DE69731038T2

DE69731038T2 - Screening-test zur identifikation von inhibitoren des makrophagenmigrationshemmenden faktors

Info

Publication number: DE69731038T2
Application number: DE69731038T
Authority: DE
Inventors: Richard Bucala; C. Peter ULRICH; Xini Xhang; Anthony Cerami; Klaus Bendrat
Original assignee: Picower Institute for Medical Research
Current assignee: Picower Institute for Medical Research
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2017-02-15
Also published as: DE69731038D1; US6420188B1; WO1997029635A1; CA2218364C; EP0821551A1; JP4116077B2; EP0821551A4; CA2218364A1; JP2000507811A; EP0821551B1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Screeningtest zum Identifizieren von therapeutischen Inhibitoren der biologischen Aktivität des makrophagenmigrationshemmenden Faktors bzw. Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktors (MIF) bereit. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem therapeutische Wirkstoffe bereit, welche die biologische Aktivität von MIF hemmen können und durch den erfindungsgemäßen Screeningtest identifiziert werden. Insbesondere sind die therapeutischen Wirkstoffe brauchbar zum Behandeln von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, wie etwa ein Schock, Entzündungskrankheiten, eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten.
Hintergrund der Erfindung
Eine Infektion durch eine Reihe von Mikroorganismen, zu denen nicht nur Bakterien, sondern auch Viren, Pilze und Parasiten gehören, kann einen septischen Schock auslösen. Ein septischer Schock ist ein facettenreicher pathologischer Zustand, der durch schädliche hämodynamische Veränderungen und eine Koagulopathie gekennzeichnet ist. Ein septischer Schock kann zu einem multiplen Organversagen und häufig zum Tod führen. Das Schocksyndrom hängt genauer gesagt mit der Reaktion des Wirts auf eine Mikroorganismeninvasion zusammen. Bei einer Infektion durch Gram-negative Bakterien, einem der am besten untersuchten Beispiele, wird angenommen, dass das Auftreten von bakteriellen Endotoxinen wie etwa Lipopolysaccharid (LPS) in dem Blutstrom des Wirtes zur endogenen Erzeugung einer Reihe von Wirtsfaktoren führt, welche direkt und indirekt die Toxizität von LPS vermitteln. LPS selbst ist für die meisten Zellen relativ harmlos. Zu diesen vom Wirt erzeugten Mediatoren gehören viele inflammatorische (entzündliche) Cytokine und klassische endokrine Hormone sowie eine Reihe von ande ren endogenen Faktoren wie Leukotriene und der plättchenaktivierende Faktor. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass das gesamte Ensemble der vom Wirt erzeugten Mediatoren und jede ihrer in Wechselbeziehung stehenden Rollen bei der Reaktion des Wirts noch nicht vollständig aufgeklärt ist.
Im Allgemeinen wird angenommen, dass diejenigen vom Wirt erzeugten Mediatoren, die in einem befallenen Wirt früher erscheinen, die Freisetzung der später auftretenden Faktoren auslösen. Außerdem üben viele endogene Mediatoren nicht nur direkte Effektorfunktionen an ihren Zielgeweben aus, sondern bereiten auch örtliche und weiter entfernte Gewebe für nachfolgende Reaktionen auf andere Mediatoren vor. Dieses wechselwirkende Netzwerk von Wirtsfaktoren wurde als die "Cytokinkaskade" bezeichnet. Dieser Begriff soll die rasche Ausbreitung und Verstärkung der Wirtsreaktion andeuten, die so erfolgt, dass nur ein oder einige wenige einleitende Stimuli schließlich die Freisetzung und Beteiligung einer großen Anzahl von endogenen Mediatoren auslösen. Wenngleich angenommen wird, dass einige Merkmale der Wirtsreaktion die Abwehr einer Invasion unterstützen, kann eine übermäßig robuste oder schlecht modulierte Wirtsreaktion sich rasch beschleunigen, so dass derart tiefgreifende Veränderungen der Homöostase des Wirts auf zellulärer, Gewebe- und systemischer Ebene hervorgerufen werden, dass der Tod innerhalb von Stunden eintreten kann.
Mäuse-Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF) wurde als ein LPS-induziertes Hypophysenhormon identifiziert (Bernhagen et al., J. Cell. Biochem. Supplement 17B, E306. 1993). Zunächst wurde die Hypothese aufgestellt, dass MIF ein von der Hypophyse erzeugter Schutzfaktor sein könnte, welcher den schädlichen Wirkungen von Cytokinen in Endotoxämien entgegenwirken könnte, aber später wurde festgestellt, dass MIF tatsächlich einen Endotoxin-induzierten Schock verschlimmert und dass die Hemmung der MIF-Aktivität verwendet werden kann, um andernfalls tödliche Wirkungen des Cytokin-vermittelten Schocks zu behandeln. MIF wurde redefiniert als ein Hypophysenvorderlappenhormon, ein Makrophagencytokin und eine entscheidende Komponente der Wirtsreaktion auf einen septischen Schock (Bernhagen et al., Nature 365: 756–759 1993; Calandra et al., J. Exp. Med. 179: 1895–1902 1994; Calandra et al., Nature 377: 68–71 1995).
MIF wurde zuerst vor über 30 Jahren als ein T-Zellprodukt beschrieben, welches die ungerichtete Migration von Meerschweinchen-Makrophagen in einem in vitro-Test hemmt (George und Vaughan, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 111: 514–521 1962; Bloom und Bennett, Science 158: 80–82 1966; David, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65: 72–77 1966). Es wurde berichtet, dass MIF: (1) mit Spättyp-Überempfindlichkeitsreaktionen in Zusammenhang gebracht wurde (Bloom und Bennett, 1966, oben; David, 1966, oben), (2) durch Lectin-aktivierte T-Zellen erzeugt wird (Weiser et al., J. Immunol. 126: 1958–1962 1981) und (3) die Makrophagenadhäsion, Phagocytose und tumorabtötende Aktivität verstärkt (Nathan et al., J. Exp. Med. 137: 275–288 1973; Nathan et al., J. Exp. Med. 133: 1356–1376 1971; und Churchill et al., J. Immunol. 115: 781–785 1975). Viele von diesen Studien verwendeten Mischkulturüberstände, von denen später gezeigt wurde, dass sie andere Cytokine wie IFN-γ und IL-4 enthielten, welche ebenfalls eine migrationshemmende Aktivität aufweisen (McInnes und Rennick, J. Exp. Med. 167: 598–611 1988; Thurman et al., J. Immunol. 134: 305–309 1985).
Rekombinantes menschliches MIF wurde ursprünglich aus menschlichen T-Zellen kloniert (Weiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7522–7526 1989). Das biologische Aktivitätsprofil von MIF war nicht vollständig bekannt und war umstritten. Es wurde jedoch gezeigt, dass MIF (1) aus Blut gewonnene Makrophagen aktiviert, so dass sie intrazelluläre Parasiten und Tumorzellen in vitro abtöten, (2) die Expression von IL-1β und TNFα stimuliert, und (3) die Stickstoffmonoxidsynthese induziert (einen Überblick findet man in Bernhagen et al., Biochemistry 33: 14144–14155 1994).
Es wurde berichtet, dass MIF ein Hypophysenvorderlappenhormon ist und aus Immunzellen freigesetzt wird, die durch niedrige Konzentrationen von Glucocorticoiden stimuliert werden. Wenn es einmal sezerniert ist, kontrolliert oder gegenreguliert MIF die immunsuppressiven Wirkungen von Glucocorticoiden auf die Erzeugung von inflammatorischem Cytokin und moduliert die starken entzündungshemmenden Eigenschaften von Glucocorticoiden, welche notwendigerweise als Teil der Wirtsreaktion auf eine Infektion und Invasion des Gewebes erzeugt werden (Calandra et al., Nature 377: 68–71 1995). MIF ist eine entscheidende Komponente des Immunsystems und wirkt der immunsuppressiven Wirkung von Glucocorticoiden zur Regulierung einer Entzündung und der Immunität entgegen.
