DE69636675T2

DE69636675T2 - PROTEINE, DIE MIT mRNA-EXPRESSION UND -STABILITÄT EINBEGRIFFEN SIND UND TESTS FÜR AGENTIEN, DIE IHRE FUNKTION BEEINFLUSSEN.

Info

Publication number: DE69636675T2
Application number: DE69636675T
Authority: DE
Inventors: W. Stuart Piscataway PELTZ; D. Jonathan North Brunswick DINMAN; Ying Plainsboro CUI
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2016-10-05
Also published as: DE69636675D1; ATE344037T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von Proteinen, die am mRNA-Leserastersprung (Frameshift) und Nonsense-mRNA-Zerfallsweg beteiligt sind, sowie RNAs, die rekombinante Gene exprimieren, mit erhöhter In-vivo-Stabilität. Die Identifizierung dieser Proteine und stabilisierten RNAs stellt In-vitro-Assaysysteme zum Identifizieren von Agentien, die die funktionelle Aktivität von mRNAs durch Modifizieren der Leserastersprungfrequenz beeinflussen, bereit. Solche Agentien werden nützliche antivirale oder antimikrobielle Arzneimittel sein. Die vorliegenden Assaysysteme stellen weiterhin die Identifizierung von Agentien, die die RNA-Stabilität beeinflussen, bereit. Solche Agentien werden zum Behandeln von Erkrankungen, die mit Nonsense-Mutationen assoziiert sind, nützlich sein. Es werden außerdem stabilisierte Antisense-RNAs und stabilisierte mRNAs, die Peptide kodieren, zur Verwendung in Zwei-Hybrid-Ligandenassaysystemen bereitgestellt.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
RNA-Turnover und ribosomaler Leserastersprung
Viele Studien haben gezeigt, dass die mRNA-Turnover- und Translationsprozesse direkt miteinander verbunden sind [Peltz et al., Prog. Nucl. Acid Res. & Mol. Biol. 47:271-298 (1994)]. Ein deutliches Beispiel der Beziehung zwischen Translation und mRNA-Turnover ist die Beobachtung, dass Nonsense-Mutationen in einem Gen die Stabilität von Nonsense-enthaltenden Transkripten verringern können [Peltz et al., Prog. Nucl. Acid Res. & Mol. Bio1. 47:271-298 (1994)]. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist zum Identifizieren und Charakterisieren der Transkriptionsfaktoren, die am Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg beteiligt sind. Mutationen in den UPFI-, UPF2- und UPF3-Genen heben die Konzentration von Nonsense-enthaltenden mRNAs in Zellen an, indem sie deren Halbwertzeiten erhöhen, ohne den Zerfall der meisten Wildtyp-Transkripte zu beeinflussen [Leeds et al., Genes & Dev. 5:2303-2314 (1991); Leeds et al., Mol. Cell. Biol. 12:2165-2177 (1992); Peltz et al., Genes & Dev. 7:1737-1754 (1993); Hagan et al., Mol. Cell. Biol. 15:809-823 (1995); Cui et al., Genes & Dev. 9:437-454 (1995); He et al., Genes & Dev. 9:437-454 (1995)]. Das Upf1p funktioniert nicht nur im Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg, sondern weist außerdem trennbare Funktionen auf, die an der Modulierung von Nonsense und der Leserastersprung-Suppression beteiligt sind, was nahe legt, dass diese Prozesse eng miteinander verbunden sind und ähnliche Komponenten gemein haben können.
Neben dem Translationsapparat, der Nonsense-Transkripte stabilisieren und Nonsense- und Leserastersprungsmutationen unterdrücken kann, haben sich Mechanismen entwickelt, die die Genexpression regulieren, indem sie sich verlängernde Ribosome dazu veranlassen, das Leseraster als Antwort auf spezifische Signale des ribosomalen Leserastersprungs zu verschieben [Chandler et al., Mol. Microbiol. 7:497-503 (1993); Farabaugh et al., J. Biol. Chem. 270:10361-10364 (1995); Hayashi et al., Biochem. J. 306:1-10 (1995)]. Leserastersprungereignisse bringen Fusionsproteine hervor, in denen die N- und C-terminalen Domänen von zwei unterschiedlichen, überlappenden offenen Leserastern kodiert werden. Der ribosomale Leserastersprung unterscheidet sich von der Leserastersprung-Suppression darin, dass diese Ereignisse von spezifischen mRNA-Sequenzen und -Strukturen gesteuert werden, anstatt eine Folge von Mutationen in den Wirtsgenprodukten zu sein.
Viraler Leserastersprung
Die meisten Beispiele ribosomalen Leserastersprungs sind in Viren identifiziert worden, die alle ihre RNA(+)-Stränge als: 1) mRNAs, die mehrere Proteinprodukte kodieren, 2) die RNA-Spezies, die in entstehende Viruspartikel verpackt wird, und 3) die Matrize zur Replikation des viralen genetischen Materials verwenden. Die Produktion mehrerer Proteinprodukte könnte mittels mRNA-Spleißen oder -Editierung erzielt werden. Diese Mechanismen könnten jedoch die Auswirkung der Produktion modifizierter RNA(+)-Stränge aufwerfen, die in der Produktion mutierter viraler Genome resultiert, es sei denn, dass das Spleißen oder die Editierung eine RNA-Stelle entfernte, die zur Verpackung und Replikation der genomischen RNA benötigt wird. Aus diesem Grund sind (+)ss- RNA- und -dsRNA-Viren vielleicht nicht dafür bekannt, Spleißen oder mRNA-Editierung zu verwenden, und Retroviren entfernen ihre Verpackungsstelle (Ψ), wenn sie ihre RNAs spleißen [Mann et al., Cell 33:153-159 (1983); Wantanabe und Temin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5986-5990 (1982)]. Durch Verwendung von ribosomalem Leserastersprung und/oder Überlesen von Terminationskodons, um Fusionsproteine herzustellen, werden RNA(+)-Strangmatrizen nicht modifiziert und somit wird die Produktion und Verpackung von mutierten viralen Genomen verhindert [Icho und Wicker, J. Biol. Chem. 264:6716-6723 (1989)].
Zum Beispiel besteht das Killervirussystem in Hefe aus den doppelsträngigen L-A- und M₁-RNA-Viren und nutzt den programmierten ribosomalen –1-Leserastersprung zur adäquaten Genexpression [R.B. Wickner, J. Biol. Chem, 268:3797-3800 (1993)]. Das dsRNA-L-A-Virus weist zwei offene Leseraster auf. Das 5'-gag kodiert das Gag-Protein und das 3'-pol-Gen kodiert eine multifunktionelle Proteindomäne, die zur Verpackung von viraler RNA benötigt wird [R.B. Wickner, J. Biol. Chem, 268:3797-3800 (1993)]. Ein Ereignis eines ribosomalen –1-Leserastersprungs zeichnet für die Produktion des Gag-Pol-Fusionsproteins verantwortlich. M₁, ein Satelliten-dsRNA-Virus von L-A, das ein sezerniertes Killertoxin kodiert [R.B. Wickner, J. Biol. Chem, 268:3797-3800 (1993)], wird eingekapselt und unter Verwendung der Genprodukte, die vom L-A-Virus synthetisiert wurden, repliziert. Frühere Ergebnisse haben demonstriert, dass Mutationen, die die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung des L-A-Virus modifizieren, das Verhältnis von synthetisiertem Gag zu Gag-Pol ändern und den Verlust des M₁-Satellitenvirus verursachen [Dinman et al., J. Virol. 66:3669-3676 (1992); Dinman et al., Genetics, 136:75-86 (1994)].
Leserastersprungmechanismen
Ribosomaler Leserastersprung in der –1-Richtung in Retroviren, (+)ssRNA-Viren und -dsRNA-Viren erfordern eine spezielle Sequenz, X XXY YYZ (das 0-Raster ist durch Leerzeichen angezeigt), die als „slippery site" (rutschige Stelle) bezeichnet wird [Jacks und Varmus, Science 230:1237-1242 (1985)]. Das gleichzeitige Rutschen von ribosomgebundenen tRNAs an der A- und der P-Stelle um eine Base in der 5'-Richtung hinterlässt dennoch ihre nicht wackligen Basen im neuen Leseraster korrekt gepaart. Ein zweites förderndes Element [Jacks et al., Cell 55:447-458 (1988)], für gewöhnlich ein RNA-Pseudoknoten, ist direkt 3' zu der „slippery site" angeordnet [Brow und Geiduschek, J. Biol. Chem. 262:13953-13958 (1987); Dinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:174-178 (1991); TenDam et al., Biochemistry 31:11665-11676 (1992)]. Der mRNA-Pseudoknoten veranlasst das Ribosom, über der „slippery site" zu pausieren, und es wird geglaubt, dass er die Wahrscheinlichkeit einer ribosomalen Bewegung am 5'-Ende erhöht [Somogyi et al., Mol. Cell. Biol. 13:6931-6940 (1993); Tu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8636-8640 (1992)]. Die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung kann von der Fähigkeit der ribosomgebundenen tRNAs, die Paarung mit dem 0-Raster aufzubrechen, der Fähigkeit dieser tRNAs, erneut ein Paar mit dem –1-Raster zu bilden, der relativen Position des RNA-Pseudoknotens zu der „slippery site" und seiner thermodynamischen Stabilität beeinflusst werden [Brierly et al., J. Mol. Biol. 227:463-479 (1992); Brierly et al., J. Mol. Biol. 227:463-479 (1991); Brow et al., (1987) oben; Dinman et al., (1991) oben; Dinman und Wickner, J. Virology 66:3669-3676 (1992); Jacks et al., (1988) oben; Morikawa und Bishop, Virology 186:389-397 (1992)]. Ortsgerichtete In-vitro-Mutagenese ist dazu verwendet worden, die „slippery site" und den mRNA-Pseudoknoten zu untersuchen. Die mRNA-Pseudoknotenstruktur ist für den effizienten ribosomalen –1-Leserastersprung im L-A-Virus von Hefe erforderlich [Dinman et al., (1991) oben; Dinman et al., (1992) oben].
Ein Screening auf Mutationen, die die Effizienzen von programmierten ribosomalen –1-Leserastersprüngen in Zellen steigerten, identifizierte neun chromosomale Mutanten, die mof genannt wurden (für Maintenance Of Frame (Erhaltung des Leserasters)) [Dinman et al., J. Virol. 66:3669-3676 (1992); Dinman et al., Genetics 136:75-86 (1994)]. Das ursprünglich zum Identifizieren der mof-Mutanten verwendete Screening nutzte ein Konstrukt, in dem das lacZ-Gen stromabwärts des Signals eines ribosomalen –1-Leserastersprungs von L-A und in Bezug auf eine Translationsstartstelle in dem –1-Leseraster inseriert wurde. Der Assay auf mof-Mutanten beruhte auf der Identifizierung von Zellen mit stärkeren β-Galactosidase-Aktivitäten als Folge einer gesteigerten Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung. Der in diesem Screening verwendete mRNA-Reporter weist eine kurze (ungefähr 100 nt) proteinkodierende Region 5' zu der Leserastersprungstelle auf, auf die eine ungefähr 3,1 kb lange lacZ-mRNA folgt, die in Bezug auf das offene Leseraster am 5'-Ende außerhalb des Leserasters liegt. Folglich ist es denkbar, dass der Translationsapparat das berichtete Transkript als eine abweichende Nonsense-enthaltende mRNA ansehen kann. So betrachtet kann die in mof-Stämmen beobachtete erhöhte β-Galactosidase-Aktivität aus Mutationen resultieren, die Nonsense-enthaltende Transkripte stabilisieren. Folglich untersuchen die hier dargelegten Versuche die Phänotypen der mof-Mutanten des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls und setzen diesen Phänotyp zu der Fähigkeit, den Killerphänotyp zu erhalten, in Beziehung.
Die Anführung eines beliebigen Literaturhinweises hierin sollte nicht als eine Anerkennung aufgefasst werden, dass ein solcher Literaturhinweis als „Stand der Technik" zur der augenblicklichen Anmeldung verfügbar ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In ihrem ersten Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die aus Anisomycin, Sparsomycin oder Paromomycin ausgewählt ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen, die von Viren verursacht wurden, unter Anwendung von ribosomalem –1-Leserastersprung. Vorzugsweise handelt es sich bei der Virusinfektion um eine HIV-Infektion.
Wie in den Beispielen in der Anlage veranschaulicht, wurde das mof4-1-Allel als UPF1 von Saccharomyces cerevisiae identifiziert und von dem Protein UPF1 wurde festgestellt, dass es die mof4-1-Mutation komplementiert. Folglich ist UPF1 als ein mit dem mRNA-Leserastersprung assoziiertes Protein identifiziert. Die mof4-1-Mutation ist mit einem Anstieg der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung von viraler mRNA assoziiert.
Darüber hinaus wurde mof2-1 als ein Allel des Gens sui1 identifiziert, das das Protein SUI1 kodiert (Castilho-Valavicius et al., 1990, Genetics 124:483-495; Yoon und Donahue, 1992, Mol. Cell. Biol. 12:248-260). Dieses Protein hat ein menschliches Homologon (Fields und Adams, 1994, Biochem. Biophys. Research Commun. 198:288-291; Kasperaitis et al., 1995, FEBS Lett. 365:47-50). Es wurde festgestellt, dass das menschliche Homologon von SUI1 die mof2-1-Mutation in S. cerevisiae komplementieren kann, wodurch eine Rolle für sowohl die Hefe- als auch die menschlichen Proteine beim ribosomalen Leserastersprung viraler mRNA bestätigt wird.
Es wird außerdem die Identifizierung von mof5-1 als ein Allel des PRP19-Gens (auch als CDC40 bekannt) beschrieben (Jones et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Vaisman et al., Mol. Gen. Genetics, 247:123-136; Vijayraghavan et al., 1989, Genes & Dev. 3:1206-1216).
Die Identifizierung dieser Gene stellt die Auswahl und Prüfung von Agentien, die die Effizienz von ribosomalem Leserastersprung beeinflusst, bereit. Agentien, die die ATPase-Aktivität, Helikase-Aktivität oder Zinkfingermotiv-Konfiguration beeinträchtigen, können zur Prüfung ausgewählt werden. Solche Agentien können nützliche Arzneimittel zum Behandeln von Virusinfektionen sein, da viele Retroviren, insbesondere HIV, Coronaviren und andere RNA-Viren, die mit medizinischen und tiermedizinischen Pathologien assoziiert sind. Durch Bereitstellung der Identität von Proteinen, die Leserastersprungereignisse modulieren, kann ein anfängliches Screening auf Agentien ein Bindungsassay auf solche Proteine beinhalten. Die Fähigkeit eines bindenden Agens, die Leserastersprungeffizienz zu beeinflussen, kann in vitro gemessen werden, z. B. mit einem Killer-Assay, wie im Beispiel in der Anlage beschrieben (Dinman und Wickner, 1992, J. Virol. 66:3669-3676). Dieser Assay kann zum Prüfen der Wirksamkeit von Agentien auf die Aktivität von mit Leserastersprüngen assoziierten Proteinen aus menschlicher sowie Hefe- oder einer anderen nicht menschlichen Quelle, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Tiere, eingesetzt werden.
Agentien, die die Effizienz von Leserastersprung entweder steigern oder senken, modifizieren das Verhältnis von Gag zu Gag-Pol-Proteinen, die von Virusgenen exprimiert werden. Ein Anstieg dieses Verhältnisses außerhalb eines engen Bereichs beeinträchtigt den Assembly-Prozess von Viruspartikeln, da zu viel Gag-Pol verfügbar ist. Eine Abnahme dieses Verhältnisses resultiert in der Unterdrückung (Suppression) der Virusreplikation, da das Niveau der pol-Expression zu gering ist. Bei jedem Ereignis ist das Endergebnis eine Störung der Produktion von Viruspartikeln. In einer spezifischen Ausführungsform sind Antibiotika, die die Leserastersprünge steigern oder verringern, gegen HIV wirksam.
Von UPF1 wird festgestellt, dass es am mRNA-Zerfallsprozess und dem Allel von UPF1, das in mit mof4-1 stabilisierter Nonsense-mRNA vorgefunden wird, beteiligt ist.
Es wird ein Screening-Assay zur Identifizierung von Agentien, die die Funktion von Proteinen beeinflussen, die am Nonsense-mRNA-Zerfallsweg beteiligt sind, offenbart. Solche Agentien können auf die Fähigkeit, Nonsense- oder kurze mRNA-Transkripte zu stabilisieren, geprüft werden. Die Identifizierung eines Proteins, das an diesem Weg beteiligt ist, ermöglicht eine rationale Auswahl solcher Agentien. Viele Assays auf Nonsense-vermittelten Zerfall sind in der Technik bekannt (Zhang et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15:2231-2244; Hagan et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15:809-823; Peltz et al., 1994, in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 47:271-298). Agentien, die die ATPase-Aktivität, Helikase-Aktivität oder Zinkfingermotiv-Konfiguration beeinträchtigen, können zur Prüfung ausgewählt werden.
Eine weitere Entdeckung der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass rekombinante Gene zur Expression von mRNA, insbesondere zur Leserastersprunganalyse, artifizielle Ergebnisse ergeben können, da das Reportertranskript 5' zu der Leserastersprungstelle zu kurz sein kann und daher von der Abbaumaschinerie als ein abweichendes Transkript erkannt wird. In diesem Fall kann eine gesteigerte Aktivität des Gens in der Leserastersprungstelle das Ergebnis von Mutationen sein, die die Nonsense-enthaltenden Transkripte stabilisieren, anstatt die Leserastersprungeffizienz zu steigern. Die vorliegende Erfindung hat vorteilhafterweise dieses Problem zum ersten Mal identifiziert und stellt folglich Strategien zum Überwinden des schnellen Abbaus von kurzen Transkripten, die vom Translationsapparat als abweichende Nonsense-enthaltende mRNA erkannt werden, bereit.
Dieses letztere Ergebnis hat bedeutende Auswirkungen auf eine Reihe verschiedener Technologien. Zum Beispiel kann die Identifizierung von Agentien, die den Zerfallsweg inhibieren oder Nonsense-Transkripte stabilisieren, für den Erfolg der Antisense-RNA-Technologie wichtig sein. Antisense-RNAs sind kleine, diffusionsfähige, untranslatierte und stark strukturierte Transkripte, die mit spezifischen Ziel-RNAs an Komplementaritätsregionen Paare bilden, wodurch die Ziel-RNA-Funktion oder -Expression kontrolliert wird. Versuche, Antisense-RNA-Technologie anzuwenden, haben jedoch nur eingeschränkten Erfolg gehabt. Der einschränkende Faktor scheint im Erzielen ausreichender Konzentrationen der Antisense-RNA in einer Zelle, um die Expression des Zielgens zu inhibieren oder zu verringern, zu liegen. Es ist wahrscheinlich, dass ein Hindernis beim Erzielen einer ausreichenden Konzentration der Nonsense-Zerfallsweg ist, da die kurzen Antisense-RNA-Transkripte, denen nicht zugedacht ist, ein Genprodukt zu kodieren, wahrscheinlich zu einer schnellen Translationstermination, wenn eine Translation erfolgt, und demzufolge zu einem schnellen Abbau und einer geringen Abundanz der Antisense-RNA in der Zelle führen werden. Folglich können die Agentien, die abweichende mRNA-Transkripte stabilisieren, auch Antisense-RNAs stabilisieren.
Die Fähigkeit, Nonsense-mRNA zu stabilisieren, hat bedeutende Auswirkungen auf das Behandeln von Erkrankungen, die mit Nonsense-Mutationen assoziiert sind, wie Thalassämie. Wie bei jedem biologischen System wird ein geringes Ausmaß an Suppression einer Nonsense-Mutation vorliegen, was in der Expression eines vollständigen Proteins (das eine Aminosäurensubstitution oder -deletion enthalten kann oder auch nicht) resultiert. Im natürlichen Zustand werden so geringe Mengen vollständigen Proteins produziert, dass daraus eine Pathologie resultiert. Durch Stabilisieren der Nonsense-mRNA wird die Wahrscheinlichkeit von „überlesenen" Transkripten drastisch erhöht und kann ausreichend Expression des Proteins ermöglichen, um den pathologischen Phänotyp zu überwinden.
Die Fähigkeit, kurze RNA-Transkripte zu stabilisieren, wird auch beim Entwickeln von Zwei-Hybrid-Systemen helfen, um Proteine, die interagieren, genetisch zu identifizieren. Zum Beispiel können verschiedene Peptide, die mit Proteinzielen interagieren, geprüft werden, wenn mRNAs, die solche Peptide kodieren, stabilisiert werden können, um die Translation zu ermöglichen. RNAs, die kleine Peptidbibliotheken kodieren, werden instabil und durch den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg bei Fehlen eines Agens, um sie zu stabilisieren, abgebaut.
Alternativ können Stämme, die den Zerfallsweg inaktivieren und abweichende RNA stabilisieren, nützliche Screening-Systeme für Zwei-Hybrid-Systeme sein, da die natürliche Tendenz solcher Stämme darin besteht, mRNAs zu stabilisieren.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Das „integrierte" Modell des ribosomalen –1-Leserastersprungs. (A) stellt bildlich dar, wie ribosomaler –1-Leserastersprung mit den Stadien der Translationselongation in Beziehung steht. (B) stellt bildlich dar, wie Tyl-vermittelter ribosomaler +1-Leserastersprung mit der Translationselongation in Beziehung steht.
2. Charakterisierung der mRNA-Abundanz von Nonsense-enthaltenden mRNAs in mof-Stämmen. A) Die mRNA-Abundanz für den CYH2-Vorläufer und CYH2-mRNA wurden mittels RNA-Blot-Analyse von RNAs aus Stämmen, die das MOF⁺ (WT), das UPF1⁺ (WT), das upf1^– und die acht verschiedenen mof-Allele beherbergen, bestimmt. Der RNA-Blot, der 20 μg RNA pro Spur enthält, wurde mit einer radioaktiv markierten CYH2-Sonde hybridisiert. Eine schematische Darstellung des CYH2-Vorläufers und dessen gespleißten Produkten ist unter dem Audioradiogramm gezeigt. B) Die mRNA-Abundanz für das Wildtyp-PGK1-Transkript und Nonsense-enthaltende Mini-PGK1-mRNA wurden mittels RNA-Blot-Analyse von RNAs aus Stämmen, die das MOF⁺ (WT), das mof4-1 und das upf1-2 beherbergen, bestimmt. Der RNA-Blot wurde mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment des PGK1-Gens hybridisiert. Schematische Darstellungen des Nonsense-enthaltenden Mini-PGK1-Allels und des Wildtyp-PGK1-Gens sind rechts vom Audioradiogramm gezeigt. C) Der mof4-1-Stamm wurde mit Centromerplasmiden, die nur den Vektor enthalten und entweder das UPF1- oder das UPF2-Gen beherbergen, und den diploiden Zellen von mof4-1, das mit einem upf1Δ-Stamm gekreuzt ist, transformiert. Die mRNA- Abundanz des CYH2-Vorläufers wurde mittels RNA-Blot-Analyse bestimmt, wie in (A) beschrieben.
3. Der Killerphänotyp und die Erhaltung von M₁-Kosegregat mit mof4-1. Es wurde eine Tetradenanalyse von einer Kreuzung (Kreuzung JD830) zwischen einem mof4-1-Stamm (JD474-3D), der entweder den Killerphänotyp (K^–) oder die doppelsträngige M₁-RNA (M_1–) nicht erhält, mit einem Wildtypstamm (JD742-2D, M+K+) durchgeführt. Beide Elternstämme enthielten das chromosomal integrierte LacZ-Gen-Frameshift-Konstrukt (leu2-1::pJD85; [Dinman und Wickner, Genetics, 136:75-86 (1994)]). Die Sporen von jeder Tetrade wurden auf ihre β-Galactosidase-Aktivität, ihren Killerphänotyp und ihre Fähigkeit, die doppelsträngige M₁-RNA zu vermehren, geprüft, wie in den Materialien und Verfahren beschrieben. Die β-Galactosidase-Aktivität (Y-Achse) für jeden Satz von Tetraden (X-Achse) sowie die Fähigkeit jeder der Sporen, entweder den Killerphänotyp (K+/K^–) oder die doppelsträngige M₁-RNA (M₁+/M_1–) zu erhalten, sind gezeigt.
4. Identifizierung und Charakterisierung der Läsion im mof-4-1-Allel. Es wurden Hybridgene zwischen dem Wildtyp-UPF1 und den mof4-1-Allelen, die in Feld A schematisch dargestellt sind, konstruiert und zu einem upf1Δ-Stamm transformiert und die CYH2-Vorläufer-Abundanz wurde mittels RNA-Blot-Analyse bestimmt, wie in 1 beschrieben. Ein Autoradiogramm dieser Analyse ist in Feld B gezeigt. Das schwarze Rechteck in Feld A stellt Sequenzen aus dem Wildtyp-UPF1-Gen dar, während das schraffierte Rechteck Sequenzen aus dem mof4-1-Allel darstellt. Die an Cystein reiche Region des UPF1-Gens wird von einem grauen Rechteck in dem Wildtyp-UPF1-Gen dargestellt. Die dunkle vertikale Linie stellt die Stelle der Mutation innerhalb des mof4-1-Allels dar. Das mof4-1-Allel wurde sequenziert und die Sequenzänderung ist gezeigt. Für jedes in Feld A gezeigte Hybridallel wurden zwei identische Konstrukte aus verschiedenen PCR-Reaktionen hergestellt und in Feld B mit dem tiefgestellten Index 1 oder 2 bezeichnet. Die in Feld A dargestellten Restriktionsendonukleasen: E1 (ECorRI), Bst (BstXI), Asp (Asp718), B1 (BamH1).
5. A) Klonierungsstrategie zum Klonieren von mof2-1. B) Sequenzanalyse zum Identifizieren der Mutation im mof2-1-Allel.
6. Klonierungsstrategie zum Klonieren von mof5-1.
7. Weder mof2-1 noch sui1-1 reprimieren die GCN4-Expression. Mit pSUI1, pmof2-1, psui1-1 oder PHUISOSUI1 transformierte isogene sui1Δ-Stämme wurden mit gemeinsam mit den folgenden Reporterplasmiden transformiert. pGCN4 = Enthält die PCN4-Upstream-Kontrollregion plus die ersten 10 Aminokodons des GCN4-Strukturgens, das mit dem lacZ-Gen fusioniert ist. pORF1 enthält nur das erste GCN4-Upstream-ORF (uORF) und die AUGs der anderen ORFs wurden deletiert. In pFG-lacZ ist uORF1 „in-frame" mit der GCN4-lacZ-Fusion fusioniert. Die Zellen wurden über Nacht in Selektivmedium gewachsen, auf die mid-Log-Phase verdünnt und weitere 2 Stunden gewachsen. Die Kulturen wurden aufgeteilt und 3-Aminotriozol wurde zugegeben, wodurch die GCN4-Expression dereprimiert wurde. Nach 6 Stunden wurden die β-Galactosidase-Aktivitäten bestimmt. Die Verhältnisse der β-Galactosidase-Aktivitäten von dereprimierten Zellen zu reprimierten Zellen sind gezeigt. Es gibt keine bedeutenden Unterschiede bei diesen Verhältnissen zwischen dem Wildtyp und den mof2-1-, sui1-1- oder HUISOSUI1-Zellen.
8. Selektivmedium (H-trp), das die angegebenen Konzentrationen von Anisomycin (A, C) oder Sparsomycin (B, D) enthält, wurde auf eine O.D.₅₅₀ von 0,200 JD88-Zellen, die die Plasmide pTI25 (0-Raster-Kontrolle), pF8 (von L-A abgeleiteter Testpartner auf ribosomalen –1-Leserastersprung) [Jimenez et al., Biochem. Biophys. Acta 383:427 (1975)] oder pJD104 (von Tyl abgeleiteter Testpartner auf ribosomalen +1-Leserastersprung) [Balasundram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:172 (1994)] beherbergen, inokuliert und 5 Std. bei 30 °C inkubiert, woraufhin die β-Galactosidase-Aktivitäten (β-gal-Aktivitäten) bestimmt wurden. (A, B) Die von pTI25 hervorgerufenen β-gal-Aktivitäten als ein Prozentanteil der Kontrollen ohne Arzneimittel. (C, D) Die Faltungsveränderungen der ribosomalen –1- oder +1-Effizienzen im Vergleich zu den Kontrollen ohne Arzneimittel (–1 = 1,8 %; +1 = 5,5 %).
9. 1906-Zellen (MATa leu2 mak8-2 K^– MKT⁺), die entweder pJD136.0 oder pJD136.-1 (LEU2 CEN-Vektoren, in die die HindIII-Fragmente aus entweder pTI25 oder pFB, die entweder die 0-Raster-Kontrolle oder Indikatorfragmente für ribosomalen –1-Leserastersprung enthalten, kloniert wurden) beherbergen, wurde auf eine O.D.₅₅₀ in H-Leu-Medium, das die angegebenen Konzentrationen von Anisomycin oder Sparsomycin enthält, inokuliert und 5 Std. bei 30 °C inkubiert, woraufhin die β-Galactosidase-Aktivitäten (β-gal-Aktivitäten) bestimmt wurden. (A, B) Wie oben für 8A und 8B beschrieben. (C, D) Die Ordinate stellt die tatsächlichen Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung bildlich dar.
10. Wie in 8 beschrieben, wurden JD88-Zellen in H-trp-Medium, das die angegebenen Konzentrationen von Arzneimitteln enthält, verwendet und die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung wurden nach 5 Stunden Inkubation bei 30 °C bestimmt.
11. JD88-Zellen wurden in reichem Medium, das die angegebenen Konzentrationen von entweder Anisomycin (A) oder Sparsomycin (B) enthält, kultiviert. Nach 24, 48, 72, 96 oder 120 Std. wurden Aliquots von Zellen entnommen, zweimal mit sterilem Wasser gewaschen, auf reichem Medium ausgestrichen und bei 30 °C zu einzelnen Kolonien gewachsen. Diese wurden dann auf Indikatorplatten replikaplattiert und im Hinblick auf ihre Killerphänotypen bewertet. Der Verlust des Killerphänotyps wurde gemessen, indem die Anzahl der Nicht-Killer-Kolonien (K^–-Kolonien) durch die Gesamtzahl der Kolonien geteilt wurde. Jeder Datensatz entspricht > 100 Kolonien insgesamt.
12. (A) Eine einzige Nicht-Killer-Kolonie (K^–-Kolonie) aus jeder Arzneimittelkonzentration in dem 72-Std.-Datensatz wurde wahllos ausgewählt und die Gesamtnukleinsäuren (total nucleic acids, TNA) wurden extrahiert [Dinman und Wickner, Virology 66:3669 (1992)]. Ungefähr gleiche Mengen von TNA wurden durch ein 1%-iges nichtdenaturierendes TAE-Agarosegel getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die 4,6 kb langen L-A- und L-BC- und die 1,8 kb langen M₁-dsRNA-Banden sind angezeigt. (B) RNA wurde in dem in (A) gezeigten Gel denaturiert, auf Nitrocellulose übertragen und mit mit [³²P]CTP markierten L-A- und M₁(+)-Strang- RNA-Sonden hybridisiert, wie in [Dinman und Wickner, Genetics 136:75 (1994)] beschrieben.
