DE1717100A1

DE1717100A1 - Verfahren zur Herstellung von anticarcinomatoesen Praeparaten haemolytischer Streptococcen

Info

Publication number: DE1717100A1
Application number: DE19681717100
Authority: DE
Inventors: Takashi Matsuno; Takao Noto; Haruki Ogawa; Hiroshi Okazaki; Yutaka Sugawara; Shigeo Suzuki; Yoshio Takagaki; Sakae Wada; Akihiro Yamaoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1967-01-20
Filing date: 1968-01-17
Publication date: 1971-02-18
Also published as: GB1153113A; FR1580145A; FR7124M; CH543227A; US3729554A

Description

" Verfahren zur Herstellung von anticareinomatösen Präparaten hämolytischer Streptococcen "

Priorität: 20. Januar 1967, Japan, Nr. 3651/67 18. September 1967, Japan, Hr. 59387/67

Bekanntlich befinden sich unter den lebenden Zellen hämolytischer Streptococcen solche, die anticarcinomatöse Wirkung besitzen. Die Verwendung von lebenden Zellen in einer für die Tumortherapie ausreichenden Menge ist jedoch sehr gefährlich, da diese Bakterien z.B. Erysipel erzeugen.

Die pathogene Wirkung der hämolytischen Streptpcoccen (worunter im folgenden auch die Virulenz oder die loxizität verstanden, werden soll) nimmt ab und die anticarcinomatöse Wirkung zu, wenn die Zellen der hämolytischen Streptococcen kurze Zeit bei etwa 37 C in einem Medium behandelt werden, das Penicillin in verhältnismässig hoher Konzentration enthält; vgl. S. Koshimura,

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R. Shimizu, A. Fujimura und H. Okaraoto, GAlIK, Bd. 5b (1964Ii Seiten 233 - 236. Es ist ferner bekannt, dass bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn die Zellen der hämolytischen Streptococcen nach der Behandlung bei etwa 37⁰C in einem penicillinhaltigen Medium kurze Zeit einer Wärmebehandlung in der Nähe von 45°C unterworfen werden; vgl. The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 36 (1966) Seiten 161 - 174.

Durch eine derartige Fenicillinbehandlung kann die antitumoröse Wirkung der hämolytischen Streptococcen erhöht und ihre pathogene Wirkung gesenkt werden. Das auf diese Weise hergestellte Präparat kann jedoch nicht Patienten verabreicht werden, bei denen die Gefahr des anaphylaktischen Schocks durch Penicillin besteht. Dieses Problem darf nicht unterschätzt werden, da die Zahl der überempfindlichen Menschen angestiegen ist infolge des schnell ansteigenden Gebrauchs -von Penicillin bei der Therapie verschiedener Krankheiten. Weiter ist zu befürchten, dass wegen der leichten Bindung des Penicillins an Protein im alkalischen Milieu eine Verbindung aus Penicillin und Zellprotein gebildet wird, die die Antigenwirkung von Penicillin erhöht, wodurch schwere allergische Reaktionen hervorgerufen werden können.

Aufgabe der Erfindung war es, die Nachteile der durch Penicillinbehandlung erhaltenen Präparate hämolytischer Streptococcen zu vermeiden und neue Präparate mit anticarcinpmatöser Wirkung zu schaffen, die nicht-pathogen sind und keine Antigenwirkung hervorrufen. Die se Aufgabe wird, durch die Erfindung gelöst.

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Gegens tand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von anticarcinoinatösen Präparaten durch Behandlung einer Suspension lebender Zellen hämolytischer Streptococcen mit anticarcinomatöser Wirkung mit einem Antibiotikum und kurzzeitigem zweist.uf igen Erwärmen auf Temperaturen von 37 bzw. 45 C, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man als Antibiotikum Cephalosporin C oder Cycloserin verwendet und in der ersten Stufe 10 bis 60 Minuten auf 30 bis 38°C und in der zweiten Stufe 20 bis 60 Minuten auf 38 bis 5O⁰C erwärmt.

