DE2148452B2 - Verwendung einer wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung bei der Bekämpfung maligner Geschwulste - Google Patents

Verwendung einer wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung bei der Bekämpfung maligner Geschwulste

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Description

Die lebenden Zellen haemplytischer Streptococcen besitzen bekanntlich eine beachtliche tumorstatische Wirkung; VgL US-PS 3477914 und GB-PS 1153113. Nach der JP-AS 66 90/196Ä erhält man ein brauchbares Präparat zur Behandlung maligner Tumoren, wenn man haemolytische Streptococcenzeüen in penicülinhaltigem Bernheimer's Basahnedhim (BBM) in verhältnismä-, Big hoher Konzentration etwa 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 37° C inkubiert und anschließend die Zellensuspension etwa 30 Minuten auf etwa 45° C erwärmt Durch diese Behandlung wird die Toxizität beträchtlich vermindert, die Aktivität des Präparates jedoch beträchtlich erhöht Dieses Präparat wird abgekürzt mit PCB-45 bezeichnet Nach der GB-PS 11 53 113 erhält man ähnliche Präparate nach gleichen Verfahren, bei denen an Stelle eines Penicillins Cephalosporin C oder Cycloserin verwendet wird. Das mit Cephalosporin C erhaltene Präparat wird als CEB-45 und das mit Cycloserin hergestellte Präparat als CYB-45 bezeichnet
Die nach den bekannten Verfahren erhaltenen Präparate besitzen zwar eine beachtliche Wirkung gegenüber malignen Geschwulsten, sie haben jedoch det Nachteil, daß sie Entzündungen und Fieber sowie am Behandhingsort Schmerzen erzeugen. Diese Nebenwirkungen rühren von verschiedenen Bestandteilen in den Zellen, insbesondere im Cytoplasma und der Zellmembran, her.
Es sind ferner verschiedene Verfahren zur Herstel- -to lung von Präparaten aus haemolytischen Streptococcen bekannt die als Wirkstoff eine wasserlösliche Fraktion enthalten. Es ist bekannt daß derartige Präparate durch Extraktion der Zellen mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes und Ausfällung des *s Wirkstoffes mit einem organischen Lösungsmittel hergestellt werden können; vgl JA-AS1 647/1963. Nach dem Verfahren der OB-PS 1163 865 kann man die Zellen der haemolytischen Streptococcen auch mit einem lyrischen Enzym, wie Lysozym, Cellulase oder so Protease, behandeln und die wasserlösliche Fraktion als Wirkstoff abtrennen»
Sämtlichen vorgenannten bekannten Präparaten ist gemeinsam, daß sie aus wasserlöslichen Fraktionen der ZeIIeA der Streptococcen stammen. Ihre tumorstatische Aktivität ist ungenügend im Vergleich zu der von PCB-45, einem Präparat aus Streptococcenzellen, Diese Präparate enthalten noch zahlreiche andere Bestandteile neben den tumorstatisch wirkenden Substanzen, die Entzündung, Fieber oder Schmerzen erzeugen. eo
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Arzneimittel aus haemolytischen Streptoceccen mit tumorstatischer Wirkung zur Verfügung zu stellen, die sich zur Bekämpfung maligner Geschwulste eignen und keine Entzündung, Fieber und Schmerzen erzeuen. Zur Lösung dieser Aufgabe wird vorgeschlagen, eine wasserunlösliche Protoplastmembfanfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung zu verwenden, Die Erfindung betrifft somit dem im Patentanspruch gekennzeichneten Gegenstand,
Dje Gewinnung einer wasserunlöslichen Protopl&stmembranfraktion aus hsemolytiscnen Streptococcen ist von Y. Sokawa und F, Egami in The Journal of Biochemistry, Bd, 57 (1965), S, 64 ft beschrieben.
Zur Herstellung der wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion können alle haemolytischen Streptococcen verwendet werden, deren Zellen eine tumorstatische Wirkung besitzen. Bevorzugt verwendete haemolytische Streptococcen sind Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nx. 21060), Streptococcus hemolyticus SV (ATCC Nr. 21059), Streptococcus hemolyticus C 203 S (ATCC Nr. 21546), Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC Nr. 21547) und Streptococcus hemolyticus BIackmore(ATCCNr.21548).