13. Ribosomaler –1-Leserastersprung in vitro. Ein auf Luciferase basierendes Reportersystem wurde auf Basis von pT7-LUC minus 3'UTR-A₅₀ konstruiert [Gallie et al., Mol. Gen. Genet. 288:258 (1991)] (hier als pLUC0 bezeichnet). Das Plasmidkonstrukt zum Test auf ribosomalen –1-Leserastersprung (pJD120, hier als pLUC-1 bezeichnet) enthält (5'-Ende zu 3'-Ende) ein AUG-Initiationskodon, ein Signal eines ribosomalen –1-Leserastersprungs von L-A (aus pF8), gefolgt von der Luciferase-DNA, die in Bezug auf das Initiationskodon im –1-Leseraster ist. Mit einem Methyl-⁷pppG-Cap versehene, polyadenylierte mRNA-Transkripte wurden unter Verwendung von pLUC0 und pLUC-1, die mit Dral, T7-RNA-Polymerase und einem mMessage mMachine-In-vitro-Transkriptionskit (Ambion) linearisiert wurden, hergestellt. Translationsfähige Hefeextrakte wurden aus dem Hefestamm JD696 (MAT_ura3-52 [L-A-o M-o L-BC-o]) hergestellt, wie in [Iizuka et al., Mol. Cell. Biol. 14:7322 (1994)] beschrieben. 20 ng LUC0- oder LUC-1-mRNA und die angegebenen Konzentrationen von Anisomycin oder Sparsomycin wurden 1 Std. bei 24 °C mit 15 _l der Hefeextrakte in dreifacher Ausfertigung inkubiert und die Luciferase-Aktivitäten jeder Probe wurden mit einem Luminometer (Turner Designs, Modell 20/20) bestimmt. (A, B) Mit den LUC0-Reporter-mRNAs hervorgerufene Luciferase-Aktivitäten als der Prozentanteil der Kontrollen ohne Arzneimittel. (C, D) Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung, die berechnet wurde, indem die Luciferase-Aktivität von der LUC-1-Reporter-mRNA durch die von der LUC0-Kontroll-mRNA hervorgerufene geteilt wurde.
14. Die LUC0- und LUC-1-mRNAs wurden zum Messen der Auswirkungen von Anisomycin und Sparsomycin auf die Translation und den ribosomalen –1-Leserastersprung in einem In-vitro-Kaninchen-Reticulozyt-Translationssystem (Retic Lysated IVT-Kit, Ambion) verwendet. Wie in 13 wurden 20 ng von entweder LUC0- oder LUC-1-mRNAs für diese Assays verwendet.
15. Anisomycin und Sparsomycin verringern HIV-Titer. Virusproduzentenzellen (Nr. 69 HIVgpt) wurden in DMEM, das 10 % fötales Kälberserum enthält, mit den angegebenen Konzentrationen von entweder Anisomycin oder Sparsomycin und bei 37 °C inkubiert. Nach 4 Tagen wurden Virus enthaltende Überstände geerntet und eine Reihe von Verdünnungen hergestellt und Virusreporterzellen (HELA T4) wurden mit 0,3 ml verdünnten Überstandslösungen 3 Stunden inkubiert, woraufhin sie abgesaugt und durch 3 ml DMEM/10 % fötales Kälberserum ersetzt wurden. Jede Verdünnung wurde in zweifacher Ausfertigung geprüft. Nach 24 Stunden wurde das Wachstumsmedium durch DMEM/10 % fötales Kälberserum, das 7 μg/ml gpt enthält, ersetzt, um gegen nicht infizierte Zellen zu selektieren. Das Medium wurde anschließend alle 3 Tage ausgetauscht. Nach 14 Tagen wurden die Kolonien für jede Verdünnung gezählt und die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten wurde durch Multiplizieren des Verdünnungsfaktors mit 3,33 bestimmt. (A) HIV-Titer von menschlichen Zellen, die mit Anisomycin (leere Kästchen) oder Sparsomycin (leere Rauten) behandelt wurden. (B) Auswirkungen von Anisomycin (leere Balken) und Sparsomycin (gefärbte Balken) auf HIV-Titer als ein Prozentanteil unbehandelter infizierter Zellen.
16. (A) Auswirkungen von Anisomycin auf ribosomalen –1-Leserastersprung. (B) Auswirkungen von Sparsomycin auf ribosomalen –1-Leserastersprung. Wildtyp von mutierten mof-Zellen wurde mit den angegebenen Mengen jedes Arzneimittels behandelt und der relative ribosomale Leserastersprung wurde bewertet und auf Zellen ohne Arzneimittelbehandlung normiert.
17. Auswirkungen von Arzneimitteln bei einer Konzentration von 5 μg/ml auf Nonsense-Suppression in Stämmen von UPF+ und UPF–. (A) Stammwachstum. (B) Marker.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ribosomaler Leserastersprung ist ein entscheidender Gesichtspunkt der Genexpression in vielen Retroviren und RNA-Viren. Darüber hinaus ist der mRNA-Abbau ein wichtiger Kontrollpunkt in der Regulierung der Genexpression und es wurde von diesem gezeigt, dass er mit dem Translationsprozess verbunden ist. Ein deutliches Beispiel dieser Verbindung ist die Beobachtung, dass Nonsense-Mutationen den Abbau von mRNAs beschleunigen. Die vorliegende Erfindung stellt die erste Identifizierung von Proteinen, die eine dieser Aktivitäten vermitteln, vor.
Zu verstehen, wie Ribosome das translationelle Leseraster erhalten, ist eine große Herausforderung für die Gebiete der Translationskontrolle und Virologie. In den letzten zehn Jahren wurde gezeigt, dass eine Reihe eukaryontischer Viren Ribosome dazu veranlassen, das Leseraster zu verschieben, um die Expression von Genprodukten mit enzymatischen Funktionen zu regulieren. Historisch haben sich viele der maßgeblichen Versuche in den Gebieten der Molekularbiologie und Virologie genetisch formbare Wirtszell-/Virussysteme zunutze gemacht. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf Studien des ribosomalen Leserastersprungs in einem solchen System, dem L-A-Virus der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Diese Studien haben demonstriert, dass 1) virale mRNA-Sequenzen und sekundäre Strukturen die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung modulieren können; 2) die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung für die Vermehrung des M₁-Satellitenvirus von L-A entscheidend ist, und 3) Mutanten von chromosomalen Genprodukten eines Hefewirts, die am „Maintenance Of translational reading Frame" (mof, Erhaltung des translationellen Leserasters) beteiligt sind, erhalten werden können, von denen viele interessante sekundäre Phänotypen aufweisen.
1A zeigt ein Modell, das den Translationselongationszyklus mit dem aktuellen Modell, das den ribosomalen –1-Leserastersprung beschreibt, integriert. Die Untersuchung dieses integrierten Modells offenbart, dass, da der ribosomale –1-Leserastersprung während der Translationselongation erfolgt, wobei beide ribosomalen A- und P-Stellen belegt werden, dieses Ereignis nach der Abgabe von Aminoacyl-tRNA durch EF-1α an die A-Stelle und vor der EF-2-vermittelten Translokation erfolgen muss; Peptidbindungsbildung und Peptidyltransfer erfolgen innerhalb dieser Parameter. Eine Überexpression eines Fragments des ribosomalen Hefeproteins L3, das an der Bildung des Peptidyltransferasezentrums beteiligt ist [Fried und Warner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:238 (1981); Schultz und Friesen, J. Bacteriol. 155:8 (1983); Schultze und Nierhaus, EMBO J. 5:609 (1982)], steigert die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung und begünstigt den Verlust von M₁ in Wildtypzellen. Folglich wirken sich pharmakologische Mittel, die sich auf das Peptidyltransferasezentrum auswirken, auf die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung aus und beeinträchtigen die Virusvermehrung.
1B zeigt, dass im Gegensatz dazu, da der von Tyl gesteuerte ribosomale +1-Leserastersprung ein Rutschen einer spezifischen P-Stellen-tRNA erfordert, dieser Prozess von einer solchen Klasse von Arzneimitteln nicht beeinflusst werden sollte. Stattdessen würden Bedingungen, die dazu dienen würden, Translationsparameter während der Zeitspanne, in der nur die P-Stelle von Peptidyl-tRNA belegt ist, zu ändern, vorausgesagt werden würden, um die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung zu beeinflussen.
Aktuelle Modelle, die den ribosomalen –1- und +1-Leserastersprung beschreiben, sind im Zusammenhang des Translationselongationszyklus integriert worden. Das resultierende „integrierte Modell" hat einen enormen Prognosewert in Bezug auf das Identifizieren von Agentien, die die Effizienzen von ribosomalem Leserastersprung in jeder Richtung verändern können, von denen wiederum vorausgesagt wird, dass sie die Fähigkeit von Zellen zunichte machen, eine große Auswahl von Viren zu vermehren, die auf Strategien ribosomalen Leserastersprungs beruhen, um eine korrekte Morphogenese sicherzustellen. Neben menschlichen Pathogenen würden diese die meisten Retroviren, einschließlich HIV, sowie eine Reihe von dsRNA- und (+)-strängigen ssRNA-Viruspathogenen einschließen. Diese Strategie findet auch Anwendung in Bezug auf Viruserkrankungen von tiermedizinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung.
Das Model sagt voraus, dass Agentien, die Translationsparameter nach Insertion und Selektion von aa-tRNA durch EF-1, durch den Peptidyltransferschritt hindurch und vor der EF-2-vermittelten Translokation ändern, die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung modifizieren sollten. Daher, obwohl wir dies mit nur zwei Antikörpern, die spezifisch die Peptidyltransferase-Funktion von eukaryontischen Ribosomen targetieren, geprüft haben, sagt das Modell voraus, dass andere Antikörper, die auf den selben Schritt einwirken (z. B. die Sesquiterpene-Antibiotika der Trichodermin-Gruppe), ähnliche Ergebnisse ergeben sollten.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung zum Teil die Entdeckung, dass eine Teilmenge von mof-Allelen in Hefe (Dinman und Wickner, 1994, Genetics 136:75-86), die als chromosomale Mutationen isoliert wurden, die die Leserastersprungeffizienz an der L-A-Virus-Leserastersprungstelle steigerten und den Verlust des L-A-Satellitenvirus M₁ bewirkten, auch den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg beeinflussen. Die Niveaus von Nonsense-enthaltenden mRNAs wurden in Zellen, die das mof4-1-Allel beherbergen, und in geringerem Maße in Zellen, die mof2-1-, mof5-1- und mof8-1-Allele enthalten, angehoben.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Entdeckung, dass mof4-1 zu UPF1 allelisch ist, von dem gezeigt wurde, dass es am Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg beteiligt ist. Darüber hinaus wurde von mof2-1 festgestellt, dass es zu SUI1 allelisch ist, das ein menschliches Homologon hat, und von mof5-1 wurde festgestellt, dass es zu PRP17/CDC40 allelisch ist. Die Klonierung von mof4-1 ist in dem Beispiel unten beschrieben. Beispiel 2 stellt die Klonierung von mof2-1 dar und identifiziert die Mutation dieses Allels; 6 stellt die Klonierung von mof5-1 dar.
Eine genetische und biochemische Studie des UPF1-Gens wurde vorgenommen, um den Mechanismus der Upf1p-Funktion im Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg zu verstehen. Unsere Analyse legt nahe, dass Upf1p ein multifunktionelles Protein mit trennbaren Aktivitäten ist, das den mRNA-Turnover und die Nonsense-Suppression beeinflussen kann. Mutationen wurden in den konservierten Helikase-Motiven des Upf11p identifiziert, die dessen mRNA-Zerfallsfunktion inaktivieren, während sie gleichzeitig die Suppression von leu2-2- und tyr7-1-Nonsense-Allelen nicht zulassen. Insbesondere fehlte es einer Mutation, die sich im ATP-Bindungs- und Hydrolysemotiv von Upf1p befand und die Asparaginsäure und die Glutaminsäure zu Alaninresten umänderte (DE5722AA), an ATPase- und Helikase-Aktivität und sie bildete einen Upf1p:RNA-Komplex in Abwesenheit von ATP. Überraschenderweise zerfiel der Upf1p:RNA-Komplex jedoch als Folge von ATP-Bindung. Dieses Ergebnis legt nahe, dass ATP-Bindung, unabhängig von ihrer Hydrolyse, die Bildung eines Upf1p:RNA-Komplexes für dieses mutierte Protein modulieren kann. Darüber hinaus wurden Mutationen in der aminoterminalen, an Cystein/Histidin reichen Region des Upf1p identifiziert und biochemisch charakterisiert, die normale Nonsense-vermittelte mRNA-Zerfall-Aktivitäten aufweisen, jedoch dazu fähig sind, leu2-2- und tyr7-1-Nonsense-Allele zu unterdrücken. Die biochemische Charakterisierung dieser mutierten Proteine demonstrierte, dass sie modifizierte RNA-Bindungseigenschaften haben. Des Weiteren charakterisieren wir unter Verwendung des Zwei-Hybrid-Systems Upf1p-Upf2p und demonstrieren die Upf2p-Upf3p-Interaktionen. Mutationen in der an Cystein/Histidin reichen Region des Upf1p heben die Upf1p-Upf2p-Interaktion auf. Auf Grundlage dieser Ergebnisse scheint die Rolle des Upf-Komplexes in dem Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall und der Nonsense-Suppression von separaten Domänen an dem Protein vermittelt zu sein. Dies hat insofern offensichtliche Auswirkungen auf die Arzneimitteltargetierung, dass eine oder die andere Domäne zur Arzneimittelentwicklung targetiert werden kann, z. B. unter Anwendung der Techniken mit kombinatorischen Bibliotheken oder rationalen Arzneimittelentwicklungstechniken.
In einem weiteren Gesichtspunkt wurde ein Klon erhalten, wie hierin beschrieben, der demonstrierte, dass ein solcher Mutant, mof2-1, ein einzigartiges Allel des SUI1-Hefegens ist. Obgleich sui1-Mutanten geringfügig erhöhte Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung aufweist, ist insofern mof2-1 einzigartig, dass es das einzige bekannte Allel von SUI1 ist, das den Verlust des M₁-dsRNA-Satellitenvirus begünstigt. Des Weiteren wird der ribosomale –1-Leserastersprung von diesen Mutanten insofern spezifisch beeinflusst, dass sie keine Auswirkungen auf den ribosomalen Leserastersprung in der +1-Richtung haben. Die mof2-1-Mutation wirkt sich auch auf den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg aus. In dieser Hinsicht zeigt die vorliegende Anmeldung, dass die mof2-1-Mutation insofern einen dazwischen liegenden Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall-Phänotyp aufweist, dass sie ein Minimum an 2 stromabwärts gelegenen Elementen erfordert, um diesen Weg zu aktivieren. Die Fähigkeit, die his4^ωg-Mutation zu unterdrücken, demonstriert, dass mof2-1-Mutanten ebenfalls einen Sui-Phänotyp aufweisen. Im Gegensatz zu sui2- und SUI3-Mutanten sind mof2-1-Mutanten jedoch nicht dazu fähig, die Expression des GCN4-Gens zu reprimieren. Die Expression des menschlichen Homologon dieses Gens kann die mutierten Phänotypen in Hefe korrigieren.
Auf Grundlage dieser neuen Daten lehrt die vorliegende Erfindung, dass das Sui1-Protein (Sui1p) beim Überwachen der Translationstreue über alle Stadien der Translation hinweg eine Rolle spielt. Darüber hinaus zeigt die vorliegende Erfindung in der Befassung mit der Rolle des Sui1/Mof2-Proteins bei der Translation, dass dieses Protein die Funktion der Prüfung auf Korrektheit von Ribosomen in allen Stadien der Translation, einschließlich der Initiation, Elongation und Termination, unterstützt. Vor kurzem hat eine Reversionsanalyse von sui1-Mutanten 5 Suppressorloki namens ssu (Suppressoren von sui1) identifiziert, die das Wachstum eines sui1-Mutanten bei restriktiven Temperaturen verbessern. Ssu1 kodiert das ribosomale Protein S4, RPS4, und ssu4 kodiert RPS26. RPS4 entspricht E. coli-S5, ein bekannter ram-Mutant (ram = ribosomale Ambiguität). Ram-Proteine sind mit der ribosomalen P-Stellen-Editierung während der Translationselongation in Zusammenhang gebracht worden. Obwohl nicht beabsichtigt ist, sich darauf zu beschränken, basiert die vorliegende Erfindung weiterhin auf der Hypothese, dass mof2-1 beim Interagieren mit dem Hefeäquivalent von bakteriellen Ram-Proteinen als ein ram-Mutant von Hefe fungiert. Die Hefeäquivalente von bakteriellen ram-Proteinen sind: bakterielles S5 = Hefe-RPS4 = sup44 und bakterielles S4 = Hefe-RPS13A = sup46.
Die Erfindung ermöglicht weiterhin die Untersuchung, 1) ob SUP44 und/oder SUP46 mit mof2-1 synthetisch letal sind; 2) ob die Überexpression von Wildtyp-sup44 und -sup46 die mof2-1-Phänotypen unterdrücken kann, und 3) zu bestimmen, ob das Wildtyp-Sui1p ribosomassoziiert ist und ob es zwischen den verschiedenen Formen des Sui1p (Sui1-1p, Mof2-1p und dem menschlichen Sui1p) qualitative Unterschiede zum Binden von Ribosomen gibt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Hypothese auf, das das Mof2-Protein (Mof2p) ein allgemeiner Regulator der Translationstreue ist und sich als ein stimulierender Faktor auf die Nukleotidtriphosphat-Hydrolyse (NTP-Hydrolyse) aufwirkt. Sui1p interagiert physikalisch mit eIF5, wobei die GTP-Hydrolyse während des Initiationsschritts stimuliert wird. Des Weiteren kodieren zwei der ssu-Mutanten, ssu2 und ssu3, eIF5 bzw. eIF2γ. Die Suppressormutationen in beiden dieser G-Proteine kartieren auf die Regionen, die Homologie zu G-Proteinen enthalten, was nahe legt, dass diese Suppressormutanten die Treue der Translation modifizieren, indem sie die GTP-Hydrolyse-Aktivität in diesen Translationsinitiationsfaktoren ändern. Demgemäß schlägt die vorliegende Erfindung vor, 1) die Auswirkungen von gereinigtem Wildtyp, Mof2-1p, Sui1-1p und hISOSUI1p auf die GTP-Hydrolyse mit gereinigten G-Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie an der Elongationsphase der Translation beteiligt sind, d. h. EF-1α und EF-2, zu untersuchen; 2) die Auswirkungen dieser Formen von Sui1p auf die ATP-Hydrolyse durch Upf1p und Mutanten davon zu untersuchen und 3) die synthetische Letalität von mof2-1 mit Allelen von TEF2 (der EF-1 α kodiert), EF-2 und UPF1 zu untersuchen. Gendosierungsversuche zeigen, ob eine Überexpression von EF-1α, EF-2 oder Upf1p entweder die mof-2-1- oder die sui1-1-Mutationen unterdrücken kann.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Entdeckung, dass ifs1- und ifs2-Allele, die zuvor als Mutationen identifiziert wurden, die den Leserastersprung beim Signal des ribosomalen –1-Leserastersprungs von Mammatumorvirus der Maus verstärken, zum UPF2- bzw. UPF1-Gen allelisch sind, obwohl beide ifs-Stämme M₁ erhielten.
Darüber hinaus steigert die Expression der 100 N-terminalen Aminosäuren des TCM1/MAK8-Gens zudem die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung und beeinträchtigt die Replikation des M₁-dsRNA-Virus von L-A. Des Weiteren sollten andere Agentien, bei denen es sich nicht um Antibiotika handelt und die sich auf die Elongation innerhalb des spezifischen Fensters auswirken, ebenfalls die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung beeinflussen.
Um einen geeigneten Bereich von Arzneimittelkonzentrationen zu bestimmen, wurden die Auswirkungen von Anisomycin und Sparsomycin auf das Zellwachstum geprüft. Wir ermittelten, dass Anisomycin-Konzentrationen, die von 0,76-3,8 μM reichten, und Sparsomycin-Konzentrationen, die von 0,52-2,6 μM reichten, die Gesamtzellwachstumsraten um weniger als 30 % inhibierten (Daten nicht gezeigt). Diese Arzneimittelkonzentrationsbereiche wurden für weitere In-vivo-Untersuchungen gewählt.
Ribosomaler Leserastersprung und Nonsense in RNA-Zerfall
Die bei der Identifizierung der mof-Mutanten eingesetzte Strategie beruhte auf dem Finden von Zellen, die erhöhte Mengen von β-gal exprimieren. Gesteigerte Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung würden in der erhöhten Expression von β-gal resultieren, wenn das lacZ-Gen sich stromabwärts von einem Signal des ribosomalen –1-Leserastersprungs von L-A und in Bezug auf die Translationsstartstelle im –1-Leseraster befindet. Dasselbe Ergebnis könnte jedoch als Folge von chromosomalen Mutationen beobachtet werden, bei denen es sich nicht um die Mutationen handelt, die die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung beeinflussen. Zum Beispiel könnten Mutationen, die die Stabilität des lacZ-Genprodukts erhöhen, oder Mutationen, die dessen Transkriptionsrate erhöhten, ebenfalls das erwünschte Ergebnis erzielen. Die interessanteste Möglichkeit wären Mutationen, die die Halbwertzeit der lacZ-Reporter-mRNA erhöhen.
Alle mof-Mutanten wurden auf ihre Upf-spezifischen mRNA-Zerfall-Phänotypen geprüft (11). Da von der Halbwertzeit der endogenen CYH2-Vorläufer-mRNA bekannt ist, dass sie in upf-Mutanten erhöht ist, wurde die Abundanz des CYH2-Vorläufers in Wildtyp und mof-Mutanten bestimmt. Die Abundanz der CYH2-Vorläufer-RNA war in den mof2-1-, mof5-1- und mof8-1-Mutanten geringfügig angehoben und sie war in mof4-1-Zellen stark erhöht. Mutierte Nonsense-vermittelte mRNA-Zerfall-Phänotypen von mof2-1, mof4-1, mof5-1, mof7-1 und mof8-1 werden mit einem Mini-PGK1-Reporterkonstrukt, das nur ein DSE enthält, verstärkt. Ein Anheben der Anzahl von DSEs verringert diesen mutierten Phänotyp, insbesondere in mof2-1-Mutanten.
Eine Komplementationsprüfung offenbarte, dass mof2-1, mof5-1 und mof8-1 nicht beliebigen bekannten Mutationen im Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg entsprechen. mof4-1 wurde als ein Allel des UPF1-Gens identifiziert. Diploide Zellen, die aus einer Kreuzung von mof4-1- und upf1-2-Zellen resultierten, wiesen β-gal- Aktivitäten auf, die von dem mof4-1-Partner nicht zu unterscheiden waren, und die Abundanz des CYH2-Vorläufers in diesen Zellen blieb erhöht. Die Einführung eines auf einem Einzelkopie-Centromer basierenden Plasmids, das das UPF1-Gen enthält, in mof4-1-Zellen konnte beide mutierten Phänotypen korrigieren, wohingegen die Einführung eines ähnlichen Plasmids, das das UPF2-Gen enthält, oder des Vektors für sich keine Auswirkung auf die mutierten Phänotypen der mof4-1-Zellen hatte.
Obwohl die Halbwertzeiten der Reporter-mRNAs mit ribosomalem –1-Leserastersprung in upf-Mutanten erhöht sind, würden die Ribosome, die sie translatieren, das Leseraster weiter mit derselben Effizienz verschieben. Somit sollten, obgleich upf-Mutanten von mof-Mutanten durch den β-gal-Assay nicht zu unterscheiden sein sollten, upf-Mutanten den M₁-Virus erhalten können, da das Verhältnis von Gag zu Gag-Pol unbeeinflusst bleiben würde. Wahre mof-Mutanten sollten aufgrund ihrer Wirkung auf die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung nicht dazu in der Lage sein, M₁ dennoch zu vermehren. Drei der vier mof-Mutanten, die ebenfalls den Upf-Phänotyp aufweisen, d. h. mof2-1, mof4-1, mof5-1, sind nicht dazu in der Lage, M₁ zu vermehren, und sind daher wahre mof-Mutanten. Nur mof8-1, das einen schwachen mutierten Upf-Nonsense-mRNA-Zerfall-Phänotyp aufweist, kann M₁ erhalten.
Die Klonierung und Charakterisierung von mof4-1 ist ein Modell zum Verständnis von Translationselongationsprozessen und wie wir unsere Einblicke auf die rationale Entwicklung von antiviralen Mitteln anwenden können, die spezifisch den ribosomalen Leserastersprung targetieren. Das mof4-1-Allel von UPF1 ist insofern interessant, dass es das einzig bekannte Allel von UPF1 ist, das das M₁-Satellitenvirus nicht erhalten kann. Mit seiner gesteigerten Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung und der hohen Abundanz von Nonsense-mRNAs definiert das mof4-1-Allel von UPF1 eine neue Klasse von Mutanten. Das mof4-1-Allel wurde sequenziert und es wurde bestimmt, dass es aus einer Cystein- (Cys) zu Tyrosin-Missense-Mutation an Aminosäure 62 besteht, dem ersten Cys-Rest im putativen Zinkfinger. Unsere Daten demonstrieren, dass es eine Verbindung zwischen den von den mof- und upf-Mutanten definierten Phänomenen gibt, was die Kontinuität des Translationsprozesses erklärt, von der mRNA-Stabilität über die Synthese des kompletten Proteinprodukts. mof4-1 ist auch gegenüber dem Translationsinhibitor Paromomycin empfindlich und die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung kann mit zunehmenden Konzentrationen von Paromomycin gesteigert werden. Dies stellt die erste Demonstration dar, dass die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung durch ein spezifisches Arzneimittel moduliert werden kann und als solche weite pharmakologische Auswirkungen hat.
Neben dem Untersuchen der Auswirkungen der mof-Mutanten auf die Akkumulation der CYH2-Vorläufer-mRNA wurde zudem die Abundanz anderer Nonsense-enthaltender mRNAs bestimmt. Diese mRNAs werden von Mini-PKG1-Allelen, die unterschiedliche Stoppkodone (UUA, UAG, UGA) beherbergen, dem HIS4-Gen mit einem Stoppkodon, das in die NheI-Stelle inseriert ist (HIS4-UGA(Nhe)), und dem vollständigen PGK1-Gen, das Nonsense-Kodone an unterschiedlichen Positionen innerhalb der kodierenden Region enthält (PKG1-n-UAG-AU) ((25, 57) und siehe 2A-2d zwecks Konstrukten) kodiert. Von den Stabilitäten dieser mRNAs wurde zuvor demonstriert, dass sie von den Upf-Genprodukten abhängig sind.
Die mRNA-Spiegel von den Mini-PGK1- und HIS4-UAG(Nhe)-Allelen in den mof2-1-, mof5-1- und mof8-1-Zellen waren fast so hoch wie in mof4-1- und Upf-Zellen und waren nicht von der Art des Stoppkodons abhängig. Interessanterweise wirkt sich die Position eines Stoppkodons innerhalb des PKG1-Gens auf den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall-Phänotyp aus, insbesondere im Fall von mof2-1. In der H2(3)-Mutation tritt der UAG-Terminator vor allen stromabwärts gelegenen Elementen auf und es gibt nur 2 (bekannte) stromabwärts gelegene Elemente 5' zu der H2(2)-Mutation. Die Niveaus der PGK-n-UAG-AU-mRNAs (in denen die Nonsense-Kodons auftreten, nachdem die stromabwärts gelegenen Elemente translatiert wurden) in mof2-1-Zellen stimmen mit den in Wildtypzellen beobachteten überein. Dies ist eine interessante Erkenntnis und prüfbare Hypothesen für diese unterschiedlichen Auswirkungen werden im Folgenden beschrieben.
In Anbetracht des Vorstehenden wird offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung eine Reihe von Wegen zum Beeinflussen des ribosomalen Leserastersprungs bereitstellt, was bedeutende Auswirkungen auf die Antivirustherapie und die Suppression von pathologischen Nonsense-Mutationen hat. Noch wichtiger ist, dass zwei Antibiotika und ein N-terminales Segment von ungefähr 100 Aminosäuren eines ribosomalen Bindungsproteins, L3, den normalen Leserastersprung und die Nonsense-Zerfallswege stören. Somit stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittel zur Verwendung als antivirale Verbindungen oder zum Modifizieren des ribosomalen Zerfalls bereit.
Der Ausdruck „Arzneimittel" wird hierin dazu verwendet, sich auf eine Verbindung, wie ein Antibiotikum oder Protein, zu beziehen, das die Funktion des Peptidyltransferasezentrums beeinflusst. Solche Verbindungen können die Effizienz von –1-Leserastersprung steigern oder senken; in jedem Fall ist das Ergebnis eine Störung der Proteinexpression, was antivirale Konsequenzen hat, oder sie kann Nonsense-Mutationen unterdrücken.
Gene die Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteine kodieren
Gemäß der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie oder rekombinanter DNA innerhalb des fachmännischen Könnens eingesetzt werden. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hierin „Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II (Hrsg. D.N. Glover, 1985); Oligonukleotide Synthesis (Hrsg. M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization [Hrsg. B.D. Hames & S.J. Higgins (1985)]; Transcription And Translation [Hrsg. B.D. Hames & S.J. Higgins (1984)]; Animal Cell Culture [Hrsg. R.I. Freshney (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Daher sollen die folgenden Ausdrücke, wenn sie hierin auftauchen, die unten dargelegten Definitionen haben.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment angeheftet sein kann, um so die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken. Ein „Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element (z. B. ein Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo funktioniert, d. h. unter seiner eigenen Kontrolle zur Replikation fähig ist.
Eine „Kassette" bezieht sich auf ein DNA-Segment, das an spezifischen Restriktionsstellen in einen Vektor inseriert werden kann. Das DNA-Segment kodiert ein Polypeptid von Interesse, und die Kassette und die Restriktionsstellen sind dafür entworfen, die Insertion der Kassette in das korrekte Leseraster zur Transkription und Translation sicherzustellen.
Eine Zelle wurde von exogener oder heterologer DNA „transfiziert", wenn eine solche DNA in die Zelle eingeführt wurde. Eine Zelle wurde von exogener oder heterologer DNA „transformiert", wenn die transfizierte DNA eine phänotypische Änderung bewirkt. Vorzugsweise sollte die transformierende DNA in chromosomale DNA, die das Genom der Zelle ausmacht, integriert (kovalent gebunden) werden.
„Heterologe" DNA bezieht sich auf DNA, die sich nicht von Natur aus in der Zelle oder in einer chromosomalen Stelle der Zelle befindet. Vorzugsweise enthält die heterologe DNA ein Gen, das in Bezug auf die Zelle fremd ist.
Ein „Nukleinsäuremolekül" bezieht sich auf die polymere Phosphatesterform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Desoxyribonukleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle") oder beliebige Phosphoesteranaloga davon, wie Phosphorthioate und Thioester, in entweder einzelsträngiger Form oder als eine doppelsträngige Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Ausdruck Nukleinsäuremolekül und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül bezieht sich nur auf die primäre und die sekundäre Struktur des Moleküls und beschränkt es nicht auf bestimmte tertiäre Formen. Folglich beinhaltet dieser Ausdruck doppelsträngige DNA, die unter anderem in linearen oder ringförmigen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmente), Plasmiden und Chromosomen vorgefunden wird. Bei der Erörterung der Struktur bestimmter doppelsträngiger DNA-Moleküle werden möglicherweise Sequenzen entsprechend des üblichen Grundsatzes, nur die Sequenz in der 5'-zu-3'-Richtung längs des untranskribierten DNA-Strangs der DNA (d. h. der Strang, der eine zu der mRNA homologe Sequenz aufweist) anzugeben, hierin beschrieben. Ein „rekombinantes" DNA-Molekül ist ein DNA-Molekül, das einer molekularbiologischen Manipulation unterzogen wurde.
Ein Nukleinsäuremolekül ist an ein anderes Nukleinsäuremolekül, wie eine cDNA, genomische DNA oder RNA, „hybridisierbar", wenn sich eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls unter den adäquaten Temperatur- und Lösungsionenstärkebedingungen an das andere Nukleinsäuremolekül anlagern kann (siehe Sambrook et al., oben). Die Temperatur- und Ionenstärkebedingungen bestimmen die „Stringenz" der Hybridisierung. Für ein vorläufiges Screening auf homologe Nukleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen geringer Stringenz, was einer T_m von 55 °C entspricht, angewendet werden, z. B. 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % Milch und kein Formamid oder 30 % Formamid, 5 × SSC, 0,5 % SDS. Hybridisierungsbedingungen moderater Stringenz entsprechen einer höheren T_m, z. B. 40 % Formamid, mit 5 × oder 6 × SSC. Die Hybridisierung bedingt, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl je nach der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die adäquate Stringenz zum Hybridisieren von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und dem Komplementationsgrad ab, in der Technik wohl bekannte Variable. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, desto höher ist der Wert von T_m für Hybride von Nukleinsäuren mit jenen Sequenzen. Die relative Stabilität (die einer höheren T_m entspricht) von Nukleinsäurehybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride, die mehr als 100 Nukleotide lang sind, wurden Gleichungen zum Berechnen von T_m abgeleitet (siehe Sambrook et al., oben, 9.50-0.51). Für eine Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonukleotiden, gewinnt die Position der Fehlpaarungen an Bedeutung und die Länge des Oligonukleotids bestimmt dessen Spezifität (siehe Sambrook et al., oben, 11.7-11.8). Vorzugsweise ist eine Mindestlänge für eine hybridisierbare Nukleinsäure mindestens etwa 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens etwa 15 Nukleotide und mehr bevorzugt ist die Länge mindestens etwa 20 Nukleotide.
In einer spezifischen Ausführungsform bezieht sich der Ausdruck „Standardhybridisierungsbedingungen" auf eine T_m von 55 °C und nutzt wie zuvor dargelegte Bedingungen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 60 °C; in einer mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 65 °C.
„Homologe Rekombination" bezieht sich auf die Insertion einer Fremd-DNA-Sequenz eines Vektors in einem Chromosom. Vorzugsweise targetiert der Vektor eine spezifische chromosomale Stelle zur homologen Rekombination. Zur spezifischen homologen Rekombination wird der Vektor ausreichend lange Regionen mit Homologie zu Sequenzen des Chromosoms enthalten, um eine komplementäre Bindung und eine Einbindung des Vektors in das Chromosom zu ermöglichen. Längere Regionen mit Homologie und größere Grade an Sequenzähnlichkeit können die Effizienz der homologen Rekombination erhöhen.
Eine „kodierende Sequenz" von DNA ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die transkribiert und in einer Zelle in vitro oder in vivo in ein Polypeptid translatiert wird, wenn es unter die Kontrolle adäquater Regulationssequenzen gestellt wird. Die Abgrenzungen der kodierenden Sequenz werden von einem Startkodon am 5'-Terminus (Aminoterminus) und einem Translationsstoppkodon am 3'-Terminus (Carboxylterminus) bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryontische Sequenzen, cDNA aus eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryontischer DNA (z. B. von einem Säugetier) und sogar synthetische DNA-Sequenzen beinhalten, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Wenn die kodierende Sequenz zur Expression in einer eukaryontischen Zelle gedacht ist, werden für gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' zu der kodierenden Sequenz angeordnet sein.
Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen sind DNA-Regulationssequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, die für die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Zelle sorgen. In eukaryontischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
Eine „Promotorsequenz" ist eine regulatorische Region von DNA, die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer stromabwärts gelegenen (3'-Richtung) kodierenden Sequenz initiieren kann. Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an seinem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die Mindestzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, die zum Initiieren der Transkription in über dem Hintergrund erkennbaren Niveaus zu initiieren. In der Promotorsequenz werden sich eine Transkriptionsinitiationsstelle (beispielsweise durch Kartieren mit Nuklease S1 zweckmäßig definiert) sowie proteinbindende Domänen (Konsensussequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich zeichnen, befinden.
Eine kodierende Sequenz steht „unter der Kontrolle" von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann trans-RNA-gespleißt und in das Protein translatiert wird, das von der kodierenden Sequenz kodiert wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „homolog" in all seinen grammatischen Formen und Schreibweisenvarianten auf die Beziehung zwischen Proteinen, die einen „gemeinsamen evolutionären Ursprung" besitzen, einschließlich Proteine von Superfamilien (z. B. der Immunglobulin-Superfamilie) und homologe Proteine von verschiedenen Spezies (z. B. leichte Myosinkette) (Reeck et al., 1987, Cell 50:667). Solche Proteine (und ihre kodierenden Gene) weisen Sequenzhomologie auf, wie von ihrem hohen Grad an Sequenzähnlichkeit widergespiegelt wird.
Demgemäß bezieht sich der Ausdruck „Sequenzähnlichkeit" in all seinen grammatischen Formen auf den Grad an Identität oder Übereinstimmung zwischen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen von Proteinen, die einen gemeinsamen evolutionären Ursprung gemein haben können oder auch nicht (siehe Reeck et al., oben).
Im allgemeinen Gebrauch und in der vorliegenden Anmeldung kann sich der Ausdruck „homolog", wenn er mit einem Adverb wie „stark" modifiziert ist, auf Sequenzähnlichkeit und nicht auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung beziehen.
In einer spezifischen Ausführungsform sind zwei DNA-Sequenzen „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen ähnlich", wenn mindestens etwa 50 % (vorzugsweise mindestens etwa 75 % und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90 oder 95 %) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen hinweg übereinstimmen. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch Vergleichen der Sequenzen unter Anwendung von Standardsoftware, die in Sequenzdatenbanken erhältlich ist, oder in einem Southern-Hybridisierungsversuch unter beispielsweise stringenten Bedingungen, wie für das bestimmte System definiert, identifiziert werden. Das Definieren adäquater Hybridisierungsbedingungen liegt innerhalb des fachmännischen Könnens. Siehe z. B. Maniatis et al., oben; DNA Cloning, Bd. I & II, oben; Nucleic Acid Hybridization, oben.
In ähnlicher Weise sind in einer bestimmten Ausführungsform zwei Aminosäuresequenzen „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen ähnlich", wenn mehr als 30 % der Aminosäuren identisch sind oder mehr als 60 % ähnlich (funktionell identisch) sind. Vorzugsweise werden die ähnlichen oder homologen Sequenzen mittels Alignment unter Anwendung des GCG-Pileup-Programms (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin, USA) identifiziert.
Der Ausdruck „entspricht" wird hierin verwendet, um sich auf ähnliche oder homologe Sequenzen zu beziehen, wenn die exakte Position zu dem Molekül, zu dem die Ähnlichkeit oder Homologie gemessen wird, identisch oder von diesem unterschiedlich ist. Ein Nukleinsäure- oder Aminosäurensequenzalignment kann Leerräume einschließen. Folglich bezieht sich der Ausdruck „entspricht" auf die Sequenzähnlichkeit und nicht die Nummerierung der Aminosäurereste oder Nukleotidbasen.
Die vorliegende Erfindung sieht die Isolierung eines Gens vor, das ein Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein der vorliegenden Erfindung, einschließlich eines vollständigen oder einer natürlich vorkommenden Form eines Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein mit, aus einer beliebigen eukaryontischen Quelle, wie Hefe, aber einschließlich Tier, insbesondere Säugetier oder Vogel und insbesondere Mensch, oder pflanzlichen Quelle kodiert. Wie hierin verwendet. bezieht sich der Ausdruck „Gen" auf eine Anordnung von Nukleotiden, die ein Polypeptid kodieren, und beinhaltet Nukleinsäuren mit cDNA und genomischer DNA.
Ein Gen, das ein Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein, ob nun genomische DNA oder cDNA, kodiert, kann aus einer beliebigen Quelle isoliert werden, insbesondere aus einer menschlichen cDNA- oder genomischen Bibliothek. Verfahren zum Erhalten solcher Gene sind in der Technik wohl bekannt, wie oben beschrieben (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, oben). Ein spezifisches Beispiel der Isolierung eines solchen Gens ist in dem Beispiel in der Anlage gezeigt.
Demgemäß kann eine beliebige eukaryontische Zelle potentiell als die Nukleinsäurequelle für die molekulare Klonierung eines Gens, das ein Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein kodiert, dienen. Die DNA kann mittels in der Technik bekannter Standardvorgehensweisen aus klonierter DNA (z. B. einer DNA-„Bibliothek"), mittels chemischer Synthese, mittels cDNA-Klonierung oder mittels Klonierung von genomischer DNA oder Fragmenten davon, aus der gewünschten Zelle gereinigt, erhalten werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, oben; D.M Glover (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, GB, Bd. I, II). Von genomischer DNA abgeleitete Klone können neben kodierenden Regionen regulatorische und Intron-DNA-Regionen enthalten; von cDNA abgeleitete Klone werden keine Intron-Sequenzen enthalten. Ungeachtet der Quelle sollte das Gen molekular in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert werden.
Bei der molekularen Klonierung des Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch einer Scherung unterzogen werden, wie beispielsweise durch Beschallung. Die linearen DNA-Fragmente können dann entsprechend ihrer Größe mittels Standardtechniken, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie, getrennt werden.
Sobald die DNA-Fragmente erzeugt wurden, kann die Identifizierung des spezifischen DNA-Fragments, das das gewünschte Gen enthält, auf eine Reihe von Weisen durchgeführt werden. Zum Beispiel können die erzeugten DNA-Fragmente, wenn eine Menge eines Teils des Gens oder von dessen spezifischer RNA oder eines Fragments davon zur Verfügung steht und gereinigt und markiert werden kann, mittels Nukleinsäurehybridisierung auf die markierte Sonde gescreent werden (Benton und Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Zum Beispiel kann ein Satz von Oligonukleotiden, die der partiellen Aminosäuresequenzinformation entspricht, die für das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein bezogen wurde, hergestellt und als Sonden zur DNA-Kodierung des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Fragment ausgewählt, dass in Bezug auf das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein der Erfindung in hohem Maße einzigartig ist. Diese DNA-Fragmente mit wesentlicher Homologie zu der Sonde werden hybridisieren. Wie oben angemerkt, je größer der Grad an Homologie, desto stringentere Hybridisierungsbedingungen können verwendet werden. Des Weiteren sind die Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteine, da sie für die Translation wesentlich sind, hoch konserviert, z. B. von Hefe zu Mensch. Folglich führt die Identifizierung eines solchen Proteins in Hefe oder einer anderen eukaryontischen Zelle leicht zum Erhalten eines solchen Proteins aus cDNA-Bibliotheken vom Menschen oder anderen Tieren.
Eine weitere Auswahl kann auf Grundlage der Eigenschaften des Gens durchgeführt werden, z. B. wenn das Gen ein Proteinprodukt kodiert, das die isoelektrische, elektrophoretische Aminosäurenzusammensetzung oder partielle Aminosäuresequenz von Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein, wie hierin offenbart, aufweist. Somit kann das Vorliegen des Gens mit Assays nachgewiesen werden, die auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts basieren. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, die eine Hybridselektion der korrekten mRNAs vornehmen, ausgewählt werden, die ein Protein produzieren, das z. B. eine ähnliche oder identische elektrophoretische Migration, isoelektrische Fokussierung oder ein ähnliches oder identisches Verhalten bei Gelelektrophorese bei nichtäquilibriertem pH-Wert, ähnliche oder identische Karten des proteolytischen Verdaus oder antigene Eigenschaften aufweist, wie von Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein bekannt ist.
Ein Gen kann auch mittels mRNA-Selektion identifiziert werden, d. h. mittels Nukleinsäurehybridisierung, auf die In-vitro-Translation folgt. Bei dieser Vorgehensweise werden Nukleotidfragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte DNA darstellen, einschließlich DNA von einer anderen Spezies, oder können synthetische Oligonukleotide sein, die aus der partiellen Aminosäuresequenzinformation entworfen wurden. Immunpräzipitationsanalyse oder Funktionsassays der In-vitro-Translationsprodukte der Produkte der isolierten mRNAs identifizieren die mRNA und somit die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Darüber hinaus können spezifische mRNAs mittels Adsorption von Polysomen, die aus Zellen isoliert wurden, an immobilisierten Antikörpern, die spezifisch gegen Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein gerichtet sind, ausgewählt werden.
Eine radioaktiv markierte cDNA kann unter Verwendung der ausgewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als einer Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann dann als eine Sonde verwendet werden, um homologe DNA-Fragmente inmitten anderer genomischer DNA-Fragmente zu identifizieren.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt zudem Klonierungsvektoren, die Gene enthalten, die Analoga und Derivate von Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein der Erfindung, die dieselbe oder eine homologe funktionelle Aktivität als Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein aufweisen, und Homologa davon von anderen Spezies kodieren. Die Produktion und Verwendung von Derivaten und Analoga, die mit Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein in Beziehung stehen, liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Derivat oder Analogon funktionell aktiv, d. h. es kann eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten aufweisen, die mit einem vollständigen Wildtyp-Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein assoziiert werden.
Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein-Derivate können hergestellt werden, indem kodierende Nukleinsäuresequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die funktionell äquivalente Moleküle bereitstellen, modifiziert werden. Vorzugsweise werden Derivate hergestellt, die in Bezug auf natives Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein eine verstärkte oder gesteigerte funktionelle Aktivität aufweisen.
Aufgrund der Degeneration von kodierenden Sequenzen von Nukleotiden können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie ein Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Gen kodieren, bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, allelische Gene, homologe Gene von anderen Spezies und Nukleotidsequenzen, die die gesamten oder Teile solcher Gene umfassen, die durch die Substitution von verschiedenen Kodons modifiziert werden, die denselben Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren, wodurch eine stumme Änderung bewirkt wird. Ebenso beinhalten die Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein-Derivate der Erfindung jene, die als eine primäre Aminosäuresequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins enthalten, einschließlich modifizierter Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz ersetzt sind, was in einer konservativen Aminosäuresubstitution resultiert, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure mit einer ähnlichen Polarität ersetzt werden, die als ein funktionelles Äquivalent fungiert, was in einer stummen Modifikation resultiert. Substitute für eine Aminosäure innerhalb einer Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel beinhalten die unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polar-neutralen Aminosäuren beinhalten Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren beinhalten Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren beinhalten Asparaginsäure und Glutaminsäure. Von solchen Modifikationen wird nicht erwartet, dass sie das scheinbare Molekulargewicht beeinflussen, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese oder isoelektrischem Punkt ermittelt.
Die Gene, die Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein-Derivate und -Analoga kodieren, können mittels verschiedener, in der Technik bekannter Verfahren produziert werden. Die Manipulationen, die in ihrer Produktion resultieren, können am Gen- oder Proteinniveau erfolgen. Zum Beispiel kann die klonierte Gensequenz des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins mittels einer beliebigen von zahlreichen, in der Technik bekannten Strategien modifiziert werden (Sambrook et al., 1989, oben). Die Sequenz kann an adäquaten Stellen mit einer Restriktionsendonuklease bzw. Restriktionsendonukleasen gespalten, gefolgt von einer weiteren enzymatischen Modifikation, falls gewünscht, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Produktion des Gens, das ein Derivat oder Analogon des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins kodiert, sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass das modifizierte Gen innerhalb desselben translationellen Leserasters wie das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein verbleibt, ununterbrochen durch Translationsstoppsignale, in der Genregion, in der die gewünschte Aktivität kodiert wird.
Darüber hinaus kann die das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erschaffen und/oder zu zerstören oder um Variationen in kodierenden Regionen zu erschaffen und/oder um neue Restriktionsendonukleasestellen zu bilden oder bereits bestehende zu zerstören, um die In-vitro-Modifikation weiter zu erleichtern. Vorzugsweise verstärken solche Mutationen die funktionelle Aktivität des Genprodukts des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins. Eine beliebige, in der Technik bekannte Technik zur Mutagenese kann angewendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, ortsgerichtete In-vitro-Mutagenese (C. Hutchinson et al., 1978, Biol. Chem. 253:6551; Zoller und Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), Verwendung von TAB^®-Linkern (Pharmacia) usw. PCR-Techniken sind für die ortsgerichtete Mutagenese bevorzugt (siehe Higuchi, 1989, „Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, Kapitel 6, S. 61-70).
Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen adäquaten Klonierungsvektor inseriert werden. Eine große Anzahl von in der Technik bekannten Vektor/Wirt-Systemen kann verwendet werden. Mögliche Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Plasmide oder modifizierte Viren, das Vektorsystem muss jedoch mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Beispiele von Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, E. coli, Bakteriophagen wie Lamda-Derivate oder Plasmide wie pBR322-Derivate oder pUC-Plasmid-Derivate, z. B. pGEX-Vektoren, pmal-c, pFLAG usw. Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise mittels Ligieren des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Termini aufweist, durchgeführt werden. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, die zum Fragmentieren der DNA verwendet werden, nicht in dem Klonierungsvektor vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann eine beliebige gewünschte Stelle durch Ligieren von Nukleotidsequenzen (Linkern) auf die DNA-Termini produziert werden; diese ligierten Linker können spezifische, chemisch synthetisierte Oligonukleotide umfassen, die Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen kodieren. Rekombinante Moleküle können mittels Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. in Wirtszellen eingeführt werden, so dass viele Kopien des Gens erzeugt werden. Vorzugsweise ist das klonierte Gen auf einem Shuttle-Vektor-Plasmid enthalten, das für Expansion in einer klonierenden Zelle, z. B. E. coli, sorgt und die Reinigung zur anschließenden Insertion in eine adäquate Expressionszelllinie, falls eine solche erwünscht ist, erleichtert. Zum Beispiel kann ein Shuttle-Vektor, bei dem es sich um einen Vektor handelt, der sich in mehr als einer Art von Organismus replizieren kann, zur Replikation in sowohl E. coli als auch Saccharomyces cerevisiae vorbereitet werden, indem Sequenzen von einem E. coli-Plasmid mit Sequenzen von dem 2μ-Plasmid von Hefe verknüpft werden.
In einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen identifiziert und nach Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor in einer „Shotgun"-Vorgehensweise isoliert werden. Die Anreicherung für das gewünschte Gen, beispielsweise durch Größenfraktionierung, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor vorgenommen werden.
Expression von Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteinen
Die Nukleotidsequenz, die für Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein oder ein funktionell aktives Derivat, einschließlich eines chimären Proteins, davon kodiert, kann in einen adäquaten Expressionsvektor inseriert werden, d. h. einen Vektor, der die für die Transkription und Translation der inserierten proteinkodierenden Sequenz erforderlichen Elemente enthält. Solche Elemente werden hierin als Promotor bezeichnet. Somit ist die Nukleinsäure, die das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein der Erfindung kodiert, mit einem Promotor in einem Expressionsvektor der Erfindung operativ verbunden. Sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen können unter der Kontrolle solcher Regulationssequenzen kloniert und exprimiert werden. Ein Expressionsvektor enthält vorzugsweise auch einen Replikationsstartpunkt.
Die erforderlichen Transkriptions- und Translationssignale können auf einem rekombinanten Expressionsvektor bereitgestellt werden oder sie können von dem nativen Gen geliefert werden, das das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein und/oder dessen flankierende Regionen kodiert.
Potentielle Wirt/Vektor-Systeme beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Säugetierzellsysteme, die mit einem Virus (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus usw.) infiziert sind; Insektenzellsysteme, die mit einem Virus (z. B. Baculovirus) infiziert sind; Mikroorganismen wie Hefe, die Hefevektoren enthält; oder Bakterien, die mit einem Bakteriophagen, einer DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert wurden. Die Expressionselemente von Vektoren unterscheiden sich in Bezug auf ihre Stärken und Spezifitäten. Je nach dem eingesetzten Wirt/Vektor-System kann ein beliebiges einer Reihe geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden.
Ein rekombinantes Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein oder ein funktionelles Fragment, Derivat, chimäres Konstrukt oder Analogon davon kann nach der Einbindung der kodierenden Sequenz durch Rekombination chromosomal exprimiert werden. In dieser Hinsicht kann ein beliebiges einer Reihe von Amplifikationssystemen verwendet werden, um hohe Niveaus stabiler Genexpression zu erzielen (siehe Sambrook et al., 1989, oben).
Die Zelle, in der der rekombinante Vektor, der die Nukleinsäure umfasst, das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein kodiert, wird in einem adäquaten Zellkulturmedium unter Bedingungen, die für die Expression des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins durch die Zelle sorgt, kultiviert.
Ein beliebiges der zuvor beschriebenen Verfahren zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Klonierungsvektor kann dazu verwendet werden, Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein Gen enthalten, das aus adäquaten Transkriptions-/Translationskontrollsignalen und den proteinkodierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren können In-vitro-Techniken mit rekombinanter DNA und In-vitro-Synthesetechniken und In-vivo-Rekombination (genetische Rekombination) beinhalten.
Die Expression von Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein kann mit einem beliebigen, in der Technik bekannten Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden, diese regulatorischen Elemente müssen jedoch in dem zur Expression ausgewählten Wirt funktionsfähig sein. Promotoren, die zum Kontrollieren der Genexpression des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins verwendet werden können, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die SV40-Early-Promotor-Region (Benoist und Chambon, 1981, Nature 290:304-310), den Promotor, der in der langen terminalen Wiederholung am 3'-Ende des Rous-Sarkom-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), den Thymidinkinasepromotor von Herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), die Regulationssequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) oder den tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); siehe auch „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94; Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen, wie der Gal4-Promotor, der ADC-Promotor (ADC = Alkoholdehydrogenase), PGK-Promotor (PGK = Phosphoglycerinkinase), Promotor der alkalischen Phosphatase; und die Transkriptionskontrollregionen von Tieren, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren eingesetzt wurden: die Genkontrollregion von Elastase I, die in Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); die Genkontrollregion von Insulin, die in Betazellen der Bauchspeicheldrüse aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), die Genkontrollregion von Immunglobulin, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grossschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), die Kontrollregion von Mammatumorvirus der Maus, die in Zellen der Hoden und der Brust, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), die Genkontrollregion von Albumin, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), die Genkontrollregion von Alpha-Fetoprotein, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), die Genkontrollregion von Alpha-I-Antitrypsin, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), die Genkontrollregion von Beta-Globin, die in Knochenmarkzellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94), die Genkontrollregion von basischem Myelinprotein, die in Oligodendrogliazellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), die Genkontrollregion der leichten Myosin-2-Kette, die in Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314:283-286), und die Genkontrollregion von Gonadotropin-Releasing-Faktor, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234:1371-1378).
Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein kodiert, können mittels vier allgemeiner Vorgehensweisen identifiziert werden: (a) PCR-Amplifikation der gewünschten Plasmid-DNA oder spezifischen mRNA, (b) Nukleinsäurehybridisierung, (c) Vorliegen oder Fehlen von Selektionsmarkergenfunktionen und (d) Expression inserierter Sequenzen. Bei der ersten Vorgehensweise können die Nukleinsäuren mittels PCR amplifiziert werden, um den Nachweis des amplifizierten Produkts bereitzustellen. Bei der zweiten Vorgehensweise kann das Vorliegen eines Fremdgens, das in einen Expressionsvektor inseriert wurde, mittels Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die zu einem inserierten Markergen homolog sind, nachgewiesen werden. Bei der dritten Vorgehensweise kann das System aus rekombinantem Vektor und Wirt identifiziert und auf Grundlage des Vorliegens oder Fehlens bestimmter „Selektionsmarker"-Genfunktionen (z. B. β-Galactosidase-Aktivität, Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antikörpern, Transformation-Phänotyp, Bildung von Einschlusskörpern in Baculovirus usw.), die durch die Insertion von Fremdgenen in den Vektor verursacht wurden, ausgewählt werden. In einem anderen Beispiel können, wenn die Nukleinsäure, die das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein kodiert, in die „Selektionsmarker"-Gensequenz des Vektors inseriert wird, Rekombinante, die das Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein enthalten, über das Fehlen der Genfunktion des Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins identifiziert werden. Bei der vierten Vorgehensweise können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden, indem auf die Aktivität, die biochemischen oder immunologischen Charakteristika des Genprodukts, das von der Rekombinante exprimiert wird, geprüft wird, vorausgesetzt, dass das exprimierte Protein eine funktionell aktive Konformation annimmt.
Sobald ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert wurde, können mehrere, in der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, um es zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen eingerichtet wurden, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und mengenmäßig hergestellt werden. Wie zuvor erläutert, beinhalten die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, die folgenden Vektoren oder deren Derivate, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Viren vom Menschen oder Tierviren wie Vacciniavirus oder Adenovirus; Insektenviren wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagenvektoren (z. B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige wenige zu nennen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Leserastersprung-Protein in einer Zelle exprimiert, die mit Viren infiziert ist, und die Fähigkeit eines Agens, die virale Abtötung zu inhibieren oder zu eliminieren, kann bewertet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das mRNA-Zerfall-Protein mit einem abweichenden mRNA-Transkript, wie einem Nonsense-Transkript und Antisense-Transkript oder einem kurzen Transkript, in einer Zelle koexprimiert, und die Fähigkeit eines Agens, die Stabilität des abweichenden Transkripts zu erhöhen, kann bewertet werden.
Vektoren werden in die gewünschten Wirtszellen mittels in der Technik bekannter Verfahren eingeführt, z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Kalziumphosphatpräzipitation, Lipofektion (Lyposomfusion), Verwendung einer Genkanone oder eines DNA-Vektor-Transporters (siehe z. B. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem. 253:14621-14624; Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, eingereicht am 15. März 1990).
Screenen auf Agentien, die die Proteinaktivität beeinflussen
Eine beliebige, in der Technik bekannte Screening-Technik kann angewendet werden, um auf Agentien zu screenen, die die Funktion eines Leserastersprung-Proteins oder eines mRNA-Zerfall-Proteins beeinflussen. Die vorliegende Erfindung sieht Screenings auf Kleinmolekülliganden vor.
Die Kenntnis der primären Sequenz eines Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Proteins und der Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen mit bekannter Funktion kann einen ersten Hinweis auf Agentien liefern, von denen wahrscheinlich ist, dass sie die Proteinaktivität beeinflussen. Die Identifizierung solcher Agentien und das Screenen auf diese werden durch Bestimmen von Strukturmerkmalen des Proteins weiter erleichtert, z. B. unter Anwendung von Röntgenkristallographie, Neuronenbeugung, kernmagnetische Resonanzspektroskopie und anderer Techniken zur Strukturbestimmung. Diese Techniken stellen den rationalen Entwurf oder die rationale Identifizierung von Agonisten und Antagonisten bereit.
In einem anderen Gesichtspunkt können synthetische Bibliotheken (Needles et al., „Generation and screening of an oligonucleotide encoded synthetic peptide library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-10704; Lam et al., US-Patentschrift Nr. 5,382,513, erteilt am 17. Januar 1995; Lam et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00252; und Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926) und dergleichen verwendet werden, um auf Agentien gemäß der vorliegenden Erfindung zu screenen.
Das Screening kann mit rekombinanten Zellen, die das Leserastersprung-Protein oder mRNA-Zerfall-Protein exprimieren, oder alternativ mit dem gereinigten Protein durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit eines markierten Proteins, an ein Molekül in einer kombinatorischen Bibliothek zu binden, als ein Screening-Assay verwendet werden, wie in den vorstehenden Literaturhinweisen beschrieben.
Antisense-RNA und Ribozyme
Antisense-Nukleotide und Ribozyme, die die hierin vorgebrachten Entwurfsstrategien einbinden oder sich die Entdeckung zunutze machen, dass der abweichende mRNA-Zerfallsweg die Halbwertzeit von Antisense-RNA oder Ribozymen verkürzen kann, so dass sie für den gewünschten Zweck unbrauchbar gemacht werden, d. h. die Expression eines Gens auf der Translationsebene beeinträchtigen. Diese Vorgehensweise setzt Antisense-Nukleinsäure und Ribozyme ein, um die Translation einer spezifischen mRNA zu blockieren, entweder durch Maskieren dieser mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder Spalten dieser mit einem Ribozym.
Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zu mindestens einem Teil eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (siehe Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:298). In der Zelle hybridisieren sie an diese mRNA, wodurch ein doppelsträngiges Molekül gebildet wird. Die Zelle translatiert eine mRNA in dieser doppelsträngigen Form nicht. Folglich beeinträchtigen Antisense-Nukleinsäuren die Expression von mRNA in Protein. Oligomere mit etwa fünfzehn Nukleotiden und Moleküle, die an das AUG-Initiationskodon hybridisieren, werden besonders effizient sein, da sie leicht zu synthetisieren sind und von ihnen wahrscheinlich ist, dass sie weniger Probleme als größere Moleküle aufwerfen, wenn sie in Organzellen eingeführt werden. Antisense-Verfahren sind dazu verwendet worden, die Expression vieler Gene in vitro zu inhibieren (Marcus-Sekura, 1988, oben; Hambor et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1237).
Ribozyme sind RNA-Moleküle, die über die Fähigkeit verfügen, andere einzelsträngige RNA-Moleküle in einer Art und Weise spezifisch zu spalten, die zu DNA-Restriktionsendonukleasen gewissermaßen analog ist. Ribozyme wurden bei der Beobachtung entdeckt, dass bestimmte mRNAs die Fähigkeit aufweisen, ihre eigenen Introns zu exzidieren. Durch Modifizieren der Nukleotidsequenz dieser RNAs waren Forscher dazu in der Lage, Moleküle zu konstruieren, die spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und es spalten (Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:3030). Da sie sequenzspezifisch sind, werden nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert.
Forscher haben zwei Arten von Ribozymen identifiziert, die Tetrahymena-Art und die „Hammerkopf"-Art. Ribozyme der Tetrahymena-Art erkennen Sequenzen von vier Basen, wohingegen die „Hammerkopf"-Art Sequenzen von elf bis achtzehn Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz, desto wahrscheinlicher ist es, dass sie ausschließlich in der Ziel-mRNA-Spezies auftritt. Folglich werden Ribozyme der Hammerkopf-Art gegenüber Ribozymen der Tetrahymena-Art zum Inaktivieren einer spezifischen mRNA-Spezies vorgezogen und Erkennungssequenzen von achtzehn Basen werden kürzeren Erkennungssequenzen vorgezogen.
Antivirale Therapie
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Mittel zum Behandeln von Virusinfektionen bereit, indem sie Agentien bereitstellt, die die Leserastersprungeffizienz modulieren und somit die Virusreplikation oder die Assembly von Viruspartikeln direkt beeinflussen. Die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in der natürlich vorkommenden „slippery site" von L-A beträgt 1,8 % -2,0 % (16). Ein Ändern der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung unter Anwendung der Arzneimittel oder molekularbiologischen Reagenzien der vorliegenden Erfindung verändert das Verhältnis von Gag zu Gag-Pol, das synthetisiert wird. Dies wiederum wirkt sich auf die Assembly von Viruspartikeln und die RNA-Verpackung aus, wodurch die Fähigkeit der Zelle, den Virus zu vermehren, beeinflusst wird. Insbesondere wirkt sich ein Ändern der Sequenz der „slippery site" auf die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung aus. Die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung kann auch durch Einführen mutierter zellulärer Genprodukte beeinflusst werden, die mit dem Translationsapparat, insbesondere dem Peptidyltransferzentrum interagieren. Sowohl molekularbiologische als auch genetische Verfahren sind dazu verwendet worden, zu demonstrieren, dass die Effizienz von ribosomalem Leserastersprung von 1,9 % das optimale Verhältnis von strukturellen zu enzymatischen Proteinen ergibt. Ein Ändern der Leserastersprungeffizienzen auf mehr als das 2- bis 3-fache resultiert im Verlust des M₁-Satellitenvirus, ob nun der Virus von L-A-cDNA-Klonen, die modifizierte „slippery sites" enthalten, oder vom Wildtyp-L-A-Virus in mutierten Wirtszellen unterstützt wird. Selbst geringfügige Veränderungen der Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung ergeben erheblich niedrigere Anzahlen von M₁-Kopien.
Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafterweise Arzneimittel und Verfahren zum Identifizieren von Arzneimitteln zur Verwendung in der antiviralen Therapie (oder Nonsense-Suppression-Therapie) von Viren, die den allgemeinen Mechanismus des ribosomalen –1-Leserastersprungs anwenden, bereit, was vier große Familien von Tierviren und drei große Familien von Pflanzenviren beinhaltet.
Zum Beispiel wenden fast alle Retroviren den ribosomalen –1-Leserastersprung an, einschließlich Lentiviren (Immundefizienzviren), wie HIV-1 und HIV-2, SIV, FIV, BIV, Visnavirus, Arthritis-/Enzephalitisvirus und infektiöser Anämievirus des Pferdes; Spumaviren (die Foamy-Viren), wie menschlicher Foamy-Virus und Foamy-Viren anderer Säugetiere; die T-lymphotrophen Viren, wie HTLV-I, HTLV-II, STLVs und BLV; Leukoseviren des Vogels, wie Leukämie und Sarkomviren vieler Vögel, einschließlich Geflügel für den gewerblichen Gebrauch; Typ-B-Retroviren, einschließlich Mammatumorvirus der Maus; und Typ-D-Retroviren, wie Mason-Pfizer-Affenvirus und Lungenadenokarzinomvirus des Schafes. Darüber hinaus wenden viele Coronaviren den –1-Leserastersprung an, einschließlich menschlicher Coronaviren, wie 229-E, Oc43; Coronaviren von Tieren, wie Coronavirus des Kalbs, ansteckender Magen-Darm-Virus des Schweins, agglutinierender Enzephalomyelitisvirus des Schweins und infektiöser Diarrhoevirus des Schweins; Coronavirus des Hundes; infektiöser Peritonitisvirus der Katze und enterischer Coronavirus der Katze; infektiöser Bronchitisvirus des Huhns und Bluecomb-Virus des Truthahns; Hepatitisvirus der Maus; Coronavirus der Ratte und Coronavirus des Kaninchens. In ähnlicher Weise wird Torovirus (eine Coronavirusart) impliziert, wie menschliche Toroviren, die mit Dünndarm- oder Atemwegserkrankungen; Bredavirus von Kälbern und Atemwegsvirus des Pferdes; Bern-Virus von Pferden; Torovirus des Schweins; Torovirus der Katze. Ein anderer Coronavirus ist der Arterivirus, der Hämorrhagisches-Fieber-Virus des Affen, Arteritisvirus des Pferdes, Lelystad-Virus (Schwein), VR2332-Virus (Schwein) und Laktatdehydrogenase erhöhenden Virus (Nagetiere) beinhaltet. Weitere Tierviren sind Paramyxoviren, wie menschlicher ribosomaler –1-Leserastersprung, von dem bei Masern berichtet wird, und Astroviren, wie menschliche Astroviren 1-5 und Astroviren des Rinds, des Schafs, des Schweins, des Hunds und der Ente.
Die Pflanzenviren, die einen –1-Leserastersprungmechanismus einbinden, beinhalten Tetraviren, wie Sobemoviren (z. B. Southern-Bean-Mosaikvirus, Knaulgrasscheckungs virus), Leuteoviren (z. B. Gelbverwergungsvirus der Gerste, Westlicher Rübenvergilbungsvirus und Kartoffelblattrollvirus), Enamoviren (z. B. Erbsenmosaikvirus) und Umbraviren (z. B. Karottenscheckungsvirus); Tombusviren, wie Tombusvirus (z. B. Tomatenzwergbuschvirus), Carmovirus (z. B. Nelkenscheckungsvirus), Necrovirus (Tabaknekrosevirus); Dianthoviren (z. B. Rotkleenekrosemosaikvirus) und Machiomovirus (z. B. Maischlorosescheckungsvirus).
Darüber hinaus sind Totiviren, wie L-A- und L-BC- (Hefe) und andere Pilzviren, Giardia-lamblia-Virus (Darmparasit), Trigonella-vaginell-Virus (menschlicher Parasit), Leishmania-brasiliensis-Virus (menschlicher Parasit) und andere Protozoenviren –1-Leserastersprung-Viren.
Suppression pathologischer Nonsense-Mutationen
Der Nonsense-vermittelte mRNA-Zerfallsweg reguliert den Zerfall von Transkripten, die durch ein mutagenes Ereignis Nonsense-Kodone erlangt haben. Als solcher ist dieser Weg bei der Regulierung der Genexpression deutlich impliziert. Noch wichtiger ist, dass ein Modulieren dieses Wegs den Mangel an Genexpression aufgrund einer Nonsense-Mutation überwinden kann. Zudem können Antisense-RNAs Substrate für den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg sein, was zu einer Verringerung ihrer zellulären Konzentration und einer Reduzierung ihrer Fähigkeit, die Genexpression zu inhibieren, führt. Mutationen oder Arzneimittel, die diesen Weg inaktivieren, können die Abundanz von „Nonsense"-RNAs erhöhen, was in einer gesteigerten Effizienz, mit der Antisense-RNAs die Genexpression inhibieren, resultiert.
Die Modulierung des mRNA-Zerfallswegs verfügt auch über erhebliches Potential zum Behandeln bestimmter Zustände. Nonsense-Mutationen werden in vielen Genen vorgefunden, die in Erkrankungen resultieren. Eine Liste solcher Erkrankungen (und des Nonsense-enthaltenden Allels) folgt: hämolytische Anämie ohne Sphärozyten (TP1), β-Thalässemie (β-GLOBIN), Hypercholestereinämie (LDL-REZEPTOR-Libanesisches Allel, Lungenemphysem (α-1-ANTITRYPSIN), Nebennierenhyperplasie (STEROID-21-HYDROLASE (CYP21)), Apolipoprotein-C-II-Mangel (APOLIPOPROTEIN C-II_Padova), Hämophilie B (FAKTOR IX_PORTLAND), Bernard-Soulier-Syndrom (GLYKOPROTEIN 1Bα), Fruktoseintoleranz (ALDOLASE B), Insulinresistenz (INSULINREZEPTOR), Ahornsirup-Krankheit (α-KETOSÄUREDEHYDROGENASE), Thrombose (PROTEIN S), Struma und Hypothyreose (THYROGLOBULIN), septische Granulomatose (ZYTOCHROM B558), Sandhoff-Jatzekewitz-Syndrom (HEBX), Willebrand-Jürgens-Syndrom Typ III (VON-WILLEBRAND-FAKTOR), Atrophia gyrata (ORNITHINAMINOTRANSFERASE), 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-resistente Rachitis (VITAMIN-D-REZEPTOR), Sphärozytose (ERYTHROZYTENBAND 3), Mukoviszidose (CFTR) und Sphärozytose (ERYTHROID ANKYRIN).
Gentherapie und transgene Vektoren
Ein Gen, das ein mutiertes ribosomales Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein oder ein Polypeptiddomänenfragment davon kodiert, oder ein Gen, das ein Antisense oder Ribozym kodiert, das für ein ribosomales Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Wildtyp-Protein spezifisch ist, wird in vivo in einen viralen Vektor eingeführt. Solche Vektoren beinhalten ein attenuiertes oder defektes DNA-Virus, wie, jedoch nicht darauf beschränkt, Herpes-simplex-Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus, Adenovirus, adenoassoziiertes Virus (AAV) und dergleichen. Defekte Viren, denen Virusgene komplett oder nahezu komplett fehlen, sind bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach Einführung in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwendung von defekten viralen Vektoren ermöglicht die Verabreichung an Zellen in einem spezifischen, lokalisierten Bereich, ohne Besorgnis, dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Somit kann spezifisch Fettgewebe targetiert werden. Beispiele von bestimmten Vektoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Vektor eines defekten Herpesvirus I (HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], ein Vektor eines attenuierten Adenovirus, wie der von Stratford-Perricaudet et al. [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992)] beschriebene Vektor, und ein Vektor eines defekten adenoassoziierten Virus [Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)].
Vorzugsweise wird zur In-vivo-Verabreichung eine adäquate immunsuppressive Behandlung in Verbindung mit dem viralen Vektor, z. B. Adenovirusvektor, eingesetzt, um eine Immundeaktivierung des viralen Vektors und transfizierter Zellen zu verhindern. Zum Beispiel können immunsuppressive Zytokine, wie Interleukin-12 (IL-12), Interferon-γ (IFN-γ) oder Anti-CD4-Antikörper, verabreicht werden, um humorale oder zelluläre Immunreaktionen an die viralen Vektoren zu blockieren [siehe z. B. Wilson, Nature Medicine (1995)]. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, einen viralen Vektor einzusetzen, der dazu konstruiert ist, eine minimale Anzahl von Antigenen zu exprimieren.
In einer anderen Ausführungsform kann das Gen in einen retroviralen Vektor eingeführt werden, wie z. B. in Anderson et al., US-Patentschrift Nr. 5,399,346; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., US-Patentschrift Nr. 4,650,764; Temin et al., US-Patentschrift Nr. 4,980,289; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., US-Patentschrift Nr. 5,124,263; internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/07358, veröffentlicht am 16. März 1995 von Dougherty et al.; und Kuo et al., 1993, Blood 82:845, beschrieben.
Targetierte Genabgabe wird in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 95/28494, veröffentlicht im Oktober 1995, beschrieben.
Alternativ kann der Vektor in vivo mittels Lipofektion eingeführt werden. Im letzten Jahrzehnt sind Liposome vermehrt zur Einkapselung und Transfektion von Nukleinsäuren in vitro verwendet worden. Synthetische kationische Lipide, die zum Beschränken der Schwierigkeiten und Risiken, die bei der liposomvermittelten Transfektion angetroffen werden, entworfen wurden, können zum Herstellen von Liposomen zur In-vivo-Transfektion eines Gens, das einen Marker kodiert, verwendet werden [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988)]. Die Verwendung von kationischen Lipiden kann die Einkapselung von negativ geladenen Nukleinsäuren fördern und auch die Fusion mit negativ geladenen Zellmembranen begünstigen [Felgner und Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. Die Anwendung von Lipofektion zum Einführen exogener Gene in die spezifischen Organe in vivo hat bestimmte praktische Vorteile. Das molekulare Richten von Liposomen auf spezifische Zellen stellt einen vorteilhaften Bereich dar. Es ist klar, dass das Richten der Transfektion auf bestimmte Zelltypen insbesondere in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität vorteilhaft wäre, wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Niere und das Gehirn. Lipide können zum Zwecke der Targetierung chemisch an andere Moleküle gekoppelt werden [siehe Mackey et al., oben]. Targetierte Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter, und Proteine wie Antikörper oder Moleküle, bei denen es sich nicht um Peptide handelt, könnten chemisch an Liposome gekoppelt werden.
Es ist auch möglich, den Vektor in vivo als ein Nackt-DNA-Plasmid einzuführen. Nackt-DNA-Vektoren zur Gentherapie können in die gewünschten Wirtszellen mittels in der Technik bekannter Verfahren eingeführt werden, z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Kalziumphosphatpräzipitation, Verwendung einer Genkanone oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters [siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu und Wu, J. Biol. Chem. 253:14621-14624 (1988); Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, eingereicht am 15. März 1990].
Des Weiteren ist es möglich, ein Genprodukt, das die Aktivität an dem Peptidyltransferasezentrum moduliert, und ein therapeutisches heterologes Antisense- oder Ribozymgen unter der Kontrolle der spezifischen DNA-Erkennungssequenz zu koexprimieren, indem ein Expressionsvektor zur Gentherapie, der sowohl ein Gen, das für einen Modulator eines Peptidyltransferasezentrums kodiert (einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, ein Gen für ein mutiertes Leserastersprung- oder mRNA-Zerfall-Protein oder eine Antisense-RNA oder ein Ribozym, die bzw. das für mRNA, die ein solches Protein kodiert, spezifisch ist), mit einem Gen für eine davon verschiedene Antisense-Nukleinsäure oder ein davon verschiedenes Ribozym unter koordinierter Expressionskontrolle bereitgestellt wird. In einem Beispiel werden diese Elemente auf separaten Vektoren bereitgestellt; alternativ können diese Elemente in einem einzigen Expressionsvektor bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung kann mittels Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele, die als für die Erfindung beispielhaft bereitgestellt sind, besser verstanden werden.
BEISPIEL 1: mof4-1, ein Allel des UPF1/IFS2-Gens, wirkt sich auf den mRNA-Turnover und die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung aus
Der mRNA-Abbau ist ein wichtiger Kontrollpunkt in der Regulierung der Genexpression und es wurde von diesem gezeigt, dass er mit dem Translationsprozess verbunden ist. Ein deutliches Beispiel dieser Verbindung ist die Beobachtung, dass Nonsense-Mutationen den Abbau von mRNAs beschleunigen. Dieses Beispiel demonstriert, dass eine Teilmenge von mof-Allelen (mof = Maintenance Of Frame (Erhaltung des Leserasters)) in Hefe, die als chromosomale Mutationen isoliert wurden, die die Leserastersprungeffizienz an der L-A-Virus-Leserastersprungstelle steigerten und den Verlust des L-A-Satellitenvirus M₁ bewirkten, auch den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg beeinflussen. Die Niveaus von Nonsense-enthaltenden mRNAs wurden in Zellen, die das mof4-1-Allel beherbergen, angehoben. Des Weiteren ist mof4-1 zu UPF1 allelisch, von dem gezeigt wurde, dass es am Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg beteiligt ist. Obgleich Zellen, die das mof4-1-Allel beherbergen, das M₁-Virus verlieren, erhalten die anderen f-Allele (d. h. upf1, upf2 und upf3), die am Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall beteiligt sind, M₁. Von dem ifs1- und dem ifs2-Allel, die zuvor als Mutationen identifiziert wurden, die den Leserastersprung beim Signal des ribosomalen –1-Leserastersprungs vom Mammatumorvirus der Maus verstärken, wurde gezeigt, dass sie zum UPF2- bzw. UPF1-Gen allelisch sind, und beide ifs-Stämme erhielten M₁. Der mof4-1-Stamm ist gegenüber dem Aminoglykosid Paromomycin empfindlicher als ein upf1Δ-Stamm und die Leserastersprungeffizienz wird in einem in Gegenwart von Paromomycin gewachsenen mof4-1-Stamm gesteigert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Upf1p eine Doppelfunktion bei sowohl der Translation als auch dem mRNA-Turnover aufweist.
Materialien und Verfahren
Stamm und Medium: Die verwendeten Stämme von Saccharomyces cerevisiae sind in Tabelle 1 aufgeführt. YPAD, YPG, SD, synthetisches Komplettmedium und 4,7-MB- Platten zum Testen des Killerphänotyps waren wie zuvor berichtet [Dinman et al., Genetics 136:75-86 (1994)].
Tabelle 1. In dieser Studie verwendete Stämme

a. Cui et al., Genes & Dev., 9:437-454 (1995).
b. Leeds et al., Genes & Dev., 5:2303-2314 (1991).
c. Dinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:174-178 (1991).
d. Dinman und Wickner, Genetics, 136:75-86 (1994).
e. Dinman und Wickner, J. Virol., 66:3669-3676 (1992).
f. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6587 (1995).

Genetische Verfahren und Assays. Die Transformation von Hefe und E. coli wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [Hagan et al., Mol. Cell. Biol., 15:809-823 (1995); Cui et al., Genes & Dev., 7:1737-1754 (1995); He und Jacobson, Genes & Dev., 9:437-454 (1995)]. Zellen wurden vom L-A-Virus geheilt, indem sie bei 39 °C zwecks einzelner Kolonien ausgestrichen wurden, und der Verlust von L-A wurde mittels Agarosegel-Analyse bestätigt. Die Erzeugung von rho°-Zellen, Cytoduktionen und der Killer-Test wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [Dinman und Wickner, J. Virol. 66:3669-3676 (1992)]. Genetische Kreuzungen, Sporenbildungs- und Tetradenanalyse, β-Galactosidase-Assays und der Killer-Test wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [Dinman und Wickner, Genetics, 136:75-86 (1994)]. dsRNA wurde wie beschrieben hergestellt [Fried und Fink, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4224-4228 (1978)] und mittels Elektrolyse durch 1,2%-ige Agarosegele analysiert. Die Prüfung auf Paromomycin-Empfindlichkeit der verschiedenen Stämme wurde wie beschrieben durchgeführt [Cui et ad., (1995) oben].
Konstruktionen von Plasmiden. Die Plasmide pJD107 und pJD108, die für den β-Galactosidase-Assay verwendet wurden, wurden von pF8 bzw. pT125 abgeleitet [Dinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:174-178 (1991)]. Bei pJD107 wurde das 4,9 kb lange HindIII-Fragment von pF8 zu mit HindIII verdautem pRS426 ligiert [Christianson et al., Gene, 110:119-122 (1992)] und es enthält den PGK1-Promotor, eine Translationsstartstelle, auf die ein 218 bp umfassendes cDNA-Fragment von L-A folgt, das das Signal des ribosomalen –1-Leserastersprungs enthält. Darauf folgt das lacZ-Gen, das sich in Bezug auf die Startstelle in dem –1-Leseraster befindet. pJD108 enthält das 4,7 kb lange HindIII-Fragment von pT125, das in die HindIII-Stelle von pRS426 kloniert ist, und das lacZ-Gen befindet sich ohne etwaige dazwischen liegende Sequenz in dem 0-Raster. pYCp33UPF1 und pYCp33UPF2 wurden wie zuvor beschrieben konstruiert [Cui et al., (1995) oben]. Die Plasmide pmof4AE, pmof4AB und pmof4BE, die zum Klonieren des mof4-1-Allels verwendet wurden, wurden wie folgt konstruiert: Das 1,47 kb lange Asp718-EcoRI-Fragment oder das 2,6 kb lange Asp718-BamHI-Fragmentvon pYCp33UPF1, das das UPF1-Gen enthält, wurde deletiert und durch die entsprechenden Fragmente des mof4-1-Allels ersetzt wurden, die mittels PCR isoliert wurden (siehe unten). pmof4BE wurde kloniert, indem das 4,2 kb lange EcoRI-BamHI-DNA-Fragment von mof4-1 in pYCplac33 inseriert wurde. Da das pYC33uPF1 mehr als eine BstXI-Stelle enthält, wurden pmof4XAE und pmof4XBE mittels zwei Schritten konstruiert. Ein 978 bp umfassendes BstXI-Asp718-DNA-Fragment von pPUC-UPF1 wurde durch ein BstXI-Asp718-DNA-Fragment von pmof4AE bzw. pmof4BE ersetzt. Die 4,2 kb langen BamHI-EcoRI-Fragmente von diesen zwei Plasmiden wurden in pYCplac33 kloniert.
Identifizierung der mof4-1-Mutation. Eine PCR-Strategie wurde zum Identifizieren des mof4-1-Allels verwendet. Die verwendeten Primer für PCR-DNA-Fragmente von dem UPF1-Gen waren: Primer-1: 5'-CCGGAATTCATGAACGGGAAA-3' (SEQ ID NO: 8); Primer-2: 5'-GACCGGCCGAACGGACGTTGTAATACAT-3' (SEQ ID NO: 9); Primer-3: 5'-ATCCCCGCGGGAGTTGAAAGTTGCCATC-3' (SEQ ID NO: 10); Primer-4: 5'-GACGGATCCGAAAGTATATTGGAC-3' (SEQ ID NO: 11). Genomische DNA (50-100 ng) wurde aus dem mof4-1-Stamm hergestellt [Rose et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press (1990)] und in der PCR als die Matrize verwendet. Die jeweiligen Primerpaare Primer-1 und Primer-2 wurden zum Synthetisieren der DNA-Fragmente verwendet, und pmof4AE (4) zu konstruieren, Primer-3 und Primer-4 wurden zum Synthetisieren des DNA-Fragments verwendet, und pmof4AB (4) zu konstruieren, und Primer-1 und Primer-4 wurden zum Konstruieren von pmof4BE (4) verwendet. Zwei PCR-Produkte aus zwei verschiedenen Reaktionen wurden in der Klonierungsreaktion verwendet, um Artefakte aus der PCR zu minimieren. Die angewendeten PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95 °C-5 Min., 94 °C-1 Min., 45 oder 50 °C-1 Min., 72 °C-1,5 Min., für 25 Zyklen. Die DNA-Fragmente aus der PCR wurden von 1%-igem Agarosegel gereinigt und zum Austauschen des entsprechenden DNA-Fragments des Wildtyp-UPF1-Gens verwendet, das sich auf einem YCplac33-Plasmid befand.
Ergebnisse
Akkumulation von CYH2-Vorläufer und Nonsense-enthaltender FGK1-mRNA in einem mof4-1-Stamm. Die zuvor identifizierten acht mof-Mutanten [Dinman und Wickner, (1994) oben] wurden analysiert, um zu bestimmen, ob sie die Aktivität des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs beeinflussten. Von der Abundanz des ineffizient gespleißten CYH2-RNA-Vorläufers, der ein Intron in der Nähe des 5'-Endes enthält, wurde demonstriert, dass sie ein guter Monitor der Aktivität dieses Zerfallswegs ist [Hagan et al., (1995) oben; Cui et al., (1995) oben; He et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7034-7038 (1993)]. Der Status der Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall-Aktivität in Zellen kann durch Vergleichen des Verhältnisses der Abundanz des CYH2-Vorläufers zu der CYH2-mRNA auf einem RNA-Blot leicht bestimmt werden.
Die Abundanz des CYH2-Vorläufers und der CYH2-mRNA wurde in Zellen, die upf1^–, UPF1⁺ (Wildtyp) und die verschiedenen mof-Allele beherbergen, mittels RNA-Blot-Analyse beobachtet. Wie in 2A gezeigt ist, war die Abundanz des CYH2-Vorläufers in Wildtyp-UPF1⁺-MOF⁺-Zellen gering, stieg jedoch in dem upf1^–-Stamm um mindestens das Fünffache an. Eine Überwachung der CYH2-Vorläufer-Abundanz in den mof-Mutanten demonstrierte, dass das mof4-1-Allel erhöhte CYH2-Vorläufer-Spiegel ähnlich der zuvor in upf-Mutanten beobachteten (2A) aufwies. Die Abundanz des CYH2-Vorläufers war in Zellen, die die mof1-1-, mof5-1- und mof8-1-Allelen beherbergen, ebenfalls erhöht, wenn auch nicht im selben Ausmaß wie in upf- oder mof4-1-Stämmen (2A). Die CYH2-mRNA-Abundanz war in diesen Zellen nicht beeinträchtigt (2A).
Das mof4-1-Allel wurde weiter charakterisiert, das es die größte Akkumulation des CYH2-Vorläufers verursachte. Um zu bestimmen, ob andere Nonsense-enthaltende mRNAs von dem mof4-1-Allel beeinflusst wurden, wurde ein Nonsense-enthaltendes Mini-PGK1-Allel, dessen Abundanz gegenüber dem UPF1-Status in der Zelle empfindlich ist [Zhang et al., Mol. Cell. Biol. 15:2231-2244 (1995)], in den mof4-1-Stamm eingeführt. Die Abundanz der Wildtyp- und der Nonsense-enthaltenden PGK1-mRNA wurde mittels RNA-Blot bestimmt und die Ergebnisse demonstrierten, dass das Nonsense-enthaltende PGK1-Transkript in einem mof4-1-Stamm im Vergleich zu dessen Abundanz in Wildtypzellen um das Zehnfache anstieg, ähnlich dem Spiegel in upf1-2 (2B). Die Abundanz der Wildtyp-PGK1-mRNA ändert sich in keiner der Zellen (2B).
mof4-1 ist zu dem UPF1-Gen allelisch. Wir bestimmten als Nächstes, ob mof4-1 zu einem beliebigen der zuvor charakterisierten UPF-Gene allelisch ist. Ein mof4-1-Stamm wurde mit upf1Δ- oder upf1Δ-Stämmen gepaart und die CYH2-Vorläufer-Abundanz wurde in diploiden Zellen beobachtet. Die CYH2-Vorläufer-Abundanz war in den mof4-1xupf2Δ-Zellen gering (Daten nicht gezeigt), war jedoch in mof4-1xupf1Δ-Zellen hoch, wobei dessen Abundanz zu der in einem haploiden upf1Δ-Stamm beobachteten gleichwertig war (2C). Des Weiteren wurde ein Stamm, der das mof4-1-Allel beherbergt, mit auf Centromeren basierenden Plasmiden, die entweder das UPF1-Gen, das UPF2-Gen oder den Vektor für sich beherbergen, transformiert und die Abundanz des CYH2-Vorläufers wurde beobachtet. Ein mof4-1-Stamm, der mit einer einzigen Kopie des UPF1-Gens transformiert wurde, verringerte die Konzentration des CYH2-Vorläufers auf dasselbe Niveau, wie es in Wildtyp-UPF1⁺-Zellen beobachtet wurde (2C, Spuren 1-2 und 7). Das Plasmid, das entweder das UPF2-Gen oder den Vektor für sich beherbergt, verringerte die Abundanz des CYH2-Vorläufers in einem mof4-1-Stamm nicht (2C, Spuren 3-4 und 5-6). Des Weiteren war die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung, wie durch pJD107 und pJD108 bestimmt, in sowohl mof4-1- als auch upf1^–-Zellen angehoben und das UPF1-Gen war dazu in der Lage, die Leserastersprungeffizienz in einem mof4-1-Stamm auf Wildtyp-Niveaus zu reduzieren (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass MOF4 zu UPF1 allelisch ist.
Vor kurzem haben Lee und Kollegen [Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6587 (1995)] zwei ifs-Mutanten (ifs = Increased Frame Shift, gesteigerter Leserastersprung) in Hefe identifiziert. Unter Verwendung eines Konstrukts, das das CUP1-Gen von Hefe stromabwärts eines Signals des ribosomalen –1-Leserastersprungs von der gag-pol-Junktion des Mammatumorvirus der Maus enthält, wurden ifs-Mutanten durch Verlust der Kupferempfindlichkeit in cup1Δ-Zellen identifiziert. Beide diese wiesen Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung auf, die ungefähr 2 Mal so groß waren wie die von Wildtypzellen, wie mittels der β-Galactosidase-Aktivitäten gemessen. Das IFS1-Gen wurde kloniert und sequenziert. Unser Vergleich von IFS1- und UPF2-Sequenzen demonstrierte, dass sie identisch sind [Cui et al., (1995) oben; He und Jacobson, (1995) oben]. Wir haben außerdem ermittelt, dass ifs2 und mof4-1 durch den β-Galactosidase-Assay in dieselbe Komplementationsgruppe fallen und dass der ifs-Phänotyp von ifs2 mit dem UPF1-Gen korrigiert werden kann (Daten nicht gezeigt). Beide mutierten ifs1- und ifs2-Stämme waren dazu in der Lage, M₁ zu vermehren (Tabelle 2; siehe unten), was anzeigt, dass diese Mutationen die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung um weniger als das Zweifache beeinflussten.
Tabelle 2. Charakterisierung des Killerphänotyps und der Arzneimittelempfindlichkeiten

* L-A und M₁ wurden mittels Cytoduktion in Zellen eingeführt. Der Killerphänotyp wurde mit dem Killer-Platten-Assay analysiert und die Fähigkeit, den M₁-dsRNA-Virus zu erhalten, wurde mittels RNA-Blot-Analyse beobachtet.
† Die Stämme Nr. 1 und Nr. 2 wurden in -Leu-Flüssigmedium gewachsen und anschließend auf Minimalmedium, dem Leucin fehlte, plattiert. Eine Scheibe, die 1,0 mg Paromomycin enthält, wurde auf dem Zellrasen angeordnet. Der Durchmesser der Zone der Wachstumsinhibierung wurde bestimmt, nachdem die Platten 4 Tage bei 30 °C inkubiert worden waren. Die Stämme Nr. 3, Nr. 4, Nr. 5, Nr. 6 und Nr. 7 waren entweder mof4-1 oder mof4-1 (UPF1::URA3 [Deletion des mof4-1-Allels aus dem Chromosom]), der die angegebenen Plasmide beherbergt. Diese Zellen wurden auf Medium, dem Uracel und Leucin fehlte, geprüft.

Im Gegensatz zu den upfΔ- oder upf1-2 Allelen wirkt sich das mof4-1-Allel auf die Erhaltung des M₁-Virus aus. Wir ermittelten als Nächstes, ob Mutationen, die den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg inaktivieren, den M₁-dsRNA-Virus erhalten können. L-A und M₁ wurden mittels Cytoduktion in Stämme eingeführt, die das mof4-1-Allel des UPF1-Gens, die upf1Δ-, upf1-1-, upf1Δ-, upf3-1-, upf4-1-, ifs1-1- und ifs2-1-Allele beherbergen, und diese Zellen wurden auf einem Zellrasen, der gegenüber dem Killertoxin empfindlich war, replikaplattiert. Zellen, die M₁ erhalten, sezernieren das Killertoxin und es wird ein Wachstumsinhibierungsring beobachtet [Dinman und Wickner, (1992) oben]. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind in Tabelle 2 zusammengefasst und demonstrieren, dass nur Zellen, die das mof4-1-Allel beherbergen, nicht dazu in der Lage waren, den Killerphänotyp zu erhalten. Im Einklang mit dem Verlust des Killerphänotyps lag die 1,8 kb lange M₁-dsRNA nicht in den mof4-1-Zellen vor, was die vorherige Beobachtung bestätigte, dass mof4-1-Zellen ebenfalls einen Mak^– -Phänotyp (Mak = MAintenance of Killer, Erhaltung des Killers) aufweist, d. h. sie können M₁ nicht vermehren (Tabelle 2, 3). Zellen, die die upf1-, upf1-, upf3-, upf4-, ifs1- und ifs2-Allele beherbergen, erhielten die M₁-dsRNA (Tabelle 2). Der Unterschied zwischen dem mof4-1-Allel und den upf1Δ- und ifs2-Allelen bei der Erhaltung von M₁ legt nahe, dass das mof4-1-Allel eine spezifische Mutation in dem UPF₁-Gen ist, die sowohl den mRNA-Zerfall als auch die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung modifiziert.
Mehrere Ergebnisse demonstrieren, dass der Mak^–-Phänotyp eine Folge des mof4-1-Allels anstatt von einer sekundären Mutation innerhalb der Zelle ist. Ein Einzelkopie-UPF1-Gen, das in mof4-1-Zellen auf einem Centromerplasmid eingeführt wurde, rettete die Fähigkeit von mof4-1-Zellen, M₁ zu erhalten, während die mit Vektor transformierten Zellen keine Auswirkung hatten (Tabelle 2, vergleiche Nr. 3 mit Nr. 4). Des Weiteren stellte das Deletieren des UPF1-Gens aus dem Chromosom in Zellen, die das mof4-1-Allel beherbergen, den Killerphänotyp wieder her (Tabelle 2, Nr. 5). Bei einer Tetradenanalyse von Zellen, die das mof4-1-Allel beherbergen, das mit einem MOF⁺-L-A⁺ gekreuzt war, demonstrierten M₂ ⁺-Stämme eine 2:2-Segregation von Killer⁺- und Killer^–-Phänotyp (3). Des Weiteren zeigt eine RNA-Analyse der gesamten Nukleinsäuren aus diesen Sporenklonen, dass die Bande der 1,8 kb langen M₁-dsRNA in den MOF⁺-Sporenklonen vorliegt und in den mof4-1-Sporenklonen fehlt (3).
Zellen, die das mof4-1 Allel beherbergen, sind gegenüber Paromomycin empfindlicher. Von Stämmen, die Mutationen beherbergen, die die Translationstreue senken; wurde gezeigt, dass sie gegenüber dem Aminoglykosid-Antibiotikum Paromomycin, einem Arzneimittel, von dem geglaubt wird, dass es die Häufigkeit von Lesefehlern in Hefe erhöht, überempfindlich sind [Palmer et al., Nature, 277:148-150 (1979); Singh et al., Nature, 277:146-148 (1979)]. Die Paromomycin-Empfindlichkeit von Stämmen, die das mof4-1-Allel enthalten, wurde bestimmt. Der mof4-1-Stamm, der mof4-1-Stamm, der das UPF1-Gen auf einem Plasmid beherbergt, und ein mof4-1-Stamm, in dem das UPF1-Gen deletiert wurde (mof4-1 (UPF::URA3)), die das mof4-1-Allel auf einem Centromerplasmid enthielten oder denen dieses fehlte, wurden gewachsen und die Paromomycin-Empfindlichkeit wurde durch Vergleichen der Wachstumsinhibierungszone um eine das Arzneimittel enthaltende Scheibe herum beobachtet. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Stämme, die das mof4-1-Allel beherbergen, gegenüber Paromomycin empfindlicher waren als Zellen, die entweder das Wildtyp-upf1-Gen oder ein upf1Δ-Allel beherbergen (Tabelle 2, vergleiche Nr. 2 mit Nr. 1, Nr. 4 mit entweder Nr. 3 oder Nr. 5). Im Gegensatz zum mof4-1-Stamm war der upf1Δ-Stamm gegenüber Paromomycin nicht empfindlicher als der Wildtyp-UPF⁺-Stamm, der mit zuvor berichteten Ergebnissen übereinstimmt [Leeds et al., Mol. Cell. Biol., 12:2165-2177 (1992); Cui et al., (1995) oben]. Die Empfindlichkeit dieser Stämme gegenüber Paromomycin war eine Folge des mof4-1-Allels, da das Deletieren von UPF1 aus dem Chromosom des mof4-1-Stamms es wie den mof4-1-Stamm, der das Wildtyp-UPF1-Gen beherbergt, gegenüber Paromomycin resistent machte (Tabelle 2, Nr. 3 und Nr. 5). Darüber hinaus erhielt eine gegenüber Paromomycin resistente Kolonie, die aus einem mof4-1-Elternstamm isoliert wurde, M₁ und wies eine Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung des Wildtyps auf (Daten nicht gezeigt). Die Koreversion dieser drei Phänotypen zeigt, dass sie alle mit dem mof4-1-Allel des UPF1-Gens verbunden sind.
Die Auswirkung von Paromomycin auf die Expression des LacZ-Gens in Wildtyp- und mof4-1-Stämmen wurde ebenfalls beobachtet. Zellen wurden in Flüssigmedium in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Arzneimittels gewachsen und die β-Galactosidase-Aktivitäten wurden bestimmt, auf die Anzahl von in dem Assay eingesetzten Zellen normiert. Die β-Galactosidase-Aktivität in einem mof4-1-Stamm wurde gemessen und die Ergebnisse demonstrierten, dass die LacZ-Expression stetig mit zunehmenden Konzentrationen von Paromomycin anstieg (Tabelle 3). Die β-Galactosidase-Aktivität in entweder einem Wildtypstamm oder einem mof4-1-Stamm, der das Wildtyp-UPF1-Gen beherbergt, wurde von der Zugabe von Paromomycin nicht beeinflusst (Tabelle 3). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Paromomycin den Defekt in einem mof4-1-Stamm verschlimmert, und sie legen nahe, dass sich Paromomycin auf die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in einem mof4-1-Stamm auswirken kann.
Tabelle 3. Auswirkung von Paromomycin auf Expression von LacZ-Gen in mof4-1-Stämmen

* Die Zellen waren JD474-5A, der entweder pT125 (0-Raster-Kontrolle) oder pF8 (Testpartner auf ribosomalen –1-Leserastersprung) enthält [Dinman et al., (1991) oben]. Paromomycin wurde zu Zellen gegeben, die bei 01. O.D.₅₉₅/ml inokuliert und 4 Stunden bei 30 °C gewachsen wurden. Die β-Galactosidase-Aktivitäten wurden gemessen und der prozentuale ribosomale –1-Leserastersprung wurde mit (pF8/pT125) × 100 % errechnet.
Die durchschnittlichen β-Galactosidase-Aktivitäten von Zellen mit pT125 und Zellen mit pT125 + pUPF1 waren 50,1 ± 7,5 bzw. 48,9 ±.

Identifizierung der mof4-1-Mutation. Das UPF1-Gen wurde kloniert und sequenziert [Leeds et al., (1992) oben; Altamura et al., J. Mol. Biol., 224:575-587 (1992)]. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des UPF1-Gens zeigt, dass sie ein 109KD-Protein mit Zinkfingermotiven in der Nähe seines Aminoterminus kodiert und die adäquaten Motive beherbergt, um als ein Mitglied der ATP-bindenden RNA/DNA-Helikase-Superfamiliengruppe I klassifiziert zu werden [Altamura et al., (1992) oben; Koonin, TIBS, 17:495-497 (1992)]. Wir wollten als Nächstes die Mutation bzw. die Mutationen identifizieren, die den mof4-1-Phänotyp verursachte bzw. verursachten. Unter Nutzung der adäquaten Primer wurden PCR-Produkte, die entweder dem einen Drittel am 5'- Ende oder den zwei Dritteln am 3'-Ende des UPF1-Gens vom mof4-1-Stamm entsprachen, isoliert und Hybridgene zwischen dem Wildtyp-UPF1 und dem mof4-1-Allel wurden hergestellt (4A). Darüber hinaus wurde auch das komplette UPF1-Gen aus einem mof4-1-Stamm mittels PCR synthetisiert. Diese Plasmide wurden zu einem upf1Δ-Stamm transformiert und die CYH2-Vorläufer-Abundanz wurde in diesen Stämmen bestimmt. Der CYH2-Vorläufer war in Zellen, die ein Hybrid enthielten, in dem das 5'-Segment des Wildtyp-UPF1-Gens durch das 5'-Fragment vom mof4-1-Allel ersetzt wurde (4 pmof4AE_1-2), oder in Zellen, die das Plasmid pmof4BE_1-2 enthielten, das das komplette mof4-1-Allel des UPF1-Gens kodiert, abundant. Die Konzentration des CYH2-Vorläufers war in Zellen niedrig, die das Plasmid pmof4AB_1-2 beherbergen, das das Hybrid-UPF1-Gen enthält, in dem die zwei Drittel am 3'-Ende des Gens durch das DNA-Fragment vom mof4-1-Allel ersetzt wurden (4 pmof4AB_1-2). Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Mutation im mof4-1-Allel innerhalb des einen Drittels am 5'-Ende des UPF1-Gens befindet. Im Einklang mit diesen Resultaten waren nur Hybride, die den Teil des einen Drittels am 5'-Ende des mof4-1-Allels enthielten, gegenüber Paromomycin empfindlich (Tabelle 2, Nr. 6 und Nr. 7).
Die DNA-Sequenz der 5'-Region des mof4-Allels (1150 nt; ein EcoRI-Asp718-DNA-Fragment) wurde aus beiden Plasmiden pmof4AE₁ und pmof4BE₁ bestimmt (4). Ein Vergleich dieses Abschnitts mit Wildtyp-UPF1 offenbarte, das eine einzige G→A-Mutation am Nukleotid 586 in der an Cystein reichen Region vorlag, wobei ein Cystein-Kodon durch ein Tyrosin ersetzt wurde (4). Beide mof4-1-Allele aus den Plasmiden pmof4AE₂ und pmof4BE₂ enthielten ebenfalls dieselbe G→A-Mutation (Daten nicht gezeigt). Um zu bestätigen, dass die Cys→Tyr-Mutation in dem Mof4-Phänotyp resultierte, wurde ein 900 bp umfassendes BstX1-Asp718-DNA-Fragment aus dem Wildtyp-UPF1-Gen durch ein analoges DNA-Fragment aus entweder dem Plasmid pmof4AE₁ und pmof4BE₁, das die mof4-1-Mutation beherbergt, ersetzt (4 pmof4XAE und pmof4XBE). Zellen, die das Hybrid-UPF1-Gen beherbergen, wiesen dieselben Charakteristika wie der mof4-1-Stamm auf, hatten eine erhöhte CYH2-Vorläufer-Abundanz und waren gegenüber Paromomycin empfindlicher (Tabelle 2, 4).
Diskussion
Die hier dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die mof2-1-, mof4-1-, mof5-1- und mof8-1-Allele, die als Mutationen identifiziert wurden, die die Effizienzen von programmiertem ribosomalem –1-Leserastersprung an der L-A-Leserastersprungstelle steigerten [Dinman und Wickner, (1994) oben], auch die Abundanz des Nonsense-enthaltenden CYH2-Vorläufers und der Mini-PGK1-mRNA erhöhen, was nahe legt, dass diese Mutationen entweder zum Teil oder vollständig die Aktivität des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs aufheben (2A). Stämme, die das mof4-1-Allel enthielten, hatten die größte Wirkung auf die Aktivität des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls und von ihnen wurde gezeigt, dass sie ein Allel des UPF1-Gens sind (2). Das UPF1-Gen wurde sequenziert und beherbergt Zinkfinger-, NTP-Hydrolyse- und Helikasemotive [Altamura et al., (1992) oben]. Eine Unterbrechung des UPF1-Gens resultiert in der Stabilisierung von Nonsense-enthaltenden mRNAs und führt zu einem Nonsense-Suppression-Phänotyp [Leeds et al., Genes & Dev., 5:2303-2314 (1991); Cui et al., (1995) oben].
Obgleich Stämme, die die mof4-1- und upf1Δ-Allele enthalten, beide die Abundanz von Nonsense-enthaltenden mRNAs erhöhen, haben Stämme, die diese Allele beherbergen, erheblich unterschiedliche Phänotypen. Zum Beispiel ist der mof4-1-Stamm gegenüber dem Aminoglykosid Paromomycin empfindlicher als ein upf1Δ-Stamm (Tabelle 2). Des Weiteren können upf1Δ-Stämme im Gegensatz zu einem mof41-Stamm das M₁-Killer-dsRNA-Virus unterstützen (Tabelle 2). Das 39 nm lange kodierte L-A-Viruspartikel weist eine ikosahedrale Symmetrie auf und setzt sich aus 59 Gag-Dimeren und 1 Dimer von Gag-Pol zusammen [Cheng et al., J. Mol. Biol., 224:255-258 (1994)]. Die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung von 1,9 % bestimmt die Stöchiometrie von Gag- zu Gag-Pol-Protein. Ein Ändern der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung wirkt sich auf die Fähigkeit von Zellen aus, M₁ zu vermehren [Dinman und Wickner, (1992) oben]. Der Verlust von M₁ in mof4-1-Stämmen kann nicht mit dem Stabilisieren der Leserastersprung-enthaltenden L-A-mRNA erklärt werden. Eine Überexpression der L-A-mRNA aus einem cDNA-Klon überträgt einen Ski^–-Phänotyp (Ski = Superkiller) auf Hefezellen [Wickner et al., J. Virol., 65:151-161 (1991); Masison et al., Mol. Cell. Biol., 15:2763-2771 (1995)], das Gegenteil des Mak^–-Phänotyps. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das mof4-1-Allel des UPF1-Gens die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung spezifisch beeinflusst, wodurch das Verhältnis der synthetisierten Gag- zu Gag-Pol-Produkten geändert wird. Interessanterweise begünstigen Stämme, die die upf1Δ-, upf1-2-, upf2Δ-, upf3-1-Allele enthalten, die alle den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg gleichwertig zum mof4-1-Allel inaktivieren, den Verlust von M₁ nicht (Tabelle 2). Dies steht mit der Auffassung im Einklang, dass ein einfaches Stabilisieren des L-A-mRNA an sich nicht den Verlust des M₁-RNA-Virus begünstigt. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass mof4-1 ein einzigartiges Allel des UPF1-Gens ist, das die Abundanz von Nonsense-enthaltenden mRNAs anhebt, die Effizienz von gerichtetem ribosomalem –1-Leserastersprung steigert und diese Zellen gegenüber Paromomycin sensibilisiert.
Eine einzige Cys→Tyr-Änderung am Kodon 62 in dem UPF1-Gen weist das mof4-1-Allel des UPF1-Gens nach (4). Diese Mutation befindet sich in der aminoterminalen, an Cystein reichen Region des UPF1-Gens (4). Eine Genanalyse des UPF1-Gens, die die Rolle des upf1p beim mRNA-Turnover und der Nonsense-Suppression untersuchte, demonstrierte, dass eine aminoterminale Deletion, die die an Cystein reiche Region des UPF1-Gens entfernte, dessen Zerfallsaktivität von dessen Funktion bei der Translationstermination trennte. Zellen, die ein upf1-Allel beherbergen, in dem die Zinkfingerregion deletiert wurde, waren dazu in der Lage, Nonsense-enthaltende Transkripte effizient abzubauen, inaktivierten jedoch dessen Translationsterminationsaktivität, was eine Suppression von Nonsense-Allelen ermöglicht. Zusammengenommen demonstrieren diese Beobachtungen weiter, dass upf1p Aktivitäten aufweist, die am mRNA-Zerfall sowie am Modulieren mehrerer Gesichtspunkte des Translationsprozesses beteiligt sind. Das mof4-1-Allel ist einzigartig, da diese Läsion die Aktivität des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfalls inaktiviert und den programmierten translationellen Leserastersprung modifiziert.
Die hier beschriebenen Ergebnisse demonstrieren, dass das Nutzen von nur Leserastersprung-Reporter-Screenings zum Identifizieren von ribosomale Leserastersprungmutanten unzureichend ist. Die upf1Δ-, upf1-2-, upf1-1-, upf1Δ-, upf3- 1-, ifs1-, ifs2- und mof8-Mutanten erzielen ein positives Resultat in Reporter-Screenings, wirken sich jedoch nicht auf die Erhaltung des M₁-dsRNA-Virus aus (Tabelle 2 und nicht gezeigte Daten). Folglich ermöglicht der MAK-Phänotyp uns, Mutationen, die die Effizienzen von ribosomalem Leserastersprung beeinflussen, von den Mutationen, die sich nur auf den mRNA-Turnover auswirken, zu unterscheiden.
Eine Virusverpackung erfordert die adäquate Stöchiometrie von synthetisierten Gag- zu Gag-Pol-Proteinen. Dies wird oftmals mittels ribosomalem Leserastersprung oder Suppression von Nonsense-Mutationen erreicht. Dass die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in mof4-1-Zellen als Antwort auf zunehmende Dosen von Paromomycin angehoben wird, ist wichtig, da es demonstriert, dass ein Arzneimittel Leserastersprungeffizienzen modulieren kann, was die Auffassung unterstützt, dass der ribosomale Leserastersprung als ein potentielles Ziel für antivirale Verbindungen dienen kann. Es wird erwartet, dass die Identifizierung und die Charakterisierung von Genprodukten, die an diesen Prozessen beteiligt sind, und von Arzneimitteln, die diesen Prozess modulieren, zu Therapeutika zum Bekämpfen von Viruserkrankungen führen werden.
BEISPIEL 2: Analyse von mof2-1 und sui1-1 auf genetischer und molekularer Ebene
mof2-1 ist insofern sehr interessant, dass 1) er von allen mof-Mutanten die höchste Steigerung der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung verleiht, 2) er das M₁-Satellitenvirus nicht vermehren kann, 3) er temperaturempfindlich ist, mit einem klassischen, vom Zellzyklus abhängigen Arrestphänotyp, und 4) er auch einen mutierten Phänotyp (Upf) mit Nonsense-vermitteltem mRNA-Zerfall aufweist. Ein Klon des SUI1-Gens war dazu in der Lage, die Temperaturempfindlichkeit, den Leserastersprung und die Upf-Phänotypen von mof2-1-Mutanten zu komplementieren. Auf Grundlage dieses Ergebnisses schlägt dieses Beispiel vor: A) mof2-1 und sui1-1 auf genetischer und molekularer Ebene zu analysieren; B) zu bestimmen, ob das menschliche Homologon des SUI1-Gens von Hefe, hISOSUI1, die verschiedenen mutierten Phänotypen von mof2-1-Zellen komplementieren kann, und C) die Hypothese zu prüfen, dass das Mof2-Protein (Mof2p) ein allgemeiner Regulator der Translationstreue ist, der die Translationsreinitiationsraten erhöht und/oder sich als ein stimulierender Faktor auf die Nukleotidtriphosphat-Hydrolyse (NTP-Hydrolyse) auswirkt.
Genetische und molekulare Analyse von mof2-1. 5A stellt eine Karte des ursprünglichen Klons (p18), der den mof2-1-Phänotyp komplementieren konnte, bildlich dar. Die Deletionsanalyse hatte offenbart, dass ein Subklon von p18, der das SUI-Gen beherbergt, 1) den ts^–-Wachstumsdefekt, 2) den Nonsense-vermittelten mRNA-Defekt und 3) den Mof-Phänotyp von mof2-1-Zellen komplementieren konnte. Der erste Satz von Versuchen wurde entworfen, um zu ermitteln, ob MOF2 zu SUI1 allelisch ist. Alle Sporenklone, die aus einer genetischen Kreuzung von mof2-1 mit sui1-1-Mutanten erzeugt wurden, waren bei 37 °C für Wachstum temperaturempfindlich, was ein Beweis dafür ist, dass mof2-1 und sui1-1 zu derselben Komplementationsgruppe gehören. In einem zweiten Versuch wurde ein auf URA3 basierender, Hefe integrierender Vektor unter Verwendung eines Hefe-DNA-Fragments, das stromabwärts des SUI1-Gens liegt (das H3-zu-SalI-Fragment von p18) konstruiert. Dieser wurde mit SphI linearisiert und in die DNA von einem mof1-1-/diploiden Wildtypstamm integriert. Nach einer Southern-Analyse, um zu ermitteln, dass das Fragment an der korrekten Position eines der Chromosome integriert wurde, wurde in der diploiden Zelle Sporen gebildet und die resultierenden Sporenklone wurden analysiert. Der Ura3⁺-Phänotyp segregierte stets zusammen mit dem Mof2-1-Phänotyp, was zeigt, das die DNA-Sequenz von p18 (die mit SUI1 physikalisch verbunden ist) auch mit dem mof2-1-Gen physikalisch verbunden war. Zusammengenommen beweisen diese Daten, dass mof2-1 ein Allel von SUI1 ist. Wir waren auch dazu in der Lage, zu demonstrieren, dass ein Plasmid, das das SUI1-Gen beherbergt, ermöglichte, dass mof2-1-Mutanten das M₁-Satellitenvirus vermehren.
Das mof2-1-Allel von SUI1 wurde unter Anwendung von PCR-Techniken (PCR = polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion) kloniert und wir waren dazu in der Lage, das gesamte Gen zu sequenzieren. Die Sequenzanalyse offenbarte, dass das mof2-1-Allel aus einer einzigen G→A-Basenmutation resultiert, die den Aminosäurerest 115 von einem hoch konservierten Glycin zu Arginin ändert (5B). Dies stellt ein einzigartiges sui1-Allel dar: Alle anderen sui1-Allele sind an den hoch konservierten D81- und Q82-Aminosäureresten innerhalb des Kontexts LQGDQR (SEQ ID NO: 12) geclustert [Yoon und Donahue, Mol. Cell. Biol., 12:248-260 (1992)). Diese Figur stellt auch ein vergleichendes Alignment der SUI1-Homologa von Menschen (SEQ ID NO: 1), Aedes sp (Moskitos) (SEQ ID NO: 2), Reis (SEQ ID NO: 3), S. cerevisiae (SEQ ID NO: 4) und Methanococcus sp (SEQ ID NO: 5) bildlich dar.
Das menschliche Homologon des SUI1-Gens von Hefe kann die Mof- und mutierten Nonsense-vermittelten mrNA-Phänotypen von mof2-1-Zellen komplementieren. Von mehreren Initiationsfaktoren von Säugetieren wurde gezeigt, dass sie die Defekte des Gegenstücks in Hefezellen komplementieren können, und das menschliche Homologon von SUI1 (hSUI1ISO1) wurde kloniert und sequenziert. Suis1p und hSUI1ISO1p haben 60 % Identität und 80 % Ähnlichkeit gemein (31). hSUI1ISO1 war dazu in der Lage, die Temperaturempfindlichkeit, die gesteigerte Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung, den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall und die M₁-Erhaltung-Phänotypen von mof2-1-Mutanten zu komplementieren. Diese Versuche demonstrieren die Aufrechterhaltung der Funktion zwischen homologen menschlichen und Hefegenen, was als noch ein weiteres Beispiel der grundlegenden biologischen Ähnlichkeit dieser zwei Organismen dient. Diese Beobachtungen sind in Bezug auf unsere Untersuchungen der Verbindung zwischen Translationsinitiation, Translationselongation und Nonsense-vermitteltem mRNA-Zerfall in Säugetiersystemen eine große Hilfe und helfen ebenfalls beim Prozess des Identifizierens von Proteinen, die als potentielle Ziele diesen können, für den rationalen Entwurf von antiviralen Mitteln, die den ribosomalen –1-Leserastersprung beeinflussen.
Weitere genetische Untersuchungen unter Verwendung der verschiedenen Formen von Sui1. Nachdem gezeigt wurde, dass mof2-1 ein einzigartiges Allel von SUI1 ist und dass das menschliche Homologon alle mof2-1-Phänotypen komplementieren kann, führten wir eine Reihe von Versuchen durch, um die genetischen Verbindungen zwischen ribosomalem Leserastersprung, Viruserhaltung und translationellen Lesefehlern, die die Suppression oder Translationsinitiationsmutationen resultieren, zu untersuchen. Um sich auf beste Weise damit zu befassen, wurden isogene Hefestämme konstruiert. Eine haploide Zelle, die das Wildtyp-SUI1-Gen auf einem URA3-Vektor mit niedriger Kopienanzahl beherbergt, wurde mit einem sui1-/Hefe integrierenden Vektor transformiert, wodurch die chromosomale Kopie des SUI1-Gens unterbrochen wurde. Nach der Selektion und der Bestätigung der Unterbrechung mittels Southern-Analyse wurden TRP1-Vektoren mit niedriger Kopienanzahl, die das Wildtyp-SUI1-Gen beherbergen, das mof2-1-Allel, das sui1-Allel oder hSUI1ISO1 in diesen Stamm eingeführt. Anschließend wurde der auf URA3 basierende Vektor aus der Zelle mit 5-Fluororotsäure (5-FOA) geheilt, wobei nur die TRP1-Vektoren in den Zellen zurückgelassen wurden. Eine weitere Genanalyse untersuchte die Mof- und Sui-Phänotypen von mof2-1, sui1-1 und hISOSUI1 im Vergleich (Tabellen 4 und 5).
Tabelle 4. Charakterisierung von Leserastersprungeffizienzen in isogenen MOF2/SUI1-Zellen.

* Diese Versuche wurden in mindestens drei verschiedenen Kolonien von jedem Stamm durchgeführt. Die Einheit von β-Galactosidase-Aktivität wurde als Aktivität/O.D.₆₀₀/-Stunde dargestellt und sie variierten um nicht mehr als 15 %. Die Erhaltung oder der Verlust des M₁-dsRNA-Virus wurde mittels sowohl M₂-Killer-Assay als auch RNA-Elektrophorese auf einem Agarosegel bestimmt.

Tabelle 5. His4^UUG-Suppression in SUI1/MOF2-Stämmen

* Diese Versuche wurden in den isogenen SUI1/MOF2-Stämmen vorgenommen. Die Zahlen waren der Durchschnitt von Messungen in drei unabhängigen Kolonien. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde als Aktivität/O.D.₆₀₀/Stunde mit Variationen von nicht mehr als 15 % dargestellt.

Tabelle 4 zeigt die Charakterisierung von Leserastersprungeffizienzen in isogenen MOF2/SUI1-Zellen. Die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung von mof2-1-Zellen ist ungefähr 5 Mal höher als die von deren Wildtyp-Gegenstücken. sui1-1-Mutanten steigern ebenfalls die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung auf ungefähr das 2,5-fache über den Wildtyp-Niveaus. Dies ist jedoch für einen Anstieg, um den Verlust des M₁-Satellitenvirus zu begünstigen, nicht genug, d. h. nur die mof2-1-Mutation überträgt den Mof-Phänotyp auf Zellen. Das menschliche Homologon scheint völlig dazu fähig zu sein, das Hefegen zu ersetzen, was weiter die Auffassung einer evolutionären Aufrechterhaltung der Sui1p-Funktion unterstützt. Interessanterweise hatte keine der geprüften Formen von Sui1 eine Auswirkung auf von Tyl geförderten ribosomalen +1-Leserastersprung.
Tabelle 5 berichtet von den Sui-Phänotypen unserer Konstrukte. Diese Analyse zeigt, dass mof2-1-Zellen auch einen kompletten Sui^–-Phänotyp haben, was eine effiziente Suppression des his4^UUG-Allels fördert. Wiederum kann das menschliche Isogen das Hefegen komplementieren.
Charakterisierung des GCN4-Derepression-Phänotyps der sui1-1- und mof2-1-Mutanten. Das GCN4-Gen wird durch einen Translationskontrollmechanismus reprimiert, bei dem kurze offene Leseraster stromaufwärts des Gens (uORFs) in Gegenwart von abundanten Pools von aminoacylierten tRNAs translatiert werden. Dies bewirkt, dass sich Translationsribosome von der mRNA trennen, bevor sie dazu in der Lage sind, am Start der GCN4-Meldung zu reinitiieren. Unter Aminosäuremangelbedingungen wird GCN4 mittels erhöhter Reinitiationsniveaus am GCN4-Initiationskodon dereprimiert. Die sui2- (eIF-2α) und SUI3-Mutanten (eIF-2β) heben die Translationsrepression von GCN4 auf, was zu konstitutiv dereprimierter GCN4-Expression und HIS4-Transkriptionsaktivierung, die von der Aminosäurenverfügbarkeit unabhängig ist, führt.
Wir prüften, ob die mof2-1-, sui1-1- und hSUI1ISO1-Formen ebenfalls GCN4 dereprimieren konnten, durch Messen der β-gal-Aktivität, die aus GCN4-lacZ-Fusionskonstrukten exprimiert wurde. Die GCN4-lacZ-Enzymaktivität dereprimiert etwa 10-fach als Antwort auf Histidinmangel in Wildtypzellen (38). Wenn die sui1-1- und mof2-1-Mutationen eine erhöhte GCN4-lacZ-Expression ergeben hätten, würde dies nahe gelegt haben, dass diese Mutationen wie die sui2- und SUI3-Mutationen die Translationskontrolle der GCN4-mRNA unterbrechen. 7 zeigt, dass weder mof2-1 noch sui1-1 die GCN4-Expression dereprimieren. Dies legt nahe, dass die scheinbaren Steigerungen des ribosomalen –1-Leserastersprungs nicht in erhöhten Niveaus ribosomaler Reinitiation oder interner Initiation in der „out of frame"-lacZ-Reporter-mRNA begründet liegen, was weiter die Auffassung unterstützt, dass die mof2-1-Mutanten und in geringerem Maße die sui1-1-Mutanten wahrhaftig ihre Wirkungen auf der Ebene des ribosomalen –1-Leserastersprungs ausüben.
Auf die biochemische Charakterisierung von Sui1p gerichtete Versuche. Klone von SUI1, mof2-1, sui1-1 und hSUI1ISO1, die das an ihre N-terminalen Enden markierte FLAG-Epitop enthalten, wurden hergestellt, um Sui1p biochemisch zu bewerten. Diese Klone konnten das Hefezellwachstum in Abwesenheit anderer Formen von SUI1 unterstützen, was zeigt, dass die Addition der Epitop-Marker die Sui1p-Funktion nicht beeinträchtigt. Wir waren zudem dazu in der Lage, diese rekombinanten Proteine unter Verwendung von Vektoren mit hoher Kopienanzahl in E. coli zu exprimieren, und konnten große Mengen reinen Proteins unter Anwendung von Immunaffinitätssäulen isolieren.
Wir entwickelten außerdem ein In-vitro-Assay auf ribosomalen –1-Leserastersprung mit Extrakten von Hefezellen. Vorläufige Versuche unter Verwendung der oben beschriebenen isogenen Stämme haben demonstriert, dass das in vivo beobachtete allgemeine Muster für das In-vitro-System gilt, da. h. dass die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung ungefähr 5 Mal höher als in Extrakten von mof2-1-Zellen und 2 Mal höher als in Extrakten von sui1-1-Zellen ist (Daten nicht gezeigt).
Untersuchungen der möglichen Ribosomassoziierung des Sui1p, Mof2-1p, Sui1-1p und hISOSUI1p. Die Tatsache, dass mof2-1 auf sowohl den ribosomalen –1-Leserastersprung als auch den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall Auswirkungen hat, legt nahe, dass Sui1p über die Initiation hinaus an Translationsprozessen beteiligt sein kann. Western-Blots von Polysomfraktionen können mit einer Sonde auf das Sui1p geprüft werden, um zu bestimmen, ob dieses Protein in den sich verlängernden Ribosomen vorliegt. Zum Beispiel kann in Zellen, die FLAG-markierte Sui1-Proteine beherbergt, ein Anti-FLAG-Antikörper zum Sichtbarmachen der Sui1p-Banden verwendet werden. Sui1p in den Fraktionen, die sich verlängernden Ribosomen entsprechen, können dann mit den aus Extrakten von Zellen, die FLAG-markierte mof2-1- und sui1-1-Mutationen beherbergen, gesammelten verglichen werden. Die Polysomprofile können unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt werden, z. B. Wachstumsrate, Temperatur, Behandlung mit Arzneimittel (Cycloheximid, Puromycin) und Salzkonzentrationen. Eine alternative Vorgehensweise besteht darin, logarithmisch wachsende Zellen sanft zu lysieren und sie unter Anwendung von Gelfiltrationstechniken zu fraktionieren. Ein Anti-TCM1-Antikörper (ribosomales Protein L3) kann zum Identifizieren der verschiedenen Ribosomfraktionen verwendet werden. Polysomfraktionen, die mit Ribosomen in der Elongationsphase korrelieren sollten, werden größer als die Monosomfraktionen sein und sollten als solche eher aus der Säule eluieren. Diese Fraktionen können mit dem Anti-FLAG-Antikörper als einer Sonde auf die verschiedenen FLAG-markierten Sui1p-Isoformen geprüft werden. Quantitative Western-Blot-Techniken können in dem Bestreben, qualitative Unterschiede beim Binden der verschiedenen Sui1p-Isoformen zu erkennen, verwendet werden.
Untersuchen der Auswirkungen von gereinigtem Wildtyp, Mof2-1p, Sui1-1p und hSUIISOp auf die GTP-Hydrolyse mit gereinigten G-Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie an der Elongationsphase der Translation beteiligt sind. Standardassays werden angewendet, um die Baseline-Raten der GTP-Hydrolyse von EF-1α und EF-2β zu bestimmen [Kinzy und Woolford, Genetics, im Druck; Merrick, Enzymol., 60:108-123 (1979); Perentesis et al., J. Biol. Chem., 267:1190-1197 (1992)]. Die verschiedenen gereinigten Isoformen unserer Sui1ps werden zu diesen Reaktionen gegeben, um ihre Auswirkungen auf die Raten der GTP-Hydrolyse zu ermitteln. Mit Sui1p verstärkte GTP-Hydrolyse durch eines oder beide dieser Proteine würde eine Schlussfolgerung unterstützen, dass Sui1p auch während der Translationselongation agiert.
Untersuchen der Auswirkungen von gereinigtem Wildtyp, Mof2-1p, Sui1-1p und hSUI1ISOp auf die ATP-Hydrolyse mit gereinigtem Upf1p, von denen bekannt ist, dass sie an der Elongationsphase der Translation beteiligt sind. Die Beobachtung von entweder stimulierenden oder inhibierenden Auswirkungen belegt die Beteiligung von Sui1p am Peptidyltransferschritt der Translationselongation (die Nonsense-Suppression erfolgt bei der Termination, die beim Peptidyltransferschritt erfolgt). Im Fall, dass die Auswirkungen von Sui1p auf Upf1p-vermittelte ATP-Hydrolyse beobachtet werden, können die Auswirkungen der Sui1p-Isoformen ebenfalls untersucht werden. Wenn Sui1p die Upf1p-vermittelte ATP-Hydrolyse beeinflusst, werden etwaige Veränderungen der stimulierenden/inhibierenden Auswirkungen von Sui1p auf die Upf1p-Mutanten von besonderem Interesse sein.
Gendosierungsversuche. Diese Versuchen sind dazu entworfen, zu bestimmen, ob die Überexpression von EF-1α, EF-2β oder Upf1p entweder die mof2-1- oder die sui1-1-Mutationen unterdrücken kann. mof2-1- und sui1-1-Zellen können mit Plasmiden mit hoher Kopienanzahl, die die Wildtyp-TEF2-, -EFT1- oder -UPF1-Gene beherbergen, transformiert werden. Die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung, die Fähigkeit, M₁ zu erhalten, die Nonsense-vermittelte Zerfall-Phänotypen und die Fähigkeit, das his4^UUG-Allel zu unterdrücken, können bewertet werden.
BEISPIEL 3: Identifizierung von Arzneimitteln, die den ribosomalen Leserastersprung modifizieren und die Virusvermehrung inhibieren
Ein bedeutender Schritt bei der Virusvermehrung ist die Assembly des Viruspartikels, die zum Teil von der Verfügbarkeit der korrekten relativen Mengen von Virusproteinen abhängt. Folglich sind, obgleich die Erhaltung des translationellen Leserasters als für die Integrität des Translationsprozesses und letztlich das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit der Zellen grundlegend betrachtet wird, Fälle beschrieben worden, in denen Ribosome zum Verschieben des Leserasters durch Virussignale ausgerichtet werden, um die adäquaten Verhältnisse von strukturellen (Gag) zu enzymatischen (Gag-Pol) Proteinen, die für die Viruspartikel-Assembly verfügbar sind, sicherzustellen. Solche Signale des ribosomalen Leserastersprungs sind größtenteils in RNA-Viren zu sehen, z. B. Retroviren und retrotransponiblen Elementen, Coronaviren, Astroviren, Totiviren und einigen unsegmentierten (+) ss-RNA-Viren von Pflanzen. Der ribosomale Leserastersprung wurde ebenfalls im Bakteriophagen T7 und einer Reihe von bakteriellen Transposonen sowie in einen wenigen bakteriellen zellularen Genen und einem chromosomalen Gen eines Säugetiers beschrieben. Ereignisse eines viralen Leserastersprungs produzieren Fusionsproteine, in denen die N- und C-terminalen Domänen von zwei verschiedenen, überlappenden offenen Leserastern kodiert werden. Ribosomaler Leserrastersprung in der –1-Richtung erfordert eine heptamere Sequenz, X XXY YYZ (das 0-Raster ist durch Leerzeichen angezeigt), die als „slippery site" (rutschige Stelle) bezeichnet wird [Jacks und Varmus, Science 230:1237-1242 (1985)]. Das gleichzeitige Rutschen von ribosomgebundenen tRNAs an der A- und der P-Stelle um eine Base in der 5'-Richtung hinterlässt dennoch ihre nicht wackligen Basen im neuen Leseraster korrekt gepaart. Ribosomgebundene tRNAs müssen zunächst die Paarung mit dem 0-Raster aufbrechen und dann erneut ein Paar mit ihren nicht wackligen Basen und dem –1-Raster bilden. Ein zweites den Leserastersprung förderndes Element, für gewöhnlich ein RNA-Pseudoknoten, ist direkt 3' zu der „slippery site" angeordnet. Der mRNA-Pseudoknoten veranlasst das Ribosom, über der „slippery site" zu pausieren, während die ribosomalen A- und P-Stellen von Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) bzw. Peptidyl-tRNA-Spezies belegt werden. Es wird geglaubt, dass der RNA-Pseudoknoten das ribosomale Pausieren über der „slippery site" begünstigt, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer ribosomalen Bewegung am 5'-Ende erhöht wird [Somogyi et al., Mol. Cell. Biol. 13:6931-6931 (1993); Tu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8636 (1992)].
Die Auswirkungen von zwei Peptidyltransferaseinhibitoren, Anisomycin und Sparsomycin, auf die Effizienzen von ribosomalem Leserastersprung und auf die Vermehrung von Hefe-dsRNA-Viren wurden untersucht. Diese Arzneimittel modifizieren spezifisch die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung, jedoch nicht von ribosomalem +1-Leserastersprung sowohl in vivo als auch in vitro und fördern den Verlust von zwei Viren (L-A und L-BC), die einen ribosomalen –1-Leserastersprung in Hefezellen, die in subletalen Dosen dieser Arzneimittel kultiviert wurden, nutzen. Beide diese Arzneimittel ändern auch die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in einem Kaninchen-Reticulozyt-System, was nahe legt, dass sie Anwendungen für RNA-Viren von höheren Eukaryonten finden, die ebenfalls diesen Translationsregulationsmechanismus nutzen. Unsere Ergebnisse bieten einen neuen Satz von Verbindungen zu dem Arsenal von antiviralen Mitteln, die einen potentiell großen Bereich von Anwendungen in den klinischen, tiermedizinischen und landwirtschaftlichen Gebieten aufweisen.
Um die Auswirkungen dieser Arzneimittel auf die Effizienzen von ribosomalem Leserastersprung in vivo zu untersuchen, wurde Selektivmedium, das die angegebenen Konzentrationen von Anisomycin oder Sparsomycin enthält, mit gleichen Mengen logarithmisch wachsender Hefezellen, die die Plasmide der 0-Raster-Kontrolle (pTI25), von L-A abgeleitetem Testpartner auf ribosomalen –1-Leserastersprung (pF8) oder von Tyl abgeleitetem Testpartner auf ribosomalen +1-Leserastersprung (pJD104) beherbergen [Balasundram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:172 (1994)], inokuliert und spezifische Zeiträume lang bei 30 °C inkubiert, woraufhin die β-Galactosidase-Aktivitäten (β-gal-Aktivitäten) bestimmt wurden. Zwei wichtige Informationssätze wurden aus diesen Versuchen gesammelt (8). Zunächst wurden als Indikatoren der Auswirkungen dieser Arzneimittel auf die Translation im Allgemeinen die β-gal-Aktivitäten von Zellen, die pTI25 enthielten und in unterschiedlichen Arzneimittelkonzentrationen gewachsen wurden, beobachtet. Dieser Datensatz zeigt, dass diese Arzneimittelkonzentrationen die Gesamttranslation nicht auf weniger als 80 % (Anisomycin) (8A) oder weniger als 50 % (Sparsomycin) (8B) der Kontrollen ohne Arzneimittel verringern. Der zweite Datensatz, die Messung der Effizienzen von ribosomalem –1- und +1-Leserastersprung, wurde durch Berechnen der Verhältnisse von β-gal, die von Zellen produziert wurden, die pF8 oder pJD104 beherbergen, geteilt durch die β-gal-Aktivitäten von Zellen, die pTI25 beherbergen, die in äquivalenten Konzentrationen der Arzneimittel gewachsen wurden, bestimmt. Hier zeigen die Daten, dass zunehmende Konzentrationen von Sparsomycin im Allgemeinen dazu neigen, die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung zu steigern (8C), wohingegen Anisomycin die entgegengesetzte Wirkung hatte, d. h. die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung verringerte (8D). Wie vorhergesagt hatte kein Arzneimittel eine Auswirkung auf den ribosomalen +1-Leserastersprung.
Um zu bestimmen, ob Veränderungen der unverarbeiteten Werte der β-gal-Aktivität eine Folge von entweder verringerten (Anisomycin) oder erhöhten (Sparsomycin) β-gal-Halbwertzeiten waren oder nicht, wurden die Auswirkungen dieser Arzneimittel nach einer Reihe unterschiedlicher Inkubationszeiträume gemessen. Die Ergebnisse blieben konsistent, d. h. längere Inkubationszeiten resultierten nicht in größeren Veränderungen der Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung (Daten nicht gezeigt). Um konsistent zu bleiben, wurden alle anschließenden In-vivo-Messungen des ribosomalen Leserastersprungs nach 6 Std. Inkubationen mit diesen Arzneimitteln geprüft. Scheinbare Veränderungen der Effizienzen von ribosomalem Leserastersprung könnten auch in verringerten (Anisomycin) oder erhöhten (Sparsomycin) Abundanzen der Leserastersprung-Reporter-mRNAs begründet liegen. Um sich damit zu befassen, wurde RNA aus Zellen in der mid-Log-Phase, die in unterschiedlichen Konzentrationen von Anisomycin oder Sparsomycin gewachsen wurden, extrahiert, gleiche Mengen von RNA wurden durch ein denaturierendes Agarosegel getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einer radioaktiv markierten lacZ-Sonde geprüft. Die Abundanzen der lacZ-mRNAs waren bei allen geprüften Konzentrationen der Arzneimittel gleich, was nahe legt, dass durch Arzneimittel hervorgerufene Veränderungen der Reporter-mRNA-Abundanz nicht für die scheinbaren Veränderungen der Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung verantwortlich zeichneten (Daten nicht gezeigt).
Das Modell sagt auch vorher, dass Wirtszellen, die Mutationen in Genprodukten beherbergen, die an der Bildung des Peptidyltransferasezentrums beteiligt sind, 1) Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung aufweisen sollten, die sich von denen von Wildtypzellen unterscheiden, und 2) Virusvermehrungsdefekte aufweisen sollten, und 3) weder Anisomycin noch Sparsomycin etwaige weitere Auswirkungen auf die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung haben sollten. Das TCM1-Gen (MAK8-Gen) kodiert das ribosomale Protein L3 [Fried und Warner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:238 (1981); Fried und Warner, Nucl. Acids Res., 10:3133 (1982); Wickner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4706 (1982)) und mak8-Mutanten stellen einen adäquaten Test auf diese Kriterien bereit. tcm1/mak8-Mutanten können M₁ nicht erhalten und sie sind gegenüber Anisomycin und einer Vielfalt von anderen Peptidyltransferaseinhibitoren resistent [Jiminez et al., Biochim. Biophys. Acta 383:427 (1975)). Die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in mak8-2-Zellen in Abwesenheit von Arzneimitteln wurde als ungefähr 5,2 % bestimmt (9A, 9B, kein Arzneimittel). Dieser Wert ist 2,9 Mal höher als Wildtypzellen (1,8 %), was mit der Auffassung im Einklang steht, dass Bedingungen, die sich auf das Peptidyltransferasezentrum auswirken, die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung verändern sollten. Wie vorhergesagt wirkte sich keines dieser Arzneimittel auf die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung aus (9C, 9D).
Obwohl zunehmende Dosen von entweder Anisomycin oder Sparsomycin dazu neigen, die Translation in Wildtypzellen in vivo zu inhibieren, haben sie entgegengesetzte Auswirkungen auf die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung. Um zu ermitteln, ob diese Arzneimittel im selben Schritt der Translation wirken, wurde ein Mischversuch geprüft (10). Diese Ergebnisse zeigen, dass Anisomycin und Sparsomycin in Bezug auf Auswirkungen auf den ribosomalen –1-Leserastersprung einander aufheben. Dies steht mit der Tatsache im Einklang, dass sie beide im Peptidyltransferaseschritt der Translation wirken, unterscheidet jedoch nicht dazwischen, ob sie um dieselben, überlappende oder separate Bindungsstellen konkurrieren.
Durch Verändern der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung sollten diese Arzneimittel das Verhältnis von Gag- zu Gag-Pol-Proteinen, die für die Viruspartikel-Assembly verfügbar sind, verändern, wobei infolgedessen die Virusvermehrung beeinträchtigt wird. Um sich damit zu befassen, wurden Wildtypzellen in reichem Medium, das unterschiedliche Konzentrationen von entweder Anisomycin oder Sparsomycin enthielt, kultiviert. Nach 24, 48, 72, 96 oder 120 Std. wurden Aliquots von Zellen zwecks einzelner Kolonien auf reichem Medium ausgestrichen, die dann auf Indikator replikaplattiert wurden, um ihre Killerphänotypen zu bewerten. 11A, 11B zeigen diesen Verlust des Killerphänotyps, der mit sowohl zunehmender Arzneimitteldosierung und Faltungsveränderungen der Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung korreliert wurde. Obwohl der Killerphänotyp in JD88-Zellen in Abwesenheit von Arzneimitteln stabil erhalten wird, resultierte das Wachstum in 3,8 μM Anisomycin darin, dass ungefähr 53 % der gesamten koloniebildenden Einheiten das Killermerkmal nach nur 48 oder 72 Stunden verloren (11A). Noch drastischer resultierte das Wachstum in Gegenwart von 2,6 μM Sparsomycin in 70 %-75 % Verlust des Killerphänotyps (11B).
Um zu ermitteln, ob der Verlust des M₁-Satellitenvirus für den Verlust des Killerphänotyps verantwortlich zeichnete, wurde eine Nicht-Killer-Kolonie (K^–-Kolonie) aus jeder Arzneimittelkonzentration in dem 72-Std.-Datensatz wahllos ausgewählt und die Gesamtnukleinsäuren (total nucleic acids, TNA) wurden extrahiert [Park et al., Virology 216:451 (1996)]. Ungefähr gleiche Mengen von TNA wurden durch ein 1%-iges nichtdenaturierendes TAE-Agarosegel getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt (12A). Wie erwartet lag die 1,8 kb lange M₁-ds-RNA-Bande in den K^–-Proben (mit Arzneimittel behandelten Proben) nicht vor. Des Weiteren scheint L-A durch dies Arzneimittel geheilt worden zu sein. Um dies zu bestätigen, wurde die RNA in dem Gel denaturiert, auf Nitrocellulose übertragen und mit mit [³²P]CTP markierten L-A- und M₁(+)-Strang-RNA-Sonden hybridisiert. 12B bestätigt, dass diese Proben mit keiner der Sonden hybridisieren, was bestätigt, dass der Verlust des Killerphänotyps eine Folge des Verlusts von L-A war, was die Auffassung unterstützt, dass durch Arzneimittel hervorgerufene Veränderungen der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung die Assembly und Vermehrung von L-A-Viruspartikeln beeinträchtigte.
Vor kurzem wurde die cDNA-Sequenz von L-BC (auch als La bekannt), ein ubiquitärer geringerer dsRNA-Virus von Hefe, bestimmt [Park et al., oben]. L-BC wendet ebenfalls den klassischen Mechanismus des ribosomalen –1-Leserastersprungs bei der Produktion seiner Gag-Pol-Fusion an. Von L-BC wurde jedoch gezeigt, dass er viel schwieriger aus Zellen zu heilen ist als L-A [Hopper et al., J. Biol. Chem. 252:9010 (1977)]. Interessanterweise scheint die L-BC-dsRNA-Bande nach 72 Std. bei Konzentrationen von Anisomycin von 3,8 μM ebenfalls zu fehlen (12A). Es steht jedoch keine für L-BC spezifische Sonde zur Verfügung und dies konnte nicht mittels Northern-Blot bestätigt werden. Diese Daten legen jedoch nahe, dass durch Anisomycin induzierte Abnahmen des ribosomalen –1-Leserastersprungs neben der Förderung des Verlusts von L-A und M₁ auch den Verlust von L-BC begünstigen.
Die spezifischen Wirkungen von Antibiotika auf den Translationsapparat wurden klassisch mit In-vitro-Systemen geprüft. Um die Auswirkungen von Anisomycin oder Sparsomycin in vitro zu testen, wurde ein auf Hefe basierendes In-vitro-Translationssystem zum Überwachen der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung unter Verwendung eines auf Luciferase basierenden Reportersystems eingesetzt. Das System setzte sich aus translationsfähigen Hefeextrakten aus einem L-A-o-, L-BC-o-Wildtypstamm zusammen, zu dem entweder eine 0-Raster-Kontrolle oder Luciferase-Reporter-mRNAs als Testpartner auf ribosomalen –1-Leserastersprung zugegeben wurden. 13 zeigt, dass die in vivo beobachteten Tendenzen mit dem In-vitro-System reproduzierbar waren, d. h. zunehmende Konzentrationen von Anisomycin verringerten die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung, wohingegen zunehmende Konzentrationen von Sparsomycin die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung steigerten. Zwischen dem In-vivo-System und dem In-vitro-System wurden einige interessante Unterschiede beobachtet. Erstens sind die effektiven Konzentrationen dieser Arzneimittel in vitro drei Größenordnungen niedriger, was höchstwahrscheinlich eine Widerspiegelung der Arzneimittelaufnahme und des Stoffwechsels in intakten Zellen ist. Zweitens stimulieren beide Arzneimittel bei diesen niedrigeren Arzneimitteldosen zunächst die Luciferaseproduktion von der LUC0-Reporter-mRNA. Die Tendenzen des ribosomalen Leserastersprungs bleiben jedoch selbst im Stimulationsbereich gleich. Drittens ist die Baseline-Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in vitro erheblich höher als in vivo. Dies könnte auf Unterschiede der Stabilitäten der Reporter-mRNAs in den zwei Systemen hinweisen. Da die Reporter-mRNA mit ribosomalem –1-Leserastersprung zwei „in-frame"-Terminationskodons innerhalb der ersten 200 Basen ihrer 3,3 kb langen mRNA aufweist, stellt sie eine Nonsense-mRNA dar. Dies macht sie zu einem Substrat zum Angriff durch den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg. In der Tat stabilisieren Zellen, die Mutationen in Genen beherbergen, die an diesem Weg beteiligt sind, diese Reporter-mRNA und ergeben scheinbar gesteigerte Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung in vivo. Die beobachteten Unterschiede der Baseline-Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung können ein Hinweis darauf sein, dass der Nonsense-vermittelte mRNA-Zerfallsweg in dem In-vitro-Translationssystem möglicherweise zum Teil oder vollständig inaktiviert ist. Das In-vitro-System unterscheidet sich auch dadurch, dass es den RNase-Inhibitor RNAsin enthält, der dabei helfen kann, die LUC-1-Reporter-mRNA vor allgemeinem nukleolytischen Angriff zu stabilisieren. Diese Faktoren zeichnen höchstwahrscheinlich für in diesem beobachtete höhere Baseline-Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung und andere Berichte unter Verwendung von In-vitro-Translationssystemen verantwortlich und unterstreichen die Bedeutung der Verwendung von in vivo bestimmten Effizienzen von ribosomalem Leserastersprung als zuverlässigere Indikatoren von viral bestimmten Gag-zu-Gag-Pol-Verhältnissen.
Anisomycin und Sparsomycin beeinflussen die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung und die Virusvermehrung in Hefe: Lassen sich diese Ergebnisse auf höhere Eukaryonten übertragen? Als ein erster Schritt wurden die LUC0- und LUC-1-mRNAs zum Messen der Auswirkungen dieser zwei Arzneimittel auf die Translation und den ribosomalen –1-Leserastersprung in einem In-vitro-Kaninchen-Reticulozyt-Translationssystem verwendet. 14 zeigt, dass dieselben allgemeinen Tendenzen, die in den auf Hefe basierenden Systemen erkannt wurden, in dem Reticulozytsystem rekapituliert wurden, d. h. Anisomycin inhibiert und Sparsomycin stimuliert den ribosomalen –1-Leserastersprung. Es wurden einige bemerkenswerte Unterschiede beobachtet. Erstens waren die Reticulozytextrakte gegenüber Anisomycin ungefähr 10 Mal empfindlicher und gegenüber Sparsomycin 100 Mal empfindlicher, als es die Hefeextrakte waren. In diesem Bereich von Konzentrationen stimulierten beide Arzneimittel die Gesamtproduktion von Luciferase von der LUC0-mRNA, was mit den Daten eines niedrigeren Arzneimittelkonzentrationsbereichs aus dem Hefeextraktsystem nicht konsistent ist. In Bezug auf den ribosomalen –1-Leserastersprung war das Reticulozytsystem gegenüber beiden Arzneimitteln viel empfindlicher. Die höchste Konzentration von Anisomycin (15,2 nM) verringerte die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung auf nur 3 % der Kontrolle ohne Arzneimittel, was diesen gewissermaßen stilllegt. Die höchste Konzentration von Sparsomycin stimulierte den ribosomalen –1-Leserastersprung 14-fach oder von ungefähr 6 % in der Kontrolle ohne Arzneimittel auf nahezu 84 %, d. h. nahezu genauso viele Ribosome wurden zum Verschieben des Leserasters veranlasst, wie im Leseraster verblieben. Wie mit dem In-vitro-Hefe-Translationssystem waren anfängliche Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung höher als in vivo beobachtet, was wiederum höchstwahrscheinlich in der Stabilisierung der LUC-1-mRNA in diesem System begründet lag.
Antivirale Aktivitäten dieser Antibiotika wurden ebenfalls gegen HIV geprüft. 15 zeigt, dass diese Arzneimittel die HIV-Virustiter bei Konzentrationen von Anisomycin, die 1500 Mal niedriger als die Mindestinhibitionskonzentration von Anisomycin (die Anisomycin-MIK beträgt etwa 1,5 μg/ml) und 50 Mal niedriger als die MIK von Sparsomycin (Sparsomycin-MIK = 50 ng/ml) waren, auf ungefähr 30 % der Kontrollen ohne Arzneimittel reduzieren. Folglich verfügen diese zwei Peptidyltransferaseinhibitoren über die antiviralen Eigenschaften, die von dem in 1 vorliegenden Modell vorhergesagt wurden, bei Konzentrationen, die weit unter den für die menschlichen Wirtszellen toxischen Niveaus liegen.
BEISPIEL 4: Darlegung von nicht-redundanten Phänotypen der Upf-Proteine
Das TCM1-Gen kodiert das ribosomale 60S-Untereinheit-Protein L3, das als ein Bestandteil in Verbindung gebracht wurde, der an der Peptidyltransferase-Aktivität beteiligt ist (Schulz und Nierhaus, 1982). TCM1 ist mit MAK8 identisch, einem Gen, das zur Erhaltung und Vermehrung des doppelsträngigen M₁-RNA-Satellitenvirus erforderlich ist. Ein genomisches Fragment von TCM1/MAK8 (L3Δ), das die 100 N-terminalen Aminosäuren von L3 kodiert, wurde als ein Antisuppressor von upf2-1 isoliert, einem mutierten Allel, das Nonsense-enthaltende mRNAs stabilisiert. Dieses Fragment kann auch als ein Antisuppressor von upf1-2, jedoch nicht upf3-1 wirken, zwei anderen Allelen, die am Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg beteiligt sind. Ein vollständiger Klon von TCM1/MAK8 weist diese Antisuppressor-Aktivität nicht auf. Die Expression von L3Δ hat keine Auswirkung auf die Stabilität von Nonsense-mRNAs in entweder Wildtyp- oder mutierten upf-Zellen. Die Expression des L3Δ-Fragments übertrug einen Mof-Phänotyp auf Wildtypzellen, wodurch die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung, jedoch nicht von ribosomalem +1-Leserastersprung gesteigert wurde, und die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung ist auch in einem mak8-Stamm erhöht. Polysomprofile von Stämmen, die das L3Δ-Fragment beherbergten, zeigten im Vergleich zu Wildtypzellen reduzierte Spiegel von 60S-Untereinheiten, ein charakteristisches Merkmal der meisten mak-Mutanten, und Killer-Assays demonstrierten, dass die episomale Expression des L3Δ-Fragments einen dominanten negativen Mak^–-Phänotyp auf Wildtyp- und Ski^–-Stämme übertrug. upf1- und upf2-Mutanten sind normalerweise dazu in der Lage, M₁ zu erhalten, und die Expression von L3Δ erhöht die Raten des Killerverlusts in diesen Zellen. upf3-Mutanten haben einen schwachen Mak^–-Phänotyp, der in Gegenwart von L3Δ vollständig wird. Diese Daten implizieren die Beteiligung des Peptidyltransferasezentrums an der Erhaltung des Leserasters bei der Erhaltung, unabhängig von dem Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg.
Materialien und Verfahren
Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim, New England Biolabs und BRL bezogen. Radioaktive Nukleotide wurden von entweder NEN oder Amersham bezogen. In diesen Studien verwendete Oligonukleotide wurden vom UMDNJ-RWJ-DNA-Synthesezentrum erworben.
Isolierung und Charakterisierung des L3Δ-Klons. YCp50 (Ausubel et al., 1992) und YCplac33 (Gietz und Sugino, 1988) wurden in diesen Studien verwendet. Der L3Δ-Klon wurde aus einer genomischen YCp50-Hefe-Bibliothek (von ATCC erworben) isoliert, die wie zuvor beschrieben aus einem partiellen Sau3A-Verdau hergestellt wurde (Cui et al., 1995). In Kürze, der upf2-1-his4-38-SUF1-1-Stamm PLY135 wurde mit dieser Bibliothek transformiert und insgesamt 5000 Ura⁺-Transformanten wurden mittels Replikaplattierung auf Minimalmedium, dem Uracil und Histidin fehlte, gescreent und 3 Tage bei entweder 30 °C oder 37 °C gewachsen. Kolonien, die bei 30 °C, jedoch nicht bei 37 °C wuchsen, wurden gesammelt und erneut geprüft. Neun Stämme, die Plasmide beherbergen, wurden isoliert (YPF2-1 bis YPF2-9). Um zu bestätigen, dass der Verlust der Suppression in dem Plasmid begründet liegt, wurden die transformierten Stämme mit Fluororotsäure (5-FOA) geheilt (Rose et al., 1990) und auf ihre Fähigkeit, das Wachstum bei 37 °C auf Selektivmedium zu unterdrücken, geprüft. Die Plasmide wurden dann aus diesen Stämmen isoliert und in E. coli vermehrt. Von YPF2-4 und YPF2-9 wurde festgestellt, dass sie identisch waren (YCpA9 genannt), wobei jedes das L3Δ-Genfragment enthielt.
Subklonierung des L3Δ-Genfragments. YCpA9 wurde mittels Restriktionsendonukleasekartierung analysiert. Fragmente des DNA-Inserts in YCpA9 wurden in das Hefe-Centromerplasmid YCplac33 subkloniert: YCpESp (2,7 kb langes EcoRI-SphI-DNA-Fragment), YCpESp (4,2 kb langes EcoRI-SnaBI-DNA-Fragment), YCpBS (4,3 kb langes BglII-SalI-DNA-Fragment), YCpNS (3,5 kb langes NcoI-SalI-DNA-Fragment), YCpPS (0,9 kb langes PvulI-SalI-DNA-Fragment). Das Plasmid YCpdP ist ein Derivat von YCpA9, in dem das PvulI-DNA-Fragment deletiert wurde.
Markieren des L3Δ-Fragments mit dem FLAG-Epitop, Erzeugung eines L3Δ/β-gal-Fusionsproteins und Subklonierung. Oligo-5'-ATAGGATCCTTAACCGGCCGGACAGTAATA-3' (SEQ ID NO: 13), die dem 5'-Ende des TCM1-Gens entspricht, und Oligo-5'-ATAGGATCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCTCAAACCTCTTGGGGTT-3' (SEQ ID NO: 14), die die FLAG-Epitop-Sequenz enthält und zu dem 3'-Ende der kodierenden Region von L3Δ sequenzkomplementär ist, wurden für die PCR-Mutagenese (PCR = polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung von genomischer DNA aus Wildtypzellen als Matrize verwendet. Die PCR-Produkte wurden mit BglII und BamHI verdaut und in den YCplac33-Vektor kloniert. Das komplette TCM1/MAK8-Gen wurde ebenfalls mittels Polymerase-Kettenreaktion kloniert und in YCplac33 und YEplac195 subkloniert. pJD134 wurde mittels Klonieren eines BglII/HindIII-Fragments mit stumpfem Ende, das den PGK1-Transkriptionsterminator enthielt, in eine NotI-Stelle mit stumpfem Ende von pRS315 konstruiert (Sikorski und Hieter, 1989). Das mit FLAG markierte L3Δ-BamHI-Fragment wurde in pJD134 subkloniert, um pJD138 zu erzeugen, einen CEN6-LEU2-Vektor, der die PGK1-Transkriptionsterminationssequenz stromabwärts des C-terminalen, mit FLAG markierten L3Δ-Fragments enthält. pJD139 enthält den L3Δ-FLAG-PK1-Transkriptionsterminator in den 2μ-URA3-Vektor pRS426 subkloniert (Christianson et al., 1992).
Klonierung von UPF3. Die zum Klonieren des UPF3-Gens angewendete Strategie war mit der identisch, die zum Klonieren von UPF2 (REF) und des L3Δ-Fragments angewendet wurde. Der upf3-1-Stamm PLY139 wurde mit einer Ycp50-Bibliothek transformiert (Rose et al., 1990) und insgesamt 2 × 10⁴ Ura⁺-Transformanten wurden mittels Replikaplattierung auf Minimalmedium, dem Uracil und Histidin fehlte, gescreent und 3 Tage bei entweder 30 °C oder 37 °C gewachsen. Kolonien, die nur bei 30 °C wuchsen, wurden zur weiteren Analyse gewählt und von einem Plasmid, YCpB1, wurde mittels standardmäßiger genetischer Verfahren, einschließlich der Konstruktion von Gen-Knockout-Allelen, bestätigt, dass es das UPF3-Gen beherbergte. Eine anschließende Subklonierung offenbarte, dass ein 2,1 kb langes Asp718-BglII-Fragment dazu ausreichte, upf3-Mutationen zu komplementieren, und die Sequenzanalyse dieses Klons zeigte, dass es mit der zuvor berichteten UPF3-Sequenz (REF) identisch war.
Herstellung von Polysomprofilen. Polysomextrakte wurden gemäß Baim et al. (1985) hergestellt, jedoch wie folgt modifiziert. Cycloheximid wurde zu 200-ml-Kulturen (O.D.₆₀₀ = 0,7) von Zellen, die entweder pJD139 oder pRS426 beherbergten, auf eine Endkonzentration von 100 μg/ml gegeben und mit 100 ml eiskaltem Medium, das 100 μg/ml Cycloheximid enthielt, gemischt. Die Zellen wurden sofort mittels Zentrifugierung gesammelt und zweimal mit Extraktpuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 μg/ml Cycloheximid, 200 _g/ml Heparin) gewaschen. Die Zellpellets wurden in einer gleich großen Menge (w/v) Extraktpuffer erneut suspendiert. Ungefähr 0,25 ml säuregewaschener Glasperlen (Thomas Scientific Co.) wurden zugegeben und die Zellen wurden mittels Schleudern der Suspensionen acht Mal 15 Sekunden lang lysiert, wobei nach jedem Schütteln für einen Zeitraum von 30 Sekunden auf Eis abgekühlt wurde. 1 ml des Extraktpuffers wurde dem Lysat zugesetzt und das Lysat wurde einmal 5 Minuten bei 5000 g und dann einmal 10 Min. bei 10.000 g zentrifugiert. 30 O.D.₂₆₀-Einheiten des Überstands wurden auf 12 ml eines linearen 7- bis 47%-igen Saccharosegradienten, der 50 mM Tris-Acetat (pH 7,4), 50 mM NH₄Cl, 12 mM MgCl₂ und 2 mM Mercaptoethanol enthielt, aufgebracht. Der Saccharosegradient wurde in einem SW41-Rotor (Beckman) 150 Minuten bei 39.000 min^–1 zentrifugiert und Polysomprofile wurden unter Verwendung eines Density Gradient Fractionator, Modell 640 (ISCO), gesammelt und mit einem VA-6-UV/VIS-Detektor (ISCO) aufgezeichnet.
Killer-Assays, Leserastersprung-Assays und Extraktion und Analyse von Gesamtnukleinsäuren. Hefestämme, die die L-A- und M₁-Viren beherbergen, wurden mit dem L3Δ-Fragment auf Plasmiden mit entweder niedriger oder hoher Kopienanzahl oder mit Vektor für sich transformiert. Der Killer-Assay wurde wie zuvor beschrieben (siehe Beispiel 1) mittels Replikaplattieren von Kolonien auf 4,7-MB-Platten, die frisch mit einem Rasen von 5 × 47 Killerindikatorzellen (0,5 ml einer Suspension auf 1 Einheit der optischen Dichte auf 550 nm pro ml pro Platte) gesät worden waren, durchgeführt. Nach 2 Tagen bei 20 °C wurde die Killer-Aktivität als eine klare Zone um die Killerkolonien herum beobachtet. Um den Verlust der Killer-Aktivität zu quantifizieren, wurden Kolonien, die als Killer⁺ identifiziert worden waren, erneut zwecks einzelner Kolonien ausgestrichen und der Prozentanteil der Killer^–-Kolonien wurde ermittelt.
Die Effizienzen von ribosomalem –1- und +1-Leserastersprung wurden wie zuvor beschrieben unter Verwendung einer 0-Raster-Kontrolle und Testplasmiden auf ribosomalem –1- und +1-Leserastersprung bestimmt. β-Galactosidase-Assays, die den L3Δ-lacZ-Fusionsreporter einsetzten, wendeten ebenfalls dieses Verfahren an.
Gesamtnukleinsäuren (total nucleic acids, TNA) wurden wie zuvor beschrieben aus Zellen extrahiert (Dinman und Wickner, 1992, 1994). Gleich große Mengen von TNA wurden durch 1,0%-ige Agarosegele getrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die TNA wurden in den Gelen 30 Min. bei 45 °C in 50 % Formamid, 9,25 % Formaldehyd, 1 × TAE denaturiert, die Gele wurden mit Wasser gewaschen und die Nukleinsäuren wurden auf Nitrocellulose übertragen.
Herstellung von radioaktiven Sonden. DNA-Sonden wurden zur hoch spezifischen Aktivität mittels wahlloser Hexonukleotid-Primerverlängerung mit [α-³²P]dCTP markiert. Ein 0,6 kb langes EcoRI-HindIII-Fragment vom CYH2-Gen wurde als eine Sonde zum Überwachen der Abundanz des CYH2-Vorläufers und der CYH2-mRNA verwendet. Ein 1,2 kb langes BglII-SalI-Fragment vom HIS4-Gen wurde als eine Sonde zum Überwachen der Abundanz der his4-38-mRNA verwendet. Ein 3,1 kb langes SmaI/HindIII-Fragment von pTI25 wurde als eine Sonde zum Überwachen der Abundanz der lacZ-mRNA verwendet.
L-A- und M₁(+)-Strang-RNA-Sonden wurden wie zuvor beschrieben (Dinman und Wickner, 1994) unter Verwendung von mit [α-³²P]dCTP markierten T3-RNA-Polymerase-Run-off-Transkripten von mit Eco-RV verdautem pLM1 (um mit dem L-A(–)-Strang und mit PstI verdautem p596 (M₁(–)-Strang) zu hybridisieren) hergestellt. Die Membrane wurden 5 Std. bei 55 °C in 50 % Formamid, 5 × SSC, 50 mM NaHPO₄, pH 6,8, 0,1 % SDS, 1 mM EDTA, jeweils 0,05 % von BSA, Ficoll und Polyvinylpyrrolidon vorhybridisiert und bei 55 °C über Nacht mit 10⁷ cpm jeder Sonde in demselben Puffer hybridisiert. Die Membrane wurden 20 Min. bei 65 °C in fünf Übergängen mit 0,1 × SSC, 0,1 % SDS gewaschen und Autoradiographie ausgesetzt.
Ergebnisse
Frühere Ergebnisse haben demonstriert, dass eine Mutation oder Deletion eines der UPF1-, UPF2-, UPF3-Gene in der Stabilisierung Nonsense-enthaltender mRNAs resultiert. Kombinationen von Mutationen oder Deletionen der UPF-Gene resultieren nicht in einer weiteren Stabilisierung Nonsense-enthaltender mRNAs, was zeigt, dass diese Proteine als Komplex funktionieren können. Im Einklang mit dieser Auffassung haben neuere Ergebnisse demonstriert, dass Upf2p mit Upf1p und Upf3p interagiert. Zwei Sätze von Ergebnissen werden dargelegt, die den programmierten ribosomalen Leserastersprung und die Leserastersprung-Suppression überwachen, die zeigen, dass eine Mutation oder Deletion des UPF3-Gens einzigartige Phänotypen vorzeigen, die nicht in Stämmen beobachtet werden, die Mutationen oder Deletionen des UPF2- oder UPF3-Gens beherbergen.
Identifizierung eines Antisuppressors von his4-38 in mutierten upf2-1- und upf1-2-, jedoch nicht in upf3-1-Zellen. Eine Deletion oder Mutation des UPF2-Gens resultiert in der Stabilisierung Nonsense-enthaltender mRNAs, der Nonsense-Suppression und der Kombination von zwei Phänotypen. Das Wildtyp-UPF2-Gen wurde mittels Screenen eines Stamms, der den upf2-1-his4-38-SUF1-1-Stamm beherbergt, mit einer genomischen Bibliothek und Identifizieren von Zellen, die nicht mehr bei 37 °C auf Medium, dem Histidin fehlte, wachsen konnten, isoliert. Zu diesem Zeitpunkt isolierten wir einen weiteren Klon (YCpA9), der ebenfalls das Wachstum des mutierten upf2-1-Stamms bei 37 °C auf Medium, dem Histidin fehlte, verhinderte. Da dieser UPF2 nicht kodierte, prüften wir die Fähigkeit dieses Klons, als ein Antisuppressor von upf1-2 und upf3-1 in Stämmen, die die his4-38-SUF1-1-Allele beherbergten, zu fungieren. YCpA9 konnte als ein Antisuppressor von upf1-2 und upf2-1, jedoch nicht von upf3-1 fungieren.
Die 100 N-terminalen Aminosäuren des TCM1/MAK8-Genprodukts zeichnen für den upf1-1- und upf2-1-Antisuppressor-Phänotyp verantwortlich. YCpA9 enthält ein 6,4 kb genomisches DNA-Insert von Hefe. Es wurden davon mehrere auf Ycplac33 basierende Plasmidsubklone mit niedriger Kopienanzahl konstruiert und zu dem upf2-Stamm PLY36 transformiert, um das funktionelle Fragment zu lokalisieren. Ein 600 nt langes Fragment an einem Ende reichte dazu aus, den Allosuppression-Phänotyp von sowohl upf2-1 als auch upf1-2 aufzuheben. Eine Sequenzanalyse zeigte, dass dieses Fragment die komplette untranslatierte Region am 5'-Ende und die ersten 300 nt (100 Aminosäuren), d. h. das N-terminale 1/4 des TCM1/MAK8-Gens enthält, das das ribosomale 60S-Untereinheit-Protein L3 kodiert und von dem geglaubt wird, dass es an der Bildung des Peptidyltransferasezentrums beteiligt ist. Wir nannten dieses Fragment L3Δ. Wir prüften außerdem die Auswirkungen episomaler Expression des kompletten TCM1/MAK8-Gens und stellten fest, dass diese die gleichen Wachstum-Phänotypen übertrug wie mit dem Vektor für sich transformierte Stämme, d. h. keine Antisuppression von upf1-2 oder upf2-1. Folglich zeichnet die Expression des L3Δ-Fragments für die Antisuppression von upf1-2 oder upf2-1 verantwortlich.
Die episomale Expression des L3Δ-Fragments beeinflusst zellulare Wachstumsraten. Wir bemerkten, dass mit den L3Δ-tragenden Plasmiden transformierte Zellen langsamer als Kontrollzellen wuchsen. Um die Auswirkung dieses Klons auf das Zellwachstums zu quantifizieren, wurden die Verdoppelungszeiten von Zellen, die Plasmide mit niedriger oder hoher Kopienanzahl enthalten, die das L3Δ-Fragment oder den Vektor für sich beherbergen, bestimmt. Die Verdoppelungszeiten von Wildtypzellen, die L3Δ exprimieren, auf Plasmiden mit entweder hoher oder niedriger Kopienanzahl waren ungefähr 2 Mal höher als die von Zellen, die den Vektor für sich beherbergen (8 Std. gegenüber 4 Stunden bei 30 °C). Die Wachstumsraten von Zellen, die das Plasmid beherbergen, das aus dem vollständigen TCM1/MAK8-Gen entstanden war, hatten keine Auswirkung auf die zellularen Wachstumsraten (Daten nicht gezeigt).
Die Antisuppression von upf1-2 und upf2-1 durch L3Δ ist vom Status des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallsweg unabhängig. Die unterschiedlichen Auswirkungen des L3Δ-Fragments in den upf1^–-, upf^2–- und upf^3–-Stämmen könnten in Veränderungen entweder der Zerfallsraten der his4-38-Nonsense-mRNA oder Auswirkungen auf der Translationsebene begründet liegen. Um zwischen diesen zwei Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Steady-State-his4-38-mRNA-Abundanz in diesen und Wildtypstämmen mittels Northern-Blot-Analyse bestimmt. Die Gesamt-RNAs wurden isoliert, durch ein Formaldehyd-Agarosegel getrennt und auf eine Nylonmembran übertragen und die mRNA wurde unter Verwendung eines HIS4-Fragments als Sonde geprüft. Als Kontrollen prüften wir außerdem unter Verwendung eines radioaktiv markierten CYH2-Fragments als Sonde auf den CYH2-Vorläufer und CYH2-mRNAs. In allen mit entweder dem L3Δ-Fragment oder einem Kontrollvektor transformierten upf-Stämmen blieb die his4-38-mRNA-Abundanz hoch. Der his4-38-mRNA-Spiegel in Wildtypstämmen (mit dem UPF⁺-Stamm transformierte upf-Stämme) waren niedrig. Folglich lag der Wachstumsdefekt des Stamms, der eine episomal exprimierte Kopie des L3Δ-Fragments beherbergt, in upf1^–- und upf2^–-Stämmen, jedoch nicht im upf3^–-Stamm nicht in einer Abnahme des Niveaus des his4-38-mRNA-Zerfalls begründet.
Das von L3Δ kodierte L3-Fragment verringert freie ribosomale 60S-Untereinheiten. Da L3Δ die komplette 5'-Leader-Sequenz und etwa 300 Nukleotide der N-terminalen kodierenden Region aufweist, sollte dieses genomische Fragment transkribiert und translatiert werden. In einem Versuch, zu ermitteln, ob dieses kleine Fragment exprimiert wurde und ob es zu Ribosomen assembliert wurde, wurde ein FLAG-Epitop in das 3'-Ende des L3Δ-Fragments inseriert. Das mit Epitop markierte L3-Fragment wies denselben Phänotyp auf wie das L3-Fragment, wie mittels der Killer-Daten (siehe unten) beurteilt, und die Antisuppression des his4-38 in dem mutierten upf2-1-Stamm (Daten nicht gezeigt).
Polysomprofile wurden aus einem Wildtypstamm erhalten, der mit dem markierten L3Δ auf einem Plasmid mit hoher Kopienanzahl (pJD139) oder einer Vektorkontrolle (pRS426) transformiert wurde. Die Untersuchung der Polysomprofile zeigte, dass die episomale Expression des L3Δ-Fragments in einer Abnahme der Peak-Höhe von freien ribosomalen 60S-Untereinheiten resultiert. Längs des Gradienten wurden Fragmente gesammelt und gleich große Mengen von Protein aus jeder Fraktion wurden mittels 10- bis 20%-iger Gradienten-SDS-PAGE getrennt. Obgleich wir versuchten, die Menge des markierten L3-Fragments mittels Western-Blot-Analyse zu überwachen, konnten wir sie in keiner der Polysomfraktionen und auch nicht in ganzen Zelllysaten nachweisen. Wir wissen nicht, ob dies eine Folge einer schlechten Translation des Fragments, einer Unzugänglichkeit des FLAG-Epitops für den Antikörper oder eines posttranslationellen Abbaus des FLAG-Epitops ist. Wir versuchten außerdem, ein L3Δ/β-Galactosidase-Fusionsprotein mit dem Ziel, in allen Polysomgradienten auf die β-Galactosidase zu prüfen, zu erzeugen. Obwohl eine Sequenzanalyse bestätigte, dass wir die korrekten Klone konstruiert hatten, stellten wir fest, dass diese Konstrukte instabil in Hefezellen erhalten wurden (Daten nicht gezeigt). Somit können wir nicht definitiv feststellen, dass das L3Δ-Protein tatsächlich exprimiert wird, obwohl die mehreren Phänotypen, die in mit diesen Plasmiden transformierten Zellen beobachtet werden, ein starkes Indiz darauf liefern. Des Weiteren ermöglichen uns unsere Daten nicht, zu ermitteln, ob das L3Δ-Fragment physikalisch mit Ribosomen assoziiert ist.
Die Expression des L3Δ-Fragments bewirkt den Verlust der Killer Aktivität und des M₁-dsRNA-Virus. Der M₁-Satellitenvirus von L-A erfordert die Produkte von mindestens 30 chromosomalen MAK-Genen für seine Erhaltung und Replikation, einschließlich TCM1/MAK8. Frühere Studien haben gezeigt, dass in den meisten der mak^–-Mutanten der Spiegel von 60S-Untereinheiten im Vergleich zu Wildtypzellen gesenkt wurde. Die Expression von L3Δ reduzierte auch die Spiegel der ribosomalen 60S-Untereinheiten in Wildtypzellen. Um zu ermitteln, ob die episomale Expression des L3Δ-Fragments den Mak8^–-Phänotyp rekapitulieren kann, wurden Plasmide mit hoher und niedriger Kopienanzahl, die das L3Δ-Genfragment beherbergen, zu Wildtyp-Killer⁺-Zellen transformiert und der Verlust des Killerphänotyps wurde mittels Replikaplattieren der Transformanten auf Killerindikator-Platten geprüft. Während mit Vektor transformierte Zellen nur einen kleinen Bruchteil der Killer-Aktivität verloren, wiesen die mit entweder dem ursprünglichen oder dem mit FLAG markierten L3Δ-Genfragment transformierten Zellen erhebliche Raten des Verlusts des Killerphänotyps auf. Ein Assay auf den Verlust des Killers zeigt, dass Zellen, die die Killer-Aktivität verloren haben, auch die M₁-dsRNA verloren haben. Es ist bemerkenswert, dass die Expression von L3Δ den Verlust des Killers (und von M₁) förderte, selbst wenn sie vom [B]-Isotop von L-A unterstützt wurde, die den Bedarf von Zellen für die meisten der MAK-Gene, einschließlich MAK8, umgehen kann.
Wir untersuchten außerdem die Auswirkungen von L3Δ-Expression in Bezug auf den Killer-Verlust in upf- und ski-Mutanten und stellten fest, dass diese ebenfalls den Verlust des Killers in diesen Kontexten verschlimmert. Interessanterweise weisen upf3-Deletionsmutanten (upf3Δ) intrinsisch hohe Rate des Killer-Verlusts auf, der in Gegenwart von L3Δ quasi auf Null reduziert wird. Die ski-Mutanten haben normalerweise den entgegengesetzten Phänotyp von mak-Mutanten, d. h. sie erhöhen die Kopienanzahl des L-A-Virus und des M₁-Virus, und ski-Mutanten sind im Allgemeinen gegenüber mak-Mutanten insofern dominant, dass ski/mak8-Doppelmutanten K^– sind (Toh-E und Wickner, 1980). Dies gilt insbesondere für ski/mak8-Doppelmutanten. Wenn sie jedoch mit einem Vektor mit hoher Kopienanzahl transformiert werden, der das L3Δ-Fragment beherbergt (pJD139), zeigten selbst die ski-Mutanten hohe Raten des Killer-Verlusts aufgrund des Verlusts von M₁. Folglich ist die Expression des L3Δ-Fragments zu den ski-Mutanten episatisch.
Die Expression von L3Δ überträgt einen Mof-Phänotyp. Das Verhältnis von verfügbaren, von L-A kodierten Gag/Gag-Pol-Fusionsproteinen, wie mittels der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung bestimmt, ist für die Erhaltung des M₁ von Bedeutung und Mutationen, die sich auf die Effizienz von ribosomalem Leserastersprung auswirken, verändern das Verhältnis der Gag/Gag-Pol-Proteine, wodurch der Verlust von M₁ gefördert wird. Um zu ermitteln, ob die L3Δ-Expression diesen Prozess beeinflusste, maßen wir die Effizienz von ribosomalem Leserastersprung in mehreren Wildtypstämmen, die das L3Δ-Fragment beherbergen, mit von L-A abgeleiteten Reportern für ribosomalem –1-Leserastersprung oder von Tyl abgeleiteten Reportern für ribosomalem +1-Leserastersprung. Die episomale Expression des L3Δ-Fragments steigert die Effizienz von programmiertem ribosomalem –1-Leserastersprung, jedoch nicht von programmiertem ribosomalem +1-Leserastersprung in Wildtypzellen. Der 2,3-fache Anstieg der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung liegt an der Obergrenze der Leserastersprungeffizienz, die für die minimale Erhaltung von M₁ toleriert wird. Die intrinsische Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung beträgt 5,3 % in mak8-2-Mutanten, d. h. 2,9 Mal höher als in Wildtypzellen. Folglich ist die mak8-2-Mutation ebenfalls ein mof-Mutant.
Wir untersuchten außerdem die Auswirkungen der Expression von L3Δ in den upf-Mutanten. Es wurde eine Reihe interessanter Informationen gefunden. Erstens scheint die intrinsische Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in den upf1Δ- und upf2Δ-Stämmen ungefähr 2 Mal höher zu sein als in Wildtypzellen. Dies liegt in der Tatsache begründet, dass der –1-Leserastersprung-Reporter eine Nonsense-mRNA ist, die in diesen Zellen stabilisiert ist, was eine größere Gesamtproduktion des β-gal-Reporterproteins im Gegensatz zu gesteigerten Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung ermöglicht. Dies ist mit den oben dargelegten Daten konsistent (Beispiel 1). Des Weiteren steigert die Expression von L3Δ die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in diesen Zellen in demselben Maße wie in Wildtypzellen, d. h. ungefähr 3-fach. Die scheinbare Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in upf3Δ-Zellen ist intrinsisch hoch (7 %) und die weitere Expression von L3Δ erhöht diese nur auf 9,4 %. Dies erklärt, warum upf3x-Zellen hohe intrinsische Raten des Killer-Verlusts zeigen: Sie sind insofern ebenfalls mof-Mutanten, dass sie die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung unabhängig von ihrer Fähigkeit, Nonsense-mRNAs zu stabilisieren, steigern.
Diskussion
Das L3Δ-Fragment fungiert in den mutierten upf1-2- und upf2-1-Zellen als ein Antisuppressor des his4-38-Leserastersprung Allels. Wir identifizierten das L3Δ-Fragment als einen Antisuppressor von upf2-1 durch den Verlust der Fähigkeit von upf2-1-his4-38-SUF1-1-Zellen, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das dieses Genfragment enthält, bei 37 °C in Medium, dem Histidin fehlte, zu wachsen. Dass ein vollständiger TCMI/MAK8-Klon diese Aktivität nicht aufwies, legt nahe, dass die Expression der 100 N-terminalen Aminosäuren dieses Proteins für die beobachteten Phänotypen verantwortlich zeichnet.
Die Antisuppression von upf1-2 und upf2-1 durch L3Δ kann aus dem Verringern der Gesamtmenge von funktionellem His4-Protein, das von der HIS4-38-mRNA bei 37 °C translatiert wurde, resultieren. Dies könnte in 1) der Aufhebung der Fähigkeit der durch SUF1-1 kodierten Glycin-tRNA, den Leserastersprung bei 37 °C zu unterdrücken, 2) der Reaktivierung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs bei der unzulässigen Temperatur oder 3) einem Translationsdefekt, der im Unvermögen der upf1-2- und upf2-1-Mutanten, als Allosuppressoren mit SUF1-1-Glycin-tRNA bei 37 °C zu fungieren, resultiert, begründet liegen. Dass die Expression des L3Δ-Fragments in Kombination mit der upf3-1-Mutation die SUF1-1-Suppression bei 37 °C nicht aufhebt, spricht gegen einen Defekt bei der Funktion der durch SUF1-1 kodierten Glycin-tRNA bei dieser Temperatur. Des Weiteren, da die Abundanzen der His4-38-mRNA und der CYH2-Vorläufer-mRNA in Zellen mit oder ohne das L3Δ-Genfragment gleich sind, spricht direkt gegen die Reaktivierung des Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfallswegs. Folglich ist es wahrscheinlich, dass das L3Δ-Fragment seine Antisuppressor-Aktivität auf der Translationsebene durch Reduzieren der Translation von funktionellem His4-Produkt aus der His4-38-mRNA ausübt.
TCM1/MAK8 kodiert das ribosomale Protein L3, das an der Bildung des Peptidyltransferasezentrums beteiligt ist. Die Transkription von TCM1 ist unter der Kontrolle einer einzigen stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenz, die von einem multifunktionellen Transkriptionsfaktor erkannt wird (Dorsman et al., 1989; Hamil et al., 1988), und das L3Δ-Fragment enthält alles der stromaufwärts gelegenen Sequenz, das für seine Transkription erforderlich ist. Moreland et al. (1985) untersuchten das Kernlokalisierungssignal im TCM1-Gen, indem sie verschiedene Deletionen der kodierenden Region am 3'-Ende, die „in-frame" mit dem lacZ-Gen fusioniert ist, vornahmen, und erkannten die Position der β-Galactosidase mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Ihre Ergebnisse legten nahe, dass die Expression der ersten 21 Aminosäuren von L3 dazu ausreichten, das Fusionsprotein in den Zellkern zu leiten. Somit ist es gut möglich, dass das von L3Δ produzierte L3-Fragment in den Zellkern und anschließend in den Nukleolus zur Assembly im Ribosom transportiert wird. Wie andere ribosomale Proteine ist die Expression des L3-Proteins reguliert und der Spiegel von L3-Protein bleibt derselbe, selbst wenn die Zellen zusätzliche Kopien des TCM1-Gens aufweisen (Pearson et al., 1982; Beus et al., 1994). Die Verringerung der Wachstumsraten von Zellen, die das L3Δ-Fragment exprimieren, und die Abnahme der Peak-Höhen von ribosomalen 60S-Untereinheiten unterstützt die Auffassung, dass die Expression dieses Genfragments die Translation beeinflusst. Zwei sich nicht gegenseitig ausschließende Modelle können vorgeschlagen werden, um unsere Beobachtungen zu erklären. 1) Dass verringerte Spiegel der 60S-Untereinheiten in der Einbindung des L3-Fragments in Ribosome begründet liegen könnten, was sich direkt auf den Prozess des Peptidtransfers auswirkt, oder alternativ 2) dass die beobachteten Auswirkungen in indirekten Auswirkungen der Expression dieses Peptidfragments auf die Ribosombiogenese begründet liegen könnten. Wenn das L3Δ-Fragment translatiert, jedoch nicht zu Ribosomen assembliert wird, wird die Expression des Wildtyp-TCM1-Gens möglicherweise von dem Peptidfragment herunterreguliert. Dies würde die Verringerung der Peak-Höhen der 60S-Untereinheiten in den Polysomprofilen von Stämmen, die das L3Δ-Fragment beherbergen, erklären. Bedauerlicherweise ermöglichen uns unsere Daten nicht, zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden.
Das L3Δ-Fragment rekapituliert eine mak8-Mutation. Dass Zellen, die das L3Δ-Fragment exprimieren, die M₁-dsRNA verloren, zeigt, dass der Verlust der Killer-Aktivität nicht in Defekten bei der Translation, der Verarbeitung oder dem Export des Killertoxins begründet lag. Des Weiteren, da die Verringerung der Spiegel der ribosomalen 60S-Untereinheiten ein für die meisten der mak-Mutanten charakteristisches Phänomen ist (Ohtake und Wickner, 1995), legten die Ergebnisse hier deutlich dar, dass die extrachromosomale Expression des L3Δ-Fragments einen dominanten negativen Mak^–-Phänotyp auf Wildtypzellen überträgt. Die Beobachtung, dass die Expression des L3Δ-Fragments in einem 2,3-fachen Anstieg der Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung resultiert, ist insofern interessant, dass dies knapp an der Grenze liegt, bei der ein Verlust von M₁ beobachtet wird, und demonstriert, dass die Expression dieses Fragments ebenfalls einen dominanten Mak^–-Phänotyp überträgt. Zwei andere Datensätze unterstützen die Auffassung. Erstens die Expression dieses Klons führt zum Ausschluss von M₁ aus Zellen, die den „Bypass"-Isotyp ([B]-Isotyp) von L-A beherbergen (die Stämme JD88 und JD11 sind L-AHNB-M₁). Während die meisten mak-Mutanten, einschließlich mak8, von [B] umgangen werden können (d. h. L-AHNB kann M₁ und Killer in diesen mak-Mutanten unterstützen), verlieren diejenigen mof-Mutanten, die den Killer nicht unterstützen können, M₁ ungeachtet des L-A-Isotyps. Dass die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in mak8-2-Mutanten beträchtlich erhöht ist, legt nahe, dass Mutationen im ribosomalen Protein L3 und somit im Peptidyltransferasezentrum ebenfalls die translationelle Erhaltung des Leserasters beeinflussen können.
Eine wichtige Erkenntnis ist, dass die Expression des L3Δ-Framents in einem Anstieg der Effizienz von durch L-A geleitetem ribosomalem –1-Leserastersprung resultierte, sich jedoch nicht auf den von Tyl geförderten ribosomalen +1-Leserastersprung auswirkte.
BEISPIEL 5: mof-Mutanten beeinflussen die Peptidyltransferasezentrum-Aktivität
Epistasisversuche haben gezeigt, dass sich bestimmte mof-Mutanten auf die Peptidyltransferase-Aktivität auswirken. Von zwei Antibiotika, Trichodermin und Anisomycin, beide Peptidyltransferaseinhibitoren, wurde gezeigt, dass sie in tcm1-Mutanten (die zuerst durch ihre Resistenz gegenüber Trichodermin identifiziert wurden) unwirksam sind. Keines dieser Arzneimittel hat eine Auswirkung auf den ribosomalen –1-Leserastersprung in mak8-2-Mutanten und ihre Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung sind ebenfalls erhöht, was diese Zellen gleichfalls zu mof-Mutanten macht. Andere mof-Mutanten zeigen einige ziemlich interessante Tendenzen. Wie mof8-2 beeinflusste keines dieser Arzneimittel die Effizienzen von ribosomalem –1-Leserastersprung in mof1-1- und mof2-1-Mutanten, was nahe legt, dass Defekte bei der Peptidyltransferreaktion entweder für die Mof-Phänotypen dieser Zellen verantwortlich zeichnen oder zu diesen beitragende Faktoren sind. Interessanterweise beeinflusst Anisomycin die –1-Leserastersprungeffizienzen in mof6-1-Zellen, Sparsomycin hatte jedoch keine solche Wirkung (16A, 16B). Umgekehrt verändert Sparsomycin die Effizienz von ribosomalem –1-Leserastersprung in mof-1-Zellen, wohingegen mit Anisomycin mit diesen Zellen keine Wirkung vorliegt (16A, 16B). Diese Daten legen nahe, dass die mof6-1- und mof9-1-Mutationen beim Zerlegen der zwei verschiedenen Aktionsstellen dieser Arzneimittel auf die Peptidyltransferasereaktion als Sonden verwendet werden können.
BEISPIEL 6: Anisomycin und Sparsomycin unterdrücken Nonsense-Mutationen
Stämme von UPF1+ und UPF1– wurden mit 5 μg/ml Sparsomycin, Anisomycin und Paromomycin behandelt und auf Nonsense-Suppression geprüft. Wie in 17 gezeigt ist, konnten diese Arzneimittel Nonsense-Mutationen unterdrücken.

Claims

Verwendung einer Verbindung, die aus Anisomycin, Sparsomycin oder Paromomycin ausgewählt ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen, die von Viren verursacht wurden, unter Anwendung von ribosomalem –1-Leserastersprung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zum Behandeln einer HIV-Infektion ist.
Polypeptid, das den N-terminalen 100 Aminosäuren von ribosomalem Bindungsprotein L3 entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum Steigern der Effizienz von programmiertem ribosomalem –1-Leserastersprung, die das Polypeptid nach Anspruch 3 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 3 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 zum Behandeln einer Virusinfektion, die von einem Virus verursacht wurde, unter Anwendung von ribosomalem –1-Leserastersprung.
Nukleinsäure, die das Polypeptid nach Anspruch 3 kodiert.
Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 6 umfasst, die mit einer Expressionskontrollsequenz operativ verbunden ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 7 zur Verwendung beim Modulieren von ribosomalem Leserastersprung oder zur Verwendung beim Behandeln einer Virusinfektion.