Nr. 4,650,764 ; Temin et al., US-Patentschrift Nr. 4,980,289 ; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., US-Patentschrift Nr. 5,124,263 ; der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 95/07358 , am 16. März 1995 von Dougherty et al. veröffentlicht; und Kuo et al., 1993, Blond 82:845, beschrieben. Die targetierte Genabgabe ist in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 95/28494 , im Oktober 1995 veröffentlicht, beschrieben.
  • Alternativ kann der Vektor mittels Lipofektion in vivo eingeführt werden. Im letzten Jahrzehnt sind Liposome vermehrt zur Verkapselung und Transfektion von Nukleinsäuren in vitro verwendet worden. Synthetische kationische Lipide, die dazu entworfen sind, die Schwierigkeiten und Gefahren zu begrenzen, die bei liposomvermittelter Transfektion angetroffen werden, können zum Herstellen von Liposomen zur In-vivo-Transfektion eines Gens, das einen Marker kodiert, verwendet werden [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413–7417 (1987); siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027–8031 (1988)]. Die Verwendung kationischer Lipide können die Verkapselung negativ geladener Nukleinsäuren fördern und auch die Fusion mit negativ geladenen Zellmembranen fördern [Felgner und Ringold, Science 337:387–388 (1989)]. Die Anwendung von Lipofektion zum Einführen exogener Gene in die spezifischen Organe in vivo hat bestimmte praktische Vorteile. Die molekulare Targetierung von Liposomen auf spezifische Zellen stellt einen Vorteilsbereich dar. Es ist offensichtlich, dass das Richten der Transfektion auf bestimmte Zellarten wäre besonders in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität, wie Pankreas, Leber, Niere und das Gehirn, von Nutzen. Lipide können zum Zwecke der Targetierung chemisch an andere Moleküle gekoppelt werden [siehe Mackey et al., oben]. Targetierte Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter, und Proteine wie Antikörper oder Moleküle, bei denen es sich nicht um Peptide handelt, könnten chemisch an Liposome gekoppelt werden.
  • Es ist auch möglich, den Vektor als ein Nackt-DNA-Plasmid in vivo einzuführen. Nackt-DNA-Vektoren zur Gentherapie können mittels in der Technik bekannter Verfahren, z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Kalziumphosphatpräzipitation, Verwendung einer Genkanone oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters, in die gewünschten Wirtszellen eingeführt werden [siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963–967 (1992); Wu und Wu, J. Biol. Chem. 263:14621–14624 (1988); Harmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311 , am 15. März 1990 eingereicht).
  • Die Koexpression eines Genprodukts, das die Aktivität am Peptidyltransferasezentrum moduliert, und eines therapeutischen heterologen Antisense- oder Ribozym-Gens unter der Kontrolle der spezifischen DNA-Erkennungssequenz kann bereitgestellt werden, indem ein Gentherapie-Expressionsvektor bereitgestellt wird, der sowohl ein Gen, das für einen Modulator eines Peptidyltransferasezentrums kodiert (einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, eines Gens für ein mutiertes Rasterverschiebungs- oder mRNA-Zerfallsprotein oder einer Antisense-RNA oder eines Ribozyms, die bzw. das für eine mRNA spezifisch ist, die ein solches Protein kodiert), als auch ein Gen für eine nicht verwandte Antisense-Nukleinsäure oder ein Ribozym unter koordinierter Expressionskontrolle umfasst. Diese Elemente können auf separaten Vektoren bereitgestellt werden; oder diese Elemente können alternativ in einem einzigen Expressionsvektor bereitgestellt werden.
  • Antivirale Therapie
  • Mittel zum Behandeln von Virusinfektionen können Agentien beinhalten, die die Translationsfidelität modulieren und somit sich direkt auf die Virusreplikation oder die Assembly viraler Teilchen auswirken.
  • Arzneimittel und Verfahren zum Identifizieren von Arzneimitteln sind hierin zur Verwendung in der antiviralen Therapie von Viren, die den grundlegenden ribosomalen -1-Rasterverschiebungsmechanismus einsetzen, was vier große Familien von Tierviren und drei große Familien von Pflanzenviren beinhaltet, beschrieben. Insbesondere Assays zum Screenen auf Agentien, Antagonisten/Agonisten, die eine Rasterverschiebung bewirken, die den Komplex einschließt, und die Upf3p einschließen. Außerdem ein mutiertes Upf3p.
  • Zum Beispiel setzen nahezu alle Retroviren ribosomale -1-Rasterverschiebung ein, einschließlich Lentiviren (Immundefizienzviren), wie HIV-1 und HIV-2, SIV, FIV, BIV, Visnavirus, Arthritis-Enzephalitis-Virus und equines infektibses Anämievirus; Spumaviren (die Foamyviren), wie Foamyvirus des Menschen und Foamyviren anderer Säugetiere; die T-Zell-Leukämieviren, wie HTLV-I, HTLV-II, STLVs und BLV; Leukoseviren von Vögeln, wie Leukämie- und Sarkomaviren vieler Vögel, einschließlich Geflügel für den gewerblichen Gebrauch; Typ-B-Retroviren, einschließlich Maus-Mammatumorvirus; und Typ-D-Retroviren, wie Masen-Pfizer-Affenvirus und Lungenadenokarzinomvirus des Schafs. Darüber hinaus setzen viele Coronaviren die -1-Rasterverschiebung ein, einschließlich Coronaviren des Menschen, wie 229-E, OC43; Coronaviren von Tieren, wie Coronavirus des Kalbs, übertragbares Gastroenteritisvirus des Schweins, hämagglutinierendes Enzephalomyelitisvirus des Schweins und infektiöses Enteritisvirus des Schweins; Coronavirus des Hunds; infektiöses Peritonitisvirus der Katze und enterisches Coronavirus der Katze; infektiöses Bronchitisvirus von Geflügel und Bluecomb-Virus des Truthahns; Hepatitisvirus der Maus, Coronavirus der Ratte und Coronavirus des Kaninchens. In ähnlicher Weise wird Torovirus (eine Coronavirusart) eingeschlossen, wie Toroviren des Menschen, die mit Darm- und Atemwegserkrankungen zusammenhängen; Bredavirus von Kälbern und Atemwegsvirus des Rinds; Berne-Virus von Pferden; Torovirus des Schweins; Torovirus der Katze. Ein anderes Coronavirus ist das Arterivirus, hämorrhagische Fiebervirus des Affen, Arteritisvirus des Pferdes, Lelystad-Virus (Schwein), VR2332-Virus (Schwein) und die Laktatdehydrogenase erhöhendes Virus (Nagetiere) beinhaltet. Andere Tierviren sind Paramyxoviren, wie die ribosomale -1-Rasterverschiebung des Menschen, von der bei Masern berichtet wird, und Astroviren, wie die Astroviren 1–5 des Menschen, und Astroviren des Rinds, des Schafs, des Schweins, des Hunds und der Ente.
  • Die Pflanzenviren, die einen -1-Rasterverschiebungsmechanismus einschließen, beinhalten Tetraviren, wie Sobemoviren (z. B. Southern-Bean-Mosaikvirus, Knaulgrasscheckungsvirus), Leuteoviren (z. B. Gelbverzwergungsvirus der Gerste, westliches Vergilbungsvirus der Rübe und Blattrolivirus der Kartoffel), Enamoviren (z. B. Erbsenmosaikvirus) und Umbraviren (z. B. Karottenscheckungsvirus); Tombusviren, wie Tombusvirus (z. B. Tomatenzwergbuschkrankheit), Carmovirus (z. B. Nelkenscheckungsvirus), Nekrosevirus (z. B. Tabaknekrosevirus); Dianthoviren (z. B. Rotklee-Nekrosemosaikvirus) und Machiomovirus (z. B. Mais-Chlorose-Scheckungsvirus).
  • Darüber hinaus sind Totiviren, wie L-A- und L-BC- (Hefe) und andere Pilzviren, Girardia-lamblia-Virus (Darmparasit), Triconella-vaginell-Virus (Parasit im Menschen), Leishmania-brasiliensis-Virus (Parasit im Menschen) und andere protozoale Viren -1-Rasterverschiebungsviren.
  • Der Bestandteil oder die Bestandteile einer therapeutischen Zusammensetzung kann bzw. können parenteral, paracanceral, transmukosal, transdermal, intramuskulär, intravenös, intradermal, subkutan, intraperitoneal, intraventrikulär oder intrakranial eingeführt oder verabreicht werden.
  • Abgabemodi beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Nackt-DNA, Protein, Peptid oder in einem viralen Vektor oder in einem Liposom. Ein viraler Vektor kann ein Retrovirus, adenoassoziiertes Virus oder Adenovirus sein.
