DE3448152C2

DE3448152C2 -

Info

Publication number: DE3448152C2
Application number: DE3448152A
Authority: DE
Inventors: Masanori Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Ikuzawa; Yoshiharu Oguchi; Kenichi Tokio/Tokyo Jp Matsunaga; Noriyuki Sagamihara Kanagawa Jp Toyoda; Takao Machida Tokio/Tokyo Jp Furusho; Takayoshi Tokio/Tokyo Jp Fujii; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-08-11
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1989-11-02
Also published as: DE3448155C2; DE3448154C2; DE3448149C2; DE3448153C2; US4820689A; DE3429551A1; DE3448145C2; DE3448144C2; DE3448148C2; DE3448151C2; US5008243A; DE3429551C2; DE3448150C2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel., gegen Schmerzen als Folge der Akzentuierung des Zentralnervs.

Das von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2 412) stammende Glycoprotein ist auf dem Markt bereits er hältlich als Antitumor-Arzneimittel unter dem Waren zeichen Krestin.

Die Stämme Coriolus versicolor (Fr.) Quel. FERM-P Nr. 2 412 und FERM-P Nr. 2 414 wurden von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology bei der American Type Culture Collection am 30. Juli 1979 unter der ATCC Nr. 30 547 und der ATCC Nr. 20 545 hinterlegt.

Da das Glycoprotein eine geringe Säugetiertoxizität aufweist und die Intestinalmikroflora nicht stört, kann eine das Glycoprotein als aktiven Bestandteil (Wirk stoff) enthaltende pharmazeutische Zubereitung über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden. Außer dem ist das Glycoprotein frei von der Gefahr der Verursachung von Mißbildungen und/oder allergischen Re aktionen und daher stellt das Glycoprotein eine extrem sichere (gefahrlose) Substanz dar.

Das Glycoprotein ist eine bereits bekannte Substanz und ist beispielsweise in den japanischen Patentpublikationen Nr. 17 149/1971, 36 322/1796, 14 274/1981, 14 276/1981, 39 288/1981 und der japanischen Patentanmeldung 57-1 34 495 beschrieben, wonach das Glycoprotein durch Kultivieren einer Basidiomy ceten-Fungi-Species, die zum Genus Coriouls gehört, Extra hieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkali lösung und Entfernen der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 er halten, wobei die auf diese Weise in Form eines Extrakts erhaltene Substanz etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine enthält und ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren, aufweist.

Zahlreiche pharmakologische Eigenschaften sind in der Fir menschrift "Outline of PSK", Seite 28-30 beschrieben.

Aus der DE-AS 26 59 808 ist die Verwendung dieses Glycoproteins zur Bekämpfung von Tumoren bekannt.

Das aus den Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammende Glycoprotein hat eine leberbraune Farbe und einen Stickstoffgehalt von 2 bis 8‰, in vielen Fällen von 3 bis 6%. Verschiedene Farbreaktionstests, die mit dem Glycoprotein durchgeführt wurden, ergaben die fol genden Ergebnisse:

α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion (Molish-Reaktion)
Purpurrot
Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dische-Reaktion)	Braun
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion	Grünlich-Blau
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion	Braun
Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion	Purpurrot-Braun
Lowry-Folin-Verfahren	Blau
Ninhydrin-Reaktion nach der Chlorwasserstoffsäure-Hydrolyse	Grünlich-Blau

Das Molekulargewicht des Glycoproteins beträgt 5000 bis 300 000, gemessen unter Anwendung eines Ultra zentrifugenverfahrens. Das Glycoprotein enthält etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine.

Der Saccharidanteil des Glycoproteins besteht haupt sächlich aus β-D-Glycan und die Struktur des Glycan-Restes ist eine verzweigte Struktur, die →3-, 1→4- und 1→6-Bindungen aufweist. Von den Aminosäuren, die den Proteinanteil des Glycoproteins bilden, ist die Menge der sauren Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl., und diejenige der neutralen Amino säuren, wie Valin, Leucin und dgl., verhältnismäßig groß und die Menge der basischen Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Argenin und dgl., ist verhältnismäßig klein. Das Glyco protein ist in Wasser löslich und in Hexan, Benzol, Chloro form, Methanol und Pyridin fast unlöslich. Das Glycopro tein zersetzt sich langsam bei einer Temperatur von etwa 120°C, wenn es erhitzt wird.

Wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich, ist die Säuge tier-Toxizität des Glycoproteins extrem niedrig und es ruft bei Tieren kaum irgendwelche Nebenwir kungen hervor. Insbesondere ist es bekannt als eine sehr sichere (gefahrlose) Substanz für Lebewesen.

Tabelle I

Die in dem Test zur Bestimmung des obengenannten akuten Toxizitätwertes (LD₅₀ mg/kg) verwendeten Mäuse waren solche vom Stamm ICR-JCL, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 21 bis 24 g. Die in dem gleichen Test verwendeten Ratten waren solche vom Stamm Donryu, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körper gewicht von 100 bis 150 g. Das Glycoprotein wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und auf jedem in der Tabelle I angegebenen Weg verabreicht. Nach der Verab reichung wurden die generellen Symptome, die Mortalität und das Körpergewicht jedes der so behandelten Tiere 7 Tage lang beobachtet und dann wurden sie getötet und einer Autopsie unterworfen.

Wie in der Tabelle I angegeben, wurde sowohl im Falle der Mäuse als auch im Falle der Ratten selbst bei der maximalen Dosis, die verabreicht werden konnte, kein Todesfall fest gestellt, so daß das Glycoprotein für Lebewesen extrem sicher (gefahrlos) ist bis zu einem solchen Grade, daß der Wert für die LD₅₀ tatsächlich nicht festge stellt werden konnte.

Als Ergebnis der Prüfung der physiologischen und pharmazeu tischen Eigenschaften des von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammenden Glycoproteins wurde gefunden, daß das Glycoprotein eine antithrom botische Aktivität aufweist und darauf beruht die vor liegende Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Glyco proteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren und 18 bis 38 Gew.-% an Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (FR.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt gegen Schmerzen als Folge der Akzentuierung des Zentralnervs.

Nachfolgend werden die pharmakologischen Eigenschaften des Glycoproteins beschrieben, und zwar die analgetische Aktivität.

Als Ergebnis der Untersuchung der analgetischen Aktivität des Glycoproteins als aktiver Bestandteil (Wirkstoff) einer pharmazeutischen Zubereitung unter Anwendung des mechani schen Stimulierungsverfahrens (durch Druck) und des chemischen Stimulierungsverfahrens unter Verwendung von Mäusen als Versuchstiere, wurde gefunden, daß die orale Verabreichung von 1000 mg Glycoprotein pro kg einen Anstieg des Druckes zum Zeitpunkt des Auftretens der Pseudo-Flucht-Reaktion, eine Verlängerung der Zeit spanne bis zum Auftreten der Pseudo-Flucht-Reaktion und eine Verminderung der Zahl der Zuckungen hervorrief.

Wenn das Glycoprotein zur Behandlung von Schmerzen, hervorgerufen durch Akzentuierung des Zentralnervs verabreicht wird, kann es wie folgt ver wendet werden:
Die kombinierte Verwendung des den Zentralnerv unter drückenden Glycoproteins mit einem anderen, den Zentralnerv unterdrückenden Agens, wie z. B. einem narkotischen analgetischen Agens, einem nicht narkotischen analgetischen Agens und einem analgeti schen, antipyretischen und antiinflammatorischen Agens, wie z. B. solchen, die von Salicylsäure, Pyrazolon, Indol, Phenylessigsäure, Anthranilsäure, Thienopyridin, Pyrimidin, Pyrimidinylpyrazol, Benzotriazin und Benzothazolin ab geleitet sind, ergibt einen Kombinationseffekt.

Die Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitung kann unter Anwendung eines von mehreren Wegen erfolgen.

Das Glycoprotein kann oral oder parenteral, vorzugsweise oral, an Menschen verabreicht werden. Die orale Verabreichung umfaßt die sublinguale Verabreichung und die parenterale Verabreichung umfaßt die subkutane Injektion, die intramuskuläre Injektion, die intravenöse Injektion und die Instillation. Die wirksame Menge der Ver abreichung des Glycoproteins hängt von der Species, dem Alter, individuellen Unterschieden und dem Krankheitszu stand des Patienten ab, im Falle der Behandlung von Human patienten beträgt die tägliche Dosis jedoch 10 bis 1000 mg, vorzugsweise 200 bis 600 mg pro kg Körpergewicht, die gleichmäßig aufgeteilt wird in 1 bis 3 Portionen, um 1 bis 3 mal pro Tag verabreicht zu werden.

Im Falle der oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zubereitung in fester Form vorliegen, beispielsweise in Form einer Tablette, eines Granulats, eines Pulvers und einer Kapsel, sie kann in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise in Form von Lösungen, Sus pensionen, Emulsionen und Sirupen, sie kann in Form von Mischungen vorliegen, die nach dem Schütteln verwendet werden, oder sie kann in einer festen Form vorliegen, die nach dem Auflösen in sterilisiertem Wasser, das keine pyretische Substanz enthält, verwendet wird. Die in fester Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann konven tionelle Zusätze enthalten, wie z. B. Bindemittel, Verdün nungsmittel, Gleitmittel, Desintegratoren, Netzmittel, und die in flüssiger Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann üblicherweise verwendete Zusätze und Konservierungsmittel enthalten. Im Falle einer Injektion kann die pharmazeutische Zubereitung weitere Zusätze, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel und isotonische Agentien enthalten, und das Produkt wird nach dem Abfüllen in eine Dosierungseinheitsampulle oder in einen konventionellen Behälter auf den Markt gebracht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) mit enem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoff säurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrie ren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise ent fernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,2 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultra filters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultra filtrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafil tration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Sub stanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 300 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 26,6 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 13%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 40,5% Kohlenstoff, 6,2% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 90%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 65%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Nachgereichtes Beispiel 1a) Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 547) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lag extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoff säurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrie ren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise ent fernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,1 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultra filters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultra filtrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafil tration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Sub stanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 280 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 28,3 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 14%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 41,2% Kohlenstoff, 6,1% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 95%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 68%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 2 Analgetische Aktivität Prüfung der analgetischen Aktivität durch mechanische Stimulierung

Aus weiblichen ICR-Mäusen wurden Versuchstiere ausge wählt durch Anwendung eines Druckes auf den Caudal-Basispunkt unter Verwendung einer Druckstimulierungsapparatur von Takagi und Kameyama (hergestellt von der Firma Natsume Works) und Auswahl der Einzeltiere, die einen Schwellen wert der Pseudo-Flucht innerhalb des Bereiches von 50 bis 80 mm Hg Druck aufwiesen.

Nach dem Einteilen der auf diese Weise ausgewählten Tiere in Gruppen zu jeweils 10 Tieren wurde das Glycoprotein jedem Tier der ersten Gruppe oral in einer Dosis von 1000 mg/kg verabreicht und in der Appara tur behandelt. Auf diese Weise wurden der Druck zu dem Zeitpunkt wenn das Tier eine Pseudo-Flucht-Reaktion zeig te, und der Zeitraum (Sekunden) bis das Tier die Pseu do-Flucht-Reaktion zeigte, bestimmt, wobei der Druck und der Zeitraum zur Beurteilung des analgetischen Effektes verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, zeigte jedes Tier, dem das Glycoprotein verabreicht worden war, einen höheren Wert für den Druck und einen längeren Zeit raum als die Kontrolle, wodurch die analgetische Aktivi tät des Glycoproteins bestätigt wurde.

Beispiel 3 Prüfung der analgetischen Aktivität durch chemische Stimulierung

Nach dem Einteilen von 20 weiblichen ICR-Mäusen mit einem Alter von 5 bis 6 Wochen in zwei Gruppen, von denen jede aus 10 Tieren bestand, wurde das Glyco protein an jede der Mäuse der ersten Gruppe in einer Dosis von 1000 mg/kg oral verabreicht und 30 min nach der Ver abreichung wurde eine 0,6%ige wäßrige Essigsäurelösung jeder der so behandelten Mäuse intraperitoneal injiziert. Die Anzahl der durch die Injektion hervorgerufenen Zuk kungen wurde unter Anwendung des Verfahrens von Kostet et al. (1959) innerhalb von 10 min 10 min nach der Injektion gezählt und die Rate der Unterdrückung der Zuckungen (%), hervorgerufen durch Glycoprotein, wurde aus der folgenden Formel errechnet:

Unterdrückungsrate (%) = (1-T/C)×100

worin bedeuten:

T die durchschnittliche Anzahl der Zuckungen der behan delten Gruppe,
C die durchschnittliche Anzahl der Zuckungen der Gruppe, der kein Glycoprotein verabreicht worden war.

Die Rate der Unterdrückung der Zuckungen durch das Glyco protein betrug 52,1%, d. h. die Anzahl der Zuckungen war deutlich geringer als in der Kontrollgruppe. Das heißt mit anderen Worten, das Glycoprotein wies eine signifikante analgetische Aktivität auf.

Beispiel 4 Formulierung einer pharmazeutischen Zubereitung

Kapseln, die jeweils 330 mg des Glycoproteins enthielten, wurden hergestellt durch Füllen von harten Kapseln Nr. 0 mit dem Glycoprotein, so wie es vorlag, unter Verwendung einer automatischen Füllvorrichtung unter Druck.

Claims

Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekular gewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ul trazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% Pro teinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Corio lus versicolor (FR.) Quel., Extra hieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäß rigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Behandlung von Schmerzen als Folge der Akzentuierung des Zentralnervs.