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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen Screeningtest zum Identifizieren
von therapeutischen Inhibitoren der biologischen Aktivität des makrophagenmigrationshemmenden
Faktors bzw. Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktors (MIF) bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem therapeutische Wirkstoffe
bereit, welche die biologische Aktivität von MIF hemmen können und
durch den erfindungsgemäßen Screeningtest
identifiziert werden. Insbesondere sind die therapeutischen Wirkstoffe
brauchbar zum Behandeln von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen, an
denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, wie etwa ein
Schock, Entzündungskrankheiten,
eine Transplantat-Wirt-Reaktion
und Autoimmunkrankheiten.
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Hintergrund
der Erfindung
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Eine
Infektion durch eine Reihe von Mikroorganismen, zu denen nicht nur
Bakterien, sondern auch Viren, Pilze und Parasiten gehören, kann
einen septischen Schock auslösen.
Ein septischer Schock ist ein facettenreicher pathologischer Zustand,
der durch schädliche
hämodynamische
Veränderungen
und eine Koagulopathie gekennzeichnet ist. Ein septischer Schock
kann zu einem multiplen Organversagen und häufig zum Tod führen. Das
Schocksyndrom hängt
genauer gesagt mit der Reaktion des Wirts auf eine Mikroorganismeninvasion
zusammen. Bei einer Infektion durch Gram-negative Bakterien, einem
der am besten untersuchten Beispiele, wird angenommen, dass das
Auftreten von bakteriellen Endotoxinen wie etwa Lipopolysaccharid (LPS)
in dem Blutstrom des Wirtes zur endogenen Erzeugung einer Reihe
von Wirtsfaktoren führt,
welche direkt und indirekt die Toxizität von LPS vermitteln. LPS selbst
ist für
die meisten Zellen relativ harmlos. Zu diesen vom Wirt erzeugten
Mediatoren gehören
viele inflammatorische (entzündliche)
Cytokine und klassische endokrine Hormone sowie eine Reihe von ande ren
endogenen Faktoren wie Leukotriene und der plättchenaktivierende Faktor.
Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass das gesamte Ensemble der
vom Wirt erzeugten Mediatoren und jede ihrer in Wechselbeziehung
stehenden Rollen bei der Reaktion des Wirts noch nicht vollständig aufgeklärt ist.
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Im
Allgemeinen wird angenommen, dass diejenigen vom Wirt erzeugten
Mediatoren, die in einem befallenen Wirt früher erscheinen, die Freisetzung
der später
auftretenden Faktoren auslösen.
Außerdem üben viele
endogene Mediatoren nicht nur direkte Effektorfunktionen an ihren
Zielgeweben aus, sondern bereiten auch örtliche und weiter entfernte
Gewebe für
nachfolgende Reaktionen auf andere Mediatoren vor. Dieses wechselwirkende
Netzwerk von Wirtsfaktoren wurde als die "Cytokinkaskade" bezeichnet. Dieser Begriff soll die
rasche Ausbreitung und Verstärkung
der Wirtsreaktion andeuten, die so erfolgt, dass nur ein oder einige wenige
einleitende Stimuli schließlich
die Freisetzung und Beteiligung einer großen Anzahl von endogenen Mediatoren
auslösen.
Wenngleich angenommen wird, dass einige Merkmale der Wirtsreaktion
die Abwehr einer Invasion unterstützen, kann eine übermäßig robuste
oder schlecht modulierte Wirtsreaktion sich rasch beschleunigen,
so dass derart tiefgreifende Veränderungen
der Homöostase
des Wirts auf zellulärer,
Gewebe- und systemischer Ebene hervorgerufen werden, dass der Tod
innerhalb von Stunden eintreten kann.
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Mäuse-Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor
(MIF) wurde als ein LPS-induziertes Hypophysenhormon identifiziert
(Bernhagen et al., J. Cell. Biochem. Supplement 17B, E306. 1993).
Zunächst
wurde die Hypothese aufgestellt, dass MIF ein von der Hypophyse
erzeugter Schutzfaktor sein könnte,
welcher den schädlichen
Wirkungen von Cytokinen in Endotoxämien entgegenwirken könnte, aber
später
wurde festgestellt, dass MIF tatsächlich einen Endotoxin-induzierten
Schock verschlimmert und dass die Hemmung der MIF-Aktivität verwendet
werden kann, um andernfalls tödliche
Wirkungen des Cytokin-vermittelten Schocks zu behandeln. MIF wurde
redefiniert als ein Hypophysenvorderlappenhormon, ein Makrophagencytokin
und eine entscheidende Komponente der Wirtsreaktion auf einen septischen
Schock (Bernhagen et al., Nature 365: 756–759 1993; Calandra et al.,
J. Exp. Med. 179: 1895–1902
1994; Calandra et al., Nature 377: 68–71 1995).
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MIF
wurde zuerst vor über
30 Jahren als ein T-Zellprodukt beschrieben, welches die ungerichtete
Migration von Meerschweinchen-Makrophagen in einem in vitro-Test
hemmt (George und Vaughan, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 111: 514–521 1962;
Bloom und Bennett, Science 158: 80–82 1966; David, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 65: 72–77
1966). Es wurde berichtet, dass MIF: (1) mit Spättyp-Überempfindlichkeitsreaktionen
in Zusammenhang gebracht wurde (Bloom und Bennett, 1966, oben; David,
1966, oben), (2) durch Lectin-aktivierte T-Zellen erzeugt wird (Weiser
et al., J. Immunol. 126: 1958–1962
1981) und (3) die Makrophagenadhäsion,
Phagocytose und tumorabtötende
Aktivität
verstärkt
(Nathan et al., J. Exp. Med. 137: 275–288 1973; Nathan et al., J.
Exp. Med. 133: 1356–1376
1971; und Churchill et al., J. Immunol. 115: 781–785 1975). Viele von diesen
Studien verwendeten Mischkulturüberstände, von
denen später
gezeigt wurde, dass sie andere Cytokine wie IFN-γ und IL-4 enthielten, welche
ebenfalls eine migrationshemmende Aktivität aufweisen (McInnes und Rennick,
J. Exp. Med. 167: 598–611
1988; Thurman et al., J. Immunol. 134: 305–309 1985).
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Rekombinantes
menschliches MIF wurde ursprünglich
aus menschlichen T-Zellen kloniert (Weiser et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86: 7522–7526
1989). Das biologische Aktivitätsprofil
von MIF war nicht vollständig
bekannt und war umstritten. Es wurde jedoch gezeigt, dass MIF (1)
aus Blut gewonnene Makrophagen aktiviert, so dass sie intrazelluläre Parasiten
und Tumorzellen in vitro abtöten,
(2) die Expression von IL-1β und TNFα stimuliert,
und (3) die Stickstoffmonoxidsynthese induziert (einen Überblick
findet man in Bernhagen et al., Biochemistry 33: 14144–14155 1994).
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Es
wurde berichtet, dass MIF ein Hypophysenvorderlappenhormon ist und
aus Immunzellen freigesetzt wird, die durch niedrige Konzentrationen
von Glucocorticoiden stimuliert werden. Wenn es einmal sezerniert
ist, kontrolliert oder gegenreguliert MIF die immunsuppressiven
Wirkungen von Glucocorticoiden auf die Erzeugung von inflammatorischem
Cytokin und moduliert die starken entzündungshemmenden Eigenschaften von
Glucocorticoiden, welche notwendigerweise als Teil der Wirtsreaktion
auf eine Infektion und Invasion des Gewebes erzeugt werden (Calandra
et al., Nature 377: 68–71
1995). MIF ist eine entscheidende Komponente des Immunsystems und
wirkt der immunsuppressiven Wirkung von Glucocorticoiden zur Regulierung
einer Entzündung
und der Immunität
entgegen.