  • Wie ein Durchschnittsfachmann leicht zu schätzen wissen wird, sind hierin beschriebene Zusammensetzungen und Behandlungen besonders zur Behandlung eines beliebigen Tiers, insbesondere eines Säugetiers, genauer gesagt eines Menschen, geeignet. Jedoch keineswegs auf Haustiere, wie Katzen- oder Hundesubjekte, Nutztiere, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Rinder-, Pferde-, Ziegen-, Schaf- und Schweinesubjekte, wilde Tiere (ob in der Wildnis oder in einem zoologischen Garten), Versuchstiere, wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen usw., d. h. zur Verwendung in der Tiermedizin, beschränkt.
  • Wie hierin verwendet, könnte „pharmazeutische Zusammensetzung" für therapeutisch wirksame Mengen des Komplexes mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägerstoffen stehen, die in der SZF-Therapie von Nutzen sind. Eine „therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf diejenige Menge, die eine therapeutische Wirkung für ein gegebenes Leiden und einen gegebenen Verabreichungsplan liefert. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierungen und beinhalten Verdünnungsmittel mit unterschiedlichen Puffergehalten (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Werten und Ionenstärken, Additive, wie Albumin oder Gelatine, um eine Absorption in Oberflächen zu verhindern, Detergentien (z. B. Tween-20, Tween-80, Pluronic F68, Gallensäuresalze), Solubilisierungsmittel (z. B. Glycerin, Polyethylenglykol), Antioxidationsmittel (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Massenaufbaumittel oder Tonusmodifikatoren (z. B. Laktose, Mannit), kovalente Anlagerung von Polymeren wie Polyethylenglykol an das Protein, Komplexbildung mit Metallionen oder Integration des Materials in oder auf bestimmten Präparaten polymerer Verbindungen, wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele usw., oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellaren oder multilamellaren Vesikeln, Blutkörperchenschatten oder Sphäroplasten. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die Geschwindigkeit der In-vivo-Freisetzung und die Geschwindigkeit der In-vivo-Clearance des SZF. Die Wahl der Zusammensetzungen wird von den physikalischen und chemischen Eigenschaften des Proteins mit SZF-Aktivität abhängen. Zum Beispiel erfordert ein Produkt, das von einer membrangebundenen Form des SZF abgeleitet ist, eine Formulierung, die Detergens enthält. Zusammensetzungen mit kontrollierter oder anhaltender Freisetzung beinhalten eine Formulierung in lipophilen Depots (z. B. Fettsäuren, Wachse, Öle). Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind teilchenförmige Zusammensetzungen, die mit Polymeren beschichtet sind (z. B. Poloxamere oder Poloxamine) und SZF, der an Antikörper gekoppelt ist, die gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtet sind, oder an Liganden von gewebespezifischen Rezeptoren gekoppelt ist. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung schließen teilchenförmige Schutzbeschichtungen, Proteaseinhibitoren oder Permeationsverbesserer für verschiedene Verabreichungswege ein, einschließlich parenteral, pulmonal, nasal und oral.
  • Des Weiteren, wie hierin verwendet, sind „pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe" Fachmännern wohl bekannt und beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphatpuffer von 0,01–0,1 M und vorzugsweise 0,05 oder 0,8 %-ige Kochsalzlösung. Darüber hinaus können solche pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoffe wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sein. Beispiele von nichtwässrigen Lösemitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ölsäureethylester. Zu wässrigen Trägerstoffen zählen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien. Zu parenteralen Vehikeln zählen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktatlösung oder nichtflüssige Öle. Zu intravenösen Vehikeln zählen Flüssigkeiten und Nährstoffe wiederauffüllende Mittel, Elektrolyten wiederauffüllende Mittel, wie die auf Ringer-Dextrose basierenden, und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Additive können ebenfalls vorhanden sein, wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner, Inertgase und dergleichen.
  • Der Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge" wird hierin so verwendet, für eine Menge zu stehen, die dazu ausreicht, ein klinisch signifikantes Defizit bei der Aktivität, Funktion und Reaktion des Wirts um mindestens etwa 15 Prozent, vorzugsweise um mindestens 50 Prozent, mehr bevorzugt um mindestens 90 Prozent zu reduzieren und am meisten bevorzugt zu verhindern. Alternativ reicht eine therapeutisch wirksame Menge dazu aus, eine Verbesserung eines klinisch signifikanten Leidens in dem Wirt zu bewirken. Wie Fachmänner zu schätzen werden wissen, kann die Menge der Verbindung in Abhängigkeit von ihrer spezifischen Aktivität variieren, und geeignete Dosierungsmengen können von etwa 0,1 bis 20, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 10 und mehr bevorzugt einem oder mehreren Milligramm Wirkstoff pro Kilogramm Körpergewicht einer Einzelperson pro Tag reichen und von dem Verabreichungsweg abhängen. In einer Ausführungsform liegt die Menge im Bereich von 10 Picogramm pro kg bis 20 Milligramm pro kg. In einer anderen Ausführungsform beträgt die Menge 10 Picogramm pro kg bis 2 Milligramm pro kg. In einer anderen Ausführungsform beträgt die Menge 2–80 Mikrogramm pro Kilogramm. In einer anderen Ausführungsform beträgt die Menge 5–20 Mikrogramm pro kg.
  • Der Ausdruck „Einheitsdosis", wenn er in Bezug auf eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einheitliche Dosierung für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorherbestimmte Menge Wirkmaterial enthält, die darauf berechnet wurde, die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Trägerstoff oder Vehikel, zu produzieren.
  • Eine therapeutische Verbindung kann in einem System mit kontrollierter Freisetzung abgegeben werden. Zum Beispiel kann der Komplex unter Anwendung von intravenöser Infusion, einer implantierbaren Osmosepumpe, eines transdermalen Pflasters, Liposomen oder anderen Verabreichungsmodi verabreicht werden. Eine Pumpe kann verwendet werden (siehe Langer, oben; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Polymere Materialien können verwendet werden (siehe Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger und Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); siehe auch Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Ein System mit kontrollierter Freisetzung kann in der Nähe des Therapieziels, d. h. dem Gehirn, angeordnet werden, wodurch nur ein Bruchteil der systemischen Dosis erforderlich ist (siehe z. B. Goodson in Medical Applications of Controlled Release, oben, Bd. 2, S. 115–138 (1984)). Vorzugsweise wird eine Vorrichtung zur kontrollierten Freisetzung in einen Probanden in der Nähe der Stelle der unangemessenen Immunaktivierung oder des Tumors eingebracht. Weitere Systeme mit kontrollierter Freisetzung sind im Überblick von Langer (Science 249:1527–1533 (1990)) erörtert.
  • Wie ein Durchschnittsfachmann leicht zu schätzen wissen wird, sind die hierin beschriebenen Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen besonders zur Behandlung eines beliebigen Tiers, insbesondere eines Säugetiers, geeignet und einschließlich, jedoch keineswegs darauf beschränkt, Haustieren, wie Katzen- oder Hundesubjekte, Nutztieren, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Rinder-, Pferde-, Ziegen-, Schaf- und Schweinesubjekte, wilden Tieren (ob in der Wildnis oder in einem zoologischen Garten), Versuchstieren, wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen; Schafe, Schweine, Hunde, Katzen usw., d. h. zur Verwendung in der Tiermedizin.
  • VERSUCHSDETAILSABSCHNITT
  • BEISPIEL 1: Eine Familie von RNA-Helicasen sind Modulatoren der Translationstermination
  • Materialien und Verfahren
  • Allgemeine Hefe-Verfahren: Hefemedien, Transformationen, RNA-Isolierung, Blotting und Hybridisierung waren wie beschrieben (Rose et al., 1990, Weng et al., 1996a, Hagan et al., 1995, Scheistl und Geitz, 1989).
  • Herstellung von Glutathion-Sepharose-RF-Fusionskomplexen und gereinigten RF-Fusionsproteinen: Die Glutathion-Speharose-RF-Fusionskomplexe wurden wie zuvor beschrieben (Czaplinski et al., 1998) hergestellt. 1 μl GST-RF-Komplexe enthielten in der Regel 0,9 μg GST-eRF1 oder 1,5 μg GST-eRF3, während GST-Komplexe in der Regel 4,5 μg GST pro μl Harz enthielten. Gereinigte GST-RF wurden ebenfalls aus Kulturen von BL21(DE3)-pLysS-Zellen hergestellt, die mit pGEX2T, pGEX2T-SUP35 oder pGEX2T-SUP45 transformiert worden waren, und die Fusionsproteine wurden wie zuvor beschrieben (Czaplinski et al., 1998) isoliert.