Im Gegensatz zu der von MIF erwarteten Funktion als ein schützender hypothalamischer Faktor verschlimmerte MIF die Letalität in verschiedenen Modellen des septischen Schocks. So kann eine robuste MIF-Reaktion innerhalb der Cytokinkaskade unerwünscht sein. Außerdem hat es das Fehlen von definierten zellulären und biochemischen Aktivitäten von MIF für Forscher sehr schwer gemacht, einen Test zum spezifischen Messen und Quantifizieren der immunologischen Aktivität von MIF und zum Identifizieren von MIF-Inhibitoren zu entwickeln. Das Fehlen eines in vitro-Tests zum Identifizieren von MIF-Inhibitoren hat die Untersuchung des genauen biologischen Profils dieses Moleküls in der Immunreaktion und die Entwicklung einer Behandlung für Störungen, die mit der Cytokin-vermittelten Toxizität zusammenhängen, behindert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen schnellen, quantitativen und spezifischen Test zum Screening von Testverbindungen (z. B. Arzneimitteln, Liganden (natürlichen oder synthetischen), Proteinen, Peptiden und kleinen organischen Molekülen) auf eine Aktivität zum Hemmen der biologischen Aktivität des Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktors (MIF) bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der identifizierten Verbindungen (d. h. Arzneimittel, Liganden, Proteine, Peptide und kleinen organischen Moleküle) gemäß Anspruch 4 bereit, die durch den erfindungsgemäßen Screeningtest identifiziert werden und in der Lage sind, biologische Aktivitäten von MIF zu hemmen. Die Erfindung stellt ferner die Verwendung von solchen identifizierten Verbindungen zum Herstellen eines Medikaments für die Behandlung von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen bereit, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten, eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der überraschenden Entdeckung, dass MIF eine Tautomerisierungsreaktion katalysiert und dass Tests auf Inhibitoren dieser Tautomeraseaktivität verwendet werden können, um Verbindungen zu identifizieren, welche andere biologische Aktivitäten von MIF hemmen.
Kurze Beschreibung der Figur
1 zeigt ein Schema für die Umwandlung von D-Dopachrom, die durch D-Dopachrom-Tautomerase und durch MIF katalysiert wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Es werden die folgenden Definitionen verwendet.
"MIF" sind Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor-Polypeptide mit MIF-Aktivität, wobei aber IFN-γ und IL-4 ausgeschlossen sind.
"MIF-Tautomeraseaktivität", "MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität" und "MIF-Tautomerisierungsaktivität" beziehen sich jeweils auf die gleiche Tautomerase-Enzymaktivität von MIF, die durch die Fähigkeit von MIF, die Tautomerisierung eines MIF-Substrats zu katalysieren, angezeigt wird.
"MIF-Substrat" umfasst (a) D-Dopachrom[D-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], (b) D-Dopachrom-methylester[D-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester] oder (c) L-Dopachrom-methylester[L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester] oder Derivate davon, ist aber nicht darauf beschränkt.
"Testverbindungen" oder "Testsubstanzen" oder "Testinhibitoren" bezieht sich jeweils auf in Frage kommende Arzneimittel, Liganden (natürliche oder synthetische), Proteine, Peptide oder kleine organische Moleküle, die auf ihre Fähigkeit, die Tautomerase-Enzymaktivität von MIF zu hemmen, getestet werden sollen.
Tautomeraseaktivität von MIF
Die Tautomerase-Enzymaktivität von MIF wurde während einer Untersuchung der biochemischen Wege der Melanogenese entdeckt. An den späten Stufen der McIaninbio synthese ist eine enzymatische Umwandlung von L-2-Carboxy-2,3-dihydroindol-5,6-chinon (L-Dopachrom) in 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäure (DHICA) beteiligt. Eine charakteristische Enzymaktivität, die aus der Augenlinse von Rindern isoliert wird, katalysiert die Tautomerisierung von D-Dopachrom, dem nicht-physiologischem Stereoisomer der natürlichen Verbindung, L-Dopachrom, zu DHICA (1). Die Reinigung und Analyse der N-terminalen Sequenz des Proteins, das für diese Tautomeraseaktivität für das in der Natur nicht vorkommende Substrat D-Dopachrom verantwortlich ist, identifizierte das Enzym als das Rinderhomologe von MIF. Die enzymatische Aktivität von gereinigtem nativem MIF wurde durch Untersuchungen von rekombinantem menschlichem MIF bestätigt, bei dem ebenfalls festgestellt wurde, dass es selektiv die gleiche Tautomerisierungsreaktion mit D-Dopachrom als Substrat katalysiert, aber gegenüber L-Dopachrom inaktiv ist. Als Ergebnis dieser Untersuchungen umfasst die vorliegende Erfindung Tests zum Identifizieren von Verbindungen, welche die enzymatische Aktivität von MIF hemmen, welche die Tautomerisierung von MIF-Substraten wie etwa D-Dopachrom zu DHICA katalysiert. Im Allgemeinen wird der Test in vitro durchgeführt durch Zugeben, Vermischen oder Vereinigen von MIF und einem geeigneten Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung und Messen der Tautomerisierung des Substrats. Die Testverbindungen, welche die Tautomerisierungsaktivität in dem erfindungsgemäßen Test hemmen, sind MIF-Inhibitoren, welche eine bedeutende pharmakologische Aktivität aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von solchen identifizierten MIF-Inhibitoren in pharmazeutischen Zusammensetzungen bereit, die darauf ausgelegt sind, die biologische Aktivität von MIF zur Behandlung von mit der Cytokintoxizität zusammenhängenden Störungen zu hemmen. Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung von solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden solcher Zusammensetzungen für die Behandlung von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten, eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Tests
Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles und quantitatives Verfahren zum Screening von Verbindungen bereit, welche die biologischen Aktivitäten von MIF hemmen. Die Tests der vorliegenden Erfindung umfassen das Messen der Fähigkeit einer Testsubstanz, die MIF-katalysierte Tautomerisierung von spezifischen MIF-Substraten zu hemmen. Die Testsubstanzen oder Testverbindungen umfassen Arzneimittel, Liganden (natürliche oder synthetische, Proteine, Peptide oder kleine organische Moleküle, welche die Fähigkeit von MIF hemmen, enzymatisch die Tautomerisierungsreaktion zu katalysieren, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Testsubstanzen, die als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von MIF identifiziert werden, sind Kandidaten für Inhibitoren der biologischen Aktivität von MIF, umfassend, aber nicht beschränkt auf MIF-induzierte entzündliche und immunologische Aktivitäten. Der erfindungsgemäße Screeningtest umfasst das Messen der Wirkung einer Testsubstanz auf die Fähigkeit von MIF, die Tautomerisierung eines spezifischen Substrats zu katalysieren.