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Im
Gegensatz zu der von MIF erwarteten Funktion als ein schützender
hypothalamischer Faktor verschlimmerte MIF die Letalität in verschiedenen
Modellen des septischen Schocks. So kann eine robuste MIF-Reaktion
innerhalb der Cytokinkaskade unerwünscht sein. Außerdem hat
es das Fehlen von definierten zellulären und biochemischen Aktivitäten von
MIF für
Forscher sehr schwer gemacht, einen Test zum spezifischen Messen
und Quantifizieren der immunologischen Aktivität von MIF und zum Identifizieren
von MIF-Inhibitoren zu entwickeln. Das Fehlen eines in vitro-Tests
zum Identifizieren von MIF-Inhibitoren hat die Untersuchung des
genauen biologischen Profils dieses Moleküls in der Immunreaktion und
die Entwicklung einer Behandlung für Störungen, die mit der Cytokin-vermittelten
Toxizität
zusammenhängen,
behindert.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen schnellen, quantitativen und
spezifischen Test zum Screening von Testverbindungen (z. B. Arzneimitteln,
Liganden (natürlichen
oder synthetischen), Proteinen, Peptiden und kleinen organischen
Molekülen)
auf eine Aktivität
zum Hemmen der biologischen Aktivität des Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktors (MIF) bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der identifizierten
Verbindungen (d. h. Arzneimittel, Liganden, Proteine, Peptide und
kleinen organischen Moleküle)
gemäß Anspruch
4 bereit, die durch den erfindungsgemäßen Screeningtest identifiziert
werden und in der Lage sind, biologische Aktivitäten von MIF zu hemmen. Die
Erfindung stellt ferner die Verwendung von solchen identifizierten
Verbindungen zum Herstellen eines Medikaments für die Behandlung von verschiedenen
Leiden bzw. Zuständen
bereit, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt
ist, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten,
eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen,
aber nicht darauf beschränkt
sind.
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Die
Erfindung beruht zum Teil auf der überraschenden Entdeckung, dass
MIF eine Tautomerisierungsreaktion katalysiert und dass Tests auf
Inhibitoren dieser Tautomeraseaktivität verwendet werden können, um Verbindungen
zu identifizieren, welche andere biologische Aktivitäten von
MIF hemmen.
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Kurze Beschreibung
der Figur
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1 zeigt
ein Schema für
die Umwandlung von D-Dopachrom, die durch D-Dopachrom-Tautomerase
und durch MIF katalysiert wird.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Definitionen
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Es
werden die folgenden Definitionen verwendet.
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"MIF" sind Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor-Polypeptide
mit MIF-Aktivität,
wobei aber IFN-γ und
IL-4 ausgeschlossen sind.
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"MIF-Tautomeraseaktivität", "MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität" und "MIF-Tautomerisierungsaktivität" beziehen sich jeweils
auf die gleiche Tautomerase-Enzymaktivität von MIF,
die durch die Fähigkeit
von MIF, die Tautomerisierung eines MIF-Substrats zu katalysieren,
angezeigt wird.
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"MIF-Substrat" umfasst (a) D-Dopachrom[D-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], (b)
D-Dopachrom-methylester[D-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester]
oder (c) L-Dopachrom-methylester[L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester]
oder Derivate davon, ist aber nicht darauf beschränkt.
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"Testverbindungen" oder "Testsubstanzen" oder "Testinhibitoren" bezieht sich jeweils
auf in Frage kommende Arzneimittel, Liganden (natürliche oder
synthetische), Proteine, Peptide oder kleine organische Moleküle, die
auf ihre Fähigkeit,
die Tautomerase-Enzymaktivität von MIF
zu hemmen, getestet werden sollen.
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Tautomeraseaktivität von MIF
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Die
Tautomerase-Enzymaktivität
von MIF wurde während
einer Untersuchung der biochemischen Wege der Melanogenese entdeckt.
An den späten
Stufen der McIaninbio synthese ist eine enzymatische Umwandlung von
L-2-Carboxy-2,3-dihydroindol-5,6-chinon
(L-Dopachrom) in 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäure (DHICA) beteiligt. Eine
charakteristische Enzymaktivität,
die aus der Augenlinse von Rindern isoliert wird, katalysiert die
Tautomerisierung von D-Dopachrom, dem nicht-physiologischem Stereoisomer
der natürlichen Verbindung,
L-Dopachrom, zu DHICA (1). Die Reinigung und Analyse
der N-terminalen Sequenz des Proteins, das für diese Tautomeraseaktivität für das in
der Natur nicht vorkommende Substrat D-Dopachrom verantwortlich
ist, identifizierte das Enzym als das Rinderhomologe von MIF. Die
enzymatische Aktivität
von gereinigtem nativem MIF wurde durch Untersuchungen von rekombinantem
menschlichem MIF bestätigt,
bei dem ebenfalls festgestellt wurde, dass es selektiv die gleiche
Tautomerisierungsreaktion mit D-Dopachrom als Substrat katalysiert,
aber gegenüber
L-Dopachrom inaktiv ist. Als Ergebnis dieser Untersuchungen umfasst
die vorliegende Erfindung Tests zum Identifizieren von Verbindungen,
welche die enzymatische Aktivität
von MIF hemmen, welche die Tautomerisierung von MIF-Substraten wie
etwa D-Dopachrom zu DHICA katalysiert. Im Allgemeinen wird der Test
in vitro durchgeführt
durch Zugeben, Vermischen oder Vereinigen von MIF und einem geeigneten
Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung und
Messen der Tautomerisierung des Substrats. Die Testverbindungen,
welche die Tautomerisierungsaktivität in dem erfindungsgemäßen Test
hemmen, sind MIF-Inhibitoren, welche eine bedeutende pharmakologische
Aktivität
aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von solchen identifizierten
MIF-Inhibitoren
in pharmazeutischen Zusammensetzungen bereit, die darauf ausgelegt
sind, die biologische Aktivität
von MIF zur Behandlung von mit der Cytokintoxizität zusammenhängenden
Störungen
zu hemmen. Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung von
solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden solcher
Zusammensetzungen für
die Behandlung von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen, an
denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, welche einen
Schock, Entzündungskrankheiten,
eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen,
aber nicht darauf beschränkt
sind.
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Tests
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein schnelles und quantitatives Verfahren
zum Screening von Verbindungen bereit, welche die biologischen Aktivitäten von
MIF hemmen. Die Tests der vorliegenden Erfindung umfassen das Messen
der Fähigkeit
einer Testsubstanz, die MIF-katalysierte Tautomerisierung von spezifischen MIF-Substraten
zu hemmen. Die Testsubstanzen oder Testverbindungen umfassen Arzneimittel,
Liganden (natürliche
oder synthetische, Proteine, Peptide oder kleine organische Moleküle, welche
die Fähigkeit
von MIF hemmen, enzymatisch die Tautomerisierungsreaktion zu katalysieren,
sie sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Testsubstanzen,
die als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von MIF identifiziert werden, sind
Kandidaten für
Inhibitoren der biologischen Aktivität von MIF, umfassend, aber
nicht beschränkt
auf MIF-induzierte entzündliche
und immunologische Aktivitäten.