  • Herstellung zytoplasmatischer Extrakte: BJ305-Zellen (MATα pep4::HIS3 prb-Δ1,6R HIS3 lys2-208 trp1-Δ10 ura-52 gal2 can1) wurden zu einer OD600 = 1,0 gezüchtet und in 5 ml kaltem Puffer IB (IBTB, dem RSA fehlte) mit 0,5 mM PMSF gewaschen. Die Zellen wurden erneut pelletiert und in 1,3 ml kaltem IB mit 0,5 mM PMSF und Proteaseinhibitoren (PI, jeweils 1 μg/ml Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin A) pro g Zellgewicht suspendiert. Ein ungefähr gleiches Volumen Glasperlen wurde zugegeben und eine Lyse wurde durch 6-maliges Vortexen für 20 Sekunden mit 1 Minute Kühlen auf Eis zwischen dem Vortexen erzielt. Das Lysat wurde entfernt und die Perlen 2-mal mit einem gleichen Volumen von IB mit 0,5 mM PMSF und jeweils 1 μg/ml Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin A gewaschen. Die Waschvorgänge wurden mit dem Lysat vereint und die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugierung bei 30.000 × g für 20 min entfernt.
  • ATPase Assays: Mtt1p-RNA-abhängige ATPase-Aktivität wurde unter Verwendung von 20 ng Mtt1p in Anwesenheit von GST-RF-Fusionsproteinen mittels eines Aktivkohle-Assays, wie zuvor beschrieben (Czaplinski et al., 1995), unter Verwendung von 1 μg/ml Poly-(U)-RNA mit 100 μg/ml RSA ermittelt. Die Ergebnisse werden als pmol freigesetztes 32P im Vergleich zur Konzentration des angegebenen Proteins aufgetragen.
  • Ergebnisse
  • Identifizierung einer Familie von Hefe-Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen, die dem UPF1-Gen ähneln: Ein Sequenzvergleich zum Identifizieren anderer Hefegene, die zu dem UPF1 homolog sind, wurde vorgenommen und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Das SEN1-Gen zeigte signifikante Homologie mit UPF1 (2; siehe Koonin, 1992). SEN1 wurde in einem Screen auf Mutationen, die sich auf die tRNA-Spleißung auswirken und alle Motive beherbergen, um als eine Superfamilie-Gruppe-I-Helicase erachtet zu werden, identifiziert (Winey und Culbertson, 1988, DeMarini et al., 1992). Das zuvor identifizierte DNA2-Gen zeigte ebenfalls signifikante Homologie zu UPF1 (2). Von DNA2 ist wahrscheinlich, dass es eine Rolle in der DNA-Replikation, möglicherweise im Verarbeiten von Okazaki-Fragmenten spielt (Budd et al., 1995, Budd und Campbell, 1997). Zwei weitere Gene, die Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen kodieren, mit hoher Homologie zu UPF1 wurden ebenfalls identifiziert und wurden in früheren Studien als Helicase A (HCSA, Biswas et al., 1997a, b) und Helicase B (HCSB, Biswas et al., 1997a, b) oder scHel1 (Bean und Matson, 1993) bezeichnet. Aus Gründen, die im Folgenden beschrieben werden, wird das Gen, das Helicase B (HCSB) kodiert, als MTT1 (für Modulator von Translationstermination) bezeichnet. Die Proteine, die von den HCSA- und MTT1-Genen kodiert werden, wurden zuvor gereinigt und von ihnen wurde gezeigt, dass sie DNA-abhängige Helicase-Aktivität aufweisen (Biswas et al., 1995; Biswas et al., 1997a, b; Bean und Matson, 1993). Von HCSA und HCSB wurde behauptet, dass sie an der Chromosomreplikation beteiligt sind (Biswas et al., 1995, 1997a, b). Diese Auffassung basiert auf den Beobachtungen, dass: 1) das einzelsträngige Hefe-DNA-Bindeprotein Rpa1p deren DNA-Helicase-Aktivitäten verstärkt (Biswas et al., 1995, 1997) und 2) HcsA gemeinsam mit DNA-Polymerase α gereinigt wird, und zeigt die biochemischen Eigenschaften replikativer Helicasen (Biswas et al., 1997a, b). Bis heute gibt es keine In-vivo-Beweise, die die Beteiligung von HCSA oder HCSB an der Replikation nahe legen. Beide hcsaΔ- und hcsbΔ-Stämme sind lebensfähig. hcsbΔ-Stämme zeigen keine Wachstumsdefekte, Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schädigung oder Atemwegsdefekte (Bean und Matson, 1997). Von Transposon-Insertion in die Promotorregion von MTT1 wurde berichtet, dass sie Überempfindlichkeit gegenüber Calcofluor White, einem Zellwandsyntheseinhibitor, und Hygromycin B, einem Arzneimittel, das einen Translationslesefehler induziert, verursacht (Lussier et al., 1997). Homologie von HcsA und HcsB wurde zuvor bemerkt (Biswas et al., 1997a). Die Homologie zwischen diesen fünf Hefe-Helicasen scheint auf ihre Helicase-Domänen beschränkt zu sein (2).
  • Acht konservierte Motive sind mit allen Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen assoziiert (Gorbalenya, 1988, Koonin, 1992). In diesen acht Motiven ist eine begrenzte Anzahl Reste unter allen Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen konserviert. Obwohl diese 8 Motive entsprechend der Kristallstruktur von 2 unterschiedlichen Superfamile-Gruppe-I-Helicasen variabel von Protein zu Protein beabstandet sind, befinden sich diese konservierten Reste alle in unmittelbarer Nähe in 3 Dimensionen (2 Kristallstrukturpapiere).
  • Eine sorgfältigere Analyse der Gene mit Ähnlichkeit zu UPF1 identifiziert diese Gruppe als eine Subklasse der Superfamilie-Gruppe I, die UPF1-ähnliche Subklasse. Das charakteristische Merkmal dieser Subklasse ist eine umfassendere Homologie, die die konservierten Reste in den Motiven II, IV, V und VI umgibt (2), die zuvor bemerkt wurde (Perlick et al., 1996). Darüber hinaus werden zwei zusätzliche Motive in dieser Domäne unter diesen fünf Genen konserviert. Das erste befindet sich zwischen den Motiven III und IV (Consensus lexSLFervl; 2) und das zweite befindet sich zwischen den Motiven IV und V (Consensus IgvitpYxaQ; 2), die als Motiv IIIa bzw. IVa bezeichnet werden. Diese zusätzlichen Motive liegen auch im humanen Homolog des Upf1-Gens vor. Von diesen fünf Hefegenen weist Dna2p die schlechteste Übereinstimmung mit dem Consensus auf und ein Weglassen dieser Sequenz ergibt einen engeren Consensus. Zwei andere Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen aus Hefe, Pif1 und RadH, und zwei gut charakterisierte Gruppe-I-Helicasen aus E. coli, Rep und uvrD, konnten nicht unter diesen Parametern mit diesen fünf Sequenzen aligniert werden, was darauf hindeutet, dass die Homologie nicht für alle Superfamile-Gruppe-I-Helicasen allgemeingültig ist, was einen Beweis für eine andere Subklasse darstellt.
  • Wie oben beschrieben, besteht ein einzigartiges Merkmal des Upf1p darin, dass es eine an Cystein/Histidin reiche Region in der Nähe seines Aminoterminus aufweist (2C). Von Mutationen in dieser Region wurde gezeigt, dass sie Translationsterminationseffizienzen an Nonsense-Codons vermindern und programmierte ribosomale -1-Rasterverschiebungseffizienzen verstärken (Weng et al., 1996b; Cui et al., 1996). Diese Region wurde als die Upf2-Interaktionsdomäne identifiziert (Weng et al., 1996b, He et al., 1996). Interessanterweise enthält das Mtt1p auch eine an Cystidin/Histidin reiche Region in der Nähe seines Aminoterminus (Bean und Matson, 1997). Innerhalb der ersten 127 Aminosäuren liegen 13 Cysteine und 3 Histidine vor. Obwohl die an Cystidin/Histidin reichen Regionen von UPF1 und MTT1 keine offensichtliche Homologie enthalten, weisen beide Regionen das Potential auf, Ringfinger zu bilden (siehe Weng et al., 1996b, Bean und Mason, 1997). Darüber hinaus können diese Regionen an mehrere Zinkbindemotive angepasst werden. Aufgrund der beträchtlichen Anzahl von Cysteinresten hinterlässt jedoch jedes Alignment dieser Art mehrere Cysteinreste, die innerhalb derselben Region nicht berücksichtigt sind.