Speziell stellt der erfindungsgemäße Test zuerst ein Reaktionsgemisch aus MIF-Polypeptid und einem MIF-Substrat in Gegenwart und Abwesenheit der Testsubstanz oder Testverbindung her. Die Tautomerisierung des MIF-Substrats wird gemessen. Verbindungen, welche die MIF-katalysierte Tautomerisierung hemmen, sind die in Frage kommenden Verbindungen, welche gemäß der Erfindung verwendet werden können. Wenngleich eine beliebige Reihenfolge der Zugabe der Reaktionskomponenten eingesetzt werden kann, ist es bevorzugt, das MIF-Substrat zu einem Gemisch aus MIF und der Testverbindung zuzugeben oder MIF zu einem Gemisch aus dem MIF-Substrat und der Testverbindung zuzugeben. Ein solche Reihenfolge der Zugaben würde die Ablesung erleichtern, da die Testreaktion erst abläuft, wenn sowohl der Katalysator als auch die Substratkomponenten vereinigt sind. Der Test kann als ein homogener Test, z. B. mit allen Komponenten in Lösung, oder als ein heterogener Test, z. B. worin entweder MIF oder das MIF-Substrat auf einem festen Träger immobilisiert ist, gestaltet werden.
Reaktionskomponenten und Bedingungen, welche in den Screeningtests der Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tautomerisierungsreaktionen, die in Rosengren et al., Molecular Medicine 2: 143–149 1996, und Aroca et al., Eur. J. Biochemistry 208: 155–163 1992 beschrieben sind, die jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen sind. Ausgangsmaterialien für MIF umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Säugergewebe (d. h. menschliches Gewebe, Hühner-, Rinder-, Maus- und Rattengewebe), Rindergewebe (d. h. die Augenlinse ist ein Ausgangsmaterial für vorgebildetes bioaktives MIF-Protein) und Hepatocyten (ein reichhaltiges Ausgangsmaterial für vorgebildetes bioaktives MIF-Protein). Vorzugsweise wird rekombinantes MIF verwendet. Bernhagen et al. (Biochemistry 33: 14144–14155 1994) beschreibt ein Verfahren zum Reinigen von bioaktivem rekombinantem MIF.
Zu MIF-Substraten, welche in dem Test verwendet werden können, gehören D-Dopachrom, D-Dopachrom-methylester und L-Dopachrom-methylester, sie sind aber nicht darauf beschränkt. D-Dopachrom ist das nicht in der Natur vorkommende D-Isomer von L-2-Carboxy-2,3-dihydroindol-5,6-chinon (L-Dopachrom). Die Methylester der D- und L-Isomere sind bessere Tautomerasesubstrate für MIF als D-Dopachrom in dem Sinn, dass sie viel schneller tautomerisiert werden. Diese Substrate werden im Allgemeinen unmittelbar vor dem Durchführen des Tests gebildet und zwar durch Oxidation des entsprechenden Phenylalanin-Analogs. Zum Beispiel wird D-DOPA [oder D-3-(3,4-Dihydroxyphenylalanin] zu D-Dopachrom [D-3,5-Dihydro-6-dihydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure] oxidiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird L-Dopachrom-methylester als das MIF-Substrat in dem Screeningtest verwendet. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann D-Dopachrom-methylester als das MIF-Substrat in dem Screeningtest verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, welches eine bioaktive Form von MIF in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung und ein MIF-Substrat (z. B. D-Dopachrom) enthält. Die Fähigkeit der Testverbindung, die enzymatische Aktivität von MIF zu hemmen, wird durch Messen der Umwandlung des orangegefärbten D-Dopachrom-Substrats in farbloses DHICA spektralfotometrisch bestimmt. Zum Beispiel kann das gefärbte MIF-Substrat unmittelbar vor dem Test durch Oxidieren eines farblosen DOPA-Derivats zum Bilden des gefärbten Substrats D-Dopachrom hergestellt werden. Die Testverbindung und bioaktives MIF werden zu dem gefärbten MIF-Substrat zugegeben. Die Tautomerisierung des MIF-Substrats durch MIF führt zu einer ungefärbten Lösung von DHICA und die Umwandlung kann z. B. spektralfotometrisch über einen bestimmten Zeitraum, z. B. eine Minute verfolgt werden.
Die Anwesenheit einer Testverbindung, welche im Hinblick auf eine MIF-hemmende Aktivität positiv ist, hemmt die Tautomerisierungsaktivität von MIF. Dieser Test führt zu einer Lösung, welche die D-Dopachrom-Farbe beibehält. Deshalb kann die Fähigkeit einer Testverbindung, die MIF-Aktivität zu hemmen, alternativ colorimetrisch sichtbar gemacht oder spektralfotometrisch quantitativ bestimmt werden. Zum Beispiel wird die Tautomerisierung von D-Dopachrom zu DHICA leicht spektralfotometrisch bestimmt durch Messen der Geschwindigkeit der Abnahme der Iminochrom-Extinktion bei einer Wellenlänge von 475 nm. Zu anderen Mitteln zum Messen der Tautomerisierung gehört z. B. die Trennung von Produkten und Substraten mittels HPLC.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Test der Erfindung das Zugeben einer Testverbindung zu einem Reaktionsgemisch, das ungefähr 0,5 mM des MIF-Substrats L-Dopachrom-methylester enthält. Dieses MIF-Substrat wird unmittelbar vor dem Test durch Oxidation von L-DOPA-methylester mit Periodat hergestellt, wobei das gefärbte Substrat L-Dopachrom-methylester erhalten wird. Es werden ungefähr 50–250 ng rekombinantes MIF zu 1 ml der Substratlösung zugegeben. Die Reaktion wird direkt in einer Küvette durch Messen der Abnahme der Extinktion bei 475 nm oder 550 nm für Substratkonzentrationen von mehr als 0,5 mM getestet. Das resultierende Reaktionsprodukt ist die farblose Verbindung 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäuremethylester (DHICA-ME). Testverbindungen, welche die Abnahme der Extinktion hemmen, sind Inhibitoren der D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität von MIF und dadurch als in Frage kommende Inhibitoren von entzündungs- oder immun-korrelierten Aktivitäten von MIF identifiziert.
Dieser Test bietet mehrere Vorteile. Der Test stellt ein schnelles, quantitatives und spezifisches Mittel zum Messen der enzymatischen Aktivität von MIF bereit. Dieser Test stellt ein schnelles Screeningverfahren zum Identifizieren von Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von MIF bereit. Solche identifizierten Inhibitoren dienen als in Frage kommende Inhibitoren für andere biologische Aktivitäten von MIF wie etwa die immun-modulatorische Aktivität.
Inhibitoren der MIF-Aktivität