Der erfindungsgemäße Screeningtest
umfasst das Messen der Wirkung einer Testsubstanz auf die Fähigkeit
von MIF, die Tautomerisierung eines spezifischen Substrats zu katalysieren.
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Speziell
stellt der erfindungsgemäße Test
zuerst ein Reaktionsgemisch aus MIF-Polypeptid und einem MIF-Substrat in
Gegenwart und Abwesenheit der Testsubstanz oder Testverbindung her.
Die Tautomerisierung des MIF-Substrats wird gemessen. Verbindungen,
welche die MIF-katalysierte Tautomerisierung hemmen, sind die in
Frage kommenden Verbindungen, welche gemäß der Erfindung verwendet werden
können.
Wenngleich eine beliebige Reihenfolge der Zugabe der Reaktionskomponenten
eingesetzt werden kann, ist es bevorzugt, das MIF-Substrat zu einem
Gemisch aus MIF und der Testverbindung zuzugeben oder MIF zu einem Gemisch
aus dem MIF-Substrat und der Testverbindung zuzugeben. Ein solche
Reihenfolge der Zugaben würde
die Ablesung erleichtern, da die Testreaktion erst abläuft, wenn
sowohl der Katalysator als auch die Substratkomponenten vereinigt
sind. Der Test kann als ein homogener Test, z. B. mit allen Komponenten
in Lösung, oder
als ein heterogener Test, z. B. worin entweder MIF oder das MIF-Substrat
auf einem festen Träger
immobilisiert ist, gestaltet werden.
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Reaktionskomponenten
und Bedingungen, welche in den Screeningtests der Erfindung verwendet werden
können,
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Tautomerisierungsreaktionen, die in Rosengren et al., Molecular
Medicine 2: 143–149
1996, und Aroca et al., Eur. J. Biochemistry 208: 155–163 1992
beschrieben sind, die jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme
in diese Anmeldung aufgenommen sind. Ausgangsmaterialien für MIF umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Säugergewebe
(d. h. menschliches Gewebe, Hühner-,
Rinder-, Maus- und Rattengewebe), Rindergewebe (d. h. die Augenlinse
ist ein Ausgangsmaterial für
vorgebildetes bioaktives MIF-Protein) und Hepatocyten (ein reichhaltiges
Ausgangsmaterial für
vorgebildetes bioaktives MIF-Protein). Vorzugsweise wird rekombinantes
MIF verwendet. Bernhagen et al. (Biochemistry 33: 14144–14155 1994)
beschreibt ein Verfahren zum Reinigen von bioaktivem rekombinantem
MIF.
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Zu
MIF-Substraten, welche in dem Test verwendet werden können, gehören D-Dopachrom,
D-Dopachrom-methylester und L-Dopachrom-methylester, sie sind aber
nicht darauf beschränkt.
D-Dopachrom ist das nicht in der Natur vorkommende D-Isomer von
L-2-Carboxy-2,3-dihydroindol-5,6-chinon (L-Dopachrom). Die Methylester
der D- und L-Isomere sind bessere Tautomerasesubstrate für MIF als
D-Dopachrom in dem Sinn, dass sie viel schneller tautomerisiert
werden. Diese Substrate werden im Allgemeinen unmittelbar vor dem Durchführen des
Tests gebildet und zwar durch Oxidation des entsprechenden Phenylalanin-Analogs.
Zum Beispiel wird D-DOPA [oder D-3-(3,4-Dihydroxyphenylalanin] zu
D-Dopachrom [D-3,5-Dihydro-6-dihydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure] oxidiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird L-Dopachrom-methylester als das
MIF-Substrat in dem Screeningtest verwendet. In einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann D-Dopachrom-methylester als das
MIF-Substrat in dem Screeningtest verwendet werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, welches eine
bioaktive Form von MIF in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung
und ein MIF-Substrat (z. B. D-Dopachrom) enthält. Die Fähigkeit der Testverbindung,
die enzymatische Aktivität
von MIF zu hemmen, wird durch Messen der Umwandlung des orangegefärbten D-Dopachrom-Substrats
in farbloses DHICA spektralfotometrisch bestimmt. Zum Beispiel kann
das gefärbte
MIF-Substrat unmittelbar vor dem Test durch Oxidieren eines farblosen
DOPA-Derivats zum Bilden des gefärbten
Substrats D-Dopachrom hergestellt werden. Die Testverbindung und
bioaktives MIF werden zu dem gefärbten
MIF-Substrat zugegeben. Die Tautomerisierung des MIF-Substrats durch
MIF führt
zu einer ungefärbten
Lösung
von DHICA und die Umwandlung kann z. B. spektralfotometrisch über einen
bestimmten Zeitraum, z. B. eine Minute verfolgt werden.
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Die
Anwesenheit einer Testverbindung, welche im Hinblick auf eine MIF-hemmende
Aktivität
positiv ist, hemmt die Tautomerisierungsaktivität von MIF. Dieser Test führt zu einer
Lösung,
welche die D-Dopachrom-Farbe beibehält. Deshalb kann die Fähigkeit
einer Testverbindung, die MIF-Aktivität zu hemmen, alternativ colorimetrisch
sichtbar gemacht oder spektralfotometrisch quantitativ bestimmt
werden. Zum Beispiel wird die Tautomerisierung von D-Dopachrom zu
DHICA leicht spektralfotometrisch bestimmt durch Messen der Geschwindigkeit
der Abnahme der Iminochrom-Extinktion bei einer Wellenlänge von
475 nm. Zu anderen Mitteln zum Messen der Tautomerisierung gehört z. B.
die Trennung von Produkten und Substraten mittels HPLC.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst der Test der Erfindung das Zugeben einer Testverbindung
zu einem Reaktionsgemisch, das ungefähr 0,5 mM des MIF-Substrats
L-Dopachrom-methylester enthält.
Dieses MIF-Substrat wird unmittelbar vor dem Test durch Oxidation
von L-DOPA-methylester mit Periodat hergestellt, wobei das gefärbte Substrat
L-Dopachrom-methylester erhalten wird. Es werden ungefähr 50–250 ng
rekombinantes MIF zu 1 ml der Substratlösung zugegeben. Die Reaktion
wird direkt in einer Küvette
durch Messen der Abnahme der Extinktion bei 475 nm oder 550 nm für Substratkonzentrationen
von mehr als 0,5 mM getestet. Das resultierende Reaktionsprodukt
ist die farblose Verbindung 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäuremethylester
(DHICA-ME). Testverbindungen, welche die Abnahme der Extinktion
hemmen, sind Inhibitoren der D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität von MIF
und dadurch als in Frage kommende Inhibitoren von entzündungs-
oder immun-korrelierten Aktivitäten
von MIF identifiziert.
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Dieser
Test bietet mehrere Vorteile. Der Test stellt ein schnelles, quantitatives
und spezifisches Mittel zum Messen der enzymatischen Aktivität von MIF
bereit. Dieser Test stellt ein schnelles Screeningverfahren zum
Identifizieren von Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von MIF
bereit. Solche identifizierten Inhibitoren dienen als in Frage kommende
Inhibitoren für
andere biologische Aktivitäten
von MIF wie etwa die immun-modulatorische
Aktivität.
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Inhibitoren
der MIF-Aktivität
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Die
vorliegende Erfindung sieht ferner die Verwendung von kleinen organischen
Molekülen
vor, die als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von MIF
identifiziert wurden. Außerdem
sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung der identifizierten
MIF-Inhibitoren
bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Behandeln
von Störungen
vor, welche mit der Cytokin-vermittelten Toxizität zusammenhängen, welche einen Schock,
Entzündungskrankheiten,
eine Transplantat-Wirt-Reaktion
und Autoimmunkrankheiten umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Die Inhibitoren sind auch insofern nützlich, als sie eine entzündungshemmende
oder anderweitig günstige
Eigenschaft durch Erhöhen
der therapeutischen Wirksamkeit von Glucocorticoiden aufweisen,
ganz gleich ob solche Glucocorticoide endogen vorhanden sind oder
exogen verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung von Verbindungen
wie kleinen organischen Molekülen
vor, die in dem erfindungsgemäßen Test
als Inhibitoren der biologischen Aktivität von MIF identifiziert werden.
In einer Ausführungsform
der Erfindung könnten
bestimmte MIF-Inhibitoren die Tautomerisierung des Substrats durch
Konkurrieren mit dem Substrat um die MIF-Bindung hemmen. Es wird
angenommen, dass bestimmte dieser Verbindungen mit MIF wechselwirken,
aber aufgrund ihrer spezifischen Strukturmerkmale nicht tautomerisiert
werden. Zu diesen direkten Konkurrenten gehören die D- und L-Formen des α-Dopachrom-methylesters,
sie sind aber nicht darauf beschränkt. Die Verwendung dieses
Typs von Inhibitor von MIF ist auch nützlich beim gezielten Ansteuern
der Tautomerase-korrelierten Substratbindungsstelle von MIF, um
ein zweites funktionelles Element eines bifunktionellen Inhibitors
in wirksame molekulare Erfassung oder sterische Anordnung zu bringen,
um die entzündliche
oder immunmodulatorische Aktivität
von MIF zu hemmen.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung hemmen bestimmte MIF-Inhibitoren (z. B. Glutathion und
Typanothion (bei dem es sich um zwei Moleküle von Glutathion handelt,
die kovalent durch eine Spermidinbrücke verknüpft sind)) die Tautomerisierungsreaktion
durch Wechselwirken mit einem Epitop von MIF, welches für die enzymatische
Aktivität
von entscheidender Bedeutung ist, z. B. dem Aminoende. Die Verwendung dieses
Typs von Inhibitor von MIF ist auch nützlich beim gezielten Ansteuern
des Aminoendes von MIF, um ein zweites funktionelles Element einer
bifunktionellen Inhibitorverbindung in wirksame molekulare Erfassung
oder sterische Anordnung zu bringen, um die entzündliche oder immunmodulatorische
Aktivität
von MIF zu hemmen.
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Beispiele
für Verbindungen
innerhalb des Bereichs der Erfindung sind nachstehend als neun Reihen von
Verbindungen gemäß den Formeln
I bis IX gezeigt:
worin
Q, X, Y und Z vorstehend für
jede Reihe von Verbindungen definiert sind und R, R' und R'' jeweils unabhängig voneinander Alkylgruppen
(C
1-C
20); vorzugsweise
niedere Alkylgruppen (C
1-C
4)
sind. Außerdem
umfasst die Erfindung pharmazeutisch annehmbare Salze von diesen
Verbindungen.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß gängigen Methoden der organischen Chemie
unter Verwendung von leicht/im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien
synthetisiert werden. Verbindungen der Formel I werden z. B. durch
Oxidation des passenden m-Hydroxyphenylalanin-Derivats mit Periodat
oder einem anderen geeigneten Oxidationsmittel synthetisiert. Zum
Beispiel ist I (X = Y = OH) aus dem im Handel erhältlichen
DL-threo-β-(3,4-Dihydroxyphenyl)serin
(Sigma) erhältlich.
Andere m-Hydroxyphenylalanine sind durch Umwandlung von 3-Hydroxy-4-substituierten
Zimtsäuren
erhältlich.
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Verbindungen
der Formel II (Z = NH oder NR, X = OH) werden synthetisiert durch
Reduktion von Verbindungen der Formel I mit Dithionit oder einem
anderen geeigneten Reduktionsmittel gefolgt von einer Alkylierung
des Stickstoffs mit einem R-Halogenid, falls Z = NR. Verbindungen
der Formel II (Z = CH2) werden durch Umwandlungen
von passend 5,6-substituierten Inden- oder 1- oder 2-Indanon-Derivaten
synthetisiert. Verbindungen der Formel II (Z = O oder S) werden
durch Umwandlungen von passend 5,6-substituierten Benzofuran- oder Thianaphthen-Derivaten
synthetisiert. Verbindungen der Formel II (Z = SO oder SO2) werden durch Oxidation von II (Z = S)
mit Wasserstoffperoxid, Persäuren
oder Periodat unter geeigneten Bedingungen hergestellt.
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Verbindungen
der Formel III werden durch Behandlung von entsprechenden Verbindungen
der Formel II (Q = Cl oder Br) mit einer geeigneten Base zum Bewirken
der β-Eliminierung
des Halogens synthetisiert. Verbindungen der Formel IV (Z = N, Y
= OH oder OR') werden
aus Kojisäurebenzylether
(2-Hydroxymethyl-5-benzyloxy-4-pyranon) durch Reaktion mit β-Alanin-ethylester
zum Erhalten von 2-Hydroxymethyl-5-benzyloxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester synthetisiert;
die Hydroxymethylgruppe wird zu dem Aldehyd, 2-Formyl-5-benzyloxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester,
mit Chromtrioxid-Pyridin-Komplex
oxidiert und die Cyclisierung erfolgt durch eine Behandlung mit
einer Base, wie etwa Lithiumdiisopropylamid, um eine Verbindung der
Formel IV (Z = N, X = OH, Y = OCH2Ph) zu
erhalten. Aus der letztgenannten Verbindung können Verbindungen der Formel
IV (X = OH) durch Behandlung mit geeigneten Reagenzien für eine Umwandlung
von Hydroxy in Halogen (z. B. Diethylaminoschwefeltrifluorid, Thionylchlorid
oder Thionylbromid) hergestellt werden. Für Verbindungen der Formel IV
(Y = Halogen) wird 2-Formyl-5-(2-tetrahydropyranyl)oxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester
aus 2-Hydroxymethyl-5-(2-tetrahydropyranyl)oxy-4-pyranon durch Reaktion
mit β-Alanin ethylester,
gefolgt von einer Oxidation mit Chromtrioxid-Pyridin-Komplex hergestellt.
Das Produkt wird anschließend
in milder Säure
zu 2-Formyl-5-hydroxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester hydrolysiert,
welcher mit einem geeigneten Dehydroxyhalogenierungsmittel, wie
etwa Diethylaminoschwefeltrifluorid, Thionylchlorid oder Thionylbromid
behandelt wird, um 2-Formyl-5-halogeno-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester
zu erhalten. Dieses Produkt wird anschließend weiter umgewandelt, wie
im Fall von Y = Benzyloxy.
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Verbindungen
der Formel IV (Z = C-CH3, X = OH) werden
aus dem entsprechenden 4-substituierten 5-Hydroxy-2-methylbenzaldehyd-Derivat
durch Behandlung mit Base zum Bilden eines Phenoxid-Anions, gefolgt
von einer Cyclisierung mit einem Acrylester hergestellt. Verbindungen
der Formel IV (Z = C-CH3, X = F, Cl oder
Br) werden durch Behandlung der passenden Verbindung der Formel
V (siehe unten) mit dem entsprechenden Halogenwasserstoff in einem
nicht-hydroxylischen Lösungsmittel
hergestellt; und anschließend
mit einem niederen Alkoxid behandelt. Dies ergibt die Verbindungen
der Formel V (Z = C-CH3, X oder OR'), welche alternativ
durch Behandlung von Verbindungen der Formel IV (Z = C-CH3, X = OH) mit einem Alkylhalogenid und einer
nicht-nukleophilen
Base synthetisiert werden.
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Verbindungen
der Formel V (Z = N) werden durch Behandlung der entsprechenden
Verbindungen der Formel II (X = Cl oder Br) mit einer geeigneten
Base zum Bewirken einer β-Eliminierung
des Halogens synthetisiert. Verbindungen der Formel V (Z = C-CH3) werden aus dem entsprechenden 4-substituierten
5-Hydroxy-2-methylbenzaldehyd-Derivat durch Behandlung mit Base
zum Bilden eines Phenoxid-Anions, gefolgt von einer Cyclisierung
mit Diethylmethylenmalonat zum Bilden eines Derivats der entsprechenden
Verbindung der Formel IV (Z = C-CH3, R =
Et, X = OH), das eine zweite Carboethoxygruppe geminal zu der in
den Strukturen der Formel IV abgebildeten Carboxylgruppe trägt, hergestellt.
Dieses Produkt wird anschließend
einer Hydrolyse, Decarboxylierung und Eliminierung, vorzugsweise
unter sauren Bedingungen unterzogen, um Verbindungen der Formel
V (Z = C-CH3, R = H) zu bilden, welche wiederverestert
werden können.
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Verbindungen
der Formel VI werden aus dem entsprechenden 6,7-substituierten Chinolin-Derivat durch
Behandlung mit Benzoylchlorid und Natriumcyanid zum Erhalten des
1-Benzoyl-2-cyano-1,2-dihydro-Derivats, gefolgt von einer Hydrierung
zum Erhalten des 1-Benzoyl-2-cyano-1,2,3,4-tetrahydro-Derivats synthetisiert.
Dieses Produkt wird unter basischen oder sauren Bedingungen hydrolysiert,
um die entsprechende 6,7-substituierte 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin-2-carbonsäure zu erhalten,
welche dann in einen Ester wie etwa den Methylester umgewandelt
werden kann. Eine Dehydrierung in der 1,2-Stellung wird beispielsweise durch
Behandlung mit einem Oxidationsmittel, einem Halogenierungsmittel
oder einem Sulfonylierungsmittel, gefolgt von Base bewirkt.
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Verbindungen
der Formel VII werden aus entsprechenden Verbindungen der Formel
III durch Behandlung mit einem geeigneten Carbenoid- oder Methylentransferreagenz,
wie etwa durch Behandlung mit Diazomethan, oder durch Behandlung
mit Diiodmethan in Gegenwart von Zinkstaub oder durch Behandlung
mit Bromoform in Gegenwart von Kalium-tert-butoxid, gefolgt von
einer Debromierung des resultierenden Dibrommethan-Derivats (z. B. unter
Verwendung von Zink in Essigsäure)
synthetisiert.
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Verbindungen
der Formel VIII werden aus Verbindungen der Formel III (Z = CH2) durch Behandlung mit einem epoxidierenden
Mittel wie etwa m-Chlorperbenzoesäure synthetisiert. Verbindungen
der Formel IX (X = O) werden ebenso aus Verbindungen der Formel
V durch Behandlung mit einem epoxidierenden Mittel wie etwa m-Chlorperbenzoesäure synthetisiert.
Verbindungen der Formel IX (X = CH2) werden
aus Verbindungen der Formel V unter geeigneten Methylentransferbedingungen,
wie etwa durch Behandlung mit Diazomethan, synthetisiert.
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Pharmazeutische
Formulierungen
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Die
durch den erfindungsgemäßen Screeningtest
identifizieren Verbindungen, welche die MIF-Tautomeraseaktivität hemmen,
sind pharmazeutische Verbindungen mit einer therapeutischen Aktivität zum Hemmen
der immunmodulatorischen Aktivität
von MIF. Die identifizierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind
in pharmakologischen Zusammensetzungen für die Behandlung von verschiedenen
Leiden bzw. Zuständen
brauchbar, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt
ist, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten,
eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen,
aber nicht darauf beschränkt
sind. Eine identifizierte Verbindung kann an einen menschlichen
Patienten allein oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, worin
sie mit geeigneten Trägern
oder Excipienzien vermischt ist, in Dosen zum Behan deln oder Bessern
von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen verabreicht werden, an
denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, welche einen
Schock, Entzündungskrankheiten,
eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen,
aber nicht darauf beschränkt
sind. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich ferner auf
die Menge der Verbindung, die ausreicht, um die biologische Aktivität von MIF
in vivo zu hemmen. Methoden zur Formulierung und Verabreichung der
Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können in "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing
Co., Easton, PA, letzte Auflage, gefunden werden.
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Zu
geeigneten Verabreichungswegen gehören z. B. eine orale, rektale,
durch Inhalation erfolgende, transmukosale oder intestinale Verabreichung;
eine parenterale Verabreichung einschließlich intramuskulärer, subkutaner,
intramedullärer
Injektionen sowie intrathekaler, direkter intraventrikulärer, intravenöser, intraperitonealer,
intranasaler oder intraokularer Injektionen. Alternativ kann man
die therapeutische Verbindung auf lokale statt systemische Weise
verabreichen, z. B. durch Injektion der Verbindung direkt an der
Stelle einer Entzündung,
häufig
in einer Depotformulierung oder Formulierung mit verzögerter Freigabe.
Außerdem
kann man die Verbindung in einem zielgerichteten Arzneimittelverabreichungssystem
verabreichen, z. B. in einem Liposom, das mit einem anti-MIF-Rezeptor-Antikörper überzogen
ist. Die Liposomen werden zu Zellen, die den MIF-Rezeptor exprimieren, gezielt hingeführt und
von diesen selektiv aufgenommen.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine an sich bekannte
Weise hergestellt werden, wie etwa durch herkömmliche Misch-, Auflösungs-,
Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-,
Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren. Solche pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
auf herkömmliche
Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch annehmbaren
Trägern
formuliert werden, die Excipienzien und Hilfsstoffe umfassen, welche
die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu pharmazeutischen Zubereitungen
erleichtern. Die zweckmäßige Formulierung
hängt von
dem gewählten
Verabreichungsweg ab.
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Für eine parenterale
Injektion können
die pharmazeutischen Zusammensetzungen in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch
verträglichen
Puffern wie etwa Hank's-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem
Kochsalzpuffer formuliert werden. Für eine transmukosale Verabreichung
werden für
die zu durchdringende Barriere zweckmäßige Penetrationsmittel in
der Formulierung verwendet. Für
eine orale Verabreichung können
die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Kombinieren der therapeutisch
wirksamen Verbindungen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert
werden. Solche Träger
machen es möglich,
dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen,
Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten,
Gele, Sirupe, Aufschlämmungen,
Suspensionen und dergleichen für
eine orale Verabreichung an einen Patienten formuliert werden. Pharmazeutische
Zubereitungen für
eine orale Verwendung können
als ein festes Excipiens erhalten werden, gegebenenfalls mit Mahlen
eines resultierenden Gemisches und Verarbeiten des Gemisches aus
Körnchen,
nach dem Zugeben von geeigneten Hilfsmitteln, falls dies gewünscht wird,
um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Excipienzien
sind insbesondere Füllstoffe
wie Zucker, einschließlich
Lactose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol; Cellulosezubereitungen
wie z. B. Maisstärke,
Weizenstärke,
Reisstärke,
Kartoffelstärke,
Gelatine, Traganthgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose
und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls es gewünscht wird können Zerfallhilfsmittel
zugegeben werden, wie etwa das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar
oder Alginsäure
oder ein Salz davon, wie etwa Natriumalginat. Drageekerne werden
mit geeigneten Überzügen versehen.
Zu diesem Zweck können
konzentrierte Zuckerlösungen
verwendet werden, welche gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon,
Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und
geeignete organische Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemische
enthalten können.
Zur Identifizierung können
Farbstoffe oder Pigmente zu den Tabletten oder Drageeüberzügen zugegeben
werden.
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Pharmazeutische
Zubereitungen, welche oral verwendet werden können, umfassen Steckkapseln
aus Gelatine sowie weiche geschlossene Kapseln aus Gelatine und
einem Weichmacher wie etwa Glycerol oder Sorbitol. Die Steckkapseln
können
die Wirkstoffe in Mischung mit Füllstoff
wie etwa Lactose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln
wie Talk oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisatoren
enthalten. In weichen Kapseln können
die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten wie fetten Ölen, flüssigem Paraffin
oder flüssigen
Polyethylenglycolen gelöst
oder suspendiert sein. Außerdem
können
Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen für eine orale
Verabreichung sollten in Dosen vorliegen, die sich für eine solche
Verabreichung eignen. Für
eine bukkale Verabreichung können
die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder
Pastillen vorliegen, die auf herkömmliche Weise formuliert sind.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in rektalen Zusammensetzungen
wie etwa Zäpfchen
oder Retentionseinläufen
formuliert werden (die z. B. herkömmliche Zäpfchengrundlagen wie Kakaobutter
oder andere Glyceride enthalten).
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Für eine Verabreichung
durch Inhalation werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen in
Form einer Aerosolspraydarreichung aus unter Druck stehenden Packungen
oder einem Zerstäuber
mit Verwendung eines geeigneten Treibmittels (z. B. Dichlordifluormethan,
Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein
anderes geeignetes Gas) abgegeben. Im Fall eines unter Druck stehenden
Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils
zur Abgabe einer abgemessenen Menge festgelegt werden. Kapseln und
Hülsen
aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator
können
formuliert werden, die eine Pulvermischung aus den pharmazeutischen
Zusammensetzungen und einer geeigneten Pulvergrundlage wie Lactose
oder Stärke
enthalten.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können für eine parenterale Verabreichung
durch Injektion wie etwa durch Bolusinjektion oder kontinuierliche
Infusion formuliert werden. Formulierungen für eine Injektion können in
Form von Dosierungseinheiten wie etwa in Ampullen oder Mehrfachdosisbehältern mit
einem zugegebenen Konservierungsmittel dargeboten werden. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen können in
Form von Suspensionen, Lösungen
oder Emulsionen in öligen
oder wässrigen
Vehikeln vorliegen und können
Formulierungshilfsmittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder
Dispergiermittel enthalten. Zu pharmazeutischen Formulierungen für eine parenterale
Verabreichung gehören
wässrige
Lösungen
der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Außerdem können Suspensionen
der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen
hergestellt werden. Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln
gehören
fette Öle
wie Sesamöl
oder synthetische Fettsäureester
wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome. Wässrige Injektionssuspensionen
können
Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie
etwa Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls
kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten,
welche die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen,
um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu gestatten.
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Alternativ
kann der Wirkstoff in Form eines Pulvers zur Konstitution mit einem
geeigneten Vehikel wie sterilem pyrogenfreiem Wasser vor der Verwendung
vorliegen.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch als Depotpräparat formuliert
werden. Solche langwirkenden Formulierungen können durch Implantation (z.
B. subkutan oder intramuskulär)
oder durch intramuskuläre
Injektion verabreicht werden. So können z. B. die Verbindungen
mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als
eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen
oder als wenig löslich
Derivate, z. B. als ein wenig lösliches
Salz formuliert werden.
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Liposome
und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Verabreichungsvehikel oder
Träger
für hydrophobe
Arzneimittel. Bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid
können
ebenfalls eingesetzt werden, wenngleich gewöhnlich zum Preis einer höheren Toxizität. Außerdem können die
Verbindungen unter Verwendung eines Systems mit verzögerter Freigabe
wie etwa semipermeabler Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren,
die den therapeutischen Wirkstoff enthalten, verabreicht werden.
Verschiedene Materialien mit verzögerter Freigabe sind eingeführt worden
und dem Fachmann bekannt. Kapseln mit verzögerter Freigabe können je
nach ihrer chemischen Beschaffenheit die Verbindungen über einige
Wochen bis über
mehr als 100 Tage freigeben. Je nach der chemischen Beschaffenheit
und der biologischen Stabilität
des therapeutischen Reagenzes können
zusätzliche
Strategien für
eine Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete feste oder
Gelphasen-Träger oder
Excipienzien umfassen. Zu Beispielen für solche Träger oder Excipienzien gehören Calciumcarbonat, Calciumphosphat,
Zucker, Stärken,
Cellulose-Derivate,
Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole, sie sind aber nicht
darauf beschränkt.
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Viele
der MIF-hemmenden Verbindungen der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch
verträglichen
Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze
können
mit vielen Säuren
gebildet werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure usw.;
oder mit Basen. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen
Lösungsmitteln
löslicher
zu sein als die entsprechenden freien Basenformen. Beispiele für pharmazeutisch
annehmbare Salze, Träger
oder Excipienzien sind dem Fachmann bekannt und können z.
B. in Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg., Mack
Publishing Co., Easton, PA, 1990 gefunden werden. Zu solchen Salzen
gehören
Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-,
Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Acetat-, Citrat-, Tartrat-,
Malatsalze und dergleichen, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
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Zu
pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören Zusammensetzungen, bei
denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um
ihren beabsichtigten Zweck zu erzielen. Genauer gesagt bedeutet
eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die zum Verhindern
der Entwicklung von oder zum Lindern der bestehenden Symptome oder
zum Behandeln der zugrundeliegenden Krankheit des behandelten Individuums
wirksam ist. Die therapeutisch wirksame Dosiskonzentration kann
ursprünglich
aus Zellkulturtests abgeschätzt
werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert
werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erzielen,
welcher die IC50 einschließt, die
in Zellkultur bestimmt wurde (d. h. die Konzentration der Verbindung,
welche eine halbmaximale Hemmung der MIF-Aktivität erzielt). Eine therapeutisch wirksame
Dosis bezieht sich auf die Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung,
welche zu einer Verbesserung von Symptomen oder einer Verlängerung
des Überlebens
bei einem Patienten führt.
Die Toxizität und
therapeutische Wirksamkeit von solchen Verbindungen kann durch gängige pharmazeutische,
pharmakologische und toxikologische Verfahren in Zellkulturen oder
Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und
therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index. Verbindungen,
welche große
therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Die aus diesen
Zellkulturtests und Tierversuchen erhaltenen Daten können beim
Formulieren eines Bereichs von Dosierungen zur Verwendung bei Menschen
verwendet werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise
in einem Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, welche die
ED50 mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die
Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren, je nach der
eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg.
Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung
können
von dem einzelnen Arzt in Anbetracht des Zustands des Patienten
ausgewählt
werden. Die Menge der verabreichten Zusammensetzung hängt von
dem behandelten Patienten, dem Gewicht des Patienten, der Schwere der
Krankheit, der Art der Verabreichung und dem Ermessen des verschreibenden
Arztes ab.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Hemmung der MIF-Tautomeraseaktivität mit Glutathion.
Durch Oxidation von L-DOPA-methylester mit Periodat wurde ein Reaktionsgemisch
hergestellt, das 0,5 mM des MIF-Substrats L-Dopachrom-methylester
enthielt. Eine 1 mM Lösung
von L-DOPA-methylester wurde in Reaktionspuffer (10 mM Natriumphosphat,
pH 6, enthaltend 0,5 mM EDTA) hergestellt. L-DOPA-methylester wurde
zu farbigem L-Dopachrom-methylester durch Zugabe von 10% (Vol./Vol.)
einer 20 mM wässrigen
Lösung von
Kaliumperiodat im Anschluss an eine 1 : 2-Verdünnung mit Reaktionspuffer oxidiert.
Nach ungefähr
10 Minuten blieb die Farbe stabil und die Substratlösung war
zur Verwendung in dem Test bereit.
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Die
Testverbindung, reduziertes Glutathion, wurde in Konzentrationen
von 0,1 mM, 0,5 mM, 1,0 mM und 2,0 mM in getrennte Küvetten gegeben,
welche die Substratlösung
enthielten. Zu jeder Küvette
wurden ungefähr
100 ng gereinigtes rekombinantes MIF zugegeben. Die Extinktion bei
475 nm von jeder Probenküvette
wurde über
die ersten 20 Sekunden bis 2 Minuten gemessen. Die Anfangsrate der Änderung
der Extinktion, welche die Reaktionsrate oder -geschwindigkeit anzeigt,
wurde aufgezeichnet. Diese Abnahme der Extinktion im Anschluss an
die Zugabe von rekombinantem MIF wurde verwendet, um die Tautomeraseaktivität von rekombinantem
MIF in Gegenwart von Glutathion zu bestimmen. Ergebnisse sind in
Tabelle 2 nachstehend gezeigt. TABELLE
2
Glutathion
in Test [mM] | %-Hemmung |
0 | 0% |
0,1 | 14% |
0,5 | 69% |
1,0 | 95% |
2,0 | 100% |
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Bei
Konzentrationen von 0,5 mM bis 2,0 mM war Glutathion ein wirksamer
Inhibitor der MIF-Tautomeraseaktivität.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel veranschaulicht den Einfluss der nativen MIF-Aminoende-Primärsequenz
auf die MIF-Tautomeraseaktivität.
Eine aminoterminale Mutation von Maus-MIF wurde in E. coli exprimiert
und auf Tautomeraseaktivität
getestet. Die kodierende Region von Maus-MIF wurde durch die Addition
einer aus drei Aminosäuren
bestehenden Verlängerungssequenz:
Methionin-Aspartat-Serin, an das native Aminoende mutagenisiert.
Die veränderte
kodierende Region des Maus-MIF wurde in E. coli exprimiert und das
exprimierte Protein wurde gereinigt und wie vorstehend beschrieben
auf MIF-Tautomeraseaktivität
getestet. Die Expression dieses veränderten Gens führte zu
einem MIF-Protein,
dem die Tautomeraseaktivität
vollständig
fehlte. Die Expression von menschlichem MIF, das ein nicht verändertes
natives Aminoende trug, in dem gleichen E. coli-System führte zu einem hochaktiven MIF,
dessen Tautomeraseaktivität
selbst in rohen Bakterienlysaten ohne Aufreinigung nachgewiesen
werden konnte.
-
Weitere
Mutationen der MIF-Primärsequenz
zerstörten
ebenfalls die MIF-Tautomeraseaktivität. Speziell führte eine
Deletionsmutante, bei der das N-terminate Prolin von MIF eliminiert
war, zum Verlust der gesamten Tautomeraseaktivität. Eine Substitution des N-terminalen
Prolins (durch Serin) führte
zum Verlust der gesamten Tautomeraseaktivität. Außerdem wiesen C-terminal verkürzte Mutanten
1 → 104
und 1 → 110
keine Tautomeraseaktivität
auf.
-
Der
vollständige
Verlust der MIF-Tautomeraseaktivität durch eine aminoterminale
Verlängerung
oder Mutation legt einen entscheidenden Einfluss dieser Region auf
die MIF-Tautomeraseaktivität nahe.
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Beispiel 3
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit
der Verbindungen 2b [L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], 3b
[D/L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], 4b
[L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H- indol-2-carbonsäure-methylester] und 5b [D/L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester],
die MIF-Tautomeraseaktivität
in vitro zu hemmen.
-
-
Das
allgemeine Verfahren zum Durchführen
eines Tests auf die MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität beginnt mit der Oxidation
einer Vorstufe des MIF-Substrats (z. B. DOPA-verwandte Verbindung
1a [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)alanin-methylester] oben) und, falls
erforderlich, einer ähnlichen
Oxidation von Vorstufen der Testinhibitoren (z. B. der DOPA-verwandten
Verbindungen 2a [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin], 3a [D/L-3-(3,4-Dihydroxylphenyl)-2-methylalanin],
4a [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin-methylester] und 5a
[D/L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin-methylester] oben).
Diese Oxidation von jeder Vorläuferverbindung
(beispielsweise mit Natriumperiodat) erzeugt ein entsprechendes
orange gefärbtes
Dopachrom-Derivat; speziell ein bevorzugtes MIF-Substrat (Verbindung
1b oben) und die Testinhibitoren (Verbindungen 2b, 3b, 4b und 5b
oben). Bei Zugabe von MIF findet eine Tautomerisierung des MIF-Substrats (Verbindung
1b [L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester]) statt,
was zu einem farblosen Produkt führt.
In Gegenwart der Testinhibitoren (Verbindungen 2b, 3b, 4b und 5b)
war die Entfärbung
des MIF-Substrats (Verbindung 1b) verzögert. Die Testverbindungen
2b, 3b, 4b und 5b selbst waren in dieser Tautomerisierungsreaktion
nicht reaktionsfähig;
d. h. sie wurden nicht durch MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität tautomerisiert
und entsprechend entfärbt,
wenn sie an die Stelle des MIF-Substrats in diesem Testverfahren traten.
-
In
einem bevorzugten MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivitäts-Testverfahren
wurden die DOPA-verwandten Vorstufen (Verbindungen 1a, 2a, 3a, 4a
und 5a oben) als 10 mM Stammlösungen
in Testpuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 6,0) hergestellt. Ungefähr 10 Minuten
vor dem Tautomerisierungstest wurden 1,0 ml von jeder Stammlösung mit
8 ml Testpuffer verdünnt
und 1,0 ml Natriumperiodat-Stammlösung (20 mM in Wasser) wurde
zugegeben, um die Oxidation der verdünnten Vorstufen auszulösen, wobei
somit jedes entsprechende Dopachrom-Derivat (d. h. die Verbindungen
1b, 2b, 3b, 4b und 5b) in einer Endkonzentration von ungefähr 1 mM
erzeugt wurde. Um den tatsächlichen
Tautomerisierungstest durchzuführen,
wurden 0,5 ml der 1 mM Lösung
des MIF-Substrats (d. h. Verbindung 1b) mit 0,5 ml Testpuffer (Kontrollreaktion
ohne Inhibitor) oder 0,5 ml der 1 mM Verdünnung des Testinhibitors (z.