  • Ein mtt1Δ-Stamm zeigt einen Nonsense-Suppressionsphänotyp: Nonsense-Suppression resultiert, wenn eine nahezu zugehörige tRNA erfolgreich mit den Terminationsfaktoren an einer Nonsense-Mutation kompetiert, so dass eine Aminosäureeinbindung in die Peptidkette anstelle einer vorzeitig terminierenden Translation stattfindet (1). Ausreichende Niveaus von Nonsense-Suppression ermöglichen die Produktion von abgeschlossenem Polypeptidprotein, was das Wachstum unterstützen kann. Ein upf1Δ-Stamm ermöglicht die Nonsense-Suppression dieser Allele. Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurde bestimmt, dass Mtt1p am Modulieren der Translationstermination an einem Stoppcodon beteiligt ist. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden Wildtyp-, mtt1Δ-, upf1Δ-, upf1Δ-mtt1Δ-Stämme, die leu2-2- und tyr7-1-Nonsense-Allele beherbergen, auf Suppression dieser Allele geprüft. Der Suppressionsphänotyp von Stämmen, die die leu2-2- und tyr7-1-Nonsense-Allele beherbergen, wurde durch Plattieren von Zellen auf -trp-leu-tyr-Medien beobachtet. Als eine Kontrolle wurden diese Zellen auf -trp-Medien plattiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die beiden upf1Δ- und mtt1Δ-Zellen beherbergenden auf beiden Medienarten wuchsen (3A), was darauf hindeutet, dass ein Deletieren entweder des UPF1- oder des MTT1-Gens eine Suppression der tyr7-1- und leu2-2-Nonsense-Allele ermöglicht (3A). Wildtyp-Zellen (UPF1+-MTT1+) waren nicht dazu im Stande, auf -trp-leu-tyr-Medien zu wachsen, was zeigte, dass das Vorliegen dieser Gene eine Suppression dieser Nonsense-Allele verhinderte (3A).
  • Der Nonsense-Suppressionsphänotyp eines upf1Δ-mtt1Δ-Stamms wurde ebenfalls wie oben beschrieben beobachtet und mit Stämmen verglichen, die einzelne Deletionen beherbergten. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen zeigten, dass ein upf1Δ-mtt1Δ-Stamm dahingehend viel wirksamer war, die tyr7-1- und leu2-2-Nonsense-Allele zu supprimieren, als Stämme, die einzelne Deletionen entweder des UPF1- oder des MTT1-Gens beherbergten (3A). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl das Upf1p als auch das Mtt1p am Modulieren der Translationstermination an Nonsense-Codons beteiligt sind.
  • Frühere Ergebnisse zeigten, dass ein upf1Δ-Stamm ebenfalls die Rasterverschiebungs suppression bei 37 °C in Stämmen, die das his4-38-Allel und einen SUF1-tRNA-Rasterverschiebungssuppressor beherbergen, verstärken konnte, während Stämme, die das Wildtyp-UPF1-Gen beherbergten, nicht bei dieser Temperatur wachsen konnten (Leeds et al., 1991, 1992). Es wurde gezeigt, dass ein mtt1Δ-his4-38-SUF1-Stamm ebenfalls die Rasterverschiebungssuppression verstärken können würde. Die Ergebnisse zeigten, dass ein mtt1Δ-his4-38-SUF1-Stamm im Gegensatz zu einem upf1Δ-Stamm nicht bei 37 °C auf Medien, denen es an Histidin mangelte, wachsen konnte, was darauf hinweist, dass ein Deletieren des MIT1-Gens die Rasterverschiebungssuppression in diesem Assay nicht steigern konnte.
  • Ein mtt1Δ-Stamm wirkt sich nicht auf den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall aus: Frühere Ergebnisse zeigten, dass das Upf1p eine Rolle beim Regulieren sowohl des mRNA-Umsatzes als auch der Translationstermination innehat (Weng et al., 1996a, b, 1998; Czaplinski et al., 1998). Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde ermittelt, ob der oben beobachtete Nonsense-Suppressionsphänotyp eine Folge des Beeinflussens der Effizienz der Translationstermination, wodurch der Nonsense-vermittelte mRNA-Zerfallsweg (nonsense-mediated mRNA decay pathway, NMD-Weg) inaktiviert wird, oder einer Kombination des Beeinflussen der zwei Wege war. Ein mtt1Δ-Stamm, der die tyr7-1- und leu2-2-Nonsense enthaltenden Allele beherbergte, wurde konstruiert, um diese Frage zu stellen (siehe Versuchsverfahren). Von einem mtt1Δ-Stamm wurde gezeigt, dass er ohne demonstrierbaren Wachstumsdefekte lebensfähig ist (siehe Versuchsverfahren). Die Auswirkung eines mtt1Δ auf NMD wurde durch Beobachten der Abundanz des CYH2-Präkursors und reifer mRNA, die ein ribosomales Protein kodiert, untersucht. Der ineffizient gespleißte CYH2-Präkursor, der in der Nähe des 5'-Endes ein Intron enthält, ist ein natürlich vorkommendes Substrat für den Nonsensevermittelten mRNA-Zerfallsweg (nonsense-mediated mRNA decay pathway, NMD-Weg) (He et al., 1993). Die Abundanz der Nonsense enthaltenden tyr7- und leu2-Transkripte wurde ebenfalls in diesen Stämmen bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Steady-State-Spiegel von CYH2-Präkursor und reifer mRNA, der tyr7- und leu2-mRNAs zu den in einem Wildtyp-Stamm gefundenen gleichwertig waren (3). Als eine Kontrolle wurden die CYH2-Präkursor und Nonsense enthaltenden tyr7- und leu2-Transkripte in einem upf1Δ-Stamm erhöht. Die Abundanz des Wildtyp-CYH2- Transkripts, bei dem es sich nicht um ein Substrat des NMD-Wegs handelt, war in allen getesteten Stämmen gleichwertig (3). Darüber hinaus ist die Abundanz der Transkripte, bei denen es sich um Substrate für den NMD-Weg handelt, in einem upf1Δ-mtt1Δ-Stamm im Vergleich zu nur einem upf1Δ-Stamm nicht mehr beeinflusst wurde (3). Ein upf1Δ-mtt1Δ-Stamm war ohne erkennbare Wachstumsdefekte lebensfähig.
  • Das Mtt1p interagiert mit dem Peptidyl-Release-Faktor eRF3: Frühere Ergebnisse legten nahe, dass das Upf1p sich durch direktes Interagieren mit den Translationsterminationsfaktoren eRF1 und eRF3 auf die Translationstermination auswirkt und folglich sich auf deren Effizienz der Translationstermination auswirken kann (Czaplinski et al., 1998). Da ein Deletieren des MTT1-Gens auch die Nonsense-Suppression der tyr7-1- und leu2-2-Allele fördert, interagiert Mtt1p auch mit den Peptidyl-Release-Faktoren. Um dies zu testen, wurden eRF1 und eR3 individuell in E. coli als Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine (GST-Fusionsproteine) exprimiert und unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-Perlen gereinigt. Die gereinigten GST-RF-Fusionsproteine (RF = Release-Faktor), die mit den Glutathion-Sepharose-Perlen assoziiert sind, wurden einem zytoplasmatischen Hefeextrakt zugesetzt, der ein mit FLAG-Epitop markiertes Mtt1p enthielt (siehe Versuchsverfahren). Nach der Inkubation wurden die GST-RFs und assoziierten Proteine mittels Affinitätschromatographie gereinigt und SDS-PAGE unterzogen. Immunoblotting wurde durchgeführt und es wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen das FLAG-Epitop auf das Vorliegen von Flag-Mtt1p geprüft. Der Anti-FLAG-Antikörper erkannte nur das 127 kD lange Mtt1p in zytoplasmatischen Extrakten aus Zellen, die mit Plasmid transformiert worden waren, das das FLAG-Upf1p exprimierte. Diese Analyse zeigte außerdem, dass das Mtt1p spezifisch gemeinsam mit eRF3 gereinigt wurde (5). Mtt1p wurde nicht gemeinsam mit entweder GST-RF1 oder GST-Protein, das nicht an ein anderes Protein fusioniert war (5), oder einem GST-JIP-Protein gereinigt, wobei ein Jak2-Interaktisonsprotein, das an GST fusioniert war, zum Überwachen der Spezifität der Reaktion verwendet wurde.
  • Das Mtt1p ist mit Polysom assoziiert: Auf Grundlage von Nonsense-Suppressionsphänotypen eines mtt1Δ-Stamms wurde untersucht, ob das Mtt1p mit Ribosomen assoziiert ist. Um zu bestimmen, ob das Mtt1p mit Ribosom assoziiert ist, wurden postmitochondriale Extrakte aus Zellen, die das Flag-Mtt1-Gen beherbergen, hergestellt und die Polysomfraktionen wurden mittels Zentrifugierung durch Saccharose-Gradienten getrennt. Die verschiedenen Fraktionen wurden gesammelt und das Vorliegen des Flag-Mtt1p-Proteins in den Gradientenfraktionen wurde mittels Western-Blotting ermittelt, wobei die Blots mit einem Antikörper sondiert wurden, der gegen das Flag-Epitop gerichtet ist. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen zeigten an, dass das Flag-Mtt1p mit Polysom und Monosom assoziiert, während die oberen Fraktionen kein nachweisbares Mtt1p enthielten (6, Bahnen 2 und 3). Das Mtt1p, das mit der Polysomfraktion assoziiert war, besteht vorwiegend aus einem 127 kD langen Protein. Die Behandlung der Polysomextrakte mit RNase A verschob das Mtt1p auf Fraktionen, die die 40S-Subeinheiten enthalten.