Die vorliegende Erfindung sieht ferner die Verwendung von kleinen organischen Molekülen vor, die als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von MIF identifiziert wurden. Außerdem sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung der identifizierten MIF-Inhibitoren bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Behandeln von Störungen vor, welche mit der Cytokin-vermittelten Toxizität zusammenhängen, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten, eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Inhibitoren sind auch insofern nützlich, als sie eine entzündungshemmende oder anderweitig günstige Eigenschaft durch Erhöhen der therapeutischen Wirksamkeit von Glucocorticoiden aufweisen, ganz gleich ob solche Glucocorticoide endogen vorhanden sind oder exogen verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung von Verbindungen wie kleinen organischen Molekülen vor, die in dem erfindungsgemäßen Test als Inhibitoren der biologischen Aktivität von MIF identifiziert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung könnten bestimmte MIF-Inhibitoren die Tautomerisierung des Substrats durch Konkurrieren mit dem Substrat um die MIF-Bindung hemmen. Es wird angenommen, dass bestimmte dieser Verbindungen mit MIF wechselwirken, aber aufgrund ihrer spezifischen Strukturmerkmale nicht tautomerisiert werden. Zu diesen direkten Konkurrenten gehören die D- und L-Formen des α-Dopachrom-methylesters, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Die Verwendung dieses Typs von Inhibitor von MIF ist auch nützlich beim gezielten Ansteuern der Tautomerase-korrelierten Substratbindungsstelle von MIF, um ein zweites funktionelles Element eines bifunktionellen Inhibitors in wirksame molekulare Erfassung oder sterische Anordnung zu bringen, um die entzündliche oder immunmodulatorische Aktivität von MIF zu hemmen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung hemmen bestimmte MIF-Inhibitoren (z. B. Glutathion und Typanothion (bei dem es sich um zwei Moleküle von Glutathion handelt, die kovalent durch eine Spermidinbrücke verknüpft sind)) die Tautomerisierungsreaktion durch Wechselwirken mit einem Epitop von MIF, welches für die enzymatische Aktivität von entscheidender Bedeutung ist, z. B. dem Aminoende. Die Verwendung dieses Typs von Inhibitor von MIF ist auch nützlich beim gezielten Ansteuern des Aminoendes von MIF, um ein zweites funktionelles Element einer bifunktionellen Inhibitorverbindung in wirksame molekulare Erfassung oder sterische Anordnung zu bringen, um die entzündliche oder immunmodulatorische Aktivität von MIF zu hemmen.
Beispiele für Verbindungen innerhalb des Bereichs der Erfindung sind nachstehend als neun Reihen von Verbindungen gemäß den Formeln I bis IX gezeigt:
worin Q, X, Y und Z vorstehend für jede Reihe von Verbindungen definiert sind und R, R' und R'' jeweils unabhängig voneinander Alkylgruppen (C₁-C₂₀); vorzugsweise niedere Alkylgruppen (C₁-C₄) sind. Außerdem umfasst die Erfindung pharmazeutisch annehmbare Salze von diesen Verbindungen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß gängigen Methoden der organischen Chemie unter Verwendung von leicht/im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien synthetisiert werden. Verbindungen der Formel I werden z. B. durch Oxidation des passenden m-Hydroxyphenylalanin-Derivats mit Periodat oder einem anderen geeigneten Oxidationsmittel synthetisiert. Zum Beispiel ist I (X = Y = OH) aus dem im Handel erhältlichen DL-threo-β-(3,4-Dihydroxyphenyl)serin (Sigma) erhältlich. Andere m-Hydroxyphenylalanine sind durch Umwandlung von 3-Hydroxy-4-substituierten Zimtsäuren erhältlich.
Verbindungen der Formel II (Z = NH oder NR, X = OH) werden synthetisiert durch Reduktion von Verbindungen der Formel I mit Dithionit oder einem anderen geeigneten Reduktionsmittel gefolgt von einer Alkylierung des Stickstoffs mit einem R-Halogenid, falls Z = NR. Verbindungen der Formel II (Z = CH₂) werden durch Umwandlungen von passend 5,6-substituierten Inden- oder 1- oder 2-Indanon-Derivaten synthetisiert. Verbindungen der Formel II (Z = O oder S) werden durch Umwandlungen von passend 5,6-substituierten Benzofuran- oder Thianaphthen-Derivaten synthetisiert. Verbindungen der Formel II (Z = SO oder SO₂) werden durch Oxidation von II (Z = S) mit Wasserstoffperoxid, Persäuren oder Periodat unter geeigneten Bedingungen hergestellt.
Verbindungen der Formel III werden durch Behandlung von entsprechenden Verbindungen der Formel II (Q = Cl oder Br) mit einer geeigneten Base zum Bewirken der β-Eliminierung des Halogens synthetisiert. Verbindungen der Formel IV (Z = N, Y = OH oder OR') werden aus Kojisäurebenzylether (2-Hydroxymethyl-5-benzyloxy-4-pyranon) durch Reaktion mit β-Alanin-ethylester zum Erhalten von 2-Hydroxymethyl-5-benzyloxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester synthetisiert; die Hydroxymethylgruppe wird zu dem Aldehyd, 2-Formyl-5-benzyloxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester, mit Chromtrioxid-Pyridin-Komplex oxidiert und die Cyclisierung erfolgt durch eine Behandlung mit einer Base, wie etwa Lithiumdiisopropylamid, um eine Verbindung der Formel IV (Z = N, X = OH, Y = OCH₂Ph) zu erhalten. Aus der letztgenannten Verbindung können Verbindungen der Formel IV (X = OH) durch Behandlung mit geeigneten Reagenzien für eine Umwandlung von Hydroxy in Halogen (z. B. Diethylaminoschwefeltrifluorid, Thionylchlorid oder Thionylbromid) hergestellt werden. Für Verbindungen der Formel IV (Y = Halogen) wird 2-Formyl-5-(2-tetrahydropyranyl)oxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester aus 2-Hydroxymethyl-5-(2-tetrahydropyranyl)oxy-4-pyranon durch Reaktion mit β-Alanin ethylester, gefolgt von einer Oxidation mit Chromtrioxid-Pyridin-Komplex hergestellt. Das Produkt wird anschließend in milder Säure zu 2-Formyl-5-hydroxy-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester hydrolysiert, welcher mit einem geeigneten Dehydroxyhalogenierungsmittel, wie etwa Diethylaminoschwefeltrifluorid, Thionylchlorid oder Thionylbromid behandelt wird, um 2-Formyl-5-halogeno-4-pyridon-1-propionsäure-ethylester zu erhalten. Dieses Produkt wird anschließend weiter umgewandelt, wie im Fall von Y = Benzyloxy.
Verbindungen der Formel IV (Z = C-CH₃, X = OH) werden aus dem entsprechenden 4-substituierten 5-Hydroxy-2-methylbenzaldehyd-Derivat durch Behandlung mit Base zum Bilden eines Phenoxid-Anions, gefolgt von einer Cyclisierung mit einem Acrylester hergestellt. Verbindungen der Formel IV (Z = C-CH₃, X = F, Cl oder Br) werden durch Behandlung der passenden Verbindung der Formel V (siehe unten) mit dem entsprechenden Halogenwasserstoff in einem nicht-hydroxylischen Lösungsmittel hergestellt; und anschließend mit einem niederen Alkoxid behandelt. Dies ergibt die Verbindungen der Formel V (Z = C-CH₃, X oder OR'), welche alternativ durch Behandlung von Verbindungen der Formel IV (Z = C-CH₃, X = OH) mit einem Alkylhalogenid und einer nicht-nukleophilen Base synthetisiert werden.
Verbindungen der Formel V (Z = N) werden durch Behandlung der entsprechenden Verbindungen der Formel II (X = Cl oder Br) mit einer geeigneten Base zum Bewirken einer β-Eliminierung des Halogens synthetisiert. Verbindungen der Formel V (Z = C-CH₃) werden aus dem entsprechenden 4-substituierten 5-Hydroxy-2-methylbenzaldehyd-Derivat durch Behandlung mit Base zum Bilden eines Phenoxid-Anions, gefolgt von einer Cyclisierung mit Diethylmethylenmalonat zum Bilden eines Derivats der entsprechenden Verbindung der Formel IV (Z = C-CH₃, R = Et, X = OH), das eine zweite Carboethoxygruppe geminal zu der in den Strukturen der Formel IV abgebildeten Carboxylgruppe trägt, hergestellt. Dieses Produkt wird anschließend einer Hydrolyse, Decarboxylierung und Eliminierung, vorzugsweise unter sauren Bedingungen unterzogen, um Verbindungen der Formel V (Z = C-CH₃, R = H) zu bilden, welche wiederverestert werden können.
Verbindungen der Formel VI werden aus dem entsprechenden 6,7-substituierten Chinolin-Derivat durch Behandlung mit Benzoylchlorid und Natriumcyanid zum Erhalten des 1-Benzoyl-2-cyano-1,2-dihydro-Derivats, gefolgt von einer Hydrierung zum Erhalten des 1-Benzoyl-2-cyano-1,2,3,4-tetrahydro-Derivats synthetisiert. Dieses Produkt wird unter basischen oder sauren Bedingungen hydrolysiert, um die entsprechende 6,7-substituierte 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin-2-carbonsäure zu erhalten, welche dann in einen Ester wie etwa den Methylester umgewandelt werden kann. Eine Dehydrierung in der 1,2-Stellung wird beispielsweise durch Behandlung mit einem Oxidationsmittel, einem Halogenierungsmittel oder einem Sulfonylierungsmittel, gefolgt von Base bewirkt.
Verbindungen der Formel VII werden aus entsprechenden Verbindungen der Formel III durch Behandlung mit einem geeigneten Carbenoid- oder Methylentransferreagenz, wie etwa durch Behandlung mit Diazomethan, oder durch Behandlung mit Diiodmethan in Gegenwart von Zinkstaub oder durch Behandlung mit Bromoform in Gegenwart von Kalium-tert-butoxid, gefolgt von einer Debromierung des resultierenden Dibrommethan-Derivats (z. B. unter Verwendung von Zink in Essigsäure) synthetisiert.
Verbindungen der Formel VIII werden aus Verbindungen der Formel III (Z = CH₂) durch Behandlung mit einem epoxidierenden Mittel wie etwa m-Chlorperbenzoesäure synthetisiert. Verbindungen der Formel IX (X = O) werden ebenso aus Verbindungen der Formel V durch Behandlung mit einem epoxidierenden Mittel wie etwa m-Chlorperbenzoesäure synthetisiert. Verbindungen der Formel IX (X = CH₂) werden aus Verbindungen der Formel V unter geeigneten Methylentransferbedingungen, wie etwa durch Behandlung mit Diazomethan, synthetisiert.
Pharmazeutische Formulierungen
Die durch den erfindungsgemäßen Screeningtest identifizieren Verbindungen, welche die MIF-Tautomeraseaktivität hemmen, sind pharmazeutische Verbindungen mit einer therapeutischen Aktivität zum Hemmen der immunmodulatorischen Aktivität von MIF. Die identifizierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in pharmakologischen Zusammensetzungen für die Behandlung von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen brauchbar, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten, eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Eine identifizierte Verbindung kann an einen menschlichen Patienten allein oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, worin sie mit geeigneten Trägern oder Excipienzien vermischt ist, in Dosen zum Behan deln oder Bessern von verschiedenen Leiden bzw. Zuständen verabreicht werden, an denen eine Cytokin-vermittelte Toxizität beteiligt ist, welche einen Schock, Entzündungskrankheiten, eine Transplantat-Wirt-Reaktion und Autoimmunkrankheiten umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich ferner auf die Menge der Verbindung, die ausreicht, um die biologische Aktivität von MIF in vivo zu hemmen. Methoden zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können in "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Auflage, gefunden werden.
Zu geeigneten Verabreichungswegen gehören z. B. eine orale, rektale, durch Inhalation erfolgende, transmukosale oder intestinale Verabreichung; eine parenterale Verabreichung einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen sowie intrathekaler, direkter intraventrikulärer, intravenöser, intraperitonealer, intranasaler oder intraokularer Injektionen. Alternativ kann man die therapeutische Verbindung auf lokale statt systemische Weise verabreichen, z. B. durch Injektion der Verbindung direkt an der Stelle einer Entzündung, häufig in einer Depotformulierung oder Formulierung mit verzögerter Freigabe. Außerdem kann man die Verbindung in einem zielgerichteten Arzneimittelverabreichungssystem verabreichen, z. B. in einem Liposom, das mit einem anti-MIF-Rezeptor-Antikörper überzogen ist. Die Liposomen werden zu Zellen, die den MIF-Rezeptor exprimieren, gezielt hingeführt und von diesen selektiv aufgenommen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine an sich bekannte Weise hergestellt werden, wie etwa durch herkömmliche Misch-, Auflösungs-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägern formuliert werden, die Excipienzien und Hilfsstoffe umfassen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu pharmazeutischen Zubereitungen erleichtern. Die zweckmäßige Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Für eine parenterale Injektion können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern wie etwa Hank's-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer formuliert werden. Für eine transmukosale Verabreichung werden für die zu durchdringende Barriere zweckmäßige Penetrationsmittel in der Formulierung verwendet. Für eine orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Kombinieren der therapeutisch wirksamen Verbindungen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert werden. Solche Träger machen es möglich, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen für eine orale Verabreichung an einen Patienten formuliert werden. Pharmazeutische Zubereitungen für eine orale Verwendung können als ein festes Excipiens erhalten werden, gegebenenfalls mit Mahlen eines resultierenden Gemisches und Verarbeiten des Gemisches aus Körnchen, nach dem Zugeben von geeigneten Hilfsmitteln, falls dies gewünscht wird, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Excipienzien sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Lactose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol; Cellulosezubereitungen wie z. B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Traganthgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls es gewünscht wird können Zerfallhilfsmittel zugegeben werden, wie etwa das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie etwa Natriumalginat. Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, welche gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Zur Identifizierung können Farbstoffe oder Pigmente zu den Tabletten oder Drageeüberzügen zugegeben werden.
Pharmazeutische Zubereitungen, welche oral verwendet werden können, umfassen Steckkapseln aus Gelatine sowie weiche geschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie etwa Glycerol oder Sorbitol. Die Steckkapseln können die Wirkstoffe in Mischung mit Füllstoff wie etwa Lactose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln wie Talk oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten wie fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder suspendiert sein. Außerdem können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen für eine orale Verabreichung sollten in Dosen vorliegen, die sich für eine solche Verabreichung eignen. Für eine bukkale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Pastillen vorliegen, die auf herkömmliche Weise formuliert sind. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in rektalen Zusammensetzungen wie etwa Zäpfchen oder Retentionseinläufen formuliert werden (die z. B. herkömmliche Zäpfchengrundlagen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten).
Für eine Verabreichung durch Inhalation werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form einer Aerosolspraydarreichung aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Zerstäuber mit Verwendung eines geeigneten Treibmittels (z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas) abgegeben. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge festgelegt werden. Kapseln und Hülsen aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die eine Pulvermischung aus den pharmazeutischen Zusammensetzungen und einer geeigneten Pulvergrundlage wie Lactose oder Stärke enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können für eine parenterale Verabreichung durch Injektion wie etwa durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion formuliert werden. Formulierungen für eine Injektion können in Form von Dosierungseinheiten wie etwa in Ampullen oder Mehrfachdosisbehältern mit einem zugegebenen Konservierungsmittel dargeboten werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen und können Formulierungshilfsmittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Zu pharmazeutischen Formulierungen für eine parenterale Verabreichung gehören wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Außerdem können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören fette Öle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie etwa Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu gestatten.
Alternativ kann der Wirkstoff in Form eines Pulvers zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel wie sterilem pyrogenfreiem Wasser vor der Verwendung vorliegen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch als Depotpräparat formuliert werden. Solche langwirkenden Formulierungen können durch Implantation (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. So können z. B. die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als wenig löslich Derivate, z. B. als ein wenig lösliches Salz formuliert werden.
Liposome und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Verabreichungsvehikel oder Träger für hydrophobe Arzneimittel. Bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid können ebenfalls eingesetzt werden, wenngleich gewöhnlich zum Preis einer höheren Toxizität. Außerdem können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems mit verzögerter Freigabe wie etwa semipermeabler Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, die den therapeutischen Wirkstoff enthalten, verabreicht werden. Verschiedene Materialien mit verzögerter Freigabe sind eingeführt worden und dem Fachmann bekannt. Kapseln mit verzögerter Freigabe können je nach ihrer chemischen Beschaffenheit die Verbindungen über einige Wochen bis über mehr als 100 Tage freigeben. Je nach der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagenzes können zusätzliche Strategien für eine Proteinstabilisierung eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete feste oder Gelphasen-Träger oder Excipienzien umfassen. Zu Beispielen für solche Träger oder Excipienzien gehören Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Zucker, Stärken, Cellulose-Derivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
Viele der MIF-hemmenden Verbindungen der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze können mit vielen Säuren gebildet werden, umfassend, aber nicht beschränkt auf Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure usw.; oder mit Basen. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Basenformen. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Salze, Träger oder Excipienzien sind dem Fachmann bekannt und können z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990 gefunden werden. Zu solchen Salzen gehören Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Acetat-, Citrat-, Tartrat-, Malatsalze und dergleichen, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören Zusammensetzungen, bei denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um ihren beabsichtigten Zweck zu erzielen. Genauer gesagt bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die zum Verhindern der Entwicklung von oder zum Lindern der bestehenden Symptome oder zum Behandeln der zugrundeliegenden Krankheit des behandelten Individuums wirksam ist. Die therapeutisch wirksame Dosiskonzentration kann ursprünglich aus Zellkulturtests abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu erzielen, welcher die IC₅₀ einschließt, die in Zellkultur bestimmt wurde (d. h. die Konzentration der Verbindung, welche eine halbmaximale Hemmung der MIF-Aktivität erzielt). Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, welche zu einer Verbesserung von Symptomen oder einer Verlängerung des Überlebens bei einem Patienten führt. Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit von solchen Verbindungen kann durch gängige pharmazeutische, pharmakologische und toxikologische Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index. Verbindungen, welche große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Die aus diesen Zellkulturtests und Tierversuchen erhaltenen Daten können beim Formulieren eines Bereichs von Dosierungen zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, welche die ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren, je nach der eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg. Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können von dem einzelnen Arzt in Anbetracht des Zustands des Patienten ausgewählt werden. Die Menge der verabreichten Zusammensetzung hängt von dem behandelten Patienten, dem Gewicht des Patienten, der Schwere der Krankheit, der Art der Verabreichung und dem Ermessen des verschreibenden Arztes ab.
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Hemmung der MIF-Tautomeraseaktivität mit Glutathion. Durch Oxidation von L-DOPA-methylester mit Periodat wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt, das 0,5 mM des MIF-Substrats L-Dopachrom-methylester enthielt. Eine 1 mM Lösung von L-DOPA-methylester wurde in Reaktionspuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 6, enthaltend 0,5 mM EDTA) hergestellt. L-DOPA-methylester wurde zu farbigem L-Dopachrom-methylester durch Zugabe von 10% (Vol./Vol.) einer 20 mM wässrigen Lösung von Kaliumperiodat im Anschluss an eine 1 : 2-Verdünnung mit Reaktionspuffer oxidiert. Nach ungefähr 10 Minuten blieb die Farbe stabil und die Substratlösung war zur Verwendung in dem Test bereit.
Die Testverbindung, reduziertes Glutathion, wurde in Konzentrationen von 0,1 mM, 0,5 mM, 1,0 mM und 2,0 mM in getrennte Küvetten gegeben, welche die Substratlösung enthielten. Zu jeder Küvette wurden ungefähr 100 ng gereinigtes rekombinantes MIF zugegeben. Die Extinktion bei 475 nm von jeder Probenküvette wurde über die ersten 20 Sekunden bis 2 Minuten gemessen. Die Anfangsrate der Änderung der Extinktion, welche die Reaktionsrate oder -geschwindigkeit anzeigt, wurde aufgezeichnet. Diese Abnahme der Extinktion im Anschluss an die Zugabe von rekombinantem MIF wurde verwendet, um die Tautomeraseaktivität von rekombinantem MIF in Gegenwart von Glutathion zu bestimmen. Ergebnisse sind in Tabelle 2 nachstehend gezeigt. TABELLE 2

Glutathion in Test [mM] %-Hemmung

0 0%

0,1 14%

0,5 69%

1,0 95%

2,0 100%
Bei Konzentrationen von 0,5 mM bis 2,0 mM war Glutathion ein wirksamer Inhibitor der MIF-Tautomeraseaktivität.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht den Einfluss der nativen MIF-Aminoende-Primärsequenz auf die MIF-Tautomeraseaktivität. Eine aminoterminale Mutation von Maus-MIF wurde in E. coli exprimiert und auf Tautomeraseaktivität getestet. Die kodierende Region von Maus-MIF wurde durch die Addition einer aus drei Aminosäuren bestehenden Verlängerungssequenz: Methionin-Aspartat-Serin, an das native Aminoende mutagenisiert. Die veränderte kodierende Region des Maus-MIF wurde in E. coli exprimiert und das exprimierte Protein wurde gereinigt und wie vorstehend beschrieben auf MIF-Tautomeraseaktivität getestet. Die Expression dieses veränderten Gens führte zu einem MIF-Protein, dem die Tautomeraseaktivität vollständig fehlte. Die Expression von menschlichem MIF, das ein nicht verändertes natives Aminoende trug, in dem gleichen E. coli-System führte zu einem hochaktiven MIF, dessen Tautomeraseaktivität selbst in rohen Bakterienlysaten ohne Aufreinigung nachgewiesen werden konnte.
Weitere Mutationen der MIF-Primärsequenz zerstörten ebenfalls die MIF-Tautomeraseaktivität. Speziell führte eine Deletionsmutante, bei der das N-terminate Prolin von MIF eliminiert war, zum Verlust der gesamten Tautomeraseaktivität. Eine Substitution des N-terminalen Prolins (durch Serin) führte zum Verlust der gesamten Tautomeraseaktivität. Außerdem wiesen C-terminal verkürzte Mutanten 1 → 104 und 1 → 110 keine Tautomeraseaktivität auf.
Der vollständige Verlust der MIF-Tautomeraseaktivität durch eine aminoterminale Verlängerung oder Mutation legt einen entscheidenden Einfluss dieser Region auf die MIF-Tautomeraseaktivität nahe.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit der Verbindungen 2b [L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], 3b [D/L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], 4b [L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H- indol-2-carbonsäure-methylester] und 5b [D/L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester], die MIF-Tautomeraseaktivität in vitro zu hemmen.
Das allgemeine Verfahren zum Durchführen eines Tests auf die MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität beginnt mit der Oxidation einer Vorstufe des MIF-Substrats (z. B. DOPA-verwandte Verbindung 1a [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)alanin-methylester] oben) und, falls erforderlich, einer ähnlichen Oxidation von Vorstufen der Testinhibitoren (z. B. der DOPA-verwandten Verbindungen 2a [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin], 3a [D/L-3-(3,4-Dihydroxylphenyl)-2-methylalanin], 4a [L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin-methylester] und 5a [D/L-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-methylalanin-methylester] oben). Diese Oxidation von jeder Vorläuferverbindung (beispielsweise mit Natriumperiodat) erzeugt ein entsprechendes orange gefärbtes Dopachrom-Derivat; speziell ein bevorzugtes MIF-Substrat (Verbindung 1b oben) und die Testinhibitoren (Verbindungen 2b, 3b, 4b und 5b oben). Bei Zugabe von MIF findet eine Tautomerisierung des MIF-Substrats (Verbindung 1b [L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester]) statt, was zu einem farblosen Produkt führt. In Gegenwart der Testinhibitoren (Verbindungen 2b, 3b, 4b und 5b) war die Entfärbung des MIF-Substrats (Verbindung 1b) verzögert. Die Testverbindungen 2b, 3b, 4b und 5b selbst waren in dieser Tautomerisierungsreaktion nicht reaktionsfähig; d. h. sie wurden nicht durch MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität tautomerisiert und entsprechend entfärbt, wenn sie an die Stelle des MIF-Substrats in diesem Testverfahren traten.
In einem bevorzugten MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivitäts-Testverfahren wurden die DOPA-verwandten Vorstufen (Verbindungen 1a, 2a, 3a, 4a und 5a oben) als 10 mM Stammlösungen in Testpuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 6,0) hergestellt. Ungefähr 10 Minuten vor dem Tautomerisierungstest wurden 1,0 ml von jeder Stammlösung mit 8 ml Testpuffer verdünnt und 1,0 ml Natriumperiodat-Stammlösung (20 mM in Wasser) wurde zugegeben, um die Oxidation der verdünnten Vorstufen auszulösen, wobei somit jedes entsprechende Dopachrom-Derivat (d. h. die Verbindungen 1b, 2b, 3b, 4b und 5b) in einer Endkonzentration von ungefähr 1 mM erzeugt wurde. Um den tatsächlichen Tautomerisierungstest durchzuführen, wurden 0,5 ml der 1 mM Lösung des MIF-Substrats (d. h. Verbindung 1b) mit 0,5 ml Testpuffer (Kontrollreaktion ohne Inhibitor) oder 0,5 ml der 1 mM Verdünnung des Testinhibitors (z. B. Verbindungen 2b, 3b, 4b oder 5b) vermischt, gefolgt von der Zugabe von 10 ml der Lösung des rekombinanten MIF aus einer 20 mg/ml-Stammlösung. Die Abnahme der Extinktion bei 475 nm in 1 Minute wurde als ein Index der Tautomeraseaktivität gemessen und die prozentuale Hemmung dieser Abnahme in Gegenwart der Verbindungen 2b, 3b, 4b und 5b wurde aus den spektralfotometrischen Daten durch Standardverfahren berechnet.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TABELLE 3 % Hemmung der MIF-Tautomerase