Es wurde gefunden, dass lediglich Cephalosporin C und Cycloserin die anticarcinomatöse Wirkung der hämolytischen Streptococcen noch besser erhöhen als Penicillin und ausserdem ihre Virulenz eliminiert. Streptomycin und viele andere Antibiotika und auch Chemotherapeutika rufen bei hämolytischen Streptococcen überhaupt keine Verbesserung 4«y mtleareinoa&tisi^ia Willing hex^sr· Da Cephalosporin 0 w& Cycloserin k®ia® Safrr^tiügjBallergife.a?,*- Penicillin zeigen, tritt die Gefahr des aa&pnylaktischen Scäiocka nicht auf ₍und man kann das erflndungsgemäss hergestellte Präparat auch an Patienten verabreichen, die gegen Penicillin überempfindlich sind. V

Das er findung ag emäs se Verfahren wird praktisch folgend ermas sen ausgeführt: Cephalosporin C oder Cycloserin wird zu einer Suspension lebender Zellen von hämolytischen Streptococcen gegeben. Die Zellen werden in üblichen Hährmedieit, 2·Β· in Pepton-Fleischbrühe, Herzfleisehbrühe oder einem hauptsächlich Hefeextrakt enthaltenden Hediom, bei Temperaturen von 30 bis 38⁰C unter stationären Bedingungen oder unter Belüften und Rühren gezüchtet. So-

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■ ·

t ·

■ ·

dann werden die Zellen in üblicher V/eise abgetrennt und z.B. in Bernheimer'B Basalmedium suspendiert (Zusammensetzungi 675 mg Maltose, 6 ml einer 20prozentigen Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat in Wasser,· die auf einen pjj-Wert 6,9 bis 7»O mit Natriumhydroxyd eingestellt ist, 12 ml einer 2prozentigen wässrigen Lösung von Magnesiumsulfat-heptahydrat und 66 ml destilliertes Wasser, im folgenden als BBM bezeichnet). Das Cephalosporin C oder Cycloserin werden zu der Zellsuspension zugesetzt, so

_2 dass diese Stoffe in einer Endkonzentration von 3 x 10 Mol pro

P Liter oder mehr vorliegen. Es ist natürlich auch möglich, das Cephalosporin C oder Cycloserin in BBM vorher zu lösen und anschliessend die lebenden Zellen darin zu suspendieren.

Das für die Zwecke der Erfindung verwendete Cephalosporin C kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es können natürliches Cephalosporin C, Cephalothin oder Cephaloridin verwendet werden. Als Suspendiermedium für die Zellsuspension kann auch eine andere Salzlösung, z.B. eine'mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung anstelle von BBM verwendet werden«

Pur das erfindungsgemässe Verfahren kommen lebende Zellen aller hämolyeierenden Streptococcen (Streptococcus hemolyticus) infrage, die anticarcinomatöße Wirkung besitzen.

Um eine bessere Einwirkung des zugesetzten Cephalosporin C oder des Cycloserine in der Zellsuspension zu erreichen, wird diese 10 bis 60 Minuten auf Temperaturen von 30 bis 38⁰C, insbesondere auf etwa 37⁰C erwärmt· Eine Behandlungsdauer von 20 Minuten ist im allgemeinen ausreichend. Auf diese Wärmebehandlung folgt eine

weitere Wärmebehandlung während etwa 20 bis 60 Minuten bei Tem-

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peraturen von 38 bis 5O⁰C, vorzugsweise in der Nähe von.45⁰C.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird die anticarcinomatöse Wirkung der lebenden Zellen der hämolytischen Streptococcen gegenüber einer Penicillinbehandlung erhöht, während die pathogene Wirkung durch diese Behandlung verschwindet. Bei Verwendung von Cephalosporin C wird.insbesondere die Fähigkeit der Streptococcen zur Bildung von Streptolysin S ebenfalls zum Verschwinden gebracht.

Die erfindungsgemäss hergestellten Präparate können Patienten .-■■ nach ausreichender Verdünnung gewöhnlich intravenös oder lokal in Form einer wässrigen Suspension appliziert werden. Die Verabreichung kann über lange Zeiträume auch an solche Patienten erfolgen, die konstitutionell zu einer Überempfindlichkeit gegenüber Penicillin neigen..

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 ■

9 g Hefeextrakt (Hersteller Ebios Yakuhin Kogyo K.K.) werden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit lOprozentiger Natronlauge auf einen p^-Wert von 7,0 bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 10O⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der ausgefallene Niederschlag abfiltriert,, der p^-Wert des Filtrats mit lOprozentiger Natronlauge erneut auf 7,0 bis 7,2 eingestellt, wieder 30 Minuten auf 100⁰C erhitzt und filtriert. Das Filtrat wird mit destilliertem Wasser auf 300 ml aufgefüllt und diese Lösung in sterilisierte Kolben gegossen und bei einem

2
Druck von 1 kg/cm 10 Minuten'dampfsterilisiert.

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Bine Kultur von Streptococcus hemolyticus, Stamm Su, ATCC Uo. 2IO6O (ein fast avirulenter Stamm), der 20 Stunden in 15 ml Fleischbrühe gezüchtet worden war, wird zur Beimpfung von 300 ml des genannten Hefeextrakts als Nährmedium verwendet und 20 Stunden statisch bei 37°C kultiviert. Sodann wird die Kulturbrühe mit Eis gekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 15 ml BBM suspendiert. Die Absorption dieser Zellensuspension bei 660 mu beträgt 7,80.

5 ml dieser Zellsuspension in BBM werden mit 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die 0,258 molar an Cephaloridin ist, und 20 Minuten auf 37°C erhitzt. Das Ergebnis der Antitumorversuche mit dieser Streptococcensuspension ist in Tabelle I unter Gruppe I angegeben.

Beispiel 2

Eine gemäss Beispiel 1 hergestellte wärmebehandelte Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus, Stamm Su _t ATCC Wo. 21060, wird weitere 30 Minuten auf 45°C erwärmt. Die erhaltene Streptococcensuspension zeigt noch bessere Ergebnisse als die gemäss Beispiel 1 erhaltene Suspension.

Beispiel 3

30 g Hefeextrakt (Hersteller Ebios Yakuhin Kogyo K.K.) werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst· Die Lösung wird mit lOprozentiger Natronlauge auf einen Pg-Wert von 7,0 bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, der p_H-Wert des Filtrate mit lOprozentiger Natronlauge erneut auf 7,0 bis 7,2

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eingestellt und mit destilliertem Wasserauf 1000 ml aufgefüllt. Die Lösung wird in sterilisierte Kolben gegossen und bei einem Druck von 1 kg/cm² IO Minuten dampfsterilisiert. 1000 ml dieser Hefeextraktlösung werden dann mit einer Kultur von Streptococcus hemolyticus, Stamm Su, ATCC No. 21060 (fast avirulenter Stamm), beimpft, der 20 Stunden in 50 ml Fleischbrühe gezüchtet worden war. Die Züchtung erfolgt 14- Stunden statisch bei 37⁰C Die Külturbrühe wird anschliessend mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend in 50 ml BBM suspendiert.

Die Absorption dieser Zellsuspension bei 660 mn beträgt 9,7.

5 ml der erhaltenen Zellsuspension in BBM werden mit 1 ml einer physiologischen KoebsalslöeSing versetzt ,die Q₉258 inlar an Cycloserin ist. Sie Suspension %&r£ 20 Hixmten' auf 37^eÖ arwirot. Es wird eine Suspension hämolytischer Streptoeoecen sit'gUa&tiger

Antitumorwirkung erhalten» . .

Beispiel 4

Eine gemäss Beispiel 3 hergestellte wärmebehandelte Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus, Stamm Su, ATCC Ho, 21060, wird weitere 30 Minuten auf 45°C erwärmt. Die erhaltene Streptococcen-Suspension zeigt eine noch bessere antixjarcinomatöse Wirkung. '

V e r s u c h s b e i s ρ i e 1 1

Eine gemäss Beispiel 1 erhaltene Zellsuspension wird fortschreitend mit BBM auf das 10 - 40-fache verdünnt und sofort hinsicht-

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- 8 lieh ihrer anticarcinomatösen Wirkung untersucht.

Zum Vergleich werden Suspensionen häraolytischer Streptococcen untersucht, die in ähnlicher Weise mit dem Kaliumsalz von Penicillin 6 oder mit Dihydrostreptomycinsulfat behandelt waren. , Ferner wird eine unbehandelte Zellsuspension und eine BBM-Iösung ohne Zellsuspension untersucht.

Es wurden Mäuse intraperitoneal mit Ehrlich Ascites Carcinomzellen beimpft. Am 8. Tage nach dem Impfen wurden die Zellen gesammelt, mit Eis abgekühlt und mit kalter physiologischer Kochsalzlösung versetzt. Sodann wurden die Zellen 5 Minuten mit 800 - 1000 Upm zentrifugiert. Die sedimentierten Carcinomzellen wurden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in BBM suspendiert, so dass die Zahl der Zellen

7
6 χ 10 pro ml betrug. 1 ml dieser Suspension von Carcinomzellen wurde mit 3 ml der zu untersuchenden Suspension hämolytischer Streptococcen bzw. der BBM-Lösung versetzt, 90 Minuten auf 37⁰C erwärmt und anschliessend in einer Menge von jeweils 0,5 ml intraperitoHßal Mäusen injiziert (ddY-Stamm, durchschnittliches Körpergewicht etwa 20 g). Für jede Gruppe wurden 5 Mäuse verwendet. Sie Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

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«■* ■■- -f ---Zm-*

- 9 -Tabelle I

Grup pe	Hämolytische	Streptococcensuspen- sion	Verdün nungs- faktor	•	Überlebende Mäuse	20 Tage spä ter	30 Tage spä ter	5o Tage spä ter
I	zugegebenes Antibiotikum	Konzentration in physiologi scher Koch salzlösung	10 20 30 40	10 Tage spä ter	5 5 4	5 5 4 2	5 5 3 2
II	Cephalo ridin	108 mg/ml (0,258 Mol)	10 20 30 40	VJl Ul Ul Ul	5 4 4 3	5 2 1 1	5 2 1 0
III	Penicillin- G-Kalium	1,6 χ 10⁵ E/ml (0,258 Mol)	10 20 30	VJl Ul VJl Ul	H CM CM	0 0 0	0 0 0
IV	Dihydro- streptomy- cinsulfat	188 mg/ml (0,258 Mol)	10 20 30 1	in in in	3 2 2	1 1 0 ,	HOO
V	unbehandelte Zellsuspen sion in phy siologischer Kochsalzlö sung		Ul Ul Ul	0	0	O
Vergleich, nur BBM ohne Zellsuspen sion		5

Die Konzentration jedes Antibiotikums in physiologischer Kochsalzlösung wurde derart eingestellt, dass sie einer äquimolaren Konzentration von Penicillin-G-Kalium von .1,6 oc 10 Einheiten/ml entsprach. Die Berechnung basierte auf der Annahme, dass ein mg Penicillin-G-Kalium 1667 Einheiten entsprichtund 1,6 ζ 10^ Einheiten pro ml einer Konzentration von 0,258 Mol. Die Menge Dihydrostreptomyein wurde als 3/2-Sulfat berechnet·

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Unter Verwendung von 8 Mäusen für Jede Gruppe und einer hämolytischen Streptococcensuspension gemäss Beispiel 2 wurden die in Tabelle II angegebenen Ergebnisse erhalten.

Tabelle II

Grup pe	Jiämolytische	Streptococeensuspen- si on	Verdün- mings- faktor	Überlebende Mäuse	20 Tage spä ter	30 Tage spä ter	50 Tage spä ter
I	Zugegebenes Antibiotikum	Konzentration in physiologi scher Koch salzlösung	20 40 60 80	10 Tage spä ter	8 8 8 7	8 8 7 5	8 8 7 5
II	Cephalo ridin	108 mg/ml (0,258 Mol)	20 40 60 80	8 8 8 8	8 8 4 3	8 6 2 1	8 6 2 1
III	Penicillin- G-Kalium	l,6x IQ⁵ E/ml (0,2^8 Mol)		8 8 8 8	0	0	0
Vergleich, nur BBM ohne Zeilsuspen sion		8

Versuchs beisp'iel 2

Die Präparate wurden folgendermassen hergestellt: Die Bakterien wurden gemäss Beispiel 3 gezüchtet und die Zellen in BBM suspendiert.

1 ml der lösung von Cycloserin, Penicillin-G-Kalium oder Dihydrostreptomycinsulfat in physiologischer Kochsalzlösung wurde zu 5 ml dieser Zellsuspension zugegeben. Sodann wurden die Suspensionen 20 Minuten auf 37⁰C und anschliessenji 30 Minuten auf 45 C erwärmt. Hierauf wurden die Suspensionen mit BBM auf das 2-fache, 4-fache und 8-fache verdünnt irad sofort hinsichtlich

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ihrer anticarcinomatösen Wirkung untersucht.

Männliche Mäuse vomddY-Stamm (durchschnittliches Körpergewicht etwa 20 g) wurden intraperitoneal mit jeweils etwa IQ Ehrlich Ascites Carcinomzellen (aus Näuseascites am 8. Tag nach der Beimpfung gewonnen) sowie mit der verdünnten BBM-Lösung in einer Menge von 0,8 ml pro Maus einmal täglich über eine Zeitspanne von 5 Tagen beimpft. Pro Gruppe wurden 8 Mäuse verwendet. Nach Verabreichung der Zellsuspension wurde die Überlebensrate der Mäuse ..jeder Gruppe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt«

Tabelle III

Grup pe	Hämolytische Streptococcensuspen- sion	Konsentrati on in physiolo gischer Xw>ek-	Verdün- nungs- faktor XB	überlebende Mäuse	20 Tage SyS,- ter	30 Tage spä ter	50 Tage spä-
I	Zugegebenes Antibiotücum	26,4 og/ml (0,258 Mol)	X* xB	10 Tage spä- i: - b . 8	8 1	S : 5	8 3 -
II	Cycloserin	l,6xlO⁵ E/ml (0,258 Mol)	xB	ω φ	Ί 3	6 2	6 2
III	Penicillin- . Gr-Kalium	188 ag/al (0,-258 Hol)		8 8	2 2	0 0	0 0
IV	Dihydro- streptomy- cinsulfat		8	0	0	0
Vergleich, nur BBM ohne Zell suspension

Die Konzentration Jeder Substanz in physiologischer Kochsalzlösung wurde derart «ingestellt, dass sie einer äquimolaren Konsentration von l,6xKr E/el Peuioillin-G-Kaliua entsprädi·

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Die Berechnung beruhte auf der Annahme, dass 1 mg Penicillin-G-Kalium 1667 Einheiten und 1,6x10 E/ml einer Menge von 0,258 Mol entsprachen. Das Dihydrostreptomycinsulfat wurde auf 3/2-Sulfat berechnet.

Versuchsbeispiel 3

Vereuchsbeispiel 2 wurde wiederholt, die Konzentration von Cycloserin in physiologischer Kochsalzlösung jedoch auf 26,4 mg/ml und die Konzentration von Penicillin-G-Kalium in physiologischer Kochsalzlösung auf die gleiche Gewichtskonzentration eingestellt. Die.Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV i

Grup pe	Hämolytische Streptococcensuspen- s ion	Konzentration in physiolo gischer Koch salzlösung	Verdün nungs- faktor	Überlebende Mäuse	20 Tage spä ter	30 Tage spä ter	50 Tage spä ter
I	zugegebenes Antibiotikum	26,4 mg/ml (0,258 Mol)	x4 ,x8	10 Tage spä ter	8 7	8 5	8 5
II	Cycloserin	4,4xlO⁴ E/ml (=26,4 mg/ml)	x4 x8	8 8	3 2	2 0	1 0
III	Penicillin- G-Kalium			8 8	0	O	0
Vergleich, nur BBM ohne Zell suspension	8

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Ve rauch sb eis pi el 4

1 ml einer Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus, Stamm Su, ATCC Nr. 21060 (fast avirulenter Stamm) in BEM, die gemäss Beispiel 1 erhalten wurde, wurden mit jeweils 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung von Cephaloridin bzw. Penicillin-G-Ealium versetzt und 20 Minuten auf 37⁰C und hierauf 30 Minuten auf 45⁰C erwärmt. 0,1 ml dieser vorbehandelten Lösung wurde subkutan in den Rücken von Mäusen _'* (ddY-Stamm, Durchschnitt skörpergewicht etwa 20 g) injiziert und die Mortalität nach 24 Stunden bestimmt. Mr jeden Versuch wurden 10 Mäuse verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben.

Tabelle V Zugegebenes Antibiotikum Mortalität, $>

Cephaloridin, 0

Penicillin-G-Kalium 0

ohne 80

Versuch s be is p ie I 5

(Toxizitätsversueh)

1 ml einer Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus, Stamm Su, ATCCNo. 21060 (fast-avirulenter Stamm) in BBM, die gemäss Beispiel 3 erhalten wurde, wurden mit 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung von Cycloserin oder Penicillin-G-Kalium der in Beispiel 2 verwendeten Konzentration versetzt und 20 Minuten auf 37°C und anschliessend weitere 30 Minuten auf 45 C erhitzt· 0,1 ml dieser vorbehandelten Lösung wurde intraperitoneal in Mäuse injiziert (ddY-Stamm, Durchschnittskörpergewicht etwa 20 g) und die Mortalität nach 7 Tagen bestimmt. Pur jeden Versuch wurden 10 Mäuse verwendet· Die Ergebnisse sind

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in Tabelle VI angegeben.	Tabelle	V e r s u c h s b e i	VI	Mortalität, #
zugegebenes Antibiotikum			O
Cycloserin		O
Penicillin-G-Kalium		80
ohne		e 1 6
s ρ i

ml einer 8prozentigen Lösung von Natriumribonucleat in BBM wurde zu 1 ml einer vorbehandelten Zellsuspension gegeben, die gemäss Versuchsbeispiel 4 erhalten worden war. Das Gemisch wurde

ο ^unc*

Stunden bei 37 C inkubiert, sodann zentrifugiert/die hämolytische Aktivität der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung von roten Blutkörperchen von Kaninchen in üblicher Weise bestimmt, Die Ergebnisse sind in Tabelle VII angegeben.

Tabelle VII

Zugegebenes Antibiotikum Bildungsfähigkeit für Streptolysin-S

Cephaloridin < 1 (Hämolyse-Einheiten/ml)

Penicillin-G-Kalium <1 " ohne 2260 "

Ve r Suchsbeispiel 7

Hemmung des Wachstums von Hatten-Ascites-Hepatomzellen AH 13 a) Herstellung der Arzneipräparate PCB-45, CEB^-45 und CYB-45 Die Streptococcenzellen wurden in einer Menge von 10 Zellen/ ml in BBM suspendiert, das entweder 27 000 I.E. Penicillin-G-Kalium ml BBM (PCB) oder 0,043 Mol Cephalöridin/ml BBM (CSB) oder 0,043 Mol Öycloserin/ml BBM (CYB)enthielt. Die Zellsuspension wurde 20 Minuten auf 37⁰C und Merauf 30 Minu-

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ten auf 45 C erwärmt.

Danach wurden die Präparate mit BBM so verdünnt, dass eine Mischung erhalten wurde, die 10 KE/ml enthielt, 1 KE = 1 klinische Einheit = 0,1 mg getrocknete Bakterienzellen.

b) Methode des Experiments

Ratten (Stamm s DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Aecites-Hepatomzellen AH-13 (10 Zellen/ Tier), .

Gruppen zu je IO Tieren wurden behandelt mit 100 KE/Tier der verdünnten Präparate PCB-45, CEB-45 und CYB-45. Ferner erhielten Gruppen zu je 10 Tieren nur BBM Mit Penicillin-G-Kalium, BBM mit Cephaloridin bzw. BBM mit Cycloserin· Die Tiere erhielten 10 Tage lang täglich eine intraperitonische Injektion. Die Behandlung wurde 72 Stunde r_: .»,.Ή& äer Inokulation der Tumorzellen fea^oäffiiea· Bis su.60 Tegia: n&ch der Inokulation wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Tiere festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben.

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Tabelle VIII

	10	20	Uberlebensrate	40	nach	Tagen'
Präparat	10	10	30	10	50	60
PCB-45	10	10	10	10	10	10
CEB-45	10	10	10	10	10	10
CYB-45	5	0	10	-	10	10
BBM+Penicillin	VJI	0	- .	-	-	-
BBM+Cephaloridin	5	0	-	-	-	-
BBM+Cycloserin		-	mm	—

Versuchabeispiel 8

Hemmung des Wachstums von Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-13 Das Experiment wurde in gleicher V/eise durchgeführt wie Versuchsbeispiel 1, jedoch wurden die verdünnten Präparate PCB-45, CEB-45 und CYB-45 intravenös injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX angegeben.

Tabelle IX

	10	Überlebensrate	39	" 40	nach Tagen	60
Präparat	9	..""120	7	5	"'.. 50	5
PCB-45	9	7	8	6	5	6
CEB-45	9	8	5	4	6	4
CYB-45	VJI	6	-	-	4	-
BBM+Penicillin	5	0	-	-	-	-
BBM+Cephaloridin	5	0	-	-	-	-
BBM+Cycloserin	0	-

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V er s u c h s b ei s pi el 9 Hemmung des Wachstums von Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH- 414

Das Experiment wurde in gleicher Weise durchgeführt, wie Versuchsbeispiel 7» jedoch wurden die genannten Hepatomzellen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle X angegeben.

. . ' Tabelle X

" . ■ " ■ . .	Präparat	10	Überlebensrate	30	4-0	nach Tagen	60
PGB-45	10	20	8	8	50	8
CEB-45	10	10	9	9	8	9
CYB-45 ·	10	10	7	7	9	7
BBM+Penicillin	10	9	0	-	7	-
BBM+Cephaloridin	10	3	0	mm	-	-
BBM+Cycloserin	10	3	0	-	^: -
	1	-

Versuchs be is pi el 10

Hemmung des Wachstums von Ratten-Aseites-YOSHIDA-Sarkomzellen (eines gegen IT-Lost-K-oxid resistenten Stamms).

Das Experiment wurde in gleicher Weise durchgeführt wie Versuchsbeispiel 7, jedoch wurden die genannten YOSHIDA-Sarkomzellen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI angegeben.

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- 18 -Tabelle XI

	10	20	Überlebensrate	40	nach	Taften
Präparat	10	10	30	9	50	60
PCB-45	10	10	9	9	9	9
CEB-45"	10	9	9	7	9	9
CYB-45	10	0	7	-	7	7
BBM+Penicillin	10	0	-	-	-	-
BBM+Cephaloridin	9	0	-	-	-	-
BBM+Cycloserin		-	IM*	-

Yersuchabei spiel 11 Klinische Versuche mit σϊΒ-45

Eine Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus in BBM, die 0,043 Mol Cycloserin enthält, wurde 20 Minuten auf 37°C und 30 Minuten auf 45⁰C erwärmt. Das erhaltene Präparat CYB-45 wurde zur Behandlung eines Reticulosarkoms bei einem 73 Jahre alten Mann verwendet· Ein fingerspitzengrosses Phyma (knolliger Auswuchs) wurde am linken Unterkiefer beobachtet.

Nach etwa 6 Monaten wurde eine Probeexcision durchgeführt und pathohistologisch untersucht. Diagnose Reticulesarkom. Im 7* Monat wurde der Patient in die Klinik eingeliefert. Bei der Untersuchung wurden drei harte Knollen von Bohnengrösse an beiden Seiten des Unterkiefers sowie ein Knollen von Daumengrösse an der linken Seite des Halses festgestellt«

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CYB-45 wurde intravenös 4 m&l in einer Gesamtdosis von 10 KE
(1 KE- 1 klinische Einheit = 0,1 mg getrocknete Bakterienzellen) verabreicht, und zwar am 11· Tag 1 KE, am 18· Tag 3 KE, am 25. Tag 3 KE und am 34. Tag 5 KE.

Zwei Stunden nach jeder Injektion bekam der Patient kurzzeitig Fieber (bis etwa 39⁰C). Zum Zeitpunkt der 4. Injektion hatte
sich der Knollen auf kleine Pingerspitzengrösee zurückgebildet·

Der Patient hatte 3 kg zugenommen, sein Appetit und Allgemeinsich
zustand/wesentlich gebessert. Wach 2 1/2 Monaten wurde der

Patient entlassen. ·

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Claims

Pat entan sp.rüche

1. Verfahren zur Herstellung von anticareinoraatösen Präparaten durch Behandlung einer Suspension lebender Zellen hämolytischer Streptococcen mit anticarcinomatoser Wirkung mit einem Antibiotikum und kurzzeitiges zweistufiges Erwärmen auf Temperaturen von 37 bzw. 45 C, dadurch gekennzeichn e t, dass man als Antibiotikum Cephalosporin C oder Cycloserin verwendet und in der ersten Stufe 10 bis 60 Minuten auf 30 bis 38⁰C und in der zweiten Stufe 20 bis 60 Minuten auf 38 bis 50⁰C erwärmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

man Cephalosporin C oder Cyclocerin in einer Konzentration von

—2

3 x 10 Mol/Liter oder mehr verwendet. -

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als hämolytische Streptococcen Streptococcus hemolyticus ATCC No. 21060 verwendet. -

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