  • Das Mtt1p zeigt RNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivitäten: Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass Mtt1p DNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivitäten aufweist (Biswas et al., 1995). Auf Grundlage der oben beschriebenen Ergebnisse wurde gezeigt, dass Mtt1p ebenfalls eine RNA-abhängige ATPase und Helicase sein wird. Es wurde zunächst gefragt, ob gereinigtes Mtt1p ATPase-Aktivität zeigte. ATPase-Assays wurden durchgeführt, indem das gereinigte Protein in Reaktionsgemischen, die radiomarkiertes [γ-32P]-ATP enthielten, in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Polyuridins (Poly(rU)) inkubiert und auf die Freisetzung von 32PO4 geprüft wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass in Abwesenheit von Poly(rU) keine ATPase-Aktivität nachweisbar war (7). Reaktionsgemische, die Poly(rU) enthielten, stimulierten jedoch die Freisetzung von 32PO4 erheblich, was darauf hinweist, dass Mtt1p ebenfalls eine RNA-abhängige ATPase-Aktivität beherbergte (7). Konzentrationen von Poly(rU) bei 330 nM oder mehr als 330 nM stimulierten die ATPase-Aktivität des Upf1p maximal.
  • Diskussion
  • Die hier dargestellten Ergebnisse beschreiben die Identifizierung von Mtt1p, einer nukleinsäureabhängigen Helicase mit signifikanter Homologie zu dem Upf1p, einem zuvor beim Regulieren von sowohl der Translationstermination als auch des NMD identifizierten Faktor (Czaplinski et al., 1995, 1998; Weng et al., 1996a, b, 1998). Mehrere Beweisreihen deuten darauf hin, dass Mtt1p auch eine Rolle beim Modulieren des Translationsterminationsvorgangs innehat. Interessanterweise identifizierte ein Vergleich des MTT1-Gens mit anderen Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen, dass einzigartige Signaturmotive, die diese Subfamilie von Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen markieren, möglicherweise an entweder RNA-abhängigen oder RNA-DNA-abhängigen Vorgängen beteiligt sind (2). Wie im Folgenden erörtert werden wird, legen diese Ergebnisse nahe, dass eine Untergruppe der Upf1p-Familie von RNA-Helicasen am Modulieren der Effizienz des Translationsterminationsvorgangs beteiligt ist.
  • Das MTT1-Gen und sein Proteinprodukt zeigen Ähnlichkeit zu dem Upf1p: Ein Vergleich der MTT1- und UPF1-Gene identifizierte mehrere Regionen von Ähnlichkeit. Beide Proteine enthalten eine an Cystidin/Histidin reiche Regionen in der Nähe des aminoterminalen Endes des Proteins und beherbergen alle Motive, um eine Superfamilie-Gruppe-I-Helicase zu sein (2). Die an Cystidin/Histidin reichen Regionen von UPF1 und MTT1 sind nicht sehr homolog. Es ist auch denkbar, dass diese an Cystidin/Histidin reichen Regionen eine neue Art von an Cystidin/Histidin reichem Motiv bilden. Interessanterweise wurde von Mutationen in der an Cystidin/Histidin reichen Region von UPF1 zuvor gezeigt, dass sie die Effizienzen von programmierter -1-Rasterverschiebung steigern und die Nonsense-Suppression fördern (Cui et al., 1996; Weng et al., 1996b).
  • Sequenzvergleiche von Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen identifizierten zunächst, dass SEN1- und MOV-10-Gene starke Regionen von Homologie zu der UPF1-Gen-Helicase-Region aufweisen (Koonin, 1992). Das MTT1-Gen zeigte ebenfalls erhebliche Homologie zu UPF1 und zu anderen Mitgliedern der UPF1-ähnlichen Subfamilie (2). Zu diesen Genen zählen DNA2, HCSA, HCSB/MTT1 und SEN1. Insbesondere ist ein anderes Mitglied der UPF1-Familie von Helicasen das jüngst isolierte HelB-Gen (Biswas et al., 1997a, b). Diese Helicase wurde zunächst als Teil des Multienzym/Polymerase-α-Komplexes isoliert (Biswas et al., 1993, 1993a, 1995). Eine Deletion von HCSA verursachte keine Nonsense-Suppression, was zeigte, dass die in upf1Δ- und mtt1Δ-Stämmen beobachteten Nonsense-Suppressionsphänotypen nicht einfach aufgrund des Deletierens einer Gruppe-I-Helicase vorliegen.
  • Das Mtt1p ist eine RNA-Helicase, die an der Translationstermination beteiligt ist: Frühere Ergebnisse zeigten, dass das Hel1p/Mtt1p DNA-Helicase-Aktivität zeigte, die von dem einzelsträngigen Hefe-DNA-Bindeprotein Rpa1p stimuliert wurde (Biswas et al., 1995; Bean und Matson, 1997). Die hier dargestellten Ergebnisse zeigten, dass das gereinigte Mtt1p ebenfalls RNA-abhängige ATPase- und Helicase-Aktivitäten zeigt (7). Folglich zeigte auch Mtt1p, ähnlich zu Upf1p (Czaplinski et al., 1995) die Fähigkeit, sowohl DNA- als auch RNA-Duplexe zu entwinden.
  • Mehrere Beweisreihen legen nahe, dass Mtt1p an der Translationstermination beteiligt ist. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass: 1) ein mtt1Δ-Stamm einen Nonsense-Suppressionsphänotyp zeigt (4); 2) das Mtt1p mit Polysom assoziiert ist (6); 3) das Mtt1p direkt mit dem Peptidyl-Release-Faktor eRF3 interagiert (5); 4) mtt1Δ-Stämme Paromomycin-Empfindlichkeit zeigen. Wenn man berücksichtigt, dass ein mtt1Δ-Stamm im Gegensatz zu einem upf1Δ-Stamm Nonsense enthaltende Transkripte nicht stabilisiert, ist der Umfang der Nonsense-Suppression pro RNA-Molekül in einem mtt1Δ-Stamm größer als in einem upf1Δ-Stamm (3).
  • Ein mtt1Δ-upf1Δ-Stamm zeigt im Vergleich mit einem upf1Δ- oder mtt1Δ-Stamm einen drastischen Nonsense-Suppressionsphänotyp. Eine Möglichkeit, diese Beobachtung zu erklären, besteht darin, dass diese Proteine im selben Schritt in der Translationstermination fungieren und dass entweder Mtt1p oder Upf1p den Verlust des anderen Faktors zum Teil kompensieren kann. Die Inaktivierung beider Faktoren führt jedoch zu einem viel höheren Niveau der Nonsense-Suppression. Eine alternative Erklärung besteht darin, dass diese zwei Faktoren in unterschiedlichen Schritten im Terminationsvorgang arbeiten. Sowohl Mtt1p als auch Upf1p fungieren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination und Upf1p agiert anschließend zum Fördern des Zerfalls der mRNA. Der synergistische Anstieg der Nonsense-Suppression kann eine Folge sowohl des Erhöhens der Menge des Nonsense enthaltenden Transkripts als auch des Verminderns der Effizienz der Translationstermination in einem mtt1Δ-upf1Δ-Stamm sein.
  • Mindestens zwei RNA-Helicasen sind am Modulieren der Effizienz der Translationstermination beteiligt: Es ist interessant, dass es scheinbar mindestens zwei Helicasen gibt, die am Modulieren der Effizienz der Translationstermination beteiligt sind. Es wurde nun klar, dass die Fähigkeit zum Manipulieren von Nukleinsäureduplexen durch Helicasen für jeden biologischen Vorgang, an dem DNA und RNA beteiligt sind, entscheidend ist. Von einer großen Anzahl von RNA-Helicasen wurde gezeigt, dass sie an posttranskriptionalen Steuermechanismen beteiligt sind. Zu Beispielen zählen tRNA-Verarbeitung, ribosomale Biogenese, Spleißen, Transport, Translation und mRNA-Umsatz. Diese RNA-Helicasen gliedern sich in mindestens zwei Familien, wobei die bedeutendste Superfamilie die „DEAD-Box"-Helicasen oder die Superfamilie-Gruppe II ist. Von den Superfamilie-Gruppe-I-Helicasen, wie die in 2 gezeigten, wurde gezeigt, dass sie sowohl DNA- als auch RNA-Duplexe entwinden.