Inhibitor Aktivität

Verbindung 2b 35

Verbindung 3b 29

Verbindung 4b 34

Verbindung 5b 45
Wenn sie in der gleichen Konzentration wie das MIF-Substrat vorhanden waren, hemmten die Testinhibitorverbindungen 2b, 3b, 4b und 5b jeweils die MIF-Tautomeraseaktivität, was durch die Hemmung der Abnahme der Dopachrom-spezifischen Extinktion gemessen wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Abstraktion des α-Wasserstoffs von dem Dopachrom-verwandten MIF-Substrat ein entscheidender Schritt bei der MIF-katalysierten Tautomerisierung ist und dass Testverbindungen, denen dieses Wasserstoffatom fehlt, (z. B. solche mit einer α-Methyl-Substitution) wirksame Inhibitoren der MIF-Dopachrom-Tautomeraseaktivität sind.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Hemmung der MIF-Tautomeraseaktivität durch Glykierung von Lysinresten. Bei längerem Kontakt mit Glucose oder einem anderen reduzierenden Zucker in vivo oder in vitro werden Proteine und andere aminohaltige Biomoleküle durch kovalent gebundene, von Zucker abgeleitete Addukte spontan modifiziert (Bucala und Cerami, Adv. Pharmacol. 23: 1–34, 1992). Die Chemie dieses Prozesses ist allgemein als die Maillard-Reaktion bekannt, worin empfindliche Protein-Aminogruppen wie etwa das Peptid-Aminoende und die ε-Amino-Komponenten von Lysinresten beispielsweise zuerst mit einer reaktiven Carbonylkomponente eines reduzierenden Zuckers kondensieren, um eine leicht reversible Schift-Base zu bilden. Dieses Ausgangsaddukt kann sich spontan umlagern unter Bildung eines Amadori-Produkts (oder Heyns-Produkts, je nach dem spezifischen Zucker, der beteiligt ist), welches stabil ist.
Gereinigtes, rekombinant hergestelltes menschliches MIF-Protein wurde durch Inkubation in wässrigem Puffer in Gegenwart von 0,5 M Glucose, charakteristischerweise während 6 Wochen im Dunkeln bei 37°C unter einer Stickstoffatmosphäre glykiert, um eine vollständige Glykierung von empfindlichen Resten zu gewährleisten (wenngleich andere spontane Glykierungsbedingungen zum Glykieren des Proteins geeignet sind, ohne von dem wesentlichen Inhalt der Erfindung abzuweichen), und auf D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität durch das in dieser Anmeldung beschriebene Verfahren getestet. Dieses glykierte oder AGE-modifizierte MIF ("AGE-MIF") wies keine D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität auf. Das AGE-MIF wurde zurückgewonnen und durch matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektroskopie analysiert und es wurde festgestellt, dass es eine Masse aufwies, die mit einer dreifachen Amadori-Produktmodifizierung des Proteins übereinstimmte; d. h. es gab einen Massenüberschuss von ungefähr 3 × 162 (der Massenüberschuss eines einzelnen Amadori-Produkts).
Es gibt drei Lysinreste, die innerhalb der Primärsequenz von menschlichem MIF verteilt sind. Da rekombinant hergestelltes MIF-Protein mit der zweiten Aminosäure in der Primärsequenz, Prolin, beginnt (da der normale Vertebraten-Methioninrest am Anfang durch die exprimierenden Bakterien charakteristischerweise abgeschnitten wird), gibt es keine freie Aminogruppe, die mit dem Aminoende des Proteins verbunden ist. Zusammengefasst deutet dies daraufhin, dass die Modifizierung von Seitenketten-Aminogruppen von Aminosäuren innerhalb der MIF-Peptidsequenz die D-Dopachrom-Tautomeraseaktivität von MIF eliminieren kann. Somit sind Verbindungen, welche die Modifizierung von Lysinresten von MIF verursachen, als Inhibitoren der MIF-Bioaktivität brauchbar, wozu ohne Einschränkung die entzündlichen und immunmodulatorischen Aktivitäten von MIF gehören.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht ein periodaffreies Testsystem zum Messen der Tautomeraseaktivität von MIF. Der Tautomerasetest erfordert die Erzeugung von frischem L-Dopachrom-methylester (L-DCME) aus L-Dopa-methylester (L-DME) durch chemische Oxidation mit überschüssigem Periodat. Es sind große Mengen des oxidierenden Reagenzes Periodat erforderlich, da keine weiteren Reinigungsschritte verwendet werden. Außerdem erhöhen Rückstände von Periodat weiter die Instabilität des Substrats, was die Herstellung von frischen Substratlösungen erfordert, und Periodat kann auch mit den Testverbindungen reagieren. Deshalb zeigt dieses Beispiel ein Verfahren zum Entfernen von überschüssigem Periodat und seinem Reaktionsprodukt Iodat aus dem Testgemisch und zum Konzentrieren des Substrats als eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Nach der Formulierung von L-DCME aus L-DME und Periodat wird das Substratgemisch einer Umkehrphasenchromatografie mit C18-beschichteten Siliciumdioxidperlen unterzogen. Das Periodat wird durch Spülen mit entionisiertem Wasser entfernt. Das Substrat wird mit reinem Methanol von der Säule eluiert, wobei eine methanolische Lösung von L-DCME erhalten wird, welche wenigstens mehrere Monate bei –70°C stabil aufbewahrt werden kann.
Gleiche Volumina von wässrigen Lösungen von L-Dopa-methylester (L-DME) (4 mM) und Natriumperiodat (8 mM) wurden vermischt und 5 min inkubiert. Das verbleibende Periodat wurde durch Chromatografie über eine selbstgepackte 10 ml C18-Umkehrphasensäule unter Verwendung einer Vakuumvorrichtung von dem tiefgefärbten L-Dopachrom-methylester entfernt. Die Säule wurde dreimal mit entionisiertem Wasser (30 ml) gespült und der L-Dopachrom-methylester (DCME) wurde mit Methanol eluiert. Das methanolische Eluat war bei –70°C wenigstens mehrere Monate lang stabil.
Unter Verwendung der vorstehend angegebenen verbesserten Reagenzien kann ein Dopachrom-Tautomerasetest 1 ml von Puffer A (0,2% Tween in 25 mM Kaliumphosphat pH 6,0) von Puffer B (500 μM EDTA in 25 mM Kaliumphosphat pH 6,0) mit 10–30 μl des Substrats L-DCME-Konzentrat vermischen (Ausgangs-E_475nm ≈ 1–1,4). Nach dem Messen bzw. Verfolgen der Hintergrundrate wird MIF zugegeben (charakteristischerweise 0,05 bis 0,5 μg MIF). Die Hintergrund und die MIF-katalysierten Reaktionen werden bei 475 nm an einem Spektralfotometer verfolgt.

Claims

Screeningtest für Verbindungen, welche die biologische Aktivität von MIF hemmen, umfassend: a) das Herstellen eines Reaktionsgemisches aus MIF und einem MIF-Substrat in Gegenwart und Abwesenheit einer Testverbindung; und b) das Nachweisen der Tautomerisierung des MIF-Substrats, wobei eine Abnahme der Tautomerisierung des MIF-Substrats die Fähigkeit der Testverbindung zum Hemmen der MIF-Aktivität anzeigt.
Screeningtest nach Anspruch 1, wobei das MIF-Substrat D-Dopachrom, D-Dopachrom-methylester oder L-Dopachrom-methylester umfasst.
Screeningtest nach Anspruch 2, wobei die Tautomerisierung des MIF-Substrats colorimetrisch oder spektralfotometrisch nachgewiesen wird.
Verwendung eines Mittels, welches die Tautomeraseaktivität von MIF hemmt und ausgewählt wird aus der D- und L-Form eines α-Methyl-dopachrom-methylesters und den Verbindungen 2b[L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], 3b [D/L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure], 4b [L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester] und 5b [D/L-3,5-Dihydro-6-hydroxy-2-methyl-5-oxo-2H-indol-2-carbonsäure-methylester] zum Herstellen eines Medikaments für die Behandlung einer Störung ausgewählt aus einem Schock, Entzündungskrankheiten, einer Transplantat-Wirt-Reaktion und einer Autoimmunkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Mittel die MIF-katalysierte Tautomerisierung von D-Dopachrom, D-Dopachrom-methylester oder L-Dopachrommethylester hemmt.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei Entzündungskrankheiten behandelt werden.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Mittel in Verbindung mit einer Glucocorticoidsteroidtherapie verabreicht wird.