B. Verbindungen 2b, 3b, 4b oder 5b) vermischt, gefolgt von der Zugabe
von 10 ml der Lösung
des rekombinanten MIF aus einer 20 mg/ml-Stammlösung. Die Abnahme der Extinktion
bei 475 nm in 1 Minute wurde als ein Index der Tautomeraseaktivität gemessen
und die prozentuale Hemmung dieser Abnahme in Gegenwart der Verbindungen
2b, 3b, 4b und 5b wurde aus den spektralfotometrischen Daten durch
Standardverfahren berechnet.
-
Die
Ergebnisse dieses Tests sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TABELLE
3
% Hemmung der MIF-Tautomerase
Inhibitor | Aktivität |
Verbindung
2b | 35 |
Verbindung
3b | 29 |
Verbindung
4b | 34 |
Verbindung
5b | 45 |
-
Wenn
sie in der gleichen Konzentration wie das MIF-Substrat vorhanden
waren, hemmten die Testinhibitorverbindungen 2b, 3b, 4b und 5b jeweils
die MIF-Tautomeraseaktivität,
was durch die Hemmung der Abnahme der Dopachrom-spezifischen Extinktion
gemessen wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Abstraktion
des α-Wasserstoffs
von dem Dopachrom-verwandten MIF-Substrat ein entscheidender Schritt bei
der MIF-katalysierten Tautomerisierung ist und dass Testverbindungen, denen
dieses Wasserstoffatom fehlt, (z. B. solche mit einer α-Methyl-Substitution)
wirksame Inhibitoren der MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität sind.
-
Beispiel 4
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Hemmung der MIF-Tautomeraseaktivität durch
Glykierung von Lysinresten. Bei längerem Kontakt mit Glucose
oder einem anderen reduzierenden Zucker in vivo oder in vitro werden
Proteine und andere aminohaltige Biomoleküle durch kovalent gebundene,
von Zucker abgeleitete Addukte spontan modifiziert (Bucala und Cerami,
Adv. Pharmacol. 23: 1–34,
1992). Die Chemie dieses Prozesses ist allgemein als die Maillard-Reaktion
bekannt, worin empfindliche Protein-Aminogruppen wie etwa das Peptid-Aminoende
und die ε-Amino-Komponenten
von Lysinresten beispielsweise zuerst mit einer reaktiven Carbonylkomponente
eines reduzierenden Zuckers kondensieren, um eine leicht reversible
Schift-Base zu bilden. Dieses Ausgangsaddukt kann sich spontan umlagern
unter Bildung eines Amadori-Produkts (oder Heyns-Produkts, je nach dem spezifischen Zucker,
der beteiligt ist), welches stabil ist.
-
Gereinigtes,
rekombinant hergestelltes menschliches MIF-Protein wurde durch Inkubation
in wässrigem
Puffer in Gegenwart von 0,5 M Glucose, charakteristischerweise während 6
Wochen im Dunkeln bei 37°C unter
einer Stickstoffatmosphäre
glykiert, um eine vollständige
Glykierung von empfindlichen Resten zu gewährleisten (wenngleich andere
spontane Glykierungsbedingungen zum Glykieren des Proteins geeignet
sind, ohne von dem wesentlichen Inhalt der Erfindung abzuweichen),
und auf D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität durch das in dieser Anmeldung
beschriebene Verfahren getestet. Dieses glykierte oder AGE-modifizierte
MIF ("AGE-MIF") wies keine D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität auf. Das
AGE-MIF wurde zurückgewonnen
und durch matrixunterstützte
Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie analysiert und
es wurde festgestellt, dass es eine Masse aufwies, die mit einer
dreifachen Amadori-Produktmodifizierung des Proteins übereinstimmte;
d. h. es gab einen Massenüberschuss
von ungefähr
3 × 162
(der Massenüberschuss
eines einzelnen Amadori-Produkts).
-
Es
gibt drei Lysinreste, die innerhalb der Primärsequenz von menschlichem MIF
verteilt sind. Da rekombinant hergestelltes MIF-Protein mit der
zweiten Aminosäure
in der Primärsequenz,
Prolin, beginnt (da der normale Vertebraten-Methioninrest am Anfang durch
die exprimierenden Bakterien charakteristischerweise abgeschnitten
wird), gibt es keine freie Aminogruppe, die mit dem Aminoende des
Proteins verbunden ist. Zusammengefasst deutet dies daraufhin, dass
die Modifizierung von Seitenketten-Aminogruppen von Aminosäuren innerhalb
der MIF-Peptidsequenz die D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität von MIF
eliminieren kann. Somit sind Verbindungen, welche die Modifizierung
von Lysinresten von MIF verursachen, als Inhibitoren der MIF-Bioaktivität brauchbar,
wozu ohne Einschränkung
die entzündlichen
und immunmodulatorischen Aktivitäten
von MIF gehören.
-
Beispiel 5
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht ein periodaffreies Testsystem zum Messen
der Tautomeraseaktivität von
MIF. Der Tautomerasetest erfordert die Erzeugung von frischem L-Dopachrom-methylester
(L-DCME) aus L-Dopa-methylester (L-DME) durch chemische Oxidation
mit überschüssigem Periodat.
Es sind große
Mengen des oxidierenden Reagenzes Periodat erforderlich, da keine
weiteren Reinigungsschritte verwendet werden. Außerdem erhöhen Rückstände von Periodat weiter die
Instabilität
des Substrats, was die Herstellung von frischen Substratlösungen erfordert,
und Periodat kann auch mit den Testverbindungen reagieren. Deshalb
zeigt dieses Beispiel ein Verfahren zum Entfernen von überschüssigem Periodat
und seinem Reaktionsprodukt Iodat aus dem Testgemisch und zum Konzentrieren
des Substrats als eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
-
Nach
der Formulierung von L-DCME aus L-DME und Periodat wird das Substratgemisch
einer Umkehrphasenchromatografie mit C18-beschichteten Siliciumdioxidperlen
unterzogen. Das Periodat wird durch Spülen mit entionisiertem Wasser
entfernt. Das Substrat wird mit reinem Methanol von der Säule eluiert,
wobei eine methanolische Lösung
von L-DCME erhalten wird, welche wenigstens mehrere Monate bei –70°C stabil aufbewahrt
werden kann.
-
Gleiche
Volumina von wässrigen
Lösungen
von L-Dopa-methylester (L-DME) (4 mM) und Natriumperiodat (8 mM)
wurden vermischt und 5 min inkubiert. Das verbleibende Periodat
wurde durch Chromatografie über
eine selbstgepackte 10 ml C18-Umkehrphasensäule unter Verwendung einer
Vakuumvorrichtung von dem tiefgefärbten L-Dopachrom-methylester
entfernt. Die Säule
wurde dreimal mit entionisiertem Wasser (30 ml) gespült und der
L-Dopachrom-methylester (DCME) wurde mit Methanol eluiert. Das methanolische
Eluat war bei –70°C wenigstens
mehrere Monate lang stabil.
-
Unter
Verwendung der vorstehend angegebenen verbesserten Reagenzien kann
ein Dopachrom-Tautomerasetest 1 ml von Puffer A (0,2% Tween in 25
mM Kaliumphosphat pH 6,0) von Puffer B (500 μM EDTA in 25 mM Kaliumphosphat
pH 6,0) mit 10–30 μl des Substrats
L-DCME-Konzentrat vermischen (Ausgangs-E475nm ≈ 1–1,4). Nach
dem Messen bzw. Verfolgen der Hintergrundrate wird MIF zugegeben
(charakteristischerweise 0,05 bis 0,5 μg MIF). Die Hintergrund und
die MIF-katalysierten Reaktionen werden bei 475 nm an einem Spektralfotometer
verfolgt.