  • Zurzeit ist nicht bekannt oder es wird nicht verstanden, wie Upf1p und Mtt1p den Translationsterminationsvorgang modulieren. Die Effizienz der Translationstermination kann durch Verändern 1) der Assoziationsraten der eRFs mit dem Ribosom, 2) der Effizienz der eRFs beim Fördern der Peptidylhydrolyse oder 3) der Rate der Dissoziation der eRFs von dem Ribosom, nachdem die Translationstermination abgeschlossen wurde, beeinflusst werden. Assays zum Überwachen dieser Schritte im Translationsterminationsvorgang, um zu beginnen, zu verstehen, bei welchem Schritt diese Proteine fungieren.
  • Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen an, dass sich die Wachstumsraten von Zellen, obwohl der Translationsapparat sehr präzise ist, unter Bedingungen, die die Genauigkeit dieses Vorgangs reduzieren, nicht ändern. Zum Beispiel zeigte ein mtt1Δ-upf1Δ-Stamm keine Auswirkungen auf das Zellwachstum, wenn auch die Translationstermination in diesen Zellen weniger effizient ist. Darüber hinaus zeigen Stämme, die das mof4-1-Allel von UPF1 oder ein upf3Δ beherbergen und eine vierfach erhöhte programmierte Rasterverschiebungseffizienz zeigen und eine Verringerung der Fidelität im Vorgang der Translationselongation anzeigen, ebenfalls keine Wachstumsdefekte (Cui et al., 1996; Ruiz-Echevarria et al., 1998).
  • REFERENZEN
    • J.A. All-Robyn, D. Kelley-Geraghty, E. Griffin, N. Brown, S.W. Liebman. 1990. Isolation of omnipotent suppressors in an [eta+] yeast strain. Genetics 124:505–514.
    • N. Altamura, O. Groudinsky, G. Dujardin und P.P. Slonimski. (1992) NAM7 nuclear gene encodes a novel member of a family of helicases with a Z1-6n-ligand motif and is involved in mitochondrial functions in Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol. 224, 575–587.
    • S.E. Applequist, M. Selg, C. Roman und H.M. Jack. (1997) Cloning and characterization of HUPF1, a human homologue of the Saccharomyces cerevisiae nonsense mRNA-reducing UPF1 protein. Nucleic Acids Res. 25, 814–821.
    • A.L. Atkin, N. Altamura, P. Leeds und M.R. Culbertson. (1995) The majority of yeast UPF1 co-localizes with polyribosomes in the cytoplasm. Mol. Biol. Cell 6, 611–625.
    • A.L. Atkin, L.R. Schenkman, M. Eastham, J.N. Dahlseid, M.J. Lelivelt, M.R. Culbertson. (1997) Relationship between yeast polyribosomes and Upf1 proteins required for nonsense mediated mRNA decay. J. Biol. Chem. 272, 22163–22172.
    • D.W. Bean und S.W. Matson. 1997. Identification of the gene encoding scHelI, a DNA helicase from Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13:1465–1475.
    • D.W. Bean, W.E. Kallam und S.W. Matson. 1993. Purification and characterization of a DNA helicase from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 268:21783–21790.
    • D.M. Bedwell, A. Kaenjak, D.J. Benos, Z. Bebok, J.K. Bubien, J. Hong, A. Tousson, J.P. Clancy, E.J. Sorscher. 1997. Suppression of a CFTR premature stop mutation in a bronchial epithelial cell line. Nature Med. 1997, 3:1280–1284.
    • E.E. Biswas, W.M. Fricke, P.H. Chef, S.B. Biswas. 1997a. Yeast DNA helicase A: cloning, expression, purification, and enzymatic characterization. Biochemistry. 36:13277–13284.
    • S.B. Biswas, P.H. Chef und E.E. Biswas. 1997b. Purification and characterization of DNA polymerase α-associated replication protein A-dependent yeast DNA helicase A. Biochemistry 36, 13270–13276.
    • E.E. Biswas, P.H. Chef, J. Leszyk und S.B. Biswas. 1995. Biochemical and genetic characterization of a replication protein A dependent DNA helicase from the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206:850–856.
    • E.E. Biswas, P.H. Chef und S.B. Biswas. 1993a. DNA helicase associated with DNA polymerase alpha: isolation by a modified immunoaffinity chromatography. Biochemistry 32:13393–13398.
    • E.E. Biswas, C.M. Ewing and S.B. Biswas. 1993b. Characterization of the DNA-dependent ATPase and a DNA unwinding activity associated with the yeast DNA polymerase alpha complex. Biochemistry. 2:3020–3026.
    • R. Buckingham, G. Grentzmann und L. Kisselev. (1997) Polypeptide chain release factors. Mol. Microbiol. 24, 449–456.
    • M.E. Budd, W.C. Choe und J.L. Campbell. 1995. DNA2 encodes a DNA helicase essential for replication of eukaryotic chromosomes. J. Biol. Chem. 270, 26766–26769.
    • M.E. Budd und J.L. Campbell. 1997. A yeast replicative helicase, Dna2, interacts with yeast FEN-1 nuclease in carrying out its essential function. Mol. Cell. Biol. 17, 2136–2142.
    • Y. Cui, K.W. Hagan, S. Zhang und S.W. Peltz. (1995) Identification and characterization of genes that are required for the accelerated degradation of mRNAs containing a premature translational termination codon. Genes & Dev. 9, 423–436.
    • Y. Cui, J.D. Dinman und S.W. Peltz. (1996) mof4-1 is an allele of the UPF1/IFS2 gene which affects both mRNA turnover and -1 ribosomal frameshifting efficiency. EMBO J. 15, 5726–5736.
    • K. Czaplinski, Y. Weng, K.W. Hagan und S.W. Peltz. (1995) Purification and characterization of the Upf1p: a factor involved in translation and mRNA degradation. RNA 1, 610–623.
    • K. Czaplinski, Ruiz-Echevarria, Y. Weng, S.V. Paushkin, H. Dietz, M.D. Ter-Avanesyan und S.W. Peltz. 1998. Assembly of the mRNA surveillance complex occurs at a translation termination event. Genes & Dev. Im Druck.
    • D.J. DeMarini, M. Winey, D. Ursic, F. Webb und M.R. Culbertson. 1992. SEN1, a positive effector of tRNA-splicing endonuclease in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 12:2154–2164.
    • S.A. Didichenko, M.D. Ter-Avanesyan und V.N. Smirnov. (1991) EF-la-like ribosomebound protein of yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 198, 705–711.
    • J.D. Dinman, M.J. Ruiz-Echevarria und S.W. Peltz. 1998. Translating old drugs into new treatments: Identifying compounds that modulate programmed -1 ribosomal frameshifting and function as potential antiviral agents. Trends in Biotech. 16:190–196.
    • J.D. Dinman, M.J. Ruiz-Echevarria, K. Czaplinski und S.W. Peltz. 1997. Peptidyltransferase inhibitors have antiviral properties by altering programmed -1 ribosomal frameshifting efficiencies: Development of model systems. P.N.A.S. 94:6606–6611.
    • L. Frolova, X. Le Goff, H.H. Rasmussen, S. Cheperegin, G. Drugeon, M. Kress, I. Arman, A.L. Haenni, L.E. Celis, M. Philippe, J. Justesen und L. Kisselev. (1994) A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of a polypeptide chain release factor. Nature 372, 701–703.
    • L. Frolova, X. Le Goff, G. Zhouraleva, E. Davydova, M. Philippe und L. Kisselev. (1996) Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1- and ribosomedependent guanosine triphosphatase. RNA 4, 334–341.
    • A.E. Gorbalenya, E.V. Koonin, A.P. Dochenko, V.M. Blinov. 1988. A novel superfamily of nucleoside triphosphate-binding motif containing proteins which are probably involved in duplex unwinding in DNA and RNA replication and recombination. FEBS Lett. 235(1, 2):16–24.
    • K.W. Hagan, M.J. Ruiz-Echevarria, Y. Quan und S.W. Peltz. (1995) Characterization of cis-acting sequences and decay intermediates involved in nonsense-mediated mRNA turnover. Mol. Cell. Biol. 15, 809–823.
    • F. He, A.H. Brown und A. Jacobson. (1997) Upf1p, Nmd2p, and Upf3p are interacting components of the yeast nonsense-mediated mRNA decay pathway. Mol. Cell. Biol. 17, 1580–1594.
    • F. He, S.W. Peltz, J.L. Donahue, M. Rosbash und A. Jacobson. (1993) Stabilization and ribosome association of unspliced pre-mRNAs in a yeast upf1-mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7034–7038.