Die haemolytischen Streptococcen werden nach üblichen Verfahren und in üblichen Nähnnedien, wie Fleischbrühe öder einem Hefeextrakt einhaltenden Nähnnedhim, gezüchtet Nach beendeter Züchtung werden die lebenden Zellen abgetrennt und mit physiologischer Kochsalzlösung oder einer anderen geeigneten Pufferlösung gewaschen.
Die Herstellung lyrischer Enzyme ist bekannt Beispielsweise kann ein lyrisches Enzym aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Streptococcen der Gruppe C nach dem von Y. Sokawa und F. Egami in The Journal of Biochemistry, Bd. 57 (1965), S. 64 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Ferner kann ein lyrisches Enzym aus der Gärmaische eines Mikroorganismus nach dem in der Zeitschrift Biochemistry, Bd. 5 (1966), S. 2764-2776, beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das verwendete zell-Iytische Enzym stammt vorzugsweise aus Bakterien und Actinomyceten oder wird aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Streptococcen hergestellt
Sofern die zell-lytischen Enzyme eine Protease enthalten, die eine ungünstige Wirkung auf die tumorstatische Aktivität ausübt wird das Enzym vorzugsweise vor der Verwendung von der Protease befreit
Die Behandlung der Zellen der haemolytischen Streptococcen mit dem zell-lytischen Enzym wird in einer wäßrigen Lösung durchgeführt, in welcher die Zellen suspendiert sind Als wäßrige Lösung wird vorzugsweise eine hypertonische Lösung von Natriumcitrat, Natriumsuccinat oder Sucrose verwendet Es können jedoch auch Salzlösungen sowie Pufferlösungen verwendet werden. Der pH-Wert des Suspendiermediums hängt von der Art des verwendeten Enzyms ab. Vorzugsweise liegt der PH-Wert im Bt/eich von 6 bis 8, um die tumorstatisch wirksame Substanz während der Behandlung zu stabilisieren. Die Behandlungstemperatur und -zeit hängt ebenfalls von der Art des verwendeten Enzyms ab. Im allgemeinen liegt die Behandlungstemperatur bei 10 bis 4O0C und die Behandlungszeit beträgt 10 bis 120 Minuten. Die bevorzugte Behandlungstemperatur 10 bis 30" C und die bevorzugte Behandlungszeit 10 bis 60 Minuten, um die Aktivität der tumorstatisch wirksamen Substanz nicht zu vermindern.
Nach beendeter Lysis der Zellen wird die aktive Substanz als wasserunlösliche Fraktion aus dem Lysat, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und danach mit physiologischer Kochsalzlösung, einer Pufferlösung oder destilliertem Wasser gewaschen.
Das nach dem geschilderten Verfahren erhaltene Präparat ist die Protoplastmembranfraktion. weiche die
L,ys}s der Zellen (Jer haemplytjschen Streptocqccen flbersteht, Dies wurde durch elektronenmikroskop!«^ Aufnahmen bei einer Vergrößerung yon 60000 festgestellt Die Fraktion enthält weder die Zellwand noch Cytopjasma, in welchem die Nebenwirkungen hervorrufenden Stoffe enthalten sind. Dieses Präparat erzeugt keine Entzündungen, kein Fieber und keine Schmerzen, wie dies bei den bekannten Präparaten der Fall ist Die tumorstatische Wirkung des Präparats ist wesentlich höher als die der bekannten Präparate mit den wasserlöslichen Wirkstoffen.
Da die Protoplastmembranfraktion in Form einer Suspension selbst beim Aufbewahren im Kühlschrank verhältnismäßig instabil ist, wird sie gefriergetrocknet Zu diesem Zweck wird die Suspension z. B. mit einem der nachstehend genannten Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel gefriergetrocknet Man erhält auf diese Weise ein Trockenpräparat, das durch Zusatz von Wasser leicht in eine applizierbare Form gebracht werden' kann. Besonders stabile Trockenpräparate können durch Gefriertrocknung einer Suspension der Protoplastmembrirfraktion erhalten werden, die als Stabilisator eine Aminosäure, ein Saccharic! oder ein wasserlösliches Kohlenhydrat in einem Gewichtsverhältnis von 1:1 bis 50:1, bezogen auf das Trockengewicht der aktiven Fraktion, enthält Beispiele für geeignete Aminosäuren sind Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Ornithin, Prolin, Serin, Threonin und Valin. Beispiele für geeignete Saccharide sind Sucrose, Maltose, Raffinose und Lactose. Beispiele für geeignete wasserlösliche Kohlenhydrate sind Dextran und lösliche Stärke.
Die Erfindung betrifft aurt die Verwendung der Protoplastmembranfraktion beider Bekämpfung maligner Geschwulste. Zu diesem Zweck wird üe Protoplastmembranfraktion in einem pharmakologisch verträglichen Trägerstoff und bzw. oder Verdünnungsmittel suspendiert Beispiele für bevorzugteTrägerstöffe bzw. Verdünnungsmittel sind Bernheimer's Basalmedium oder physiologische Kochsalzlösung.
Die Beispiele und Versuchsbeispiele erläutern die Herstellung der Protoplastmembranfraktion.
Bernheimer's Basalmedium hat folgende Zusammensetzung:
675 mg Maltose, 6 ml einer 20prozentigen wäßrigen Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat, auf pH 6,9 bis 7,0 mit Natriumhydroxid eingestellt, 12 ml einer 2prozentigen wäßrigen Lösung von Magnesiumsulfatheptahydrat und 66 ml destilliertes Wasser.
Beispiel 1
Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21060, ein nahezu avirulenter Stamm) wird 24 Stunden bei 37° C in Fleischbrühe gezüchtet 100 ml der Kultur werden in 21 eines 5prozentigen Hefeextraktmediums überimpft, das durch Auflösen von 100 g Hefeextrakt in 1,51 destilliertem Wasser, Einstellen des pH'Wertes der Lösung auf pH 7,4 mit Natronlauge, 60minütiges Erhitzen auf 10O0C Abkühlen, Filtrieren und Auffüllen mit Wasser auf 21 und lömfaiütiges Dampfsterilisieren bei 1 atü hergestellt wurde. Die Züchtung in diesem Nährmedium wurde 20 Stunden bei 37" C durchgeführt Die erhaltene Gärmaische wurde mit Eis abgekühlt und zentrifugiert Die Zellen wurden zweimal mit kalter physiolgischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in BBM suspendiert und die Absorption wurde auf einen Wert von 8,00 bei 660 nm eingestellt. Die Absorption zeigt, daß die Suspension 5 mg Zellen, ausgedruckt in Zellentrockengewicht, pro ml der Suspension enthielt, Das Volumen der Suspension betrug 95 mit 20 ml der ZpJlensuspension wurden unter
Kühlung zentrifugiert und die abgetrennten. Zellen wurden in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratjösung suspendiert piese Lösung wurde durch Vßrmischen von 5 Volumtefjen einer 1 molaren N.atriumcitratlösung mit 1 Volumteil einer 0,2 molaren Phosphatpufferlösung
ίο (pH 7,2), 1 Volumteil einer 2prozentigen NfatrhimtHoglykolatlösung und 3 Volumteilen destilliertem Wasser hergestellt Die Suspension wurde mit 80 mg eines lyrischen Enzyms versetzt, das aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Streptococcen sp. der
is Gruppe C nach dem in Journal of Biochemistry, Bd. 57 (1965), S. 64 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 25° C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und 30 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert Die Fällung wurde zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 20 ml BBM suspendiert das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27 000 IE/ml enthielt Das Präparat enthielt unlösliche Wirkstoffe in einer Menge von 0,88, ausgedrückt als Absorption bei 660 nm.
Beispiel 2
Beispiel 1 wurde wiede/hoh, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC Nr. 21059) verwendet Das Präparat enthielt aktive Substanzen in einer Menge von 030, ausgedrückt durch die Absorption bei 660 nm.
Beispiel 3
Beispiel 1 wurde wiederholt jedoch wurde Streptococcus hemolyticus C 203 S (ATCC Nr. 21 546) verwendet. Das Präparat hat einen Absorptionsweri von 0,96 bei 660 nm.
Beispiel 4
Beispiel 1 wurde wiederholt jedoch wurde Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC Nr. 21547) verwendet Das Präparat hat eine Absorption von 0,32 bei 660 nm.
Beispiel 5
Das Beispiel 1 wurde wiederholt jedoch wurde Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC Nr. 21 548) verwendet Das Präparat hat eine Absorption von 035 bei 660 nm.
Beispiel 6
Gemäß Beispiel 1 wurden gezüchtete Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21060, nahezu avirulenter Stamm) hergestellt Die Zellen wurden in
BBM suspendiert und die Absorption wurde auf einen Weft von 9,20 bei 660 nm eingestellt Dieser Wert entspricht einer Konzentration der trockenen Zellen von 6 mg/ml. 40 ml der Suspension wurden mit 8 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt die das KaIiumsaiz von Penicillin G in einer Konzentration von l,6xlO*IE/ffll enthielt und 20 Minuten bei 37° C inkubiert Danach wurde die Suspension 30 Minuten auf 450C erwärmt und hierauf sofort abgekühlt Die erhaltene Suspension entspricht dem bekannten Präparat PCB-45. Dieses Präparat PCB-45 enthielt die Streptococcenzellen in einer Menge von 5 mg/ml, ausgedrückt als trockene Zellen (Absorptionswert 8,00 bei 660 nm).
Aus 20 ml der erhaltenen (Suspension wurden die Zellen abzentrifugiert twd in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumpifratlösung suspendiert, Die erhaltene Suspension wurde mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt, das nach der in Beispiel 1 zitierten Methode erhalten wurde. Die Suspension wird 30 Minuten bei 25° C stehengelassen, danach mit His abgekühlt und zentrifugiert Die erhaltene Fällung wurde gemäß Beispiel 1 weiter verarbeitet Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 1,20 bei 660 nm erhalten,
Beispiel 7
20 ml des gemäß Beispiel 6 hergestellten Präparates PCB-45 wurden mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt das nach der in Beispiel 1 zitierten Methode erhalten wurde.
Die weitere Verarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1. Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 0,98 bei 660 nm erhalten.
Beispiel &
20 ml des gemäß Beispiel 6 hergestellten Präparates PCB-45 wurden zentrifugiert Die abgetrennten Zellen wurden in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratlösung suspendiert Die Suspension wurde mit 160 mg eines teilweise gereinigten lytischen Enzyms versetzt das aus einer Gärmaische von Streptomyces albus nach der in der Zeitschrift Biochemistry, Bd. 5 (1964), S. 2764 beschriebenen Methode erhalten wurde. Die begleitende Peptidase wurde abgetrennt Die mit dem lytischen Enzym versetzte Suspension wurde 40 Minuten bei 37° C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und zenrifugiert Die Fällung wurde gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 1,05 bei 660 nm erhalten.
Beispiel 9
Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Präparat wurde mit einem gleichen Volumen einer lprozentigen wäßrigen DL-Methioninlösung versetzt Jeweils 2 ml des Gemisches wurde in Reagenzgläser abgefüllt Die Reagenzgläser wurden 2 Stunden auf -300C eingefroren und hierauf 20 Stunden bei einer Temperatur unterhalb 2O0C urtd einem Druck von 0,01 Torr gefriergetrocknet Danach wurde das Vakuum mit getrockneter Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser wurden dicht verschlossen. Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.
Beispiel 10
Die gemäß Beispiel 6 erhaltene Fällung wurde in 20 ml BBM suspendiert das kein Penicillin enthielt Die erhaltene Suspension wurde mit einem gleichen Volumen einer lprozentigen wäßrigen DL-Methioninlösung versetzt und gemäß Beispiel 9 gefriergetrocknet Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.
Beispiel 11
Beispiel 10 wurde wiederholt an Stelle von DL-Methionin wurde L-Arginin verwendet. Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.
Beispiel 12
Beispiel 10 wurde wiederholt, an Stelle von DL-Methionin wurde Sucrose verwendet Es wurde ein trockenprftparat erhalten.
Zum Vergleich der tumorstatJschen Wirkung, der entzündungserregenden und schmerzerregenden Eigenschaften der Protoplastroembranfraktion mit bekannten. Präparaten wurden einige bekannte Präparate auf die in den folgenden Vergleichsbeispielen beschriebene Weise hergestellt
Vergleichsbeispiel 1 Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr.
21060) wurden in BBM suspendiert, das das Kaliumsalz von PefiicUlin ( G in einer Konzentration von 27 000 IEj'ml enthielt Die Suspension wurde 20 Minuten bei 37°C:inkubiert und anschließend 30 Minuten auf 45°C erwärmt Das als PCB-45 bezeichnete Präparat
hat einen! Absorptionswert von 8,00 bei 660 nm; vgl. Beispiel 6.
; Verg!eichsbeispiei2
Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt an Stelle von Penicillin G wurde Cephalosphorin C (Cephaloridin) verwendet Das mit CEB-45 bezeichnete Präparat hatte einer; Absorptionswert von 8,00 bei 660 nm.
Vergleichsbeispiel 3
Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt an Stelle von Penicillin G wurde Cycloserin verwendet Das mit CYB-45 bezeichnete Präparat hat einen Absorptionswert von 8,00 bei 660 nm.
Vergleichsbeispiel 4
Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21 060) wurden mit Aluminiumpulver in einem Mörser vermählen und mit einer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 extrahiert Der Extrakt wurde largsam mit kaltem Aceton versetzt Die hierbei auftretende Fällung wurde abgetrennt getrocknet und in destilliertem Wasser gelöst
Vergleichsbeispiel 5
Der Überstand des im Verfahren gemäß Beispiel 1 erhaltenen Lysats von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21 060) wurde abgetrennt
Vergleichsbeispiel 6
Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21 060) wurden in destilliertem Wasser suspendiert und mit Glaspulver in einem Zellenhomogenisator der Firma Braun vermählen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Überstand abgetrennt und in einem Cellophanschlauch gegen Ammoniumsulfatlösung dialysiert Eine Fraktion, die zwischen 50- und 80prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfiel, wurde abzentrifugiert Diese Fraktion wurde gegen destilliertes Wasser dialysier'. Es wurde ein tumorstatisches Präparat erhalten.
Versuch A
b5 In diesem Versuch wurde die entzündungserregende Wirkung der Prc /oplastmembranfraktion und bekannter Präparate untersucht
Versuchsmethodik
Die in den Beispielen und Vergleichsbeispielen beschriebenen Präparate wurden subcutan in den Rücken von männlichen Mäusen des ddY-Stammes mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 28,5 g in der in Tabelle I angegebenen Menge injiziert. Nach 3 Stunden wurde in die gleiche Stelle eine O^prozentige Evans Blau-Lösung injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Mäuse getötet und die Häute abgezogen und auf das Auslaufen des Pigmentes untersucht. Das Auslaufen des t'igments zeigt eine Entzündungswirkung mit ihr vorausgehender Vasodilatation an. Für jeden Versuch wurde eine Gruppe von 5 Mäusen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I
Verabfolgte
Dosis, ·/
Präparat von
Beispiel Nr.
Präparat von Vergleichsbeispiel Nr.
1
30
30
30
30
30
30
30
!00
100
100
Zahl der Mäuse mit positiver
0
0
0
0
0
0
0
Anmerkungen:
Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das Trockensubstanzgewicht Im Falle der Präparate von Beispiel 1 bis 6 und 8 sowie der Präparate der Vergleichsbeispiele 4 bis 6 bedeutet die Dosis die Wirkstoffmenge aus 100 γ Trockengewicht Streptococcenzellen. Im Falle der Präparate der Vergleichsbeispiele t bis 3 bedeutet die Dosis die Menge an Streptococcenzellen.
Versuch B
In diesem Versuch werden die Fieber erzeugenden Eigenschaften der Protoplastmembranfraktion und der bekannten Präparate untersucht
Versuchsmethodik
Die gleichen Präparate wie in Versuch A wurden intravenös in das Ohr von Kaninchen (japanischer weißer Stamm) injiziert, und die Körpertemperatur wurde rektal in stündlichen Abständen bis 12 Stunden nach der Injektion gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt Die Temperaturerhöhung bei der. Präparaten der Beispiele 1 bis 6 und 8 beträgt höchstens 0,5° C. während die Temperaturerhöhung der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 6 mehr als 10C betrug.
Tabelle II
Verabfolgte
Dosis, γ
Körpertemperatur (rektal)
Stunden nach Verabfolgung
des Präparats
Präparat von
Beispiel Nr.
1 150
300
750
1500
150
150
2
3
4
5
6
8
Präparat von
Vergleichsbeispiel Nr.
150
150
150
150
500
500
500
350
250
100
38.8 38,9 38.9 39,3 39,1
38,8 38,7 39,2 39,2 39,1
39,3 39,6 39,5 39,4 39,3
39.0 39.5 39.5 39,4 39.3
38.8 38,9 38,8 38,9 38.8 39;0 39;0 389 39.2 39 0
38.9 39,1 39.1 39,2 39.2
39.1 39,1 39,4 39,4 39,3 39,3 39,2 39,3 39,1 39.1 38,9 38,9 39.0 39,0 39,2
38,8 38,8 40,7 40,1 38.9
39,0 38,9 41,0 39.9 39.6
39.0 38,9 40,9 40.2 39,2 38,6 38,6 40,3 38,9 38,7 39,2 39,2 41,1 40,1 39.8
39.1 39,1 40,7 39,8 39,3
Anmerkungen:
Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das Trockensubstanzgewicht. Im Falle von Beispiel 1 bedeuten die Dosen die Menge an aktiven Substanzen, die aus 500, 1000, 2300 und 5000}» (Trockengewicht) Streptococcenzellen erhalten wurden. Im Falle der Beispiele 2—6 und 8 sowie der Vergleichsbeispiele 4—6 bedeuten die Dosen die Menge an aktiven Substanzen, die aus 500y (Trockengewicht) der Streptococcenzellen erhalten wurden. Im Falle der Vergleichsbeispiele 1—3 bedeuten die Dosen die Mengen an Streptococcenzellen.
Versuch C
;o In diesem Versuch wurden die schmerzerregenden Eigenschaften der Protoplastmembranfraktion und der bekannten Präparate untersucht Es wurden die gleichen Präparate verwendet wie in Versuch A, die intraperitoneal 5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20,6 g injiziert wurden. Die Dosen betrugen bei den Präparaten der Beispiele 1 bis 6 und 8 jeweils 750 γ, bei den Präparaten der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 je 2500 γ und bei den Präparaten der Vergleichsbeispie-Ie 4,5 bzw. 6 175Oy, 1250y bzw. 50Oy.
Das Verhalten der Mäuse wurde während einer Stunde nach der Injektion der Präparate beobachtet Die mit der Protoplastmembranfraktion gespritzten Mäuse zeigten kein anormales Verhalten, während die mit den bekannten Präparaten gespritzten Mäuse Krümmungssyndrome zeigten, d. h. Verdrehung des Körpers, Einziehen der Bauchdecke und Strecken der Hinterbeine.
Versuch D
10
In diesem Versuch wird die tumorstatische Wirkung der Protoplastmembranfraktion und der bekannten Präparate untersacht.
5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm wurden Ehrlich ascites Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 10* Zellen pro Maus injiziert. Pro Gruprni wurden 10 Mäuse verwendet. Die Präparate der Beispiele 1 bis 3,5 und 10 und der Vergleichsbeispiele 1 bis 6 wurden den Mäusen 24 Stunden nach der
Tabelle III
IO
Beimpfung mit den Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 0,1 ml pro Maus täglich während 4 Tagen injiziert.
Als Blindprobe wurde BBM injiziert, das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27 000 ΙΕ/ml enthielt. Nach 40 Tagen wurde die tumorstatische Wirkung an Hand der Zahl der überlebenden Tiere in jeder Gruppe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle UI zusammengestellt.
Verabfolgte Dosis, γ Zahl der überlebenden Mäuse
Präparate von
Beispiel Nr.
10
Präparat von Vergleichsbeispiel Nr.
Blindversuch Anmerkungen:
Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das Trockensubstanzgewicht Im Falle des Präparats von Beispiel 1 bis 3, 5 und 10 sowie der Präparate der Vergleichsbeispiele 4 bis 6 bedeuten die Dosen die Wirkstoffmengen aus 250 γ (Trockengewicht) Streptococcenzellen. Im Falle der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 bedeuten die Dosen die Mengen an Streptococcenzellen.
75 7
75 6
75 6
75 5
75 7
250 10
250 10
250 10
175 1
125 1
50 3
Versuch E Tabelle IV Zur Bestimmung der akuten Toxizität (LD») und der
effektiven Dosis (ED») werden 5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm Ehrlich ascites Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 106 Zellen pro Maus injiziert. Pro Gruppe wurden 10 Mäuse verwendet Das Präparat von Beispiel 1 sowie das bekannte Streptococcen-Präparat PCB-45 wird den Mäusen 24 Stunden nach der Beimpfung mit den Carcinomzellen intraperitoneal in bestimmter Menge täglich während 4 Tagen gegeben. Nach 40 Tagen wird an Hand der Zahl der überlebenden Tiere die ED» und LD50 berechnet In Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengefaßt Präparat
PCB-45
von Beispiel 1
ΕΓ» (KE/Tier) 0,246 Ul
LD50 (KE/Tier) 25 400 <
LD5(ZED5O 101,6 330,6 <
Anmerkung: IKE (klinische Einheit) entspricht 0,1 mg Trockensubstanzgewicht Streptococcenzellen.

Claims (1)

  1. Patentanspruch;
    Verwendung einer wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumörstatischer Wirkung bei der Bekämpfung maligner Geschwulste.
    IO
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US3786141A (en) 1974-01-15
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