    • M. Howard, R.A. Frizzell und D.M. Bedwell. (1996) Aminoglycoside antibiotics restore CFTR function by overcoming premature stop mutations. Nature Med. 2, 467–469.
    • A. Jacobson und S.W. Peltz. (1996) Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells. Ann. Rev. Biochem. 65, 693–739.
    • E.V. Koonin. (1992) A new group of putative RNA helicases. TIBS 17, 495–497.
    • S. Korolev, J. Hsieh, G.H. Gauss, T.M. Lohman und G. Waksman. 1997. Major domain swiveling revealed by the crystal structures of complexes of E. coli Rep helicase bound to single-stranded DNA and ADP. Cell. 90:635–647.
    • P. Leeds, S.W. Peltz, A. Jacobson und M.R. Culbertson. (1991) The product of the yeast UPF1 gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a premature translational termination codon. Genes & Dev. 5, 2303–2314.
    • P. Leeds, J.M. Wood, B.S. Lee und M.R. Culbertson. (1992) Gene products that promote mRNA turnover in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 12, 2165–2177.
    • M. Lussier, A.-M. White, J. Sheraton, T. di Paolo, J. Treadwell, S.B. Southard, C.I. Horenstein, J. Chen-Weiner, A.F.J. Ram, J.C. Kapteyn, T.W. Roemer, D.H. Vo, D.C. Bondoc, J. Hall, W.W. Zhong, A.-M. Sdicu, J. Davies, F.M. Klis, P.W. Robbins und H. Bussey. 1997. Large Scale identification of Genes Involved in Cell Surface Biosynthesis and Architecture in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 147, 435–450.
    • V.A. McKusick (mit der Unterstützung von C.A. Francomano, S.E. Antonarakis und P.L. Pearson). (1994) Mendelian inheritance in man: a catalog of human genes and genetic disorders. Johns Hopkins University Press. Baltimore MD. (Website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/).
    • E. Palmer, J. Wilhelm und F. Sherman. (1979) Phenotypic suppression of nonsense mutants in yeast by aminoglycoside antibiotics. Nature 277, 148–150.
    • S.V. Paushkin, V.V. Kushnirov, V.N. Smirnov und M.D. Ter-Avanesyan (1997a). In Vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. Science 277, 381–383.
    • S.V. Paushkin, V.V. Kushnirov, V.N. Smirnov und M.D. Ter-Avanesyan (1997b). Interaction between yeast Sup45p(eRF1) and Sup35p(eRF3) polypeptide chain release factors: Implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell. Biol. 17, 2798–2805.
    • H.A. Perlick, S.M. Medghalchi, F.A. Spencer, R.J. Kendzior Jr. und H.C. Dietz. (1996) Mammalian orthologues of a yeast regulator of nonsense-transcript stability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10928–10932.
    • M.D. Rose, D.F. Winston und P. Hieter. (1990) Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
    • F. Rozen, I. Edery, K. Meerovitch, T.E. Dever, W.C. Merrick, N. Sonenberg. 1990. Bidirectional RNA helicase activity of eukaryotic translation initiation factors 4A and 4F. Mol. Cell. Biol. 10:1134–1144.
    • M.J. Ruiz-Echevarria, K. Czaplinski und S.W. Peltz. (1996) Making sense of nonsense in yeast. TIBS 21, 433–438.
    • M.J. Ruiz-Echevarria und S.W. Peltz (1996). Utilizing the GCN4 leader region to investigate the role of the sequence determinants in nonsense-mediated mRNA decay. EMBO J. 15, 2810–2819.
    • R.H. Scheistl und R.D. Geitz. (1989) High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr. Genetics 16:339–346.
    • A. Singh, D. Ursic und J. Davies. 1979. Phenotypic suppression and misreading Saccharomyces cerevisiae. Nature. 277, 146–148.
    • I. Stansfield, C.M. Grant, Akhmaloka und M.F. Tuite. (1992) Ribosomal association of the yeast SAL4(SUP45) gene product: implications for its role in translation fidelity and termination. Mol. Microbiol. 6, 3469–3478.
    • J.M. Song und S.W. Liebman. 1987. Allosuppressors that enhance the efficiency of omnipotent suppressors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 115:451–460.
    • I. Stansfield, K.M. Jones, V.V. Kushnirov, A.R. Dagakesamanskaya, A.I. Poznyakov, S.V. Paushkin, C.R. Nierras, B.S. Cox, M.D. Ter-Avanesyan und M.F. Tuite. (1995) The products of the SUP45(eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14, 4365–4373.
    • H.S. Subramanya, L.E. Bird, J.A. Brannigan und D.B. Wigley. 1996. Crystal structure of Dexx box DNA helicases. Nature. 384:379–383.
    • M. Venkatesan, L.L. Silver, N.G. Nossal. 1982. Bacteriophage T4 Gene 41 protein, required for synthesis of RNA primers, is also a DNA helicase. J. Biol. Chem. 257:12426–12434.
    • Y. Weng, K. Czaplinski und S.W. Peltz. (1996a) Genetic and biochemical characterization of the mutations in the ATPase and helicase regions of Upf1 Protein. Mol. Cell. Biol. 16, 5477–5490.
    • Y. Weng, K. Czaplinski und S.W. Peltz. (1996b) Identification and characterization of mutations in the UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex, but not mRNA turnover. Mol. Cell. Biol. 16, 5491–5506.
    • Y. Weng, K. Czaplinski und S.W. Peltz. (1998) ATP is a cofactor of the Upf1 protein that modulates its translation termination and RNA binding activities. RNA 4, 205–214.
    • Y. Weng, M.J. Ruiz-Echevarria, S. Zhang, Y. Cui, K. Czaplinski, J.D. Dinman und S.W. Peltz. (1997) Characterization of the nonsense-mediated mRNA decay pathway and its effect on modulating translation termination and programmed frameshifting. In: mRNA Metabolism and Post-transcriptional Gene Regulation. Modern Cell Biology 17, 241–263.
    • M. Winey und M.R. Culbertson. 1988. Mutations affecting the tRNA-splicing endonuclease activity of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 118:607–617.
    • G. Zhouravleva, L. Frolova, X. Le Goff, R. LeGuellec, S. Inge-Vechtomov, L. Kisselev und M. Philippe. (1995) Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3. EMBO J. 14, 4065–4072.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001
  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001

Claims (16)

  1. Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung oder eines Testagens, die bzw. das die Effizienz der Translationstermination moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkontaktbringen des MTT1-Gens oder von dessen Proteinprodukt Mtt1p (Helicase B) mit einer Testzusammensetzung oder einem Testagens unter Bedingungen, die die Bindung zwischen dem MTT1-Gen oder Mtt1p und der Testzusammensetzung ermöglichen; (b) Nachweisen einer spezifischen Bindung der Testzusammensetzung oder des Testagens an das MTT1-Gen oder Mtt1p und (c) Ermitteln, ob die Testzusammensetzung oder das Testagens das MTT1-Gen oder Mtt1p inhibiert, um eine Testzusammensetzung oder ein Testagens zu identifizieren, die bzw. das die Effizienz der Translationstermination moduliert.
  2. Verfahren zum Identifizieren einer Testzusammensetzung oder eines Testagens, die bzw. das die Bindung des MTT1-Gen-Produkts Mtt1p (Helicase B) an RNA, Polysome oder einen eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl moduliert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Inkubieren von Komponenten, die die Testzusammensetzung umfassen, und des MTT1-Gen-Produkts (Mtt1p), wobei das Inkubieren unter Bedingungen durchgeführt werden, die dazu ausreichen, das Interagieren der Komponenten zu ermöglichen; und (b) Messen der Auswirkung der Testzusammensetzung auf die Bindung des MTT1-Gen-Produkts (Mtt1p) an RNA, Polysome oder einen eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin das Identifizieren eines Gens umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Einführen einer Testzusammensetzung, die die Bindung des MTT1-Gen-Produkts (Mtt1p) moduliert, in eine Zelle in vitro; (b) Bestimmen des Phänotyps der Zelle nach (a); (c) Vergleichen des Zellphänotyps nach (a) mit dem Zellphänotyp vor (a) und (d) Identifizieren des Gens der Zelle, in die die Testzusammensetzung eingeführt wurde.
  4. Verfahren zum Nachweisen einer Störung der Nonsense-Suppression, die mit der Expression des MTT1-Proteins Mtt1p (Helicase B) zusammenhängt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe von einem Probanden, der eine Störung aufweist oder von dem vermutet wird, dass er eine Störung aufweist, mit einem Reagens, das die Expression von Mtt1p nachweist, und Nachweisen der Bindung des Reagens in der Probe umfasst.
  5. Isolierter Multiproteinkomplex, der das MTT1-Protein Mtt1p (Helicase B), humanes Upf1p-Protein, einen eukaryotischen Release-Faktor 1 (eRFI) von Peptidyl und einen eukaryotischen Release-Faktor 3 (eRF3) von Peptidyl umfasst, wobei der Komplex dahingehend wirksam ist, die Peptidyltransferaseaktivität während der Translation zu modulieren.
  6. Komplex nach Anspruch 5, der weiterhin humanes Upf3p und/oder Upf2p umfasst.
  7. Verfahren zum Modulieren der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation, das das Inkontaktbringen einer Zelle in vitro mit dem Komplex nach Anspruch 5 in einer Menge, die zum Erleichtern der Translationstermination wirksam ist, umfasst, wodurch die Peptidyltransferaseaktivität moduliert wird.
  8. Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel, das an der Peptidyltransferaseaktivität während der Translation beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkontaktbringen von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel und b) Prüfen auf Modulation des Komplexes nach Anspruch 5, wobei ein Arzneimittel, das den Komplex moduliert, an der Peptidyltransferaseaktivität beteiligt ist.
  9. Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel, das aktiv an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkontaktbringen von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel und b) Prüfen auf Modulation des Proteinkomplexes nach Anspruch 5; wobei ein Arzneimittel, das den Proteinkomplex moduliert, an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist.
  10. Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel, das an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkubieren des Arzneimittels und des Komplexes nach Anspruch 5 und b) Messen der Auswirkung auf die Nonsense-Suppression, wodurch auf ein Arzneimittel gescreent wird, das an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Assay um einen RNA-Assay oder einen ATPase-Assay handelt.
  12. Verfahren zum Screenen auf ein Arzneimittel, das die Interaktion zwischen dem MTT1-Protein Mttp1 (Helicase B) und eRF3 inhibiert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Inkontaktbringen von Zellen mit einem Kandidatenarzneimittel und b) Prüfen auf Modulation des Komplexes nach Anspruch 5, wobei ein Arzneimittel, das die Bindung von Mtt1p an eRF3 moduliert, an der Verstärkung der Translationstermination beteiligt ist.
  13. Verfahren zum Modulieren der Effizienz der Translationstermination von mRNA und/oder des Abbaus von abweichenden Transkripten in einer Zelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Bereitstellen einer isolierten Zelle, die einen Vektor enthält, der die Nukleinsäure umfasst, die den Komplex nach Anspruch 5 kodiert; oder eine Antisense davon; b) Überexprimieren des Vektors in der Zelle, um einen überexprimierten Komplex zu produzieren, um die Funktion des Komplexes zu beeinträchtigen.
  14. Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands, der mit einem Defekt in dem Komplex nach Anspruch 5 einhergeht, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle in vitro mit einer Nukleinsäure, die den Komplex nach Anspruch 5 kodiert; (b) Ermitteln des Anteils des defekten Komplexes der Zelle nach der Transfektion; (c) Vergleichen des Anteils des defekten Komplexes der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil des defekten Komplexes der Zelle vor der Transfektion.
  15. Verwendung des Komplexes nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von β-Thalassämie, β-Globin, DuchenneBecker-Muskeldystrophie, Hämophilie A, Hämophilie B, Willebrand-Jürgens-Syndrom, Osteogenesis imperfecta (OI), Brustkrebs, Eierstockkrebs, Wilms-Tumor, Hirschsprung-Krankheit, Mukoviszidose, Nierensteinen, familiärer Hypercholesterinämie (FH), Retinitis pigmentosa oder Recklinghausen-Krankheit, Retinoblastom, ATM, Kostmann-Syndrom.
  16. Verfahren zum Identifizieren eines Krankheitszustands, der mit defekten multimeren Proteinen einhergeht, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Transfizieren einer Zelle in vitro mit einem Vektor, der die Nukleinsäure umfasst, die den Komplex nach Anspruch 5 kodiert; (b) Ermitteln des Anteils von defekten multimeren Proteinen der Zelle nach der Transfektion und (c) Vergleichen des Anteils von defekten multimeren Proteinen der Zelle nach der Transfektion mit dem Anteil von defekten multimeren Proteinen der Zelle vor der Transfektion.
DE69936588T 1998-07-22 1999-07-22 Eine Subfamilie von RNA-Helicasen, die Modulatoren der Fidelität der Translationstermination sind, und Verwendungen dieser Expired - Fee Related DE69936588T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12043598A 1998-07-22 1998-07-22
US120435 1998-07-22
PCT/US1999/016802 WO2000005586A2 (en) 1998-07-22 1999-07-22 Rna helicases modulating translation termination

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69936588D1 DE69936588D1 (de) 2007-08-30
DE69936588T2 true DE69936588T2 (de) 2008-04-17

Family

ID=22390262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69936588T Expired - Fee Related DE69936588T2 (de) 1998-07-22 1999-07-22 Eine Subfamilie von RNA-Helicasen, die Modulatoren der Fidelität der Translationstermination sind, und Verwendungen dieser

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1098905B1 (de)
JP (1) JP2002524719A (de)
KR (1) KR20010083141A (de)
AT (1) ATE367399T1 (de)
AU (1) AU5228699A (de)
CA (1) CA2338312A1 (de)
DE (1) DE69936588T2 (de)
ES (1) ES2291037T3 (de)
MX (1) MXPA01000826A (de)
WO (1) WO2000005586A2 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6458538B1 (en) * 1999-12-14 2002-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay
JP2004528825A (ja) * 2000-11-02 2004-09-24 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 核酸修飾酵素
US7608704B2 (en) 2000-11-08 2009-10-27 Incyte Corporation Secreted proteins

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5679566A (en) * 1995-01-20 1997-10-21 University Of Massachusetts Medical Center Yeast NMD2 gene
WO1997040855A1 (en) * 1996-04-29 1997-11-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Mammalian regulator of nonsense-mediated rna decay
CA2329267C (en) * 1998-05-28 2013-01-22 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey A method of modulating the efficiency of translation termination and degradation of aberrant mrna involving a surveillance complex comprising human upflp, eucaryotic release factor 1 and eucaryotic release factor 3

Also Published As

Publication number Publication date
ATE367399T1 (de) 2007-08-15
ES2291037T3 (es) 2008-02-16
KR20010083141A (ko) 2001-08-31
WO2000005586A2 (en) 2000-02-03
CA2338312A1 (en) 2000-02-03
MXPA01000826A (es) 2002-04-08
DE69936588D1 (de) 2007-08-30
JP2002524719A (ja) 2002-08-06
AU5228699A (en) 2000-02-14
WO2000005586A3 (en) 2000-04-20
EP1098905B1 (de) 2007-07-18
EP1098905A2 (de) 2001-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Guziewicz et al. Molecular consequences of BEST1 gene mutations in canine multifocal retinopathy predict functional implications for human bestrophinopathies
AU3789393A (en) Dna encoding taurine and gaba transporters and uses thereof
US6225115B1 (en) DNA encoding taurine and GABA transporters and uses thereof
US20070059684A1 (en) Method of identifying an antiviral agent
EP1141005B1 (de) Verfahren zur identifikation von modulatoren von hif-1-alpha
JP4889150B2 (ja) ヒトＵＰＦ１Ｐ、真核性終結因子１および真核性終結因子３を含む監視複合体を必要とする異常なｍＲＮＡの翻訳終結および分解の効率を調整する方法
US6436654B1 (en) Methods for identifying compounds that modulate HIF-1α
DE69936588T2 (de) Eine Subfamilie von RNA-Helicasen, die Modulatoren der Fidelität der Translationstermination sind, und Verwendungen dieser
AU700405B2 (en) Origin of replication complex genes, proteins and methods
US6989256B2 (en) Subfamily of RNA helicases which are modulators of the fidelity of translation termination and uses thereof
DE69631041T2 (de) Promotor des utrophingens
WO1997012617A9 (en) Proteins involved in targeting of peptidyl transfer center, and corresponding therapeutic agents and methods
DE69933785T2 (de) Peptide enthaltend eine cholesterin-erkennungssequenz und deren verwendungen
DE60024862T2 (de) "insulinabhängiges sequenz dna bindendes protein-1" (irsdbp-1), dafür kodierendes gen und ihre verwendungen
DE69636675T2 (de) PROTEINE, DIE MIT mRNA-EXPRESSION UND -STABILITÄT EINBEGRIFFEN SIND UND TESTS FÜR AGENTIEN, DIE IHRE FUNKTION BEEINFLUSSEN.
AU3504301A (en) Proteins involved in targeting of peptidyl transfer center and corresponding therapeutic agents and methods
DE10228187A1 (de) Testsystem zum Nachweis von Krebserkrankungen
WO2004072111A2 (de) Therapeutische und diagnostische apoptoseinduktoren
EP1252310A2 (de) Mlp-gen, nukleinsäuren, polypeptide und deren verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee